PT1192185E - Sinergismo de agonista do receptor de apo-2l e cpt-11 - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Sinergismo de agonista do receptor de Apo-2L e CPT-11"

CAMPO DO INVENTO 0 presente invento refere-se de um modo geral a métodos para induzir apoptose em células de mamífero. Em particular, refere-se à utilização de agonistas do receptor de Apo-2L e de CPT-11 para induzir sinergicamente apoptose em células de mamífero. Os vários agonistas do receptor de Apo-2L contemplados pelo presente invento incluem o ligando conhecido como ligando Apo-2 ou TRAIL, bem como anticorpos agonistas dirigidos a um ou mais receptores de Apo-2L.

ANTECEDENTES DO INVENTO Várias moléculas, tais como o factor de necrose tumoral-a ("TNF-a"), o factor de necrose tumoral-β ("TNF-β" ou "linfotoxina-α"), a linfotoxina-β ("LT-β"), o ligando CD30, o ligando CD27, o ligando CD40, o ligando OX-40, o ligando 4-1BB, o ligando Apo-1 (também referido como ligando Fas ou ligando CD95), o ligando Apo-2 (também referido como TRAIL), o ligando APO-3 (também referido como TWEAK), a osteoprotegerina (OPG), APRIL, o ligando RANK (também referido como TRANCE) e TALL-1 (também referido como BlyS, BAFF ou THANK), foram identificadas como membros da família de citoquinas do factor de necrose tumoral (TNF") (Ver, p. ex., Gruss e Dower, Blood 85: 3378-3404, 1995; Pitti et al., J. Biol. Chem. 271: 12687-12690, 1996; Wiley et al., Immunity 3: 673-682, 1995; Browning et al., Cell 72: 847-856, 1993; Armitage et al., Nature 357: 80-82, 1992, WO 97/01633 publicado a 16 de Janeiro de 1997; WO 97/25428 publicado a 17 de Julho de 1997; Marsters et al., Curr. Biol. 8: 525-528, 1998; Simonet et al., Cell 89: 309-319, 1997; Chicheportiche et al., Biol. Chem. 272: 32401-32410, 1997; Hahne et al., J. Exp. Med. 188 : 1185-1190, 1998; WO 98/28426 publicado a 2 de Julho de 1998; WO 98/46751 publicado a 22 de Outubro de 1998; WO 98/18921 publicado a 7 de Maio de 1998; Moore et al., Science 285: 260-263, 1999; Shu et al., J. Leukocyte Biol. 65: 680, 1999; Schneider et al., J. Exp. Med. 189: 1747-1756, 1999; Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem. 274: 15978-15981, 2 ΕΡ 1 192 185 /PT 1999) . Entre estas moléculas, o TNF-a, TNF-β, ligando CD30, ligando 4-1BB, ligando Apo-1, ligando Apo-2 (Apo-2L/TRAIL) e ligando APO-3 (TWEAK) foram relatados estarem envolvidos em morte celular apoptótica. Foi relatado que tanto o TNF-α como o TNF-β induzem morte apoptótica em células tumorais susceptíveis (Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 1881, 1986; Dealtry et al., Eur. J. Immunol. 17: 689, 1987).

Recentemente, moléculas adicionais que se crê serem membros da família de citoquinas do TNF foram identificadas e relatadas como estando envolvidas em apoptose. Por exemplo, em Pitti et al., J. Biol. Chem. 271: 12687-12690, 1996, está descrita uma molécula referida como ligando Apo-2. Ver também, WO 97/25428 publicado a 17 de Julho de 1997. O ligando inteiro Apo-2 humano está relatado como sendo um polipéptido de 281 aminoácidos que induz apoptose em várias células de mamífero. Outros investigadores descreveram polipéptidos aparentados referidos como TRAIL (Wiley et al., Iirmunity 3: 673-682, 1995;; WO 97/01633 publicado a 16 de Janeiro de 1997) e AGP-1 (WO 97/46686 publicado a 11 de Dezembro de 1997). Várias moléculas da familia do TNF têm também um papel ou papéis contemplados na função ou desenvolvimento do sistema imunitário (Gruss et al., Blood 85: 3378, 1995). Zheng et al. relataram que o TNF-α está envolvido em apoptose após estimulação de células T positivas para CD8 (Zheng et al., Nature 377: 348-351, 1995). Outros investigadores relataram que o ligando CD30 pode estar envolvido na supressão de células T auto-reactivas no timo (Amakawa et al., "Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death", Resumo N.° 10, 1995). O ligando CD40 activa muitas funções nas células B, incluindo proliferação, secreção de imunoglobulinas e sobrevivência (Renshaw et al., J. Exp. Med. 180: 1889, 1994) . Foi relatado que outra citoquina da família do TNF recentemente identificada, TALL-1 (BlyS), sob certas condições, induz proliferação de células B e secreção de imunoglobulinas (Moore et al., supra; Schneider et al., supra; Mackay et al., J. Exp. Med. 190: 1697, 1999).

Mutações nos genes do receptor de Fas/Apo-1 ou do ligando de ratinho (designados Ipr e gld, respectivamente) foram associadas a alguns distúrbios auto-imunes, indicando que o 3

ΕΡ 1 192 185 /PT ligando Apo-1 pode ter um papel na regulação da supressão clonal de linfócitos auto-reactivos na periferia (Krammer et al.r Curr. Op. Immunol. 6: 279-289, 1994; Nagata et al.,

Science 267: 1449-1456, 1995). Está também relatado que o ligando Apo-1 induz apoptose pós-estimulação em linfócitos T positivos para CD4 e em linfócitos B, e pode estar envolvido na eliminação de linfócitos activados quando a sua função já não é necessária (Krammer et al., supra; Nagata et al., supra). Foi relatado que anticorpos monoclonais de ratinho agonistas que se ligam especificamente ao receptor de Apo-1 exibem actividade de morte celular que é comparável ou semelhante à de TNF-cx (Yonehara et al., J. Exp. Med. 169: 1747-1756, 1989) .

Crê-se que a indução de várias respostas celulares mediadas por tais citoquinas da família do TNF seja iniciada pela sua ligação a receptores celulares específicos. Anteriormente, foram identificados dois receptores de TNF distintos de aproximadamente 55 kDa (TNFR1) e 75 kDa (TNFR2) (Hohman et al., J. Biol. Chem. 264: 14927-14934, 1989;

Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 3127-3131, 1990; EP 417563, publicada a 20 de Março de 1991; Loetscher et al., Cell 61: 351, 1990; Schall et al., Cell 61: 361, 1990; Smith et al., Science 248 : 1019-1023, 1990; Lewis et al.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 2830-2834, 1991; Goodwin et al., Mol. Cell. Biol. 11: 3020-3026, 1991) . Verificou-se que esses TNFR partilham a estrutura típica dos receptores de superfície celular incluindo as regiões extracelulares, transmembranares e intracelulares. As porções extracelulares de ambos os receptores foram verificadas naturalmente também como proteínas solúveis de ligação a TNF (Nophar, Y. et al., EMBO J. 9: 3269, 1990; e Kohno, T. et al., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 87: 8331, 1990; Hale et al., J. Cell. Biochem. Supplement, 15F, 1991, pág. 113, P424). A porção extracelular dos TNFR (TNFR1 e TNFR2) contém um padrão repetitivo da sequência de aminoácidos de quatro domínios ricos em cisteína (CDR) designados 1 a 4, a começar no terminal NH2 (Schall et al., supra; Loetscher et al., supra; Smith et al., supra; Nophar et al., supra; Kohno et al., supra; Banner et al., Cell 73: 431-435, 1993). Um padrão repetitivo semelhante de CDR existe em várias outras proteínas 4 ΕΡ 1 192 185 /PT da superfície celular, incluindo o receptor do factor de crescimento dos nervos p75 (NGFR) (Johnson et al., Cell 47: 545, 1986; Radeke et al., Nature 325: 593, 1987), o antigénio de células B CD40 (Stamenkovic et al., EMBO J. 8: 1403, 1989), o antigénio de células T 0X40 (Mallet et al., EMBO J. 9: 1063, 1990) e o antigénio Fas (Yonehara et al., supra e Itoh et al., Cell 66: 233-243, 1991). As CDR encontram-se também nas proteínas T2 semelhantes a TNFR solúvel (sTNFR) dos poxvírus Shope e mixoma (Upton et al., Virology 160: 20-29, 1987; Smith et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 176: 335, 1991; Upton et al., Virology 184: 370, 1991). O alinhamento óptimo destas sequências indica que as posições dos resíduos de cisteína são bem conservadas. Estes receptores são por vezes colectivamente referidos como membros da superfamília dos receptores de TNF/NGF.

Os ligandos da família do TNF identificados até à data, com a excepção da linfotoxina-α, são proteínas transmembranares de tipo II, cujo terminal C é extracelular. Em contraste, a maioria dos receptores da família do receptor de TNF (TNFR) identificados até à data são proteínas transmembranares de tipo I. No entanto, em ambas as famílias de ligandos TNF e receptores de TNF, a homologia identificada entre os membros da família verificou-se principalmente no domínio extracelular ("ECD"). Várias citoquinas da família do TNF, incluindo TNF-α, ligando Apo-1 e ligando CD40, são clivadas proteoliticamente na superfície celular; a proteína resultante em cada caso forma tipicamente uma molécula homotrimérica que funciona como citoquina solúvel. As proteínas da família do receptor de TNF são também habitualmente clivadas proteoliticamente para libertar ECD do receptor solúveis que podem funcionar como inibidores das citoquinas cognatas.

Mais recentemente, foram identificados outros membros da família do TNFR. Em Bulow et al., Science 278: 138-141, 1997, os investigadores descrevem um receptor da membrana plasmática referido como Activador Transmembranar e CAML-Interactuante ou "TACI". Foi relatado que o receptor TACI contém um motivo rico em cisteína característico da família do TNFR. Num ensaio in vitro, a ligação cruzada de TACI à superfície de células Jurkat transfectadas com anticorpos específicos de TACI levou 5

ΕΡ 1 192 185 /PT à activação de NF-KB (ver também WO 98/39361 publicado a 18 de Setembro de 1998) .

Laabi et ai., EMBO J. 11: 3897-3904, 1992, relataram a identificação de um novo gene designado "BCM" cuja expressão se verificou coincidir com a maturação terminal das células B. O enquadramento de leitura aberto do ADNc normal de BCM previa um polipéptido de 184 aminoácidos de comprimento com um único domínio transmembranar. Estes investigadores designaram posteriormente este gene "BCMA" (Laabi et al., Nucleic Acids Res. 22: 1147-1154, 1994). Foi relatado que a expressão do ARNm de BCMA estava ausente em linhas de células B malignas humanas o que representa o estádio de linfócito pró-B e, assim, crê-se estar ligada ao estádio de diferenciação dos linfócitos (Gras et ai., Int. Immunology 7: 1093-1106, 1995). Em Madry et al., Int. Immunology 10: 1693-1702, 1998, foi descrita a clonagem do ADNc de BCMA de murídeo. Está relatado que o ADNc de BCMA de murídeo codifica um polipéptido de 185 aminoácidos de comprimento possuindo uma identidade de 62% com o polipéptido BCMA humano. O alinhamento das sequências proteicas de BCMA de murídeo e humana revelou um motivo conservado de seis cisteínas na região N-terminal, sugerindo que a proteína BCMA pertence à superfamília do TNFR (Madry et al., supra).

Em Marsters et ai., Curr. Biol. 6: 750, 1996, os investigadores descrevem um polipéptido humano de sequência nativa inteira, designado Apo-3, que exibe semelhanças com a família do TNFR nas suas repetições extracelulares ricas em cisteína e se parece com TNFR1 e CD95 por conter uma sequência do domínio de morte citoplasmático (ver também Marsters et al., Curr. Biol. 6: 1669, 1996) . Apo-3 foi também referido por outros investigadores como DR3, wsl-1, TRAMP e LARD (Chinnaiyan et al., Science 274: 990, 1996; Kitson et al.,

Nature 384: 372, 1996; Bodmer et al., Immunity 6 : 79, 1997;

Screaton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 94: 4615-4619, 1997).

Pan et al. divulgaram outro membro da família do receptor de TNF referido como "DR4" (Pan et al., Science 276: 111-113, 1997; ver também W0 98/32856 publicado a 30 de Julho de 1998). Foi relatado que DR4 contém um domínio de morte citoplasmático capaz de envolver o aparelho de suicídio celular. Pan et al. 6

ΕΡ 1 192 185 /PT divulgam que se crê que DR4 seja um receptor para o ligando conhecido como Apo2L/TRAIL.

Em Sheridan et al., Science 277: 818-821, 1997 e Pan et al., Science 277: 815-818, 1997, é descrita outra molécula que se crê ser um receptor para AP02L/TRAIL (ver também, WO 98/51793 publicado a 19 de Novembro de 1998; WO 98/41629 publicado a 24 de Setembro de 1998). Essa molécula é referida como DR5 (foi também alternativamente referida como Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAP08, TRICK2 ou KILLER (Screaton et al., Curr. Biol. 7: 693-696, 1997; Walczak et al., EMBO J. 16: 5386-5387, 1997; Wu et al., Nature Genetics 17: 141-143, 1997; WO 98/35986 publicado a 20 de Agosto de 1998; EP 870827 publicada a 14 de Outubro de 1998; WO 98/4664 publicado a 22 de Outubro de 1998; WO 99/02653 publicado a 21 Janeiro de 1999; WO 99/09165 publicado a 25 de Fevereiro de 1999; WO 99/1179 publicado a 11 Março de 1999) . Está relatado que, tal como DR4, DR5 contém um domínio de morte citoplasmático e é capaz de sinalizar apoptose. A estrutura cristalina do complexo formado entre Apo-2L/TRAIL e DR5 está descrita em Hymowitz et al., Molecular Cell 4: 563-571, 1999.

Ainda outro receptor contendo um domínio de morte, DR6, foi recentemente identificado (Pan et al., FEBS Letters 431: 351-356, 1998). Para além de conter quatro putativos domínios extracelulares ricos em cisteína e um domínio de morte citoplasmático, crê-se que DR6 contenha uma putativa sequência de fecho de leucina que se sobrepõe a um motivo rico em prolina na região citoplasmática. 0 motivo rico em prolina parece-se com sequências que se ligam a domínios src-homologia-3, que se verificam em muitas moléculas intracelulares de transdução de sinal.

Outro grupo de receptores recentemente identificados são referidos como "receptores de engodo" ("decoy receptors"), que se crê funcionarem como inibidores, em vez de transdutores de sinalização. Este grupo inclui DCR1 (também referido como TRID, LIT ou TRAIL-R3) (Pan et al., Science 276: 111-113, 1997; Sheridan et al., Science 277: 818-821, 1997; McFarlane et al., J. Biol. Chem. 272: 25417-25420, 1997; Schneider et al., FEBS Letters 416: 329-334, 1997; Degli-Esposti et al., J. Exp. Med. 186: 1165-1170, 1997; e Mongkolsapaya et al., J. 7

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Immunol. 160: 3-6, 1998) e DCR2 (também designado TRUNDD ou TRAIL-R4) (Marsters et al., Curr. Biol. 7: 1003-1006, 1997;

Pan et al., FEBS Letters 424: 41-45, 1998; Degli-Esposti et al., Immunity 1: 813-820, 1997), ambas moléculas da superfície celular, bem como OPG (Simonet et al., supra; Emery et al., infra) e DCR3 (Pitti et ai., Nature 396: 699-703, 1998), ambas as quais são proteínas excretadas e solúveis.

Membros adicionais recentemente identificados da família do TNFR incluem CARI, HVEM, GITR, ZTNFR-5, NTR-1, e TNFL1 (Brojatsch et al., Cell 87: 845-855, 1996; Montgomery et al.,

Cell 87: 427-436, 1996; Marsters et <3-Z ♦ r J· Biol. Chem. 272 : 14029-14032, 1997; Nocentini et al. , Proc. Natl. Acad. Sei . USA 9 4: 6216-6221, 1997; Emery et 3.1 ♦ r J · Biol. Chem. 273 : 14363-14367, 1998; WO 99/04001 publicado a 28 de Janeiro de 1999; WO 99/07738 publicado a 18 de Fevereiro de 1999; WO 99/3398 publicado a 8 de Julho de 1999) .

Tal como recentemente revisto por Tewari et al., TNFR1, TNFR2 e CD40 modulam a expressão de citoquinas pró-inflamatórias e co-estimulantes, receptores de citoquinas e moléculas de adesão celular através da activação do factor de transcrição, NF-KB (Tewari et al., Curr. Op. Genet. Develop. 6: 39-44, 1996) . NF-KB é o protótipo de uma família de factores de transcrição diméricos cujas subunidades contêm regiões Rei conservadas (Verma et al., Genes Develop. 9: 2723-2735, 1996; Baldwin, Ann. Rev. Immunol. 14: 649-681, 1996). Na sua forma latente NF-KB está complexado com membros da família de inibidores IKB; após inactivação do IKB em resposta a certos estímulos, o NF-KB libertado desloca-se para o núcleo onde se liga a sequências de ADN específicas e activa a transcrição de genes. Tal como descrito acima, os membros de TNFR identificados até à data ou incluem ou não possuem uma região de domínio de morte intracelular. Algumas moléculas de TNFR sem um domínio de morte, tal como TNFR2, CD40, HVEM e GITR são capazes de modular a actividade de NF-KB (ver, p. ex., Lotz et al., J. Leukocyte Biol. 60: 1-7, 1996).

Para uma revisão da família de citoquinas TNF e seus receptores, ver Ashkenazi e Dixit, Science 281: 1305-1308, 1998; Golstein, Curr. Biol. 7: 750-753, 1997; Gruss e Dower, supra, e Nagata, Cell 88: 355-365, 1997. 8

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SUMÁRIO DO INVENTO

Os requerentes verificaram surpreendentemente que o ligando Apo-2 ou outros agonistas do receptor de Apo-2L e CPT-11 podem actuar sinergicamente para induzir apoptose em células de mamífero, particularmente em células cancerosas de mamífero. 0 presente invento proporciona vários métodos para a utilização do ligando Apo-2 e CPT-11 para induzir apoptose em células de mamífero. Por exemplo, o presente invento proporciona um método para induzir apoptose compreendendo a exposição de uma célula cancerosa de mamífero (de preferência uma célula de cancro do cólon ou colorrectal) em cultura celular ou ex vivo, ao ligando Apo-2 e a CPT-11 numa quantidade eficaz para induzir sinergicamente apoptose. 0 presente invento inclui ainda medicamentos para tratamento de um mamífero a sofrer de cancro compreendendo uma quantidade eficaz de ligando Apo-2 e CPT-11, tal como aqui divulgado. 0 anticorpo agonista anti-receptor do ligando Apo-2 pode imitar a actividade apoptótica do ligando Apo-2. Numa concretização preferida, o anticorpo agonista compreenderá um anticorpo monoclonal contra o receptor DR4 ou DR5. 0 presente invento proporciona também composições que compreendem o ligando Apo-2 ou anticorpo agonista do receptor de Apo-2L e/ou CPT-11. Opcionalmente, as composições do presente invento incluirão transportadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. De preferência, as composições incluirão o ligando Apo-2 ou anticorpo agonista e/ou CPT-11 numa quantidade que seja eficaz para induzir sinergicamente apoptose em células de mamífero. 0 presente invento proporciona também artigos de fabrico e estojos que incluem o ligando Apo-2 ou o anticorpo agonista do receptor de Apo-2L e/ou CPT-11.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra o efeito de Apo-2L (triângulos vazios), CPT-11 (quadrados vazios), Apo-2L mais CPT-11 (triângulos a cheio) ou só veículo (círculos vazios) no crescimento de 9 ΕΡ 1 192 185 /PT células de carcinoma do cólon humano injectadas subcutaneamente em ratinhos nus atimicos. A Figura 2 mostra o efeito de Apo-2L (60 mg/kg) (guadrados vazios), CPT-11 (80 mg/kg) (triângulos a cheio), Apo-2L ("APO2L.0") mais CPT-11 (guadrados a cheio), mAb anti-DR4 4H6 (triângulos vazios), mAb anti-DR4 mais CPT-11 (triângulos a cheio) ou só veiculo (círculos a cheio) no crescimento de células de carcinoma do cólon humano injectadas subcutaneamente em ratinhos nus atimicos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO I. Definições

Os termos "apoptose" e "actividade apoptótica" são utilizados num sentido amplo e referem-se à forma ordenada ou controlada de morte celular em mamíferos que é tipicamente acompanhada de uma ou mais alterações celulares características, incluindo condensação do citoplasma, perda das microvilosidades da membrana plasmática, segmentação do núcleo, degradação do ADN cromossómico ou perda da função mitocondrial. Esta actividade pode ser determinada e medida utilizando técnicas conhecidas na arte, por exemplo, através de ensaios da viabilidade celular, análise de FACS ou electroforese de ADN, e mais especificamente através da ligação de anexina V, fragmentação de ADN e encolhimento celular, dilação do retículo endoplasmático, fragmentação celular e/ou formação de vesículas membranares (designadas corpos apoptóticos).

Tal como aqui se utilizam, os termos "sinergia" ou "sinergismo" ou "sinergicamente" referem-se à interacção de dois ou mais agentes de forma a que o seu efeito combinado seja superior à soma dos seus efeitos individuais.

Os termos "ligando Apo-2", "Apo-2L" ou "TRAIL" são aqui utilizados para referir um polipéptido que inclui os resíduos de aminoácidos 95-281, inclusive, 114-281, inclusive, os resíduos 91-281, inclusive, os resíduos 92-281, inclusive, os resíduos 41-281, inclusive, os resíduos 15-281, inclusive ou os resíduos 1-281, inclusive, da sequência de aminoácidos 10

ΕΡ 1 192 185 /PT mostrada na Figura IA de Pitti et al., J. Biol. Chem. 271: 12687-12690, 1996, bem como fragmentos, variantes de deleção, inserção ou substituição biologicamente activos das sequências de cima. Numa concretização a sequência polipeptidica compreende os resíduos 114-281. Opcionalmente a sequência polipeptidica tem pelo menos os resíduos 91-281 ou os resíduos 92-281. Noutra concretização preferida, os fragmentos ou variantes biologicamente activos têm pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, sendo preferível pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos, sendo ainda preferível, pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência de aminoácidos com qualquer uma das sequências de cima. A definição engloba variantes de substituição do ligando Apo-2 compreendendo os aminoácidos 91-281 da Figura IA de Pitti et al., J. Biol. Chem. 271: 12687-12690, 1996, em que pelo menos um dos aminoácidos nas posições 203, 218 ou 269 (utilizando a numeração da sequência proporcionada por Pitti et al., supra) são substituídos por uma resíduo de alanina. A definição engloba o ligando Apo-2 isolado a partir de uma fonte de ligando Apo-2, tal como de tipos de tecido humano, ou a partir de outra fonte ou preparado através de métodos recombinantes ou sintéticos. O termo ligando Apo-2 refere-se também aos polipéptidos descritos em WO 97/25428, supra, e WO 97/01633, supra. O termo "CPT-11" refere-se a um agente de quimioterapia ou quimioterapêutico que seja da classe de inibidores da topoisomerase I. O termo "CPT-11" tal como aqui se utiliza, inclui os agentes quimioterapêuticos possuindo o nome químico cloridrato de (4S)-4,ll-dietil-4-hidroxi-9-[(4-piperidino-piperidino)carboniloxil]-IH-pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2— b]quinolina-3,14(4H,12H)diona tri-hidratado e os nomes irinotecano, camptotecina, topotecano ou Camptosar®, bem como derivados solúveis em água destes ou sais farmaceuticamente aceitáveis de tais agentes. O cloridrato de irinotecano tem a fórmula empírica 033Η38Ν406*Η01*3Η20 e um peso molecular de aproximadamente 677,19. Tais nomes químicos e fórmulas químicas serão prontamente familiares para os peritos na arte. Camptosar® está comercialmente disponível em Pharmacia & Upjohn e aprovado para comercialização nos Estados Unidos pela FDA. A bula do produto Camptosar® indica que a molécula pode 11

ΕΡ 1 192 185 /PT ser utilizada para tratamento de pacientes humanos com carcinoma colorrectal metastático cuja doença tenha recorrido ou progredido após terapia baseada em 5-FU. "Percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos" em relação às sequências do polipéptido Apo-2L aqui identificadas é definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos numa sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos numa sequência de Apo-2L, após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para alcançar a percentagem máxima de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. 0 alinhamento para fins de determinação da percentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser alcançado de vários modos que estão dentro da perícia na arte, por exemplo, utilizando programa de computador publicamente disponível tal como o programa BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os peritos na arte podem determinar os parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar um alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências a comparar. Opcionalmente, os valores da % de identidade de sequência de aminoácidos são obtidos utilizando o programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2. 0 programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2 foi concebido por Genentech, Inc. e o código fonte foi apresentado com documentação para o utilizador em U.S. Copyright Office, Washington, D.C., 20559, onde está registado com o U.S. Copyright Registration N.° TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível através de Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para utilização num sistema operativo UNIX, de preferência UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros para comparação de sequências são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam. No entanto, a % de identidade de sequência de aminoácidos pode também ser determinada utilizando o programa para comparação de sequências NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). O programa para comparação de sequências NCBI-BLAST2 pode ser descarregado em http://www.ncbi.nlm.nih.gov. NCBI-BLAST2 utiliza vários parâmetros de pesquisa, em que todos esses parâmetros de 12

ΕΡ 1 192 185 /PT pesquisa são colocados a valores por defeito incluindo, por exemplo, "unmask = yes", "strand = all", "expected occurrences = 10", "minimum low complexity length = 15/5", "multi-pass e-value = 0,01", "constant for multi-pass = 25", "dropoff for final gapped alignment = 25" e "scoring matrix = BLOSUM62". O termo "anticorpo" quando utilizado em relação a um "anticorpo anti-receptor do ligando Apo-2 agonista" é utilizado no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecificos (p. ex., anticorpos biespecificos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos, e fragmentos de anticorpo desde que imitem a actividade apoptótica do ligando Apo-2. "Receptor do ligando Apo-2" inclui os receptores referidos na arte como "DR4" e "DR5". Pan et al. descreveram o membro da família de receptores de TNF referido como "DR4" (Pan et al., Science 276: 111-113, 1997; ver também WO 98/32856 publicado a 30 de Julho de 1998). Foi relatado que o receptor DR4 contém um domínio de morte citoplasmático capaz de envolver o aparelho de suicídio celular. Pan et al. divulgam que se crê que DR4 seja um receptor para o ligando conhecido como Apo-2L/TRAIL. Sheridan et al., Science 277: 818-821, 1997 e Pan et al., Science 277: 815-818, 1997 descrevem outro receptor para Apo2L/TRAIL (ver também, WO 98/51793 publicado a 19 de Novembro de 1998; WO 98/41629 publicado a 24 de Setembro de 1998). Este receptor é referido como DR5 (o receptor foi também alternativamente referido como Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAP08, TRICK2 ou KILLER; Screaton et al., Curr. Biol. 1: 693-696, 1997; Walczak et al., EMBO J. 16: 5386-5387, 1997; Wu et al., Nature Genetics 17: 141-143, 1997; WO 98/3598 publicado a 20 de Agosto de 1998; EP 870827 publicada a 14 de Outubro de 1998; WO 98/46643 publicado a 22 Outubro de 1998; WO 99/02653 publicado a 21 de Janeiro de 1999; WO 99/09165 publicado a 25 de Fevereiro de 1999; WO 99/1179 publicado a 11 Março de 1999). Está relatado que, tal como DR4, DR5 contém um domínio de morte citoplasmático e é capaz de sinalizar apoptose. Tal como descrito acima, outros receptores para Apo-2L incluem DcRl, DcR2 e OPG (ver, Sheridan et al., supra; Marsters et al., supra; e Simonet et al., supra). O termo "receptor de Apo-2L" 13

ΕΡ 1 192 185 /PT quando aqui utilizado engloba o receptor de sequência nativa e variantes do receptor. Estes termos englobam o receptor de Apo-2L expresso numa variedade de mamíferos, incluindo humanos. 0 receptor de Apo-2L pode ser endogenamente expresso tal como ocorre naturalmente numa variedade de linhagens de tecidos humanos ou pode ser expresso através de métodos recombinantes ou sintéticos. Um "receptor de Apo-2L de sequência nativa" compreende um polipéptido possuindo a mesma sequência de aminoácidos que um receptor de Apo-2L derivado da natureza. Assim, um receptor de Apo-2L de sequência nativa pode ter a sequência de aminoácidos do receptor de Apo-2L de ocorrência natural de qualquer mamífero. Um tal receptor de Apo-2L de sequência nativa pode ser isolado da natureza ou pode ser produzido por meios recombinantes ou sintéticos. 0 termo "receptor de Apo-2L de sequência nativa" engloba especificamente formas truncadas ou segregadas de ocorrência natural do receptor (p. ex., uma forma solúvel contendo, por exemplo, uma sequência de domínio extracelular) , formas variantes de ocorrência natural (p. ex., formas de processamento alternativo) e variantes alélicas de ocorrência natural. As variantes do receptor podem inclui fragmentos ou mutantes de deleção do receptor de Apo-2L de sequência nativa. 0 termo "anticorpo monoclonal" tal como aqui se utiliza refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i.e., os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos excepto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em menores quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, estando dirigidos contra um único local antigénico. Para além disso, em contraste com preparações de anticorpo convencionais (policlonais) que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio. Para além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos por serem sintetizados pela cultura de hibridoma, não contaminada por outras imunoglobulinas. 0 adjectivo "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogénea de anticorpos e não deve ser entendido como requerendo a produção do anticorpo através de qualquer método 14 ΕΡ 1 192 185 /PT em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a utilizar de acordo com o presente invento podem ser produzidos através do método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature 256: 495, 1975, ou podem ser produzidos através de métodos de ADN recombinante (ver, por exemplo, Patente U.S. N.° 4816567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partir de bibliotecas fágicas de anticorpos utilizando as técnicas descritas, por exemplo, em Clackson et al., Nature 352: 624-628, 1991 e Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991.

Os anticorpos monoclonais daqui incluem especificamente anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma determinada espécie ou pertencentes a uma determinada classe ou subclasse de anticorpos, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes de anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a actividade biológica desejada (Patente U.S. N.° 4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 6851-6855, 1984).

As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (p. ex. de murideo) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos destas (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação ao antigénio dos anticorpos) que contêm uma sequência minima derivada de imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que são substituídos resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do receptor por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato ou coelho possuindo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Nalguns casos, os resíduos da região estrutural de Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Para além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não se verifiquem nem no anticorpo receptor nem nas sequências de CDR ou estruturais importadas. Estas modificações são feitas para refinar e maximizar mais o 15

ΕΡ 1 192 185 /PT desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todo de pelo menos um e tipicamente dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência da imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado compreenderá também optimamente pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) de imunoglobulina, tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver Jones et al., Nature 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature 332: 323-329, 1988; e Presta,

Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596, 1992. 0 anticorpo humanizado inclui um anticorpo PRIMATIZED™ em que a região de ligação ao antigénio do anticorpo é derivada de um anticorpo produzido através de imunização de macacos com o antigénio de interesse.

Os anticorpos são tipicamente proteínas ou polipéptidos que exibem especificidade de ligação a um antigénio específico. Os anticorpos nativos são habitualmente glicoproteínas heterotetraméricas, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Tipicamente, cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada através de uma ligação covalente dissulfureto embora o número de ligações dissulfureto varie entre as cadeias pesadas dos diferentes isotipos de imunoglobulinas. Cada cadeia pesada e leve possui também pontes dissulfureto intracadeias regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada possui numa extremidade um domínio variável (VH) seguido de vários domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável numa extremidade (VL) e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Crê-se que determinados resíduos de aminoácidos formam uma interface entre os domínios variáveis da cadeia leve e pesada (Chothia et al., J. Mol. Biol. 186: 651-663, 1985; Novotny e Haber, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 4592-4596, 1985). As cadeias leves dos anticorpos de qualquer espécie de vertebrado podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, designados capa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos dos deus domínios constantes. 16

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Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e várias destas podem ser ainda divididas em subclasses (isotipos), p. ex., IgG-1, IgG-2, IgG-3 e IgG-4; IgA-1 e IgA-2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são designados alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente. "Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, geralmente a região de ligação ao antigénio ou variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv, diacorpos, moléculas de anticorpo de cadeia simples e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. 0 termo "variável" é aqui utilizado para descrever certas porções dos domínios variáveis que diferem na sequência entre os anticorpos e são utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo em particular para o seu antigénio particular. No entanto, a variabilidade não é habitualmente distribuída uniformemente pelos domínios variáveis dos anticorpos. Está tipicamente concentrada em três segmentos designados regiões determinantes de complementaridade (CDR) ou regiões hipervariáveis, ambas nos domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são designadas a estrutura (FR). Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve nativas compreendem cada um quatro regiões FR, adoptando grandemente a configuração de uma folha β, ligada por três CDR, que formam voltas ligando, e nalguns casos fazendo parte da estrutura em folha β. As CDR em cada cadeia são mantidas juntas em íntima proximidade através das regiões FR e, com as CDR de outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação ao antigénio dos anticorpos (ver, Kabat, E.A. et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, M.D., 1989). Os domínios constantes não estão directamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antigénio, mas exibem várias funções efectoras, tais como a participação do anticorpo na toxicidade celular dependente de anticorpos. 17

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Os anticorpos monoclonais daqui incluem anticorpos quiméricos, híbridos e recombinantes produzidos através de processamento alternativo de um domínio variável (incluindo hipervariável) de um anticorpo anti-receptor de Apo-2L com um domínio constante (p. ex. anticorpos "humanizados"), ou uma cadeia leve com uma cadeia pesada, ou uma cadeia de uma espécie com uma cadeia de outra espécie, ou fusões com proteínas heterólogas, independentemente da espécie de origem ou da designação da classe ou subclasse da imunoglobulina, bem como fragmentos de anticorpo (p. ex., Fab, F(ab')2 e Fv) , desde que exibam a actividade biológica ou propriedades desejadas. Ver, p. ex., Pat. U.S. N° 4816567 e Mage et al., em "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications", pág. 79-97 (Mareei Dekker, Inc.: New York, 1987).

Um "anticorpo humano" é um que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde à de uma anticorpo produzido por um humano e/ou foi produzido utilizando qualquer uma das técnicas para produção de anticorpos humanos tal como divulgado. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antigénio não humanos. Os anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na arte. Numa concretização, o anticorpo humano é seleccionado a partir de uma biblioteca fágica, onde essa biblioteca fágica expressa anticorpos humanos (Vaughan et al.r Nature Biotechnology 14: 309-314, 1996; Sheets et al., PNAS (USA) 95: 6157-6162, 1998; Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol. 227: 381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581, 1991). Anticorpos humanos podem também ser produzidos através da introdução de loci de imunoglobulinas humanas em animais transgénicos, p. ex., ratinhos nos quais os genes das imunoglobulinas endógenas foram parcialmente ou completamente inactivados. Após confronto, observa-se a produção de anticorpos humanos, que se parece muito com a observada em humanos em todos os aspectos, incluindo no rearranjo génico, montagem e repertório de anticorpos. Esta abordagem está descrita, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5661016 e nas seguintes publicações científicas: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783, 1992; Lonberg et al., Nature 368: 856-859 1994; Morrison, Nature 368: 812-13, 1994; Fishwild et 18

ΕΡ 1 192 185 /PT al., Nature Biotechnology 14: 845-51, 1996; Neuberger, Nature

Biotechnology 14: 826, 1996; Lonberg e Huszar, Intern. Rev.

Immunol. 13: 65-93, 1995. Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado através de imortalização de linfócitos B humanos produtores de um anticorpo dirigido contra um antigénio alvo (tais linfócitos B podem ser recuperados a partir de um indivíduo ou podem ser imunizados in vitro). Ver, p. ex., Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy", Alan R. Liss, pág. 77 (1985); Boerner et al., J.

Immunol. 147(1): 86-95, 1991; e Pat. U.S. N.° 5750373. O termo "região Fc" é utilizado para definir a região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que pode ser gerada através de digestão com papaína de um anticorpo intacto. A região Fc pode ser uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc variante. Embora as fronteiras da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc da cadeia pesada da IgG humana está habitualmente definida no trecho de um resíduo de aminoácido cerca da posição Cys226, ou de cerca da posição Pro230, até ao terminal carboxilo da região Fc (utilizando aqui o sistema de numeração de acordo com Kabat et al., supra) . A região Fc de uma imunoglobulina compreende geralmente dois domínios constantes, um domínio CH2 e um domínio CH3, e compreende opcionalmente um domínio CH4.

Por "cadeia da região Fc" entenda-se aqui uma das duas cadeias polipeptídicas de uma região Fc.

O "domínio CH2" de uma região Fc de IgG humana (também referido como domínio "CJ2") prolonga-se habitualmente de um resíduo de aminoácido cerca da posição 231 até um resíduo de aminoácido cerca da posição 340. O domínio CH2 é único por não estar intimamente emparelhado com outro domínio. Em vez disso, estão interpostas duas cadeias de hidratos de carbono ramificadas ligadas em N entre os dois domínios CH2 de uma molécula de IgG nativa intacta. Tem sido especulado se o hidrato de carbono pode proporcionar um substituto para o emparelhamento domínio-domínio e ajudar a estabilizar o domínio CH2 (Burton, Molec. Immunol. 22: 161-206, 1985). O domínio CH2 aqui pode ser um domínio CH2 de sequência nativa ou um domínio CH2 variante. 19

ΕΡ 1 192 185 /PT Ο "domínio CH3" compreende o trecho de resíduos C-terminais a um domínio CH2 numa região Fc (i.e. de um resíduo de aminoácido cerca da posição 341 até um resíduo de aminoácido cerca da posição 447 de uma IgG). A região CH3 aqui pode ser um domínio CH3 de sequência nativa ou um domínio CH3 variante (p. ex. um domínio CH3 com uma "protuberância" introduzida numa cadeia deste e uma "cavidade" introduzida correspondente na outra cadeia deste; ver Patente U.S. N.° 5821333) . A "região charneira" é geralmente definida como prolongando-se de cerca de Glu216 ou cerca de Cys226 até cerca de Pro230 da IgGl humana (Burton, Molec. Immunol. 22: 161-206, 1985) . As regiões charneira de outros isotipos de IgG podem ser alinhadas com a sequência de IgGl através da colocação do primeiro e último resíduos de cisteína que formam as ligações S-S inter-cadeias pesadas nas mesmas posições. A região charneira aqui pode ser uma região charneira de sequência nativa ou uma região charneira variante. As duas cadeias polipeptídicas de uma região charneira variante geralmente mantêm geralmente pelo menos um resíduo de cisteína por cadeia polipeptídica, para que as duas cadeias polipeptídicas da região charneira variante possam formar uma ligação dissulfureto entre as duas cadeias. A região charneira preferida aqui é uma região charneira humana de sequência nativa, p. ex. uma região charneira de IgGl humana de sequência nativa.

Uma "região Fc funcional" possui pelo menos uma "função efectora" de uma região Fc de sequência nativa. "Funções efectoras" exemplares incluem a ligação Clq; citotoxicidade dependente do complemento (CDC); ligação ao receptor de Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores da superfície celular (p. ex. receptor de células B; BCR), etc. Tais funções efectoras requerem geralmente que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (p. ex. um domínio variável de anticorpo) e podem ser avaliadas utilizando vários ensaios conhecidos na arte para avaliação de tais funções efectoras de anticorpos. 20

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Uma "região Fc de sequência nativa" compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc verificada na natureza. Uma "região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácidos que difere da de uma região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de um aminoácido. De preferência, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácidos em comparação com uma região Fc de sequência nativa ou com a região Fc de um polipéptido progenitor, p. ex. de cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácidos, e de preferência de cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácidos numa região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipéptido progenitor. A região Fc variante aqui possuirá de preferência pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipéptido progenitor e de preferência pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com estes, sendo ainda preferível pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência com estes.

Os termos "receptor de Fc" e "FcR" são utilizados para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Para além disso, um FcR preferido é um que se liga a uma anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e F cyRI11, incluindo variantes alélicas e formas de processamento alternativo destes receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor activador") e FcyRIIB (um "receptor inibidor"), que têm sequências de aminoácidos semelhantes que diferem primariamente nos seus domínios citoplasmáticos. O receptor activador FcyRIIA contém um motivo imunorreceptor de activação baseado em tirosina (ITAM) no seu domínio citoplasmático. O receptor inibidor FcyRIIB contém um motivo imunorreceptor de inibição baseado em tirosina (ITIM) no seu domínio citoplasmático (revisto em Daêron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234, 1997). Os FcR são revistos em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92, 1991; Capei et al., Immunomethods 4: 25-34, 1994; e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41, 1995. Outros FcR, incluindo aqueles a identificar no futuro, são englobados pelo termo "FcR" aqui. O termo inclui também o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgG maternas para o feto 21

ΕΡ 1 192 185 /PT (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587, 1976; e Kim et al., J.

Inmunol. 24: 249, 1994).

Um anticorpo "de afinidade maturada" é um com uma ou mais alterações numa ou mais CDR deste que resultam numa melhoria na afinidade do anticorpo para o antigénio, em comparação com um anticorpo progenitor que não possua essa alteração ou alterações. Os anticorpos de afinidade maturada preferidos terão afinidades nanomolares ou mesmo picomolares para o antigénio alvo. Os anticorpos de afinidade maturada são produzidos através de procedimentos conhecidos na arte. Marks et al., Bio/Technology 10 : 779-783, 1992, descrevem a maturação da afinidade através de purga do domínio VH e VL. A mutagénese aleatória de resíduos de CDR e/ou da estrutura está descrita por: Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 91: 3809-3813, 1994; Schier et al., Gene 169: 147-155, 1995; Yelton et al., J. Immunol. 155: 1994-2004, 1995; Jackson et al., J. Immunol. 154(7): 3310-9, 1995; e Hawkins et al., J.

Mol. Biol. 226: 889-896, 1992. O termo "agonista", quando aqui utilizado, refere-se ou descreve um molécula que é capaz de, directa ou indirectamente, induzir, promover ou estimular substancialmente a actividade biológica ou a activação de um receptor para o ligando Apo-2. Opcionalmente, um "anticorpo agonista do receptor de Apo-2L" é um anticorpo que tem actividade que imita ou é comparável com o ligando Apo-2. De preferência, o agonista é uma molécula que é capaz de induzir apoptose numa célula de mamífero. De maior preferência, o agonista é um anticorpo dirigido a um receptor de Apo-2L e o referido anticorpo tem uma actividade apoptótica que é igual ou superior à do polipéptido Apo-2L descrito no Exemplo 1. Opcionalmente, a actividade agonista de uma tal molécula pode ser determinada através do ensaio da molécula, sozinha ou numa forma ligada de forma cruzada utilizando imunoglobulina Fc ou complemento (descrito abaixo), num ensaio descrito no

Exemplo 2 para examinar apoptose de células 9D ou de outras células que expressem um receptor para Apo-2L tal como DR4 ou DR5. "Isolado", quando utilizado para descrever as várias proteínas aqui divulgadas, significa uma proteína que foi 22 ΕΡ 1 192 185 /PT identificada e separada e/ou recuperada a partir de um componente do seu ambiente natural. Componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que tipicamente interfeririam com utilizações de diagnóstico ou terapêuticas da proteína e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em concretizações preferidas, a proteína será purificada (1) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna através da utilização de um sequenciador de copo giratório, ou (2) até à homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições não redutoras ou redutoras utilizando azul de Coomassie ou, de preferência, coloração de prata. A proteína isolada inclui a proteína in situ dentro de células recombinantes, desde que não esteja presente pelo menos um componente do ambiente natural da proteína. Vulgarmente, no entanto, a proteína isolada será preparada através de pelo menos um passo de purificação. "Biologicamente activo" ou "actividade biológica" para os fins daqui significa (a) possuir a capacidade de induzir ou estimular apoptose em pelo menos um tipo de célula cancerosa de mamífero ou célula infectada viralmente in vivo ou ex vivo; (b) ser capaz de criar um anticorpo, i.e., ser imunogénica; ou (c) manter a actividade de um polipéptido ligando Apo-2 nativo ou de ocorrência natural.

Um "agente inibidor do crescimento" quando aqui utilizado refere-se a um composto ou uma composição que inibe o crescimento de uma célula in vitro e/ou in vivo. Assim, o agente inibidor do crescimento pode ser um que reduza significativamente a percentagem de células em fase S.

Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (numa fase diferente da fase S), tais como agentes que induzem a paragem em G1 e a paragem na fase M. Bloqueadores clássicos na fase M incluem os vincas (vincristina e vinblastina), TAXOL® e inibidores de topo II tais como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposido e bleomicina. Os agentes que param G1 também extravasam para paragem na fase S, por exemplo, agentes que alquilam o ADN tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo, e ara-C. Mais informação pode ser encontrada 23 ΕΡ 1 192 185 /PT em "The Molecular Basis of Câncer", Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo I, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al.r (W.B. Saunders; Philadelphia, 1995), especialmente a pág. 13. 0 termo "pró-fármaco" tal como utilizado neste pedido refere-se a um precursor ou forma derivada de uma substâncias farmaceuticamente activa que é menos citotóxica para as células cancerosas em comparação com o fármaco progenitor e é capaz de ser enzimaticamente activada ou convertida na forma progenitora mais activa. Ver, p. ex., Wilman, "Prodrugs in Câncer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions 14, pág. 375-382, 615th Meeting Belfast, 1986 e Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al. (ed.), págs. 247-267, Humana Press (1985). Os pró-fármacos deste invento incluem, mas não se limitam a, pró-fármacos contendo fosfato, pró-fármacos contendo tiofosfato, pró-fármacos contendo sulfato, pró-fármacos contendo péptidos, pró-fármacos modificados com D-aminoácidos, pró-fármacos glicosilados, pró-fármacos contendo beta-lactama, pró-fármacos contendo fenoxiacetamida opcionalmente substituída ou pró-fármacos contendo fenilacetamida opcionalmente substituída, 5-fluorocitosina e outros pró-fármacos de 5-fluorouridina que podem ser convertidos no fármaco livre citotóxico mais activo. Exemplos de fármacos citotóxicos que podem ser derivados numa forma de pró-fármaco para utilizar neste invento incluem, mas não se limitam aos agentes quimioterapêuticos descritos abaixo. 0 termo "agente citotóxico" tal como aqui se utiliza refere-se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou causa a destruição de células. 0 termo pretende incluir isótopos radioactivos (p. ex. At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterapêuticos e toxinas tais como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente activas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes destas.

Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil no tratamento de condições semelhantes a cancro. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes tais 24 ΕΡ 1 192 185 /PT como tiotepa e ciclofosfamida (CY-TOXAN™) ; sulfonatos de alquilo tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoiminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosfaoramida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo os seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos KW-2189 e CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictiina; espongistatina; mostardas de azoto tais como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo; nitrosureias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tais como os antibióticos de enediina (p. ex. caliqueamicina, especialmente caliqueamicina Yi1 e caliqueamicina θΣι, ver, p. ex., Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl. 33: 183-186, 1994); dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamicina; bem como o cromóforo neocarzinostatina e cromóforos antibióticos enediinas cromoproteinas aparentados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabolitos tais como metotrexato e 5-fluorouracilo (5-FU); análogos do ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purinas tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidinas tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, 25 ΕΡ 1 192 185 /PT didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; androgénios tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenérgicos tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedores de ácido fólico tais como ácido frolínico; aceglatona; glicósido aldofosfamida; ácido aminolevulinico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; uma epotilona; etoglúcido; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidamina; maitansinóides tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina 1-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, p. ex. paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Miers Squibb Oncology, Princeton, NJ) e doxetaxel (TAXOTERE® , Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucilo, gencitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor da topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinóico; capecitabina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos de cima. Estão também incluídos nesta definição agentes anti-hormonais que actuam regulando ou inibindo a acção de hormonas em tumores tais como anti-estrogénios incluindo por exemplo tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles que inibem a aromatase, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona, e toremifeno (Fareston); e anti-androgénios tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos de cima. 26

ΕΡ 1 192 185 /PT Ο termo "citoquina" é um termo genérico para proteínas libertadas por uma população celular que actuam noutras células como mediadores intercelulares. Exemplos de tais citoquinas são as linfoquinas, monoquinas e as hormonas polipeptídicas tradicionais. Incluídas entre as citoquinas estão as hormonas do crescimento tais como a hormona do crescimento humana, a N-metionil-hormona do crescimento humana e a hormona do crescimento bovina; a hormona paratiróide; tiroxina; insulina; pró-insulina; relaxina; pró-relaxina; hormonas glicoproteicas tais como a hormona estimulante do folículo (FSH), a hormona estimulante da tiróide (TSH) e a hormona luteinizante (LH); o factor de crescimento hepático; factor de crescimento dos fibroblastos; a prolactina; o lactogénio placentário; factor de necrose tumoral alfa e beta; a substância inibidora do mulleriano; o péptido associado à gonadotropina de ratinho; a inibina; activina; o factor de crescimento endotelial vascular; a integrina; trombopoietina (TPO); factores de crescimento dos nervos tais como NGF-alfa; factor de crescimento das plaquetas; factores de crescimento transformantes (TGF) tais como TGF-α e TGF-β; factor de crescimento semelhante à insulina I e II; eritropoietina (EPO); factores osteoindutores; interferões tais como o interferão alfa, beta e gama; factores estimulantes de colónias (CSF) tais como CSF de macrófagos (M-CSF) ; CSF de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) e CSF de granulócitos (G-CSF) ; interleucinas (IL) tais como IL-1, IL-1 alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; um factor de necrose tumoral tal como TNF-alfa ou TNF-beta; e outros factores polipeptídicos incluindo LIF e o ligando kit (KL) . Tal como aqui se utiliza, o termo citoquina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinantes e equivalentes biologicamente activos das citoquinas de sequência nativa. "Tratamento" ou "terapia" referem-se tanto a tratamento terapêutico como profiláctico ou medidas preventivas. 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um fármaco eficaz para tratar uma doença ou distúrbio num mamífero. No caso de cancro, a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco pode reduzir o número de células cancerosas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (i.e., 27 ΕΡ 1 192 185 /PT atrasar até um certo ponto e de preferência parar) a infiltração das células cancerosas nos órgãos periféricos; inibir (i.e., atrasar até um certo ponto e de preferência parar) a metástase do tumor; inibir, até certo ponto, o crescimento do tumor; e/ou aliviar até certo ponto um ou mais dos sintomas associados ao distúrbio. Até ao ponto em que o fármaco pode prevenir o crescimento e/ou matar células cancerosas existentes, este pode ser citostático e/ou citotóxico. Para terapia de cancro, a eficácia in vivo pode, por exemplo, ser medida através da avaliação do peso ou volume do tumor, do tempo para a progressão da doença (TTP) e/ou da determinação das taxas de resposta (RR). "Mamífero" para fins de tratamento ou terapia refere-se a qualquer animal classificado como mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de quinta, e animais de zoológico, desporto ou estimação, tais como cães, cavalos, gatos, vacas, etc. De preferência, o mamífero é humano.

Os termos "cancro", "canceroso" ou "maligno" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado. Exemplos de cancro incluem mas não se limitam a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais particulares de tais cancros incluem cancro do cólon, cancro colorrectal, cancro rectal, cancro das células escamosas, cancro das células pequenas do pulmão, cancro das células não pequenas do pulmão, linfoma de Hodgkin e não hodgkiniano, cancro dos testículos, cancro esofágico, cancro gastrointestinal, cancro renal, cancro pancreático, glioblastoma, cancro cervical, cancro do ovário, glioma, cancro do fígado, cancro da bexiga, hepatoma, cancro da mama, carcinoma do endométrio, carcinoma das glândulas salivares, cancro do rim, cancro do fígado, cancro da próstata, cancro da vulva, cancro da tiróide, carcinoma hepático e vários tipos de cancro da cabeça e do pescoço. II. Métodos e Materiais

Geralmente, os métodos do presente invento para induzir apoptose em células de mamífero compreendem a exposição das células a uma quantidade eficaz de ligando Apo-2 e CPT-11 ou 28 ΕΡ 1 192 185 /PT uma quantidade eficaz de anticorpo agonista do receptor de Apo-2L e CPT-11. De preferência, a quantidade de Apo-2L (ou anticorpo agonista) e de CPT-11 empregue será uma quantidade eficaz para induzir sinergicamente apoptose. Isto pode ser alcançado in vivo ou ex vivo de acordo com, por exemplo, os métodos descritos abaixo e nos Exemplos. Condições ou distúrbios exemplares a tratar com o ligando Apo-2 ou o anticorpo agonista e CPT-11 incluem cancro benigno e maligno.

A. MATERIAIS 0 Apo-2L que pode ser empregue nos métodos inclui os polipéptidos Apo-2L descritos em Pitti et al., supra, WO 97/25428, supra, e WO 97/01633, supra (os polipéptidos referidos como TRAIL). Está contemplado que podem ser utilizadas várias formas de Apo-2L, tais como o polipéptido inteiro bem como formas solúveis de Apo-2L que compreendem uma sequência do domínio extracelular (ECD). Exemplos de tais sequências de DEC solúveis incluem polipéptidos compreendendo os aminoácidos 114-281, 95-281, 91-281 ou 92-281 da sequência de Apo-2L apresentada na Figura IA de Pitti et ai., J. Biol. Chem. 271: 12687-12690, 1996. Crê-se actualmente que o polipéptido compreendendo os aminoácidos 92-281 é uma forma naturalmente clivada de Apo-2L. Os requerentes expressaram Apo-2L humano em células CHO e verificaram que o polipéptido 92-281 é a forma expressa de Apo-2L. Formas modificadas de Apo-2L, tais como as formas covalentemente modificadas descritas em WO 97/25428 estão incluídas. Em particular, está incluído Apo-2L ligado a um polímero não proteináceo tal como polietilenoglicol para utilizar nos presentes métodos. O polipéptido Apo-2L pode ser produzido de acordo com qualquer um dos métodos descritos em WO 97/25428.

As variantes do ligando Apo-2 possuindo actividade apoptótica que podem ser utilizadas nos métodos incluem, por exemplo, as identificadas através de técnicas de pesquisa de alanina. Determinadas variantes de substituição compreendem os aminoácidos 91-281 da Figura IA de Pitti et al., J. Biol. Chem. 271: 12687-12690, 1996, em que pelo menos um dos aminoácidos nas posições 203, 218 ou 269 é substituído por um resíduo de alanina. Opcionalmente, as variantes do ligando 29

ΕΡ 1 192 185 /PT Αρο-2 podem incluir uma ou mais destas três substituições de locais diferentes.

Está contemplado que uma molécula que imite a actividade apoptótica de Apo-2L pode alternativamente ser empregue nos métodos presentemente divulgados. Exemplos de tais moléculas incluem anticorpos agonistas que podem induzir apoptose de um modo pelo menos comparável ou semelhante a Apo-2L. Em particular, estes anticorpos agonistas compreenderão anticorpos para um ou mais dos receptores para Apo-2L. De preferência, o anticorpo agonista é dirigido a um receptor de Apo-2L que inclui um domínio de morte citoplasmático tal como DR4 ou DR5. De preferência ainda, o anticorpo agonista liga-se a um tal receptor e a ligação pode ser determinada, p. ex., utilizando análise de FACS ou ELISA, tal como descrito no Exemplo 2. Os anticorpos agonistas dirigidos para o receptor designado DR5 (ou Apo-2) foram preparados utilizando técnicas de fusão tais como descritas abaixo. Um dos anticorpos agonistas do receptor DR5 ou Apo-2 é referido como 3FII.39.7 e foi depositado na ATCC com o número de depósito HB-12456 a 13 de Janeiro de 1998. Outros anticorpos para o receptor DR5 incluem 3H3.14.5, depositado na ATCC tal como aqui mostrado. A actividade agonista dos anticorpos do receptor de Apo-2L pode ser determinada utilizando vários métodos para ensaio da actividade apoptótica e, opcionalmente, a actividade apoptótica de um tal anticorpo pode ser determinada através do ensaio do anticorpo, sozinho ou numa forma de ligação cruzada utilizando imunoglobulina Fc ou complemento (descrito abaixo), no ensaio descrito no Exemplo 2 para examinar a apoptose de células 9D ou de outras células expressando um receptor de Apo-2L tal como DR4 ou DR5.

Adicionalmente, foram também preparados anticorpos agonistas dirigidos para outro receptor de Apo-2L designado DR4. Um dos anticorpos agonistas de DR4 é referido como 4H6.17.8 e foi depositado na ATCC com o número de depósito HB-12455 a 13 de Janeiro de 1998. Ainda outros anticorpos agonistas de DR4 incluem os anticorpos 4E7.24.3, 1H5.25.9, 4G7.18.8 e 5G11.17.1 que foram depositados na ATCC, tal como mostrado abaixo. A actividade agonista dos anticorpos do receptor de Apo-2L pode ser determinada utilizando vários métodos para ensaio da actividade apoptótica, e, 30

ΕΡ 1 192 185 /PT opcionalmente, a actividade apoptótica de tal anticorpo pode ser determinada através do ensaio do anticorpo, sozinho ou numa forma de ligação cruzada utilizando imunoglobulina Fc ou complemento (descrito abaixo), no ensaio descrito no Exemplo 2 para examinar apoptose de células 9D ou de outras células expressando um receptor de Apo-2L tal como DR4 ou DR5.

Os anticorpos agonistas contemplados pelo presente invento incluem anticorpos gue se ligam a um único receptor de Apo-2L ou a mais de um receptor de Apo-2L. Um anticorpo gue se ligue a mais de um receptor de Apo-2L pode ser caracterizado como um anticorpo gue "reage de forma cruzada" com dois ou mais antigénios diferentes e é capaz de se ligar a cada um dos diferentes antigénios, p. ex. tal como determinado através de ELISA ou FACS como nos exemplos abaixo. Opcionalmente, um anticorpo que "reage especificamente de forma cruzada" com dois ou mais antigénios diferentes é um que se liga a um primeiro antigénio e que se liga ainda a um segundo antigénio diferente, em que a capacidade de ligação do anticorpo ao segundo antigénio a uma concentração de anticorpo de cerca de 10 μρ/ιηΐ é de cerca de 50% a cerca de 100% (de preferência de cerca de 75% a cerca de 100%) da capacidade de ligação ao primeiro antigénio tal como determinado num ELISA de captura (tal como no exemplos abaixo) . Por exemplo, o anticorpo pode ligar-se especificamente a DR5 (o "primeiro antigénio") e reagir especificamente de forma cruzada com outro receptor de Apo-2L tal como DR4 (o "segundo antigénio") em que o grau de ligação de cerca de 10 μg/ml do anticorpo a DR4 é de cerca de 50% a cerca de 100% da capacidade de ligação do anticorpo a DR5 no ELISA de captura daqui. Vários anticorpos reactivos de forma cruzada para os receptores de Apo-2L estão descritos em mais detalhe no pedido de Patente Internacional número PCT/US9 9/1319 7.

Tal como descrito abaixo, formas exemplares de tais anticorpos incluem anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados, biespecificos e heteroconjugados. 1. Anticorpos Policlonais

Os anticorpos do presente invento podem compreender anticorpos policlonais. Os métodos de preparação de anticorpos 31

ΕΡ 1 192 185 /PT policlonais são conhecidos dos peritos na arte. Os anticorpos policlonais podem ser criados num mamífero, por exemplo, através de uma ou mais injecções de um agente imunizante e, se desejado, um adjuvante. Tipicamente, o agente imunizante e/ou o adjuvante serão injectados no mamífero através de múltiplas injecções subcutâneas ou intraperitoneais. 0 agente imunizante pode incluir um polipéptido DR4 ou DR5 (ou um ECD de DR4 ou DR5) ou uma proteína de fusão deste. Pode ser útil conjugar o agente imunizante com uma proteína que se saiba ser imunogénica no mamífero a imunizar. Exemplos de tais proteínas imunogénicas incluem mas não se limitam a hemocianina da lapa, albumina do soro, tiroglobulina bovina e inibidor da tripsina de soja. Exemplos de adjuvantes que podem ser empregues incluem o adjuvante completo de Freund e o adjuvante MPL-TDM (monofosforil-Lípido A, dicorinomicolato de trealose sintético). 0 protocolo de imunização pode ser seleccionado por um perito na arte sem demasiada experimentação. 0 mamífero pode então ser sangrado e o soro ensaiado para titular o anticorpo. Se desejado, o mamífero pode ser reforçado até o título do anticorpo aumentar ou alcançar um patamar. 2. Anticorpos Monoclonais

Os anticorpos do presente invento podem, alternativamente, ser anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando métodos de hibridoma, tais como os descritos por Kohler e Milstein, Nature 256: 495, 1975. Num método de hibridoma, um ratinho, hamster ou outro animal hospedeiro apropriado, é tipicamente imunizado com um agente imunizante para provocar linfócitos que produzam ou sejam capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente ao agente imunizante. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. 0 agente imunizante incluirá tipicamente um polipéptido DR4 ou DR5 ou uma proteína de fusão deste, tal como uma proteína de fusão ECD de DR4 ou DR5-IgG.

Geralmente, são utilizados linfócitos de sangue periférico ("PBL") se forem desejadas células de origem humana ou são utilizadas células do baço ou dos nódulos linfáticos se forem desejadas fontes de mamífero não humano. Os linfócitos 32 ΕΡ 1 192 185 /PT são então fundidos com uma linha celular imortalizada utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principies and Practice", Academic Press, págs. 59-103, 1986). As linhas celulares imortalizadas são habitualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origem em roedor, bovino ou humano. Habitualmente, são empregues linhas celulares de mieloma de rato ou ratinho. As células de hibridoma podem ser cultivadas num meio de cultura adequado que, de preferência, contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células imortalizadas não fundidas. Por exemplo, se as células parentais não tiverem a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina ("meio HAT"), substâncias que impedem o crescimento de células deficientes em HGPRT.

As linhas celulares imortalizadas preferidas são as que se fundem eficientemente, suportam um nível de expressão estável elevado de anticorpo pelas células seleccionadas produtoras de anticorpo e são sensíveis a um meio tal como o meio HAT. As linhas celulares imortalizadas mais preferidas são linhas de mieloma de murídeo, que podem ser obtidas, por exemplo, do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, e American Type Culture Collection, Manassas, Virgínia. Um exemplo de uma tal linha celular de mieloma de murídeo é P3X63AgU.l descrita no Exemplo 2 abaixo. Foram também descritas linhas celulares de mieloma humano e de heteromieloma ratinho-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol. 133: 3001, 1984; Brodeur et al., "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications", Mareei Dekker, Inc., New York, 1987, pág. 51-63) . O meio de cultura no qual são cultivadas as células de hibridoma pode então ser ensaiado quanto à presença de anticorpos monoclonais dirigidos contra o receptor de Apo-2L. De preferência, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada através de imunoprecipitação ou através de ensaio 33

ΕΡ 1 192 185 /PT de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou imunoensaio enzimático (ELISA). Tais técnicas e ensaios são conhecidos na arte. A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada através de análise Scatchard de Munson e Pollard, Anal. Biochem. 107: 220, 1980.

Após as células de hibridoma desejadas serem identificadas, os clones podem ser subclonados através de procedimentos de diluição limitante e criados através de métodos padrão (Goding, supra). Meios de cultura adeguados para este fim incluem, por exemplo, Meio de Eagle Modificado por Dulbecco ou meio RPMI-1640. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser criadas in vivo como ascites num mamífero.

Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones podem ser isolados ou purificados a partir do meio de cultura ou do fluído de ascites através de procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulinas tais como, por exemplo, cromatografia de proteína A-Sepharose e de hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.

Os anticorpos monoclonais podem também ser produzidos através de métodos de ADN recombinante, tais como os descritos na Patente U.S. N.° 4816567. ADN codificando os anticorpos monoclonais do presente invento pode ser facilmente isolado e seguenciado utilizando procedimentos convencionais (p. ex., através da utilização de sondas oligonucleotídicas que sejam capazes de se ligar especificamente a genes codificando as cadeias pesada e leve de anticorpos de murídeo). As células de hibridoma do presente invento servem como fonte preferida de tal ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vectores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras tais como células COS de símio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma, que de outro modo não produzem proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. O ADN pode também ser modificado, por exemplo, através de substituição da sequência de codificação para os domínios constantes das cadeias pesada e leve humanas em vez das sequências homólogas de murídeo (Patente U.S. N.° 4816567; 34

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Morrison et al., supra) ou unindo covalentemente à sequência de codificação da imunoglobulina toda ou parte da sequência de codificação para um polipéptido não imunoglobulina. Um tal polipéptido não imunoglobulina pode substituir os dominios constantes de um anticorpo do presente invento ou pode substituir os dominios variáveis de um local de combinação com o antigénio de um anticorpo do presente invento para criar um anticorpo bivalente quimérico. Opcionalmente, podem ser construídos anticorpos quiméricos que incluam pelo menos um domínio variável ou hipervariável de um anticorpo anti-receptor de Apo-2L seleccionado a partir dos anticorpos 4H6.17.8, 3F11.39.7, 4E7.24.3, 1H5.25.9, 4G7.18.8, 5G11.17.1 e 3H3.14.5 aqui divulgados.

Opcionalmente, os anticorpos agonistas do presente invento ligar-se-ão ao mesmo ou aos mesmos epítopos que qualquer um dos anticorpos 4H6.17.8, 3F11.39.7, 4E7.24.3, 1H5.25.9, 4G7.18.8, 5G11.17.1 e 3H3.14.5 aqui divulgados. Isto pode ser determinado através da condução de vários ensaios, tal como aqui descrito. Por exemplo, para determinar se um anticorpo monoclonal tem a mesma especificidade que os anticorpos de DR4 ou DR5 especificamente aqui referidos, pode-se comparar a sua actividade em ensaios de bloqueio ou em ensaios de indução de apoptose.

Os anticorpos do presente invento incluem anticorpos "ligados de forma cruzada". 0 termo "ligados de forma cruzada" tal como aqui se utiliza refere-se à ligação de pelo menos duas moléculas de IgG uma à outra para formarem uma (única) molécula. Os anticorpos do receptor de Apo-2L podem ser ligados de forma cruzada utilizando várias moléculas ligantes, opcionalmente os anticorpos de DR4 são ligados de forma cruzada utilizando um molécula anti-IgG, de complemento, modificação química ou engenharia molecular. É apreciado pelos peritos na arte que o complemento tenha uma afinidade relativamente elevada para moléculas de anticorpo uma vez que os anticorpos se ligam à membrana da superfície celular. Em concordância, crê-se que o complemento possa ser utilizado como molécula de ligação cruzada para ligar dois ou mais anticorpos ligados à membrana da superfície celular. Entre os vários isotipos de Ig de murídeo, sabe-se que IgM, IgG2a e IgG2b fixam o complemento. 35

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Os anticorpos do presente invento pode opcionalmente compreender anticorpos diméricos, bem como formas multivalentes de anticorpos. Os peritos na arte podem construir tais dimeros ou formas multivalentes através de técnicas conhecidas na arte e utilizando os anticorpos anti-receptor de Apo-2L daqui.

Os anticorpos do presente invento podem também compreender anticorpos monovalentes. Os métodos para preparação de anticorpos monovalentes são bem conhecidos na arte. Por exemplo, um método envolve a expressão recombinante de uma cadeia leve de imunoglobulina e de uma cadeia pesada modificada. A cadeia pesada é truncada geralmente em qualquer ponto da região Fc de forma a prevenir que a cadeia pesada se ligue de forma cruzada. Alternativamente, os resíduos de cisteína relevantes são substituídos por outro resíduo de aminoácido ou são suprimidos de forma a prevenir a ligação cruzada. Métodos in vitro são também adequados para preparação de anticorpos monovalentes. A digestão de anticorpos para produzir fragmentos destes, particularmente fragmentos Fab, pode ser alcançada utilizando técnicas de rotina conhecidas na arte. Por exemplo, a digestão pode ser efectuada utilizando papaína. Exemplos de digestão com papaína estão descritos em WO 94/29348 publicado a 12/22/94 e na Patente U.S. N.° 4342566. A digestão com papaína de anticorpos produz tipicamente dois fragmentos idênticos de ligação ao antigénio, designados fragmentos Fab, cada um com um único local de ligação ao antigénio e um fragmento Fc residual. 0 tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 que possui dois locais de combinação com o antigénio e é ainda capaz de se ligar de forma cruzada ao antigénio.

Os fragmentos Fab produzidos na digestão de anticorpos contêm também os domínios constantes da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHi) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carboxilo do domínio CHi da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região charneira do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui para Fab' em que o(s) 36

ΕΡ 1 192 185 /PT resíduo (s) de cisteína dos domínios constantes possuem um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que possuem cisteínas de charneira entre eles. São também conhecidas outras ligações químicas de fragmentos de anticorpo.

Podem também ser produzidos fragmentos Fv de cadeia simples, tal como descrito em Iliades et al., FEBS Letters 409: 437-441, 1997. A ligação de tais fragmentos de cadeia simples utilizando vários ligantes está descrita em Kortt et ai., Protein Engineering 10: 423-433, 1997.

Para além dos anticorpos descritos acima, está contemplado que possam ser preparados in vitro anticorpos quiméricos ou híbridos utilizando métodos conhecidos na química sintética de proteínas, incluindo os que envolvem agentes de ligação cruzada. Por exemplo, podem ser construídas imunotoxinas utilizando uma reacção de permuta de dissulfureto ou através da formação de uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para este fim incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato.

Os anticorpos do receptor de Apo-2L do presente invento podem compreender ainda anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. As formas humanizadas de anticorpos não humanos (p. ex., de murídeo) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos destas (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação ao antigénio dos anticorpos) que contêm uma sequência mínima derivada de uma imunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais são substituídos resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do receptor por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato ou coelho possuindo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Nalguns casos, os resíduos da região estrutural Fv da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Os anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que não se encontrem nem no anticorpo receptor nem nas sequências de CDR ou estruturais importadas. Em geral, o anticorpo humanizado 37 ΕΡ 1 192 185 /PT compreenderá substancialmente todo de pelo menos um e tipicamente dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado compreenderá também optimamente pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) de imunoglobulina, tipicamente a de uma imunoglobulina humana (Jones et al., Nature 321: 522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332: 323-329, 1988; e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596, 1992).

Os métodos para humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na arte. Geralmente, um anticorpo humanizado possui um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos de uma fonte que é não humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são frequentemente referidos como resíduos "importados", que são tipicamente tirados de um domínio variável de "importação". A humanização pode ser efectuada essencialmente seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature 321: 522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332: 323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536, 1988), substituindo CDR ou sequências de CDR de um anticorpo humano pelas sequências correspondentes de roedor. Em concordância, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente U.S. N.° 4816567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são anticorpos tipicamente humanos nos quais alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedor. As fontes de tais resíduos importados ou domínios variáveis (ou CDR) importados incluem os anticorpos anti-receptor de Apo-2L depositados 4H6.17.8, 3F11.39.7, 4E7.24.3, 1H5.25.9, 4G7.18.8, 5G11.17.1 e 3H3.14.5 aqui divulgados. A escolha de domínios variáveis humanos, tanto da leve como da pesada, a utilizar na produção de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o método do "mais ajustado", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é pesquisada contra 38

ΕΡ 1 192 185 /PT a biblioteca inteira de sequências de domínios variáveis humanos conhecidas. A sequência humana que estiver mais próxima da do roedor é então aceite como a estrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151: 2296-2308, 1993; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901- 917, 1987). Outro método utiliza uma estrutura particular derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um determinado subgrupo de cadeias leves e pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para diferentes anticorpos humanizados (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 4285-4289, 1992; Presta et al., J. Immunol. 151: 2623-2632, 1993). É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados com manutenção da elevada afinidade para o antigénio e de outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar este objectivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados através de um processo de análise das sequências progenitoras e de vários produtos humanizados conceptuais utilizando modelos tridimensionais das sequências progenitoras e humanizadas. Os modelos tridimensionais de imunoglobulinas estão vulgarmente disponíveis e são familiares dos peritos na arte. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e apresentam estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas seleccionadas. A inspecção destas apresentações permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, i.e., a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para se ligar ao seu antigénio. Deste modo, resíduos de FR podem ser seleccionados e combinados a partir da sequência de consenso e de importação para que seja alcançada a característica desejada do anticorpo, tal como uma maior afinidade para o antigénio ou antigénios alvo. Em geral, os resíduos de CDR estão directamente e muito substancialmente envolvidos na influência da ligação ao antigénio (ver WO 94/04679 publicado a 3 de Março de 1994).

Anticorpos monoclonais humanos podem ser produzidos através de uma adaptação do método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler e Milstein através da utilização de linfócitos B humanos como parceiro de fusão. Linfócitos B 39

ΕΡ 1 192 185 /PT humanos produtores de um anticorpo de interesse podem, por exemplo, ser isolados a partir de um indivíduo humano, após obtenção de consentimento informado. Por exemplo, o indivíduo pode estar a produzir anticorpos contra um auto-antigénio tal como ocorre em certos distúrbios tais como lúpus eritematoso sistémico (Shoenfeld et al., J. Clin. Invest. 70: 205, 1982), púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) (Nugent et al., Blood 70(1): 16-22, 1987) ou cancro. Alternativamente, ou adicionalmente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Por exemplo, podem-se expor in vitro linfócitos do sangue periférico humano isolados a um agente lisomotrófico (p. ex., éster L-leucina-O-metílico, éster dimetílico de ácido L-glutâmico ou éster L-leucil-L-leucina-O-metílico) (Patente U.S. N.° 5567610, Borrebaeck et al.); e/ou podem ser tratados in vitro linfócitos do sangue periférico esgotado de células T com adjuvantes tais como 8-mercaptoguanosina e citoquinas (Patente U.S. N.° 5229275, Goroff et al.).

Os linfócitos B recuperados do sujeito ou imunizados in vitro, são então geralmente imortalizados para gerar um anticorpo monoclonal humano. As técnicas para imortalizar os linfócitos B incluem, mas não se limitam a: (a) fusão dos linfócitos B humanos com células de mielomas humanos e de murídeo ou de heteromielomas ratinho-humano; (b) transformação virai (p. ex. com um vírus de Epstein-Barr; ver Nugent et al., supra, por exemplo); (c) fusão com uma linha celular linfoblastóide; ou (d) fusão com células de linfoma.

Os linfócitos podem ser fundidos com células de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, “Monoclonal Antibodies: Principies and Practice", págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e criadas num meio de cultura adequado que, de preferência, contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma progenitoras não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma progenitoras não tiverem a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (“meio HAT"), substâncias que impedem o crescimento de células deficientes em HGPRT. Linhas 40

ΕΡ 1 192 185 /PT celulares de mieloma humano e de heteromieloma ratinho-humano adequadas foram descritas (Kozbor, J. Immunol. 133: 3001, 1984; Brodeur et al., "Monoclonal Antibody Production

Techniques and Applications", páq. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., New York, 1987)). O meio de cultura no qual as células de hibridoma crescem é ensaiado quanto à produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio. De preferência, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada através de imunoprecipitação ou através de ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou imunoensaio enzimático (ELISA).

Após serem identificadas as células de hibridoma que produzem anticorpos da especificidade, afinidade e/ou actividade desejadas, os clones podem ser subclonados através de procedimentos de diluição limitante e criados através de métodos padrão (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principies and Practice", págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI 1640. Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, do fluido de ascites ou do soro através de procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulinas tais como, por exemplo, cromatografia de proteína A, electroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.

Anticorpos humanos podem também ser criados utilizando um hospedeiro não humano, tal como um ratinho, que seja capaz de produzir anticorpos humanos. Tal como observado acima, estão actualmente disponíveis ratinhos transgénicos que são capazes, após imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulinas endógenas. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de união da cadeia pesada do anticorpo (JH) em ratinhos mutantes quiméricos e de linha germinal resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência da série de genes de imunoglobulina da linha germinal humana em tais ratinhos mutantes de linha germinal resultará na produção de anticorpos humanos após confronto com o antigénio. Ver, p. ex., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 2551-2555, 41

ΕΡ 1 192 185 /PT 1993; Jakobovits et al., Nature 362: 255-258, 1993;

Bruggermann et al., Year in Immuno. 1: 33, 1993; Patente U.S. N.° 5591669; Patente U.S. N.° 5589369; e Patente U.S. N.° 5545807. Anticorpos humanos podem também ser preparados utilizando ratinhos SCID-hu (Duchosal et ai., Nature 355: 258-262, 1992).

Noutra concretização, o anticorpo humano pode ser seleccionado a partir de uma biblioteca de apresentação fágica de anticorpos humanos. A preparação de bibliotecas de anticorpos ou fragmentos destes é bem conhecida na arte e qualquer um dos métodos conhecidos pode ser utilizado para construir uma família de vectores de transformação que possam ser introduzidos em células hospedeiras. Bibliotecas de cadeias leves e pesadas de anticorpos em fagos (Huse et al., Science 246: 1275, 1989) ou de proteínas de fusão em fagos ou fagemídeos podem ser preparadas de acordo com procedimentos conhecidos. Ver, por exemplo, Vaughan et ai., Nature

Biotechnology 14: 309-314, 1996; Barbas et al., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 88 : 7978-7982, 1991; Marks et al., J. Mol.

Biol. 222: 581-597, 1991; Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol. 227: 381-388, 1992; Barbas et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 4457-4461, 1992; Griffiths et al., EMBO Journal 13: 3245- 3260, 1994; de Kruif et al. , J. Mol. Biol. 248: 97-105, 1995; WO 98/05344; WO 98/15833; WO 97/47314; WO 97/44491; WO 97/35196; WO 95/34648; Patente U.S. N.° 5712089; Patente U.S. N.° 5702892; Patente U.S. N.° 5427908; Patente U.S. N.° 5403484; Patente U.S. N.° 5432018; Patente U.S. N.° 5270170; WO 92/06176; WO 99/06587; Patente U.S. N.° 5514548; WO 97/08320 e Patente U.S. N.° 5702892. O antigénio de interesse é peneirado contra a biblioteca fágica utilizando procedimentos conhecidos na arte para selecção de anticorpos de fagos que se liguem ao antigénio alvo.

Os anticorpos do receptor de Apo-2L, tal como aqui descrito, possuem opcionalmente uma ou mais actividades biológicas ou propriedades desejadas. Tais anticorpos podem incluir mas não se limitam a anticorpos quiméricos, humanizados, humanos e de afinidade maturada. Tal como descrito acima, os anticorpos podem ser construídos ou modificados utilizando várias técnicas para alcançar estas actividades ou propriedades desejadas. Numa concretização, o 42

ΕΡ 1 192 185 /PT anticorpo do receptor de Apo-2L terá uma afinidade de ligação ao receptor DR4 ou DR5 de pelo menos 105 M_1, de preferência pelo menos no intervalo de 106 M 1 a 107 M_1, sendo preferível pelo menos no intervalo de 108 M-1 a 1012 M-1, sendo ainda preferível pelo menos no intervalo de 04 O \—1 M-1 a ΙΟ12 Μ'1. A afinidade de ligação do anticorpo pode ser determinada sem demasiada experimentação através de testes do anticorpo de acordo com técnicas conhecidas na arte, incluindo análise Scatchard (ver Munson et al., supra) . Por exemplo, um anticorpo de DR4 pode ser ensaiado quanto à afinidade de ligação à construção de receptor DR4-IgG, tal como descrito no Exemplo 2.

Noutra concretização, o anticorpo do receptor de Apo-2L do presente invento pode ligar-se ao mesmo epítopo em DR4 e DR5 a que se liga Apo-2L ou ligar-se a um epítopo em DR4 ou DR5, que coincide ou se sobrepõe com o epítopo em DR4 ou DR5, respectivamente, ao qual se liga Apo-2L. 0 anticorpo pode também interagir de modo a criar uma conformação espacial que impeça a ligação do ligando Apo-2L a DR4 ou DR5. A propriedade de ligação ao epítopo do anticorpo do presente invento pode ser determinada utilizando técnicas conhecidas na arte. Por exemplo, o anticorpo pode ser testado num ensaio in vitro, tal como um ensaio de inibição competitiva, para determinar a capacidade do anticorpo para bloquear ou inibir a ligação de Apo-2L a DR4 ou DR5. Opcionalmente, o anticorpo pode ser testado num ensaio de inibição competitiva para determinar a capacidade de, p. ex., um anticorpo de DR4 para inibir a ligação de um polipéptido Apo-2L (tal como descrito no Exemplo 1) a uma construção DR4-IgG (tal como descrito no Exemplo 2) ou a uma célula que expresse DR4. Opcionalmente, o anticorpo será capaz de bloquear ou inibir a ligação de Apo-2L ao receptor em pelo menos 50%, de preferência em pelo menos 75% e ainda de preferência em pelo menos 90%, o que pode ser determinado, por exemplo, num ensaio de inibição competitiva in vitro utilizando uma forma solúvel do ligando Apo-2 (TRAIL) e uma ECD de DR4-IgG (tal como descrito no Exemplo 2).

Numa concretização preferida, o anticorpo compreenderá um anticorpo agonista possuindo actividade que imite ou seja comparável à do ligando Apo-2 (TRAIL). De preferência, um tal anticorpo agonista de DR4 ou DR5 induzirá apoptose em pelo 43 ΕΡ 1 192 185 /PT menos um tipo de linha celular de cancro ou tumoral ou num tumor primário. A actividade apoptótica de um anticorpo agonista de DR4 ou DR5 pode ser determinada utilizando ensaios in vitro ou in vivo conhecidos. Exemplos de tais ensaios in vitro e in vivo estão descritos em detalhe na secção Exemplos abaixo. In vitro, a actividade apoptótica pode ser determinada utilizando técnicas conhecidas tais como ligação de Anexina V. In vivo, a actividade apoptótica pode ser determinada, p. ex., através da medição da redução no peso ou volume do tumor. 3. Anticorpos Biespecíficos

Anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais, de preferência humanos ou humanizados que têm especificidades de ligação para pelo menos dois antigénios diferentes. No presente caso, uma das especificidades de ligação é para um receptor de Apo-2L, a outra é para qualquer outro antigénio e de preferência para uma proteína ou receptor ou subunidade de receptor da superfície celular.

Os métodos para produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos na arte. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos baseia-se na co-expressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias pesadas têm diferentes especificidades (Milstein e Cuello, Nature 305: 537-539, 1983). Devido à variação aleatória de cadeias pesada e leve de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma potencial mistura de dez moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correcta. A purificação da molécula correcta é habitualmente alcançada através de passos de cromatografia de afinidade. Procedimentos semelhantes são divulgados em WO 93/08829, publicado a 13 de Maio de 1993 e em Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655-3659, 1991.

Os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação anticorpo-antigénio) podem ser fundidos com sequências de domínios constantes de imunoglobulinas. A fusão é de preferência com um domínio constante da cadeia pesada da imunoglobulina, compreendendo pelo menos parte das regiões de charneira, CH2 e CH3. É preferível ter a primeira região constante da cadeia 44

ΕΡ 1 192 185 /PT pesada (CHI) contendo o local necessário para a ligação da cadeia leve presente em pelo menos um das fusões. Os ADN codificando as fusões da cadeia pesada da imunoglobulina e, se desejado, da cadeia leve da imunoglobulina, são inseridos em vectores de expressão separados e são co-transfectados num organismo hospedeiro adeguado. Para mais detalhes sobre a criação de anticorpos biespecíficos ver, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210, 1986). 4. Anticorpos Heteroconjugados

Os anticorpos heteroconjugados estão também dentro do âmbito do presente invento. Os anticorpos heteroconjugados são compostos por dois anticorpos unidos covalentemente. Tais anticorpos foram, por exemplo, propostos para direccionar células do sistema imunitário para células indesejadas (Patente U.S. N.° 4676980) e para tratamento da infecção por HIV (WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089). Está contemplado gue os anticorpos podem ser preparados in vitro utilizando métodos conhecidos em guimica sintética de proteínas, incluindo os gue envolvem agentes de ligação cruzada. Por exemplo, podem ser construídas imunotoxinas utilizando uma reacção de permuta de dissulfureto ou através da formação de uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adeguados para este fim incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato e os divulgados, por exemplo, na Patente U.S. N.° 4676980. 5. Triacorpos

Os triacorpos estão também dentro do âmbito do presente invento. Tais anticorpos estão descritos por exemplo em Iliades et al., supra, e Kortt et al., supra. 6. Outras Modificações

Outras modificações dos anticorpos do receptor de Apo-2L são agui contempladas. Os anticorpos do presente invento podem ser modificados através da conjugação do anticorpo com um agente citotóxico (tal como uma molécula de toxina) ou uma enzima activadora de um pró-fármaco que converta um pró-fármaco (p. ex. um agente quimioterapêutico peptidilo, ver WO 81/01145) num fármaco anticanceroso activo. Ver, por 45

ΕΡ 1 192 185 /PT exemplo, WO 88/07378 e Patente U.S. N.° 4975278. Esta tecnologia é também referida como "Terapia de Pró-fármacos Mediada por Enzimas Dependente de Anticorpos" (ADEPT). O componente enzima do imunoconjugado útil para ADEPT inclui qualquer enzima capaz de actuar sobre um pró-fármaco de um modo tal que o converta numa forma mais activa e citotóxica. Enzimas que são úteis no método deste invento incluem, mas não se limitam a, fosfatase alcalina útil para converter pró-fármacos contendo fosfato em fármacos livres; arilsulfatase útil para converter pró-fármacos contendo sulfato em fármacos livres; citosina-desaminase útil para converter 5-fluorocitosina não tóxica no fármaco anticanceroso 5-fluorouracilo; proteases tais como a protease de Serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (tais como as catepsinas B e L) , que são úteis para converter pró-fármacos contendo péptidos em fármacos livres; caspases tais como a caspase-3; D-alanilcarboxipeptidases, úteis para converter pró-fármacos que contêm D-aminoácidos substituintes; enzimas que clivam hidratos de carbono tais como a beta-galactosidase e a neuraminidase úteis para converter pró-fármacos glicosilados em fármacos livres; beta-lactamase útil para converter fármacos derivados com beta-lactamas em fármacos livres; e penicilina-amidases, tais como penicilina V-amidase ou penicilina G-amidase, úteis para converter fármacos derivados nos seus azotos de aminas com grupos fenoxiacetilo ou fenilacetilo, respectivamente, em fármacos livres. Alternativamente, podem ser utilizados anticorpos com actividade enzimática também conhecidos na arte como "abzimas", para converter pró-fármacos do presente invento em fármacos activos livres (ver, p. ex., Massey, Nature 328: 457-458, 1987). Conjugados anticorpo-abzima podem ser preparados tal como aqui descrito para distribuição da abzima a uma população de células tumorais.

As enzimas podem ser covalentemente ligadas aos anticorpos através de técnicas bem conhecidas na arte tais como a utilização de reagentes de ligação cruzada heterobifuncionais. Alternativamente, as proteínas de fusão compreendendo pelo menos a região de ligação ao antigénio de um anticorpo do presente invento ligada a pelo menos uma porção funcionalmente activa de uma enzima do presente invento

ΕΡ 1 192 185 /PT 4 6 podem ser construídas utilizando técnicas de ADN recombinante bem conhecidas na arte (ver, p. ex., Neuberger et ai., Nature 312: 604-608, 1984) .

Outras modificações de anticorpos são contempladas. Por exemplo, o anticorpo pode ser ligado a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, p. ex., polietilenoglicol, polipropilenoglicol, polioxialquilenos ou copolímeros de polietilenoglicol e polipropilenoglicol. O anticorpo pode também ser aprisionado em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou através de polimerização interfacial (por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente), em sistemas coloidais de distribuição de fármacos (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16a Edição, Oslo, A., Ed., 1980. Para aumentar a semivida do anticorpo no soro, pode-se incorporar no anticorpo (especialmente num fragmento de anticorpo) um epítopo de ligação ao receptor recuperado tal como descrito, por exemplo na Patente U.S. N.° 5739277. Tal como aqui se utiliza, o termo "epítopo de ligação ao receptor recuperado" refere-se a um epítopo da região Fc de uma molécula IgG (p. ex., IgGi, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável pelo aumento da semivida no soro in vivo da molécula de IgG. 7. Métodos Recombinantes O presente invento proporciona também ácidos nucleicos isolados codificando os anticorpos aqui divulgados, vectores e células hospedeiras compreendendo o ácido nucleico e técnicas recombinantes para a produção do anticorpo.

Para a produção recombinante do anticorpo, o ácido nucleico codificando-o é isolado e inserido num vector replicável para posteriores clonagens (amplificação do ADN) ou para expressão. O ADN codificando o anticorpo é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (p. ex., através da utilização de sondas que sejam capazes de se ligar especificamente a genes codificando o anticorpo). 47

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Estão disponíveis muitos vectores. Os componentes do vector incluem geralmente, mas não se limitam a, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição.

Os métodos daqui incluem métodos para a produção de anticorpos quiméricos ou recombinantes anti-receptor de Apo-2L que compreendem os passos de proporcionar um vector compreendendo uma sequência de ADN codificando uma cadeia leve ou uma cadeia pesada (ou ambas uma cadeia leve e uma cadeia pesada) de um anticorpo anti-receptor de Apo-2L, transfecção ou transformação de uma célula hospedeira com o vector e cultura da(s) célula(s) hospedeira(s) sob condições suficientes para produzir o produto anticorpo anti-receptor de Apo-2L recombinante. (i) Componente sequência de sinal 0 anticorpo anti-receptor de Apo-2L deste invento pode ser produzido de forma recombinante não só directamente como também como polipéptido de fusão com um polipéptido heterólogo que seja, de preferência, uma sequência de sinal ou outro polipéptido possuindo um local de clivagem específico no N-terminal da proteína ou polipéptido maduro. A sequência de sinal heteróloga seleccionada é de preferência uma que seja reconhecida e processada (i.e., clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas que não reconheçam nem processem a sequência de sinal nativa do anticorpo, a sequência de sinal é substituída por uma sequência de sinal procariótica seleccionada, por exemplo, de entre o grupo dos comandos da fosfatase alcalina, penicilinase, lpp ou enterotoxina II termo-estável. Para secreção em levedura a sequência de sinal pode ser substituída por exemplo, pelo comando de levedura da invertase, o comando do factor oc (incluindo os comandos dos factores α de Saccharomyces e Kluyveromyces) ou o comando da fosfatase ácida, o comando da glucoamilase de C. albicans ou o sinal descrito em WO 90/13646. Na expressão em células de mamífero estão disponíveis sequências de sinal de mamífero bem como comandos de secreção virais, por exemplo, o sinal de gD de herpes simplex. 48

ΕΡ 1 192 185 /PT Ο ADN para tal região precursora está ligado no enquadramento de leitura com o ADN codificando o anticorpo. (ii) Componente origem de replicação

Ambos os vectores de expressão e de clonagem contêm uma sequência de ácido nucleico que permite que o vector se replique numa ou mais células hospedeiras seleccionadas. Geralmente, em vectores de clonagem esta sequência é uma que permite que o vector se replique independentemente do ADN cromossómico do hospedeiro e inclui origens de replicação ou sequências de replicação autónoma. Tais sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmídeo 2μ é adequada para leveduras e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vectores de clonagem em células de mamífero. Geralmente, o componente origem de replicação não é necessário para vectores de expressão em mamífero (a origem de SV40 pode ser tipicamente utilizada apenas porque contém o promotor precoce). (iii) Componente gene de selecção

Os vectores de expressão e de clonagem podem conter um gene de selecção, também designado um marcador seleccionável. Tipicamente os genes de selecção codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, p. ex., ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos, p. ex., o gene codificando a D-alanina-racemase para Bacilli.

Um exemplo de um esquema de selecção utiliza um fármaco para parar o crescimento de uma célula hospedeira. As células que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência ao fármaco e sobrevivem assim ao regime de selecção. Exemplos de tal selecção dominante utilizam os fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina. 49

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Outro exemplo de marcadores seleccionáveis adequados para células de mamífero são os que permitem a identificação de células competentes para a tomada do ácido nucleico do anticorpo, tais como DHFR, timidina-quinase, metalotioneína-I e II, de preferência qenes de metalotioneína de primatas, adenosina-desaminase, ornitina-descarboxilase, etc.

Por exemplo, células transformadas com o gene de selecção de DHFR são primeiro identificadas através da cultura de todos os transformantes num meio de cultura que contenha metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada quando é empregue DHFR de tipo selvagem é a linha celular de ovário de hamster chinês (CHO) deficiente na actividade de DHFR.

Alternativamente, as células hospedeiras (particularmente hospedeiros de tipo selvagem que contenham DHFR endógena) transformadas ou co-transformadas com sequências de ADN codificando o anticorpo anti-receptor de Apo-2L, a proteína DHFR de tipo selvagem e outro marcador seleccionável tal como a aminoglicósido-3'-fosfotransferase (APH) podem ser seleccionadas através de crescimento celular em meio contendo um agente de selecção para o marcador seleccionável tal como um antibiótico aminoglicosídico, p. ex., canamicina, neomicina ou G418. Ver Patente U.S. N.° 4965199).

Um gene de selecção adequado para utilizar em levedura é o gene trpl presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb et al.r Nature 282: 39, 1979). 0 gene trpl proporciona um marcador de selecção para uma estirpe mutante de levedura sem capacidade para crescer em triptofano, por exemplo, ATCC N.° 44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics 85: 12, 1977). A presença da lesão em trpl no genoma das células hospedeiras de levedura proporciona então um ambiente eficaz para a detecção de transformação através do crescimento na ausência de triptofano. Semelhantemente, estirpes de levedura deficientes em Leu2 (ATCC 20622 ou 38626) são complementadas por plasmídeos conhecidos possuindo o gene Leu2.

Adicionalmente, vectores derivados do plasmídeo circular pKDl de 1,6 μιη podem ser utilizados para transformação de 50

ΕΡ 1 192 185 /PT leveduras Kluyveromyces. Alternativamente, foi relatado um sistema de expressão para produção em grande escala de quimosina recombinante de vitelo para K. lactis, Van den Berg, Bio/Technology 8: 135, 1990. Foram também divulgados vectores de expressão estável em múltiplas cópias para secreção de albumina do soro humano madura recombinante através de estirpes industriais de Kluyveromyces, Fleer et al., Bio/Technology 9: 968-975, 1991. (iv) Componente Promotor

Os vectores de expressão e de clonagem contêm habitualmente um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está operativamente ligado ao ácido nucleico do anticorpo. Promotores adequados para utilizar com hospedeiro procarióticos incluem o promotor phoA, os sistemas promotores da β-lactamase e da lactose, da fosfatase alcalina, um sistema promotor do triptofano (trp) e promotores híbridos tais como o promotor tac. No entanto, são adequados outros promotores bacterianos conhecidos. Os promotores para utilização em sistemas bacterianos conterão também uma sequência de Shine-Dalgarno (S.D.) operativamente ligada ao ADN codificando o anticorpo anti-receptor de Apo-2L. São conhecidas sequências promotoras para eucariotas. Virtualmente todos os genes eucarióticos têm uma região rica em AT situada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do local onde a transcrição é iniciada. Outra sequência verificada 70 a 80 bases a montante do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleótido. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucarióticos está uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para a adição da cauda poli A à extremidade 3' da sequência de codificação. Todas estas sequências são adequadamente inseridas em vectores de expressão eucarióticos.

Exemplos de sequências promotoras adequadas para utilização com hospedeiros de levedura incluem os promotores para a 3-fosfoglicerato-quinase ou outras enzimas glicolíticas, tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato- desidrogenase, hexoquinase, piruvato-descarboxilase, fosfofrutoquinase, glucose-6-fosfato-isomerase, 51

ΕΡ 1 192 185 /PT 3-fosfoglicerato-mutase, piruvato-quinase, triosefosfato- isomerase, fosfoglucose-isomerase e glucoquinase.

Outros promotores de levedura, que são promotores indutíveis possuindo a vantagem adicional de transcrição controlada pelas condições de crescimento, são as regiões promotoras para a álcool-desidrogenase-2, o isocitocromo C, a fosfatase ácida, enzimas de degradação associadas ao metabolismo do azoto, metalotioneina, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase e enzimas responsáveis pela utilização da maltose e galactose. Vectores e promotores adequados para utilização em expressão de levedura estão ainda descritos na EP 73657. Potenciadores de levedura são vantajosamente utilizados com promotores de levedura. A transcrição do anticorpo anti-receptor de Apo-2L a partir de vectores em células hospedeiras de mamífero pode ser controlada, por exemplo, através de promotores obtidos a partir dos genomas de vírus tais como o vírus do polioma, vírus da varíola das aves, adenovírus (tais como

Adenovírus 2), vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e, de maior preferência, Vírus Símio 40 (SV40), de promotores heterólogos de mamífero, p. ex., o promotor da actina ou um promotor de uma imunoglobulina, de promotores de choque térmico, desde que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.

Os promotores precoce e tardio do vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição de SV40 que contém também a origem de replicação virai de SV40. O promotor precoce imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição HindiII E. Um sistema para expressar ADN em hospedeiros mamíferos utilizando o vírus de papiloma bovino como um vector é divulgado na Patente U.S. N.° 4419446. Uma modificação deste sistema está descrita na Patente U.S. N.° 4601978. Ver também, Reyes et al., Nature 297: 598-601, 1982 sobre a expressão de ADNc do interferão β humano em células de ratinho sob o controlo de um promotor da timidina-quinase do vírus de herpes simples. Alternativamente, pode ser utilizada como promotor a repetição terminal longa do vírus do sarcoma de Rous. 52

ΕΡ 1 192 185 /PT (v) Componente elemento potenciador A transcrição de um ADN codificando o anticorpo anti-receptor de Apo-2L deste invento por eucariotas superiores é frequentemente aumentada através da inserção de uma sequência potenciadora no vector. Muitas sequências potenciadoras são actualmente conhecidas de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, no entanto, utilizar-se-á um potenciador de um vírus de células eucarióticas. Exemplos incluem o potenciador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o potenciador do promotor precoce de citomegalovirus, o potenciador do polioma no lado tardio da origem de replicação e potenciadores de adenovírus. Ver também Yaniv, Nature 297: 17-18, 1982, em elementos potenciadores para activação de promotores eucarióticos. O potenciador pode ser unido no vector numa posição a 5' ou a 3' da sequência de codificação do anticorpo, mas situa-se de preferência num local a 5' do promotor. (vi) Componente terminação da transcrição

Os vectores de expressão utilizados em células hospedeiras eucarióticas (de levedura, fungos, insecto, vegetais, animais, humanas ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) conterão também sequências necessárias para a terminação da transcrição e para a estabilização do ARNm. Tais sequências estão vulgarmente disponíveis a partir das regiões 5' e, ocasionalmente, 3' não traduzidas de ADN ou ADNc eucarióticos ou virais. Estas regiões contêm segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do ARNm codificando o anticorpo multivalente. Um componente de terminação da transcrição útil é a região de poliadenilação da hormona do crescimento bovina. Ver WO 94/11026 e o vector de expressão aí divulgado. (vii) Selecção e transformação de células hospedeiras Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do ADN nos vectores daqui são as células procariotas, de 53 ΕΡ 1 192 185 /PT levedura ou de eucariotas superiores descritas acima. Procariotas adequados para este fim incluem eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo Enterobacteriaceae tais como Escherichia, p. ex., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, p. ex., Salmonella typhimurium, Serratla, p. ex., Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli tais como B. subtilis e B. licheniformis (p. ex., B. licheniformis 41P divulgado em DD 266719 publicado a 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem de E. coli preferido é E. coli 294 (ATCC 31446) embora sejam adequadas outras estirpes tais como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31537) e E. coli W3110 (ATCC 27325). Estes exemplos são ilustrativos em vez de limitantes.

Para além dos procariotas, micróbios eucariotas tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros adequados de clonagem e expressão para os vectores codificando o anticorpo do receptor de Apo-2L. Saccharomyces cerevisiae, ou a vulgar levedura do pão, é o mais vulgarmente utilizado de entre os microrganismos hospedeiros eucarióticos inferiores. No entanto, vários outros géneros, espécies e estirpes estão vulgarmente disponíveis e são úteis aqui, tais como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros Kluyveromyces tais como, p. ex., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans e K. marxianus; Yarrowia (EP 402226); Pichia pastoris (EP 183070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tais como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos tais como, p. ex., hospedeiros Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e Aspergillus tais como A. nidulans e A. niger.

As células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpo glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrado incluem células vegetais e de insecto. Foram identificadas numerosas estirpes e variantes de baculovírus e correspondentes células hospedeiras de insecto permissivas de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da 54

ΕΡ 1 192 185 /PT fruta) e Bombyx morí. Uma variedade de estirpes virais para transfecção está publicamente disponível, p. ex., a variante L-l de NPV de Autographa californica e a estirpe Bm-5 de NPV de Bombyx mori, e tais vírus podem ser utilizados como o vírus daqui de acordo com o presente invento, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

Culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco podem também ser utilizadas como hospedeiros.

No entanto, o interesse tem sido maior em células de vertebrado e a propagação de células de vertebrado em cultura (cultura de tecidos) tornou-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhas celulares hospedeiras de mamífero úteis são a linha de rim de macaco CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); a linha de rim embrionário humano (293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59, 1977); células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4216, 1980); células de Sertoli de ratinho (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251, 1980); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sei. 383: 44-68, 1982); células MRC 5; células FS4; uma linha de hepatoma humano (Hep G2) ; e células de mieloma ou linfoma (p. ex. células Y0, J558L, P3 e NSO) (ver Patente U.S. N.° 5807715).

As células hospedeiras são transformadas com os vectores de expressão ou clonagem acima descritos para produção de anticorpo e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para induzir promotores, seleccionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as sequências desejadas. 55

ΕΡ 1 192 185 /PT (viii) Cultura das células hospedeiras

As células hospedeiras utilizadas para produzir o anticorpo deste invento podem ser cultivadas numa variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis tais como FIO de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) são adequados para cultura das células hospedeiras. Adicionalmente, qualquer um dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enzymol. 58: 44, 1979; Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255, 1980, Patente U.S. N.° 4767704; 4657866; 4927762; 4560655 ou 5122469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou Patente US Re. 30985 pode ser utilizado como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado conforme necessário com hormonas e/ou outros factores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou factor de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleótidos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como o fármaco GENTAMYCIN™) , elementos vestigiários (definidos como compostos inorgânicos habitualmente presentes em concentrações finais no intervalo micromolar) e glucose ou uma fonte equivalente de energia. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos nas concentrações apropriadas que seriam conhecidas dos peritos na arte. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, são as anteriormente utilizadas com a célula hospedeira seleccionada para expressão e serão aparentes para o vulgar perito. (ix) Purificação

Quando se utilizam técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplasmático, ou segregado directamente para o meio. Se o anticorpo for produzido intracelularmente, como primeiro passo os restos particulados, células hospedeiras ou fragmentos de lise, são removidos, por exemplo, através de centrifugação ou ultrafiltração. Cárter et al., Bio/Technology 10: 163-167, 1992, descrevem um procedimento para isolamento de anticorpos que sejam segregados para o espaço periplasmático de E. coli. 56

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Resumidamente, a pasta celular é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) ao longo de cerca de 30 min. Os restos celulares podem ser removidos através de centrifugação. Quando o anticorpo é segregado para o meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão primeiro são geralmente concentrados utilizando um filtro de concentração de proteínas comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de proteases tal como PMSF pode ser incluído em qualquer um dos passos antecedentes para inibir proteólise e podem ser incluídos antibióticos para prevenir o crescimento de contaminantes adventícios.

A composição do anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada utilizando, por exemplo, cromatografia de hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, sendo a cromatografia de afinidade a técnica de purificação preferida. A adequabilidade da proteína A como ligando de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer região Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A proteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que se baseiem nas cadeias pesadas humanas γΐ, γ2 ou γ4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13, 1983). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de ratinho e para a γ3 humana (Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575, 1986). A matriz à qual é ligado o ligando de afinidade é muito frequentemente agarose, mas estão disponíveis outras matrizes. Matrizes mecanicamente estáveis tais como de vidro de poro controlado ou de poli(estirenodivinil)benzeno permitem caudais mais rápidos e tempos de processamento mais curtos do que os que podem ser alcançados com agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX™ (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para purificação. Outras técnicas para purificação de proteínas tais como fraccionamento numa coluna de permuta iónica, precipitação em etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina, cromatografia em SEPHAROSE™ ou uma resina de permuta aniónica ou catiónica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE e precipitação em sulfato de amónio, estão também disponíveis dependendo do anticorpo a recuperar. 57

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Β. FORMULAÇÕES Ο ligando Άρο-2 ou ο anticorpo agonista do receptor de Apo-2L e CPT-11 são de preferência administrados num transportador. As moléculas podem ser administradas num único transportador, ou, alternativamente, podem ser incluídas em transportadores separados. Transportadores adequados e suas formulações estão descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16a Ed., 1980, Mack Publishing Co., editado por Oslo et al. Tipicamente, é utilizada uma quantidade apropriada de um sal farmaceuticamente aceitável no transportador para tornar a formulação isotónica. Exemplos do transportador incluem solução salina, solução de Ringer e solução de dextrose. O pH da solução é de preferência de cerca de 5 a cerca de 8 e de maior preferência de cerca de 7,4 a cerca de 7,8. Será aparente para os peritos na arte que certos transportadores podem ser preferíveis, dependendo, por exemplo, da via de administração e da concentração do agente a administrar. O transportador pode estar na forma de uma formulação liofilizada ou de uma solução aquosa.

Os transportadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são de preferência não tóxicos para as células e/ou os receptores nas dosagens e concentrações empregues, e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos tais como metilparabeno ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-iões formadores de sais tais como sódio; e/ou tensioactivos não iónicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG). 58

ΕΡ 1 192 185 /PT A formulação pode também conter mais de um composto activo conforme necessário para a indicação em particular a tratar, de preferência aqueles com actividades complementares que não se afectam adversamente um ao outro. Alternativamente ou adicionalmente, a composição pode compreender um agente citotóxico, citoquina ou agente inibidor do crescimento. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para os fins pretendidos. 0 Apo-2L ou o anticorpo agonista e CPT-11 podem também ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou através de polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas coloidais de distribuição de fármacos (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartícuias e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16a Edição, Oslo, A., Ed., 1980.

As formulações a utilizar para administração in vitro devem de ser estéreis. Isto é facilmente alcançado por filtração através de membranas de filtração estéril.

Podem ser preparadas preparações de libertação sustida. Exemplos adequados de preparações de libertação sustida incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros sólidos hidrófobos contendo o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, p. ex. películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de libertação sustida incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) ou poli(álcool vinílico)), polilactidos (Patente U.S. N.° 3773919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo não degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico-ácido glicólico tais como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injectáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros tais como etileno-acetato de vinilo e de ácido láctico-ácido glicólico permitem a libertação de 59

ΕΡ 1 192 185 /PT moléculas durante mais de 100 dias, certos hidrogéis libertam proteínas durante períodos mais curtos.

C. MODOS DE ADMINISTRAÇÃO O Apo-2L ou o anticorpo agonista do receptor de Apo-2L e CPT-11 podem ser administrados de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa de uma só vez ou através de infusão contínua ao longo de um período de tempo, através das vias intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutânea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica ou de inalação. Opcionalmente, a administração pode ser efectuada através de infusão de mini-bombas utilizando vários dispositivos comercialmente disponíveis.

As dosagens eficazes e programas para administração de ligando Apo-2 ou de anticorpo agonista e CPT-11 podem ser determinados empiricamente e fazer tais determinações está dentro da perícia na arte. Crê-se actualmente que uma dosagem ou quantidade eficaz de ligando Apo-2 utilizada sozinha pode variar de cerca de 1 μρ/]ζρ a cerca de 100 mg/kg de peso corporal ou mais por dia. Uma dosagem ou quantidade eficaz de CPT-11 utilizada sozinha pode variar de cerca de 1 mg/m2 a cerca de 150 mg/m2. A transposição interespecífica das dosagens pode ser efectuada de um modo conhecido na arte, p. ex., tal como divulgado em Mordenti et al., Pharmaceut. Res. 8: 1351, 1991. Os peritos na arte compreenderão que a dosagem de ligando Apo-2 ou de anticorpo agonista e de CPT-11 que tem de ser administrada variará dependendo, por exemplo, do mamífero que receberá o ligando Apo-2 ou anticorpo agonista e CPT-11, da via de administração e de outros fármacos ou terapias administrados ao mamífero.

Dependendo do tipo de células e/ou da gravidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 15 mg/kg (p. ex. 0,1-20 mg/kg) de anticorpo agonista é uma dosagem inicial candidata para administração, tanto, por exemplo, numa ou mais administrações em separado, como através de infusão contínua. Uma dosagem diária típica poderia variar de cerca de 1 μρ/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos factores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, 60

ΕΡ 1 192 185 /PT dependendo da condição, o tratamento é sustido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas de doença. No entanto, outros regímenes de dosagem podem ser úteis.

Está contemplado que possam ainda ser empregues terapias adicionais nos métodos. A terapia ou terapias adicionais podem incluir, mas não se limitam a, outras quimioterapias (ou agentes quimioterapêuticos) e/ou terapia de radiação, imunoadjuvantes, agentes inibidores do crescimento, citoquinas e outras terapias baseadas em anticorpos não Her-2. Exemplos incluem interleucinas (p. ex., IL-1, il-2, IL-3, IL-6), factor inibidor da leucemia, interferões, TGF-beta, eritropoietina, trombopoietina e anticorpo anti-VEGF. Outros agentes que se sabe induzirem apoptose em células de mamífero podem também ser empregues e tais agentes incluem TNF-a, TNF-β (linfotoxina-a), ligando CD30, ligando 4-1BB e ligando Apo-1.

As quimioterapias adicionais contempladas pelo presente invento incluem substâncias químicas ou fármacos que são conhecidos na arte e que estão comercialmente disponíveis, tais como Adriamicina, Doxorrubicina, 5-Fluorouracilo, Citosina-arabinósido ("Ara-C"), Ciclofosfamida, Leucovorin, Tiotepa, Bussulfano, Citoxina, Taxol, Toxotere, Metotrexato, Cisplatina, Melfalano, Vinblastina, Bleomicina, Etoposido, Ifosfamida, Mitomicina C, Mitoxantrona, Vincristina,

Vinorelbina, Carboplatina, Teniposido, Daunomicina,

Carminomicina, Aminopterina, Dactinomicina, Mitomicinas,

Esperamicinas (ver Patente U.S. N.° 4675187), Malfalano e outras mostardas de azoto aparentadas. Também incluídos estão agentes que actuam regulando ou inibindo a acção de hormonas em tumores tais como o tamoxifeno e a onapristona. A preparação e os programas de dosagem para tal quimioterapia podem ser utilizados de acordo com as instruções do fabricante ou tal como determinado empiricamente pelo perito praticante. A preparação e os programas de dosagem para tal quimioterapia estão também descritos em "Chemotherapy Service", Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). O agente quimioterapêutico pode preceder ou seguir-se à administração com o Apo-2L ou o anticorpo agonista e/ou CPT-11 ou pode ser dado simultaneamente com estes. 61

ΕΡ 1 192 185 /PT A quimioterapia é de preferência administrada num transportador, tal como os descritos acima. O modo de administração da quimioterapia pode ser o mesmo que o empregue para o ligando Apo-2 ou anticorpo agonista ou CPT-11 ou pode ser administrada através de um modo diferente. A terapia de radiação pode ser administrada de acordo com protocolos vulgarmente empregues na arte e conhecidos dos peritos na arte. Tal terapia pode incluir radiação de césio, iridio, iodo ou cobalto. A terapia de radiação pode ser irradiação do corpo todo ou pode ser dirigida localmente para um local ou tecido específico dentro ou por cima do corpo. Tipicamente, a terapia de radiação é administrada em pulsos ao longo de um período de tempo de cerca de 1 a cerca de 2 semanas. A terapia de radiação pode, no entanto, ser administrada ao longo de períodos de tempo mais longos. Opcionalmente, a terapia de radiação pode ser administrada como uma dose única ou como doses múltiplas sequenciais. 0 ligando Apo-2 ou o anticorpo agonista e CPT-11 (e uma ou mais outras terapias) podem ser administrados concorrente ou sequencialmente. Após a administração de ligando Apo-2 ou anticorpo agonista e CPT-11, as células tratadas In vitro podem ser analisadas. Quando houve tratamento in vitro, um mamífero tratado pode ser monitorizado de vários modos bem conhecidos do perito praticante. Por exemplo, a massa tumoral pode ser observada fisicamente, através de biopsia ou através de técnicas padrão de imagiologia de raios X. III. Artigos Fabricados

Noutra concretização do presente invento, é proporcionado um artigo fabricado contendo materiais úteis para o tratamento dos distúrbios descritos acima. 0 artigo fabricado compreende um recipiente e uma etiqueta. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser constituídos por uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. 0 recipiente contém uma composição que é eficaz para tratar a condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco ou um frasco de solução intravenosa possuindo uma rolha perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica). Os agentes 62

ΕΡ 1 192 185 /PT activos na composição são o ligando Apo-2 ou o anticorpo agonista e CPT-11. A etiqueta no recipiente ou associada a este indica que a composição é utilizada para tratamento da condição de escolha. 0 artigo fabricado pode compreender ainda um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e pacotes inseridos com instruções para utilização.

Os seguintes exemplos são oferecidos para fins de ilustração e não para limitação. As divulgações de todas as citações no fascículo são expressamente aqui incorporadas por referência. EXEMPLO 1

Este exemplo ilustra a inibição sinérgica do crescimento do tumor por ligando Apo-2 e CPT-11 in vivo. A linha celular de carcinoma do cólon COLO205 (disponível em NCI) foi criada e mantida de acordo com os métodos do fornecedor. Resumidamente, as células COLO205 foram cultivadas em meio DMEM rico em glucose/F12 (50:50) contendo soro fetal bovino a 10% e L-Glutamina 2,0 mM. O ligando Apo-2 compreendendo os aminoácidos 114-281 foi preparado em E. coli. A parte extracelular do Apo-2L humano (aminoácidos 114-281; ver Pitti et al., supra) foi subclonada no plasmídeo de expressão pS1346 (Scholtissek et al., Gene 62: 55-64, 1988) com um codão de metionina iniciador adicionado, e expressa sob controlo do promotor trp na estirpe de E. coli W3110, em fermentadores de 10 1 ou 100 1. A pasta celular contendo o

Apo-2L humano solúvel recombinante foi extraída com um tampão contendo Tris 0,1 M/NaCl 0,2 M/EDTA 50 mM, pH 8,0. O extracto foi precipitado por sulfato de amónio a 40%. A purificação até >98% de homogeneidade foi alcançada através de dois passos cromatográficos consecutivos em colunas de hidroxiapatite e Ni-NTA agarose (crê-se que embora não tenha uma etiqueta de poli-histidina, o fragmento de Apo-2L de 114-281 solúvel recombinante se ligue à coluna Ni-NTA através de resíduos 63

ΕΡ 1 192 185 /PT endógenos de histidina). A pureza foi determinada através de electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio (SDS)-poliacrilamida e coloração de nitrato de prata ou azul de Coomassie, através de análise da sequência de aminoácidos, e através de exclusão de tamanho em cromatografia liquida de alta resolução (HPLC). 0 CPT-11 (Camptosar®) foi obtido em

Pharmacia & Upjohn.

Ratinhos nus atimicos (Jackson Laboratories) foram injectados subcutaneamente com 5 milhões de células de carcinoma do cólon COLO205 e deixou-se que os tumores crescessem até cerca de 120 mm3. Os ratinhos possuindo tumores foram distribuídos aleatoriamente por 4 grupos a 9 ratinhos por grupo e tratados com veículo (Tris 20 mM, Trealose a 8%, Tween 20 a 0,01%, pH 7,5), Apo-2L (30 mg/kg/dia nos dias 0-4 e 7-11) ou CPT-11 (80 mg/kg/dia nos dias 0, 4 e 8) ou uma combinação de Apo-2L (30 mg/kg/dia nos dias 0-4 e 7-11) mais CPT-11 (80 mg/kg/dia nos dias 0, 4 e 8) . Os volumes dos tumores foram determinados nos dias indicados ao longo de 34 dias.

Tal como mostrado na Figura 1, tanto o Apo-2L (triângulos vazios) como o CPT-11 (quadrados vazios) suprimiram o crescimento do tumor durante o período de tratamento, embora o crescimento do tumor tenha continuado vários dias depois em todos os 9 animais de cada grupo. Em contraste, a combinação de Apo-2L com CPT-11 (triângulos a cheio) causou uma substancial retracção do tumor, resultando na completa eliminação do tumor em 8 dos 9 animais do grupo de tratamento da combinação.

Os resultados desta experiência indicam que as combinações de ligando Apo-2 e tratamento com CPT-11 inibem sinergicamente o crescimento de células cancerosas in vivo. EXEMPLO 2

Este exemplo ilustra a inibição sinérgica do crescimento do tumor por anticorpo agonista do receptor DR4 4H6.17.8 (" 4 H 6 ") e CPT-11 in vivo. 64

ΕΡ 1 192 185 /PT Ο anticorpo agonista foi preparado como se segue. Uma construção de imunoadesina de ECD de DR4 foi preparada. Uma sequência de ECD de DR4 maduro (aminoácidos 1-218 mostrados em Pan et ai., supra) foi clonada num vector pCMV-1 Flag (Kodak) a jusante da sequência de sinal Flag e fundida com a região CHI, charneira e Fc da cadeia pesada da imunoglobulina Gi humana tal como descrito anteriormente (Aruffo et ai., Cell 61: 1303-1313, 1990). A imunoadesina foi expressa através de transfecção transiente para células 293 humanas e purificada a partir dos sobrenadantes celulares através de cromatografia de afinidade de proteína A, tal como descrito por Ashkenazi et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 10535-10539, 1991) .

Ratinhos Balb/c (obtidos em Charles River Laboratories) foram imunizados através da injecção de 0,5 μg/50 μΐ de uma proteína imunoadesina de ECD de DR4 (tal como descrito acima) (diluída em adjuvante MPL-TDM adquirido em Ribi Immunochemical Research Inc., Hamilton, MT) 11 vezes em cada almofada das patas traseiras a intervalos de 3-4 dias.

Três dias após o reforço final, os nódulos linfáticos popliteais foram removidos dos ratinhos e foi preparada uma suspensão de células individuais em meio DMEM (obtido em Biowhitakker Corp.) suplementado com penicilina-estreptomicina a 1%. As células dos nódulos linfáticos foram então fundidas com células de mieloma de murídeo P3X63AgU.l (ATCC CRL 1597) utilizando polietilenoglicol a 35% e cultivadas em placas de cultura de 96 poços. Os hibridomas resultantes da fusão foram seleccionados em meio HAT. Dez dias após a fusão, os sobrenadantes das culturas de hibridoma foram pesquisados num ELISA para testar a presença de ligação de anticorpos monoclonais à proteína imunoadesina de ECD de DR4 (descrita acima).

No ELISA, placas de microtítulo de 96 poços (Maxisorp; Nunc, Kamstrup, Dinamarca) foram revestidas através da adição a cada poço de 50 μΐ de 2 pg/ml de Fc de cabra anti-IgG humana (adquirido em Cappel Laboratories) em PBS e incubando a 4°C de um dia para o outro. As placas foram então lavadas três vezes com tampão de lavagem (PBS contendo Tween 20 a 0,05%) . Os poços das placas de microtítulo foram então bloqueados com 200 μΐ de albumina de soro bovino a 2,0% em PBS e incubados à 65

ΕΡ 1 192 185 /PT temperatura ambiente durante 1 hora. As placas foram então lavadas novamente três vezes com tampão de lavagem.

Após o passo de lavagem, foram adicionados a cada poço 50 μΐ de proteína imunoadesina de ECD de DR4 a 0,4 pg/ml em tampão de ensaio. As placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente num aparelho de agitação, seguido de lavagem três vezes com tampão de lavagem.

Após os passos de lavagem, foram adicionados aos poços designados 100 μΐ dos sobrenadantes de hibridoma ou de anticorpo purificado em coluna de Proteína G-Sepharose (10 μμ/ιηΐ) . Foram adicionados a outros poços designados como controlos 100 μΐ de meio condicionado de células de mieloma P3X63AgU.l. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora num aparelho de agitação e depois lavadas três vezes com tampão de lavagem.

Depois, foram adicionados a cada poço 50 μΐ de Fc de cabra anti-IgG de ratinho conjugado com HRP (adquirido em Cappel Laboratories), diluído 1:1000 em tampão de ensaio (albumina de soro bovino a 0,5%, Tween-20 a 0,05% em PBS) e as placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente num aparelho de agitação. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem, seguido de adição de 50 μΐ de substrato (TMB Microwell Peroxidase Substrate; Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) a cada poço e de incubação à temperatura ambiente durante 10 minutos. A reacção foi parada através da adição a cada poço de 50 μΐ de TMB 1-Component Stop Solution (Diethyl Glycol; Kirkegaard & Perry) e a absorvância a 450 nm foi lida num leitor de placas de microtítulo automático.

Os sobrenadantes dos hibridomas inicialmente pesquisados no ELISA foram considerados quanto à sua capacidade para se ligarem a DR4-IgG mas não a CD4-IgG. Os sobrenadantes que testaram positivo no ELISA foram ainda analisados através de análise de FACS utilizando células 9D (uma linha celular linfóide B humana que expressa DR4, Genentech, Inc.) e IgG de cabra anti-ratinho conjugada com FITC. Para esta análise, foram adicionados 25 μΐ de células suspensas (a 4xl06 células/ml) num tampão de separação de células (PBS contendo FCS a 1% e NaN3 a 0,02%) a placas de microtítulo com 66

ΕΡ 1 192 185 /PT fundo em U, misturados com 100 μΐ de sobrenadante de cultura ou de anticorpo purificado (10 μρ/ιηΐ) em tampão de separação de células e incubou-se durante 30 minutos em gelo. As células foram então lavadas e incubadas com 100 μΐ de IgG de cabra anti-ratinho conjugada com FITC a 4°C. As células foram então lavadas duas vezes, ressuspensas em 150 μΐ de tampão de separação de células e depois analisadas através de FACScan (Becton Dickinson, Moutain View, CA). A coloração de FACS das células 9D revelou que os anticorpos, 4E7.24.3 e 4H6.17.8, reconheceram o receptor DR4 nas células 9D. Os sobrenadantes dos hibridomas e os anticorpos purificados foram então testados quanto à actividade para induzir apoptose de células 9D mediada por DR4. As células 9D (5xl05 células/0,5 ml) foram incubadas com 5 μρ de mAb de DR4 (4E7.24.3 ou 4H6.17.8) ou anticorpos de controlo IgG em 200 μΐ de meio RPMI completo a 4°C durante 15 minutos. As células foram então incubadas durante 5 minutos a 37°C com ou sem 10 μρ de anticorpo Fc de cabra anti-IgG de ratinho (ICN Pharmaceuticals) em 300 μΐ de RPMI completo. Neste ponto, as células foram incubadas de um dia para o outro a 37°C e na presença de CO2 a 7%. As células foram então colhidas e lavadas uma vez com PBS. A apoptose das células foi determinada através de coloração da ligação de FITC-anexina V a fosfatidilserina de acordo com as recomendações do fabricante (Clontech). As células foram lavadas em PBS e ressuspensas em 2 00 μΐ de tampao de ligação. Foram adicionados às células 10 μι de anexina V—FITC (1 μρ/ml) e 10 μΐ de iodeto de propídio. Após incubação durante 15 minutos no escuro, as células 9D foram analisadas por FACS. Ambos os anticorpos de DR4 (na ausência de Fc de cabra anti-IgG de ratinho) induziram apoptose nas células 9D em comparação com os anticorpos de controlo. No entanto, a actividade agonista de ambos os anticorpos de DR4 foi aumentada através da ligação cruzada do receptor DR4 na presença de Fc de cabra anti-IgG de ratinho. Esta maior apoptose por ambos os anticorpos de DR4 é comparável com a actividade apoptótica de Apo-2L em células 9D. O estudo in vivo que examina os efeitos do anticorpo monoclonal 4H6.17.8 mais CPT-11 (em comparação com outros 67

ΕΡ 1 192 185 /PT grupos de tratamento indicados na Figura 2) foi conduzido essencialmente tal como descrito no Exemplo 1 acima, excepto que nos grupos de tratamento de anticorpo, o anticorpo anti-DR4 4H6 (5 mg/kg; preparado tal como descrito acima) foi administrado através de injecção i.p. nos ratinhos duas vezes por semana durante a duração do estudo. Nos grupos de tratamento de Apo-2L, o Apo-2L foi administrado através de i.p. nos dias 0-4 a 60 mg/kg/dia. Nos grupos de tratamento de CPT-11, CPT-11 foi administrado através de injecção i.v. nos dias 0, 4 e 8 a 80 mg/kg.

Os resultados são mostrados na Figura 2. Cada agente sozinho causou um atraso significativo na progressão do tumor. A combinação de Apo-2L ou anticorpo monoclonal anti-DR4 com CPT-11 causou regressão do tumor, com um tempo para a progressão do tumor muito mais atrasado em comparação com os tratamentos dos agentes sozinhos. O anticorpo monoclonal anti-DR4 foi mais eficaz que Apo-2L tanto como agente sozinho como em combinação com CPT-11. Uma resposta parcial (menor volume do tumor em mais de 50% do seu valor inicial) ocorreu em todos os 10 ratinhos tratados com o anticorpo anti-DR4 mais CPT-11, mas em apenas 6 dos 10 ratinhos tratados com o Apo-2L mais CPT-11. Estes resultados mostram que os agonistas do receptor de Apo-2L cooperam sinergicamente com CPT-11 para inibir a progressão do tumor para além da adição algébrica dos efeitos dos tratamentos dos respectivos agentes sozinhos.

Depósito de Material

Os seguintes materiais foram depositados na American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia, USA (ATCC):

Material Dep. ATCC 4E7.24.3 HB-12454 4H6.17.8 HB-12455 1H5.25.9 HB-12695 4G7.18.8 PTA-99 5G11.17.1 HB-12694 3F11.39.7 HB-12456 3H3.14.5 HB-12534 N.° Data de Depósito 13 de Janeiro de 1998 13 de Janeiro de 1998 01 de Abril de 1999 21 de Maio de 1999 01 de Abril de 1999 13 de Janeiro de 1998 02 de Junho de 1998 68

ΕΡ 1 192 185 /PT

Este depósito foi feito segundo as disposições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para Efeitos do Procedimento em Matéria de Patentes e seus Regulamentos (Tratado de Budapeste). Isto assegura a manutenção de uma cultura viável do depósito durante 30 anos desde a data do depósito. O depósito será disponibilizado pela ATCC segundo os termos do Tratado de Budapeste e sujeito a um acordo entre a Genentech, Inc. e a ATCC, que assegura a disponibilidade permanente e sem restrições da descendência da cultura do depósito ao público após publicação da patente U.S. pertinente ou após disponibilização ao público de qualquer pedido de patente U.S. ou estrangeira, conforme o que ocorrer primeiro, e assegura a disponibilidade da descendência a quem for determinado pelo U.S. Commissioner of Patents and Trademarks estar para isso qualificado de acordo com 35 USC Secção 122 e as regras do Commissioner correspondentes (incluindo 37 CFR Secção 1.14 com particular referência a 886 OG 683). O cessionário do presente pedido concordou que se uma cultura dos materiais em depósito morrer ou se perder ou for destruída quando cultivada sob condições adequadas, os materiais serão prontamente substituídos após notificação por outros iguais. A disponibilidade do material depositado não deve ser entendida como uma licença para a prática do presente invento em contravenção dos direitos concedidos pela autoridade de qualquer governo de acordo com as suas leis sobre patentes. A descrição escrita antecedente é considerada suficiente para permitir que um perito na especialidade ponha em prática o presente invento. O presente invento não deve ser limitado no seu âmbito pelos exemplos aqui apresentados. De facto, várias modificações do presente invento para além das mostradas e descritas aqui tornar-se-ão aparentes aos peritos na arte a partir da descrição antecedente e recaem dentro do âmbito das reivindicações anexas.

Lisboa,

Claims (21)

1. ΕΡ 1 192 185 /PT 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de anticorpo agonista anti-receptor do ligando Apo-2 no fabrico de um medicamento para a indução de apoptose em células cancerosas de mamífero, em que o medicamento é para administração concorrente ou sequencial com uma quantidade sinergicamente eficaz de CPT-11.
2. 2. Utilização de CPT-11 no fabrico de um medicamento para a indução de apoptose em células cancerosas de mamífero, em que o medicamento é para administração concorrente ou sequencial com uma quantidade sinergicamente eficaz de anticorpo agonista anti-receptor do ligando Apo-2.
3. 3. Utilização de uma quantidade sinergicamente eficaz de anticorpo agonista anti-receptor do ligando Apo-2 e de CPT-11 no fabrico de um medicamento para a indução de apoptose em células cancerosas de mamífero.
4. 4. Método para indução de apoptose em células cancerosas de mamífero em cultura celular ou ex vivo, compreendendo a exposição das células cancerosas de mamífero em cultura celular ou ex vivo a uma quantidade sinergicamente eficaz de anticorpo agonista anti-receptor do ligando Apo-2 e de CPT-11.
5. 5. Utilização ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 em que o referido anticorpo agonista compreende um anticorpo anti-receptor DR4.
6. 6. Utilização ou método de acordo com a reivindicação 5 em que o referido anticorpo anti-receptor DR4 é um anticorpo monoclonal.
7. 7. Utilização ou método de acordo com a reivindicação 6 em que o referido anticorpo monoclonal anti-receptor DR4 compreende um anticorpo quimérico.
8. 8. Utilização ou método de acordo com a reivindicação 6 em que o referido anticorpo monoclonal anti-receptor DR4 compreende um anticorpo humano. ΕΡ 1 192 185 /PT 2/3
9. 9. Utilização ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 em que o referido anticorpo agonista compreende um anticorpo anti-receptor DR5.
10. 10. Utilização ou método de acordo com a reivindicação 9 em que o referido anticorpo anti-receptor DR5 é um anticorpo monoclonal.
11. 11. Utilização ou método de acordo com a reivindicação 10 em que o referido anticorpo monoclonal anti-receptor DR5 compreende um anticorpo quimérico.
12. 12. Utilização ou método de acordo com a reivindicação 10 em que o referido anticorpo monoclonal anti-receptor DR5 compreende um anticorpo humano.
13. 13. Utilização ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 em que o referido anticorpo agonista anti-receptor do ligando Apo-2 é um anticorpo que reage de forma cruzada com mais de um receptor do ligando Apo-2.
14. 14. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em que o medicamento é para administração com um ou mais agentes inibidores do crescimento.
15. 15. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em que o medicamento é para administração com terapia de radiação.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 4, compreendendo ainda a exposição das células cancerosas a um ou mais agentes inibidores do crescimento.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 4, compreendendo ainda a exposição das células cancerosas a radiação.
18. 18. Utilização ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 em que as células cancerosas compreendem células de cancro colorrectal. ΕΡ 1 192 185 /PT 3/3
19. 19. Quantidade sinergicamente eficaz de anticorpo agonista anti-receptor do ligando Apo-2 e de CPT-11 para administração concorrente ou sequencial num método de tratamento médico.
20. 20. Composição compreendendo uma quantidade sinergicamente eficaz de anticorpo agonista anti-receptor do ligando Apo-2 e de CPT-11 num transportador.
21. 21. Estojo compreendendo uma quantidade sinergicamente eficaz de anticorpo agonista anti-receptor do ligando Apo-2 e de CPT-11 para administração concorrente ou sequencial no tratamento de cancro num mamífero. Lisboa,