JP2008500969A - Dr5抗体とその使用法 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、米国特許法119条に基づき、2004年4月6日提出の米国特許仮出願番号第60/559,928号の優先権を主張する出願であり、ここに出典明記により組み込まれるものである。
本発明は、DR5レセプターに結合する抗体に関する。そのような抗体は、例えばApo-2L及び/又はApo-2Lレセプターの生物学的活性の調節を目的とする方法で用いることができる。
様々な分子、例えば腫瘍壊死因子-α(「TNF-α」)、腫瘍壊死因子-β(「TNF-β」又は「リンホトキシン-α」)、リンホトキシン-β(「LT-β」)、CD30リガンド、CD27リガンド、CD40リガンド、OX-40リガンド、4-1BBリガンド、Apo-1リガンド(Fasリガンド又はCD95リガンドとも称される)、Apo−2リガンド(Apo2L又はTRAILとも称される)、Apo-3リガンド(TWEAKとも称される)、APRIL、OPGリガンド(RANKリガンド、ODF又はTRANCEとも称される)、及びTALL-1(BlyS、BAFF又はTHANKとも称される)が、サイトカインの腫瘍壊死因子(「TNF」)ファミリーのメンバーとして同定されている[例えば、Gruss及びDower, Blood, 85:3378-3404(1995);Schmidら, Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986);Dealtryら, Eur. J. Immunol., 17:689 (1987);Pittiら, J. Biol. Chem., 271:12687-12690(1996);Wileyら, Immunity, 3:673-682(1995);Browningら, Cell, 72:847-856(1993);Armitageら, Nature, 357:80-82(1992), 1997年1月16日公開のWO97/01633;1997年7月17日公開のWO97/25428;Marstersら, Curr. Biol., 8:525-528(1998);Chicheporticheら, Biol. Chem., 272:32401-32410(1997);Hahneら, J. Exp. Med., 188:1185-1190(1998);1998年7月2日公開のWO98/28426;1998年10月22日公開のWO98/46751;1998年5月7日公開のWO/98/18921;Mooreら, Science, 285:260-263(1999);Shuら, J. Leukocyte Biol., 65:680(1999);Schneiderら, J. Exp. Med., 189:1747-1756(1999);Mukhopadhyayら, J. Biol. Chem., 274:15978-15981(1999)参照]。これらの分子のなかでも、TNF-α、TNF-β、CD30リガンド、4-1BBリガンド、Apo-1リガンド、Apo−2リガンド(Apo2L/TRAIL)及びApo-3リガンド(TWEAK)は、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告されている。
Apo2L/TRAILは、リウマチ様関節炎のような自己免疫疾患を含む免疫系の調節、及びHIVの治療に役割を担っている可能性があることが文献において報告されている[例えば、Thomasら, J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsenら, Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffithら, J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Songら, J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000);Jeremias ら., Eur. J. Immunol., 28:143-152 (1998);Katsikis ら., J. Exp. Med., 186:1365-1372 (1997);Miura ら., J. Exp. Med., 193:651-660 (2001)]。
そのようなTNFファミリーのサイトカインが介在する種々の細胞応答の誘導は、特異的な細胞レセプターに結合することにより開始されると考えられている。既に、約55-kDa(TNFR1)と75-kDa(TNFR2)の2つの異なるTNFレセプターが同定されている[Hohmanら, J. Biol. Chem., 264:14927-14934(1989);Brockhausら, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131(1990);1991年3月20日に公開された欧州特許第417563号;Loetscherら, Cell, 61:351(1990);Schallら, Cell, 61:361(1990);Smithら, Science, 248:1019-1023(1990);Lewisら, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834(1991);Goodwinら, Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026(1991)]。それらのTNFRが細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面レセプターの典型的な構造を共有している。双方のレセプターの細胞外部分はまた可溶型TNF結合タンパク質として天然に見出されている[Nophar, Yら, EMBO J., 9:3269(1990);及びKohno, Tら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:8331(1990);Hale等[J. Cell. Biochem. 増補15F, 1991, p.113(P424)]。
Sheridanら, Science, 277: 818-821 (1997)及びパンら, Science, 277: 815-818 (1997)においては、Apo−2L/TRAILに対するレセプターと思われる他の分子が記載されている[1998年11月19日に公開の国際公開98/51793;1998年9月24日公開の国際公開98/41629もまた参照のこと]。この分子は、DR5と呼ばれる(あるいは、Apo−2;TRAIL-R、TR6、Tango-63、hAPO8、TRICK2又はKILLERとも呼ばれている[例としてScreatonら, Curr. Biol., 7:693-696 (1997);Walczakら, EMBO J., 16:5386-5387 (1997);Wuら, Nature Genetics, 17:141-143 (1997);1998年8月20日公開の国際公開98/35986;1998年10月14日公開の欧州特許第870,827号;1998年10月22日公開の国際公開98/46643;1999年1月21日公開の国際公開99/02653;1999年2月25日公開の国際公報99/09165;1999年3月11日公開の国際公報99/11791;2002年8月13日公開の米国公開特許2002/0072091;2001年12月7日公開の米国公開特許2002/0098550;2001年12月6日発行の米国特許第6,313,269号;2001年8月2日公開の米国公開特許2001/0010924;2003年7月3日公開の米国公開特許2003/01255540;2002年10月31日公開の米国公開特許2002/0160446、2002年4月25日公開の米国公開特許2002/0048785;2003年5月27日発行の米国特許第6,569,642号;2000年6月6日発行の米国特許第6,072,047号;2003年11月4日発行の米国特許第6,642,358号)。DR4と同様に、DR5は細胞質デスドメインを含み、アポトーシスをシグナル伝達可能であると報告されている。Apo−2L/TRAIL及びDR5の間に形成される複合体の結晶構造はHymowitzら, Molecular Cell, 4:563-571 (1999)に記載されている。
Apo−2L/TRAILは細胞表面「デスレセプター」DR4及びDR5を通して作用してカスパーゼ、又は細胞死プログラムを実施する酵素を活性化させると考えられている。リガンド結合の際、DR4とDR5は、双方共、FADD/Mort1[Kischkelら, Immunity, 12:611-620 (2000); Sprickら, Immunity, 12:599-609 (2000); Bodmerら, Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)]と称されるデスドメイン含有アダプター分子を通してアポトーシス発動因子であるカスパーゼ-8を独立して補充し活性化することによってアポトーシスを惹起しうる。DR4及びDR5とは対照的に、DcR1及びDcR2レセプターはアポトーシスをシグナル伝達しない。
サイトカインのTNFファミリー及びそれらのレセプターの概説については、Ashkenazi及びDixit, Science, 281:1305-1308(1998);Ashkenazi及びDixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000);Golstein, Curr. Biol., 7:750-753(1997);上掲のGruss及びDower;Nagata, Cell, 88:355-365(1997);Locksleyら, Cell, 104:487-501 (2001);Wallach, “TNF Ligand and TNF/NGF Receptor Families”, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, 377-411頁を参照。
本発明は、DR5レセプターに結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体は、単量体、二量体、三量体、四量体、又はより高次のオリゴマー型である。場合によっては、抗体はオリゴマー複合体形成を容易にする異種性ペプチド配列に融合した抗体を含んでなるキメラ分子又は融合タンパク質である。一実施態様では、抗体は、DR5レセプターとApo−2Lの相互作用を阻害する。場合によっては、抗体は、少なくとも一のApo−2L関連生物学的活性、例えばDR5レセプターを介したアポトーシスの誘導のアゴニストである。
ある実施態様では、抗DR5抗体は、図6、7又は8に記載のCDR-H1、CDR-H2又はCDR-H3として示す一又は複数のアミノ酸残基又は配列を含む。場合によっては、抗DR5抗体は、図6、7又は8に記載のCDR-H1、CDR-H2又はCDR-H3に示す配列と少なくとも80%の同一性を有する一又は複数のアミノ酸配列を含む。更なる実施態様では、抗DR5抗体は、図6、7又は8に記載のCDR-H1、CDR-H2又はCDR-H3に示す配列と少なくとも95%の同一性を有する一又は複数のアミノ酸配列を含んでもよい。場合によっては、本発明のDR5抗体は、(以下の実施例に開示するような)BIAcore結合アッセイの測定による約0.1nMから約20mMの範囲の濃度でDR5レセプターに結合する。場合によっては、本発明のDR5抗体は、(以下の実施例に開示するような)BIAcore結合アッセイの測定による約0.6nMから約18mMのIC50値を示す。
本発明のDR5レセプター抗体は、当分野に公知の様々な方法のうちの何れかを用いて修飾されうる。本発明の好適な実施態様では、本発明の抗体は異種性分子又はポリペプチド配列に結合される。場合によっては、異種性ポリペプチド配列はロイシンジッパードメインである。場合によっては、異種性配列はアミノ酸配列グリシン-グリシン-メチオニンを含んでなる。場合によっては、抗体は一又は複数のリンカー分子又はポリオール基とコンジュゲート又は結合してもよい。
本発明のある実施態様では、抗体はApo-2LとDR5との間の相互作用をブロック又は阻害する。場合によっては、抗体は一又は複数の哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導する。
また、本明細書に記載の抗体をコードする単離された核酸も提供され、例えばインビボ又はエクスビボ遺伝子治療に用いられうる。
本発明の他の実施態様は、哺乳動物細胞のApo−2L及び/又はApo−2Lレセプターの生物学的活性の調節方法である。本発明の好ましい実施態様は、哺乳動物細胞を有効量のここに記載のDR5レセプター抗体に曝すことを含む、哺乳動物細胞のアポトーシス誘導方法である。前記哺乳動物細胞は例えば癌細胞でもよい。更なる態様では、本発明は、哺乳動物に有効量の本発明で提供されるDR5レセプター抗体を場合によっては注射又は輸液によって投与することを含む、哺乳動物の癌又は免疫関連疾患等の疾患の治療方法を提供する。場合によっては、疾患は癌、特に乳癌、肺癌又は大腸癌(又は直腸結腸癌)又は神経膠癌である。ここに記載の抗体は単独又は他の薬剤と共に投与されうる。
本発明の更なる他の実施態様は、ここに記載の抗体を内包する容器と、抗体の使用についての印刷された指示書を含んでなる製造品である。場合によっては、容器は、ボトル、バイアル、シリンジ又は試験管である。場合によっては、製造品は、注射用水、生理食塩水、リンガー溶液又はブドウ糖溶液を内包する第2の容器を含む。
1.図6、7又は8に記載の一又は複数のアミノ酸配列を含んでなる単離された抗DR5抗体。
2.重鎖及び軽鎖を含んでなり、該重鎖が図6、7又は8に記載の一又は複数のアミノ酸配列を含有する可変領域を含むものである単離された抗DR5抗体。
3.前記重鎖及び前記軽鎖が可動性リンカーにより結合されて一本鎖抗体となる、請求項2に記載の抗体。
4.一本鎖Fv抗体である、請求項3に記載の抗体。
5.Fab抗体である。請求項2に記載の抗体。
6.完全にヒトである、請求項2に記載の抗体。
7.DR5レセプターに特異的に結合し、DR4レセプター、DcR1レセプター又はDcR2レセプターに結合しない、請求項1又は請求項2に記載の抗体。
8.少なくとも一種類の哺乳動物癌細胞においてアポトーシスを誘導する、請求項1又は請求項2に記載の抗体。
9.Apo-2リガンドのDR5レセプターへの結合をブロック又は阻害する、請求項1又は請求項2に記載の抗体。
10.請求項1ないし9の何れか一の抗体と担体を含んでなる組成物。
11.請求項10に記載の組成物を投与することを含む、哺乳動物の疾患の治療方法。
12.前記疾患が免疫関連疾患である、請求項11に記載の方法。
13.前記疾患が癌である、請求項11に記載の方法。
A.定義
「TNFファミリーメンバー」は広範囲の意味に使用され、構造又は機能に関し、腫瘍壊死因子(TNF)にある程度の類似性を共有する種々のポリペプチドを称する。TNFファミリーのポリペプチドに関連したある種の構造的及び機能的特徴は、当該分野において公知であり、例えば、上述した本発明の背景に記載されている。限定されるものではないが、このようなポリペプチドには、当該分野でTNF-アルファ、TNF-ベータ、CD40リガンド、CD30リガンド、CD27リガンド、OX-40リガンド、4-1BBリガンド、Apo-1リガンド(Fasリガンド又はCD95リガンドとも称される)、Apo-2L/TRAIL(TRAILとも称される)、Apo-3リガンド(TWEAKとも称される)、APRIL、OPGリガンド(RANKリガンド、ODF又はTRANCEとも称される)、及びTALL-1(B1yS、BAFF又はTHANKとも称される)と称されるポリペプチドが含まれる[例えば、Gruss及びDower, Blood 1995, 85:3378-3404;Pittiら, J. Biol. Chem., 1996, 271:12687-12690;Wileyら, Immunity, 1995, 3:673-682;Browning等, Cell, 1993, 72:847-856 ;Armitage等, Nature 1992, 357:80-82 、国際公開第97/01633号;国際公開第97/25428号;Marstersら, Curr. Biol., 1998, 8:525-528;Chicheporticheら, Biol. Chem. 1997, 272:32401-32410;Hahneら, J. Exp. Med. 1998, 188:1185-1190;国際公開第98/28426号;国際公開第98/46751号;及び国際公開第98/18921号;Mooreら, Science 1999, 285:260-263;Shuら, J. Leukocyte Biol. 1999, 65:680;Schneiderら, J. Exp. Med., 1999,189:1747-1756;Mukhopadhyayら, J. Biol. Chem. 1999, 274:15978-15981(1999)を参照のこと]。
場合によっては、本発明のDR5抗体は、(例えば以下の実施例に開示するような)BIAcore結合アッセイの測定による約0.1nMから約20mMの範囲の濃度でDR5レセプターに結合する。場合によっては、本発明のDR5抗体は、(例えば以下の実施例に開示するような)BIAcore結合アッセイの測定による約0.6nMから約18mMのIC50値を示す。
「Apo2L/TRAIL単量体」又は「Apo2L単量体」なる用語は、Apo2Lの細胞外ドメイン配列の共有鎖を称する。
「Apo2L/TRAIL二量体」又は「Apo2L二量体」なる用語は、ジスルフィド結合を介して共有結合に連結した2つのApo-2Lモノマーを称する。ここで使用される場合の用語には、独立したApo2L二量体、及び三量体形態のApo2Lが範囲に入る二量体(すなわち、互いに結合した、第2のApo2L単量体)が含まれる。
「Apo2L/TRAIL三量体」又は「Apo2L三量体」なる用語は、非共有結合している3つのApo2L単量体を称する。
「Apo2L/TRAIL凝集体」なる用語は、自己結合した高級オリゴマー性形態のApo2L/TRAIL、例えばApo2L/TRAIL三量体、さらには六量体及びナノ量体(nanomeric)の形態のApo2L/TRAILを形成するものを称するために使用する。Apo2L/TRAIL単量体、二量体又は三量体(又は他の凝集体)の存在性及び量の決定は、当該分野で公知の方法及びアッセイ(市販されている物質を使用)、例えば天然サイズ排除HPLC(「SEC」)、ドデシル硫酸ナトリウムを使用する変性サイズ排除(「SDS-SEC」)、逆相HPLC、キャピラリー電気泳動によりなされ得る。
「アゴニスト」なる用語は広義で用いられ、Apo2L/TRAIL、DR4ないしDR5のインビトロ、インサイツないしインビボでの一以上の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化する任意の分子を含む。Apo2L/TRAIL、DR4ないしDR5の生物学的活性の例には、DR4又はDR5へのApo2L/TRAILの結合、アポトーシス並びに更に文献に報告されているものが含まれる。アゴニストは直接的ないし間接的形式で機能しうる。例えば、アゴニストは、レセプター活性化又はシグナル伝達を起こすDR4ないしDR5への直接的結合の結果としてのインビトロ、インサイツないしインビボでのDR4ないしDR5の一以上の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化するために機能するかもしれない。また、アゴニストは、例えば、DR4又はDR5の活性化ないしシグナル伝達を引き起こす他のエフェクター分子を刺激する結果としてのDR4ないしDR5のインビトロ、インサイツないしインビボでの一以上の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化するために間接的に機能するかもしれない。アゴニストは、DR4ないしDR5の活性化ないし活性を亢進又は増強するように間接的に機能するエンハンサー分子として働きうることが考えられる。例えば、アゴニストは哺乳動物の内因性のApo−2Lの活性を亢進しうる。例えば、これはDR4ないしDR5をプレ複合体化することによって、ないし、DR4ないしDR5レセプターとのそれぞれのリガンドの複合体を安定化することによって達成することができる(Apo−2LとDR4ないしDR5との天然複合体型を安定化するなど)。
「単離された」とは、ここで開示された種々のペプチド又はタンパク質を記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収されたペプチド又はタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、タンパク質の診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ペプチド又はタンパク質は、(1)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、N末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに充分なほど、あるいは、(2)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性が得られるように充分なほど、又は(3)質量分光分析又はペプチドマッピング技術による均一性が得られるように充分なほど精製される。その自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された材料には、組換え細胞内のインサイツのペプチド又はタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたペプチド又はタンパク質は少なくとも一の精製工程により調製される。
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, New York:Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように同定され、20%ホルムアミド、5×SSC(150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハート液、10%デキストラン硫酸、及び20mg/mLの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中にて37℃で終夜インキュベーション、次いで1×SSC中にておよそ37−50℃でフィルターの洗浄を含む。当業者であれば、プローブ長等の因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのDNAに作用可能に結合している;プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している;又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
「ヒトエフェクター細胞」とは、1つ又は複数のFcRsを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。好ましくは、その細胞が少なくともFcγRIIIを発現し、ADCCエフェクター機能を実行する。ADCCを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、細胞障害性T細胞及び好中球が含まれるが、PBMCとNK細胞が好適である。
ここで「抗体」なる用語は、広い意味で用いられ、特に無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの無傷の抗体から形成した多特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び所望の生物学的活性を有する限りにおける抗体断片の範囲にわたる。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Fab、Fab’、F(ab’)2及びFv断片;ダイアボディ;線形抗体;一本鎖抗体分子;及び抗体断片から形成された多特異性抗体が含まれる。
「天然抗体」は、通常、2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖からなる、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(VH)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(VL)を、他端に定常ドメインを有する;軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Fc」断片と命名される。ペプシン処理はF(ab')2断片を生じ、それは2つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
またFab断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(CH1)を有する。Fab'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖CH1領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でFab断片とは異なる。Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を担持しているFab'に対するここでの命名である。F(ab')2抗体断片は、間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体は異なるクラスが割り当てられる。無傷の抗体には5つの主なクラスがある:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgM、更にそれらは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、及びIgA2等のサブクラス(イソ型)に分かれる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。
「一本鎖Fv」又は「scFv」抗体断片は、抗体のVH及びVLドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、FvポリペプチドはVH及びVLドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはscFvが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。scFvの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養により合成され、他のイムノグロブリンの混入がないという利点がある。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要として構築したものであることを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えDNA法によって作ることができる(例えば米国特許第4816567号を参照のこと)。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks等, J. Mol. biol. 222: 581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから作成することもできる。
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒトイムノグロブリン(免疫グロブリン)に由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ヒト免疫グロブリン配列の高頻度可変ループがFRのすべて又は実質的にすべてである少なくとも一又は一般的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Fc)の一部、一般的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986);Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
目的の抗原、例えば、DR5レセプターに「結合する」抗体とは、抗体が抗原発現細胞を標的とした治療薬又は診断剤として有用となるように十分な親和性及び/又は結合活性を有して抗原に結合することができるものである。
ここでの目的のための「免疫治療」とは、抗体を用いた哺乳動物(好ましくはヒト患者)の治療方法を意味し、この抗体はコンジュゲートされたもの又は「ありのままの」抗体でもよいし、又は一又は複数の細胞障害性剤などの薬剤やヘテロ分子とコンジュゲート又は融合して、それによって「免疫コンジュゲートを生成してもよい。
「治療的有効量」という用語は、疑われる疾患又は症状を予防、寛解又は治療するのに効果的なDR5抗体の量を意味する。
ここで用いられる「細胞障害剤」という用語は、細胞の機能を阻害し又は妨害し、及び/又は細胞の破壊を引き起こす物質を称する。この用語は放射性アイソトープ(例えば、I131、I125、Y90及びRe186)、化学療法剤、及び細菌性、真菌性、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素等の毒素又はその断片を含むことが意図されている。
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、典型的には、細胞質の凝集、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体DNAの分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴う、哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形態を称する。この活性は、当該分野で公知の、例えば細胞生死判別アッセイ(例えばアラマーブルーアッセイ又はMTTアッセイ)、FACS分析、カスパーゼ活性化、DNA断片化(例えば、Nicolettiら, J. Immunol. Methods, 139:271-279(1991)を参照)、ポリ-ADPリボースポリメラーゼ、「PARP」、切断アッセイにより、決定し測定することができる。
「癌」、「癌性」又は「悪性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を称するか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、白血病、芽細胞腫、及び肉腫が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、消化管癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、神経芽細胞種、膵臓癌、多形成膠芽腫、子宮頸癌、脳癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫(hepatoma)、乳癌、結腸癌、及び頭部及び頸部の癌が含まれる。
ここで使用される「処置する」又は「処置」又は「治療」とは、治癒的治療、予防的治療又は防止的治療を称する。連続的治療又は投与とは、一又は複数の日数、治療を中断することなく、少なくとも毎日であることを基本とし治療を行うことを称する。断続的治療又は投与、もしくは断続的な方法での治療又は投与とは、連続させることなく、むしろ事実的には周期的に治療することを称する。
ここで使用される「哺乳動物」なる用語は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを含む、哺乳類に分類される任意の哺乳動物を称する。本発明の好ましい実施態様において、哺乳動物はヒトである。
この出願では、特に示さない限り、特異的な使用に複数を含む。
ここに記載の本発明は、DR5レセプターに結合する抗体に関する。場合によっては、抗体はApo−2LとDR5との相互作用を阻害するアンタゴニストである。あるいは、抗体はDR5シグナル伝達活性のアゴニストである。
本発明のDR5抗体の生成方法を本明細書中に記載する。抗体の生成又は抗体のスクリーニングために用いられる抗原は、抗原あるいは所望のエピトープを含む抗原の一部の可溶型でもよい。あるいは又は加えて、細胞表面に抗原を発現する細胞を用いて抗体を生成、抗体のスクリーニングも可能である。抗体を生成するのに有用な抗原の他の型は当分野の技術者に周知である。
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより動物に産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに関連抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基による抱合)、N-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、又はRとR1が異なったアルキル基であるR1N=C=NRにより抱合させることが有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート100μg又は5μg(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント3容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。1ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の1/5ないし1/10のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。7ないし14日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び/又は異なった架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
モノクローナル抗体は実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、わずかながら存在する起こりうる天然に生じる突然変異体を除いて同一である。よって、「モノクローナル」との修飾詞は、別個の抗体の混合物ではなく、抗体の特性を示すものである。
例えば、モノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えDNA法(米国特許第4,816,567号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、HGPRT欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(HAT培地)。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)又は酵素結合免疫吸着検定(ELISA)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonほか, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
モノクローナル抗体をコードしているDNAは、常法を用いて(例えば、マウスの重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたならば、DNAを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするDNAの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerraら, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPlueckthum, Immunol. Revs., 130:151-188(1992)がある。
DNAはまた、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を、相同的マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第4,816,567号;Morrisonら, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることで修飾できる。
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対する特異性を有する1つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
非ヒト抗体をヒト化する方法は従来からよく知られている。好ましくは、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのFR残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(FR)として受け入れる(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993);Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993))。
ヒト化のための別法により、ヒト抗体を生産することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovitsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993);Jakobovitsら, Nature 362:255-258 (1993);Bruggermanら, Year in Immuno., 7:33 (1993);米国特許第5,591,669号、同5,589,369号及び同5,545,807号を参照されたい。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してF(ab')2断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Fv断片(scFV)である。国際公開第93/16185号;米国特許第5,571,894号;及び米国特許第5,587,458号を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第5,641,870号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。
二重特異性抗体は少なくとも2つの異なるエピトープについて結合特異性を有する抗体である。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片として調整できる(例えばF(ab')2二重特異性抗体)。
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millsteinら, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は10個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法がWO93/8829及びTrauneckerら、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、CH2及びCH3領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(CH1)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているDNAを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、コンストラクトに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、2または3個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
米国特許第5,731,168号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第1抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第2の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合抗体」を含む。例えば、ヘテロ抱合体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること(米国特許第4,676,980号)及びHIV感染の治療(国際公報91/00360、国際公報92/200373及び欧州特許第03089号)等の用途が提案されてる。ヘテロ抱合抗体は適当な架橋方法によって生成できる。当技術分野においては、適切な架橋剤は周知であり、それらは複数の架橋法と共に米国特許第4,676,980号に記されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985);Shalabyら,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。3以上の抗原結合部位を有する抗体は国際公報01/77342(Miller及びPresta)に記載されており、特別に出典明記によりここに組み込まれる。
そのような抗体-細胞障害性剤コンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は前述している。
また、抗体と一つ以上の小分子毒素のコンジュゲート、例えばカリケアミシン(calicheamicin)、マイタンシン(maytansine)(米国特許第5,208,020号)、トリコテン(trichothene)及びCC1065もここにおいて考慮される。本発明の一実施態様では、アンタゴニストは、一つ以上のマイタンシン(maytansine)分子(例えば、抗体分子当たり約1から約10のメイタンシン分子)と共役している。マイタンシンは、例えばMay−SH3へ還元されるMay−SS−Meへ変換され、修飾抗体(Chariら,Cancer Research 52:127-131(1992))と反応してメイタンシノイド(maytansinoids)-抗体コンジュゲートを生じる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素A鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシン(modeccin)A鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP-S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、1993年10月28日に公開の国際公開第93/21232を参照のこと。
本発明は、更に、核酸分解性活性(例えば、リボヌクレアーゼ又はDNAエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ;DNA分解酵素)と化合物との抗体コンジュゲートについて考慮する。
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオール)プロピオナート(SPDP)、スクシインミジル1-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート、イミノチオラン(IT)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートHCL)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えば、ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-2,6-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-14標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(MX-DTPA)をアンタゴニスト又は抗体に放射性ヌクレオチドにコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開94/11026号を参照されたい。リンカーは、細胞内で細胞毒性薬剤を放出を容易にする「切断可能なリンカー」でもよい。例えば、酸易動性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー(Chari等 Cancer Research 52: 127-131 (1992))を用いてもよい。
また、本発明の抗体を、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公報81/01145を参照)を活性な抗癌剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素にコンジュゲートさせてもよい。例えば国際公報88/07378及び米国特許第4,975,278号を参照されたい。
そのようなコンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。
抗体の他の修飾がここで検討される。例えば、抗体は、様々な非タンパク質性(nonproteinaceous)のポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン類、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーの1つに結合させてもよい。
抗体の血清半減期を延長するために、例として米国特許第5739277号に記載されているように抗体(特に抗体断片)内にサルベージレセプター結合エピトープを組み込む方法がある。ここで用いる、「サルベージレセプター結合エピトープ」は、IgG分子のインビボ血清半減期延長に関与するIgG分子(例えば、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4)のFc領域のエピトープを表す。あるいは又は付加的に、変更したFcRn結合を有する変異形を産生するために抗体のFc領域のアミノ酸配列を変更することによって血清半減期を延長又は短縮しうる。FcRn結合及び/又は血清半減期を変更した抗体は国際公報00/42072(Presta, L)に記載されている。
抗体上の適切な架橋部位は、N末端アミノ及びC末端カルボキシル基を除いて、ペプチドの内部残基又は隣接配列に導入される残基の側鎖に位置する水酸基、スルフヒドリル、カルボキシル、イミノ、アミノ、並びにリジン残基上にみられるイプシロンアミノ基を含む。外部から添加する架橋剤による架橋は、例えば当分野で公知の多くの試薬のうちの何れかを用いるなどして、ポリペプチドのカルボジイミド処理を経て好適に達成される。適切な多官能価(通常二機能性)の架橋剤の他の例は、文献に示される。
ここでの一般的な製剤の調製において、使用される成分の推奨される質又は「等級」は、製剤の最終的な用途に依存する。治療用途において、成分(群)は製薬品への添加剤として許容可能な等級(例えば「GRAS」)のものであることが好ましい。
ある実施態様では、DR5レセプター抗体と、抗体の溶解度及び/又は安定性を高めるのに十分なイオン強度を付与する賦形剤を含有する組成物が提供され、その組成物は6(又は約6)〜9(又は約9)のpHを有する。抗体は、例えば上述した方法のような、所望の純度のタンパク質を達成するのに適した任意の方法で調製され得る。ある実施態様では、DR5抗体は、宿主細胞において組換え的に発現されるか、化学的合成法により調製される。製剤中の抗体の濃度は、例えば製剤の意図される用途に応じて変わりうる。当業者であれば、過度の実験をすることなく、DR5抗体の所望の濃度を決定することができる。
組成物は、好ましくは6(又は約6)〜9(又は約9)、より好ましくは約6.5〜約8.5、さらに好ましくは約7〜約7.5のpHを有する。この実施態様の好ましい側面では、組成物は、組成物のpHを少なくとも約6〜約8に保持するためのバッファーをさらに含有する。使用され得るバッファーの例には、限定されるものではないが、Tris、HEPES及びヒスチジンが含まれる。Trisを使用する場合、pHは、場合によっては約7〜約8.5に調節され得る。Hepes又はヒスチジンを使用する場合は、pHは、場合によっては約6.5〜7に調節され得る。場合によっては、バッファーは、製剤中で約5mM〜約50mMの濃度で使用される。
本発明の製剤は、DR5抗体に加えて、上述した成分、さらには種々の例えばの賦形剤又は成分を含有していてもよい。場合によっては、製剤は、非経口投与のために、製薬的又は非経口的に許容可能な担体、すなわち使用される濃度及び用量で受容者に対して毒性がなく、製剤の他の成分と融和性のあるものを含有してよい。場合によっては、担体は非経口用担体、例えば受容者の血液と等張な溶液である。このような担体ビヒクルの例には、水、生理食塩水、又は緩衝溶液、例えばリン酸緩衝液(PBS)、リンガー液及びデキストロース液が含まれる。種々の任意の製薬的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th, Osol, A.編(1980)に、さらに記載されている。
最終製剤が液体である場合、好ましくは≦20℃で凍らせて保存される。また、製剤は凍結乾燥することもでき、場合によっては2−30℃で保存されうる注射用の水で再構成されるパウダーとして提供することができる。
治療投与に使用される製剤は無菌でなければならない。滅菌は、滅菌濾過膜(例えば0.2ミクロンの膜)を通した濾過により容易に達成される。治療用組成物は、一般的に無菌のアクセスポート、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルを具備する容器に配されている。
組成物は通常、単位毎又は多数回用量容器、例えば封入されたアンプル又はバイアルに、水溶液、又は再構成用の凍結乾燥された製剤として貯蔵される。容器は、当該分野で任意の入手可能な容器で、常法を用いて充填されるものであってよい。場合によっては、製剤は、注射ペン装置(又は、ペン装置に嵌合するカートリッジ)、例えば製剤の治療的送達に適した、当該分野で入手可能なもの(例えば、米国特許第5370629号を参照)に収容されうる。注射用溶液は、例えば注射用の水を使用し、凍結乾燥されたDR5抗体製剤を再構成することにより調製することができる。
ここに記載のDR5抗体は、様々な治療的及び非治療的手段で用いることができる。これらの手段の中には、癌、免疫関連症状又はウイルス症状などの疾患を治療する方法がある。そのような治療的及び非治療的手段は、例えば国際公報97/25428、国際公報97/01633及び国際公報01/22987に更に記載されている。
本発明は、DR5抗体をコードする核酸を用いて、哺乳動物を治療することを目的とした遺伝子治療の使用を含む。DR5抗体をコードする核酸をこの目的で用いることができる。アミノ酸配列が公知になると、遺伝子コードの縮重を用いて様々な核酸分子を精製し、遺伝子治療に使用できるものを選択することができる。
遺伝子治療を目的として患者の細胞内に核酸を(場合によってはベクターに内包して)入れる方法には主に二つある:インビボ及びエクスビボ。インビボ送達のために、核酸は、患者に、通常DR5抗体が必要とされる部位に直接注入する。エクスビボ送達のために、患者の細胞を取り出し、核酸をこの単離した細胞に導入し、修飾した細胞を直接的又は、例えば患者内に埋めこんだ小胞膜内にカプセル抱合するかのいずれかにて患者に投与する。例として、米国特許第4892538号及び同第5283187号を参照。
近年の好ましいインビボ核酸移入技術には、ウイルスベクターを用いた形質移入(例として、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス又はアデノ関連ウイルス)、及び脂質を元にしたシステム(例えば、遺伝子の脂質媒介性移入に有用な脂質はDOTMA、DOPE及びDC-Cholである)が含まれる。ある場合には、核酸源に標的細胞を標的とした薬剤、例えば細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターのリガンドなどを供給することが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシス関連の細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、例えば、特定の細胞型に対して親和性があるカプシドタンパク質又はその断片、循環時に内部移行されるタンパク質に対する抗体、及び細胞内の限局した部位を標的として細胞内半減期を亢進するタンパク質のターゲティング及び/又は取り込みを促進するために用いてもよい。レセプター媒介性エンドサイトーシスの技術は、例としてWu等., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987);及び Wagner等., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990)に記載されている。近年公知になった遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコールの概観については、Anderson 等., Science, 256: 808-813 (1992)を参照のこと。また、国際公報 93/25673及びここに挙げた文献も参照のこと。
注射の浸透圧は、皮下及び筋肉内注射において重要であり得る。注射用溶液が低張又は高張であると、注入時に、患者に痛みが生じるおそれがある。通常、ここで治療用の注射用製剤は、注射用溶液の相対浸透圧が約300mosm〜約600mosmになるようにされることが好ましい。
さらに付加的な治療が本方法において使用され得ることを考慮する。一又は複数の他の治療には、限定されるものではないが、放射線治療、サイトカイン(類)、成長阻害剤(類)、化学治療剤(類)、細胞障害剤(類)、チロシンキナーゼインヒビター、rasファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、血管形成インヒビター、及びサイクリン依存性キナーゼインヒビターなど、当該分野で公知であり、更に上記に定義されるものであり、DR5抗体と組み合わせて(例えば、同時に又は連続して)投与しうるものの投与が含まれる。さらに、治療は、CD20抗体(RituxanTMを含む)又はHerレセプター抗体(HerceptinTMを含む)等の腫瘍又は他の細胞抗原を標的にする治療用抗体、並びに抗-血管形成抗体、例えば抗VEGF、又はApo2Lレセプター、例えばDR4を標的にする抗体をベースにしている。
また、他の抗原に対する抗体、例えばCD20、CD11a、CD18、CD40、ErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4、血管内皮因子(VEGF)、又は他のTNFRファミリーのメンバー(例えば、OPG、DR4、TNFR1、TNFR2)に結合する抗体を投与することも好ましい。別法として、あるいは付加的に、ここに開示した同一の又は二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。しばしば、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有利である。
上記したように、本発明のDR5抗体は様々な有用性を有する。例えば、DR5作用性ペプチドは、哺乳動物の病的状態、例えば癌又は免疫関連疾患の治療方法に用いてもよい。ここで記載されている様々な病的状態の哺乳動物の診断は、熟練した専門家によってなされることができる。診断用技術は、例えば、哺乳動物の癌又は免疫関連疾患の診断ないし検出をする分野において有用である。例えば、癌は、限定するものではないが、触診、血液分析、X線、NMRなどを含む技術により同定してもよい。また、免疫関連疾患は直ちに同定されうる。全身エリテマトーデスにおいて、疾患の中心的媒体は、自己タンパク質/組織に対する自己応答性抗体の生成と続いて起こる免疫媒介性炎症である。腎臓、肺、筋骨格系、皮膚粘膜、目、中枢神経系、心血管系、消化管、骨髄及び血液を含む多数の器官および系が、臨床的に影響を受ける。
脊椎関節症は、いくつかの共通した臨床的特徴とHLA-B27遺伝子産物の発現との共通の関連性を持つ疾患のグループである。該疾患には:Bechterew氏病(ankylosing sponylitis)、ライター症候群(反応性関節炎)、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。顕著な特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎;炎症非対称性関節炎;HLA-B27(クラスI MHCのHLA-B座位にある血清学的に定義された対立遺伝子)との関連;眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導に対する鍵として最も関わっている細胞はCD8+Tリンパ球で、クラスI MHC分子により提示される抗原を標的としている細胞である。CD8+T細胞は、MHCクラスI分子により発現された外来ペプチドであるかのように、クラスI MHC対立遺伝子HLA-B27に対して反応する。HLA-B27のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原性エピトープを模倣し、よってCD8+細胞の反応を誘発すると仮定されている。
皮膚筋炎、多発性筋炎及び他のものを含む特発性炎症ミオパシーは病因がよく知られていない慢性筋肉炎症疾患であり、筋肉の弱化に至る。筋肉損傷/炎症は多くの場合対照的で進行性である。自己抗体は多くの形態と関連している。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に関与する成分、タンパク質及びRNAに対して産生されその機能を阻害する。
全身性血管炎症は一次病巣が炎症で、続いて血管にダメージを受け、結果として冒された脈管により供給される組織に虚血/壊死/変性が生じ、いくつかのケースでは最終的な末端器官機能障害になるといった疾患である。また、血管炎(vasculitides)は他の免疫炎症媒介疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性硬化症等、特に免疫複合体の生成に関連した疾患等の続発症として又は二次病変として生じる場合がある。原発性全身性血管炎症グループの疾患には:全身壊死性血管炎:多動脈炎結節(polyarteritis nodosa)、アレルギー性脈管炎及び肉芽腫症、多脈管炎:ヴェゲナー肉芽腫症;リンパ腫様肉芽腫症:及び巨細胞動脈炎が含まれる。その他の血管炎には:粘膜皮膚リンパ節症候群(MLNS又は川崎病)、隔離されたCNS血管炎、ベヘット(Behet's)病、閉塞性血栓性血管炎(バージャー病)及び皮膚壊死性細静脈炎(venulitis)が含まれる。列挙した血管炎のほとんどの種類の発病メカニズムは、主に脈管壁に免疫グロブリン複合体が付着し、続いてADCC、補体活性又は双方を介して炎症反応が誘発されることによると考えられている。
自己免疫性溶血性貧血、免疫再生不良性貧血、及び発作性夜間血色素尿を含む自己免疫溶性血性貧血は、赤血球(いくつかの場合においては血小板もまた含む他の血液細胞)表面で発現した抗原と反応する抗体が産出される結果によるものであり、補体媒介溶解及び/又はADCC/Fc-レセプター-媒介メカニズムを介して、その抗体被覆細胞の除去に反映される。
他の臨床的環境における血小板減少性紫斑病及び免疫仲介血小板減少を含む自己免疫性血小板減少では、血小板破壊/除去が、抗体又は補体が血小板に接合し、続いて補体溶解、ADCC又はFc-レセプター-媒介メカニズムにより除去される結果として生じる。
I型真性糖尿病又はインスリン依存性糖尿病は膵臓ランゲルハンス島β細胞の自己免疫破壊であり;この破壊は自己抗体及び自己反応性T細胞により媒介される。また、インスリン又はインスリン様レセプターに対する抗体は、インスリン-非反応性の表現型をつくりだすことができる。
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫仲介腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体又はT細胞が産生される結果として直接的に、又は他の非腎抗原に対して反応性である、腎臓中の抗体及び/又は免疫複合体の沈着の結果として間接的に、腎組織に抗体又はT細胞媒介傷害が生じることによるものである。よって、免疫複合体の生成をもたらす他の免疫媒介疾患により、間接的続発症として免疫媒介腎疾患も誘発しうる。直接的及び間接的免疫メカニズムの双方により、結果として、器官機能が損なわれ、いくつかの場合では腎臓機能不全に進行する、病巣発達を腎組織に生じさせ/誘発する炎症反応が生じる。体液及び細胞免疫メカニズムの双方が障害の発病に関与しうる。
好球性肺炎;特発性肺線維症及び過敏性肺炎を含む炎症及び線維症の肺疾患には、調節されない免疫炎症反応が関連している。その反応の阻害は治療的に有益であろう。
水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患は自己抗体により媒介され、その発病はTリンパ球依存性である。
乾癬はTリンパ球媒介炎症疾患である。病巣にはTリンパ球、マクロファージ及び抗原プロセシング細胞及びある種の好中球の浸潤が含まれる。
喘息;アレルギー性鼻炎;アトピー性皮膚炎;食物過敏症及び蕁麻疹等を含むアレルギー性疾患はTリンパ球依存性である。これらの疾患はTリンパ球誘発性炎症、IgE媒介炎症、又は双方の組合せにより主に媒介される。
免疫及び/又は炎症反応への介在が有益である他の疾患は、限定するものではないがウィルス感染(限定するものではないがAIDS、A型、B型、C型、D型、E型肝炎)、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染(MLRを刺激する分子(又は誘導体/アゴニスト)を治療に利用し、感染要因に対する免疫反応性を増強することができる)を含む感染疾患、MLRを刺激し、治療に利用し、遺伝性、獲得性、感染誘発性(例えばHIV感染)、又は医原性(即ち、化学療法からのもの)免疫不全の状態に対する免疫反応を増強するために治療上用いることが可能な免疫欠損疾患(分子/誘導体/アゴニスト)、及び異常増殖である。
またここで診断方法を提供する。例えば、DR5抗体は、Apo−2L又はDR5関連の病理状態を有することがわかっている又は有すると思われる哺乳動物において、DR5レセプターを検出するために用いてもよい。該結合ペプチドは、例えば試料中のDR5を検出ないし定量するアッセイで用いてよい。哺乳動物から得た細胞などの試料を標識した結合ペプチド存在下でインキュベートし、試料中の結合した標識結合ペプチドを検出することができる。様々な臨床的アッセイ手段を含むこのようなアッセイは、例えばVoller等., Immunoassays, University Park, 1981に記載のように当分野に公知である。
全ての特許、特許出願、出版物、製品についての記載、及びプロトコルは、この出願を通して引用され、その開示は、出典明記によりそれらの全てがここに取り込まれる。本明細書中で使用した項目の表題は単に構造化するためのものであって、記載した内容を制限するためのものではない。
以下の実施例は例示目的のためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を限定することを意図したものでは決してない。実施例に示されている市販試薬は、特に記載しない限りは、製造者の使用説明書に従い使用した。以下の実施例及び明細書を通して、ATCC受託番号により特定されたそれらの細胞の供給源は、アメリカ培養細胞系統保存機関、マナッサス、バージニア州である。次の一連の実施例において、中間体及び終末産物を指すときに、共通のα−アミノ酸は標準の1−又は3−文字アミノ酸コードによって記載されていてもよい。共通のα−アミノ酸によって、mRNAによってタンパク質に組み込まれるアミノ酸を意味する。標準的な略語は、The Merck Index, 10th Edition, pp Misc-2 - Misc-3に挙げられている。示さない限り、共通のα−アミノ酸は天然又はα炭素原子で「L」−構成を有する。コードが「D」の後にある場合、共通のα−アミノ酸の逆の光学異性体を示す。ノルロイシン(Nle)及びオルニチン(Orn)等の修飾型又は非一般的αアミノ酸は、U.S. Patent and Trademark Office Official Gazette 1114 TMOG, May 15, 1990に記載のように表示する。
「LSS-2331B」と称するファージディスプレイscFvライブラリは、scFvと遺伝子-3微量コートタンパク質(P3C)のC末端ドメインとの間に挿入されるロイシンジッパードメインによって二量化される二価のscFv成分をディスプレイするファジミドベクターを用いて構築された。このベクターは、「pS2072a」と称され、図4に示される配列を含んでなる。ベクターは、アルカリフォスファターゼ(phoA)プロモータの制御下にヒト化抗体4D5可変ドメインを含有する。ヒト化抗体4D5は、主に重鎖及び軽鎖のヒトコンセンサス配列フレームワーク領域とHer-2に特異的なマウスモノクローナル抗体由来のCDR領域を有する抗体である。抗Her-2抗体の作製方法及び可変ドメイン配列の同一性は、米国特許第5,821,337号及び同第6,054,297号に示される。
LSS-2331Bは、全3つの重鎖CDR内のランダム化された残基を用いて作製した。ランダム化された特異的な残基は以下の通りである:CDR-H1内の残基28、30、31、32及び33;CDR-H2内の残基50、52、53、54、56及び58;CDR-H3内の残基95、96、97、98、99及び100。縮重コドン(3〜14)の数を変化させて位置95〜100の間の6つの野生型コドンを置換することによって、CDR-H3内に付加的に多様性を導入した。
突然変異誘発反応液を大腸菌SS320 (Sidhu, S. S.,等, Methods Enzymol. (2000), 328:333-363)に電気穿孔し、形質転換細胞を、M13-KO7ヘルパーファージ(New England Biolabs, Beverly, MA)存在下にて終夜生育し、ファジミドDNAを内包し、それらの表面上にFab断片をディスプレイするファージ粒子を産生した。ライブラリLSS-2331Bは、3×1010の異なるメンバーを含有した。
分類1
1.Maxisorpイムノプレート12ウェルに2μg/ml、100μl/ウェルのコートヒトDR5-ECD(以下の表9参照)を入れ、4℃で一晩インキュベートする。
2.プレートの遮断:200μlのカゼインを含むPBSを加えて室温にて1時間置く。
3.ファージの遮断:遮断用緩衝液(カゼイン)をファージ溶液に1:1の割合で加え、室温にて1時間インキュベートする。
4.プレートをPT緩衝液(PBS+0.05%Tween20)にて5回すすぐ。
5.100μlのライブラリファージ溶液(ステップ4からのもの)をウェルに加え、室温にて2時間、ゆっくりと攪拌しながらインキュベートする。
6.プレートをPT緩衝液にて10回すすぐ。
7.第一の12ウェルを50μlの0.1M HCL、pH2にて20分間溶出し、1.0Mトリス塩基(約1/6量)にて溶出物を中和する。
8.1.5mlのファージ溶出物を5mlのXl1−ブルー細胞(OD600=1.0)に感染させる。37℃で20分間生育する。LB/カーブプレート上で力価を測定し、50mlの2YT/カーブVCSに培養物を移して37℃で一晩生育させる。
9.細胞を沈降させ、次の分類に用いるために上清を除去する。
1.ヒトDR5-ECDにて12ウェルをコートする。
2.プレートの遮断:200μlのスーパーブロック(Pierce Chemicals, Product # 37515)を加え室温にて1時間。
3.ファージの遮断:カゼインをファージ上清(分類1のステップ12からのもの)に1:1の割合で加え、室温にて1時間インキュベートする。
4.0.3mlのファージ溶出物を1mlのXl1−ブルー細胞(OD600=1.0)に感染させた。37℃で20分間生育した。LB/カーブプレート上で力価を測定し、25mlの2YT/カーブVCSに培養物を移して37℃で一晩生育させる。
5.細胞を沈降させ、次の分類に用いるために上清を除去した。
1.ヒトDR5-ECDにて12ウェルをコートする。
2.プレートの遮断:200μlのPBS/BSAを加え室温にて1時間。
3.ファージの遮断:スーパーブロックをファージ上清に1:1の割合で加え、室温にて1時間インキュベートする。
4−5.上記と同じ。
以下の相違以外は実施例1に記載のLSS-2331Bと同様に、「LSS-2344F」と称するライブラリを構築した。
停止鋳型(pG4503f)は重鎖内に点突然変異(H91S)を生じるように一コドンがpS2072cと異なる。ライブラリの構築に用いた突然変異原性オリゴヌクレオチドの配列は以下の表2に示す。
表2 ライブラリLSS-2344Fの構築に用いた突然変異原性オリゴヌクレオチド。等モルのDNA縮重をIUBコードで表す(W=A/T、R=A/G、V=G/A/C、N=A/G/C/T、M=A/C、Y=C/T、D=G/A/T、B=G/T/C、K=G/T、S=G/C、H=A/T/C)。
次いで、実施例1に記載の3工程の分類方法を用いて分類を行った。
「LSS-2369B」ファージディスプレイFabライブラリは、遺伝子-3微量コートタンパク質(P3C)のC末端ドメインに融合したFab分子をディスプレイするファジミドベクターを用いて構築された。このベクターは、pV-0350-2と称され、図5に示される配列を含んでなる。ベクターは、アルカリフォスファターゼ(phoA)プロモータの制御下に軽鎖内の3つの突然変異(N30S、R66G及びH91S)を有するヒト化抗体4D5Fabを含有する。ヒト化抗体4D5は、主に重鎖及び軽鎖のヒトコンセンサス配列フレームワーク領域とHer-2に特異的なマウスモノクローナル抗体由来のCDR領域を有する抗体である。抗Her-2抗体の作製方法及び可変ドメイン配列の同一性は、米国特許第5,821,337号及び同第6,054,297号に示される。
LSS-2369Bは、全3つの重鎖CDR内のランダム化された残基を用いて作製した。ランダム化された特異的な残基は以下の通りである:CDR-H1内の残基28、30、31、32及び33;CDR-H2内の残基50、52、53、54、56及び58;CDR-H3内の残基95、96、97、98、99、100、100a、100b及び100c。縮重コドン(7、8、9、10又は12)の数を変化させて位置95〜100の間の9つの野生型コドンを置換することによって、CDR-H3内に付加的に多様性を導入した。
突然変異誘発反応液を大腸菌SS320 (Sidhu, S. S.,等, Methods Enzymol. (2000), 328:333-363)に電気穿孔し、形質転換細胞を、M13-KO7ヘルパーファージ(New England Biolabs, Beverly, MA)存在下にて終夜生育し、ファジミドDNAを内包し、それらの表面上にFab断片をディスプレイするファージ粒子を産生した。ライブラリLSS-2369Bは6.2×1010の異なるメンバーを含有した。
次いで、実施例1に記載の3工程の分類方法を用いて分類を行った。
上記の(実施例1、2及び3)各々のライブラリからのファージを、ヒトDR5-ECDに結合するクローンをエンリッチするための結合選別工程により、別々に選別した(下記の表9参照)。結合選別は先に述べた方法(Sidhu等, supra)を用いて行われた。
NUNC96穴Maxisorpイムノプレートを、捕獲標的(5μg/mLのhDR5-ECDを含有するPBS)にて4℃で終夜コートして、ウシ血清アルブミン(BSA) (Sigma)にて2時間ブロックした。前述のように(Sidhu等, 上掲)、37℃で一晩の生育の後、ファージをPEG/NaClで沈殿することによって濃縮し、PBS、0.5% BSA、0.1% Tween20(Sigma)に再懸濁した。ファージ溶液(1012ファージ/mL)を、コートしたイムノプレートに加えた。ファージ結合のために2時間インキュベーションした後、プレートを、PBS、0.05% Tween20にて10回洗浄した。結合したファージを10分間、0.1M HClにて溶出し、溶出液を1.0M トリス塩基にて中和した。溶出されたファージを、大腸菌XL1-ブルー内で増幅し、更なる選別に用いた。ライブラリLSS-2344F及びLSS-2331Bそれぞれを用いて、hDR5-ECDへの結合についての3又は4ラウンドの選別を行った。ライブラリLSS-2369BはhDR5-ECDに対して2ラウンドの選別を行った後に、Fabをディスプレイするクローン(軽鎖のC末端に融合されたgDエピトープがある)を濃縮(エンリッチ)するために抗gDエピトープ抗体に対して1ラウンドの選別(ラウンド2a)を行い、次いでhDR5-ECDに対する第3ラウンドの選別を行った。
ライブラリLSS-2331B(実施例1を参照)から選択されたクローンのファージELISAの結果は、下記の表4に示される。表4の「識別番号」は、特定のクローニングされた抗体に付した名前又はコードを指し、それぞれの識別子は図6に含まれるものに対応する。比較のためにカニクイザル(「cyno」)DR5-IgGとヒトDR5-ECD(下記の表9参照)に対する各々の抗体の結合を表4に示した。
(34B8中の)コロニーを5ml 2YT+50μg/ml carbにピックアップし、細胞を、37℃で1.5−2.5ODまで生育させた。5mlの培養物を、500mlの完全C.R.A.P培地+50μg/ml carbに播種し、30℃で18−24時間生育させた。細胞を遠心し、上清を別の容器に移した。ペレットを−20℃で終夜凍結した。
細胞ペレットを氷上で解凍し、以下を加えた:a)TE(5ml/g)20ml;PMSH(5μl/g)20μ l;1M ベンズアミジン(1μl/g)4μl ;250mM EDTA(0.4ml/g)2ml。細胞を十分に再懸濁して、少なくとも1時間、氷上に置いた。ショックを与えた細胞を、60分間、15Krpmにて遠心した。上清を精製するか又は細胞を5分間ホモジナイズした(ultraturex)。細胞をマイクロ流動器にて破壊し、60分間、15Kで遠心した。上清を0.45μmフィルタにろ過して、タンパク質カラムに流した(TE緩衝液にてカラムを事前に洗浄した)。カラムをTE緩衝液にて洗浄し、0.1Mの酢酸+1mMのEDTAにて溶出し、1Mのトリス(pH8)によって中和し、その後PBS緩衝液に取り替えた。次いで、OD280(conc=1OD/0.4=mh/ml)で測定した。
表6 Fab abs
また、ヒトDR5-ECDへのBdf2の結合を示すアッセイの結果を図9に示す。
BIAcore分析を用いて結合アッセイを行った。CM5チップ(Biocare)を少なくとも30分で室温まで暖めた。BIAcore計測器を開き、チップを計測器に装備した。初回刺激は、ランニングバッファ(PBS/0.05%Tween-20/0.01% NaAzide)で処理した後、70%グリセロールにて標準化した。製造業者の指示に従ってセンソグラムを行い、固定化タンパク質溶液(酢酸緩衝液ph5.5)を調製し、タンパク質を20μg/mlで希釈した。チップはECD及びNHSにて活性化した。タンパク質が100RUで固定するまで、5−30μlのタンパク質(ヒトDR5-ECD、Cyno DR5-IgG、マウスDR5-ECD又はヒトDR4-IgG、表9に記述されるすべて)を20μl/分で注入した。次いで、チップを1M エタノールアミンでブロックした。試料を50nM−500nMの濃度で始め、1:1に希釈した。
データはBiaevaluationソフトウエアプログラムを用いて分析して、タンパク質動態を測定した。
表8
*CHO細胞から精製したタンパク質
**大腸菌から精製したタンパク質
N.D.は「検出不可」を意味する。
対照標準物質及び抗体「BdF2」(図8参照)の2倍階段希釈を、96ウェル組織培養プレート(Falcon)において行った。Apo-2リガンド(アミノ酸114−281、PCT US00/17579に記載)は比較のために試験した。Colo-205(20000細胞個/ウェル)のヒト大腸カルシノーマ細胞(ATCC)を96ウェルプレートに播種した。プレートを24時間、37℃でインキュベートした。AlamarBlue (Trek Diagnostic Systems, Inc.)を、24時間のインキュベーション時間の最後の3時間に加えた。530nmの励起及び590nmの発光で96ウェル蛍光光度計を用いて蛍光発光を読み取った。結果は、相対的な蛍光発光単位(RFU)で表した。4-パラメータ曲線フィッティングプログラム(Kaleidagraph)を用いてデータ分析した。
バイオアッセイの結果を図10に示す。
1. ヒト DR5-ECD ポリペプチド
MSALLILALVGAAVADYKDDDDKLSALITQQDLAPQQRVAPQQKRSSPSEGLCPPGHHIS
EDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREED
SPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKESGTKHSGEAPAVEETVTSSPGTPASP
CSLS (配列番号:154)
2. ヒト DR4 IgG 融合 ポリペプチド
MAPPPARVHLGAFLAVTPNPGSAASGTEAAAATPSKVWGSSAGRIEPRGGGRGALPTSMG
QHGPSARARAGRAPGPRPAREASPRLRVHKTFKFVVVGVLLQVVPSSAATIKLHDQSIGT
QQWEHSPLGELCPPGSHRSERPGACNRCTEGVGYTNASNNLFACLPCTACKSDEEERSPC
TTTRNTACQCKPGTFRNDNSAEMCRKCSTGCPRGMVKVKDCTPWSDIECVHKESGNGHND
KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG
VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG
QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号:155)
3. ヒト DR5-IgG 融合 ポリペプチド
MEQRGQNAPAASGARKRHGPGPREARGARPGLRVPKTLVLVVAAVLLLVSAESALITQQD
LAPQQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCD
SGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVH
KESGLAFQDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(配列番号:156)
4. カニクイザル DR4-IgG 融合 ポリペプチド
MGQQGPSAQARAGRVVGPRSAQGASPGLRVHKTLKFVVVGVLLQVVPGSAATIKVHDQSV
GTQQWEHSPLGELCPPGSHRSEHSGACNQCTEGVGYTSASNNLFSCLPCTACKSDEEERS
ACTRTRNTACQCKPGTFRNDDSAEMCRKCSTGCPRGKVKVKDCTPWSDIECVHNESGNGH
NVWAILIVTVVILVVLLLLVAVLMFCRRIGSGCGGNPKCMHRVFLWCLGLLRGPGAEDNA
HNMILNHGDSLSTFISEQQMESQEPADLTGVTVQSPGEAQCLLGPAEPEGSQRRRLLVPA
NGADPTETMMLFFDNFADIVPFNSWDQLMRQLGLTNNEIHMVRADTAGPGDALYAMLMKW
VNKTGQDASIHTLLDALERIGERHAKERIQDLLVDSGKFIYVEDGTGSAVSLE
(配列番号:157)
5. カニクイザル DR5-IgG 融合 ポリペプチド
MGQLRQSAPAASVARKGRGPGPREARGARPGLRVLKTLVLVVAAARVLLSVSADCAPITR
QSLDPQRRAAPQQKRSSPTEGLCPPGHHISEDSRECISCKYGQDYSTHWNDFLFCLRCTK
CDSGEVEVNSCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEICRKCRTGCPRGMVKVKDCTPWSDIEC
VHKESGIIIGVIVLVVIVVVTVIVWKTSLWKKVLPYLKGVCSGDGGDPEHVDSSSHSPQR
PGAEDNALNEIVSIVQPSQVPEQEMEVQEPAEQTDVNTLSPGESEHLLEPAKAEGPQRRG
QLVPVNENDPTETLRQCFDDFAAIVPFDAWEPLVRQLGLTNNEIKVAKAEAASSRDTLYV
MLIKWVNKTGRAASVNTLLDALETLEERLAKQKIQDRLLSSGKFMYLEDNADSATS
(配列番号:158)
Claims (13)
- 図6、7又は8に記載の一又は複数のアミノ酸配列を含んでなる単離された抗DR5抗体。
- 重鎖及び軽鎖を含んでなり、該重鎖が図6、7又は8に記載の一又は複数のアミノ酸配列を含有する可変領域を含むものである単離された抗DR5抗体。
- 前記重鎖及び前記軽鎖が可動性リンカーにより結合されて一本鎖抗体となる、請求項2に記載の抗体。
- 一本鎖Fv抗体である、請求項3に記載の抗体。
- Fab抗体である。請求項2に記載の抗体。
- 完全にヒトである、請求項2に記載の抗体。
- DR5レセプターに特異的に結合し、DR4レセプター、DcR1レセプター又はDcR2レセプターに結合しない、請求項1又は請求項2に記載の抗体。
- 少なくとも一種類の哺乳動物癌細胞においてアポトーシスを誘導する、請求項1又は請求項2に記載の抗体。
- Apo-2リガンドのDR5レセプターへの結合をブロック又は阻害する、請求項1又は請求項2に記載の抗体。
- 請求項1ないし9の何れか一の抗体と担体を含んでなる組成物。
- 請求項10に記載の組成物を投与することを含む、哺乳動物の疾患の治療方法。
- 前記疾患が免疫関連疾患である、請求項11に記載の方法。
- 前記疾患が癌である、請求項11に記載の方法。
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