CN107238597A - 一种研究木材细胞壁中木质素微观分布规律的方法 - Google Patents

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Abstract

木质纤维素是地球上数量最大的可再生资源，由木质素与纤维素紧密结合产生的抗降解屏障作用是纤维素资源利用的主要障碍，这种与纤维素的紧密结合和对其保护作用，阻碍了纤维素酶与其底物的接触，进而影响纤维素糖转化及酶解效率。精准分析细胞壁中木质素微观分布规律将有利于提高木材中纤维素的利用效率。本发明提出了分析细胞壁中不同区域中木质素结构和分布的方法，得到了更加精细的结构。通过对每一级分离得到的木质素单体及相应切片的局部化学分析，明确木质素逐级溶出规律，最终提出木质素结构在细胞壁不同层区的空间分布模型。

Description

一种研究木材细胞壁中木质素微观分布规律的方法
研究领域
本专利所属领域为木材材性分析领域，具体为木材细胞壁中木质素分布及结构分析。
背景技术
木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素通过复杂的连接方式及大分子结构空间分布共同组成，三者占到总细胞壁含量的90%以上，其中纤维素是由葡萄糖以β-1-4糖苷键聚合而成的线性聚合物，分子内及分子间具有很强的氢键，具有一定的结晶度；半纤维素是由木糖及其他糖基聚合而成的具有一定分支度的复杂聚合物；纤维素和半纤维素经过糖化和发酵转化为乙醇。木质素则是由苯丙烷基聚合而成的大分子，以化学键与半纤维素相连。
提高纤维素的利用效率是木材进一步加工处理的主要问题，但由于木质素包在纤维素和半纤维素的外面，这种与纤维素的紧密结合和对其保护作用，阻碍了所添加纤维素酶与其底物的接触，进而影响纤维素糖转化及酶解效率。
一般地，高效分离木质素，须充分认识木质素在植物细胞壁中的结构及分布规律。细胞壁主要是由胞间层，初生壁和次生壁三个部分组成，不同区域的木质素成分和结构及比例分布也有所不同，胞间层往往主要由G型木质素为主，而S型木质素则在次生壁积累较多。由于不同结构的木质素对于不同介质的响应性不一致，因此，细胞壁中木质素的分布不同和结构差异造成了木质素分离效率上的差异。
由于细胞各部位的木质化先后不同，各部位木质素的分子结构形式也会有所不同，能否解决该问题将影响到木材的进一步高效选择转化，如影响制浆时脱木质素和预处理（物理，化学和生物预处理）中的木素移除顺序和含量。因此，研究细胞壁中木质素分布和成分的不均一性，即不同壁层间的木质素分布浓度规律，化学组成和结构差异，是植物化学领域的一个重要科学问题。选择合适并且可行的方法研究植物细胞壁中不同区域的木质素的分布规律及其化学成分，阐明不同溶剂和试剂对于不同区域木质素的响应机制，为木质素的选择性分离提供理论保障。
目前，研究木材细胞壁中木质素分布规律的方法主要有紫外显微法、溴或汞与X射线能谱仪结合法、荧光显微法、组织化学法、干涉显微镜法和透射电子显微镜法等。这些方法在木质素的分布规律研究方面起到了较大的进展，但是均具有一定的局限性，如精确度低、重现性差等问题。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种得率高、结构破坏小，可以对木材细胞壁不同层区中有效逐级分离木质素结构的方法。该方法包括如下6个步骤:
第一步，截取树干中部远离树芯的木材部分为样本，切取厚度为8μm的切片，把样品包好后，放进索氏抽提器，用甲苯和乙醇2：1的苯醇抽提液进行抽提，90℃连续抽提6-8小时去除灰分蜡质；
第二步：利用96%的二氧六环对苯醇抽提后的木材样本进行再提取，得到木质素1，进行核磁分析，同时对此步切片样品进行拉曼光谱观察；
第三步：用水清洗切片样本，对其用纤维素酶酶解，再用80%的二氧六环对切片残渣进行提取，得到酶解木质素2，再进行核磁分析，并对此步切片残渣进行拉曼光谱观察；
第四步：将上一步的切片残渣进行球磨，再次用纤维素酶彻底酶解，提取酶解木质素3，进行核磁分析；
第五步：分别对木质素1、酶解木质素2和酶解木质素3核磁分析得到相应木质素结构，定位每一步溶出的木质素单体；
第六步：对上述每一步所剩的木材切片进行拉曼光谱分析，观察木质素组分分布及移除情况，还原细胞壁中木质素的结构。
第二及第三步中的二氧六环处理时，最好避光处理，强光影响二氧六环的抽提效率。
第三及第四步中，纤维素酶用的是诺维信Cellucast 1.5LFG纤维素酶，纤维素酶浓度为1g木材样品对应50fpu纤维素酶，最好在Ph=4.8醋酸钠缓冲液中进行，最适温度48~50度，连续处理两次，每次24小时。
第三步纤维素酶酶解时，不要过度震荡以免震散切片样本。
第四步利用行星球磨仪将上一步切片残渣球磨10小时，每磨30分钟休息10分钟以免过热破坏结构，最终球磨成635目约20微米的粉末。再进行纤维素酶彻底酶解，样品在酶解体系中转速约50rmp进行酶解。
本发明提出了分析不同细胞壁区域中木质素结构和分布的方法，得到了更加精细的结构。通过对每一级分离得到的木质素单体及相应切片的局部化学分析，明确木质素逐级溶出规律，最终提出木质素结构在细胞壁不同层区的空间分布模型。
具体实施：
为了对木质素结构在阔叶材木材细胞壁中空间尺度上分布不均一性进行剖析，本研究提出可以从细胞壁不同层区中有效逐级分离木质素单体的溶剂系列及分离方法。在对木质素的提取上，首先采用96%二氧六环提取易溶解的胞间层区域的G型木质素单体，之后采用酶解处理，暴露出更多的富含木质素的组分，再采用 80%二氧六环提取次生壁区域的S型木质素单体，最后球磨所剩残渣，酶解提取得到次生壁中不易提取出的木质素大分子S型及少量H型木质素单体。相对96%的二氧六环提取木质素，80%二氧六环提取率更高，提取的糖也多，梯度提取有助于分析木质素微观分布规律。
通过对每一级分离得到的木质素单体及相应切片的局部化学分析，明确木质素逐级溶出规律，最终提出木质素结构在细胞壁不同层区的空间分布模型。本方法对其他类型木质纤维生物质原料研究具有普适性。
原本木质素分离方法学上的创新：逐级梯度原本木质素分离方法；用来逐级分离细胞壁中的木质素，结合拉曼光谱，研究不同细胞壁区域中木质素的溶解规律和结构特点，能够获得得率高，纯度高的木质素，并且能够全面定量地研究木材中木质素的精细结构，有助于理解木材细胞壁中全部木质素的结构特点。该方法通过对每一级分离得到的木质素单体及相应切片的局部化学分析，明确木质素逐级溶出规律，最终提出木质素结构在细胞壁不同层区的空间分布模型。本方法对其他类型木质纤维生物质原料研究具有普适性。以适合于植物细胞壁中木质素微观分布和结构不均一性研究的客观要求，进而为制浆造纸和生物质预处理技术领域提供相关技术支撑。
木质素的分子结构定量关键技术：利用定量碳谱、定量磷谱及二维异核单量子相关谱核磁共振技术及其降解分析技术，对分离木质素组分进行分子结构定量表征研究。其核心技术是无需对分离的木质素组分进行进一步处理，直接用于定量表征研究。
定量碳谱（13C NMR）：称取140 mg 木质素样品溶解在0.5 mL DMSO-d6 (99.8%D)中，在FT 模式100.6 MHz 下采用反转门控去偶脉冲序列(C13IG)对样品进行信号采集。具体采样条件为：30o 脉冲、采样时间1.4 s、弛豫时间3 s、采样点数64k、采样次数30000 次。DMSO 的化学位移（39.5 ppm）作为较标用。为保证木质素样品中所有原子核都能充分弛豫，向样品中添加20 μl 0.01 M 的三价乙酰丙酮化铬的DMSO-d6 溶液，缩短弛豫时间。样品在布鲁克400 M 超导Bruker核磁共振仪（德国）上25 oC进行测定。碳谱的积分采用芳环内标法进行，先校正基线，再积分。积分的方法是芳环区的102-160 为积分计算内标，以61.5-58.0 ppm 代表木质素的β-O-4 芳基醚键，而58.0-54.0 ppm 为木质素的甲氧基基团。
二维异核单量子相干谱（2D HSQC NMR）：称取60 mg 木质素样品溶解在0.5mLDMSO-d6 中，采用HSQC 谱对应程序（HSQCETGPSI）对样品进行信号采集。1H 及13C 两个维度的谱宽分别为4000Hz 和20000Hz。1H 维度的采样点数为1024，弛豫时间为2.0 s，累加64 次。13C 维度的采样点数为256，碳氢耦合常数为145 Hz。傅立叶变换前，13C 维度的数据点数首先通过冲零处理。数据处理采用布鲁克Topspin 软件进行分析。样品在布鲁克400M 超导核磁共振仪上25 oC或在带有冷冻探头的高场高分辨率800MHz 核磁共振仪上进行测定。数据处理方法为：校正相位，波谱校正，基线校正，积分处理。
定量核磁磷谱技术（31P NMR）
准确称取54.25 mg 环己醇（Sigma 试剂）及25.0 mg 三价乙酰丙酮化铬，用氘代吡啶/氘代氯仿溶液定容至5 mL，得到所需内标溶液。用微型试剂瓶准确称取25.0 mg三价乙酰丙酮化铬，然后加入5 mL 氘代吡啶/氘代氯仿溶液，充分溶解得到所需的松弛剂。准确称取20mg 木质素样品，加入100 μL 内标溶液，然后再加入氘代吡啶/氘代氯仿混合液500 μL，充分溶解后加入100 μL 松弛剂，充分混合后加入100 μL磷化试剂 2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁磷杂戊环（TMDP）进行磷化处理，15 分钟后测定。
木质素样品中不同羟基与磷化试剂2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁磷杂戊环（TMDP）进行磷化衍生化的反应。先对磷谱进行不同官能团的归属，将归属的信号和内标信号进行积分对比，即可获取木质素官能团的定量信息。

Claims (5)

1.一种研究木材细胞壁中木质素微观分布规律的方法，其特征在于包括如下6个步骤：
第一步：截取树干中部远离树芯的木材部分为样本，切取厚度为8μm的切片，把样品包好后，放进索氏抽提器，用甲苯和乙醇2：1的苯醇抽提液进行抽提，90℃连续抽提6-8小时去除灰分蜡质；
第二步：利用96%的二氧六环对苯醇抽提后的木材样本进行再提取，得到木质素1，进行核磁分析，同时对此步切片样品进行拉曼光谱观察；
第三步：用水清洗切片样本，对其用纤维素酶酶解，再用80%的二氧六环对切片残渣进行提取，得到酶解木质素2，再进行核磁分析，并对此步切片残渣进行拉曼光谱观察；
第四步：将上一步的切片残渣进行球磨，再次用纤维素酶彻底酶解，提取酶解木质素3，进行核磁分析；
第五步：分别对木质素1、酶解木质素2和酶解木质素3核磁分析得到相应木质素结构，定位每一步溶出的木质素单体；
第六步：对上述每一步所剩的木材切片进行拉曼光谱分析，观察木质素组分分布及移除情况，还原细胞壁中木质素的结构。
2.如权利要求1所述研究木材细胞壁中木质素微观分布规律的方法，其特征在于第二步和第三步中二氧六环处理在遮光黑暗条件下进行。
3.如权利要求1所述研究木材细胞壁中木质素微观分布规律的方法，其特征在于第三步和第四步中所用的纤维素酶是诺维信Cellucast 1.5LFG纤维素酶，纤维素酶浓度为1g木材样品对应50fpu纤维素酶，在Ph=4.8醋酸钠缓冲液中进行，温度为48~50℃，连续处理两次，每次24小时。
4.如权利要求1所述研究木材细胞壁中木质素微观分布规律的方法，其特征在于第三步纤维素酶酶解时，不要过度震荡。
5.如权利要求1所述研究木材细胞壁中木质素微观分布规律的方法，其特征在于第四步利用行星球磨仪将上一步切片残渣球磨10小时，每磨30分钟休息10分钟以免过热破坏结构，球磨成635目约20微米的粉末，再进行纤维素酶彻底酶解，样品在酶解体系中转速约50rmp进行酶解。
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