CN114518414B

CN114518414B - 鉴定外周血和月经血的应用以及鉴定方法

Info

Publication number: CN114518414B
Application number: CN202011295232.6A
Authority: CN
Inventors: 罗群; 汪福意; 石慧霞; 唐朝; 孟祥超; 章一鸣; 季安全; 朱军; 王明直; 姜懿璇; 戚鲁豫; 侯垠竹
Original assignee: Institute of Chemistry CAS; Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC
Current assignee: Appraisal Center Of Ministry Of Public Security; Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2020-11-18
Filing date: 2020-11-18
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2040-11-18
Also published as: CN114518414A

Abstract

本发明涉及物证鉴定领域，公开了外周血特征小分子和/或月经血特征小分子在外周血和月经血鉴定中的应用以及外周血与月经血的鉴定方法。本发明中，所述外周血特征小分子包括(PB‑1)～(PB‑9)中的一种或多种，所述月经血特征小分子包括(MB‑1)～(MB‑7)中的一种或多种。本发明的应用和鉴定方法可用作血液斑迹组织来源的鉴定，为案件准确定性与快速侦破提供技术支撑和科学依据中的应用。

Description

鉴定外周血和月经血的应用以及鉴定方法

技术领域

本发明涉及物证鉴定领域，具体涉及外周血特征小分子和/或月经血特征小分子在外周血和月经血鉴定中的应用以及外周血与月经血的鉴定方法。

背景技术

对犯罪现场遗留的体液斑组织来源的准确鉴定，有助于案件现场重建，是案件定性及侦破的关键技术。不同体液其组织来源、生物功能及代谢差异，其小分子种类及含量会有显著的差异，因此，体液中的特征小分子也是区分体液的重要依据。如血红素就是区分血液与其他体液的一种特征小分子。

物证鉴定中对外周血与月经血的区分和鉴定难度大，是案件侦破中的技术挑战，现有的方法主要是通过提取RNA后进行RT-PCR，再通过电泳分离检测特异性的产物。但是由于RNA不稳定，上述方法对于样品的要求较高，因此亟待于建立精准的可靠的鉴定新方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的外周血与月经血的区分和鉴定难度大和不准确的问题，提供一种外周血特征小分子和/或月经血特征小分子在外周血和月经血鉴定中的应用以及外周血和月经血的鉴定方法，该应用和鉴定方法可用作血液斑迹组织来源的鉴定，为案件准确定性与快速侦破提供技术支撑和科学依据中的应用。

针对上述技术问题，本发明一方面提供，外周血特征小分子和/或月经血特征小分子在外周血和月经血鉴定中的应用，所述外周血特征小分子包括下述(PB-1)～(PB-9)中的一种或多种，

所述月经血特征小分子包括下述(MB-1)～(MB-7)中的一种或多种，

本发明第二方面提供一种外周血与月经血的鉴定方法，该鉴定方法包括：检测并判断待测样品中是否含有外周血特征小分子或者月经血特征小分子，其中，所述外周血特征小分子包括下述(PB-1)～(PB-9)中的一种或多种，

优选地，所述外周血特征小分子包括(PB-1)～(PB-9)中的2种以上。

优选地，所述月经血特征小分子包括(MB-1)～(MB-7)中的2种以上。

优选地，该鉴定方法包括：

(1)对所述待测样品进行提取，得到检测样品；

(2)利用超高效液相色谱-质谱技术以检测所述检测样品中含有的小分子化合物；

(3)判断所述检测样品中含有的小分子是否为外周血特征小分子或者月经血特征小分子。

优选地，步骤(1)中，利用提取剂提取所述待测样品中的小分子，并离心取上清液作为检测样品。

优选地，步骤(1)中，所述提取剂含有一元醇和水，优选地，所述一元醇为C1-C5一元醇，更优选为甲醇、乙醇、丙醇中的一种或多种。

优选地，步骤(1)中，所述一元醇与水的体积比为2-8：1，优选为3-5：1。

优选地，步骤(1)中，所述提取的条件包括：温度4-40℃，时间5min-12h。

优选地，步骤(1)中，针对载体上的所述待测样品，所述提取剂的用量为载体体积的6-30倍，优选为8-20倍。

优选地，步骤(1)中，针对无载体的所述待测样品，所述提取剂的用量为所述待测样品体积的6-30倍，优选为8-20倍。

优选地，步骤(1)中，提取过程重复2-5次。

优选地，步骤(2)中，所述超高效液相色谱中使用的色谱柱为C18色谱柱。

优选地，步骤(2)中，所述超高效液相色谱的条件包括：A相包括水、乙腈和甲酸，B相包括乙腈和甲酸，柱温为15-45℃，流速为0.1-2mL/min，进样量为2-20μL。

优选地，步骤(2)中，所述质谱的检测参数为：质量范围为50-1,000Da，扫描速度为0.2-2s。

优选地，步骤(2)中，所述质谱分别采用正离子模式和负离子模式进行数据采集。

优选地，步骤(3)中，该方法还包括判断所述待测样品中是否含有血红素。

优选地，步骤(3)中，所述检测样品中含有血红素并且含有外周血特征小分子中的一种或多种时，判断所述待测样品为外周血；所述检测样品中含有血红素并且含有月经血特征小分子中的一种或多种时，判断所述待测样品为月经血。

通过上述技术方案，本发明的鉴定外周血和月经血的应用以及外周血和月经血的鉴定方法利用筛选得到的外周血特征小分子和/或月经血特征小分子作为特征标志物，检测过程操作简便，迅速便捷，鉴定结果准确性高。进而，本发明的鉴定方法利用质谱高分辨、高准确及高灵敏的特点，尤其是与色谱技术相结合，对体内内源性小分子的分离富集与鉴定，及代谢组学分析中表现出独特的优势。

本申请的发明人基于UPLC-MS联用技术，以小分子化合物为分析对象，通过对样品前处理、液相分离富集及高分辨质谱检测，对比分析外周血与月经血中小分子化合物(50-1000Da)质谱数据，成功筛选出了正、负离子两种质谱模式下的外周血与月经血的特征小分子。由此，建立了HPLC-MS联用分析新方法用于血液斑迹组织来源的鉴定，为案件准确定性与快速侦破提供技术支撑和科学依据。

附图说明

图1是UPLC-MS分析技术鉴定血液组织来源的实验流程示意图。

图2是基于LC-MS数据分析软件Progensis QI筛选特征小分子的分析流程图

图3是外周血(PB)、月经血(MB)和月经血载体(MB-ctrl)的UPLC-MS数据PCA分析。

图4A是在各外周血(PB)、月经血(MB)和月经血载体(MB-ctrl)样本中特征小分子的标准归一化丰度对比结果(正离子模式，ESI+)。

图4B是在各外周血(PB)、月经血(MB)和月经血载体(MB-ctrl)样本中特征小分子的标准归一化丰度对比结果(负离子模式，ESI-)。

图5是外周血(PB)和月经血(MB)在ESI(+)中的基峰离子流图(BPI)的比较结果，插入框为血红素的测量值(曲线)与同位素(实心点，C₃₄H₃₂FeN₄O₄)的模拟值进行比较。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明第一方面提供外周血特征小分子和/或月经血特征小分子在外周血和月经血鉴定中的应用，其中，所述外周血特征小分子包括下述(PB-1)～(PB-9)中的一种或多种，

优选地，所述外周血特征小分子包括(PB-1)～(PB-9)中的2种以上，更优选为3种以上，例如2-9种。具体可以为1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或9种。

优选地，所述月经血特征小分子包括(MB-1)～(MB-7)中的2种以上，更优选为3种以上，例如2-7种。具体可以为1种、2种、3种、4种、5种、6种或7种。

由于生物样本的复杂性，可能并不是所有的样品中均含有上述全部9种外周血特征小分子或者全部7种月经血特征小分子，通过本发明的方法，只要血液样品中含有1种以上的外周血特征小分子即可判断该血液样品为外周血样品，只要血液样品中含有1种以上的月经血特征小分子即可判断该血液样品为月经血样品。当待测样品中含有的外周血特征小分子或者月经血特征小分子的种类为2种或者更多种以上时，可以提高判断待测样品为外周血或者月经血的准确度。

根据本发明，当待测样品中含有的外周血特征小分子或者月经血特征小分子的种类为2种或者更多种以上时，可以提高判断待测样品为外周血或者月经血的准确度。

根据本发明，如图1所示，该鉴定方法可以包括：

(1)对所述待测样品进行提取，得到检测样品；

在本发明的鉴定方法中，步骤(1)用于制备检测样品，具体地，通过去除待测样品中的蛋白等大分子杂质得到小分子，以提高后续检测的准确性。

作为一个具体除杂的方法，步骤(1)中，可以利用提取剂提取所述待测样品中的小分子，并离心取上清液作为检测样品。优选地，所述提取剂含有一元醇和水，优选地，所述一元醇为C1-C5的一元醇，具体可以为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或者戊醇等，更优选为甲醇、乙醇、丙醇中的一种或多种。根据本发明的一个优选的实施方式，所述一元醇与水的体积比为2-8：1，更优选为3-5：1，例如4：1。

在由不同介质制备样品的情况下，针对载体(例如卫生巾)上的所述待测样品，所述提取剂的用量为载体体积的6-30倍，优选为8-20倍；针对无载体的所述待测样品，所述提取剂的用量为所述待测样品体积的6-30倍，优选为8-20倍。为了保证提取的效果，优选地，提取过程重复2-5次，例如为3-4次。

为了提高除杂的效果，优选地，所述提取的条件包括：温度4-40℃，时间5min-12h；更优选地，所述提取的条件包括：温度5-25℃，时间10-120min。另外，所述离心的条件包括：5000rpm以上，时间为20min以上；优选地，8000-15000rpm，时间为30-60min。

通过上述方法进行提取后，可以得到适用于步骤(2)的检测样品。

在本发明的鉴定方法中，步骤(2)中利用超高效液相色谱(UPLC)-质谱(MS)联用技术对检测样品中的小分子化合物进行检测。

具体地，UPLC和MS中使用的具体条件没有特别的限定，只要能够分析得到检测样品中的小分子化合物即可。在此，小分子化合物是指分子量为50-1,000Da的化合物。

优选的情况下，所述超高效液相色谱中使用的色谱柱为与100％水性流动相兼容的色谱柱，优选可以使用C18色谱柱，例如ACQUITY UPLC HSS T3 Column(2.1*100mm，1.8μm)，这是一种与100％水性流动相兼容的C18色谱柱，专用于保留和分离极性水溶性好的有机小分子。

优选的情况下，所述超高效液相色谱的条件包括：A相可以包括水、乙腈和甲酸，例如以体积比计可以为98％水+2％乙腈+0.1％甲酸(FA)，B相可以包括乙腈和甲酸，例如以体积比计可以为100％乙腈+0.1％甲酸(FA)；柱温为15-45℃，优选25-35℃，例如30℃；流速可以为0.1-2mL/min，进样量为2-20μL，优选为3-8μL。

优选的情况下，所述质谱分别采用正离子模式(positive electrosprayionization mode，ESI+)和负离子模式(Negative electrospray ionization mode，ESI-)进行数据采集。优选地，所述质谱的检测参数包括：质量范围为50-1,000Da，扫描速度为0.2-2s，优选为0.3-1.0s。优选地，使用1-5ng/μL的Leucine encephalin(亮氨酸-脑啡肽)溶液(ESI+：556.2771Da，ESI-：554.2615Da)用于lockspray实时校准。

通过上述超高效液相色谱-质谱技术，可以得到检测样品中的小分子化合物的保留时间(RT)和质荷比(m/z)。通过上述保留时间和质荷比的测定结果，分析判断具体小分子的结构，例如可以通过chemspider和/或HMDB_structures等数据库查询判断小分子的具体结构。

根据本发明，优选该方法还包括判断所述待测样品中是否含有血红素。具体地，可以通过判断检测样品中的小分子化合物是否包括血红素进行。

根据本发明，在步骤(3)中，通过步骤(2)的检测结果得到鉴定结果。具体地，所述检测样品中含有血红素并且含有外周血特征小分子中的一种或多种时，判断所述待测样品为外周血；所述检测样品中含有血红素并且含有月经血特征小分子中的一种或多种时，判断所述待测样品为月经血。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，使用的质谱仪为Waters Q-TOF ESI-MS质谱仪；HPLC中使用ACQUITY UPLC HSS T3Column(2.1*100mm，1.8μm)色谱柱，购自Waters公司；超滤管Midi(3KDa)，购自Merck Millipore；三次去离子水经Millpore系统制备。

实施例1

本实施例用于说明本发明中利用无载体的待测样品制备检测样品的方法。

外周血样品100μL与1000μL的甲醇：三次水(体积比为4：1)混合溶剂(以下称为提取液)混合后静置10min，样品分别在在15mL 3K超滤管12000rpm下4℃离心40min，反复操作3次，分次共加入的提取液约4mL。合并滤液，真空离心浓缩至干，再加入提取液100μL复溶，离心取上清液作为检测样品用于检测。

实施例2

本实施例用于说明本发明中利用载体上的待测样品(卫生巾上的月经血样品)制备检测样品的方法。

对于在卫生巾上的月经血液斑迹，取大小5*20mm通过甲醇：三次水(体积比为4：1)混合溶剂(以下称为提取液)以20倍体积的浸润有斑迹的载体1h后，在15mL 3K超滤管12000rpm下4℃离心40min，反复操作3次，分3次加入提取液共约4mL，合并滤液，真空离心浓缩至干，再加提取液100μL复溶，离心取上清液作为检测样品用于检测。

实施例3

本实施例用于说明本发明中血液实验样品设置方案

8份来源不同人的外周血(6女2男)，9份来源不同人的月经血及其相应的卫生巾载体，其中外周血和月经血来源于同一志愿者的情况有6组。实验样品分别是外周血组(PB，8份样品)、月经血组(MB，9份样品)、以及月经血载体对照组(MB-Ctrl，9份样品)，并设置溶剂空白对照(仅提取液)以排除检测中的系统误差。

实施例4

本实施例用于说明本发明中样品UPLC-MS检测方案。

在所有实验样本(外周血、月经血、月经血载体)中各取10μL充分混合均匀，制成质量控制样品(Quality control sample，QC)样品运行前，首先运行QC样品的4个进样梯度检测(3、5、7、9μL)，用于QC校准(QC Calibration，以下简称QC cali)，通过比较选择合适的QC进样量5μL，以保证UPLC-MS系统的状态平衡。

随后每隔5-6个样品运行QC样品1次，共进行5次，以为监控UPLC-QTof-MS系统的稳定性，QC样品前后均运行一个溶剂空白对照，以减少对QC样品与实验样品之间交叉影响。

实施例5

本实施例用于说明本发明中利用UPLC-MS对血液样品的检测条件。

UPLC-MS分析所用的仪器是ACQUITY Ultra Performanc Liquid Chromatogaphy(Waters)和XEVO-G2 QTof Mass Spectrometer(Waters)高分辨液质联用仪(UPLC-MS)。通过优化，超高效液相色谱检测条件如下。

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 Column(2.1*100mm，1.8μm)

流动相：A相以体积比计为98％水+2％乙腈+0.1％甲酸(FA)；B相以体积比计为100％乙腈+0.1％甲酸(FA)

柱温：30℃

流速：0.2mL/min

进样量：5μL

质谱分别采用正离子模式(ESI+)和负离子模式(ESI-)进行数据采集，质谱检测参数为：质量范围为50-1,000Da，2ng/μL的Leucine encephalin(亮氨酸脑啡肽)溶液(ESI+:556.2771Da,ESI-:554.2615Da)用于lockspray实时校准，扫描速度设置为0.5s。

实施例6

本实施例用于说明本发明中对UPLC-MS数据处理与分析的方案。

对实施例5中UPLC-MS质谱数据的分析，结合特征小分子筛选流程进行特征小分子的筛选，过程如图2所示。

UPLC-QTof-MS原始数据利用Waters公司提供的Waters Masslynx V4.1和Progenesis QI V2.0进行处理。从处理后的MS数据中提取信噪比(S/N)>5的峰值，利用m/z、相对强度信息，形成对齐矩阵。再经过去卷积、峰提取、鉴定marker(使用的数据库为chemspider及HMDB_structures_201807)。

通过Progenesis QI进行数据分析，分析流程为如下：导入所有样品+高中低梯度浓度QC正离子数据；系统自动在QC中选择中浓度进行数据对齐；选峰加合正离子模式M+non，M+H，2M+H，或者峰加合负离子模式M-H₂O-H，M-H，M+Cl，M+FA-H，2M-H；将外周血组与月经血组和月经血载体对照组进行组间差异分析，将月经血组与外周血组和月经血载体对照组进行组间差异分析，利用QC cali组判断信号是否来源于样品；在上述组间差异分析的结果中进行筛选；筛选流程：highest mean，max fold change＝infinity。

正离子模式：通过组间差异分析检索到1274个已知结构的化合物。

(1)在QC cali组中导出数据筛选浓度线性拟合≥0.7，且为正相关。除去含空白的值，共有489个分子。

(2)筛选流程：highest mean为MB，max fold change为大于1000倍；highest mean为PB，max fold change为大于30倍.

正离子模式的筛选结果：在正离子模式下得到12个候选月经血特征小分子，得到4个候选外周血特征小分子，结果见表1。

负离子模式：通过组间差异分析检索到1536个已知结构的化合物。

(1)在QC cali组中导出数据筛选浓度线性拟合大于0.7，且为正相关。除去含空白的值，共有792个分子。

(2)筛选流程：highest mean为MB，max fold change为大于1000倍；highest mean为PB，max fold change为大于20倍。

负离子模式的筛选结果：在负离子模式下得到7个候选月经血特征小分子，得到4个候选外周血特征小分子，结果见表1。

如下表1示出了候选外周血特征小分子和候选月经血特征小分子的UPLC-MS的保留时间与质荷比。

表1

实施例7

本实施例用于说明本发明中对UPLC-MS的外周血(PB)与月经血(MB)及月经血的载体(MB-Ctrl)数据的主成分分析(PCA)。

将实施例5中UPLC-MS的结果通过Progenesis QI进行主成分分析，得到图3所示的分析结果。图3中(a)和(b)为正离子模式，(c)和(d)为负离子模式。

从图3的主成分分析PCA统计分析中，正、负离子模式下的外周血(PB)与月经血(MB)及月经血的载体(MB-Ctrl)可以很好的区分。具体地，正离子模式下PC1(占比为26.06％)可以对月经血(MB)及月经血的载体(MB-Ctrl)有很好的区分；PC2(占比为20.69％)可以对月经血(MB)及外周血(PB)有较好好的区分。负离子模式下PC1(占比为27.76％)可以对月经血(MB)及月经血的载体(MB-Ctrl)有很好的区分，PC3(占比为12.95％)可以对月经血(MB)及外周血(PB)有很好的区分。

通过上述主成分分析，得到对比主成分分析贡献值大的候选小分子，具体见图3中各图示出的小分子。

实施例8

将上述对比主成分分析贡献值大的候选小分子与实施例6筛选得到的候选小分子汇总，结合标准归一化丰度分布进行验证和筛选，剔除结果中归一化丰度分布中相对偏差大的候选小分子，筛选结果如表2所示。上述筛选得到的各小分子在各个样品(PB、MB和MB-Ctrl)的标准归一化丰度对比如图4A和图4B所示。

表2

利用表2的结果结合代谢组学数据库(HMDB)进行性能检索，最后筛选确定的外周血特征小分子为7个(见表3)，月经血特征小分子为4个(见表4)。表3示出外周血特征小分子的结构及性质，表4示出月经血特征小分子结构及性质。

表3

表4

测试例1

本测试例用于测试本发明的样品制备方法。

图5示出了外周血(PB)和月经血(MB)样品在ESI(+)中的基峰离子流图(BPI)的比较结果；插入框为血红素的测量值(曲线)与模拟值(实心点，C₃₄H₃₂FeN₄O₄)的对比。图5中Heme表示血红素。

由图5可知，通过本发明的实施例1和2的方法能够制备得到含有血红素和所需特征小分子的检测样品。

测试例2

本测试例用于说明本发明的鉴定方法。

取外周血和月经血样品各10份，按照实施例1或2的方法相应地制备检测样品，再按照实施例5的方法进行UPLC-MS分析，判断样品中是否含有血红素，并将检测得到的小分子以及本申请的外周血特征小分子与月经血特征小分子进行对比。当检测样品中含有血红素并且含有外周血特征小分子中的一种或多种时，判断该待测样品为外周血；当检测样品中含有血红素并且含有月经血特征小分子中的一种或多种时，判断该待测样品为月经血。

鉴定的结果如下表5所示，表5中“○”表示含有相应的成分，“×”表示不含相应的成分。

表5

将表5中的鉴定结果与血液样品来源进行比对，可得测定的准确度为100％。

通过上述结果可以看出，采用本发明外周血特征小分子和月经血特征小分子对于血液样品具有很好的区分效果，能够对外周血与月经血进行鉴别，为相关的案件侦破提供技术支持。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims

1.外周血特征小分子和月经血特征小分子在外周血和月经血鉴定中的应用，其特征在于，

所述外周血特征小分子包括下述PB-1、PB-2、PB-3、PB-7、PB-8、PB-9中的一种或多种，

所述月经血特征小分子包括下述MB-1、MB-2、MB-7中的一种或多种，

2.一种外周血与月经血的鉴定方法，其特征在于，该鉴定方法包括：检测并判断待测样品中是否含有外周血特征小分子或者月经血特征小分子，

其中，所述外周血特征小分子包括下述PB-1、PB-2、PB-3、PB-7、PB-8、PB-9中的一种或多种，

其中，该鉴定方法包括：

(1)利用提取剂提取所述待测样品中的小分子，并离心取上清液作为检测样品；

(3)判断所述检测样品中含有的小分子是否为外周血特征小分子或者月经血特征小分子；

其中，步骤(1)中，所述提取剂含有C1-C5一元醇和水；

步骤(2)中，所述超高效液相色谱的条件包括：使用的色谱柱为C18色谱柱，A相包括水、乙腈和甲酸，B相包括乙腈和甲酸，所述质谱的检测参数为：质量范围为50-1,000Da，扫描速度为0.2-2s。

3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其中，所述外周血特征小分子包括PB-1、PB-2、PB-3、PB-7、PB-8、PB-9中的2种以上。

4.根据权利要求2所述的鉴定方法，其中，所述月经血特征小分子包括MB-1、MB-2、MB-7中的2种以上。

5.根据权利要求2所述的鉴定方法，其中，步骤(1)中，所述一元醇为甲醇、乙醇、丙醇中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的鉴定方法，其中，所述一元醇与水的体积比为2-8：1。

7.根据权利要求6所述的鉴定方法，其中，所述一元醇与水的体积比为3-5：1。

8.根据权利要求2所述的鉴定方法，其中，所述提取的条件包括：温度4-40℃，时间5min-12h。

9.根据权利要求2所述的鉴定方法，其中，步骤(1)中，针对载体上的所述待测样品，所述提取剂的用量为载体体积的6-30倍。

10.根据权利要求9所述的鉴定方法，其中，步骤(1)中，针对载体上的所述待测样品，所述提取剂的用量为载体体积的8-20倍。

11.根据权利要求2所述的鉴定方法，其中，步骤(1)中，针对无载体的所述待测样品，所述提取剂的用量为所述待测样品体积的6-30倍。

12.根据权利要求11所述的鉴定方法，其中，步骤(1)中，针对无载体的所述待测样品，所述提取剂的用量为所述待测样品体积的8-20倍。

13.根据权利要求2所述的鉴定方法，其中，提取过程重复2-5次。

14.根据权利要求2-13中任意一项所述的鉴定方法，其中，所述超高效液相色谱的条件包括：柱温为15-45℃，流速为0.1-2mL/min，进样量为2-20μL。

15.根据权利要求2-13中任意一项所述的鉴定方法，其中，该方法还包括判断所述待测样品中是否含有血红素。

16.根据权利要求15所述的鉴定方法，其中，步骤(3)中，所述检测样品中含有血红素并且含有外周血特征小分子中的一种或多种时，判断所述待测样品为外周血；所述检测样品中含有血红素并且含有月经血特征小分子中的一种或多种时，判断所述待测样品为月经血。