CN115932090B - 一种基于风味组学的施用和未施用农药草莓的区别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于风味组学的施用和未施用农药草莓的区别方法，该方法包括以下步骤：分别称取施用和未施用农药草莓样品2.00‑4.00g至顶空瓶中，采用顶空‑固相微萃取方法对草莓样品中的挥发性和半挥发性成分进行萃取；采用全二维气相色谱结合飞行时间质谱分析萃取得到的挥发性和半挥发性成分；基于风味组学，根据全二维气相色谱和飞行时间质谱分析结果区别施用和未施用农药草莓。本发明方法通过SPME‑GC×GC‑TOF‑MS进行定性分析，比传统的气相色谱‑质谱法具有更大的峰容量，更高的灵敏度，获得的风味物质信息更全面。本方法可以用于多组分、较复杂样品的风味物质分析，对于不同种植模式下草莓的区分具有较好的优势。

Description

一种基于风味组学的施用和未施用农药草莓的区别方法
技术领域
本发明属于食品技术领域，具体涉及一种基于风味组学的施用和未施用农药草莓的区别方法。
背景技术
随着现代社会对高质量、高产量、绿色无污染农产品的需求不断提高，从源头上改善农产品质量、提高农业生产质量与水平将是新时代农业发展的重点。有机农业成为实现生态可持续发展、农业高质量生产的重要举措。与有机农业相比，传统农业生产模式由于农药等的施用，不仅导致土地质量下降、环境污染和物种多样性下降等问题，还在粮食作物(小麦等)、蔬菜(菠菜等)和水果(苹果等)的品质研究中证实对农产品的品质产生影响。但目前研究仅限于农产品的抗氧化性等营养品质和颜色等感官品质，对于影响消费者喜好的风味品质的研究还较缺乏，主要与农产品挥发性组分复杂，检测仪器分辨率达不到要求等原因有关。
浆果是一类富含维生素、酚类、花青素等多种生物活性物质的水果，是近年来全球食品科学研究领域的热点。草莓是全球种植面积和消费量最大的浆果，中国位居第一，占草莓总产量的三分之一以上。2020年，全球草莓总产值超过220.6亿美元，是蓝莓、树莓和蔓越莓的8.85-16.39倍。风味品质是草莓商品属性的重要品质指标之一。草莓果实风味物质的组成复杂且受遗传因素、肥料和土壤类型等因素影响。
近年来，随着食品学科的发展，风味组学逐渐成为解析风味物质基础的关键技术，其针对风味相关代谢物质进行综合分析，并结合化学计量学将样品中的化学成分和感官相联系，从而挖掘、鉴定或预测影响样品风味感知的关键风味成分。目前，基于风味组学的农产品品质研究受到食品领域的广泛关注，将食物的香气与其化学特征相关联开辟了新的视角。传统分析方法基本可以实现食品成分检测，但是已不能完全满足现风味组学技术发展的要求，现代仪器分析技术已经逐渐成为风味组学分析中不可缺少的重要手段。
气相色谱-质谱联用是国际公认的对风味物质进行定性定量分析最高效的检测方法，被广泛应用于香辛料、食品风味物质领域的研究。但是其对草莓挥发性物质检出成分较少，对于多组分、较复杂样品的风味物质分析不足，不能对施用和未施用农药草莓进行区别。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明的目的在于提供一种基于风味组学的施用和未施用农药草莓的区别方法。
为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
提供一种基于风味组学的施用和未施用农药草莓的区别方法，该方法包括以下步骤：
(1)分别称取施用和未施用农药草莓样品2.00-4.00g至顶空瓶中，采用顶空-固相微萃取方法对草莓样品中的挥发性和半挥发性成分进行萃取；
(2)采用全二维气相色谱结合飞行时间质谱分析萃取得到的挥发性和半挥发性成分；
(3)基于风味组学，结合全二维气相色谱和飞行时间质谱分析结果区别施用和未施用农药草莓。
进一步地，步骤(1)中，顶空-固相微萃取条件为：采用自动取样器，装有草莓样品的顶空瓶在50-70℃下平衡20-40分钟后，将SPME萃取针头暴露在顶空中，在50-70℃提取30-40min后，立即将SPME萃取针头在240-260℃下插入注射器端口5-7min。
进一步地，步骤(2)中，全二维气相色谱的色谱柱采取GC×GC柱系统：一维色谱柱为：DB-5MS型色谱柱，30m×0.32mm内径，膜厚0.15μm；二维色谱柱为：DB-17型二级色谱柱，2.00m×0.25mm内径，膜厚0.15μm；调制柱为：HV型调制柱，1.3m×0.25mm内径，膜厚0.25μm。
进一步地，步骤(2)中，全二维气相色谱条件为：使用纯度为99.999％的氦气作为载气，恒定流量为1mL/min，采用不分流模式；进样口的温度设置为230-270℃；柱温箱升温程序：起始温度35-45℃，保持2-4min后，以1-3℃/min升温至180-220℃，保持0.5-2min，再以4-8℃/min升温至250-290℃，保持4-6min，调制器调制时间为5-10s，调制补偿温度为20-40℃。
进一步地，步骤(2)中，飞行时间质谱分析条件为：采用电子轰击离子源，电压为70eV，离子源温度为230-260℃，传输线温度为230-260℃，检测器电压为1600-1800V，采集质量数范围为10-550amu，采集频率为90-110谱/秒，溶剂延迟2-5min。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种基于风味组学区分施用和未施用农药草莓的方法，该方法通过SPME-GC×GC-TOF-MS进行定性分析，比传统的气相色谱-质谱法具有更大的峰容量，更高的灵敏度，获得的风味物质信息更全面。传统的气相色谱-质谱法只有一根色谱柱，非极性或极性，而全二维气相色谱-飞行时间质谱采用GC×GC双柱系统，物质可以根据分子大小和极性大小先后分离，获得更加全面的分离信息。施用和未施用农药草莓的挥发性和半挥发性成分差异明显，经风味组学分析技术可以实现将施用和未施用农药草莓很好的区分。因此，本方法可以用于多组分、较复杂样品的风味物质分析，对于不同种植模式下草莓的区分具有较好的优势。
附图说明
图1为实施例中未施用吡虫啉草莓中挥发性和半挥发性化合物的GC×GC-TOF-MS三维指纹图谱；
图2为实施例中施用吡虫啉草莓中挥发性和半挥发性化合物的GC×GC-TOF-MS三维指纹图谱；
图3为实施例中不同处理组草莓果实样品中的挥发性和半挥发性化合物的数量示意图；
图4为实施例中通过GC×GC-TOF-MS定性的未施用吡虫啉和施用吡虫啉草莓果实样品中不同类别的挥发性和半挥发性化合物的数量示意图；
图5为实施例中通过GC×GC-TOF-MS定性的未施用吡虫啉和施用吡虫啉草莓果实样品中不同类别的挥发性和半挥发性化合物的峰面积示意图；
图6为实施例中不同处理组草莓果实与香气相关的主要挥发性化合物的相对含量示意图；
图7为实施例中两个处理组的PCA得分图；
图8为实施例中两个处理组的PLS-DA得分图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例
采用全二维气相色谱飞行时间质谱法(GC×GC TOFMS，GGT 0620)(中国广州禾信分析仪器有限公司)，配备GERSTEL MPS 2XL自动取样器(中国广州智达实验科技有限公司)测定施用和未施用农药草莓中的挥发性和半挥发性物质的组分构成和相对含量。
田间试验：草莓品种选为中国主要的种植品种“红颜”草莓；有机温室昼夜平均温度和相对湿度分别为89.6°F/64.4°F(32℃/18℃)和35％/80％；施用和未施用农药草莓种植措施的区别在农药控制方面；农药对象：吡虫啉(属于在草莓中已经登记使用的农药)；吡虫啉的施用浓度为已登记的推荐最大剂量(25g/亩)；当草莓果实坐果后，草莓植株被分成两组，间隔5米。第一组(未施用吡虫啉组)喷洒蒸馏水。第二组(施用吡虫啉组)喷施已登记吡虫啉在草莓上的推荐最大剂量(25g/亩)，一次喷施。30天(成熟阶段)后采摘成熟果实样品。样品用液氮速冻后立即运至实验室。液氮条件下研磨至粉末后储存至-80℃。将未施用吡虫啉组和施用吡虫啉组草莓果实样品粉末从-80℃冰箱取出，分别称取2.00g样品粉末至顶空瓶中。每组称取18个平行样品，待全二维气相色谱-飞行时间质谱分析。
样品分析步骤如下：
挥发性和半挥发性物质的组分构成和相对含量测定方法：
分别称取未施用吡虫啉组和施用吡虫啉组样品2.00g至顶空瓶中并立即用螺帽密封顶空瓶进行顶空-固相微萃取，每组称取18个平行样本，待全二维气相色谱-飞行时间质谱分析。
顶空-固相微萃取(SPME)条件：
采用配备GERSTEL MPS 2XL自动取样器，装有样品的顶空瓶在55℃下平衡20分钟后，将SPME萃取针头(WR/PDMS，50/30μm，10mm；中国广州智达实验科技有限公司)暴露在顶空中。在55℃提取30min后，立即将SPME萃取针头在250℃下插入注射器端口5min。
全二维气相色谱的分析条件：
色谱柱采取GC×GC柱系统，一维色谱柱为：DB-5MS型色谱柱，30m×0.32mm内径，膜厚0.15μm；二维色谱柱为：DB-17型二级色谱柱，2.00m×0.25mm内径，膜厚0.15μm；调制柱为：HV型调制柱(HV柱，1.3m×0.25mm内径，膜厚0.25μm；中国广州和信分析仪器有限公司)。
色谱条件：使用高纯度氦气(99.999％)作为载气，恒定流量为1mL/min。采用不分流模式。进样口的温度设置为250℃。柱温箱升温程序：起始温度40℃，保持2min后，以2℃/min升温至200℃，保持1min，再以6℃/min升温至270℃，保持5min，调制器调制时间为7s，调制补偿温度为30℃；
飞行时间质谱的分析条件：电子轰击离子源，电压为70eV，离子源温度为250℃，传输线温度为250℃，检测器电压为1730V，采集质量数范围为10-550amu，采集频率为100谱/秒，溶剂延迟4min。
数据处理条件为：实验采集的飞行时间质谱数据由Canvas Browser软件W2.2.0.29702版本(中国上海雪晶电子科技有限公司)处理。如峰值发现和质谱反褶积，使用基线偏移为3-4、信噪比为6-8的自动峰值发现和频谱反褶积。对于色谱图中峰的排列，最大一维和二维保留时间偏差分别设置为10-12s和0.1-0.3s。线性保留指数通过使用正构烷烃(C7-C40)计算。通过将化合物与NIST20数据库中的化合物的相似性进行比较，最小匹配度为600-800，并将线性保留指数值与NIST库中的值的进行比较，误差范围为20-50，确定化合物。挥发性化合物的相对含量通过任何挥发物的峰面积比进行相对定量。采用禾信质谱数据跟踪软件(广州禾信分析仪器有限公司)进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。组间显著性分析基于单因素方差分析(ANOVA)，使用SPSS统计21.0软件(SPSSInc.，芝加哥，伊利诺伊州，美国)。
本实施例在该分析条件下获得了上述草莓果实样品中挥发性和半挥发性物质的组分和相对含量，施药和未施药草莓共检出1164个化合物，其中施药组825个，未施药组779个。如图1-图4得出施用吡虫啉草莓的挥发性和半挥发性物质的组分数量明显大于未施用吡虫啉的草莓；图5反映了草莓挥发性和半挥发性物质组分的相对含量，施用吡虫啉的草莓果实的主要香气物质(醛类、酯类、酮类和呋喃酮类等)的相对含量显著大于未施用吡虫啉的草莓；图6反映了草莓7种主要香气物质种类(酯类、醇类、酸类、酮类、醛类、萜烯类、呋喃类)的组成情况，以酯类为例，施用吡虫啉后草莓的各种酯类物质的相对含量明显发生了变化。图5和图6表明施用吡虫啉后草莓的主要香气物质组分的相对含量发生了变化，草莓的香气可能受到了影响；图7反映了施药组和未施药组草莓检出化合物的主成分分析结果，表明了基于挥发性和半挥发性物质，施药组和未施药组的草莓可明显区分开。
表1为实施例中未施用吡虫啉和施用吡虫啉草莓样品中差异贡献者(PLS-DA分析种VIP值>1)的相对含量、香气描述和香气阈值信息。由表1结果推测，吡虫啉的施用会对草莓的独特香气产生影响。以4-甲氧基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(DMMF)为例，施用吡虫啉显著降低了DMMF的相对含量，该物质由于其香气阈值小、在草莓中相对含量高等因素，被认为草莓最主要的特征性香气物质。
以上结果表明，运用风味组学的方法，可以实现从香气物质组分数量和相对含量以及特征性差异物质的相对含量结合香气阈值来区分施用和未施用农药的草莓。
表1
注：a没有中文名称的化合物，标注英文名称。
本发明提供了一种基于风味组学区分施用和未施用农药草莓的方法，该方法通过SPME-GC×GC-TOF-MS进行定性分析，比传统的气相色谱-质谱法具有更大的峰容量，更高的灵敏度，获得的风味物质信息更全面。传统的气相色谱-质谱法只有一根色谱柱，非极性或极性，而全二维气相色谱-飞行时间质谱采用GC×GC双柱系统，物质可以根据分子大小和极性大小先后分离，获得更加全面的分离信息。施用和未施用农药草莓的挥发性和半挥发性成分差异明显，经风味组学分析技术可以实现将施用和未施用农药草莓很好的区分。因此，本方法可以用于多组分、较复杂样品的风味物质分析，对于不同种植模式下草莓的区分具有较好的优势。
于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (1)

1.一种基于风味组学的施用和未施用农药草莓的区别方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分别称取施用和未施用农药草莓样品2.00-4.00g至顶空瓶中，采用顶空-固相微萃取方法对草莓样品中的挥发性和半挥发性成分进行萃取；
(2)采用全二维气相色谱结合飞行时间质谱分析萃取得到的挥发性和半挥发性成分；
(3)基于风味组学，根据全二维气相色谱和飞行时间质谱分析结果区别施用和未施用农药草莓；
步骤(1)中，所述顶空-固相微萃取条件为：采用自动取样器，装有草莓样品的顶空瓶在50-70℃下平衡20-40分钟后，将SPME萃取针头暴露在顶空中，在50-70℃提取30-40min后，立即将SPME萃取针头在240-260℃下插入注射器端口5-7min；
步骤(2)中，所述飞行时间质谱分析条件为：采用电子轰击离子源，电压为70eV，离子源温度为230-260℃，传输线温度为230-260℃，检测器电压为1600-1800V，采集质量数范围为10-550amu，采集频率为90-110谱/秒，溶剂延迟2-5min；
步骤(2)中，所述全二维气相色谱的色谱柱采取GC×GC柱系统：一维色谱柱为：DB-5MS型色谱柱，30m×0.32mm内径，膜厚0.15μm；二维色谱柱为：DB-17型二级色谱柱，2.00m×0.25mm内径，膜厚0.15μm；调制柱为：HV型调制柱，1.3m×0.25mm内径，膜厚0.25μm；
步骤(2)中，所述全二维气相色谱条件为：使用纯度为99.999％的氦气作为载气，恒定流量为1mL/min，采用不分流模式；进样口的温度设置为230-270℃；柱温箱升温程序：起始温度35-45℃，保持2-4min后，以1-3℃/min升温至180-220℃，保持0.5-2min，再以4-8℃/min升温至250-290℃，保持4-6min，调制器调制时间为5-10s，调制补偿温度为20-40℃；
所述农药为吡虫啉；未施用吡虫啉和施用吡虫啉草莓样品中差异贡献者的相对含量、香气描述和香气阈值信息如下表所示：
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