JP6771002B2 - 上皮細胞増殖因子受容体３（ｈｅｒ３）に対する抗体 - Google Patents

上皮細胞増殖因子受容体３（ｈｅｒ３）に対する抗体 Download PDF

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Description

関連出願に対する相互参照
本願は、２０１０年８月２０日出願の米国仮出願第６１／３７５，４０８号に基づく優
先権を主張するものであり、該仮出願の内容全体が本明細書に取り込まれる。
技術分野
本発明は、一般的に、受容体のＨＥＲファミリー、例えば、ＨＥＲ３受容体と相互作用
する抗体またはその断片に関する。特に、それは、ドメイン２および４の両方由来の残基
を含むＨＥＲ受容体（例えば、ＨＥＲ３）の立体構造的エピトープを認識し、リガンド依
存性およびリガンド非依存性シグナル変換の両方の阻害をもたらす抗体またはその断片に
関する。本発明はまた、リガンド（例えば、ニューレグリン）と同時にＨＥＲ受容体（例
えば、ＨＥＲ３受容体）に結合し、リガンド誘導シグナル変換の活性化を防止する抗体お
よびその断片に関する。
発明の背景
ヒト上皮細胞増殖因子受容体３（ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ３としても知られている）は、受
容体タンパク質チロシンキナーゼであり、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１、ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２
（ＥｒｂＢ２、Ｎｅｕ）およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）を含み得る受容体タンパク質チロ
シンキナーゼの上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）サブファミリーに属する(Plowmanら
(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:4905-4909; Krausら (1989) Proc. Natl. A
cad. Sci. U.S.A. 86:9193-9197;およびKrausら (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
90:2900-2904)。原型的な上皮細胞増殖因子受容体のような、膜貫通受容体ＨＥＲ３は、
細胞外リガンド−結合ドメイン（ＥＣＤ）、ＥＣＤ内の二量体化ドメイン、膜貫通ドメイ
ン、細胞内タンパク質チロシンキナーゼ−様ドメイン（ＴＫＤ）およびＣ−末端リン酸化
ドメインからなる。他のＨＥＲファミリーメンバーとは異なって、ＨＥＲ３のキナーゼド
メインは、非常に低い内因性キナーゼ活性を示す。
リガンドニューレグリン１（ＮＲＧ）またはニューレグリン２は、ＨＥＲ３の細胞外ド
メインに結合し、他の二量体化パートナー、例えば、ＨＥＲ２との二量体化を促進するこ
とにより受容体−介在シグナル伝達経路を活性化する。ヘテロ二量体化は、ＨＥＲ３の細
胞内ドメインの活性化およびリン酸転移をもたらし、シグナル多様化だけでなくシグナル
増幅の手段である。加えて、ＨＥＲ３ヘテロ二量体化はまた、活性化リガンドの非存在下
で起こり得、これは、一般的にリガンド非依存性ＨＥＲ３活性化と称される。例えば、Ｈ
ＥＲ２が（例えば、乳房、肺、卵巣または胃癌）における遺伝子増幅の結果として高レベ
ルで発現されるとき、自発的ＨＥＲ２／ＨＥＲ３二量体が形成され得る。該状況下で、Ｈ
ＥＲ２／ＨＥＲ３は非常に活性なＥｒｂＢシグナル伝達二量体を考慮し、したがって高度
に形質転換している。
増加したＨＥＲ３は、いくつかの型の癌、例えば、乳房、肺、消化器および膵臓癌にお
いて見いだされている。興味深いことに、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３の発現と非浸潤性から浸潤
性段階への進行間の相関関係は、示されている（Alimandiら (1995) Oncogene 10:1813-1
821; DeFazioら (2000) Cancer 87:487-498; Naiduら (1988) Br. J. Cancer 78:1385-13
90）。したがって、ＨＥＲ３介在シグナル伝達を妨げる薬剤が必要である。
発明の概要
本発明は、ＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含むＨＥＲ３受
容体の立体構造的エピトープに結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその断
片）の発見に基づく。ドメイン２およびドメイン４と抗体またはその断片との結合は、Ｈ
ＥＲ３活性化が阻害されるような不活性な、または閉塞的な立体構造におけるＨＥＲ３受
容体を安定化する。驚くべきことに、立体構造的エピトープと抗体またはその断片との結
合は、リガンド依存性（例えば、ニューレグリン）およびリガンド非依存性ＨＥＲ３シグ
ナル伝達経路の両方をブロックする。さらに、おそらくＨＥＲ３が活性化のために必要な
立体構造の再配列を受けることができないため、リガンド誘導シグナル伝達の抗体介在阻
害は、リガンド結合のブロックなしに起こる（すなわち、リガンドおよび抗体の両方がＨ
ＥＲ３に結合することができる）。
したがって、１つの局面において、本発明は、ＨＥＲ受容体の不活性化状態に結合する
単離された抗体またはその断片であって、リガンド依存性およびリガンド非依存性シグナ
ル変換の両方をブロックする、抗体またはその断片に関する。１つの態様において、抗体
またはその断片は、不活性化状態におけるＨＥＲ受容体を安定化する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ
酸残基を含むＨＥＲ受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体またはその
断片であって、リガンド依存性およびリガンド非依存性シグナル変換の両方をブロックす
る、抗体またはその断片に関する。１つの態様において、抗体またはその断片は、ＨＥＲ
受容体の不活性化状態に結合する。１つの態様において、抗体またはその断片は、ＨＥＲ
受容体の活性状態に結合し、不活性化状態に駆動する。別の態様において、抗体またはそ
の断片は、不活性化状態におけるＨＥＲ受容体を安定化する。ＨＥＲ受容体は、ＨＥＲ１
、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４からなる群から選択される。抗体は、モノクローナ
ル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および合成抗体からなる群から選
択される。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ
酸残基を含むＨＥＲ受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体またはその
断片であって、抗体の結合は、不活性化状態におけるＨＥＲ受容体を安定化し、ＨＥＲリ
ガンドは、ＨＥＲ受容体上のリガンド結合部位に同時に結合することができる、抗体また
はその断片に関する。１つの態様において、リガンド結合部位へのＨＥＲリガンド結合は
、活性状態へのＨＥＲ受容体における構造変化を誘導しない。別の態様において、リガン
ド結合部位へのＨＥＲリガンド結合は、シグナル変換を活性化しない。
１つの態様において、ＨＥＲリガンドは、ニューレグリン１（ＮＲＧ）、ニューレグリ
ン２、ニューレグリン３、ニューレグリン４、ベタセルリン、ヘパリン結合上皮細胞増殖
因子、エピレグリン、上皮細胞増殖因子、アンフィレグリンおよび形質転換増殖因子アル
ファからなる群から選択される。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ
酸残基を含むＨＥＲ受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体またはその
断片であって、抗体の結合は、ＨＥＲ受容体が共受容体と二量体化して、受容体−受容体
複合体を形成することができないように、不活性化状態においてＨＥＲ受容体を安定化す
る、抗体またはその断片に関する。受容体−受容体複合体を形成できないことが、リガン
ド依存性およびリガンド非依存性シグナル変換の両方の活性化を防止する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ
酸残基を含むＨＥＲ受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体またはその
断片であって、ＨＥＲ受容体への抗体の結合が共受容体と二量体化でき、不活性な受容体
−受容体複合体を形成する、抗体またはその断片に関する。不活性な受容体−受容体複合
体の形成は、リガンド非依存性シグナル変換の活性化を防止する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３受容体の不活性な立体構造に結合する単離され
た抗体またはその断片であって、リガンド依存性およびリガンド非依存性シグナル変換の
両方をブロックする、抗体またはその断片に関する。１つの態様において、抗体またはそ
の断片は、不活性化状態におけるＨＥＲ３受容体を安定化する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミ
ノ酸残基を含むＨＥＲ３受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体または
その断片であって、リガンド依存性およびリガンド非依存性シグナル変換の両方をブロッ
クする、抗体またはその断片に関する。１つの態様において、抗体またはその断片は、Ｈ
ＥＲ３受容体の不活性化状態に結合する。別の態様において、抗体またはその断片は、不
活性化状態におけるＨＥＲ３受容体を安定化する。抗体は、モノクローナル抗体、ポリク
ローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および合成抗体からなる群から選択される。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミ
ノ酸残基を含むＨＥＲ３受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体または
その断片であって、抗体の結合は、不活性化状態におけるＨＥＲ３受容体を安定化し、Ｈ
ＥＲ３リガンドは、ＨＥＲ３受容体上のリガンド結合部位に同時に結合する、抗体または
その断片に関する。１つの態様において、リガンド結合部位へのＨＥＲ３リガンド結合は
、活性状態へのＨＥＲ３受容体における構造変化を誘導しない。別の態様において、リガ
ンド結合部位へのＨＥＲ３リガンド結合は、シグナル変換を活性化しない。１つの態様に
おいて、ＨＥＲ３リガンドは、ニューレグリン１（ＮＲＧ）、ニューレグリン２、ベタセ
ルリン、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子およびエピレグリンからなる群から選択される。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミ
ノ酸残基を含むＨＥＲ３受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体または
その断片であって、リガンド依存性およびリガンド非依存性シグナル変換の両方をブロッ
クする、抗体またはその断片に関する。１つの態様において、抗体またはその断片は、Ｈ
ＥＲ３受容体の不活性化状態に結合する。別の態様において、抗体またはその断片は、不
活性化状態におけるＨＥＲ３受容体を安定化する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミ
ノ酸残基を含むＨＥＲ３受容体の立体構造的エピトープに結合する単離された抗体または
その断片であって、ドメイン２は二量体化ループをを含み、リガンド依存性およびリガン
ド非依存性シグナル変換の両方をブロックする、抗体またはその断片に関する。１つの態
様において、抗体またはその断片は、不活性化状態におけるＨＥＲ３受容体を安定化する
。１つの態様において、立体構造的エピトープは、アミノ酸残基２６５−２７７、３１５
（ドメイン２の）、５７１、５８２−５８４、５９６−５９７、６００−６０２、６０９
−６１５（ドメイン４の）またはそれらのサブセットを含む。１つの態様において、抗体
またはそれらの断片のＶＨが、少なくとも１つの以下のＨＥＲ３残基：Ａｓｎ２６６、Ｌ
ｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｎ２７１、Ｇｌｕ２７３、Ｐｒｏ２７４
、Ａｓｎ２７５、Ｐｒｏ２７６、Ｈｉｓ２７７、Ａｓｎ３１５、Ａｓｐ５７１、Ｐｒｏ５
８３、Ｈｉｓ５８４、Ａｌａ５９６、Ｌｙｓ５９７に結合する。１つの態様において、抗
体またはそれらの断片のＶＬが、少なくとも１つの以下のＨＥＲ３残基：Ｔｙｒ２６５、
Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｐｈｅ２７０、Ｇｌｙ５８２、Ｐｒｏ５８３、Ｌｙｓ５９
７、Ｉｌｅ６００、Ｌｙｓ６０２、Ｇｌｕ６０９、Ａｒｇ６１１、Ｐｒｏ６１２、Ｃｙｓ
６１３、Ｈｉｓ６１４、Ｇｌｕ６１５に結合する。
別の局面において、本発明は、第１のＨＥＲ受容体のドメイン２およびドメイン４内の
アミノ酸残基を含む第１のＨＥＲ受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗
体またはその断片であって、ＨＥＲ受容体リガンドの非存在下で第１のＨＥＲ受容体への
抗体またはその断片の結合は、第１のＨＥＲ受容体および第２のＨＥＲ受容体を発現する
細胞中の第１のＨＥＲ受容体−第２のＨＥＲ受容体タンパク質複合体のリガンド非依存性
形成を減少させる、抗体またはその断片に関する。１つの態様において、抗体またはその
断片は、第１のＨＥＲ受容体は、第２のＨＥＲ受容体と二量体化して、第１のＨＥＲ受容
体−第２のＨＥＲ受容体タンパク質複合体を形成することができないように、不活性化状
態において第１のＨＥＲ受容体を安定化する。１つの態様において、第１のＨＥＲ受容体
−第２のＨＥＲ受容体タンパク質複合体を形成できないことがシグナル変換の活性化を防
止する。１つの態様において、第１のＨＥＲは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨ
ＥＲ４からなる群から選択される。１つの態様において、第２のＨＥＲは、ＨＥＲ１、Ｈ
ＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４からなる群から選択される。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残
基を含むＨＥＲ３受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体またはその断
片であって、ＨＥＲ３リガンドの非存在下でＨＥＲ３受容体への抗体またはその断片の結
合は、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を発現する細胞中のＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体
のリガンド非依存性形成を減少させる、抗体またはその断片に関する。１つの態様におい
て、抗体またはその断片は、ＨＥＲ３受容体は、ＨＥＲ２受容体と二量体化して、ＨＥＲ
２−ＨＥＲ３タンパク質複合体を形成することができないように、不活性化状態において
ＨＥＲ３受容体を安定化する。１つの態様において、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合
体を形成できないことがシグナル変換の活性化を防止する。１つの態様において、抗体ま
たはその断片は、ＨＥＲ３受容体がＨＥＲ２と二量体化できるが、不活性なＨＥＲ２−Ｈ
ＥＲ３タンパク質複合体を形成するように、不活性化状態におけるＨＥＲ３受容体を安定
化する。１つの態様において、不活性なＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体の形成は、
シグナル変換の活性化を防止する。
別の局面において、本発明は、第１のＨＥＲ受容体のドメイン２およびドメイン４内の
アミノ酸残基を含む第１のＨＥＲ受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗
体またはその断片であって、ＨＥＲリガンドの存在下で第１のＨＥＲ受容体への抗体また
はその断片の結合は、第１のＨＥＲ受容体および第２のＨＥＲ受容体を発現する細胞中の
第１のＨＥＲ受容体−第２のＨＥＲ受容体タンパク質複合体のリガンド依存性形成を減少
させる、抗体またはその断片に関する。１つの態様において、抗体またはその断片は、Ｈ
ＥＲ受容体が、第１のＨＥＲリガンドの存在下で第２のＨＥＲ受容体と二量体化して、第
１のＨＥＲ受容体−第２のＨＥＲ受容体タンパク質複合体を形成することができないよう
に、不活性化状態において第１のＨＥＲ受容体を安定化する。１つの態様において、第１
のＨＥＲ受容体−第２のＨＥＲ受容体タンパク質複合体を形成できないことが、シグナル
変換の活性化を防止する。１つの態様において、ＨＥＲリガンドは、ニューレグリン１（
ＮＲＧ）、ニューレグリン２、ニューレグリン３、ニューレグリン４、ベタセルリン、ヘ
パリン結合上皮細胞増殖因子、エピレグリン、上皮細胞増殖因子、アンフィレグリンおよ
び形質転換増殖因子アルファからなる群から選択される。１つの態様において、第１のＨ
ＥＲは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４からなる群から選択される。１つ
の態様において、第２のＨＥＲは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４からな
る群から選択される。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残
基を含むＨＥＲ３受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体またはその断
片であって、ＨＥＲリガンドの存在下でＨＥＲ３受容体への抗体またはその断片の結合は
、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を発現する細胞中のＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体のリ
ガンド依存性形成を減少させる、抗体またはその断片に関する。リガンドは、ニューレグ
リン１（ＮＲＧ）およびニューレグリン２からなる群から選択される。１つの態様におい
て、抗体またはその断片は、ＨＥＲ３受容体が、ＨＥＲリガンドの存在下でＨＥＲ２受容
体と二量体化して、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体を形成することができないよう
に、不活性化状態においてＨＥＲ３受容体を安定化する。１つの態様において、ｔＨＥＲ
２−ＨＥＲ３タンパク質複合体を形成できないことがシグナル変換の活性化を防止する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残
基を含むＨＥＲ３受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体またはその断
片であって、ＨＥＲ３リガンド非依存性リン酸化アッセイにより評価されるとき、ＨＥＲ
３のリン酸化を阻害する、抗体またはその断片に関する。１つの態様において、ＨＥＲ３
リガンド非依存性リン酸化アッセイはＨＥＲ２増幅細胞を使用し、ＨＥＲ２増幅細胞はＳ
Ｋ−Ｂｒ−３細胞である。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残
基を含むＨＥＲ３受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体またはその断
片であって、ＨＥＲ３リガンド依存性リン酸化アッセイにより評価されるとき、ＨＥＲ３
のリン酸化を阻害する、抗体またはその断片に関する。１つの態様において、ＨＥＲ３リ
ガンド依存性リン酸化アッセイにニューレグリン（ＮＲＧ）で刺激されたＭＣＦ７細胞を
使用する。
別の局面において、本発明は、少なくとも１×１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ
−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、１０１３Ｍ−１の解離（ＫＤ
）を有する、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。１つの態
様において、抗体またはその断片は、ホスホ−ＨＥＲ３およびホスホ−Ａｋｔからなる群
から選択されるリン酸化アッセイにおけるヒトＨＥＲ３へのインビトロ結合により測定さ
れるとき、ＨＥＲ３のリン酸化を阻害する。
別の局面において、本発明は、表１に記載されている抗体と交差競合する、ＨＥＲ３受
容体に対する単離された抗体またはその断片；表１に記載されている抗体と同じエピトー
プと相互作用する（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布による）単離
された抗体またはその断片に関する。１つの態様において、抗体またはその断片はモノク
ローナル抗体である。別の態様において、抗体またはその断片はヒトまたはヒト化抗体で
ある。別の態様において、抗体またはその断片はキメラ抗体である。１つの態様において
、抗体またはその断片はヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域を含む。１つの態様に
おいて、抗体またはその断片は一本鎖抗体である。別の態様において、抗体またはその断
片はＦａｂ断片である。さらに別の態様において、抗体またはその断片はｓｃＦｖである
。１つの態様において、抗体またはその断片は、ヒトＨＥＲ３およびカニクイザルＨＥＲ
３の両方に結合する。１つの態様において、抗体またはその断片は、ＩｇＧアイソタイプ
である。別の態様において、抗体またはその断片は、アミノ酸がそれぞれのヒトＶＨまた
はＶＬ生殖細胞系列配列由来の抗体フレームワークに置換されているフレームワークを含
む。
１つの局面において、本発明は、表１におけるいずれかの抗体のＫａｂａｔまたはＣｈ
ｏｔｈｉａにより計算された１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含むＨＥＲ３に対
する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：４、配列番号：１０、配列番号：２２、配列
番号：２８、配列番号：４０、配列番号：４６、配列番号：５８、配列番号：６４、配列
番号：７６、配列番号：８２、配列番号：９４、配列番号：１００、配列番号：１１２、
配列番号：１１８、配列番号：１３０、配列番号：１３６、配列番号：１４８、配列番号
：１６６、配列番号：１８４、配列番号：２０２、配列番号：２２０、配列番号：２３８
、配列番号：２５６、配列番号：２７４、配列番号：２９２、配列番号：３１０、配列番
号：３２８、配列番号：３４６および配列番号：３６４からなる群から選択される重鎖Ｃ
ＤＲ３を含むＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、抗体が、配列番号：１５を含むＶＨおよび配列番号：１
４を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ
３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、抗体が、配列番号：３３を含むＶＨおよび配列番号：３
２を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ
３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、抗体が、配列番号：５１を含むＶＨおよび配列番号：５
０を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ
３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、抗体が、配列番号：６９を含むＶＨおよび配列番号：６
８を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ
３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、抗体が、配列番号：８７を含むＶＨおよび配列番号：８
６を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ
３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、抗体が、配列番号：１０５を含むＶＨおよび配列番号：
１０４を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｈ
ＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、抗体が、配列番号：１２３を含むＶＨおよび配列番号：
１２２を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｈ
ＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、抗体が、配列番号：１４１を含むＶＨおよび配列番号：
１４０を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｈ
ＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、抗体が、配列番号：１５９を含むＶＨおよび配列番号：
１５８を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｈ
ＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、抗体が、配列番号：１７７を含むＶＨおよび配列番号：
１７６を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｈ
ＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、抗体が、配列番号：１９５を含むＶＨおよび配列番号：
１９４を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｈ
ＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、抗体が、配列番号：２１３を含むＶＨおよび配列番号：
２１２を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｈ
ＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、抗体が、配列番号：２３１を含むＶＨおよび配列番号：
２３０を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｈ
ＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、抗体が、配列番号：２４９を含むＶＨおよび配列番号：
２４８を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｈ
ＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、抗体が、配列番号：２６７を含むＶＨおよび配列番号：
２６６を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｈ
ＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、抗体が、配列番号：２８５を含むＶＨおよび配列番号：
２８４を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｈ
ＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、抗体が、配列番号：３０３を含むＶＨおよび配列番号：
３０２を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｈ
ＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、抗体が、配列番号：３２１を含むＶＨおよび配列番号：
３２０を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｈ
ＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、抗体が、配列番号：３３９を含むＶＨおよび配列番号：
３３８を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｈ
ＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、抗体が、配列番号：３５７を含むＶＨおよび配列番号：
３５６を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｈ
ＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、抗体が、配列番号：３７５を含むＶＨおよび配列番号：
３７４を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｈ
ＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：４９３を有する可変重鎖配列を含む単離され
た抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：４９４を有する可変軽鎖配列を含む単離され
た抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：４９３を有する可変重鎖配列および配列番号
：４９４を有する可変軽鎖配列を含む単離された抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む変異体重鎖可
変領域を有するＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片であって、該変異
体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３の１つにおいて少なくとも１から４つのアミノ
酸変化を有する、抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：２の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：３の
ＣＤＲ２；配列番号：４のＣＤＲ３；配列番号：５の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：
６のＣＤＲ２；および配列番号：７のＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその断片に関
する。
別の局面において、本発明は、配列番号：２０の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２
１のＣＤＲ２；配列番号：２２のＣＤＲ３；配列番号：２３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配
列番号：２４のＣＤＲ２；および配列番号：２５のＣＤＲ３を含む単離された抗体または
その断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：３８の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：３
９のＣＤＲ２；配列番号：４０のＣＤＲ３；配列番号：４１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配
列番号：４２のＣＤＲ２；および配列番号：４３のＣＤＲ３を含む単離された抗体または
その断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：５６の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：５
７のＣＤＲ２；配列番号：５８のＣＤＲ３；配列番号：５９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配
列番号：６０のＣＤＲ２；および配列番号：６１のＣＤＲ３を含む単離された抗体または
その断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：７４の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：７
５のＣＤＲ２；配列番号：７６のＣＤＲ３；配列番号：７７の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配
列番号：７８のＣＤＲ２；および配列番号：７９のＣＤＲ３を含む単離された抗体または
その断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：９２の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：９
３のＣＤＲ２；配列番号：９４のＣＤＲ３；配列番号：９５の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配
列番号：９６のＣＤＲ２；および配列番号：９７のＣＤＲ３を含む単離された抗体または
その断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：１１０の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：
１１１のＣＤＲ２；配列番号：１１２のＣＤＲ３；配列番号：１１３の軽鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号：１１４のＣＤＲ２；および配列番号：１１５のＣＤＲ３を含む単離され
た抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：１２８の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：
１２９のＣＤＲ２；配列番号：１３０のＣＤＲ３；配列番号：１３１の軽鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号：１３２のＣＤＲ２；および配列番号：１３３のＣＤＲ３を含む単離され
た抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：１４６の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：
１４７のＣＤＲ２；配列番号：１４８のＣＤＲ３；配列番号：１４９の軽鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号：１５０のＣＤＲ２；および配列番号：１５１のＣＤＲ３を含む単離され
た抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：１６４の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：
１６５のＣＤＲ２；配列番号：１６６のＣＤＲ３；配列番号：１６７の軽鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号：１６８のＣＤＲ２；および配列番号：１６９のＣＤＲ３を含む単離され
た抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：１８２の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：
１８３のＣＤＲ２；配列番号：１８４のＣＤＲ３；配列番号：１８５の軽鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号：１８６のＣＤＲ２；および配列番号：１８７のＣＤＲ３を含む単離され
た抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：２００の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：
２０１のＣＤＲ２；配列番号：２０２のＣＤＲ３；配列番号：２０３の軽鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号：２０４のＣＤＲ２；および配列番号：２０５のＣＤＲ３を含む単離され
た抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：２１８の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：
２１９のＣＤＲ２；配列番号：２２０のＣＤＲ３；配列番号：２２１の軽鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号：２２２のＣＤＲ２；および配列番号：２２３のＣＤＲ３を含む単離され
た抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：２３６の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：
２３７のＣＤＲ２；配列番号：２３８のＣＤＲ３；配列番号：２３９の軽鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号：２４０のＣＤＲ２；および配列番号：２４１のＣＤＲ３を含む単離され
た抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：２５４の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：
２５５のＣＤＲ２；配列番号：２５６のＣＤＲ３；配列番号：２５７の軽鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号：２５８のＣＤＲ２；および配列番号：２５９のＣＤＲ３を含む単離され
た抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：２７２の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：
２７３のＣＤＲ２；配列番号：２７４のＣＤＲ３；配列番号：２７５の軽鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号：２７６のＣＤＲ２；および配列番号：２７７のＣＤＲ３を含む単離され
た抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：２９０の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：
２９１のＣＤＲ２；配列番号：２９２のＣＤＲ３；配列番号：２９３の軽鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号：２９４のＣＤＲ２；および配列番号：２９５のＣＤＲ３を含む単離され
た抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：３０８の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：
３０９のＣＤＲ２；配列番号：３１０のＣＤＲ３；配列番号：３１１の軽鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号：３１２のＣＤＲ２；および配列番号：３１３のＣＤＲ３を含む単離され
た抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：３２６の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：
３２７のＣＤＲ２；配列番号：３２８のＣＤＲ３；配列番号：３２９の軽鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号：３３０のＣＤＲ２；および配列番号：３３１のＣＤＲ３を含む単離され
た抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：３４４の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：
３４５のＣＤＲ２；配列番号：３４６のＣＤＲ３；配列番号：３４７の軽鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号：３４８のＣＤＲ２；および配列番号：３４９のＣＤＲ３を含む単離され
た抗体またはその断片に関する。
別の局面において、本発明は、配列番号：３６２の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：
３６３のＣＤＲ２；配列番号：３６４のＣＤＲ３；配列番号：３６５の軽鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号：３６６のＣＤＲ２；および配列番号：３６７のＣＤＲ３を含む単離され
た抗体またはその断片に関する。
１つの態様において、抗体の断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ２）’、Ｆ（ａｂ）２’、ｓｃ
Ｆｖ、ＶＨＨ、ＶＨ、ＶＬ、ｄＡｂからなる群から選択されるＨＥＲ３に結合する。
別の局面において、本発明は、抗体またはその断片および薬学的に許容される担体を含
む医薬組成物に関する。１つの態様において、医薬組成物は、さらなる治療剤、例えば、
抗体、小分子、ｍＴＯＲ阻害剤またはＰＩ３キナーゼ阻害剤をさらに含む。１つの態様に
おいて、医薬組成物は、本発明の抗体またはその断片および限定はしないが、マツズマブ
（ＥＭＤ７２０００）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）／セツキシマブ、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ
（登録商標）／パニツムマブ、ｍＡｂ ８０６、ニモツズマブ、イレッサ（登録商標）／
ゲフィチニブ、ＣＩ−１０３３（ＰＤ１８３８０５）、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６
）、Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標）／トシル酸ラパチニブ、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）／エ
ルロチニブ ＨＣＬ（ＯＳＩ−７７４）、ＰＫＩ−１６６およびＴｏｖｏｋ（登録商標）
を含むＨＥＲ１阻害剤を含む。
１つの態様において、医薬組成物は、本発明の抗体またはその断片および限定はしない
が、ペルツズマブ、トラスツマブ、ＭＭ−１１１、ネラチニブ、ラパチニブまたはトシル
酸ラパチニブ／Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標）を含むＨＥＲ２阻害剤を含む。
１つの態様において、医薬組成物は、本発明の抗体またはその断片および限定はしない
が、ＭＭ−１２１、ＭＭ−１１１、ＩＢ４Ｃ３、２ＤＩＤ１２（Ｕ３ Ｐｈａｒｍａ Ａ
Ｇ）、ＡＭＧ８８８（Ａｍｇｅｎ）、ＡＶ−２０３（Ａｖｅｏ）、ＭＥＨＤ７９４５Ａ（
Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ＨＥＲ３を阻害する小分子を含むＨＥＲ３阻害剤を含む。
１つの態様において、医薬組成物は、本発明の抗体またはその断片およびＨＥＲ４阻害
剤を含む。
１つの態様において、医薬組成物は、本発明の抗体またはその断片および限定はしない
が、ＧＤＣ ０９４１、ＢＥＺ２３５、ＢＭＫ１２０およびＢＹＬ７１９を含むＰＩ３キ
ナーゼ阻害剤を含む。
１つの態様において、医薬組成物は、本発明の抗体またはその断片および限定はしない
が、テムシロリムス／Ｔｏｒｉｓｅｌ（登録商標）、リダフォロリムス／デフォロリムス
、ＡＰ２３５７３、ＭＫ８６６９、エバロリムス／Ａｆｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）を含
むｍＴＯＲ阻害剤を含む。別の局面において、本発明は、癌を発現するＨＥＲ３を有する
対象を選択すること、前記請求項のいずれかに記載の抗体またはその断片を含む有効量の
組成物を対象に投与することを含む、癌を処置する方法に関する。１つの態様において、
対象はヒトである。
別の局面において、本発明は、癌を発現するＨＥＲ３を有する対象を選択すること、前
記請求項のいずれかに記載の抗体またはその断片を含む有効量の組成物を対象に投与する
ことを含む、癌を処置する方法であって、該癌は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多発性骨髄
腫、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、
骨肉腫、扁平上皮癌、末梢神経鞘腫瘍、神経鞘腫、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、グリア芽
腫、軟組織の明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎臓癌、黒色腫からなる群から選
択される、方法に関する。１つの態様において、癌が乳癌である。
別の局面において、本発明は、癌を発現するＨＥＲ３を有する対象を選択すること、Ｈ
ＥＲ３に結合する表１に記載されている抗体またはそれらの断片の組合せを含む有効量の
組成物を該対象に投与することを含む、癌を処置する方法に関する。
別の局面において、本発明は、癌を発現するＨＥＲ３を有する対象を選択すること、Ｈ
ＥＲ３に結合し、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換およびリガンド非依存性シグナル
変換を阻害する抗体またはその断片を含む有効量の組成物を該対象に投与することを含む
、癌を処置する方法に関する。
別の局面において、本発明は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝臓
癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮
癌、末梢神経鞘腫瘍、神経鞘腫、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、グリア芽腫、軟組織の明細
胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎臓癌および黒色腫からなる群から選択されるＨＥ
Ｒ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌
の処置のための薬物の製造における、前記請求項のいずれかに記載の抗体またはその断片
の使用に関する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非
依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：１５のＶ
Ｈおよび配列番号：１４のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非
依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：３３のＶ
Ｈおよび配列番号：３２のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非
依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：５１のＶ
Ｈおよび配列番号：５０のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非
依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：６９のＶ
Ｈおよび配列番号：６８のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非
依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：８７のＶ
Ｈおよび配列番号：８６のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非
依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：１０５の
ＶＨおよび配列番号：１０４のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非
依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：１２３の
ＶＨおよび配列番号：１２２のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非
依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：１４１の
ＶＨおよび配列番号：１４０のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非
依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：１５１の
ＶＨおよび配列番号：１５８のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非
依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：１７７の
ＶＨおよび配列番号：１７６のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非
依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：１９５の
ＶＨおよび配列番号：１９４のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非
依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：２１３の
ＶＨおよび配列番号：２１２のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非
依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：２３１の
ＶＨおよび配列番号：２３０のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非
依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：２４９の
ＶＨおよび配列番号：２４８のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非
依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：２６７の
ＶＨおよび配列番号：２６６のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非
依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：２８５の
ＶＨおよび配列番号：２８４のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非
依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：３０３の
ＶＨおよび配列番号：３０２のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非
依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：３２１の
ＶＨおよび配列番号：３２０のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非
依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：３３９の
ＶＨおよび配列番号：３３８のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非
依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：３５７の
ＶＨおよび配列番号：３５６のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非
依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：３７５の
ＶＨおよび配列番号：３７４のＶＬを有する抗体に関する。別の局面において、本発明は
、薬物としての使用のための、配列番号：１５のＶＨおよび配列番号：１４のＶＬを有す
る抗体に関する。
別の局面において、本発明は、薬物としての使用のための、配列番号：３３のＶＨおよび
配列番号：３２のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、薬物としての使用のための、配列番号：５１のＶＨおよ
び配列番号：５０のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、薬物としての使用のための、配列番号：６９のＶＨおよ
び配列番号：６８のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、薬物としての使用のための、配列番号：８７のＶＨおよ
び配列番号：８６のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、薬物としての使用のための、配列番号：１０５のＶＨお
よび配列番号：１０４のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、薬物としての使用のための、配列番号：１２３のＶＨお
よび配列番号：１２２のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、薬物としての使用のための、配列番号：１４１のＶＨお
よび配列番号：１４０のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、薬物としての使用のための、配列番号：１５９のＶＨお
よび配列番号：１５８のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、薬物としての使用のための、配列番号：１７７のＶＨお
よび配列番号：１７６のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、薬物としての使用のための、配列番号：１９５のＶＨお
よび配列番号：１９４のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、薬物としての使用のための、配列番号：２１３のＶＨお
よび配列番号：２１２のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、薬物としての使用のための、配列番号：２３１のＶＨお
よび配列番号：２３０のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、薬物としての使用のための、配列番号：２４９のＶＨお
よび配列番号：２４８のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、薬物としての使用のための、配列番号：２６７のＶＨお
よび配列番号：２６６のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、薬物としての使用のための、配列番号：２８５のＶＨお
よび配列番号：２８４のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、薬物としての使用のための、配列番号：３０３のＶＨお
よび配列番号：３０２のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、薬物としての使用のための、配列番号：３２１のＶＨお
よび配列番号：３２０のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、薬物としての使用のための、配列番号：３３９のＶＨお
よび配列番号：３３８のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、薬物としての使用のための、配列番号：３５７のＶＨお
よび配列番号：３５６のＶＬを有する抗体に関する。
別の局面において、本発明は、薬物としての使用のための、配列番号：３７５のＶＨお
よび配列番号：３７４のＶＬを有する抗体に関する。
ヒト、マウス、ラットおよびカニクイザルＨＥＲ３で得られた典型的なＭＯＲ１０７０１ ＳＥＴ曲線。 ＦＡＣＳ滴定によるＳＫ−Ｂｒ−３細胞結合測定。 ＨＥＲ３ドメイン結合ＥＬＩＳＡ。 水素重水素交換エピトープマッピング。Ａ）以下のＨＤＸ−ＭＳ分析で回収されたＨＥＲ３ ＥＣＤペプチドは、破線により示されている。起こりうるＮ−連結グリコシル化部位が強調されている。 水素重水素交換エピトープマッピング。Ｂ）ＭＳにより同定されたペプ チドにおいて観察された重水素化の相対程度。 水素重水素交換エピトープマッピング。Ｃ）公開されたＨＥＲ３結晶構 造上にマッピングされた保護された残基。 Ａ）ＨＥＲ３／ＭＯＲ０９８２３およびＨＥＲ３／ＭＯＲ０９８２５ｘ線結晶構造の表面表示。ＨＥＲ３（薄い灰色）は閉塞的な立体構造であり、ＭＯＲ０９８２３またはＭＯＲ０９８２５（濃い灰色）はドメイン２および４の両方に結合する。 Ｂ）（Ａ）と同様の方向において示されたＨＥＲ３／ＭＯＲ０９８２３ 構造からＨＥＲ３の表面図。ＭＯＲ０９８２３は明瞭さに欠けている。 Ｃ）パネル（Ａ）、（Ｂ）および（Ｄ）から９０°回転で描写されたリ ボン構造として説明されたＨＥＲ３／ＭＯＲ０９８２３構造。 Ｄ）ドメイン２／ドメイン４接合面の拡大図でＭＯＲ０９８２３ Ｆａ ｂにより認識される不活性なＨＥＲ３立体構造のリボン表示、Ｆａｂの５Å内であるＨＥＲ３残基を強調している。 Ｅ）ＥＬＩＳＡ滴定による変異体ＨＥＲ３／ＭＯＲ１０７０３結合測定 。 リガンド誘導（Ａ）またはリガンド非依存性（Ｂ）ＨＥＲ３リン酸化の阻害。 ＨＥＲ２増殖細胞系におけるＨＥＲ３依存性下流シグナル伝達経路の阻害。 Ａ）ＢＴ−４７４およびＢ）ニューレグリン刺激ＭＣＦ７細胞における細胞増殖時のＨＥＲ３阻害の影響。 ＭＣＦ７細胞へのニューレグリン結合時のＭＯＲ０９８２３およびＭＯＲ０９８２５の効果。 ＢｉａｃｏｒｅＴＭにより評価されるとき、ＨＥＲ３／ニューレグリン複合体形成時のＭＯＲ０９８２３結合の影響。抗体なし（黒色棒）、ＭＯＲ０９８２３（白色棒）、１０５．５（灰色）＆コントロールＩｇＧ（縞模様の棒）。 インビボでの（Ａ）リガンド非依存性（ＢＴ−４７４）および（Ｂ）リガンド依存性（ＢｘＰＣ３）ＨＥＲ３シグナル伝達のＭＯＲ０９８２３介在阻害。 ＢＴ−４７４腫瘍増殖時のＭＯＲ１０７０１およびＭＯＲ１０７０３の影響。 ＢｘＰＣ３腫瘍増殖時のＭＯＲ１０７０１およびＭＯＲ１０７０３の影響。 ＭＯＲ１０７０３ インビトロでの薬物組合せアイソボログラム（Ａ）ＭＯＲ０９８２３／トラスツマブ、（Ｂ）ＭＯＲ０９８２３／ラパチニブ、（Ｃ）ＭＯＲ１０７０３／ＢＥＺ２３５、（Ｄ）ＭＯＲ１０７０３／ＢＫＭ１２０、（Ｅ）ＭＯＲ１０７０３／ＢＹＬ７１９、および（Ｆ）ＭＯＲ１０７０３／ＲＡＤ００１。 ＭＯＲ１０７０３ インビトロでの薬物組合せアイソボログラム（Ｇ ）ＭＯＲ１０７０３／セツキシマブおよび（Ｈ）ＭＯＲ１０７０３／エルロチニブ。 ＢＴ−４７４およびＬ３．３における（Ａ）トラスツマブおよび（Ｂ）エルロチニブとＭＯＲ１０７０１またはＭＯＲ１０７０３とのインビボ組合せ。
本発明の詳細な説明
定義
本発明がより容易に理解されるよう、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は、
詳細な説明全体を通して示される。
本明細書において用いる「シグナル変換」または「シグナル伝達活性」の語句は、一般
的にタンパク質−タンパク質相互作用、例えば受容体への成長因子の結合によって開始さ
れ、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達をもたらす生化学的因果関係
をいう。ＨＥＲ３に関して、該伝達は、シグナル伝達を引き起こす一連の反応における１
以上のタンパク質上の１以上のチロシン、セリンまたはスレオニン残基の特異的リン酸化
を含む。最後から２番目のプロセスは通常、核の事象を含み、遺伝子発現の変化をもたら
す。
「ＨＥＲ受容体」は、ＨＥＲ受容体ファミリーに属し、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３
およびＨＥＲ４受容体ならびに将来的に該ファミリーに特定される他のメンバーを含む受
容体タンパク質チロシンキナーゼである。ＨＥＲ受容体は、一般的に、ＨＥＲリガンドに
結合し得る細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存されている細胞内チロシンキナ
ーゼドメイン；および、リン酸化され得るいくつかのチロシン残基を含むカルボキシル末
端シグナル伝達ドメインを含む。好ましくは、ＨＥＲ受容体は、天然配列ヒトＨＥＲ受容
体である。
「ＨＥＲ１」、「ＥｒｂＢ１」、「上皮細胞増殖因子受容体」および「ＥＧＦＲ」なる
用語は、本明細書において互換的に使用され、天然変異体形態（例えば、Humphreyら (19
90) PNAS (USA) 87:4207-4211において欠失変異体ＥＧＦＲ）を含む、例えば、Carpenter
ら Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987)において記載されているＥＧＦＲを示す。ｅ
ｒｂＢ１は、ＥＧＦＲタンパク質産物をコードする遺伝子を示す。
「ＨＥＲ２」および「ＥｒｂＢ２」なる用語は、本明細書において互換的に使用され、
例えば、Sembaら (1985) PNAS (USA) 82:6497-6501およびYamamotoら(1986) Nature 319:
230-234（遺伝子バンク受入番号Ｘ０３３６３）において記載されているヒトＨＥＲ２タ
ンパク質を示す。「ｅｒｂＢ２」なる用語はヒトＥｒｂＢ２をコードする遺伝子を示し、
「ｎｅｕ」はラットｐ１８５ｎｅｕをコードする遺伝子を示す。
本明細書における「ＨＥＲ４」および「ＥｒｂＢ４」なる用語は、例えば、１９９９年
４月２２日公開ＷＯ９９／１９４８８に記載されているアイソフォームを含む、例えば、
ＥＰ特許出願第５９９，２７４号；Plowmanら (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:
1746-1750;およびPlowmanら (1993) Nature, 366:473-475において記載されている受容体
ポリペプチドを示す。
本明細書において使用される「ＥｒｂＢ３」としても知られている「ＨＥＲ３」または
「ＨＥＲ３受容体」なる用語は哺乳動物ＨＥＲ３タンパク質を示し、「ｈｅｒ３」または
「ｅｒｂＢ３」は哺乳動物ｈｅｒ３遺伝子を示す。好ましいＨＥＲ３タンパク質は、細胞
の細胞膜に存在するヒトＨＥＲ３タンパク質である。ヒトＨＥＲ３遺伝子は、米国特許第
５，４８０，９６８号およびPlowmanら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4905-4
909に記載されている。
受入番号ＮＰ＿００１９７３（ヒト）において定義されるヒトＨＥＲ３は、配列番号：
１として以下で示される。全命名法は、全長未成熟ＨＥＲ３（アミノ酸１−１３４２）に
対してである。未成熟ＨＥＲ３は位置１９と２０間で開裂され、成熟ＨＥＲ３タンパク質
（２０−１３４２アミノ酸）となる。
Figure 0006771002
本明細書において使用される「ＨＥＲリガンド」なる用語は、ＨＥＲ受容体、例えば、
ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４に結合し、活性化するポリペプチドを示す
。ＨＥＲリガンドの例は、限定はしないが、ニューレグリン１（ＮＲＧ）、ニューレグリ
ン２、ニューレグリン３、ニューレグリン４、ベタセルリン、ヘパリン結合上皮細胞増殖
因子、エピレグリン、上皮細胞増殖因子、アンフィレグリンおよび形質転換増殖因子アル
ファを含む。該用語は、天然ポリペプチドの生物学的に活性な断片および／または変異体
を含む。
本明細書において使用される「ＨＥＲ３リガンド」なる用語は、ＨＥＲ３に結合し、活
性化するポリペプチドを示す。ＨＥＲ３リガンドの例は、限定はしないが、ニューレグリ
ン１（ＮＲＧ）およびニューレグリン２、ベタセルリン、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子
およびエピレグリンを含む。該用語は、天然ポリペプチドの生物学的に活性な断片および
／または変異体を含む。
「ＨＥＲ−ＨＥＲタンパク質複合体」は、任意の組合せにおいてＨＥＲ共受容体を含む
非共有結合的オリゴマー（例えば、ＨＥＲ１−ＨＥＲ２、ＨＥＲ１−ＨＥＲ３、ＨＥＲ１
−ＨＥＲ４、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３、ＨＥＲ３−ＨＥＲ４など）である。該複合体は、これ
らの受容体の両方を発現する細胞がＨＥＲリガンド、例えば、ＮＲＧに暴露されたとき、
またはＨＥＲ受容体が活性であるか、もしくは過剰発現されるとき、形成され得る。
「ＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体」は、ＨＥＲ２受容体およびＨＥＲ３受容体を
含む非共有結合的オリゴマーである。該複合体は、これらの受容体の両方を発現する細胞
がＨＥＲ３リガンド、例えば、ＮＲＧに暴露されたとき、またはＨＥＲ２が活性であるか
、もしくは過剰発現されるとき、形成され得る。
本明細書において使用される「ＨＥＲ３活性」または「ＨＥＲ３活性化」なる語句は、
オリゴマー形成の増加（例えば、複合体を含むＨＥＲ３の増加）、ＨＥＲ３リン酸化、立
体構造再配列（例えば、リガンドにより誘導されるもの）、およびＨＥＲ３媒介下流シグ
ナル伝達を示す。
ＨＥＲ３の文脈において使用される「安定化」または「安定」は、リガンド結合がもは
やＨＥＲ３を活性化できないように、ＨＥＲ３へのリガンド結合のブロックなしでＨＥＲ
３の不活性化状態または立体構造を直接的に維持（固定する、つなぎ止める、保持する、
優先的に結合する、支持する）する抗体またはその断片を示す。実施例に記載されている
アッセイ、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ アッセイは、安定化ＨＥＲ３受容体に対するリガン
ド結合を測定するために使用することができる。
本明細書において使用される「リガンド依存性シグナル伝達」なる用語は、リガンドを
介するＨＥＲ（例えば、ＨＥＲ３）の活性化を示す。ＨＥＲ３活性化は、下流シグナル伝
達経路（例えば、ＰＩ３Ｋ）が活性化されるようなオリゴマー形成（例えば、ヘテロ二量
体化）および／またはＨＥＲ３リン酸化の増加により証明される。抗体またはその断片は
、実施例に記載されているアッセイを使用して測定されるとき、未処理（コントロール）
細胞と比較して、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）に暴露された刺激細胞中のリン酸
化ＨＥＲ３の量を統計的に有意に減少させる。ＨＥＲ３を発現する細胞は、天然細胞系（
例えば、ＭＣＦ７）であってよく、またはＨＥＲ３タンパク質をコードする核酸を宿主細
胞に導入することにより組換え的に生産され得る。細胞刺激は、活性化ＨＥＲ３リガンド
の外因的付加を介して、または活性化リガンドの内因的発現により起こり得る。
「細胞におけるニューレグリン誘導ＨＥＲ３活性化を減少させる」抗体またはその断片
は、実施例に記載されているアッセイを使用して測定されるとき、未処理（コントロール
）細胞と比較して、ＨＥＲ３チロシンリン酸化を統計的に有意に減少させるものである。
これは、ＮＲＧおよび興味ある抗体へのＨＥＲ３の暴露に続くＨＥＲ３ホスホチロシンレ
ベルに基づいて測定することができる。ＨＥＲ３タンパク質を発現する細胞は、天然細胞
または細胞系（例えば、ＭＣＦ７）であってよく、または組換え的に生産され得る。
本明細書において使用される「リガンド非依存性シグナル伝達」なる用語は、リガンド
結合のための必要条件の非存在下での細胞性ＨＥＲ３活性（例えば、リン酸化）を示す。
例えば、リガンド非依存性ＨＥＲ３活性化は、ＨＥＲ３ヘテロ二量体パートナー、例えば
、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２におけるＨＥＲ２過剰発現または活性化変異の結果であり得る
。抗体またはその断片は、未処理（コントロール）細胞と比較して、抗原結合タンパク質
（例えば、抗体）に暴露された細胞におけるリン酸化ＨＥＲ３の量を統計的に有意に現象
させ得る。ＨＥＲ３を発現する細胞は、天然細胞系（例えば、ＳＫ−Ｂｒ−３）であって
よく、またはＨＥＲ３タンパク質をコードする核酸を宿主細胞に導入することにより組換
え的に生産され得る。
本明細書において使用される「ブロックする」なる用語は、相互作用またはプロセスを
停止または防止すること、例えば、リガンド依存性またはリガンド非依存性シグナル伝達
を停止することを示す。
本明細書において使用される「認識する」なる用語は、立体構造的エピトープを見つけ
る、および相互作用する（例えば、結合する）抗体またはその断片を示す。
本明細書において使用される「同時に結合する」なる語句は、ＨＥＲ抗体と一緒にＨＥ
Ｒ受容体上のリガンド結合部位に結合することができるＨＥＲリガンドを示す。これは、
抗体および抗体の両方がＨＥＲ受容体に互いに結合することができることを意味する。説
明のみの目的のために、ＨＥＲ３リガンドＮＲＧは、ＨＥＲ３抗体と一緒にＨＥＲ３受容
体に結合することができる。リガンドおよび抗体の同時結合を測定するためのアッセイ（
例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）は、実施例の部に記載されている。
本明細書において使用される「できない」なる用語は、特定の事象を行わない抗体また
はその断片を示す。例えば、「シグナル変換を活性化できない」抗体またはその断片は、
シグナル変換を引き起こさないものである；「構造変化を誘導できない」抗体またはその
断片は、ＨＥＲ受容体における構造変化を引き起こさないものである；ＨＥＲ受容体が「
二量体化できない」ような、不活性化状態におけるＨＥＲ受容体を安定化する抗体または
その断片は、タンパク質−タンパク質複合体を形成しないものである。
本明細書において使用される「抗体」なる用語は、（例えば結合、立体障害、安定化／
不安定化、空間分布によって）ＨＥＲ３エピトープと相互作用し、シグナル伝達を阻害す
る抗体全体(whole antiboy)をいう。天然の「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互
接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質であ
る。各々の重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略す）および重鎖定常領域で
構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成され
る。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略す）および軽鎖定常領域で
構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域
は、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と称される領域と共に散在する、相補性
決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。各々のＶ
ＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順番で並んだ３つのＣＤＲおよ
び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、
ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の
定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第一
成分（Ｃｌｑ）を含む宿主の組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。「
抗体」の用語は、例えば、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化(camel
ised)抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖｓ(scFv)、ジスルフィド連結Ｆｖｓ(sdFv)、Ｆａｂ
断片、Ｆ（ａｂ’）断片、および抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体（例えば本発明の抗
体に対する抗−Ｉｄ抗体を含む）、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合性断片を含
む。抗体は、いかなるアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ
およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１
およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであってもよい。
軽鎖および重鎖は共に、構造上および機能上の相同性の領域に分けられる。「定常」お
よび「可変」の用語は、機能的に用いられる。この点に関し、軽鎖（ＶＬ）および重鎖（
ＶＨ）部分の両方の可変ドメインが抗原認識および特異性を決定することが理解される。
逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、重要
な生物学的特性、例えば分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合等を与える。慣
例により、定常領域ドメインの番号付けは、それが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端
からより遠く離れるにつれて大きくなる。Ｎ−末端は可変領域であり、Ｃ−末端は定常領
域である；ＣＨ３およびＣＬドメインは、それぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を実
際に含む。
本明細書において使用される「抗体断片」なる語句は、（例えば結合、立体障害、安定
化／不安定化、空間分布によって）ＨＥＲ３エピトープと特異的に相互作用し、シグナル
伝達を阻害する能力を保持している、抗体の１以上の断片をいう。結合断片の例としては
、これらに限定されないが、Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからな
る一価の断片；Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結し
た２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗
体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなるｄ
Ａｂ断片（Wardら (1989) Nature 341:544-546）；および単離された相補性決定領域（Ｃ
ＤＲ）が挙げられる。
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコー
ドされているが、それらは、組換え方法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価
の分子を形成する単一のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、
Birdら (1988) Science 242:423-426；およびHustonら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.
85:5879-5883を参照）として作成されることを可能にする合成リンカーによって連結する
ことができる。かかる単鎖抗体も、「抗体断片」なる用語の中に包含されることを意図さ
れている。これらの抗体断片は当業者に公知の常套の方法を用いて得られ、該断片はイン
タクトな抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
抗体断片は、単一ドメイン抗体、マキシボディ(maxibody)、ミニボディ(minibody)、細
胞内抗体(intrabodies)、ダイアボディ(diabody)、トリアボディ(triabody)、テトラボデ
ィ(tetrabody)、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖ（例えば、Hollinger and Hudson, (20
05) Nature Biotechnology 23: 1126-1136を参照）の中に組み込むこともできる。抗体断
片は、ポリペプチド、例えばフィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）に基づく足場（フィブ
ロネクチンポリペプチドモノボディ(monobody)を記載する米国特許第６，７０３，１９９
号を参照）の中に移植することができる。
抗体断片は、相補的軽鎖ポリペプチドと共に抗原結合領域のペアを形成するタンデムな
Ｆｖセグメントのペア（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む単鎖分子の中に組み込むこ
とができる（Zapataら (1995) Protein Eng. 8:1057-1062；および米国特許第５，６４１
，８７０号）。
「エピトープ」なる用語は、免疫グロブリンに特異的に結合するか、あるいは分子と相
互作用することができるあらゆるタンパク質決定因子を含む。エピトープ決定因子は、一
般的に、分子、例えば、アミノ酸または炭水化物または糖側鎖の化学的に活性な表面群か
らなり、特異的三次元構造特性、ならびに特異的電荷特性を有し得る。エピトープは、「
直線的」または「立体構造的」であり得る。
「直線的エピトープ」なる用語は、タンパク質および相互作用する分子（例えば、抗体
）間の相互作用の全ての部分が、タンパク質の一次アミノ酸配列（連続的な）に沿って直
線的に起こるエピトープを示す。抗原上の所望のエピトープが決定されると、例えば、本
発明に記載されている技術を使用して、エピトープに対する抗体を作製することができる
。あるいは、開発プロセス中、抗体の作製および特性化は、望ましいエピトープについて
の情報を解明し得る。この情報から、次に、同じエピトープに結合する抗体を競合的にス
クリーニングすることができる。これをなし遂げるアプローチは、お互いに競合的に結合
する抗体を見つける交差競合試験を行うことである、例えば、抗体は、抗原への結合に対
して競合する。交差競合に基づく「結合」抗体に対するハイスループットプロセスは、国
際特許出願ＷＯ２００３／４８７３１に記載されている。当業者により理解されるとおり
、抗体が特異的に結合する実質的にすべてのものは、エピトープであり得る。エピトープ
は、抗体が結合する残基を含むことができる。
「立体構造的エピトープ」なる用語は、不連続的なアミノ酸が三次元立体構造に集合す
るエピトープを示す。立体構造的エピトープにおいて、相互作用の部分は、お互いから分
離されるタンパク質上のアミノ酸残基にわたって起こる。１つの態様において、エピトー
プは、本願明細書の実施例に記載されているものである。１つの態様において、立体構造
的エピトープは、配列番号：１の（ｉ）ＨＥＲ３アミノ酸残基２６５−２７７および３１
５（ドメイン２の）および（ｉｉ）ＨＥＲ３アミノ酸残基５７１、５８２−５８４、５９
６−５９７、６００−６０２、６０９−６１５（ドメイン４の）またはそれらのサブセッ
トにより定義される。当業者により理解されるとおり、分子の形状を作る残基または側鎖
により占有される空間は、エピトープであるかを決定するための手助けとなる。
一般的に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または高分子の複雑
な混合物中において、標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。
所与のポリペプチドのエピトープを含む領域は、当該技術分野において周知のエピトー
プマッピング手法のいずれかを用いて同定することができる。例えば、Epitope Mapping
Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Hu
mana Press, Totowa, New Jerseyを参照されたい。例えば、直線的エピトープは、例えば
タンパク質分子の部分に相当する多数のペプチドを固体支持体上で同時に合成し、該ペプ
チドが支持体に付着している間に該ペプチドを抗体と反応させることによって、決定し得
る。かかる手法は当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８
７１号；Geysenら (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysenら (1985)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysenら (1986) Mol. Immunol. 23:709-715に
記載されている。同様に、立体構造的エピトープは、例えば、水素／重水素交換、ｘ線結
晶学および二次元核磁気共鳴によってアミノ酸の空間的高次構造を決定することにより、
容易に同定される。例えば、前掲のEpitope Mapping Protocolsを参照されたい。タンパ
ク質の抗原性領域も、標準的な抗原性および疎水性プロット、例えばOxford Molecular G
roupから入手可能なＯｍｉｇａ ｖｅｒｓｉｏｎ １．０ソフトウェアプログラムを使用
して計算されるプロットを用いて同定することができる。このコンピュータプログラムは
、抗原性プロファイルの決定のためにＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法、Hoppら (1981) Proc. Na
tl. Acad. Sci USA 78:3824-3828を採用し；疎水性プロットのためにＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌ
ｉｔｔｌｅ法、Kyteら (1982) J.MoI. Biol. 157:105-132を採用している。
本明細書において使用される「パラトープ」なる用語は、エピトープへの結合を決定す
る結合領域の一般的な構造を示す。この構造は、結合領域がエピトープに結合し得るか否
か、どのような形かに影響する。パラトープは、抗原決定因子に結合する、抗体またはそ
の断片に関与する抗体の抗原部位を示すことができる。パラトープはまた、抗体のイディ
オトープおよびエピトープに結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）領域を示す。１つの態様
において、パラトープは、配列番号：１の（ｉ）ＨＥＲ３アミノ酸残基２６５−２７７お
よび３１５（ドメイン２の）、および（ｉｉ）ＨＥＲ３アミノ酸残基５７１、５８２−５
８４、５９６−５９７、６００−６０２、６０９−６１５（ドメイン４の）またはそれら
のサブセットを含む立体構造的エピトープに結合する抗体の領域である。１つの態様にお
いて、パラトープは、ＣＤＲ配列を含む抗体の領域である。１つの態様において、パラト
ープは、表１に記載されている配列を含む。１つの態様において、パラトープは、ＨＥＲ
３残基と結合する少なくとも１つのアミノ酸残基を含む：Ａｓｎ２６６、Ｌｙｓ２６７、
Ｌｅｕ２６８、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｎ２７１、Ｇｌｕ２７３、Ｐｒｏ２７４、Ａｓｎ２７
５、Ｐｒｏ２７６、Ｈｉｓ２７７、Ａｓｎ３１５、Ａｓｐ５７１、Ｐｒｏ５８３、Ｈｉｓ
５８４、Ａｌａ５９６、Ｌｙｓ５９７。１つの態様において、パラトープは、ＨＥＲ３残
基と結合する少なくとも１つのアミノ酸残基を含む：Ｔｙｒ２６５、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅ
ｕ２６８、Ｐｈｅ２７０、Ｇｌｙ５８２、Ｐｒｏ５８３、Ｌｙｓ５９７、Ｉｌｅ６００、
Ｌｙｓ６０２、Ｇｌｕ６０９、Ａｒｇ６１１、Ｐｒｏ６１２、Ｃｙｓ６１３、Ｈｉｓ６１
４、Ｇｌｕ６１５。当業者により理解されるとおり、抗体またはその変異体のパラトープ
は、本出願により示されている方法において決定することができる。
本明細書において用いる「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」
なる語句は、実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、または同じ遺伝源(genetic sourc
e)に由来する、抗体、抗体断片、二特異性抗体等を含むポリペプチドをいう。かかる用語
は、単一の分子構成の抗体分子の調製物をも含む。モノクローナル抗体組成物は、特定の
エピトープに対する単一の結合特異性およびアビディティーを示す。
本明細書において用いる「ヒト抗体」なる語句は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の
両方がヒト起源の配列に由来するものである可変領域を有する抗体を含む。さらに、該抗
体が定常領域を含む場合、該定常領域もかかるヒト配列、例えばヒト生殖系列配列に由来
するものであるか、またはヒト生殖系列配列の突然変異したバージョンであるか、あるい
は、該抗体は、例えば、Knappikら (2000. J Mol Biol 296, 57-86)に記載されるヒトフ
レームワーク配列の解析から得られるコンセンサスフレームワーク配列を含むものである
。免疫グロブリン可変ドメイン、例えば、ＣＤＲの構造および位置は、周知の番号付け体
系、例えば、Ｋａｂａｔ番号付け体系、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け体系、またはＫａｂａｔ
およびＣｈｏｔｈｉａの組み合わせを用いて定義することができる（例えば、Sequences
of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Servi
ces (1991), eds. Kabatら; Lazikaniら (1997) J. Mol. Bio. 273:927 948; Kabatら (1
991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication
no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services; Chothiaら (1987) J. M
ol. Biol. 196:901-917; Chothiaら (1989) Nature 342:877-883;およびAl-Lazikaniら (
1997) J. Mol. Biol. 273:927-948を参照されたい）。
本発明のヒト抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビ
トロのランダムなもしくは部位特異的突然変異誘発によって又はインビボの体細胞突然変
異によって導入される突然変異、または安定性もしくは製造を促進するための保存的置換
）を含んでもよい。
本明細書において使用される「ヒトモノクローナル抗体」なる語句は、フレームワーク
およびＣＤＲ領域の両方がヒト配列由来である可変領域を有する単一の結合特異性を示す
抗体を示す。１つの態様において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合された
ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒ
ト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマに
よって生産される。
本明細書において使用される「組換えヒト抗体」なる語句は、組換えの手段によって調
製、発現、作成または単離される全てのヒト抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子の
トランスジェニックまたは染色体導入である動物（例えば、マウス）または該動物から調
製されたハイブリドーマから単離される抗体、ヒト抗体を発現するよう形質転換された宿
主細胞、例えばトランスフェクトーマ(transfectoma)から単離される抗体、組換えのコン
ビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、および、ヒト免疫グロブリン遺
伝子配列の全てまたは一部を他のＤＮＡ配列へスプライスすることを含む他のいずれかの
手段によって調製、発現、作成または単離される抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、
フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来するもので
ある可変領域を有する。しかし、特定の態様においては、かかる組換えヒト抗体は、イン
ビトロの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に関してトランスジェニックである動物を
用いる場合には、インビボの体細胞突然変異誘発）に供することができ、それにより、該
組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨおよびＶＬ配列
に由来し且つ関連するが、インビボのヒト抗体生殖系列レパートリー内には天然には存在
しない可能性がある配列となり得る。
２つの実体間の特異的結合は、少なくとも１０２Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０２Ｍ−１
、少なくとも１０３Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０３Ｍ−１、少なくとも１０４Ｍ−１、少
なくとも５ｘ１０４Ｍ−１、少なくとも１０５Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０５Ｍ−１、少
なくとも１０６Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０６Ｍ−１、少なくとも１０７Ｍ−１、少なく
とも５ｘ１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０８Ｍ−１、少なく
とも１０９Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくと
も５ｘ１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０１１Ｍ−１、少
なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、
少なくとも５ｘ１０１３Ｍ−１、少なくとも１０１４Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０１４Ｍ
−１、少なくとも１０１５Ｍ−１、または少なくとも５ｘ１０１５Ｍ−１の平衡定数（Ｋ
Ａ）（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）での結合を意味する。
抗体（例えばＨＥＲ３結合抗体）と「特異的に（または選択的に）結合する」との語句
は、タンパク質および他の生物学的物質(biologics)の異種性集団中における同族の抗原
（例えばヒトＨＥＲ３）の存在を決定する結合反応をいう。上記平衡定数（ＫＡ）に加え
て、本発明のＨＥＲ３結合抗体は、通常、５ｘ１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５ｘ１
０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５ｘ１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５ｘ１０−５Ｍ
未満、１０−５Ｍ未満、５ｘ１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５ｘ１０−７Ｍ未満、１
０−７Ｍ未満、５ｘ１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５ｘ１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ
未満、５ｘ１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５ｘ１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ
未満、５ｘ１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５ｘ１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ
未満、５ｘ１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５ｘ１０−１５Ｍ未満、もしくは１０
−１５Ｍ未満またはそれより小さい解離速度定数（ＫＤ）（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）をも有し
、非特異的抗原（例えばＨＳＡ）に対するその結合親和性よりも少なくとも２倍大きい親
和性でＨＥＲ３と結合する。
一つの態様において、抗体またはそれらの断片は、本明細書に記載される方法または当
業者に公知の方法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＳＥＴ）
（Biacore International AB, Uppsala, Sweden）を用いて評価される３０００ｐＭ未満
、２５００ｐＭ未満、２０００ｐＭ未満、１５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、７５０
ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、２５０ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１５０ｐＭ未満、１００
ｐＭ未満、７５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、１ｐＭ未満の解離定数（Ｋｄ）を有する。本明
細書において使用される「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」の用語は、特定の抗体−抗原相
互作用の会合速度をいい、他方、本明細書におい使用される「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」
の用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度をいう。本明細書において用いる「ＫＤ
」の用語は、Ｋａに対するＫｄの比（即ちＫｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）とし
て表される解離定数をいう。抗体についてのＫＤ値は、当該分野において十分に確立され
た方法を用いて決定することができる。抗体のＫＤを決定する方法は、表面プラズモン共
鳴法を用いること、またはバイオセンサー系、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システ
ムを用いることである。
本明細書において使用される「親和性」なる用語は、単一の抗原性部位における抗体と
抗原の間の相互作用の強さをいう。各々の抗原性部位内において、抗体「アーム」の可変
領域は、多数の部位において弱い非共有結合的力を介して抗原と相互作用する；相互作用
が大きければ大きいほど、アビディティーは強くなる。
本明細書において使用される「アビディティー」なる用語は、抗体−抗原複合体の全体
的安定性または強度の有益な尺度をいう。それは３つの主な要因：抗体エピトープアビデ
ィティー；抗原および抗体両方の価数；および相互作用する部分の構造的配置によって制
御される。究極的に、これらの要因は、抗体の特異性、即ち、特定の抗体が正確な(preci
se)抗原エピトープに結合している可能性を規定する。
本明細書において使用される「価数」なる用語は、ポリペプチドにおいて起こり得る標
的結合部位の数を示す。それぞれの標的結合部位は、１つの標的分子または標的分子上の
特定の部位（すなわち、エピトープ）に特異的に結合する。ポリペプチドが２つ以上の標
的結合部位を含むとき、それぞれの標的結合部位は、同じか、または異なっている分子に
特異的に結合し得る（例えば、異なる分子、例えば、異なる抗原、または同じ分子上の異
なるエピトープに結合し得る）。
本明細書において使用される「アンタゴニスト抗体」なる語句は、ＨＥＲ３に結合し、
ＨＥＲ３シグナル伝達の生物学的活性を中和する、例えば、ホスホ−ＨＥＲ３またはホス
ホ−Ａｋｔアッセイにおいて、例えば、ＨＥＲ３誘導シグナル伝達活性を低下、減少およ
び／または阻害する抗体を示す。アッセイの例は、以下の実施例により詳細に記載されて
いる。したがって、当分野で既知の方法論および本明細書に記載されている方法論にした
がって決定されるとき、１つ以上のこれらのＨＥＲ３機能特性（例えば、生化学的、免疫
化学的、細胞、生理学的または他の生物学的活性など）を「阻害する」抗体は、抗体の非
存在下で（例えば、または不適切な特異性のコントロール抗体が存在するとき）に見られ
るものと比較して、特定の活性における統計的に有意な減少に関すると理解する。ＨＥＲ
３活性を阻害する抗体は、測定されるパラメーターの少なくとも１０％、少なくとも５０
％、８０％または９０％による、このような統計的に有意な減少をもたらし、１つの態様
において、本発明の抗体は、細胞性ＨＥＲ３リン酸化のレベルの減少により証明されると
き、ＨＥＲ３機能活性の９５％、９８％または９９％以上阻害し得る。
「単離された抗体」なる語句は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まな
い抗体をいう（例えば、ＨＥＲ３に特異的に結合する単離された抗体は、ＨＥＲ３以外の
抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まないものである）。しかし、ＨＥＲ３に特異
的に結合する単離された抗体は、他の抗原に対する交差反応性を有するものであってもよ
い。さらに、単離された抗体は、他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含ま
ないものであってもよい。
「保存的に改変された変異体」なる語句は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用され
る。特定の核酸配列に関し、保存的に改変された変異体とは、同一または本質的に同一の
アミノ酸配列をコードする核酸をいうか、あるいは核酸がアミノ酸配列をコードしない場
合には本質的に同一の配列をいう。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が
所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは
すべてアミノ酸アラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが特定
されるあらゆる位置において、該コドンは、コードされるポリペプチドを変化させること
なく、記載した対応するコドンのいずれかに変更することができ、かかる核酸変異は「サ
イレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。本明細書における、ポリ
ペプチドをコードするすべての核酸配列は、該核酸のあらゆる可能なサイレント変異をも
表す。当業者は、核酸中の各々のコドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、
および通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して機能的に同一
の分子を生み出し得ることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする
核酸の各々のサイレント変異が、記載された各々の配列中に潜在している。
ポリペプチド配列に関し、「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸の、化学的に類
似するアミノ酸による置換をもたらす、ポリペプチド配列に対する個々の置換、欠失また
は付加を含む。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は当該技術分野において
周知である。かかる保存的に改変された変異体は、本発明の多型変異体、種間ホモログお
よび対立遺伝子に対して追加的なものであり、これらを除外しない。以下の８つのグルー
プは、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン
（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ
）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、
トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（
Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照）。いくつかの態
様において、「保存的配列改変」なる用語は、あるアミノ酸配列を含む抗体の結合特性に
有意な影響を与えず、また有意に変化もさせないアミノ酸改変をいうために使用される。
「交差競合する」および「交差競合」なる用語は、標準的な競合結合アッセイにおいて
他の抗体または結合物質とＨＥＲ３との結合に干渉する抗体または結合物質の能力を意味
するために本明細書において互換的に使用される。
抗体または結合物質が別の抗体または結合分子とＨＥＲ３との結合に干渉することがで
きる能力または程度、およびそれを本発明による交差競合と言えるか否かは、標準的な競
合結合アッセイを用いて決定することができる。１つの適切なアッセイとしては、表面プ
ラズモン共鳴の技術を用いて相互作用の程度を測定することができるＢｉａｃｏｒｅ ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００装置(Biacore, Uppsala, Swede
n)を用いることによる）の使用が挙げられる。交差競合を測定するための別のアッセイは
、ＥＬＩＳＡに基づくアプローチを用いるものである。
本明細書において使用される「最適化された」なる用語は、産生細胞または生物、一般
的には真核細胞、例えばピキア(Pichia)の細胞、トリコデルマ(Trichoderma)の細胞、チ
ャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞において好適なコドンを用いた
アミノ酸配列をコードするよう変更されたヌクレオチド配列をいう。最適化されたヌクレ
オチド配列は、「親」配列としても知られる出発ヌクレオチド配列によって元々コードさ
れていたアミノ酸配列を完全に又は可能な限り多く保持するよう、操作される。
様々な種のＨＥＲ３に対する抗体の結合能力を評価するための標準的なアッセイは、当
該技術分野において公知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットおよびＲＩＡ
が挙げられる。適切なアッセイは、実施例において詳細に記載されている。抗体の結合動
態（例えば結合親和性）も、当該技術分野において公知の標準的なアッセイ、例えば、Ｂ
ｉａｃｏｒｅ解析またはＦＡＣＳ相対的親和性(Scatchard)によって評価することができ
る。ＨＥＲ３の機能的特性に対する抗体の効果を評価するためのアッセイ（例えば、受容
体結合アッセイ、Ｈｅｒ経路の調節）は、実施例においてさらに詳細に記載されている。
２以上の核酸またはポリペプチド配列に関し、「パーセント同一」または「パーセント
同一性」なる語句は、同一である２以上の配列または部分配列(subsequence)をいう。以
下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または手動アラインメントおよび目視検査に
よって測定される比較ウィンドウまたは指定した領域にわたる最大の対応(maximum corre
spondence)に対して比較および整列された場合に、２つの配列が同一であるアミノ酸残基
またはヌクレオチドの特定されたパーセンテージ（即ち、特定された領域にわたる６０％
の同一性、所望により６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または
９９％同一、あるいは、特定されていない場合には、配列全体にわたる）を有していれば
、２つの配列は「実質的に同一」である。所望により、同一性は、長さが少なくとも約５
０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）である領域にわたって、またはより好ましくは長
さが１００から５００または１０００またはそれ以上のヌクレオチド（または２０、５０
、２００またはそれ以上のアミノ酸）である領域にわたって存在する。
配列比較に関し、通常は１つの配列が参照配列としての役割を果たし、試験配列は該参
照配列と比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列をコ
ンピュータに入力し、必要であれば部分配列の座標を指定し、そして配列アルゴリズムプ
ログラムのパラメーターを指定する。デフォルトのプログラムパラメーターを用いてもよ
く、あるいは代替のパラメーターを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、
プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性
を算出する。
本明細書において使用される「比較ウィンドウ」は、２つの配列（ある配列と参照配列
）が最適に整列された後、ある配列を同じ数の連続する位置の参照配列と比較し得る、２
０から６００、通常約５０から約２００、より通常には約１００から約１５０からなる群
より選択される連続する位置の数のいずれかのセグメントへの言及を含む。比較のための
配列のアラインメントの方法は、当該技術分野において周知である。比較のための配列の
最適なアラインメントは、例えば、Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:48
2cの局所的相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol.
48:443の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman (1988) Pro
c. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムの
コンピュータ化された実行（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer
Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、
およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または、手動アラインメントおよび目視検査（例えば、
Brentら (2003) Current Protocols in Molecular Biologyを参照）によって、行うこと
ができる。
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの２つの例
は、それぞれAltschulら (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402;およびAltschulら (199
0) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０ア
ルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を行うためソフトウェアは、米国国立生物工学情報セ
ンター（National Center for Biotechnology Information）を通じて公的に入手可能で
ある。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列した場合に一
致するかまたはいくつかの正の値の閾値スコアＴを満たすクエリー配列中の長さＷの短い
ワードを同定することにより、最初に高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含む
。Ｔは、隣接ワードスコア閾値(neighborhood word score threshold)（前掲のＡｌｔｓ
ｃｈｕｌら）と称される。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳ
Ｐを見出す検索を開始するための種としての役割を果たす。ワードヒットは、累積アライ
ンメントスコアを増大させ得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは
、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（一致する残基のペアに対する報酬スコ
ア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を用い
て算出される。アミノ酸配列については、累積スコアを算出するためにスコアリングマト
リックスが用いられる。各方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される
：累積アラインメントスコアがその最大達成値から数(quantity)Ｘだけ減少するとき；１
以上の負のスコアを与える残基アラインメントの蓄積のため、累積スコアがゼロ以下とな
るとき；または、いずれかの配列の末端に到達するとき。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラ
メーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮ
プログラム（ヌクレオチド配列用）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ
＝５、Ｎ＝−４および両鎖比較をデフォルトとして用いている。アミノ酸配列に関して、
ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳ
ＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 89:10915を参照）、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ
＝５、Ｎ＝−４、および両鎖比較をデフォルトとして用いている。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析をも実行する（例えば、
Karlin and Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照）。Ｂ
ＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の一つの尺度は、２つのヌクレオチドま
たはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる可能性の指標を提供する最小合計確率（Ｐ（Ｎ
））である。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が約０．２未満
、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満であるとき、核酸は
参照配列と類似すると考えられる。
２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性も、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．
０）に組み込まれているE. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11
-17)のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０重み付き残基表、１２のギャップ長ペナルテ
ィおよび４のギャップペナルティを用いて決定することができる。加えて、２つのアミノ
酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（www.gcg.comにおいて
入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch (1970) J. M
ol. Biol. 48:444-453）アルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたは
ＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６または４
のギャップ重みおよび１、２、３、４、５または６の長さ重みを用いて決定することがで
きる。
上記した配列同一性のパーセンテージ以外の、２つの核酸配列またはポリペプチドが実
質的に同一であることの別の指標は、以下に記載する通り、第一の核酸にコードされるポ
リペプチドが、第二の核酸にコードされるポリペプチドに対して作成された抗体と免疫学
的に交差反応性であることである。したがって、例えば２つのペプチドが保存的置換のみ
によって異なる場合、ポリペプチドは通常、第二のポリペプチドと実質的に同一である。
２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、以下に記載する通り、該２つの
分子またはそれらの相補体がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすること
である。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらなる別の指標は、同じプライマ
ーを用いて該配列を増幅できることである。
本明細書において、「核酸」なる語句は、「ポリヌクレオチド」なる用語と互換的に用
いられ、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖または二本鎖い
ずれかの形態におけるその重合体をいう。該用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、
かつ、参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される、合成、天然および非天然の、既知の
ヌクレオチド類似体または改変された骨格残基または結合を含む核酸を包含する。かかる
類似体の例としては、これらに限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミダー
ト、メチルホスホナート、キラル−メチルホスホナート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチ
ド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
特に断りの無い限り、特定の核酸配列は、明示される配列のみならず、その保存的に改
変された変異体（例えば縮重コドン置換）および相補配列をも黙示的に包含する。具体的
には、以下において詳細に記載する通り、縮重コドン置換は、１以上の選択された（また
は全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基(mixed-base)および／またはデオキシイノシ
ン残基によって置換されている配列を生成することによって達成し得る（Batzerら (1991
) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsukaら (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608;およ
びRossoliniら (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98）。
「作動可能に連結」なる語句は、２以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）のセグ
メント間の機能的関係をいう。通常、それは転写調節配列と転写される配列との機能的関
係をいう。例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列は、それが適切な宿主細胞また
は他の発現系においてコード配列の転写を刺激または調節する場合、該コード配列に作動
可能に連結している。一般的に、転写される配列に作動可能に連結しているプロモーター
転写調節配列は、該転写される配列と物理的に連続しており、即ち、それはシス作用性で
ある。しかし、いくつかの転写調節配列、例えばエンハンサーは、それが転写を増強する
コード配列と物理的に連続しているかまたは近接して位置している必要がない。
本明細書において、「ポリペプチド」および「タンパク質」なる用語は、アミノ酸残基
の重合体をいうために互換的に用いられる。該用語は、天然アミノ酸の重合体および非天
然アミノ酸の重合体のみならず、１以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的
化学的模倣物であるアミノ酸重合体に適用される。特に断りのない限り、特定のポリペプ
チド配列は、その保存的に改変された変異体をも黙示的に包含する。
「対象」なる用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、
例えば、哺乳類および非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、
両生類、および爬虫類を含む。特記した場合を除き、本明細書において「患者」または「
対象」なる用語は互換的に用いられる。
「抗癌剤」なる用語は、細胞増殖性障害、例えば癌を処置するために用いることができ
るあらゆる物質を意味し、細胞傷害性物質、化学療法剤、放射線治療および放射線治療剤
、標的化された抗癌剤、および免疫治療剤を含む。
「腫瘍」とは、悪性であるか良性であるかに関わらず、腫瘍性の細胞成長および増殖、
ならびに全ての前癌性および癌性の細胞および組織をいう。
「抗腫瘍活性」の用語は、腫瘍細胞の増殖速度、生存度または転移活性の低下を意味す
る。抗腫瘍活性を示す一つの可能な方法は、治療の間に生じる異常細胞の増殖速度の低下
、または腫瘍サイズ安定性または減少を示すことである。かかる活性は、これらに限定さ
れないが、異種移植モデル、同種移植モデル、ＭＭＴＶモデル、および抗腫瘍活性を研究
するために当分野で知られている他の既知のモデルを含む受け入れられたインビトロまた
はインビボの腫瘍モデルを用いて評価することができる。
「悪性腫瘍(malignancy)」の用語は、非良性腫瘍または癌をいう。本明細書において用
いる場合、「癌」の用語は、調節解除された又は制御されない細胞増殖に特徴付けられる
悪性腫瘍を含む。例示的な癌としては、以下が挙げられる：癌腫、肉腫、白血病およびリ
ンパ腫。「癌」の用語は、原発性悪性腫瘍（例えば、その細胞が対象の体における元の腫
瘍の部位以外の部位へ移動していないもの）および二次悪性腫瘍（例えば、転移、即ち元
の腫瘍の部位とは異なる二次的部位への腫瘍細胞の移動から生じるもの）を含む。
本発明の様々な側面を、以下のセクションおよびサブセクションにおいてさらに詳細に
説明する。
ＨＥＲ受容体の構造および活性化のメカニズム
全４つのＨＥＲ受容体は、細胞外リガンド−結合ドメイン、１回膜貫通ドメインおよび
細胞質チロシンキナーゼ含有ドメインを有する。ＨＥＲ受容体の細胞内チロシンキナーゼ
ドメインは高度に保存されているが、ＨＥＲ３のキナーゼドメインは、重要なアミノ酸の
置換を含み、したがってキナーゼ活性を欠いている（Guyら (1994): PNAS 91, 8132-8136
）。ＨＥＲ受容体のリガンド誘導二量体化は、キナーゼの活性化、Ｃ−末端テールにおけ
るチロシン残基上の受容体リン酸転移、次に細胞内シグナル伝達エフェクターの補充およ
び活性化を誘導する（Yarden and Sliwkowski, (2001) Nature Rev 2, 127-137; Jorisse
nら (2003) Exp Cell Res 284, 31-53）。
ＨＥＲの細胞外ドメインの結晶構造は、リガンド誘導受容体活性化のプロセスへのいく
つかの見識を提供している（Schlessinger, (2002) Cell 110, 669-672）。それぞれのＨ
ＥＲ受容体の細胞外ドメインは、４つのサブドメインからなり：サブドメインＩおよびＩ
ＩＩはリガンド−結合部位の形成において協力するが、サブドメインＩＩ（おそらくサブ
ドメインＩＶも）は直線的受容体−受容体相互作用を介する受容体二量体化に参加する。
リガンド結合ＨＥＲ１の構造において、サブドメインＩＩにおけるβヘアピン（二量体化
ループと称される）は、パートナー受容体の二量体化ループと相互作用し、受容体二量体
化（Garrettら (2002) Cell 110, 763-773; Ogisoら (2002) Cell 110, 775-787）を仲介
する。対照的に、不活性なＨＥＲ１、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４の構造において、二量体化
ループは、リガンドの非存在下で受容体二量体化を防止するサブドメインＩＶとの分子内
相互作用に関与する（Cho and Leahy, (2002) Science 297, 1330-1333; Fergusonら (20
03) Mol Cell 12, 541-552; Bouyanら (2005) PNAS102, 15024-15029）。ＨＥＲ２の構造
は、ＨＥＲ中でユニークである。リガンドの非存在下で、ＨＥＲ２は、他のＨＥＲ受容体
と相互作用するように利用できる、隆起型二量体化ループを有するＨＥＲ１のリガンド活
性化状態に似ている立体構造を有する（Choら (2003) Nature 421, 756-760; Garrettら
(2003) Mol Cell 11, 495-505）。これは、ＨＥＲ２の増強されたヘテロ二量体化能力を
説明し得る。
ＨＥＲ受容体結晶構造は、ＨＥＲ受容体ホモおよびヘテロ二量体化に対するモデルを提
供するが、他者に対するいくつかのＨＥＲホモおよびヘテロ二量体の普及（Franklinら (
2004) Cancer cell 5, 317-328）ならびに受容体二量体化および自己阻害におけるドメイ
ンのそれぞれの立体構造の役割（Burgessら (2003) Mol Cell 12, 541-552; Mattoonら (
2004) PNAS101, 923-928）のための背景は、若干あいまいなままである。以下に記載され
るとおり、ＨＥＲ３ｘ線結晶構造は、さらなる見識を提供する。
ＨＥＲ３構造および立体構造的エピトープ
抗原結合タンパク質、例えば、抗−ＨＥＲ３抗体が結合する立体構造的エピトープは、
本明細書において提供されている。初めて、抗体と複合体化されたＨＥＲ３の細胞外ドメ
インの切断形態（残基２０−６４０）の三次元構造は示された。ＨＥＲ３−ＭＯＲ０９８
２３Ｆａｂ複合体およびＨＥＲ３−ＭＯＲ０９８２５はそれぞれ、３．２Åおよび３．４
Å分解能で決定され、図５Ａに示される。本明細書における記載はまた、初めて、ＨＥＲ
３の不活性化状態に結合し、不活性化状態における受容体を安定化する抗体またはその断
片を示す。本発明の抗体はまた、ＨＥＲ３受容体とＨＥＲ３リガンド、例えばニューレグ
リンとの同時結合が可能である。
理論に束縛はされないが、作用機序のための１つの可能なモデルは、ＨＥＲ３が一般的
に不活性（閉、連結(tethered)）または活性な（開）状態において存在することである。
リガンド結合は、ＨＥＲ３がヘテロ二量体パートナーに結合することができ、下流シグナ
ル伝達における活性化をもたらす活性な（開）状態において存在するように、構造変化を
誘導する。抗体、例えば、ＭＯＲ０９８２３は、ＨＥＲ３の不活性な（連結）状態に結合
するが、リガンド結合部位をブロックしない。抗体、例えば、ＭＯＲ０９８２３は、活性
な立体構造への移行のためのＨＥＲ３に必要なリガンド誘導構造再配列を防止し、それに
よりシグナル変換を防止することにより、ＨＥＲ３を阻害する。１つの態様において、本
発明の抗体またはその断片は、ＨＥＲ３の不活性な（連結）状態に結合するが、リガンド
結合部位をブロックしない。別の態様において、抗体またはその断片は、活性な立体構造
への移行のためのＨＥＲ３に必要なリガンド誘導構造再配列を防止し、それによりシグナ
ル変換を防止することにより、ＨＥＲ３を阻害する。別の態様において、抗体またはその
断片は、不活性化状態または立体構造におけるＨＥＲ３受容体を安定化する（直接的に維
持する、固定する、つなぎ止める、保持する、優先的に結合する、または支持する）。１
つの態様において、不活性なＨＥＲ３受容体は、細胞表面ＨＥＲ３受容体の喪失を引き起
こすように、選択的内在化または分解に影響されやすい。実施例の部において存在する生
物学的データは、これらの態様を提供する。
ＨＥＲ３の結晶は、適当な宿主細胞においてＨＥＲ３またはその変異体をコードするヌ
クレオチド配列を発現し、次に、関連ＨＥＲ３標的化Ｆａｂの存在下で精製されたタンパ
ク質を結晶化することにより調製され得る。好ましくは、ＨＥＲ３ポリペプチドは、細胞
外ドメイン（ヒトポリペプチドのアミノ酸２０から６４０または好ましくはアミノ酸２０
−６４０を含むその切断型）を含むが、膜貫通および細胞内ドメインを欠いている。
ＨＥＲ３ポリペプチドはまた、例えば、抽出および精製を手助けするために、融合タン
パク質として生産され得る。融合タンパク質パートナーの例は、グルタチオン−Ｓ−トラ
ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジン（ＨＩＳ）、ヘキサヒスチジン（６ＨＩＳ）、Ｇ
ＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン）およびベータ−ガラクトシダー
ゼを含む。それはまた、融合タンパク質パートナーと興味あるタンパク質配列間にタンパ
ク質分解切断部位を含み、融合タンパク質配列の除去を可能にするために便利であり得る
。
発現後、タンパク質は、例えば、固定化モデルアフィニティークロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィー、および／またはゲル濾過により、精製および／または濃縮
され得る。
タンパク質は、本明細書に記載されている技術を使用して結晶化され得る。一般的に、
結晶化プロセスにおいて、タンパク質溶液を含む１滴を結晶化バッファーと混合し、密封
容器中で平衡にしてもよい。平衡は、既知の技術、例えば。「水滴」または「座滴(sitti
ng drop)」方法によりなし遂げられ得る。これらの方法において、該滴は、結晶化バッフ
ァーの非常に広大な容器のそばで上記水滴または座滴であり、平衡は蒸気拡散を介して達
する。あるいは、平衡は、例えば、油存在下で、半透膜を介する他の方法により、または
自由接合面拡散により起こり得る（例えば、Chayenら (2008) Nature Methods 5, 147 -
153参照）。
結晶が得られたとき、構造は既知のｘ線回折技術により解かれ得る。多数の技術は、空
間的に近い相に対して化学的に修飾された結晶、例えば、重原子誘導体化により修飾され
たものを使用する。実際には、結晶を、結晶に拡散し、タンパク質の表面に結合すること
ができる重金属原子塩または有機金属化合物、例えば、塩化鉛、金チオマレート、チメロ
サールまたは酢酸ウラニルを含む溶液に浸す。次に、結合した重金属原子の位置を、浸さ
れた結晶のｘ線回折分析により決定することができる。結晶の原子（散乱中心）によるＸ
線の単色ビームの回折において得られたパターンを、数学的等式により解き、数学的座標
を得ることができる。回折データを使用して、結晶の繰り返し単位の電子密度図を計算す
る。相情報を得る別の方法は、分子置換として知られている技術を使用することである。
この方法において、回転および並進アルゴリズムは、関連構造由来のサーチモデルを適用
し、興味あるタンパク質に対する空間的に近い方向を得る（Rossmann, (1990) Acta Crys
tal A 46, 73-82参照）。電子密度図を使用して、結晶の単位格子内の個々の原子の位置
を確立する（Blundelら (1976) Protein Crystallography, Academic Press）。
本記載は、初めて、ＨＥＲ３および抗−ＨＥＲ３抗体のＦａｂの三次元構造を記載する
。ＨＥＲ３の細胞外ドメインの空間的に近いドメイン境界は以下のとおりである；ドメイ
ン１：アミノ酸２０−２０７；ドメイン２：アミノ酸２０８−３２８；ドメイン３：アミ
ノ酸３２９−４９８；およびドメイン４：アミノ酸４９９−６４２。ＨＥＲ３および抗体
の三次元構造はまた、可能性のあるＨＥＲ３モジュレーターに対する標的結合部位の同定
を可能にする。好ましい標的結合部位は、ＨＥＲ３の活性化に関与するものである。１つ
の態様において、標的結合部位はＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン４内に位置する。
したがって、ドメイン２またはドメイン４のいずれか、好ましくは両方のドメインに結合
する抗体またはその断片は、互いにドメインを解離から防止することにより、またはドメ
インの関連位置を修飾することにより、ＨＥＲ３活性化を修飾することができる。したが
って、ドメイン２またはドメイン４内のアミノ酸残基への抗体またはその断片の結合は、
タンパク質を活性化を防止する立体構造をとらせ得る。本明細書における記載はまた、初
めて、ＨＥＲ３リガンド、例えば、ニューレグリンに同時に結合することができる抗体ま
たはその断片を示す。
いくつかの態様において、抗体またはその断片がＨＥＲ３を共受容体（限定はしないが
、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２およびＨＥＲ４を含む）との相互作用から防止するように、抗体ま
たはその断片はＨＥＲ３の特異的な立体構造状態を認識する。いくつかの態様において、
抗体またはその断片は、不活性または閉状態におけるＨＥＲ３受容体を安定化することに
より、ＨＥＲ３を共受容体との相互作用から防止する。１つの態様において、抗体または
その断片は、ＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基へ結合することに
より、ＨＥＲ３受容体を安定化する。不活性化状態において、ドメイン２内に位置する二
量体化ループは暴露されず、したがって他の共受容体（限定はしないが、ＨＥＲ１、ＨＥ
Ｒ２およびＨＥＲ４を含む）との二量体化のために利用できない。いくつかの態様におい
て、抗体またはその断片は、配列番号：１の（ｉ）ＨＥＲ３アミノ酸残基２６５−２７７
および３１５（ドメイン２の）および（ｉｉ）ＨＥＲ３アミノ酸残基５７１、５８２−５
８４、５９６−５９７、６００−６０２、６０９−６１５（ドメイン４の）またはそれら
のサブセットを含む立体構造的エピトープを有するヒトＨＥＲ３タンパク質に結合する。
いくつかの態様において、抗体またはその断片は、配列番号：１のアミノ酸残基２６５−
２７７および３１５（ドメイン２の）および（ｉｉ）ＨＥＲ３アミノ酸残基５７１、５８
２−５８４、５９６−５９７、６００−６０２、６０９−６１５（ドメイン４の）内また
は重複のアミノ酸に結合する。いくつかの態様において、抗体またはその断片は、配列番
号：１のアミノ酸２６５−２７７および３１５（ドメイン２の）および（ｉｉ）ＨＥＲ３
アミノ酸残基５７１、５８２−５８４、５９６−５９７、６００−６０２、６０９−６１
５（ドメイン４の）またはそれらのサブセット内のアミノ酸（および／またはからなるア
ミノ酸配列）に結合する。いくつかの態様において、抗体またはその断片は、ドメイン２
およびドメイン４の移動度を限定し、不活性または閉立体構造を安定化するように、立体
構造的エピトープに結合する。活性な立体構造を形成できないことは、シグナル変換を活
性化しなくなる。いくつかの態様において、抗体またはその断片は、ドメイン２内の二量
体化ループを塞ぎ、それにより受容体−受容体相互作用のために利用できなくさせるよう
に、立体構造的エピトープに結合する。ホモまたはヘテロ二量体を形成できないことは、
シグナル変換を活性化しなくなる。
別の局面において、抗体またはその断片は、ＨＥＲ受容体、例えば、ＨＥＲ３受容体の
立体構造的エピトープに結合する。１つの態様において、抗体またはその断片は、不活性
化状態におけるＨＥＲ３受容体を安定化する。別の態様において、抗体またはその断片は
、ＨＥＲ３受容体の活性状態に結合し、不活性化状態として不活性化状態にする。したが
って、抗体またはその断片は、ＨＥＲ３の活性または不活性化状態のいずれかに結合する
ことができるが、不活性化状態の形成を支持し、ＨＥＲ３の活性状態を不活性化状態にし
、シグナル変換を活性化しなくなる。
別の局面において、抗体またはその断片は、ＨＥＲ３受容体が共受容体と二量体化して
、受容体−受容体複合体を形成することができないように、抗体またはその断片の結合が
不活性化状態においてＨＥＲ３受容体を安定化するＨＥＲ受容体、例えば、ＨＥＲ３受容
体の立体構造的エピトープに結合する。受容体−受容体複合体を形成できないことは、リ
ガンド依存性およびリガンド非依存性シグナル変換の両方の活性化を防止する。
別の局面において、抗体またはその断片は、ＨＥＲ３受容体への抗体またはその断片の
結合が共受容体との二量体化を可能にし、不活性な受容体−受容体複合体を形成するＨＥ
Ｒ受容体、例えば、ＨＥＲ３受容体の立体構造的エピトープに結合する。不活性な受容体
−受容体複合体の形成は、リガンド非依存性シグナル変換の活性化を防止する。例えば、
リガンド非依存性シグナル変換において、ＨＥＲ３は不活性化状態において存在し得るが
、しかしながら、ＨＥＲ２の過剰発現は、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３複合体形成を引き起こすが
、しかしながら、これらの得られた複合体は不活性であり、リガンド非依存性シグナル変
換の活性化を防止する。
描写された構造はまた、ＨＥＲ３と抗体またはその断片（例えば、ＭＯＲ０９８２３）
との相互作用接合面のための特定のコアＨＥＲ３アミノ酸残基を同定することを可能にす
る。これは、ＭＯＲ０９８２３タンパク質ＶＨ鎖の５Å内である残基として定義された。
コア残基は以下のとおりである：Ａｓｎ２６６、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｔｈｒ２
６９、Ｇｌｎ２７１、Ｇｌｕ２７３、Ｐｒｏ２７４、Ａｓｎ２７５、Ｐｒｏ２７６、Ｈｉ
ｓ２７７、Ａｓｎ３１５、Ａｓｐ５７１、Ｐｒｏ５８３、Ｈｉｓ５８４、Ａｌａ５９６、
Ｌｙｓ５９７。
構造はまた、抗体またはその断片（例えば、ＭＯＲ０９８２３）との相互作用接合面に
対する境界ＨＥＲ３アミノ酸残基を同定するために使用することができる。これらの残基
は、ＭＯＲ０９８２３タンパク質ＶＨ鎖から５−８ÅであったＨＥＲ３残基でありうる。
境界残基は以下のとおりである：Ｐｒｏ２６２、Ｖａｌ２６４、Ｔｙｒ２６５、Ｐｈｅ２
７０、Ｌｅｕ２７２、Ｔｈｒ２７８、Ｌｙｓ３１４、Ｇｌｙ３１６、Ｇｌｕ３２１、Ａｓ
ｎ５６６、Ｓｅｒ５６８、Ｇｌｙ５６９、Ｓｅｒ５７０、Ｔｈｒ５７２、Ａｒｇ５８０、
Ａｓｐ５８１、Ｇｌｙ５８２、Ｇｌｙ５９５、Ｇｌｙ５９８、Ｉｌｅ６００。
描写された構造はまた、特定のコアＨＥＲ３アミノ酸残基と抗体またはその断片（例え
ば、ＭＯＲ０９８２３）との相互作用接合面に対する特定のコアＨＥＲ３アミノ酸残基を
同定することを可能にする。これは、ＭＯＲ０９８２３タンパク質ＶＬ鎖の５Å内である
残基として定義された。コア残基は以下のとおりである：Ｔｙｒ２６５、Ｌｙｓ２６７、
Ｌｅｕ２６８、Ｐｈｅ２７０、Ｇｌｙ５８２、Ｐｒｏ５８３、Ｌｙｓ５９７、Ｉｌｅ６０
０、Ｌｙｓ６０２、Ｇｌｕ６０９、Ａｒｇ６１１、Ｐｒｏ６１２、Ｃｙｓ６１３、Ｈｉｓ
６１４、Ｇｌｕ６１５。
構造はまた、抗体またはその断片（例えば、ＭＯＲ０９８２３）との相互作用接合面に
対する境界ＨＥＲ３アミノ酸残基を同定するために使用することができる。これらの残基
は、ＭＯＲ０９８２３タンパク質ＶＬ鎖から５−８ÅであったＨＥＲ３残基であった。境
界残基は以下のとおりである：Ａｓｎ２６６、Ｔｈｒ２６９、Ａｓｐ５７１、Ａｒｇ５８
０、Ａｓｐ５８１、Ｈｉｓ５８４、Ｐｒｏ５９０、Ａｌａ５９６、Ｐｒｏ５９９、Ｔｙｒ
６０１、Ｔｙｒ６０３、Ａｓｐ６０５、Ｇｌｎ６０７、Ｃｙｓ６１０、Ａｓｎ６１６、Ｃ
ｙｓ６１７、Ｃｙｓ６２１、Ｇｌｙ６２３、Ｐｒｏ６２４。
表１１および１２（ＭＯＲ０９８２３）ならびに表１３および１４（ＭＯＲ０９８２５
）においてそれぞれ見ることができるとおり、重鎖は、主に、ドメイン４のアミノ酸残基
とのわずかな相互作用にてエピトープのドメイン２内のアミノ酸残基への抗原結合タンパ
ク質の結合に関与するが、軽鎖は、主に、ドメイン２内のアミノ酸残基とのわずかな相互
作用にてエピトープのドメイン４内のアミノ酸残基への結合に関与する。
そのため、当業者は、現在の教示を考慮すると、抗原結合タンパク質の残基および領域
は、ＨＥＲ３に結合する抗原結合タンパク質の能力との過度の干渉なしに変化することが
できると予測することができる。
コア相互作用接合面アミノ酸は、ＨＥＲ３パートナータンパク質から５Å以下である少
なくとも１つの原子を有する全てのアミノ酸残基であると決定した。５Åは、ファン・デ
ル・ワールス半径および可能な水媒介水素結合内の原子を考慮して、コア領域カットオフ
距離として決定した。境界相互作用接合面アミノ酸は、ＨＥＲ３パートナータンパク質か
ら８Å以下であるが、コア相互作用リストに含まれない少なくとも１つの原子を有する全
てのアミノ酸残基であると決定した。
いくつかの態様において、上記残基のいずれかに結合するか、上記残基のいずれかを覆
うか、または上記残基のいずれかとの相互作用からＭＯＲ０９８２３を防止するあらゆる
抗原結合タンパク質を、ＨＥＲ３に結合するか、またはＨＥＲ３を中和するために使用す
ることができる。いくつかの態様において、抗体またはその断片は、少なくとも１つの以
下のＨＥＲ３残基（配列番号：１）に結合するか、または少なくとも１つと相互作用する
：Ａｓｎ２６６、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｎ２７１、Ｇｌｕ２
７３、Ｐｒｏ２７４、Ａｓｎ２７５、Ｐｒｏ２７６、Ｈｉｓ２７７、Ａｓｎ３１５、Ａｓ
ｐ５７１、Ｐｒｏ５８３、Ｈｉｓ５８４、Ａｌａ５９６、Ｌｙｓ５９７。いくつかの態様
において、抗体またはその断片は、少なくとも１つの以下のＨＥＲ３残基（配列番号：１
）に結合するか、または少なくとも１つと相互作用する：Ｔｙｒ２６５、Ｌｙｓ２６７、
Ｌｅｕ２６８、Ｐｈｅ２７０、Ｇｌｙ５８２、Ｐｒｏ５８３、Ｌｙｓ５９７、Ｉｌｅ６０
０、Ｌｙｓ６０２、Ｇｌｕ６０９、Ａｒｇ６１１、Ｐｒｏ６１２、Ｃｙｓ６１３、Ｈｉｓ
６１４、Ｇｌｕ６１５。いくつかの態様において、抗体またはその断片は、少なくとも１
つの以下のＨＥＲ３残基（配列番号：１）に結合するか、または少なくとも１つと相互作
用する：Ａｓｎ２６６、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｎ２７１、Ｇ
ｌｕ２７３、Ｐｒｏ２７４、Ａｓｎ２７５、Ｐｒｏ２７６、Ｈｉｓ２７７、Ａｓｎ３１５
、Ａｓｐ５７１、Ｐｒｏ５８３、Ｈｉｓ５８４、Ａｌａ５９６、Ｌｙｓ５９７、Ｔｙｒ２
６５、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｐｈｅ２７０、Ｇｌｙ５８２、Ｐｒｏ５８３、Ｌｙ
ｓ５９７、Ｉｌｅ６００、Ｌｙｓ６０２、Ｇｌｕ６０９、Ａｒｇ６１１、Ｐｒｏ６１２、
Ｃｙｓ６１３、Ｈｉｓ６１４、Ｇｌｕ６１５。いくつかの態様において、抗体またはその
断片は、以下のＨＥＲ３残基（配列番号：１）の組合せに結合するか、または組合せと相
互作用する：Ａｓｎ２６６、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｎ２７１
、Ｇｌｕ２７３、Ｐｒｏ２７４、Ａｓｎ２７５、Ｐｒｏ２７６、Ｈｉｓ２７７、Ａｓｎ３
１５、Ａｓｐ５７１、Ｐｒｏ５８３、Ｈｉｓ５８４、Ａｌａ５９６、Ｌｙｓ５９７、Ｔｙ
ｒ２６５、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｐｈｅ２７０、Ｇｌｙ５８２、Ｐｒｏ５８３、
Ｌｙｓ５９７、Ｉｌｅ６００、Ｌｙｓ６０２、Ｇｌｕ６０９、Ａｒｇ６１１、Ｐｒｏ６１
２、Ｃｙｓ６１３、Ｈｉｓ６１４、Ｇｌｕ６１５。いくつかの態様において、抗体または
その断片は、以下のＨＥＲ３残基（配列番号：１）の全てに結合するか、または全てと相
互作用する：Ａｓｎ２６６、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｎ２７１
、Ｇｌｕ２７３、Ｐｒｏ２７４、Ａｓｎ２７５、Ｐｒｏ２７６、Ｈｉｓ２７７、Ａｓｎ３
１５、Ａｓｐ５７１、Ｐｒｏ５８３、Ｈｉｓ５８４、Ａｌａ５９６、Ｌｙｓ５９７、Ｔｙ
ｒ２６５、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｐｈｅ２７０、Ｇｌｙ５８２、Ｐｒｏ５８３、
Ｌｙｓ５９７、Ｉｌｅ６００、Ｌｙｓ６０２、Ｇｌｕ６０９、Ａｒｇ６１１、Ｐｒｏ６１
２、Ｃｙｓ６１３、Ｈｉｓ６１４、Ｇｌｕ６１５。いくつかの態様において、抗体または
その断片は、１つ以上の上記残基と５オングストローム内である。いくつかの態様におい
て、抗体またはその断片は、１つ以上の上記残基と５から８オングストロームである。い
くつかの態様において、抗体またはその断片は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、
１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０
個の上記残基と相互作用するか、残基をブロックするか、残基と８オングストローム内で
ある。
ＨＥＲ３およびＨＥＲ３：ＭＯＲ０９８２３の複合体に対する３Ｄ構造の有用性は、例
えば、より詳細に他のＨＥＲ３抗体を探索するためのフレームワークを提供する。ＨＥＲ
３の３Ｄ構造は、いくつかは細胞増殖を阻害し、いくつかは細胞増殖を刺激し、いくつか
は細胞増殖における影響を有さないため、モノクローナル抗体に対するエピトープをマッ
ピングする、およびそれらの作用様式を推測することを可能にする。ＭＯＲ０９８２３に
対する立体構造的エピトープは、ＨＥＲ３のドメイン２および４に位置している。この受
容体の３Ｄ構造の有用性は、これらの阻害剤の正確な作用機序の決定およびＨＥＲ３受容
体機能との干渉に対する新規アプローチの設計を容易にする。１つの態様において、本発
明の抗体は、ＭＯＲ０９８２３と同じ立体構造的エピトープに結合する。
いくつかの態様において、表１に記載されている抗体のいずれかにより結合される立体
構造的エピトープは、とりわけ有用である。１つの態様において、ＨＥＲ３立体構造的エ
ピトープは、ＨＥＲ３に結合する抗体またはその断片を単離するために利用することがで
きる。１つの態様において、ＨＥＲ３立体構造的エピトープは、ＨＥＲ３に結合する抗体
またはその断片を作製するために利用することができる。１つの態様において、ＨＥＲ３
立体構造的エピトープは、ＨＥＲ３立体構造的エピトープに結合する抗体またはその断片
を作製するために免疫原として利用することができる。１つの態様において、ＨＥＲ３立
体構造的エピトープを動物に投与することができ、次に、ＨＥＲ３に結合する抗体を動物
から得ることができる。
いくつかの態様において、抗体と接触するか、または抗体に埋まる残基を含むドメイン
／領域は、ＨＥＲ３（例えば、野生型抗原）における特定の残基を変異し、抗体またはそ
の断片が変異または変異体ＨＥＲ３タンパク質に結合することができるか否かを決定する
か、または野生型からの親和性の変化を測定することにより同定することができる。多く
の個々の変異を作ることにより、結合において直接的役割を果たすか、または変異が抗体
と抗原間の結合に影響することができるような抗体に十分に密接に近接している残基は、
同定することができる。これらのアミノ酸の情報から、抗体と接触しているか、または抗
体により覆われている残基を含む抗原（ＨＥＲ３）のドメインまたは領域を、解明するこ
とができる。既知の技術、例えば、アラニン−スキャンニングを使用する変異誘発は、機
能的に関連したエピトープを定義することを手助けすることができる。アルギニン／グル
タミン酸スキャニングプロトコールを利用する変異誘発もまた、使用することができる（
例えば、Naneviczら (1995), J. Biol. Chem. 270(37):21619-21625およびZupnickら (20
06), J. Biol. Chem. 281(29):20464-20473参照）。一般的に、アルギニンおよびグルタ
ミン酸は、荷電しており、巨大であり、したがって変異が導入される抗原の領域における
抗原結合タンパク質と抗原間の結合を破壊する可能性を有するため、野生型ポリペプチド
におけるアミノ酸に対して（一般的に個々に）置換されている。野生型抗原において存在
するアルギニンは、グルタミン酸と置換される。種々のこのような個々の変異体は回収さ
れ、回収された結合結果を分析して、残基が結合に影響することを決定することができる
。一連の変異体ＨＥＲ３抗原は、単一の変異を有するそれぞれの変異体抗原にて作製する
ことができる。種々のＨＥＲ３抗体またはその断片とそれぞれの変異体ＨＥＲ３抗原との
結合は測定することができ、選択された抗体またはその断片が野生型ＨＥＲ（配列番号：
１）３に結合する能力と比較することができる。
抗体またはその断片と本明細書において使用される変異または変異体ＨＥＲ３間の結合
における変化（例えば、減少または増加）は、結合アビディティーの変化（例えば、既知
の方法、例えば、実施例において以下に記載されるＢｉａｃｏｒｅ試験またはビーズに基
づくアッセイにより測定されるとき）、ＥＣ５０、および／または抗原結合タンパク質の
全結合能力における変化（例えば、減少）（例えば、抗原結合タンパク質濃度 対 抗原
濃度のプロットにおけるＢｍａｘの減少により証明されるとき）が存在することを意味す
る。結合における有意な変化は、変異された残基が抗体またはその断片への結合に関与す
ることを示す。
いくつかの態様において、結合における有意な減少は、結合アビディティー、ＥＣ５０
、および／または抗体またはその断片と変異体ＨＥＲ３抗原間の能力が、抗体またはその
断片と野生型ＨＥＲ３（例えば、配列番号：１）間の結合と比較して、１０％以上、２０
％以上、４０％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、
７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上減少していることを
意味する。
いくつかの態様において、抗体またはその断片の結合は、野生型ＨＥＲ３タンパク質（
例えば、配列番号：１）と比較して、１個またはそれ以上（例えば、１、２、３、４、５
、６、７、８、９、１０またはそれ以上）の変異を有する変異体ＨＥＲ３タンパク質に対
して、有意に減少または増加している。
変異体型は配列番号：１において示される野生型配列に対して言及されるが、ＨＥＲ３
の対立遺伝子またはスプライス変異体において、アミノ酸が異なり得ることが理解される
。ＨＥＲ３のこのような対立遺伝子型に対する有意に改変された結合（例えば、より低い
またはより高い結合）を示す抗体またはその断片もまた考えられる。
抗体の一般的な構造局面に加えて、パラトープとエピトープ間のさらに特異的な相互作
用は、構造的アプローチを介して実施され得る。１つの態様において、ＣＤＲの構造は、
抗体がエピトープに結合することができ、パラトープに寄与する。このようなパラトープ
の形は、多くの方法において決定され得る。従来の構造試験アプローチ、例えば、ＮＭＲ
またはＸ線結晶学を使用することができる。これらのアプローチは、パラトープ単独の形
、またはエピトープに結合しているものを試験することができる。あるいは、分子モデル
は、コンピューター内で作成することができる。構造は、市販のパッケージ、例えば、Ａ
ｃｃｅｌｒｙｓからのＩｎｓｉｇｈｔＩＩモデリングパッケージ(San Diego, Calif.)で
手助けされる、相同性モデリングを介して作成することができる。簡潔には、それは、調
査される抗体の配列を使用して、既知の構造のタンパク質のデータベース、例えば、Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに対して検索することができる。それは既知の構造を有
する同種タンパク質を同定した後、これらの同種タンパク質をモデリング鋳型として使用
する。それぞれの可能性のある鋳型をアラインし、したがって、鋳型中の構造ベースの配
列アラインメントを生産することができる。次に、未知の構造を有する抗体の配列をこれ
らの鋳型とアラインし、未知の構造を有する抗体に対する分子モデルを作成することがで
きる。当業者により理解されるとおり、コンピューター内でこのような構造を作成するた
めの多数の代替方法が存在し、これらのうちのいずれかが使用され得る。例えば、ＱＵＡ
ＮＴＡ（Polygen Corp., Waltham, Mass.）を使用するＨａｒｄｍａｎらの米国特許第５
，９５８，７０８号およびＣＨＡＲＭ（Brooksら (1983), J. Comp. Chem. 4:187）に記
載されているものと同様のプロセスが、使用され得る（出典明示によりその内容について
本明細書に包含させる）。
可能なパラトープがエピトープに結合するか否か、どのように結合するかを決定するに
おいて重要なパラトープの形だけでなく、エピトープとパラトープ間の相互作用自体は、
変異体抗体の設計における良い情報の供給源でもある。当業者により理解されるとおり、
この相互作用を試験することができる種々の方法が存在する。１つの方法は、上記されて
いるであろう作成された構造モデルを使用して、次に、とりわけ、パラトープとそのエピ
トープ間の立体構造および方向空間についてＭｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ検索を実施すること
ができるドッキングモジュールを有するプログラム、例えば、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ(Accel
rys, San Diego, Calif.)を使用することである。結果は、エピトープがパラトープと相
互作用する場所を予測することができ、または該相互作用するか否かを予測することがで
きるということである。１つの態様において、エピトープの断片または変異体のみを、関
連の相互作用を決定することを助けるために使用される。１つの態様において、全体のエ
ピトープは、パラトープとエピトープ間の相互作用のモデリングにおいて使用される。
これらのモデル構造の使用を介して、それは、どの残基がエピトープとパラトープ間の
相互作用において最も重要であるかを予測することができる。したがって、１つの態様に
おいて、それは、抗体の結合特性を改変するために変化させる残基を容易に選択すること
ができる。例えば、パラトープにおける特定の残基の側鎖がエピトープの結合を立体的に
妨げ、したがって、これらの残基をより小さい側鎖を有する残基に改変することが有益で
あり得ることが、ドッキングモデルから明らかであり得る。これは、多数の方法において
決定することができる。例えば、それは、２つのモデルを単に試験し、官能基および近接
に基づく相互作用を評価し得る。あるいは、それは、より有益なエネルギー相互作用を得
るために、上記エピトープおよびパラトープの繰り返しペアリング(pairing)を行い得る
。それはまた、抗体の種々の変異体に対するこれらの相互作用を決定し、抗体がエピトー
プに結合し得る代替方法を決定することができる。それはまた、所望の特定の特性を有す
る抗体を得るために、抗体の構造を改変するべきであるかどうかを決定するように種々の
モデルと組み合わせることができる。
上記決定されたモデルは、種々の技術を介して試験することができる。例えば、さらに
試験して変異体のエネルギーを決定するために、相互作用エネルギーは、上記プログラム
で決定することができる。また、クーロンおよびファン・デル・ワールス相互作用を使用
して、エピトープおよび変異体パラトープの相互作用エネルギーを決定する。部位特異的
変異誘発はまた、抗体構造における予測される変化が、実際に結合特性において所望の変
化をもたらすかどうかを確かめるために使用される。あるいは、変化は、モデルが正しい
ことを証明するか、またはパラトープとエピトープ間に起こり得る一般的な結合テーマ(t
heme)を決定するために、エピトープに作られ得る。
当業者により理解されるとおり、これらのモデルは、本願の態様の抗体およびその変異
体を作製するために必要な情報を提供するが、おそらくインビトロ試験を介するコンピュ
ーター内のモデルの日常的な試験を行うことが望ましい。加えて、当業者に理解されると
おり、何らかの修飾はまた、抗体の活性に対してさらなる副作用を有し得る。例えば、よ
り良い結合をもたらすことが予測される変化がより良い結合を誘導し得るが、それはまた
、抗体の活性を減少または改変させ得る他の構造変化を引き起こし得る。これが事実であ
るか否かの決定は当分野で日常的であり、多数の方法においてなし遂げることができる。
例えば、活性は、ＥＬＩＳＡ試験を介して試験することができる。あるいは、サンプルは
、表面プラズモン共鳴装置の使用を介して試験することができる。
ＨＥＲ３抗体
本発明は、ＨＥＲ３の立体構造的エピトープを認識する抗体を提供する。本発明は、Ｈ
ＥＲ３に対する抗体のクラスが、リガンド依存性およびリガンド非依存性ＨＥＲ３シグナ
ル変換経路の両方をブロックするという驚くべき知見に基づく。ＨＥＲ３の特定の立体構
造エピトープに結合する抗体のクラスは、表１に記載されている。１つの態様において、
該抗体は、リガンド依存性およびリガンド非依存性ＨＥＲ３シグナル伝達の両方を阻害す
る。別の態様において、該抗体はＨＥＲ３に結合し、リガンド結合部位へのＨＥＲリガン
ド結合をブロックしない（すなわち、リガンドおよび抗体の両方が、ＨＥＲ３に同時に結
合することができる）。
本発明は、ＨＥＲ３タンパク質（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルのＨＥＲ３
）に特異的に結合する抗体であって、配列番号：１５、３３、５１、６９、８７、１０５
、１２３、１４１、１５９、１７７、１９５、２１３、２３１、２４９、２６７、２８５
、３０３、３２１、３３９、３５７および３７５のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを
含む抗体を提供する。本発明は、ＨＥＲ３タンパク質（例えば、ヒトおよび／またはカニ
クイザルのＨＥＲ３）に特異的に結合する抗体であって、配列番号：１４、３２、５０、
６８、８６、１０４、１２２、１４０、１５８、１７６、１９４、２１２、２３０、２４
８、２６６、２８４、３０２、３２０、３３８、３５６および３７４のアミノ酸配列を有
するＶＬドメインを含む抗体を提供する。本発明はまた、ＨＥＲ３タンパク質（例えば、
ヒトおよび／またはカニクイザルのＨＥＲ３）に特異的に結合する抗体であって、以下の
表１に示すＶＨ ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む抗体を提
供する。特に、本発明は、ＨＥＲ３タンパク質（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザ
ルのＨＥＲ３）に特異的に結合する抗体であって、以下の表１に示すＶＨ ＣＤＲのいず
れかのアミノ酸配列を有する１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のＶＨ ＣＤ
Ｒを含む（あるいは該ＶＨ ＣＤＲからなる）抗体を提供する。
本発明の他の抗体は、突然変異しているが、ＣＤＲ領域において、表１に記載される配
列中に示されるＣＤＲ領域と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５または９８同一性
パーセントを有するアミノ酸を含む。いくつかの態様において、それは、表１に記載され
る配列中に示されるＣＤＲ領域と比較した場合にＣＤＲ領域においてわずか１、２、３、
４または５個のアミノ酸が突然変異しているが、元の抗体のエピトープに対するその特異
性を依然として維持している突然変異体アミノ酸配列を含む。
本発明の他の抗体は、突然変異しているが、フレームワーク領域において、表１に記載
される配列中に示されるフレームワーク領域と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５
または９８の同一性パーセントを有するアミノ酸を含む。いくつかの態様において、それ
は、表１に記載される配列中に示されるフレームワーク領域と比較した場合に、フレーム
ワーク領域においてわずか１、２、３、４、５、６または７個のアミノ酸が突然変異して
いるが、元の抗体のエピトープに対するその特異性を依然として維持している突然変異体
アミノ酸配列を含む。本発明はまた、ＨＥＲ３タンパク質（例えば、ヒトおよび／または
カニクイザルのＨＥＲ３）に特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、全長重鎖および全長軽
鎖をコードする核酸配列を提供する。
本発明のＨＥＲ３抗体は、ＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン４由来のアミノ酸残基
を含むＨＥＲ３の立体構造的エピトープに結合する。
表１：本発明のＨＥＲ３抗体の例
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本発明の他の抗体は、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸が変異されているが、
表１に記載の配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８および
９９％の同一性を有するものを含む。いくつかの実施形態では、表１に記載の配列に示さ
れている可変領域と比較した場合、可変領域において１、２、３、４または５以下のアミ
ノ酸が変異されているが、実質的に同一の治療活性を保持している変異アミノ酸配列を含
む。
これらの抗体またはそれらの断片の各々はＨＥＲ３に結合できるので、ＶＨ、ＶＬ、全
長軽鎖および全長重鎖配列（アミノ酸配列およびアミノ酸配列をコードする配列）を「組
み合わせて適合させ」て、本発明の他のＨＥＲ３結合抗体を作成できる。かかる「組み合
わせて適合させ」たＨＥＲ３結合抗体は、当該技術分野で知られている結合アッセイ（例
えばＥＬＩＳＡ、および実施例の節に記載の他のアッセイ）を用いて試験してもよい。こ
れらの鎖が組み合わせて適合されている場合、特定のＶＨ／ＶＬ対の対由来のＶＨ配列は
、構造的に類似したＶＨ配列で置換されるべきである。同様に、特定の全長重鎖／全長軽
鎖の対由来の全長重鎖配列は、構造的に類似した全長重鎖配列で置換されるべきである。
同様に、特定のＶＨ／ＶＬの対由来のＶＬ配列は、構造的に類似したＶＬで置換されるべ
きである。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖の対由来の全長軽鎖配列は、構造的に類似
した全長軽鎖配列で置換されるべきである。したがって、一態様では、本発明は：配列番
号１５、３３、５１、６９、８７、１０５、１２３、１４１、１５９、１７７、１９５、
２１３、２３１、２４９、２６７、２８５、３０３、３２１、３３９、３５７および３７
５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号１４、
３２、５０、６８、８６、１０４、１２２、１４０、１５８、１７６、１９４、２１２、
２３０、２４８、２６６、２８４、３０２、３２０、３３８、３５６および３７４からな
る群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有し；ＨＥＲ３（例えば、ヒトお
よび／またはカニクイザル）に特異的に結合するものである、単離されたモノクローナル
抗体またはそれらの断片を提供する。
別の態様では、本発明は、表１に記載の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ
Ｒ３、またはそれらの組合せを含む、ＨＥＲ３結合抗体を提供する。該抗体のＶＨ ＣＤ
Ｒ１のアミノ酸配列は、配列番号：２、８、２０、２６、３８、４４、５６、６２、７４
、８０、９２、９８、１１０、１１６、１２８、１３４、１４６、１５２、１６４、１７
０、１８２、１８８、２００、２０６、２１８、２２４、２３６、２４２、２５４、２６
０、２７２、２７８、２９０、２９６、３０８、３１４、３２６、３３２、３４４、３５
０、３６２および３６８に示される。該抗体のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番
号：３、９、２１、２７、３９、４５、５７、６３、７５、８１、９３、９９、１１１、
１１７、１２９、１３５、１４７、１５３、１６５、１７１、１８３、１８９、２０１、
２０７、２１９、２２５、２３７、２４３、２５５、２６１、２７３、２７９、２９１、
２９７、３０９、３１５、３２７、３３３、３４５、３５１、３６３および３６９に示さ
れる。該抗体のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号：４、１０、２２、２８、４
０、４６、５８、６４、７６、８２、９４、１００、１１２、１１８、１３０、１３６、
１４８、１５４、１６６、１７２、１８４、１９０、２０２、２０８、２２０、２２６、
２３８、２４４、２５６、２６２、２７４、２８０、２９２、２９８、３１０、３１６、
３２８、３３４、３４６、３５２、３６４および３７０に示される。該抗体のＶＬ ＣＤ
Ｒ１のアミノ酸配列は、配列番号：５、１１、２３、２９、４１、４７、５９、６５、７
７、８３、９５、１０１、１１３、１１９、１３１、１３７、１４９、１５５、１６７、
１７３、１８５、１９１、２０３、２０９、２２１、２２７、２３９、２４５、２５７、
２６３、２７５、２８１、２９３、２９９、３１１、３１７、３２９、３３５、３４７、
３５３、３６５および３７１に示される。該抗体のＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配
列番号：６、１２、２４、３０、４２、４８、６０、６６、７８、８４、９６、１０２、
１１４、１２０、１３２、１３８、１５０、１５６、１６８、１７４、１８６、１９２、
２０４、２１０、２２２、２２８、２４０、２４６、２５８、２６４、２７６、２８２、
２９４、３００、３１２、３１８、３３０、３３６、３４８、３５４、３６６および３７
２に示される。該抗体のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号：７、１３、２５、
３１、４３、４９、６１、６７、７９、８５、９７、１０３、１１５、１２１、１３３、
１３９、１５１、１５７、１６９、１７５、１８７、１９３、２０５、２１１、２２３、
２２９、２４１、２４７、２５９、２６５、２７７、２８３、２９５、３０１、３１３、
３１９、３３１、３３７、３４９、３５５、３６７および３７３に示される。ＣＤＲ領域
は、Ｋａｂａｔ系を用いて描写される（Kabatら (1991)Sequences of Proteins of Immun
ological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services,
NIH Publication No. 91-3242;Chothiaら (1987)J. Mol. Biol. 196:901-917;Chothiaら
(1989)Nature 342:877-883;およびAl-Lazikaniら (1997)J. Mol. Biol. 273, 927-948）
。
特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：２の重鎖可変領域ＣＤＲ
１；配列番号：３のＣＤＲ２；配列番号：４のＣＤＲ３；配列番号：５の軽鎖可変領域Ｃ
ＤＲ１；配列番号：６のＣＤＲ２；および配列番号：７のＣＤＲ３を含む。
特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：２０の重鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号：２１のＣＤＲ２；配列番号：２２のＣＤＲ３；配列番号：２３の軽鎖可
変領域ＣＤＲ１；配列番号：２４のＣＤＲ２；および配列番号：２５のＣＤＲ３を含む。
特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：３８の重鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号：３９のＣＤＲ２；配列番号：４０のＣＤＲ３；配列番号：４１の軽鎖可
変領域ＣＤＲ１；配列番号：４２のＣＤＲ２；および配列番号：４３のＣＤＲ３を含む。
特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：５６の重鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号：５７のＣＤＲ２；配列番号：５８のＣＤＲ３；配列番号：５９の軽鎖可
変領域ＣＤＲ１；配列番号：６０のＣＤＲ２；および配列番号：６１のＣＤＲ３を含む。
特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：７４の重鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号：７５のＣＤＲ２；配列番号：７６のＣＤＲ３；配列番号：７７の軽鎖可
変領域ＣＤＲ１；配列番号：７８のＣＤＲ２；および配列番号：７９のＣＤＲ３を含む。
特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：９２の重鎖可変領域ＣＤ
Ｒ１；配列番号：９３のＣＤＲ２；配列番号：９４のＣＤＲ３；配列番号：９５の軽鎖可
変領域ＣＤＲ１；配列番号：９６のＣＤＲ２；および配列番号：９７のＣＤＲ３を含む。
特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：１１０の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ１；配列番号：１１１のＣＤＲ２；配列番号：１１２のＣＤＲ３；配列番号：１１３
の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１１４のＣＤＲ２；および配列番号：１１５のＣＤ
Ｒ３を含む。
特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：１２８の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ１；配列番号：１２９のＣＤＲ２；配列番号：１３０のＣＤＲ３；配列番号：１３１
の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１３２のＣＤＲ２；および配列番号：１３３のＣＤ
Ｒ３を含む。
特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：１４６の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ１；配列番号：１４７のＣＤＲ２；配列番号：１４８のＣＤＲ３；配列番号：１４９
の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１５０のＣＤＲ２；および配列番号：１５１のＣＤ
Ｒ３を含む。
特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：１６４の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ１；配列番号：１６５のＣＤＲ２；配列番号：１６６のＣＤＲ３；配列番号：１６７
の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１６８のＣＤＲ２；および配列番号：１６９のＣＤ
Ｒ３を含む。
特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：１８２の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ１；配列番号：１８３のＣＤＲ２；配列番号：１８４のＣＤＲ３；配列番号：１８５
の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１８６のＣＤＲ２；および配列番号：１８７のＣＤ
Ｒ３を含む。
特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：２００の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ１；配列番号：２０１のＣＤＲ２；配列番号：２０２のＣＤＲ３；配列番号：２０３
の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２０４のＣＤＲ２；および配列番号：２０５のＣＤ
Ｒ３を含む。
特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：２１８の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ１；配列番号：２１９のＣＤＲ２；配列番号：２２０のＣＤＲ３；配列番号：２２１
の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２２２のＣＤＲ２；および配列番号：２２３のＣＤ
Ｒ３を含む。
特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：２３６の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ１；配列番号：２３７のＣＤＲ２；配列番号：２３８のＣＤＲ３；配列番号：２３９
の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２４０のＣＤＲ２；および配列番号：２４１のＣＤ
Ｒ３を含む。
特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：２５４の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ１；配列番号：２５５のＣＤＲ２；配列番号：２５６のＣＤＲ３；配列番号：２５７
の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２５８のＣＤＲ２；および配列番号：２５９のＣＤ
Ｒ３を含む。
特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：２７２の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ１；配列番号：２７３のＣＤＲ２；配列番号：２７４のＣＤＲ３；配列番号：２７５
の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２７６のＣＤＲ２；および配列番号：２７７のＣＤ
Ｒ３を含む。
特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：２９０の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ１；配列番号：２９１のＣＤＲ２；配列番号：２９２のＣＤＲ３；配列番号：２９３
の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２９４のＣＤＲ２；および配列番号：２９５のＣＤ
Ｒ３を含む。
特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：３０８の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ１；配列番号：３０９のＣＤＲ２；配列番号：３１０のＣＤＲ３；配列番号：３１１
の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：３１２のＣＤＲ２；および配列番号：３１３のＣＤ
Ｒ３を含む。
特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：３２６の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ１；配列番号：３２７のＣＤＲ２；配列番号：３２８のＣＤＲ３；配列番号：３２９
の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：３３０のＣＤＲ２；および配列番号：３３１のＣＤ
Ｒ３を含む。
特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：３４４の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ１；配列番号：３４５のＣＤＲ２；配列番号：３４６のＣＤＲ３；配列番号：３４７
の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：３４８のＣＤＲ２；および配列番号：３４９のＣＤ
Ｒ３を含む。
特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：３６２の重鎖可変領域Ｃ
ＤＲ１；配列番号：３６３のＣＤＲ２；配列番号：３６４のＣＤＲ３；配列番号：３６５
の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：３６６のＣＤＲ２；および配列番号：３６７のＣＤ
Ｒ３を含む。
特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：１５のＶＨおよび配列番
号：１４のＶＬを含む。特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：３
３のＶＨおよび配列番号：３２のＶＬを含む。特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する
抗体は、配列番号：５１のＶＨおよび配列番号：５０のＶＬを含む。特定の態様において
、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：６９のＶＨおよび配列番号：６８のＶＬを含む
。特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：８７のＶＨおよび配列番
号：８６のＶＬを含む。特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：１
０５のＶＨおよび配列番号：１０４のＶＬを含む。特定の態様において、ＨＥＲ３に結合
する抗体は、配列番号：１２３のＶＨおよび配列番号：１２２のＶＬを含む。特定の態様
において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：１４１のＶＨおよび配列番号：１４０
のＶＬを含む。特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：１５９のＶ
Ｈおよび配列番号：１５８のＶＬを含む。特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体
は、配列番号：１７７のＶＨおよび配列番号：１７６のＶＬを含む。特定の態様において
、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：１９５のＶＨおよび配列番号：１９４のＶＬを
含む。特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：２１３のＶＨおよび
配列番号：２１２のＶＬを含む。特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列
番号：２３１のＶＨおよび配列番号：２３０のＶＬを含む。特定の態様において、ＨＥＲ
３に結合する抗体は、配列番号：２４９のＶＨおよび配列番号：２４８のＶＬを含む。特
定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：２６７のＶＨおよび配列番号
：２６６のＶＬを含む。特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：２
８５のＶＨおよび配列番号：２８４のＶＬを含む。特定の態様において、ＨＥＲ３に結合
する抗体は、配列番号：３０３のＶＨおよび配列番号：３０２のＶＬを含む。特定の態様
において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：３２１のＶＨおよび配列番号：３２０
のＶＬを含む。特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：３３９のＶ
Ｈおよび配列番号：３３８のＶＬを含む。特定の態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体
は、配列番号：３５７のＶＨおよび配列番号：３５６のＶＬを含む。特定の態様において
、ＨＥＲ３に結合する抗体は、配列番号：３７５のＶＨおよび配列番号：３７４のＶＬを
含む。１つの態様において、ＨＥＲ３抗体はアンタゴニスト抗体である。１つの態様にお
いて、ＨＥＲ３に結合する抗体は、表１に記載されている抗体である。
本明細書で用いる場合、抗体の可変領域または全長鎖がヒト生殖系列免疫グロブリン遺
伝子を用いる系から獲得される場合、該ヒト抗体は、特定の生殖系列配列「の産物」であ
るかまたはそれ「に由来する」、重鎖もしくは軽鎖可変領域または全長重鎖もしくは軽鎖
を含む。かかる系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスを
対象とする抗原で免疫するか、あるいは対象とする抗原でファージ上に提示されたヒト免
疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。ヒト生殖系列免疫グ
ロブリン配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミ
ノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較して、ヒト抗体配列と配列
において最も近い（すなわち、最大の同一性％）ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択
することにより、それ自体同定できる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物
」であるかまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば、天然に存在する体細胞変異あ
るいは部位特異的突然変異の意図的導入のために、生殖系列配列と比較した場合、アミノ
酸の相違を含有してもよい。しかしながら、ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域において
、選択されたヒト抗体は典型的には、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードさ
れるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、かつ、他の種
の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖系列配列）と比較した場合
、ヒトであるとヒト抗体を同定するアミノ酸残基を含有する。場合によっては、ヒト抗体
は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列に
おいて少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは少なくとも９５％、または
さらに少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一でありうる。典型的には、
組換えヒト抗体は、ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域においてヒト生殖系列免疫グロブ
リン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、１０以下のアミノ酸の相違を示すだろう
。場合によっては、ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされる
アミノ酸配列と、５以下、または４、３、２あるいは１以下のアミノ酸の相違を示しうる
。典型的な数のＨＥＲ３抗体に対するＶＨおよびＶＬ生殖細胞系列配列を使用する種々の
生殖細胞系列バージョンを、Ｋａｂａｔを使用して、表２に示す。ＣＤＲ位置は、ボール
ド体において強調されている。生殖細胞系列配列で表において使用される表記は、以下の
とおりである：ＭＯＲ１０７０１−ＶＨ＿３−０７は、ＶＨ生殖細胞系列配列３−０７（
命名法はＶｂａｓｅにしたがう）のフレームワーク領域におけるＭＯＲ１０７０１ＣＤＲ
ループを意味し、ＭＯＲ１０７０３−ＶＫ＿Ｌ１は、ＶＫがカッパ軽鎖であるＶＫ＿Ｌ１
由来の生殖細胞系列フレームワーク領域におけるＭＯＲ１０７０３からのＣＤＲを意味す
る。
表２：典型的な抗体の選択された数の異なる生殖細胞系列バージョン
Figure 0006771002
Figure 0006771002
Figure 0006771002
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Figure 0006771002
Figure 0006771002
表３：ＪＨセグメント
Figure 0006771002
表４：ＪＫセグメント
Figure 0006771002
ＪＨセグメントとＶＨ−生殖細胞系列配列の組合せを使用することができる。組合せの
典型的な例は、表５に示される。
表５：ＪＨセグメントとＶＨ−生殖細胞系列配列の組合せの典型的な例
Figure 0006771002
ＪＫセグメントとＶＬ−生殖細胞系列配列の組合せを使用することができる。組合せの
典型的な例は、表６に示される。
表６：ＪＫセグメントとＶＬ−生殖細胞系列配列の組合せの典型的な例
Figure 0006771002
ＶＨをＪＨと、ＶＫをＪＫと組み合わせたとき、ＶＨまたはＪＨとＶＫまたはＪＫとの
任意の組合せを使用することができる。１つの態様において、ＶＨ生殖細胞系列領域のい
ずれかを、それぞれの抗体に対するＶＫ（ＶＬ）生殖細胞系列領域のいずれかと組み合わ
せることができる。組合せの典型的な数の例を表７に示す。
表７：生殖細胞系列配列の組合せの典型的な例
Figure 0006771002
Figure 0006771002
１つの態様において、本発明は、Ｘａａ１−ＨＣＤＲ１−Ｘａａ２−ＨＣＤＲ２−Ｘａ
ａ３−ＨＣＤＲ３−Ｘａａ４の配列（重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は、表１
および２から選択される任意の重鎖ＣＤＲである）の配列を含む重鎖可変領域に関する。
説明の目的のみのために、該配列は：
Ｘａａ１−ＳＹＡＭＳ−Ｘａａ２−ＡＩＮＳＱＧＫＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ−Ｘａａ３−Ｗ
ＧＤＥＧＦＤＩ−Ｘａａ４（配列番号：４９３）、
Ｘａａ１は、任意の３０個のアミノ酸のフレームワーク領域である；
Ｘａａ２は、任意の１４個のアミノ酸のフレームワーク領域である；
Ｘａａ３は、任意の３２個のアミノ酸のフレームワーク領域である；
Ｘａａ４は、任意の１１個のアミノ酸のフレームワーク領域である；
であり得る。
１つの態様において、本発明は、Ｘａａ１−ＬＣＤＲ１−Ｘａａ２−ＬＣＤＲ２−Ｘａ
ａ３−ＬＣＤＲ３−Ｘａａ４の配列（軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は、表１
および２から選択される任意の軽鎖ＣＤＲである）の配列を含む軽鎖可変領域に関する。
説明の目的のみのために、該配列は：
Ｘａａ１−ＲＡＳＱＧＩＳＮＷＬＡ−Ｘａａ２−ＧＡＳＳＬＱＳ−Ｘａａ３−ＱＱＹＳＳ
ＦＰＴＴ−Ｘａａ４（配列番号：４９４）、
Ｘａａ１は、任意の２３個のアミノ酸のフレームワーク領域である；
Ｘａａ２は、任意の１５個のアミノ酸のフレームワーク領域である；
Ｘａａ３は、任意の３２個のアミノ酸のフレームワーク領域である；および
Ｘａａ４は、任意の１０個のアミノ酸のフレームワーク領域である
であり得る。
本明細書に開示される抗体は、一本鎖抗体、二重特異性抗体(diabody)、ドメイン抗体
、ナノ抗体(nanobody)およびユニボディ(unibody)の誘導体でありうる。「一本鎖抗体」
（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインが対合して一価分子を形成する、ＶＨ
ドメインに連結したＶＬドメインを含む、単一のポリペプチド鎖からなる。一本鎖抗体は
、当該技術分野で知られている方法により調製できる（例えば、Birdら (1988)Science 2
42:423-426およびHustonら (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）。
「ｄｉｓｂｕｄ」は２つの鎖からなり、各鎖は、短いペプチドリンカーにより結合され、
同一ポリペプチド鎖上で軽鎖可変領域に結合された重鎖可変領域を含み、同一鎖上の２つ
の領域はお互いに対合しないが、他方の鎖の相補ドメインと二重特異性分子を形成するも
のである。二重特異性抗体の調製方法は、当該技術分野で知られている（例えば、Hollig
erら (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448およびPoljakら (1994)Strucure
2:1121-1123を参照）。ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）は、抗体の重鎖あるいは軽鎖のいずれ
かの可変領域に相当する、抗体の小さい機能的結合単位である。ドメイン抗体は、細菌、
酵母およびほ乳類細胞系で良好に発現する。ドメイン抗体およびそれらの産生方法のさら
なる詳細は、当該技術分野で知られている（例えば、米国特許第６，２９１，１５８号；
同第６，５８２，９１５号；同第６，５９３，０８１号；同第６，１７２，１９７号；同
第６，６９６，２４５号；欧州特許第０３６８６８４号および同第０６１６６４０号；国
際公開第０５／０３５５７２号，同第０４／１０１７９０号，同第０４／０８１０２６号
，同第０４／０５８８２１号，同第０４／００３０１９号および同第０３／００２６０９
号を参照）。ナノ抗体は抗体の重鎖に由来する。ナノ抗体は典型的に、単一の可変ドメイ
ンおよび２つの定常ドメイン（Ｃ２およびＣ３）を含み、元の抗体の抗原結合能を保持す
る。ナノ抗体は当該技術分野で知られている方法により調製できる（例えば、米国特許第
６，７６５，０８７号，同第６，８３８，２５４号，国際公開第０６／０７９３７２号を
参照）。ユニボディはＩｇＧ４の１つの軽鎖および１つの重鎖からなる。ユニボディはＩ
ｇＧ４抗体のヒンジ領域の除去により作製できる。ユニボディおよびそれらの調製方法の
さらなる詳細は、国際公開第２００７／０５９７８２号に見出される。
相同抗体(homologous antibody)
さらに別の実施形態では、本発明は、表１に記載の配列と相同なアミノ酸配列であって
、ＨＥＲ３タンパク質（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３）に結合し、
表１に記載の抗体の所望の機能的特性を保持している抗体またはそれらの断片を提供する
。
例えば、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル
抗体（またはその機能的断片）であって、該重鎖可変領域は配列番号１５、３３、５１、
６９、８７、１０５、１２３、１４１、１５９、１７７、１９５、２１３、２３１、２４
９、２６７、２８５、３０３、３２１、３３９、３５７および３７５からなる群から選択
されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同
一であるアミノ酸配列を含み；該軽鎖可変領域は配列番号１４、３２、５０、６８、８６
、１０４、１２２、１４０、１５８、１７６、１９４、２１２、２３０、２４８、２６６
、２８４、３０２、３２０、３３８、３５６および３７４からなる群から選択されるアミ
ノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であるア
ミノ酸配列を含み；ＨＥＲ３（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３）に結
合し、リン酸化アッセイまたはＨＥＲシグナル伝達（例えば、実施例に記載されているホ
スホ−ＨＥＲ３アッセイ、ホスホ−Ａｋｔアッセイ、細胞増殖およびリガンド阻害アッセ
イ）の他の測定において測定できる、β−プロペラ１依存性Ｗｎｔタンパク質のシグナル
伝達活性を阻害する抗体を提供する。また、可変重鎖および軽鎖親ヌクレオチド配列；な
らびにほ乳類細胞での発現のために最適化された全長重鎖および軽鎖配列も本発明の範囲
内である。本発明の他の抗体は、変異されたアミノ酸または核酸を含むが、上述の配列と
少なくとも６０、７０、８０、９０、９５または９８％同一性を有する。いくつかの実施
形態では、上述の配列に示される可変領域と比べると１、２、３、４または５以下のアミ
ノ酸が可変領域においてアミノ酸欠失、挿入または置換により変異している、変異アミノ
酸配列を含む。
他の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、表１に記載の配列と５０
％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同
一でありうる。他の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、１、２、３
、４または５以下のアミノ酸位置でのアミノ酸置換を除き同一でありうる。表１に記載の
抗体のＶＨおよびＶＬ領域と高い（すなわち、８０％以上の）同一性を有するＶＨおよび
ＶＬ領域を有する抗体は、突然変異誘発（例えば部位特異的またはＰＣＲ介在突然変異誘
発）により得ることができ、次いで本明細書に記載の機能的アッセイを用いて保持される
機能について、コードされる変化された抗体を試験できる。
他の実施形態では、重鎖および／または軽鎖ヌクレオチド配列の可変領域は、上記の配
列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同
一でありうる。
本明細書で用いる場合、２つの配列間の「同一性パーセント」は、２つの配列の最適な
アラインメントのために導入することが必要なギャップ数、および各ギャップの長さを考
慮に入れて、当該配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性
％は同一位置の数／位置の総数×１００に等しい）。２つの配列間の配列の比較および同
一性パーセントの決定は、下記非限定的な例に記載の通り、数学的なアルゴリズムを用い
て実施できる。
さらにまたはあるいは、本発明のタンパク質配列はさらに「クエリー配列」として用い
て、公開データベースに対する検索を実行し、例えば関連配列を同定できる。例えば、か
かる検索は、Altschulら (1990)J.Mol. Biol. 215:403-10のＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅ
ｒｓｉｏｎ ２．０）を用いて実行することができる。
保存的修飾を有する抗体
特定の実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む
重鎖可変領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を有し
、これらのＣＤＲ配列の一以上は、本明細書に記載の抗体に基づいて特定されるアミノ酸
配列またはその保存的修飾を有し、そして本発明のＨＥＲ３結合抗体の所望の機能的特性
を保持するものである。
したがって、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域な
らびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域からなる、単離された
ＨＥＲ３モノクローナル抗体またはその断片であって：該重鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸
配列が、配列番号：２、８、２０、２６、３８、４４、５６、６２、７４、８０、９２、
９８、１１０、１１６、１２８、１３４、１４６、１５２、１６４、１７０、１８２、１
８８、２００、２０６、２１８、２２４、２３６、２４２、２５４、２６０、２７２、２
７８、２９０、２９６、３０８、３１４、３２６、３３２、３４４、３５０、３６２およ
び３６８ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され；該重鎖可変領域ＣＤＲ２
アミノ酸配列が、配列番号：３、９、２１、２７、３９、４５、５７、６３、７５、８１
、９３、９９、１１１、１１７、１２９、１３５、１４７、１５３、１６５、１７１、１
８３、１８９、２０１、２０７、２１９、２２５、２３７、２４３、２５５、２６１、２
７３、２７９、２９１、２９７、３０９、３１５、３２７、３３３、３４５、３５１、３
６３および３６９ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され；該重鎖可変領域
ＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号：４、１０、２２、２８、４０、４６、５８、６４、
７６、８２、９４、１００、１１２、１１８、１３０、１３６、１４８、１５４、１６６
、１７２、１８４、１９０、２０２、２０８、２２０、２２６、２３８、２４４、２５６
、２６２、２７４、２８０、２９２、２９８、３１０、３１６、３２８、３３４、３４６
、３５２、３６４および３７０ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され；該
軽鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号：５、１１、２３、２９、４１、４７、
５９、６５、７７、８３、９５、１０１、１１３、１１９、１３１、１３７、１４９、１
５５、１６７、１７３、１８５、１９１、２０３、２０９、２２１、２２７、２３９、２
４５、２５７、２６３、２７５、２８１、２９３、２９９、３１１、３１７、３２９、３
３５、３４７、３５３、３６５および３７１ならびにそれらの保存的修飾からなる群から
選択され；該軽鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号：６、１２、２４、３０、
４２、４８、６０、６６、７８、８４、９６、１０２、１１４、１２０、１３２、１３８
、１５０、１５６、１６８、１７４、１８６、１９２、２０４、２１０、２２２、２２８
、２４０、２４６、２５８、２６４、２７６、２８２、２９４、３００、３１２、３１８
、３３０、３３６、３４８、３５４、３６６および３７２ならびにそれらの保存的修飾か
らなる群から選択され；該軽鎖可変領域ＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号：７、１３、
２５、３１、４３、４９、６１、６７、７９、８５、９７、１０３、１１５、１２１、１
３３、１３９、１５１、１５７、１６９、１７５、１８７、１９３、２０５、２１１、２
２３、２２９、２４１、２４７、２５９、２６５、２７７、２８３、２９５、３０１、３
１３、３１９、３３１、３３７、３４９、３５５、３６７および３７３ならびにそれらの
保存的修飾からなる群から選択され；ＨＥＲ３に特異的に結合し、リン酸化アッセイまた
は他のＨＥＲシグナル伝達の他の測定（例えば、実施例に記載されているホスホ−ＨＥＲ
３アッセイ、ホスホ−Ａｋｔアッセイ、細胞増殖およびリガンド結合アッセイ）において
測定できる、ＨＥＲシグナル伝達経路を阻害することによりＨＥＲ３活性を中和する、抗
体またはそれらの断片を提供する。
同じエピトープに結合する抗体
本発明は、表１および図７に記載されているＨＥＲ３結合抗体と同じエピトープと相互
作用する（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布による）抗体を提供す
る。したがって、さらなる抗体は、ＨＥＲ３結合アッセイにおいて、本発明の他の抗体と
交差競合する（例えば、統計的に有意な様式において競合的に阻害する）能力に基づいて
同定することができる。試験抗体がＨＥＲ３タンパク質（例えば、ヒトおよび／またはカ
ニクイザルＨＥＲ３）への本発明の抗体の結合を阻害する能力は、該試験抗体がＨＥＲ３
の結合に対して抗体と競合することができる；このような抗体は、非限定的な理論による
と、競合する抗体と同じ、または関連する（例えば、構造的に類似の、または空間的に隣
接している）ＨＥＲ３タンパク質上のエピトープに結合し得るということを証明する。特
定の態様において、本発明の抗体と同じＨＥＲ３上のエピトープに結合する抗体はヒトモ
ノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は、本明細書に記載されて
いるとおりに調製し、単離することができる。
１つの態様において、抗体またはその断片は、ドメイン２内に存在する二量体化ループ
の暴露を防止する不活性な立体構造におけるＨＥＲ３を保持するように、ＨＥＲ３のドメ
イン２およびドメイン４の両方に結合する。これは、他のファミリーメンバー、例えば、
ＨＥＲ１、ＨＥＲ２およびＨＥＲ４とのヘテロ二量体化を防止する。抗体またはその断片
は、リガンド依存性およびリガンド非依存性ＨＥＲ３シグナル変換の両方を阻害する。
別の態様において、抗体またはその断片は、ＨＥＲ３リガンド、例えば、ニューレグリ
ンの同時結合をブロックすることなく、ＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン４の両方に
結合する。理論を提供することは必要ではないが、ＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン
４の両方への抗体またはそれらの断片の結合は、ＨＥＲ３上のリガンド結合部位をブロッ
クすることなく、不活性な立体構造におけるＨＥＲ３を保持することが可能である。した
がって、ＨＥＲ３リガンド（例えば、ニューレグリン）は、抗体またはその断片と同時に
ＨＥＲ３に結合することができる。
本発明の抗体またはその断片は、リガンド結合を防止することなく、ＨＥＲ３のリガン
ド依存性および非依存性活性化の両方を阻害する。これは、以下の理由のための利点と考
えられる：
（ｉ）別個の腫瘍型がそれぞれのメカニズムにより駆動されるため、治療抗体は、ＨＥ
Ｒ３活性化（すなわちリガンド依存性またはリガンド非依存性）の単一のメカニズムを標
的化する抗体よりも、腫瘍の広範な範囲において臨床的有用性を有する。
（ｉｉ）治療抗体は、ＨＥＲ３活性化の両方のメカニズムが同時に関与する腫瘍型におい
て有効である。ＨＥＲ３活性化（すなわちリガンド依存性またはリガンド非依存性）の単
一のメカニズムを標的化する抗体は、これらの腫瘍型においてあまり、もしくは全く有効
性を示さない。
（ｉｉｉ）リガンド結合を防止することなく、ＨＥＲ３のリガンド依存性活性化を阻害す
る抗体の有効性は、リガンドの濃度を増加することにより、有害に影響される可能性が少
ない。これは、ＨＥＲ３リガンドの非常に高い濃度により駆動される腫瘍型における有効
性の増加、またはＨＥＲ３リガンドの上方制御が介在する薬物耐性不利益の減少のいずれ
かに置き換わる。
（ｉｖ）不活性な形態を安定化することによりＨＥＲ３活性化を阻害する抗体は、ＨＥＲ
３活性化の代替メカニズムにより駆動される薬物耐性があまり起こらない。
結果として、本発明の抗体は、治療抗体の存在が臨床的に有効である状態を処置するた
めに使用され得る。
操作および修飾された抗体
本発明の抗体はさらに、修飾された抗体を設計するための出発物質として、本明細書に
示される一以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列を有する抗体を用いて調製でき、この修飾
された抗体は、出発抗体とは異なる特徴を有しうる。一方または両方の可変領域（すなわ
ち、ＶＨおよび／またはＶＬ）、例えば一以上のＣＤＲ領域および／または一以上のフレ
ームワーク領域における一以上の残基を修飾することにより、抗体を操作できる。さらに
またはあるいは、例えば抗体のエフェクター機能を変化させるために、定常領域内の残基
を修飾することにより、抗体を操作できる。
実施できる可変領域操作の一種が、ＣＤＲ移植(CDR grafting)である。抗体は、６つの
重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基によって主として標的
抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外の配列よりも個々
の抗体間でより多様である。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体−抗原相互作用に関与するため
、異なる特徴を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列上に移植した特定の天然に存
在する抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然に存
在する抗体の特徴を模倣する組換え抗体を発現することが可能である（例えば、Riechman
nら (1998)Nature 332:323-327;Jonesら (1986)Nature 321:522-525;Queenら (1989)Proc
. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033；Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９
号，ならびにＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９
号；同第５，６９３，７６２号および同第６，１８０，３７０号を参照）。
したがって、本発明の別の実施形態は、配列番号：２、８、２０、２６、３８、４４、
５６、６２、７４、８０、９２、９８、１１０、１１６、１２８、１３４、１４６、１５
２、１６４、１７０、１８２、１８８、２００、２０６、２１８、２２４、２３６、２４
２、２５４、２６０、２７２、２７８、２９０、２９６、３０８、３１４、３２６、３３
２、３４４、３５０、３６２および３６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有す
るＣＤＲ１配列；配列番号：３、９、２１、２７、３９、４５、５７、６３、７５、８１
、９３、９９、１１１、１１７、１２９、１３５、１４７、１５３、１６５、１７１、１
８３、１８９、２０１、２０７、２１９、２２５、２３７、２４３、２５５、２６１、２
７３、２７９、２９１、２９７、３０９、３１５、３２７、３３３、３４５、３５１、３
６３および３６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；配列番
号：４、１０、２２、２８、４０、４６、５８、６４、７６、８２、９４、１００、１１
２、１１８、１３０、１３６、１４８、１５４、１６６、１７２、１８４、１９０、２０
２、２０８、２２０、２２６、２３８、２４４、２５６、２６２、２７４、２８０、２９
２、２９８、３１０、３１６、３２８、３３４、３４６、３５２、３６４および３７０か
らなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列をそれぞれ含む重鎖可変領域
；ならびに配列番号：５、１１、２３、２９、４１、４７、５９、６５、７７、８３、９
５、１０１、１１３、１１９、１３１、１３７、１４９、１５５、１６７、１７３、１８
５、１９１、２０３、２０９、２２１、２２７、２３９、２４５、２５７、２６３、２７
５、２８１、２９３、２９９、３１１、３１７、３２９、３３５、３４７、３５３、３６
５および３７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；配列番号
：６、１２、２４、３０、４２、４８、６０、６６、７８、８４、９６、１０２、１１４
、１２０、１３２、１３８、１５０、１５６、１６８、１７４、１８６、１９２、２０４
、２１０、２２２、２２８、２４０、２４６、２５８、２６４、２７６、２８２、２９４
、３００、３１２、３１８、３３０、３３６、３４８、３５４、３６６および３７２から
なる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；および配列番号：７、１３、
２５、３１、４３、４９、６１、６７、７９、８５、９７、１０３、１１５、１２１、１
３５、１３９、１５１、１５７、１６９、１７５、１８７、１９３、２０５、２１１、２
２３、２２９、２４１、２４７、２５９、２６５、２７７、２８３、２９５、３０１、３
１３、３１９、３３１、３３７、３４９、３５５、３６７および３７３からなる群から選
択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３配列をそれぞれ有する軽鎖可変領域を含む、単離
されたＨＥＲ３結合モノクローナル抗体またはそれらの断片に関する。それゆえ、かかる
抗体は、モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ配列を含有するが、これらの抗体
とは異なるフレームワーク配列を含有しうる。かかるフレームワーク配列は、生殖系列抗
体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは公表された参考文献から得ることがで
きる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子のための生殖系列ＤＮＡ配列は、「Ｖ
ａｓｅ］ヒト生殖系列配列データベース（www.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbaseでインターネッ
ト上で入手可能）、ならびに、それぞれの内容が出典明示により本明細書に明確に組み込
まれる；Kabatら (1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edi
tion, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242;
Chothiaら (1987)J. Mol. Biol. 196:901-917;Chothiaら (1989)Nature 342:877-883;お
よびAl-Lazikaniら (1997)J. Mol. Biol. 273:927-948;Tomlinsonら (1992) J. fol. Bio
l. 227:776-798;およびCoxら (1994)Eur. J Immunol. 24:827-836において、見出しうる
。
本発明の抗体に使用するためのフレームワーク配列の例は、選択された本発明の抗体に
より用いられるフレームワーク配列、例えば、コンセンサス配列および／または本発明の
モノクローナル抗体により使用されるフレームワーク配列と構造的に類似のものである。
ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬ ＣＤＲ１、２および３配列は、フレーム
ワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子において見られるものと同一の配列
を有するフレームワーク領域上に移植でき、あるいは該ＣＤＲ配列は、生殖系列配列と比
較して一以上の変異を含有するフレームワーク領域上に移植できる。例えば、場合によっ
ては、抗体の抗原結合能力を維持または向上するために、フレームワーク領域内の残基を
変異させることが有益であるということが見出されている（例えば、Ｑｕｅｅｎらの米国
特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号お
よび同第６，１８０，３７０号を参照）。
別の種類の可変領域修飾は、ＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／ま
たはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させることにより、対象とする抗体の一以上の
結合特性（例えば親和性）を改善することであり、「親和性成熟」として知られる。部位
特異的突然変異誘発またはＰＣＲ介在突然変異誘発を実施して変異を導入でき、抗体結合
または他の対象とする機能的特徴に対する効果は、本明細書に記載され、実施例に提供さ
れる通り、インビトロおよびインビボアッセイで評価できる。（上記に議論されるような
）保存的修飾を導入してもよい。突然変異は、アミノ酸置換、付加または欠失でありうる
。さらにＣＤＲ領域内の典型的には１、２、３、４または５以上の残基が変化される。
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号：２、８、２０、２６、３８、４
４、５６、６２、７４、８０、９２、９８、１１０、１１６、１２８、１３４，１４６、
１５２、１６４、１７０、１８２、１８８、２００、２０６、２１８、２２４、２３６、
２４２、２５４、２６０、２７２、２７８、２９０、２９６、３０８、３１４、３２６、
３３２、３４４、３５０、３６２および３６８を有する群から選択されるアミノ酸配列ま
たは配列番号：２、８、２０、２６、３８、４４、５６、６２、７４、８０、９２、９８
、１１０、１１６、１２８、１３４、１４６、１５２、１６４、１７０、１８２、１８８
、２００、２０６、２１８、２２４、２３６、２４２、２５４、２６０、２７２、２７８
、２９０、２９６、３０８、３１４、３２６、３３２、３４４、３５０、３６２および３
６８と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミ
ノ酸配列からなるＶＨ ＣＤＲ１領域；配列番号：３、９、２１、２７、３９、４５、５
７、６３、７５、８１、９３、９９、１１１、１１７、１２９、１３５、１４７、１５３
、１６５、１７１、１８３、１８９、２０１、２０７、２１９、２２５、２３７、２４３
、２５５、２６１、２７３、２７９、２９１、２９７、３０９、３１５、３２７、３３３
、３４５、３５１、３６３および３６９からなる群から選択されるアミノ酸配列または配
列番号：３、９、２１、２７、３９、４５、５７、６３、７５、８１、９３、９９、１１
１、１１７、１２９、１３５、１４７、１５３、１６５、１７１、１８３、１８９、２０
１、２０７、２１９、２２５、２３７、２４３、２５５、２６１、２７３、２７９、２９
１、２９７、３０９、３１５、３２７、３３３、３４５、３５１、３６３および３６９と
比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配
列を有するＶＨ ＣＤＲ２領域；配列番号：４、１０、２２、２８、４０、４６、５８、
６４、７６、８２、９４、１００、１１２、１１８、１３０、１３６、１４８、１５４、
１６６、１７２、１８４、１９０、２０２、２０８、２２０、２２６、２３８、２４４、
２５６、２６２、２７４、２８０、２９２、２９８、３１０、３１６、３２８、３３４、
３４６、３５２、３６４および３７０からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列
番号：４、１０、２２、２８、４０、４６、５８、６４、７６、８２、９４、１００、１
１２、１１８、１３０、１３６、１４８、１５４、１６６、１７２、１８４、１９０、２
０２、２０８、２２０、２２６、２３８、２４４、２５６、２６２、２７４、２８０、２
９２、２９８、３１０、３１６、３２８、３３４、３４６、３５２、３６４および３７０
と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸
配列を有するＶＨ ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域；配列番号：５、１１、２３、２
９、４１、４７、５９、６５、７７、８３、９５、１０１、１１３、１１９、１３１、１
３７、１４９、１５５、１６７、１７３、１８５、１９１、２０３、２０９、２２１、２
２７、２３９、２４５、２５７、２６３、２７５、２８１、２９３、２９９、３１１、３
１７、３２９、３３５、３４７、３５３、３６５および３７１からなる群から選択される
アミノ酸配列または配列番号：５、１１、２３、２９、４１、４７、５９、６５、７７、
８３、９５、１０１、１１３、１１９、１３１、１３７、１４９、１５５、１６７、１７
３、１８５、１９１、２０３、２０９、２２１、２２７、２３９、２４５、２５７、２６
３、２７５、２８１、２９３、２９９、３１１、３１７、３２９、３３５、３４７、３５
３、３６５および３７１と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失また
は付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１領域；配列番号：６、１２、２４、
３０、４２、４８、６０、６６、７８、８４、９６、１０２、１１４、１２０、１３２、
１３８、１５０、１５６、１６８、１７４、１８６、１９２、２０４、２１０、２２２、
２２８、２４０、２４６、２５８、２６４、２７６、２８２、２９４、３００、３１２、
３１８、３３０、３３６、３４８、３５４、３６６および３７２からなる群から選択され
るアミノ酸配列または配列番号：６、１２、２４、３０、４２、４８、６０、６６、７８
、８４、９６、１０２、１１４、１２０、１３２、１３８、１５０、１５６、１６８、１
７４、１８６、１９２、２０４、２１０、２２２、２２８、２４０、２４６、２５８、２
６４、２７６、２８２、２９４、３００、３１２、３１８、３３０、３３６、３４８、３
５４、３６６および３７２と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失ま
たは付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２領域；ならびに配列番号：７、１
３、２５、３１、４３、４９、６１、６７、７９、８５、９７、１０３、１１５、１２１
、１３５、１３９、１３９、１５１、１５７、１６９、１７５、１８７、１９３、２０５
、２１１、２２３、２２９、２４１、２４７、２５９、２６５、２７７、２８３、２９５
、３０１、３１３、３１９、３３１、３３７、３４９、３５５、３６７および３７３から
なる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号：７、１３、２５、３１、４３、４９
、６１、６７、７９、８５、９７、１０３、１１５、１２１、１３５、１３９、１３９、
１５１、１５７、１６９、１７５、１８７、１９３、２０５、２１１、２２３、２２９、
２４１、２４７、２５９、２６５、２７７、２８３、２９５、３０１、３１３、３１９、
３３１、３３７、３４９、３５５、３６７および３７３と比較して１、２、３、４または
５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３領域
からなる、単離されたＨＥＲ３結合モノクローナル抗体またはそれらの断片を提供する。
別のフレームワークまたはスキャフォールド(scaffold)への抗体断片の移植
生じるポリペプチドが少なくとも一つのＨＥＲ３に特異的に結合する結合領域を含む限
り、多種多様の抗体／免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドが使用でき
る。かかるフレームワークまたはスキャフォールドは、ヒト免疫グロブリンの５種の主な
イディオタイプまたはそれらの断片を含み、また、好ましくはヒト化性状(aspect)を有す
る、他の動物種の免疫グロブリンを含む。新たなフレームワーク、スキャフォールドおよ
び断片が、当業者により発見および開発され続けている。
一態様では、本発明は、本発明のＣＤＲが移植できる非免疫グロブリンスキャフォール
ドを用いた、非免疫グロブリンをベースとする抗体を生成することに関する。標的ＨＥＲ
３タンパク質（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３）に特異的な結合領域
を含む限り、既知または将来的な非免疫グロブリンフレームワークおよびスキャフォール
ドが使用できる。既知の非免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドには、
フィブロネクチン（Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA）、アンキリン（Molecu
lar Partners AG, Zurich, Switzerland）、ドメイン抗体（Domantis, Ltd., Cambridge,
MA, およびAblynx nv, Zwijnaarde, Belgium）、リポカリン（Pieris Proteolab AG, Fr
eising, Germany）、小モジュラー免疫医薬(small modular immuno-pharmaceuticals)（T
rubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA）、マキシボディ(maxybodies)（Avidia, In
c., Mountain View, CA）、プロテインＡ（Affibody AG, Sweden）、およびアフィリン（
ガンマクリスタリン(crystallin)またはユビキチン）（Scil Proteins GmbH, Halle, Ger
many）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
フィブロネクチンスキャフォールドはフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（例えば、フ
ィブロネクチンＩＩＩ型ドメインの第１０モジュール（１０Ｆｎ３ドメイン））に基づく
。フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは、それら自体が互いをパックしてタンパク質のコ
アを形成する、２つのベータシート間に分布する７または８個のβ鎖を有し、さらにベー
タ鎖と互いに結合し、溶媒に曝されるループ（ＣＤＲに類似する）を含む。ベータシート
サンドイッチの各端に、かかるループが少なくとも３個存在し、該端はベータ鎖の方向に
垂直なタンパク質の境界である（米国特許第６，８１８，４１８号を参照）。これらのフ
ィブロネクチンをベースとするスキャフォールドは、免疫グロブリンではないが、全体的
な折りたたみ(fold)は、最も小さな機能的抗体断片であり、ラクダおよびラマＩｇＧの全
抗原認識ユニットを含む、重鎖可変領域のものと極めて関連している。この構造のため、
非免疫グロブリン抗体は、抗体のものと性質および親和性において類似する抗原結合特性
を模倣する。これらのスキャフォールドは、インビボでの抗体の親和性成熟のプロセスと
類似の、インビトロでのループランダム化およびシャッフル戦略において用いることがで
きる。これらのフィブロネクチンをベースとする分子は、該分子のループ領域が標準的な
クローニング技術を用いる本発明のＣＤＲで置換する場合に、スキャフォールドとして用
いることができる。
アンキリン技術は、異なる標的に結合するために用いることができる可変領域を保持す
るためのスキャフォールドとして、アンキリン由来反復モジュールを備えるタンパク質を
用いることに基づく。アンキリン反復モジュールは、２つの逆平行αヘリックスおよびβ
ターンからなる３３アミノ酸のポリペプチドである。可変領域の結合は、多くの場合、リ
ボソームディスプレイを用いて最適化される。
アビマーは、ＨＥＲ３などの天然のＡドメイン含有タンパク質に由来する。これらのド
メインは、本来タンパク質間相互作用のために用いられ、ヒトでは２５０種以上のタンパ
ク質が構造的にＡドメインに基づいている。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して結合
した多数の異なる「Ａドメイン」モノマー（２〜１０個）からなる。標的抗原に結合しう
るアビマーは、例えば米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号、同第２００５００
５３９７３号、同第２００５００４８５１２号および同第２００６０００８８４４号に記
載された方法論を用いて作成できる。
アフィボディ(Affibody)親和性リガンドは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの１個
のスキャフォールドに基づいた３ヘリックスバンドルからなる、小さく単純なタンパク質
である。プロテインＡは、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来の表面タンパク
質である。このスキャフォールドドメインは５８アミノ酸からなり、そのうち１３個がラ
ンダム化されて、多数のリガンド変異体を有するアフィボディライブラリーを生じる（例
えば、米国特許第５８３１０１２号参照）。アフィボディ分子は抗体を模倣し、１５０ｋ
Ｄａである抗体の分子量と比較して、それらは６ｋＤａの分子量を有する。その小さなサ
イズにもかかわらず、アフィボディ分子の結合部位は抗体のものと同様である。
アンチカリンは、Ｐｉｅｒｉｓ ＰｒｏｔｅｏＬａｂ ＡＧ社により開発された製品で
ある。それらは、化学的に感受性または不溶性の化合物の生理学的輸送または貯蔵に通常
関与する広範なグループの小さく強固なタンパク質であるリポカリンに由来する。多様な
天然リポカリンがヒト組織または体液中に生じる。タンパク質構造は免疫グロブリンに類
似しており、強固なフレームワークの上端に超可変ループを有する。しかしながら、抗体
またはその組換え断片とは異なり、リポカリンは、単一免疫グロブリンドメインよりも僅
かに大きな１６０〜１８０アミノ酸残基を有する単一ポリペプチド鎖からなる。結合ポケ
ットを構成する４個のループのセットは、顕著な構造可塑性を示し、多様な側鎖に耐容性
である。したがって結合部位は、高い親和性および特異性で異なる形の所定の標的分子を
認識するため、特許方法で再形成してよい。リポカリンファミリーの一タンパク質である
、Ｐｉｅｒｉｓ Ｂｒａｓｓｉｃａｅのビリン結合タンパク質（ＢＢＰ）は、４個のルー
プのセットを変異させてアンチカリンを開発するために使用されている。アンチカリンに
ついて記載する特許出願の一例は、ＰＣＴ国際公開第１９９９１６８７３号である。
アフィリン分子は、タンパク質および低分子に対する特異的親和性について設計されて
いる、小さな非免疫グロブリンタンパク質である。新たなアフィリン分子は、各々異なる
ヒト由来スキャフォールドタンパク質に基づく、２個のライブラリーから極めて速やかに
選択しうる。アフィリン分子は免疫グロブリンタンパク質に対して何ら構造的相同性を示
さない。現在、２種のアフィリンスキャフォールドが使用されており、一方はヒトの構造
的眼レンズタンパク質であるガンマクリスタリンであり、他方は「ユビキチン」スーパー
ファミリータンパク質である。いずれのヒトスキャフォールドも極めて小さく、高い温度
安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤にほぼ耐性である。この高い安定性は、主として該
タンパク質の伸長ベータシート構造のためである。ガンマクリスタリン由来タンパク質の
例は国際公開第２００１０４１４４号に記載されており、「ユビキチン様」タンパク質の
例は国際公開第２００４１０６３８号に記載されている。
タンパク質エピトープ模倣物(Protein Epitope Mimetic)（ＰＥＭ）は、タンパク質間
相互作用に関与する主な二次構造である、タンパク質のベータヘアピン二次構造を模倣す
る、中間サイズの環状ペプチド様分子（ＭＷ １−２ｋＤａ）である。
いくつかの態様において、Ｆｃ領域を変えることにより、ＦａｂがサイレントＩｇＧ１
形態に変換される。例えば、表１における抗体は、ＩｇＧ形態に変換されうる。
ヒトまたはヒト化抗体
本発明は、ＨＥＲ３（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザル／マウス／ラットＨＥ
Ｒ３）に特異的に結合する完全ヒト抗体を提供する。キメラ抗体またはヒト化抗体と比較
して、本発明のヒトＨＥＲ３結合抗体は、ヒト対象に投与した時、さらに低下した抗原性
を有する。
ヒトＨＥＲ３結合抗体は、当該技術分野で知られている方法を用いて生成できる。例え
ば、非ヒト抗体を操作された(engineered)ヒト抗体に変換するために用いられるヒト化(h
umaneering)技術。米国特許出願公開番号第２００５０００８６２５号は、非ヒト抗体の
ものに対して同じ結合特性を維持しあるいはより良い結合特性を提供しながら、抗体中の
ヒト可変領域で非ヒト抗体可変領域を置換するためのインビボでの方法について記載して
いる。この方法は、完全ヒト抗体による非ヒト参照抗体の可変領域のエピトープガイド置
換(epitope guided replacement)に依存する。得られるヒト抗体は、一般に、参照非ヒト
抗体と構造的に関連しないが、参照抗体と同じ抗原上の同じエピトープと結合する。簡潔
には、試験抗体と抗原の結合に応答するレポーター系の存在下で、限定量の抗原との結合
について、「コンペティター」と参照抗体（試験抗体）の多様なハイブリッドのライブラ
リーとの間の細胞における競合を設定することによって、連続エピトープガイド相補性置
換(serial epitope guided complementarity replacement)アプローチが可能となる。該
コンペティターは、一本鎖Ｆｖ断片などの、参照抗体またはその誘導体でありうる。コン
ペティターはまた、参照抗体と同じエピトープに結合する抗原の天然または人工リガンド
であってもよい。コンペティターに唯一要求されることは、それが参照抗体と同じエピト
ープと結合し、抗原結合について参照配列と競合することである。試験抗体は、非ヒト参
照抗体と共通する１つの抗原結合Ｖ領域およびヒト抗体のレパートリーライブラリーのよ
うな多様な供給源からランダムに選択された他のＶ領域を有する。参照抗体と共通のＶ領
域は、抗原上の同じエピトープに同じ配向で試験抗体を配置するガイドとして作用し、し
たがって選択は参照抗体に対して最も高い抗原結合忠実度に偏向している。
多様なレポーターシステムを用いて、試験抗体と抗原間の所望の相互作用を検出できる
。例えば、相補レポーター断片は、抗原および試験抗体とそれぞれ連結して、試験抗体が
抗原に結合する場合にのみ、断片相補性によるレポーター活性化が生じる。試験抗体−お
よび抗原−レポーター断片融合体がコンペティターと共に発現される場合、レポーター活
性化は、抗原に対する試験抗体の親和性と比例する、コンペティターと競合する試験抗体
の能力に依存することとなる。他の用いられるレポーターシステムは、米国特許出願番号
第１０／２０８，７３０号（公開番号第２００３０１９８９７１号）に開示される再アク
チベーターの自己阻害レポーター再活性化システム（ＲＡＩＲ）、あるいは米国特許出願
番号第１０／０７６，８４５号（公開番号第２００３０１５７５７９号）に開示される競
合活性化を含む。
連続エピトープガイド相補性置換システムにより選択を行い、コンペティター、抗原お
よびレポーター成分とともに試験抗体を単独で発現する細胞を同定する。これらの細胞に
おいて、各試験抗体は、限定量の抗原との結合について、コンペティターと一対一で競合
する。レポーターの活性は、試験抗体と結合する抗原の量に比例し、したがって抗原に対
する試験抗体の親和性および試験抗体の安定性に比例する。試験抗体は、試験抗体として
発現した場合の参照抗体の活性と比較したその活性に基づいてまず選択される。１回目の
選択の結果は、「ハイブリッド」抗体のセットであり、これはそれぞれ、参照抗体由来の
同じ非ヒトＶ領域およびライブラリー由来のヒトＶ領域を含み、そして参照抗体と同じ抗
原上のエピトープに結合する。１回目で選択した一以上のハイブリッド抗体は、参照抗体
のものと同等またはそれ以上の抗原に対する親和性を有する。
第２のＶ領域置換工程において、第１段階で選択したヒトＶ領域は、同種ヒトＶ領域の
多様なライブラリーでの残留非ヒト参照抗体Ｖ領域のヒト置換の選択のためのガイドとし
て用いられる。１回目で選択したハイブリッド抗体は、２回目の選択のためのコンペティ
ターとして用いてもよい。２回目の選択の結果は、参照抗体とは構造的に異なるが、同じ
抗原への結合に関して参照抗体と競合する、完全ヒト抗体のセットである。選択したヒト
抗体のいくつかは、参照抗体と同じ抗原上の同じエピトープに結合する。これらの選択し
たヒト抗体のうち、一以上が参照抗体のものと同等またはそれ以上の親和性で同じエピト
ープと結合する。
上記のマウスまたはキメラＨＥＲ３結合抗体の１つを参照抗体として用いて、この方法
は、同じ結合特異性および同じまたはより良い結合親和性を有する、ヒトＨＥＲ３に結合
するヒト抗体を生成するために容易に使用できる。加えて、かかるヒトＨＥＲ３結合抗体
はまた、通常ヒト抗体を製造している企業、例えばKaloBios, Inc.(Mountain View, CA)
から商業的に入手可能である。
ラクダ抗体
ラマ種（Lama paccos、Lama glamaおよびLama vicugna）などの新世界メンバーを含む
、ラクダおよびヒトコブラクダ（Camelus bactrianusおよびCalelus dromaderius）ファ
ミリーのメンバーから得た抗体タンパク質は、サイズ、構造の複雑性およびヒト対象に対
する抗原性について、特徴付けられている。天然に見出されるほ乳類のこのファミリー由
来の特定のＩｇＧ抗体は軽鎖を欠き、それゆえ、他の動物由来の抗体における２つの重鎖
および２つの軽鎖を有する典型的な４鎖の四次構造とは構造的に異なる。国際特許出願第
ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４号（１９９４年３月３日公開の国際公開第９４／０４６７
８号）を参照されたい。
ＶＨＨと同定される小さな１個の可変ドメインであるラクダ抗体の領域を遺伝子操作に
よって入手して、標的に高い親和性を有し、「ラクダナノ抗体」として知られる低分子量
抗体由来タンパク質を得ることができる。１９９８年６月２日公開の米国特許第５，７５
９，８０８号を参照されたい：Stijlemansら (2004)J Biol Chem 279:1256-1261;Dumouli
nら (2003)Nature 424:783-788;Pleschbergerら (2003)Bioconjugate Chem 14:440-448;C
ortez-Retamozoら (2002)Int J Cancer 89:456-62;およびLauwereysら (1998)EMBO J 17:
3512-3520も参照されたい。ラクダ抗体および抗体断片の操作されたライブラリーは、例
えばAblynx, Ghent, Belgiumから商業的に入手可能である（例えば、ＵＳ２００６０１１
５４７０；Ｄｏｍａｎｔｉｓ（ＵＳ２００７００６５４４０、ＵＳ２００９０１４８４３
４）。非ヒト起源の他の抗体として、ラクダ抗体のアミノ酸配列を組換え的に変化させて
、ヒト配列により似た配列を得てもよい、すなわち、ナノ抗体を「ヒト化」してよい。し
たがって、ヒトに対するラクダ抗体の天然の低い抗原性をさらに低下させうる。
ラクダナノ抗体はヒトＩｇＧ分子の約１０分の１の分子量を有し、該タンパク質はわず
か数ナノメートルの物理的直径を有する。小さなサイズの一つの帰結は、より大きな抗体
タンパク質には機能的に不可視の抗原部位に結合するというラクダ抗体の能力であり、す
なわちラクダナノ抗体は、従来の免疫学的技術を用いると隠される抗原を検出する試薬と
して、そして可能性のある治療薬物として、有用である。したがって、小さなサイズのさ
らに別の帰結は、ラクダナノ抗体、標的タンパク質の溝または小さな割れ目の特定の部位
に結合することの結果として、阻害でき、したがって伝統的な抗体のものよりも伝統的な
低分子量薬物の機能により似た能力を提供できることである。
低分子量およびコンパクトなサイズは、さらに、極めて熱安定であり、極端なｐＨおよ
びタンパク分解に安定であり、かつ低い抗原性をラクダナノ抗体にもたらす。別の帰結は
、ラクダナノ抗体は循環系から組織に容易に移動することおよび血液脳関門を通過して神
経組織に作用する障害を処置しうることである。ナノ抗体はさらに、薬物の血液脳関門通
過を促進しうる。２００４年８月１９日公開の米国特許番号第２００４０１６１７３８号
を参照されたい。ヒトへの低抗原性と組み合わさったこれらの特徴は、大きな治療的可能
性を示す。さらに、これらの分子は、大腸菌などの原核生物において十分に発現され、バ
クテリオファージで融合タンパク質として発現され、かつ機能的である。
したがって、本発明の特徴は、ＨＥＲ３に対する高い親和性を有するラクダ抗体または
ナノ抗体である。本明細書における特定の実施形態では、ラクダ抗体またはナノ抗体はラ
クダ科動物において天然に生産され、すなわち他の抗体について本明細書に記載の技術を
用いて、ＨＥＲ３またはそのペプチド断片でラクダを免疫して産生される。あるいは、Ｈ
ＥＲ３結合ラクダナノ抗体が操作される、すなわち例えば、本明細書の実施例に記載の通
り、標的としてＨＥＲ３を用いるパニング手法を用いて、適切に変異誘発したラクダナノ
抗体タンパク質を提示する、例えばファージディスプレイライブラリーから選択して産生
される。操作されたナノ抗体は、４５分から２週間の受容対象における半減期を有するよ
うに、さらに遺伝子工学操作によりカスタマイズしてもよい。特定の実施形態では、ラク
ダ抗体またはナノ抗体は、例えば国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４号に記載
の通り、本発明のヒト抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ配列を、ナノ抗体またはシングルド
メイン抗体フレームワーク配列内に移植することにより、獲得される。１つの態様におい
て、ラクダ抗体またはナノボディは、少なくとも１つの以下のＨＥＲ３残基に結合する：
Ａｓｎ２６６、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｎ２７１、Ｇｌｕ２７
３、Ｐｒｏ２７４、Ａｓｎ２７５、Ｐｒｏ２７６、Ｈｉｓ２７７、Ａｓｎ３１５、Ａｓｐ
５７１、Ｐｒｏ５８３、Ｈｉｓ５８４、Ａｌａ５９６、Ｌｙｓ５９７。１つの態様におい
て、ラクダ抗体またはナノボディは、少なくとも１つの以下のＨＥＲ３残基に結合する：
Ｔｙｒ２６５、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｐｈｅ２７０、Ｇｌｙ５８２、Ｐｒｏ５８
３、Ｌｙｓ５９７、Ｉｌｅ６００、Ｌｙｓ６０２、Ｇｌｕ６０９、Ａｒｇ６１１、Ｐｒｏ
６１２、Ｃｙｓ６１３、Ｈｉｓ６１４、Ｇｌｕ６１５。
二重特異性分子および多価抗体
別の局面において、本発明は、本発明のＨＥＲ３結合抗体またはその断片を含むビパラ
トープ(biparatopic)、二重特異性または多特異的分子を特徴とする。本発明の抗体また
はその断片は少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子
を産生するように、別の機能性分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、
受容体に対する別の抗体またはリガンド）に誘導体化または連結され得る。実際に、本発
明の抗体は、２つ以上の異なる結合部位および／または標的分子に結合するビパラトープ
または多特異的分子；このようなビパラトープまたは多特異的分子を産生するように２つ
以上の他の機能性分子に誘導体化または連結され得る。本発明の二重特異性分子を作るた
めに、本発明の抗体は、二重特異性分子をもたらすように、１つ以上の他の結合分子、例
えば、別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模擬物に（例えば、化学的カップリング
、遺伝学的融合、非共有結合またはその他により）機能的に連結され得る。
さらなる臨床的利益は、１つの抗体内で２つ以上の抗原の結合により提供され得る（Co
lomaら (1997); Merchantら (1998); Altら (1999); Zuoら (2000); Luら (2004); Luら
(2005); Marvinら (2005); Marvinら (2006); Shenら (2007); Wuら (2007); Dimasiら (
2009); Michaelsonら (2009))。(Morrisonら (1997) Nature Biotech. 15:159-163; Alt
ら (1999) FEBS Letters 454:90-94; Zuoら (2000) Protein Engineering 13:361-367; L
uら (2004) JBC 279:2856-2865; Luら (2005) JBC 280:19665-19672; Marvinら (2005)
Acta Pharmacologica Sinica 26:649-658; Marvinら (2006) Curr Opin Drug Disc Devel
op 9:184-193; Shenら (2007) J Immun Methods 218:65-74; Wuら (2007) Nat Biotechno
l. 11:1290-1297; Dimasiら (2009) J Mol Biol. 393:672-692;およびMichaelsonら (200
9) mAbs 1:128-141。
本発明の二重特異性分子は、当該技術分野で知られている方法を用いて、構成要素であ
る結合特異性をコンジュゲートすることにより調製されうる。例えば、二重特異性分子の
各結合特異性は別々に生成でき、次いで互いにコンジュゲートできる。結合特異性がタン
パク質あるいはペプチドである場合、様々なカップリングまたは架橋剤が共有結合コンジ
ュゲーションのために使用できる。架橋剤の例には、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ
−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビ
ス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ
−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびス
ルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロへキサン−ｌ−カルボキシレ
ート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Karpovskyら (1984)J. Exp. Med. 160
:1686;Liuら(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照）。他の方法は、Paulus(
1985)Behring Ins. Mitt. No. 78:118-132;Brennanら (1985)Science 229:81-83およびGl
ennieら (1987)J. Immunol. 139:2367-2375に記載のものを含む。コンジュゲート剤はＳ
ＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、両者ともＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ
．(Rockford, IL)から入手可能である。
結合特異性が抗体である場合、それは２個の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル
結合によりコンジュゲートされうる。特定の実施形態では、コンジュゲーションより前に
、奇数、例えば１個のスルフヒドリル残基を含有するようにヒンジ領域が修飾される。
あるいは、両方の結合特異性は同じベクター内でコードされ、同じ宿主細胞で発現され
そして組み立てられてもよい。この方法は、二重特異性分子が、ｍＡｂｘｍＡｂ、ｍＡｂ
ｘＦａｂ、ＦａｂｘＦ（ａｂ’）２またはリガンドｘＦａｂ融合タンパク質である場合に
特に有用である。本発明の二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体および結合決定因子を含
む一本鎖分子、または、２つの結合決定因子を含む一本鎖二重特異性分子でありうる。二
重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含みうる。二重特異性分子を調製するた
めの方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号；米国特許第５，４５５，０３０
号；米国特許第４，８８１，１７５号；米国特許第５，１３２，４０５号；米国特許第５
，０９１，５１３号；米国特許第５，４７６，７８６号；米国特許第５，０１３，６５３
号；米国特許第５，２５８，４９８号；および米国特許第５，４８２，８５８号に記載さ
れている。
二重特異性分子とそれらの特定の標的との結合は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（
ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ解析、バイオアッセイ（例え
ば、増殖阻害）またはウェスタンブロットアッセイにより確認できる。これらのアッセイ
はそれぞれ、一般に、対象とする複合体に特異的な標識付き試薬（例えば、抗体）を用い
ることにより、特定の対象とするタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
別の態様では、本発明は、ＨＥＲ３に結合する本発明の抗体の少なくとも２つの同一ま
たは異なる断片を含む多価化合物を提供する。該抗体断片は、タンパク質融合または共有
もしくは非共有結合によって一体に連結されうる。例えば、本発明の抗体を、本発明の抗
体の定常領域、例えばＦｃまたはヒンジ領域に結合する抗体と架橋することにより、四価
化合物が獲得できる。トリマー化ドメインは、例えば、Ｂｏｒｅａｎ特許ＥＰ１０１２２
８０Ｂ１において記載されている。ペンタ化モジュールは、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９７／
０５８９７に記載されている。
１つの態様において、ビパラトープ／二重特異性は、ＨＥＲ３のドメイン２およびドメ
イン４内のアミノ酸残基に結合する。
別の態様において、本発明は、単一のモノクローナル抗体が、抗原結合部位が２つ以上
の抗原に結合するように修飾されている二重機能抗体、例えば、ＨＥＲ３および別の抗原
（例えば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２およびＨＥＲ４）の両方に結合する二重機能抗体に関する
。別の態様において、本発明は、同じ立体構造を有する抗原、例えば、「閉塞的な」また
は「不活性な」状態におけるＨＥＲ３の同じ立体構造を有する抗原を標的化する二重機能
抗体に関する。「閉塞的な」または「不活性な」状態におけるＨＥＲ３の同じ立体構造を
有する抗原の例は、限定はしないが、ＨＥＲ１およびＨＥＲ４を含む。したがって、二重
機能抗体は、ＨＥＲ３およびＨＥＲ１；ＨＥＲ３およびＨＥＲ４、またはＨＥＲ１および
ＨＥＲ４の両方に結合し得る。二重機能抗体の二重結合特異性は、さらに、二重活性、ま
たは活性の阻害に置き換えられ得る（例えば、Jenny Bostrom ら (2009) Science: 323;
1610-1614参照）。
延長された半減期を有する抗体
本発明は、インビボで延長された半減期を有する、ＨＥＲ３タンパク質の特異的に結合
する抗体を提供する。
多くの要因がインビボでのタンパク質の半減期に影響しうる。例えば、腎臓ろ過、肝臓に
おける代謝、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）による分解および免疫原性応答(immun
ogenic response)（例えば、抗体によるタンパク質中和ならびにマクロファージおよび樹
状細胞による取り込み）。多様な戦略を用いて本発明の抗体の半減期を延長することがで
きる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｒｅＣＯＤＥ ＰＥＧ、抗体スキャ
フォールド、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミ
ン結合リガンドおよび糖質障壁との化学的結合；アルブミン、ＩｇＧ、ＦｃＲｎおよびト
ランスフェリンなどの血清タンパク質と結合するタンパク質との遺伝的融合；ナノ抗体、
Ｆａｂ、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、アフィボディおよびアンチカリンなどの血清タンパク
質と結合する他の結合部分とのカップリング（遺伝的または化学的）；ｒＰＥＧ、アルブ
ミン、アルブミンのドメイン、アルブミン結合タンパク質およびＦｃとの遺伝的融合；ま
たはナノ担体、遅延放出製剤または医薬デバイスへの導入による。
インビボでの抗体の血清循環を延長するため、多機能リンカー有りまたは無しで、高分
子量ＰＥＧなどの不活性ポリマー分子を本抗体またはそれらの断片に、抗体のＮもしくは
Ｃ末端またはリシン残基のイプシロンアミノ基とＰＥＧの部位特異的コンジュゲーション
により結合してもよい。抗体をペグ化するため、本抗体またはそれらの断片は、典型的に
は、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）と、一以上のＰＥＧ基が抗体またはそれらの断片に結合するような条件下で、反応
させる。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または同様の反応性水溶性ポリマー）を用いたア
シル化反応またはアルキル化反応により実施できる。本明細書で用いる場合、用語「ポリ
エチレングリコール」は、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−
ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの、他のタンパ
ク質を誘導体化するために用いられているあらゆる形態のＰＥＧを含む。特定の実施形態
では、ペグ化される抗体は、非グリコシル化(aglycosylated)抗体である。生物学的活性
の最小限の損失をもたらす直鎖または分枝鎖ポリマー誘導体化が用いられる。コンジュゲ
ーションの程度は本抗体とＰＥＧ分子の適切なコンジュゲーションを確保するために、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析により密接にモニターできる。未反応のＰＥＧは、サイズ
排除またはイオン交換クロマトグラフィーにより抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離で
きる。ＰＥＧ誘導体化抗体は、当業者によく知られている方法を用いて、例えば本明細書
に記載のイムノアッセイにより、結合活性およびインビボでの有効性を試験してもよい。
タンパク質をペグ化する方法は、当該技術分野において知られており、本発明の抗体に適
用できる。例えば、ＮｉｓｈｉｍｕｒａらによるＥＰ０１５４３１６およびＩｓｈｉｋａ
ｗａらによるＥＰ０４０１３８４を参照されたい。
他の修飾されたペグ化技術は、ｔＲＮ合成酵素およびｔＲＮＡを含む再構成系を介して
生合成タンパク質に化学的に特定された側鎖を導入する、再構成化学的直交操作技術(rec
onstituting chemically orthogonal directed engineering technology)（ReCODE PEG）
を含む。この技術は、大腸菌、酵母および哺乳類細胞において３０個を超える新しいアミ
ノ酸の取り込みを可能とする。ｔＲＮＡは非天然アミノ酸をアンバーコドンが位置する任
意の位置で取り込み、アンバーを終止コドンから化学的に特定したアミノ酸の取り込みを
伝達するものに変換する。
組換えペグ化技術（ｒＰＥＧ）も血清半減期延長のために用いることができる。この技
術は、既存の医薬タンパク質の末尾に３００〜６００アミノ酸の構造不定の(unstrucured
)タンパク質を遺伝的に融合することを含む。かかる構造不定のタンパク質鎖の見かけの
分子量は、その実際の分子量よりも約１５倍大きいため、該タンパク質の血清半減期は大
きく延長される。化学的コンジュゲーションおよび再精製を必要とする従来のＰＥＧ化と
対照的に、製造工程がかなり単純化され、産物が均一である。
ポリシアル化がもう一つの技術であり、これは天然ポリマーポリシアル酸（ＰＳＡ）を
用いて活性時間を延長し、治療ペプチドおよびタンパク質の安定性を改善する。ＰＳＡは
シアル酸（糖）のポリマーである。タンパク質および治療ペプチド薬物送達に用いられる
場合、ポリシアル酸は、コンジュゲーションにより保護的な微小環境を提供する。これは
循環中の治療タンパク質の活性時間を延長し、免疫系により認識されるのを防ぐ。ＰＳＡ
ポリマーは人体において天然に見出される。これはある種の細菌によって採用されており
、それらの細胞壁を覆うために数百万年にわたって進化させてきた。これらの天然ポリシ
アル化細菌は、分子擬態のおかげで、体の防御システムの追跡を免れることができる。天
然の究極のステルス技術であるＰＳＡは、かかる細菌から大量に、あらかじめ定められた
物理的特徴で容易に産生できる。細菌のＰＳＡは、人体におけるＰＳＡと化学的に同一で
あるため、タンパク質と結合させても、完全に非免疫原性である。
別の技術は抗体に連結したヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）誘導体の使用を含む。
ＨＥＳはロウトウモロコシ(waxy maize)デンプン由来の修飾された天然ポリマーであり、
体の酵素により代謝できる。ＨＥＳ溶液は通常、不充分な血液量を代替し、血液のレオロ
ジー特性を改善するために投与される。抗体のＨＥＳ化は、分子の安定性の上昇により、
ならびに腎クリアランスの低下によって循環半減期の延長を可能とし、増加した生物学的
活性をもたらす。ＨＥＳの分子量などの様々なパラメーターを変化させることにより、広
範なＨＥＳ抗体コンジュゲートを設計できる。
インビボでの延長された半減期を有する抗体は、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのＦｃＲ
ｎ結合断片（好ましくはＦｃまたはヒンジＦｃドメイン断片）に、一以上のアミノ酸修飾
（すなわち置換、挿入または欠失）を導入して生成してもよい。例えば国際公開第９８／
２３２８９号；同第９７／３４６３１号；および米国特許第６，２７７，３７５号を参照
されたい。
さらに、インビボでより安定であるかまたはインビボでより延長された半減期を有する
抗体または抗体断片を作成するために、抗体をアルブミンとコンジュゲートさせてもよい
。本技術は当該技術分野でよく知られており、例えば国際公開第９３／１５１９９号、同
第９３／１５２００号および同第０１／７７１３７号；ならびに欧州特許４１３，６２２
を参照されたい。
ＨＥＲ３抗体またはそれらの断片はまた、１つ以上のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ポ
リペプチドまたはその部分に融合され得る。成熟形態において５８５個のアミノ酸のタン
パク質であるＨＳＡは、血清の浸透圧の有意な割合の原因であり、内因性および外因性リ
ガンドの担体としても機能する。担体分子としてのアルブミンの役割およびその不活性性
質は、インビボでポリペプチドの担体およびトランスポーターとしての使用のために望ま
しい特性である。種々のタンパク質のための担体としてのアルブミン融合タンパク質の成
分としてのアルブミンの使用は、ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００およびＥ
Ｐ４１３６２２に提案されている。ポリペプチドへの融合のためのＨＳＡのＮ−末端断片
の使用はまた、提案されている（ＥＰ３９９６６６）。したがって、遺伝的または化学的
融合または複合体化により、アルブミンに対する抗体またはそれらの断片は、安定化する
、または保存可能期間を延長する、および／または溶液中で、インビトロでおよび／また
はインビボで長期間、分子の活性を保持することができる。
別のタンパク質へのアルブミンの融合は、ＨＳＡをコードするＤＮＡまたはそれらの断
片がタンパク質をコードするＤＮＡに連結されるように、遺伝子操作により成し遂げられ
得る。次に、適当な宿主は、融合ポリペプチドを発現するように適当なプラスミド上に配
列されるように、融合ヌクレオチド配列で形質転換またはでトランスフェクトされる。発
現は、例えば、原核生物または真核細胞からインビトロ、または、例えば、トランスジェ
ニック生物からインビボでもたらされ得る。ＨＳＡ融合に属するさらなる方法は、例えば
、出典明示により本明細書に包含させるＷＯ２００１０７７１３７およびＷＯ２００３０
６００７において見出すことができる。特定の態様において、融合タンパク質の発現は、
哺乳動物細胞系、例えば、ＣＨＯ細胞系において行われる。低または高ｐＨでの抗体の受
容体への改変された異なる結合はまた、本発明の範囲内であると考えられる。例えば、抗
体の親和性は、低ｐＨ、例えば、リソソーム(lyzozome)内の低ｐＨで受容体への結合を維
持するように、抗体のＣＤＲ内のさらなるアミノ酸、例えば、ヒスチジンを含むように抗
体を修飾することにより、修飾され得る（例えば、Tomoyuki Igawaら (2010) Nature Bio
technology; 28, 1203-1207参照）。
抗体結合体(Antibody Conjugates)
本発明は、異種(heterologous)タンパク質またはポリペプチド（またはそれらの、好ま
しくは少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも
５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０または少なく
とも１００アミノ酸の断片）に組換え技術によって融合された、または化学的に結合(con
jugate)され（共有および非共有の結合を含む）て融合タンパク質を生成するＨＥＲ３タ
ンパク質に特異的に結合する抗体またはそれらの断片を提供する。特に、本発明は、ここ
に記載される抗体の断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片
、ＶＨドメイン、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬドメインまたはＶＬ ＣＤＲ）、および異種タンパ
ク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む融合タンパク質を提供する。タンパク質、ポリ
ペプチドまたはペプチドを融合または結合するための方法は、当業者に公知である。例え
ば、米国特許番号５，３３６，６０３号、５，６２２，９２９号、５，３５９，０４６号
、５，３４９，０５３号、５，４４７，８５１号、および５，１１２，９４６号明細書；
欧州特許番号ＥＰ３０７，４３４号およびＥＰ３６７，１６６号明細書；国際公開番号Ｗ
Ｏ９６／０４３８８およびＷＯ９１／０６５７０号公報；Ashkenaziら (1991) Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 88:10535-10539; Zhengら (1995) J. Immunol. 154:5590-5600;およ
びVilら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341を参照のこと。
追加の融合タンパク質は遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング(motif-shuff
ling)、エクソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（まとめて「Ｄ
ＮＡシャッフリング」と呼ばれる）の技術を経て生成されてもよい。ＤＮＡシャッフリン
グは、発明の抗体またはそれらの断片（例えば、高い親和性および低い解離速度の抗体ま
たはそれらの断片）の活性を改変するために用いられ得る。一般に、米国特許番号５，６
０５，７９３号；５，８１１，２３８号；５，８３０，７２１号；５，８３４，２５２号
；および５，８３７，４５８号；Pattenら (1997) Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33
;Harayama, (1998) Trends Biotechnol. 16(2):76-82;Hanssonら (1999) J. Mol. Biol.
287:265-76;およびLorenzo and Blasco, (1998) Biotechniques 24(2):308-313を参照（
各々の特許および出版物はその全体が出展明示として本明細書に組み込まれる）。抗体ま
たはそれらの断片、またはコード化抗体またはそれらの断片は、組換の前にエラープロー
ンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法によってランダム変異導入に供され
て改変され得る。ＨＥＲ３タンパク質に特異的に結合する抗体またはそれらの断片をコー
ドするポリヌクレオチドは、１個以上の異種分子の、１個以上の成分、モチーフ、片(sec
tion)、部分(part)、ドメイン、断片等と再結合し得る。
さらに、抗体またはそれらの断片は、精製を促進するペプチドのような、マーカー配列
と融合し得る。好ましい実施形態において、マーカーアミノ酸配列はヘキサ−ヒスチジン
ペプチドであり、多数のものが市販されている中でも、とりわけｐＱＥベクター（QIAGEN
, Inc, 9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311）で提供されるタグのようなものである
。Gentzら, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824に記載のように、例えば、
ヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク質の便利な精製を提供する。精製に有用な他のペプチ
ドタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質（Wilsonら (1984) Cell 37:767）
由来のエピトープに相当するヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ、および「フラッグ(flag)
」タグを含むが、これらに限定されるものではない。
他の実施形態において、本発明の抗体またはそれらの断片は診断または検出剤と結合す
る。このような抗体は、特定の治療の有効度を測定するといった、臨床試験手順の一部と
して、発現、成長、発育および／または疾病もしくは疾患の重症度を監視または予見する
ために有用となり得る。そのような診断および検出は抗体に、西洋ワサビペルオキシダー
ゼ、アルカリフォスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエス
テラーゼなどのような、しかしこれらに限定されない様々な酵素；ストレプトアビジン／
ビオチンおよびアビジン／ビオチンのような、しかしこれらに限定されない補欠分子族；
ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、
ジクロロトリアジニルアミン フルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンな
どのような、しかしこれらに限定されない蛍光物質；ルミノールなどのような、しかしこ
れらに限定されない発光物質；ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンなどのよ
うな、しかしこれらに限定されない生物発光体；ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ
および１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、三重水素（３Ｈ）、インジウム（
１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎおよび１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、
タリウム（２０１Ｔｌ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）
、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、
１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、
４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５
７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、
７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｔｉｎなどのような、しかしこれらに限定されない
放射性物質；および様々な陽電子放射断層撮影に使用する陽電子放出金属、および放射性
でない常磁性金属イオン、などを含むがこれらに限定されない検出可能な物質を組み合わ
せることによって達成できる。
本発明はさらに、治療的部分(therapeutic moiety)と結合した抗体またはそれらの断片
の使用を包含する。抗体またはそれらの断片は、細胞毒素、例えば細胞増殖抑制剤または
細胞破壊剤、治療剤、または放射性金属イオン、例えばアルファ放射体などの治療的部分
、と結合し得る。細胞毒素または細胞毒性薬は細胞に有害ないかなる剤を含む。
さらに、抗体またはそれらの断片は、既知の生物学的応答を変更する治療的部分または
薬物部分(drug moiety)と結合し得る。治療的部分または薬物部分は古典的な化学治療薬
に制限されると解釈されるものではない。例えば、薬物部分は所望の生物活性を有するタ
ンパク質、ペプチドまたはポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質は、例えば、
アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、コレラ毒素、またはジフテリア毒素などの毒素；腫
瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来
成長因子、組織プラスミノゲン活性化因子、アポトーシス剤、血管新生阻害剤などのタン
パク質；または例えばリンフォカインなどの生物反応修飾物質、を含み得る。一の実施形
態において、抗−ＨＥＲ３抗体、またはそれらの断片は、細胞毒素、薬物（例えば免疫抑
制剤）または放射性毒素などの治療的部分と結合する。このような結合体(conjugate)は
本明細書において「免疫結合体(immunoconjugate)」と称する。１つ以上の細胞毒素を含
む免疫結合体は、「免疫毒素(immunotoxin)」と称する。細胞毒素または細胞毒性薬は細
胞に有害（例えば、死滅させる）ないかなる剤を含む。例として、タキソール、サイトカ
ラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、
テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ｔコルヒチン、ドキソルビシン、ダウノ
ルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ジヒドロキシアントラシンジオン(dihydro
xy anthracin dione)、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−
デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン
、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにこれらの類似体または相同体が
含まれる。治療剤にはまた、例えば、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メ
ルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン(5
−fluorouracil decarbazine)）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパク
ロラムブシル(thioepa chlorambucil)、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）および
ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、
ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ
）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダ
ウノマイシン）、及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前の
アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アンスラマイシン（ＡＭＣ）、
ならびに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）も含まれる（
例えば、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＵＳ２００９０３０４７２１参照）。
本発明の抗体と結合できる治療的細胞毒素の他の例として、デュオカルマイシン、カリ
ケアマイシン、メイタンシンおよびアウリスタチン、ならびにこれらの誘導体が含まれる
。カリケアマイシン抗体結合体の一例は、市販される（MylotargTm;Wyeth-Ayerst）。
細胞毒素は当分野で利用できるリンカー技術を用いて、本発明の抗体と結合できる。細
胞毒素を抗体に結合させるために用いられているリンカーの型の例として、ヒドラゾン、
チオエーテル、エステル、ジスルフィドおよびペプチド含有リンカーが挙げられるが、こ
れらに限定されるものではない。リンカーは、例えば、リソソームコンパートメント（ly
sosomal compartment）内で低いｐＨにより開裂されやすい、または、カテプシン（例え
ば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）などの、腫瘍組織で優先的に発現されるプロテアーゼなどの
、プロテアーゼにより開裂されやすい、ものから選ぶことができる。
抗体への治療剤の結合のための細胞毒素の型、リンカーおよび方法のさらなる考察のた
めに、Saitoら (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trailら (2003) Cancer Imm
unol. Immunother. 52:328-337; Payne, (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, (2002)
Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan and Kreitman, (2002) Curr. Opin. Investig. D
rugs 3:1089-1091; Senter and Springer, (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264を
参照のこと。
本発明の抗体はまた、放射性同位体と結合して、放射性免疫結合体とも呼ばれる、細胞
毒性放射性医薬品を生成することができる。診断または治療の用途のために抗体と結合で
きる放射性同位体の例は、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０およびル
テチウム１７７を含むが、これらに限定されるものではない。放射性免疫結合体を調製す
る方法は当分野にて確立されている。放射性免疫結合体の例は商業的に利用可能であり、
Ｚｅｖａｌｉｎ登録商標（DEC Pharmaceuticals）およびＢｅｘｘａｒ登録商標（Corixa
Pharmaceuticals）を含み、さらに類似の方法も本発明の抗体を用いる放射性免疫結合体
の調製のために使用できる。いくらかの実施形態において、大環状キレート剤は、リンカ
ー分子を介して抗体と付着できる１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ
’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。そのようなリンカー分子は当分野に
おいて周知であり、それぞれの全体が出展明示により組み込まれる、Denardoら (1998) C
lin Cancer Res. 4(10):2483-90; Petersonら (1999) Bioconjug. Chem. 10(4):553-7;お
よびZimmermanら (1999) Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50に記載される。
抗体に治療的部分を結合(conjugating)させるための技術は周知であり、例えば、Arnon
ら “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in
Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldら (eds.), pp. 243-56 (Alan R.
Liss, Inc. 1985); Hellstromら “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled D
rug Delivery (2nd Ed.), Robinsonら (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)
; Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”,
in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pincheraら (
eds.), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Th
erapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibo
dies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinら (eds.), pp. 303-16 (Academic Pr
ess 1985)およびThorpeら (1982) Immunol. Rev. 62:119-58を参照のこと。
抗体はまた、特に免疫測定法または標的抗原の精製に有用な固相担体(solid support)
に付着させ得る。このような固相担体はガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ポリ
スチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンを含むが、これらに限定されるものでは
ない。
抗体組合せ
別の局面において、本発明は、他の治療剤、例えば、別の抗体、小分子阻害剤、ｍＴＯ
Ｒ阻害剤またはＰＩ３キナーゼ阻害剤と共に使用される本発明のＨＥＲ３抗体またはその
断片に関する。例は、限定はしないが、以下のものを含む：
ＨＥＲ１阻害剤：ＨＥＲ３抗体またはその断片は、限定はしないが、マツズマブ（EMD7
2000）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）／セツキシマブ（Imclone）、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（
登録商標）／パニツムマブ（Amgen）、ｍＡｂ８０６およびニモツズマブ（TheraCIM）、
イレッサ（登録商標）／ゲフィチニブ（Astrazeneca）；ＣＩ−１０３３（PD183805）（P
fizer）、ラパチニブ（GW-572016）（GlaxoSmithKline）、Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標）／
トシル酸ラパチニブ（SmithKlineBeecham）、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）／エルロチニ
ブＨＣＬ（OSI-774）（OSI Pharma）およびＰＫＩ−１６６（Novartis）およびＢｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍにより商標Ｔｏｖｏｋ（登録商標）の下に販売されて
いるＮ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［［（３’’Ｓ
’’）−テトラヒドロ−３−フラニル］オキシ］−６−キナゾリニル］−４（ジメチルア
ミノ）−２−ブテンアミドを含むＨＥＲ１阻害剤と共に使用することができる。
ＨＥＲ２阻害剤：ＨＥＲ３抗体またはその断片は、限定はしないが、ペルツズマブ（Ｇ
ｅｎｅｎｔｅｃｈにより商標Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）の下に販売されている）、ト
ラスツマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＲｏｃｈｅによりＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の
下に販売されている）、ＭＭ−１１１、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２としても知られてい
る、（２Ｅ）−Ｎ−［４−［［３−クロロ−４−［（ピリジン−２−イル）メトキシ］フ
ェニル］アミノ］−３−シアノ−７−エトキシキノリン−６−イル］−４−（ジメチルア
ミノ）ブタ−２−エナミド、およびＰＣＴ公開ＷＯ０５／０２８４４３に記載されている
）、トシル酸ラパチニブまたはラパチニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅにより商標
Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標）の下に販売されている）を含むＨＥＲ２阻害剤と共に使用する
ことができる。
ＨＥＲ３阻害剤：ＨＥＲ３抗体またはその断片は、限定はしないが、ＭＭ−１２１、Ｍ
Ｍ−１１１、ＩＢ４Ｃ３、２ＤＩＤ１２（U3 Pharma AG）、ＡＭＧ８８８（Amgen）、Ａ
Ｖ−２０３（Aveo）、ＭＥＨＤ７９４５Ａ（Genentech）およびＨＥＲ３を阻害する小分
子を含むＨＥＲ３阻害剤と共に使用することができる。
ＨＥＲ４阻害剤：ＨＥＲ３抗体またはその断片は、ＨＥＲ４阻害剤と共に使用すること
ができる。
ＰＩ３Ｋ阻害剤：ＨＥＲ３抗体またはその断片は、限定はしないが、４−［２−（１Ｈ
−インダゾール−４−イル）−６−［［４−（メチルスルホニル）ピペラジン−１−イル
］メチル］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−イル］モルホリン（ＧＤＣ０９４１と
しても知られている、ＰＣＴ公開第ＷＯ０９／０３６０８２およびＷＯ０９／０５５７３
０に記載されている）、２−メチル−２−［４−［３−メチル−２−オキソ−８−（キノ
リン−３−イル）−２，３−ジヒドロイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］フェ
ニル］プロピオニトリル（ＢＥＺ２３５またはＮＶＰ−ＢＥＺ２３５としても知られてい
る、およびＰＣＴ公開ＷＯ０６／１２２８０６に記載されている）、ＢＭＫ１２０および
ＢＹＬ７１９を含むＰＩ３キナーゼ阻害剤と共に使用することができる。
ｍＴＯＲ阻害剤：ＨＥＲ３抗体またはその断片は、限定はしないが、テムシロリムス（
Ｐｆｉｚｅｒにより商標Ｔｏｒｉｓｅｌ（登録商標）の下に販売されている）、リダフォ
ロリムス（形式的にデフェロリムス(deferolimus)として知られている、（１Ｒ，２Ｒ，
４Ｓ）−４−［（２Ｒ）−２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ
，２１Ｒ、２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジ
ヒドロキシ−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３、２９，３５−ヘキサメ
チル−２，３，１０，１４，２０−ペンタオキソ−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリ
シクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テト
ラエン−１２−イル］プロピル］−２−メトキシシクロヘキシル ジメチルホスフィナー
ト、デフォロリムス、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９（Ariad Pharm.）としても知ら
れている、およびＰＣＴ公開ＷＯ０３／０６４３８３に記載されている）、エバロリムス
（RAD001）（Ｎｏｖａｒｔｉｓにより商標Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）の下に販売され
ている）、本発明のＨＥＲ３抗体またはその断片の投与と同時、投与前または投与後のい
ずれかで投与され得る１つ以上の治療剤を含むｍＴＯＲ阻害剤と共に使用することができ
る。
本発明の抗体の作成方法
（ｉ）抗体をコードする核酸
本発明は、上記ＨＥＲ３結合抗体鎖のセグメントまたはドメインを含むポリペプチドを
コードする実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明の核酸のいくつかは、ＨＥＲ
３抗体重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、および／または軽鎖可変領域をコー
ドするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、核酸分子は、表１に同定され
たものである。他の本発明の核酸分子のいくつかは、表１に同定されたもののヌクレオチ
ド配列と実質的に（例えば、少なくとも６５、８０％、９５％または９９％）同一である
ヌクレオチド配列を含む。適切な発現ベクターから発現される場合、これらのポリヌクレ
オチドによってコードされるポリペプチドは、ＨＥＲ３抗原結合能を示しうる。
上記ＨＥＲ３結合抗体の重鎖または軽鎖由来の少なくとも１個のＣＤＲ領域、および通
常３個全てのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドも、本発明において提供される。
他のポリヌクレオチドのいくつかは、上記ＨＥＲ３結合抗体の重鎖および／または軽鎖の
可変領域の全てまたは実質的に全てをコードする。コードの縮重のため、多様な核酸配列
が各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードする。
本発明の核酸分子は、抗体の可変領域および定常領域の両方をコードし得る。本発明の
核酸配列のいくつかは、表１に記載されているＨＥＲ３抗体の成熟重鎖可変領域配列と実
質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％または９９％）同一の成熟重鎖可変領域配列
をコードするヌクレオチドを含む。他の核酸配列のいくつかは、表１に記載されているＨ
ＥＲ３抗体の成熟軽鎖可変領域配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％また
は９９％）同一の成熟軽鎖可変領域配列をコードするヌクレオチドを含む。
ポリヌクレオチド配列は、新たな(de novo)固相ＤＮＡ合成またはＨＥＲ３結合抗体ま
たはその結合断片をコードする既存の配列（例えば下記実施例に記載の配列）のＰＣＲ変
異導入法によって作成できる。核酸の直接化学合成は、当分野で既知の、Narangら 1979,
Meth. Enzymol. 68:90のホスホトリエステル法；Brownら Meth. Enzymol. 68:109, 1979
のホスホジエステル法；Beaucageら Tetra. Lett., 22:1859, 1981のジエチルホスホラミ
ダイト法；および米国特許４，４５８，０６６の固相担体法などの方法によって実施でき
る。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への変異の導入は、例えば、PCR Technology: Pr
inciples and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Pres
s, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innisら (Ed
.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattilaら(1991) Nucleic Acids Res. 19:9
67;およびEckertら(1991) PCR Methods and Applications 1:17に記載のとおりに実施で
きる。
上記ＨＥＲ３結合抗体を製造するための発現ベクターおよび宿主細胞も本発明において
提供される。ＨＥＲ３結合抗体鎖または結合断片をコードするポリヌクレオチドを発現す
るため、多様な発現ベクターが使用できる。ウイルス性および非ウイルス性発現ベクター
のどちらも、哺乳類宿主細胞において抗体を製造するために使用することができる。非ウ
イルス性ベクターおよび系は、プラスミド、典型的にはタンパク質もしくはＲＮＡを発現
するための発現カセットを有する、エピソームベクターおよびヒト人工染色体（例えば、
Harringtonら Nat Genet 15:345, 1997を参照）を含む。例えば、ＨＥＲ３結合ポリヌク
レオチドおよびポリペプチドの哺乳類（例えばヒト）細胞での発現に有用な非ウイルス性
ベクターは、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、Ｂ＆Ｃ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉ
ｓ Ａ、Ｂ＆Ｃ、（Invitrogen, San Diego, CA）、ＭＰＳＶベクターおよび他のタンパ
ク質を発現するために当分野で既知の多様な他のベクターを含む。有用なウイルス性ベク
ターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、Ｓ
Ｖ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰ Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウイ
ルス、ワクシニアウイルスベクターおよびＳｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔウイルス（ＳＦ
Ｖ）を含む。Brentら(1995) supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807;およびRosen
feldら(1992) Cell 68:143参照。
発現ベクターの選択は、ベクターが発現される、意図する宿主細胞に依存する。典型的
には、発現ベクターは、ＨＥＲ３結合抗体鎖または断片をコードするポリヌクレオチドと
作動可能に連結しているプロモーターおよび他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含
む。いくつかの態様において、誘導性プロモーターを用いて、誘導条件下以外での挿入配
列の発現を防止する。誘導性プロモーターは、例えばアラビノース、ｌａｃＺ、メタロチ
オネインプロモーターまたは熱ショックプロモーターを含む。形質転換された生物の培養
は、発現産物が宿主細胞によってより耐容性である配列をコードするために集団に圧力を
加えることなしに、非誘導性条件下で拡大されうる。プロモーターに加えて、ＨＥＲ３結
合抗体鎖または断片の効果的な発現のために、他の調節要素も要求または所望される。こ
れらの要素は典型的には、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接リボソーム結合部位または他の配
列を含む。加えて、発現の効率は、使用する細胞系に適切なエンハンサーを含めることで
向上し得る（例えば、Scharfら(1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125,;およびBit
tnerら(1987) Meth. Enzymol., 153:516を参照）。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたは
ＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳類宿主細胞における発現を増加させ得る。
発現ベクターは、挿入されたＨＥＲ３結合抗体配列によってコードされるポリペプチド
との融合タンパク質を形成する挿入シグナル配列位置も提供し得る。非常に多くの場合、
挿入されたＨＥＲ３結合抗体配列は、ベクターに含まれる前にシグナル配列と連結される
。ＨＥＲ３結合抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする配列を受け取るために使用
されるベクターは、定常領域またはそれらの一部をコードする場合もある。このようなベ
クターは定常領域を有する融合タンパク質として可変領域の発現が可能であり、それによ
り無傷の(intact)抗体またはそれらの断片の製造を導く。典型的には、かかる定常領域は
ヒトである。
ＨＥＲ３結合抗体鎖を有し、そして発現する宿主細胞は、原核または真核細胞であって
よい。大腸菌は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングおよび発現するのに有用な原
核宿主の一つである。使用に適した他の微生物宿主は、枯草菌(Bacillus subtilis)など
の桿菌、およびサルモネラ属(Salmonella)、セラチア属(Serratia)および多様なシュード
モナス属(Pseudomonas)などの他の腸内細菌、を含む。これらの原核宿主において、典型
的には宿主細胞に適合性の発現調節配列（例えば複製起点）を含む発現ベクターも作成で
きる。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、
ベータ−ラクタマーゼプロモーター系またはファージラムダ由来のプロモーター系などの
、任意の数の多様な周知のプロモーターが存在している。典型的には、プロモーターは、
任意にはオペレーター配列で、発現を制御し、転写および翻訳を開始し完了するためのリ
ボソーム結合部位などを有する。酵母のような他の微生物もまた、本発明のＨＥＲ３結合
ポリペプチドを発現するために使用できる。バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆
虫細胞も使用できる。
いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＨＥＲ３結合抗体を発現、製造するた
めに、哺乳類宿主細胞が使用される。例えば、それは内因性免疫グロブリン遺伝子を発現
するハイブリドーマ細胞系（例えば、実施例に記載の１Ｄ６．Ｃ９骨髄腫ハイブリドーマ
クローン）または外因性発現ベクターを有する哺乳類細胞系（例えば、以下に例示するＳ
Ｐ２／０骨髄腫細胞）であってよい。これらはあらゆる通常の死に至るものかあるいは通
常もしくは異常な不死動物またはヒト細胞系を含む。例えば、ＣＨＯ細胞系、多様なＣｏ
ｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマを含む、
無傷な免疫グロブリンを分泌できる多数の好適な宿主細胞系が開発されている。ポリペプ
チドを発現するための哺乳類組織細胞培養の使用は、一般に、例えば、Winnacker, FROM
GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987に記載されている。哺乳類宿主細
胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーターおよびエンハンサー（例えば、Quee
nら Immunol. Rev. 89:49-68, 1986を参照）などの発現制御配列ならびにリボソーム結合
部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位および転写終止配列などの必要な
プロセッシング情報部位を含み得る。これらの発現ベクターは、通常、哺乳類遺伝子また
は哺乳類ウイルス由来のプロモーターを含む。好適なプロモーターは、構造性、細胞型特
異的、発生段階特異的(stage-specific)、および／または調節可能もしくは制御可能であ
り得る。有用なプロモーターは、メタロチオネインプロモーター、構造性アデノウイルス
後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター
、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構造性ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン
誘導性ＣＭＶプロモーター（例えばヒト初期ＣＭＶプロモーター）、構造性ＣＭＶプロモ
ーターおよび当分野で既知のプロモーターとエンハンサーの組合せを含むが、これらに限
定されない。
目的のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主の型に依
存して変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは一般に、原核細胞につ
いて利用されるが、一方で、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションは他の
細胞宿主に使用できる（一般に、Sambrookら supraを参照）。他の方法は、例えば、エレ
クトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム介在形質転換、インジェクショ
ンおよびマイクロインジェクション、弾道法、ビロソーム、免疫リポソーム、ポリカチオ
ン：核酸複合体、裸ＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２と
の融合体（Elliot and O’Hare, Cell 88:223, 1997）、ＤＮＡの薬剤向上取り込みおよ
びエクスビボ形質導入を含む。組換えタンパク質の長期間高収率生産のために、安定な発
現がしばしば所望される。例えば、ＨＥＲ３結合抗体鎖または結合断片を安定的に発現す
る細胞系は、ウイルス性複製起点または内因性発現要素および選択可能なマーカー遺伝子
を含む本発明の発現ベクターを用いて製造できる。ベクターの導入後、富化培地中で細胞
を１〜２日間増殖させた後、選択培地に移す。選択可能なマーカーの目的は、選択に対す
る耐性を与えることであり、その存在が選択培地中で導入した配列の発現に成功している
細胞の増殖を可能とする。耐性で、安定な、トランスフェクトされた細胞は、細胞型に適
切な組織培養技術を用いて増殖できる。
（ｉｉ）本発明のモノクローナル抗体の生成
モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、慣用的なモノクローナル抗体方法論、例えば、Ko
hler and Milstein, 1975 Nature 256: 495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技
術を含む多様な技術によって作成できる。モノクローナル抗体を作成するための多くの技
術、例えば、Ｂリンパ球のウイルス性または発がん性遺伝子による形質転換が使用できる
。
ハイブリドーマを調製するための動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリ
ドーマ作成は、十分に確立された方法である。融合体についての免疫化プロトコールおよ
び免疫した脾細胞の単離のための技術は、当分野で既知である。融合パートナー（例えば
マウス骨髄腫細胞）および融合手法も既知である。
本発明のキメラまたはヒト化抗体は、上記のとおりに調製したマウスモノクローナル抗
体の配列に基づいて調製できる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、
目的のマウスハイブリドーマから得られ、非マウス（例えばヒト）免疫グロブリン配列を
含むように、標準的な分子生物学の技術を用いて操作できる。例えばキメラ抗体を作成す
るために、当分野で既知の方法を用いて、マウス可変領域をヒト定常領域と連結させるこ
とができる（例えば、Cabilly et al.の米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。ヒト
化抗体を作成するために、当分野で既知の方法を用いて、マウスＣＤＲ領域をヒトフレー
ムワークに挿入できる。例えば、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５２２５５３９号およびＱｕ
ｅｅｎらの米国特許５５３０１０１；５５８５０８９；５６９３７６２および６１８０３
７０を参照。
いくらかの実施形態において、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。このよ
うな、ＨＥＲ３に対するヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりもヒト免疫系の一部を
担持するトランスジェニックまたはトランスクロモソームマウスを用いて生成できる。こ
れらのトランスジェニックおよびトランスクロモソームマウスは、それぞれＨｕＭＡｂマ
ウスおよびＫＭマウスと本明細書において称するマウスを含み、集合的に、「ヒトＩｇマ
ウス」と称する。
ＨｕＭＡｂマウス登録商標（Medarex, Inc.）は、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活
性化する標的変異と共に、再配列されていないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫
グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子小座を含む（例えば、Lonbergら
(1994) Nature 368(6474): 856-859参照）。したがって、マウスはマウスＩｇＭまたはκ
の低下した発現を示し、免疫化に応答して、導入したヒト重鎖および軽鎖トランスジーン
がクラススイッチおよび体細胞変異を起こして、高い親和性のヒトＩｇＧκモノクローナ
ルを作成する（Lonbergら (1994) supra; reviewed in Lonberg, (1994) Handbook of Ex
perimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg and Huszar, (1995) Intern. Rev. Immu
nol.13: 65-93、およびHarding and Lonberg, (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-5
46）。ＨｕＭＡｂマウスの作成および使用ならびにこのようなマウスによって担持される
ゲノム修飾は、出展明示により全体が本明細書に組み込まれる、Taylorら (1992) Nuclei
c Acids Research 20:6287-6295; Chenら (1993) International Immunology 5: 647-656
; Tuaillonら (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choiら (1993) Natur
e Genetics 4:117-123; Chenら (1993) EMBO J. 12:821-830; Tuaillonら (1994) J. Imm
unol. 152:2912-2920; Taylorら (1994) International Immunology 579-591;およびFish
wildら (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851にさらに記載される。さらに、Ｌｏｎ
ｂｅｒｇおよびＫａｙの米国特許第５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２
５，１２６；５，６３３，４２５；５，７８９，６５０；５，８７７，３９７；５，６６
１，０１６；５，８１４，３１８；５，８７４，２９９；および５，７７０，４２９号、
Ｓｕｒａｎｉらの米国特許第５，５４５，８０７号、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙのＰＣ
Ｔ公開ＷＯ９２１０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７
１１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ９９／４５９６２およびＫｏｒｍａｎら
のＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４参照。
他の実施形態において、本発明のヒト抗体は、ヒト重鎖トランスジーンおよびヒト軽鎖
トランスクロモソームを担持するマウスのようなトランスジーンおよびトランスクロモソ
ーム上にヒト免疫グロブリン配列を担持するマウスを用いて、産生できる。このようなマ
ウスは、本明細書において「ＫＭマウス」と称し、ＩｓｈｉｄａらのＰＣＴ公開ＷＯ０２
／４３４７８に詳細に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスジェニック動物系が当分野
で利用可能であり、本発明のＨＥＲ３結合抗体の産生に使用できる。例えば、Ｘｅｎｏｍ
ｏｕｓｅ（Abgenix, Inc.）と称される別のトランスジェニック系が使用できる。このよ
うなマウスは、例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらの米国特許第５，９３９，５９８；６
，０７５，１８１；６，１１４，５９８；６，１５０，５８４および６，１６２，９６３
号に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスクロモソーム動物系が当分
野で利用可能であり、本発明のＨＥＲ３結合抗体の産生に使用できる。例えば、「ＴＣマ
ウス」と称されるヒト重鎖トランスクロモソームおよびヒト軽鎖トランスクロモソームの
両方を担持するマウスが使用でき；このようなマウスはTomizukaら (2000) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 97:722-727に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランスク
ロモソームを担持するウシが当分野で既知であり（Kuroiwaら (2002) Nature Biotechnol
ogy 20:889-894）、本発明のＨＥＲ３結合抗体の産生に使用できる。
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のスクリーニングライ
ブラリーのファージディスプレイ法を用いて調製してもよい。ヒト抗体を単離するための
このようなファージディスプレイ法は、当分野で確立されており、下記実施例に記載され
ている。例えば、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第５，２２３，４０９；５，４０３，４８４
および５，５７１，６９８号；Ｄｏｗｅｒらの米国特許第５，４２７，９０８および５，
５８０，７１７号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらの米国特許第５，９６９，１０８および６，
１７２，１９７号；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓらの米国特許第５，８８５，７９３；６，５２１
，４０４；６，５４４，７３１；６，５５５，３１３；６，５８２，９１５および６，５
９３，０８１参照。
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト抗体応答が免疫化によって発生され得る
ようにヒト免疫細胞が再構築されているＳＣＩＤマウスを用いて調製できる。このような
マウスは、例えばＷｉｌｓｏｎらの米国特許第５，４７６，９９６および５，６９８，７
６７号に記載されている。
（ｉｉｉ）フレームワークまたはＦｃ操作
操作された本発明の抗体は、例えば抗体の特性を改善するために、ＶＨおよび／または
ＶＬ内のフレームワーク残基に修飾が施されているものを含む。典型的には、このような
フレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば一つのアプ
ローチは、１個以上のフレームワーク残基を対応する生殖系配列(germline sequence)に
「復帰変異(back mutation)」することである。より具体的には、体細胞変異を起こした
抗体が、その抗体から由来する生殖系配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。こ
のような残基は、抗体フレームワーク配列と抗体に由来する生殖系配列を比較することで
同定できる。フレームワーク領域配列をその生殖系配置に戻すため、体細胞変異は、例え
ば部位特異的変異誘発による生殖系配列への「復帰変異」であり得る。このような「復帰
変異」された抗体も、本発明に含まれる。
他の型のフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去するための、フレームワーク
領域内または１個以上のＣＤＲ領域内の１以上の残基での突然変異を含み、それによって
抗体の潜在的な免疫原性を低下させる。このアプローチは「脱免疫化(deimmunization)」
とも称され、Ｃａｒｒらの米国特許公開２００３０１５３０４３号により詳細に記載され
ている。
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で行われる修飾に加えてまたはそれとは別に、本発
明の抗体は、典型的には、血清半減期、補体結合、Ｆｃレセプター結合および／または抗
原依存的細胞毒性などの、抗体の１個以上の機能的特徴を変化させるための、Ｆｃ領域内
の修飾を含むように操作し得る。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾（例えば、１個
以上の化学的部分を抗体に付着させることができる）させるかまたはその糖鎖形成を変化
させ、再度抗体の１個以上の機能的特徴を変化させるために、修飾し得る。これらの実施
形態の各々については以下にさらに詳細に記載する。Ｆｃ領域での残基の番号は、Ｋａｂ
ａｔのＥＵ指数によるものである。
１つの実施形態において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域内のシステイン残基数が
変化、例えば増加または減少するように修飾される。このアプローチはＢｏｄｍｅｒらの
米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシス
テイン残基数を変化させて、例えば、軽鎖と重鎖の会合を促進し、あるいは抗体の安定性
を上昇または低下させる。
別の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域を変異して、該抗体の生物学的半減期を
減少させる。さらに具体的には、１個以上のアミノ酸変異は、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２
−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入され、それにより、抗体が天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳ
ｐＡ結合と比較して改善されたブドウ球菌タンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合を有する。このア
プローチは、Ｗａｒｄらの米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に記載されてい
る。
さらに他の実施形態において、少なくとも１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で
置換してＦｃ領域を変化させて、抗体のエフェクター機能を変化させる。例えば、１個以
上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置換して、抗体がエフェクターリガンドについて変
化した親和性を有するが親抗体の抗原結合能を保持するようにできる。親和性が変化され
たエフェクターリガンドは、例えばＦｃレセプターまたは補体のＣ１成分であり得る。こ
のアプローチは、Ｗｉｎｔｅｒらの米国特許第５，６２４，８２１および５，６４８，２
６０号にさらに詳細に記載されている。
別の実施形態において、アミノ酸残基から選択される１個以上のアミノ酸は、抗体が変
化したＣ１ｑ結合および／または低下もしくは消滅した補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣ）
を有するように、異なるアミノ酸残基で置換され得る。このアプローチはＩｄｕｓｏｇｉ
ｅらの米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載されている。
別の実施形態において、１個以上のアミノ酸残基が変化させて、それにより抗体の補体
を固定化する能力を変化させる。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒ ｅｔ ａｌ．のＰＣ
Ｔ公開ＷＯ９４／２９３５１にさらに詳細に記載されている。
さらに別の実施形態において、Ｆｃ領域は、１個以上のアミノ酸を修飾することにより
修飾して、抗体の抗体依存的細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を仲介する能力を向上しおよび／ま
たはＦｃγレセプターに対する抗体の親和性を向上させる。このアプローチはＰｒｅｓｔ
ａのＰＣＴ公開ＷＯ００／４２０７２にさらに詳細に記載されている。さらに、ＦｃγＲ
ｌ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位が
マッピングされており、改善された結合を有する変異体が記載されている（Shields, R.L
.ら (2001)J. Biol. Chen. 276:6591-6604）。
さらに別の実施形態において、抗体のグリコシル化を修飾させる。例えば、非グリコシ
ル化抗体を作成する（すなわち抗体がグリコシル化を欠く）ことができる。グリコシル化
は、例えば抗体の「抗原」に対する親和性を上昇させるために、変化され得る。このよう
な炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１個以上のグリコシル化部位を変化することに
よって実施できる。例えば、１個以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の削除
をもたらし、それによってこの部位でのグリコシル化を削除する、１個以上のアミノ酸置
換が行われ得る。このような非グリコシル化は、抗体の抗原に対する親和性を上昇させ得
る。このようなアプローチは、Ｃｏらの米国特許第５，７１４，３５０および６，３５０
，８６１号にさらに詳細に記載されている。
さらにまたはあるいは、フコシル残基の量が減少している低フコシル化抗体または増加
した二分ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体などの、グリコシル化の型が変化した抗体を作成
できる。このような変化したグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能を増加すること
が示されている。このような炭水化物修飾は、例えば、変化されたグリコシル化機構を有
する宿主細胞において抗体を発現することによって、達成できる。変化されたグリコシル
化機構を有する細胞は、当分野において記載されており、本発明の組換え抗体を発現し、
それによって変化したグリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として使用できる。
例えば、ＨａｎｇらのＥＰ１，１７６，１９５は、細胞系で発現される抗体が低フコシル
化を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破
壊されている細胞系を記載する。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５
は、Ａｓｎ（２９７）結合糖にフコースを結合させる能力が低下し、また宿主細胞におい
て発現される抗体の低フコシル化をもたらすＣＨＯ細胞系変異体であるＬｅｃｌ３細胞を
記載する（Shields, R.L.ら (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740参照）。Ｕｍａｎ
ａらによるＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２は、細胞系で発現される抗体が増加した二分
(bisecting)ＧｌｃＮａｃ構造を示し、抗体の増加したＡＤＣＣ活性をもたらすように、
糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えばベータ（１，４））−Ｎアセチ
ルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎｔＩＩＩ））を発現するように操作さ
れた細胞系を記載する（Umanaら 1999 Nat. Biotech. 17:176-180も参照）。
別の実施形態において、抗体を修飾してその生物学的半減期を上昇させる。多様なアプ
ローチが可能である。例えば、Ｗａｒｄの米国特許第６，２７７，３７５号に記載のとお
り、下記変異の１つ以上を導入できる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは
、生物学的半減期を上昇させるために、Ｐｒｅｓｔａらの米国特許第５，８６９，０４６
および６，１２１，０２２号に記載のとおり、ＣＨ１またはＣＬ領域内で抗体を変化させ
て、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２個のループから得たサルベージレセプター結
合エピトープを含める。
（ｉｖ）改変された抗体を操作する方法
上記のとおり、本明細書に示すＶＨおよびＶＬ配列または全長重鎖および軽鎖配列を有
するＨＥＲ３結合抗体を用いて、全長重鎖および／または軽鎖配列、ＶＨおよび／または
ＶＬ配列、またはそれに結合した定常領域を修飾して、新たなＨＥＲ３結合抗体を作成で
きる。したがって、本発明の他の態様において、本発明のＨＥＲ３結合抗体の構造的特徴
を用いて、ヒトＨＥＲ３との結合およびＨＥＲ３の１個以上の機能的特徴の阻害などの、
本発明の抗体の少なくとも１個の機能的特徴を保持する、構造的に関連したＨＥＲ３結合
抗体を作成する。例えば、本発明の抗体またはその変異体の１個以上のＣＤＲ領域を既知
のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組換え的に結合して、上記のとおり、
本発明のさらなる組換え操作されたＨＥＲ３結合抗体を作成できる。他の型の修飾は、前
節に記載のものを含む。操作方法の出発物質は、本明細書で提供されるＶＨおよび／また
はＶＬ配列の１個以上またはそのＣＤＲ配列の１個以上である。操作された抗体を作成す
るためには、本明細書で提供されるＶＨおよび／またはＶＬ配列の１個以上またはそのＣ
ＤＲ配列の１個以上を有する抗体を実際に作成する（すなわちタンパク質として発現する
）必要はない。むしろ、配列に含まれる情報を出発物質として用いて、元の配列に由来す
る「第二世代」配列を作成し、当該「第二世代」配列が調製され、タンパク質として発現
される。
したがって、他の実施形態において、本発明は、配列番号：２、８、２０、２６、３８
、４４、５６、６２、７４、８０、９２、９８、１１０、１１６、１２８、１３４、１４
６、１５２、１６４、１７０、１８２、１８８、２００、２０６、２１８、２２４、２３
６、２４２、２５４、２６０、２７２、２７８、２９０、２９６、３０８、３１４、３２
６、３３２、３４４、３５０、３６２および３６８からなる群から選択されるＣＤＲ１配
列；配列番号：３、９、２１、２７、３９、４５、５７、６３、７５、８１、９３、９９
、１１１、１１７、１２９、１３５、１４７、１５３、１６５、１７１、１８３、１８９
、２０１、２０７、２１９、２２５、２３７、２４３、２５５、２６１、２７３、２７９
、２９１、２９７、３０９、３１５、３２７、３３３、３４５、３５１、３６３および３
６９からなる群から選択されるＣＤＲ２配列；および／または配列番号：４、１０、２２
、２８、４０、４６、５８、６４、７５、８２、９４、１００、１１２、１１８、１３０
、１３６、１４８、１５４、１６６、１７２、１８４、１９０、２０２、２０８、２２０
、２２６、２３８、２４４、２５６、２６２、２７４、２８０、２９２、２９８、３１０
、３１６、３２８、３３４、３４６、３５２、３６４および３７０からなる群から選択さ
れるＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域抗体配列；ならびに配列番号：５、１１、２３、
２９、４１、４７、５９、６５、７７、８３、９５、１０１、１１３、１１９、１３１、
１３７、１４９、１５５、１６７、１７３、１８５、１９１、２０３、２０９、２２１、
２２７、２３９、２４５、２５７、２６３、２７５、２８１、２９３、２９９、３１１、
３１７、３２９、３３５、３４７、３５３、３６５および３７１からなる群から選択され
るＣＤＲ１配列；配列番号：６、１２、２４、３０、４２、４８、６０、６６、７８、８
４、９６、１０２、１１４、１２０、１３２、１３８、１５０、１５６、１６８、１７４
、１８６、１９２、２０４、２１０、２２２、２２８、２４０、２４６、２５８、２６４
、２７６、２８２、２９４、３００、３１２、３１８、３３０、３３６、３４８、３５４
、３６６および３７２からなる群から選択されるＣＤＲ２配列；および／または配列番号
：７、１３、２５、３１、４３、４９、６１、６７、７９、８５、９７、１０３、１１５
、１２１、１３３、１３９、１５１、１５７、１６９、１７５、１８７、１９３、２０５
、２１１、２２３、２２９、２４１、２４７、２５９、２６５、２７７、２８３、２９５
、３０１、３１３、３１９、３３１、３３７、３４９、３５５、３６７および３７３から
なる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域抗体配列からなるＨＥＲ３結合
抗体を作成する方法であって；重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配
列内の少なくとも１個のアミノ酸残基を変化させて、少なくとも１個の変化した抗体配列
を作成し；そして変化した抗体配列をタンパク質として発現させる、方法を提供する。変
化した抗体配列はまた、固定されたＣＤＲ３配列または米国公開ＵＳ２００５０２５５５
５２号に記載の最小必須結合決定部分およびＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列の多様性を有す
る抗体ライブラリーをスクリーニングすることによっても調製できる。スクリーニングは
、ファージディスプレイ技術などの、抗体ライブラリーから抗体をスクリーニングするた
めの適切ないかなるスクリーニング技術に従って、実施できる。
標準的な分子生物学技術を用いて、変化した抗体配列を調製し、発現させることができ
る。変化した抗体配列によってコードされる抗体は、本明細書に記載のＨＥＲ３結合抗体
の１個、数個または全ての機能的特性を保持するものであり、ここで該機能的特性は、ヒ
トおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３との特異的結合；抗体がＨＥＲ３と結合し、ホス
ソ−ＨＥＲアッセイにおけるＨＥＲシグナル伝達活性の阻害によってＨＥＲ３の生物活性
を中和すること、を含むがこれらに限定されない。
変化した抗体の機能的特性は、当分野において利用可能でありそして／または本明細書
に記載の標準的なアッセイ、例えば実施例に記載のもの（例えば、ＥＬＩＳＡ）を用いて
、評価できる。
本発明の抗体を操作する方法のある実施形態において、ＨＥＲ３結合抗体コーディング
配列の全部または一部にわたってランダムにまたは選択的に変異を導入でき、そして得ら
れた修飾ＨＥＲ３結合抗体は、結合活性および／または本明細書に記載の他の機能的特性
についてスクリーニングされ得る。変異方法は当分野において記載されている。例えば、
ＳｈｏｒｔによるＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９２７８０は、飽和変異誘発、合成ライゲーシ
ョンアセンブリまたはそれらの組合せを用いた抗体変異体の作成およびスクリーニング法
を記載する。あるいは、ＬａｚａｒらによるＰＣＴ公開ＷＯ０３／０７４６７９は、抗体
の物理化学的特性を最適化するための計算スクリーニング法を用いる方法を記載する。
本発明の抗体の特徴づけ
本発明の抗体は多様な機能的アッセイによって特徴付けられる。例えば、本明細書に記
載されるホスホ−ＨＥＲアッセイにおけるＨＥＲシグナル伝達の阻害による生物活性を中
和する能力、ＨＥＲ３タンパク質（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３）
との親和性、エピトープ結合、タンパク質分解に対する耐性、およびＨＥＲ３下流シグナ
ル伝達を阻止する能力によって、特徴付けられることができる。様々な方法を用いてＨＥ
Ｒ３−介在シグナル伝達を測定できる。例えば、ＨＥＲシグナル伝達経路は、（ｉ）ホス
ホ−ＨＥＲ３の測定、（ｉｉ）ＨＥＲ３または他の下流シグナル伝達タンパク質（例えば
Ａｋｔ）のリン酸化反応の測定、（ｉｉｉ）本明細書に記載されているリガンド阻害アッ
セイ、（ｉｖ）ヘテロ二量体形成、（ｖ）ＨＥＲ３依存性遺伝子発現サイン、（ｖｉ）受
容体内在化、および（ｖｉｉ）ＨＥＲ３駆動細胞表現型（例えば、増殖）によって監視で
きる。
ＨＥＲ３と結合する抗体の能力は、目的の抗体を直接ラベルして検出でき、あるいは該
抗体はラベルされていなくてもよく、当分野で既知の多様なサンドイッチアッセイ形式を
用いて間接的に検出できる。
いくつかの実施形態において、本発明のＨＥＲ３結合抗体は、参照ＨＥＲ３結合抗体と
ＨＥＲ３ポリペプチドまたはタンパク質の結合を阻止しまたはそれと競合する。これらは
上記完全ヒトＨＥＲ３結合抗体であり得る。これらはまた、参照抗体と同じエピトープと
結合する他のマウス、キメラまたはヒト化ＨＥＲ３結合抗体であってもよい。参照抗体結
合を阻止しまたはそれと競合する能力は、試験下のＨＥＲ３結合抗体が参照抗体によって
定義されるものと同じまたは類似のエピトープと、あるいは参照ＨＥＲ３結合抗体が結合
するエピトープと十分に近接しているエピトープと結合することを示す。このような抗体
は、参照抗体について同定された有利な特性を共有している可能性が特に高い。参照抗体
を阻止しまたはそれと競合する能力は、例えば競合結合アッセイによって測定できる。競
合結合アッセイにより、試験下の抗体は、ＨＥＲ３ポリペプチドまたはタンパク質などの
共通の抗原と参照抗体の特異的結合を阻害する能力について試験される。過剰の試験抗体
が実質的に参照抗体の結合を阻害する場合、試験抗体は抗原との特異的結合について参照
抗体と競合する。実質的阻害は、試験抗体が参照抗体の特異的結合を通常少なくとも１０
％、２５％、５０％、７５％または９０％低下させることを意味する。
ＨＥＲ３タンパク質との結合について、参照ＨＥＲ３結合抗体とＨＥＲ３結合抗体との
競合を評価するために使用できる多数の既知の競合結合アッセイが存在する。例えば、固
相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素イムノアッ
セイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Stahliら(1983) Methods in Enzymology 9
:242-253参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Kirklandら(1986) J. Immunol. 1
37:3614-3619参照）；固相直接標識化アッセイ、固相直接標識化サンドイッチアッセイ（
Harlow & Lane, 上記を参照）；Ｉ−１２５ラベルを用いた固相直接ラベルＲＩＡ（Morel
ら(1988) Molec. Immunol. 25:7-15を参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Cheu
ngら(1990) Virology 176:546-552）；および直接標識化ＲＩＡ（Moldenhauerら(1990) S
cand. J. Immunol. 32:77-82）を含む。典型的には、このようなアッセイは、固体表面と
結合した精製抗体または未標識化試験ＨＥＲ３結合抗体および標識化参照抗体のいずれか
を有する細胞の使用を含む。競合阻害は試験抗体の存在下での固体表面または細胞と結合
したラベルの量を測定して測定される。通常、試験抗体は過剰に存在する。競合アッセイ
によって同定された抗体（競合抗体）は、参照抗体と同じエピトープと結合する抗体およ
び参照抗体が結合するエピトープと立体障害が起こる程度に十分に近接している隣接エピ
トープと結合する抗体を含む。
選択したＨＥＲ３結合モノクローナル抗体が固有のエピトープと結合するかを決定する
ため、商業的に入手可能な試薬（例えば、Pierce, Rockford, ILからの試薬）を用いて各
抗体をビオチニル化できる。未標識モノクローナル抗体およびビオチニル化モノクローナ
ル抗体を用いた競合試験は、ＨＥＲ３ポリペプチド被覆ＥＬＩＳＡプレートを用いて実施
できる。ビオチニル化ＭＡｂ結合は、ストレプ−アビジン−アルカリフォスファターゼプ
ローブで検出できる。精製されたＨＥＲ３結合抗体のアイソタイプを決定するため、アイ
ソタイプＥＬＩＳＡを実施できる。例えば、マイクロタイタープレートのウェルを１μｇ
／ｍｌの抗ヒトＩｇＧで、４℃で一夜被覆できる。１％のＢＳＡでブロックした後、プレ
ートを１μｇ／ｍｌ以下のモノクローナルＨＥＲ３結合抗体または精製したアイソタイプ
コントロールと、周囲温度で１〜２時間反応させる。次いでウェルをヒトＩｇＧ１または
ヒトＩｇＭ特異的アルカリフォスファターゼ複合化プローブと反応できる。次いでプレー
トを現像し、分析して、精製した抗体のアイソタイプを決定できる。
モノクローナルＨＥＲ３結合抗体とＨＥＲ３ポリペプチドを発現する生きた細胞との結
合を示すため、フローサイトメトリーが使用できる。簡潔には、０．１％のＢＳＡおよび
１０％の胎児ウシ血清を含むＰＢＳ中の多様な濃度のＨＥＲ３結合抗体とＨＥＲ３を発現
する細胞系（標準的な成長条件下で増殖する）を混合し、４℃で１時間インキュベートで
きる。洗浄後、細胞を一次抗体染色と同じ条件下でフルオレセイン標識化抗ヒトＩｇＧ抗
体と反応させる。１個の細胞を通過させる光および側面散乱特性を用いるＦＡＣＳｃａｎ
によって試料を分析できる。蛍光顕微鏡を用いる別のアッセイを、フローサイトメトリー
アッセイに加えてまたはそれと代えて使用してもよい。細胞は、上記の通り正確に染色で
き、蛍光顕微鏡で試験できる。この方法は、個々の細胞の可視化が可能であるが、抗原の
密度に依存する感受性が消え得る。
本発明のＨＥＲ３結合抗体はさらに、ウェスタンブロッティングによってＨＥＲ３ポリ
ペプチドまたは抗原性断片との反応性について試験できる。簡潔には、精製したＨＥＲ３
ポリペプチドもしくは融合タンパク質またはＨＥＲ３を発現する細胞由来の細胞抽出物を
調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる
。電気泳動後、分離した抗原をニトロセルロース膜に移し、１０％胎児ウシ血清でブロッ
クし、試験モノクローナル抗体で探索する。ヒトＩｇＧ結合は、抗ヒトＩｇＧアルカリフ
ォスファターゼを用いて検出でき、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠（Sigma Chem. Co., St. Lou
is, MO）で現像できる。
多くの読出し装置を、リガンド誘導ヘテロ二量体形成の細胞ベースのアッセイにおける
ＨＥＲ３抗体の有効性および特異性を評価するために使用することができる。活性は、１
つ以上の以下のものにより評価することができる：
（ｉ）標的細胞系、例えばＭＣＦ−７乳癌細胞における他のＥＧＦファミリーメンバーで
のＨＥＲ２のリガンド誘導ヘテロ二量体化の阻害。細胞溶解物からのＨＥＲ２複合体の免
疫沈降は受容体特異的抗体で行うことができ、複合体内の他のＥＧＦ受容体の非存在／存
在および生物学的に関連するリガンドを、他のＥＧＦ受容体に抗体でプローブすることに
より、以下の電気泳動法／ウエスタントランスファーで分析することができる。
（ｉｉ）リガンド活性化ヘテロ二量体によるシグナル伝達経路の活性化の阻害。ＨＥＲ３
との結合は、受容体のＥＧＦファミリーの他のメンバーに対して重要であり、リガンド結
合後の最大の細胞性応答を誘導するようである。キナーゼ欠損ＨＥＲ３の場合、ＨＥＲ２
は、機能性チロシンキナーゼドメインを提供し、シグナル伝達を可能にし、増殖因子リガ
ンドの結合後に起こる。したがって、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を共発現する細胞は、阻害
剤の非存在および存在下でリガンド、例えばヘレグリンで処理することができ、ＨＥＲ３
チロシンリン酸化の効果は、処理された細胞溶解物からのＨＥＲ３の免疫沈降および次に
抗−ホスホチロシン抗体を使用するウェスタンブロッティングを含む多くの方法によりモ
ニタリングすることができる（詳細のためにAgus op. cit.参照）。あるいは、ハイスル
ープットアッセイは、抗−ＨＥＲ３受容体抗体でコーティングされた９６−ウェルプレー
トのウェル上に溶解された溶解物からＨＥＲ３を捕捉することにより展開することができ
、チロシンリン酸化レベルは、例えば、Waddletonら (2002) Anal. Biochem. 309:150-15
7により具体化されるユーロピウム−標識抗−ホスホチロシン抗体を使用して測定するこ
とができる。
このアプローチのよい広範な拡張において、活性化受容体ヘテロ二量体、例えば、マイ
トージェン−活性タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）およびＡｋｔの下流を活性化させるこ
とが知られているエフェクター分子は、処理された溶解物から免疫沈降し、これらのタン
パク質の活性化形態を検出する抗体でブロットすることにより、または、これらのタンパ
ク質が特異的な基質を修飾／活性化する能力を分析することにより、直接的に分析され得
る。
（ｉｉｉ）リガンド誘導細胞増殖の阻害。種々の細胞系、例えば、多数の乳癌および前立
腺癌細胞系は、ＥｒｂＢ受容体の組合せを共発現することが知られている。アッセイは、
ＤＮＡ合成（トリチウムチミジン取り込み）、細胞数の増加（結晶バイオレット染色）な
どに基づいて読出し装置で２４／４８／９６ウェルフォーマットにおいて行われ得る。
多くの読出し装置は、リガンド非依存性ホモおよびヘテロ二量体形成の細胞ベースのア
ッセイにおいてＨＥＲ３抗体の有効性および特異性を評価するために使用することができ
る。例えば、ＨＥＲ２過剰発現は、キナーゼドメインのリガンド非依存性活性化を引き起
こし、自発的二量体形成を引き起こす。過剰発現されたＨＥＲ２は、ホモ二量体または他
のＨＥＲ分子、例えば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４とのヘテロ二量体のいずれか
を産生する。
抗体またはその断片が腫瘍表現型がＨＥＲ３ヘテロ二量体細胞シグナル伝達のリガンド
活性化に少なくとも部分的に依存することが知られているヒト腫瘍細胞系、例えば、Ｂｘ
ＰＣ３膵臓癌細胞などの腫瘍異種移植片のインビボ増殖をブロックする能力。これは、単
独で、または問題になっている細胞系に対して適当な細胞毒性剤と組み合わせて、免疫不
全マウスにおいて評価することができる。機能アッセイの例はまた、以下の実施例の部に
も記載されている。
予防的および治療的使用
本発明は、有効量の本発明の抗体を必要とする対象に投与することにより、ＨＥＲ３シ
グナル伝達経路と関連する疾患または障害を処置する方法を提供する。特定の態様におい
て、本発明は、有効量の本発明の抗体を必要とする対象に投与することにより、癌（例え
ば、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌
、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮癌、末梢神経鞘腫瘍、神経鞘
腫、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、グリア芽腫、軟組織の明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線
維腫症、腎臓癌および黒色腫）を処置または予防する方法を提供する。いくつかの態様に
おいて、本発明は、有効量の本発明の抗体を必要とする対象に投与することにより、ＨＥ
Ｒシグナル伝達経路と関連する癌を処置または予防する方法を提供する。
特定の態様において、本発明は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝
臓癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上
皮癌、末梢神経鞘腫瘍、神経鞘腫、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、グリア芽腫、軟組織の明
細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎臓癌および黒色腫を含むがこれらに限定されな
い、ＨＥＲシグナル伝達経路に関連する癌の治療の方法を提供する。
ＨＥＲ３抗体はまた、呼吸器疾患、骨粗鬆症、骨関節症、多発性嚢胞腎、糖尿病、統合
失調症、血管疾患、心疾患、非発癌の増殖性疾患、線維症およびアルツハイマー病などの
神経変性疾患を含むがこれらに限定されない、ＨＥＲシグナル伝達の以上または血管に関
連する他の障害の治療または予防に使用できる。
ＨＥＲ３結合抗体との併用療法に好適な剤は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路を調節できる
、当分野で既知の標準治療剤を含む。ＨＥＲ２に対してケアする薬剤の標準の適当な例は
、限定はしないが、ハーセプチンおよびタイケルブを含む。ＥＧＦＲに対してケアする薬
剤の標準の適当な例は、限定はしないが、イレッサ、タルセバ、アービタックスおよびベ
クチビックスを含む。ＨＥＲ３結合抗体との組合せ処置のために適当であり得る他の薬剤
は、限定はしないが、受容体チロシンキナーゼ、Ｇ−タンパク質共役受容体、増殖／生存
シグナル変換経路、核ホルモン受容体、アポトーシス経路、細胞周期および血管形成を調
節するものを含む。
診断的使用
一の態様において、本発明は、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）
または癌に罹患しているかまたは癌を発症するリスクを有する個体由来のサンプルにおけ
る、ＨＥＲ３タンパク質および／または核酸発現ならびびにＨＥＲ３タンパク質機能を測
定するための、診断アッセイを含む。
競合アッセイなどの診断アッセイは、共通の結合パートナー上の限られた数の結合部位
について試験サンプルと分析物が競合するラベルアナログ（トレーサー）の能力に依存す
る。結合パートナーは一般に、競合の前または後に非可溶化され、次いで結合パートナー
に結合しているトレーサーおよび分析物を結合していないトレーサーおよび分析物から分
離する。この分離は傾斜法（結合パートナーが予め非可溶化された場合）または遠心分離
法（競合反応後に結合パートナーを沈殿させる場合）によって実施される。試験サンプル
分析物の量は、マーカー物質の量によって測定したとき、結合したトレーサーの量に反比
例する。既知量の分析物で用量応答曲線を作成し、試験結果と比較して、試験サンプル中
に存在する分析物の量を定量的に決定する。これらのアッセイは、検出マーカーとして酵
素が使用される場合にはＥＬＩＳＡと呼ばれる。この形態のアッセイにおいて、抗体とＨ
ＥＲ３結合抗体間の競合的結合は、血清サンプル中の抗体、より具体的には血清サンプル
中の中和抗体の物差しである結合ＨＥＲ３タンパク質、好ましくは本発明のＨＥＲ３エピ
トープをもたらす。
このアッセイの重要な利点は、測定が抗体を直接中和することで行われることである（
すなわち、ＨＥＲ３タンパク質、特にエピトープの結合と干渉するもの）。このようなア
ッセイ、特にＥＬＩＳＡ試験の形態のアッセイは、臨床的環境および通常の血液スクリー
ニングに相当に利用される。
本発明の別の態様は、個体におけるＨＥＲ３核酸発現またはＨＥＲ３タンパク質活性を
測定するための方法であって、それによってその個体に適切な治療または予防薬を選択す
る方法を提供する（本明細書において「薬理ゲノミクス」と称する）。薬理ゲノミクスは
、個体の遺伝子型（例えば特定の剤に応答する個体の能力を測定するために試験した個体
の遺伝子型）に基づいて、個体の治療または予防処置のための剤（例えば薬物）を選択で
きる。
本発明のさらに別の態様は、臨床試験におけるＨＥＲ３タンパク質の発現または活性に
対する剤（例えば薬物）の影響を監視することに関する。
医薬組成物
ＨＥＲ３結合抗体（無傷または結合断片）を含む医薬組成物または無菌組成物を製造す
るためには、ＨＥＲ３結合抗体（無傷または結合断片）を、医薬上許容される担体または
賦形剤と混合する。組成物は追加的に癌（乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣
癌、肝臓癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、
扁平上皮癌、末梢神経鞘腫瘍、神経鞘腫、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、グリア芽腫、軟組
織の明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎臓癌および黒色腫）の治療または予防に
好適な１以上の治療剤を含めることができる。
治療および診断剤の製剤は、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、ローションまた
は懸濁液の形態で、生理的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより
製造され得る（例えば、Hardmanら (2001) Goodman and Gilman‘s The Pharmacological
Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: T
he Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York
, N.Y.; Avisら (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications
, Marcel Dekker, NY; Liebermanら (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tabl
ets, Marcel Dekker, NY; Liebermanら(eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Di
sperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicit
y and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.参照）。
治療のための投与計画の選択は、該物質の血清または組織ターンオーバー速度、症状の
レベル、該物質の免疫原性、および生物学的マトリックスにおける標的細胞の接近性を含
む幾つかの要因に左右される。ある実施形態においては、投与計画は、許容される副作用
レベルと調和させて、患者に送達される治療用物質の量を最大にする。したがって、送達
される生物学的製剤の量は、部分的には、個々の物質および治療される状態の重症度に左
右される。抗体、サイトカインおよび小分子の適当な用量を選択する際の指針は入手可能
である（例えば、Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, O
xfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthri
tis, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and
Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Baertら (
2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgromら (1999) New Engl. J. Med. 341:1966
-1973; Slamonら (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitzら (2000) New
Engl. J. Med. 342:613-619; Ghoshら (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipskyら
(2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602参照）。
適当な用量の決定は、例えば、治療に影響を及ぼすことまたは治療に影響を及ぼすと予
想されることが当分野で既知であるまたは疑われるパラメーターおよび要因を用いて、臨
床医によってなされる。一般に、投与は、最適用量より若干少ない量から開始され、つい
で、いずれかの負の副作用との対比において所望のまたは最適な効果が達成されるまで、
少しずつ投与量を増加させる。重要な診断尺度には、例えば炎症の症状の尺度、または産
生される炎症サイトカインのレベルが含まれる。
本発明の医薬組成物における有効成分の実際の投与レベルは、患者にとって毒性となる
ことなく個々の患者、組成物および投与方法に関する所望の治療応答を達成するのに有効
な有効成分量が得られるよう様々なレベルとなり得る。選択される投与レベルは、使用さ
れる本発明の個々の組成物またはそれらのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路
、投与時点、使用される個々の化合物の排泄速度、治療の持続期間、使用される個々の組
成物と組合せて使用される他の薬物、化合物および／または物質、治療される患者の年齢
、性別、体重、状態、全身健康状態および既往歴ならびに医学分野で公知の他の要因を含
む種々の薬物動態学的要因に左右される。
本発明の抗体またはそれらの断片を含む組成物は、連続的注入により、または例えば１
日、１週間または週１〜７回の間隔での投与により投与され得る。投与は、静脈内、皮下
、局所、経口的、鼻腔内、直腸、筋肉内、脳内に、または吸入により行われ得る。特定の
投与プロトコールは、有意な望ましくない副作用を回避する最大用量または投与頻度を含
むものである。週当たりの合計用量は、少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも
０．２μｇ／ｋｇ、少なくとも０．５μｇ／ｋｇ、少なくとも１μｇ／ｋｇ、少なくとも
１０μｇ／ｋｇ、少なくとも１００μｇ／ｋｇ、少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくと
も１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、少なく
とも２５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも５０ｍｇ／ｋｇであり得る（例えば、Yangら (20
03) New Engl. J. Med. 349:427-434; Heroldら (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-16
98; Liuら (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portieljiら (2003) Can
cer Immunol. Immunother. 52:133-144を参照のこと）。抗体またはそれらの断片の所望
の用量は、モル／ｋｇ体重に基づいた抗体またはポリペプチドの場合とほぼ同じである。
抗体またはそれらの断片の所望の血漿濃度は、モル／ｋｇ体重に基づいた抗体の場合とほ
ぼ同じである。該用量は、少なくとも１５μｇ、少なくとも２０μｇ、少なくとも２５μ
ｇ、少なくとも３０μｇ、少なくとも３５μｇ、少なくとも４０μｇ、少なくとも４５μ
ｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも５５μｇ、少なくとも６０μｇ、少なくとも６５μ
ｇ、少なくとも７０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも８０μｇ、少なくとも８５μ
ｇ、少なくとも９０μｇ、少なくとも９５μｇ、または少なくとも１００μｇであり得る
。対象に投与される投与回数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０
、１１もしくは１２またはそれ以上であり得る。
本発明の抗体またはそれらの断片の場合、患者に投与される投与量は０．０００１ｍｇ
／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重１ｋｇ当たりのｍｇ）であり得る。該投与量は、
０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、
０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜
１ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ
〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０
．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ
、０．０１〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、または０．０１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重１
ｋｇ当たりのｍｇ）であり得る。
本発明の抗体またはそれらの断片の投与量は、キログラム（ｋｇ）単位の患者の体重と
ｍｇ／ｋｇ単位の投与用量とを掛け算することにより算出され得る。本発明の抗体または
それらの断片の投与量は、１５０μｇ／ｋｇ未満、１２５μｇ／ｋｇ未満、１００μｇ／
ｋｇ未満、９５μｇ／ｋｇ未満、９０μｇ／ｋｇ未満、８５μｇ／ｋｇ未満、８０μｇ／
ｋｇ未満、７５μｇ／ｋｇ未満、７０μｇ／ｋｇ未満、６５μｇ／ｋｇ未満、６０μｇ／
ｋｇ未満、５５μｇ／ｋｇ未満、５０μｇ／ｋｇ未満、４５μｇ／ｋｇ未満、４０μｇ／
ｋｇ未満、３５μｇ／ｋｇ未満、３０μｇ／ｋｇ未満、２５μｇ／ｋｇ未満、２０μｇ／
ｋｇ未満、１５μｇ／ｋｇ未満、１０μｇ／ｋｇ未満、５μｇ／ｋｇ未満、２．５μｇ／
ｋｇ未満、２μｇ／ｋｇ未満、１．５μｇ／ｋｇ未満、１μｇ／ｋｇ未満、０．５μｇ／
ｋｇ未満、または０．５μｇ／ｋｇ（患者の体重１ｋｇ当たりのμｇ）であり得る。
本発明の抗体またはそれらの断片の単位用量は０．１ｍｇ〜２０ｍｇ、０．１ｍｇ〜１
５ｍｇ、０．１ｍｇ〜１２ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、０．１ｍｇ〜８ｍｇ、０．１ｍ
ｇ〜７ｍｇ、０．１ｍｇ〜５ｍｇ、０．１〜２．５ｍｇ、０．２５ｍｇ〜２０ｍｇ、０．
２５〜１５ｍｇ、０．２５〜１２ｍｇ、０．２５〜１０ｍｇ、０．２５〜８ｍｇ、０．２
５ｍｇ〜７ｍｇ、０．２５ｍｇ〜５ｍｇ、０．５ｍｇ〜２．５ｍｇ、１ｍｇ〜２０ｍｇ、
１ｍｇ〜１５ｍｇ、１ｍｇ〜１２ｍｇ、１ｍｇ〜１０ｍｇ、１ｍｇ〜８ｍｇ、１ｍｇ〜７
ｍｇ、１ｍｇ〜５ｍｇ、または１ｍｇ〜２．５ｍｇであり得る。
本発明の抗体またはそれらの断片の投与量は、対象において少なくとも０．１μｇ／ｍ
ｌ、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも２μｇ／ｍｌ、
少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも６μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なく
とも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも２５μｇ／ｍｌ、少なくと
も５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも１２５μｇ／ｍｌ、少なく
とも１５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１７５μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少
なくとも２２５μｇ／ｍｌ、少なくとも２５０μｇ／ｍｌ、少なくとも２７５μｇ／ｍｌ
、少なくとも３００μｇ／ｍｌ、少なくとも３２５μｇ／ｍｌ、少なくとも３５０μｇ／
ｍｌ、少なくとも３７５μｇ／ｍｌまたは少なくとも４００μｇ／ｍｌの血清力価を達成
し得る。あるいは、本発明の抗体またはそれらの断片の投与量は、対象において少なくと
も０．１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくと
も２μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも６μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μ
ｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも２５μｇ
／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも１２５μ
ｇ／ｍｌ、少なくとも１５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１７５μｇ／ｍｌ、少なくとも２０
０μｇ／ｍｌ、少なくとも２２５μｇ／ｍｌ、少なくとも２５０μｇ／ｍｌ、少なくとも
２７５μｇ／ｍｌ、少なくとも３００μｇ／ｍｌ、少なくとも３２５μｇ／ｍｌ、少なく
とも３５０μｇ／ｍｌ、少なくとも３７５μｇ／ｍｌまたは少なくとも４００μｇ／ｍｌ
の血清力価を達成し得る。
本発明の抗体またはそれらの断片の投与は反復可能であり、それらの投与は、少なくと
も１日間、２日間、３日間、５日間、１０日間、１５日間、３０日間、４５日間、２ヶ月
間、７５日間、３ヶ月間または少なくとも６ヶ月間、隔てられ得る。
個々の患者に対する有効量は、治療される状態、患者の全身健康状態、投与の方法、経
路および用量ならびに副作用の重症度などの要因によって様々となり得る（例えば、Mayn
ardら (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Bo
ca Raton, Fla.; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Pub
l., London, UK参照）。
投与の経路は、例えば、局所または皮膚適用、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、
動脈内、脳脊髄内、病変内への注射または注入、あるいは徐放系またはインプラントによ
るものであり得る（例えば、Sidmanら (1983) Biopolymers 22:547-556; Langerら (1981
) J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277; Langer (1982) Chem. Tech. 12:98-105; Epstei
nら (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; Hwangら (1980) Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 77:4030-4034；米国特許第６，３５０，４６６および６，３１６，０２４
号参照）。必要に応じて、該組成物は、可溶化剤、および注射部位の疼痛を低減するため
の局所麻酔薬、例えばリドカインをも含み得る。また、例えば吸入器またはネブライザー
の使用およびエアゾール化剤の配合により、肺投与も行われうる。例えば、米国特許第６
，０１９，９６８、５，９８５，３２０、５，９８５，３０９、５，９３４，２７２、５
，８７４，０６４、５，８５５，９１３、５，２９０，５４０および４，８８０，０７８
号；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／
４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６およびＷＯ９９／６６９０３号公報（各々の全体を出
典明示により本明細書に組み入れる）参照。
また、本発明の組成物は、当技術分野で公知の種々の方法の１以上を用いて、１以上の
投与経路で投与されうる。当業者に理解されるとおり、投与の経路および／または方法は
、所望の結果に応じて様々となろう。本発明の抗体またはそれらの断片に関する選択され
る投与経路には、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路
、例えば注射または注入が含まれる。非経口投与は経腸および局所投与以外の投与方法に
相当しうるものであり、通常は注射によるものであり、限定的なものではないが静脈内、
筋肉内、動脈内、鞘内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、
関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内の注射および注入を包含する。
あるいは、本発明の組成物は、経口経路を解して、例えば、局所、表皮または粘膜投与経
路、例えば、鼻腔内、経口、膣内、経直腸、舌下または局所的に投与することができる。
１つの態様において、本発明の抗体またはそれらの断片は注入により投与される。別の態
様において、本発明の多特異的エピトープ結合タンパク質は皮下に投与される。
本発明の抗体またはそれらの断片が制御放出または徐放系で投与される場合には、制御
放出または徐放を達成するためにポンプが使用され得る（例えば、Langer, supra; Sefto
n, (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwaldら (1980), Surgery 88:507;
Saudekら (1989) N. Engl. J. Med. 321:574参照）。本発明の治療用物質の制御放出また
は徐放を達成するためには、高分子物質が使用され得る（例えば、Medical Applications
of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (197
4); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen
and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, (1983) J., Macromol
. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61参照; また、Levyら (1985) Science 228:190; Duri
ngら (1989) Ann. Neurol. 25:351; Howardら (1989) J. Neurosurg. 7 1:105；米国特許
第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０
１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公
開番号ＷＯ９９／１５１５４号公報；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／２０２５３号公報
も参照）。徐放製剤において使用される重合体の具体例には、限定的なものではないが以
下のものが含まれる：ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）、ポリ（メチルメタ
クリラート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアセタート）、ポリ（
メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン
）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポ
リラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオ
ルトエステル。１の実施形態において、徐放製剤において使用される高分子は不活性であ
り、浸出性不純物を含有せず、貯蔵時に安定であり、無菌であり、生分解性である。制御
放出または徐放系は予防または治療標的に接近して配置され、したがって、全身投与量の
ごく一部を要するに過ぎない（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controll
ed Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)参照）。
制御放出系はLanger (1990, Science 249:1527-1533)による総説において考察されてい
る。本発明の１以上の抗体またはそれらの断片を含む徐放製剤を製造するためには、当業
者に既知の任意の技術が用いられ得る。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号，ＰＣ
Ｔ公開ＷＯ９１／０５５４８号公報、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２０６９８号公報、Ningら (
1996), Radioimmunotheraphy & Oncology 39:179-189、Songら (1995) PDA Journal of P
harmaceutical Science & Technology 50:372-397、Cleekら (1997) Pro. Int’l. Symp.
Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854、およびLamら(1997) Proc. Int’l. Symp.
Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760（各々の全体を出典明示により本明細書に組み
入れる）参照。
本発明の抗体またはそれらの断片を局所投与する場合、それは、軟膏剤、クリーム剤、
経皮パッチ、ローション剤、ゲル剤、シャンプー、噴霧剤、エアゾール剤、溶液剤（水剤
）、乳剤または当業者によく知られた他の形態で製剤化され得る。例えば、Remington’s
Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th e
d., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)参照。非噴霧可能局所剤形の場合、局所適用に
適しており幾つかの場合には水より大きな粘性率を有する担体または１以上の賦形剤を含
む粘性ないし半固体または固体形態が典型的に使用される。適当な製剤には、溶液剤（水
剤）、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、散剤、リニメント剤、ロウ剤などが含まれる
がこれらに限定されるものではなく、これらは、所望により、滅菌され、または例えば浸
透圧のような種々の特性に影響を及ぼすための補助物質（例えば、保存剤、安定剤、湿潤
剤、バッファーまたは塩）と混合される。他の適当な局所剤形には、噴霧可能なエアゾー
ル剤が含まれ、この場合、有効成分は、いくつかの場合には固体または液体不活性担体と
組合されており、加圧揮発性物質（例えば、気体プロペラント、例えばフレオン）との混
合物として、またはスクィーズボトル内に充填される。所望により、医薬組成物および剤
形に保湿剤または湿潤剤も加えられうる。そのような追加的成分の具体例は当分野で周知
である。
抗体またはそれらの断片を含む組成物を鼻腔内に投与する場合には、それは、エアゾー
ル形態、噴霧剤、ミストまたは滴剤の形態で製剤化され得る。特に、本発明にしたがって
使用するための予防または治療剤は、加圧パックからのエアロゾルスプレー提示(present
ation)または噴霧器の形態において、適当な高圧ガス（例えば、ジクロロジフルオロメタ
ン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の
適当なガス）の使用で便利に送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投与単位は
、計量された量を送達するような値を提供することにより決定され得る。吸入器または吸
入器における使用のためのカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチンからなる）は
、化合物および適当な粉末ベース、例えば、ラクトースまたはデンプンの粉末混合物を含
んで製剤化され得る。
第２の治療剤、例えばサイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質または放射線
による共投与または治療のための方法は当分野で既知である（例えば、Hardmanら (eds.)
(2001) Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10.sup.
th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacoth
erapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wi
lkins, Phila., Pa.; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biot
herapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.参照）。治療用物質の有効量は
、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも約３０％、少なくとも４０％または
少なくとも５０％、症状を軽減し得る。
本発明の抗体またはそれらの断片と組合せて投与されうる追加的な療法（例えば、予防
または治療剤）は、本発明の抗体またはそれらの断片から５分未満を隔てて、３０分未満
を隔てて、１時間未満を隔てて、約１時間を隔てて、約１〜約２時間を隔てて、約２時間
〜約３時間を隔てて、約３時間〜約４時間を隔てて、約４時間〜約５時間を隔てて、約５
時間〜約６時間を隔てて、約６時間〜約７時間を隔てて、約７時間〜約８時間を隔てて、
約８時間〜約９時間を隔てて、約９時間〜約１０時間を隔てて、約１０時間〜約１１時間
を隔てて、約１１時間〜約１２時間を隔てて、約１２時間〜１８時間を隔てて、１８時間
〜２４時間を隔てて、２４時間〜３６時間を隔てて、３６時間〜４８時間を隔てて、４８
時間〜５２時間を隔てて、５２時間〜６０時間を隔てて、６０時間〜７２時間を隔てて、
７２時間〜８４時間を隔てて、８４時間〜９６時間を隔てて、または９６時間〜１２０時
間を隔てて投与され得る。それらの２以上の療法は患者の１回の同じ来院時に投与され得
る。
本発明の抗体またはそれらの断片およびその他の療法は周期的に投与されうる。周期的
(cycling)療法は、ある期間にわたる第１療法（例えば、第１の予防または治療剤）の投
与、およびそれに続く、ある期間にわたる第２療法（例えば、第２の予防または治療剤）
の投与、および場合によってはそれに続く、ある期間にわたる第３療法（例えば、予防ま
たは治療剤）などの投与、ならびにこの連続的投与の反復を含み、該周期は、それらの療
法の１つに対する耐性の発生を低減するため、および／またはそれらの療法の１つの副作
用を回避または軽減するため、および／またはそれらの療法の効力を改善するためのもの
である。
ある実施形態において、本発明の抗体またはそれらの断片は、インビボにおける適切な
分布が確保されるよう製剤化され得る。例えば、血液−脳関門（ＢＢＢ）は多数の高親水
性化合物を排除する。本発明の治療用化合物が（所望により）ＢＢＢを通過することを保
証するために、それらは例えばリポソーム中に製剤化されうる。リポソームの製造方法に
関しては、例えば、米国特許第４，５２２，８１１、５，３７４，５４８および５，３９
９，３３１号を参照のこと。リポソームは、標的化薬物送達を促進するよう特定の細胞ま
たは器官へ選択的に輸送される１以上の部分を含み得る（例えば、Ranade, (1989) J. Cl
in. Pharmacol. 29:685を参照のこと）。典型的な標的化部分には、ホラートまたはビオ
チン（例えば、Ｌｏｗらの米国特許第５，４１６，０１６号を参照のこと）；マンノシド
（Umezawaら (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（Bloemanら (1
995) FEBS Lett. 357:140; Owaisら (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）；
界面活性剤プロテインＡ受容体（Briscoeら (1995) Am. J. Physiol. 1233:134）；ｐ１
２０（Schreierら (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）；K. Keinanen; M. L. Laukkanen
(1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:27
3も参照）が含まれる。
本発明は、本発明の抗体またはそれらの断片を含む医薬組成物を、単独でまたは他の療
法と組合せて、それを要する対象に投与するための方法を提供する。本発明の組合せ療法
の療法（例えば、予防または治療剤）は同時または連続的に対象に投与され得る。本発明
の組合せ療法の療法（例えば、予防または治療剤）は周期的にも投与され得る。周期的療
法は、ある期間にわたる第１療法（例えば、第１の予防または治療剤）の投与、およびそ
れに続く、ある期間にわたる第２療法（例えば、第２の予防または治療剤）の投与、なら
びにこの連続的投与の反復を含み、該周期は、それらの療法（例えば、剤）の１つに対す
る耐性の発生を低減するため、および／またはそれらの療法（例えば、剤）の１つの副作
用を回避または低減するため、および／またはそれらの療法の効力を改善するためのもの
である。
本発明の組合せ療法の療法（例えば、予防または治療剤）は同時に対象に投与され得る
。「同時」なる語は、厳密に同一時点での療法（例えば、予防または治療剤）の投与に限
定されるものではなく、本発明の抗体またはそれらの断片がその他の療法と共に作用して
、それらがそれ以外の様態で投与された場合に比べて増加した利益をもたらし得るように
或る順序および時間間隔で、本発明の抗体を含む医薬組成物が対象に投与されることを意
味する。例えば、各療法は、同時に、または異なる時点においていずれかの順序で連続的
に対象に投与され得るが、それらは、所望の治療または予防効果が得られるよう時間的に
十分に接近して投与されるべきである。各療法は、任意の適当な形態および任意の適当な
経路で、別々に対象に投与されうる。種々の実施形態においては、該療法（例えば、予防
または治療剤）は、１５分未満を隔てて、３０分未満を隔てて、１時間未満を隔てて、約
１時間を隔てて、約１〜約２時間を隔てて、約２時間〜約３時間を隔てて、約３時間〜約
４時間を隔てて、約４時間〜約５時間を隔てて、約５時間〜約６時間を隔てて、約６時間
〜約７時間を隔てて、約７時間〜約８時間を隔てて、約８時間〜約９時間を隔てて、約９
時間〜約１０時間を隔てて、約１０時間〜約１１時間を隔てて、約１１時間〜約１２時間
を隔てて、２４時間を隔てて、４８時間を隔てて、７２時間を隔てて、または１週間を隔
てて、対象に投与され得る。他の実施形態において、２以上の療法（例えば、予防または
治療剤）は患者の同一来院時に投与され得る。
該組合せ療法の予防または治療剤は同一医薬組成物中で対象に投与され得る。あるいは
、該組合せ療法の予防または治療剤は別々の医薬組成物中で同時に対象に投与され得る。
該予防または治療剤は、同じまたは異なる投与経路により対象に投与され得る。
本発明は完全に説明され、さらに以下の実施例および請求項により例示されるが、これ
は一例であり、さらなる限定を意味するものではない。
実施例１：抗体に関する方法、材料およびスクリーニング
（ｉ）細胞系
ＢＸＰＣ−３、ＳＫ−Ｂｒ−３、ＢＴ−４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＦａＤｕおよ
びＭＣＦ−７細胞系は、ＡＴＣＣから購入し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補った増
殖培地中で慣例通りに維持した。
（ｉｉ）組換えヒト、カニクイザル、マウスおよびラットＨＥＲ３ベクターの作製
マウスＨＥＲ３細胞外ドメインを、マウス脳ｃＤＮＡ（Clontech）からＰＣＲ増幅し、
配列をＮＭ＿０１０１５３との比較により立証した。ラットＨＥＲ３ ＥＣＤを、Ｒａｔ
−２細胞ｍＲＮＡから逆転写し、配列をＮＭ＿０１７２１８との比較により立証した。カ
ニクイザルＨＥＲ３ ｃＤＮＡ鋳型を、種々のカニクイザル組織由来のＲＮＡを使用して
作製し（Zyagen Laboratories）、ＲＴ−ＰＣＲ産物をｐＣＲ（登録商標）−ＴＯＰＯ−
ＸＬ（Invitrogen）にクローンニングし、両方の鎖をシーケンシングした。ヒトＨＥＲ３
は、ヒト胎児の脳ｃＤＮＡライブラリー由来であり（Ｓｏｕｒｃｅ）、配列は、ＮＭ＿０
０１９８２との比較により立証した。
タグ化組換えタンパク質を作製するために、ヒト、マウス、ラットおよびカニクイザル
ＨＥＲ３を、Ｐｗｏ Ｔａｑポリメラーゼ（Roche Diagnostics）を使用してＰＣＲ増幅
した。増幅されたＰＣＲ産物をゲル精製し、インフレームＮ−末端 ＣＤ３３ リーダー
配列およびＣ−末端ＴＡＧ、例えば、ＦＬＡＧ ＴＡＧを含むように以前に修飾されてい
るｐＤｏｎＲ２０１（Invitrogen）ｇａｔｅｗａｙ エントリーベクターにクローニング
した。ＴＡＧは、抗−ＴＡＧモノクローナル抗体を介して単量体タンパク質の精製を可能
にする。標的遺伝子の両側には、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニング技術（Invitr
ogen）を使用してＧａｔｅｗａｙ適合専売目的ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１）に
組換え可能にする、ＡｔｔＢ１およびＡｔｔＢ２が配置された。組換え反応はＣＭＶプロ
モーターを含む専売目的ベクターでのＧａｔｅｗａｙ ＬＲ反応を使用して行い、ＴＡＧ
発現ベクターを作製したが、市販されているあらゆるベクターを使用することができる。
Ｃ−末端因子Ｘ切断部位のＨＥＲ３ ＥＣＤ上流およびヒトＩｇＧヒンジおよびＦｃド
メインを融合したさらなる組換えＨＥＲ３タンパク質を作製し、Ｆｃ−タグ化タンパク質
を作った。これをなし遂げるために、種々のＨＥＲ３ ＥＣＤをＰＣＲ増幅し、因子Ｘ部
位−Ｈｉｎｇｅ−ｈＦｃのインフレームＣ−末端融合を含むように修飾されたベクター（
例えば、ｐｃＤＮＡ３．１）にクローニングした。作製されたオープンリーディングフレ
ームの両側には、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）組換えクローニング技術（Invitrogen）に
てさらなるクローニングのために、ＡｔｔＢ１およびＡｔｔＢ２部位が配置された。ＬＲ
Ｇａｔｅｗａｙ反応は、ＨＥＲ３−ＦｃをＣＭＶプロモーターを含む目的発現構築物中
に移入するために使用した。ＨＥＲ３点変異発現構築物を標準部位特異的な変異誘発プロ
トコールを使用して作製し、得られたベクター配列を証明した。
表８．ＨＥＲ３発現ベクターの作製。ＨＥＲ３のアミノ酸番号付けは、ＮＰ＿００１９７
３（ヒト）、ＮＰ＿０３４２８３（マウス）およびＮＰ＿０５８９１４（ラット）に基づ
く。
Figure 0006771002
Figure 0006771002
（ｉｉｉ）組換えＨＥＲ３タンパク質の発現
所望のＨＥＲ３組換えタンパク質を以前に懸濁培養に適合されたＨＥＫ２９３由来細胞
系において発現させ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売無血清培地において増殖させた。小規模発現
検査は、リポフェクションに基づいて一過性６−ウェル−プレートトランスフェクション
アッセイにおいて取り組んだ。一過性トランスフェクションを介する大規模タンパク質生
産を、ＷａｖｅＴＭ バイオリアクターシステム（Wave Biotech）において１０−２０Ｌ
スケールで行った。ＤＮＡポリエチレンイミン（Polysciences）を、１：３（ｗ：ｗ）の
比率でプラスミド担体として使用した。細胞培養上清をトランスフェクション７−１０日
後に回収し、精製の前に交差流濾過および透析濾過により濃縮した。
（ｉｖ）タグ化タンパク質精製
組換えタグ化ＨＥＲ３タンパク質（例えば、ＴＡＧ−ＨＥＲ３）を、細胞培養上清を回
収し、１０ｋＤａカットオフフィルター（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ）での交差流濾過により１
０倍に濃縮することにより精製した。抗−ＴＡＧカラムを、１ｍＬの樹脂あたり１０ｍｇ
の抗体の最終比率で抗−ＴＡＧモノクローナル抗体をＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂに
結合させることにより調製した。濃縮した上清を、１−２ｍＬ／分の流速で３５ｍｌの抗
−タグ カラムに付した。ＰＢＳで基線洗浄後、結合した物質を１００ｍＭのグリシン（
ｐＨ２．７）で溶離し、中和し、無菌濾過した。タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの吸光
度を測定し、０．６６ＡＵ／ｍｇの理論的因子を使用して変換することにより決定した。
精製されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎ−末端シーケンシングおよびＬＣ−ＭＳ
により最終的に特徴付けた。
（ｖ）Ｆｃタグ精製
濃縮した細胞培養上清を１ｍｌ／分の流速で５０ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムに付した。ＰＢＳで基線洗浄後、カラムを、１０
カラム容量の１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／３０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール、ｐＨ７．
３、次に５カラム容量のＰＢＳで洗浄した。最後に、結合した物質を５０ｍＭ Ｃｉｔｒ
ａｔｅ／１４０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ２．７）で溶離し、中和し、無菌濾過した。
（ｖｉ）過剰発現する細胞系の作製
細胞表面上に高レベルのＨＥＲ３を発現する細胞系を作製するために、ヒトＥＧＦＲの
アミノ酸残基６６９−１２１０にインフレームにおいて融合したヒトＨＥＲ３のアミノ酸
残基２０−６６７の上流にＣＤ３３リーダー配列をコードする挿入物を含む哺乳動物発現
ベクターを構築した。哺乳動物細胞において発現されるとき、得られたキメラタンパク質
は、Ｎ−末端ＨＥＲ３細胞外および膜貫通ドメインおよびＣ−末端ＥＧＦＲ細胞質ドメイ
ンを含む。ＨＥＲ３／１ベクターをＣＨＯ−Ｓ細胞（Invitrogen）にトランスフェクトし
、安定なプールが抗生物質選択後に生じた。得られた細胞系（ＣＨＯ ＨＥＲ３／１）は
、細胞表面上に高レベルのＨＥＲ３細胞外ドメインを発現した。
（ｖｉｉ）ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）パニング
ヒトＨＥＲ３を認識する抗体の選択のために、多数のパニング戦略を使用した。ヒトＨ
ＥＲ３タンパク質に対する治療的抗体を、抗体変異体タンパク質の供給源として、市販さ
れているファージディスプレイライブラリーであるＭｏｒｐｈｏＳｙｓ ＨｕＣＡＬ Ｇ
ＯＬＤ（登録商標）ライブラリーを使用して高結合アフィニティーを有するクローンを選
択することによって作製した。ファージミドライブラリーは、ＨｕＣＡＬ（登録商標）コ
ンセプト（Knappikら (2000) J Mol Biol 296:57-86）に基づくものであり、ファージ表
面上でＦａｂ提示するためのＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（登録商標）技術を使用する（Ｌｏｈ
ｎｉｎｇによるＷＯ０１／０５９５０）。
抗−ＨＥＲ３抗体の単離ために、標準ならびにＲａｐＭＡＴパニング戦略を、固相、溶
液、全細胞および差示的(differential)全細胞パニングアプローチを使用して行った。
（ｖｉｉｉ）固相パニング
抗−ＨＥＲ３抗体を同定するために、種々の固相パニング戦略を、異なる組換えＨＥＲ
３タンパク質を使用して行った。それぞれのラウンドの固相パニングを行うために、Ｍａ
ｘｉｓｏｒｐ ｐｌａｔｅｓ（Nunc）をＨＥＲ３タンパク質でコーティングした。タグ化
タンパク質を、抗−Ｆｃ（ヤギまたはマウス抗−ヒトＩｇＧ、Jackson Immuno Research
）、抗−Ｔａｇ抗体で以前にコーティングされたプレートを使用してか、または受動的な
吸着を介してのいずれかで捕獲した。コーティングされたプレートをＰＢＳで洗浄し、ブ
ロックした。コーティングされたプレートをＰＢＳで２回洗浄し、震盪器上でＨｕＣＡＬ
ＧＯＬＤ（登録商標）ファージ−抗体を室温で２時間で加えた。結合したファージを溶
離し、大腸菌ＴＧ−１に加え、ファージ感染のためにインキュベートした。次に、感染し
た細菌を単離し、寒天プレート上に播種した。コロニーをプレートから掻き取り、ファー
ジをレスキューし、増幅した。それぞれのＨＥＲ３パニング戦略は、個々のラウンドのパ
ニングを含み、ユニークな抗原、抗原濃度および洗浄ストリンジェンシーを含んだ。
（ｉｘ）溶液相パニング
それぞれのラウンドの溶液相パニングを、ニューレグリン１−β１（R&D Systems）の
存在または非存在下で種々のビオチン化組換えＨＥＲ３タンパク質を使用して行った。タ
ンパク質を、製造業者の指示にしたがってＥＺ−連結 スルホ−ＮＨＳ−ＬＣビオチン化
キット（Pierce）を使用してビオチン化した。８００μｌのストレプトアビジン連結電磁
ビーズ（Dynabeads、Dynal）をＰＢＳで１回洗浄し、Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ（Chemic
on）で一晩ブロックした。ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）ファージ−抗体および適当
なビオチン化ＨＥＲ３を反応チューブ中でインキュベートした。ストレプトアビジン電磁
ビーズを２０分間で加え、磁性粒子分離器（Dynal）で回収した。結合したファージを、
ＤＴＴ含有バッファーをそれぞれのチューブに加えることによりＤｙｎａｂｅａｄｓから
溶離し、大腸菌ＴＧ−１に加えた。ファージ感染を、固相パニングに記載されている方法
と同一の方法において行った。それぞれのＨＥＲ３パニング戦略は、個々のラウンドのパ
ニングを含み、ユニークな抗原、抗原濃度および洗浄ストリンジェンシーを含んだ。
（ｘ）細胞ベースのパニング
細胞パニングのために、ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）ファージ−抗体を、回転器
上で室温で２時間、約１０７個の細胞とインキュベートし、次に遠心分離した。細胞ペレ
ットを単離し、ファージを細胞から溶離した。上清を回収し、上記プロセスにより続けた
大腸菌ＴＧ−１培養物に加えた。２つの細胞ベースの戦略を使用して、抗−ＨＥＲ３抗体
を同定した：
ａ）全細胞パニング：該戦略において、種々の無傷な細胞系を抗原として使用した。
ｂ）差示的全細胞パニング：該戦略において、抗原は、連続して、細胞および組換えＨＥ
Ｒ３タンパク質からなった（例として１９８１．０９参照）。細胞ベースのパニングは、
上記のとおりに行い、一方、組換えタンパク質を抗原として利用するときに、固相パニン
グプロトコールを使用した。洗浄は、ＰＢＳ（２−３Ｘ）およびＰＢＳＴ（２−３Ｘ）を
使用して行った。
（ｘｉ）ＲａｐＭＡＴＴＭライブラリー作製およびパニング
ライブラリー多様性を維持すると同時に、抗体結合アフィニティーを増加させるために
、溶液および固相の両パニングの第２ラウンドアウトプットをＲａｐＭＡＴＴＭプロセス
に入れ、一方、全細胞および差示的全細胞パニング戦略の第３ラウンドアウトプットを入
れた（Prasslerら (2009) Immunotherapy; 1: 571-583）。ＲａｐＭＡＴＴＭライブラリ
ーを、パニングを介して選択されたファージのＦａｂをコードする挿入物を、提示ベクタ
ーｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２５＿ｂｌａ＿ＬＨＣへサブクローニングすることにより作
製し、さらに、Ｈ−ＣＤＲ２ ＲａｐＭＡＴＴＭライブラリーおよびＬ−ＣＤＲ３ Ｒａ
ｐＭＡＴＴＭライブラリーのいずれかを作製するために、特異的な制限酵素を使用するこ
とにより消化した。挿入物を、プール組成にしたがって、Ｈ−ＣＤＲ２またはＬ−ＣＤＲ
３に対するＴＲＩＭ成熟カセット（Virnekasら (1994) Nucleic Acids Research 22:5600
-5607）で置き換えた。ライブラリーサイズは、８ｘ１０６−１ｘ１０８個のクローンの
範囲であると概算された。ＲａｐＭＡＴ抗体−ファージを生産し、以前に記載された実験
方法を使用して、溶液、固相または細胞ベースのパニングの２つのさらなるラウンドに付
した。
実施例２：抗−ＨＥＲ３ ＩｇＧの一過性発現
懸濁液適合ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞を、ＢｉｏＷａｖｅ２０において、約２×１０６の
生存細胞／ｍＬの密度にまで培養した。細胞を関連無菌ＤＮＡ：ＰＥＩ−ＭＩＸで一時的
にトランスフェクトし、さらに増殖した。トランスフェクションの７日後に、Ｆｒｅｓｅ
ｎｉｕｓフィルター（０．２μｍ）を使用する交差流濾過によって細胞を取り出した。無
細胞材料を、１０ｋＤａカットオフフィルター（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ）を使用する交差流
濾過で濃縮し、濃縮物をｓｔｅｒｉｃｕｐフィルター（０．２２μｍ）を介して無菌濾過
した。無菌上清を４℃で貯蔵した。
実施例３：抗−ＨＥＲ３ ＩｇＧの精製
ＡＥＫＴＡ １００ ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ａｉｒクロマトグラフィーシステムで、６℃
で、冷却キャビネットにおいて、２５ｍｌのｓｅｌｆ−ｐａｃｋｅｄ ＭａｂＳｅｌｅｃ
ｔ ＳｕＲｅ樹脂（全て、GE Healthcare）とともにＸＫ１６／２０カラムを使用して、
ＩｇＧの精製を行った。５ｂａｒの圧力制限でのローディングを除き、全ての流動速度は
、３．５ｍｌ／分であった。カラムを３カラム容量のＰＢＳで平衡にし、２．０ｍＬ／分
で濾過発酵上清を負荷した。カラムを８カラム容量のＰＢＳで洗浄した。ＩｇＧを、５０
ｍＭ クエン酸塩／７０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ４．５）で開始し、１２カラム容量におい
て５０ｍＭ クエン酸塩／７０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ２．５）に直線的に下がるｐＨ勾配
で、次に同じｐＨ２．５バッファーの２カラム容量一定の工程で溶離した。ＩｇＧ含有画
分をプールし、即座に中和し、無菌濾過した（Millipore Steriflip、０．２２ｕｍ）。
ＯＤ２８０を測定し、タンパク質濃度を、配列データに基づき計算した。プールを、凝集
（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）および純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＳ）について別々に試験し
た。
実施例４：大腸菌におけるＨｕＣＡＬ（登録商標）−Ｆａｂ抗体の発現および精製
ＴＧ−１細胞におけるｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＭＨによってコードさ
れるＦａｂ断片の発現を、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補った５００ｍＬの
２ｘＹＴ培地を使用して、震盪器フラスコ培養物中で行った。培養は、ＯＤ６００ｎｍで
０．５に達するまで３０℃で震盪した。発現は、３０℃で２０時間の０．７５ｍＭのＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）の添加により誘導した。細胞を
リゾチームを使用して破壊した。Ｈｉｓ６−タグ化Ｆａｂ断片をＩＭＡＣ（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ）を介して単離した。１ｘダルベッコＰＢＳ（ｐＨ７．２）へのバッファー交換、をＰ
Ｄ１０カラムを使用して行った。サンプルを無菌濾過（０．２μｍ）した。タンパク質濃
度を、ＵＶ−分光光度法によって測定した。サンプルの純度を、変性、還元１５％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥにおいて分析した。Ｆａｂ調製物の均質性を、校正基準でサイズ排除クロマト
グラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）によって天然状態で決定した。
実施例５：溶液平衡滴定（ＳＥＴ）によるＨＥＲ３抗体親和性（ＫＤ）測定
溶液における親和性決定は、本質的に、以前に記載されているとおりに行った（Frigue
tら (1985) J Immunol Methods 77:305-19）。ＳＥＴ方法の感度および精度を改善するた
めに、古典的なＥＬＩＳＡからＥＣＬベースの技術にそれを移した（Haenelら (2005) An
al biochem 339:182-84）。
以前に記載された非標識ＨＥＲ３−Ｔａｇ（ヒト、ラット、マウスまたはカニクイザル
）を、ＳＥＴによる親和性決定のために使用した。
特注フィッティングモデルを適用するＸＬｆｉｔソフトウェア（ID Business Solution
s）でデータを評価した。それぞれのＩｇＧのＫＤ決定のために、以下のモデルを使用し
た（Piehlerら (Piehlerら (1997) J Immunol Methods 201:189-206にしたがい修正され
た）。
Figure 0006771002
 ［ＩｇＧ］：適用した総ＩｇＧ濃度
ｘ：適用した総可溶性抗原濃度（結合部位）
Ｂｍａｘ：抗原なしのＩｇＧの最大シグナル
ＫＤ：親和性
実施例６：ＦＡＣＳによる抗体細胞結合測定
ヒト癌細胞上に発現される内因性ヒト抗原への抗体の結合をＦＡＣＳにより評価した。
抗体ＥＣ５０値を決定するために、ＳＫ−Ｂｒ−３細胞をアキュターゼ(accutase)で回収
し、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ／３％ ＦＢＳ／０．２％ ＮａＮ３）にて１×１０６
細胞／ｍＬに希釈した。１ｘ１０５細胞／ウェルを９６−ウェルプレート（Nunc）のそれ
ぞれのウェルに加え、４℃で２１０ｇで５分間遠心し、上清を除去した。試験抗体の連続
希釈物（ＦＡＣＳバッファーで１：４希釈工程において希釈された）をペレット状の細胞
に加え、氷上で１時間インキュベートした。細胞を１００μＬのＦＡＣＳバッファー３回
洗浄し、ペレット化した。ＦＡＣＳバッファーで１／２００に希釈されたＰＥ結合ヤギ抗
−ヒトＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch）を細胞に加え、氷上で１時間インキュベートし
た。さらなる洗浄工程を１００μＬのＦＡＣＳバッファーで３回、次に、２１０ｇで４℃
で５分間の遠心分離工程を行った。最後に、細胞を２００μＬのＦＡＣＳバッファーに再
懸濁し、蛍光値をＦＡＣＳＡｒｒａｙ（BD Biosciences）で測定した。細胞表面結合抗−
ＨＥＲ３抗体の量を平均チャネル蛍光を測定することにより評価した。
実施例７：ＨＥＲ３ドメインおよび変異体結合
９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Nunc）を、４℃で一晩で、２００ｎｇの適当な
組換えヒトタンパク質（ＨＥＲ３−タグ、Ｄ１−２−タグ、Ｄ２−タグ、Ｄ３−４−タグ
、Ｄ４−タグ、ＨＥＲ３ Ｋ２６７Ａ−タグ、ＨＥＲ３ Ｌ２６８Ａ−タグ、ＨＥＲ３
Ｋ２６７Ａ／Ｌ２６８Ａおよびタグ化された不適切なコントロール）で被覆した。次に、
全てのウェルをＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、ＰＢＳ／１％ ＢＳ
Ａ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で１時間ブロックし、ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−
２０で３回洗浄した。抗−ＨＥＲ３抗体を１０μｇ／ｍＬの最終濃度にまで関連ウェルに
加え、適当なウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．
１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、次に、ＰＢＳ／１％ ＢＳＡ／０．１％ Ｔｗｅ
ｅｎ−２０において１／１００００に希釈された適当なペルオキシダーゼ連結検出抗体を
加えた。使用された検出抗体は、ヤギ抗−マウス（Ｐｉｅｒｃｅ、３１４３２）、ウサギ
抗−ヤギ（Ｐｉｅｒｃｅ、３１４０２）およびヤギ抗−ヒト（Ｐｉｅｒｃｅ、３１４１２
）であった。プレートを室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ
−２０で３回洗浄した。１００μｌのＴＭＢ（３，３’、５，５’テトラメチルベンジジ
ン）基質溶液（BioFx）を６分間で全てのウェルに加え、５０μｌの２．５％ Ｈ２ＳＯ
４で反応を停止させた。それぞれの組換えタンパク質へのＨＥＲ３抗体結合の程度を、Ｓ
ｐｅｃｔｒａＭａｘ プレートリーダー（Molecular Devices）を使用してＯＤ４５０を
測定することにより決定した。適宜、用量応答曲線は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを
使用して分析した。
実施例８：水素／重水素交換質量分析を使用するＨＥＲ３エピトープマッピング
材料
Ｄ２Ｏバッファーを、重水（Ｓｉｇｍａ）に２５ｍＭのＴＢＳ（ｐＨ７．５）／５００
ｍＭのＮａＣｌを溶解することにより作製した。還元溶液は、水中で５０ｍＭのギ酸バッ
ファー（ｐＨ４）、５００ｍＭのＴＣＥＰおよびクエンチ溶液０．５％（ｖ／ｖ）トリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）であった。バッファーＡは、水中で０．２５％ギ酸／１０％メタノ
ール／１０％エチレングリコールであり、バッファーＢは、水中で０．２５％ギ酸アセト
ニトリルであった。全ての化学薬品はＳｉｇｍａから購入し、ＨＰＬＣ勾配溶媒はＦｉｓ
ｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。
液体処理およびクロマトグラフィー
自動水素−重水素交換質量分析（ＨＤＸ ＭＳ）実験は、Walesら (2006) Anal. Chem.
78:1005-1014により記載されている方法および装置に基づいて設計した。要するに、全
ての液体処理操作は、２℃で維持された冷蔵エンクロージャー中に入れられたＰａｌ Ｈ
ＴＳ液体−ハンドラー(handler)（LEAP Technologies）を使用した。６−ポート注入バル
ブおよび洗い場を液体−ハンドラーレール上に搭載し、クロマトグラフィーシステムへの
サンプル注入およびシリンジ洗浄を容易にした。クロマトグラフィーシステムは、分析カ
ラム（１００μｍｘ〜６０ｍｍ、Kinetex ２．６μｍ Ｃ１８、Phenomenex）として、
さらなる１０−ポートバルブ、２．１ｍｍｘ３０ｍｍ Ｐｏｒｏｓｚｙｍｅ ペプシンカ
ラム（Applied Biosystems）、逆相０．５ｍｍｘ２ｍｍ Ｃａｐ Ｔｒａｐ カートリッ
ジ（Michrom Bioresources）、および自己パック(self-packed)エレクトロスプレーエミ
ッターからなった。１０−ポートバルブヘッド、トラップカートリッジおよび分析カラム
を、アルミニウムから構築された別々のエンクロージャー中に入れ、ペルチェ(peltier)
スタック(stack)により−５℃で維持した。バルブおよびカラムを、サンプルを質量分析
計のエレクトロスプレーオン化（ＥＳＩ）供給源に導入前に、タンパク質消化、ペプチド
脱塩および逆相クロマトグラフィーを一列に可能にする方法で配置した（LTQ-Orbitrap,
Thermo Scientific）。
操作のために必要な流体の流れは、２つの別々のＨＰＬＣポンプにより提供した。第１
のＨＰＬＣ（Surveyor MS pump, Thermo Scientific）は、１２５μＬ／分の一定流速で
バッファーＡを送達し、１０−ポートバルブを介して搭載された逆相トラップカートリッ
ジ上に固定されたペプシンカートリッジを通してサンプルを移動させるように使用した。
ローディングおよび脱塩期間後、１０−ポートバルブを、勾配ポンプ（AQUITY UPLC, Wat
ers）の助けで、逆相トラップカートリッジから、分析カラムを介して質量分析計のイオ
ン供給源にサンプルを溶離するように切り替えた。固定された酵素カートリッジを単離し
、勾配溶離中に浪費した。勾配ポンプは、５μＬ／分で３５分にわたる０から４０％の移
動相Ｂおよび５μＬ／分で１０分にわたる４０から９５％の移動相Ｂの直線的勾配セグメ
ントを送達した。ポンプからの勾配流量は、勾配溶離のためのトラップカートリッジおよ
び分析カラムを介する実際の流量が〜１μＬ／分であるように、受動スプリッター(split
ter)を使用して１０−ポートバルブで分けた。全クロマトグラフィー稼働は、洗浄および
平衡工程を含んで７０分の長さであった。
質量分析
オンライン消化から得られるタンパク質分解断片の同定の目的のために、いくつかのデ
ータ依存性ＭＳ／ＭＳ実験を行った。これらの獲得のために、タンデムＭＳスペクトルは
、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐハイブリッド質量分析計のＬＴＱ分析器で獲得した。前駆質
量選択は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ分析器によって獲得したＭＳスキャンに基づいた。重水素化
レベル決定の目的ために行われる単段階ＭＳ獲得は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ（ｍ／ｚ４００−
２０００にわたる）分析器によって６０，０００の分解能で獲得した。
タンパク質およびタンパク質：Ｆａｂ複合体の調製
ＨＥＲ３タンパク質を、５０μｇのＨＥＲ３−Ｔａｇを２５ｍＭ ＴＢＳ（ｐＨ７．５
）／５００ｍＭ ＮａＣｌで希釈することにより調製し、５０μＬの最終容量を得た。タ
ンパク質：Ｆａｂ複合体を、Ｆａｂ試験で１：１モル比において５０μｇのＨＥＲ３−Ｔ
ａｇを混合することにより調製した。次に、タンパク質：Ｆａｂ混合物を、２５ｍＭ Ｔ
ＢＳ（ｐＨ７．５）／５００ｍＭ ＮａＣｌで５０μＬの最終容量に希釈した。
タンパク質：Ｆａｂ複合体を調製し、４℃で少なくとも２時間インキュベートした。サ
ンプル、希釈剤、クエンチおよび還元溶液を含む４つの９６−ウェルプレートを、それぞ
れの実験の開始前に、液体−ハンドラーに負荷した。交換実験のために、５０μＬのＨＥ
Ｒ３またはＨＥＲ３：Ｆａｂ複合体を１５０μＬのＤ２Ｏバッファーで希釈した。混合物
を、２００μＬの還元バッファーを１分間で加えることにより還元し、６００μＬのクエ
ンチバッファーでクエンチした。全ての液体処理工程後の全容量は〜１ｍＬであった。混
合後、クエンチされた溶液を、自動的に消化し、分離し、ＬＣＭＳにより分析されるクロ
マトグラフィーシステムに注入した。サンプルおよびコントロール間の重水素化における
平均変化を、サンプルおよびコントロール間の重水素取込レベルの差として計算した。
データ処理
Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＲＡＷファイルを、社内プログラム（RawXtract）を使用してｍｚ
ＸＭＬファイルに変換した。次に、タンデムＭＳ獲得をＳＥＱＵＥＳＴ（Yates Lab, Scr
ipps Research Institute, La Jolla, CA）を使用して探索し、検索結果をＤＴＡＳｅｌ
ｅｃｔ ２．０（Yates Lab, Scripps Research Institute, La Jolla, CA）を使用して
自動的にフィルターにかけた。ペプチド配列同定を使用して、社内で作製されたプログラ
ムを使用して、それぞれの同定された配列に対する単一イオンクロマトグラムを自動的に
抽出し、クロマトグラフィーピークにわたって平均スペクトルを作成した。平均スペクト
ルをなめらかにし、重心をとった(centroided)。重水素摂取のレベルを、重水素サンプル
および非重水素基準間の重量の差としてとった。処理データを手動で確認し、調整して、
自動処理工程からの不正確(inaccuracy)および誤差を正した。重水素取込レベルを、それ
ぞれのペプチドにわたって重水素量を非局在化することにより、タンパク質配列のそれぞ
れの残基に割り当てた（すなわち、観察される重水素化レベルを、ペプチド中のアミノ酸
の数で割る）。残基が２つ以上のペプチドによりカバーされるとき、残基をカバーする全
てのペプチドの標準化重水素取込を平均化した。
実施例９：ヒトＨＥＲ３／ＭＯＲ０９８２３ ＦａｂおよびヒトＨＥＲ３／ＭＯＲ０９８
２５ Ｆａｂ複合体のｘ線結晶構造決定
本実施例は、３．２Åおよび３．４Åの分解能でそれぞれ決定されたＭＯＲ０９８２３
のＦａｂ断片およびＭＯＲ０９８２５のＦａｂ断片に結合した全長ＨＥＲ３の結晶構造を
示す。さらに、タグ化ヒトＨＥＲ３をＰＢＳ（ｐＨ７．３）にて平衡化されたＨｉＬｏａ
ｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＰｒｅｐＧｒａｄｅ カラム（GE Healthc
are）にて精製した。大腸菌発現ＭＯＲ０９８２３およびＭＯＲ０９８２５ Ｆａｂを、
細胞をリゾチームで溶解することにより単離し、Ｈｉｓ６−タグ化Ｆａｂ断片をＨｉｓＴ
ｒａｐ＿ＨＰ（GE Healthcare）カラムで捕獲した。さらに、ＭＯＲ０９８２３ Ｆａｂ
−断片を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌにて平衡化されたＳ
ｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １６／６０ カラム（GE Healthcare）を使用してゲル濾過クロ
マトグラフィーにより精製した。
ＨＥＲ３ Ｆａｂ複合体を、１．３−１．８：１（ＨＥＲ３およびＦａｂのそれぞれに
対して０．９および１．４（ｍｇ／ｍｌ）−１ｃｍ−１の計算された減衰係数を使用して
２８０ｎｍでの吸光度により概算された濃度）のモル比において、Ｆａｂをタグ化ＨＥＲ
３と混合し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌにて平衡化され
たＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ カラム（GE Healthcare）にて複合体を精
製することにより調製した。ピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣＭＳにより分析し
た。それぞれの複合体に対して、およそ等モル比にてＨＥＲ３およびＦａｂの両方を含む
画分をプールし、濃縮した。ＨＥＲ３／ＭＯＲ０９８２３結晶を、１５０ｎｌのＨＥＲ３
／ＭＯＲ０９８２３複合体および１５０ｎｌの貯蔵溶液（１００ｍＭ クエン酸ナトリウ
ム ｐＨ５．６、２０％ ＰＥＧ ４０００および２０％ イソプロパノール）を含む滴
から座滴蒸気拡散により２９３Ｋで成長させた。結晶をさらなる８％ グリセロールを含
む貯蔵溶液に移し、液体窒素にて瞬間冷凍した。ＨＥＲ３／ＭＯＲ０９８２５結晶を、１
５０ｎｌのＨＥＲ３／ＭＯＲ０９８２５複合体および１５０ｎｌの貯蔵溶液（１００ｍＭ
ビス−トリス ｐＨ６．５、１６％ ＰＥＧ １０，０００）を含む滴から座滴蒸気拡
散により２９３Ｋで成長させた。結晶を１００ｍＭ ビス−トリス ｐＨ６．５、１８％
ＰＥＧ １０，０００および２２％ グリセロールに移し、液体窒素にて瞬間冷凍した
。
データを、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ（Argonne National Labor
atory）でビームライン１７−ＩＤで回収した。ＨＥＲ３／ＭＯＲ０９８２３ Ｆａｂ複
合体データを処理し、良い統計値で、セル寸法 ａ＝１２４．１６、ｂ＝１３９．４４、
ｃ＝１８０．２５Åで空間群Ｉ２２２においてＨＫＬ２０００（HKL Research Inc）を使
用して３．２Åで取った。ＨＥＲ３／ＭＯＲ０９８２３ Ｆａｂ構造は、Ｆａｂの断片お
よびサーチモデルとしての公開されたＨＥＲ３ ＥＣＤ構造で、Ｐｈａｓｅｒ（McCoyら
(2007) J. Appl. Cryst. 40:658-674）を使用する分子置換により解いた。非対称ユニッ
トあたり１分子のＨＥＲ３／ＭＯＲ０９８２３ Ｆａｂ複合体を含む最終モデルを、ＣＯ
ＯＴ（Emsley & Cowtan (2004) Acta Cryst. 60:2126-2132）において構築し、ＢＵＳＴ
ＥＲ（Global Phasing, LTD）を使用して、結合距離および結合角のそれぞれに対して０
．０１０Åおよび１．３７°のｒｍｓｄで１９．０および２４．５％のそれぞれのＲおよ
びＲｆｒｅｅ値に精密化した。ＰｙＭＯＬ（Schroedinger, LLC）にて同定されるＭＯＲ
０９８２３ Ｆａｂ中のあらゆる原子の５Å内の原子を含むＨＥＲ３の残基は、表１１お
よび１２に記載されている。ＨＥＲ３／ＭＯＲ０９８２５ Ｆａｂ複合体データを処理し
、良い統計値で、セル寸法 ａ＝１２４．２３、ｂ＝１４０．９４、ｃ＝１８０．２５Å
で空間群Ｉ２２２においてａｕｔｏＰＲＯＣ（Global Phasing, LTD）を使用して３．４
Åで取った。ＨＥＲ３／ＭＯＲ０９８２５ Ｆａｂ構造は、サーチモデルとしてＨＥＲ３
／ＭＯＲ０９８２３ Ｆａｂ構造で、Ｐｈａｓｅｒ（McCoyら, (2007) J. Appl. Cryst.
40:658-674）を使用する分子置換により解いた。非対称ユニットあたり１分子のＨＥＲ３
／ＭＯＲ０９８２５ Ｆａｂ複合体を含む最終モデルを、ＣＯＯＴ（Emsley & Cowtan (2
004) Acta Cryst. 60:2126-2132）において構築し、ＢＵＳＴＥＲ（Global Phasing, LTD
）を使用して、結合距離および結合角のそれぞれに対して０．００９Åおよび１．２１°
のｒｍｓｄで１８．８および２４．９％のそれぞれのＲおよびＲｆｒｅｅ値に精密化した
。ＰｙＭＯＬ（Schroedinger, LLC）にて同定されるＭＯＲ０９８２５ Ｆａｂ中のあら
ゆる原子の５Å内の原子を含むＨＥＲ３の残基は、表１３および１４に記載されている。
実施例１０：ホスホ−ＨＥＲ３のインビトロ細胞アッセイ
ＭＣＦ−７細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、Ｌ−グルタミン、Ｍｃ
Ｃｏｙ’ｓ ５ａ中で１０％ ＦＣＳおよびＳＫ−Ｂｒ−３、１０％ ＦＣＳ、１．５ｍ
Ｍ Ｌ−グルタミンに慣例通りに維持した。完全培地において培養したサブコンフルエン
トＭＣＦ７またはＳＫ−Ｂｒ−３細胞をアキュターゼ（PAA Laboratories）で回収し、５
ｘ１０５個の細胞／ｍＬの最終濃度で適当な増殖培地に再懸濁した。次に、１００μＬの
細胞懸濁液を９６−ウェル平底プレート（Nunc）のそれぞれのウェルに加え、５ｘ１０４
個の細胞／ウェルの最終密度を得た。ＭＣＦ７細胞を約３時間で付着させ、培地を０．５
％ ＦＢＳを含む飢餓培地と交換した。次に、全てのプレートを３７℃で一晩インキュベ
ートし、３７℃で８０分間で適当な濃度のＨＥＲ３抗体（適当な培地において希釈された
）で処理した。ＭＣＦ７細胞を、最後の２０分間、５０ｎｇ／ｍＬのニューレグリン１−
β１ ＥＧＦドメイン（Ｒ&D Systems）で処理し、ＨＥＲ３リン酸化を刺激した。全ての
培地を穏やかに吸引し、細胞を１ｍＭ ＣａＣｌ２および０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Gibc
o）を含む氷冷ＰＢＳで洗浄した。細胞に５０μＬの氷冷溶解バッファー（２０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ（ｐＨ８．０）／１３７ｍＭ ＮａＣｌ／１０％ グリセロール／２ｍＭ ＥＤＴ
Ａ／１％ ＮＰ−４０／１ｍＭ オルトバナジウム酸ナトリウム／アプロチニン（１０μ
ｇ／ｍＬ）／ロイペプチン（１０μｇ／ｍＬ））を加えることにより溶解し、３０分間震
盪しながら氷上でインキュベートした。次に、溶解物を回収し、１８００ｇで４℃で１５
分間で回転させ、細胞残屑を除去した。２０μＬの溶解物を前調製された捕獲プレートに
加えた。
ＨＥＲ３捕獲プレートを、４℃で一晩でＰＢＳで希釈された２０μＬの４μｇ／ｍＬの
ＭＡＢ３４８１捕捉抗体（R&D Systems）でコーティングされた炭素プレート（Mesoscale
Discovery）を使用して製造し、次に１ｘ Ｔｒｉｓ バッファー（Mesoscale Discover
y）／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０中の３％ウシ血清アルブミンでブロックした。ＨＥＲ
３を、震盪しながら１時間室温でプレートをインキュベートすることにより溶解物から捕
獲し、溶解物を吸引し、ウェルを１ｘ Ｔｒｉｓ バッファー（Mesoscale Discovery）
／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄した。リン酸化ＨＥＲ３を、１％ ＢＳＡ／１ｘ
Ｔｒｉｓ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０中で調製された０．７５μｇ／ｍＬのビオチン化
抗−ホスホチロシン抗体（R&D Systems）を使用して、室温で１時間震盪しながらインキ
ュベートすることにより検出した。ウェルを１ｘ Ｔｒｉｓ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２
０で４回洗浄し、ビオチン化タンパク質を、室温で１時間、１％ ＢＳＡ／１ｘ Ｔｒｉ
ｓ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で希釈されたＳ−Ｔａｇ標識化ストレプトアビジン（Me
soscale Discovery）とインキュベートすることにより検出した。それぞれのウェルを吸
引し、１ｘ Ｔｒｉｓ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、界面活性剤（Mesosc
ale Discovery）を有する２０μＬのＲｅａｄ バッファー Ｔを加え、シグナルをＭｅ
ｓｏｓｃａｌｅ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒを使用して定量化した。抗体ＭＯＲ０６３
９１またはＭＯＲ０３２０７を、シグナル伝達実験においてアイソタイプコントロールと
して含んだ。
実施例１１：ホスホ−Ａｋｔ（Ｓ４７３）のインビトロ細胞アッセイ
完全培地において培養したサブコンフルエントＳＫ−Ｂｒ−３およびＢＴ−４７４細胞
をアキュターゼ（PAA Laboratories）で回収し、５ｘ１０５個の細胞／ｍＬの最終濃度で
適当な増殖培地に再懸濁した。次に、１００μＬの細胞懸濁液を９６−ウェル平底プレー
ト（Nunc）のそれぞれのウェルに加え、５ｘ１０４個の細胞／ウェルの最終密度を得た。
次に、全てのプレートを３７℃で一晩インキュベートし、３７℃で８０分間で適当な濃度
のＨＥＲ３抗体（適当な培地において希釈された）で処理した。全ての培地を穏やかに吸
引し、細胞を１ｍＭ ＣａＣｌ２および０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Gibco）を含む氷冷Ｐ
ＢＳで洗浄した。細胞に５０μＬの氷冷溶解バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．
０）／１３７ｍＭ ＮａＣｌ／１０％ グリセロール／２ｍＭ ＥＤＴＡ／１％ ＮＰ−
４０／１ｍＭ オルトバナジウム酸ナトリウム／アプロチニン（１０μｇ／ｍＬ）／ロイ
ペプチン（１０μｇ／ｍＬ））を加えることにより溶解し、３０分間震盪しながら氷上で
インキュベートした。次に、溶解物を回収し、１８００ｇで４℃で１５分間で回転させ、
細胞残屑を除去した。２０μＬの溶解物を、３％ ＢＳＡ／１ｘ Ｔｒｉｓ／０．１％
Ｔｗｅｅｎ−２０で以前にブロックされたマルチスポット ３８４−ウェル ホスホ−Ａ
ｋｔ炭素プレート（Mesoscale Discovery）に加えた。プレートを震盪しながら２時間室
温でプレートをインキュベートし、溶解物を吸引し、ウェルを１ｘ Ｔｒｉｓ バッファ
ー（Mesoscale Discovery）／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄した。リン酸化Ａｋｔ
を、１％ ＢＳＡ／１ｘ Ｔｒｉｓ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で５０倍に希釈された
２０μＬのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ 抗−ホスホ−Ａｋｔ（Ｓ４７３）抗体（Mesoscale Disc
overy）を使用して、室温で２時間震盪しながらインキュベートすることにより検出した
。ウェルを１ｘ Ｔｒｉｓ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、界面活性剤（Me
soscale Discovery）を有する２０μＬのＲｅａｄ バッファー Ｔを加え、シグナルを
Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒを使用して定量化した。抗体ＭＯＲ０
６３９１またはＭＯＲ０３２０７を、シグナル伝達実験においてアイソタイプコントロー
ルとして含んだ。
実施例１２：細胞系増殖アッセイ
ＳＫ−Ｂｒ−３細胞を、１０％ ウシ胎児血清で修飾され、補われたＭｃＣｏｙ’ｓ
５Ａ培地で日常的に培養し、ＢＴ−４７４細胞を１０％ ＦＢＳを補ったＤＭＥＭで培養
した。サブコンフルエント細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、増殖培地で５ｘ１
０４個の細胞／ｍＬに希釈し、５０００個の細胞／ウェルの密度で９６−ウェル透明底黒
色プレート（Costar 3904）に置いた。細胞を３７℃で一晩インキュベートし、適当な濃
度のＨＥＲ３抗体（１０または１μｇ／ｍＬの典型的な最終濃度）を加えた。プレートを
６日間インキュベーターに戻し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Promega）を使用して細
胞生存能力を評価した。１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ溶液をそれぞれのウェ
ルに加え、１０分間穏やかに震盪しながら室温でインキュベートした。発光の量を、スペ
クトルＭａｘ プレートリーダー（Molecular Devices）を使用して決定した。それぞれ
の抗体で得られた増殖阻害の程度を、それぞれのＨＥＲ３抗体で得られる発光値を標準ア
イソタイプコントロール抗体（ＭＯＲ０６３９１）と比較することにより計算した。
増殖アッセイのために、ＭＣＦ−７細胞を、４ｍＭ Ｌ−グルタミン／１５ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳ／１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）で慣例通りに培養した。サブ
コンフルエント細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、４ｍＭ Ｌ−グルタミン／１
５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１０μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン／０．２％ ＢＳＡを含む
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）で１ｘ１０５個の細胞／ｍＬに希釈した。細胞を５０００個
の細胞／ウェルの密度で９６−ウェル透明底黒色プレート（Costar）に置いた。次に、適
当な濃度のＨＥＲ３抗体（１０または１μｇ／ｍＬの典型的な最終濃度）を加えた。１０
ｎｇ／ｍＬのＮＲＧ１−β１ ＥＧＦ ドメイン（R&D Systems）もまた適当なウェルに
加え、細胞増殖を刺激した。プレートを６日間インキュベーターに戻し、ＣｅｌｌＴｉｔ
ｅｒ−Ｇｌｏ（Promega）を使用して細胞生存能力を評価した。それぞれの抗体で得られ
た増殖阻害の程度を、背景（ニューレグリンなし）発光値を引き、それぞれの抗−ＨＥＲ
３抗体で得られる値を標準アイソタイプコントロール抗体（ＭＯＲ０６３９１）と比較す
ることにより計算した。
実施例１３：リガンドブロッキング細胞アッセイ
１０％ ＦＢＳおよび１μｇ／ｍＬのインスリン（Sigma）を補ったＭＥＭで培養した
ＭＣＦ−７細胞を濯ぎ、小容量のＦＡＣＳｍａｘ細胞解離バッファー（Genlantis）に回
収し、５ｍＬのＦＡＣＳ バッファー（ＰＢＳ／１％ ＦＢＳ／０．１％ アジ化ナトリ
ウム）を加えた。細胞密度をカウントし、１ｘ１０６個の細胞／ｍＬの最終濃度に調整し
た。１００μｌの細胞懸濁液を９６−ウェルプレートのそれぞれのウェルに加え、細胞を
遠心分離（２２０ｇ、３分、４℃）にてペレット化した。細胞ペレットを、ＦＡＣＳバッ
ファー（１００から０．１ｎＭの範囲である典型的な最終抗体濃度）に希釈された１００
μＬの適当な試験抗体に再懸濁し、プレートを４５分間氷上でインキュベートした。リガ
ンドブロッキング抗体ＭＡＢ３４８１（R&D Systems）をポジティブコントロールとして
含んだ。細胞を染色バッファーで２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファーで希釈された１０ｎＭ
のＮＲＧ１−β１ ＥＧＦ ドメイン（R&D Systems）を加え、４５分間氷上でインキュ
ベートした。細胞を染色バッファーで２回洗浄し、結合したニューレグリンを、細胞を１
０ｎＭの抗−ヒトＮＲＧ１−β１ ＥＧＦ ドメイン抗体（R&D Systems）と４５分間氷
上でインキュベートすることにより検出した。細胞を染色バッファーで２回洗浄し、ＦＡ
ＣＳバッファーにて１／５００希釈されたＰＥ−結合抗−ヤギ抗体（Jackson ImmunoRese
arch）と４５分間氷上でインキュベートした。次に、細胞を遠心分離にてペレット化し、
ペレットを２００μＬのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。それぞれのサンプルを定量す
るために、１０，０００個の生存細胞をＬＳＲ ＩＩ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（
BD Biosciences）上でカウントし、平均チャネル蛍光を測定することにより細胞表面結合
ニューレグリンの量を評価した。
実施例１４：リガンドブロッキング生化学的アッセイ
本方法は、ニューレグリンに結合するＨＥＲ３／抗体複合体の能力を試験するための、
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）−ベースのバイオセンサー（BiacoreTM, GE Healthcare,
Uppsala, Sweden）の有用性を含む。
ＢｉａｃｏｒｅＴＭは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の減少を利用し、結合相互作用
を検出し、測定する。典型的なＢｉａｃｏｒｅ実験において、相互作用する分子（ニュー
レグリン）の１つはマトリックス上に固定されるが、相互作用するパートナー（ＨＥＲ３
）は表面上を流れる。結合相互作用は、センサー表面上の質量における増加およびセンサ
ー表面の近接における培地の屈折率における対応する直接的変化をもたらす。屈折率また
はシグナルの変化を、複合体の結合および解離によって共鳴単位（Ｒ．Ｕ．）シグナル変
化において記録し、非浸潤性方法において、連続的に、リアルタイムでモニタリングし、
該結果をセンサーグラムの型において報告する。
ＢｉａｃｏｒｅＴＭ Ｔ１００（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）を使用して、本明
細書において報告されている全ての実験を行った。センサー表面調製および相互作用分析
を２５℃で行った。バッファーおよびＢｉａｃｏｒｅ試薬は、GE Healthcareから購入し
た。１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｐ２０、
０．５％ ＢＳＡを含むランニングバッファーを、アッセイで利用した。
ＮＲＧ−１β１細胞外ドメイン（R&D Systems）を、ＥＺ−連結スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ
−ＬＣ−ビオチン（Pierce）と５：１のモル比で４５分間、氷上でインキュベートした。
反応を過剰のエタノールアミンの添加を介してクエンチし、脱塩スピンカラム（Zeba）を
使用してビオチン化−ＮＲＧから非結合ビオチンを除去した。ビオチン化−ＮＲＧを、約
３０００Ｒ．Ｕ．のｓｓＤＮＡ−ストレプトアビジン（ビオチン捕獲キット）であらかじ
め固定されたセンサーチップＣＡＰ上に捕獲し、４００−６００Ｒ．Ｕの範囲のニューレ
グリン表面密度を生じた。ｓｓＤＮＡ−ストレプトアビジンのみがフローセル表面上に存
在するように、参照フローセルを、ビオチン化−ＮＲＧを注入工程から省くことにより作
製した。
ＨＥＲ３／抗体複合体を、適当な試験抗体の濃度（０−５０ｎＭ）を増加させながら１
０ｎＭ ヒトＨＥＲ３−Ｆｃを室温で１５分間インキュベートすることにより作製し、Ｂ
ｉａｃｏｒｅＴＭと１０℃でインキュベートした。相互作用分析は、６０μＬ／分の流速
で１８０秒間連続して参照およびニューレグリン表面上に、ＨＥＲ３／抗体複合体を注入
することにより行った。複合体解離を、６０μＬ／分の流速で１８０秒間モニタリングし
た。３０μＬ／分の流速で、８Ｍ グアニジン：１Ｍ ＮａＯＨ（３：１）の１２０秒注
入、次に、３０％ アセトニトリル／０．２５Ｍ ＮａＯＨの１２０秒注入を使用するそ
れぞれの分析サイクルの最後に、表面再生を行った。
実施例１５：インビボＰＤ試験
ＢｘＰＣ３およびＢＴ−４７４細胞を培養し、実施例１６および１７に記載されている
メス無胸腺 ｎｕ／ｎｕ Ｂａｌｂ／Ｃ マウス（Harlan Laboratories）に注入した。
腫瘍が適当なサイズに達したとき、動物を腫瘍の質について試験した。潰瘍化腫瘍を有
する動物または液体で満たされた(fluid-filled)腫瘍を有する動物を、試験から除いた。
残りの動物に、抗体を外側尾静脈注射を介して静脈内に投与した。所定の時点で、動物を
ＣＯ２窒息を介して殺し、全血を心穿刺を介して回収し、１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒ
ｆ回収チューブに入れた。腫瘍組織を即座に切断し、ねじぶた付きポリプロピレンサンプ
ルチューブに入れ、液体窒素で瞬間凍結した。溶解物を調製するまで、組織を−８０℃で
貯蔵した。
実施例１６：インビボＢＴ−４７４有効性試験
移植の時まで、ＢＴ−４７４細胞を、抗生物質を含まない１０％加熱不活性化ウシ胎児
血清を含むＤＭＥＭ中で培養した。
細胞接種の１日前に、血清エストロゲンレベルを維持するように、メス無胸腺ｎｕ／ｎ
ｕ Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Harlan Laboratories）に、持続放出１７β−エストラジオー
ル ペレット（Innovative Research of America）を皮下に移植した。１７β−エストラ
ジオール ペレット移植の１日後に、５×１０６個の細胞を、ハンクス液中に５０％フェ
ノールレッドフリーマトリゲル（BD Biosciences）を含む懸濁液中で、４番目の乳房脂肪
体に同所注射した。懸濁液中に細胞を含む注射の全容量は２００μＬであった。細胞移植
後２０日間、約２００ｍｍ３の腫瘍体積を有する動物を有効性試験に登録した。一般的に
、１グループあたり全１０匹の動物を有効性試験に登録した。
単剤試験において、動物に、ＭＯＲ１０７０１またはＭＯＲ１０７０３のいずれかを外
側尾静脈注射を介して静脈内に投与した。開始負荷用量の４０ｍｇ／ｋｇを、第１の投与
で投与した。開始投与後、動物に、試験期間中、一日おきのスケジュールで２０ｍｇ／ｋ
ｇで投与した。組合せ試験において、動物に、ＭＯＲ１０７０１またはＭＯＲ１０７０３
のいずれか（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ、ｑ２ｄ）および準最適な用量のトラスツマブ（１ｍ
ｇ／ｋｇ、ｉｖ、２ｑｗ）を投与した。
試験期間中、腫瘍体積を、週に２回キャリパーにより測定した。処置／コントロール（
Ｔ／Ｃ）パーセント値を、以下の式を使用して計算した：
％Ｔ／Ｃ＝１００×△Ｔ／△Ｃ、△Ｔ＞０のとき
式中：
Ｔ＝試験の最終日の薬物処置グループの平均腫瘍体積；
△Ｔ＝試験最終日の薬物処置グループの平均腫瘍体積−投与の開始日の薬物処置グループ
の平均腫瘍体積；
Ｃ＝試験最終日のコントロールグループの平均腫瘍体積；および
△Ｃ＝試験最終日のコントロールグループの平均腫瘍体積−投与の開始日のコントロール
グループの平均腫瘍体積
体重を週に２回測定し、用量を体重にて調整した。体重変化％を、（ＢＷ現在−ＢＷ開
始）／（ＢＷ開始）×１００として計算した。データは、処置開始日からの体重変化パー
セントとして示す。
全てのデータは、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として示した。デルタ腫瘍体積および体重
は、統計分析のために使用した。グループ間の比較を、一元配置ＡＮＯＶＡ、次に、ｐｏ
ｓｔ ｈｏｃ Ｔｕｋｅｙを使用して行った。全ての統計評価のために、有意レベルは、
ｐ＜０．０５であった。ビヒクルコントロールグループと比較しての有意性が報告される
。
実施例１７：インビボＢｘＰＣ３有効性試験
移植の時まで、ＢｘＰＣ３細胞を、抗生物質を含まない１０％加熱不活性化ウシ胎児血
清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。
メス無胸腺ｎｕ／ｎｕ Ｂａｌｂ／Ｃ マウス（Harlan Laboratories）に、１０×１
０６個の細胞を、５０％マトリゲルを含む５０％リン酸緩衝生理食塩水の混合物中で、皮
下に移植した。懸濁液中に細胞を含む注射の全容量は２００μＬであった。腫瘍が約２０
０ｍｍ３のサイズに達したとき、動物を有効性試験に登録した。一般的に、１グループあ
たり全１０匹の動物を試験に登録した。動物が登録前に異常な腫瘍増殖特性を示したとき
、それらを登録から除外した。
動物に、外側尾静脈注射を介して静脈内に投与した。開始負荷用量の４０ｍｇ／ｋｇを
、第１の用量で投与した。開始用量後、動物に、試験期間（処置下で２５日間）中、一日
おきのスケジュールで２０ｍｇ／ｋｇで投与した。腫瘍体積およびＴ／Ｃ値は、以前に詳
細に記載されているとおりに、計算した。
実施例１８：ホスホ−Ａｋｔ（Ｓ４７３）インビボＰＤアッセイ
約５０ｍｍ３の凍結腫瘍（例えば、ＢＴ−４７４またはＢＸＰＣ−３）組織を氷上で解
凍し、ホスファターゼ（Roche）およびプロテアーゼ阻害剤（Roche）を含む１００−３０
０μＬのＴ−ＰＥＲバッファー（Pierce）を、それぞれのサンプルに加えた。加えられる
溶解バッファーの容量は、腫瘍サンプルのサイズに依存させた。組織を１．５ｍＬの乳棒
（Fisher Scientific）を使用して破壊し、得られた懸濁液を１５分間氷上でインキュベ
ートし、−８０℃で一晩凍結した。サンプルを解凍し、１３０００ｇで４℃で１５分間回
転させ、上清タンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Thermo Scientific）により定量した。
組織上清を溶解バッファー（Mesoscale Discovery）で希釈し、２５μｇを、以前にＢｌ
ｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ−Ａ（Mesoscale Discovery）でブロックされているマ
ルチ−スポット ９６−ウェル ホスホ−Ａｋｔ 炭素プレート（Mesoscale Discovery
）に加えた。プレートを、室温で１時間震盪しながらインキュベートし、溶解物を吸引し
、ウェルをＴｒｉｓ洗浄バッファー（Mesoscale Discovery）で４回洗浄した。リン酸化
Ａｋｔを、室温で１時間震盪しながらインキュベートすることにより、抗体希釈バッファ
ーで希釈された２５μＬのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ 抗−ホスホ−Ａｋｔ（Ｓ４７３）抗体（
Mesoscale Discovery）を使用して検出した。ウェルをＴｒｉｓ洗浄バッファーで４回洗
浄し、１５０μＬのＲｅａｄ バッファー Ｔ（界面活性剤を含む）（Mesoscale Discov
ery）を加え、シグナルをMesoscale Sector Imagerを使用して定量した。
実施例１９：ホスホＨＥＲ３（Ｙ１１９７）インビボＰＤアッセイ
約５０ｍｍ３の凍結腫瘍（例えば、ＢＸＰＣ−３）組織を氷上で解凍し、ホスファター
ゼ（Roche）およびプロテアーゼ阻害剤（Roche）を含む１００−３００μＬのＴ−ＰＥＲ
バッファー（Pierce）を、それぞれのサンプルに加えた。組織を１．５ｍＬの乳棒（Fish
er Scientific）を使用して破壊し、得られた懸濁液を１５分間氷上でインキュベートし
、−８０℃で一晩凍結した。サンプルを解凍し、１３０００ｇで４℃で１５分間回転させ
、上清タンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Thermo Scientific）により定量した。組織上
清を溶解バッファーで希釈し、１５０μｇを、以前に４μｇ／ｍＬ ＭＡＢ３４８１（R&
D Systems）で一晩被覆され、３％ミルクでブロックされているマルチ−スポット ９６
−ウェル 炭素プレート（Mesoscale Discovery）に加えた。プレートを、室温で２時間
震盪しながらインキュベートし、溶解物を吸引し、ウェルをＴｒｉｓ洗浄バッファー（Me
soscale Discovery）で４回洗浄した。リン酸化 ＨＥＲ３を、バッファーで１／８００
０希釈された抗−ＨＥＲ３ ｐＹ１１９７を使用して結合させた。室温で１時間インキュ
ベーション後、ウェルをＴｒｉｓ洗浄バッファーで洗浄し、抗−ｐＹ１１９７抗体を、室
温で１時間震盪しながらインキュベートすることにより、ブロッキングバッファーで１／
１０００希釈されたＳ−Ｔａｇ標識化抗−ウサギ抗体（Mesoscale Discovery）を使用し
て検出した。ウェルをＴｒｉｓ洗浄バッファーで４回洗浄し、１５０μＬの１／４希釈Ｒ
ｅａｄ バッファー Ｔ（界面活性剤を含む）（Mesoscale Discovery）を加え、シグナ
ルをMesoscale Sector Imagerを使用して定量した。
実施例２０：インビトロ薬物組合せ試験
標的化治療と組み合わせるためのＨＥＲ３−標的化抗体の能力を評価するために、ＭＯ
Ｒ０９８２５またはＭＯＲ１０７０３を、細胞生存能力アッセイにおいて、トラスツマブ
、ラパチニブ、ＢＥＺ２３５、ＢＫＭ１２０、ＢＹＬ７１９、ＲＡＤ００１、エルロチニ
ブおよびセツキシマブと組み合わせた。約１０００−１５００個のＳＫ−Ｂｒ−３（Ｍｃ
Ｃｏｙ’ｓ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＲＰＭＩ）、ＦａＤｕ（ＥＭＥＭ）またはＬ３．
３（ＲＰＭＩ）細胞を、２％ＦＢＳを補った適当な培養培地において３８４−ウェルプレ
ートに播種し、３７℃で一晩付着させた。次に、それぞれのプレートが、二次元マトリッ
クスにおいてそれぞれの薬物の用量応答曲線を含むように、適当な薬物組合せ（ラパチニ
ブ、ＢＫＭ１２０およびＢＹＬ７１９のための、典型的な最終薬物濃度は、３μＭから１
３ｎＭの範囲であり；ＲＡＤ００１では、２７ｎＭから０．００４１ｎＭの範囲であり；
エルロチニブでは、１μＭから０．００２５ｎＭの範囲であり；ＭＯＲ１０７３では、１
００ｎｍから０．０１ｎｍの範囲であり；セツキシマブでは、１００ｎＭから０．００１
５ｎＭの範囲であり；トラスツマブでは、３００ｎＭから０．０４６ｎＭの範囲であった
）をウェルに加えた。プレートを、３−６日間、インキュベーターに戻し、ＣｅｌｌＴｉ
ｔｅｒ−Ｇｌｏ（Promega）を使用して細胞生存能力を評価した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−
Ｇｌｏ溶液をそれぞれのウェルに加え、室温で１０分間穏やかに震盪しながらインキュベ
ートした。発光量をＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Molecular Devices）を使
用して測定した。それぞれの組合せで得られる増殖阻害の程度を計算し、組合せ活性は、
Ｌｏｅｗｅｓ相加(additivity)モデルを使用して強調した。
実施例２１：Ｌ３．３細胞におけるインビボ薬物組合せ試験
移植時まで、膵臓Ｌ３．３細胞を、１０％加熱不活性化ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培
地中で培養した。メス Ｆｏｘｎ１ ヌードマウス（Harlan Laboratories）に、３×１
０６個の細胞をＦＢＳフリーＤＭＥＭ中で皮下に移植した。懸濁液中に細胞を含む注射の
全容量は１００μＬであった。細胞移植後１２日間、全てのグループに対して約１００ｍ
ｍ３の平均腫瘍体積を有する動物を有効性試験に登録した。一般的に、１グループあたり
全８匹の動物を有効性試験に登録した。動物が登録前に異常な腫瘍増殖特性を示したとき
、それらを登録から除外した。
動物に、試験期間（処置下で１４日間）中、一日おきのスケジュールで２０ｍｇ／ｋｇ
で外側尾静脈注射を介してＭＯＲ１０７０３を静脈内に投与した。エルロチニブを５０ｍ
ｇ／ｋｇ（ＰＯ）で、単剤またはＭＯＲ１０７０３と組み合わせてのいずれかでの１日ス
ケジュールで投与した。腫瘍体積およびＴ／Ｃ値は、以前に詳細に記載されているとおり
に、計算した。
結果および議論
集合的に、これらの結果は、抗体の１つのクラスが、ＨＥＲ３の立体構造的エピトープ
のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基に結合し、不活性な、または閉塞的な立
体構造においてＨＥＲ３を安定化することを示す。これらの抗体の結合は、リガンド依存
性およびリガンド非依存性シグナル伝達の両方を阻害する。これらの抗体はまた、同時に
、ＨＥＲ３リガンドに結合することができる。
（ｉ）親和性決定
抗体親和性は、上記溶液平衡滴定（ＳＥＴ）により決定した。該結果は表９に要約され
、ＭＯＲ１０７０１に対する滴定曲線の例は図１に含まれる。該データは、多くの抗体が
ヒト、カニクイザル、ラットおよびマウスＨＥＲ３としっかりと結合することを同定した
ことを示す。
表９：溶液平衡滴定（ＳＥＴ）により決定される抗−ＨＥＲ３ ＩｇＧのＫＤ値。Ｈｕ（
ヒト）、Ｃｙ（カニクイザル）、Ｍｕ（マウス）およびｒａ（ラット）
Figure 0006771002
（ｉｉ） ＳＫ−Ｂｒ−３細胞ＥＣ５０決定
ＨＥＲ３を発現する細胞に結合する同定された抗体の能力を、ＨＥＲ２増幅細胞系ＳＫ
−Ｂｒ−３への結合に対するＥＣ５０値を計算することにより決定した（図２および表１
０参照）。
表１０：ＳＫ−Ｂｒ−３細胞上の抗−ＨＥＲ３ ＩｇＧのＦＡＣＳ ＥＣ５０値。ｎ．ｄ
．（決定されない）
Figure 0006771002
（ｉｉｉ）ＨＥＲ３ドメイン結合
抗−ＨＥＲ３抗体のサブセットは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ヒトＨＥＲ３の種々
の細胞外ドメインに結合する能力に対して特徴付けた。これをなし遂げるために、ＨＥＲ
３の細胞外ドメインを４つの構成的ドメインに分類し、上記のとおり非依存性タンパク質
として、これらのドメインの種々の組合せをクローンし、発現させ、精製した。該戦略を
使用して、以下のドメインを成功裏に可溶性タンパク質として作製した：ドメイン１およ
び２（Ｄ１−２）、ドメイン２（Ｄ２）、ドメイン３および４（Ｄ３−４）ならびにドメ
イン４（Ｄ４）。多くの内部に製造されたマウス抗−ヒトＨＥＲ３抗体（８Ｄ７、１Ｆ５
および８Ｐ２）もまた、それぞれの単離されたドメインの完全性を証明するために、ポジ
ティブコントロールとして試験した。
図３に示されるとおり、ＭＯＲ０９８２３およびＭＯＲ０９８２５の両方が、ＨＥＲ３
細胞外ドメインに成功裏に結合することが観察されたが、単離されたドメインへの結合が
、これらの抗体でのこのアッセイにおいてわずかにしか観察されなかった。該結合パター
ンに対するいくつかの可能性のある説明が存在する：
ａ）ＭＯＲ０９８２３およびＭＯＲ０９８２５が、ドメイン境界にわたる直線状エピトー
プに結合し得、したがって、ドメインが単離されたタンパク質として発現されるとき、結
合エピトープの部分を喪失する。
ｂ）ＭＯＲ０９８２３およびＭＯＲ０９８２５が、多数のドメインと架橋する非直線状エ
ピトープに結合し得る。結果として、成分ユニットへのＨＥＲ３の分離が、結合部位を破
壊し得る。
ｃ）ＨＥＲ３の型／立体構造が、ＨＥＲ３の全長細胞外ドメインのみが該型／立体構造を
採用することができるが、単離されたドメインは該立体構造を完全にとることができない
ような、ＨＥＲ３へのＭＯＲ０９８２３およびＭＯＲ０９８２５の結合の成分であり得る
。
（ｖｉ）水素／重水素交換質量分析を使用するＨＥＲ３エピトープマッピング
ＨＥＲ３エピトープを、さらに、ＭＯＲ０９８２３、ＭＯＲ０９８２４、ＭＯＲ０９８
２５およびＭＯＲ０９９７４のＦａｂバージョンの存在および非存在下でＨＥＲ３ ＥＣ
ＤのＨＤＸ−ＭＳ分析により探索した。図４Ａは、結合Ｆａｂの非存在下で、ＨＥＲ３
ＥＣＤ配列の約６９％が少なくとも１つのペプチドによりカバーされていたことを示す。
範囲内のＧａｐは、これらの領域内の残基のグリコシル化またはドメイン２において特に
明らかであるシステインリッチ領域におけるジスルフィド結合の不十分な減少のためであ
り得る。興味深いことに、それぞれのＦａｂが個々の保護パターンを生じたが、強い保護
の１つの領域は、一貫してＭＯＲ０９８２３、ＭＯＲ０９８２４、ＭＯＲ０９８２５およ
びＭＯＲ０９９７４（図４Ｂ参照）で観察され、これらの高度に関連したファミリーの抗
体が、同一の様式でＨＥＲ３に結合することを示した。最も強い保護は、ドメイン２の残
基２６９−２８６（ＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴＫＹＱＹＧＧＶＣ）（配列番号：１４６）に対
して観察され、該近接残基がｍＡｂ結合に重要であり得ることを示した。公開されたＨＥ
Ｒ３結晶構造（Cho & Leahy, (2002) Science 297:1330-1333）上へのＦａｂ保護残基の
マッピングは、残基２６９−２８６がドメイン２内の機能的に重要なβ−ヘアピンループ
内および近位であることを強調する（図４Ｃ参照）。
（ｖｉｉ）ＨＥＲ３／ＭＯＲ０９８２３結晶構造
ＨＥＲ３細胞外ドメインへ結合したＭＯＲ０９８２３ Ｆａｂ断片の３．２Å分解能
ｘ線結晶構造を、関連抗体のファミリーにより認識されるＨＥＲ３エピトープをさらに定
義するために解明した（図５Ａ参照）。加えて、ヒトＨＥＲ３へ結合したＭＯＲ０９８２
５ Ｆａｂ断片の３．４Å構造を解明した。ＭＯＲ０９８２３／ＨＥＲ３およびＭＯＲ０
９８２５／ＨＥＲ３結晶構造の両方において、ＨＥＲ３は、連結（不活性な）立体構造（
図５Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ参照）内である。該立体構造は、ドメイン２におけるβ−ヘアピ
ン二量体化ループが介在するドメイン２および４間の有意な相互作用接合面により特徴付
けられる。ＨＥＲ３の観察される立体構造は、ニューレグリンの非存在下でのＨＥＲ３細
胞外ドメインの結晶構造を公開したCho et al. (Cho & Leahy, (2002), Science 297:133
0-1333)により以前に記載された構造と類似である。ニューレグリンはＨＥＲ３を活性化
することができるため、ＨＥＲ３の連結立体構造は、不活性であると推定される。関連Ｅ
ＧＦＲファミリーメンバーＨＥＲ４（Bouyainら (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1
02:15024-15029)およびＨＥＲ１(Fergusonら (2003) Molec. Cell 11:507-517）が結晶化
されているとき、同様の連結立体構造もまた、観察されている。
不活性な（連結）状態におけるＨＥＲ３のドメイン１から４の間の空間的関連は、伸長
した（活性な）状態の関連と有意に異なっている。この知見は、共に伸長した（活性な）
状態である関連ＥＧＦＲファミリーメンバーＨＥＲ２およびリガンド結合ＨＥＲ１（Cho
ら (2003) Nature 421:756-760; Ogisoら (2002) Cell 110:775-787; Garrettら (2002)
Cell 110:763-773）の結晶構造に基づく。伸長した状態において、ドメイン２ β−ヘア
ピン二量体化ループは、４との阻害相互作用から放出され、したがって、その二量体化パ
ートナータンパク質と自由に相互作用することができる。したがって、ドメイン２ β−
ヘアピン二量体化ループは、連結（不活性な）状態を維持すること、および伸長した状態
におけるＥＧＦ受容体の二量体化を介在することの両方において機能的に重要であり、細
胞内キナーゼドメインの活性化をもたらす。したがって、ＭＯＲ０９８２３／ＨＥＲ３お
よびＭＯＲ０９８２５／ＨＥＲ３結晶構造（図５参照）は、ＭＯＲ０９８２３およびＭＯ
Ｒ０９８２５の両方が、ＨＥＲ３の不活性な立体構造を安定化することにより機能するこ
とを示唆する。
結晶構造はまた、ＭＯＲ０９８２３およびＭＯＲ０９８２５の両方により認識されるＨ
ＥＲ３エピトープが、ドメイン２および４の両方由来の残基を含む非直線状エピトープで
あること示した（図５ＣおよびＤ、表１１、１２、１３および１４参照）。したがって、
高度に関連した抗体のファミリーにより認識されるＨＥＲ３エピトープは、以下のとおり
に定義することができる：
ドメイン２：残基２６５−２７７、３１５
ドメイン４残基：５７１、５８２−５８４、５９６−５９７、６００−６０２、６０９−
６１５
ＭＯＲ０９８２３またはＭＯＲ０９８２５によるドメイン２および４の両方の結合は、
結果として、ＨＥＲ３の連結立体構造を安定化し、したがって、そのシグナル伝達する能
力をアンタゴナイズする。
結晶構造において観察されるＭＯＲ０９８２３／ＭＯＲ０９８２５結合モードは、本発
明者らの他のエピトープマッピング試験と一致する。具体的には、ＥＬＩＳＡドメイン結
合実験は、ＭＯＲ０９８２３およびＭＯＲ０９８２５の親和性が、無傷なＨＥＲ３細胞外
タンパク質に対して、あらゆる単離されたドメイン（例えば、Ｄ１、Ｄ１−Ｄ２、Ｄ３ま
たはＤ３−Ｄ４断片）よりも、有意に良いことを証明する（図３参照）。抗体認識エピト
ープの部分としてドメイン２ β−ヘアピンを同定するＨＥＲ３ ＨＤＸ−ＭＳデータ（
図４Ｂ参照）の証明もある。最後に、両方の結晶構造は、ＨＥＲ１と類似によりドメイン
１および３にマッピングされているＨＥＲ３のリガンド結合表面（Ogisoら (2002) Cell,
110:775-787; Garrettら (2002) Cell, 110:763-773）が、ＭＯＲ０９８２３またはＭＯ
Ｒ０９８２５結合のいずれかにより閉塞されないことを示す（図５Ｂ参照）。これは、Ｍ
ＯＲ０９８２３もＭＯＲ０９８２５もＭＣＦ７細胞へのニューレグリン結合をブロックし
ないこと（図９参照）、およびＨＥＲ３／ＭＯＲ０９８２３複合体が、ｂｉａｃｏｒｅ試
験において固定されたニューレグリンに結合することができること（図１０参照）という
、本発明者らの知見と一致する。
表１１：ＭＯＲ０９８２３ Ｆａｂ重鎖およびヒトＨＥＲ３間の相互作用。Ｆａｂ ＶＨ
残基は、その直線状アミノ酸配列（配列番号：１５）に基づいて番号付けされる。ＨＥＲ
３残基は、ＮＰ＿００１９７３に基づいて番号付けされる。示されるＨＥＲ３残基は、Ｍ
ＯＲ０９８２３ Ｆａｂにおける原子の５Å内の少なくとも１つの原子を有する。
Figure 0006771002
Figure 0006771002
表１２：ＭＯＲ０９８２３ Ｆａｂ軽鎖およびヒトＨＥＲ３間の相互作用。Ｆａｂ ＶＬ
残基は、その直線状アミノ酸配列（配列番号：１４）に基づいて番号付けされる。ＨＥＲ
３残基は、ＮＰ＿００１９７３に基づいて番号付けされる。示されるＨＥＲ３残基は、Ｍ
ＯＲ０９８２３ Ｆａｂにおける原子の５Å内の少なくとも１つの原子を有する。
Figure 0006771002
Figure 0006771002
表１３：ＭＯＲ０９８２５ Ｆａｂ重鎖およびヒトＨＥＲ３間の相互作用。Ｆａｂ ＶＨ
残基は、その直線状アミノ酸配列（配列番号：５１）に基づいて番号付けされる。ＨＥＲ
３残基は、ＮＰ＿００１９７３に基づいて番号付けされる。示されるＨＥＲ３残基は、Ｍ
ＯＲ０９８２５ Ｆａｂにおける原子の５Å内の少なくとも１つの原子を有する。
Figure 0006771002
Figure 0006771002
表１４：ＭＯＲ０９８２５ Ｆａｂ軽鎖およびヒトＨＥＲ３間の相互作用。Ｆａｂ ＶＬ
残基は、その直線状アミノ酸配列（配列番号：５０）に基づいて番号付けされる。ＨＥＲ
３残基は、ＮＰ＿００１９７３に基づいて番号付けされる。示されるＨＥＲ３残基は、Ｍ
ＯＲ０９８２５ Ｆａｂにおける原子の５Å内の少なくとも１つの原子を有する。
Figure 0006771002
Figure 0006771002
Figure 0006771002
ＭＯＲ０９８２３／ＭＯＲ０９８２５結晶構造の目視検査は、ＨＥＲ３残基Ｌｙｓ２６
７およびＬｅｕ２６８が種々の抗体ＣＤＲと多数の相互作用を形成することを強調し、そ
れらが抗体結合に重要であり得ることを示唆した。結果として、抗体結合に対する影響を
評価するために、Ｌｙｓ２６７および／またはＬｅｕ２６８をアラニンに変異し、発現さ
せ、得られた組換えタンパク質を精製した。ＥＬＩＳＡ結合アッセイは、Ｌｙｓ２６７ま
たはＬｅｕ２６８のいずれかの変異がＨＥＲ３へのＭＯＲ１０７０３結合を破壊すること
を示し（図５Ｆ）、両方の残基がＨＥＲ３エピトープの不可欠な部分であることを示唆し
、したがって、ＭＯＲ０９８２３／ＭＯＲ０９８２５とＨＥＲ３間の提案される相互作用
をサポートした。
（ｖｉｉｉ）細胞シグナル伝達の阻害
リガンド依存性ＨＥＲ３活性における抗−ＨＥＲ３抗体の効果を確認するために、ニュ
ーレグリンでの刺激前に、ＭＣＦ７細胞をＩｇＧとインキュベートした。阻害曲線の例は
、図６Ａにおいて説明され、表１５に要約される。ＨＥＲ２−媒介ＨＥＲ３活性化におけ
る抗−ＨＥＲ３抗体の効果もまた、ＨＥＲ２増幅細胞系ＳＫ−Ｂｒ−３を使用して試験し
た（図６Ｂおよび表１５）。
表１５：ＭＣＦ７およびＳＫ−Ｂｒ−３細胞における抗−ＨＥＲ３ ＩｇＧのｐＨＥＲ３
ＩＣ５０および阻害値の範囲
Figure 0006771002
ＨＥＲ３活性の阻害が下流細胞シグナル伝達Ａｋｔに影響するか否かを決定するために
、リン酸化もまた、抗−ＨＥＲ３抗体での処置後に、ＨＥＲ２増幅細胞において測定した
（図７および表１６参照）。
表１６：ＳＫ−Ｂｒ−３ ＢＴ−４７４およびＭＣＦ７細胞における抗−ＨＥＲ３ Ｉｇ
ＧのｐＡｋｔ（Ｓ４７３）ＩＣ５０および阻害値の範囲
Figure 0006771002
要約すれば、ＭＯＲ０９８２３、ＭＯＲ０９８２４、ＭＯＲ０９８２５、ＭＯＲ０９９
７４、ＭＯＲ１０７０１、ＭＯＲ１０７０２、ＭＯＲ１０７０３、ＭＯＲ１２６０９およ
びＭＯＲ１２６１０は、それぞれ、リガンド依存性およびリガンド非依存性の両方におけ
る細胞ＨＥＲ３活性を阻害することができる。
（ｉｘ）増殖阻害
ＭＯＲ０９８２３、ＭＯＲ０９８２４、ＭＯＲ０９８２５、ＭＯＲ０９９７４、ＭＯＲ
１０７０１、ＭＯＲ１０７０２およびＭＯＲ１０７０３全てが、ＨＥＲ３活性および下流
シグナル伝達を阻害したため、それらを、リガンド依存性および非依存性インビトロ細胞
増殖をブロックする能力について試験した（データの例は図８に示され、表１７に要約さ
れる）。試験された抗−ＨＥＲ３抗体は、全て細胞増殖の有効な阻害剤であった。
表１７：ＳＫ−Ｂｒ−３、ＢＴ−４７４およびＭＣＦ７細胞における１０μｇ／ｍｌの抗
−ＨＥＲ３ ＩｇＧでの処置後の増殖阻害
Figure 0006771002
（ｘ）リガンドブロッキング評価
リガンド結合をブロックする記載されている抗−ＨＥＲ３抗体の能力を、ＭＯＲ０９８
２３またはＭＯＲ０９８２５のいずれかで以前に処理されたＭＣＦ７細胞へのニューレグ
リンの結合を試験することにより評価された。ＭＯＲ０９８２３またはＭＯＲ０９８２５
のいずれかの存在は、ＭＣＦ７細胞に結合するニューレグリンの能力において有意な効果
を有さなかったが、実験において使用されたポジティブコントロール（Ｍａｂ３４８１）
は、ニューレグリン結合に深く干渉することができた（図９参照）。これらの結果は、Ｍ
ＯＲ０９８２３はドメイン２および４と相互作用するが、ニューレグリンとＨＥＲ３の相
互作用のための主な接触点は、ドメイン１および３内に主に集中すると仮定されるので、
結晶構造と一致する。ニューレグリンがＨＥＲ３の不活性な立体構造に結合することがで
きるとき（Kaniら (2005) Biochemistry 44: 15842-15857）、ＭＯＲ０９８２３およびＭ
ＯＲ０９８２５は、シグナル伝達のために必要なＨＥＲ３ドメイン再配列を防止すること
により、または受容体二量体化を干渉することにより機能する可能性がある。
（ｘｉ）リガンドブロッキング評価（生化学的）
ＭＯＲ０９８２３およびニューレグリンが、同時にＨＥＲ３に結合することができるか
否かを探索するために、生化学的アッセイをＢｉａｃｏｒｅＴＭ技術を使用して確立した
。相互作用分析は、ビオチン捕獲キット（GE Healthcare）を利用してＢｉａｃｏｒｅＴ
Ｍ センサーチップ ＣＡＰ（GE Healthcare）の表面上にビオチン化ニューレグリンを
捕獲することにより行った。ＨＥＲ３複合体は、ＭＯＲ０９８２３、１０５．５（Thermo
Scientific）またはヒトＩｇＧのいずれかの濃度の増加とともに、ヒトＨＥＲ３−Ｆｃ
とインキュベートすることにより作製した。前形成ＨＥＲ３／抗体複合体を参照および活
性な表面上に注入し、ニューレグリンとＨＥＲ３の相互作用を観察した。
コントロールＩｇＧは、ＨＥＲ３／ニューレグリン複合体形成への影響はなかったが、
１０５．５が、リガンドブロッキング抗体としての種類を確認するニューレグリンに結合
するＨＥＲ３の能力を有意に阻害することを観察した（図１０）。対照的に、ＨＥＲ３／
ＭＯＲ０９８２３複合体は、ニューレグリンに結合することができ、ＭＯＲ０９８２３が
リガンド結合を防止しないことを証明した。興味深いことに、ＭＯＲ０９８２３／ＨＥＲ
３複合体を注入したとき、ＲＵ値の用量依存的増加が唯一観察された。このデータは、ニ
ューレグリン、ＨＥＲ３およびＭＯＲ０９８２３を含むトリマー複合体がチップ表面上に
作製されることを示す。ＭＯＲ０９８２３結合がＨＥＲ３のリガンド結合部位を閉塞しな
いため、該トリマー複合体が形成する能力は、ＨＥＲ３／ＭＯＲ０９８２３結晶構造によ
り予測され、ニューレグリンおよびＭＯＲ０９８２３の結合が相互排他的でないことを示
唆する。
別の態様において、抗体またはそれらの断片は、ＨＥＲ３リガンド、例えば、ニューレ
グリンの同時結合をブロックすることなく、ＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン４の両
方に結合する。理論を提供する必要はないが、ＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン４の
両方へ結合する抗体またはそれらの断片が、ＨＥＲ３上のリガンド結合部位をブロックす
ることなく、不活性な立体構造におけるＨＥＲ３を保持することを可能にする。したがっ
て、ＨＥＲ３リガンド（例えば、ニューレグリン）は、抗体として同時にＨＥＲ３に結合
することができる。
本発明の抗体またはその断片は、リガンド結合を防止することなく、ＨＥＲ３のリガン
ド依存性および非依存性活性化の両方を阻害すう。これは、以下の理由のために利点であ
ると考えられる：
（ｉ）別個の腫瘍型は、それぞれのメカニズムにより駆動しているため、治療抗体は、Ｈ
ＥＲ３活性化の単一のメカニズム（すなわちリガンド依存性またはリガンド非依存性）を
標的化する抗体よりも、腫瘍の広範なスペクトルにおける臨床的有用性を有する。
（ｉｉ）治療抗体は、ＨＥＲ３活性化の両方のメカニズムが同時に含まれる腫瘍型におい
て有効である。ＨＥＲ３活性化の単一のメカニズム（すなわちリガンド依存性またはリガ
ンド非依存性）を標的化する抗体は、これらの腫瘍型においてほとんど有効性を示さない
。
（ｉｉｉ）リガンド結合を防止することなく、ＨＥＲ３のリガンド依存性活性化を阻害す
る抗体の有効性は、リガンドの濃度を増加することにより有害に影響する可能性が低い。
これは、非常に高い濃度のＨＥＲ３リガンドにより駆動される腫瘍型における有効性の増
加、または耐性がＨＥＲ３リガンドの上方制御を介在する薬物耐性負荷の減少のいずれか
に変わる。
（ｉｖ）不活性な形態を安定化することによりＨＥＲ３活性化を阻害する抗体は、ＨＥＲ
３活性化の代替メカニズムにより駆動される薬物耐性になりにくい。
結果として、本発明の抗体は、既存の治療抗体が臨床的に有効でない状態を処置するた
めに使用され得る。
（ｘｉｉ）ＨＥＲ３活性のインビボ阻害および腫瘍増殖に対する効果
記載されている抗−ＨＥＲ３抗体のインビボ活性を決定するために、ＭＯＲ０９８２３
を、ＢｘＰＣ−３およびＢＴ−４７４腫瘍モデルの両方において試験した。ＭＯＲ０９８
２３は、腫瘍ｐＨＥＲ３レベルにおける有意な減少により証明されるＨＥＲ３活性を阻害
することが証明された（図１１）。ＨＥＲ３のシグナル伝達下流を、同様に、ＢｘＰＣ−
３およびＢＴ−４７４の両方におけるｐＡｋｔレベルの減少により証明されるとおり阻害
した（図１１）。ＨＥＲ２駆動ＢＴ−４７４有効性試験において、反復ＭＯＲ１０７０１
処置は、腫瘍増殖の７４％阻害を生じたが（図１２Ａ参照）、ＭＯＲ１０７０３は８３％
阻害を生じた。ＢｘＰＣ３腫瘍増殖モデルにおいて、ＭＯＲ１０７０１およびＭＯＲ１０
７０３の両方は、リガンド駆動腫瘍増殖を非常に有効に阻害した（図１３参照）。
（ｘｉｉｉ）インビトロ薬物組合せおよび細胞増殖に対する影響
腫瘍細胞増殖は、頻繁に多数のシグナル伝達経路により駆動するため、本発明者らは、
ＭＯＲ０９８２３またはＭＯＲ１０７０３と種々の標的化薬物との組合せが、細胞増殖の
ブロックにおいて有利である否かを評価した。選択した標的化薬物は、主にＨＥＲ２（ト
ラスツマブ、ラパチニブ）、ＥＧＦＲ（セツキシマブ、エルロチニブ）、ＰＩ３Ｋ／ｍＴ
ＯＲ（ＢＥＺ２３５）、ＰＩ３Ｋ（ＢＫＭ１２０）、ＰＩＫ３ＣＡ（ＢＹＬ７１９）およ
びｍＴＯＲ（ＲＡＤ００１）を阻害したが、これらの標的はヒト腫瘍において一般的に活
性化されるためであった。アイソボログラム分析（図１４参照）は、ＭＯＲ０９８２３お
よびＭＯＲ１０７０３が、トラスツマブ、ラパチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、Ｂ
ＥＺ２３５、ＢＫＭ１２０、ＢＹＬ７１９およびＲＡＤ００１と相乗的薬物組合せを示し
たことを示した。このデータは、ＨＥＲ３シグナル伝達の阻害が、受容体チロシンキナー
ゼまたはＰＩ３Ｋシグナル伝達経路を標的化する阻害剤に対して特定の利益があることを
示唆する。
（ｘｉｖ）インビボＭＯＲ１０７０３薬物組合せ
ＨＥＲ３阻害は、受容体チロシンキナーゼ標的化薬剤とインビトロで協同したので、本
発明者らは、トラスツマブおよびエルロチニブと組み合わせてのＭＯＲ１０７０１または
ＭＯＲ１０７０３のいずれかの影響をインビボで評価した。ＢＴ−４７４異種移植片（図
１５Ａ参照）において、最適に満たない用量のトラスツマブ（１ｍｇ／ｋｇ）とＭＯＲ１
０７０１またはＭＯＲ１０７０３（２０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかの組合せは、腫瘍退行を
誘導するために十分であった（それぞれ、％Ｔ／Ｃ＝−５０および−３７）。Ｌ３．３膵
臓異種移植片において、１日のエルロチニブ（５０ｍｇ／ｋｇ）とＭＯＲ１０７０３（２
０ｍｇ／ｋｇ）の組合せは、腫瘍静止状態をもたらした（％Ｔ／Ｃ＝３、図１５Ｂ参照）
。両方のモデルにおいて、２つの薬物の組合せは、いずれかの薬物単独よりも有意により
有効であり、したがって、本発明者らが先にインビトロで見出したＥｒｂＢ−標的化薬剤
とＨＥＲ３−標的化抗体を組み合わせることの利益をサポートした。
要約すれば、ＨＥＲ３の不活性な立体構造を安定化する抗体のファミリーのユニークな
(unique)能力は、ＨＥＲ３がリガンド依存性または非依存性のいずれかで活性化されるモ
デルにおいて、有意なインビボ効力をもたらす。さらに、該抗体ファミリーによるＨＥＲ
３阻害は、多種多様の標的化治療と組み合わせて有益なようである。
参考文献の取り込み
特許、特許出願、文書、テキストブックなどを含む本明細書に引用される全ての文献、
およびそれらに引用される文献は、それらが引用されたいない限り、それら全体において
出典明示により本明細書に包含させる。
均等
前記明細書は、当業者が本発明を実施することが可能であるために十分であると考えられる。前記および実施例は、本発明の特定の好ましい態様を列挙しており、本発明者らによる考慮された最も良い形式を記載している。しかしながら、たとえ、前記明細書において文章で詳細であろうとも、本発明は多数の方法において実施され得、本発明は特許請求の範囲およびそれらのあらゆる同等物にしたがって解釈されるべきであると解される。

本発明は、以下の態様を含む。
［１］
ＨＥＲ受容体の不活性化状態に結合する単離された抗体またはその断片であって、該抗体はリガンド依存性およびリガンド非依存性シグナル変換の両方を阻害する、抗体またはその断片。
［２］
不活性化状態におけるＨＥＲ受容体を安定化する、［１］に記載の単離された抗体またはその断片。
［３］
ＨＥＲ受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含むＨＥＲ受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体またはその断片であって、リガンド依存性およびリガンド非依存性シグナル変換の両方を阻害する、抗体またはその断片。
［４］
ＨＥＲ受容体の不活性化状態に結合する、［３］に記載の単離された抗体またはその断片。
［５］
不活性化状態におけるＨＥＲ受容体を安定化する、［４］に記載の単離された抗体またはその断片。
［６］
ＨＥＲ受容体がＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４からなる群から選択される、［２］に記載の単離された抗体またはその断片。
［７］
抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および合成抗体からなる群から選択される、［３］に記載の単離された抗体またはその断片。
［８］
ＨＥＲ受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含むＨＥＲ受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体またはその断片であって、抗体の結合は、不活性化状態におけるＨＥＲ受容体を安定化し、ＨＥＲリガンドは、ＨＥＲ受容体上のリガンド結合部位に同時に結合することができる、抗体またはその断片。
［９］
リガンド結合部位へのＨＥＲリガンド結合が、活性状態へのＨＥＲ受容体における構造変化を誘導しない、［８］に記載の単離された抗体またはその断片。
［１０］
リガンド結合部位へのＨＥＲリガンド結合がシグナル変換を活性化しない、［８］に記載の単離された抗体またはその断片。
［１１］
ＨＥＲリガンドが、ニューレグリン１（ＮＲＧ）、ニューレグリン２、ニューレグリン３、ニューレグリン４、ベタセルリン、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子、エピレグリン、上皮細胞増殖因子、アンフィレグリンおよび形質転換増殖因子アルファからなる群から選択される、［８］に記載の単離された抗体またはその断片。
［１２］
ＨＥＲ受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含むＨＥＲ受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体またはその断片であって、抗体の結合は、ＨＥＲ受容体が共受容体と二量体化して、受容体−受容体複合体を形成することができないように、不活性化状態においてＨＥＲ受容体を安定化する、抗体またはその断片。
［１３］
受容体−受容体複合体を形成できないことが、シグナル変換の活性化を防止する、［１２］に記載の単離された抗体またはその断片。
［１４］
シグナル変換がリガンド非依存性シグナル変換である、［１２］に記載の単離された抗体またはその断片。
［１５］
シグナル変換がリガンド依存性シグナル変換である、［１２］に記載の単離された抗体またはその断片。
［１６］
ＨＥＲ３受容体の不活性な立体構造に結合する単離された抗体またはその断片であって、該抗体はリガンド依存性およびリガンド非依存性シグナル変換の両方を阻害する、抗体またはその断片。
［１７］
不活性化状態におけるＨＥＲ３受容体を安定化する、［１６］に記載の単離された抗体またはその断片。
［１８］
ＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含むＨＥＲ３受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体またはその断片であって、リガンド依存性およびリガンド非依存性シグナル変換の両方を阻害する、抗体またはその断片。
［１９］
ＨＥＲ３受容体の不活性化状態に結合する、［１８］に記載の単離された抗体またはその断片。
［２０］
不活性化状態におけるＨＥＲ３受容体を安定化する、［１８］に記載の単離された抗体またはその断片。
［２１］
抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および合成抗体からなる群から選択される、［１８］に記載の単離された抗体またはその断片。
［２２］
ＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含むＨＥＲ３受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体またはその断片であって、抗体の結合は、不活性化状態におけるＨＥＲ３受容体を安定化し、ＨＥＲ３リガンドは、ＨＥＲ３受容体上のリガンド結合部位に同時に結合する、抗体またはその断片。
［２３］
リガンド結合部位へのＨＥＲ３リガンド結合が、活性状態へのＨＥＲ３受容体における構造変化を誘導しない、［２２］に記載の単離された抗体またはその断片。
［２４］
リガンド結合部位へのＨＥＲ３リガンド結合が、シグナル変換を活性化しない、［２２］に記載の単離された抗体またはその断片。
［２５］
ＨＥＲ３リガンドが、ニューレグリン１（ＮＲＧ）、ニューレグリン２、ベタセルリン、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子およびエピレグリンからなる群から選択される、［２２］に記載の単離された抗体またはその断片。
［２６］
ＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含むＨＥＲ３受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体またはその断片であって、リガンド依存性およびリガンド非依存性シグナル変換の両方を阻害する、抗体またはその断片。
［２７］
ＨＥＲ３受容体の不活性化状態に結合する、［２６］に記載の単離された抗体またはその断片。
［２８］
不活性化状態におけるＨＥＲ３受容体を安定化する、［２７］に記載の単離された抗体またはその断片。
［２９］
ＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含むＨＥＲ３受容体の立体構造的エピトープに結合する単離された抗体またはその断片であって、不活性なＨＥＲ３受容体に結合し、リガンド依存性およびリガンド非依存性シグナル変換の両方を阻害する、抗体またはその断片。
［３０］
不活性化状態におけるＨＥＲ３受容体を安定化する、［２８］に記載の単離された抗体またはその断片。
［３１］
立体構造的エピトープがアミノ酸残基２６５−２７７、３１５（ドメイン２の）、５７１、５８２−５８４、５９６−５９７、６００−６０２、６０９−６１５（ドメイン４の）またはそれらのサブセットを含む、［２９］に記載の単離された抗体。
［３２］
抗体またはそれらの断片のＶＨが、少なくとも１つの以下のＨＥＲ３残基：Ａｓｎ２６６、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｎ２７１、Ｇｌｕ２７３、Ｐｒｏ２７４、Ａｓｎ２７５、Ｐｒｏ２７６、Ｈｉｓ２７７、Ａｓｎ３１５、Ａｓｐ５７１、Ｐｒｏ５８３、Ｈｉｓ５８４、Ａｌａ５９６、Ｌｙｓ５９７に結合する、［２９］に記載の単離された抗体。
［３３］
抗体またはそれらの断片のＶＬが、少なくとも１つの以下のＨＥＲ３残基：Ｔｙｒ２６５、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｐｈｅ２７０、Ｇｌｙ５８２、Ｐｒｏ５８３、Ｌｙｓ５９７、Ｉｌｅ６００、Ｌｙｓ６０２、Ｇｌｕ６０９、Ａｒｇ６１１、Ｐｒｏ６１２、Ｃｙｓ６１３、Ｈｉｓ６１４、Ｇｌｕ６１５に結合する、［２９］に記載の単離された抗体。
［３４］
第１のＨＥＲ受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む第１のＨＥＲ受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体またはその断片であって、ＨＥＲ受容体リガンドの非存在下で第１のＨＥＲ受容体への抗体またはその断片の結合は、第１のＨＥＲ受容体および第２のＨＥＲ受容体を発現する細胞中の第１のＨＥＲ受容体−第２のＨＥＲ受容体タンパク質複合体のリガンド非依存性形成を減少させる、抗体またはその断片。
［３５］
第１のＨＥＲ受容体が、第２のＨＥＲ受容体と二量体化して、第１のＨＥＲ受容体−第２のＨＥＲ受容体タンパク質複合体を形成することができないように、不活性化状態において第１のＨＥＲ受容体を安定化する、［３４］に記載の単離された抗体またはその断片。
［３６］
第１のＨＥＲ受容体−第２のＨＥＲ受容体タンパク質複合体を形成できないことがシグナル変換の活性化を防止する、［３５］に記載の単離された抗体またはその断片。
［３７］
第１のＨＥＲが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４からなる群から選択される、［３５］に記載の単離された抗体またはその断片。
［３８］
第２のＨＥＲが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４からなる群から選択される、［３５］に記載の単離された抗体またはその断片。
［３９］
ＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含むＨＥＲ３受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体またはその断片であって、ＨＥＲ３リガンドの非存在下でＨＥＲ３受容体への抗体またはその断片の結合は、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を発現する細胞中のＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体のリガンド非依存性形成を減少させる、抗体またはその断片。
［４０］
ＨＥＲ３受容体が、ＨＥＲ２受容体と二量体化して、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体を形成することができないように、不活性化状態においてＨＥＲ３受容体を安定化する、［３９］に記載の単離された抗体またはその断片。
［４１］
ＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体を形成できないことがシグナル変換の活性化を防止する、［４０］に記載の単離された抗体またはその断片。
［４２］
第１のＨＥＲ受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含む第１のＨＥＲ受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体またはその断片であって、ＨＥＲリガンドの存在下で第１のＨＥＲ受容体への抗体またはその断片の結合は、第１のＨＥＲ受容体および第２のＨＥＲ受容体を発現する細胞中の第１のＨＥＲ受容体−第２のＨＥＲ受容体タンパク質複合体のリガンド依存性形成を減少させる、抗体またはその断片。
［４３］
ＨＥＲ受容体が、第１のＨＥＲリガンドの存在下で第２のＨＥＲ受容体と二量体化して、第１のＨＥＲ受容体−第２のＨＥＲ受容体タンパク質複合体を形成することができないように、不活性化状態において第１のＨＥＲ受容体を安定化する、［４２］に記載の単離された抗体またはその断片。
［４４］
第１のＨＥＲ受容体−第２のＨＥＲ受容体タンパク質複合体を形成できないことが、シグナル変換の活性化を防止する、［４３］に記載の単離された抗体またはその断片。
［４５］
ＨＥＲリガンドが、ニューレグリン１（ＮＲＧ）、ニューレグリン２、ニューレグリン３、ニューレグリン４、ベタセルリン、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子、エピレグリン、上皮細胞増殖因子、アンフィレグリンおよび形質転換増殖因子アルファからなる群から選択される、［４２］に記載の単離された抗体またはその断片。
［４６］
第１のＨＥＲが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４からなる群から選択される、［４２］に記載の単離された抗体またはその断片。
［４７］
第２のＨＥＲが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４からなる群から選択される、［４２］に記載の単離された抗体またはその断片。
［４８］
ＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含むＨＥＲ３受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体またはその断片であって、ＨＥＲリガンドの存在下でＨＥＲ３受容体への抗体またはその断片の結合は、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を発現する細胞中のＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体のリガンド依存性形成を減少させる、抗体またはその断片。
［４９］
ＨＥＲ３受容体が、ＨＥＲリガンドの存在下でＨＥＲ２受容体と二量体化して、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体を形成することができないように、不活性化状態においてＨＥＲ３受容体を安定化する、［４８］に記載の単離された抗体またはその断片。
［５０］
ＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体を形成できないことがシグナル変換の活性化を防止する、［４９］に記載の単離された抗体またはその断片。
［５１］
リガンドが、ニューレグリン１（ＮＲＧ）、ニューレグリン２、ベタセルリン、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子およびエピレグリンからなる群から選択される、［４８］に記載の単離された抗体またはその断片。
［５２］
ＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含むＨＥＲ３受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体またはその断片であって、ＨＥＲ３リガンド非依存性リン酸化アッセイにより評価されるとき、ＨＥＲ３のリン酸化を阻害する、抗体またはその断片。
［５３］
ＨＥＲ３リガンド非依存性リン酸化アッセイにＨＥＲ２増幅細胞を使用し、ＨＥＲ２増幅細胞がＳＫ−Ｂｒ−３細胞である、［５２］に記載の単離された抗体またはその断片。
［５４］
ＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含むＨＥＲ３受容体の立体構造的エピトープを認識する単離された抗体またはその断片であって、ＨＥＲ３リガンド依存性リン酸化アッセイにより評価されるとき、ＨＥＲ３のリン酸化を阻害する、抗体またはその断片。
［５５］
ＨＥＲ３リガンド依存性リン酸化アッセイにニューレグリン（ＮＲＧ）の存在下で刺激ＭＣＦ７細胞を使用する、［５４］に記載の単離された抗体またはその断片。
［５６］
少なくとも１×１０ ７ Ｍ −１ 、１０ ８ Ｍ −１ 、１０ ９ Ｍ −１ 、１０ １０ Ｍ −１ 、１０ １１ Ｍ −１ 、１０ １２ Ｍ −１ 、１０ １３ Ｍ −１ の解離（Ｋ Ｄ ）を有する、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［５７］
ホスホ−ＨＥＲ３およびホスホ−Ａｋｔからなる群から選択されるインビトロリン酸化アッセイにより測定されるとき、ＨＥＲ３のリン酸化を阻害する、［５６］に記載の単離された抗体またはその断片。
［５８］
表１に記載されている抗体と交差競合する、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［５９］
表１に記載されている抗体と同じ立体構造的エピトープに結合する単離された抗体またはその断片。
［６０］
抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ＦａｂおよびｓｃＦｖからなる群から選択される、上記のいずれかに記載の単離された抗体またはその断片。
［６１］
抗体がヒトである、上記のいずれかに記載の単離された抗体またはその断片。
［６２］
ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域を含む、上記のいずれかに記載の単離された抗体またはその断片。
［６３］
ヒトＨＥＲ３およびカニクイザルＨＥＲ３の両方に結合する、上記のいずれかに記載の単離された抗体またはその断片。
［６４］
ＩｇＧアイソタイプである、上記のいずれかに記載の単離された抗体またはその断片。
［６５］
アミノ酸がそれぞれのヒトＶＨまたはＶＬ生殖細胞系列配列由来の抗体フレームワークに置換されているフレームワークを含む、上記のいずれかに記載の単離された抗体またはその断片。
［６６］
表１におけるいずれかの抗体のＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａにより計算された１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含むＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［６７］
配列番号：４、配列番号：１０、配列番号：２２、配列番号：２８、配列番号：４０、配列番号：４６、配列番号：５８、配列番号：６４、配列番号：７６、配列番号：８２、配列番号：９４、配列番号：１００、配列番号：１１２、配列番号：１１８、配列番号：１３０、配列番号：１３６、配列番号：１４８、配列番号：１６６、配列番号：１８４、配列番号：２０２、配列番号：２２０、配列番号：２３８、配列番号：２５６、配列番号：２７４、配列番号：２９２、配列番号：３１０、配列番号：３２８、配列番号：３４６および配列番号：３６４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含むＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［６８］
抗体が、配列番号：１５を含むＶＨおよび配列番号：１４を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［６９］
抗体が、配列番号：３３を含むＶＨおよび配列番号：３２を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［７０］
抗体が、配列番号：５１を含むＶＨおよび配列番号：５０を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［７１］
抗体が、配列番号：６９を含むＶＨおよび配列番号：６８を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［７２］
抗体が、配列番号：８７を含むＶＨおよび配列番号：８６を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［７３］
抗体が、配列番号：１０５を含むＶＨおよび配列番号：１０４を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［７４］
抗体が、配列番号：１２３を含むＶＨおよび配列番号：１２２を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［７５］
抗体が、配列番号：１４１を含むＶＨおよび配列番号：１４０を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［７６］
抗体が、配列番号：１５９を含むＶＨおよび配列番号：１５８を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［７７］
抗体が、配列番号：１７７を含むＶＨおよび配列番号：１７６を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［７８］
抗体が、配列番号：１９５を含むＶＨおよび配列番号：１９４を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［７９］
抗体が、配列番号：２１３を含むＶＨおよび配列番号：２１２を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［８０］
抗体が、配列番号：２３１を含むＶＨおよび配列番号：２３０を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［８１］
抗体が、配列番号：２４９を含むＶＨおよび配列番号：２４８を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［８２］
抗体が、配列番号：２６７を含むＶＨおよび配列番号：２６６を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［８３］
抗体が、配列番号：２８５を含むＶＨおよび配列番号：２８４を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［８４］
抗体が、配列番号：３０３を含むＶＨおよび配列番号：３０２を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［８５］
抗体が、配列番号：３２１を含むＶＨおよび配列番号：３２０を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［８６］
抗体が、配列番号：３３９を含むＶＨおよび配列番号：３３８を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［８７］
抗体が、配列番号：３５７を含むＶＨおよび配列番号：３５６を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［８８］
抗体が、配列番号：３７５を含むＶＨおよび配列番号：３７４を含むＶＬ、またはそれらと９７−９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片。
［８９］
配列番号：４９３を有する可変重鎖配列を含む単離された抗体またはその断片。
［９０］
配列番号：４９４を有する可変軽鎖配列を含む単離された抗体またはその断片。
［９１］
配列番号：４９３を有する可変重鎖配列および配列番号：４９４を有する可変軽鎖配列を含む単離された抗体またはその断片。
［９２］
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む変異体重鎖可変領域を有するＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその断片であって、該変異体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３の１つにおいて少なくとも１から４つのアミノ酸変化を有する、抗体またはその断片。
［９３］
配列番号：２の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：３のＣＤＲ２；配列番号：４のＣＤＲ３；配列番号：５の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：６のＣＤＲ２；および配列番号：７のＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその断片。
［９４］
配列番号：２０の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２１のＣＤＲ２；配列番号：２２のＣＤＲ３；配列番号：２３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２４のＣＤＲ２；および配列番号：２５のＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその断片。
［９５］
配列番号：３８の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：３９のＣＤＲ２；配列番号：４０のＣＤＲ３；配列番号：４１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：４２のＣＤＲ２；および配列番号：４３のＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその断片。
［９６］
配列番号：５６の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：５７のＣＤＲ２；配列番号：５８のＣＤＲ３；配列番号：５９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：６０のＣＤＲ２；および配列番号：６１のＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその断片。
［９７］
配列番号：７４の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：７５のＣＤＲ２；配列番号：７６のＣＤＲ３；配列番号：７７の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：７８のＣＤＲ２；および配列番号：７９のＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその断片。
［９８］
配列番号：９２の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：９３のＣＤＲ２；配列番号：９４のＣＤＲ３；配列番号：９５の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：９６のＣＤＲ２；および配列番号：９７のＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその断片。
［９９］
配列番号：１１０の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１１１のＣＤＲ２；配列番号：１１２のＣＤＲ３；配列番号：１１３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１１４のＣＤＲ２；および配列番号：１１５のＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその断片。
［１００］
配列番号：１２８の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１２９のＣＤＲ２；配列番号：１３０のＣＤＲ３；配列番号：１３１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１３２のＣＤＲ２；および配列番号：１３３のＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその断片。
［１０１］
配列番号：１４６の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１４７のＣＤＲ２；配列番号：１４８のＣＤＲ３；配列番号：１４９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１５０のＣＤＲ２；および配列番号：１５１のＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその断片。
［１０２］
配列番号：１６４の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１６５のＣＤＲ２；配列番号：１６６のＣＤＲ３；配列番号：１６７の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１６８のＣＤＲ２；および配列番号：１６９のＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその断片。
［１０３］
配列番号：１８２の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１８３のＣＤＲ２；配列番号：１８４のＣＤＲ３；配列番号：１８５の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１８６のＣＤＲ２；および配列番号：１８７のＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその断片。
［１０４］
配列番号：２００の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２０１のＣＤＲ２；配列番号：２０２のＣＤＲ３；配列番号：２０３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２０４のＣＤＲ２；および配列番号：２０５のＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその断片。
［１０５］
配列番号：２１８の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２１９のＣＤＲ２；配列番号：２２０のＣＤＲ３；配列番号：２２１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２２２のＣＤＲ２；および配列番号：２２３のＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその断片。
［１０６］
配列番号：２３６の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２３７のＣＤＲ２；配列番号：２３８のＣＤＲ３；配列番号：２３９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２４０のＣＤＲ２；および配列番号：２４１のＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその断片。
［１０７］
配列番号：２５４の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２５５のＣＤＲ２；配列番号：２５６のＣＤＲ３；配列番号：２５７の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２５８のＣＤＲ２；および配列番号：２５９のＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその断片。
［１０８］
配列番号：２７２の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２７３のＣＤＲ２；配列番号：２７４のＣＤＲ３；配列番号：２７５の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２７６のＣＤＲ２；および配列番号：２７７のＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその断片。
［１０９］
配列番号：２９０の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２９１のＣＤＲ２；配列番号：２９２のＣＤＲ３；配列番号：２９３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２９４のＣＤＲ２；および配列番号：２９５のＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその断片。
［１１０］
配列番号：３０８の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：３０９のＣＤＲ２；配列番号：３１０のＣＤＲ３；配列番号：３１１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：３１２のＣＤＲ２；および配列番号：３１３のＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその断片。
［１１１］
配列番号：３２６の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：３２７のＣＤＲ２；配列番号：３２８のＣＤＲ３；配列番号：３２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：３３０のＣＤＲ２；および配列番号：３３１のＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその断片。
［１１２］
配列番号：３４４の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：３４５のＣＤＲ２；配列番号：３４６のＣＤＲ３；配列番号：３４７の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：３４８のＣＤＲ２；および配列番号：３４９のＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその断片。
［１１３］
配列番号：３６２の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：３６３のＣＤＲ２；配列番号：３６４のＣＤＲ３；配列番号：３６５の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：３６６のＣＤＲ２；および配列番号：３６７のＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその断片。
［１１４］
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ ２ ）’、Ｆ（ａｂ） ２ ’、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、ＶＨ、ＶＬ、ｄＡｂか
らなる群から選択されるＨＥＲ３に結合する、前記のいずれかに記載の抗体の断片。
［１１５］
前記のいずれかに記載の抗体またはその断片および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
［１１６］
さらなる治療剤をさらに含む、［１１５］に記載の医薬組成物。
［１１７］
さらなる治療剤が、ＨＥＲ１阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、ＨＥＲ４阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤およびＰＩ３キナーゼ阻害剤からなる群から選択される、［１１６］に記載の医薬組成物。
［１１８］
さらなる治療剤が、マツズマブ（ＥＭＤ７２０００）、アービタックス（登録商標）／セツキシマブ、ベクチビックス（登録商標）／パニツムマブ、ｍＡｂ ８０６、ニモツズマブ、イレッサ（登録商標）／ゲフィチニブ、ＣＩ−１０３３（ＰＤ１８３８０５）、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６）、タイケルブ（登録商標）／トシル酸ラパチニブ、タルセバ（登録商標）／エルロチニブ ＨＣＬ（ＯＳＩ−７７４）、ＰＫＩ−１６６およびＴｏｖｏｋ（登録商標）からなる群から選択されるＨＥＲ１阻害剤；ペルツズマブ、トラスツマブ、ＭＭ−１１１、ネラチニブ、ラパチニブまたはトシル酸ラパチニブ／タイケルブ（登録商標）からなる群から選択されるＨＥＲ２阻害剤；ＭＭ−１２１、ＭＭ−１１１、ＩＢ４Ｃ３、２ＤＩＤ１２（Ｕ３ Ｐｈａｒｍａ ＡＧ）、ＡＭＧ８８８（Ａｍｇｅｎ）、ＡＶ−２０３（Ａｖｅｏ）、ＭＥＨＤ７９４５Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）およびＨＥＲ３を阻害する小分子からなる群から選択されるＨＥＲ３阻害剤；ならびにＨＥＲ４阻害剤である、［１１７］に記載の医薬組成物。
［１１９］
さらなる治療剤が、テムシロリムス／Ｔｏｒｉｓｅｌ（登録商標）、リダフォロリムス／デフォロリムス、ＡＰ２３５７３、ＭＫ８６６９、エバロリムス／Ａｆｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）からなる群から選択されるｍＴＯＲ阻害剤である、［１１７］に記載の医薬組成物。
［１２０］
さらなる治療剤が、ＧＤＣ ０９４１、ＢＥＺ２３５、ＢＭＫ１２０およびＢＹＬ７１９からなる群から選択されるＰＩ３キナーゼ阻害剤である、［１１７］に記載の医薬組成物。
［１２１］
癌を発現するＨＥＲ３を有する対象を選択すること、前記のいずれかに記載の抗体またはその断片を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、癌を処置する方法。
［１２２］
対象がヒトである、［１２１］に記載の方法。
［１２３］
癌を発現するＨＥＲ３を有する対象を選択すること、前記のいずれかに記載の抗体またはその断片を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、ＨＥＲシグナル伝達経路が介在する癌を処置する方法であって、該癌は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮癌、末梢神経鞘腫瘍、神経鞘腫、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、グリア芽腫、軟組織の明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎臓癌および黒色腫からなる群から選択される、方法。
［１２４］
該癌が乳癌である、［１２３］に記載の方法。
［１２５］
癌を発現するＨＥＲ３を有する対象を選択すること、ＨＥＲ３に結合する表１に記載されている抗体またはそれらの断片の組合せを含む有効量の組成物を該対象に投与することを含む、癌を処置する方法。
［１２６］
癌を発現するＨＥＲ３を有する対象を選択すること、ＨＥＲ３に結合し、ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換およびリガンド非依存性シグナル変換を阻害する抗体またはその断片を含む有効量の組成物を該対象に投与することを含む、癌を処置する方法。
［１２７］
薬物としての使用のための、前記のいずれかに記載の抗体またはその断片。
［１２８］
乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮癌、末梢神経鞘腫瘍、神経鞘腫、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、グリア芽腫、軟組織の明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎臓癌および黒色腫からなる群から選択されるＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、前記のいずれかに記載の抗体またはその断片。
［１２９］
ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：１５のＶＨおよび配列番号：１４のＶＬを有する抗体。
［１３０］
ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：３３のＶＨおよび配列番号：３２のＶＬを有する抗体。
［１３１］
ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：５１のＶＨおよび配列番号：５０のＶＬを有する抗体。
［１３２］
ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：６９のＶＨおよび配列番号：６８のＶＬを有する抗体。
［１３３］
ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：８７のＶＨおよび配列番号：８６のＶＬを有する抗体。
［１３４］
ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：１０５のＶＨおよび配列番号：１０４のＶＬを有する抗体。
［１３５］
ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：１２３のＶＨおよび配列番号：１２２のＶＬを有する抗体。
［１３６］
ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：１４１のＶＨおよび配列番号：１４０のＶＬを有する抗体。
［１３７］
ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：１５１のＶＨおよび配列番号：１５８のＶＬを有する抗体。
［１３８］
ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：１７７のＶＨおよび配列番号：１７６のＶＬを有する抗体。
［１３９］
ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：１９５のＶＨおよび配列番号：１９４のＶＬを有する抗体。
［１４０］
ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：２１３のＶＨおよび配列番号：２１２のＶＬを有する抗体。
［１４１］
ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：２３１のＶＨおよび配列番号：２３０のＶＬを有する抗体。
［１４２］
ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：２４９のＶＨおよび配列番号：２４８のＶＬを有する抗体。
［１４３］
ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：２６７のＶＨおよび配列番号：２６６のＶＬを有する抗体。
［１４４］
ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：２８５のＶＨおよび配列番号：２８４のＶＬを有する抗体。
［１４５］
ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：３０３のＶＨおよび配列番号：３０２のＶＬを有する抗体。
［１４６］
ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：３２１のＶＨおよび配列番号：３２０のＶＬを有する抗体。
［１４７］
ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：３３９のＶＨおよび配列番号：３３８のＶＬを有する抗体。
［１４８］
ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：３５７のＶＨおよび配列番号：３５６のＶＬを有する抗体。
［１４９］
ＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：３７５のＶＨおよび配列番号：３７４のＶＬを有する抗体。
［１５０］
薬物としての使用のための、配列番号：１５のＶＨおよび配列番号：１４のＶＬを有する抗体。
［１５１］
薬物としての使用のための、配列番号：３３のＶＨおよび配列番号：３２のＶＬを有する抗体。
［１５２］
薬物としての使用のための、配列番号：５１のＶＨおよび配列番号：５０のＶＬを有する抗体。
［１５３］
薬物としての使用のための、配列番号：６９のＶＨおよび配列番号：６８のＶＬを有する抗体。
［１５４］
薬物としての使用のための、配列番号：８７のＶＨおよび配列番号：８６のＶＬを有する抗体。
［１５５］
薬物としての使用のための、配列番号：１０５のＶＨおよび配列番号：１０４のＶＬを有する抗体。
［１５６］
薬物としての使用のための、配列番号：１２３のＶＨおよび配列番号：１２２のＶＬを有する抗体。
［１５７］
薬物としての使用のための、配列番号：１４１のＶＨおよび配列番号：１４０のＶＬを有する抗体。
［１５８］
薬物としての使用のための、配列番号：１５９のＶＨおよび配列番号：１５８のＶＬを有する抗体。
［１５９］
薬物としての使用のための、配列番号：１７７のＶＨおよび配列番号：１７６のＶＬを有する抗体。
［１６０］
薬物としての使用のための、配列番号：１９５のＶＨおよび配列番号：１９４のＶＬを有する抗体。
［１６１］
薬物としての使用のための、配列番号：２１３のＶＨおよび配列番号：２１２のＶＬを有する抗体。
［１６２］
薬物としての使用のための、配列番号：２３１のＶＨおよび配列番号：２３０のＶＬを有する抗体。
［１６３］
薬物としての使用のための、配列番号：２４９のＶＨおよび配列番号：２４８のＶＬを有する抗体。
［１６４］
薬物としての使用のための、配列番号：２６７のＶＨおよび配列番号：２６６のＶＬを有する抗体。
［１６５］
薬物としての使用のための、配列番号：２８５のＶＨおよび配列番号：２８４のＶＬを有する抗体。
［１６６］
薬物としての使用のための、配列番号：３０３のＶＨおよび配列番号：３０２のＶＬを有する抗体。
［１６７］
薬物としての使用のための、配列番号：３２１のＶＨおよび配列番号：３２０のＶＬを有する抗体。
［１６８］
薬物としての使用のための、配列番号：３３９のＶＨおよび配列番号：３３８のＶＬを有する抗体。
［１６９］
薬物としての使用のための、配列番号：３５７のＶＨおよび配列番号：３５６のＶＬを有する抗体。
［１７０］
薬物としての使用のための、配列番号：３７５のＶＨおよび配列番号：３７４のＶＬを有する抗体。
［１７１］
乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮癌、末梢神経鞘腫瘍、神経鞘腫、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、グリア芽腫、軟組織の明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎臓癌および黒色腫からなる群から選択されるＨＥＲ３リガンド依存性シグナル変換またはリガンド非依存性シグナル変換経路が介在する癌の処置のための薬物の製造のための、前記のいずれかに記載の抗体またはその断片の使用。

Claims (10)

  1. 配列番号：１４１を含むＶＨおよび配列番号：１４０を含むＶＬを含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその抗原結合断片。
  2. 配列番号：４９３を有する可変重鎖配列および配列番号：４９４を有する可変軽鎖配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその抗原結合断片。
  3. 配列番号：１４５を有する重鎖配列および配列番号：１４４を有する軽鎖配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体。
  4. 配列番号：１２８の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１２９のＣＤＲ２；配列番号：１３０のＣＤＲ３；配列番号：１３１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：１３２のＣＤＲ２；および配列番号：１３３のＣＤＲ３を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその抗原結合断片を含む、医薬組成物。
  5. 配列番号：１４１を含むＶＨおよび配列番号：１４０を含むＶＬを含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその抗原結合断片を含む、医薬組成物。
  6. 配列番号：４９３を有する可変重鎖配列および配列番号：４９４を有する可変軽鎖配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体またはその抗原結合断片を含む、医薬組成物。
  7. 配列番号：１４５を有する重鎖配列および配列番号：１４４を有する軽鎖配列を含む、ＨＥＲ３受容体に対する単離された抗体を含む、医薬組成物。
  8. ＨＥＲ３が発現する癌の治療に使用するための、請求項４〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  9. 前記癌がＨＥＲ３シグナル伝達経路によって介在される、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 前記癌が、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮癌、末梢神経鞘腫瘍、神経鞘腫、頭頸部癌、膀胱癌、食道癌、グリア芽腫、軟組織の明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎臓癌および黒色腫からなる群から選択される、請求項９または１０に記載の医薬組成物。
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