KR20120059568A - Ｅｒｂｂ３의 엑토도메인에 대한 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 ErbB3 수용체의 세포외 도메인과 결합하여 다양한 ErbB3 기능을 억제하는 새로운 부류의 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 예를 들어, 본원에 기술된 항체 및 항원 결합 단편은 수용체 지정된 ErbB3에 결합하여 그 수용체의 EGF 유사 리간드 매개성 인산화를 억제할 수 있다. 그와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편은 ErbB3를 발현시키는 암 세포의 증식을 억제하는 유용한 특징을 갖는다.

Description

ＥＲＢＢ３의 엑토도메인에 대한 항체 및 이의 용도{ANTIBODIES AGAINST THE ECTODOMAIN OF ERBB3 AND USES THEREOF}

폴리펩타이드 성장 인자 수용체의 ErbB/HER 아과(亞科)는 상피세포 성장 인자 (EGF) 수용체 (EGFR/ErbB1/HER1), neu 발암유전자 산물 (ErbB2/HER2) 및 보다 최근에 동정된 ErbB3/HER3과 ErbB4/HER4 수용체 단백질 (예를 들어, 문헌[Hynes et al., (1994) Biochim . Biophys . Acta Rev . Cancer 1198, 165-184] 참고)을 포함한다. 이러한 각 수용체들은 엑토도메인 (ectodomain; 세포외 리간드 결합 도메인), 막관통 도메인, 세포질, 단백질 티로신 키나아제 (PTK) 도메인 및 C-말단 인산화 도메인 (예를 들어, 문헌[Kim et al., (1998) Biochem . J. 334, 189-195] 참조)으로 이루어진다고 알려졌다. ErbB 수용체의 엑토도메인은 4개의 도메인 (I-IV)으로 나누어지는 것을 또한 특징으로 한다. ErbB 엑토도메인의 도메인 I 및 Ⅲ은 리간드 결합에 관여한다 (참조, 예를 들어 Hynes et . al.(2005)Nature Rev . Cancer 5, 341-354). 이들 수용체를 위한 리간드는 헤레귤린 (heregulin) (HRG) 및 헤타셀루린 (betacellulin) (BTC)을 포함한다.

시험관 내 실험으로부터, ErbB3 수용체 (ErbB3) 단백질의 단백질 티로신 키나아제 활성은 ErbB/HER 과의 다른 일원들에 비해서 현저히 약독화되며, 이러한 약독화 특성은 부분적으로는 ErbB3의 알려진 세포내 촉매 도메인 내의 비보존적 아미노산 치환의 발생으로부터 연유한다는 사실을 시사 받을 수 있다(예를 들어, 문헌[Guy et al., (1994) Proc . Natl . Acad . Sci . USA. 91, 8132-8136]; [Sierke et al., (1997) Biochem . J. 322, 757-763] 참조). 그러나, ErbB3 단백질은 다양한 세포 내용물에서 인산화되는 것으로 알려졌다. 예를 들어, ErbB3은 이 단백질을 과발현하는 인간 유방암 세포주의 하위군 내의 티로신 잔기 상에서 구조적으로 인산화된다(예를 들어, 문헌[Kraus et al., (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA. 90, 2900-2904]; 및 [Kim et al. 상기와 동일]를 참조하며; [Schaefer et al., (2006) Neoplasia 8(7):613-22] 및 [Schaefer et al., Cancer Res (2004) 64(10):3395-405]도 참조한다).

암에서 ErbB3의 역할이 밝혀졌으나(예를 들어, 문헌[Horst et al. (2005) 115, 519-527]; [Xue et al. (2006) Cancer Res. 66, 1418-1426] 참조), ErbB3은 임상적 개입을 위한 표적으로서는 아직 널리 인식되지는 못하고 있는 실정이다. 현재의 면역요법은 ErbB2의 작용, 특히 ErbB2/ErbB3 복합체의 이종이합체화를 억제하는데에 일차적으로 초점을 맞추고 있다(예를 들어, 문헌[Sliwkowski et al. (1994) J. Biol . Chem. 269(20):14661-14665 (1994)] 참조). 따라서, 본 발명의 목적은 ErbB3 신호 전달을 효과적으로 억제하여 다양한 암의 치료 및 진단에 사용될 수 있는 개선된 면역요법을 제공하고자 하는 것이다.

발명의 개요

어떤 그의 양태에서, 본 발명은 ErbB3 수용체에 결합하여 다양한 ErbB3 기능을 억제하는 새로운 부류의 항체 (예를 들어, 단일클론 항체)를 제공한다. 예를 들어, 본원에 기재된 항체는 ErbB3에 결합하여 수용체의 EGF 유사 리간드 매개성 인산화를 억제할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, EGF 유사 리간드는 EGF, TGF-α, 베타셀룰린, 헤파린 결합 상피세포 성장 인자, 바이레귤린 및 암피레귤린을 포함하며, 이들은 EGFR에 결합하여 EGFR과 ErbB3의 이합체화를 유도한다. 이러한 이합체화는, 결과적으로 ErbB3의 인산화를 야기하여, 수용체를 통한 신호 전달을 활성화시킨다. 따라서, 본 발명의 항체는 ErbB3 매개성 세포 신호 전달과 관련된 다양한 암의 치료 및 진단에 유용하다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명은 ErbB3에 결합하여 ErbB3의 EGF 유사 리간드 매개성 인산화를 억제하는 항체(이의 항원 결합부 포함)를 제공한다.

또 다른 구현예에서, 항체 및 이의 단편은 추가로 하나 이상의 하기 특성을 가진다: (i) 예컨대 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 및 바이레귤린과 같은 ErbB3 리간드의 ErbB3에의 결합에 의해 매개되는 신호 전달을 포함하는 ErbB3 리간드 매개성 신호 전달의 억제; (ⅱ) ErbB3을 발현하는 세포의 증식 억제; (ⅲ) 세포 표면에서 ErbB3의 수준을 감소시키는 능력 (예를 들어, ErbB3의 세포 내 함입을 유도함으로써); (ⅳ) ErbB3을 발현하는 세포에 의한 VEGF(혈관 내피 성장 인자)의 분비 억제; (v) ErbB3을 발현하는 세포의 이동 억제; (ⅵ) ErbB3을 발현하는 세포의 구상(spheroid) 성장 억제; 및 (ⅶ) 성숙 ErbB3 (서열번호: 73)의 아미노산 잔기 1 내지 약 190에 상응하는 엑토도메인 (세포외 도메인) 도메인 I 상에 위치한 에피토프, 예를 들어, 서열번호: 73의 잔기 1-183의 어떤 부분을 수반하거나 포괄하는, 더욱 바람직하게는 서열번호: 73의 잔기 93-104 또는 92-129를 수반하거나 포괄하는, 더욱 더 바람직하게는 ErbB의 아미노산 서열의 잔기 92, 93, 99, 101, 102, 서열번호:73의 104 및 129 또는 서열번호: 73의 잔기 93, 101, 102, 및 104을 수반하는 에피토프에의 결합.

바람직한 구현예에서, 항체는 서열번호: 73의 잔기 93-104 또는 92-129를 수반하거나 포괄하는, 더욱 더 바람직하게는 서열번호: 73의 잔기 92, 93, 99, 101, 102, 104 및 129 또는 서열번호: 73의 잔기 93, 101, 102, 및 104을 수반하는 에피토프에 결합하고, 단, 상기 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아니다.

또 다른 구현예에서, 항체는 서열번호: 73의 잔기 93-104 또는 92-129를 수반하거나 포괄하는, 더욱 더 바람직하게는 서열번호: 73의 잔기 92, 93, 99, 101, 102, 104 및 129 또는 서열번호: 73의 잔기 93, 101, 102, 및 104을 수반하는 에피토프에 결합하고, 단, 상기 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체; (ⅳ) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #3; (v) 서열번호: 3 및 4에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; (ⅵ) 서열번호: 13, 14 및 15에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 16, 17 및 18에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체; (ⅶ) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #17; (vⅲ) 서열번호: 35 및 36에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; (ix) 서열번호: 39, 40 및 41에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 42, 43 및 44에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체; (x) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #19; (xi) 서열번호: 37 및 38에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (xⅱ) 서열번호: 45, 46 및 47에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 48, 49 및 50에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아니다.

본원에 개시된 바람직한 항체 및 이의 항원 결합부는 표면 플라스몬 공명 분석법 또는 세포 결합 분석법에 의해 측정했을 때, 50 nM 이하의 K_{D 를} 나타낸다.

추가의 구현예에서, 본 발명의 특정 항체 및 이의 항원 결합부는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 35, 또는 서열번호 37에 기재된 중쇄 가변부 아미노산 서열과 80% 이상 (예를 들어, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산을 포함하는 중쇄 가변부(V_H)를 포함한다. 발명의 다른 특정 항체 및 이의 항원 결합부는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 36, 또는 서열번호 38에 기재된 경쇄 가변부 아미노산 서열과 80% 이상 (예를 들어, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산을 포함하는 경쇄 가변부(V_L)를 포함한다. 또한, 항체는 상기 언급한 중쇄 및 경쇄 가변부 양자 모두를 포함할 수도 있다.

항체 또는 이의 항원 결합부의 중쇄 및 경쇄 가변부는 보통 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 이들은 CDR1, CDR2, 또는 CDR3 영역을 하나 이상 포함된다. 따라서, 본 개시내용의 다른 특정 단일클론 항체 및 이의 항원 결합부는 서열번호 7을 포함하는 중쇄 가변부 CDR1; 서열번호 8을 포함하는 중쇄 가변부 CDR2; 서열번호 9를 포함하는 중쇄 가변부 CDR3; 서열번호 10을 포함하는 경쇄 가변부 CDR1; 서열번호 11을 포함하는 경쇄 가변부 CDR2; 서열번호 12를 포함하는 경쇄 가변부 CDR3; 및 이들의 조합물로부터 선택되는 하나 이상의 CDR 서열을 포함한다.

본 개시내용의 또 다른 특정 단일클론 항체 및 이의 항원 결합부는 서열번호 13을 포함하는 중쇄 가변부 CDR1; 서열번호 14를 포함하는 중쇄 가변부 CDR2; 서열번호 15를 포함하는 중쇄 가변부 CDR3; 서열번호 16을 포함하는 경쇄 가변부 CDR1; 서열번호 17을 포함하는 경쇄 가변부 CDR2; 서열번호 18을 포함하는 경쇄 가변부 CDR3; 및 이들의 조합물로부터 선택되는 하나 이상의 CDR 서열을 포함한다.

본 개시내용의 또 다른 특정 단일클론 항체 및 이의 항원 결합부는 서열번호 19를 포함하는 중쇄 가변부 CDR1; 서열번호 20을 포함하는 중쇄 가변부 CDR2; 서열번호 21을 포함하는 중쇄 가변부 CDR3; 서열번호 22를 포함하는 경쇄 가변부 CDR1; 서열번호 23을 포함하는 경쇄 가변부 CDR2; 서열번호 24를 포함하는 경쇄 가변부 CDR3; 및 이들의 조합물로부터 선택되는 하나 이상의 CDR 서열을 포함한다.

본 개시내용의 또 다른 특정 단일클론 항체 및 이의 항원 결합부는 서열번호 39를 포함하는 중쇄 가변부 CDR1; 서열번호 40을 포함하는 중쇄 가변부 CDR2; 서열번호 41을 포함하는 중쇄 가변부 CDR3; 서열번호 42를 포함하는 경쇄 가변부 CDR1; 서열번호 43을 포함하는 경쇄 가변부 CDR2; 서열번호 44를 포함하는 경쇄 가변부 CDR3; 및 이들의 조합물로부터 선택되는 하나 이상의 CDR 서열을 포함한다.

본 개시내용의 또 다른 특정 단일클론 항체 및 이의 항원 결합부는 서열번호 45를 포함하는 중쇄 가변부 CDR1; 서열번호 46을 포함하는 중쇄 가변부 CDR2; 서열번호 47을 포함하는 중쇄 가변부 CDR3; 서열번호 48을 포함하는 경쇄 가변부 CDR1; 서열번호 49를 포함하는 경쇄 가변부 CDR2; 서열번호 50을 포함하는 경쇄 가변부 CDR3; 및 이들의 조합물로부터 선택되는 하나 이상의 CDR 서열을 포함한다.

또한, 항체 및 이의 항원 결합부는 상기 언급한 임의의 CDR, 또는 이들 CDR의 조합물과 80% 이상 (예를 들어, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 CDR을 하나 이상 포함할 수도 있다.

한 구현예에서, 항체 및 이의 항체 부분은 전부 인간의 것이다(즉, 인간 CDR 및 골격 서열을 포함한다). 본 개시내용의 특정 인간 항체는 인간 VH3 생식세포 유전자 유래의 중쇄 가변부 및/또는 인간 VL2 생식세포 유전자 유래의 경쇄 가변부를 가지는 것들을 포함한다.

또한, 성숙 ErbB3 (서열번호: 73)의 아미노산 서열의 잔기 1-183 중 어떤 것을 수반하거나 포괄하는, 더욱 바람직하게는 서열번호: 73의 잔기 93-104 또는 92-129를 수반하거나 포괄하는, 더욱 더 바람직하게는 서열번호: 73의 잔기 92, 93, 99, 101, 102, 104 및 129 또는 서열번호: 73의 잔기 93, 101, 102, 및 104를 수반하는 에피토프와 같은 본원에 기재된 임의의 항체 또는 이의 부분의 어떤 것에 의해 결합된 동일 또는 중첩되는 에피토프 (예를 들어, ErbB3의 엑토도메인의 도메인 I 상에 위치한 에피토프)에 결합되는 항체 및 이의 항원 결합부도 본 발명에 포함된다. 본원에 기재된 항체와 동일한 에피토프 결합 활성을 갖는 항체, 예를 들어, Ab #6과 동일한 서열을 갖거나 서열번호: 73의 잔기 93-104를 수반하는 에피토프에 결합하는 항체도 본 발명에 포함된다.

본 발명에는 또한, 인간 ErbB3의 엑토도메인에 결합하고, CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 및 이의 항원 결합부가 포함되고,

여기서:

상기 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 서열번호: 60 또는 75 (CDR1), 61 (CDR2) 및 62 (CDR3)에서 각각 보여진 바와 같은 공통 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고,

상기 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 서열번호: 66 또는 77 (CDR1), 67 (CDR2) 및 68 또는 79 (CDR3)에서 각각 보여진 바와 같은 공통 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 단, 상기 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아니다.

바람직한 구현예에서, 단리된 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열번호: 73의 잔기 92-129 또는 93-104를 포함하는 인간 ErbB3의 엑토도메인의 도메인 I 내에 에피토프에 결합하고. 더욱 더 바람직하게는, 단리된 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열번호: 73의 잔기 92-129 또는 93-104를 포함하는 인간 ErbB3의 엑토도메인의 도메인 I 내에 에피토프에 결합하고, ErbB3를 발현시키는 암 세포의 증식을 억제한다. 바람직하게는, 상기 암 세포는 MALME-3M 흑색종 세포, AdrR (AdrR) 난소 선암 세포 또는 ACHN 신장암 세포이고, 증식은 대조군(즉, 어울리는 비처리 세포)에 비해서 적어도 10%까지 감소된다.

인간 ErbB3의 엑토도메인의 도메인 I에 결합하는 단리된 항체, 또는 이의 항원 결합부의 다른 구현예에서, 서열번호: 73의 잔기 93 (아스파라긴), 잔기 99 (페닐알라닌), 잔기 101 (메티오닌), 잔기 102 (류신) 및 잔기 104 (티로신)으로부터 선택된 인간 ErbB3의 엑토도메인의 도메인 I의 아미노산 잔기 중 어느 하나가 알라닌에 의해 치환되거나, 서열번호: 73의 잔기 92 (티로신) 또는 129 (티로신)이 페닐알라닌에 의해 치환되고, 단일 아미노산 치환을 갖는 돌연변이체 ErbB3를 생성할 때, 항체 또는 이의 항원 결합부의 서열번호: 73의 무변화 아미노산 서열 (또는 이의 상응하는 단편)을 포함하는 인간 ErbB3에의 결합과 비교하여 항체 또는 이의 항원 결합부의 돌연변이체 ErbB3 (또는 이의 단편)에의 결합에서 실질적 감소가 있다. 바람직하게는, 결합에서의 실질적 감소는 결합의 K_D 값에서 적어도 10배 변화이다.

본 발명에는 또한, 인간 ErbB3의 엑토도메인의 도메인 I에 결합하고, CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 및 이의 항원 결합부가 포함되고,

여기서:

상기 중쇄 가변 영역 파라토프는 서열번호: 63 또는 76 (CDR1), 64 (CDR2) 및 65 (CDR3)에서 각각 보여진 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고,

상기 경쇄 가변 영역 파라토프는 서열번호: 69 또는 78 (CDR1), 70 (CDR2) 및 71 또는 80 (CDR3)에서 각각 보여진 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 단, 상기 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아니다.

본 발명에는 또한, 인간 ErbB3의 엑토도메인의 도메인 I에 특이적으롤 결합하는 항체 및 이의 항원 결합부가 포함되며, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는,

서열번호: 7 또는 그의 보존성 아미노산 치환을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;

서열번호: 8 또는 그의 보존성 아미노산 치환을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

서열번호: 9 또는 그의 보존성 아미노산 치환을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

서열번호: 10 또는 그의 보존성 아미노산 치환을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;

서열번호: 11 또는 그의 보존성 아미노산 치환을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및

서열번호: 12 또는 그의 보존성 아미노산 치환을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하며,

여기서, 항체 또는 이의 항원 결합부의 ErbB3에의 결합은 표면 플라스몬 공명 검정 또는 세포 결합 검정에 의해 측정시, 50 nM 또는 초과의 K_D를 나타낸다.

본 발명의 항체는 공지된 모든 형태의 항체 및 항체 유사 특성을 갖는 기타의 단백질 골격(scaffold)을 포함한다. 예를 들어, 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 이중특이적 항체, 키메라 항체, 또는 피브로넥틴 또는 앤키린 반복과 같은 항체 유사 특성을 갖는 단백질 골격일 수 있다. 또한, 항체는 Fab, Fab'2, ScFv, SMIP, 어피바디(affibody), 나노바디(nanobody), 또는 도메인 항체일 수 있다. 또한, 항체는 하기 아형 중에서 임의로 하나 이상을 가질 수 있다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD 및 IgE.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 허용가능한 담체 및/또는 아주반트와 함께 제형화된, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합부의 혼합물을 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 ErbB3 상의 서로 다른 에피토프와 결합하는 항체 또는 ErbB3과 결합하지 않는 항암 항체와 조합된 본원에 기재된 항체를 2종 이상 포함한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 및 이의 항원 결합부를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 특정 구현예에서, 핵산은 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 35 또는 서열번호 37과 80% 이상 (예를 들어, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일하거나, 높은 엄격한 조건 하에 상기 서열들과 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 중쇄 가변부; 또는 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 36, 또는 서열번호 38과 80% 이상 (예를 들어, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일하거나, 고도의 엄격한 조건 하에 상기 서열들과 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경쇄 가변부; 또는 이러한 중쇄 및 경쇄 가변부의 조합물을 코딩한다.

본 발명은 추가로 본원에 기재된 항체 및 항원 결합부를 발현 및/또는 생산하는 인간을 제외한 트랜스게닉 포유류, 하이브리도마 및 트랜스게닉 식물을 제공한다.

또한, 본 발명은 본원에 기재된 단리된 항체 또는 이의 항원 결합부를 하나 이상 포함하며, 임의로는 ErbB3 의존적 신호 전달과 관련된 질병, 예컨대 암을 치료 또는 진단하는데 사용하는 설명서를 포함하는 키트도 제공한다.

본원에 개시된 항체 및 이의 항원 결합부는 광범위한 치료 및 진단 용도, 특히 종양학적 용도에서 사용될 수 있다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 ErbB3의 EGF 유사 리간드 매개성 인산화를 억제하기에 충분한 양으로 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합부를 하나 이상 투여함으로써 대상에서 ErbB3의 EGF 유사 리간드 매개성 인산화를 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 대상에 있어서 다양한 종류의 암, 예컨대, 이에 제한하지는 않지만, 흑색종, 유방암, 난소암, 신장암, 위/결장암, 폐암, 투명세포 육종 및 전립선암을 치료하기에 충분한 양으로 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합부를 하나 이상 투여함으로써 상기 기술된 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 암은 KRAS 돌연변이를 포함하는 세포를 포함한다. 예시적인 KRAS 돌연변이는 인간 KRAS 유전자의 코돈 12 및 코돈 13 중 하나 또는 모두에 있다. 각각이 글리신 (야생형 글리신 12 또는 글리신 13을 세린, 아르기닌, 시스테인, 아스파르레이트, 또는 발린으로 변화시키는 것들 중 어떤 것을 포함) 에 대해 통상 코딩하는 코돈 12 또는 13에서의 돌연변이는 인간 KRAS 유전자의 코돈 15, 20, 61 및 146에서의 돌연변이와 같이, 종양형성을 촉진하는 KRAS 돌연변이를 활성화한다. 또 다른 구현예에서, 암은 PI3K (포스파티딜리노시톨 3-키나제) 돌연변이를 포함하는 세포를 포함한다. 예시적인 PI3K 돌연변이는 엑손 9 또는 엑손 20 중 하나 또는 모두에서 인간 PIK3CA 유전자에서 돌연변이를 활성화한다. 항체 또는 이의 항원 결합부는 단독으로 또는 치료제, 예컨대 항암제, 예를 들어, 다른 항체, 화학요법제 및/또는 방사선과 병용하여 투여될 수 있다.

일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 제2 제제와 병용하여 투여되고, 여기서 상기 제2 제제는 단백질 합성 억제제, 소마토스타틴 유사체, 면역치료제, 및 효소 억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 상기 제2 제제는 IGF1R 표적 소분자, EGFR 표적 소분자, ErbB2 표적 소분자, c-MET 표적 소분자, 항대사물질, 알킬화제, 토포아이소머라제 억제제, 미소관 표적제, 키나아제 억제제, 호르몬 치료제, 글루코코르티코이드, 아로마타제 억제제, mTOR 억제제, 화학요법제, 단백질 키나아제 B 억제제, 포스파티딜이노시톨 3-키나아제 억제제, 사이클린 의존성 키나아제 억제제, 및 MEK 억제제로부터 선택된다. 병용 치료에서 제2 제제로서 사용하기 위한 예시적인 항체는 항-Her2 항체, 예를 들어, 트라스투주맙 및 항-EGFR 항체, 예를 들어, 파니투무맙 또는 세툭시맙을 포함한다. 병용 치료에서 제2 제제로서 사용하기 위한 어떤 바람직한 항암제는 에를로티닙, 라파티닙, 파클리탁셀 및 시스플라틴을 포함한다.

다른 구현예에서, 본 발명은 ErbB3과 관련된 질병(예를 들어, 암)을 진단하여 예측하는 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 이러한 방법은 대상의 세포와 본 개시내용의 항체 또는 항원 결합부와 접촉시킨 후(예를 들어, 체외 또는 체내에서), 세포 상에서 ErbB3와의 결합 수준을 측정함으로써 달성되며, 여기서 ErbB3에의 결합 수준이 비정상적으로 높은 경우는 대상이 ErbB3이 관련된 암에 걸렸음을 나타내는 것이다.

본 발명의 다른 특징과 장점들은 하기 상세한 설명과 특허청구범위로부터 명백히 알 수 있을 것이다.

도 1a과 1b는 염소 항-인간 Alexa 647 이차 항체(GAHu-Alexa 674)를 이용하여 MALME-3M 흑색종 세포 상에 발현된 ErbB3에 다양한 항-ErbB3 항체 후보물질을 결합시킨 것을 나타낸 막대 그래프이다. 이들 실험에서, "Ab#"로서 나타낸 항체는 Fab 단편 형태로 사용되고 "GAHu-Alexa 674"는 대조군으로서 단독으로 사용된 형광 염료 접합된 이차 항체를 나타내고, 한편, "염색되지 않는"은 이차 항체의 부재에서의 대조군을 나타낸다.
도 2a-2d는 다양한 항-ErbB3 항체 후보물질의 K_D 값로서 나타낸 ErbB3에의 항체의 결합을 나타낸 그래프이다. 도 2a와 2b는 각각 표면 플라스몬 공명(SPR) 기법 및 식 K_D=k_d/k_a을 이용하여 측정시, Ab #6 및 Ab #3의 K_D 값을 나타낸 그래프이다. 도 2c와 2d는 각각 MALME-3M 흑색종 세포 및 식 Y=Bmax*X/K_D+X를 사용하여 세포 결합 분석법으로 측정했을 때 Ab #6과 Ab #3의 K_D 값을 나타낸 그래프이다.
도 3은 ELISA를 이용하여 ErbB3에 대한 항-ErbB3 항체 (Ab #6)의 결합 특이성을 나타낸 그래프이다. EGFR 세포외 도메인, 소혈청 알부민 (BSA) 및 TGFα를 대조군으로 사용했다.
도 4는 ELISA를 이용하여 측정된, 시험관 내 MALME-3M 흑색종 세포에서 총 ErbB3 수준을 감소시키는 항-ErbB3 항체 (Ab #6)의 능력을 나타내는 그래프이다.
도 5a와 5b는 하기 실시예 5에서 기재된 바와 같이, FACS 분석을 이용하여 측정된, MALME-3M 세포 상에서 ErbB3 수용체를 하향조절시키는 항-ErbB3 항체 (Ab #6)의 능력을 나타내는 그래프이다. 도 5a는 항체의 IgG1 아형을 이용한 결과를 나타낸다. 도 5b는 항체의 IgG2 아형을 이용한 결과를 나타낸다.
도 6a-6d는 FACS 분석을 이용하여 측정된, 항체 매개성 ErbB3 하향조절의 시간 경과(Ab #6)를 나타낸 그래프이다.
도 7은 약동학적 연구의 결과를 보여준다. 막대 그래프는 생체내 이종이식편에서 MALME3M 흑색종 세포에서의 총 ErbB3 수분에 대한 지정된 항-ErbB3 항체의 24시간 투여 후 결과를 나타낸다. 볼 수 있는 바와 같이, 데이타는 ErbB3을 하향조절시키는 Ab #6의 능력을 설명한다.
도 8은 생체내 AdrR 이종이식편에서 ErbB3을 하향조절시키는 항-ErbB3 항체(Ab #6)의 능력을 나타낸 막대 그래프이다. AdrR 이종이식편에서의 총 ErbB3 수준은 보여진다.
도 9는 세포 적정 발광 분석법(CellTiter-Glo® assay)에서 MALME-3M 세포의 증식을 억제하는 항-ErbB3 항체 (Ab #6)의 능력을 나타낸 그래프이다.
도 10은 AdrR 세포의 세포 증식을 억제하는 항-ErbB3 항체 (Ab #6)의 능력을 나타낸 그래프이다.
도 11은 ACHN 세포의 증식을 억제하는 항-ErbB3 항체 (Ab #6)의 능력을 나타낸 그래프이다.
도 12는 생체내 AdrR 이종이식편에서 ErbB3 인산화를 억제하는 항-ErbB3 항체 (Ab #6)의 능력을 나타낸 그래프이다.
도 13a-13c는 AdrR 세포에서 ErbB3의 베타셀룰린, 헤레귤린, 및 TGFα 매개성 인산화를 억제하는 항-ErbB3 항체 (Ab #6)의 능력을 나타낸 그래프이다.
도 14a-14b는 난소 종양 세포주 OVCAR 5와 OVCAR 8에서 ErbB3 인산화를 억제하는 항-ErbB3 항체 (Ab #6 IgG2 아형)의 능력을 나타낸 그래프이다.
도 15a-15c는 ErbB1 음성 MALME-3M 세포에 대한 결합 부족에 의해 나타난 베타셀룰린 (BTC)의 ErbB1에 대한 결합 능력 (도 15a); 10 nM (도 15b)와 200 nM (도 15c)의 각 농도에서 ErbB1 양성 AdrR 세포에의 결합 능력과, 세툭시맙(cetuximab)에 의한 이러한 결합의 억제를 나타낸 그래프이다.
도 16a-16d는 MALME-3M 세포 (도 16a 및 16b) 및 OVCAR8 세포 (도 16c 및 16d)에서 헤레귤린 매개성 신호 전달을 억제하는 항-ErbB3 항체 (Ab #6 IgG2 아형)의 능력을 나타낸 그래프이다. 도 16a는 MALME-3M 세포에서 ErbB3의 헤레귤린 매개성 인산화를 억제하는 Ab #6의 능력을 나타낸 그래프이다 (IC₅₀=1.5e-8). 도 16b는 MALME-3M 세포에서 AKT의 인산화를 억제하는 Ab #6의 능력을 나타낸 그래프이다 (IC₅₀=1.1e-8). 도 16c는 OVCAR8 세포에서 ErbB3의 헤레귤린 매개성 인산화를 억제하는 Ab #6의 능력을 나타낸다 (IC₅₀=2.4e-8). 도 16b는 OVCAR8 세포에서 AKT의 인산화를 억제하는 Ab #6의 능력을 나타낸다 (IC₅₀=6.7e-8).
도 17a-17d는 이종이식 연구를 통한 (도 17a) 난소 (AdrR 세포), (도 17b) 전립선 (Du145 세포), (도 17c) 난소 (OVCAR8 세포), 및 (도 17d) 췌장 (Colo-357 세포) 종양 성장을 억제하는 항-ErbB3 항체 (Ab #6)의 능력을 나타내는 그래프이다.
도 18a와 18b는 FACS 분석을 이용하여 측정된, MALME-3M 세포에서 ErbB3에 대한 헤레귤린의 결합을 억제하는 Ab #6 (도 18a) 및 Ab #3(Fab) (도 18b)의 능력을 나타낸 그래프이다.
도 19a는 AdrR 세포에 대한 에피레귤린의 결합을 나타내며, 도 19b는 에피레귤린이 AdrR 세포에 결합하는 것을 억제하기 위해 ERBITUX (세툭시맙)아닌 Ab #6의 능력을 나타낸다.
도 20은 AdrR 세포에 결합하는 헤파린 결합 상피세포 성장 인자 (HB-EGF)의 능력을 나타내는 그래프이다.
도 21a-21c는 항체 Ab #6, Ab #3, Ab #14, Ab #17 및 Ab #19의 중쇄 및 경쇄 가변부의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 22a-22b는 항체 Ab #6, Ab #3 및 Ab #14의 중쇄 및 경쇄 가변부의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 23은 상응하는 해당 생식세포 아미노산 서열로 복귀된 항체 Ab #6, Ab #17 및 Ab #19의 경쇄 가변부의 아미노산 서열을 나타낸다. 이 역전을 달성하는 아미노산 잔기 변화 (도 21 비교)는 밑줄로 나타나 있다.
도 24a 및 24b는 종양 세포에 의해 VEGF 분비를 억제하는 Ab #6의 능력을 보여주는 그래프이다 (실시예 11 참조). 도 24c는 Ab #에 의해 종양 세포에서 VEGF 분비의 억제 및 pErbB3의 억제 사이의 상호관계를 보여준다.
도 25는 세포 이동에 있어서 Ab #6의 효과를 보여주는 그래프이다 (실시예 12 참조). 대조군 0uM = RPMI 배지 단독, 대조군 8uM =RPMI 배지 + 8uM Ab #6, FBS 0mM = RPMI 배지 + 10% FBS, FBS 8uM = RPMI 배지 + 10% FBS + 8uM Ab #6.
도 26a-26c는 (도 26a) AdrR 세포에서의 구상 성장의 억제, (도 26b) AdrR 세포에서의 HRG 유발성 구상 성장의 억제, 및 (도 26c) Du145 세포에서의 HRG 유발성 구상 성장의 억제를 보여주는 그래프이다.
도 27a와 27b는 AdrR 세포에 대한 (도 17a) HRG 결합, 및 (도 27b) BTC 결합에 대한 Ab #6의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 28은 AdrR 세포에서 HGF (간세포 성장 인자) 유발성 ErbB3 인산화에 대한 Ab #6의 효과를 보여주는 그래프이다. HGF에 대한 IC₅₀은 2.439e-10인 것으로 측정되었다.
도 29a와 29b는 (도 29a) pErbB1과 pErbB3의 인산화, 및 (도 29b) HRG 유발성 ErbB2/3 복합체 형성에 대한 Ab #6의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 30은 Ab #6 단독, 엘로티닙 단독 또는 Ab #6과 엘로티닙이 누드 마우스에서 ACHN 이종이식편 종양의 성장에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다. 상기 데이터는 27일 후 300 ug의 용량의 Ab #6(단독 투여시 차선 용량)과 엘로티닙의 병용이 상승작용에 의해 통계학적으로 유의한 정도로 종양 성장을 억제함을 보여준다.
도 31은 Ab #6 단독, 탁솔 단독 또는 Ab #6과 탁솔이 누드 마우스에서 DU145 이종이식편 종양의 성장에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다. 상기 데이터는 300 ug의 용량의 Ab #6(단독 투여시 차선 용량)과 엘로티닙의 병용이 27일 후 통계학적으로 유의한 정도로 약물 단독 처리보다 더 큰 정도로 종양 성장을 억제함을 보여준다.
도 32a는 Ab #6 처리 단독이 KRAS 돌연변이 A549 폐암 세포의 다세포성 종양 구상체(spheroid)의 성장에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다. 세포를 7일간 0, 0.001, 0.01, 0.1 또는 1 μM Ab #6로 처리하였다. x축의 "-4"는 "0" 용량에 해당한다. 상기 결과는 KRAS 돌연변이 종양 구상체 성장에 대한 Ab #6 용량 반응 효과를 보여준다.
도 32b는 처리 1일 및 7일에 1 μM Ab #6로 처리되거나 처리되지 않은 대표적인 A549 구상체의 일련의 사진이다.
도 32c는 Ab #6 처리 단독이 누드 마우스에서 KRAS 돌연변이 A549 피하 이종이식편 종양의 성장에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다. Ab #6의 투여(3일마다 600 μg)는 22일에 중지되었다.
도 33a는 Ab #6 처리 단독, 엘로티닙 처리 단독 또는 Ab #6과 엘로티닙의 병용 처리가 누드 마우스에서 KRAS 돌연변이 A549 피하 이종이식편 종양의 성장에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다.
도 33b는 Ab #6 처리 단독, 탁솔 처리 단독 또는 Ab #6과 탁솔의 병용 처리가 누드 마우스에서 KRAS 돌연변이 A549 피하 이종이식편 종양의 성장에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다.
도 34a-34e는 야생형 ErbB3 (도 34A)을 발현하는 CHO 세포 또는 하기 점 돌연변이 중 하나를 갖는 ErbB3를 발현하는 CHO 세포에 대한 Ab #6 및 대조군 항-ErbB3 항체(SGP1)의 결합을 위한 FACS 분석 결과를 보여준다: D93A(도 34b), M101A(도 34c), L102A(도 34d) 또는 Y104A(도 34e).
도 35a는 Ab #6 처리 단독이 마우스에서 PI3K 돌연변이 SKOV3 이종이식편 종양의 성장에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다.
도 35b는 Ab #6 처리 단독, 또는 시스플라틴(CDDP)과의 병용 처리가 마우스에서 PI3K 돌연변이 SKOV3 이종이식편 종양의 성장에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다.
도 36은 파라토프(paratope) 맵핑 실험으로부터 얻은 데이터를 보여준다. 단백질 A에 대한 Ab #6의 동일한 돌연변이의 결합과 비교하여 ErbB3에 대한 Ab #6 돌연변이의 결합에 미치는 단일 아미노산 돌연변이(나타낸 돌연변이의 본질을 위해 실시예 20, 표 2 참조)의 효과가 나타나 있다. 그래프를 양분하는 대각선은 ErbB3 및 단백질 A에 대한 효과의 1:1 대응을 가리킨다. 돌연변이들을 세 가지 카테고리(결합에 미치는 효과가 큼, 작음 및 없음)로 간편하게 분류하기 위해 상기 대각선을 y축 아래로 0.33 및 0.66만큼 이동시켜 생성된 추가 평행선들을 위치시켰다. 상기 그래프는 야생형 Ab #6에 대해 정규화된 돌연변이의 결합에 미치는 효과를 보여준다. Y축의 값은 ErbB3에 대한 야생형 Ab #6의 결합 대 Ab #6 돌연변이의 결합의 비율이다. < 1의 비율은 야생형 Ab #6과 비교하여 상기 돌연변이가 ErbB3에 대하여 결합 손실을 가진다는 것을 의미하는 반면, > 1의 비율은 상기 돌연변이가 야생형 Ab #6보다 ErbB3에 대해 더 강한 결합을 나타낸다는 것을 의미한다.
도 37a 및 37b는 Ab #6 야생형 중쇄 가변 영역(V_H) CDR1, CDR2 및 CDR3 서열(각각 서열번호: 7, 8 및 9), 공통 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열(도 37a의 경우 각각 서열번호: 60, 61 및 62, 및 도 37b의 경우 각각 서열번호: 75, 61 및 62), V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 파라토프 서열(도 37a의 경우 각각 서열번호: 63, 64 및 65, 및 도 37b의 경우 각각 서열번호: 76, 64, 65), Ab #6 야생형 경쇄 가변 영역(V_L) CDR1, CDR2 및 CDR3 서열(각각 서열번호: 10, 11 및 12), 공통 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열(도 37a의 경우 각각 서열번호: 66, 67 및 68, 및 도 37b의 경우 각각 서열번호: 77, 67 및 79) 및 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 파라토프 서열(도 37a의 경우 각각 서열번호: 69, 70 및 71, 및 도 37b의 경우 각각 서열번호: 78, 70 및 80)의 도식이다. 이들 도면에서, 표준 한 글자 아미노산 약자가 사용되며 아미노산을 표시하는 한 글자들의 대시 기호에 의한 분리는 서열 내의 순차적인 잔기들을 가리키는 반면, 하나 이상의 슬래시 기호로 분리된 아미노산을 표시하는 둘 이상의 인접한 한 글자들의 임의의 그룹은 그렇게 분리된 그룹화된 인접한 아미노산 중 어느 하나가 서열 내의 상기 위치에 있는 임의의 다른 것으로 치환될 수 있음을 가리킨다. 예를 들어, 표기법 "(Xaa)₇-W-T/A/G/S-L-(Xaa)₇"은 하기와 같은 아미노 말단으로부터 카르복시 말단까지의 서열을 가리킨다: 7개의 불특정한 아미노산 다음으로 트립토판, 다음으로 (트레오닌 또는 알라닌 또는 글리신 또는 세린), 다음으로 류신, 다음으로 불특정한 아미노산. "불특정한 아미노산"은, 몇 가지 위치들이 함께 나타난다 할지라도, Xaa로 명명된 각 위치에 임의의 아미노산이 독립적으로 나타날 수 있음을 가리키고자 본원에 사용된다. Xaa 또는 Xaa_# -- 예컨대, "(Xaa)₇"--로 명명된 임의의 그룹의 반복은 이들 서열 내의 하나의 위치에 있는 불특정한 아미노산들의 상기 명명된 그룹 및 임의의 다른 위치에 있는 불특정한 아미노산들의 명명된 그룹 간의 어떠한 관련성을 나타내지 않는다. 따라서, 서열 "(Xaa)₇-W-T/A/G/S-L-(Xaa)₇"의 처음과 말단에 있는 (Xaa)₇의 반복은 각각 7개의 불특정한 아미노산을 함유한다는 것 이외에 각 (Xaa)₇ 서열 간의 어떠한 관련성도 나타내지 않는다.
도 38 a-e는 AdrR 세포에서 리간드-유도된 ErbB3 인산화(pErbB3 수준; 표시된 바와 같이 Y축을 따라 농도 증가)에 대한 Ab #6의 효과(표시된 바와 같이, X축을 따라 농도 감소)를 보여준다. 도 38a에서 리간드는 HRG이고, 도 38b에서 리간드는 BTC이며, 도 38c에서 리간드는 HGF이며, 도 38d에서 리간드는 EGF이다.
도 39는, Ab #6가 ErbB3의 엑토도메인의 도메인 I에 결합하는 것을 설명하는 FACS의 프로파일이다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 보다 용이한 이해를 위하여 특정 용어들을 먼저 정의한다. 추가의 정의들은 발명의 상세한 설명을 통해 기재된다.

I. 정의

본원에서 호환되어 사용되는 "ErbB3", "HER3", "ErbB3 수용체" 및 "HER3 수용체"라는 용어들은, 미국특허 제5,480,968호 및 문헌[Plowman et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 87:4905-4909 (1990)]에 기술된 바와 같은 인간 ErbB3 단백질을 지칭한다(문헌[Kani et al., Biochemistry 44:15842-857 (2005)], [Cho and Leahy, Science 297:1330-1333 (2002)]도 참조한다). (선도 서열없는) 전체 길이의, 성숙 인간 ErbB3 단백질 서열은 서열번호: 73에서 보여진다. 이 서열은 도 4 및 미국 특허 No. 5,480,968의 서열번호: 4에서 보여진 서열 - 성숙 단백질로부터 절단된 19 아미노산 선도 서열에 상응한다.

본원에서 사용된 "EGF 유사 리간드"라는 용어는 상피세포 성장 인자 (EGF)와 이와 밀접하게 관련있는 단백질, 예컨대 변형 성장 인자-α(TGFα), 베타셀룰린 (BTC), 헤파린 결합 상피세포 성장 인자 (HB-EGF), 바이레귤린 (BIR) 및 암피레귤린 (AR)를 포함하는 상피세포 성장 인자 수용체 (EGFR)의 리간드를 지칭하는데, 이들은 세포 표면의 EGFR에 결합하여 수용체 고유의 단백질-티로신 키나아제 활성을 촉진한다. 전형적으로, EGF 유사 리간드는 EGFR과 ErbB3 단백질 복합체의 형성을 유도하여(예를 들어, 문헌[Kim et al., (1998) Biochem J., 334:189-195] 참조), 복합체 내의 티로신 잔기의 인산화를 유도한다.

본원에 개시된 바람직한 항체 및 이의 항원 결합부는 ErbB3의 EGF 유사 리간드 매개성 인산화를 억제하며, 특정 구현예에서, 하기의 추가적인 특성을 하나 이상 가진다: (i) 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 및 바이레귤린 중 하나 이상으로 매개된 ErbB3을 통한 신호전달의 억제; (ⅱ) ErbB3을 발현하는 세포의 증식 억제; (ⅲ) 세포 표면에서 ErbB3의 수준을 감소시키는 능력; (ⅳ) ErbB3을 발현하는 세포의 VEGF 분비 억제; (v) ErbB3을 발현하는 세포의 이동 억제; (ⅵ) ErbB3을 발현하는 세포의 구상 성장 억제; 및/또는 (ⅶ) ErbB3의 엑토도메인의 도메인 I 상에 위치한 에피토프, 예를 들어 성숙 ErbB3 (서열번호: 73)의 아미노산 서열의 잔기 1 내지 183를 수반하거나 포괄하는, 더 바람직하게는 서열번호: 73의 잔기 92-129 또는 93-104를 수반하거나 그에 걸치거나 함유하거나 구성하거나 포함하는, 더욱 더 바람직하게는 서열번호: 73의 잔기 92, 93, 101, 102 및 104 및 129, 또는 잔기 93, 101, 102 및 104을 수반하거나 함유하거나 구성하거나 포함하는 에피토프에의 특이적 결합. 하나의 그와 같은 항체인 Ab#6는 MM-121과 같은 상 I 임상시험을 현재 경험한다.

본원에서 "억제"라는 용어는 활성을 완전히 차단하는 것을 비롯하여, 생물학적 활성에 있어서 통계적으로 유의한 정도로 감소했음을 지칭한다. 예를 들어, "억제"는 생물학적 활성에 있어서 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%가 감소되었음을 가리킨다.

따라서, 본원에서 "ErbB3의 EGF 유사 리간드 매개성 인산화의 억제"라는 말은 아무런 처리를 하지 않은 (대조군) 세포에서의 인산화에 비해서, EGF 유사 리간드에 의해 유도된 ErbB3의 인산화를 통계적으로 유의한 정도로 감소시키는 항체 또는 항원 결합부의 능력을 가리킨다. ErbB3을 발현하는 세포는 자연 발생적인 세포 또는 세포주일 수 있거나, 숙주 세포 내로 ErbB3을 코딩하는 핵산을 도입함으로써 재조합 생성될 수 있다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는, 예를 들어, 문헌[Kim et al., (1998) Biochem J., 334:189-195]과 아래의 실시예들에서 기술된 바와 같이 항-포스포티로신 항체를 이용한 탐침을 수반하는 웨스턴 블롯팅에 의해 측정하였을 때, ErbB3의 EGF 유사 리간드 매개성 인산화를 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 약 100%까지 억제한다.

본원에서 "ErbB3을 통한 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 또는 바이레귤린 매개성 신호 전달의 억제"라는 말은 항체의 부재 하(대조군)의 신호 전달과 비교하여, ErbB3을 통한 ErbB3 리간드 (예를 들어, 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 및 바이레귤린)로 매개된 신호 전달을 통계적으로 유의한 정도로 감소시키는 항체 또는 이의 항원 결합부의 능력을 지칭한다. 이는 ErbB3을 발현하는 세포 내에서 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 및 바이레귤린 중 하나 이상에 의해 매개된 신호 전달이, 대조군(항체 없음)과 비교하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 존재 하에서 통계적으로 유의한 정도로 감소된다는 것을 의미한다. ErbB3-리간드 매개성 신호 전달은 ErbB3 기질 및/또는 ErbB3이 관계된 세포의 일련의 단계적인 반응에서 존재하는 단백질의 수준 또는 활성에 대해 분석함으로써 측정될 수 있다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는, ErbB3 기질 및/또는 ErbB3이 관계된 세포의 일련의 단계적인 반응에서 존재하는 단백질의 수준 또는 활성을, 이러한 항체 또는 이의 항원 결합부의 부재 하(대조군)에서의 수준 또는 활성에 비하여 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 100%까지 감소시킨다. 이러한 ErbB3-리간드 매개성 신호 전달은 ErbB3 기질(예를 들어, SHC 또는 PI3K)의 수준 또는 활성을 측정하는 당업계에 공지된 기법을 이용하거나, 또는 ErbB3이 관계된 세포의 일련의 단계적인 반응에서 존재하는 단백질(예를 들어, AKT 경로 - AKT는 단백질 키나아제 B 또는 PKB로 언급된 세린/트레오닌 키아나제의 세트를 의미한다)의 수준 또는 활성을 이러한 단백질에 대한 키나아제 분석법을 이용하여 측정할 수 있다(예를 들어, 문헌[Horst et al. 상기와 동일], [Sudo et al. (2000) Methods Enzymol, 322:388-92]; 및 [Morgan et al. (1990) Eur . J. Biochem., 191:761-767] 참조).

특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 ErbB3에 대한 ErbB3-리간드 (예를 들어, 하나 이상의 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 또는 바이레귤린) 결합을 저해함으로써, ErbB3을 통한 ErbB3-리간드 (예를 들어, 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 또는 바이레귤린) 매개성 신호 전달을 억제한다. 일부 리간드 (예를 들어, 바이레귤린, 인공 키메라 리간드: Barbacci, et al., J Biol Chem 1995 270(16) 9585-9)는 ErbB3 유사 리간드 (즉, ErbB3에 결합) 뿐 아니라 EGF 유사 리간드 (즉, EGFR/ErbB1에 결합)로서도 작용한다.

본원에서 "ErbB3에 대한 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 또는 바이레귤린의 결합의 억제"라는 말은, 항체 부재 하(대조군)에서의 결합에 비하여 ErbB3 리간드 (예를 들어, 하나 이상의 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 또는 바이레귤린)의 ErbB3에 대한 결합을, 통계적으로 유의한 정도까지 감소시키는 항체 또는 이의 항원 결합부의 능력을 지칭한다. 이는 ErbB3에 결합하는 ErbB3-리간드 (예를 들어, 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 또는 바이레귤린)의 양이 대조군(항체 없음)에 비하여 항체 또는 이의 항원 결합부가 존재할 경우에 통계적으로 유의한 정도로 감소된다는 것을 의미한다. ErbB3에 결합하는 ErbB3-리간드의 양은 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합부의 존재 하에서, 그것이 부재(대조군)하는 경우의 양에 비해, 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 100%까지 감소될 수 있다. ErbB3-리간드 결합의 감소는 항체 또는 이의 항원 결합부의 존재 또는 부재(대조군)하에, ErbB3을 발현하는 세포에 대하여 표지된 ErbB3-리간드 (예를 들어, 방사선 표지된 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 또는 바이레귤린)의 결합 수준을 측정하는 당업계에 알려진 기법을 사용하여 측정될 수 있다.

본원에서 "ErbB3을 발현하는 세포의 증식 억제"라는 말은 항체의 부재 하의 증식에 비하여 ErbB3을 발현하는 세포의 증식을 통계적으로 유의한 정도로 감소시키는 항체 또는 이의 항원 결합부의 능력을 지칭한다. 한 구현예에서, ErbB3을 발현하는 세포 (예를 들어, 암세포)의 증식은, 이 세포를 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부와 접촉시킨 경우, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합부의 부재(대조군) 하에 측정된 증식 정도에 비해 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 100%까지 감소될 수 있다. 세포 증식 정도는 세포 분열 속도, 세포 분열을 진행 중인 세포 군집 내의 세포 분획, 및/또는 말단 분화 또는 세포 사멸로 인한 세포 군집의 세포 손실율을 측정하는 당업계에 알려진 기법(예를 들어, CellTiter-Glo® 분석법 또는 티미딘 도입)을 이용하여 분석될 수 있다.

본원에서 "세포 표면에서 ErbB3 수준을 감소시키는 능력"이라는 말은 처리되지 않은 (대조군) 세포에 비해 항체에 노출된 세포 표면에서 발견되는 ErbB3의 양을 통계적으로 유의한 정도로 감소시키는 항체 또는 이의 항원 결합부의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 세포 표면에서의 ErbB3 수준의 감소는 ErbB3의 세포 내 함입의 증가(또는 ErbB3 세포 이물 흡수의 증가)로부터 기인할 수 있다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는, 그것이 부재(대조군)하는 경우의 세포 표면 발현 또는 세포 내 함입에 비하여, ErbB3의 세포 표면 발현을 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상 또는 100%까지 감소시키고/감소시키거나, ErbB3 수용체의 세포 내 함입을 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상 또는 100%까지 증가시킨다. 항체 또는 이의 항원 결합부의 존재 및 부재 하에서, 세포 표면에서의 ErbB3 세포 및/또는 ErbB3 수용체의 세포 내 함입 수준은 당업계에 알려진 기법, 예컨대 문헌[Horst et al., 상기 동일] 및 본원의 실시예들에 기술된 기법을 사용하여 용이하게 측정될 수 있다.

본원에서 "ErbB3을 발현하는 세포의 VEGF 분비 억제"라는 말은 항체의 부재 하에 있어서 VEGF 분비에 비해, ErbB3을 발현하는 세포의 VEGF 분비를 통계적으로 유의한 정도로 감소시키는 항체 또는 이의 항원 결합부의 능력을 지칭한다. 한 구현예에서, ErbB3을 발현하는 세포(예컨대, 암세포)의 VEGF 분비는, 이 세포를 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합부와 접촉시키는 경우, 항체 또는 이의 항원 결합부가 부재(대조군)하는 경우에 측정된 VEGF 분비 정도에 비하여, 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상 또는 100%까지 감소될 수 있다. VEGF 분비는 본원에 기재된 것과 같은 당업계에 알려진 기법을 사용하여 측정될 수 있다.

본원에서 "ErbB3을 발현하는 세포의 이동 억제"라는 말은 항체의 부재 하에 있어서의 세포의 이동에 비해, ErbB3을 발현하는 세포의 이동을 통계적으로 유의한 정도로 감소시키는 항체 또는 이의 항원 결합부의 능력을 지칭한다. 한 구현예에서, ErbB3을 발현하는 세포(예컨대, 암세포)의 이동은, 이 세포를 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합부와 접촉시키는 경우, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합부가 부재(대조군)하는 경우에 측정된 세포 이동에 비하여, 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상 또는 100%까지 감소될 수 있다. 세포 이동은 본원에 기재된 것과 같은 당업계에 알려진 기법을 사용하여 측정될 수 있다.

본원에서 "ErbB3을 발현하는 세포의 구상 성장 억제"라는 말은 항체의 부재(대조군)하에 있어서의 세포의 이동에 비해, ErbB3을 발현하는 세포의 이동을 통계적으로 유의한 정도로 감소시키는 항체 또는 이의 항원 결합부의 능력을 지칭한다. 한 구현예에서, ErbB3을 발현하는 세포(예컨대, 암세포)의 이동은, 이 세포를 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부와 접촉시키는 경우, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합부가 부재(대조군)하는 경우에 측정된 이동에 비하여, 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상 또는 100%까지 감소될 수 있다. 세포의 이동은 본원에 기재된 것과 같은 당업계에 알려진 기법을 사용하여 측정될 수 있다.

본원에서 호환되어 사용되는 "항체" 또는 "면역글로불린"이라는 용어는 전체 항체 및 이의 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원 결합부") 또는 이의 단일 사슬을 포함한다. "전형적인 항체"는 이황화 결합에 의해 내부 결합된 2개 이상의 중쇄(H) 및 경쇄(L)를 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변부 (본원에서는 V_H로 약칭함)와 중쇄 불변부로 이루어진다. 중쇄 불변부는 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각 경쇄는 경쇄 가변부 (본원에서는 V_L로 약칭함)와 경쇄 불변부로 이루어진다. 경쇄 불변부는 하나의 도메인 CL로 이루어진다. V_H와 V_L 영역은 상보성 결정 영역(CDR)이라 불리는 영역과 여기에 산재된 보다 보존된 영역인 골격 영역(FR)이라는 과변이(hypervariability) 영역들로 추가로 세분될 수 있다. V_H와 V_L 각각은 3개의 CDR과 4개의 FR로 이루어지며, 이는 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된다. 중쇄 및 경쇄 가변부는 항원과 접촉하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변부는 면역 체계를 갖는 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 고전적인 보체계의 1차 성분(Clq)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자들에 대한 면역글로불린의 결합을 조정할 수 있다. 본 개시내용의 예시적인 항체는 항체 #1, #3, #6 및 #14, 그리고 이의 항원 결합부를 포함한다.

본원에서 항체의 "항원 결합부"(또는 간단히 "항체부")라는 용어는 항원(예를 들어, ErbB3)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편들에 의해 수행되는 것으로 밝혀졌다. 항체의 "항원 결합부"라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로서는 (i) V_L, V_H, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ⅱ) 경첩 부위에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')₂ 단편; (ⅲ) V_H와 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (ⅳ) 항체의 단일 암(arm)의 V_L 및 V_H 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) V_H 및 V_L 도메인을 포함하는 dAb 단편; (ⅵ) V_H 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (문헌[Ward et al., (1989) Nature 341, 544-546]); (ⅶ) V_H 또는 V_L 도메인으로 이루어진 dAb 단편; 및 (vⅲ) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 (ix) 합성 링커에 의해 결합될 수 있는 2종 이상의 단리된 CDR의 조합물을 포함한다. 또한, Fv 단편의 두 도메인 V_L 및 V_H가 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 V_L 및 V_H 영역이 쌍으로 1가의 분자(단쇄 Fv (scFv)로서 알려짐; 예를 들어, 문헌[Bird et al. (1988) Science 242, 423-426]; 및 [Huston et al. (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA . 85, 5879-5883]을 참조)를 만드는 단일 단백질 사슬로서 형성되도록 해주는 합성 링커를 이용하여 재조합법에 의해 결합될 수 있다. 이러한 단쇄 항체도 항체의 "항원 결합부"라는 용어에 포함된다. 이러한 항체 단편은 당업계에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 수득되며, 그 단편은 온전한 항체와 동일한 방법으로 사용하기 위해 스크리닝된다. 항원 결합부는 온전한 면역글로불린의 재조합 DNA 기법, 즉 효소적 또는 화학적 분해에 의해 제조될 수 있다.

본원에서 "단일클론 항체"라는 용어는 실질적으로 균질한 항체의 군집으로부터 수득된 또는 그로서 제조된 항체, 즉 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생적인 돌연변이를 제외하고 동일한 군집을 포함하는 개별 항체를 지칭한다. 단일클론 항체는 매우 특이적이어서, 하나의 항원성 부위에 유도된다. 또한, 서로 다른 결정 부위(에피토프)에 대해 유도되는 서로 다른 항체를 포함하는 통상적인(다클론성) 항체 조제물과는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 전형적으로 항원 상의 하나의 결정 부위로 유도된다. 단일클론 항체는 당업계에 알려진 기법 및 본원에 기재된 방법 예컨대, 예를 들어, 하이브리도마 기법(문헌[Kohler et al. (1975) Nature, 256:495]에 기술됨), 트랜스게닉 동물(예를 들어, 문헌[Lonberg, et al. (1994) Nature, 368(6474): 856-859] 참조), 재조합 DNA 기법(예를 들어, 미국특허 제4,816,567호 참조), 또는 예를 들어, 문헌[Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol . Biol ., 222:581-597 (1991)]에 기술된 방법으로 파아지 항체 라이브러리를 이용하는 방법으로 제조될 수 있다. 단일클론 항체는 키메라 항체, 인간 항체 및 인간화 항체를 포함하며 자연적으로 발생되거나 재조합 생성될 수 있다.

"재조합 항체"라는 용어는 재조합 방법, 예컨대 (a) 면역글로불린 유전자 (예를 들어, 인간 면역글로불린 유전자)가 유전자이식 또는 염색체변형(transchromosomal)된 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체 또는 이로부터 제조된 하이브리도마, (b) 예를 들어, 이입세포(transfectoma)로부터 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체, (c) 파아지 디스플레이를 이용하여 재조합체, 조합 항체 라이브러리 (예를 들어, 인간 항체 서열을 포함하는 라이브러리)로부터 단리된 항체, 및 (d) 다른 DNA 서열에 면역글로불린 유전자 서열 (예를 들어, 인간 면역글로불린 유전자)을 스플라이싱하는 단계를 수반하는 임의의 기타 방법에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체와 같은, 재조합 기법에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 일컫는다. 이러한 재조합 항체는 인간 생식세포 면역글로불린 서열에서 유래된 가변부 및 불변부를 가질 수 있다. 그러나, 특정 구현예에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관 내에서 돌연변이 과정을 거칠 수 있어, 재조합 항체의 V_H 및 V_L 영역의 아미노산 서열은 비록 그것이 인간 생식세포 V_H 및 V_L 서열로부터 유래하여 연관이 있다 하더라도, 생체내 인간 항체 생식세포 레파토리 내에서는 자연적으로 존재할 수 없는 서열일 수 있다.

"키메라 면역글로불린" 또는 “키메라 항체”는 가변부가 첫번째 종에서 유래하고 불변부는 두번째 종에서 유래하는 면역글로불린 또는 항체를 지칭한다. 키메라 면역글로불린 또는 항체는 예를 들어 유전 공학 기법에 의해 서로 다른 종에 속하는 면역글로불린 유전자 단편으로부터 구축될 수 있다.

본원에서 "인간 항체"라는 용어는 예를 들어, Kabat 등에 의해 기술된 바와 같이, 골격 영역 및 CDR 영역 모두가 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변부를 갖는 항체를 포함한다(문헌[Kabat, et al. (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest , Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Serⅵces, NIH Publication No. 91-3242] 참조). 또한, 항체가 불변부를 포함하는 경우, 이 불변부도 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유래한다. 인간 항체는 인간 생식세포 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 또는 생체내 체성 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나, 본원에서 "인간 항체"라는 용어는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 생식세포로부터 유래된 CDR 서열이 인간 골격 서열 상에 그래프트된 항체를 포함하지는 않는다.

인간 항체는 아미노산 잔기, 예를 들어, 인간 생식세포 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 활성 증진 아미노산 잔기로 치환된 하나 이상의 아미노산을 가질 수 있다. 보통, 인간 항체는 인간 생식세포 면역글로불린 서열의 일부가 아닌 아미노산 잔기로 치환된 20개 이하의 부위를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 치환은 하기 상세히 기술된 것과 같이 CDR 영역 내에서 이루어진다.

"인간화 면역글로불린" 또는 "인간화 항체"라는 용어는 하나 이상의 인간화 면역글로불린 또는 항체 사슬 (즉, 하나 이상의 인간화 경쇄 또는 중쇄)을 포함하는 면역글로불린 또는 항체를 일컫는다. "인간화 면역글로불린 사슬" 또는 "인간화 항체 사슬" (즉, "인간화 면역글로불린 경쇄" 또는 "인간화 면역글로불린 중쇄")이라는 용어는 실질적으로 인간 면역글로불린 또는 항체 유래의 가변 골격 영역과, 실질적으로 인간이 아닌 면역글로불린 또는 항체 유래의 상보성 결정 영역 (CDR) (예를 들어, 하나 이상의 CDR, 바람직하게는 2개의 CDR, 보다 바람직하게는 3개의 CDR)을 포함하는 가변부를 가지며, 추가로 불변부(예를 들어, 경쇄의 경우, 하나 이상의 불변부 또는 이의 부분, 그리고 바람직하게는 중쇄의 경우 3개의 불변부)를 포함하는 면역글로불린 또는 항체 사슬 (즉, 각각 경쇄 또는 중쇄)을 지칭한다. "인간화 가변부"(예를 들어, "인간화 경쇄 가변부" 또는 "인간화 중쇄 가변부")라는 용어는 실질적으로 인간 면역글로불린 또는 항체 유래의 가변 골격 영역과, 실질적으로 인간이 아닌 면역글로불린 또는 항체 유래의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 가변부를 지칭한다.

"이중특이성" 또는 "이중기능성" 항체는 2개의 서로 다른 중쇄/경쇄 쌍과 2개의 서로 다른 결합 부위를 갖는 인공적인 하이브리드 항체이다. 이중특이성 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 결합을 포함하는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Songsiⅵlai & Lachmann, (1990) Clin . Exp . Immunol. 79, 315-321]; [Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148, 1547-1553]을 참조한다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 ErbB3 및 IGF1-R (즉, 인슐린 유사 성장 인자 1-수용체) 양자 모두에 대한 결합 부위를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 ErbB3 및 C-MET 양자 모두에 대한 결합 부위를 포함한다. 다른 구현예에서, 이중특이적 항체는 ErbB3에 대한 결합부위와, ErbB2, ERbB3, ErbB4, EGFR, 루이스 Y, MUC-1, EpCAM, CA125, 전립선 특이적 막 항원, PDGFR-α PDGFR-β C-KIT, 또는 임의의 FGF 수용체에 대한 결합 부위를 포함한다.

본원에서, "이종 항체"는 이러한 항체를 생성하는 인간이 아닌 트랜스게닉 유기체 또는 트랜스게닉 식물과 관련하여 정의된다.

본원에서 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 가진 다른 항체가 실질적으로 존재하지 않는 항체를 지칭한다(예를 들어, ErbB3에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 ErbB3 이외의 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 존재하지 않는다). 또한, 단리된 항체는 통상 다른 세포성 물질 및/또는 단백질이 실질적으로 존재하지 않는다. 본 발명의 한 구현예에서, 상이한 ErbB3 결합 특이성을 갖는 "단리된" 항체의 조합물은 매우 특징적인 조성으로 혼합된다.

본원에서, "아형"은 중쇄 불변부 유전자에 의해 코딩되는 항체 부류(예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 일컫는다. 한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD, 또는 IgE 항체 아형으로부터 선택된 아형이다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG1 아형이다. 다른 구현예에서, 항체는 IgG2 아형이다.

본원에서, "아형 스위칭(switching)"은 하나의 Ig 부류로부터 다른 하나의 Ig 부류로 항체의 부류 또는 아형이 변화하는 것을 일컫는다.

본원에서, "스위칭되지 않은 아형"은 아형 스위칭이 발생하지 않은 경우에 생성된 중쇄의 아형 부류를 가리킨다. 스위칭되지 않은 아형을 코딩하는 CH 유전자는 통상 기능적으로 재배열된 VDJ 유전자로부터 바로 아래 부분의 첫번째 CH 유전자이다. 아형 스위칭은 고전적 또는 비고전적 아형 스위칭으로 분류된다. 고전적 아형 스위칭은 항체를 코딩하는 유전자에서 하나 이상의 스위치 서열 영역이 관계되는 재조합 이벤트에 의해 발생한다. 비고전적 아형 스위칭은 예를 들어, 인간 σ_μ와 인간 ∑_μ 사이의 동종 재조합에 의해 발생할 수 있다(δ-연관 결실). 대안적인 비고전적 스위칭 기작, 예컨대 여러 방법들 중에서 도입유전자 내(intertransgene) 및/또는 염색체 내(interchromosomal) 재조합을 일으켜 아형 스위칭을 유효화시킬 수 있다.

본원에서, "스위치 서열"이라는 용어는 스위치 재조합을 담당하는 DNA 서열을 가리킨다. "스위치 도너(donor)" 서열은 통상 μ스위치 영역으로, 스위치 재조합 도중 결실될 구축물 영역의 5'(즉, 상류부)일 것이다. "스위치 수용체" 영역은 결실될 구축물 영역과 치환 불변 영역(예를 들어, γ,ε 등) 사이에 존재할 것이다. 재조합이 항상 일어나는 특정 부위가 없기 때문에, 최종 유전자 서열은 통상 구축물로부터 예측가능하지 않다.

"항원"은 항체 또는 이의 항원 결합부가 결합하는 실체(예를 들어, 단백질성 실체 또는 펩타이드)이다. 본원에 개시된 다양한 구현예에서, 항원은 ErbB3 또는 ErbB3 유사 분자이다. 본 발명에 따른 특정 구현예에서, 항원은 인간 ErbB3이다.

"에피토프" 또는 "항원 결정기"라는 용어는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위를 말한다. 에피토프는 단백질의 3차 접힘에 의해 병치된 인접 아미노산 또는 비인접 아미노산 양자 모두로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 보통 변성 용매에 노출시 유지되는 반면에, 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프는 보통 변성 용매로 처리시 손상된다. 에피토프는 통상 하나의 독특한 공간 구조 내에 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 또는 15개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간 구조를 결정하는 방법으로서는 당업계에 공지된 기법 및 본원에 기재된 방법, 예를 들어 x-선 결정학 및 2차원 핵자기 공명을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)]을 참조한다.

아미노산 서열이 본원에 개시된 항체, 즉 ErbB3으로의 결합에 대해 경쟁하는 항체와 동일하거나 중첩하는 에피토프에 결합하거나, 또는 본원에 기재된 항체에 의해 결합된 에피토프와 중첩하는 에피토프, 즉 ErbB3의 엑토도메인 상에, 바람직하게는 ErbB3의 엑토도메인의 도메인 I 상에 위치한 에피토프와 결합하는 항체도 본 발명에 포함된다. 동일한 에피토프를 인식하는 항체는 통상적인 기법, 예컨대, 표적 항원에 다른 항체의 결합을 차단하는 항체의 능력을 보여주는 면역분석법, 즉 경쟁적 결합 분석법을 사용하여 동정될 수 있다. 경쟁적 결합은 시험 중인 면역글로불린이 ErbB3과 같은 흔한 항원에 기준 항체의 특이적 결합을 억제하는 분석에서 측정된다. 다양한 유형의 경쟁적 결합 분석법, 예를 들어, 고체상 직접 또는 간접 방사능면역분석법 (RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역분석법 (EIA), 샌드위치 경쟁 분석법 (문헌[Stahli et al., (1983) Methods in Enzymology 9:242] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA (문헌[Kirkland et al., (1986) J. Immunol. 137:3614] 참조); 고체상 직접 표지 분석법, 고체상 직접 표지 샌드위치 분석법 (문헌[Harlow and Lane, (1988) Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press] 참조); I-125 표지를 이용한 고체상 직접 표지 RIA (문헌[Morel et al., (1988) Mol . Immunol. 25(1):7] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA (문헌[Cheung et al., (1990) Virology 176:546]); 및 직접 표지 RIA (문헌[Moldenhauer et al., (1990) Scand . J. Immunol. 32:77])가 공지되어 있다. 통상, 이러한 분석법은 비표지된 시험 면역글로불린 및 표지된 기준 면역글로불린 중 어느 하나를 갖는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원(예를 들어, ErbB3)의 사용을 수반한다. 경쟁적 억제는 시험 면역글로불린의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 측정함으로써 판단할 수 있다. 보통 시험 면역글로불린은 초과량으로 존재한다. 일반적으로, 경쟁 항체가 초과량으로 존재하는 경우에는 보통의 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합이 적어도 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% 또는 그 이상까지 억제될 것이다.

용어 "파라토프"는, 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 에피토프를 인식하거나 접촉시키는 것이 직접적으로 수반되는 것으로 보이는 항체의 일부 또는 아미노산 잔기를 의미한다. 파라토프는 중쇄 및 경쇄의 상보적 결정 영역 (CDR) 내에 아미노산 잔기를 전부는 아니지만 일부를 전형적으로 포함한다. 파라토프는 V_H 및 V_L CDR 모두 또는 CDR (예를 들어, 어떤 CDR은 결합 항원과 연관이 없을 수 있다)의 단지 일부에사 아미노산 잔기를 수반할 수 있다. 특정 항원에 대한 파라토프는 항체, 특히 (예를 들어, 결정학 모델링에 의해 측정되는 바와 같이) 표면 노출되고 항원 결합과 연관되는 것이 가능하다고 생각되는 CDR 내에, 예를 들어, 아미노산 잔기의 스캐닝 돌연변이유발 (예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발)에 의해 정의될 수 있다. 그 다음, 돌연변이체의 항원에의 결합의 평가는, 돌연변이된 아미노산 위치가 항원 결합과 연관있는지를 측정할 수 있고, 따라서 항체의 파라토프의 일부를 형성한다. 항체 파라토프를 측정하는 방법은 실시예 20에서 추가로 상세히 기재되어 있다.

바람직한 구현예에서, 항-ErbB3 항체는 서열번호: 63 또는 76 (CDR1), 64 (CDR2) 및 65 (CDR3)에서 각각 보여진 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 파라토프를 포함하고, 단, 상기 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아니다.

또 다른 구현예에서, 항-ErbB3 항체는 서열번호: 69 또는 78 (CDR1), 70 (CDR2) 및 71 또는 80 (CDR3)에서 각각 보여진 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 파라토프를 포함하고, 단, 상기 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아니다.

또 다른 구현예에서, 항-ErbB3 항체는 서열번호: 63, 64 및 65에서 각각 보여진 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 파라토프, 및 서열번호: 69, 70 및 71에서 각각 보여진 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 파라토프를 포함하고, 단, 상기 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아니다.

또 다른 구현예에서, 항-ErbB3 항체는 서열번호: 76, 64 및 65에서 각각 보여진 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 파라토프, 및 서열번호: 78, 70 및 80에서 각각 보여진 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 파라토프를 포함하고, 단, 상기 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아니다.

용어 "공통 서열"은 상보적 결정 영역 (CDR)에 대해 본원에서 사용된 바와 같이, CDR 내의 아미노산 잔기가 항원 결합에 대한 손상없이 변형이 쉽다는 것에 대한 정보를 기초로 정의되었던 CDR의 복합 또는 일반화 서열을 의미한다. 따라서, CDR에 대한 "공통 서열"에서, 어떤 아미노산 위치는 그 위치에서 다중 가능한 아미노산 잔기 중의 하나에 의해 점령된다. 예를 들어, CDR 내에, 항원 결합이 특정 위치에서 티로신 또는 페닐알라닌의 존재에 의해 영향을 받지 않는 것으로 발견된다면, 이때 공통 서열 내의 그 특정 위치는 티로신 또는 페닐알라닌 (T/F)일 수 있다. CDR에 대한 공통 서열은, 예를 들어, 항체 CDR 내의 아미노산 잔기의 스캐닝 돌연변이유발 (예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발)에 의해, 그 다음 돌연변이된 아미노산 위치가 항원 결합에 영향을 주는 지를 측정하기 위해 돌연변이체의 항원에의 결합의 평가에 의해 정의될 수 있다. 항체 CDR 공통 서열를 측정하는 방법은 실시예 20에서 추가로 상세히 기재되어 있다.

바람직한 구현예에서, 항-ErbB3 항체는 서열번호: 60 또는 75 (CDR1), 61 (CDR2) 및 62 (CDR3)에서 각각 보여진 바와 같은 공통 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 단, 상기 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아니다.

또 다른 구현예에서, 항-ErbB3 항체는 서열번호: 66 또는 77 (CDR1), 67 (CDR2) 및 68 또는 79 (CDR3)에서 각각 보여진 바와 같은 공통 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 단, 상기 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아니다.

또 다른 구현예에서, 항-ErbB3 항체는 서열번호: 60, 61 및 62에서 각각 보여진 바와 같은 공통 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 66, 67 및 68에서 각각 보여진 바와 같은 공통 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 단, 상기 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아니다.

또 다른 구현예에서, 항-ErbB3 항체는 서열번호: 75, 61 및 62에서 각각 보여진 바와 같은 공통 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 77, 67 및 79에서 각각 보여진 바와 같은 공통 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 단, 상기 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아니다.

본원에서, "특이적 결합", "특이적으로 결합한다", "선택적 결합" 및 "선택적으로 결합한다"라는 말은 항체 또는 이의 항원 결합부가 특정 항원 또는 에피토프에 대해 뚜렷한 친화도를 나타내며, 일반적으로 다른 항원 및 에피토프와는 유의한 교차 반응성을 나타내지는 않는다는 것을 의미한다. "뚜렷한" 또는 바람직한 결합은 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ M^-1 이상 또는 10¹⁰ M^-1 이상의 친화도를 갖는 결합을 포함한다. 10⁷ M^-1 초과, 바람직하게는 10⁸ M^-1 초과의 친화도가 보다 바람직하다. 본원에 기재된 친화도의 중간값도 본 발명의 범위 내에 포함되며, 바람직한 결합 친화도는 일정 범위의 친화도, 예를 들어, 10⁶ 내지 10¹⁰ M^-1, 바람직하게는 10⁷ 내지 10¹⁰ M^-1, 보다 바람직하게는 10⁸ 내지 10¹⁰ M^-1로서 표시될 수도 있다. "유의한 교차 반응성을 나타내지 않는" 항체는 바람직하지 않은 실체(예를 들어, 바람직하지 않은 단백질성 실체)에 뚜렷이 결합하지 않는 항체이다. 예를 들어, 한 구현예에서, ErbB3에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합부는 그 ErbB3 분자에는 명백하게 결합하겠지만 다른 ErbB 분자와 비-ErbB 단백질 또는 펩타이드와는 유의하게 반응하지 않을 것이다. 특이적 또는 선택적 결합은 이러한 결합을 측정하는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 스캐차드(Scatchard) 분석법 및/또는 경쟁적 결합 분석법에 따라 측정될 수 있다.

본원에서 "K_D"라는 용어는, 바람직하게는 표면 플라스몬 공명 분석 (예를 들어, BIACORE 3000 기기 (GE Healthcare)에서 측정된 바와 같이) 또는 세포 결합 분석을 사용하여 측정된 바와 같이, 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수 또는 항원에 대한 항체의 친화도를 지칭한다. 그와 같은 분석 모두는 하기 실시예 3에서 상세히 기재되어 있다. 한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합부는 50 nM 또는 초과 (즉, 50 nM 이하) (예를 들어, 40 nM 또는 30 nM 또는 20 nM 또는 10 nM 또는 그 이하) 친화도(K_D)를 갖는 항원 (예를 들어, ErbB3)과 결합한다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합부는 8 nM 또는 초과 (예를 들어, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 2 nM, 1.5 nM, 1.4 nM, 1.3 nM, 1nM 이하) 친화도(K_D)를 갖는 ErbB3과 결합한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 약 10^-7 M 이하, 예컨대 약 10^-8 M, 10^-9 M, 또는 10^-10 M 이하의 친화도(K_D)를 갖는 항원 (예를 들어, ErbB3)과 결합하며, 미리 결정된 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 비특이적 항원(예를 들어, BSA, 카세인)에 대한 결합 친화도의 2배 이상의 친화도로 미리 결정된 항원에 결합한다.

본원에서 "K_off"라는 용어는 항체/항원 복합체로부터의 항체 해리에 대한 손실 상수(off rate constant)를 지칭한다.

본원에서 "EC50"이라는 용어는 시험관 내 또는 생체내 분석법에서 최대 반응의 50%, 즉 최대 반응과 최저 반응의 중간 정도인 반응을 유도해내는, 항체 또는 이의 항원 결합부의 농도를 일컫는다.

본원에서, "당화 패턴"이라는 것은 단백질, 보다 구체적으로는 면역글로불린 단백질에 공유결합되는 탄수화물 단위의 패턴으로 정의된다.

본원에서 대상물에 적용된 "자연 발생적인"이라는 용어는 대상물이 자연에서 찾을 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 자연상의 공급원으로부터 단리될 수 있는 유기체(바이러스 포함)에 존재하며 실험실에서 인가에 의해 의도적으로 조작되지 않은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열이 자연 발생적인 것이다.

본원에서 "재배열된"이라는 용어는 V 세그먼트가 완전한 V_H 또는 V_L 도메인을 본질적으로 코딩하는 구조의 D-J 또는 J 세그먼트에 바로 인접하여 위치한 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 자위(locus)의 배치를 일컫는다. 재배열된 면역글로불린 유전자 자위는 생식세포 DNA와의 비교에 의해 확인될 수 있으며; 재배열된 자위는 하나 이상의 재조합된 칠량체/구량체 동종 성분을 가질 것이다.

본원에서 V 세그먼트와 관련하여 사용된 "재배열되지 않은" 또는 "배선형(germline) 배치"라는 용어는 V 세그먼트를 D 또는 J 세그먼트에 바로 인접시키기 위해 재조합하지 않은 배치를 지칭한다.

본원에서 "핵산 분자"라는 용어는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.

본원에서 ErbB3에 결합하는 항체 또는 항체부(예를 들어, V_H, V_L, CDR3)와 관련하여 사용된 "단리된 핵산 분자"라는 용어는 항체 또는 항체부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이, ErbB3 이외에 항원에 결합하는 항체를 코딩하는 다른 뉴클레오타이드 서열, 즉 인간 유전체 DNA에서 핵산을 자연적으로 플랭킹할 수 있는 다른 서열이 존재하지 않는 핵산 분자를 지칭한다.

본원에서 "조작" 또는 "변형"이라는 용어는 항체 또는 이의 항원 결합부에서 하나 이상의 아미노산을 변화시키는 것을 지칭한다. 이러한 변화는 하나 이상의 자리에 아미노산의 부가, 치환 또는 결실에 의해 야기될 수 있다. 그 변화는 PCR 돌연변이유발법과 같은 공지된 기법을 사용하여 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법을 사용하여 동정된 항체 또는 이의 항원 결합부는 ErbB3에 대한 항체 또는 이의 항원 결합부의 결합 친화도를 조작하여 변형될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 서열에 있어서 "보존적 아미노산 치환"이라는 개념을 포함하는데, 이는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되거나 아미노산 서열을 포함하는 항체의 항원, 즉 ErbB3에 대한 결합력에는 영향을 주지 않는 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이다. 보존적 아미노산 치환은 한 부류의 하나의 아미노산을 동일한 부류의 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는데, 여기서 하나의 부류라는 것은 예를 들어, 표준 데이호프(Dayhoff) 진동수 교환 매트릭스 또는 BLOSUM 매트릭스로 측정했을 때, 자연에서 찾아질 수 있는 동종 단백질에 있어서 공통적인 물리화학적 아미노산 측쇄 특성과 높은 치환 빈도수로 규정된다. 일반적인 아미노산 측쇄는 6가지의 군으로 나뉘어 있으며, 여기에는 I군 (Cys); Ⅱ군 (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); Ⅲ군 (Asn, Asp, Gln, Glu); IV군 (His, Arg, Lys); V군 (Ile, Leu, Val, Met); 및 VI군 (Phe, Tyr, Trp)이 포함된다. 예를 들어, Asn, Gln, 또는 Glu와 같은 다른 Ⅲ군 잔기에 대한 Asp의 치환은 보존적 치환이다. 따라서,항-ErbB3 항체에서 알려진 비필수성 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 군의 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 항원 결합력에 영향을 주지 않는 뉴클레오타이드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993)]; [Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999)]; 및 [Burks et al. Proc . Natl . Acad. Sci . USA 94:.412-417 (1997)] 참조).

"비보존적 아미노산 치환"이라는 용어는 한 부류의 아미노산을 다른 부류의 아미노산으로 치환하는 것, 예를 들어, Ⅱ군의 잔기인 Ala을 Ⅲ군의 잔기, 예컨대 Asp, Asn, Glu, 또는 Gln으로 치환하는 것을 지칭한다.

대안으로, 또 다른 구현예에서, 돌연변이(보존적 또는 비보존적)는 예컨대 집중 돌연변이유발법(saturation mutagenesis)에 의해 항-ErbB3 항체 코딩 서열의 모든 부분 또는 일부를 따라 무작위로 도입될 수 있으며, 이렇게 변형 생성된 항-ErbB3 항체는 결합 활성에 대하여 스크리닝될 수 있다.

"공통 서열(consensus sequence)"이라는 것은 관련 서열의 부류(family)에서 가장 흔하게 나나타는 아미노산(또는 뉴클레오타이드)으로부터 형성된 서열을 말한다(예를 들어, 문헌[Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)] 참조). 한 부류의 단백질에서 각 공통 서열의 위치는 그 부류에 있어서 그 위치에 가장 흔하게 나타나는 아미노산에 의해 점유된다. 2개의 아미노산이 동일한 빈도로 나타나는 경우에는, 그 중 하나가 공통 서열에 포함될 수 있다. 면역글로불린의 "공통 골격(consensus framework)"이라는 것은 공통 면역글로불린 서열의 골격 영역을 지칭한다.

유사하게, CDR에 대한 공통 서열은, CDR 아미노산 서열이 본원에 개시된 ErbB3 항체의 CDR 아미노산 서열의 최적 배열에 의해 유도될 수 있다.

핵산에 있어서, "실질적 상동성"이라는 용어는 2개의 핵산, 또는 이의 지정된 서열을 최적으로 배열하여 이를 적절한 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실과 비교하였을 때, 뉴클레오타이드 중 약 80% 이상이, 통상 약 90% 내지 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 98% 내지 99.5% 이상의 뉴클레오타이드가 동일하다는 것을 의미한다. 다르게는, 실질적 상동성은 선택적 하이브리드화 조건 하에서 세그먼트들이 가닥의 보체에 하이브리드화하는 경우에 존재한다.

두 서열 간의 백분율 상동성은, 두 서열의 최적 배열을 위해 도입될 필요가 있는 갭수와 각 갭의 길이를 고려하여, 동일한 위치의 수를 총 서열 수로 나눈 함수(즉, % 상동성 = 동일한 위치의 수/총 위치 수×100)로 표현된다. 두 서열 간의 서열 비교 및 % 상동성의 측정은 하기 비제한적인 실시예에 기술된 바와 같은 수학적 알고리즘을 이용하여 수행할 수 있다.

두 뉴클레오타이드 서열 간의 % 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스와 40, 50, 60, 70, 또는 80의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 중량을 이용한 GCG 소프트웨어의 GAP 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다. 두 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 간의 % 동일성은 PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 벌점 및 4의 갭 벌점을 이용하여, ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 포함된 E. Meyers와 W. Miller의 알고리즘 (CABIOS, 4:11-17 (1989))으로 측정될 수도 있다. 또한, 두 아미노산 서열 간의 % 동일성은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중 하나를 사용하고, 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량과 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 이용한 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램에 포함된 Needleman과 Wunsch의 알고리즘 (J. Mol . Biol. (48):444-453 (1970))을 사용하여 측정될 수도 있다.

본 개시내용의 핵산 및 단백질 서열은 추가로 "질의 서열(query sequence)"로서 사용되어 예를 들어, 관련 서열을 확인하기 위해 공개된 데이터베이스에 대해 검색을 수행할 수 있다. 이러한 검색은 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol . Biol . 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 이용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 본 발명의 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 수득하기 위해 NBLAST 프로그램(스코어 = 100, 단어길이 = 12)을 이용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위해 XBLAST 프로그램(스코어 = 50, 단어길이 = 3)을 이용하여 수행될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭핑된 배열을 수득하기 위해서는, 문헌[Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]에 기술된 바와 같은 Gapped BLAST가 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 각 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 매개변수를 사용할 수 있다.

핵산은 전세포, 세포 용해물 내에 존재할 수 있거나, 일부 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 잘 알려진 다른 방법을 포함하는 표준 기법에 의하여 다른 세포 성분들 또는 다른 오염원들, 예를 들어, 다른 세포 핵산 또는 단백질이 정제되어 없어졌을 때 "단리되거나" 또는 "실질적으로 순수하게" 된다. 문헌[F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]을 참조한다.

cDNA, 유전체 또는 이의 혼합물로부터 흔히 본래의 서열로 존재(조작된 제한 부위 등을 제외하고)하는 본 개시내용의 핵산 조성물은 표준 기법에 따라 돌연변이를 유발시켜 유전자 서열을 제공할 수 있다. 코딩 서열에 있어서, 이러한 돌연변이로 원하는 대로 아미노산에 영향을 줄 수 있다. 특히, 본원에 기재된 본래의 V, D, J, 불변부, 스위치 및 이러한 기타 다른 서열과 실질적으로 상동성이거나 이로부터 유래한 DNA 서열이 고려된다("유래한"이라는 말은 서열이 다른 서열과 동일하거나 그로부터 변형된다는 것을 의미함).

"작동가능하게 연결된"이라는 용어는 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓인 핵산 서열을 지칭한다. 예를 들어, 사전서열(presequence) 또는 분비성 선도물질(secretory leader)을 위한 DNA가 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 사전단백질(preprotein)로 발현되는 경우, 그것은 폴리펩타이드를 위한 DNA에 작동가능하게 연결되며; 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되고; 또는 리보솜 결합 부위가 번역을 촉진시키기 위해 위치하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"이라는 말은 연결된 DNA 서열이 인접한다는 의미이며, 분비성 선도물질의 경우에 판독 단계에 있어서도 인접한다는 것이다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 적절한 제한 부위에서 라이게이션에 의해 수행된다. 이러한 부위가 없는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 통상적인 절차에 따라 사용한다. 핵산은 그것이 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓이는 경우 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 전사 조절 서열과 관련하여, 작동가능하게 연결된다는 것은 연결된 DNA 서열이 인접한다는 의미이며, 두 단백질 코딩 영역을 결합시키는 것이 필요한 곳에는 판독 단계에서 인접하고 있다는 것이다. 스위치 서열에 있어서, 작동가능하게 연결된다라는 것은 서열이 스위치 재조합을 수행할 수 있다는 것을 가리킨다.

본원에서 "벡터"라는 용어는 핵산 분자로서 그것이 연결되어 있는 다른 핵산 분자를 운반할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한 유형은 추가의 DNA 세그먼트가 라이게이션될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 벡터의 또 다른 유형은 추가의 DNA 세그먼트가 바이러스 유전체 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터들은 그들이 도입된 숙주 세포에서 자가 복제를 할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 원점을 갖는 박테리아 벡터 및 포유류 유전자 부체 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 포유류 비-유전자 부체 벡터)는 숙주 세포로의 도입시 숙주 세포의 유전체 내로 삽입되어 숙주 유전체와 함께 복제될 수 있다. 또한, 특정 벡터들은 그들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수도 있다. 이러한 벡터들은 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히, "발현 벡터")로서 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 사용되는 발현 벡터는 흔히 플라스미드의 형태이다. "플라스미드" 및 "벡터"라는 용어는 호환되어 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동일한 기능을 발휘하는 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터(예를 들어, 복제불능 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)를 포함한다.

본원에서 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 일컫는다. 이러한 용어는 특정 개체의 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손도 지칭하는 것임을 이해해야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향에 기인하여 다음 세대에서 임의의 변형이 생길 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 그들의 모세포와 동일하지 않을 수 있으나, 여전히 이들도 본원에서 사용한 "숙주 세포"라는 용어의 범위 내에 포함되는 것이다.

본원에서 "치료", "처치" 및 "처리"라는 용어는 본원에 개시된 치료적 또는 예방적 조치들을 지칭한다. "치료" 방법은 질병 또는 장애 또는 재발성 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 지연시키고, 그 중증도를 감소시키거나, 또는 경감시키기 위해, 또는 이러한 치료의 부재 하에 예상되는 손을 쓸 수 없는 대상의 생존을 연장시키기 위해서, 대상, 예컨대 ErbB3 의존성 신호 전달과 연관된 질병 또는 장애를 갖거나 이러한 질병 또는 장애에 걸리기 쉬운 소인을 지닌 대상에게 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합부를 투여하는 단계를 수반한다.

본원에서 "ErbB3 의존성 신호 전달과 연관된 질병", 또는 "ErbB3 의존성 신호 전달과 연관된 장애"라는 용어는 증가된 수준의 ErbB3 및/또는 ErbB3이 관계된 세포 일련의 단계적 반응의 활성화가 나타나는 질병 상태와 연관된 질병 상태 및/또는 증상을 포함한다. ErbB3은 그 수준이 증가되는 경우 다른 ErbB 단백질, 예컨대, EGFR 및 ErbB2와 이종 이합체화되는 것으로 알려져 있다. 따라서, "ErbB3 의존성 신호 전달과 연관된 질병"이라는 용어는 EGFR/ErbB3 및/또는 ErbB2/ErbB3 이종이합체의 수준이 증가되는 질병 상태와 연관된 질병 상태 및/또는 증상도 포함한다. 일반적으로, "ErbB3 의존성 신호 전달과 연관된 질병"이라는 용어는 ErbB3의 관여가 필요한 임의의 장애, 증상의 개시, 진행 또는 지속됨을 지칭한다. 대표적인 ErbB3 매개성 장애로서는, 이에 제한하지는 않지만, 예컨대 암을 포함한다.

"암" 및 "발암성"이라는 용어는 통상 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유류에서의 생리학적 질환을 지칭하거나 기술하는 말이다. 암의 예로서는, 이에 제한하지는 않지만, 암종, 임파종, 아세포종, 육종 및 백혈병을 포함한다. 이러한 암의 보다 구체적인 예로서는 편평세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 위암, 췌장암, 교세포 종양, 예컨대 신경교아세포종 및 신경섬유종증, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 흑색종, 대장암, 자궁내막 암종, 타액선암, 신장암, 신세포암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간세포암 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 방법을 사용하여 치료 또는 진단된 암은 흑색종, 유방암, 난소암, 신장암, 위/결장암, 폐암 및 전립선암으로부터 선택된다.

용어 "KRAS 돌연변이"는, 본원에 사용된 바와 같이, v-Ki-ras2 Kirsten 랫트 육종 바이러스 발암유전자의 인간 유사체에서 어떤 암에서 발견된 돌연변이를 의미한다. 인간 KRAS 유전자 mRNA 서열의 비제한적인 예는 Genbank의 등록번호 NM_004985 및 NM_033360를 포함한다. KRAS 돌연변이가 췌장 종양의 73%, 대장 종양의 35%, 난소 종양의 16% 및 폐 종양의 17%에서 발견된다는 것이 보고된다.

용어 "PI3K 돌연변이"는, 본원에 사용된 바와 같이, 전형적으로 암 세포에서 PI3K의 활성으로 유도되는 포스파티딜-이노시톨-3-키나아제 유전자에서 어떤 암에서 발견된 돌연변이를 의미한다. PI3K 돌연변이가 대장 종양의 12%, 두경부 종양의 15% 및 유방 종양의 26%에서 발견된다는 것이 보고된다.

본원에서 "유효량"이라는 용어는 대상에게 투여시, 본원에 기재된 바와 같은 ErbB3 의존성 신호 전달과 연관된 질병의 치료, 예측 또는 진단을 실시하는데 충분한, ErbB3와 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합부의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 치료될 대상과 질병 상태, 대상의 체중과 나이, 질병 상태의 중증도, 투여 방식 등에 따라 다를 수 있으며, 이는 당업계의 숙련자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합부의 투여 용량은 예를 들어, 약 1 ng 내지 약 10,000 mg, 약 5 ng 내지 약 9,500 mg, 약 10 ng 내지 약 9,000 mg, 약 20 ng 내지 약 8,500 mg, 약 30 ng 내지 약 7,500 mg, 약 40 ng 내지 약 7,000 mg, 약 50 ng 내지 약 6,500 mg, 약 100 ng 내지 약 6,000 mg, 약 200 ng 내지 약 5,500 mg, 약 300 ng 내지 약 5,000 mg, 약 400 ng 내지 약 4,500 mg, 약 500 ng 내지 약 4,000 mg, 약 1 ㎍ 내지 약 3,500 mg, 약 5 ㎍ 내지 약 3,000 mg, 약 10 ㎍ 내지 약 2,600 mg, 약 20 ㎍ 내지 약 2,575 mg, 약 30 ㎍ 내지 약 2,550 mg, 약 40 ㎍ 내지 약 2,500 mg, 약 50 ㎍ 내지 약 2,475 mg, 약 100 ㎍ 내지 약 2,450 mg, 약 200 ㎍ 내지 약 2,425 mg, 약 300 ㎍ 내지 약 2,000 mg, 약 400 ㎍ 내지 약 1,175 mg, 약 500 ㎍ 내지 약 1,150 mg, 약 0.5 mg 내지 약 1,125 mg, 약 1 mg 내지 약 1,100 mg, 약 1.25 mg 내지 약 1,075 mg, 약 1.5 mg 내지 약 1,050 mg, 약 2.0 mg 내지 약 1,025 mg, 약 2.5 mg 내지 약 1,000 mg, 약 3.0 mg 내지 약 975 mg, 약 3.5 mg 내지 약 950 mg, 약 4.0 mg 내지 약 925 mg, 약 4.5 mg 내지 약 900 mg, 약 5 mg 내지 약 875 mg, 약 10 mg 내지 약 850 mg, 약 20 mg 내지 약 825 mg, 약 30 mg 내지 약 800 mg, 약 40 mg 내지 약 775 mg, 약 50 mg 내지 약 750 mg, 약 100 mg 내지 약 725 mg, 약 200 mg 내지 약 700 mg, 약 300 mg 내지 약 675 mg, 약 400 mg 내지 약 650 mg, 약 500 mg, 또는 약 525 mg 내지 약 625 mg 범위일 수 있다. 복용량 처방은 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 조절될 수 있다. 또한, 유효량은 항체 또는 이의 항원 결합부의 임의의 독성 또는 불리한 효과(즉, 부작용)가 최소화되고/되거나 유익한 효과가 보다 중요시되는 양이다. 추가적인 바람직한 복용량 처방 계획은 약제학적 조성물에 속하는 섹션에서 하기에서 추가로 기재되어 있다.

"환자"라는 용어는 예방학적 또는 치료적 처치를 받는 인간 및 기타 포유류 대상을 포함한다.

본원에서, "대상" 또는 "환자"라는 용어는 임의의 특정 인간 또는 인간이 아닌(인간을 제외한) 동물을 포함한다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 암에 걸린 대상을 치료하는데 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 대상은 인간이다. "인간이 아닌(인간을 제외한) 동물"이라는 용어는 모든 척추동물, 예를 들어, 포유류 및 비포유류, 예컨대 인간이 아닌 영장류, 양, 개, 소 등을 포함한다.

"시료"라는 용어는 환자 또는 대상의 조직, 체액, 또는 세포를 지칭한다. 보통, 조직 또는 세포는 환자로부터 제거되나, 생체내 진단도 고려된다. 고체 종양의 경우, 외과적으로 제거하여 통상적인 기법으로 조직 시료를 시험을 위해 준비할 수 있다. 림프종과 백혈병의 경우, 림프구 세포, 백혈병 세포 또는 림프 조직을 수득하여 적절히 제조할 수 있다. 기타의 환자 시료, 예컨대 오줌, 눈물, 혈청, 뇌척수액, 똥, 물, 침, 세포 추출물 등도 특정 종양을 위해 유용할 수 있다.

"항암제" 및 "항신생물제"라는 용어는 암 성장과 같은 악성 종양을 치료하는데 사용되는 약물을 지칭한다. 약물 요법은 단독으로, 또는 외과 수술 또는 방사선 요법과 같은 기타의 치료와 병용될 수 있다. 연관된 장기의 성질에 따라 여러 부류의 약물이 사용될 수 있다. 예를 들어, 유방암은 에스트르겐에 의해 흔히 자극되어, 성호르몬을 불활성화하는 약물로 치료될 수 있다. 유사하게, 전립선암은 남성 호르몬인 안드로겐을 불활성화하는 약물로 치료될 수 있다. 본 발명의 어떤 방법에서 사용하기 위한 항암제는 특히 하기의 제제들을 포함한다:

하나 이상의 항암제를 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합부의 투여와 동시에 또는 투여 전 또는 후에 투여할 수 있다.

본 발명의 다양한 양태들을 하기의 섹션에서 추가로 상세히 기술한다.

Ⅱ. 항체 제조 방법

(i) 단일클론 항체

본 개시내용의 단일클론 항체는 여러 공지된 방법, 예컨대 문헌[Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495]에 기술된 표준 체세포 하이브리드화 기법, B 림프구 세포의 바이러스 또는 종양유발성 형질전환, 또는 인간 항체 유전자의 라이브러리를 이용한 파아지 디스플레이 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 완전한 인간 단일클론 항체이다.

따라서, 한 구현예에서, ErbB3와 결합하는 항체를 제조하기 위해 하이브리도마법이 이용된다. 이 방법에서는, 림프구 세포가 면역화에 사용되는 항원에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 또는 생성할 수 있게끔 유도하기 위해, 적절한 항원을 이용하여 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물에게 면역성을 부여할 수 있다. 다르게는, 림프구 세포는 시험관 내에서 면역성이 부여될 수 있다. 이후, 림프구 세포를 적절한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 흑색종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 제조할 수 있다(Goding, 1986 상기). 하이브리도마 세포가 성장하는 항원 처리 배지를 항원에 대하여 유발되는 단일클론 항체의 생성에 대해 분석한다. 하이브리도마 세포가 원하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생성하는 것으로 확인된 후에는, 클론들을 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝하여 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 (문헌[Goding, 1986)] 상기). 이러한 목적을 위해 적절한 항원 처리 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수(ascites) 종양과 같이 체내 성장할 수 있다. 서브클론에 의해 분비된 단일클론 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 과정 예컨대, 예를 들어, 단백질 A-SEPHAROSE, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 항원 처리 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 분리될 수 있다.

또 다른 구현예에서, ErbB3과 결합하는 항체 및 항체부는 예를 들어, 문헌[McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)], [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)], [Marks et al., J. Mol . Biol ., 222:581-597 (1991)] 및 [Hoet et al., (2005) Nature Biotechnology 23, 344-348]; 미국특허 제5,223,409호; 제5,403,484호; 및 제5,571,698호(Ladner et al.); 미국특허 제5,427,908호 및 제5,580,717호(Dower et al.); 미국특허 제5,969,108호 및 제6,172,197호(McCafferty et al.); 및 미국특허 제5,885,793호; 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호 및 제6,593,081호(Griffiths et al.)에 기술된 기법을 이용하여 생성된 항체 파아지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 추가로, 사슬 치환(shuffling)에 의한 높은 친화도(nM 범위)를 가는 인간 항체의 생산(문헌[Marks et al., Bio / Technology, 10:779-783 (1992)]) 뿐만 아니라, 매우 큰 파아지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서의 조합 감염법 및 생체내 재조합법(문헌[Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)])도 사용될 수 있다.

특정 구현예에서, ErbB3과 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합부는 문헌[Hoet et al., 상기와 동일]에 기술된 파아지 디스플레이 기법을 사용하여 제조된다. 상기 기법은 인간 도너로부터 단리된 독특한 조합의 면역글로불린 서열을 갖고, 중쇄 CDR에서 합성적 다양성을 보유하는 인간 Fab 라이브러리의 생성을 포함한다. 이후, 이 라이브러리는 ErbB3과 결합하는 Fab에 대해 스크리닝된다.

또 다른 구현예에서, ErbB3에 대해 유발되는 인간 단일클론 항체는 마우스 계통보다는 오히려 인간 면역 체계의 일부를 수반하는 트랜스게닉 또는 염색체변형된 마우스를 이용하여 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859]; [Lonberg, N. et al. (1994), 상기와 동일]; [Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]; [Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern . Rev . Immunol. 13: 65-93], 및 [Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann . N.Y. Acad . Sci. 764:536-546] 참조). 추가로 미국특허 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,789,650호; 제5,877,397호; 제5,661,016호; 제5,814,318호; 제5,874,299호; 및 제5,770,429호(모두 [Lonberg and Kay]에 귀속됨); 미국특허 제5,545,807호(Surani et al.); PCT 공보 WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 및 WO 99/45962(모두 [Lonberg and Kay]에 귀속됨); 및 PCT 공보 WO 01/14424(Korman et al.)도 참조한다.

또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 인간 항체는 전이유전자(transgene) 및 전이염색체(transchromosome) 상에 인간 면역글로불린 서열을 수반하는 마우스, 예컨대 인간 중쇄 전이유전자 및 인간 경쇄 전이염색체를 수반하는 마우스를 이용하여 성장시킬 수 있다(예를 들어, PCT 공보 WO 02/43478[Ishida et al.] 참조).

또한 추가로, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 트랜스게닉 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하여, 본 발명의 항-ErbB3 항체 또는 이의 단편을 증식시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, XENOMOUSE(Abgenix, Inc.)로 지칭되는 대안적인 트랜스게닉 시스템이 사용될 수 있으며; 이러한 마우스들은 예를 들어, 미국특허 제5,939,598호; 제6,075,181호; 제6,114,598호; 제6,150,584호 및 제6,162,963호(Kucherlapati et al)에 기술되어 있다.

또한, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 염색체변형 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하여, 본 발명의 항-ErbB3 항체 또는 이의 단편을 증식시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 전이염색체 및 인간 경쇄 전이염색체 모두를 수반하는 마우스가 사용될 수 있으며; 이는 문헌[Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl . Acad . Sci . USA 97:722-727]에 기술되어 있다. 추가로, 인간 중쇄 및 경쇄 전이염색체를 수반하는 소도 당업계에 기술되어 있어(문헌[Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894]), 본 발명의 항-ErbB3 항체 또는 이의 단편을 증식시키는데 사용될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 항체는 이러한 항체를 생성하는 트랜스게닉 식물 및/또는 항원 처리된 식물 세포 (예컨대, 예를 들어, 담배, 옥수수 및 개구리밥)를 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합부를 발현하는 트랜스게닉 담뱃잎은 예를 들어, 유도성 프로모터 (예를 들어, 문헌[Cramer et al., Curr . Top . Microbol . Immunol. 240:95 118 (1999)] 참조)를 이용하여 이러한 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 또한, 트랜스게닉 옥수수는 이러한 항체 및 이의 항원 결합부를 발현하는데 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hood et al., Adv . Exp . Med . Biol . 464:127-147 (1999)참조). 또한, 항체는 예를 들어, 담배 종자 및 감자 덩이줄기를 이용하여, 예컨대, 단일 사슬 항체 (예를 들어, scFv)와 같은 항체의 부분을 포함하는 트랜스게닉 식물 종자로부터 대량 제조될 수도 있다(예를 들어, 문헌[Conrad et al., Plant Mol . Biol. 38:101-109 (1998)] 참조). 또한, 식물에 있어서 항체 또는 항원 결합부를 제조하는 방법은, 예를 들어, 문헌[Fischer et al., Biotechnol . Appl . Biochem. 30:99-108 (1999)], [Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995)]; [Ma et al., Plant Physiol. 109:341-6 (1995)]; [Whitelam et al., Biochem . Soc . Trans. 22:940 944 (1994)] 및 미국특허 제6,040,498호 및 제6,815,184호에서 찾을 수 있다.

본원에 개시된 방법들을 비롯한 임의의 기법을 이용하여 제조된, ErbB3과 결합하는 항체 또는 이의 부분의 결합 특이성은 면역침전법 또는 시험관 내 결합 분석법, 예컨대 방사면역분석법 (RIA) 또는 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)에 의해 측정될 수 있다. 또한, 항체 또는 이의 부분의 결합 친화도는 문헌[Munson et al., Anal. Biochem ., 107:220 (1980)]의 스캐차드 분석에 의해 측정될 수 있다.

특정 구현예에서, 상기 거론된 임의의 방법으로 제조된 ErbB3 항체 또는 이의 부분은 당업계에 공지된 기법, 예컨대 본원에 기재된 기법들을 이용하여 목적하는 결합 특이성 및/또는 친화도를 달성하기 위해 추가로 변형 또는 최적화될 수 있다.

한 구현예에서, ErbB3 항체로부터 유래한 일부 항체 서열은 구조적 및 기능적으로 관련된 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 위치한 아미노산 잔기를 통해서 표적 항원과 우세하게 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열보다 개별 항체들 간에 있어서 더욱 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 결합을 담당하고 있기 때문에, 상이한 특성을 갖는 서로 다른 항체의 골격 서열 상에 그래프트된 특이적 자연발생 항체의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써, 특이적 자연발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다(예를 들어, 문헌[Riechmann, L. et al., 1998, Nature 332:323-327]; [Jones, P. et al., 1986, Nature 321:522-525]; 및 [Queen, C. et al., 1989, Proc . Natl . Acad . See. U.S.A. 86:10029-10033] 참조). 이러한 골격 서열은 생식세포 항체 유전자 서열을 포함하는 공개된 DNA 데이터베이스로부터 얻을 수 있다.

따라서, CDR과 같은 본 발명의 항-ErbB3 항체 또는 이의 단편의 하나 이상의 구조적 특징은, 본 발명의 항체의 기능적 특성, 예를 들어, ErbB3의 EGF 유사 리간드 매개성 인산화 억제; ErbB3을 통한 헤레귤린, 에피레귤린, 베타셀룰린, 에피겐 또는 바이레귤린 매개성 신호 전달 중 하나 이상의 신호 전달 억제; ErbB3을 발현하는 세포의 증식 억제; 세포 표면에서 ErbB3의 수준 감소시키는 등의 특성을 하나 이상 보유하는 구조적으로 연관된 본 발명의 다른 항-ErbB3 항체 또는 이의 단편을 생성하는데 사용될 수 있다.

특정 구현예에서, 서열번호 7-12, 서열번호 13-18, 서열번호 19-24, 서열번호 39-44 및 서열번호 45-50로부터 선택된 하나 이상의 CDR 영역은 공지된 인간 골격 영역 및 CDR과 재조합되어 추가의 재조합 설계된 본 발명의 항-ErbB3 항체 또는 이의 단편을 생성할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 골격 가변부는 동일하거나 상이한 항체 서열로부터 유래할 수 있다.

항체의 중쇄 및 경쇄 CDR 도메인이 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화도에 있어서 특히 중요한 역할을 한다는 것은 당업계에 잘 알려져 있다(문헌[Hall et al., J. Imunol ., 149:1605-1612 (1992)]; [Polymenis et al., J. Immunol ., 152:5318-5329 (1994)]; [Jahn et al., Immunobiol ., 193:400-419 (1995)]; [Klimka et al., Brit . J. Cancer, 83:252-260 (2000)]; [Beiboer et al., J. Mol . Biol., 296:833-849 (2000)]; [Rader et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 95:8910-8915 (1998)]; [Barbas et al., J. Am . Chem . Soc ., 116:2161-2162 (1994)]; [Ditzel et al., J. Immunol ., 157:739-749 (1996)] 참조). 따라서, 특정 구현예에서, 항체는 본원에 기재된 특정 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3을 포함하여 생성된다(예를 들어, 서열번호 9, 15, 21, 41, 47 및/또는 서열번호 12, 18, 24, 44, 50). 항체는 추가로, 본원에 구체적으로 개시된 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR1 및/또는 CDR2를 포함할 수 있다(예를 들어, 서열번호 7-8 및/또는 서열번호 10-11; 서열번호 13-14 및/또는 서열번호 16-17; 서열번호 20-21 및/또는 서열번호 22-23; 서열번호 39-40 및/또는 서열번호 42-43; 또는 서열번호 45-46 및/또는 서열번호 48-49).

상기 기술된 조작 항체의 CDR1, 2, 및/또는 3 영역은 본원에 개시된 것과 정확히 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다(예를 들어, 각각 서열번호 7-12, 13-18, 19-24, 39-44 및 45-50에 기재된 Ab #6, Ab #3, Ab #14, Ab #17, 또는 Ab #19의 CDR). 그러나, 당업자라면 상기 본래의 것과 같은 CDR 서열이라도 ErbB3과 결합하는 항체의 능력을 보유할 수 있다면(예를 들어, 보존적 아미노산 치환), 일부 변형이 가능할 수도 있다는 사실을 알 것이다. 따라서, 또 다른 구현예에서, 상기 조작된 항체는 Ab #6, Ab #3 또는 Ab #14의 하나 이상의 CDR과 예를 들어, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99.5% 동일한 하나 이상의 CDR로 구성될 수 있다.

또 다른 구현예에서, CDR의 하나 이상의 잔기는 결합력을 변화시키기 위해 변형되어 보다 우수한 결합 등급(on-rate)을 달성할 수 있다. 이러한 전략을 사용하여, 매우 높은 결합 친화도, 예를 들어, 10¹⁰ M^-1 이상의 친화도를 갖는 항체가 얻어질 수 있다. 당업계에 잘 알려져 있으며 본원에도 기술되는 친화도 성숙 기법이 CDR 영역을 변형시키는데 사용될 수 있으며, 이후 결합력에 있어서 원했던 변화를 확인하기 위해 생성된 결합 분자의 스크리닝을 수반한다. 따라서, CDR이 변형되었기 때문에, 결합 친화도 뿐만 아니라 면역원성의 변화를 모니터링하고 점수를 매겨, 최적의 결합력과 낮은 면역원성에 대해 최적화된 항체를 얻도록 할 수 있다.

실시예 20에서 추가로 상세히 기재된 바와 같이, 돌연변이유발 (예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발)은 ErbB3에의 결합과 연관된 아미노산 잔기를 확인하여 항체의 파라토프를 정의하도록 Ab #6의 중쇄 및 경쇄 CDR 상에서 수행된다.

항-ErbB3 항체에 대한 파라토프 CDR 서열은 돌연변이유발 분석을 기반으로 하는 도 37a 및 37b에서 보여진다. 도 37a에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 항-ErbB3 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 63, 64 및 65에서 각각 보여진 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 파라토프, 및 서열번호: 69, 70 및 71에서 각각 보여진 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 파라토프를 포함할 수 있고, 단, 상기 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아니다.

도 37b에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 항-ErbB3 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 76, 64 및 65에서 각각 보여진 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 파라토프, 및 서열번호: 78, 70 및 80에서 각각 보여진 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 파라토프를 포함할 수 있고, 단, 상기 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아니다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호: 63 또는 76 (CDR1), 64 (CDR2) 및 65 (CDR3)에서 각각 보여진 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 파라토프를 포함하는 항-ErbB3 항체를 제공하고, 단, 상기 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아니다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호: 69 또는 78 (CDR1), 70 (CDR2) 및 71 또는 80 (CDR3)에서 각각 보여진 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 파라토프를 포함하는 항-ErbB3 항체를 제공하고, 단, 상기 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아니다.

본 발명의 항-ErbB3 항체 또는 이의 단편에 대한 공통 CDR 서열은 또한, 이 돌연변이유발 분석을 기반으로 한 도 37a 및 37b에서 보여진다. 도 37a에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 항-ErbB3 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 60, 61 및 62에서 각각 보여진 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 66, 67 및 68에서 각각 보여진 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 단, 상기 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아니다.

도 37b에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 항-ErbB3 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 75, 61 및 62에서 각각 보여진 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 77, 67 및 79에서 각각 보여진 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 단, 상기 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아니다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호: 60 또는 75 (CDR1), 61 (CDR2) 및 62 (CDR3)에서 각각 보여진 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-ErbB3 항체를 제공하고, 단, 상기 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아니다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호: 66 또는 77 (CDR1), 67 (CDR2) 및 68 또는 79 (CDR3)에서 각각 보여진 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역를 포함하는 항-ErbB3 항체를 제공하고, 단, 상기 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아니다.

CDR 내부에서의 변형 이외에, 또는 그러한 변형 대신에, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변부의 골격 영역인, FR1, FR2, FR3 및 FR4 중 하나 이상에 있어서의 변형도 그것이 항체의 결합 친화도를 제거하지 않는 한 행해질 수 있다.

또 다른 구현예에서, 항체는 예를 들어 암의 치료에 있어서 항체의 효능을 증진시키기 위해 효과기 기능과 관련하여 추가로 변형된다. 예를 들어, 시스테인 잔기는 Fc 영역에 도입되어, 이 영역에서 사슬 내 이황화 결합 형성을 허용할 수 있다. 이렇게 생성된 단일이합성 항체는 향상된 내재화 능력 및/또는 증진된 보체 매개성 세포사 및 항체 의존성 세포독성(ADCC)의 특징들을 가질 수 있다. 문헌[Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)]을 참조한다. 또한, 증진된 항-종양 활성을 갖는 단일이합성 항체는 문헌[Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기술된 바와 같은 이종이중기능성(heterobifunctional) 가교제를 사용하여 제조될 수 있다. 대안으로, 항체는 이중 Fc 영역을 갖도록 조작되어 향상된 보체 매개성 세포 용해능과 ADCC 능력을 가질 수 있다. 문헌[Stevenson et al. Anti - Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)]을 참조한다.

본원에서 개시된 바와 같은 CDR, 프레임워크 영역, Fc 영역, 또는 다른 항체 영역에서 하나 이상의 잔기의 돌연변이유발은 부위 지정 돌연변이유발 및 PCR 매개성 돌연변이유발을 비제한적으로 포함하는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 항원 결합 (예를 들어, ErbB3에의 결합) 시의 돌연변이의 효과의 스크리닝 및 다른 기능적 특성화는 또한 표준 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이된 CDR을 함유하는 항체 (예를 들어, scFv 버젼)은 (예를 들어, 파아지 디스플레이 시스템을 사용하여) 세포, 예컨대 포유동물 세포, 효모 세포 또는 박테리아 세포의 표면 상에서 발현될 수 있고, 항원의 세포에의 결합은 표준 방법, 예를 들어 세포에 결합된 항원이 예를 들어 표지된 이차 항체를 사용하여 검출되는 유세포 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 추가 또는 대안적으로, 항체는 가용 형태로 발현될 수 있고, 항체의 항원에의 결합은 ELISA 또는 BIACORE 분석과 같은 표준 결합 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 그와 같은 목적을 위한 상기 및 관련 기술의 상세한 설명은 수많은 하기의 예와 같은 공지된 교과서 및 실험실 매뉴얼에서 발견될 수 있다: Handbook of Therapeutic Antibodies Vols. 1-3, Stefan Dubel, ed., Wiley-VCH 2007; Making and Using Antibodies: A Practical Handbook, Gary C. Howard, CRC 2006; Antibody Engineering: Methods and Protocols, Benny K. C. Lo, Humana Press 2003; Therapeutic Antibodies: Methods and Protocols, Antony S. Dimitrov, ed., Humana Press 2009; Antibody Phage Display: Methods and Protocols, 2nd ed. Robert Aitken, ed., Humana Press 2009; Flow Cytometry Protocols, 2nd ed. Teresa S. Hawley and Robert G. Hawley, eds., Humana Press 2004; Flow Cytometry: Principles and Applications, Marion G. Macey, ed., Humana Press 2007. 또한, "Selecting and Screening Rebombinant Antibody Libraries," H.R. Hoogenboom, Nature Biotechnol. 23:1105-1116; 2005 참고.

하기 기술된 이중특이성 항체 및 면역접합체도 본 발명에 포함된다.

(ⅱ) 이중특이적 항체

본 개시내용의 이중특이적 항체는 ErbB3에 대한 하나 이상의 결합 특이성과, 다른 항원, 예컨대 발암유전자의 생성물에 대한 하나 이상의 결합 특이성을 포함한다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로 제조될 수 있다(예를 들어 F(ab')₂ 이중특이적 항체).

이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, WO 05117973 및 WO 06091209 참조). 예를 들어, 전장 이중특이적 항체의 제조는 두 사슬이 서로 다른 특이성을 가지는 두 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현을 기초로 하여 이루어질 수 있다(예를 들어, 문헌[Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)] 참조). 이중특이적 항체 제조에 대한 추가의 상세한 설명은 예를 들어, 이중특이적 항체 제조를 위한 화학 결합 방법을 기술하고 있는 문헌[Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)] 및 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]에서 찾아볼 수 있다. 재조합 세포 항원 처리물로부터 직접 이중특이적 항체 단편을 제조하여 단리하는 다양한 기법도 기술되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 이용하여 생성된다(예를 들어, 문헌[Kostelny et al., J. Immunol ., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조). 단쇄 Fv (scFv) 이합체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하는 또 다른 전략도 보고된다(예를 들어, 문헌[Gruber et al., J. Immunol ., 152:5368 (1994)] 참조).

특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 ErbB3과 결합하는 일차 항체 또는 이의 결합부 및 ErbB2, ERbB3, ErbB4, EGFR, IGF1-R, C-MET, 루이스 Y, MUC-1, EpCAM, CA125, 전립선 특이적 막 항원, PDGFR-σ, PDGFR-β, C-KIT, 또는 임의의 FGF 수용체와 결합하는 이차 항체 또는 이의 결합부를 포함한다.

(ⅲ) 면역접합체

본 개시내용의 면역접합체는 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합부를 다른 치료제에 접합시켜 형성될 수 있다. 적절한 제제로서는, 예를 들어, 세포독성 치료제 (예를 들어, 화학요법제), 독소 (예를 들어 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 유래의 효소 활성형 독소, 또는 이의 단편), 및/또는 방사성 동위원소 (즉, 방사선접합체)를 포함한다. 이러한 면역접합체의 생성에 유용한 화학요법제는 상기 기술되어 있다. 사용가능한 효소 활성형 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성형 단편, 외독소 A 사슬(녹농균 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, α-사신, 유동(Aleurites fordⅱ) 단백질, 디안틴 단백질, 미국자리공(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPⅡ 및 PAP-S), 여주(Momordica charantia) 억제제, 커신, 크로틴, 비누풀(Sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 마이토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 방사선접합된 항-ErbB3 항체의 제조를 위해 다양한 방사선핵종이 이용된다. 예로서는 ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y 및 ¹⁸⁶Re을 포함한다.

본 발명의 면역접합체는 다양한 이중기능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 2-이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이중기능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수버레이트), 알데하이드 (예컨대 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스-(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예컨대 1,5-디플루오르-2,4-디니트로벤젠)을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌[Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)]에 기술된 것과 같이 제조될 수 있다. ¹⁴C 표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사선뉴클레오타이드 접합을 위한 대표적인 킬레이트제이다(예를 들어, WO94/11026 참조).

(ⅳ) ErbB3 엑토도메인 펩타이드에 대항하여 성장된 항체

당해 분야의 숙련가는, Ab #6의 다양한 바람직한 특성을 갖거나, ErbB3에 결합하기 위해 Ab #6과 경쟁하는 모노클로날 및 단일특이적 폴리클로날 항체 (예를 들어, 암 세포 증식을 억제하고 세포 상 ErbB3를 하향조절하는 항체)는 면역원으로서 펩타이드 (예를 들어, 합성 펩타이드), 또는 그의 접합체 (예를 들어, KLH 접합체)를 사용하는 종래의 면역화 방법을 사용하여 쉽게 얻을 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이 구현예에서 면역원으로서 사용하기 위한 펩타이드는 서열번호: 73의 잔기 1-183로부터 어떤 10 또는 초과의 인접 아미노산 잔기를 포함하는 것이다. 바람직하게는 10 또는 초과의 인접 아미노산 잔기는 ErbB3의 엑토도메인의 도메인 I로부터이고, 바람직하게는 잔기는 적어도 부분적으로, 서열번호: 73의 잔기 92-104 내이거나 포괄한다.

Ⅲ. 항체 스크리닝 방법

ErbB3과 결합하는 항체 또는 항원 결합부를 제조한 이후에, 이러한 항체 또는 이의 부분은 당업계에 잘 알려진 다양한 분석법을 이용하여 다양한 특성들, 예컨대 본원에 기재된 특성들에 대해 스크리닝 될 수 있다.

한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 ErbB3의 EGF 유사 리간드 매개성 인산화를 억제하는 능력에 대해 스크리닝 된다. 이는 항체 또는 이의 항원 결합부의 존재 및 부재 하에 ErbB3을 발현하는 세포를 EGF 유사 리간드로 처리함으로써 수행될 수 있다. 이후 세포를 용해시킬 수 있고, 그 미정제 용해물을 원심분리하여 불용성 물질을 제거할 수 있다. ErbB3 인산화는 예를 들어, 문헌[Kim et al., 상기와 동일]과 하기 실시예들에서 기술된 바와 같은 항-포스포티로신 항체를 이용한 탐침을 수반하는 웨스턴 블롯팅에 의해 측정될 수 있다.

다른 구현예에서, 항체 및 이의 항원 결합부는 추가로 하나 이상의 하기 특성에 대해 스크리닝 된다: (1) ErbB3을 통한 ErbB3 리간드(예컨대 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 또는 바이레귤린) 매개성 신호 전달의 억제; (2) ErbB3을 발현하는 세포의 증식 억제; (3) 세포 표면에서의 ErbB3의 수준을 감소시키는 능력 (예를 들어, ErbB3의 세포 내 함입을 유도함으로써); (4) ErbB3을 발현하는 세포의 VEGF 분비 억제; (5) ErbB3을 발현하는 세포의 이동 억제; (6) ErbB3을 발현하는 세포의 구상 성장 억제; 및/또는 (7) ErbB3의 엑토도메인의 도메인 I 상에 위치한 에피토프에의 결합. 이들 각각은 당업계에 공지된 기법 및 본원에 거론된 방법을 이용하여 쉽게 측정될 수 있다.

ErbB3을 통한 하나 이상의 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 또는 바이레귤린 매개성 신호 전달의 억제는 예컨대, 문헌[Horst et al. 상기와 동일]에 기술된 바와 같은 통상적인 분석법을 이용하여 쉽게 측정될 수 있다. 예를 들어, ErbB3을 통한 하나 이상의 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 또는 바이레귤린 매개성 신호 전달을 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합부의 능력은 예를 들어, 문헌[Horst et al. 상기와 동일], [Sudo et al., (2000) Methods Enzymol, 322:388-92]; 및 [Morgan et al. (1990) Eur . J. Biochem ., 191:761-767]에 기술된 바와 같은, ErbB3의 공지된 기질, 예를 들어, SHC 및 PI3K에 대한 키나아제 분석을 수행한 후, 하나 이상의 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 또는 바이레귤린으로 자극시킴으로써 측정할 수 있다. 따라서, ErbB3을 발현하는 세포는 하나 이상의 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 또는 바이레귤린으로 자극되어, 후보 항체 또는 이의 항원 결합부를 이용하여 항원 처리될 수 있다. 이러한 세포로부터 후속 제조된 세포 용해물은, 예를 들어 항-JNK-1 항체와 같은 ErbB3의 기질(또는 ErbB3이 관여하는 세포 경로 내 단백질)에 대한 항체를 이용하여 면역침전시켜, 당업계에 공지된 기법을 이용해 키나아제 활성(예를 들어, JNK 키나아제 활성 또는 PI3-키나아제 활성)에 대해 분석할 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합부의 부재 하에 비하여, 그들의 존재 하에 있어서 ErbB3 기질 또는 ErbB3이 관여하는 경로 내의 단백질의 수준 또는 활성(예를 들어, 키나아제 활성)의 감소 또는 완전한 소실은, 하나 이상의 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 또는 바이레귤린 매개성 신호 전달을 억제하는 항체 또는 항원 결합부가 있음을 나타내는 것이다.

특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 ErbB3에 대한 하나 이상의 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 또는 바이레귤린의 결합을 감소시킴으로써 ErbB3-리간드 (예를 들어, 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 또는 바이레귤린) 매개성 신호 전달을 억제한다.

하나 이상의 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 또는 바이레귤린의 ErbB3에 대한 결합을 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합부를 선별하기 위해서는, ErbB3을 발현하는 세포 (예를 들어 하기 실시예에서 기술된 것과 같은 MALME-3M 세포)를 항-ErbB3 항체 또는 이의 항원 결합부의 부재(대조군) 또는 존재 하에, 표지된 ErbB3-리간드 (예를 들어, 방사선 표지된 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 또는 바이레귤린)에 접촉시킬 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합부가 ErbB3에 대한 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 또는 바이레귤린의 결합을 억제하는 경우에는, 항체 또는 이의 항원 결합부의 부재 하에서의 양과 비교하여 회수된 표지량(예를 들어, 방사선표지된 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 또는 바이레귤린)에 있어서 통계적으로 유의한 감소가 관찰될 것이다.

항체 또는 이의 항원 결합부는 임의의 기작에 의해 ErbB3-리간드 (예를 들어, 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 또는 바이레귤린)의 결합을 억제할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합부는 ErbB3 리간드가 ErbB3 상의 동일한 부위 또는 중첩하는 부위에 결합하는 것을 억제함으로써 ErbB3에 대한 ErbB3 리간드 (예를 들어, 하나 이상의 헤레귤린, 에피레귤린, 에피겐 또는 바이레귤린)의 결합을 억제할 수 있다. 다르게는, 항체 또는 이의 항원 결합부는 ErbB3의 구조를 변형시키거나 뒤틀어놓음으로써, 그것이 ErbB3 리간드에 결합할 수 없도록 하여 ErbB3 리간드의 결합을 억제할 수 있다.

세포 표면에서의 ErbB3 수준을 감소시키는 항체 및 이의 항원 결합부는 종양 세포 상에서 ErbB3을 하향조절시키는 이들의 능력에 의해 확인될 수 있다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 Erbb3의 세포 내 함입을 유도(또는 세포 이물 흡수 증가)함으로써 ErbB3 세포 표면 발현을 감소시킨다. 이를 시험하기 위해, ErbB3에 비오틴을 부착시켜, 예를 들어, 문헌[Waterman et al., J. Biol . Chem . (1998), 273:13819-27]에 기술된 바와 같이, 항체 또는 이의 항원 결합부의 존재 또는 부재 하에 항원 처리물의 세포의 단층 상에서 비오틴의 양을 측정한 후, ErbB3의 면역침전과 스트렙타비딘을 이용한 탐침을 사용하면 세포 표면 상의 ErbB3 분자수를 쉽게 측정할 수 있다. 항체 또는 항원 결합부의 존재 하에 시간이 경과함에 따른 비오틴 부착된 ErbB3의 검출이 감소하는 것은 세포 표면에서 ErbB3 수준을 감소시키는 항체가 있음을 의미하는 것이다.

또한, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합부를 당업계에 공지된 기법, 예컨대 하기 실시예에 기술된 CellTiter-Glo® 분석법을 이용하여 종양 세포와 같은 ErbB3를 발현하는 세포의 증식을 억제하는 그 능력에 대해 시험할 수도 있다(예를 들어, 문헌[Macallan et al., Proc . Natl . Acad . Sci. (1998) 20;95(2):708-13]; [Perez et al. (1995) Cancer Research 55, 392-398]도 참조한다).

또 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 ErbB3를 발현하는 세포의 VEGF 분비를 억제하는 능력에 대해 스크리닝 된다. 이는 잘 알려진 분석법, 예컨대 R&D Systems (미국 미네소타주 미네아폴리스 소재, #DY293B)에서 입수가능한 VEGF ELISA 키트를 이용하여 수행될 수 있다. 유사하게, 항체 또는 이의 부분은 본원에 기재된 것과 같이 반투과성막 분석법(trans-well assay) [밀리포어 코포레이션(Millipore Corp.), 미국 메사추세츠주 빌레리카 소재, #ECM552]을 이용하여 ErbB3를 발현하는 세포(예를 들어, MCF-7 세포)의 이동을 억제하는 능력에 대해 스크리닝 된다.

또 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 ErbB3를 발현하는 세포의 구상 성장을 억제하는 능력에 대해 스크리닝 된다. 이는 종양 성장을 진행시키는 조건을 모방하는 분석법을 이용하여 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Herman et al. (2007), Journal of Biomolecular Screening Electronic publication] 참조).

본원에 구체적으로 개시된 하나 이상의 항체와 동일하거나 중첩하는 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합부도 당업계에 공지된 표준 기법 및 본원에 기재된 방법을 이용하여 동정될 수 있다. 예를 들어, 해당 항체에 의해 결합된 ErbB3 상의 동일하거나 중첩하는 에피토프에 결합하는 항체에 대하여 스크리닝하기 위해, 문헌[Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and Daⅵd Lane (1988)]에 기술된 바와 같은 교차-차단 분석법(cross-blocking assay)을 수행할 수 있다.

IV . 약학 조성물

다른 양태에서, 본 발명은 조성물, 예를 들어, 본원에 개시된 항체, 또는 이의 항원 결합부를 하나 또는 그들의 혼합물로 포함하여, 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화되는 약학 조성물을 제공한다. 한 구현예에서, 상기 조성물은 ErbB3 상의 서로 다른 에피토프에 결합하는 복수(예를 들어, 2개 이상) 단리된 항체들의 혼합물을 포함한다.

본원에서, "약제학적으로 허용가능한 담체"는 생리학적으로 혼화가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 상기 담체는 정맥, 근육, 피하, 비경구, 척수 또는 상피세포 투여(예를 들어, 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다. 투여 경로에 따라서, 활성제 즉, 항체, 항체 단편, 이중특이적 및 다중 특이적 분자는 상기 제제를 불활성화시킬 수 있는 산의 작용 및 기타 자연 상태로부터 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.

"약제학적으로 허용가능한 염"은 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하면서 바람직하지 못한 독소의 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다(예를 들어, 문헌[Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm . Sci . 66:1-19] 참조). 이러한 염의 예로서는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 비독성 무기산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등으로부터 유래한 산 부가염, 그리고 비독성 유기산, 예컨대 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알카논산, 히드록시 알카논산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 설폰산 등으로부터 유래한 산 부가염을 포함한다. 염기 부가염은 알칼리토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유래된 염기 부가염, 그리고 비독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 염기 부가염을 포함한다.

본 발명의 약학 조성물은 다른 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 적어도 하나 이상의 추가의 치료제, 예컨대 하기 기술된 항암제를 포함할 수 있다. 약학 조성물은 방사선 요법 및/또는 외과 수술과 함께 병행하여 투여될 수도 있다. 대안적으로 본 발명의 조성물은 아래에 기재되어 있는 항암제와 같은 적어도 하나 이상의 추가 치료제와 따로따로 공투여될 수 있다.

본 개시내용의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 당업자라면 투여 경로 및/또는 투여 방식은 원하는 결과에 따라 다를 것이라는 사실을 이해할 것이다. 활성제는 임플란트, 경피성 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 서방형 제제와 같은 신속한 방출에 대해 제제를 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가의 무수물, 폴리클리콜산, 콜라겐, 폴리오르쏘에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체 친화성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형들을 제조하는 다수의 방법은 특허받거나 또는 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delⅳ ery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.

특정 투여 경로에 의해 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 투여하기 위해서는, 그의 불활성화를 방지할 물질로 코팅하거나, 동시에 투여하는 것이 필요하다. 예를 들어, 상기는 리포좀 또는 희석제와 같은 적절한 담체로 대상에게 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 희석제는 식염수 및 완충 수용액을 포함한다. 리포좀은 통상적인 리포좀 뿐만 아니라 수중-유중수 CGF 에멀젼을 포함한다(문헌[Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27]).

약제학적으로 허용가능한 담체는 멸균 수용액 또는 분산액과, 멸균 주사액 또는 분산액의 일시 제조를 위한 멸균 분말 또는 리요필리세이트를 포함한다. 약학적 활성 항체를 위한 이러한 매질과 제제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성제와 불상용성인 경우를 제외하면, 본 발명의 약학 조성물에서의 이의 사용은 고려된다. 보충적인 활성 화합물도 조성물 내에 포함될 수 있다.

치료 조성물은 일반적으로 제조 및 저장 상태 하에서는 멸균되고 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀 또는 기타 높은 약물 농도에 적합한 정돈된 구조로서 제형화될 수 있다. 담체는 용매, 또는 예컨대 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적절한 혼합물을 포함하는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에 있어, 조성물 내에 등장화제, 예를 들어, 당, 다가알콜 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사 조성물의 흡수 지연은 조성물 내에 모노스테아레이트 염 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 포함시킴으로써 야기시킬 수 있다.

멸균 주사액은 적절한 용매에 필요량의 활성제를 상기 열거된 성분들을 하나 또는 그들의 혼합물과 함께 혼입시키고, 필요하다면 멸균 미세여과를 거쳐 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성제를 기본 분산 매질과 상기 열거된 필수 기타 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분에 미리 멸균 여과시킨 그의 용액으로부터 추가로 임의의 원하는 성분을 더한 분말을 제조할 수 있는 진공 건조와 동결 건조(냉동 건조)이다.

복용량 처방 계획은 최적의 목적하는 반응(예를 들어, 치료적 반응)을 제공하기 위해 조절될 수 있다. 예를 들어, 단회 용량으로 투여할 수 있으며, 수회의 용량을 시간의 경과에 따라 투여할 수 있거나, 치료 상황의 요건에 의해 점차 복용량을 감소하거나 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 인간 항체는 피하 주사로 한 주에 1회 또는 2회 투여되거나, 피하 주사로 한 달에 1회 또는 2회 투여될 수 있다.

적합한 복용 범위 및 계획의 비제한적인 예는 1회/1주, 또는 2회/1주 또는 1회/3일, 또는 1회/2주로 투여된 2-50 mg/kg (대상체의 체중), 및 1회/1주, 또는 2회/1주 또는 1회/3일, 또는 1회/2주로 투여된 1-100 mg/kg을 포함한다. 다양한 구현예에서, 항체는 1회/1주, 또는 2회/1주 또는 1회/3일, 또는 1회/2주의 시점에서 3.2 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg 또는 40 mg/kg의 복용량으로 투여된다. 추가적인 복용 범위는 1-1000 mg/kg, 1-500 mg/kg, 1-400 mg/kg, 1-300 mg/kg 및 1-200 mg/kg를 포함한다. 적합한 복용 스케줄은 1회/3일, 1회/5일, 1회/7일 (즉, 1회/1주), 1회/10일, 1회/14일 (즉, 1회/2주), 1회/21일 (즉, 1회/3주), 1회/28일 (즉, 1회/4주) 및 1회/1개월을 포함한다.

실시예에서 설명된 바와 같이, 추가 치료제와 병용하여 본원에 개시된 항체의 사용은 항-종양 활성에 대해 첨가제 효과가 있을 것이다. 따라서, 병용 치료를 위해, 항체 또는 제2 치료제, 또는 모두의 차선 복용량은 제제의 첨가제 효과에 기인하여 원하는 치료 결과를 얻기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 또 다른 치료제와 병용하여 사용할 때, 다양한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은, 상기 항체가 단독으로 투여될 때 사용된 복용량의 90 %, 또는 80 %, 또는 70 % 또는 60 % 또는 50 %인 복용량으로 투여될 수 있다.

투여의 용이성과 용량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 비경구 조성물을 제조하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 투여 단위 형태라는 용어는 치료될 대상을 위한 단위 복용량으로 맞춰진 물리적으로 분리된 단위를 가리키며; 각 단위는 필요한 약학적 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 이끌어내도록 미리 계산된 활성제의 양을 포함한다. 본 발명의 투여 단위 형태를 위한 상세한 사항은 하기 요인에 의하여 상술되며, 직접적으로 하기에 따라 달라진다: (a) 활성제의 독특한 특성과 달성할 특정 치료 효과 및 (b) 각 개인의 개별 민감성의 치료에 대한 이러한 활성제에 있어서 화합물 당업계의 본래의 한계점.

약제학적으로 허용가능한 항산화제의 예로서는 (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 중아황산나트룸, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 지용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, α-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.

치료 조성물에 있어서, 본 개시내용의 제형은 경구, 비강, 국소(구강 및 설하 포함), 직장, 질 및/또는 비경구 투여를 위해 적절한 제형을 포함한다. 제형은 단위 투여 형태로 알맞게 제공될 수 있고, 약학업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 단일 투여 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 혼합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 대상 및 특정 투여 방식에 따라 다를 것이다. 단일 투여 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 혼합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타낼 수 있는 조성물의 양이 될 것이다. 일반적으로, 전체를 100%로 했을 때, 그 양은 약 0.001% 내지 약 90%의 활성 성분, 바람직하게는 약 0.005% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 30% 범위가 될 것이다.

질 투여를 위해 적절한 본 개시내용의 제형은 당업계에 적합한 것으로 공지된 담체를 포함하는 질좌약, 탐폰, 크림, 젤, 페이스트, 거품 또는 스프레이 제형들을 포함한다. 본 발명의 조성물의 국소 또는 경피성 투여를 위한 투여 형태는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 젤, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 활성제는 멸균 조건 하에서 약제학적으로 허용가능한 담체와, 그리고 필요한 경우 임의의 보존제, 완충제, 또는 추진체와 혼합될 수 있다.

본원에서 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여된다"라는 말은 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하는데, 통상 주사에 의하며, 이에 제한하지는 않지만 정맥내, 근육내, 동맥내, 뇌척수강내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경피기관내, 피하, 각피하, 관절내, 간피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골하 주사와 주입에 의한다.

본 발명의 약학 조성물에서 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예로서는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적절한 혼합물, 식물유, 예컨대 올리브유 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.

또한, 이러한 조성물은 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 아주반트를 포함할 수도 있다. 당업계에 잘 알려진 아주반트의 구체적인 예로서는, 예를 들어, 무기질 아주반트 (예컨대 알루미늄 염, 예를 들어, 인산알루미늄 및 수산화알루미늄), 유기질 아주반트 (예를 들어, 스쿠알렌), 유성 아주반트, 바이로솜 (예를 들어, 인플루엔자 바이러스로부터 유래한 막결합 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제를 포함하는 바이로솜)을 포함한다.

미생물 존재의 예방은 멸균 절차(상기 참조) 에 의하여, 그리고 다양한 항박테리아제와 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 주입함으로써 수행될 수 있다. 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물 내에 포함하는 것도 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 약학적 형태의 흡수 지연은 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 포함시킴으로써 야기할 수 있다.

본 개시내용의 항체가 인간 및 동물에게 의약으로 투여되는 경우, 이는 단독으로, 또는 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께, 예를 들어, 0.001 내지 90% (보다 바람직하게는, 0.005 내지 70%, 예컨대 0.01 내지 30%)의 활성 성분을 포함하는 약학 조성물로서 투여될 수 있다.

선택된 투여 경로와는 관계없이, 적절한 함수형 및/또는 본 개시내용의 약학 조성물로 사용될 수 있는 본 개시내용의 항체는, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 약제학적으로 허용가능한 투여 형태로 제형화된다.

본 개시내용의 약학 조성물 내의 활성 성분의 실제 투약 수준은, 환자에게 독성을 부여하지 않으면서 특정 환자, 조성물 및 투여 경로에 대하여 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위해서 다양할 수 있다. 선택된 투약 수준은 다양한 약동학적 요인, 예컨대 사용된 특정 조성물, 또는 본원에 제공된 항체 또는 이의 단편과 공투여된 화합물 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용된 특정 제제의 방출 속도, 치료의 지속 시간, 사용된 특정 조성물과 함께 사용된 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료할 환자의 나이, 성별, 체중, 질환, 일반적인 건강 상태 및 사전 병력 및 의학 업계에 잘 알려진 기타 요인들에 따라 달라질 것이다. 당업계의 일반지식을 지닌 의사 또는 수의사라면 필요한 약학 조성물의 유효량을 쉽게 결정하여 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 약학 조성물에 사용되는 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 투약량을 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 필요한 수준보다 낮게 시작하여, 치료 효과를 달성할 때까지 점차적으로 투약량을 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적절한 일일 투약량은 치료 효과를 나타내는데 유효한 가장 낮은 투약량을 제공하는 양이 될 것이다. 이러한 유효한 투약량은 일반적으로 상기 기술한 요인들에 따라 다를 것이다. 투약은 정맥내, 근육내, 복강내, 또는 피하, 바람직하게는 표적 부위에 근접하여 투약하는 것이 바람직하다. 필요하다면, 치료 조성물의 유효한 일일 복용량은 하루에 적절한 간격을 두어 2, 3, 4, 5, 6회 이상의 양으로 나누어 투여하며, 임의로는 단위 투여 형태로 투여할 수 있다. 본 개시내용의 항체를 단독으로 투여하는 것이 가능하나, 약학적 제형(조성물)로서 항체를 투여하는 것이 바람직하다.

치료 조성물은 당업계에 공지된 의학 장비를 이용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 치료 조성물은 예컨대, 미국특허 제5,399,163호, 제5,383,851호, 제5,312,335호, 제5,064,413호, 제4,941,880호, 제4,790,824호, 또는 제4,596,556호에 개시된 장비와 같은 무침 피하 주사 장비를 이용하여 투여될 수 있다. 본 발명에서 유용한 잘 알려진 임플란트 및 모듈의 예로서는: 속도를 조절하면서 투약하는 매몰식 미세주입 펌프를 개시하는 미국특허 제4,487,603호; 피부를 통해 의약을 투여하는 치료 장비를 개시하는 미국특허 제4.,486,194호; 정밀한 주입 속도로 의약을 전달하기 위한 의약 주입 펌프를 개시하는 미국특허 제4,447,233호; 연속적 약물 전달을 위한 가변적 유동 매몰식 주입 장치를 개시하는 미국특허 제4,447,224호; 다중 챔버 구획을 갖는 삼투압을 이용한 약물 전달 시스템을 개시하는 미국특허 제4,439,196호; 및 삼투압을 이용하는 약물 전달 시스템을 개시하는 미국특허 제4,475,196호를 포함한다. 다수의 기타 이러한 임플란트, 전달 시스템 및 모듈이 당업자에게 공지되어 있다.

특정 구현예에서, 본원에 개시된 조성물은 생체내 적절한 분배를 확보하기 위하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 뇌혈관장벽 (BBB)은 많은 고친수성 화합물을 차단한다. 본 발명의 조성물 중 치료 화합물을 BBB에 통과시키기 위해서는(필요한 경우), 이들은 예를 들어, 리포좀으로 제형화될 수 있다. 리포좀을 제조하는 방법에 대해서는, 예를 들어, 미국특허 제4,522,811호; 제5,374,548호; 및 제5,399,331호를 참조한다. 리포좀은 특정 세포 또는 기관으로 선택적으로 수송하여 표적화된 약물 전달을 증진시키는 하나 이상의 부분(moiety)을 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[V.V. Ranade (1989) J. Clin . Pharmacol. 29:685] 참조). 대표적인 표적화 부분은 엽산 또는 비오틴 (예를 들어, 미국특허 제5,416,016호(Low et al.)); 만노사이드 (문헌[Umezawa et al., (1988) Biochem . Biophys . Res . Commun. 153:1038]); 항체 (문헌[P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140]; [M. Owais et al. (1995) Antimicrob . Agents Chemother. 39:180]); 본 발명의 분자 성분 뿐만 아니라 본 발명의 제형물을 포함할 수 있는 상이한 종인, 계면활성제 단백질 A 수용체 (문헌[Briscoe et al. (1995) Am . J. Physiol. 1233:134]); p120 (문헌[Schreier et al. (1994) J. Biol . Chem. 269:9090])을 포함하며, 문헌[K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123]; [J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273]도 참조한다.

V. 항체를 이용하는 방법

또한, 본 발명은 ErbB3과 결합하는 항체 및 이의 항원 결합부를 다양한 체외 및 체내 진단과 치료용으로 이용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본원에 개시된 항체는 여러가지 암을 비롯하여 ErbB3 의존성 신호 전달과 연관된 질병을 치료하는데 사용될 수 있다.

한 구현예에서, 본 발명은 질병을 치료하기에 효과적인 양으로 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 대상에게 투여함으로써 ErbB3 의존성 신호 전달과 연관된 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 해당 질병으로는 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 흑색종, 유방암, 난소암, 신장암, 위암, 결장암, 폐암 (예를 들면, 비소세포 폐암) 및 전립선암을 비롯한 다양한 암을 포함한다.

바람직한 구현예에서, 환자로부터 얻은 종양 시료는 시험되고, 치료는 본원에 참고로 통합되어 있는 국제출원 No. PCT/US09/054051 (2009년 8월 17일 출원, 명칭 "Methods, Systems And Products For Predicting Response Of Tumor Cells To A Therapeutic Agent And Treating A Pateent According To The Predicted Response")에서 개시된 방법에 따라 제공된다. 예를 들어, 환자는 악성 종양에 대해 시험될 것이고, 종양의 시료가 얻어지며, 시료에서 포스포-ErbB3 (pErbB3)의 수준이 결정되고, 적어도 하나의 항신생물 치료제는 환자에게 차후에 투여되지만, 시료에서 측정된 pErbB3의 수준이 혈청 유리 배지에서 20-24시간 동안 항원 처리 후 ACHN 세포의 항원 처리에서 측정된 pErbB3의 수준의 50% 이상이면, 이때 환자에게 차후에 투여된 적어도 하나의 항신생물 치료제는 본 발명의 항-ErbB3 항체, 예를 들어, Ab #6를 포함하고, 시료에서 측정된 pErbB3의 수준이 ACHN 세포의 항원 처리에서 측정된 pErbB3의 수준의 50% 미만이면, 이때 환자에게 차후에 투여된 적어도 하나의 항신생물 치료제는 항-ErbB3 항체를 포함하지 않는다.

일 구현예에서, 암은 KRAS 돌연변이를 포함한다. 실시예 17에서 설명된 바와 같이, 본원에 개시된 항체 (예를 들어, Ab #6)는, 단일 제제 (단일치료제)로서 또는 다른 치료제와 병용하여 사용될 때 KRAS 돌연변이를 포함하는 종양 세포의 성장을 억제할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 암은 PI3K 돌연변이를 포함한다. 실시예 19에서 설명된 바와 같이, 본원에 개시된 항체 (예를 들어, Ab #6)는, 단일 제제 (단일치료제)로서 또는 다른 치료제와 병용하여 사용될 때, PI3K 돌연변이를 포함하는 종양 세포의 성장을 억제할 수 있다.

항체는 ErbB3 매개된 신호 전달과 연관된 질병을 치료하기 위해, 단독으로 투여되거나, 항체와 함께 작용하거나 또는 항체와 상승적으로 작용하는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 이러한 치료제는, 예를 들어, 하기 기술된 항암제(예를 들어, 세포 독소, 화학요법제, 소형 분자 및 방사선)를 포함한다. 실시예 16, 17 및 19에서 설명된 바와 같이, 본원에 개시된 항체 (예를 들어 Ab#6)는, 다른 치료제와 조합하여 사용될 때, 단독치료로 사용될 때와 비교하여 증가된 종양 성장 억제를 나타낼 수 있다. 조합 치료를 위한 바람직한 치료제는 에를로티닙 (Tarceva®), 파클리탁셀 (Taxol®) 및 시스플라틴 (CDDP)을 포함한다.

어떤 측면에서, 본원에 개시된 항체는 환자에게 투여된다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합부를 대상의 세포와 (예를 들어, 체외 또는 체내) 접촉시킨 후, 세포 상의 ErbB3에 대한 결합 수준을 측정함으로써, 대상의 ErbB3 상향 조절과 연관된 질병(예를 들어, 암)을 진단하는 방법을 제공한다. ErbB3에 대한 비정상적으로 높은 결합 수준은 대상이 ErbB3 상향 조절과 연관된 질병에 걸렸음을 나타낸다.

본 발명의 항체 및 이의 항원 결합부를 포함하는 키트도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 키트는 키트의 내용물의 사용 취지를 나타내는 라벨을 포함할 수 있고, ErbB3 상향 조절 및/또는 ErbB3 의존성 신호 전달과 연관된 질병을 치료 또는 진단시, 예를 들어 종양의 치료시 키트의 사용을 위한 설명서를 임의로 포함할 수 있다. 라벨이라는 용어는 키트 상 또는 키트와 함께 제공되거나, 다르게는 키트와 함께 수반되는 임의의 기록, 마케팅 자료 또는 기록 자료를 포함한다.

본 발명을 하기 실시예로 추가로 예시하나, 이로써 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 본 출원에서 언급된 서열 목록, 도면 및 모든 참조 문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 본원에 참조로서 명백하게 포함된다.

실시예

재료 및 방법

이하 실시예에서는 달리 언급이 없는 한, 다음과 같은 재료 및 방법을 사용한다.

일반적으로, 다양한 측면의 본 발명을 실시함에 있어서, 달리 지정하지 않은 한, 통상의 화학 기술, 분자 생물학 기술, 재조합 DNA 기술, 면역학 기술(특히, 예를 들어, 항체 이용 기술), 그리고 표준적인 폴리펩티드 제조 기술을 사용한다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow 외 다수, C.S.H.L. Press, Pub. (1999); 및 Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel 외 다수, John Wiley & Sons (1992)]을 참조하시오. HCV의 생물학적 특징을 분석하기 위한 시험관 내 및 생체내 모델 시스템에 관하여는 예를 들어, 문헌[Cell culture models and animal models of ⅵral hepatitis. Part Ⅱ: hepatitis C, Lab. Anim. (NY);34(2):39-47 (2005) 및 The chimpanzee model of hepatitis C ⅵrus infections, ILAR J.;42(2): 117-26 (2001)]에 개시되어 있다.

헤레귤린

이들 실시예 및 도에서 사용된 바와 같이, HRG은 헤레귤린 1 베타 1, HRG1-B, HRG-β1, 뉴레귤린 1, NRG1, 뉴레귤린 1 베타 1, NRG1-b1, HRG ECD 등으로 다양하게 공지된 헤레귤린의 아이소폼을 의미한다. HRG는 예를 들어, R&D Systems # 377-HB-050/CF로부터 상업적으로 이용가능하다.

세포주

이하에 기재된 실험에 사용된 모든 세포주는 공보의 인용에 의해 지시된 바와 같이, 미국 미생물 보존 센터 (ATCC, Manassas, VA), 국립 암 협회 또는 (NCI, www.cancer.gov), 예를 들어, 암 치료 진단부 (DCTD), 또는 연구자(들)로부터 지시된 바와 같이 얻는다.

ㆍMCF7- ATCC cat. No. HTB-22

ㆍT47D- ATCC cat. No. HTB-133

ㆍColo357- Kolb, et al., (2006) Int. J. Cancer, 120:514-523.

또한 Morgan, et al., (1980) Int. J. Cancer, 25:591-598 참조.

ㆍDu145- ATCC cat. No. HTB-81

ㆍOVCAR8- NCI

ㆍH1975- ATCC cat. No. CRL-5908

ㆍA549- ATCC cat. No.CCL-185

ㆍMALM -3M-NCI

ㆍAdrR-NCI

ㆍACHN- ATCC cat. No. CRL-1611

종양 세포의 미분쇄

냉동 미분쇄기(코바리스 인코포레이티드; Covaris Inc.)를 사용하여 종양을 미분쇄한다. 종양을 특수 주머니(종양을 넣기 전에 미리 중량을 측정함)에 넣은 후, 이를 사용하는 동안에 액체 질소에 넣어 보관한다. 소형 종양의 경우, 처음에 200uL의 용해 완충액을, 종양이 담겨있는 주머니에 첨가하고, 이를 액체 질소에 넣어 냉동시킨 다음, 미분쇄하여, 주머니로부터의 종양 회수 능을 개선한다. 미분쇄된 종양을 2mL들이 EPPENDORF 튜브로 옮긴 다음, 다음 단계가 준비될 때까지 이 튜브를 액체 질소 중에 넣는다.

종양 세포의 용해

종양을, 단백질 분해 효소와 포스파타제의 억제제가 보강된 용해 완충액 중에서 용해한다. 용해 완충액을 최종 농도 약 62.5㎎/mL가 되도록 종양 분취액에 첨가한다. 종양 시료를 30초 동안 와류시키고, 이를 얼음 상에서 약 30분 동안 항온처리함으로써 상기 시료를 균질화한다. 용해물을 QIAGEN QIASHREDDER 컬럼 내에서 약 10분 동안 회전시켜 이 시료를 추가로 균질화한다. 투명한 용해물을 추가의 처리를 위해 새 튜브에 분액화하여 넣는다.

BCA 분석법

다음과 같은 제조자의 프로토콜에 따라서, 모든 종양 시료를 대상으로 BCA 분석법(피어스(Pierce))을 수행한다. 각 종양 시료의 총 단백질 농도(㎎/mL)는 이후 ELISA 결과를 정규화하는데 사용한다.

ELISA 분석법

전체 및 인산화 ErbB3 ELISA에 사용되는 모든 ELISA 시약은 R&D Sysetms로부터 구입한다(DUOSET 키트). 96-웰 NUNC MAXISORB 평판을 50uL의 항체로 코팅한 다음, 이를 실온에서 밤새도록 항온처리한다. 다음날 아침, 평판을, 첨가된 Tween 세정제 PBST (0.05% Tween-20)와 함께 칼슘 또는 마그네슘없는 둘베코(Dulbecco) 인산염 완충액 염수 (PBS)를 갖는 BIOTEK 평판 세척기 중에서 1000 ㎕/웰로 3회 세척한다. 이후, 평판을 실온에서 PBS중 2% BSA를 사용하여 약 1시간 동안 차단시킨다. 상기 평판을 BIOTEK 평판 세척기 중에서 1000 ㎕/웰의 농도의 PBST(0.05% Tween-20)로 3회 세척한다. 50㎕의 세포 용해물과 50% 용해 완충액 및 1% BSA 중 희석된 표준 물질을 추후의 과정을 수행하기 위해 2개씩 준비한다. 시료들을 평판 진탕기(4℃) 상에서 2시간 동안 항온처리하고, 이를 이전과 같이 3회 세척한다. 약 50㎕의 검출 항체를 2%의 BSA 중에 희석시키고, 여기에 PBST를 첨가한 다음, 이를 실온에서 약 1시간 동안 항온처리한다. 인광체-ErbB3용으로서, 검출 항체를 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)에 직접 접합한 다음, 이를 실온에서 2시간 동안 항온처리한다. 상기 평판을 이전과 같이 세척한다. 약 50㎕의 스트렙타비딘-HRP를 첨가한 다음, 이를 실온에서 30분 동안 항온처리한다(pErbB3 제외). 상기 평판을 이전과 같이 세척한다. 약 50㎕의 SUPERSIGNAL ELISA Pico (Thermo Scientific) 기질을 첨가하고, 퓨젼 평판 판독기(FUSION plate reader)를 사용하여 평판을 판독한다. EXCEL을 이용하여 상기 데이터를 분석한다. 2개씩 준비된 시료들에 관한 측정치들을 평균 내고, 에러 바(error bar)를 사용하여 2개씩의 시료들에 관한 측정치 사이의 표준 편차를 구한다.

실시예 1: 파아지 디스플레이법을 이용한 항체의 생산

인간 항-ErbB3 항체(본원에서는 Ab #6, Ab #3, Ab #14, Ab #17 및 Ab #19라고 칭함)를 얻기 위해서, 인간 공여자로부터 얻어진 면역글로불린 서열의 독특한 조합을 포함하는 인간 Fab-파아지 라이브러리[Hoet 외 다수, 상동]를 처음에 ErbB3 결합제에 대해 스크리닝한다.

정제된 ErbB3과 표면 ErbB3을 발현하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주를 사용하여, (상기에 기재된 방법 또는 그의 작은 변화를 사용하여 얻은) 라이브러리로부터 73개의 독특한 Fab 서열을 동정한다. 이후 상기 73개의 클론들을, 파아지만을 제외한 Fab로서 재구성한다. 고 처리량 법을 이용하여, 상기 Fab을 소규모로 발현시키고, ELISA 및 플렉스칩(FLEXCHIP) 방법(즉, 고 처리량 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술)을 이용하여, 결합 여부에 대해 테스트한다. 파아지가 제거된 73개의 Fab을 칩 표면상에 찍은 다음, 결합 동력학 및 ErbB3-his 융합 표적 단백질 또는 ErbB3-Fc 단백질(R & D Systems)에 대한 에피토프 차단율을 측정한다. 얻어진 데이터로부터 Fab에 대한 평형 결합 상수 및 온/오프 비율을 계산한다.

그 다음, 약 500nM의 Fab와 염소 항-인간 알렉사 647 2차 항체의 1:750배 희석액을 사용하여, MALME-3M 세포에 다양한 Fab가 결합하는지 여부를 관찰한다. 도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이, 상기에 기재된 방법 또는 그의 작은 변화를 사용하여 얻은 데이타는, 몇몇 후보 Fab는 감지할 수 있을 정도로 MALME-3M 세포를 염색시킨다는 것을 나타낸다.

실시예 2: 항- ErbB3 Fab 의 최적화

ErbB3 리간드, 헤레귤린과 ErbB3의 결합을 차단한 Fab을 동정한 다음, Fab의 VH 및 VL 서열을 다음과 같이 코돈-최적화한다.

IgG1 또는 IgG2 아형으로 발현되도록 하는 발현 구조물을 이용하여 VH 및 VL 부위를 재구성한다. 이 구조물은 적당한 중쇄 서열 및 경쇄 서열 치환용으로 디자인된 카세트를 보유하는 셀렉시스(SELEXIS) 골격을 포함한다. 셀렉시스 벡터는 CMV 프로모터와 매칭 폴리-A 신호를 포함한다.

(상기에 기재된 방법 또는 그의 작은 변화를 사용하여 얻은) Ab #6의 코돈-최적화 VH 및 VL에 대한 핵산 서열을 각각 서열 번호 25 및 서열 번호 26에 제시하며, Ab #3에 대한 핵산 서열은 각각 서열 번호 27 및 서열 번호 28에 제시한다(도 22 참조).

실시예 3: ErbB3 에 대한 결합 친화도

2개의 독립된 기술 즉, MALME-3M 세포를 이용하는 세포 결합 분석법 및 표면 플라스몬 공명 분석법(Surface Plasmon Resonance Assay)을 사용하여, 항-ErbB3 항체의 해리 상수를 측정한다.

표면 플라스몬 공명 분석법

문헌[Wassaf 외 다수 (2006) Analytical Biochem., 351:241-253]에 개시된 바와 같이, 표면 플라스몬 공명 분석법(예를 들어 FLEXCHIP 분석법)을, 분석물로서 재조합 ErbB3 및 리간드로서 대상체 항체를 사용하여 재조합 BIACORE 3000 기기 등에서 실질적으로 수행한다. 공식 K_D = K_d/K_a를 바탕으로 하여 K_D 값을 계산한다.

상기에 기재된 방법 또는 그의 작은 변화를 사용하는 표면 플라스몬 공명 분석법을 이용하여 측정된 Ab #6 및 Ab #3에 대한 각각의 K_D 값을 도 2a 및 도 2b에 도시한다. Ab #6는 약 4nM의 K_D 값을 나타내며, Ab #3는 약 8nM의 K_D 값을 나타낸다. 또한, 표면 플라스몬 공명은, Ab #6가 ErbB3에 결합하기 위해 HRG와 경쟁한다는 것을 설명한다.

세포 결합 분석법

Ab #6 및 Ab #3에 대한 K_D 값을 측정하기 위한 세포 결합 분석법을 다음과 같이 수행한다.

실온에서 5분 동안, 2mL의 트립신-EDTA + 2mL의 RPMI + 5mM의 EDTA를 이용하여 MALME-3M 세포를 탈착시킨다. 완전한 RPMI(10mL)를 트립신 처리된 세포에 즉시 첨가하고, 이를 서서히 재현탁시켜, 탁상용 벡맨(Beckman) 원심 분리기에서 원심 분리시킨다(1100rpm, 5분). 세포를 BD 염색 완충액(PBS + 2% FBS + 0.1% 아지드화 나트륨, 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))에, 2×10⁶개 세포/mL의 농도로 재현탁하고, 50㎕의 분취액(1×10⁵개 세포)을 96-웰 적정 평판에 도말한다.

BD 염색 완충액 중 200nM 항-ErbB3 항체(Ab #6 또는 Ab #3) 용액 150㎕를 EPPENDORF 튜브 내에 준비하고, 이를 연속적으로 2배 희석하여 75㎕의 BD 염색 완충액을 만든다. 희석된 항체의 농도는 200-0.4nM였다. 이후, 상이한 단백질 희석 분취액 50㎕를 50uL의 세포 현탁액에 직접 첨가하여, 최종 항체 농도를 100nM, 50nM, 25nM, 12nM, 6nM, 3nM, 1.5nM, 0.8nM, 0.4nM 및 0.2nM로 만든다.

96-웰 평판 중 분취 세포를 단백질 희석액과 함께 30분 동안 실온에서 항온처리하고(플랫폼 진탕기), 이를 300㎕의 BD 염색 완충액으로 3회 세척한다. 이후, 세포를 BD 염색 완충액 중 알렉사 647-표지화 염소 항-인간 IgG의 1:750배 희석액 100㎕와 함께 항온처리한다(45분, 플랫폼 진탕기, 냉장실). 마지막으로, 세포를 2회 세척하고, 펠릿화한 다음, 250㎕ BD 염색 완충액 + 0.5㎍/mL의 요드화 프로피듐 중에 재현탁한다. FL4 채널을 이용하는, FACSCALIBUR 유동성 혈구 계측기 내에서 10,000개의 세포를 분석한다. MFI 값과 이와 상응하는 항-ErbB3-항체의 농도를 각각 y-축과 x-축에 표시하여 그래프를 작성한다. 상기 분자의 K_D 값은 비선형 회귀 곡선에 대한 1-위치 결합 모델을 이용하는, GraphPad PRISM 소프트웨어로 측정한다.

공식 Y=Bmax* X/K_D + X(Bmax = 포화시 형광도; X = 항체 농도; Y = 결합도)을 바탕으로 하여 K_D 값을 계산한다. 도 2c 및 2d에서 보여진 데이타로부터 계산된 바와 같이, Ab #6 또는 Ab #3의 K_D 값은 각각 약 4nM 및 1.3nM이고, MALME-3M 세포를 이용하는 세포 결합 분석법으로 (상기에 기재된 방법 또는 그의 작은 변화를 사용하여) 얻었다.

KinExA ® 분석

Ab #6의 결합 역학을 연구하기 위한 추가 실험에서, 역학 배제 분석 (KinExA®)을, Ab #6의 해리 및 해리속도를 측정하기 위해 사용한다. 1.43×10⁵ M^-1s^-2의 해리속도 1.10×10^-4 s^-1의 해리속도를, KinExA® 기기 (Sapidyne Instruments, Boise, ID)를 사용하여 측정했고, 해리상수 (K_d)는 769 pM인 것으로 측정된다.

실시예 4: ErbB3 에 대한 결합 특이성/ 에피토프 결합

다음과 같이 ELISA를 이용하여, Ab #6의 IgG2 아형과 ErbB3의 결합 특이성을 분석한다. Ab #6이 결합된 에피토프의 동정 결과도 분석한다.

96-웰 NUNC MAXISORB 평판을, 50㎕/웰의 5㎍/㎖의 개별 단백질로 실온에서 밤새 항원 처리으로 코팅한다. 단백질은 재조합 인간 EGFR 엑토도메인, BSA, 재조합 인간 ErbB3 엑토도메인 및 TGF-α이다. 다음날 아침, 평판을 1000㎕/웰의 PBST(0.05% Tween-20)로 3회 세척한다(BIOTEK 평판 세척기 사용). PBS중 2% BSA를 이용하여 상기 웰을 실온에서 1시간 동안 차단시키고 이전과 같이 다시 세척한다. 약 50㎕의 Ab #6을 2%의 BSA 중에 수 회 희석시킨(1μM 및 2배 연속 희석) 희석액인 PBST를 첨가한다. 모든 시료는 2개씩 준비하여 평판 상에 전개시켰으며, 이후 평판 진탕기 상에서 2시간 동안 항온처리(4℃)한다. 상기 평판을 이전과 같이 다시 세척한다. 50㎕의 인간 IgG-Fc 검출 항체(HRP 접합형 항체(Bethyl Laboratories, Inc; 2% BSA 중 1:75000배 희석, PBST)를 첨가한 다음, 평판을 실온에서 1시간 동안 항온처리한다. 이 평판을 이전과 같이 다시 세척한다. 50㎕의 SUPERSIGNAL ELISA Pico 기질을 첨가한 다음, 상기 평판을 FUSION 평판 판독기(Packard/Perkin Elmer)로 판독한다. EXCEL 프로그램을 이용하여 데이터를 분석한다. 2개씩 준비한 시료들의 측정값들을 평균내고, 이때의 에러 바는 2개의 시료들 간 표준 편차를 나타내는 것이다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 상기에 기재된 방법 및 이의 작은 변화를 사용하여 얻은 데이타는, ELISA에서 Ab #6은 재조합 ErbB3과 결합하지만, EGFR, BSA 또는 TNF-α에 대한 임의의 인식가능 결합을 보여주지 않았다는 것을 나타낸다.

성숙 ErbB3 (서열번호: 73)의 1-183 아미노산 잔기에 해당하는 ErbB3 엑토도메인 단편을 암호화하는 DNA 단편을, 효모 디스플레이 벡터인 pYD2(His 태그의 앞 부분에 종결 코돈이 조작되어 도입된 pYD1의 변형된 벡터; Inⅵtrogen(Inⅵtrogen))의 Nhe 및 BsiWI 제한 위치 사이에 클로닝한다. 이 플라스미드를 효모 균종 EBY100(Inⅵtrogen)과, Trp- 선택 배지 상에서 선택된 플라스미드를 포함하는 클론에 형질 전환시킨다. 이 클론을, 글루코스를 함유하는 배지 중에서 밤새도록 생육시키고(30℃), 이를 갈락토스-함유 배지에 옮겨 ErbB3 절단형 돌연 변이체의 발현을 유도한다(2일, 18℃). ErbB3 절단형 돌연 변이체를 디스플레이하는 효모를 50nM의 Ab #6으로 염색한 다음, 알렉사 염료-647로 표지화한 염소 항-인간 항체로 염색한다. 별도의 시료를 염소 항-인간 항체만으로 염색하여, 2차 항체와 효모는 특이적으로 결합한다는 사실을 확인한다. FACSCALIBUR 세포 분류기(BD Biosciences)) 상에서 유동성 혈구 측정법을 수행한다.

도 39에서 제공된 (상기에 기재된 방법 또는 이의 작은 변화를 사용하여 얻은) 데이타에 의해 보여진 바와 같이, Ab #6은, ErbB3 엑토도메인, 즉, 성숙 ErbB3 (서열번호: 73)의 1-183 아미노산 잔기에 결합했다.

실시예 5: 종양 세포 상의 총 ErbB3 의 하향 조절

Ab #6이 시험관 내 및 생체내(종양 세포 내)에서 ErbB3의 발현을 하향 조절하는 능력을 다음과 같이 테스트한다.

MALME-3M 세포를 96웰 조직 항원 처리 평판에 접종한 다음, 항생제, 2mM L-글루타민 및 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보강된 RPMI-1640 배지에서 생육한다(24시간, 37℃ 및 5% 이산화탄소). 이후, 배지를 동일한 배지에 대해 스위칭(switching)시켰는데, 이때, FBS를 첨가하지 않고 항체를 첨가하기도 하고(첨가하였을 경우에는, 항체 농도를 1uM, 25OnM, 63nM, 16nM, 4.0nM, 1.0nM, 24OpM, 61pM 및 15pM) 첨가하지 않기도 한다. FBS 또는 항체를 함유하지 않는 배지를 대조군으로서 사용한다. 세포를 24시간 동안 37℃에서 생육시키고(5% 이산화탄소), 이를 냉각 PBS로 세척한 다음, 15OmM NaCl, 5mM 피로인산나트륨, lOuM bpV(phen), 5OuM 페닐라신, 1mM 오소바나데이트 나트륨, 그리고 단백질 분해효소 억제제의 혼합물(cocktail)(시그마(Sigma), P2714)가 첨가된 포유동물 단백질 추출물(MPER) 용해 완충액(Pierce, 78505)을 이용하여 수집한다. PBST (0.1%의 Tween-20)에서 포함하는 인산염 완충 염수 중 4% 소 혈청 알부민으로 세포 용해물을 2배 희석한 다음, 마우스 항-인간 ErbB3 포획 항체(capture antibody)와 바이오틴화된 마우스 항-인간 ErbB3 2차 검출용 항체를 이용하여 이 세포 용해물을 ELISA 분석한다. SUPERSIGNAL ELISA Pico 화학발광 기질(Pierce, 37070)과 반응시킨 양고추냉이-퍼옥시다제에 접합한 스트렙타비딘으로 신호를 발생시킨다. 루미노미터(luminometer)를 이용하는 ELISA의 양을 평가한다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 상기에 기재된 방법 및 이의 작은 변화를 사용하여 얻은 데이타는, Ab #6은 MALME-3M 세포 내(시험관 내) 총 ErbB3 수준을 약 46.9%까지 감소시킨다(ELISA로 측정함)는 것을 나타낸다.

추가의 실험에서는, Ab #6의 IgG1 및 IgG2 아형을 이용하여, MALME-3M 세포 상에 존재하는 ErbB3 수용체가 하향 조절되는지 여부를 관찰한다(FACS 분석법). MALME-3M 세포를 15㎝의 접시 상에서 트립신 처리하고, 이를 RPMI + 10% FBS으로 1회 세척한다. 세포 펠릿은 1㎖당 1×10⁶개의 세포의 밀도로 재현탁한다. 2×10⁵개 세포의 분취액 2 가지를 12-웰 조직 항원 처리 평판에서 별개의 웰에 첨가하고, 각각을 최종 부피 800ul RPMI + 10% FBS이 되도록 재현탁한다. 하나의 웰에는 Ab #6의 IgG1 또는 Ab #6의 IgG2 아형을 첨가하여, 최종 농도 100nM이 되도록 하며(처리 시료), 다른 웰에는 동 부피의 PBS를 첨가한다(미처리 시료).

다음날, 처리 및 미처리 세포를 트립신으로 처리하고, 세척한 다음, 얼음 상에서 30분 동안 이를 100nM의 Ab #6(BD 염색 완충액 중)과 함께 항온처리한다. 세포를 1㎖의 BD 염색 완충액으로 2회 세척하고, 이를 알렉사 647-표지화된 염소 항-인간 알렉사 647의 1:500배 희석액 100ul과 함께 얼음 상에서 45분 동안 항온처리한다. 이후, 세포를 세척한 다음, 300ul의 BD 염색 완충액 + 0.5ug/㎖의 요드화프로피듐 중에 재현탁한다. 10,000개의 세포들을, FL4 채널을 이용하는 FACSCALIBUR 유동성 혈구 측정계에서 분석한다.

도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, 상기에 기재된 방법 및 이의 작은 변화를 사용하여 얻은 데이타는, Ab #6의 IgG1 및 IgG2 아형은 둘 다 MALME-3M 세포 상의 ErbB3을 각각 약 62% 및 약 66%까지 하향 조절한다는 것을 나타낸다.

이와 같은 ErbB3의 하향조절이 MALME-3M 세포 표면상에 존재하는 ErbB3 수용체의 내부화로 인한 것인지 여부를 알아보기 위해서, 세포 표면 형광 켄칭 분석을 수행한다. MALME-3M 세포를 RPMI + 10% FBS에서 6-웰 평판(0.2×10⁶개/웰) 상에 밤새 둔다. 다음날, 오래된 배지를 제거하고, 세포를, 형광 염료 Alexa 488에 접합된 100nM의 Ab #6를 함유하는 RPMI + 2% FBS에서 얼음 상에서 60분 동안 미리 항원 처리한다. 그 다음, 세포를, 37℃ 인큐베이터로 되돌리고, 0.5시간, 2시간 또는 24시간 동안 항원 처리한다. 각 시점의 말기에, 세포를 트립신으로 처리하고, PBS + 2% BSA + 0.1% 나트륨 아지드 (FACS 염색 완충액)로 세척하고, 모든 시료가 준비될 때까지 얼음 상에서 보관한다. 0 시점 동안에, 세포를 예비항원 처리 60분 후 즉시 트립신으로 처리하고, 얼음 상에서 보관한다. 세포가 모둔 시점으로부터 수집된 후, 각 시점으로부터의 시료를 2개의 튜브로 나눈다. 하나의 튜브 세트를, 25 ug/ml 항-Alexa 488 항체로 60분 동안 얼음 상에서 항원 처리하여 세포 표면 상의 임의 형광 공급원 (즉, Alexa 488 접합된 Ab #6)을 켄칭한다. 다른 튜브 세트를 켄칭 상태로 두고, 이 항원 처리 기간 동안에 얼음 상에 보관한다. 켄칭 기간 말기에서, 세포를 FACS 염색 완충액로 2회 세척하고, 300 ul FACS 염색 완충액의 최종 용적에서 재현탁시킨다. 각 시료에 대해, 10,000 이벤트를 수집하고, FACSCALIBUR 유동성 혈구 측정계에서 분석한다. 이러한 프로토콜은 (형광에 의해 측정된 바와 같은) AB #6의 비가 (각 시점에서 켄칭된 세포의 형광과 켄칭되지 않은 세포의 형광 사이의 차이에 의해 나타나는) 세포 표면 상에 어떻게 존재하는지 그리고 얼마나 많이 (켄칭된 세포의 형광의 수준에 의해 나타내는) 내재화되는 지의 표시를 제공한다.

도 6에 나타낸 바와 같이, Ab #6의 존재 하에서 ErbB3가 하향 조절되는지 여부를 0시간(도 6a), 0.5시간(도 6b), 2시간(도 6c) 및 24시간(도 6d) 경과시에 측정한다. 도 6a-6d에 나타낸 바와 같이, 세포 표면 ErbB3 수용체는 약 30분 후에 약 50%까지 하향조절되었고, 약 24시간 경과 후에 약 93%까지 하향조절된다.

Ab #6이 흑색종 세포와 같이 생체내에서 ErbB3을 하향 조절하는 능력도 다음과 같이 관찰한다.

T-세포 결핍 nu/nu 마우스(NIH 입수, 3-4주령 암컷 마우스; 이계 교배; 알비노증 소인)를 찰스 리버(Charles Rⅳer) 실험실(메사츄세츠주 윌밍톤 소재)로부터 구입한다. 이식용 MALME-3M 세포를 항원 처리액(RPMI 배지, 10% FBS, L-글루타민 및 항생제, 37℃, 5% CO₂) 중에서 항원 처리하여, 회수 전 합류도가 약 80%가 되도록 한다. 이식할 때까지 세포를 얼음 상에 보관한다. 마우스의 오른쪽 옆구리에 100ul의 MALME-3M 세포(PBS 중 3.5×10⁶ 세포)를 피하 주사하여 이 세포를 마우스에 이식하고, 초기 종양 성장에 대해 모니터하면서 회수한다.

디지털 방식의 측경 양각기를 이용하여 종양의 크기를 측정하며(길이 × 폭), 이후 마우스를 정맥 주사로 뮤린 IgG2a(시그마, M7769-5mg)로 미리 처리하여 뮤리 Fc 수용체에 의한 시험 항체의 생체내 결실을 차단한다. 마우스를, 각각이 별개로 IgG1 및 IgG2 모두 형태인, 15㎍ 또는 100㎍의 Ab #1, Ab #6, Ab #11, 및 Ab #13로 하루 걸러서 복강내 투여하며, 종양 크기는 1주일에 3회씩 측정하고, 측정치를 마이크로소프트 EXCEL 스프레드시트에 기록한다.

종양의 최종 크기(L×W)를 측정하고, CO₂로 마우스를 질식시켜 안락사시킨 다음, 종양을 절개하며, 이와 같이 절개한 종양을 액체 질소 중에서 스냅 동결(snap frozen)시킨 후, -80℃에 보관한다(생화학적 분석용). 최종 종양 크기를 측정하여 분석한 다음, 그 결과를 예를 들어, 문헌[Burtrum 외 다수, (2003) Cancer Res., 63:8912-8921]에 개시한 바와 같이, 종양 표면적과 종양 부피 간의 그래프로 나타나 있다. 이 데이터를 또한 종양 부피 및 종양 표면적에 대해 "정규화" 수단과 "비정규화" 수단으로 분석한다. 이 데이터를 "정규화"하기 위하여, 각각의 측정 시점에서 각 그룹에 속하는 각각의 종양을 초기 종양 크기별로 나누었다(측경 양각기를 이용하여 측정함).

도 7에 나타낸 바와 같이, PBS를 대조군으로서 사용했고, 이 이종이식편 모델에서 시험된 다양한 항체는 IgG2 아형에서 Ab #11 및 IgG1와 IgG2 모두 아형에서 각각의 Ab #1, Ab #6 및 Ab #13을 포함했다. 이들 중에서, Ab #6 만이 전체 ErbB3의 상당한 하향조절을 야기했고, 효과는 Ab #6의 IgG1 또는 IgG2 아형 버젼을 종양에 주사한 다음 24시간 경과시 보였다.

추가의 실험에서, Ab #6이 AdrR 이종이식편 내 ErbB3을 하향 조절하는 능력을 생체내 관찰한다.

요약하면, 시료를 냉동 분쇄기(cryopulverizer)(코바리스 인코포레이티드) 내에서 미분쇄한다. 종양을 특수 주머니에 보관하였는데(종양을 넣기 전에 이 주머니의 중량을 미리 측정함), 사용하는 동안 이를 액체 질소 내에 넣었다. 소형 종양의 경우, 처음에 200㎕의 용해 완충액을 종양을 넣어둔 주머니에 가하고, 이를 액체 질소에 넣어 냉동시킨 후, 미분쇄하여 주머니로부터의 종양 회수 능을 개선시킨다. 미분쇄된 종양을 2㎖들이 EPPENDORF 튜브로 옮긴 다음, 용해시킬 때까지 액체 질소 중에 넣었다. 종양을 단백질 분해 효소와 포스파타제 억제제로 보강된 용해 완충액 중에서 용해한다. 용해 완충액을 종양 분취액에 첨가하여 최종 농도 62.5㎎/㎖가 되도록 한다. 종양 시료를 30초 동안 와류시킨 후, 30분 동안 얼음 상에 방치하여, 이 시료를 균질화한다. 용해물을 QIAGEN QIASHREDDER 컬럼 내에서 10분 동안 회전시켜, 이 시료를 추가로 균질화한다. 투명한 용해물을 새 튜브에 분액화하여 넣었다.

상기 재료와 방법 섹션에 실질적으로 제시된 바와 같이 BCA 분석법을 수행한다.

ErbB3의 전체 수준을 ELISA로 측정한다. 상기 ELISA 시약은 R&D Sysetms로부터 구입한다(DUOSET 키트). 96-웰 NUNC MAXISORB 평판을 50㎕의 각 포획 항체로 코팅한 다음, 이를 실온에서 밤새도록 항온처리한다. 다음날 아침, 평판을 BIOTEK 평판 세척기 중에서 1000㎕/웰의 농도의 PBST(0.05% Tween-20)로 3회 세척한 다음, 이 평판을 실온에서 PBS중 2% BSA를 사용하여 1시간 동안 차단시킨다. 이후, 상기 평판을 이전과 같이 다시 세척한다. 50㎕의 세포 용해물과 표준 물질을 50% 용해 완충액 및 1% BSA 중 희석하며; 이때 모든 시료는 2개씩 준비한다. 평판들을 평판 진탕기(4℃) 상에서 2시간 동안 항온처리하고, 이를 이전과 같이 다시 세척한다. 50㎕의 검출 항체를 2%의 BSA 중에 희석시키고, 여기에 PBST를 첨가한 다음, 이를 실온에서 1시간 동안 항온처리한다. 상기 평판을 이전과 같이 다시 세척한다. 약 50㎕의 스트렙타비딘-HRP를 첨가한 다음, 이를 실온에서 30분 동안 항온처리한다. 상기 평판을 이전과 같이 다시 세척한다. 약 50㎕의 SUPERSIGNAL ELISA Pico 기질을 첨가하고, 퓨젼 평판 판독기로 판독한다. Microsoft EXCEL을 이용하여 상기 데이터를 분석한다. 2개씩 준비된 시료들의 측정값을 평균 내고, 에러 바를 사용하여 2개씩 준비한 시료들의 측정값 사이의 표준 편차를 구한다.

이 실험 결과를 도 8에 나타나 있다. 도 8에 도시한 바와 같이, Ab #6은 AdrR 이종이식편 내에서(생체내에서) ErbB3을 하향 조절한다.

실시예 6 : 종양 세포 증식의 억제

Ab #6이, ErbB3을 발현하는 세포(예를 들어, 암 세포)의 세포 내 증식을 억제하는 능력을 다음과 같이 관찰한다.

MALME3M, ACHN 및 NCI/AdrR 세포를 96웰 조직 항원 처리 평판에 접종하고, 이를 항생제, 2mM L-글루타민 및 10% FBS이 보강된 RPMI-1640 배지 중에서 생육시킨다(24시간, 37℃ 및 5% 이산화탄소). 이후, 배지를, 1uM, 25OnM, 63nM, 16nM, 4.OnM, 1.OnM, 24OpM, 61pM 및 15pM) 농도에서 Ab #6의 존재 또는 부재에서 FBS 없이 항생제와 2mM의 L-글루타민을 포함하는 RPMI-1640 배지에 대해 스위칭시킨다. 첨가하지 않기도 한다. 세포를 96시간 동안 37℃에서 생육시키고(5% 이산화탄소), 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)　 발광 세포 생존능 분석법(Luminescent Cell Viability Assay; 프로메가(Promega), G7573)으로 수집하여, 이를 루미노미터로 분석한다. 혈청과 항체를 함유하지 않는 배지를 대조군으로 사용한다.

도 9, 도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 상기에 기재된 방법 및 이의 작은 변화를 사용하여 얻은 데이타는, Ab #6이 ErbB3을 발현하는, MALME-3M 세포(도 9), AdrR 난소암 세포(도 10) 및 ACHN 세포(도 11)의 증식을 억제한다는 것을 나타낸다. 특히, Ab #6은 MALME-3M 세포의 증식을 약 19.6%까지 억제하며[CellTiter Glo® 분석법 이용], AdrR 난소암 세포의 증식은 약 30.5%까지 억제한다. 또한, 도 11에 나타낸 바와 같이, Ab #6은 ACHN 세포의 증식을 약 25.4%까지 억제한다.

실시예 7: 종양 세포 내 ErbB3 인산화의 억제

Ab #6이, ErbB3의 인산화를 생체내에서 억제하는 능력을 다음과 같이 관찰한다.

이 시료를 상기 실시예 5(즉, 도 8에 관한 실시예)에 기재된 바와 같이 실질적으로 미분쇄한다. 상기 재료 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 BCA 분석법을 실질적으로 수행하며, ELISA 분석법은 도 8에 관한 실시예인 실시예 5에 제시된 바와 같이 실질적으로 수행한다.

(상기에 기재된 방법 또는 이의 작은 변화를 사용하여 얻은) 이 실험의 결과를 도 12에 나타나 있다. 도 12에 도시한 바와 같이, Ab #6은 생체내 AdrR 난소 이종이식편 내 ErbB3의 인산화를 상당 수준 억제한다[인산화된 ErbB3 (pErbB3)의 양에 의해 측정, 총 단백질 양(ng/㎎)].

Ab #6에 의한 BTC 또는 HRG 유도된 ErbB3 인산화의 억제는 다음과 같이 시험관내에서 시험된다.

Ab #6과 함께 난소 AdrR 세포를 30분 동안 예비 항온처리한 다음, 이를 50mM BTC, 10mM HRG 또는 333nM TGF로 자극한다. 예비 항온처리 후, 상기 배지를 제거하고, 세포를 50nM BTC 또는 333nM TGF-α로 자극한다(5분, 37℃ 및 5% CO2). HRG 대조군(5분, 5nM), 10% 혈청 및 0% 혈청 대조군도 사용한다. 세포를 1×의 냉각 PBS로 세척하고, 또한 이를 얼음 상에서 30분 동안 항온처리함으로써, 30㎕의 냉각 용해 완충액(M-PER 완충액 (Pierce) + 바나듐산나트륨(NaVO4, 시그마), 2-글리세로포스페이트, 산화페닐아신, BpV 및 단백질 분해 효소 억제제) 중에서 용해시킨다. 용해물은 -80℃에서 밤새도록 보관하여 둔다.

도 13a-13c에 도시한 바와 같이, 상기에 기재된 방법 또는 이의 작은 변화를 사용하여 얻은 데이타는, Ab #6이 ErbB3의 베타셀룰린 및 헤레귤린-매개 인산화 과정을 상당 수준 억제한다는 것을 나타낸다.

추가의 실험에서, Ab #6이, 난소 종양 세포주인 OVCAR5 및 OVCAR8 내 ErbB3의 인산화 과정을 억제하는 능력은 다음과 같이 관찰한다.

OVCAR5 및 OVCAR8 세포주는 미국 국립 암 협회, 암 치료 및 진단과("DCTD")로부터 입수한다. ELISA는 상기 재료 및 방법에 관한 섹션에 기술된 바와 같이 실질적으로 수행된다.

(상기에 기재된 방법 또는 이의 작은 변화를 사용하여 얻은) 본 실험의 결과는 도 14a 및 14b에 나타나 있다. 인용된 바와 같이, Ab #6은 OVCAR5 및 OVCAR8 난소 암 세포주 둘 다에서 ErbB3의 인산화를 억제한다.

전술한 바와 같이, Ab #6은 ErbB3의 베타셀룰린-매개 인산화 과정을 억제한다. ErbB3의 베타셀룰린-매개 인산화 과정이 ErbB1 또는 ErbB3을 통해서 진행되는지 여부를 관찰하기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행한다.

AdrR 세포 또는 MALME-3M 세포(1×10⁵)를 25μM의 항-ErbB3 Ab #6 또는 25μM의 세툭시맙(항-ErbB1)와 함께 50㎕의 BD 염색 완충액 중에서 예비 항온처리한다(30분, 얼음 상). 30분 경과 후, 400nM 바이오틴화 BTC 50㎕를 세포에 첨가하고, 이것들을 얼음 상에서 30분 더 항온처리한다. 이로써 항체의 최종 농도는 12.5μM을 산출하고, 이때의 BTC 최종 농도는 200nM였다. 이후, 세포를 500㎕의 BD 염색 완충액으로 2회 세척한 다음, 이를 BD 염색 완충액 중에서 스트렙타비딘-PE(PE = 피코에리트린)(Inⅵtrogen)의 1:200배 희석액 100㎕와 함께 45분 동안 항온처리한다. 마지막으로, 세포를 2회 세척한 다음, 이를 300㎕의 BD 염색 완충액 중에 재현탁시키고, FACSCALIBUR 유동성 혈구 측정계로 분석한다. 양성 대조군인, 1×10⁵개의 AdrR 또는 MALME-3M 세포를 200nM BTC와 함께 얼음 상에서 30분 동안 항온처리하고, 세척한 다음, 이를 스트렙타비딘-PE의 1:200배 희석액과 함께 45분 동안 항온처리한다. 스트렙타비딘-PE 접합체로부터 배경 염색률(background staining)을 평가하기 위하여, 세포를 스트렙타비딘-PE의 1:200배 희석액 100㎕만으로 항온처리한다.

(상기에 기재된 방법 또는 이의 작은 변화를 사용하여 얻은) 본 실험의 결과를 도 15a-15c에 도시한다. 도 15a에 도시한 바와 같이, BTC은 ErbB1 음성 MALME-3M 세포와 거의 결합하지 않는다. 그러나, 도 15b와 15c에 도시한 바와 같이, BTC는 ErbB1 양성 AdrR 세포에 결합함을 알 수 있다.

또한, 도 15b 및 15c에 도시한 바와 같이, ErbB1에의 결합은 세툭시맙 (Erbitux®), 즉, EGFR에 특이적으로 결합하는 항-EGFR 항체로서, EGF 유사 리간드와 EGFR이 결합함을 입증하는 대조군으로서 포함된 항체에 의해 차단된다[예를 들어, Adams 외 다수(2005), Nature Biotechnology 23, 1147-1157].

실시예 8: 종양 세포 내 헤레귤린 -매개 신호 전달 과정의 억제

Ab #6이, 헤레귤린-매개 종양 세포의 신호 전달 과정을 억제하는 능력은 다음과 같이 관찰한다.

MALME-3M 세포 및 OVCAR8 세포를 96웰 조직 항원 처리 평판(35,000 세포/웰)에 따로따로 접종하고, 이를 항생제, 2mM L-글루타민 및 10% FBS이 보강된 RPMI-1640 배지 중에서 생육시킨다(24시간, 37℃ 및 5% 이산화탄소). 세포를 37℃ 및 5% 이산화탄소 하에서 24시간 동안, 항생제와 2mM L-글루타민을 포함하는 RPMI-1640 배지 내에서 혈청 결핍 상태(serum starⅵng)로 둔다. 세포를 항-ErbB3 항체(Ab #6의 IgG2 아형)를 사용하거나 사용하지 않고 30분 동안 예비 처리하였는데, 항체를 사용하였을 경우에는, 항체의 농도를 1μM, 25OnM, 63nM, 16nM, 4.OnM, 1.OnM, 24OpM, 61pM 및 15pM으로 하고, 이후, 37℃ 및 5% 이산화탄소 하에서 5nM HRG로 10분 동안 자극한다. 대조군은 첨가된 항체 및 미처리 세포 없는 HRG이다 (HRG도 Ab도 없음). 세포를 냉각 PBS로 세척한 다음, 이를, 150mM NaCl, 5mM 피로인산나트륨(Sigma, 221368-100G), 10uM bpV(phen)(Calbiochem, 203695), 50μM 옥소페닐아르신(Calbiochem, 521000), 1mM 오소바나데이트나트륨(Sigma, S6508-10G), 그리고 단백질 분해 효소 억제제의 혼합물(Sigma, P2714)을 함유하는, 포유동물 단백질 추출물(M-PER) 용해 완충액(Pierce, 78505)으로 수집한다. 세포 용해물을 PBST(0.2% tween-20) 중 4% 소 혈청 알부민으로 2배 희석시킨 다음, ELISA를 이용하여 이를 ErbB3 또는 AKT(ErbB3의 하류 효과기)의 인산화에 대해 분석한다.

AKT 인산화에 대해 테스트하기 위하여, 용해물을 ELISA 평판 상에서, AKT에 대해 특이적인 포획 항체 및, 포스포-AKT (pAKT))의 포스포-세린 473에 대해 특이적인 바이오틴화 검출용 항체와 함께 전개시킨다. SUPERSIGNAL ELISA Pico 화학발광 기질(Pierce, 37070)과 반응한 양 고추 냉이-퍼옥시다제에 접합된 스트렙타비딘으로 신호를 발생시킨다. ErbB3 인산화에 관해 분석하기 위하여, 용해물을, ErbB3에 특이적인 포획 항체와, 양 고추 냉이-퍼옥시다제에 접합된 항-인산화티로신 검출 항체와 함께 ELISA 평판 상에서 전개시킨다. 이후, 이것들을 동일한 화학발광 기질과 반응시킨다. 루미노미터를 사용하여 ELISA 상의 형광 신호를 측정한다.

(상기에 기재된 방법 또는 이의 작은 변화를 사용하여 얻은) 도 16a 및 16d에서 제공된 데이타에 의해 보여진 바와 같이, Ab #6은 MALME-3M 세포 및 OVCAR8 세포 내 헤레귤린-매개 신호 전달 과정의 잠재적인 억제 인자였다[ErbB3 (도 16a) 및 AKT(도 16b)의 인산화가 감소한 것으로 판단함]. 주목할 점은, Ab #6에 의한 AKT 및 ErbB3 각각의 인산화의 본질적으로 완전한 억제가 관찰된다.

실시예 9: 난소, 전립선 및 췌장 종양의 성장 억제

생체내 Ab #6의 효능을 평가하기 위하여, 인간 암의 몇몇 이종이식편 모델을 누드 마우스(nude mouse)내에서 확립하며, 종양의 성장이 억제되는지 여부는 Ab #6를 다수 회 투여함으로써 평가한다. 예를 들어, 이종이식편에 관한 연구를 위해서, T-세포 결핍 nu/nu 마우스(3-4주령 암컷 마우스, NIH 입수; 이계 교배; 알비노증 소인)를 찰스 리버 실험실(메사츄세츠주 윌밍톤 소재)로부터 구입한다. 이식용 AdrR 세포를 항원 처리액(RPMI 배지, 10% FBS, L-글루타민 및 항생제, 37℃, 5% CO₂) 중에서 항원 처리하여, 회수 전 합류도가 약 85%가 되도록 한다. 이식할 때까지 세포를 얼음 상에 보관한다. 마우스의 오른쪽 옆구리에 100㎕의 AdrR 세포 (PBS 중 6×10⁶)를 피하 주사하여 이 세포를 마우스에 이식하고, 초기 종양 성장에 대해 모니터하면서 회수한다.

디지털 방식의 측경 양각기를 이용하여 종양의 크기를 측정하며(길이 × 폭), 이후 마우스에 IgG2a(시그마, M7769-5MG)를 투여한다(정맥 내 주사). 항체 #6을 마우스에 하루 걸러서 복강 내 투여하며(30㎍ 또는 300㎍), 이때 종양 크기는 1주일에 3회씩 측정한 후, 마이크로소프트 EXCEL 스프레드시트에 기록한다.

종양의 최종 크기(L×W)를 측정하고, CO₂로 마우스를 질식시켜 안락사시킨 다음, 종양을 절개하며, 이와 같이 절개한 종양을 액체 질소 중에서 스냅 동결시킨 후, -80℃에 보관한다(생화학적 분석용). 최종 종양 크기를 측정하여 분석한 다음, 그 결과를 문헌[Burtrum 외 다수, 상동]에 개시한 바와 같이, 종양 표면적과 종양 부피의 관계의 그래프로 나타나 있다. 이 데이터를 또한 종양 부피 및 종양 표면적에 대해 "정규화" 수단과 "비정규화" 수단으로 분석한다. 이 데이터를 "정규화"하기 위하여, 각각의 측정 시점에서 각 그룹에 속하는 각각의 종양을 초기 종양 크기별로 나누었다(측경 양각기를 이용하여 측정함).

3가지의 인간 종양 세포주 즉, AdrR(난소), Du145(전립선) 및 OvCAR8(난소) 데이타의 상이한 모델로부터의 (상기에 기재된 방법 또는 이의 작은 변화를 사용하여 얻은) 데이터를 도 17a-17c에 도시하며, Colo357 (췌장) 이종이식편에 관한 연구 데이타는 도 17d에 도시한다. 이들 도면 각각에서, 우측 패널은 Ab #6의 특정 복용량에서 달성될 혈청 수준을 보여주고, 좌측 패널은 상이한 처리에 의한 종양 용적 변화를 보여준다. 이와 같은 연구를 통해 얻어진 데이터를 통하여, 300ug의 Ab #6을 3일에 한 번씩 투여하면(Q3d), 종양의 성장이 상당 수준 억제됨을 알 수 있다[연구 중 다수의 시점, p < 0.05]. 뿐만 아니라, 투여량을 600ug으로 증가시켰을 때(Q3d), Du145 전립선 암 모델과 신장 (ACHN) 및 췌장암 이종 (COLO357) 이종이식편 모델에서 Ab #6의 이와 같은 억제 효과는 더욱 상승한다. 그러나, 투여량을 1500ug으로 더욱 증가시키면(Q3d), 효능은 증가하지 않았는데(OvCAR8 - 도 17c; COLO357 - 도 17d), 이는 곧, 종양 성장 억제에 대한 포화량이 600ug임을 말해주는 것이다. 이와 같은 연구에 사용된 동물들로부터 얻어진 혈청의 약물 동태학(PK)적 분석 결과를 통하여, Ab #6의 혈청 중 보유율이 투여량에 의존적으로 증가함이 입증된다. 이와 유사하게, 이와 같이 상이한 연구에 사용된 Ab #6의 종양 내 수준을 생화학적으로 분석한 결과, 총 종양 용해물 1ug당 Ab #6의 양은 투여량에 따라서 약 0-6pg임을 알 수 있다.

실시예 10: 종양 세포 상에서의 ErbB3 과 ErbB3 리간드의 결합 억제

추가의 실험에서, ErbB3 리간드와 ErbB3의 결합을 억제하되, EGFR과 EGF 유사 리간드의 결합은 억제하지 않는 Ab #6 및 Ab #3의 특이성을 다음과 같이 관찰한다.

하나의 실험에서, Ab #6과 Ab/Fab #3이 헤레귤린과 ErbB3의 결합을 억제하는 능력을 관찰하기 위하여, ErbB3 리간드(예를 들어, 헤레귤린 및 에피레귤린)와 ErbB3의 결합을 억제하는 Ab #6 및 Ab #3의 Fab형(Ab/Fab #3)의 특이성을 관찰한다.

MALME3M 세포(1×10⁵)를, 50㎕의 BD 염색 완충액 중에서 10μM의 항-ErbB3 항체(예를 들어, Ab #6 또는 Ab/Fab #3)와 함께 항온처리한다(30분, 얼음 상). 30분 경과한 후, 50㎕의 바이오틴화된 헤레귤린 EGF(40nM)를 세포에 첨가하고, 이를 얼음 상에서 10분 더 항온처리한다. 이로써, 항체의 최종 농도는 5μM로, 그리고 헤레귤린 EGF의 최종 농도는 20nM로 산출한다. 이후, 세포를 500㎕의 BD 염색 완충액으로 2회 세척한 다음, 스트렙타비딘-PE(PE = 피코에리트린)(Inⅵtrogen)의 BD 염색 완충액 중 1:200배 희석액 100㎕와 함께 항온처리한다(45분). 마지막으로, 세포를 2회 세척하고, 이를 300㎕의 BD 염색 완충액 중에 재현탁한 후, FACSCALIBUR 유동성 혈구 계측기 중에서 분석한다. 양성 대조군으로서, 1×10⁵개의 MALME3M 세포를 20nM의 헤레귤린 EGF와 함께 얼음 상에서 항온처리하고(10분), 2회 세척한 다음, 45분 동안 스트렙타비딘-PE의 1:200배 희석액과 함께 항온처리한다. 스트렙타비딘-PE 접합체로부터 백 그라운드 염색률을 측정하기 위하여, 1×10⁵개의 MALME3M 세포를 스트렙타비딘-PE의 1:200배 희석액 100㎕와만 항온처리한다(45분).

(상기에 기재된 방법 또는 이의 작은 변화를 사용하여 얻은) 본 실험의 결과를 도 18a와 18b에 나타나 있다. 도 18a와 18b에 도시한 바와 같이, Ab #6과 Ab/Fab #3은 헤레귤린과 ErbB3의 결합을 억제할 수 있다.

이와 유사하게, Ab #6이 기타 ErbB3-리간드인 에피레귤린과 ErbB3의 결합을 억제하는 능력은 다음과 같이 관찰한다.

AdrR 세포(1×10⁵)를, 50㎕의 BD 염색 완충액 중에서 25μM의 항-ErbB3 항체, Ab #6, 또는 25μM의 항-ErbB3 항체 세툭시맙, 또는 첨가된 항체(대조군) 없이 예비 항온처리한다(30분, 얼음 상). 30분이 경과한 후, 50㎕의 바이오틴화된 Epi(2μM)를 세포에 첨가하고, 이를 얼음 상에서 30분 더 항온처리한다. 이로써, 항체의 최종 농도는 12.5μM로, 그리고 Epi의 최종 농도는 1μM로 산출한다. 이후, 세포를 500㎕의 BD 염색 완충액으로 2회 세척한 다음, 스트렙타비딘-PE(PE = 피코에리트린, 형광 단백질)(Inⅵtrogen)의 BD 염색 완충액 중 1:200배 희석액 100㎕와 함께 항온처리한다(45분). 마지막으로, 세포를 2회 세척하고, 이를 300㎕의 BD 염색 완충액 중에 재현탁한 후, FACSCALIBUR 유동성 혈구 계측기 중에서 분석한다. 양성 대조군으로서, 1×10⁵개의 AdrR 세포를 1μM의 Epi와 함께 얼음 상에서 항온처리하고(30분), 2회 세척한 다음, 45분 동안 스트렙타비딘-PE의 1:200배 희석액과 함께 항온처리한다. 스트렙타비딘-PE 접합체로부터 백 그라운드 염색률을 측정하기 위하여, 상기 세포를 스트렙타비딘-PE의 1:200배 희석액 100㎕와 항온처리한다(45분).

(상기에 기재된 방법 또는 이의 작은 변화를 사용하여 얻은) 본 실험의 결과를 도 19a 및 19b에 나타나 있다. 도 19a에 도시한 바와 같이, 에피레귤린은 ErbB3 양성 AdrR 세포에 결합한다. 뿐만 아니라, 도 19b에 도시한 바와 같이, 이와 같은 결합은 세툭시맙 및 Ab #6에 의해 억제되었는데, 이는 곧, 에피레귤린이 EGFR과 ErbB3 둘 다와 결합할 수 있음을 시사하는 것이다.

Ab #6이 EGF 유사 리간드(예를 들어, HB-EGF)와 종양 세포의 결합을 억제할 수 있는지 여부를 관찰하기 위하여 추가의 실험을 수행한다.

AdrR 세포(1×10⁵개)를 25μM의 Ab #6 또는 25μM의 세툭시맙(대조군)와 함께 50㎕의 BD 염색 완충액 중에서 예비 항온처리한다(30분, 얼음 상). 30분 경과 후, 400nM의 바이오틴화된 HB-EGF 50㎕를 세포에 첨가하고, 이를 얼음 상에서 30분 더 항온처리한다. 이로써, 항체의 최종 농도는 12.5μM로, 그리고 HB-EGF의 최종 농도는 200nM로 산출한다. 이후, 세포를 500㎕의 BD 염색 완충액으로 2회 세척하고, 이를 스트렙타비딘-PE(PE = 피코에리트린)(Inⅵtrogen)의 BD 염색 완충액 중 1:200배 희석액 100㎕와 함께 항온처리한다(45분). 마지막으로, 세포를 2회 세척하고, 이를 300㎕의 BD 염색 완충액 중에 재현탁한 후, FACSCALIBUR 유동성 혈구 계측기 중에서 분석한다. 양성 대조군으로서, 1×10⁵개의 AdrR 세포를 200nM의 HB-EGF와 함께 얼음 상에서 항온처리하고(30분), 2회 세척한 다음, 45분 동안 스트렙타비딘-PE의 1:200배 희석액과 함께 항온처리한다. 스트렙타비딘-PE 접합체로부터 백 그라운드 염색률을 측정하기 위하여, 상기 세포를 스트렙타비딘-PE의 1:200 배 희석액 100㎕와만 항온처리한다(45분).

(상기에 기재된 방법 또는 이의 작은 변화를 사용하여 얻은) 도 20에서 나타나 있는 데이타에 의해 보는 바와 같이, HB-EGF는 AdrR 세포, 아마 AdrR 세포 상의 ErbB1 및 ErbB4 중 하나 또는 모두에 결합한다. Ab #6은 이와 같은 결합을 억제하지 않은 것으로 보아, Ab #6이 ErbB3 리간드(예를 들어, 헤레귤린 및 에피레귤린)와 ErbB3의 결합을 특이적으로 억제함을 알 수 있다.

실시예 11: 종양 세포 내 VEGF 분비의 억제

Ab #6이 ErbB3을 발현하는 세포(예를 들어, 암 세포)의 VEGF 분비를 억제하는 능력을, 상기 물질 및 방법에서 "ELISA 분석" 하에서 기재된 바와 같이 VEGF 분비 분석법(VEGF ELISA, R&D Sysetms, DY293B)을 이용하여 관찰한다. 우선, 미처리 및 HRG 처리 MCF-7, T47D 및 COLO-357 세포 내에서 Ab #6이 VEGF 분비를 억제하는 능력을 분석한다. 도 24a에서 보여진 바와 같이, 이와 같이 연구한 결과, COLO-357 세포가 배지에 가장 다량의 VEGF를 분비하였음을 알 수 있다. 이와 같은 세포들은 또한 HRG 수준이 매우 높기 때문에, 배지에 HRG를 첨가하여도 VEGF 분비를 거의 유도하지 않는다. 이와는 반대로, HRG는 MCF-7 세포 및 T47D 세포 내에서 VEGF 분비의 배증 초과를 유도할 수 있다. 3개의 세포주 모두의 경우, Ab #6은 잠재적 억제 효능을 높은 수준으로 나타냈으며, 특히 COLO-357 세포의 경우 가장 높았다(도 24a, FU=형광 단위).

Ab #6은 또한 3가지의 상이한 이종이식편 내 VEGF의 분비를 억제함으로써 생체내 유사한 효능을 나타냈는데, 이 경우 COLO-357 이종이식편의 경우가 가장 높았다(도 24b). VEGF의 억제 여부는 ErbB3 인산화의 억제 여부와 상관성이 있다(도 24c). 골수종 세포-분비 인자 예를 들어, VEGF 및 bFGF는 신생 혈관 형성을 촉발하는 것으로 설명되었다[예를 들어, Leung 외 다수(1989) Science 246(4935): 1306-9; Yen 외 다수 (2000) Oncogene 19(31):3460-9 참조]. VEGF 분비의 억제는 또한, 종양 성잘의 촉진자인, 종양 유도된 혈관신생생성의 억제와 관련되는 것으로 당해 기술분야에 공지되어 있다.

실시예 12: 세포 이동의 억제

트랜스-웰 분석법(trans-well assay)을 통하여, Ab #6이, ErbB3을 발현하는 세포(예를 들어, MCF-7 세포)의 이동을 억제하는 능력을 관찰한다[메사츄세츠주 빌레리카 소재, 밀리포어 코포레이션(Millipore Corp.), Cat # ECM552]. 우선, MCF-7 세포를 밤새도록 혈청 결핍 조건 하에 두고, 이후, 이를 Ab #6(최종 농도 = 8uM)의 존재 또는 부재 하에서 항온처리한다(15분, 실온). 이후, 상기 세포를 세포가 이동할 수 있는, 제I형 콜라겐으로 코팅된 막으로 하부 챔버와 분리된 상부 챔버에 옮긴다. 10%의 FBS를 하부 챔버의 배지(즉, Ab #6의 존재 또는 부재 하에 화학적 유인 물질로서 작용을 하는 배지)에 첨가한다. 상기 챔버를 37℃에서 16시간 동안 항온처리한 후, 이탈 완충액을 이용함으로써, 이 막 통해 하부 챔버로 이동한 세포들을 제거하고, 세포-결합 형광 염료와 함께 항온처리한다. 형광 평판 판독기를 이용하여 형광도를 정량한다. 평균 형광도 ± SEM(n = 2)을 도 25에 나타낸다.

(상기에 기재된 방법 또는 이의 작은 변화를 사용하여 얻은) 도 25에서 제공된 데이타에서 보는 바와 같이, 10%의 FBS는 미처리 대조군(레인 1)과 비교하였을 때 세포 이동을 자극하였으며(레인 3), 8uM Ab #6은 FBS 유도 세포 이동을 억제한다(레인 4).

실시예 13: 구상체 성장의 억제

종양 성장을 진행시키는 조건과 가까운 조건의 분석법을 이용하여, ErbB3을 발현하는 세포의 구상체 성장을 억제하는 Ab #6의 능력을 조사한다(Herrmann et al. J Biomol Screen. 2008 Jan;13(1):1-8. Epub 2007 Nov 26). AdrR(난소암 세포주) 및 DU145(전립선암 세포주) 구상체를 현적법(hanging drop method)을 이용하여 96웰 플레이트의 웰당 1개의 구상체의 빈도수로 개시한다(Herrmann et al., supra). 미혼탁상태(subconfluent)의 세포를 트립신처리하고, 계수한 다음, 여과된 배지에 재현탁시킨다. 세포 농도를 100,000 세포/ml로 조정하고, 20 ul의 1 방울(2000 세포 함유)을 96-웰 플레이트의 뚜껑의 아랫면에 있는 각 링에 첨가한다. 그리고 나서, 이들 현적(hanging droplet)을 갖는 리드를, 수분을 유지하기 위해 각 웰에 100 ul의 PBS를 함유한 원래의 96-웰 플레이트 위로 다시 올려놓는다. 초기 플레이팅 4일 후, 구상체를 함유하는 현적을 새로운 96-웰 플레이트 내로 재플레이팅한다. 이 재플레이팅은 현적을 함유하는 리드를 웰당 150 ul의 배지를 함유하는 새로운 1% 아가로스/RPMI-코팅된 96-웰 플레이트로 옮기는 것을 포함한다. 그리고 나서, 상기 플레이트 및 리드를 500 rpm에서 1분간 함께 원심분리하여 구상체 함유 방울을 리드에서 웰로 옮긴다. 그리고 나서, 플레이트를 습윤 CO₂ 배양기에서 37℃에서 추가 배양한다. 구상체를 역위 위상차 현미경으로 촬영한다. 또한 동일한 배율로 마이크로미터 눈금을 촬영하여 구상체 크기를 결정한다. 구상체의 직경을 메타모프 분석 소프트웨어(Metamorph Analysis software; MDS Analytical Technologies)를 이용하여 결정한다.

이후, 상기 얻어진 각 구상체를 Ab #6(8 uM 최종 농도), 헤레굴린(heregulin)-β1 EGF 도메인(R&D Systems, 396-HB, 3.4 nM 최종 농도), 또는 둘의 병용으로 처리한다. 상기 구상체의 직경을 1일 및 13일에 광학 현미경(10X 대물렌즈)을 이용하여 측정한다.

도 26A 및 26B에 나타난 데이터(전술한 방법 또는 이의 약간의 변형을 이용하여 얻음)는 Ab #6이 AdrR 세포에서 구상체 성장을 억제한다는 것과, 3.4nM HRG가 구상체 성장을 자극하는 반면 Ab #6는 HRG 효과를 억제한다는 것을 보여준다(도 26B). 도 26C에 나타난 데이터(전술한 방법 또는 이의 약간의 변형을 이용하여 얻음)는 DU145로부터 유래된 구상체가 실험 13일 동안 크기가 증가하지 않지만, HRG에 의해 성장이 현저히 자극받는다는 것을 보여준다. 이들 세포에서, 8uM Ab #6는 HRG 유도된 구상체 성장을 억제한다.

추가 실험에서, 또 다른 난소암 세포주인 OVCAR8 세포의 구상체 성장을 억제하는 Ab #6의 능력을 조사한다. 다세포성 종양 구상체를 위와 같이 제조한다. 구상체 성장에 대한 Ab #6의 효과를 시험하기 위해, 상기 항체를 구상체 형성의 1일 및 4일에 25 μg/m1의 최종 농도로 첨가한다. 전술한 방법 또는 이의 약간의 변형을 이용하여 얻은 데이터는 Ab #6가 OVCAR8 구상체 면적의 30-40% 감소를 야기하였음을 보여주었다.

실시예 14: 신호 전달의 억제

Ab #6이, 상이한 리간드에 의해 유도되는 신호 전달 과정을 억제하는 능력에 대해 관찰한다. 예를 들어, Ab #6이, ErbB3 수용체를 발현하는 AdrR 세포와 HRG 및 BTC의 결합에 비치는 영향력을 테스트한다. 도 27a 및 27b에서 제공된 FACS 분석 결과에 의해 보여진 바와 같이, Ab #6은 AdrR 세포와의 결합에 대해 HRG와 경쟁하되, BTC와는 경쟁하지 않는다. 그러므로, Ab #6은 (하기 실험에 의해 나타난 바와 같이) HRG 유도 신호전달을 활성화하지 않기 때문에, Ab #6에 의한 ErbB3에 대한 HRG 결합의 차단은 HRG에 의해 유도되는 신호 전달을 억제할 것이다.

다양한 리간드를 대상으로 ErBb3 인산화의 유도에 대해 테스트한다. 적어도 3개의 리간드 즉, HRG, BTC 및 HGF는 AdrR 세포 내에서 ErbB3 유도성 인산화 과정을 자극할 수 있었던 반면에, EGF는 그렇지 못한다. 도 28에 도시한 바와 같이, Ab #6은 AdrR 세포 내에서 HGF 유도성 ErbB3 인산화 과정을 억제한다. 뿐만 아니라, 당 업계에 공지된 바와 같이[예를 들어, Wallenius 외 다수 (2000) Am J Pathol. 156 (3):821-9], HGF 신호 전달률은 다양한 상피 종양 및 비-상피 종양에서 상승하였음이 보고되었다.

ErbB3 /c- MET 상호 작용 및 이와 같은 상호 작용을 조정함에 있어서 Ab #6의 역할

EGFR 내에서 돌연 변이를 활성화하는 비-소세포 폐암은, c-MET와 HER3을 재보충하여, PI3K-AKT 세포 생존 경로를 활성화함으로써 티로신 키나제 억제 인자에 대한 내성을 발생시킴을 알 수 있었다[Engelmann 외 다수 (2007) Science 316: 1039-1043; Gou (2007) PNAS: 105(2): 692-697]. EGFR의 돌연 변이가 진행되는 세포주 내 EGFR과 c-MET 사이의 결합 관계는, 복합-면역 침전법(co-immunoprecipitation)에 의해 널리 확립되어 있다[Engelmann 외 다수 2007; Gou 2007]. 최근, 구오(Guo) 외 다수는, c-MET와 ErbB3 역시, 증폭된 c-MET에 의존성인 것으로 알려진 위 세포주인 MKN45 내에 복합체의 형태로 존재함을 입증하기 위해 복합-면역 침전법을 사용했다.

이와 같은 c-MET-ErbB3의 상호 작용은 또한 야생형 EGFR을 보유하는 AdrR 세포에서도 일어나며, 이는 증폭된 c-MET와는 독립적이다. 도 28에 도시한 바와 같이, HGF(간세포 성장 인자)는 투여량 의존적 방식으로 AdrR 세포 내 ErbB3의 인산화 과정을 유도한다. 뿐만 아니라, Ab #6은 HGF 유도성 ErbB3 인산화 과정을 억제한다.

ErbB1 및 ErbB3 인산화 과정 둘 다에 미치는 HRG 및 BTC의 효과에 관하여도 관찰하였으며, HRG와 BTC는 ErbB1과 ErbB3 둘 다의 인산화를 유도하는 것으로 밝혀졌다. HRG는 ErbB3 인산화의 보다 강력한 유도 인자인 반면에, BTC는 ErbB1 인산화의 잠재적인 유도 인자였다(도 29a). 이와 같은 인산화 과정은 ErbB1 및 ErbB3의 복합체에 의해 유도되는 것으로 판단된다. HRG가 ErbB3에 결합하면, ErbB1과 ErbB3 사이의 복합체 형성을 유도하며, 그 결과, 상기 두 수용체가 활성화되는 것이다. BTC의 경우도 동일한 현상이 관찰되는데, 이 경우, BTC와 ErbB1이 결합하면 ErbB1과 ErbB3 사이의 복합체 형성을 자극하고, 그 결과, ErbB1과 ErbB3 둘 다의 인산화를 유도하는 것이다.

HRG , BTC , EGF 및 HGF 자극된 ErbB3 인산화의 억제

다음과 같은 방법으로, Ab #6이, 리간드(HRG, BTC, EGF 및 HGF) 유도성 ErbB3 인산화 과정을 억제하는 능력을 관찰한다:

1. AdrR 세포를, 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지 중 96웰 평판에 30,000 세포/웰/100uL의 밀도로 도말한 후, 이를 밤새도록 생육시키는 단계;

2. 다음날, 상기 배지를 FBS-불포함 배지로 바꾸어 상기 세포를 혈청이 존재하지 않는 조건 하에 두고, 이 세포를 밤새도록 생육시키는 단계;

3. 세포를 상이한 농도의 Ab #6(0.01-100nM) 또는 완충액(미처리, "0")으로 예비 처리하는 단계(2시간);

4. 이후, 예비처리 및 미처리 세포를 10nM의 HRG 또는 HGF로 10분 동안 자극하거나, 또는 10nM의 BTC 또는 EGF로 5분 동안 자극하고, 미처리된 세포의 별개의 세포를 비자극된 ("대조군") 채로 두는 단계;

5. 항원 처리 배지를 제거한 다음, 이 세포를 얼음 냉각 PBS로 1회 세척하여, 상기 반응을 정지시키는 단계;

6. 이후, 상기 세포를, 1× 단백질 분해 효소 억제제 및 1× 포스파타제 억제제와 함께, 25mM Tris(pH +7.5), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1.0% Triton X-100, 1.0% CHAPS, 10% v/v 글리세롤 중에서 용해하는 단계; 및

7. 제조자의 지침에 따라서, 휴먼 포스포-ErbB3 ELISA 키트(Human Phospho- ErbB3 ELISA 키드; R&D Systems, DYC1769)을 사용하여, 세포 용해물 중에서 ErbB3 인산화 여부를 측정하는 단계.

상기에 기재된 방법 또는 이의 작은 변화에 의해 얻은 결과는 도 38a-d에 나타나 있다.

항체에 의한 ErbB2 - ErbB3 단백질 복합체 형성의 억제

AdrR 세포를 실온에서 60분 동안 완충액(대조군) 또는 250nM Ab #6과 함께 예비 항온처리한 후, 이를 10nM HRG 또는 10nM BTC 또는 대조군 완충액으로 10분 동안 처리한다. 상기 세포를, 0.2mM PMSF, 50mTU/㎖ 아프로티닌 및 100 uM 루펩틴과 함께, 25 mM Tris, pH+7.5, 15O mM NaCl, 1mM EDTA, 1.0% Triton X-100, 1.0% CHAPS, 10% v/v 글리세롤 중에서 용해한 다음, 미정제 용해물을 간단히 원심 분리하여 불용성 물질을 제거한다. 상청액을 새로운 EPPENDORF 튜브에 옮기고, 항-ErbB3 항체(Santa Cruz sc-285)를 1:500배 희석률로 첨가한다. 상청액을 4℃에서 가볍게 흔들어주면서 밤새도록 항온처리한다. 처음에, 고정화된 단백질 A/G 아가로스 비드(일리노이주 록포드 소재, Pierce, # 20421) 60ul를 1×PBS로 세척한다. 세포 용해물-항체 혼합물을 상기 PBS 세척 비드에 첨가한 다음, 이를 4℃에서 가볍게 진탕시키면서 2시간 동안 항온처리한다. 이후, 면역 침전물을 얼음 냉각 용해 완충액으로 3회 세척하고, 이를 2×SDS 시료 완충액 30ul 중에 재현탁한 다음, 다시 95℃에서 7분 동안 열 변성시키고 나서, 4-12%의 Bis-Tris 겔 상에서 전개시켰다. SDS-PAGE를 수행한 후, 10% MeOH를 함유하는 Tris-글리신 완충액 중 PVDF 막에 전기 이동시켰다. 상기 막을 10㎖의 차단 완충액 중에서 1시간 동안 차단시킨 다음[네브라스카주 링컨 소재, Li-Cor Biosciences(Li-Cor Biosciences), # 927-40000], 차단 완충액[Li-Cor Biosciences, # 927-40000] 10㎖ 중 1:1000배 희석률의 항-ErbB2 항체[메사츄세츠주 댄버사 소재, Cell Signaling Technology]와 함께 항온처리한다. 10㎖의 차단 완충액(Li-Cor Biosciences, # 927-40000) 중 염소 항-토끼 IRDye800(1:5000배(2ul))을 이용하여 신호를 검출한다.

상기에 기재된 방법 또는 이의 작은 변화에 의해, Ab #6은 HRG 자극된 ErbB2/3 복합체가 형성되는 것을 완전히 억제하는 것으로 보인다(도 29b).

실시예 15: Ab #6의 억제 프로파일이 세툭시맙 , 라파티닙 및 퍼투주맙과 다르다.

본 실시예에서는, Ab #6, 세툭시맙, 라파티닙 또는 퍼투주맙 중 어느 하나의 존재하에 HRG 또는 BTC로 자극된 AdrR 세포를 이용하여 억제제 용량 반응 연구를 수행한다. 혈청 기아 상태의 AdrR 세포를 2 mM 내지 7.6 pM의 Ab #6, 라파티닙 또는 세툭시맙, 또는 100 nM 내지 1.5 pM의 퍼투주맙의 4배 연속 희석물과 함께 30분간 전배양한 다음, 25 nM의 HRG 또는 BTC로 10분간 자극시킨다. ErbB3의 인산화를 ELISA(R&D Systems, DYC1769-5, 제조사의 프로토콜에 따름)에 의해 측정하고 IC₅₀ 값을 프리즘(Prism; GraphPad Software Inc.)을 이용하여 결정한다.

전술한 방법 또는 이의 약간의 변형을 이용하여 얻은 데이터는 하기를 보여준다:

- Ab #6는 각각 2.4 nM 및 5.9 nM의 IC₅₀으로 HRG-유도된 ErbB3 인산화 및 BTC-유도된 ErbB3 인산화 모두를 억제하였다(각각 1.5-3.8 nM 및 2.5-13.6 nM의 95% 신뢰구간을 가짐).

- 라파티닙(ErbB1 및 ErbB2의 가역적인 티로신 키나아제 억제제)은 각각 150 nM 및 360 nM의 IC₅₀으로 HRG 및 BTC-유도된 ErbB3 인산화를 억제하였다(각각 46-504 nM 및 119-1069 nM의 95% 신뢰구간을 가짐).

- 세툭시맙(항-ErbB1 항체)은 1.8 nM의 IC₅₀으로 BTC-유도된 ErbB3 인산화를 억제하였지만(0.9-3.8 nM의 95% 신뢰 구간을 가짐), 세툭시맙은 HRG-유도된 ErbB3-유도된 ErbB3 인산화를 억제하지 않았으며, 이는 HRG 신호전달이 ErbB1/ErbB3 이종이합체가 아니라 ErbB2/ErbB3에 의해 우선적으로 매개된다는 종래 관찰들이 사실임을 보여준다.

- 퍼투주맙(ErbB 리간드 복합체로의 ErbB2의 동원(recruitment)을 입체적으로 방해하는 단일클론 항체)은 3.6 nM의 IC₅₀으로 HRG-유도된 ErbB3 인산화를 억제하였지만(1.0-13.5 nM의 95% 신뢰 구간을 가짐), BTC-유도된 ErbB3 인산화를 억제하지 않았다.

따라서, Ab #6는 HRG 및 BTC 자극 모두에 대하여 낮은 나노몰의 IC₅₀ 값으로 ErbB3 인산화를 강력하게 억제할 수 있는 시험된 유일한 억제제였다.

실시예 16: Ab #6 및 기타 치료제를 이용한 병용 요법

본 실시예에서는, 이종이식편 종양 모델의 종양 성장을 억제하는데 있어서 Ab #6의 효능을 다른 치료제, 즉 엘로티닙 또는 탁솔과 병용하여 평가한다.

일차 실험에서, 누드 마우스(Charles Rⅳer Laboratories)의 옆구리에 피하로 종양을 확립하여 ACHN(신장 종양 세포주) 이종이식편 종양을 갖는 마우스를 제조한다. 상기 종양을 갖는 마우스에 차선 용량의 300 μg Ab #6 또는 비히클을 3일마다 복막내(IP)로 투여한다. 엘로티닙(25 mg/kg)은 단독으로 또는 Ab #6 처리와 병용하여 하루에 1회 경구로 투여한다. 종양 크기(길이×폭)를 일주일에 2회 측정하고 측정값을 사용하여 종양 부피를 계산한다(p/6 (L×W2). 도 30에 나타낸 데이터(전술한 방법 또는 이의 약간의 변형을 이용하여 얻음)는 Ab #6 또는 엘로티닙 단독이 종양 성장을 억제하는 반면, 병용 요법(Ab #6 및 엘로티닙)에 의한 억제가 단일 제제 단독보다 더 커서 부가적인 효과를 생성한다는 것을 입증한다.

이차 실험에서, 누드 마우스(Charles Rⅳer Laboratories)의 옆구리에 피하로 종양을 확립하여 DU145(전립선 종양 세포주) 이종이식편 종양을 갖는 마우스를 제조한다. 상기 종양을 갖는 마우스에 Ab #6(300 μg) 또는 비히클을 3일마다 복막내(IP)로 투여한다. 탁솔(20 mg/kg)은 단독으로 또는 Ab #6 처리와 병용하여 일주일에 1회 IP 투여한다. 다시, 종양 크기를 일주일에 2회 측정하고 측정값을 사용하여 종양 부피를 계산한다. 도 31에 나타낸 데이터(전술한 방법 또는 이의 약간의 변형을 이용하여 얻음)는 Ab #6 또는 탁솔 단독은 종양 성장을 억제하는 반면, 병용 요법(Ab #6 및 엘로티닙)에 의한 억제가 단일 제제보다 더 커서 부가적인 효과를 생성한다는 것을 입증한다.

실시예 17: KRAS 돌연변이 종양 세포의 성장의 억제

본 실시예에서는, KRAS 돌연변이를 포함하는 종양 세포의 성장을 억제하는 단독 또는 다른 제제와 병용한 Ab #6의 능력을 조사한다.

A549는 인간 KRAS 유전자의 코돈 12에서의 돌연변이인, G12S KRAS 돌연변이를 포함하는 폐암 세포주로서, 상기 코돈이 글리신(G)을 암호화하는 것으로부터 세린(S)을 암호화하는 것으로 바뀌어 있다. 이 세포주는 엘로티닙 또는 탁솔 단독 처리에 둔감하다. 시험관내에서 A549 세포의 성장을 억제하는 Ab #6 단독의 능력을 시험하기 위해, 상기 세포를 다세포성 종양 구상체로 성장시킨 다음(2000 세포/구상체/96 웰 플레이트의 웰), 7일간 0, 0.001, 0.01, 0.1 또는 1 μM Ab #6로 처리한다. 상기 구상체의 면적을 1일 및 7일에 메타모프(METAMORPH) 소프트웨어를 이용하여 4x 배율 하에서 측정하고 구상체 면적의 백분율 변화를 계산한다((초기 면적 - 최종 면적 / 초기 면적×100). 결과(전술한 방법 또는 이의 약간의 변형을 이용하여 얻음)가 도 32A의 그래프(그래프의 x축의 "-4"는 "0" 용량에 해당함) 및 도 32B의 사진에 나타나 있다. 도 32A의 데이터는 Ab #6 처리 단독이 시험관내 KRAS 돌연변이 A549 종양 세포의 성장을 억제하는데 충분하다는 것과, Ab #6 농도의 표시된 10배 증가함에 따라 구상체 면적의 백분율 감소와 관련하여 1차 용량 반응이 존재함을 입증한다. 대표적인 구상체의 사진이 도 32B에 나타나 있다. 처리되지 않은 구상체는 7일에 약 5% 성장하는 반면 1 μM Ab #6으로 처리된 구상체의 크기는 35% 감소하였다.

생체내에서 KRAS 돌연변이 A549 세포의 성장을 억제하는 Ab #6 단독의 능력을 시험하기 위해, A549 피하 이종이식편 종양을 갖는 누드 마우스에 3일마다 600 μg의 Ab #6를 처리한 다음, 종양 부피를 측정한다. 결과(전술한 방법 또는 이의 약간의 변형을 이용하여 얻음)가 도 32C의 그래프에 나타나 있으며, 도 32는 Ab #6 처리 단독에 의한 현저한 종양 성장 억제를 보여주며, 종양 성장은 22일에 투여가 중지된 이후 유지된다. 따라서, Ab #6 단독은 생체내에서 KRAS 돌연변이 종양 세포의 성장을 억제할 수 있었다.

생체내에서 KRAS 돌연변이 A549 세포의 성장을 억제하는, 엘로티닙 또는 탁솔과 병용된 Ab #6의 능력을 시험하기 위해, A549 피하 이종이식편 종양을 갖는 누드 마우스에 하기를 처리한다: (i) 3일마다 300 μg의 Ab #6 단독; (ⅱ) 매일 25 mg/kg 엘로티닙 단독; (ⅲ) 7일마다 20 mg/kg 탁솔 단독; (ⅳ) Ab #6 및 엘로티닙 병용(동일한 용량으로); 또는 (v) Ab #6 및 탁솔 병용(동일한 용량으로). 엘로티닙 실험 및 탁솔 실험 결과(전술한 방법 또는 이의 약간의 변형을 이용하여 얻음)가 도 33A 및 33B에 나타나 있다. 두 가지 실험 결과들은 KRAS 돌연변이 A549 이종이식편이 엘로티닙 또는 탁솔 단독 처리에 둔감하다는 것과, KRAS 돌연변이 이종이식편의 성장이 Ab #6 처리 단독에 의해 억제된다는 것과, 엘로티닙 또는 탁솔 처리와 Ab #6 처리의 병용이 Ab #6 단독 요법시 관찰되는 것보다 훨씬 더 큰 종양 성장 억제를 야기하였음을 입증한다.

실시예 18: ErbB3 에 결합하는 Ab #6의 에피토프 맵핑

본 실시예에서는, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발법(mutagenesis)을 사용하여 Ab #6이 결합하는 ErbB3 내의 에피토프를 맵핑하였다.

Ab #6가 ErbB3에 대한 HRG 결합을 억제하므로, ErbB3의 세포외 도메인(엑토도메인(ectodomain)) 내의 예측되는 HRG 결합 부위, 및 특히 ErbB3의 엑토도메인의 도메인 I에 집중하여 알라닌 돌연변이유발 분석을 개시한다. 잔기가 돌연변이된 것을 선별하는 것을 돕기 위해, TGFα와 복합체화된 EGFR의 결정 구조(Garret et al. (2002) Cell 110:763-773)를 모델로서 사용하였는데, HRG와 복합체된 ErbB3의 결정 구조를 이용할 수 없었기 때문이다. ErbB3 및 EGFR은 구조면에서 유사하며, 따라서 상호작용하는 잔기들이 동일하지 않더라도 그 구조 성분들(특정 루프 또는 나선면)은 동일해야 한다. 따라서, 상기 Garret et al에 기술된 바와 같이 리간드 결합과 연관된 것으로 명시된 EGFR 내의 잔기들이 확인되며 ErbB3 및 EGFR의 서열 정렬은 대응하는 ErbB3 잔기들을 밝혀낸다. 리간드 결합 부위 이외에도, ErbB3 엑토도메인의 도메인 I의 다른 면들이 가이드로서 ErbB3의 결정 구조를 이용하여 돌연변이된다(Cho and Leahy (2002) Science 297:1330-1333).

따라서, 하기 ErbB3 점 돌연변이가 만들어진다: L14A, N15A, L17A, S18A, V19A, T20A, N25A, K32A, L33A, V47A, L48A, M72A, Y92A, Y92P, D93A, M101A, L102A, Y104A, Y104P, N105A, T106A, Y129A, Y129P, K132A, Q59A, T77A, Q90A, Q114A, Q119A, R145A, R151A, V156A, H168A, K172A 및 L186A. 표준 한 글자 아미노산 약자를 사용하는 이 표기법에서, L14A는, 예를 들어, 성숙한 ErbB3 (서열번호 73)의 아미노산 위치 14에 있는 류신(L)이 알라닌(A)으로 특이적으로 돌연변이됨을 가리키며, 다른 치환 돌연변이도 동일한 방식으로 나타나 있다. 돌연변이유발은 본 기술분야에 공지된 표준 방법을 이용하여 이루어지며, ErbB3 돌연변이는, ErbB3 엑토도메인 도메인 I의 문맥 내에서, 본 기술분야에 공지된 표준 방법을 이용하여 효모 세포의 표면상에서 발현된다. 모든 돌연변이는 야생형 ErbB3 도메인 I과 동일한 수준으로 효모의 표면에서 잘 발현된다. 효모에서의 ErbB3 도메인 I 돌연변이의 발현은 재조합 단백질을 일차 정제하지 않고 FACS를 이용하여 돌연변이에 대한 Ab #6의 결합을 조사할 수 있게 한다.

단일 돌연변이를 포함하는 ErbB3 엑토도메인 도메인 I 단편에 대한 Ab #6의 결합은 표준 FACS 분석에 의해 결정된다. 상기 돌연변이가 일반적으로 ErbB3 구조를 불안정하게 하지 않는다는 것을 확인하기 위해, Ab #6가 결합된 에피토프와 중첩되지 않는 ErbB3 상의 에피토프에 결합하는, 이차 항-ErbB3 항체(SGP1; LabVision)(ErbB3에 대한 결합을 위한 경쟁의 결핍에 의해 입증됨)를 대조군으로 사용한다. 따라서, 두 가지 항체의 결합에 영향을 미치는 ErbB3 돌연변이들이 추가의 특성평가에서 제외된다. FACS 분석을 위해, 표면상에 ErbB3 도메인 I의 상이한 돌연변이 형태를 발현하는 효모 세포를 Ab #6(이후 이차 항체로서 염소 항-인간 Ab-Alexa 488에 의해 표지됨) 및 SGP1-Alexa 647로 동시에 표지한다. 데이터(전술한 방법 또는 이의 약간의 변형을 이용하여 얻음)는 전술한 알라닌 점 돌연변이 중 4개가 ErbB3 엑토도메인 도메인 I에 대한 Ab #6 결합을 억제하는 반면 대조군 항-ErbB3 항체(SGP1)의 결합을 억제하지 않음을 보여준다. 이들 4개의 돌연변이는 다음과 같다: D93A, M101A, L102A 및 Y104A.

Ab #6 에피토프가 성숙한 ErbB3 (서열번호 73)의 잔기 93, 101, 102 및 104를 포함한다는 것을 더 확인하기 위해, 이들 4개의 돌연변이(D93A, M101A, L102A, Y104A)를 CHO K1 세포내로 적절히 형질감염시킨 다음 이 문맥에서 이들의 효과를 조사하기 위해 전장의 성숙한 ErbB3의 문맥 내에서 발현시킨다. 야생형 전장 ErbB3을 발현하는 CHO K1 세포가 양성 대조군의 역할을 한다. 각 돌연변이에 대하여 고발현 클론을 선별하고 표준 FACS 분석을 위해 Ab #6 또는 SGP1 중 어느 하나(ErbB3의 적절한 폴딩을 확인하기 위함)로 표지한다. SGP1을 Alexa 647 염료로 직접 표지하고 Ab #6을 Alexa 488 염료로 직접 표지한다.

결과(전술한 방법 또는 이의 약간의 변형을 이용하여 얻음)가 도 34A-34E에 나타나 있으며, 상기 도면들은 각각 야생형 ErbB3, D93A 돌연변이, M101A 돌연변이, L102A 돌연변이 또는 Y104A 돌연변이에 대한 SGP1 또는 Ab #6의 결합을 보여준다. 상기 결과들은 대조군 항-ErbB3 항체(SGP1)가 4개의 모든 돌연변이에 결합할 수 있는 반면, Ab #6은 본질적으로 상기 돌연변이 중 3개(D93A, L102A 및 Y104A)에 결합하지 않고 4번째 돌연변이(M101A)에 대해 단지 최소한의 결합을 나타냄을 입증한다. 따라서, 전장 ErbB3 CHO 세포 발현 실험은 ErbB3 상의 Ab #6 에피토프가 서열번호 73에 나타낸 성숙한 인간 ErbB3 서열의 잔기 93, 101, 102 및 104를 포함한다는 것을 입증한다. 이들 4개의 잔기는 ErbB3 내의 5 스탠드 평행 베타-시트의 가닥 3에 위치한다. 유사한 방식으로 수행된 추가 실험들은 상기 에피토프가 서열번호 73에 나타낸 성숙한 인간 ErbB3 서열의 잔기 92, 99 및 129를 추가로 포함한다는 것을 보여주는 데이터를 생성하였다. 따라서, Ab #6가 결합한 에피토프는 서열번호 73의 성숙한 인간 ErbB3 서열의 잔기 92-104 및 129(폴딩된 단백질 내의 92-104에 인접해 있음)에 걸쳐 있는 서열을 포함하는 것으로 여겨질 수 있다.

실시예 19: PI3K 돌연변이 종양 세포의 성장의 억제

본 실시예에서는, PI3K 돌연변이를 포함하는 종양 세포의 성장을 억제하는, 단독 또는 다른 제제와 병용된 Ab #6의 능력을 조사한다.

SKOV3(SKOV-3)은 PI3K 발현을 상향조절하는 돌연변이를 포함하는 난소암 세포주이다. 생체내에서 PI3K 돌연변이 SKOV3 세포의 성장을 억제하는 Ab #6 단독의 능력을 시험하기 위해, SKOV3 피하 이종이식편 종양(150-200 mm³의 종양 부피)을 갖는 누드 마우스에 3일마다 600 μg의 Ab #6를 처리한 다음, 종양 부피를 측정한다. 상기 결과(전술한 방법 또는 이의 약간의 변형에 의해 얻음)가 도 35A의 그래프에 나타나 있으며, 상기 결과는 Ab #6 처리 단독이 부분적인 종양 성장 억제를 야기함을 입증한다. 본 실험에서, 약 30일의 종양 성장의 "정체기(lag phase)"가 비히클-처리된 마우스에서도 관찰되었고, 이는 이 종양이 생체내에서 느리게 성장함을 보여준다. 그럼에도 불구하고, 비히클 처리된 마우스와 비교하여 Ab #6 처리된 마우스에서의 30일 후 종양 부피의 감소는 Ab #6 처리 단독이 생체내에서 PI3K 돌연변이 종양 세포의 성장을 억제할 수 있음을 입증한다.

생체내에서 PI3K 돌연변이 SKOV3 세포의 성장을 억제하는, 시스플라틴과 병용된 Ab #6의 능력을 시험하기 위해, SKOV3 피하 이종이식편 종양을 갖는 누드 마우스에 하기를 처리한다: (i) 3일마다 300 μg의 Ab #6 단독 (차선 용량의 Ab #6); (ⅱ) 1.5 mg/kg 시스플라틴 (CDDP) 단독; 또는 (ⅲ) Ab #6 및 시스플라틴 병용(동일한 용량으로). 전술한 Ab #6 단일요법 실험에서 30일 "정체기"가 관찰되었음을 고려할 때, 병용 실험에서 Ab #6의 투여는 30일 정체기가 경과한 이후까지 시작하지 않는다. 병용요법 실험에 대한 결과(전술한 방법 또는 이의 약간의 변형을 이용하여 얻음)가 도 35B에 나타나 있다. 상기 결과들은 Ab #6 및 시스플라틴 단독 모두가 SKOV3 이종이식의 성장을 억제할 수 있다는 것과, 병용 처리가 제제 단독보다 훨씬 더 큰 종양 성장 억제를 야기하였음을 입증하며, 이로써 시스플라틴과 같은 이차 치료제와 결합시 Ab #6의 향상된 효과를 입증한다.

실시예 20: Ab #6의 파라토프 맵핑

본 실시예에서는, 항체의 단쇄(scFv) 형태를 이용하여 Ab #6의 파라토프 맵핑을 수행한다. 이러한 scFv 형태(서열번호 72)에서, V_H 영역(서열번호 1) 및 V_L 영역(서열번호 2)이 (G4S)₃ 링커(서열번호 72의 아미노산 123-137; 상기 링커 서열은 또한 서열번호 74에 나타나 있음)와 연결되어 있고, 이 scFv는 ErbB3에 특이적으로 결합하는 능력을 여전히 보유하고 있다. 이 포맷을 사용하여 CDR 루프에서 알라닌 (및 일부 경우 페닐알라닌) 치환 돌연변이의 ErbB3 결합에 미치는 효과를 조사한다.

Ab #6의 CDR 루프 내의 어떠한 잔기가 표면 노출되는지 예측하기 위해, Ab #6의 결정 구조가 아직 실험적으로 결정되지 않았기 때문에, 두 개의 매우 상동인 항체의 결정 구조를 조사하였다. Ab #6에 가장 상동인 것으로 보이는, 결정 구조가 이용가능한 항체는, V_H 사슬의 경우 1mhp(항-알파1 인테그린, Karpusas et al ., J. Mol . Biol. 327:1031 (2003))이고 V_L 사슬의 경우 1mco(Guddat et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA 90:4271 (1993))이다. Ab #6의 CDR 루프가 하기 표 1에 나타나 있으며, 돌연변이를 위해 선택된 잔기들이 볼드체와 밑줄로 강조되어 있다. 또한, 1mhp 항체의 V_H CDR 서열 및 V_L CDR 서열이 표 1에 나타나 있으며, 각 CDR에 대한 서열번호 다음에 Ab #6 대비 아미노산 불일치의 개수가 괄호로 나타나 있고, 표면 잔기들이 이탤릭체, 볼드체 및 밑줄로 강조되어 있다.

[표 1]

Ab #6에서 이뤄진 돌연변이들이 하기 표 2에 요약되어 있다. 돌연변이에 대한 아미노산 잔기 번호매기기는, 카바트(Kabat) 번호매기기가 아닌, scFv 포맷 내의 V_H 및 V_L 잔기의 선형 번호매기기에 해당한다. 표기법 Thr28Ala는 scFv의 아미노산 위치 28에 있는 트레오닌(Thr)이 알라닌(Als)으로 특이적으로 돌연변이됨을 가리키며, 상기 치환 돌연변이의 나머지들도 동일한 방식으로 표시된다.

[표 2]

표 2에 나타난 바와 같이, Phe과 Tyr이 구조적으로 매우 유사하므로(예컨대, 둘다 방향족임) 상기 돌연변이가 항원 결합에 대하여 덜 분열을 일으킬 것으로 예측되기 때문에 티로신 잔기가 페닐알라닌으로 돌연변이되는 것을 제외하면, 모든 돌연변이는 알라닌에 대한 것이다. CDR 내에 이뤄진 돌연변이 외에도, CDR 밖의 중쇄 잔기 28 및 30 역시 CDR 루프 영역에 속하기 때문에 돌연변이된다(표 2에서 돌연변이 M1 및 M2). 모든 돌연변이는 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 이루어지며 ErbB3에 대한 돌연변이의 결합은 본 기술분야에 알려진 표준 스크리닝 기술을 이용하여 시험한다.

도 36에 나타난 바와 같이, 몇 가지 돌연변이들은 단백질 A에 대한 scFv의 결합(결합이 CDR을 수반하지 않음)을 변형시키는 것보다 ErbB3 도메인에 대한 scFv의 결합에 우선적으로 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 이들의 본질 및 효과(도 36에 나타난 세 가지 그룹화에 기초함)가 하기 표 3에 나타나 있다. "결합에 대한 효과 없음"은 ErbB3에 대한 결합이 실질적으로 영향을 받지 않는다는 것 또는 scFv 단백질의 불안정화로 인한 단백질 A에 대한 결합에 상응하는 감소가 존재한다는 것을 가리킨다. 결합 잔기의 대다수는 H1, H2 및 H3 루프에 위치하며 일부는 L1 및 L3 루프에 위치한다. 다른 많은 항체 항원 복합체에서 관찰된 바와 같이, L2 CDR은 결합에 직접 기여하지 않는다.

[표 3]

표 3에 나타난 결과에 기초하여, 중쇄 및 경쇄 CDR 각각에 대한 공통 서열을 도출하였다. 이들 공통 서열이 도 37a 및 37B의 야생형 CDR 서열 아래에 나타나 있다. 상기 공통 서열은, 알라닌으로 돌연변이되어 있고 결합에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 확인된 그 아미노산 잔기가 그 위치에 있는 임의의 아미노산(Xaa)을 허용하도록 일반화되었다는 점에서 야생형 CDR 서열과 상이하다. 또한, 방향족 페닐알라닌으로의 돌연변이는 결합에 영향을 미치지 않았지만 알라닌으로의 돌연변이는 결합에 영향을 미친, 방향족 티로신 잔기를 함유하는 아미노산 위치의 경우, 방향족 아미노산 티로신, 히스티딘, 트립토판 및 페닐알라닌 중 어느 하나가 도 37a에 나타낸 공통 서열 내의 상기 위치에 허용되는 반면, 도 37b에 나타난 공통 서열에서 상기 아미노산 위치가 티로신 또는 페닐알라닌인 것이 허용된다.

나아가, 표 3에 나타낸 결과에 기초하여, 각 중쇄 및 경쇄 CDR에 대한 파라토프 서열이 도출되었다. 이들 파라토프 서열이 도 37a 및 37B의 야생형 및 공통 CDR 서열 아래에 나타나 있다. 상기 파라토프 서열은, 알라닌으로 돌연변이되는 경우 ErbB3에 대한 결합을 실질적으로 감소시키는 것으로 나타난 CDR 내의 상기 아미노산 잔기 위치에 해당하며, 이는 이로써 항원 결합에 있어서 이들 위치에 대한 실질적인 역할을 제시한다. 또한, 방향족 페닐알라닌으로의 돌연변이는 결합에 영향을 미치지 않았지만 지방족 알라닌으로의 돌연변이는 결합에 영향을 미친, 방향족 티로신 잔기를 함유하는 아미노산 위치의 경우, 도 37a에서 방향족 아미노산 티로신, 히스티딘, 트립토판 및 페닐알라닌 중 어느 하나(또는 대안적으로 도 37b에서 티로신 및 페닐알라닌)가 파라토프 내의 각각의 상기 위치에 허용된다. 항원 결합에 직접 관여하지 않는 것으로 보이는 CDR 내의 다른 아미노산 위치들이 파라토프 내의 임의의 아미노산 잔기(Xaa)인 것이 허용된다.

Ab #6에 대한 야생형 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 또한, 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같고, Ab #6에 대한 야생형 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 또한, 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같다. Ab #6 공통 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 또한, 서열번호: 60 및 75 (CDR1), 61 (CDR2) 및 62 (CDR3)에서 각각 보여진 바와 같고, Ab #6에 대한 공통 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 또한, 서열번호: 66 및 77 (CDR1), 67 (CDR2) 및 68 및 79 (CDR3)에서 각각 보여진 바와 같다. Ab #6에 대한 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 파라토프 서열은 또한, 서열번호: 63 및 76 (CDR1), 64 (CDR2) 및 65 (CDR3)에서 각각 보여진 바와 같고, Ab #6에 대한 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 파라토프 서열은 또한, 서열번호: 69 및 77 (CDR1), 70 (CDR2) 및 71 및 80 (CDR3)에서 각각 보여진 바와 같다.

균등 범위

당업자는 통상의 실험을 통하여, 본원에 개시된 본 발명의 특정 구체예에 관한 다수의 균등물을 파악하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이와 같은 균등 범위는 이하 청구의 범위에 포함되는 것이다. 종속항에 개시된 구체예를 임의로 조합한 것도 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 간주한다.

참고 문헌의 인용

본원에 언급된 각각 및 모든 미국 특허 및 외국 특허 및 계류중인 특허 출원들의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> SCHOEBERL, BIRGIT NIELSEN, ULRIK FELDHAUS, MICHAEL <120> ANTIBODIES AGAINST THE ECTODOMAIN OF ERBB3 AND USES THEREOF <130> MMJ-022PC <140> <141> <150> <151> <160> 80 <170> PatentIn Ver. 3.5 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr 20 25 30 Val Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Gly Trp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Leu Lys Met Ala Thr Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr 20 25 30 Asn Val Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Ile Ile Tyr Glu Val Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser 85 90 95 Ser Ile Phe Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 3 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr 20 25 30 Asn Met Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ala Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 4 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asp Ser Asn Ile Gly Arg Asn 20 25 30 Tyr Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Ile Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Glu Tyr His Cys Gly Thr Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 5 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly His Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Leu Glu Thr Gly Leu Leu Val Asp Ala Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 6 Gln Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Tyr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Gln Leu Gly Ser Lys Phe Val 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Met Tyr 35 40 45 Lys Asp Lys Arg Arg Pro Ser Glu Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Ile 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Tyr Val 85 90 95 Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 His Tyr Val Met Ala 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 8 Ser Ile Ser Ser Ser Gly Gly Trp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Gly Leu Lys Met Ala Thr Ile Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr Asn Val Val Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Glu Val Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Cys Ser Tyr Ala Gly Ser Ser Ile Phe Val Ile 1 5 10 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Ala Tyr Asn Met Arg 1 5 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Val Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ala Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Ser Gly Ser Asp Ser Asn Ile Gly Arg Asn Tyr Ile Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Gly Thr Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Pro Val 1 5 10 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Ala Tyr Gly Met Gly 1 5 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly His Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Val Leu Glu Thr Gly Leu Leu Val Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Ser Gly Asp Gln Leu Gly Ser Lys Phe Val Ser 1 5 10 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Tyr Lys Asp Lys Arg Arg Pro Ser 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Tyr Val 1 5 <210> 25 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 25 gaggtgcagc tgctggagag cggcggaggg ctggtccagc caggcggcag cctgaggctg 60 tcctgcgccg ccagcggctt caccttcagc cactacgtga tggcctgggt gcggcaggcc 120 ccaggcaagg gcctggaatg ggtgtccagc atcagcagca gcggcggctg gaccctgtac 180 gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcac caggggcctg 300 aagatggcca ccatcttcga ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357 <210> 26 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 26 cagtccgccc tgacccagcc cgccagcgtg agcggcagcc caggccagag catcaccatc 60 agctgcaccg gcaccagcag cgacgtgggc agctacaacg tggtgtcctg gtatcagcag 120 caccccggca aggcccccaa gctgatcatc tacgaggtgt cccagaggcc cagcggcgtg 180 agcaacaggt tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgaccat cagcggcctg 240 cagaccgagg acgaggccga ctactactgc tgcagctacg ccggcagcag catcttcgtg 300 atcttcggcg gagggaccaa ggtgaccgtc cta 333 <210> 27 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 27 gaggtgcagc tgctggaaag cggcggaggg ctggtgcagc caggcggcag cctgaggctg 60 tcctgcgccg ccagcggctt caccttcagc gcctacaaca tgagatgggt gcggcaggcc 120 ccaggcaagg gcctggaatg ggtgtccgtg atctacccca gcggcggagc caccagatac 180 gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caggggctac 300 tactactacg gcatggacgt gtggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354 <210> 28 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 28 cagagcgtgc tgacccagcc cccaagcgcc agcggcaccc caggccagag ggtgaccatc 60 agctgcagcg gcagcgacag caacatcggc aggaactaca tctactggta tcagcagttc 120 cccggcaccg cccccaagct gctgatctac aggaacaacc agaggcccag cggcgtgccc 180 gacaggatca gcggcagcaa gagcggcacc agcgccagcc tggccatcag cggcctgaga 240 agcgaggacg aggccgagta ccactgcggc acctgggacg acagcctgag cggcccagtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 29 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 29 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct gcttacggta tgggttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcca tactaagtat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagtactg 300 gaaactggct tattggttga tgcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 tcaagc 366 <210> 30 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 30 cagtacgaat tgactcagcc accctcagtg tccgtgtacc caggacagac agccagcatc 60 acctgctctg gagatcaatt ggggagtaaa tttgtttcct ggtatcagca gaggccaggc 120 cagtcccctg tgttggtcat gtataaagat aaaaggcggc cgtcagagat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctata 240 gatgaggctg actattattg tcaggcgtgg gacagcagca cttatgtctt cggcactggg 300 accaaggtca ccgtccta 318 <210> 31 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 31 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cattacgtta tggcttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctcttctt ctggtggctg gactctttat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acagccgtgt attactgtac tagaggtctc 300 aagatggcta caatttttga ctactggggc cagggcaccc tggtcaccgt ctcaagc 357 <210> 32 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 32 cagagcgctt tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagcag tgatgttggg agttataatg ttgtctcctg gtaccaacaa 120 cacccaggca aagcccccaa actcatcatt tatgaggtca gtcagcggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgacaat ctctgggctc 240 cagactgagg acgaggctga ttattactgc tgctcatatg caggtagtag tattttcgtg 300 atattcggcg gagggaccaa ggtgaccgtc cta 333 <210> 33 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 33 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct gcttacaata tgcgttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttctgtt atctatcctt ctggtggcgc tactcgttat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggtac 300 tactactacg gtatggacgt ctggggccaa ggcaccctgg tcaccgtctc aagc 354 <210> 34 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 34 cagagcgtct tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcgtgttctg gaagcgactc caacatcgga agaaattata tatattggta ccagcaattc 120 ccaggaacgg cccccaagct cctcatctat aggaataatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgaatct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgagta tcactgtgga acatgggatg acagcctgag tggtccggta 300 ttcggcggag ggactaagct gaccgtccta 330 <210> 35 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 35 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ile Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Asn Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asp 20 25 30 Ser Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Phe Arg Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Ala Asn Ala Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 37 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 37 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Gly Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Gly Ser Ser Gly Gly Pro Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Gly Arg Gly Thr Pro Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 38 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 38 Gln Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Arg Trp 20 25 30 Asn Ile Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 39 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Trp Tyr Gly Met Gly 1 5 <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ile Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Leu Asn Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val 1 5 <210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asp Ser Leu Asn 1 5 10 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Gln Gln Ser Ala Asn Ala Pro Phe Thr 1 5 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Arg Tyr Gly Met Trp 1 5 <210> 46 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 46 Tyr Ile Gly Ser Ser Gly Gly Pro Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Gly Arg Gly Thr Pro Tyr Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 <210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 48 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Arg Trp Asn Ile Val Ser 1 5 10 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 50 Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Trp Val 1 5 10 <210> 51 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 51 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr 20 25 30 Asn Val Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser 85 90 95 Ser Ile Phe Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 52 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 52 Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asp 20 25 30 Ser Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Phe Arg Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Ala Asn Ala Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Arg 100 105 <210> 53 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 53 Gln Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Arg Trp 20 25 30 Asn Ile Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 54 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Arg Tyr Thr Met Ser 1 5 <210> 55 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Thr Ile Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 57 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Ser Ser Tyr Glu Gly Ser Asp Asn Phe Val 1 5 10 <210> 60 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Tyr, Phe, Trp or His <400> 60 Xaa Xaa Val Met Ala 1 5 <210> 61 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(5) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Thr or Ala <400> 61 Ser Ile Xaa Xaa Xaa Gly Gly Trp Xaa Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Any amino acid <400> 62 Gly Leu Xaa Met Ala Thr Ile Phe Xaa Tyr 1 5 10 <210> 63 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Tyr, Phe, Trp or His <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(5) <223> Any amino acid <400> 63 Xaa Xaa Val Xaa Xaa 1 5 <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(7) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Thr or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(17) <223> Any amino acid <400> 64 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(10) <223> Any amino acid <400> 65 Xaa Leu Xaa Met Xaa Thr Ile Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 66 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(5) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Tyr, Phe, Trp or His <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Any amino acid <400> 66 Thr Gly Xaa Xaa Xaa Asp Val Gly Xaa Xaa Xaa Val Val Ser 1 5 10 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(5) <223> Any amino acid <400> 67 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Ser 1 5 <210> 68 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Tyr, Phe, Trp or His <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(8) <223> Any amino acid <400> 68 Cys Ser Xaa Ala Gly Xaa Xaa Xaa Phe Val Ile 1 5 10 <210> 69 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(5) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(9) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Tyr, Phe, Trp or His <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(14) <223> Any amino acid <400> 69 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa 1 5 10 <210> 70 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(7) <223> Any amino acid <400> 70 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 71 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(2) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Tyr, Phe, Trp or His <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(11) <223> Any amino acid <400> 71 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 72 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 72 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr 20 25 30 Val Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Gly Trp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Leu Lys Met Ala Thr Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro 130 135 140 Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr 145 150 155 160 Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr Asn Val Val Ser Trp Tyr Gln 165 170 175 Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Ile Ile Tyr Glu Val Ser Gln 180 185 190 Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn 195 200 205 Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp 210 215 220 Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser Ser Ile Phe Val Ile Phe Gly 225 230 235 240 Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 245 <210> 73 <211> 1323 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr Leu Asn Gly 1 5 10 15 Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr Leu Tyr Lys 20 25 30 Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu 35 40 45 Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile Arg Glu Val 50 55 60 Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr Leu Pro Leu 65 70 75 80 Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp Gly Lys Phe 85 90 95 Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser His Ala Leu 100 105 110 Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser Gly Gly Val 115 120 125 Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu Cys His Met Asp Thr Ile Asp Trp 130 135 140 Arg Asp Ile Val Arg Asp Arg Asp Ala Glu Ile Val Val Lys Asp Asn 145 150 155 160 Gly Arg Ser Cys Pro Pro Cys His Glu Val Cys Lys Gly Arg Cys Trp 165 170 175 Gly Pro Gly Ser Glu Asp Cys Gln Thr Leu Thr Lys Thr Ile Cys Ala 180 185 190 Pro Gln Cys Asn Gly His Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn Gln Cys Cys 195 200 205 His Asp Glu Cys Ala Gly Gly Cys Ser Gly Pro Gln Asp Thr Asp Cys 210 215 220 Phe Ala Cys Arg His Phe Asn Asp Ser Gly Ala Cys Val Pro Arg Cys 225 230 235 240 Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu Glu Pro Asn 245 250 255 Pro His Thr Lys Tyr Gln Tyr Gly Gly Val Cys Val Ala Ser Cys Pro 260 265 270 His Asn Phe Val Val Asp Gln Thr Ser Cys Val Arg Ala Cys Pro Pro 275 280 285 Asp Lys Met Glu Val Asp Lys Asn Gly Leu Lys Met Cys Glu Pro Cys 290 295 300 Gly Gly Leu Cys Pro Lys Ala Cys Glu Gly Thr Gly Ser Gly Ser Arg 305 310 315 320 Phe Gln Thr Val Asp Ser Ser Asn Ile Asp Gly Phe Val Asn Cys Thr 325 330 335 Lys Ile Leu Gly Asn Leu Asp Phe Leu Ile Thr Gly Leu Asn Gly Asp 340 345 350 Pro Trp His Lys Ile Pro Ala Leu Asp Pro Glu Lys Leu Asn Val Phe 355 360 365 Arg Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Asn Ile Gln Ser Trp Pro 370 375 380 Pro His Met His Asn Phe Ser Val Phe Ser Asn Leu Thr Thr Ile Gly 385 390 395 400 Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Arg Gly Phe Ser Leu Leu Ile Met Lys Asn 405 410 415 Leu Asn Val Thr Ser Leu Gly Phe Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Ala 420 425 430 Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Ala Asn Arg Gln Leu Cys Tyr His His Ser 435 440 445 Leu Asn Trp Thr Lys Val Leu Arg Gly Pro Thr Glu Glu Arg Leu Asp 450 455 460 Ile Lys His Asn Arg Pro Arg Arg Asp Cys Val Ala Glu Gly Lys Val 465 470 475 480 Cys Asp Pro Leu Cys Ser Ser Gly Gly Cys Trp Gly Pro Gly Pro Gly 485 490 495 Gln Cys Leu Ser Cys Arg Asn Tyr Ser Arg Gly Gly Val Cys Val Thr 500 505 510 His Cys Asn Phe Leu Asn Gly Glu Pro Arg Glu Phe Ala His Glu Ala 515 520 525 Glu Cys Phe Ser Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Met Glu Gly Thr Ala 530 535 540 Thr Cys Asn Gly Ser Gly Ser Asp Thr Cys Ala Gln Cys Ala His Phe 545 550 555 560 Arg Asp Gly Pro His Cys Val Ser Ser Cys Pro His Gly Val Leu Gly 565 570 575 Ala Lys Gly Pro Ile Tyr Lys Tyr Pro Asp Val Gln Asn Glu Cys Arg 580 585 590 Pro Cys His Glu Asn Cys Thr Gln Gly Cys Lys Gly Pro Glu Leu Gln 595 600 605 Asp Cys Leu Gly Gln Thr Leu Val Leu Ile Gly Lys Thr His Leu Thr 610 615 620 Met Ala Leu Thr Val Ile Ala Gly Leu Val Val Ile Phe Met Met Leu 625 630 635 640 Gly Gly Thr Phe Leu Tyr Trp Arg Gly Arg Arg Ile Gln Asn Lys Arg 645 650 655 Ala Met Arg Arg Tyr Leu Glu Arg Gly Glu Ser Ile Glu Pro Leu Asp 660 665 670 Pro Ser Glu Lys Ala Asn Lys Val Leu Ala Arg Ile Phe Lys Glu Thr 675 680 685 Glu Leu Arg Lys Leu Lys Val Leu Gly Ser Gly Val Phe Gly Thr Val 690 695 700 His Lys Gly Val Trp Ile Pro Glu Gly Glu Ser Ile Lys Ile Pro Val 705 710 715 720 Cys Ile Lys Val Ile Glu Asp Lys Ser Gly Arg Gln Ser Phe Gln Ala 725 730 735 Val Thr Asp His Met Leu Ala Ile Gly Ser Leu Asp His Ala His Ile 740 745 750 Val Arg Leu Leu Gly Leu Cys Pro Gly Ser Ser Leu Gln Leu Val Thr 755 760 765 Gln Tyr Leu Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp His Val Arg Gln His Arg 770 775 780 Gly Ala Leu Gly Pro Gln Leu Leu Leu Asn Trp Gly Val Gln Ile Ala 785 790 795 800 Lys Gly Met Tyr Tyr Leu Glu Glu His Gly Met Val His Arg Asn Leu 805 810 815 Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Lys Ser Pro Ser Gln Val Gln Val Ala 820 825 830 Asp Phe Gly Val Ala Asp Leu Leu Pro Pro Asp Asp Lys Gln Leu Leu 835 840 845 Tyr Ser Glu Ala Lys Thr Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile 850 855 860 His Phe Gly Lys Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val 865 870 875 880 Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Glu Pro Tyr Ala Gly Leu 885 890 895 Arg Leu Ala Glu Val Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Ala 900 905 910 Gln Pro Gln Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Val Met Val Lys Cys 915 920 925 Trp Met Ile Asp Glu Asn Ile Arg Pro Thr Phe Lys Glu Leu Ala Asn 930 935 940 Glu Phe Thr Arg Met Ala Arg Asp Pro Pro Arg Tyr Leu Val Ile Lys 945 950 955 960 Arg Glu Ser Gly Pro Gly Ile Ala Pro Gly Pro Glu Pro His Gly Leu 965 970 975 Thr Asn Lys Lys Leu Glu Glu Val Glu Leu Glu Pro Glu Leu Asp Leu 980 985 990 Asp Leu Asp Leu Glu Ala Glu Glu Asp Asn Leu Ala Thr Thr Thr Leu 995 1000 1005 Gly Ser Ala Leu Ser Leu Pro Val Gly Thr Leu Asn Arg Pro Arg 1010 1015 1020 Gly Ser Gln Ser Leu Leu Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Met Pro Met 1025 1030 1035 Asn Gln Gly Asn Leu Gly Glu Ser Cys Gln Glu Ser Ala Val Ser 1040 1045 1050 Gly Ser Ser Glu Arg Cys Pro Arg Pro Val Ser Leu His Pro Met 1055 1060 1065 Pro Arg Gly Cys Leu Ala Ser Glu Ser Ser Glu Gly His Val Thr 1070 1075 1080 Gly Ser Glu Ala Glu Leu Gln Glu Lys Val Ser Met Cys Arg Ser 1085 1090 1095 Arg Ser Arg Ser Arg Ser Pro Arg Pro Arg Gly Asp Ser Ala Tyr 1100 1105 1110 His Ser Gln Arg His Ser Leu Leu Thr Pro Val Thr Pro Leu Ser 1115 1120 1125 Pro Pro Gly Leu Glu Glu Glu Asp Val Asn Gly Tyr Val Met Pro 1130 1135 1140 Asp Thr His Leu Lys Gly Thr Pro Ser Ser Arg Glu Gly Thr Leu 1145 1150 1155 Ser Ser Val Gly Leu Ser Ser Val Leu Gly Thr Glu Glu Glu Asp 1160 1165 1170 Glu Asp Glu Glu Tyr Glu Tyr Met Asn Arg Arg Arg Arg His Ser 1175 1180 1185 Pro Pro His Pro Pro Arg Pro Ser Ser Leu Glu Glu Leu Gly Tyr 1190 1195 1200 Glu Tyr Met Asp Val Gly Ser Asp Leu Ser Ala Ser Leu Gly Ser 1205 1210 1215 Thr Gln Ser Cys Pro Leu His Pro Val Pro Ile Met Pro Thr Ala 1220 1225 1230 Gly Thr Thr Pro Asp Glu Asp Tyr Glu Tyr Met Asn Arg Gln Arg 1235 1240 1245 Asp Gly Gly Gly Pro Gly Gly Asp Tyr Ala Ala Met Gly Ala Cys 1250 1255 1260 Pro Ala Ser Glu Gln Gly Tyr Glu Glu Met Arg Ala Phe Gln Gly 1265 1270 1275 Pro Gly His Gln Ala Pro His Val His Tyr Ala Arg Leu Lys Thr 1280 1285 1290 Leu Arg Ser Leu Glu Ala Thr Asp Ser Ala Phe Asp Asn Pro Asp 1295 1300 1305 Tyr Trp His Ser Arg Leu Phe Pro Lys Ala Asn Ala Gln Arg Thr 1310 1315 1320 <210> 74 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 74 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 75 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Tyr or Phe <400> 75 Xaa Xaa Val Met Ala 1 5 <210> 76 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Tyr or Phe <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(5) <223> Any amino acid <400> 76 Xaa Xaa Val Xaa Xaa 1 5 <210> 77 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(5) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Tyr or Phe <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Any amino acid <400> 77 Thr Gly Xaa Xaa Xaa Asp Val Gly Xaa Xaa Xaa Val Val Ser 1 5 10 <210> 78 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(5) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(9) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Tyr or Phe <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(14) <223> Any amino acid <400> 78 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa 1 5 10 <210> 79 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Tyr or Phe <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(8) <223> Any amino acid <400> 79 Cys Ser Xaa Ala Gly Xaa Xaa Xaa Phe Val Ile 1 5 10 <210> 80 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(2) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Tyr or Phe <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(11) <223> Any amino acid <400> 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 MMJ-022PC 1

Claims (25)

1. 인간 ErbB3의 엑토도메인의 도메인 I에 결합하고,
   중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
   경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부로서,
   여기서:
   상기 중쇄 CDR1 서열은 서열번호: 60 또는 75를 포함하고,
   상기 중쇄 CDR2 서열은 서열번호: 61을 포함하고,
   상기 중쇄 CDR3 서열은 서열번호: 62를 포함하고,
   상기 경쇄 CDR1 서열은 서열번호: 66 또는 77을 포함하고,
   상기 경쇄 CDR2 서열은 서열번호: 67을 포함하고,
   상기 경쇄 CDR3 서열은 서열번호: 68 또는 79를 포함하며,
   단, 상기 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아닌, 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부.
2. 서열번호: 73의 잔기 92-104를 포함하는 인간 ErbB3의 에피토프에 결합하고, ErbB3를 발현시키는 암 세포의 증식 억제를 특징으로 하며, 단, 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아닌, 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부.
3. 서열번호: 73의 잔기 92-104를 포함하는 인간 ErbB3의 에피토프에 결합하고, ErbB3를 발현시키는 암 세포의 증식 억제를 특징으로 하며, 단, 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체; (ⅳ) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #3; (v) 서열번호: 3 및 4에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; (ⅵ) 서열번호: 13, 14 및 15에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 16, 17 및 18에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체; (ⅶ) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #17; (vⅲ) 서열번호: 35 및 36에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; (ix) 서열번호: 39, 40 및 41에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 42, 43 및 44에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체; (x) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #19; (xi) 서열번호: 37 및 38에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (xⅱ) 서열번호: 45, 46 및 47에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 48, 49 및 50에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아닌, 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부.
4. 청구항 2 또는 3에 있어서, 상기 에피토프는 서열번호: 73의 잔기 129를 추가로 포함하는, 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부.
5. 청구항 2 내지 4 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 암 세포는 MALME-3M 세포, AdrR 세포, 또는 ACHN 세포이고, 상기 증식이 대조군에 비해 적어도 10%까지 감소되는, 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부.
6. 청구항 1 내지 4 중 어느 하나의 항에 있어서, 서열번호: 73의 잔기 93 (아스파라긴), 잔기 101 (메티오닌), 잔기 102 (류신) 및 잔기 104 (티로신)로부터 선택된 인간 ErbB3의 어느 하나의 아미노산 잔기가 단일 아미노산 치환을 갖는 돌연변이체 ErbB3을 생성하도록 알라닌에 의해 치환될 때, 항체 또는 이의 항원 결합부의, 서열번호: 73의 아미노산 서열 포함 인간 ErbB3에의 결합과 비교하여 항체 또는 이의 항원 결합부의 돌연변이체 ErbB3에의 결합에서 실질적 감소가 있는, 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부.
7. 청구항 6에 있어서, 결합에서의 실질적 감소는 결합의 K_D 값에서 적어도 10배 변화가 있는, 항체 또는 이의 항원 결합부.
8. 인간 ErbB3의 엑토도메인의 도메인 I에 결합하고,
   중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
   경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부로서,
   여기서:
   상기 중쇄 CDR1 서열은 서열번호: 63 또는 76을 포함하고,
   상기 중쇄 CDR2 서열은 서열번호: 64을 포함하고,
   상기 중쇄 CDR3 서열은 서열번호: 65을 포함하고,
   상기 경쇄 CDR1 서열은 서열번호: 69 또는 78을 포함하고,
   상기 경쇄 CDR2 서열은 서열번호: 70을 포함하고,
   상기 경쇄 CDR3 서열은 서열번호: 71 또는 80을 포함하며,
   단, 상기 항체는, (i) 본원에서 개시된 바와 같은 Ab #6; (ⅱ) 서열번호: 1 및 2에서 각각 보여진 바와 같은 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체; 또는 (ⅲ) 서열번호: 7, 8 및 9에서 각각 보여진 바와 같은 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열번호: 10, 11 및 12에서 각각 보여진 바와 같은 V_L CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체가 아닌, 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부.
9. 청구항 1 내지 8 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 이중특이적 항체, 또는 키메라 항체인, 항체.
10. 청구항 1 내지 8 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체의 부분인, 항원 결합부.
11. 청구항 1 내지 8 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 Fab, Fab'2, scFv, SMIP, 아피바디(affibody), 아비머(aⅵmer), 나노바디(nanobody), 및 도메인 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원 결합부.
12. 청구항 1 내지 8 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD, 및 IgE로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아형인, 항체.
13. 약제학적으로 허용가능한 담체 내에 청구항 1 내지 12 중 어느 하나의 항의 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 조성물.
14. 대상체에게 치료적 유효량의 청구항 13의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 대상체의 암의 치료 방법.
15. 청구항 14에 있어서, 상기 암은 KRAS 돌연변이 또는 PI3K 돌연변이 중 하나 또는 모두를 포함하는 세포를 포함하는 방법.
16. 청구항 14에 있어서, 상기 대상체는 인간이고, 상기 KRAS 돌연변이는 인간 KRAS 유전자의 코돈 12 또는 코돈 13의 돌연변이를 포함하는 방법.
17. 청구항 14에 있어서, 상기 대상체는 인간이고, 상기 PI3K 돌연변이는 인간 PIK3CA 유전자의 엑손 9 또는 엑손 20 내에 돌연변이를 포함하는 방법.
18. 청구항 1 내지 12 중 어느 하나의 항의 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부인 치료적 유효량의 제1 제제를 제1 제제 이외의 항암제인 치료적 유효량의 제2 제제와 병용하여 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체의 암의 치료 방법.
19. 청구항 18에 있어서, 상기 제2 제제는 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 방법.
20. 청구항 18에 있어서, 상기 제2 제제는 단백질 합성 억제제, 소마토스타틴 유사체, 면역치료제, 및 효소 억제제로부터 선택되는 방법.
21. 청구항 18에 있어서, 상기 제2 제제는 IGFIR 표적 소분자, EGFR 표적 소분자, ErbB2 표적 소분자, c-MET 표적 소분자, 항대사물질, 알킬화제, 토포아이소머라제(topoisomerase) 억제제, 미소관 표적제, 키나아제 억제제, 호르몬 치료제, 글루코코르티코이드(glucocorticoid), 아로마타제(aromatase) 억제제, mTOR 억제제, 화학요법제, 단백질 키나아제 B 억제제, 포스파티딜이노시톨 3-키나아제 억제제, 사이클린 의존성 키나아제 억제제, 및 MEK 억제제로부터 선택되는 방법.
22. 청구항 19에 있어서, 상기 제2 제제는 파니투무맙, 트라스투주맙 또는 세툭시맙인 방법.
23. 청구항 21에 있어서, 상기 제2 제제는 파클리탁셀인 방법.
24. 청구항 21에 있어서, 상기 제2 제제는 시스플라틴인 방법.
25. 청구항 21에 있어서, 상기 제2 제제는 에를로티닙 또는 라파티닙인 방법.

Images