PT1212422E - Anticorpos contra citla-4 humana e suas utilizações - Google Patents

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Alan J Korman
Edward L Halk
Nils Lonberg
Tibor P Keler
Yashwant M Deo
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Description

DESCRIÇÃO "ANTICORPOS CONTRA CTLA-4 HUMANA E SUAS UTILIZAÇÕES"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se, de um modo geral, à imunologia molecular e ao tratamento de doenças humanas. Em particular, refere-se a novos anticorpos de sequência humana contra CTLA-4 e métodos de tratamento de doenças humanas e infecções utilizando estes anticorpos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 sistema imunitário dos vertebrados requer sinais múltiplos para alcançar a activação imunitária óptima; ver, e. g.,
Janeway, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 54:1-14 (1989);
Paul William E., ed. Raven Press, N.Y., Fundamental Immunology, 4a edição (1998), particularmente os capítulos 12 e 13, páginas 411 a 478. As interacções entre linfócitos T (células T) e células apresentadoras de antigénio (APC) são essenciais para a resposta imunitária. Os níveis de muitas moléculas coesivas que se encontram nas células T e APCs aumentam durante uma resposta imunitária (Springer et ai., A. Rev. Immunol. 5:223-252 (1987);
Shaw e Shimuzu, Current Opinion in Immunology, Eds. Kindt e
Long, 1:92-97 (1988)); e Hemler, Immunology Today 9:109-113 (1988)). Níveis aumentados destas moléculas pode ajudar a explicar porque é que as APCs activadas são mais eficazes para estimular proliferação de células T específicas para o antigénio 1 do que as APCs em repouso (Kaiuchi et al., J. Immunol. 131:109-114 (1983); Kreiger et al., J Immunol. 135:2937-2945 (1985); McKenzie, J. Immunol. 141:2907-2911 (1988); e
Hawrylowicz e Unanue, J. Immunol. 141:4083-4088 (1988)). A resposta imunitária de células T é um processo complexo que envolve interacções célula-célula (Springer et al., A. Rev. Immunol. 5:223-252 (1987)), particularmente entre células T e acessórias, tais como APCs, e produção de mediadores imunitários solúveis (citocinas ou linfocinas) (Dinarello (1987) New Engl. Jour. Med 317:940-945; Sallusto (1997) J. Exp. Med. 179:1109-1118) . Esta resposta é regulada por vários receptores de superfície de células T, incluindo o complexo de receptor de células T (Weiss (1986) Ann. Rev. Immunol. 4:593-619) e outras moléculas de superfície "acessórias" (Allison (1994) Curr. Opin. Immunol. 6:414-419; Springer (1987) supra). Muitas destas moléculas acessórias são antigénios de diferenciação de superfície celular (CD) que ocorrem naturalmente definidos pela reactividade de anticorpos monoclonais na superfície das células (McMichael, Ed., Leukocyte Typing III, Oxford Univ. Press, Oxford, N.Y. (1987)).
Estudos anteriores sugeriram que a activação de linfócitos B requer dois sinais (Bretscher (1970) Science 169:1042-1049) e agora crê-se que todos os linfócitos requerem dois sinais para a sua activação óptima, um sinal específico para o antigénio ou clonal, assim como um segundo sinal não específico para o antigénio. (Janeway, supra). Freeman (1989) J. Immunol. 143:2714-2722) isolaram e sequenciaram um clone de ADNc codificando um antigénio de activação de células B reconhecido como MAb B7 (Freeman (1987) J. Immunol. 138:3260). As células COS transfectadas com este ADNc demonstraram corar com ambos os 2 MAb B7 e MAb BB-1 marcados (Clark (1986) Human Immunol. 16:100-113; Yokochi (1981) J. Immunol. 128:823; Freeman et al., (1989) supra; Freeman et al. (1987), supra). Adicionalmente, a expressão deste antigénio foi detectada em células de outras linhagens, tais como monócitos (Freeman et al., supra). A resposta antigénica a células T auxiliares (Th) requer sinais proporcionados por APCs. O primeiro sinal é iniciado pela interacção do complexo receptor de células T (Weiss, J. Clin. Invest. 86:1015 (1990)) com antigénio apresentado no contexto de moléculas do complexo de histocompatibilidade principal de classe II na APC (Allen, Immunol. Today 8:270 (1987)). Este sinal especifico para o antigénio não é suficiente para gerar uma resposta completa, e na ausência de um segundo sinal pode conduzir na realidade à inactivação clonal ou anergia (Schwartz, Science 248:1349 (1990)). A necessidade de um segundo sinal "co-estimulador" proporcionado pelo MHC foi demonstrado em vários sistemas experimentais (Schwartz, supra; Weaver e Unanue, Immunol. Today 11:49 (1990)). A natureza molecular deste segundo sinal não está completamente compreendido, embora seja claro, em alguns casos que ambas as moléculas solúveis, tais como interleucina (IL)-l (Weaver e Unanue, supra) e receptores de membrana envolvidos na adesão intercelular (Springer, Nature 346:425 (1990)) podem proporcionar sinais co-estimuladores. O antigénio CD28, uma glicoproteina homodimérica da superfamilia das imunoglobulinas (Aruffo e Seed, Proc. Natl. Acad. Sei. 84:8573-8577 (1987)), é uma molécula acessória encontrada na maioria das células T humanas maduras (Damle et al., J. Immunol. 131:2296-2300 (1983)). Evidências actuais sugerem que esta molécula funciona numa via de activação de células T alternativa, distinta daquela iniciada pelo complexo 3 receptor de células T (June et al., Mol. Cell. Biol. 7:4472-4481 (1987)). Anticorpos monoclonais (MAbs) reactivos com o antigénio CD28 podem aumentar as respostas das células T, iniciadas por vários estímulos policlonais (revisto por June et al., supra). Estes efeitos estimuladores podem resultar da produção de citocinas induzidas por MAb (Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sei 86:1333-1337 (1989); e Lindsten et al., Science 244:339-343 (1989)) como uma consequência de estabilização de ARNm aumentada (Lindsten et al. (1989), supra). Os mAbs anti-CD28 também podem possuir efeitos inibidores, i. e., podem bloquear reacções de linfócitos mistos autólogos (Damle et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 78:5096-6001 (1981)) e activação de clones de células T específicas para antigénio (Lesslauer et al., Eur. J. Iimunol. 16:1289-1296 (1986)) .
Alguns estudos indicaram que o CD28 é um contra-receptor para o antigénio de activação de células B, B7BB-1 (Linsley et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:5031-5035 (1990)). O antigénio B7/BB-1 é, daqui em diante, referido como o "antigénio B7".
Os ligandos B7 são também membros da superfamília das imunoglobulinas mas possuem, em contraste com CD28, dois domínios Ig na sua região extracelular, um domínio N-terminal de tipo variável (V) seguido por um domínio de tipo constante (C). A distribuição de um sinal co-estimulador não específico para a célula T requer, pelo menos, dois membros da família dos homólogos de B7 que se encontram nas APCs, B7-1 (também denominado B7, B7.1, ou CD80) e B7-2 (também denominado B7.2 ou CD86), podendo ambos distribuir sinais co-estimuladores às 4 células T através de CD28. A co-estimulação através de CD28 promove a activação de células T.
Utilizando fusões genéticas das porções extracelulares do antigénio B7 e do receptor CD28, e Imunoglobulina (Ig) C.gama.l (cadeias pesadas da região constante), as interacções entre CD28 e o antigénio B7 foram caracterizadas (Linsley et ai., J. Exp. Med. 173:721-730 (1991)). A proteína de fusão B7Ig imobilizada, assim como células CHO positivas para B7, demonstraram co-estimular a proliferação de células T. A estimulação de células T com células CHO positivas para B7 também estimula especificamente níveis aumentados de transcritos para IL-2. Estudos adicionais demonstraram que MAb anti-CD28 inibiu a produção de IL-2 induzida em certas linhas celulares de leucemia de células T através de interacções celulares com uma linha de leucemia de células B (Kohno et al., Cell. Immunol. 131-1-10 (1990)). O CD28 possui um domínio único da região tipo variável (V) extracelular (Aruffo e Seed, supra) . Uma molécula homóloga CTLA-4 foi identificada por rastreio diferencial de uma biblioteca de ADNc de células T citolíticas de murídeo (Brunet (1987) Nature 328:267-270). CTLA-4 é uma molécula de superfície de células T que foi originalmente identificada por rastreio diferencial de uma biblioteca de ADNc de células T citolíticas de murídeo (Brunet et al., Nature 328:267-270 (1987)). CTLA-4 é também um membro da superfamília de imunoglobulinas (Ig); CTLA-4 compreende um domínio extracelular Ig único. Os transcritos de CTLA-4 foram encontrados em populações de células T possuindo actividade 5 citotóxica, sugerindo que a CTLA-4 pode funcionar na resposta citolitica (Brunet et ai., supra; Brunet et ai., Immunol. Rev. 103-21-36 (1988)). Os investigadores relataram a clonagem e o
mapeamento de um gene para o equivalente humano de CTLA-4 (Dariavach et ai., Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988)) para a mesma região cromossómica (2q33-34) como CD28 (Lafage-Pochitaloff et ai., Immunogenetics 31:198-201 (1990)). A comparação de sequências entre este ADN de CTLA-4 humana e que codifica as proteínas CD28 revela homologia significativa da sequência, com o maior grau de homologia nas regiões justamembranares e citoplásmicas (Brunet et ai.., 1988, supra;
Dariavach et ai., 1988, supra).
Alguns estudos sugeriram que CTLA- 4 possui uma função análoga como um co-estimulador secundário (Linsley et ai., J. Exp. Med. 176:1595- 1604 (1992) ; Wu et al. ., J Exp. Med. 185:1327-1335 (1997) Lindsley, P. et al., Patentes U.S. Nos. 5977318; 5968510 ; 5885796; e 5 885 579) . Todavia, outros reportaram que CTLA-4 possui um papel oposto como um amortecedor da activação de células T (Krummel (1995) J. Exp. Med. 182:459-465); Krummel et ai., Int'1 Immunol. 8:519-523 (1996); Chambers et ai., Immunity. 7:885-895 (1997)). Foi relatado que murganhos deficientes em CTLA-4 sofrem de linfoproliferação massiva (Chambers et ai., supra). Foi relatado que o bloqueamento de CTLA-4 aumenta as respostas de células T in vitro (Walunas et ai., Immunity. 1:405-413 (1994)) e in vivo (Kearney (1995) J.
Immunol. 155:1032-1036), imunidade anti-tumoral exacerbada (Leach (1996) Science. 271:1734-1736), e aumenta uma doença autoimunitária induzida (Luhder (1998) J. Exp. Med. 187:427-432). Foi também relatado que CTLA-4 possui um impacto alternativo ou adicional no carácter inicial da resposta imunitária de células T (Chambers (1997) Curr. Opin. Immunol. 9: 6 396-404; Bluestone (1997) J. Immunol. 158: 1989-1993; Thompson (1997) Immunity 7: 445-450). Isto é consistente com a observação de que alguns doentes auto-imunes possuem auto-anticorpos contra CTLA-4. É possivel que anticorpos bloqueadores de CTLA-4 possuam um papel patogénico nestes doentes (Matsui (1999) J. Immunol. 162: 4328-4335).
Foram utilizados anticorpos contra CTLA-4 não humana nos vários estudos discutidos acima. Adicionalmente, o documento W098/42752 descreve anticorpos anti-CTLA-4 humanizados de murídeo. O documento WO95/33770 descreve anticorpos monoclonais anti-CTLA-4 de murideo e formas humanizadas e quiméricas destes anticorpos de murideo. O documento WO96/34096 descreve anticorpos derivados de "xenomurganhos" imunizados que são criados para expressar regiões variáveis de anticorpo humano. CTLA-4 é listado como um de muitos antigénios potenciais contra os quais os anticorpos podem ser criados. O documento WO00/37 504 publicado em 26 de Junho de 2000 e reivindica a data de prioridade de 23 de Dezembro de 2005. Descreve anticorpos anti-CTLA-4 criados por imunização de um murganho transgénico expressando genes de anticorpo humano. O documento WOOO/32231 publicado em 8 de Junho de 2000 e reivindica a data de prioridade de 3 de Dezembro de 1998. Descreve anticorpos de hamster e de murideo contra CTLA-4 e métodos para produzir anticorpos anti-CTLA-4 humanizados.
Todavia, um dos principais impedimentos que enfrenta o desenvolvimento de aplicações de terapêutica e diagnóstico in vivo para anticorpos em humanos é a imunogenicidade intrínseca de imunoglobulinas não humanas. Por exemplo, quando doentes humanos imunocompetentes são administrados com doses terapêuticas de anticorpos monoclonais de roedores, os doentes 7 produzem anticorpos contra as sequências de imunoglobulina de roedores; estes anticorpos anti-murganho humanos (HAMA) neutralizam os anticorpos terapêuticos e podem provocar toxicidade aguda.
Estas e outras deficiências nos anticorpos anteriores são ultrapassadas pelo fornecimento de anticorpos humanos contra CTLA-4 pela presente invenção.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um anticorpo humano terapeuticamente eficaz ou uma porção de ligação ao antigénio deste que se liga a CTLA4 na superfície de células T humanas com uma afinidade de ligação de cerca de 108 M'1 ou superior, cujo anticorpo compreende: (a) uma região variável da cadeia pesada de um gene VH 3-30.3 humano; e (b) uma região variável da cadeia leve de um gene VK A-27 humano.
Outros aspectos da invenção são apresentados nas reivindicações anexas. O anticorpo de sequência humana terapeuticamente eficaz liga-se a CTLA-4 na superfície celular de células T humanas normais. As sub-populações de células T marcadas pelos antigénios de CD, CD4, CD8, CD25, e CD69 podem permanecer estáveis durante, e subsequentemente, à administração do anticorpo de sequência humana terapeuticamente eficaz. O anticorpo de sequência humana pode ser bem tolerado num doente. É também aqui divulgada uma composição de anticorpos policlonais compreendendo uma pluralidade de anticorpos de sequência humana que se ligam especificamente a CTLA-4 humana. A composição de anticorpos policlonais pode compreender, pelo menos, cerca de 2, 5, 10, 50, 100, 500 ou 1000 anticorpos diferentes de sequências humanas que se ligam especificamente a CTLA-4 humana. São aqui divulgados anticorpos de sequências humanas que se ligam especificamente a CTLA-4 humana e que bloqueiam a ligação de CTLA-4 humana a B7 humano ou não bloqueiam a ligação de CTLA-4 humana a B7 humano. A invenção proporciona anticorpos de sequências humanas que se ligam a CTLA-4 humanas com uma constante de associação em equilíbrio (Ka) de, pelo menos, 108 M_1. São também proporcionados anticorpos de sequências humanas que se ligam a CTLA-4 humana com uma constante de associação em equilíbrio (Ka) de, pelo menos, 109 M"1. A invenção também proporciona anticorpos de sequências humanas que se ligam especificamente a CTLA-4 humana que bloqueia a ligação de CTLA-4 humana a B7 humana em, pelo menos, cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99%, ou 100%. A invenção também proporciona anticorpos de sequências humanas que se ligam especificamente a CTLA-4 humana possuindo uma cadeia pesada de anticorpo de IgG ou IgM. A cadeia pesada de anticorpo IgG pode ser IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. São aqui divulgados anticorpos de sequências humanas em que a cadeia leve 9 do anticorpo é uma cadeia leve Kapa. Um anticorpo de sequência humana pode ser codificado por ácidos nucleicos de cadeia pesada de igG humano e cadeia leve Kapa humana que compreendem sequências de nucleótidos nas suas regiões variáveis como apresentado nas SEQ ID N°:2 até SEQ ID N°:23, respectivamente.
Também é divulgado um anticorpo de sequência humana em que o anticorpo de sequência humana é codificado por ácidos nucleicos de cadeia pesada de IgG humano e cadeia leve Kapa humana que compreendem sequências de nucleótidos nas suas regiões variáveis como apresentado nas SEQ ID N°:16 e SEQ ID N°:6, respectivamente.
Também é divulgado um anticorpo de sequência humana em que o anticorpo de sequência humana é codificado por ácidos nucleicos de cadeia pesada IgG humana e cadeia leve Kapa humana que compreendem sequências de nucleótidos nas suas regiões variáveis como apresentado nas SEQ ID N°:18 e SEQ ID N°:8, respectivamente.
Também é divulgado um anticorpo de sequência humana em que o anticorpo de sequência humana é codificado por ácidos nucleicos de cadeia pesada IgG humana e cadeia leve Kapa humana que compreendem sequências de nucleótidos nas suas regiões variáveis como apresentado nas SEQ ID N°:22 e SEQ ID N°:12, respectivamente. A invenção também proporciona um anticorpo de sequência humana em que o anticorpo de sequência humana é codificado por sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada e da cadeia leve como apresentada nas SEQ ID N°:17 e SEQ ID N°: 7, respectivamente. 10 A invenção proporciona um anticorpo de sequência humana em que o anticorpo de sequência humana é codificado por sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada e da cadeia leve como apresentadas nas SEQ ID N°:19 e SEQ ID N°:9, respectivamente.
Também é divulgado um anticorpo de sequência humana em que o anticorpo de sequência humana é codificado por sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada e da cadeia leve como apresentadas nas SEQ ID N°:23 e SEQ ID N°:13, respectivamente.
Também é divulgado um anticorpo de sequência humana em que o anticorpo de sequência humana é codificado por ácidos nucleicos da cadeia pesada IgG humana e da cadeia leve Kapa humana compreendendo as sequências da cadeia pesada e leve variável dos segmentes do gene V, VH 3-30.3 e VK A-27, respectivamente.
Também é divulgado um anticorpo de sequência humana em que o anticorpo de sequência humana é codificado por ácidos nucleicos da cadeia pesada IgG humana e cadeia leve Kapa humana compreendendo sequências de cadeia pesada e leve variáveis dos segmentos do gene V, VH 3-33 e VK L-15, respectivamente.
Alguns anticorpos de sequências humanas da invenção compreendem as sequências de CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia pesada, SYTMH (SEQ ID N°:27), FISYDGNNKYYADSVKG (SEQ ID N°:32) e TGWLGPFDY (SEQ ID N°:37), respectivamente, e sequências de CDRl, CDR2, e CDR3 da cadeia leve RASQSVGSSYLA (SEQ ID N°:24), GAFSRAT (SEQ ID N°:29), e QQYGSSPWT (SEQ ID N°:35), respectivamente. 11
Alguns anticorpos de sequências humanas da invenção compreendem as sequências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada, SYTMH (SEQ ID N°:27), FISYDGSNKHYADSVKG (SEQ ID N°:33) e TGWLGPFDY (SEQ ID N°:38), respectivamente, e sequências de CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia leve, RASQSVSSSFLA (SEQ ID N°:25), GASSRAT (SEQ ID N°:30), e QQYGSSPWT (SEQ ID N°:35), respectivamente.
Outros anticorpos de sequências humanas aqui divulgados compreendem sequências de CDRl, CDR2, e CDR3 da cadeia pesada, SYGMH (SEQ ID N°:28), VIWYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID N°:34) e APNYIGAFDV (SEQ ID N°:39), respectivamente, e sequências de CDRl, CDR2, e CDR3 de cadeia leve, RASQGISSWLA (SEQ ID N°:26), AASSLQS (SEQ ID N°:31), e QQYNSYPPT (SEQ ID N°:36), respectivamente. São aqui divulgados anticorpos de sequências humanas que se ligam especificamente a CTLA-4 humana, em que o referido anticorpo de sequência humana é produzido por um animal transgénico não humano. 0 animal transgénico não humano pode ser um murganho.
Também é aqui divulgado um anticorpo de sequência humana que se liga especificamente a CTLA-4 humana que é um fragmento Fab.
Também é aqui divulgado um complexo polivalente compreendendo, pelo menos, dois anticorpos de sequências humanas cada um dos quais se liga especificamente a CTLA-4 humana. Os dois anticorpos diferentes podem ser ligados um ao outro covalentemente ou não covalentemente. 12 É aqui divulgado um ácido nucleico codificando uma cadeia pesada de um anticorpo de sequência humana. 0 ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleótidos como apresentado na SEQ ID N° 1. É aqui divulgado um animal transgénico não humano possuindo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada de sequência humana e um transgene de cadeia leve de sequência humana, cujo animal foi imunizado com uma CTLA-4 humana, ou um fragmento ou um análogo desta, por meio do qual o animal expressa anticorpos de sequência humana contra CTLA-4 humana. 0 animal transgénico não humano pode ser um murganho transgénico. 0 murganho transgénico pode compreender HCo7 ou HCol2. É aqui divulgada uma linha celular de hibridoma compreendendo uma célula B obtida de um animal transgénico não humano possuindo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada de sequência humana e um transgene de sequência de cadeia leve humana, em que o hibridoma produz um anticorpo de sequência humana que se liga especificamente a CTLA-4 humana. 0 hibridoma pode segregar um anticorpo de sequência humana que se liga especificamente a CTLA-4 humana ou fragmento de ligação deste, em que o anticorpo é seleccionado do grupo que consiste em: um anticorpo de sequência humana compreendendo as sequências de cadeia pesada CDRl, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada, SYTMH (SEQ ID N°:27), FISYDGNNKYYADSVKG (SEQ ID N°:32) e TGWLGPFDY (SEQ ID N°:37), respectivamente, e sequências de CDRl, CDR2, e CDR3 de cadeia leve, RASQSVGSSYLA (SEQ ID N°:24), GAFSRAT (SEQ ID N°:29), e QQYGSSPWT (SEQ ID N°:35), respectivamente, e sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada e da cadeia leve como apresentado nas SEQ ID N°:17 e SEQ ID N°:7, respectivamente, um anticorpo de sequência humana compreendendo 13 as sequências de CDRl, CDR2, e CDR3 da cadeia pesada, SYTMH (SEQ ID N°:27), FISYDGSNKHYADSVKG (SEQ ID N°:33) e TGWLGPFDY (SEQ ID N°:38), respectivamente, e sequências de CDRl, CDR2, e CDR3 da cadeia leve, RASQSVSSSFLA (SEQ ID N°:25), GASSRAT (SEQ ID N°:30), e QQYGSSPWT (SEQ ID N°:35), respectivamente, e sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada e da cadeia leve como apresentado nas SEQ ID N°:19 e SEQ ID N°:9, respectivamente; ou um anticorpo de sequência humana da reivindicação 1, compreendendo sequências de CDRl, CDR2, e CDR3
de cadeia pesada, SYGMH (SEQ ID N 0:28), VIWYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID N° : 34) e APNYIGAFDV (SEQ ID Nc ’:39), respectivamente, e sequências de CDRl, CDR2, í 2 CDR3 da cadeia leve, RASQGISSWLA (SEQ ID NO:26), AASSLQS (SEQ ID N°:31), e QQYNSYPPT (SEQ ID N°:36), respectivamente, e sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada e da cadeia leve, como apresentado nas SEQ ID N°:23 e SEQ ID N°:13, respectivamente. A invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo da invenção e um veiculo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ainda compreender um agente eficaz para induzir uma resposta imunitária contra um antigénio alvo. São também proporcionados agentes quimioterapêuticos. Adicionalmente, também são divulgados anticorpos contra moléculas imunossupressoras. A invenção proporciona a utilização de um anticorpo da invenção para a preparação de um medicamento para induzir, aumentar ou prolongar uma resposta imunitária a um antigénio num doente. O medicamento pode compreender uma dosagem eficaz de um anticorpo de sequência humana que se liga especificamente a CTLA-4 humana, em que o anticorpo bloqueia a ligação de CTLA-4 humana a B7 humano. O antigénio pode ser um antigénio tumoral, 14 ou o antigénio pode ser de um agente patogénico. 0 antigénio tumoral também pode ser telomerase. 0 agente patogénico pode ser um vírus, uma bactéria, um fungo ou um parasita. 0 agente patogénico também pode ser um HIV. 0 medicamento pode ainda compreender o antigénio, ou um fragmento ou um análogo deste, através do qual o antigénio em combinação com o anticorpo de sequência humana induz, aumenta ou prolonga a resposta imunitária. 0 antigénio pode ser um antigénio tumoral ou um componente de uma formação amilóide no doente, tal como um doente que sofre da doença de Alzheimer e o antigénio é péptido AB. 0 medicamento pode ainda compreender uma citocina. É também aqui relevado um método de supressão de uma resposta imunitária num doente, compreendendo administrar ao doente uma dosagem eficaz de uma preparação polivalente compreendendo, pelo menos, dois anticorpos de sequências humanas contra CTLA-4 humana ligados um ao outro. É também aqui divulgado um método de supressão de uma resposta imunitária num doente, compreendendo administrar ao doente uma dosagem eficaz de uma preparação policlonal compreendendo, pelo menos, dois anticorpos de sequência humana contra CTLA-4 humana. São aqui divulgados anticorpos isolados ou recombinantes de sequência humanas e anticorpos monoclonais humanos que se ligam especificamente a CTLA-4 humana, assim como composições contendo um ou uma combinação desses anticorpos. Os anticorpos de sequências humanas da invenção são caracterizados pela ligação a CTLA-4 humana com elevada afinidade, e, em algumas formas de realização bloqueando a interacção de CTLA-4 humana com o seu ligando, a B7-1 humana e moléculas de B7-2. Consequentemente, os anticorpos de sequências humanas e os anticorpos monoclonais 15 humanos da invenção podem ser utilizados como agentes de diagnóstico ou terapêuticos in vivo e in vitro.
Os anticorpos de sequências humanas da invenção podem abranger vários isotipos do anticorpo, ou suas misturas, tais como IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgAsec, IgD, e IgE. Tipicamente, eles incluem os isotipos IgGl (e. g., IgGlk) e IgM. Os anticorpos de sequências humanas podem ser de comprimento total (e. g., um anticorpo IgGl ou IgG4) ou podem incluir apenas uma porção de ligação ao antigénio (e. g., Fab, F(ab')2, Fv ou um fragmento Fv de cadeia única). Alguns anticorpos de sequências humanas são anticorpos recombinantes de sequências humanas. Alguns anticorpos de sequências humanas são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal transgénico não humano, e. g., um murganho transgénico, possuindo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve humana. 0 hibridoma pode ser produzido por, e. g., fusão da célula B numa célula imortalizada. Alguns anticorpos de sequências humanas aqui divulgados são produzidos pelos hibridomas referidos como 4C8, 4E10, 4E10.5, 5A8, 5C4, 5C4.1.3, 5D7, 5D7.1, 5E10, 5E10.12, 5G1, 5G1.4, 6A10, 6C9, 6C9.6, 6D9, 6D9.7, 6G4, 7E4, 7E4.4, 7E6, 7H8, 8E8, 8E8.4, 8F8, 8F8.19, 8H1, 9810, 9A10.1, 9B9, 9C1, 9G5, 105B, 10B5.8, 10B9, 10B9.2, 10D1, 10D1.3, 10E11, 10E4, 10E4.5, 11B4, 11D10, 11E4, 11E4.1, 11E8, 11F10, 11F11, 11F9, 11G1, 11G1.5, 1C7, 1H8.8, 2A7, 2A7.6, 2E2, 2E2.7, 2E7, 2E7.2, 2G1, 2G1.2, 3C12, 3E10, 3E10.5, 3E6, 3E6.0, 3F10, 4A1, 4B6 e 4B6.12. Os sufixos após o ponto decimal indicam diferentes isolados clonais isolados das mesmas linhas de células de hibridoma.
Alguns anticorpos anti-CTLA-4 de sequência humana aqui divulgados podem ser caracterizados por uma ou mais das 16 seguintes propriedades: a) especificidade para CTLA-4 humana (ligação especificamente a CTLA-4 humana); b) uma afinidade de ligação a CTLA-4 humana com uma constante de associação em equilíbrio (Ka) de, pelo menos, cerca de 107 M_1, ou cerca de 109 M”1, ou cerca de 1011 M"1 a 10 M"1 ou superior; c) uma constante de associação cinética (Ka) de, pelo menos, cerca de 103, cerca de 104, ou cerca de 105m”1s’1; e/ou, d) uma constante de desassociação cinética (kd) de, pelo menos, cerca de 103, cerca de 104, ou cerca de 105 m"1s"1.
Noutro aspecto, a invenção proporciona moléculas de ácido nucleico codificando os anticorpos de sequências humanas, ou porções de ligação ao antigénio, da invenção. Consequentemente, vectores de expressão recombinante que incluem os ácidos nucleicos codificando o anticorpo da invenção, e células hospedeiras transfectadas com esses vectores, são também compreendidos pela invenção, como o são os métodos de produção desses anticorpos da invenção cultivando essas células hospedeiras.
Também são aqui divulgadas células B isoladas de um animal transgénico não humano, e. g., um murganho transgénico, que são capazes de expressar vários isotipos (e. g., IgG, IgA e/ou IgM) de anticorpos monoclonais humanos que se ligam especificamente a CTLA-4 humana. As células B isoladas podem ser obtidas de um animal transgénico não humano, e. g., um murganho transgénico, que foi imunizado com uma preparação purificada ou enriquecida de antigénio CTLA-4 humana (ou seu fragmento antigénico) e/ou células expressando CTLA-4 humana. O animal transgénico não humano, e. g., um murganho transgénico, pode possuir um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve humana. As células B isoladas podem ser 17 imortalizadas para proporcionar uma fonte (e. g., um hibridoma) de anticorpos monoclonais humanos contra CTLA-4 humana.
Consequentemente, é aqui divulgado um hibridoma capaz de produzir anticorpos monoclonais humanos que se ligam especificamente a CTLA-4 humana. 0 hibridoma pode incluir uma célula B obtida a partir de um animal transgénico não humano, e. g., um murganho transgénico, possuindo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve humana fundidos numa célula imortalizada. 0 animal transgénico não humano pode ser imunizado com uma preparação purificada ou enriquecida de antigénio de CTLA-4 humana e/ou células expressando CTLA-4 humana para criar hibridomas produzindo anticorpo.
Também é aqui divulgado um animal transgénico não humano, tal como um murganho transgénico, que expressa anticorpos monoclonais humanos (também aqui referido como um "HuMAb-Mouse™") que se ligam especificamente a CTLA-4 humana. 0 animal transgénico não humano pode ser um murganho transgénico possuindo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve humana. 0 animal transgénico não humano pode ser imunizado com uma preparação purificada ou enriquecida de antigénio CTLA-4 (ou seu fragmento antigénico) e/ou células expressando a CTLA-4 humana. 0 animal transgénico não humano, e. g., o murganho transgénico, pode ser capaz de produzir isotipos múltiplos de anticorpos monoclonais humanos contra a CTLA-4 humana (e. g., IgG, IgA e/ou IgM) através de submissão a recombinação de V-D-J e substituição de isotipo. A substituição de isotipo pode ocorrer através de, e. g., substituição de isotipo clássica ou não clássica. 18 São também aqui divulgados métodos para produzir anticorpos de sequências humanas e anticorpos monoclonais de sequências humanas que reagem especificamente com CTLA-4 humana. Alguns métodos incluem imunizar um animal transgénico não humano, e. g., um murganho transgénico, possuindo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve humana, com uma preparação purificada ou enriquecida de antigénio de CTLA-4 humana e/ou células expressando CTLA-4 humana. Podem, então, ser obtidas células B (e. g., células B esplénicas) do animal e fundidas com células de mieloma para formar células de hibridoma imortais, que segregam anticorpos monoclonais humanos contra CTLA-4 humana.
Anticorpos monoclonais humanos anti-CTLA-4 humana da invenção, ou porções de ligação ao seu antigénio (e. g., Fab), podem ser derivados ou ligados a outra molécula funcional, e. g., outro péptido ou proteína (e. g., um fragmento Fab'')· Por exemplo, um anticorpo ou porção de ligação ao antigénio da invenção pode ser ligado funcionalmente (e. g., por acoplagem química, fusão genética, associação não covalente ou de outro tipo) a uma ou mais entidades moleculares diferentes. Por exemplo, o anticorpo da sequência anti-CTLA-4 humana, ou fragmento de ligação ao seu antigénio, pode ser conjugado com uma unidade terapêutica, e. g., um fármaco citotóxica, uma toxina enzimaticamente activa, ou um seu fragmento, um radioisótopo, ou um fármaco anticancerígeno de molécula pequena. Os anticorpos da invenção também podem ser conjugados com agentes farmacêuticos citotóxicos, e. g., marcados radioactivamente com um agente citotóxico, tal como, e. g., 131I (e. g., Shen (1997) Câncer 80 (12 Supl):2553-2557), cobre-67 (e. g., Deshpande (1988) J. Nucl. Med. 29:217-225) ou, e. g., 19 conjugação com a proteína gelonina de inactivação do ribossoma (e. g., Boyle (1996) J. of Immunol. 18:221-230).
Noutro aspecto, a presente invenção proporciona composições, e. g., composições farmacêuticas e de diagnóstico, compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e, pelo menos, um anticorpo monoclonal humano da invenção, ou uma porção de ligação ao seu antigénio, que se liga especificamente a CTLA-4 humana. As composições podem compreender uma combinação de anticorpos de sequência humana ou porções de ligação ao seu antigénio, de um modo preferido, cada um dos quais se liga a um epitopo distinto. Composições, e. g., composições farmacêuticas, compreendendo uma combinação de, pelo menos, um anticorpo de sequência humana ou, pelo menos, um anticorpo monoclonal humano da invenção, ou porções de ligação ao seu antigénio, e, pelo menos, uma molécula biespecífica ou multiespecífica da invenção, são também aqui divulgados.
Para métodos in vivo, o anticorpo, ou porção de ligação ao seu antigénio (ou uma molécula biespecífica ou multiespecífica), pode ser administrada a um indivíduo humano sofrendo de uma doença relacionada com células T, ou uma doença que pode ser melhorada ou prevenida através do aumento ou supressão ou prolongando uma resposta imunitária. O anticorpo monoclonal da sequência humana e as composições de anticorpo de sequência humana da invenção também podem ser administrados em combinação com outras terapêuticas conhecidas, e. g., uma terapêutica anticancerigeno. Consequentemente, é divulgado um método para tratar cancro num indivíduo compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica de um anticorpo de sequência 20 humana juntamente com um veículo farmacêutico ao indivíduo. Alguns desses métodos incluem uma vacina. Algumas dessas vacinas incluem uma vacina de célula tumoral, uma vacina de célula tumoral modificada por GM-CSF, ou uma vacina de célula dendrítica carregada com antigénio. Em alguns desses métodos, o cancro é cancro da próstata, melanoma, ou cancro epitelial.
Os anticorpos de sequências humanas contra CTLA-4 humana podem ser utilizados nos métodos de tratamento que requerem que estimulação de respostas imunitárias ou supressão. A primeira indicação é tratada utilizando anticorpos que bloqueiam a ligação de CTLA-4 humana a B7 humana. As doenças sensíveis ao tratamento por estimulação, aumento do prolongamento das respostas imunitárias incluindo cancro, incluindo cancros da próstata, rim ou cólon, infecções patogénicas, doenças associadas com auto-antigénios, e. g., doenças amiloidogénicas, incluindo doença de Alzheimer, e doenças com componentes inflamatórios ou alérgicos. A imunossupressão é alcançada utilizando uma preparação polivalente compreendendo, pelo menos, dois anticorpos diferentes contra CTLA-4 humana que estão ligados um ao outro. As doenças sensíveis ao tratamento incluem doença de enxerto versus hospedeiro, doença de hospedeiro versus enxerto, doenças auto-imunes e inflamação.
Os anticorpos da invenção podem ser utilizados para detectar in vitro ou in vivo a presença de antigénio de CTLA-4 humana numa amostra, e. g., para diagnosticar uma doença relacionada com CTLA-4 humana. Em alguns métodos, isto é alcançado por colocar em contacto uma amostra a ser testada, juntamente com uma amostra de controlo, com um anticorpo de sequência humana ou um anticorpo monoclonal humano da invenção, ou uma porção de ligação ao seu antigénio (ou uma molécula biespecífica ou 21 multiespecífica), sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e a CTLA-4 humana. A formação do complexo é então detectada (e. g.; utilizando uma ELISA) em ambas as amostras, e qualquer diferença estatisticamente significativa na formação de complexos entre as amostras é indicadora da presença do antigénio da CTLA-4 humana na amostra de teste.
Uma compreensão adicional da natureza e das vantagens da presente invenção pode ser realizada por referência às porções restantes da descrição, as figuras e reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
As Figuras que não estão relacionadas especificamente com a invenção reivindicada são incluídas apenas para ilustração. A Figura 1 apresenta esquemas ilustrando a inserção direccionada de uma cassete neo no sítio Sma I do exão μΐ. Fig. IA) Diagrama esquemático da estrutura genómica do locus μ. As caixas a cheio representam os exões μ; Fig. 1B) Diagrama esquemático do vector direccionado para CmD. As linhas ponteadas representam as sequências μ genómicas incluídas na construção. As sequências do plasmídeo não são apresentadas; Fig. 1C) Diagrama esquemático do locus μ direccionado no qual a cassete neo foi inserida em μΐ. A caixa na parte inferior direita apresenta os diagnósticos por RFLPg de recombinação homóloga entre a construção direccionada e o locus μ. Os RFLPs foram detectados por hibridação de transferência de Southern utilizando a sonda A, o fragmento Sac I de 915 pb é apresentado na Fig. 1C. 22 A Figura 2 apresenta os resultados de experiências demonstrando que anticorpos solúveis de sequência humana contra CTLA-4 humana inibe a ligação de CTLA-4 humana solúvel recombinante a células que expressam B7.1 de murganho, como descrito em detalhe, abaixo. A Figura 3 apresenta os resultados de um ensaio de ligação competitivo para identificar os anticorpos de sequência humana que reconhecem epitopos não sobreponiveis na CTLA-4 humana, como descrito em detalhe, abaixo. A Figura 4 apresenta resultados preliminares de sequência nucleotidica para o fragmento de cadeia pesada e leve do anticorpo anti-CTLA-4 10D1.3. A Figura 5 apresenta as sequências de nucleótidos das regiões variáveis da cadeia leve (VK) de Anticorpos Anti-CTLA-4 Humana. Os anticorpos anti-CTLA-4 10D1 (SEQ ID N°:6) e 4B6 (SEQ ID N°:8) derivaram da sequência da linha germinal VK A-27 (SEQ ID N°:4) são apresentados no topo da Figura. 0 anticorpo anti-CTLA-4 1E2 (SEQ ID N°:12) derivado da sequência da linha germinal VkL-15 (SEQ ID N°:10) é apresentado no fundo da Figura. As sequências VK de três anticorpos anti-CTLA-4 são alinhadas com as suas sequências do gene VK codificadas pela linha germinal. Os resíduos determinantes complementares (CDR) estão marcados. Os tracejados indicam identidade de sequência. A Figura 6 apresenta as sequências de nucleótidos das regiões variáveis da cadeia pesada (VH) de Anticorpos Anti-CTLA-4 Humana. Os anticorpos anti-CTLA-4 10D1 (SEQ ID N°:16) 23 e 4B6 (SEQ ID N°:18) derivados da sequência da linha germinal VH 3-30.3 (SEQ ID N°:14) são apresentados no topo da Figura. O anticorpo anti-CTLA-4 1E2 (SEQ ID N°:22) derivado da sequência da linha germinal VH 3-33 (SEQ ID N°:20) é apresentado no fundo da Figura. As sequências de VH de três anticorpos anti-CTLA-4 são alinhadas com as suas sequências codificadas pela linha germinal. Os residuos determinantes complementares (CDR) estão marcados. Os tracejados indicam identidade de sequência. A Figura 7 apresenta as sequências de aminoácidos previstas das Regiões variáveis da cadeia leve dos Anticorpos Anti-CTLA-4 Humana. As sequências de aminoácidos previstas de VK dos anticorpos anti-CTLA-4 descritos na Figura 5 são apresentados. Os anticorpos anti-CTLA-4 10D1 (SEQ ID N°:7) e 4B6 (SEQ ID N°:9) derivados da sequência da linha germinal VK A-27 (SEQ ID N°:5) são apresentados no topo da Figura. O anticorpo anti-CTLA-4 1E2 (SEQ ID N°:13) derivado da sequência da linha germinal VK L-15 (SEQ ID N°:ll) é apresentado no fundo da Figura. A Figura 8 apresenta as sequências de aminoácidos previstas das Regiões variáveis da cadeia pesada dos Anticorpos Anti-CTLA-4 Humana. As sequências de aminoácidos previstas de VH dos anticorpos anti-CTLA-4 descritos na Figura 6 são apresentados. Os anticorpos anti-CTLA-4 10D1 (SEQ ID N°:17) e 4B6 (SEQ ID N°:19) derivados da sequência da linha germinal VH 3-30.3 (SEQ ID N°:15) são apresentados no topo da Figura. O anticorpo anti-CTLA-4 1E2 (SEQ ID N°:23) derivado da sequência da linha germinal VH 3-33 (SEQ ID N°:21) é apresentado no fundo da Figura. 24 A Figura 9 apresenta os resultados das experiências de ligação de MAb 10D1 a CTLA-4 humana recombinante por ELISA. 0 MAb 10D1 liga-se com cinéticas dependentes da dose e saturante a CTLA-4 purificada recombinante. A Figura 10 apresenta a ligação de 10D1 a uma linha de células T expressando CTLA4. Estes resultados demonstram que o MAb 10D1 se liga com cinéticas dependentes da dose e de saturação a células que expressam CTLA-4. A Figura 11 apresenta inibição de ligação de B7.2 Ig humano a células T que expressam CTLA4. Estes resultados demonstram que o MAb 10D1 pode bloquear eficientemente a ligação de B7.2 a CTLA-4 em comparação com um MAB humano de controlo. A Figura 12 apresenta os resultados para o bloqueamento da ligação de CTLA4-FITC a células que expressam B7.1 de murideo. Estes resultados demonstram que o MAb 10D1 pode bloquear eficientemente a ligação de CTLA-4 a B7.1 em comparação com um MAb humano de controlo. A Figura 13 apresenta ELISAS competitiva de MAbs anti-CTLA-4 humana demonstrando classificações de grupo de epitopo. A Figura 14 apresenta a expressão de CTLA-4 em células T estimuladas com PHA. Células T activadas, mas não em repouso, expressam níveis baixos, mas detectáveis de CTLA-4 na superfície da célula. A Figura 15 apresenta os resultados de MAb 10D1 na Lise
Dependente do Complemento de Células T Activadas. Não se observa lise de células T activadas com PHA. 25 A Figura 16 apresenta os resultados de MAb 10D1 em Lise Dependente do Anticorpo de Células T Activadas. Não se observa lise de células T activadas com PHA com 10D1 e células mononucleares. A Figura 17 apresenta respostas de igM e IgG anti-lODl em macacos cynomolgus injectadas com anticorpo 10D1. Não se observa resposta de anticorpo significativa contra 10D1.
DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção proporciona novas terapêuticas à base de anticorpo que podem ser utilizadas para tratar e diagnosticar doenças caracterizados por expressão, particularmente sobre-expressão, ou activação de, particularmente sobre-activação, de CTLA-4 humana e/ou moléculas relacionadas. As terapêuticas aqui divulgadas empregam anticorpos de sequência humana, anticorpos monoclonais de sequência humana, ou porções destes de ligação ao antigénio, que se ligam a um epitopo presente em CTLA-4 humana. Estes anticorpos de sequência humana anti-CTLA-4 podem actuar como antagonistas funcionais (e. g., inibindo a capacidade de CTLA-4 para se ligar ao ligando ou para activar a célula, e. g., inibindo a sua capacidade para transmitir um sinal à célula) ou agonistas (e. g., para estimular o efeito de ligando).
Os anticorpos de sequência humana aqui divulgados podem ser produzidos num animal transgénico não humano, e. g., um murganho transgénico, capaz de produzir isótopos múltiplos de anticorpos humanos (e. g., monoclonais ou policlonais) contra CTLA-4 humana 26 (e. g., IgG, IgA e/ou IgE) sofrendo recombinação V-D-J e substituição de isotipo. Consequentemente, são aqui divulgados anticorpos e fragmentos de anticorpo, e suas composições farmacêuticas, assim como animais transgénicos não humanos, e células B e hibridomas para produzir esses anticorpos monoclonais. Métodos de utilização dos anticorpos da invenção para detectar uma célula que expressa CTLA-4 humana ou um receptor relacionado do factor de crescimento de reacção cruzada, ou para inibir o crescimento, diferenciação e/ou mobilidade de uma célula que expressa CTLA-4 humana, quer in vitro ou in vivo, são também divulgados.
Excepto quando referido, os termos "doente" ou "indivíduo" são utilizados indistintamente e referem-se a mamíferos, tais como doentes humanos e primatas não humanos, assim como animais experimentais, tais como coelhos, ratos, e murganhos, e outros animais. 0 termo "tratamento" inclui a administração dos compostos ou agentes aqui divulgados para prevenir ou retardar o início dos sintomas, complicações, ou indícios bioquímicos de uma doença, aliviando os sintomas ou interrompendo ou inibindo o futuro desenvolvimento da doença, estado, ou distúrbio (e. g., doença autoimune). 0 tratamento pode ser profiláctico (para prevenir ou retardar o início da doença, ou para prevenir a manifestação dos seus sintomas clínicos ou subclínicos) ou supressão terapêutica ou alívio dos sintomas após a manifestação da doença.
Em geral, a frase "bem tolerado" refere-se à ausência de alterações adversas no estado de saúde que ocorre como um resultado do tratamento e iria afectar as decisões de tratamento. 27 0 termo "linfócito", como aqui utilizado, tem o significado normal na técnica, e refere-se a qualquer um dos leucócitos não fagociticos mononucleares, encontrados no sangue, linfa, e tecidos linfóides, i. e., linfócitos B e T. A frase "sub-populações de linfócitos T" ou "sub-conjunto (s) de células T" referem-se a linfócitos T ou células T caracterizados pela expressão de marcadores de superfície de células particulares (ver Barclay, A. N. et al., (eds.), 1997,
The Leukocyte Antigen Facts Book, 2a edição, Academic Press, Londres, Reino Unido). 0 termo "estável" em referência às células T refere-se ao facto de a frequência ou percentagem de um sub-conjunto de células T não se altera ao longo do curso ou duração da administração de um agente.
Os termos "antigénio-4 associado a linfócito T citotóxico", "CTLA-4", "CTLA4", "antigénio CTLA-4" e "CD152" (ver, e. g., Murata (1999) Am. J. Pathol. 155:453-460) são utilizados indistintamente, e incluem variantes, isoformas, espécies homólogas de CTLA-4 humana, e análogos possuindo, pelo menos, um epitopo comum com CTLA-4 (ver, e. g., Balzano (1992) Int. J. Câncer Suppl. 7:28-32). A sequência de ADNc completa da CTLA-4 humana possui o número de acesso no Genbank L15006. A região dos aminoácidos 1-37 é o péptido líder; 38-161 é o domínio extracelular tipo V; 162-187 é o domínio transmembranar; e 188-223 é o domínio citoplásmico. Foram relatadas variantes da sequência
nucleotídica, incluindo uma transição de G para A na posição 49, uma transição de C para T na posição 272, e uma transição de A para G na posição 439. A sequência completa de ADN de CTLA-4 de 28 murganho possui o número de acesso EMBL X05719 (Brunet et al. (1987) Nature 328:267-270). A região dos aminoácidos 1-35 é o péptido lider. A sequência de ADN completa de B7-1 (CD80) humano possui o número de acesso do Genbank X60958; o número de acesso para a sequência do murganho é X60958; o número de acesso para a sequência de rato é U05593. A sequência completa de ADNc de B7-2 (CD86) humano possui o número de acesso do Genbank L25259; o número de acesso para a sequência de murganho é L25606.
Os genes codificando CD28 foram caracterizados extensivamente. A sequência de ARNm de galinha possui o número de acesso do Genbank X67915. A sequência de ARNm de rato possui o número de acesso do Genbank X55288. A sequência de ARNm humana possui o número de acesso do Genbank J02988. A sequência de ARNm de murganho possui o número de acesso do Genbank M34536. O termo "epitopo" significa um determinante proteico capaz de ligação especifica a um anticorpo. Os epitopos consistem normalmente em agrupamentos de superfície quimicamente activos de moléculas, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e, normalmente, possuem características estruturais tridimensionais específicas, assim como características de carga específica. Os epitopos conformacionais e não conformacionais são distinguíveis no sentido em que a ligação ao primeiro mas não ao último é perdida na presença de solventes desnaturantes.
Um "anticorpo" intacto compreende, pelo menos, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) inter-ligadas por ligações persulfureto. Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável da cadeia pesada (aqui abreviada como HCVR ou VH) e uma 29 região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida por três domínios, CHI, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida por uma região variável da cadeia leve (aqui abreviada como LC-VR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), entremeadas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR) . Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostos a partir do terminal amino para o terminal carboxilo na ordem seguinte: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 . As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interactua com um antigénio. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina para os tecidos ou factores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imunitário (e. g., células efectoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico. 0 termo anticorpo inclui porções de ligação ao antigénio de um anticorpo intacto que retém a capacidade para se ligar a CTLA-4. Exemplos de ligação incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ligação persulfureto na região da dobra; (iii) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CHI; (iv) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989)
Nature 341:544-546), que consiste num domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR). Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, 30 utilizando métodos recombinantes, por um ligando sintético que permite que sejam produzidos como uma cadeia de proteina única, em que as regiões VL e VH se emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); Ver, e. g., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Esses anticorpos de cadeia única são incluídos por referência ao termo "anticorpo". Os fragmentos podem ser preparados por técnicas recombinantes ou clivagem enzimática ou quimica dos anticorpos intactos.
Um anticorpo biespecifico possui duas especificidades de ligação diferentes, ver, e. g., Patentes U.S. 5922845 e 5837243; Zeilder (1999) J. Immunol. 163:1246-1252; Somasundaram (1999) Hum. Antibodies 9:47-54; Keler (1997) Câncer Res. 57:4008-4014. Por exemplo, foram aqui divulgados anticorpos biespecificos possuindo um sitio de ligação para um antigénio de superfície celular, tal como CTLA-4 humana, e um segundo sitio de ligação para um receptor Fc na superfície de uma célula efectora. São também aqui divulgados anticorpos multiespecíficos, que possuem, pelo menos, três sítios de ligação. O termo "anticorpos biespecificos" inclui ainda diacorpos. Os diacorpos são bivalentes, anticorpos biespecificos em que os domínios VH e VL são expressos numa única cadeia de polipéptido, mas utilizando um ligando que é muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando assim os domínios para emparelharem com os domínios complementares da cadeia de outro e criando dois sítios de ligação ao antigénio (Ver, e. g., Holliger, P., et al.. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). 31 0 termo "anticorpo de sequência humana" inclui anticorpos possuindo regiões variáveis e constantes (se presentes) derivadas das sequências de imunoglobulina da linha germinal humana. Os anticorpos de sequência humana aqui divulgados podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da linha germinal humana (e. g., mutações introduzidas por mutagénese aleatória ou específica para um sítio in vitro ou por mutação somática in vivo). Todavia, o termo "anticorpo de sequência humana", como aqui utilizado, não pretende incluir anticorpos em que as sequências de CDR derivadas da linha germinal de outra espécie de mamífero, tal como um murganho, foram enxertadas nas sequências da estrutura humana (i. e., anticorpos humanizados).
Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" refere-se à preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal apresenta uma especificidade de ligação e afinidade únicas para um epitopo particular. Consequentemente, o termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos apresentando uma especificidade de ligação única que possuem regiões variáveis e constantes (se presentes) derivadas das sequências da imunoglobulina da linha germinal humana. Os anticorpos monoclonais humanos podem ser produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal transgénico não humano, e. g., um murganho transgénico, possuindo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e o transgene da cadeia leve fundido a uma célula imortalizada. 32 0 termo "anticorpo diclonal" refere-se a uma preparação de, pelo menos, dois anticorpos contra CTLA-4 humana. Tipicamente, os anticorpos diferentes ligam-se a diferentes epitopos. 0 termo "anticorpo oligoclonal" refere-se a uma preparação de 3 a 100 anticorpos diferentes contra CTLA-4 humana. Tipicamente, os anticorpos numa tal preparação ligam-se a uma variedade de diferentes epitopos. O termo "anticorpo policlonal" refere-se a uma preparação de mais do que 1 (dois ou mais) anticorpos diferentes contra CTLA-4 humana. Essa preparação inclui anticorpos que se ligam a uma variedade de epitopos diferentes. A invenção proporciona anticorpos de sequência humana contra CTLA-4 humana que bloqueia ou antagoniza sinais transduzidos pelo receptor da CTLA-4 humana. Alguns desses anticorpos podem ligar-se a um epitopo na CTLA-4 humana desde que iniba CTLA-4 de interagir com um contra-receptor de B7 humana. Devido à interacção de CTLA-4 humana com B7 humana transduzir um sinal que conduz à inactivação de células T contendo o receptor da CTLA-4 humana, o antagonismo da interacção induz efectivamente, aumenta ou prolonga a activação das células T contendo o receptor da CTLA-4 humana, prolongando desse modo ou aumentando uma resposta imunitária. Um "anticorpo bloqueador" refere-se a um anticorpo que reduz a ligação de CTLA-4 humana solúvel ao ligando de B7 humano expresso na célula em, pelo menos, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ou 99,9% nas condições em que a proporção de sítio de combinação de anticorpo ao sítio de ligação de ligando da CTLA-4 humana é superior a 1:1 e a concentração do anticorpo é superior a 10“8 M. 33
Outras preparações de anticorpo, por vezes referidas como preparações multivalentes, ligam-se a CTLA-4 humana de um modo a realizar ligação reticulada de múltiplos receptores de CTLA-4 humana na mesma célula. A ligação reticulada do receptor possui o mesmo efeito ou semelhante na ligação de CTLA-4 humana a B7 humana. Assim, a ligação reticulada de receptores agoniza eficazmente a resposta a CTLA-4 humana resultando em imunossupressão. A ligação reticulada também pode ser realizada combinando anticorpos divalentes solúveis possuindo especificidades de epitopo diferentes. Estas preparações de anticorpo policlonal compreendem, pelo menos, dois pares de cadeias pesada e leve em ligação a diferentes epitopos na CTLA-4 humana de modo a que um sinal de imunossupressão possa ser transduzido como um resultado de ligação reticulada de CTLA-4 humana. 0 termo "anticorpo humano recombinante" inclui todos os anticorpos de sequência humana aqui divulgados que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos isolados de um animal (e. g., um murganho) que é transgénico para os genes da imunoglobulina humana (descritos ainda na Secção I, abaixo); anticorpos expressos utilizando um vector de expressão recombinante transfectado numa célula hospedeira, anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpos humanos recombinantes, combinatoriais, ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem a excisão de sequências humanas de genes da imunoglobulina para outras sequências de ADN. Esses anticorpos humanos recombinantes possuem regiões variáveis e constantes (se presentes) derivadas de sequências de imunoglobulina humana da linha germinal. Esses 34 anticorpos podem, todavia, ser indivíduos a mutagénese in vitro (ou, quando é utilizado um animal transgénico para sequências de igG humana, in vivo, mutagénese somática) e assim, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas com as sequências VH e VL da linha germinal humana, podem não existir naturalmente no repertório da linha germinal do anticorpo humano in vivo.
Um "anticorpo heterólogo" é definido em relação ao organismo transgénico não-humano produzindo tal anticorpo. Este termo refere-se a um anticorpo possuindo uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de aminoácidos codificando as sequências de aminoácidos correspondendo ao que se encontra num organismo não consistindo do animal transgénico não humano, e geralmente de uma espécie diferente daquela do animal transgénico não humano.
Um "anticorpo hetero-híbrido" refere-se a um anticorpo possuindo cadeias leve e pesada de diferentes organismos de origem. Por exemplo, um anticorpo possuindo uma cadeia pesada humana associada a uma cadeia leve de murídeo é um anticorpo hetero-híbrido. Exemplos de anticorpos hetero-híbridos incluem anticorpos quiméricos e humanizados, discutidos supra. 0 termo "substancialmente puro" ou "isolado" significa uma espécie objecto (e. g., um anticorpo da invenção) foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural, de modo a que a espécie objecto seja a espécie predominante presente (i. e., numa base molar é mais abundante do que outra espécie individual na composição); uma composição "substancialmente pura" ou "isolada" também significa que a outra espécie objecto compreende, pelo menos, cerca de 50 por 35 cento (numa base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Uma composição substancialmente pura ou isolada também pode compreender mais do que cerca de 80 a 90 por cento em peso de todas as espécies macromoleculares presentes na composição. Uma espécie de artigo isolado (e. g., anticorpos da invenção) pode também ser purificado até à homogeneidade essencial (espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodos de detecção convencionais) em que a composição consiste, essencialmente, de derivados de uma única espécie macromolecular. Um anticorpo isolado contra CTLA-4 humana pode ser substancialmente isenta de outros anticorpos que não possuem ligação à CTLA-4 humana e se ligam a um antigénio diferente. Um anticorpo isolado que se liga especificamente a um epitopo, isoforma ou variante da CTLA-4 humana pode, contudo, apresentar reactividade cruzada com outros antigénios relacionados, e. g., de outras espécies (e. g., espécies homólogas de CTLA-4). Além disso, um anticorpo isolado da invenção pode ser substancialmente isento de outro material celular (e. g., proteínas não imunoglobulinas associadas) e/ou químicos. "Ligação específica" refere-se à ligação de anticorpo a um pré-determinado antigénio. A frase "liga-se especificamente (ou selectivamente)" a um anticorpo refere-se a uma reacção de ligação que é determinante da presença da proteína numa população heterogénea de proteínas e outras moléculas biológicas. Tipicamente, o anticorpo liga-se com uma constante de associação (Ka) de, pelo menos, cerca de 1 x 106 M_1 ou 107 M_1, ou cerca de 108 M_1 a 109 M_1, ou cerca de IO10 M_1 a 1011 M_1 ou superior, e liga-se ao antigénio pré-determinado com uma afinidade que é, pelo menos, duas vezes maior do que a sua afinidade para a ligação a um outro antigénio não específico 36 (e. g., BSA, caseína) que não o antigénio pré-determinado ou um antigénio intimamente relacionado. As frases "um anticorpo que reconhece um antigénio" e "um anticorpo específico para um antigénio" são aqui utilizadas intercaladamente com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antigénio". A frase "liga-se especificamente" ou "especificamente liga-se", quando em referência a um péptido refere-se a uma molécula de péptido que possui uma afinidade de ligação intermédia ou elevada, exclusivamente ou predominantemente, a uma molécula alvo. As frases "liga-se especificamente a" refere-se a uma reacção de ligação que determina a presença de uma proteína alvo na presença de uma população heterogénea de proteínas e outras moléculas biológicas. Deste modo, sob condições de ensaio designadas, as unidades de ligação especificadas ligam-se, de modo preferido, a uma proteína alvo particular e não se liga numa quantidade significativa a outros componentes presentes numa amostra de teste. A ligação específica a uma proteína alvo sob estas condições pode necessitar de uma unidade de ligação que é seleccionada pela sua especificidade para um antigénio alvo particular. Podem ser utilizados vários formatos para seleccionar ligandos que são especificamente reactivos com uma proteína particular. Por exemplo, os imunoensaios ELISA em fase sólida, imunoprecipitação, Biacore e transferência de Western são utilizadas para identificar péptidos que reagem especificamente com CTLA-4. Tipicamente uma reacção específica ou selectiva será, pelo menos, o dobro do sinal do fundo ou ruído e mais tipicamente mais de 10 vezes o fundo. O termo "afinidade elevada" para um anticorpo IgG refere-se a uma constante de associação em equilíbrio (Ka) de, pelo menos, cerca de 107 M”1, pelo menos, cerca de 108 M”1, pelo menos, cerca 37 de 109 M"1, pelo menos, cerca de IO10 M"1, pelo menos, cerca de 1011 M”1, ou, pelo menos, cerca de 1012 M"1 ou superior, e. g., até 1013 M”1 ou 1014 M"1 ou superior. Contudo, ligação de "afinidade elevada" pode variar para outros isotipos do anticorpo. 0 termo "Ka", como aqui utilizado, pretende referir-se à constante de associação em equilíbrio de uma interacção anticorpo-antigénio particular. Esta constante possui unidades de 1/M. 0 termo "Kd", como aqui utilizado, pretende referir-se à constante de dissociação de equilíbrio de uma interacção anticorpo-antigénio particular. Esta constante possui unidades de M. 0 termo "ka", como aqui utilizado, pretende referir-se à constante cinética de associação de uma interacção anticorpo-antigénio particular. Esta constante possui unidades de 1/Ms. 0 termo "kd", como aqui utilizado, pretende referir-se à constante cinética de dissociação de uma interacção anticorpo-antigénio particular. Esta constante possui unidades de 1/s.
As "interacções anticorpo-antigénio particulares" referem-se às condições experimentais em que as constantes de equilíbrio e cinéticas são medidas. "Isotipo" refere-se à classe de anticorpo (e. g., IgM ou IgGl) que é codificado por genes para a região constante da cadeia pesada. 38 "Substituição de isotipo" refere-se ao fenómeno através do qual a classe, ou isotipo de um anticorpo, se altera de uma classe de Ig para uma das outras classes de Ig. "Isotipo não trocado" refere-se à classe isotipica da cadeia pesada que é produzida quando não ocorreu substituição de isotipo; o gene CH codificando o isotipo não trocado é tipicamente o primeiro gene CH imediatamente a jusante do gene VDJ rearranjado funcionalmente. A substituição de isotipo foi classificada como substituição de isotipo clássica ou não. A substituição de isotipo clássica ocorre através de eventos de recombinação que envolve, pelo menos, uma região de sequência de troca no transgene. A substituição de isotipo não clássica pode ocorrer por, por exemplo, recombinação homóloga entre σμ humana e Σμ humana (deleção associada-δ). Os mecanismos de troca não clássica alternativos, tais como recombinação intertransgénica e/ou intercromossómica, entre outras, podem ocorrer e efectuar a substituição de isotipo. 0 termo "sequência de troca" refere-se às sequências de ADN responsáveis por recombinação de troca. Uma sequência "dadora de troca", tipicamente uma região de troca μ, é a região 5' (i. e., a montante) da construção a sofrer deleção durante a recombinação de troca. A região "receptora de troca" está entre região da construção a sofrer deleção e a região constante de substituição (e. g., γ, ε, etc.). Como não existe um sitio especifico em que a recombinação ocorre sempre, a sequência final do gene não é tipicamente previsível a partir da construção. 0 "perfil de glicosilação" é definido como o perfil das unidades de hidrato de carbono que estão covalentemente ligadas 39 a uma proteína, mais especificamente a uma proteína imunoglobulina. 0 perfil de glicosilação de um anticorpo heterólogo pode ser caracterizado como sendo substancialmente semelhante aos perfis de glicosilação que ocorrem naturalmente em anticorpos produzidos pela espécie do animal transgénico não humano, quando um especialista da técnica reconhece o perfil de glicosilação do anticorpo heterólogo como sendo mais semelhante ao referido perfil de glicosilação nas espécies do animal transgénico não humano do que nas espécies a partir das quais os genes CH do transgene são derivados. 0 termo "que ocorre naturalmente" quando aplicado a uma entidade refere-se ao facto de que uma entidade pode ser encontrada na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipéptido ou polinucleótidos que está presente num organismo (incluindo vírus), que pode ser isolada a partir de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado pelo homem no laboratório, ocorre naturalmente. 0 termo "rearranjado" refere-se a uma configuração de um locus de cadeia pesada ou cadeia leve de imunoglobulina em que um segmento V está posicionado imediatamente adjacente a um segmento D-J ou J numa conformação codificando, essencialmente, um domínio completo VH ou VL, respectivamente. Um locus de gene rearranjado de imunoglobulina pode ser identificado por comparação com o ADN da linha germinal; um locus rearranjado possui, pelo menos, um elemento de homologia heptâmero/nonâmero recombinado. 0 termo "não rearranjado" ou "configuração da linha germinal" em referência a um segmento V refere-se à configuração 40 em que o segmento V não está recombinado de modo a ser imediatamente adjacente ao segmento D ou J. 0 termo "ácido nucleico" pretende incluir moléculas de ADN e moléculas de ARN. 0 ácido nucleico pode ser de cadeia única ou de cadeia dupla. 0 termo "ácido nucleico isolado" em referência a ácidos nucleicos codificando anticorpos ou porções de anticorpo (e. g., VH, VL, CDR3) que se ligam a CTLA-4, pretende referir-se a um ácido nucleico em que as sequências de nucleótidos codificando o anticorpo ou porções de anticorpo estão isentas de outras sequências de nucleótidos codificando anticorpos ou porções de anticorpo que se ligam a outros antigénios para além de CTLA-4, sequências essas que podem flanquear naturalmente o ácido nucleico no ADN genómico humano. As SEQ ID Nos: 4-23 compreendem as sequências de nucleótidos e de aminoácidos compreendendo as regiões variáveis da cadeia pesada (VH) e cadeia leve (VL) dos anticorpos monoclonais 10D1, 4B6 e 1E2 anti-CTLA-4 humana da invenção. 0 termo "substancialmente idêntico," no contexto de dois ácidos nucleicos ou polipéptidos, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que possuem uma identidade em nucleótidos ou resíduos de aminoácidos de, pelo menos, cerca de 80%, cerca de 90, cerca de 95% ou superior, quando comparadas e alinhadas para uma correspondência máxima, conforme medido utilizando o seguinte método de comparação de sequências e/ou inspecção visual. Por exemplo, a invenção proporciona ácidos nucleicos possuindo sequências que são substancialmente idênticas a SEQ ID N°:l, SEQ ID N°:2. Estas sequências "substancialmente idênticas" são tipicamente consideradas como 41 sendo homólogas. A "identidade substancial" pode existir ao longo de uma região da sequência que possui, pelo menos, cerca de 50 resíduos de comprimento, ao longo de uma região de, pelo menos, cerca de 100 resíduos, ou ao longo de uma região de, pelo menos, cerca de 150 resíduos, ou ao longo do comprimento total das duas sequências a ser comparadas. Como a seguir descrito, quaisquer duas sequências de anticorpo só podem ser alinhadas utilizando o esquema de numeração em Kabat. Deste modo, para anticorpos, a percentagem de identidade possui um significado único e bem definido.
Os aminoácidos das regiões variáveis das cadeias pesadas e leves maduras das imunoglobulinas são designadas Hx e Lx respectivamente, em que x é um número que designa a posição de um aminoácido de acordo com o esquema de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 e 1991) . Kabat lista muitas sequências de aminoácidos para anticorpos para cada subgrupo, e lista a maior parte dos aminoácidos que normalmente ocorrem para cada posição de resíduo nesse subgrupo para produzir uma sequência de consenso. Kabat utiliza um método para atribuir um número de resíduo a cada aminoácido numa sequência de uma lista, e este método para atribuir números de resíduo tornou-se convencional na técnica. O esquema de Kabat é extensível a outros anticorpos não incluídos no seu compêndio através do alinhamento do anticorpo em questão com uma das sequências de
consenso em Kabat por referência aos aminoácidos conservados. A utilização do sistema de numeração de Kabat identifica rapidamente os aminoácidos posições equivalentes em diferentes anticorpos. Por exemplo, um aminoácido na posição L50 de um anticorpo humano ocupa a posição equivalente a um aminoácido na posição L50 de um anticorpo de murganho. Do mesmo modo, os 42 ácidos nucleicos codificando cadeias de anticorpo são alinhados quando as sequências de aminoácidos codificadas pelos respectivos ácidos nucleicos são alinhados de acordo com a convenção da numeração de Kabat. A frase "híbrida selectivamente (ou especificamente) com" refere-se à ligação, duplicação, ou hibridação de uma molécula com uma sequência de nucleótidos particular sob condições de hibridação restringentes quando essa sequência está presente numa mistura complexa (e. g., ADN ou ARN celular total ou em biblioteca), em que a sequência de nucleótidos particular é detectada a, pelo menos, cerca de 10 vezes o fundo. Numa forma de realização, um ácido nucleico pode ser determinado como estando no âmbito desta divulgação (e. g., é substancialmente idêntico à SEQ ID N°:l ou SEQ ID N°:2) pela sua capacidade de hibridar sob condições restringentes com um ácido nucleico doutro modo determinado como estando no âmbito desta divulgação (tal como as sequências exemplificativas aqui descritas). A frase "condições de hibridação restringentes" refere-se a condições, sob as quais, uma sonda vai hibridar com a sua subsequência alvo, tipicamente numa mistura complexa de ácidos nucleicos, mas não com outras sequências em quantidades significativas (um sinal positivo (e. g., identificação de um ácido nucleico da invenção) é cerca de 10 vezes o fundo de hibridação). As condições restringentes são dependentes da sequência e são diferentes em diferentes circunstâncias. As sequências longas hibridam especificamente a temperaturas mais elevadas. Um guia extenso para a hibridação de ácidos nucleicos é encontrado em e. g., Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2a ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor
Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLOS IN MOLECULAR BIOLOGY, 43
Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WrrH NUCLEIC ACID PROBES, Parte I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993).
Geralmente, as condições restringentes são seleccionadas para ser cerca de 5-10 °C abaixo do ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência especifica a um pH de força iónica definida. A Tm é a temperatura (sob uma força iónica definida, pH, e concentração nucleica) em que 50% das sondas complementares ao alvo hibridam com a sequência alvo no equilíbrio (como as sequências alvo estão presentes em excesso, à Tm, 50% das sondas estão ocupadas no equilíbrio) . As condições restringentes serão aquelas em que a concentração de sal é inferior a cerca de 1,0 M de ião sódio, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de ião sódio (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é, pelo menos, cerca de 30 °C para sondas curtas (e. g., 10 a 50 nucleótidos) e, pelo menos, cerca de 60 °C para sondas longas (e. g., superior a 50 nucleótidos). As condições restringentes também podem ser conseguidas com a adição de agentes destabilizadores tais como formamida, como descrito em Sambrook (citado a seguir). Para hibridação com restrigência elevada, um sinal positivo é, pelo menos, duas vezes o fundo, de um modo preferido, 10 vezes o fundo de hibridação. As condições de hibridação de elevada restringência ou restringentes incluem: 50% de formamida, 5x SSC e 1% de SDS incubados a 42 °C ou 5x SSC e 1% de SDS incubados a 65 °C, com uma lavagem em 0,2x SSC e 0,1% de SDS a 65 °C. Para hibridação selectiva ou específica, um sinal positivo (e. g., identificação de um ácido nucleico da invenção), é cerca de 10 vezes o fundo da hibridação. As condições de hibridação restringentes que são utilizadas para identificar ácidos nucleicos no âmbito da invenção incluem, 44 e. g.f hibridação num tampão compreendendo 50% de formamida, 5x SSC, e 1% de SDS a 42 °C, ou hibridação num tampão compreendendo 5x SSC e 1% de SDS a 65 °C, ambas com uma lavagem de 0,2x SSC e 0,1% de SDS a 65 °C. Na presente invenção, o ADN genómico ou ADNc compreendendo ácidos nucleicos da invenção pode ser identificado em transferências de Southern convencionais sob condições restringentes utilizando as sequências de ácido nucleico aqui divulgadas. As condições restringentes adicionais para estas hibridações (para identificar ácidos nucleicos no âmbito da invenção) são as que incluem a hibridação num tampão de 40% de formamida, 1 M NaCl, 1% de SDS a 37 °C.
Contudo, a selecção de um formato de hibridação não é critica - é a restringência das condições de lavagem que estabelece as condições que determinam se um ácido nucleico está no âmbito desta divulgação. As condições de lavagem utilizadas para identificar ácidos nucleicos no âmbito desta divulgação incluem, e. g.: uma concentração de sal de cerca de 0,02 molar a pH 7 e uma temperatura de, pelo menos, cerca de 50 °C ou cerca de 55 °C a cerca de 60 °C; ou, uma concentração de sal de cerca de 0,15 M NaCl a 72°C durante cerca de 15 minutos; ou, uma concentração de sal de cerca de 0,2X SSC a uma temperatura de, pelo menos, cerca de 50 °C ou cerca de 55 °C a cerca de 60 °C durante cerca de 15 a cerca de 20 minutos; ou, o complexo de hibridação é lavado duas vezes com uma solução com uma concentração de sal de cerca de 2X SSC contendo 0,1% de SDS à temperatura ambiente durante 15 minutos e depois lavado duas vezes com 0,1X SSC contendo 0,1% de SDS a 68°C durante 15 minutos; ou, condições equivalentes. Ver Sambrook, Tijssen e Ausubel para uma descrição do tampão SSC e condições equivalentes. 45
Os ácidos nucleicos da invenção podem estar presentes em células completas, num lisado celular, ou numa forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando purificados a partir de outros componentes celulares ou outros contaminantes, e. g., outros ácidos nucleicos ou proteínas celulares, por técnicas convencionais, incluindo tratamento alcalino/SDS, bandas de CsCl, cromatografia em coluna, electroforese em gel de agarose e outros bem conhecidos na técnica, ver, e. g., Sambrook, Tijssen e Ausubel. As sequências de ácido nucleico da invenção e outros ácidos nucleicos
utilizados na prática desta invenção, seja ARN, ADNc, ADN genómico, ou seus híbridos, podem ser isolados a partir de uma variedade de fontes, geneticamente manipulados, amplificados, e/ou expressos de forma recombinante. Pode ser utilizado qualquer sistema de expressão recombinante, incluindo, adicionalmente ao bacteriano, e. g., sistemas de leveduras, insectos ou de mamífero. Alternativamente, estes ácidos nucleicos podem ser quimicamente sintetizados in vitro. As técnicas para a manipulação de ácidos nucleicos, tais como, e. g., subclonagem em vectores de expressão, marcação de sondas, sequenciação, e hibridação são bem descritas na literatura científica e de patentes, ver, e. g., Sambrook, Tijssen e
Ausubel. Os ácidos nucleicos podem ser analisados e quantificados por qualquer um dos vários meios bem conhecidos dos especialistas na técnica. Estes incluem, e. g., métodos bioquímicos analíticos tais como RMN, espectrofotometria, radiografia, electroforese, electroforese capilar, cromatografia líquida e elevado desempenho (HPLC), cromatografia de camada fina (TLC), e cromatografia de hiperdifusão, vários métodos imunológicos, tais como reacções de precipitina em fluido ou gel, imunodifusão (única ou dupla), imunoelectroforese, 4 6 radioimunoensaios (RIAs), ensaios de imunoabsorção ligados a enzima (ELISAs), ensaios de imunofluorescência, análise de Southern, análise de Northern, análise de transferência em gota, electroforese em gel (e. g. , SDS-PAGE), RT-PCR, PCR quantitativa, outros métodos de amplificação de ácido nucleico ou alvo ou de sinal, marcação radioactiva, contagem de cintilações, e cromatografia de afinidade.
As composições de ácido nucleico da presente invenção, embora frequentes numa sequência nativa (excepto para sítios de restrição modificados e semelhantes), quer de ADNc, genómico ou suas misturas podem ser mutadas, de acordo com técnicas convencionais para proporcionar sequências de genes. Para sequências codificantes, estas mutações podem afectar a sequência de aminoácidos como desejado. Em particular, as sequências de ADN substancialmente homólogas a, ou derivadas de V, D, J nativas, constantes, substituições e outras sequências deste tipo aqui descritas estão contempladas (em que "derivado" indica que uma sequência é idêntica ou modificada de outra sequência).
Um ácido nucleico está "ligado operacionalmente" quando é colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor ou intensificador está ligado operacionalmente a uma sequência codificante se afectar a transcrição da sequência. Em relação às sequências de regulação de transcrição, ligado operacionalmente significa que as sequências de ADN a serem ligadas são contíguas e, quando necessário, unir duas regiões codificantes de proteína, contíguas e em grelha de leitura. Para a sequência de trocas, ligado operacionalmente indica que as sequências são capazes de realizar recombinação de troca. 47 0 termo "vector" pretende referir-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Um tipo de vector é um "plasmideo", que se refere a uma ansa de ADN de cadeia dupla circular à qual podem ser ligados segmentos de ADN adicionais. Outro tipo de vector é um vector virai, em que segmentos de ADN podem ser ligados adicionalmente no genoma virai. Certos vectores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira na qual foram introduzidos (e. g., vectores bacterianos possuindo uma origem de replicação bacteriana e vectores de mamíferos epissomais). Podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira outros vectores (e. g., vectores de mamifero não epissomais) após introdução na célula hospedeira, e desse modo são replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vectores são capazes de direccionar a expressão de genes aos quais estão operacionalmente ligados. Esses vectores são aqui referidos como "vectores de expressão recombinantes" (ou simplesmente, "vectores de expressão") . Em geral, vectores de expressão de utilidade em técnicas de ADN recombinante são frequentes na forma de plasmideos. Na presente especificação, "plasmideo" e "vector" podem ser utilizados indistintamente na medida em que o plasmideo é a forma de vector utilizada mais comum. Contudo, a invenção pretende incluir outras formas de vectores de expressão, tais como vectores virais (e. g., retrovirus de replicação deficiente, adenovirus e virus adeno-associados), que servem funções equivalentes. 0 termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira") refere-se a uma célula na qual foi introduzido um vector de expressão recombinante. Deve ser entendido que esses termos pretendem referir-se não apenas à 48 célula de indivíduo particular, mas à progenie de uma tal célula. Dado que podem ocorrer certas modificações em gerações subsequentes devido quer a mutação ou influências ambientais, essa progenie pode, de facto, não ser idêntica à célula parental, mas estar ainda incluída no âmbito do termo "célula hospedeira" como aqui utilizado. 0 termo "transgene minilocus" refere-se a um transgene que compreende uma porção do locus genómico da imunoglobulina possuindo, pelo menos, uma deleção interna (i. e., não num terminal da porção) de uma porção de ADN não essencial (e. g., sequência de intervenção; intrão ou sua porção) em comparação com o locus Ig da linha germinal que ocorre naturalmente.
Um "marcador" é uma composição detectável por meio espectroscópico, fotoquímico, bioquímico, imunoquímico, ou químico. Por exemplo, marcadores úteis incluem 32P, corantes fluorescentes, reagentes densos aos electrões, enzimas (e. g., como normalmente utilizado numa ELISA), biotina, digoxigenina, ou haptenos e proteínas para os quais estão disponíveis anti-soros ou anticorpos monoclonais (e. g., os polipéptidos da invenção pode ser tornados detectáveis, e. g., incorporando um marcador radioactivo no péptido, e utilizado para detectar anticorpos especificamente reactivos com o péptido). 0 termo "escolha" no contexto de células como aqui utilizado refere-se a tanto à selecção física das células, como pode ser alcançado utilizando, e. g., um seleccionador de células activado por fluorescência, bem como à analise das células com base na expressão de marcadores de superfície celular, e. g., análise de FACS na ausência de escolha. 49 A frase "resposta de célula imunitária" refere-se à resposta das células do sistema imunitário a estímulos externos ou internos (e. g., antigénio, citocinas, quimiocinas, e outras células) produzindo alterações bioquímicas nas células imunitárias que resultam na migração de células imunitárias, morte de células alvo, fagocitose, produção de anticorpos, outros efectores solúveis da resposta imunitária, e semelhantes.
Os termos "resposta de linfócitos T" e "actividade de linfócitos T" são aqui utilizados indistintamente para se referirem ao componente de resposta imunitária dependente de linfócitos T (i. e., a proliferação e/ou diferenciação de linfócitos T em linfócitos T auxiliares, assassinos citotóxicos, ou supressores, o fornecimento de sinais por linfócitos T auxiliares a linfócitos B, que provoca ou previne a produção de anticorpo, a morte de células alvo especificas por linfócitos T citotóxicos, e a libertação de factores solúveis, tais como citocinas que modulam a função de outras células imunitárias) . 0 termo "resposta imunitária" refere-se à acção concertada de linfócitos, células apresentadoras de antigénio, células fagociticas, granulócitos, e macromoléculas solúveis produzidas pelas células acima ou do fígado (incluindo anticorpos, citocinas, e complemento) que resulta numa lesão selectiva, destruição, ou eliminação do corpo humano de patogénicos invasores, células ou tecidos infectados com patogénicos, células cancerosas, ou, nos casos de autoimunidade ou inflamação patológica, células humanas e normais ou tecidos.
Os componentes de uma resposta imunitária podem ser detectados in vitro por vários métodos que são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Por exemplo, (1) podem ser 50 incubados linfócitos T citotóxicos com células alvo marcadas radioactivamente e a lise destas células alvo detectadas pela libertação de radioactividade, (2) podem ser incubados linfócitos T auxiliares com antigénios e células apresentadoras de antigénio e a síntese e secreção das citocinas medidas por métodos convencionais (Windhagen A; et al.r 1995, Immunity 2(4): 373-80), (3) células apresentadoras de antigénio podem ser incubadas com o antigénio da proteína total e a apresentação desse antigénio em MHC detectada quer por ensaios de activação de linfócitos T ou por métodos biofísicos (Harding et al.r 1989, Proc. Natl. Acad. Sci.r 86:4230-4), (4) os mastócitos podem ser incubados com reagentes que apresentam reacção cruzada com os seus receptores Fc-epsilon e a libertação da histamina medida por imunoensaio enzimático (Siraganian, et al.r 1983, TIPS 4: 432-437).
De forma semelhante, os produtos de uma resposta imunitária quer num organismo modelo (e. g., murganho) ou num doente humano podem também ser detectados por vários métodos que são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Por exemplo, (1) a produção de anticorpos em resposta a vacinação pode ser prontamente detectada por métodos convencionais normalmente utilizados em laboratórios clínicos, e. g., uma ELISA; (2) a migração de células imunitárias para locais de inflamação pode ser detectada por raspagem da superfície da pele e colocação de um recipiente estéril para capturar as células migrantes ao longo do sítio de raspagem (Peters et al., 1988, Blood 72:1310-5); (3) a proliferação de células mononucleares do sangue periférico em resposta a mitogénios ou reacção de linfócitos mista pode ser medida utilizando 3H-timidina; (4) a capacidade fagocítica de granulócitos, macrófagos, e outros fagócitos em PBMCs pode ser medida colocando PMBCs em poços 51 juntamente com partículas marcadas (Peters et al.., 1988); e (5) a diferenciação de células do sistema imunitário pode ser medida por marcação de PBMCs com anticorpos contra moléculas de CD, tais como CD4 e CD8 e medindo a fracção dos PBMCs que expressa esses marcadores.
Como aqui utilizada, a frase "via de transdução de sinal" ou "evento de transdução de sinal" refere-se a, pelo menos, uma reacção bioquímica, mas mais normalmente, uma série de reacções bioquímicas, que resultam da interacção de uma célula com um composto ou agente estimulador. Deste modo, a interacção de um composto estimulador com uma célula cria um "sinal" que é transmitido através da via de transdução de sinal, resultando ultimamente - numa resposta celular, e. g., uma resposta imunitária descrita acima.
Uma via de transdução de sinal refere-se à relação bioquímica entre uma variedade de moléculas de transdução de sinal que desempenham um papel na transmissão de um sinal de uma porção de uma célula para outra porção de uma célula. As moléculas de transdução de sinal aqui divulgadas incluem, por exemplo, MAb 147.1 aqui divulgado. Como aqui utilizada, a frase "receptor da superfície celular" inclui moléculas e complexos de moléculas capazes de receber um sinal e a transmissão desse sinal através da membrana plasmática de uma célula. Um exemplo de um "receptor de superfície celular" da presente invenção é o receptor de células T (TCR) ou os ligandos B7 de CTLA-4.
Uma via de transdução de sinal numa célula pode ser iniciada pela interacção de uma célula com um estimulador que está dentro ou fora da célula. Se um estimulador exterior (i. e., fora da célula) (e. g., um complexo MHC-antigénio numa célula que 52 apresenta antigénio) interage com um receptor de superfície celular (e. g., um receptor de células T), uma via de transdução de sinal pode transmitir um sinal através da membrana da célula, através do citoplasma da célula, e em alguns casos para o núcleo. Se um estimulador interior (e. g., dentro da célula) interage com uma molécula de transdução de sinal intracelular, uma via de transdução de sinal pode resultar na transmissão de um sinal através do citoplasma da célula, e em alguns casos, para dentro do núcleo da célula.
Pode ocorrer transdução de sinal através, e. g., da fosforilação de uma molécula; interacções alostéricas não covalentes; complexação de moléculas; a alteração conformacional de uma molécula; libertação de cálcio; produção de fosfato de inositol; clivagem proteolítica; produção de nucleótido cíclico e produção de diacilglicérido. Tipicamente, a transdução de sinal ocorre através de fosforilação da molécula de transdução de sinal. 0 termo "activação não específica de células T" refere-se à estimulação de células T independentemente da sua especificidade antigénica. PRODUÇÃO DE ANTICORPOS HUMANOS CONTRA CTLA-4
Os anticorpos monoclonais (mAbs) e os anticorpos de sequência humana da invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo metodologia convencional de anticorpo monoclonal, e. g., a hibridação convencional de células somáticas de Kohler e Milstein, Nature 256:495 (1975). 53
Pode ser empregue qualquer técnica para produzir anticorpos monoclonais e. g., transformação virai ou oncogénica de linfócitos B. Um sistema animal para preparar hibridomas é o sistema de murideo. A produção de hibridomas no murganho é um processo muito bem estabelecido. Os protocolos e técnicas de imunização para o isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Os parceiros de fusão (e. g., células de mieloma de murideo) e processos de fusão também são conhecidos (ver, e. g., Harlow e Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Nova Iorque).
Anticorpos monoclonais humanos e anticorpos de sequência humana dirigidos contra CTLA-4 humana podem ser criados utilizando murganhos transgénicos comportando um sistema imunitário humano em vez do sistema de murganho. Estes murganhos transgénicos, também aqui referidos como "HuMAb-Mouse™", contêm um miniloci do gene da imunoglobulina humana que codifica as sequências da imunoglobulina da cadeia pesada não rearranjada (μ e γ) e da cadeia leve k, juntamente com mutações direccionadas que inactivam os loci da cadeia μ e κ (Lonberg, N. et ai., (1994) Nature 368(6474):856-859 e Patente US 5770429). Consequentemente, os murganhos apresentam expressão reduzida de IgM ou κ de murganho, e em resposta à imunização, os transgenes introduzidos de cadeia pesada e leve humana sofrem substituição de classe e mutação somática para produzir IgGx monoclonal humana com afinidade elevada (Lonberg, N. et al., (1994), supra; revisto em Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. e Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93, e Harding, F. e Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sei 764:536-546). A preparação de murganhos transgénicos é descrita em detalhe na Secção II abaixo e em 54
Taylor, L. et al., (1992) Nucleic Acids Research 20:6287 — 6295; Chen, J. et al., (1993) International Immunology 5:647—656; Tuaillon et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sei USA 90:3720—3724; Choi et al., (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., (1993) EMBO J. 12:821-830; Tuaillon et al., (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474):856-859;
Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. et al., (1994) International Immunology 6:579-591; Lonberg, N. e Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93; Harding, F. e Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sei 764:536-546; Fishwild, D. et al., (1996) Nature
Biotechnology 14:845-851. Ver ainda, Patentes U.S. Nos. 5625126 e 5770429, ambas de Lonberg e Kay, e GenPharm International; Patente U.S. N° 5 545 807 de Surani et al.; Publicações Internacionais Nos WO 98/24884, publicada em 11 de Junnho de 1998; WO 94/25585, publicada em 10 de Novembro de 1994; WO 93/1227, publicada em 24 de Junho de 1993; WO 92/22645, publicada em 23 de Dezembro de 1992; WO 92/03918, publicada em 19 de Março de 1992. Alternativamente, os transgenes CMD e HCo 12, descritos nos Exemplos 1 e 2, abaixo, podem ser utilizados para produzir anticorpos anti-CTLA-4 humana.
Processos detalhados para produzir anticorpos monoclonais totalmente humanos contra CTLA-4 são descritos nos Exemplos abaixo. A experiência cumulativa com vários antigénios demonstrou que os murganhos transgénicos respondem quando inicialmente imunizados intraperitonealmente (IP) com antigénio em adjuvante completo de Freund, seguido por imunizações IP em semanas alternadas (até um total de 6) com antigénio em adjuvante incompleto de Freund. Contudo, adjuvantes para além de Freund também demonstraram ser eficazes. Adicionalmente, células totais na ausência de adjuvante demonstraram ser altamente 55 imunogénicas. A resposta imunitária pode ser monitorizada ao longo do curso do protocolo de imunização com amostras de plasma sendo obtidas por sangrias retro-orbitais. 0 plasma pode ser rastreado por ELISA (como descrito abaixo), e murganhos com títulos suficientes de imunoglobulina anti-CTLA-4 humana podem ser utilizados para fusões. Os murganhos podem ser reforçados intravenosamente com antigénio 3 dias antes de serem sacrificados e 0 baço 1 removido Espera-se que possa ser necessário realizar 2- 3 fusões para cada imunização. São tipicamente imunizados entre 6 e 24 murganhos para cada antigénio. Normalmente, são utilizadas ambas as estirpes HCo7 e HCol2. Adicionalmente, ambos os transgenes HCo7 e HCo 12 podem ser cultivados em conjunto num único murganho possuindo dois transgenes de cadeia pesada humana diferentes.
Para purificar anticorpos anti-CTLA-4 humana, os hibridomas seleccionados podem ser cultivados em frascos de agitação de dois litros para purificação do anticorpo monoclonal. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteína A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) . 0 IgG eluído pode ser verificado por electroforese em gel e cromatografia líquida de elevado desempenho para assegurar a pureza. A solução tampão pode ser substituída para PBS, e a concentração pode ser determinada por OD280 utilizando coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser fraccionados e armazenados a -80 °C.
Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-CTLA-4 humana seleccionados se ligam a epitopos únicos, cada anticorpo pode ser biotinilado utilizando reagentes disponíveis comercialmente (Pierce, Rockford, IL). Estudos de competição utilizando anticorpos monoclonais não marcados e anticorpos 56 monoclonais biotinilados podem ser realizados utilizando placas de ELISA revestidas com CTLA-4, como descrito acima. A ligação a MAb biotinilado pode ser detectada com uma sonda de estreptavidina-fosfatase alcalina.
Para determinar o isotipo de anticorpos purificados, podem ser realizadas ELISAs para isotipo. Os poços de placas de
microtitulação podem ser revestidos com 1 pg/mL de IgG anti-humano durante a noite a 4 °C. Após bloqueamento com BSA a 1%, as placas são feitas reagir com 1 pg/mL ou menos de anticorpos monoclonais ou controlos de isotipo purificado, à temperatura ambiente durante uma a duas horas. Os poços podem então ser reagidos com sondas conjugadas com fosfatase alcalina, quer especificas para IgGl humana ou IgM humana. As placas são divulgadas e analisadas como descrito acima.
Para demonstrar a ligação de anticorpos monoclonais a células vivas expressando a CTLA-4, pode ser utilizada citometria de fluxo. Resumidamente, as linhas celulares que expressam CTLA-4 (cultivadas sob condições de crescimento convencionais) são misturadas com várias concentrações de anticorpos monoclonais em PBS contendo BSA a 0,1% e soro de vitela fetal a 10%, e incubadas a 37 °C durante 1 hora. Após lavagem, as células são feitas reagir com anticorpo IgG anti-humano marcado com Fluoresceina sob as mesmas condições que a coloração com o anticorpo primário. As amostras podem ser analisadas por instrumento de FACScan utilizando luz e propriedades de dispersão lateral para sairem células únicas. Pode ser utilizado um ensaio alternativo utilizando microscopia de fluorescência (adicionalmente a, ou em vez de) o ensaio de citometria de fluxo. As células podem ser coradas exactamente microscopia de como descrito acima e examinadas por 57 fluorescência. Este método permite a visualização de células individuais, mas pode possuir sensibilidade diminuída, dependendo da densidade do antigénio.
Podem ser ainda testados IgGs Anti-CTLA-4 humana para reactividade com antigénio de CTLA-4 por transferência de Western. Resumidamente, os extractos celulares das células que expressam CTLA-4 podem ser preparados e indivíduos a electroforese em gel de poliacrilamida com sulfato de dodecil de sódio. Após electroforese, os antigénios separados são transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados com soro de vitela fetal a 10%, e sondados com os anticorpos monoclonais a serem testados. A ligação de IgG humana pode ser detectada utilizando IgG anti-humana com fosfatase alcalina e divulgada com pastilhas de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).
PRODUÇÃO DE ANIMAIS TRANSGÉNICOS NÃO HUMANOS QUE CRIAM ANTICORPOS ΑΝΤΙ-CTLA-4 HUMANA MONOCLONAIS São aqui divulgados animais transgénicos não humanos, e. g., murganhos transgénicos, que são capazes de expressar anticorpos monoclonais humanos que se ligam especificamente a CTLA-4. Alguns animais transgénicos não humanos, e. g., os murganhos transgénicos, possuem um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve. Alguns animais transgénicos não humanos são imunizados com uma preparação purificada ou enriquecida de antigénio CTLA-4 e/ou células expressando CTLA-4. Alguns animais transgénicos não humanos são capazes de produzir isotipos múltiplos de anticorpos monoclonais humanos contra CTLA-4 (e. g., IgG, IgA e/ou IgE) 58 submetendo a recombinação de V-D-J e substituição de isotipo. A substituição de isotipo pode ocorrer através de, e. g., substituição de isotipo clássica ou não clássica. A construção de um animal transgénico não humano que responde a estimulação de antigénio estranho com um repertório de anticorpos heterólogos, requer que os transgenes de imunoglobulina heterólogos contidos no animal transgénico funcionem correctamente ao longo da via do desenvolvimento de células B. Em alguns murganhos, a função correcta de um transgene heterólogo de cadeia pesada inclui substituição de isotipo. Consequentemente, os transgenes da invenção são construídos de modo a produzir substituição de isotipo e um ou mais dos seguintes: (1) expressão de nível elevado e específica para o tipo de célula, (2) rearranjo de gene funcional, (3) activação de e resposta a exclusão alélica, (4) expressão de um repertório primário suficiente, (5) transdução de sinal, (6) hipermutação somática, e (7) domínio do locus do anticorpo do transgene durante a resposta imunitária.
Nem todos os critérios anteriores têm de ser cumpridos. Por exemplo, num animal transgénico em que os loci de imunoglobulina endógena dos animais transgénicos são funcionalmente interrompidos, o transgene não necessita de activar a exclusão alélica. Além disso, nos animais transgénicos em que o transgene compreende um gene de imunoglobulina de cadeia pesada e/ou leve funcionalmente rearranjado, o segundo critério de rearranjo de gene funcional não é necessário, pelo menos para o transgene que já está rearranjado. Para antecedentes em imunologia molecular, Ver, e. g., Fundamental Immunology, 4 a edição (1998), Paul, William E., ed. Lippencott-Raven Press, N.Y. 59
Alguns animais transgénicos não humanos utilizados para produzir os anticorpos monoclonais humanos da invenção contêm transgenes de cadeia pesada e cadeia leve de imunoglobulina heteróloga rearranjados, não rearranjados ou uma combinação de rearranjados e não rearranjados na linha germinal do animal transgénico. Cada um dos transgenes de cadeia pesada compreende, pelo menos, um gene CH. Adicionalmente, o transgene de cadeia pesada pode conter sequências de substituição de isotipo funcional, que são capazes de suportar substituição de isotipo de um transgene heterólogo codificando genes CH múltiplos nas células B do animal transgénico. Essas sequências de troca podem ser aquelas que ocorrem naturalmente no locus da imunoglobulina da linha germinal da espécie que serve como a fonte dos genes do transgene de CH, ou as sequências de troca pode ser derivadas daquelas que ocorrem na espécie que irá receber a construção do transgene (o animal transgénico). Por exemplo, uma construção de transgene humano que é utilizada para produzir um murganho transgénico pode produzir uma frequência mais elevada de eventos de substituição de isotipo se incorporar sequências de troca semelhantes às que ocorrem naturalmente no locus da cadeia pesada de murganho, como presumivelmente as sequências de substituição de murganho são optimizadas para funcionar com o sistema enzimático de recombinase de substituição de murganho, enquanto que as sequências de substituição de humano não são. As sequências de troca podem ser isoladas e clonadas através de métodos de clonagem convencionais, ou podem ser sintetizadas de novo a partir de oligonucleótidos sintéticos sobreponiveis concebidos com base na informação de sequências publicadas relacionadas com as sequências da região de substituição de imunoglobulina (Mills et al.., Nucl. Acids Res. 15:7305-7316 (1991); Sideras et al., Intl. Immunol. 1:631-642 (1989). 60
Para cada um dos animais transgénicos antecedentes, os transgenes de imunoglobulina de cadeia pesada e leve heterólogos rearranjados funcionalmente são encontrados numa fracção significativa das células B do animal transgénico (pelo menos 10 por cento).
Os transgenes utilizados para produzir os animais transgénicos da invenção incluem um transgene de cadeia pesada compreendendo ADN codificando, pelo menos, um segmento de gene variável, um segmento de gene de diversidade, um segmento de gene de união e, pelo menos, um segmento de gene da região constante. Os transgenes de imunoglobulina da cadeia leve compreendem ADN codificando, pelo menos, um segmento de gene variável, um segmento de gene de união e, pelo menos, um segmento de gene de região constante. Os segmentos de gene codificando os segmentos de gene de cadeia leve e pesada são heterólogos para o animal transgénico não humano no sentido em que eles derivam de, ou correspondem a, ADN codificando segmentos de gene da cadeia pesada e leve da imunoglobulina de uma espécie não consistindo no animal transgénico não humano. 0 transgene pode ser construído de modo a que os segmentos de gene individuais não são rearranjados, i. e., não rearranjados de modo a codificar uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina funcional. Esses transgenes não rearranjados suportam a recombinação dos segmentos de gene V, D, e J (rearranjo funcional) e, de um modo preferido, suportam a incorporação de todo ou de uma porção do segmento do gene da região D na cadeia pesada da imunoglobulina resultante rearranjado no animal transgénico não humano, quando exposto a antigénio de CTLA-4. 61
Esses transgenes compreendem, tipicamente, uma porção substancial dos segmentos C, D, e J, assim como um subconjunto dos segmentos do gene V. Nessas construções de transgene, as várias sequências reguladoras, e. g. promotores, intensificadores, regiões de substituição de classe, sequências dadoras de excisão e aceitadoras de excisão para o processamento de ARN, sinais de recombinação e afins, compreendem sequências correspondentes derivadas do ADN heterólogo. Essas sequências reguladoras podem ser incorporadas no transgene do mesmo tipo ou de uma espécie relacionada do animal não humano utilizado. Por exemplo, segmentos de gene de imunoglobulina humana podem ser combinados num transgene com uma sequência intensificadora de imunoglobulina de roedor para utilização num murganho transgénico. Alternativamente, podem ser incorporadas sequências de regulação sintéticas no transgene, em que essas sequências de regulação sintéticas não são homólogas a uma sequência de ADN funcional que é conhecida por ocorrer naturalmente nos genomas de mamíferos. As sequências de regulação sintéticas são concebidas de acordo com regras de consenso, tais como, por exemplo, aquelas que especificam as sequências permissiveis de um sítio aceitador de excisão e ou um motivo de promotor/intensificador. 0 transgene pode compreender um minilocus.
Alguns animais transgénicos utilizados para produzir anticorpos humanos contra CTLA-4 contêm, pelo menos, uma, tipicamente 2-10, e por vezes 25-50 ou mais cópias do transgene descrito no Exemplo 37 da Patente US 5770429, ou do transgene descrito no Exemplo 2 abaixo (e. g., HCol2), pelo menos, uma cópia de um transgene de cadeia leve descrito nos Exemplos 38 da Patente US 5 770 429, duas cópias da deleção Cmu descrita no
Exemplo 1 abaixo, e duas cópias da deleção JKapa descrita no 62
Exemplo 9 da Patente US 5770429. Os animais resultantes são injectados com antigénios e utilizados para produção de anticorpos monoclonais humanos contra estes antigénios.
Alguns animais transgénicos exibem produção de imunoglobulina com um repertório significativo, idealmente substancialmente, semelhante ao do murganho nativo. Deste modo, por exemplo, animais em que os genes de Ig endógenos foram inactivados, os níveis de imunoglobulina total variam desde cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/mL de soro.
As imunoglobulinas expressadas pelos murganhos transgénicos reconhecem, tipicamente, cerca de metade ou mais de proteínas altamente antigénicas, e. g., proteína A de Staphylococcus. Tipicamente, as imunoglobulinas exibem uma constante de associação para antigénios pré-seleccionados de, pelo menos, cerca de ΙΟ7 Μ'1, ΙΟ8 Μ'1, 109 Μ"1, ΙΟ10 Μ"1, 1011 Μ"1, 1012 M"1, 1013 M"1, ou superior.
Os murganhos transgénicos podem ser imunizados com uma preparação purificada ou enriquecida de antigénio de CTLA-4 humana (ou seu fragmento antigénico) e/ou células expressando CTLA-4 humana como descrito anteriormente. Os murganhos produzem células B que sofrem substituição de classe através de recombinação de troca intratransgene (troca em cis) e expressam imunoglobulinas reactivas com CTLA-4. As imunoglobulinas podem ser sequência de anticorpos de humanos, em que os polipéptidos da cadeia pesada e leve são codificados por sequências de transgene humanas, que podem incluir sequências derivadas por mutação somática e junções recombinatórias da região V, assim como sequências codificadas pela linha germinal; estas imunoglobulinas de sequência humana podem ser referidas como 63 sendo substancialmente idênticas a uma sequência de polipéptido codificada por um segmento de gene de VL ou VH humana e um segmento de JL ou JH humana, mesmo embora possam estar presentes outras sequências não da linha germinal como um resultado da mutação somática e juntas de recombinação diferencial V-J e V-D-J. Em relação a essas sequências de anticorpos humanas, as regiões variáveis de cada cadeia são tipicamente, pelo menos, 80 por cento codificadas por segmentos do gene V, J, da linha germinal humana e, no caso segmentos do gene de cadeias pesadas, D; frequentemente, pelo menos, 85 por cento das regiões variáveis são codificadas por sequências da linha germinal humana presentes no transgene; frequentemente 90 ou 95 por cento ou mais das sequências da região variável são codificadas por sequências da linha germinal humana presentes no transgene. Contudo, uma vez que as sequências não da linha germinal são introduzidas por mutação somática e junção de VJ e VDJ, os anticorpos de sequência humana possuem, frequentemente, algumas sequências da região variável (e menos frequentemente sequências da região constante) que não são codificadas por segmentos dos genes V, D, ou J humanos, como se encontra no(s) transgene (s) humanos na linha germinal dos murganhos. Tipicamente, essas sequências não da linha germinal (ou posições de nucleótidos individuais) agrupam-se nas CDRs ou próximo destas, ou nas regiões em que se sabe que as mutações somáticas se agrupam.
Os anticorpos de sequência humana que se ligam ao antigénio pré-determinado podem resultar de substituição de isotipo, de modo a que sejam produzidos anticorpos humanos compreendendo uma cadeia γ de sequência humana (tal como γΐ, γ2, γ3, ou γ4) e uma cadeia leve de sequência humana (tal como Kapa ou lambda). Esses anticorpos de sequência humana de isotipo trocado contêm, frequentemente, uma ou mais mutações somáticas, tipicamente na 64 região variável e frequentemente na CDR ou a cerca de 10 resíduos desta, como um resultado da maturação de afinidade e selecção de células B por antigénio, particularmente subsequente ao desafio com antigénio secundário (ou subsequente). Alguns anticorpos de sequência humana de elevada afinidade possuem constantes de associação em equilíbrio de, pelo menos, cerca de 1 x 107 M’1, ou, pelo menos, cerca de 1 x 108 M’1, ou mais do que cerca de 1 x 109 M_1, ou 5 x 109 M_1 até 1 x 1011 M"1 ou superior.
Outro aspecto da divulgação aqui apresentada refere-se às as células B desses murganhos que podem ser utilizadas para gerar hibridomas expressando anticorpos monoclonais humanos que se ligam com afinidade elevada (e. g., possuindo constante de associação superior a 107 M"1) para CTLA-4. Estes hibridomas são utilizados para produzir uma composição compreendendo uma imunoglobulina possuindo uma constante de associação (Ka) de, pelo menos, 107 M’1 para a ligação a CTLA-4. Essa imunoglobulina contém uma cadeia leve de sequência humana composta por uma região variável da cadeia leve possuindo uma sequência de polipéptido que é substancialmente idêntica à sequência de polipéptido codificada por um segmento de gene Vk ou VÀ humano e um segmento de Jk ou JÀ humano, e uma região constante da cadeia leve possuindo uma sequência de polipéptido que é substancialmente idêntica à sequência de polipéptido codificada por um segmento humano do gene Ck ou CX. Também contém uma cadeia pesada de sequência humana composta por uma região variável da cadeia pesada possuindo uma sequência de polipéptido que é substancialmente idêntica à sequência de polipéptido codificada por um segmento de gene VH humano, opcionalmente uma região D, e um segmento de JH humano, e uma região constante possuindo uma sequência de polipéptido que é substancialmente 65 idêntica a uma sequência de polipéptido codificada por um segmento de gene CH humano.
Também são aqui divulgados anticorpos monoclonais humanos e anticorpos de sequência humana contra CTLA-4 humana derivada ou ligada a outra molécula funcional, e. g., outro péptido ou proteína (e. g., a citocina, um agente citotóxico, um agente de estimulação ou inibição imunitária, um fragmento Fab', e semelhantes, como discutido acima) para produzir uma molécula biespecífica ou multiespecífica que se liga a sítios de ligação múltipla ou epitopos alvo. Por exemplo, um anticorpo ou porção de ligação ao antigénio da invenção pode ser ligado funcionalmente (e. g., por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outro tipo) a uma ou mais moléculas de ligação diferentes, tais como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, péptido ou ligação mimética.
Consequentemente, são aqui divulgadas composições biespecíficas e multiespecíficas compreendendo, pelo menos, um anticorpo de sequência humana ou fragmento de ligação ao antigénio com uma primeira especificidade de ligação para CTLA-4 humana e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epitopo alvo. 0 segundo epitopo alvo pode ser um receptor Fc, e. g., FcyRI humano ou um receptor de Fcy humano. Deste modo, são divulgadas moléculas biespecíficas e multiespecíficas capazes de ligação a células efectoras que expressam quer FcyRI, FcyR ou FcsR (e. g., monócitos, macrófagos ou células polimorfonucleares (PMNs)), e a células alvo que expressam CTLA-4 humana. Estas moléculas multi-específicas (e. g., biespecífica ou multiespecífica) direccionam-se para células efectoras que expressam CTLA-4 humana, e despoletam actividades de células efectoras mediadas pelo receptor Fc, tais como fagocitose de 66 células que expressam uma CTLA-4 humana, citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC), libertação de citocina, ou criação do anião de superóxido.
As moléculas biespecíficas e multiespecíficas podem compreender a especificidade de ligação, pelo menos, um anticorpo, ou um seu fragmento de anticorpo, incluindo, e. g., um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ou um Fv de cadeia única. 0 anticorpo pode também ser um dimero de cadeia leve ou cadeia pesada, ou qualquer fragmento minimo deste, tal como um Fv ou uma construção de cadeia única, como descrito em, e. g., Ladner et al., Patente U.S. N° 4946778. As moléculas da invenção biespecíficas e multiespecificas podem compreender uma especificidade de ligação para um FcyR ou um FcyR presente na superfície de uma célula efectora, e uma segunda especificidade de ligação para um antigénio de célula alvo, e. g., CTLA-4 humana. A especificidade de ligação para um receptor de Fc é proporcionada por um anticorpo monoclonal, cuja ligação não é bloqueada pela imunoglobulina G humana (IgG). Como aqui utilizado, o termo "receptor de IgG" refere-se a qualquer um dos oito genes de cadeia y localizados no cromossoma 1. Estes genes codificam para um total de doze isoformas de transmembrana ou receptor solúvel que estão agrupadas nas três classes de receptor de Fcy: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), e FcyRIII (CDI6). Por exemplo, o receptor de Fcy pode ser um FcyRI humano de afinidade elevada. 0 FcyRI humano é uma molécula de 72 kDa, que apresenta afinidade elevada para IgG monomérico (108 até 109 M”1). A produção e caracterização destes anticorpos monoclonais
preferidos são descritas por Fanger et al. no Pedido de PCT 67 WO 88/00052 e na Patente U.S. N° 4954617. Estes anticorpos ligam-se a um epitopo de FcyRI, FcyRII ou FcyRIII num sítio que é distinto do sítio de ligação a Fcy do receptor e, deste modo, a sua ligação não é substancialmente bloqueada por níveis fisiológicos de IgG. Anticorpos específicos anti-FcyRI úteis nesta invenção são MAb 22, MAb 32, MAb 44, MAb 62 e MAb 197. O hibridoma que produz MAb 32 está disponível na American Type Culture Collection, N° de Acesso da ATCC HB9469. Fragmentos F(ab')2 MAb 22 anti-FcYRI, de MAb 22, e podem ser obtidos de Medarex, Inc. (Annandale, N.J.). O anticorpo anti-receptor Fcy também pode ser uma forma humanizada de anticorpo monoclonal 22 (H22). A produção e caracterização do anticorpo H22 está descrita em Graziano (1995) J. Immunol 155:4996-5002 e documento PCT/US93/10384 (WO 94/10332). A linha celular que produz o anticorpo H22 foi depositada na American Type Culture Collection a 4 de Novembro de 1992 sob a designação HA022CL1 e tem o n° de acesso CRL 11177. A especificidade de ligação para um receptor Fc também pode ser proporcionada por um anticorpo que se liga a um receptor de IgA humano, e. g., um receptor Fc-alfa (FcaR (CD89) ) . De um modo preferido, o anticorpo liga-se a um receptor de IgA humano num sítio que não é bloqueado por IgA endógena. O termo "receptor de IgA" pretende incluir o produto do gene de um gene-α (FcaRI) localizado no cromossoma 19. Este gene é conhecido por codificar várias isoformas de transmembrana alternativamente excisados de 55 a 110 kDa. FcaRI (CD89) é expresso constitutivamente em monócitos/macrófagos, granulócitos eosinofílicos e neutrofilicos, mas não em populações de células não efectoras. O FcaRI possui afinidade média (¾ 5 X 107 M’1) tanto para IgAl como IgA2, que é aumentado após exposição a citocinas, tais como G-CSF ou GM-CSF (Morton (1996) Criticai Reviews in Immunology 68 16:423-440). Quatro anticorpos monoclonais específicos para FcocRI, identificados como A3, A59, A62 e A77, que se ligam a FcaRl fora do domínio de ligação ao ligando IgA, foram descritos por, e.g., Monteiro (1992) J. Immunol. 148:1764.
Moléculas biespecíficas e multiespecíficas podem compreender ainda uma especificidade de ligação que reconhece, e. g., se liga a, um antigénio de célula alvo, e. g. CTLA-4 humana. A especificidade de ligação é proporcionada por um anticorpo de sequência humana ou um anticorpo monoclonal humano da presente invenção.
Um "anticorpo específico para a célula efectora", como aqui utilizado, refere-se a um anticorpo ou fragmento de anticorpo funcional que se liga ao receptor Fc das células efectoras. Anticorpos preferidos para utilização em ligação com o objecto da invenção ligam-se ao receptor Fc das células efectoras num sítio que não está ligado por imunoglobulina endógena.
Como aqui utilizado, o termo "célula efectora" refere-se a uma célula imunitária que está envolvida na fase efectora de uma resposta imunitária, em oposição às fases de activação cognitiva de uma resposta imunitária. Células imunitárias exemplares incluem uma célula de uma origem mielóide ou linfóide, e. g., linfócitos (e. g., células B e células T incluindo células T citolíticas (CTLs)), células assassinas, células assassinas naturais, macrófagos, monócitos, eosinófilos, neutrófilos, células polimorfonucleares, granulócitos, mastócitos, e basófilos. As células efectoras expressam receptores Fc específicos e realizam funções imunitárias específicas. Uma célula efectora pode induzir citotoxicidade mediada por células dependentes do anticorpo (ADCC), e. g., um neutrófilo capaz de 69 induzir ADCC. Por exemplo, monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, e linfócitos que expressam FcaR estão envolvidos na morte especifica de células alvo e apresentando antigénios a outros componentes do sistema imunitário, ou ligação a células que apresentem antigénios. Uma célula efectora também pode fagocitar um antigénio alvo, célula alvo, ou microrganismo. A expressão de um FcR particular numa célula efectora pode ser regulada por factores humorais, tais como citocinas. Por exemplo, verificou-se que a expressão de FcyRI era regulada positivamente por interferão gama (IFN-γ). Esta expressão intensificada aumenta a actividade citotóxica (incluindo, e. g., fagocitose) por células contendo FcyRI contra células alvo. "Célula alvo" significará qualquer célula indesejável num indivíduo (e. g., um humano ou animal) que pode ser alvo de uma composição (e. g., um anticorpo de sequência humana ou um anticorpo monoclonal humano da invenção, uma molécula biespecífica ou multiespecífica da invenção). A célula alvo pode ser uma célula expressando ou sobre-expressando CTLA-4 humana. Células expressando CTLA-4 humana podem incluir células tumorais, e. g. linfomas.
Adicionalmente a anticorpos de sequência humana e anticorpos monoclonais humanos da invenção, também podem ser empregues outros anticorpos nas moléculas biespecíficas ou multiespecíficas, incluindo, e. g., anticorpos monoclonais de murídeo, quiméricos e humanizados.
Anticorpos monoclonais quiméricos de murganho-humanos (i. e., anticorpos quiméricos) podem ser produzidos por técnicas de ADN recombinante conhecidas na técnica. Por exemplo, um gene 70 codificando a região de Fc constante de uma molécula de anticorpo monoclonal de murideo (ou outra espécie) é digerida com enzimas de restrição para remover a região codificando o Fc de murideo, e a porção equivalente de um gene codificando uma região constante de Fc humano é substituído. {Ver, e. g., Robinson et al., Publicação de Patente Internacional PCT/US86/02269 (WO 87/02671); Akira, et al., Pedido de Patente Europeia 184 187; Taniguchi, M., Pedido de Patente Europeia 171496; Morrison et al., Pedido de Patente Europeia 173494; Neuberger et al., Pedido Internacional WO 86/01533; Cabilly et al., Patente U.S. N° 4816567; Cabilly et al., Pedido de Patente Europeia 125023; Better (1988) Science 240:1041-1043; Liu (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura (1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood (1985) Nature 314: 446-449; Shaw (1988) J. Natl. Câncer Inst. 80:1553-1559) . O anticorpo quimérico pode ser ainda humanizado substituindo sequências da região variável de Fv que não estão directamente envolvidas na ligação ao antigénio com sequências equivalentes de regiões variáveis de Fv humano. Revisões gerais de anticorpos quiméricos humanizados são proporcionadas por Morrison (1985) Science 229:1202-1207 e por Oi (1986) BioTechniques 4:214. Esses métodos incluem isolamento, manipulação, e expressão de sequências de ácido nucleico que codificam a totalidade ou parte das regiões variáveis de Fv de imunoglobulina de, pelo menos, uma das cadeias pesada ou leve. Fontes desse ácido nucleico são bem conhecidas dos especialistas na técnica e, por exemplo, podem ser obtidas de 7E3, um anticorpo anti-GPIIbIIIa produzindo hibridoma. O ADN recombinante codificando o anticorpo quimérico, ou seu fragmento, pode ser então clonado num vector de expressão apropriado. Anticorpos humanizados adequados podem ser 71 produzidos alternativamente por substituição de CDR Patente U.S. 5225539; Jones (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al., 1988 Science 239:1534; e Beidler (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.
Todas as CDRs de um anticorpo humano particular podem ser substituídas com, pelo menos, uma porção de uma CDR não humana ou apenas algumas das CDRs podem ser substituídas com CDRs não humanas. É apenas necessário substituir o número de CDRs necessárias para ligação do anticorpo humanizado ao receptor Fc. Um anticorpo pode ser humanizado por qualquer método, que é capaz de substituir, pelo menos, uma porção de uma CDR de um anticorpo humano com uma CDR derivada de um anticorpo não humano. Winter descreve um método que pode ser utilizado para preparar os anticorpos humanizados da presente invenção, ver Pedido de Patente GB 2188638A, do Reino Unido, apresentada em 26 de Março de 1987. As CDRs humanas podem ser substituídas com CDRs não humanas utilizando mutagénese dirigida por oligonucleótido, como descrito em, e. g., docuemnto WO 94/10332 intitulado, Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes.
Anticorpos quiméricos e humanizados em que foram substituídos, removidos ou adicionados aminoácidos específicos também estão no âmbito desta divulgação. Por exemplo, anticorpos humanizados podem possuir substituições de aminoácidos na região de grelha, tais como para melhorar a ligação ao antigénio. Num anticorpo humanizado possuindo CDRs de murganho, os aminoácidos localizados na região de grelha humana podem ser substituídos com os aminoácidos localizados nas posições correspondentes no anticorpo de murganho. Sabe-se que essas substituições melhoram a ligação de anticorpos humanizados contra o antigénio em alguns casos. Os anticorpos em que foram adicionados, removidos ou 72 substituídos aminoácidos são aqui referidos como anticorpos modificados ou anticorpos alterados.
Moléculas biespecíficas e multiespecíficas como aqui divulgadas podem ainda incluir uma terceira especificidade de ligação, adicionalmente a uma especificidade de ligação anti-Fc e uma especificidade de ligação humana anti-CTLA-4. A terceira especificidade de ligação pode ser uma porção anti-factor de intensificação (EF), e. g., uma molécula que se liga a uma proteína de superfície envolvida na actividade citotóxica e desse modo aumenta a resposta imunitária contra a célula alvo. A "porção anti-factor de intensificação" pode ser um anticorpo, fragmento de anticorpo funcional ou um ligando que se liga a uma dada molécula, e. g., um antigénio ou um receptor, e deste modo resulta num aumento do efeito dos determinantes de ligação para o receptor Fc ou antigénio de célula alvo. A "porção anti-factor de intensificação" pode ligar-se a um receptor Fc ou um antigénio de célula alvo. Alternativamente, a porção anti-factor de intensificação pode ligar-se a uma entidade que é diferente da entidade à qual a primeira e segunda especificidades de ligação se ligam. Por exemplo, a porção anti-factor de intensificação pode ligar-se a célula T citotóxica através de, e. g., CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ou outras moléculas de célula imunitária que estão envolvidas numa resposta imunitária aumentada contra a célula alvo.
Moléculas biespecíficas e multiespecíficas como aqui divulgadas podem ser produzidas utilizando técnicas químicas (ver, e. g., Kranz (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:5807), técnicas de "polidoma" (ver, e. g., Patente U.S. 4474893), ou técnicas do ADN recombinante. Moléculas biespecíficas e multiespecíficas também podem ser preparadas por conjugação das 73 especificidades de ligação constituintes, e. g., a anti-FcR e anti-humano. As especificidades de ligação a CTLA-4, utilizando métodos conhecidos na técnica e como aqui descrito. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecifica e multiespecifica pode ser criada separadamente e depois conjugadas uma com a outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou péptidos, uma variedade de acoplamento ou agentes de ligação reticulada podem ser utilizados pata conjugação covalente. Exemplos de agentes de ligação reticulada incluem proteina A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil- tioacetato (SATA), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), e sulfossuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (ver, e. g., Karpovsky (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:8648). Outros métodos incluem aqueles descritos por Paulus (Behríng Ins. Mitt. (1985) N° 78, 118-132; Brennan (1985) Science 229:81-83), Glennie (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Outros agentes conjugantes são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Quando as especificidades de ligação são anticorpos (e. g., dois anticorpos humanizados), eles podem ser conjugados através de ligação sulfidrilo das regiões da dobra do terminal C das duas cadeias pesadas. A região da dobra pode ser modificada para conter um número impar de resíduos sulfidrilo, e. g., um, antes da conjugação.
Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vector e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil quando a molécula biespecifica e multiespecifica é uma proteína de fusão MAb x MAb, MAb x Fab, Fab x F(ab')2 ou ligando x Fab. Uma 74 uma molécula biespecífica e multiespecifica da invenção, e. g., molécula biespecífica pode ser uma molécula de cadeia única, tais como um anticorpo biespecífico de cadeia única, uma molécula biespecífica de cadeia única compreendendo um anticorpo de cadeia única e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia única compreendendo dois determinantes de ligação. As moléculas biespecífica e multiespecifica também podem ser moléculas de cadeia única ou podem compreender, pelo menos, duas moléculas de cadeia única. Métodos para preparar moléculas bi- e multiespecíficas são descritos, por exemplo, na Patente U.S. Número 5260203; Patente U.S. Número 5455030; Patente U.S. Número 4881175; Patente U.S. Número 5132405; Patente U.S. Número 5091513; Patente U.S. Número 5476786; Patente U.S. Número 5013653; Patente U .S. Número 5258498; e
Patente U.S. Número 5482858. A ligação das moléculas biespecífica e multiespecifica aos seus alvos específicos pode ser confirmada por ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA), um radioimunoensaio (RIA), ou um Ensaio de Transferência de Western. Cada um destes ensaios detecta, geralmente, a presença de complexos proteína-anticorpo de particular interesse empregando um reagente marcado (e. g., um anticorpo) específico para o complexo de interesse. Por exemplo, os complexos FcR-anticorpo podem ser detectados utilizando e. g., um anticorpo ligado a enzima ou fragmento de anticorpo que reconhece e se liga especificamente aos complexos anticorpo-FcR. Alternativamente, os complexos podem ser detectados utilizando qualquer um de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado radioactivamente e utilizado num radioimunoensaio (RIA) (ver, por exemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays,
Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The 75
Endocrine Society, Março de 1986) . 0 isotopo radioactivo pode ser detectado por tais meios como a utilização de um contador γ ou um contador de cintilações ou por autorradiografia.
Também incluídos na presente divulgação estão anticorpos modificados. 0 termo "anticorpo modificado" incluir anticorpos, tais como anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos, e anticorpos humanizados que foram modificados por, e. 9-' remoção, adição, ou substituição de porções do anticorpo. Por exemplo, um anticorpo pode ser modificado por remoção da região constante e substitui-lo com uma região constante destinada a aumentar a semi-vida, e. g., semi-vida no soro, estabilidade ou afinidade do anticorpo.
Os conjugados de anticorpos aqui divulgados podem ser utilizados para modificar uma dada resposta biológica ou criar uma resposta biológica (e. g., para recrutar células efectoras). A unidade de fármaco não deve ser encarada como limitada a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a unidade de fármaco pode ser uma proteína ou polipéptido possuindo uma actividade biológica desejada. Essas proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente activa, ou seu fragmento activo, tais como abrina, rícino A, exotoxina de Pseudomonas, ou toxina da difteria; uma proteína, tal como factor da necrose tumoral ou interferâo-alfa; ou, modificadores de resposta biológica, tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor de estimulação de colónia de macrófago de granulócitos ("GM-CSF"), factor de estimulação de colónia de granulócitos ("G-CSF"), ou outros factores de crescimento. 76 Técnicas para conjugar essa unidade terapêutica de anticorpos são bem conhecidas, ver, e. g., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinicai Applications, Pinchera et al., (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, and Future
Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Câncer Detection and Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., "The Preparation and Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982) .
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS A invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo um ou uma combinação de anticorpos monoclonal humanos e/ou anticorpos de sequência humana (intacto ou fragmentos de ligação) formulados juntamente com um veiculo farmaceuticamente aceitável. Algumas composições podem incluir uma combinação de múltiplos (e. g., dois ou mais) anticorpos humanos isolados e/ou anticorpo de sequência humana ou porções de ligação ao seu antigénio da invenção. Em algumas composições, cada um dos anticorpos ou porções de ligação ao seu antigénio da composição é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo de 77 sequência humana que se liga a um epitopo distinto, pré-seleccionado de CTLA-4 humana. A. Dosagens Eficazes
Os regimes de dosagem são ajustados para proporcionar a resposta óptima desejada (e. g., uma resposta terapêutica). Por exemplo, pode ser administrado um único bolus, podem ser administradas várias doses divididas ao longo do tempo ou a dose pode ser reduzida ou aumentada proporcionalmente, como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas na forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade da dosagem. A forma de dosagem unitária, como aqui utilizada, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade pré-determinada de composto activo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido. A especificação para as formas de dosagem unitária da invenção são ditadas por e estão directamente dependentes de (a) as características únicas do composto activo e o efeito terapêutico particular a ser alcançado, e (b) as limitações inerentes na técnica de formação de compostos, tais como composto activo para o tratamento de sensibilidade nos indivíduos.
Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e semelhantes; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de 78 hidroxitolueno ascorbilo, hidroxianisole butilado (BHA) , butilado (BHT), lecitina, gaiato de propilo, alfa-tocoferol, e semelhantes; e (3) agentes quelantes metálicos, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetra acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e semelhantes.
Independentemente da via de administração seleccionada, os compostos da presente invenção, que pode ser utilizada numa forma hidratada adequada, e/ou as composições farmacêuticas da presente invenção, são formuladas nas formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis através de métodos convencionais conhecidos dos especialistas na técnica.
Os níveis actuais de dosagem dos ingredientes activos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente activo que é eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um doente particular, composição, e modo de administração, sem ser tóxico para o doente. 0 nível de dosagem seleccionado depende de uma variedade de factores farmacocinéticos incluindo a actividade das composições particulares da presente invenção empregues, ou o éster, sal ou amida deste, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular a ser empregue, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com as composições particulares empregues, a idade, sexo, peso, estado, saúde geral e história clínica antecedente do doente a ser tratado, e factores semelhantes.
Um médico ou veterinário pode iniciar doses dos compostos da invenção empregues na composição farmacêutica a níveis mais baixos do que os requeridos para alcançar o efeito terapêutico 79 desejado e gradualmente aumentar a dosagem até que seja alcançado o efeito desejado. Em geral, uma dose diária adequada das composições da invenção é que a quantidade do composto que é a dose mais baixa eficaz para produzir um efeito terapêutico. Essa dose eficaz depende, geralmente, dos factores descritos acima. É preferido que a administração seja intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, ou subcutânea, ou administrada próxima do sítio do alvo. Se desejado, a dose diária eficaz das composições terapêuticas pode ser administrada como duas, três, quatro, cinco, seis ou mais sub-doses administradas separadamente a intervalos apropriados ao longo do dia, opcionalmente, em formas de dosagem unitárias. Embora seja possível para um composto da presente invenção ser administrado isoladamente, é preferido administrar o composto como uma formulação farmacêutica (composição).
Doses eficazes das composições da presente invenção, para o tratamento de estados e doenças relacionados com o sistema imunitário aqui descritos variam dependendo de muitos factores diferentes, incluindo meios de administração, sítio alvo, estado fisiológico do doente; quer o doente seja humano ou um animal, outros medicamentos administrados, e se o tratamento é profiláctico ou terapêutico. As dosagens de tratamento têm que ser tituladas para optimizar a segurança e a eficácia.
Para administração com um anticorpo, os intervalos de dosagem de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais normalmente 0,01 a 5 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser de 1 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou no intervalo de 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplar compreende administração uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês ou vez a cada 3 a 6 meses. Em alguns 80 métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com diferentes especificidades de ligação são administradas simultaneamente, em que caso a dosagem de cada anticorpo administrado cai dentro dos intervalos indicados. 0 anticorpo é normalmente administrado em múltiplas ocasiões. Os intervalos entre dosagens únicas podem ser semanalmente, mensalmente ou anualmente. Os intervalos podem também ser irregulares como indicado medindo os niveis sanguíneos de anticorpo contra CTLA-4 no doente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para atingir uma concentração de anticorpo no plasma de 1-1000 pg/mL e em alguns métodos 25 - 300 pg/mL. Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de libertação sustentada, e nesse caso é necessária administração menos frequente. A dosagem e a frequência variam dependendo da semi-vida do anticorpo no doente. Em geral, os anticorpos humanos apresentam a semi-vida mais longa, seguido por anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, e anticorpos não humanos. A dosagem e frequência de administração podem variar dependendo se o tratamento é profiláctico ou terapêutico. Em aplicações profilácticas, é administrada uma dosagem relativamente baixa a intervalos relativamente infrequentes ao longo de um período de tempo longo. Alguns doentes continuam a receber tratamento para o resto das suas vidas. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente elevada em intervalos relativamente curtos é por vezes requerida até que a progressão da doença é reduzida ou terminada, e de um modo preferido até que o doente apresenta melhoras parciais ou completas dos sintomas da doença, posteriormente, o doente pode ser administrado com um profiláctico.
Doses para ácidos nucleicos codificando imunogénios variam desde cerca de 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 pg a 10 mg, ou 81 30-300 μς de ADN por doente. As doses para vectores virais infecciosos variam desde 10-100, ou mais, viriões por dose.
Alguns anticorpos de sequência humana e anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser formulados para assegurar distribuição apropriada in vivo. Por exemplo, a barreira hematoencefálica (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofilicos. Para assegurar que os compostos terapêuticos da invenção atravessam a BBB (se desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para os métodos de preparação de lipossomas, Ver, e. g., Patentes U.S. 4522811; 5374548; e 5399331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais unidades que são selectivamente transportadas para células ou órgãos específicos, aumentando assim a distribuição de fármaco direccionado (ver, e. g., V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Unidades de direccionamento exemplares incluem folato ou biotina (ver, e. g., Patente U.S. 5416016 de Low et al.); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticorpos (P.G. Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de proteína A tensioactiva (Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134), da qual diferentes espécies podem compreender as formulações das invenções, assim como componentes das moléculas inventadas; pl20 (Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); Ver também K. Keinanen; M.L. LaukKanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J.
Fidler (1994) Immunomethods 4:273. Nalguns métodos, os compostos terapêuticos da invenção são formulados em lipossomas; numa forma de realização mais preferida, os lipossomas incluem uma unidade de direccionamento. Nalguns métodos, os compostos terapêuticos nos lipossomas são distribuídos por injecção de bolus a um sítio próximo do tumor ou infecção. A composição deve 82 ser fluida até ao ponto em que exista facilidade de aplicação com seringa. Deve ser estável nas condições de preparação e armazenamento e deve ser preservada contra a acção de contaminação de microrganismos, tais como bactérias e fungos.
Para aplicações terapêuticas, as composições farmacêuticas são administradas a um doente que sofre de doença estabelecida numa quantidade suficiente para parar ou inibir maior desenvolvimento ou reverter ou eliminar a doença, os seus sintomas ou marcadores bioquímicos. Para aplicações profilácticas, as composições farmacêuticas são administradas a um doente susceptível ou em risco de uma doença numa quantidade suficiente para retardar, inibir ou evitar o desenvolvimento da doença, seus sintomas e marcadores bioquímicos. Uma quantidade adequada para concretizar isto é definida como uma "dose terapeuticamente" ou "profilacticamente eficaz". A dosagem depende da doença a ser tratada, o tamanho do indivíduo, a gravidade dos sintomas do indivíduo, e a composição ou via de administração particular seleccionada. Especificamente, no tratamento de tumores, uma "dosagem terapeuticamente eficaz" pode inibir o crescimento tumoral em, pelo menos, cerca de 20%, ou, pelo menos, cerca de 40%, ou pelo menos cerca de 60%, ou, pelo menos, cerca de 80% em relação a indivíduos não tratados. A capacidade de um composto para inibir o cancro pode ser avaliada num sistema de modelo animal que prediz a eficácia em tumores humanos. Alternativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada examinando a capacidade do composto para inibir através de ensaios convencionais ín vitro. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor, ou de outra forma melhorar os sintomas num indivíduo. 83 A composição deve ser estéril e fluida até ao ponto em que seja possível distribuir a composição através de seringa. Adicionalmente à água, o veículo pode ser uma solução salina isotónica tamponada, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido, e semelhantes), e suas misturas adequadas. Pode ser mantida fluidez apropriada, por exemplo, através da utilização de revestimento, tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e por utilização de tensioactivos. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol ou sorbitol, e cloreto de sódio na composição. A absorção a longo termo das composições injectáveis pode ser realizada incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina.
Quando o composto activo é protegido adequadamente, como descrito acima, o composto pode ser administrado oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou um veículo assimilável comestível. B. Vias de Administração
As composições farmacêuticas da invenção também podem ser administradas em terapêutica de combinação, i. e., combinadas com outros agentes. Por exemplo, no tratamento do cancro, a terapêutica de combinação pode incluir uma composição da presente invenção com, pelo menos, um agente anti-tumoral ou outra terapêutica convencional, tal como tratamento com radiação. 84
Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de retardamento de absorção, e semelhantes que são fisiologicamente compatíveis. 0 veículo pode ser adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentérica, espinal ou epidérmica (e. g., por injecção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto activo, i. e., anticorpo, molécula biespecífica e multiespecífica, pode ser revestida num material para proteger o composto da acção de ácidos e outras condições naturais que podem inactivar o composto.
Um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que retém a actividade biológica desejada do composto parental e não provoca quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (ver, e. g., Berge, S.M., et al., (1977) J. Pharm. Sei. 66:1-19). Exemplos desses sais incluem sais de adição ácida e sais de adição básicos. Os sais de adição ácida incluem aqueles que derivam de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídico, fosfórico e semelhantes, assim como ácidos orgânicos não tóxicos, tais como ácidos alifáticos mono- e dicarboxílicos, ácidos alcanóicos fenilsubstituídos, ácidos hidroxialcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos alifáticos e aromáticos e semelhantes. Sais de adição básicos incluem os derivados de metais alcalino terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e semelhantes, bem como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e semelhantes.
Uma composição da presente invenção pode ser administrada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. A via e/ou 85 modo de administração varia dependendo dos resultados desejados. Os compostos activos podem ser preparados com veículos que protegem o composto contra a libertação rápida, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, pensos transdérmicos, e sistemas de distribuição microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, tais como acetato de etilenovinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres, e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação dessas formulações são descritos por e. g., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978. As composições farmacêuticas são, de um modo preferido, preparadas nas condições de GMP.
Para administrar um composto da invenção por certas vias de administração, pode ser necessário revestir o composto com, ou co-administrar o composto com, um material para prevenir a sua inactivação. Por exemplo, o composto pode ser administrado a um indivíduo num veículo apropriado, por exemplo, lipossomas, ou um diluente. Diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções de tampão salinas e aquosas. Lipossomas incluem emulsões água-em-óleo-em-água CGF, assim como lipossomas convencionais (Strejan et al., (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).
Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões estéreis aquosas e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersão estéril injectáveis. A utilização desses meios e agentes para substâncias farmaceuticamente activas é conhecida na técnica. Excepto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto activo, a sua utilização nas composições farmacêuticas da invenção está contemplada. Também 86 podem ser incorporados nas composições compostos activos suplementares.
As composições terapêuticas devem ser tipicamente estéreis, substancialmente isotónicas, e estáveis nas condições de preparação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para concentração elevada do fármaco. 0 veiculo pode ser um meio de solvente ou dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol liquido, e semelhantes), e suas misturas. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerida no caso de dispersão e pela utilização de tensioactivos. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injectáveis pode ser realizada incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
Podem ser preparadas soluções estéreis injectáveis incorporando o composto activo na quantidade requerida num solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido por esterilização por microfiltração. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando o composto activo num veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos dos enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são secos sob vácuo e secos com congelação (liofilização) que produz um pó do ingrediente activo mais 87 qualquer ingrediente adicional desejado de uma sua solução previamente esterilizada por filtração. As composições terapêuticas também podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma composição terapêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivo de injecção sem agulha hipodérmica, tais como os dispositivos divulgados em, e. g., Patentes U.S. Nos 5399163, 5383851, 5312335, 5064413, 4941880, 4790824, ou 4596556. Exemplos de implantes e módulos úteis na presente invenção incluem: Patente U.S. N° 4487603, que revela uma bomba de micro-infusão implantável para dispensar medicação a uma taxa controlada; Patente U.S. N° 4486194, que revela um dispositivo terapêutico para administrar medicamentos através da pele; Patente U.S. N° 4447233, que revela uma bomba de infusão de medicação para distribuir medicação a uma taxa de infusão precisa; Patente U.S. N° 4447224, que revela um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para distribuição continua de fármaco; Patente U.S. N° 4439196, que revela um sistema de distribuição de fármaco osmótico possuindo compartimentos de multi-câmara; e Patente U.S. N° 4475196, que revela um sistema de distribuição de fármaco osmótico. Muitos outros desses implantes, sistemas de distribuição, e módulos são conhecidos. C. Formulação
Para as composições, formulações terapêuticas da presente invenção incluem aqueles adequados para administração oral, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), rectal, vaginal e/ou parentérica. As formulações podem ser apresentadas convenientemente em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por quaisquer métodos conhecidos na técnica de 88 farmácia. A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única varia dependendo do indivíduo a ser tratado, e o modo de administração particular. A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única será geralmente a quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Geralmente, de cem por cento, esta quantidade varia desde cerca de 0,01 por cento até cerca de noventa e nove por cento de ingrediente activo, desde cerca de 0,1 por cento até cerca de 70 por cento, ou desde cerca de 1 por cento até cerca de 30 por cento.
As formulações da presente invenção que são adequadas para administração vaginal também incluem pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações de pulverização contendo esses veículos como são conhecidos na técnica como sendo apropriados. As formas de dosagem para a administração tópica ou transdérmica de composições desta invenção incluem pós, pulverizadores, unguentos, pastas, cremes, loções, géis, soluções, pensos e inaladores. O composto activo pode ser misturado em condições estéreis com um veículo farmaceuticamente aceitável, e com quaisquer conservantes, tampões, ou propulsores que possam ser necessários.
As frases "administração parentérica" e "administrado parentericamente" significa modos de administração diferentes de administração entérica e tópica, normalmente por injecção, e incluem, sem limitação, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intra-orbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, 89 subaracnóide, intra-espinal, injecção e infusão epidural e intra-esternal.
Exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregues nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol, e semelhantes), e suas misturas adequadas, óleos vegetais, tais como azeite, e ésteres orgânicos injectáveis, tais como oleato de etilo. Pode ser mantida fluidez apropriada, por exemplo, pela utilização de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerida no caso de dispersões, e pela utilização de tensioactivos.
Estas composições podem também conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes humidificantes, agentes emulsificantes e agentes de dispersão. A prevenção da presença de microrganismos pode ser assegurada tanto por processos de esterilização, supra, como pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico, e semelhantes. Também pode ser desejável incluir agentes isotónicos, tais como açúcares, cloreto de sódio, e semelhantes nas composições. Adicionalmente, a absorção prolongada da forma farmacêutica injectável pode ser realizada através da inclusão de agentes que retardam a absorção, tais como monoestearato de alumínio e gelatina.
Quando os compostos da presente invenção são administrados como produtos farmacêuticos a humanos e animais, eles podem ser administrados isoladamente ou como uma composição farmacêutica contendo, por exemplo, 0,01 até 99,5% (ou 0,1 até 90%) do 90 ingrediente activo em combinação com um veiculo farmaceuticamente aceitável.
As composições farmacêuticas são geralmente formuladas como estéreis, substancialmente isotónicas e em total conformidade com todos os regulamentos das Boas Práticas de Preparação (GMP) da U.S. Food and Drug Administration.
MÉTODOS E UTILIZAÇÕES DA INVENÇÃO A. Métodos
As composições (e. g., anticorpos de sequência humana e anticorpos monoclonais humanos contra CTLA-4 humana e seus derivados/conjugados) aqui divulgadas possuem utilidades de diagnóstico e terapêuticas in vitro e in vivo. Por exemplo, estas moléculas podem ser administradas a células em cultura, e. g. in vitro ou ex vivo, ou num indivíduo, e. g., in vivo, para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de distúrbios. 0 termo "indivíduo" inclui animais humanos e não humanos. Animais não humanos incluem todos os vertebrados, e. g., mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, vacas, galinhas, anfíbios, e répteis. Os métodos são particularmente adequados para tratar doentes humanos possuindo um distúrbio que pode ser tratado aumentando ou reduzindo a resposta imunitária mediada por células T.
Quando os anticorpos contra CTLA-4 são administrados juntamente com outro agente, os dois podem ser administrados em qualquer ordem ou simultaneamente. Os métodos podem ser 91 utilizados para tratar qualquer tipo de cancro incluindo melanoma, cancro do cólon, cancro da próstata, e cancro renal.
Por exemplo, microesferas de látex revestidas com anti-CTLA-4 (para aumentar a valência do anticorpo) podem inibir a proliferação e activação de células T. Agentes possuindo o mesmo sitio de combinação do anticorpo podem actuar como um antagonista de CTLA-4 quando apresentado como um Fab ou uma IgG solúvel, e um agonista de CTLA-4 quando em ligação reticulada elevada. Assim, formas multivalentes de anticorpos anti-CTLA-4 são agentes terapêuticos úteis para resposta imunitárias moduladas negativamente.
Adicionalmente à ligação a microesferas de látex ou outras partículas insolúveis, os anticorpos podem ser ligados reticuladamente um ao outro ou modificados geneticamente para formar multimeros. A ligação reticulada pode ser por ligação quimica directa, ou por ligação indirecta, tal como um complexo anticorpo-biotina-avidina. A ligação reticulada pode ser covalente, quando são empregues grupos de ligação química, ou não covalente, quando são empregues interacções proteína-proteina ou outras interacções proteina-ligando. As abordagens de engenharia genética para ligação incluem, e. g., a re-expressão das regiões variáveis de anticorpos IgG de elevada afinidade em vectores de expressão IgM ou qualquer unidade de proteina (e. g., polilisina, e semelhantes). Converter um anticorpo IgG de afinidade elevada num anticorpo IgM pode criar um complexo decavalente com avidez muito elevada. Também podem ser utilizados vectores de expressão lgA2 para produzir complexos de anticorpo multivalentes. IgA2 pode formar polímeros juntamente com cadeia J e componente de secreção. IgA2 pode possuir a vantagem adicional de poder ser adicionalmente ligado 92 reticuladamente pelo receptor de IgA CD89, que é expresso em neutrófilos, macrófagos, e monócitos.
Também pode ser obtido agonismo utilizando algumas preparações de anticorpos policlonais contra CTLA-4 compreendendo anticorpos contra, pelo menos, dois epitopos não sobreponiveis em CTLA-4. Um anticorpo numa tal preparação contendo dois sítios de ligação pode ligar a duas moléculas de CTLA-4 para formar um pequeno agrupamento. Um segundo anticorpo possuindo diferentes sítios de ligação pode então ligar (agregar) esses agrupamentos pequenos para formar agrupamentos grandes, formando assim um complexo de CTLA-4 (na superfície da célula) que pode transduzir um sinal para a célula T para inibir, reduzir ou prevenir a activação da célula T contendo (expressando) CTLA-4. Deste modo, algumas preparações de anticorpos policlonais apresentam agonismo semelhante às preparações polivalentes descritas acima.
Deste modo, preparações polivalentes ou policlonais de anticorpos anti-CTLA-4 são úteis para agonizar o receptor de CTLA-4, suprimindo assim respostas imunitárias de outra forma mediadas pelas células T que contêm o receptor de CTLA-4. Alguns exemplos de doenças que podem ser tratadas utilizando essas preparações de anticorpos polivalentes ou policlonais incluem doença auto-imune, rejeição de transplante, e inflamação. 93 B. Utilizações 1. Respostas Imunitárias Activantes a. Cancro
Alguns métodos terapêuticos tratam doentes com cancro. 0 bloqueamento de CTLA-4 por anticorpos pode aumentar a resposta imunitária a células cancerosas no doente. Opcionalmente, anticorpos contra CTLA-4 podem ser combinados com um agente imunogénico, tais como células cancerosas, antigénios de tumor purificado (incluindo proteínas recombinantes, péptidos, e moléculas de hidratos de carbono), células, e células transfectadas com genes codificando citocinas estimuladoras imunitárias e antigénios de superfície celular, tais como B7 {ver, e. g., Hurwitz, A. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei U.S.A. 95, 10067-10071) .
Em sistemas experimentais de murídeo, a implantação de alguns tumores seguido pela administração de anticorpos anti-CTLA-4 pode resultar na rejeição de tumores. Em alguns casos a rejeição tumoral de tumores estabelecidos ocorre; noutros casos, o crescimento do tumor é abrandado pela utilização de anticorpos anti-CTLA-4. Em geral, o bloqueamento de CTLA-4 é eficaz contra tumores imunogénicos. Operacionalmente isto é definido como aqueles tumores para os quais a vacinação utilizando o próprio tumor pode conduzir à imunidade para desafio tumoral. Em humanos, alguns tumores demonstraram ser imunogénicos, tais como melanomas. Antecipa-se que aumentando o limiar de activação de células T por bloqueamento de CTLA-4, se possa esperar activar respostas tumorais no hospedeiro. 94 0 bloqueamento com CTLA-4 é muito eficaz quando combinado com um protocolo de vacinação. Foram criadas muitas estratégias experimentais para vacinação contra tumores (ver Rosenberg, S., 2000, Development of Câncer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; ver também Restifo, N. e Sznol, M., Câncer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 em DeVita, V. et al., (eds.), 1997, Câncer: Principies and Practice of Oncology, Quinta Edição). Numa destas estratégias, é preparada uma vacina utilizando células tumorais autólogas ou alogénicas. Estas vacinas celulares demonstraram ser mais eficazes quando as células tumorais são transduzidas para expressar GM-CSF. GM-CSF demonstrou ser um activador potente de apresentação de antigénio para vacinação tumoral (Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei U.S.A. 90 (80:3539-43) . 0 bloqueamento Anti-CTLA-4 juntamente com a utilização de vacinas de células tumorais modificadas por GMCSF demonstrou ser eficaz num número de modelos tumorais experimentais, tais como carcinoma mamário (Hurwitz et al., (1998) supra), cancro primário da próstata (Hurwitz A. et al., (2000) Câncer Research 60 (9):2444-8) e melanoma (van Elsas, A et al. (1999) J. Exp.
Med. 190:355-66). Nestes casos, tumores não imunogénicos, tais como o melanoma B 16, tornaram-se susceptiveis à destruição pelo sistema imunitário. A vacina de células tumorais pode também ser modificada para expressar outros activadores imunitários tais como IL2, e moléculas co-estimuladores, entre outros. O estudo de expressão genética e de padrões de expressão genética em grande escala em vários tumores conduziu à definição 95 dos denominados antigénios específicos de tumor (Rosenberg, SA (1999) Immunity 10:281-7). Em muitos casos, estes antigénios específicos para o tumor são antigénios de diferenciação expressos nos tumores e na célula da qual o tumor surge, por exemplo antigénios gp 100 de melanócitos, antigénios MAGE, Trp-2. Mais importante, pode ser mostrado que muitos destes antigénios são os alvos de células T específicas para tumor encontradas no hospedeiro. Bloqueamento com CTLA-4 pode ser utilizado em conjunção com uma colecção de proteínas e/ou péptidos recombinantes expressos num tumor de modo a produzir uma resposta imunitária a estas proteínas. Estas proteínas são normalmente vistas pelo sistema imunitário como antigénios próprios e são, por isso, tolerantes a estes. O antigénio tumoral também pode incluir a proteína telomerase, que é necessária para a síntese de telómeros de cromossomas e que é expressa em mais do que 85% dos cancros humanos e em apenas um número limitado de tecidos somáticos (Kim, N et al. (1994)
Science 266, 2011-2013) . (Estes tecidos somáticos podem ser protegidos de ataque imunitário por vários meios) . Antigénio tumoral também pode ser "neo-antigénios" expressos em células do cancro devido a mutações somáticas que alteram a sequência de proteína ou criam proteínas de fusão entre duas sequências não relacionadas (i. e. bcr-abl no cromossoma Philadelphia), ou idiotipo de tumores de células B. Outras vacinas de tumor podem incluir as proteínas de vírus implicados em cancros humanos, tais como Vírus de Papiloma Humano (HPV), Vírus da Hepatite (HBV e HCV) e Vírus do Sarcoma de Herpes de Kaposi (KHSV). Outra forma de antigénio específico de tumor que pode ser utilizada em conjunção com bloqueamento com CTLA-4 é proteínas de choque térmico purificadas (HSP) isoladas do próprio tecido tumoral. Estas proteínas de choque térmico contêm fragmentos de proteínas das células tumorais e estas HSPs são altamente eficientes na 96 distribuição a células apresentadoras de antigénio para conferir imunidade tumoral (Suot, R & Srivastava, P (1995) Science 269:1585-1588; Tamura, Y. et al., (1997) Science 278:117-120.
As células dendriticas (DC) são células apresentadoras de antigénio potentes que podem ser utilizadas para iniciar respostas especificas para o antigénio. As DCs podem ser produzidas ex vivo e carregadas com vários antigénios de proteína e péptido, bem como extractos de célula tumoral (Nestle, F. et al., (1998) Nature Medicine 4:328-332). As DCs também podem ser transduzidas por meios genéticos para expressar também estes antigénios tumorais. As DCs também foram fundidas directamente às células tumorais com o objectivo de imunização (Kugler, A. et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336). Como um método de vacinação, a imunização com DC pode ser combinada eficazmente com bloqueamento com CTLA-4 para activar mais respostas anti-tumorais potentes. O bloqueamento com CTLA-4 também pode ser combinado com tratamentos do cancro convencionais. O bloqueamento com CTLA-4 pode ser combinado eficazmente com regimes quimioterapêuticos. Nestes casos, pode ser possível reduzir a dose de reagente quimioterapêutico administrado (Mokyr, M. et al. (1998) Câncer Research 58:5301-5304). A argumentação científica por trás da utilização combinada de bloqueamento com CTLA-4 e quimioterapêutica é que a morte celular, que é uma consequência da acção citotóxica da maioria dos compostos quimioterapêuticos, deve resultar em níveis aumentados de tumor antigénio na via de apresentação do antigénio. Outras terapêuticas de combinação que podem resultar em sinergia com bloqueamento com CTLA-4 através da morte celular são radiação, cirurgia, e privação hormonal (Kwon, E. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei U.S.A. 96 97 (26):15074-9. Cada um destes protocolos cria uma fonte de antigénio tumoral no hospedeiro. Os inibidores da angiogénese também podem ser combinados com bloqueamento com CTLA-4. A inibição da angiogénese conduz à morte celular tumoral que pode alimentar o antigénio tumoral nas vias de apresentação do antigénio do hospedeiro.
Também podem ser utilizados anticorpos de bloqueamento de CTLA-4 em combinação com anticorpos biespecificos que direccionam células efectoras que expressam receptor Fc alfa ou Fc gama para as células tumorais (ver, e. g., Patente U.S. N0b 5922845 e 5837243) . Podem ser utilizados anticorpos biespecificos para direccionar dois antigénios separados. Por exemplo foram utilizados anticorpos biespecificos anti-receptor Fc/anti-antigénio tumoral (i. e., Her-2/neu) para direccionar macrófagos para os sítios do tumor. Este direccionamento pode activar mais eficazmente respostas específicas para o tumor. O braço da célula T destas respostas seria aumentado pela utilização de bloqueamento com CTLA-4. Alternativamente, o antigénio pode ser distribuído directamente a DCs através da utilização de anticorpos biespecificos que se ligam ao antigénio tumoral e um marcador de superfície celular específico para célula dendrítica.
Os tumores evadem a vigilância imunitária do hospedeiro através de uma larga variedade de mecanismos. Muitos destes mecanismos podem ser superados pela inactivação de proteínas que são expressas pelos tumores e que são imunossupressoras. Estas incluem, entre outras Tgfp (Kehrl, J. et al., (1986) J. Exp. Med. 163:1037-1050), IL-10 (Howard, M. & 0'Garra, A. (1992)
Immunology Today 13:198-200), e ligando Fas (Hahne, M. et al., (1996) Science 274: 1363-1365). Anticorpos para cada uma destas 98 entidades podem ser utilizados em combinação com anti-CTLA-4 para contrariar os efeitos do agente imunossupressor e favorecer respostas imunitárias tumorais pelo hospedeiro.
Outros anticorpos que podem ser utilizados para activar a capacidade imunitária do hospedeiro podem ser utilizados em combinação com anti-CTLA-4. Estes incluem moléculas na superfície de células dendríticas que activam a função das DC e apresentação de antigénio. Os anticorpos anti-CD40 são capazes de substituir eficazmente a actividade das células T auxiliares (Ridge, J. et al., (1998) Nature 393:474-478) e podem ser utilizados em conjunção com anticorpos CTLA-4 (Ito, N. et al. (2000) Immunobiology 201 (5) 527-40) . Anticorpos activadores
para moléculas co-estimuladoras de células T, tais como OX-40 (Weinberg, A. et al. (2000) J Immunol 164:2160-2169), 4-1BB (Melero, I. et al. (1997) Nature Medicine 3:682-685 (1997), e ICOS (Hutloff, A. et al., (1999) Nature 397:262-266) também podem proporcionar níveis aumentados de activação de células T. O transplante da medula óssea é presentemente utilizado para tratar uma variedade de tumores de origem hematopoiética. Embora a doença de enxerto versus hospedeiro seja uma consequência deste tratamento, o benefício terapêutico pode ser obtido de respostas de enxerto vs. tumor. O bloqueamento com CTLA-4 pode ser utilizado para aumentar a eficácia de células T enxertadas de dador específicas para tumor (Blazar, B. et ai., (1999) J Immunol 162: 6368-6377).
Existem, também, vários protocolos de tratamento experimentais que envolvem activação ex vivo e expansão de células T específicas para o antigénio e transferência adoptiva destas células para receptores para células T específicas para o 99 antigénio contra tumor (Greenberg, R. & Riddell, S. (1999) 285:546-51). Estes métodos também podem ser utilizados para activar respostas de células T para agentes infecciosos, tais como CMV (ver abaixo) . Pode esperar-se que a activação ex vivo na presença de anticorpos anti-CTLA-4 aumente a frequência e a actividade das células T transferidas de forma adoptiva. b. Doenças infecciosas São utilizados outros métodos para tratar doentes que foram expostos a toxinas ou patogénicos particulares. Semelhante à sua aplicação a tumores como discutido acima, o bloqueamento com CTLA-4 mediado pelo anticorpo pode ser utilizado isoladamente, ou como um adjuvante, em combinação com vacinas, para estimular a resposta imunitária a patogénicos, toxinas, e antigénios próprios. 0 bloqueamento com CTLA-4 demonstrou ser eficaz na fase aguda de infecções de Nippostrongylus brasiliensis (McCoy, K. et al., (1997) 186 (2); 183-187) e Leishmania donovani (Murphy, M. et al. (1998) J. Immunol. 161:4153-4160). Exemplos de patogénicos para os quais esta abordagem terapêutica pode ser particularmente útil, incluem patogénicos para os quais não existe presentemente vacina eficaz, ou agentes patogénicos para os quais as vacinas convencionais são menos do que completamente eficazes. Estes incluem, mas não estão limitados a HIV, Hepatite (A, B, & C), Influenza, Herpes, Giardia, Malária, Leishmania, Staphylococcus Aureus, Pseudomonas aeruginosa. O bloqueamento com CTLA-4 é particularmente útil contra infecções estabelecidas por agentes, tais como HIV que apresenta antigénios alterados ao longo do curso das infecções. Estes novos epitopos são reconhecidos como estranhos no momento da administração anti- 100 CTLA-4 humana, provocando assim uma resposta forte de células T que não é diminuída por sinais negativos através de CTLA-4.
Alguns exemplos de vírus patogénicos que provocam infecções tratáveis pelos métodos da invenção incluem hepatite (A, B, ou C), vírus herpes (e. g., VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, e CMV, vírus Epstein Barr), adenovírus, vírus influenza, flavivírus, echovírus, rhinovírus, vírus coxsackie, cornovírus, vírus síncial respiratório, vírus da papeira, rotavírus, vírus do sarampo, vírus da rubéola, parvovírus, vírus vaccinia, vírus HTLV, vírus do dengue, papilomavírus, vírus molluscum, vírus da polio, vírus da raiva, vírus JC e vírus da encefalite arboviral.
Alguns exemplos de bactérias patogénicas que provocam infecções tratáveis pelos métodos da invenção incluem chlamydia, bactérias rickettsias, mycobacteria, staphylococci, streptococci, pneumonococci, meningococci e conococci, klebsiella, proteus, serratía, pseudomonas, legionella, diphtheria, salmonella, bacilli, cólera, tétano, botulismo, anthrax, peste, leptospirosis, e bactéria da doença de Lyme.
Alguns exemplos de fungos patogénicos que provocam infecções tratáveis pelos métodos da invenção incluem Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Género Mucorales (Mucor, Absidia, Rhizophus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum.
Alguns exemplos de parasitas patogénicos que provocam infecções tratáveis por métodos da invenção incluem Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleria fowleri, Acanthamoeba 101 sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondi, Nippostrongylus brasiliensis.
Em todos os métodos acima, um bloqueamento com CTLA-4 pode ser combinado com outras formas de imunoterapêutica, tal como tratamento com citocina (e. g. interferões, GM-CSF, GCSF, IL-2), ou terapêutica com anticorpo biespecifico, que proporciona apresentação intensificada de antigénios tumorais {ver, e. g., Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123). c. Promoção de reacções "auto-imunes" benéficas para o tratamento de doença e intervenção terapêutica. A capacidade de anticorpos anti-CTLA-4 para provocar e amplificar respostas auto-imunitárias foi documentada em vários dos sistemas experimentais (EAE - Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, a murine model for MS (Perrin, P. et al. (1996) J Immunol 157 (4):1333-1336); diabetes (Luhder, F. et al., (1998) supra). Na verdade, a indução de respostas anti-tumorais utilizando vacinas de célula tumoral e péptido revela que muitas respostas anti-tumorais envolvem reacções anti-próprias (despigmentação observada em melanoma B16 modificado anti-CTLA-4 + GM-CSF em van Elsas et al., supra; despigmentação em murganhos vacinados com Trp-2 (Overwijk, W. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 96:2982-2987); prostatite autoimune provocada por vacinas de células tumorais TRAMP (Hurwitz, A. (2000) supra), vacinação com antigénio de péptido de melanoma e vitilago observada em ensaios clínicos em 102 humanos (Rosenberg, SA e White, DE (1996) J Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81-4).
Deste modo, é possível considerar utilizando bloqueamento anti-CTLA-4 em conjunção com várias proteínas próprias de modo a criar protocolos de vacinação para criar eficazmente respostas imunitárias contra estas proteínas próprias para o tratamento da doença. Por exemplo, a doença de Alzheimer envolve uma acumulação inapropriada de péptido Αβ em depósitos amilóides no cérebro; as respostas de anticorpo contra amilóide são capazes de clarificar estes depósitos amilóides (Schenk et al., (1999) Nature 400:173-177).
Também podem ser utilizadas outras proteínas próprias como alvos tais como IgE para o tratamento de alergia e asma, e TNF para artrite reumatóide. Finalmente, as respostas de anticorpo contra várias hormonas podem ser induzidas pela utilização de anticorpo anti-CTLA-4. Respostas de anticorpo neutralizante contra hormonas reprodutivas podem ser utilizadas para contracepção. Respostas de anticorpo neutralizante contra hormonas e outros factores solúveis que são necessários para o crescimento de tumores particulares também podem ser consideradas como possíveis alvos de vacinação. Métodos análogos como descrito acima para a utilização de anticorpos anti-CTLA-4 podem ser utilizados para indução de respostas auto-imunitárias terapêuticas para tratar doentes possuindo uma acumulação inapropriada de outros antigénios próprios, tais como depósitos amilóides, incluindo Αβ na doença de Alzheimer, citocinas, tais como TNFa, e IgE. 103 2. Inactivar Respostas Imunitárias
Distúrbios provocados por respostas imunitárias são denominados doença de hipersensibilidade. Doenças provocadas por falha de auto-tolerância e respostas imunitárias subsequentes contra antigénios próprios, ou autólogos, são denominadas doenças auto-imunes. A doença da hipersensibilidade também pode resultar de respostas não controladas ou excessivas contra antigénios estranhos, tais como micróbios.
Embora os anticorpos contra CTLA-4 humana solúveis tenham demonstrado promover a expansão e activação de células T (i. e., quando a função de CTLA-4 (e. g., ligação ao ligando) é inibida; neste cenário os anticorpos são antagonistas contra a função de CTLA-4), aumentar a valência destes mesmos anticorpos produz o efeito oposto (em que agora, por contraste, os anticorpos actuam como agonistas de CTLA-4 para suprimir a resposta imunitária) (ver, e. g., Krummel e Allison, 1996, J. Exp. Med. 183, 2533-2540). Para os objectivos de inactivar respostas de células T específicas para o antigénio, tais como as que são os alvos de células T auto-reactivas a agentes patogénicos, o antigénio alvo que é específico para estas células T (i. e. antigénio e/ou complexos MHC/antigénio) deve ser administrado com a forma polivalente de anticorpo anti-CTLA-4. a. Inflamação
Inflamação representa a consequência da dilatação capilar com acumulação de fluido e migração de leucócitos fagocíticos, tais como granulócitos e monócitos. A inflamação é importante na defesa de um hospedeiro contra uma variedade de infecções mas 104 pode, também, possuir consequências indesejáveis em distúrbios inflamatórios, tais como choque anafilático, artrite, gota e isquemia-reperfusão. As células T activadas possuem um papel modulador importante na inflamação, libertando interferão γ e factores de estimulação de colónia que por sua vez activam os leucócitos fagociticos. Os leucócitos fagociticos activados são induzidos para expressar uma variedade de moléculas de superfície de células específicas denominadas receptores de direccionamento, que servem para ligar os fagócitos a células alvo endoteliais. As respostas inflamatórias podem ser reduzidas ou eliminadas por tratamento com os agentes terapêuticos da presente invenção. Por exemplo, preparações polivalentes de anticorpos contra CTLA-4 bloqueiam a activação de células T activadas, prevenindo assim estas células de libertarem moléculas necessárias para a activação de tipos de células fagocíticas. b. Doenças Auto-Imunes
Outra situação em que a supressão imunitária é desejável é no tratamento de doenças auto-imunes, tais como diabetes mellitus dependente da insulina, esclerose múltipla, síndroma do homem rígido, artrite reumatóide, miastenia gravis e lúpus eritematoso. Nestas doenças, o corpo desenvolve uma resposta imunitária celular e/ou humoral contra um dos seus próprios antigénios conduzindo à destruição do antigénio, e potencialmente incapacitação e/ou consequências fatais. Crê-se que as células T activadas desempenhem um papel principal em muitas doenças auto-imunes, tais como diabetes mellitus. As doenças auto-imunes podem ser tratadas administrando um dos agentes terapêuticos aqui divulgados que inibem a activação das 105 células T. Opcionalmente, o autoantigénio, ou um fragmento deste, contra o qual a doença auto-imune é direccionada pode ser administrada imediatamente antes, simultaneamente com, ou pouco tempo após o agente imunossupressor. Deste modo, a tolerância pode ser induzida para o autoantigénio sob a cobertura de tratamento supressor, obviando assim a necessidade para imunossupressão continuada. Ver, e. g., Cobbold et al., documento WO 90/15152 (1990). c. Doença de Enxerto Versus Hospedeiro
Uma utilização relacionada para os agentes terapêuticos aqui divulgados é na modulação da resposta imunitária envolvida na doença de "enxerto versus hospedeiro" (GVHD). A GVHD é uma doença potencialmente fatal que ocorre quando as células imunologicamente competentes são transferidas para um recipiente alogénico. Nesta situação, as células imunocompetentes do dador podem atacar os tecidos no recipiente. Os tecidos da pele, epitélio do tubo digestivo e fígado são alvos frequentes e podem ser destruídos durante o curso de GVHD. A doença apresenta um problema especialmente severo quando o tecido imunitário é transplantado, tal como em transplante da medula óssea; mas também foi relatada GVHD menos severa noutros casos, incluindo transplantes do coração e fígado. Os agentes terapêuticos aqui divulgados podem ser utilizados para inibir a activação de leucócitos dadores, inibindo assim a sua capacidade para lisar células alvo no hospedeiro. 106 d. Rejeição de Transplante
Ao longo dos últimos anos houve uma melhoria considerável na eficiência de técnicas cirúrgicas para transplante de tecidos e órgãos, tais como pele, rim, fígado, coração, pulmão, pâncreas e medula óssea. Talvez o principal problema pendente seja a ausência de agentes satisfatórios para induzir imuno-tolerância no recipiente para o aloenxerto ou órgão transplantado. Quando as células alogénicas ou órgãos são transplantados para um hospedeiro (i. e., o dador e o receptor são indivíduos diferentes da mesma espécie), o sistema imunitário hospedeiro é provável que origine uma resposta imunitária para antigénios estranhos no transplante (doença de hospedeiro-versus-enxerto) conduzindo à destruição do tecido transplantado. As células CD8+, células CD4+ e monócitos estão todos envolvidos na rejeição de tecidos de transplante. Os agentes terapêuticos aqui divulgados são úteis para inibir respostas imunitárias induzidas por aloantigénio mediadas por células T no receptor, prevenindo assim que essas células participem na destruição do tecido ou órgão transplantado. B. Métodos para detectar/medir a presença de CTLA-4 numa amostra
Também são aqui divulgados métodos para detectar a presença de antigénio de CTLA-4 humana numa amostra, ou medindo a quantidade de antigénio de CTLA-4 humana, compreendendo contactar a amostra, e uma amostra de controlo, com um anticorpo monoclonal humano, ou uma sua porção de ligação ao antigénio, que se liga especificamente a CTLA-4 humana, em condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou sua 107 porção e CTLA-4 humana. A formação de um complexo é então detectada, em que a formação de um complexo diferente entre a amostra comparada com a amostra de controlo é indicadora da presença de antigénio de CTLA-4 humana na amostra. C. Kits São também aqui divulgados kits compreendendo as composições (e. g., anticorpos de sequência humana, anticorpos humanos, moléculas multiespecificas e biespecificas) aqui divulgados e instruções para utilização. 0 kit pode conter ainda, pelo menos, um reagente adicional, ou um ou mais anticorpos humanos adicionais (e. g., um anticorpo humano possuindo uma actividade complementar que se liga a um epitopo num antigénio CTLA-4 distinto do primeiro anticorpo humano). Os kits incluem, tipicamente, um marcador indicando a utilização pretendida dos conteúdos do kit. 0 termo marcador inclui qualquer escrita, ou material registado fornecido em ou com o kit, ou que acompanha o kit de qualquer outra forma.
EXEMPLOS
Aspectos dos Exemplos que não se referem especificamente à invenção reivindicada são incluídos apenas para comparação. 108
Exemplo 1. Criação de murganhos Cmu alvo
Construção de um vector de direccionamento para CMD. 0 plasmídeo pICEmu contém um fragmento EcoRI/Xhol do locus da cadeia pesada Ig de murídeo, que se estende pelo gene mu, que foi obtido a partir de uma biblioteca genómica em fagos lambda de Balb/C (Marcu et al., Cell 22:187, 1980). Este fragmento genómico foi subclonado nos sítios Xhol/EcoRI do plasmídeo pICEMl9H (Marsh et al.; Gene 32, 481-485, 1984). As sequências da cadeia pesada incluídas em pICEmu estendem-se a jusante do sítio EcoRI localizado imediatamente a 3' do intensificador mu intrónico, até ao sítio Xhol localizado aproximadamente 1 kb a jusante do último exão transmembranar do gene mu; contudo, muita da região da repetição de substituição de mu foi removida pela passagem em E. coli. 0 vector de direccionamento foi construído como se segue (ver Figura 1). Um fragmento de 1,3 kb HindIII/Smal foi excisado de pICEmu e subclonado em pBluescript digerido com HindIII/Smal (Stratagene, La Jolla, CA) . Este fragmento pICEmu estende-se desde o sítio HindIII localizado aproximadamente a 1 kb a 5' de Cmul até ao sítio Smal localizado no Cmul. O plasmídeo resultante foi digerido com Smal/Spel e foi inserido o fragmento de, aproximadamente, 4 kb Smal/Xbal de pICEmu, que se estende desde o sítio Sma I em Cmul a 3' do sítio Xbal localizado imediatamente a jusante do último exão de Cmu. O plasmídeo resultante, pTARl, foi linearizado no sítio Smal, e foi inserida uma cassete de expressão neo. Esta cassete consiste no gene neo sob o controlo de transcrição do promotor da cinase de fosfoglicerato de murganho (pgk) (fragmento Xbal/Taql; Adra et al., (1987) Gene 60:65-74) e contendo o sítio de poliadenilação 109 pgk (fragmento PvulI/HindIII; Boer et al., (1990) Bíochemical Genetics 28:299-308). Esta cassete foi obtida a partir do plasmideo pKJl (descrito por Tybulewicz et al., (1991) Cell 65:1153-1163) do qual a cassete neo foi excisada como um fragmento EcoRI/HindIII e subclonada em pGEM-7Zf (+)digerido com EcoRI/HindIII para produzir pGEM-7 (KJ1). A cassete neo foi excisada de pGEM-7 (KJ1) por digestão com EcoRI/SalI, as extremidadas foram tornadas rombas e foi subclonado no sítio Smal do plasmideo pTARl, na orientação oposta das sequências genómicas Cmu. O plasmideo resultante foi linearizado com Not I, e foi inserida uma cassete de cinase de timidina de vírus herpes simplex (tk) para permitir o enriquecimento dos clones ES contendo recombinantes homólogos, como descrito por Mansour et al., (1988) Nature 336:348-352. Esta cassete consiste nas sequências codificantes do gene tk ladeado pelo promotor de pgk do murganho e o sítio de poliadenilação, como descrito por Tybulewicz et al., (1991) Cell 65:1153- 1163. 0 vector de direccionamento CMD resultante contém um total de, aproximadamente, 5,3 kb de homologia com o locus da cadeia pesada e é concebido para produzir um gene mutante mu no qual foi inserida uma cassete de expressão neo no sítio Smal único do primeiro exão Cmu. O vector de direccionamento foi linearizado com Pvul, que corta nas sequências do plasmideo, antes da electroporação em células ES.
Produção e análise de células ES alvo.
Foram cultivadas células ES AB-1 (McMahon, A.P. e Bradley, A., (1990) Cell 62:1073-1085) em camadas de alimentador de células SNL76/7 mitoticamente inactivas (ibid.) essencialmente como descrito (Robertson, E. J. (1987) em Teratocarcinomas and 110
Embryonic Stem cells: a Practical Approach (E.J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, p. 71-112). 0 vector de direccionamento CMD linearizado foi electroporado em células AB-1 pelos métodos descritos Hasty et ai., (Hasty, P. R. et ai., (1991) Nature 350:243-246). As células electroporadas foram plaqueadas em placas de 100 mm a uma densidade de 1-2 x 106 células/placa. Após 24 horas, foram adicionados G418 (200 microgramas/mL de componente activo) e FIAU (5 x 10“7 M) ao meio, e foram deixados desenvolver clones resistentes ao fármaco ao longo de 8-9 dias. Os clones foram repicados, tripsinizados, divididos em duas porções, e posteriormente expandidos. Metade das células derivadas de cada clone foram então congeladas e a outra metade foram analisadas para recombinação homóloga entre sequências vector e alvo. A análise de ADN foi realizada por hibridação de transferência de Southern. O ADN foi isolado dos clones como descrito em Laird et ai., (Laird, P. W. et ai., (1991) Nucleic
Acids Res. 19:4293). O ADN genómico isolado foi digerido com Spel e rastreado com uma fragmento sonda de 915 pb Saci, sonda A (Figura 1), que híbrida com uma sequência entre o intensificador mu intrónico e a região de substituição de mu. A sonda A detecta um fragmento Spel de 9,9 kb do locus de tipo selvagem, e uma banda de diagnóstico de 7,6 kb de um locus mu que foi recombinado homologamente com o vector de direccionamento CMD (a cassete de expressão neo contém um sítio Spel). De 1132 clones resistentes G418 e FIAU rastreados por análise de transferência de Southern, 3 apresentaram a banda Spe I de 7,6 kb indicativa de recombinação homóloga no locus mu. Estes 3 clones foram ainda digeridos com as enzimas Bgll, BstXI, e EcoRI para verificar que o vector integrou homologamente no gene mu. Quando hibridados com a sonda A, as transferências de Southern de ADN de tipo 111 selvagem digerido com Bgll, BstXI, ou EcoRI produzem fragmentos de 15,7, 7,3, e 12,5 kb, respectivamente, enquanto que a presença de um alelo mu direccionado é indicado por fragmentos de 7,7, 6,6, e 14,3 kb, respectivamente. Todos os 3 clones positivos detectados pela digestão com Spel apresentaram os fragmentos de restrição com Bgll, BstXI, e EcoRI esperados, diagnóstico da inserção da cassete neo no exão Cmul.
Produção de murganhos contendo o gene mu mutado.
Os três clones ES alvo, designados número 264, 272, e 408, foram descongelados e injectados nos blastocistos C57BL/6J como descritos por Bradley (Bradley, A. (1987) em Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach. (E. J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, p. 113-151). Os blastocistos injectados foram transferidos no útero de fêmeas pseudográvidas para produzir murganhos quiméricos reapresentando uma mistura de células derivadas da entrada de células ES e o blastocisto hospedeiro. A extensão da contribuição das células ES para a quimera pode ser visualmente estimada pela quantidade de coloração de revestimento de agouti, derivada da linha de células ES, no fundo C57BL/6J preto. Os clones 272 e 408 produziram apenas quimeras de baixa percentagem (i. e. baixa percentagem de pigmentação de agouti) mas o clone 264 produziu percentagem elevada de quimeras de machos. Estas quimeras foram cultivadas com fêmeas C57BL/6J e foram produzidas descendências de agouti, indicativas da transmissão da linha germinal do genoma de células ES. O rastreio para o gene mu direccionado foi realizado por análise de transferência de Southern de ADN digerido com Bgll da biópsia da cauda (como descrito acima para a análise de ADN de células ES). Aproximadamente 50% da 112 descendência agouti apresentou uma banda de hibridação Bgll de 7,7 kb adicionalmente à banda de tipo selvagem de 15,7 kb, demonstrando uma transmissão da linha germinal do gene mu direccionado.
Análise de murganhos transgénicos para inactivação funcional do gene mu.
Para determinar se a inserção da cassete neo em Cmul inactivou o gene da cadeia pesada de Ig, foi cultivado um clone 264 quimera com um murganho homozigótico para a mutação de JHD, que inactiva a expressão da cadeia pesada como um resultado da deleção dos segmentos do gene JH (Chen et al., (1993) Immunol. 5:647-656). Foram produzidas quatro descendências agouti. 0 soro foi obtido destes animais à idade de 1 mês e ensaiada por ELISA para a presença de IgM de murideo. Duas das quatro descendências tinham IgM completamente ausente (Tabela 1) . A genotipagem dos quatro animais por análise de transferência de Southern do ADN de biopsias da cauda por digestão com Bgll e hibridação com sonda A (Figura 1), e por digestão com StuI e hibridação com um fragmento de 475 pb EcoRI/StuI (ibid.) demonstraram que os animais que não conseguem expressar IgM no soro são aqueles em que um alelo do locus da cadeia pesada comporta a mutação JHD, o outro alelo da mutação Cmul. Murganhos heterozigóticos para a mutação JHD apresentam níveis de tipo selvagem de Ig no soro. Estes resultados demonstram que a mutação Cmul inactiva a expressão do gene mu. 113
Tabela 1. Nível de IgM no soro, detectado por ELISA para murganhos comportando ambas as mutações CMD e JHD (CMD/JHD) , para murganhos heterozigóticos para a mutação JHD (+/JHD), para o tipo selvagem murganhos (129Sv x C57BL/6J)F1 (+/+), e para murganhos homozigóticos deficientes em células B para a mutação JHD (JHD/JHD).
Murganho IgM no soro (microgramas/mL) Genótipo de cadeia Ig H 42 <0,002 CMD/JHD 43 196 + /JHD 44 <0,002 CMD/JHD 45 174 + /JHD 129 x BL6 F1 153 + / + JHD <0,002 JHD/JHD
Exemplo 2. Produção de murganhos transgénicos HCol2 O transgene da cadeia pesada humana HCol2. 0 transgene HCol2 foi produzido por co-injecção da inserção de 80 kb de pHC2 (Taylor et al., 1994, Int. Immunol., 6:579-591) e a inserção de 25 kb de pVx6. O plasmídeo pVx6 foi construído como descrito abaixo.
Um fragmento de ADN de 8,5 kb HindIII/SalI, compreendendo um gene da linha germinal humana VHI-18 (DP-14) juntamente com, aproximadamente, 2,5 kb de flanqueamento 5', e 5 kb da sequência genómica flanqueadora a 3' foi subclonado no vector plasmídico pSP72 (Promega, Madison, WI) para produzir o plasmídeo 114 p343.7.16. Um fragmento de ADN de 7 kb BamHI/HindIII, compreendendo o gene da linha germinal humana VH5-51 (DP-73) juntamente com aproximadamente 5 kb de flanqueamento a 5' e sequência genómica de 1 kb de flanqueamento a 3' , foi clonado no vector de clonagem pGPlf baseado no plasmideo pBR322 (Taylor et al.r 1992, Nucleic Acids Res. 20:6287-6295), para produzir o plasmideo p251f. Um novo vector de clonagem derivado de pGPlf, pGPlk (Seq. ID #1), foi digerido com EcoRV/BamHI, e ligado a um fragmento de ADN de 10 kb EcoRV/BamHI, compreendendo o gene da linha germinal humana VH3-23 (DP47) juntamente com aproximadamente 4 kb da sequência genómica flanqueada a 5' e sequência 5 kb de flanqueamento em 3' . O plasmideo resultante, pll2.2RR.7, foi digerido com BamHI/SalI e ligado com a inserção purificada de 7 kb BamHI/SalI de p251f. O plasmideo resultante, pVx4, foi digerido com Xhol e ligado com a inserção de 8,5 kb Xhol/Sall de p343.7.16. Foi obtido um clone com o gene VH1-18 na mesma orientação que os outros dois genes V. Este clone, designado pVx6, foi então digerido com Notl e a inserção purificada de 26 kb foi co-injectada juntamente com a inserção purificada de 80 kb Notl de pHC2 a uma proporção molar 1:1 no pronúcleo de embriões de meio dia (C57BL/6J x DBA/2J)F2 como descrito por Hogan et ai., (B. Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, 2a edição, 1994, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview NY) . Três linhas independentes de murganhos transgénicos compreendendo sequências de Vx6 e de HC2 foram estabilizadas a partir de murganhos que se desenvolveram a partir de embriões injectados. Estas linhas são designadas (HCol2) 14881, (HCol2)15083, e (HCol2) 15087. Cada uma das três linhas foram então cultivadas com murganhos compreendendo a mutação CMD descrita no Exemplo 1, a mutação JKD (Chen et al., 1993, EMBO J. 12:811-820), e o transgene (KCo5)9272 (Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 115 14:845-851). Os murganhos resultantes expressam transgenes de cadeia pesada e kapa leve humana num fundo homozigótico para a interrupção dos loci da cadeia pesada e leve kapa do murganho endógeno.
Exemplo 3. Produção de Anticorpos monoclonais Anti-CTLA-4 Humana de IgG Kapa Humana
Antigénio à base de células
Um segmento de ADN codificando uma proteína de fusão compreendendo sequências dos genes da CTLA-4 humana e CD3zeta de murídeo foi construído por amplificação por PCR de clones de ADNc juntamente com oligonucleótidos sintéticos de ponte. A proteína de fusão codificada contém as seguintes sequências: i. aminoácidos 1-190 codificando CTLA-4 humana (contendo o péptido sinal, o domínio extracelular da CTLA-4 humana e a totalidade da sequência transmembranar presumida da CTLA-4 humana) e ii. CD3zeta de murídeo dos aminoácidos 52 até ao terminal carboxilo (Weissman et al., (1988) Science 239:1018-1021). O produto amplificado por PCR foi clonado num vector plasmídico e a sequência de ADN foi determinada. A inserção clonada foi então subclonada no vector pBABE (que contém um gene codificando para a resistência a puromicina (Morganstern, JP e Land, H Nucl. Acids Res. 18:3587-96 (1990)) para criar pBABE-huCTLA-4/CD3z. pBABE-huCTLA-4/CD3z foi transfectado na linha de empacotamento retroviral, ψ-2, e foram seleccionadas uma mistura de células resistentes de puromicina. Estas células foram co-cultivadas com o hibridoma de células T de murídeo BW5147 (ATCC #TIB-47). Após 2 dias de co-cultura as células BW5147 não aderentes foram
removidas e seleccionadas para resistência a puromicina. A 116 mistura de células resistente a puromicina foi subclonada por diluição limitante e testada para expressão de superfície da CTLA-4 humana por FACS. Um clone expressando niveis elevados de CTLA-4 humana na superfície celular foi seleccionada.
Antigénio Solúvel A proteína de fusão de CTLA-4 recombinante compreendendo o domínio extracelular de CTLA-4 humana foi adquirida de R&D Systems (Cat. #325-CT-200) . 0 fragmento de CTLA-4 extracelular foi preparado por clivagem proteolítica da proteína de fusão CTLA-4 num sítio de clivagem de protease de Factor Xa localizado após o terminal C do domínio extracelular de CTLA-4. A proteína de fusão foi tratada com Factor Xa a uma proporção de 50:1 de proteína de fusão com o Factor Xa, e o fragmento de CTLA-4 foi isolado pela passagem por HPLC em proteína G-Sepharose e Mono Q. As fracções foram testadas quanto à presença de dímero de CTLA-4 humana por SDS-PAGE e por ligação a células expressando moléculas de B7 de murganho (LtkmB7.1: células Ltk(-)de murganho transfectadas com um clone de vector de expressão de ADNc B7.1 de murganho). As fracções positivas foram misturadas e dialisadas em tampão PBS.
Murganhos transgénicos
Foram utilizadas duas estirpes diferentes de murganhos para produzir anticorpos monoclonais reactivos para CTLA-4. A estirpe ((CMD)++; (JKD)++; (HCo7)11952+/++; (KCo5)9272+/++), e a estirpe ((CMD)++; (JKD)++; (HCol2)15087+/++; (KCo5)9272+/++). Cada uma destas estirpes são homozigóticas para interrupções dos loci da 117 cadeia pesada endógena (CMD) e cadeia leve Kapa (JKD). Ambas as estirpes compreendem também um transgene de cadeia leve humana Kapa (KCo5), com animais individuais quer hemizigóticos ou homozigóticos para a inserção #11952. As duas estirpes diferem no transgene da cadeia pesada humana utilizada. Os murganhos foram hemizigóticos ou homozigóticos para ambos os transgenes HCo7 ou HCol2. A mutação CMD é descrita acima no Exemplo 1. A produção de murganhos (HCol2)15087 é descrita no Exemplo 2. A mutação JKD (Chen et al., 1993, EMBO J. 12:811-820) e os murganhos (KCo5)9272 (Fishwild et al., 1996, Nature
Biotechnology 14:845-851) e (HCo7)11952, são descritos na Patente U.S. N° 5 770 429 (Lonberg & Kay, 6/23/98).
Imunização
Murganhos transgénicos foram inicialmente imunizados i.p. com 1 - 3 x 107 células em PBS, ou com 10 - 50 pg de proteina de fusão solúvel em adjuvante (quer Freund completo ou Ribi). Murganhos imunizados foram subsequentemente reforçados a cada 2 a 4 semanas i.p. com 1 - 3 x 107 células em PBS. Os animais foram mantidos no protocolo durante 2 a 5 meses. Antes da fusão, os animais foram reforçados i.v. nos dias -3 e -2 com aproximadamente 106 células, ou com 10 - 20 pg de antigénio solúvel (proteina de fusão ou proteina de fusão e fragmento extracelular). Alguns animais também receberam proteina de fusão i.v. no dia-4. Fusões sucessivas resultando em anticorpos monoclonais IgG Kapa reactivos para CTLA-4 foram obtidas de murganhos imunizados por uma variedade de diferentes protocolos, incluindo apenas células, apenas antigénio solúvel, e imunizações celulares seguidas por antigénio solúvel administrado i.v. antes da fusão. 118
Fusões
As células do baço foram fundidas com células de mieloma de murganho (linha P3 X63 Ag8.6.53, ATCC CRL 1580, ou SP2/0-Agl4, ATCC CRL 1581) através de processos convencionais (Harlow e Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. Nova Iorque; Kennett et al., 1980, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysis. Plenum, Nova Iorque; Oi e Hertzenberg, 1980, Immunoglobulin Producíng Hybrid Cell Lines, em Selected Methods In Cellular Immunology, ed. Mishell e Shiigi, pp. 357-372. Freeman, São Francisco; Halk, 1984, Methods in Enzymology: Plant Molecular Biology, ed. Weissbach e Weissbach, pp. 766-780, Academic Press, Orlando, FL) . As células foram cultivadas em DMEM, FBS a 10%, OPI (Sigma 0-5003), BME (Gibco 21985-023), Origen Hibridoma Cloning Factor a 3% (Igen IG50-0615) , e meio condicionado P388dl a 5% (ATCC TIB 63) . Foi adicionado suplemento HAT ou HT ao meio durante o crescimento inicial e selecção.
Rastreio de Hibridomas
Para identificar hibridomas que segregam anticorpos IgG Kapa humanos, foram revestidas placas de ELISA (Nunc MaxiSorp) durante a noite a 4 °C com 100 pL/poço de anticorpo especifico Fcgama γ anti-humana (Jackson Immuno Research #109-006-098) a 1 pg/mL em PBS. As placas foram lavadas e bloqueadas com 100 pL/poço de PBS-Tween contendo BSA a 1%. Foram adicionados cinquenta pL do sobrenadante da cultura de células seguido por uma incubação de 1 - 2 horas. As placas foram lavadas e depois 119 incubadas durante uma hora com 100 pL/poço de cadeia leve anti-Kapa de cabra conjugada com fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano (Sigma #A-3813, ou #A-7164). As placas foram lavadas três vezes em PBS-Tween entre cada passo. Foi utilizado um ensaio análogo para identificar hibridomas que segregam anticorpos humanos reactivos com CTLA-4 humana. Este ensaio foi idêntico excepto que as placas de ELISA foram revestidas com proteína de fusão de CTLA-4 recombinante em vez de anticorpo de Fcgama de cabra anti-humana.
Caracterização de anticorpos monoclonais
Foram subclonados setenta e dois hibridomas que se verificou por ELISA segregarem IgG Kapa humana que se liga a CTLA-4 humana. Quarenta e sete destes subclones foram testados para determinar se os anticorpos humanos segregados se ligam a células que expressam CTLA-4, e se os anticorpos inibem a CTLA-4 solúvel da ligação às células que expressam B7. A ligação foi determinada por citometria de fluxo. Para medir a inibição, foram incubados 50 microlitros de cada sobrenadante com células 105LtkmB7.1 e 25 ng de proteína de fusão CTLA-4 recombinante. A fluorescência de canal média foi então determinada por citometria de fluxo. A Figura 2 apresenta a inibição da ligação de CTLA-4 solúvel a células que expressam B7.1. A fluorescência de canal média (MCF) das células LtkmB7.1 coradas com a proteína de fusão CTLA-4 recombinante humana foi determinado na presença de sobrenadante de hibridoma. Os hibridomas que segregam anticorpos bloqueadores resultaram em valores inferiores de MCF. BNI3.1 (Cat.#34580D, Pharmingen, San Diego, CA) foi utilizado como um anticorpo monoclonal de murganho de controlo positivo que bloqueia a ligação GTLA-4/B7. 120
Aproximadamente 40% dos hibridomas parecem inibir fortemente a ligação de CTLA-4 ao ligando B7.
Os anticorpos dos clones 10D1.3, 4B6.12, e 11E8, foram então ensaiados por BIAcore (Biacore AB, Uppsala, Suécia) para determinar a cinética de ligação. O fragmento extracelular de CTLA-4 recombinante purificada foi acoplado ao chip sensor CM5 @ 1200 RU. A ligação foi medida por adição do anticorpo em concentrações de 0,25, 0,5, 1, 2,5, e 5 pg/mL a uma taxa de fluxo de 5 pL/min. As curvas de ligação foram ajustadas ao modelo de ligação de Langmuir utilizando BIAevaluation software (Biacore AB, Uppsala, Suécia) . Os anticorpos foram purificados por cromatografia em proteina-A Sepharose. As taxas de início e final são apresentadas na Tabela 2:
Tabela 2. Cinética da ligação de anticorpos humanos IgG Kapa a CTLA-4 recombinante imobilizada numa superfície.
Hibridoma ka (1/Ms) kd (1/s) Ka (1/M) 10D1.3 4,1 x 10' O 1—1 X 0 1 1 O 1—1 X 4B6.12 5,1 x 10' 1,3 x 10“4 O \—1 X 11E8 4,3 x 10' O \—1 X 00 1 1 2 x 10y
As diluições seriadas de 10 diferentes anticorpos monoclonais humanos IgG Kapa anti-CTLA-4 humana (3A4, 9A5, 2E2, 2E7, 4B6, 4E10, 5C4, 5G1, 11E8, e 11G1) foram adicionados a poços de microtitulação revestidos com proteína de fusão CTLA-4 recombinante. Após uma incubação de 2 horas, o anticorpo 11E8 121 biotinilado foi adicionado a cada poço a uma concentração de 0,1 yg/mL. As amostras foram incubadas durante 30 minutos, lavadas, e o anticorpo ligado detectado com conjugado de fosfatase alcalina/estreptavidina. As titulações são apresentadas na Figura 3. A ligação do anticorpo 11 E8 foi bloqueada pelo próprio e 7 dos outros anticorpos humanos. Contudo, a ligação não foi bloqueada pelos anticorpos 3A4 ou 9A5. As experiências de ligação reciproca mostraram que a ligação de 11E8 não bloqueia a ligação de 3A4 ou 9A5 a CTLA-4.
Sequência de ADN O ARN foi extraído a partir de, aproximadamente, 2 x 10β células de cada linha de células de hibridoma subclonado e utilizado para sintetizar ADNc utilizando reagentes e protocolos da Invitrogen (Micro-FastTrack e cDNA Cycle: Cat. #L1310-01, e #Kl520-02, Invitrogen, Carlsbad, CA). Os fragmentos da região V da cadeia pesada e kapa leve da imunoglobulina foram amplificados por PCR utilizando a polimerase pfu (Stratagene, La Jolla, CA), iniciadores degenerados FR1 e iniciadores únicos para a região constante. Os fragmentos de PCR resultantes foram clonados no vector pCR-Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA) e a sequência da inserção foi determinada. As sequências preliminares para o fragmento da cadeia pesada e leve do hibridoma 10D1.3 são apresentadas na Figura 4. As sequências determinadas para o fragmento da cadeia pesada e leve do hibridoma 10D1.3 são apresentadas da Figura 5 à Figura 8. 122
Tabela-3. Sequências CDR das cadeias leve e pesada para os MAbs 10D1, 4B6, e 1E2.
Cadeia HuMftb CDRl SEQ ID N°: CDR2 SEQ ID N°: CDR3 SEQ ID N° : Cadeia 10D1 RASQSVGSSYLA 24 GAFSRAT 29 QQYGSSPWT 35 Leve 4B6 RASQSVSSSFLA 25 GASSRAT 30 QQYGSSPWT 35 1E2 RASQGISSWLA 26 AASSLQS 31 QQYNSYPPT 36 Cadeia 10D1 SYTMH 27 FISYDGNNICYYADSVKG 32 TGWLGPFDY 37 pesada 4B6 SYTMH 27 FISYDGSNKHYRDSVKG 33 TGWLGPFDY 38 1E2 SYGMH 28 VIWYDGSNKYYADSVKG 34 APNYIGAFDV 39
Exemplo 4. Utilização das Sequências Parciais de Anticorpo para Expressar Anticorpos Intactos
Os anticorpos interagem com antigénios alvo predominantemente através de residuos de aminoácidos que estão localizados nas seis regiões que determinam a complementaridade da cadeia pesada e leve (CDR's). Por esta razão, as sequências de aminoácidos nos CDR's são mais diversas entre anticorpos individuais do que as sequências fora dos CDR's. Porque as sequências do CDR são responsáveis pela maioria das interacções anticorpo-antigénio, é possível expressar anticorpos recombinantes que mimam as propriedades de anticorpos que ocorrem especificamente de uma forma natural através da construção de vectores de expressão que incluem sequências CDR do anticorpo específico que ocorre naturalmente enxertado numa estrutura de sequências a partir de um anticorpo diferente com diferentes propriedades (Jones et al. 1986, Nature 321, 522-525) . Estas sequências da estrutura podem ser obtidas a partir das bases de dados de ADN públicas que incluem sequências de genes de anticorpo de uma linha germinal. Estas sequências da 123 linha germinal diferem das sequências dos genes do anticorpo maduro porque não incluem os genes variáveis completamente montados, que são formados pela união V(D)J durante a maturação de células B. As sequências dos genes da linha germinal vão também diferir da sequência de anticorpo de repertório secundário com afinidade elevada nos nucleótidos individuais devido às mutações somáticas. Contudo, as mutações somáticas não estão distribuídas uniformemente ao longo da região variável. Por exemplo, as mutações somáticas são relativamente pouco frequentes na porção amino-terminal da estrutura da região 1 e na porção carboxi-terminal da estrutura da região 4. Além disso, muitas mutações somáticas não alteram significativamente as propriedades de ligação do anticorpo. Por esta razão, não é necessário obter a sequência de ADN total de um anticorpo particular de modo a recriar um anticorpo recombinante intacto possuindo propriedades de ligação semelhantes às do anticorpo original (ver documento PCT/US99/05535 (documento WO 9945962) apresentado em 12 de Março de 1999. A sequência parcial da cadeia pesada e leve que se estende pelas regiões CDR é tipicamente suficiente para este objectivo. A sequência parcial é utilizada para determinar qual a linha germinal variável e unir os segmentos do gene que contribuem para os genes variáveis do anticorpo recombinado. A sequência da linha germinal é então utilizada para preencher as porções que faltam da região variável. As sequências líder da cadeia pesada e leve são clivadas durante a maturação da proteína e não contribuem para as propriedades da anticorpo final. Por esta razão, não é necessária a utilização da correspondente sequência líder da linha germinal nas construções de expressão. Para adicionar as sequências que faltam, as sequências de ADNc clonadas podem ser combinadas com oligonucleótidos sintéticos por ligação ou amplificação por PCR. Alternativamente, a região variável total 124 pode ser sintetizada como um conjunto de oligonucleótidos curtos, sobreponiveis, e combinados por amplificação por PCR para criar um clone com uma região variável completamente sintética. Este processo possui certas vantagens, tais como a eliminação ou inclusão de sitios de restrição particulares, ou optimização de codões particulares.
As sequências de nucleótidos dos transcritos da cadeia pesada e leve a partir de hibridomas são utilizadas para a concepção de um conjunto sobreponivel de oligonucleótidos sintéticos para criar sequências V sintéticas com idênticas capacidades de codificação de aminoácidos como as sequências naturais. As sequências sintéticas da cadeia pesada e leve kapa podem diferir das sequências naturais em três formas: cadeias de bases de nucleótidos repetidas são interrompidas para facilitar a síntese de oligonucleótido e a amplificação por PCR; os sítios de iniciação de tradução óptimos são incorporados de acordo com as regras de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266, 19867-19870); e, os sítios í/indIII são manipulados a montante dos sítios de iniciação de tradução.
Para as regiões variáveis da cadeia pesada e leve, a codificação óptima, e as sequências não codificantes da cadeia correspondentes são degradadas em segmentos de 30 - 50 nucleótidos de modo que as falhas entre nucleótidos para a cadeia da sequência codificante ocorrem a, aproximadamente, o ponto médio do oligonucleótido não codificante correspondente. Deste modo, para cada cadeia, os oligonucleótidos podem ser montados em conjuntos de cadeias duplas sobreponiveis que cobrem completamente a sequência desejada. Estes oligonucleótidos são combinados em misturas que cobrem segmentos de 150 - 400 nucleótidos. As misturas são então utilizadas como moldes para 125 produzir produtos de amplificação por PCR, de 150 - 400 nucleótidos. Tipicamente, um único conjunto de oligonucleótidos para uma única região variável será clivado em duas misturas que são separadamente amplificadas para produzir dois produtos de PCR sobreponiveis. Estes produtos sobreponiveis são então combinados por amplificação por PCR para formar uma região variável completa. Pode também ser desejável incluir um fragmento sobreponivel da região constante da cadeia pesada ou leve (incluindo o sitio Bbsl da cadeia leve kapa, ou o sitio Agel na cadeia pesada gama) na amplificação por PCR para produzir fragmentos que podem facilmente ser clonados nas construções de vector de expressão.
As regiões variáveis reconstruídas da cadeia pesada e leve são, então, combinadas com as sequências clonadas do promotor, iniciação da tradução, região constante, 3' não traduzida, poliadenilação, e de terminação da transcrição, para formar as construções do vector de expressão. As construções de expressão da cadeia pesada e leve podem ser combinadas num único vector, co-transfectadas, serialmente transfectadas, ou separadamente transfectadas em células hospedeiras que são então fundidas para formar uma célula hospedeira que expressa ambas as cadeias.
Os plasmídeos para utilização na construção de vectores de expressão para IgGk humana estão abaixo descritos. Os plasmídeos foram construídos de modo que as sequências de ADNc da cadeia pesada V e leve kapa V amplificadas por PCR possam ser utilizados para reconstruir minigenes completos de cadeia pesada e leve. Estes plasmídeos podem ser utilizados para expressar anticorpos IgGlk ou IgG4k completamente humanos, ou quiméricos. Os plasmídeos semelhantes podem ser construídos por expressão de 126 outros isotipos da cadeia pesada, ou para expressão de anticorpos compreendendo cadeia leves lambda. 0 plasmideo da cadeia leve kapa, pCK7-96 (SEQ ID N°:40), inclui a região constante kapa e o sitio de poliadenilação, de modo que as sequências de kapa amplificam com iniciadores 5' que incluem sitios HindIII a montante da metionina iniciadora que podem ser digeridos com HindIII e Bbsl, e clonados em pCK7-96 digerido com HindIII e Bbsl para reconstruir uma sequência codificante completa de cadeia leve em conjunto com um sitio de poliadenilação. Esta cassete pode ser isolada como um fragmento HindIII/Notl e ligada às sequências do promotor de trancrição para criar um minigene funcional para transfecção em células. 0 plasmideo da cadeia pesada gamai, pCG7-96 (SEQ ID N°:41), inclui a região constante gamai humana e o sítio de poliadenilação, de modo que as sequências gama amplificam com iniciadores 5' que incluem sitios HindIII a montante da metionina iniciadora e podem ser digeridos com HindIII e Agel, e clonados em pCG7-96 digerido com HindIII e Agel para reconstruir uma sequência codificante completa da cadeia pesada gamai em conjunto com um sitio de poliadenilação. Esta cassete pode ser isolada como um fragmento HindIII/SalI e ligada a sequências de promotor de transcrição para criar um minigene funcional para transfecção de células. 0 plasmideo da cadeia pesada gama4, pG4HE (SEQ ID N°:42), inclui a região constante gama4 humana e o sitio de poliadenilação, de modo que as sequências gama amplificam com iniciadores 5' que incluem sítios HindIII a montante da metionina iniciadora e podem ser digeridos com HindIII e Agel, e clonados em pG4HE digerido com HindIII e Agel para reconstruir 127 uma sequência codificante completa da cadeia pesada gama4 em conjunto com um sitio de poliadenilação. Esta cassete pode ser isolada como um fragmento Hindlll/EcoRI e ligada a sequências de promotor de transcrição para criar um minigene funcional para transfecção de células.
Um diferente número de promotores (incluindo, mas não se limitando a CMV, ubiquitina, SRalpha, e beta-actina) pode ser utilizado para expressar os genes reconstruídos da cadeia pesada e leve. Por exemplo, o Vector pCDNA3.1+ (Invitrogen, Carlsbad, CA), pode ser clivado com HindIII e Notl, Xhol, ou EcoRI, para a ligação com as cassetes Kapa, gamai, ou gama4 descritas acima, para formar vectores de expressão que podem ser directamente transfectados em células de mamífero.
Exemplo 5. Ligação de 10D.1 a CTLA-4 A. Ligação de 10D1 a CTLA-4 humana recombinante purificada A ligação de 10D1 a CTLA-4 humana recombinante purificada foi demonstrada por ELISA utilizando métodos e processos convencionais (Figura 9 e Figura 10) . As placas de microtitulação revestidas com CTLA-4 purificada foram incubadas com várias concentrações de 10D1, e depois divulgadas com F(ab')2 de cabra anti-IgG humana conjugado com fosfatase alcalina. Os dados demonstram uma ligação dependente da dose de 10D1, que está bem ajustada com uma curva de 4 parâmetros (coeficiente de correlação é -1,0). A metade da ligação máxima a 15 ng/mL reflecte a elevada capacidade de ligação de 10D1 a CTLA-4. A saturação da ligação foi observada a aproximadamente 0,1 pg/mL. 128
B. Ligação de 10D.1 a CTLA-4 expresso na membrana plasmática das células T
De modo a demonstrar a ligação de 10D1 a CTLA-4 expressa na membrana plasmática de células T, são apresentados os resultados de um ensaio de citometria de fluxo na Figura 10. O ensaio de citometria de fluxo foi utilizado com uma linha de células T transfectadas para expressar níveis elevados de CTLA-4 humana (designada células 58apCTLA-4/CD3zeta) . Foram incubadas várias concentrações de 10D1 fluoresceinado (10D1-FITC), com células 58apCTLA-4. A fluorescência associada às células foi determinada por citometria de fluxo. Como observado com a CTLA4 purificada, 10D1 liga-se às células que expressam CTLA4 de uma forma dependente da dose que estava bem ajustada a uma equação de 4 parâmetros (coeficiente de correlação é -0,999). Metade da ligação máxima foi 190 ng/mL, e a saturação foi atingida com 2 yg/mL. Os 10D1 não se ligam a quaisquer linhas de células negativas para CTLA4 testadas, incluindo os tumores epiteliais da mama SKBR-3, BT474 e MCF10A e células de tumor de Hodgkin's L540, nem se ligam a células que expressam CTLA-4 de murídeo. Estes dados indicam a especificidade do 10D1 para a CTLA humana. Contudo, verificou-se que 10D1 reagia de forma cruzada com CTLA-4 de macaco (ver abaixo). C. Reactividade cruzada de 10D1 com Tecidos Normais Humanos
Neste estudo, uma forma fluoresceinada do artigo de teste (10D1-FITC) foi utilizada para avaliar a ligação. O objectivo do estudo foi avaliar a potencial reactividade cruzada de 10D1-FITC com criossecções de tecidos normais humanos. Não foi observada reactividade cruzada não antecipada. 129 0 estudo foi conduzido de acordo com os Regulamentos das Boas Práticas de Laboratório (GLP) da Food and Drug Administration (21 CFR Parte 58) . 0 painel de tecidos humanos inclui todos os tecidos na "lista sugerida de tecidos humanos para ser utilizados para investigações imuno-histoquimicas de reactividade cruzada" no Anexo II da EC CPMP Guideline III/ 5271/94, "Production and quality control of monoclonal antibodies" e todos os tecidos recomendados em 1997 US FDA/CBER "Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use".
Utilizando um método indirecto com imunoperoxidase, o 10D1-FITC corou especificamente o controlo positivo, que expressa CTLA4 humana, células 58apCTLA4CD3zeta, assim como linfócitos em amígdalas humanas como controlo positivo. A reactividade de 10D1-FITC foi moderada a intensa e foram examinadas duas concentrações de anticorpo (10 pg/mL e 2,5 pg/mL). No controlo positivo 58aPCTLA4CD3zeta e no controlo positivo linfócitos de amígdalas humanas, o 10D1-FITC corou especificamente na membrana e no citoplasma, imediatamente abaixo da membrana, grânulos discretos, redondos. A reactividade foi observada com linfócitos ocasionais foliculares, interfoliculares, e subepiteliais. Menos do que 1-2% de todos os linfócitos de amígdalas foram reactivos com 10D1-FITC.
Os 10D1-FITC não reagiram com o controlo negativo de cérebro humano (cerebelo). Um anticorpo controlo negativo do mesmo isotipo (HulgGl-k-FITC) não se liga especificamente ao controlo positivo 58o$CTLA4CD3zeta que expressa CTLA4 humano ou à amígdalas humana; nem se liga especificamente ao controlo negativo do cérebro humano (cerebelo). 130
Para determinar a reactividade cruzada, o 10D1-FITC foi aplicado a um painel de tecidos normais humanos a duas concentrações (10 pg/mL e 2,5 pg/mL). A reactividade especifica de 10D1-FITC foi observada para linfócitos nas amígdalas (3/3 dadores), nódulo linfóide submucosal no cólon (tracto gastrointestinal [1/3 dadores]), e esfregaços de sangue (2/3 dadores).
As células imunorreactivas foram identificadas como linfócitos com base na morfologia típica (células moleculares redondas com grandes núcleos: citoplasma proporcional e citoplasma escasso, ausência de processos dendríticos, 10-15 pm em diâmetro) e localização nos tecidos (e. g., localização típica nos tecidos linfóides). Nas amigdalass de todos os três dadores (tecidos de teste), linfócitos, 10D1-FITC corou especificamente na membrana e no citoplasma imediatamente a seguir, grânulos discretos, redondos. A reactividade foi observada com linfócitos foliculares, interfoliculares e subepitelial ocasionais. Menos do que 1-2% de todos os linfócitos de amígdalas foram reactivos com 10D1-FITC.
Em 1/3 dos dadores examinados, 10D1-FITC também corou especificamente grânulos discretos em linfócitos foliculares e interfoliculares ocasionais localizados em nódulos linfóides submucosos no cólon (tracto gastrointestinal-cólon [intestino grosso]). De novo, foram corados grânulos discretos na membrana.
Em esfregaços de sangue periférico de dois de três dadores examinados, 10D1-FITC corou especificamente grânulos discretos com aproximadamente 1 pm de diâmetro associados com a membrana de linfócitos raros. Os grânulos foram arranjados em forma de 131 anel ou num padrão curvo. Menos do que 1-2% de todos os leucócitos de sangue periférico foram reactivos com 10D1-FITC.
Tabela 4. Reactividade cruzada de MAb 10D1 com Tecidos Normais Humanos
Artigo de teste 10D1- FITC Anticorpo Controlo Negativo HulgGl-k- FITC Tecido 10 pg/mL 2,5 pg/mL 10 pg/mL 2,5 pg/mL Controlo do Ensaio β2- microglobulina Controlo Positivo de Células 58o$CTLA4CD3zeta 3-4 + 2-4 + Neg Neg Neg Pos Controlo Positivo de Linfócitos em amígdalas humanas 2-3 + 2-3+ Neg Neg Neg Pos Controlo Negativo do Cérebro Humano -cerebelo Neg Neg Neg Neg Neg Pos Adrenais Neg Neg Neg Neg Neg Pos Sangue Pos Neutrófilos Neg Neg Neg Neg Neg Pos Linfócitos 2 + (raro) Neg Neg Neg Neg Pos 132 (continuação)
Artigo de teste 10D1- FITC Anticorpo Controlo Negativo HulgGl-k- FITC Eosinófilos Neg Neg Neg Neg Neg Pos Monócitos Neg Neg Neg Neg Neg Pos Plaquetas Neg Neg Neg Neg Neg Pos Vasos Sanguíneos (endotélio) Examinado em todos os tecidos Detalhado em tecidos individuais Medula óssea Neg Neg Neg Neg Neg Pos Cérebro - Cerebelo Neg Neg Neg Neg Neg Pos Cérebro - Cerebrum (córtex) Neg Neg Neg Neg Neg Pos Mama (Glândula mamária) Neg Neg Neg Neg Neg Pos Olho Neg Neg Neg Neg Neg Pos Tracto Gastrointestinal - Cólon (Intestino grosso) Nódulo linfóide submucoso (foliculares ocasionais e linfócitos interfoliculares) 2-3 + 2-3+ Neg Neg Neg Pos Tracto Gastrointestinal - Cólon (Intestino grosso) Outros elementos Neg Neg Neg Neg Neg Pos 133 (continuação)
Artigo de teste 10D1- FITC /iii Lrcurpu Controlo Negativo HulgGl-k-FITC Tracto gastrointestinal - Esófago Neg Neg Neg Neg Neg Pos Tracto gastrointestinal - Intestino delgado Neg Neg Neg Neg Neg Pos Tracto gastrointestinal - Estômago Neg Neg Neg Neg Neg Pos Coração Neg Neg Neg Neg Neg Pos Rim (glomérulo, túbulos Neg Neg Neg Neg Neg Pos Fígado Neg Neg Neg Neg Neg Pos Pulmão Neg Neg Neg Neg Neg Pos Nódulo Linfático Neg Neg Neg Neg Neg Pos Ovário Neg Neg Neg Neg Neg Pos Trompa de Falópio (oviducto) Neg Neg Neg Neg Neg Pos Pâncreas Neg Neg Neg Neg Neg Pos Paratiróide Neg Neg Neg Neg Neg Pos Nervo periférico Neg Neg Neg Neg Neg Pos Pituitária Neg Neg Neg Neg Neg Pos Placenta Neg Neg Neg Neg Neg Pos Próstata Neg Neg Neg Neg Neg Pos Glândulas salivares Neg Neg Neg Neg Neg Pos Pele Neg Neg Neg Neg Neg Pos Medula espinal Neg Neg Neg Neg Neg Pos Baço Neg Neg Neg Neg Neg Pos Músculo Estriado (Esquelético) Neg Neg Neg Neg Neg Pos 134 (continuação)
Artigo de teste 10D1- FITC Anticorpo Controlo Negativo HulgGl-k- FITC Testículos Neg Neg Neg Neg Neg Pos Timo Tiróide Linfócitos das amígdalas (foliculares, interfoliculares ocasionais e linfócitos subepiteliais) 2+ 1-2+ Neg Neg Neg Pos Outros Elementos das Amígdalas Neg Neg Neg Neg Neg Pos Ureter Neg Neg Neg Neg Neg Pos Vesícula Urinária Neg Neg Neg Neg Neg Pos Útero - Corpo (endométrio) Neg Neg Neg Neg Neg Pos Útero - Cérvix Neg Neg Neg Neg Neg Pos *omissão do anticorpo de teste D. Reactividade específica de 10D.1 com CTLA-4 de macaco A reactividade específica com CTLA-4 de macaco foi demonstrada utilizando células T transfectadas para expressar a CTLA-4 de macaco a níveis elevados (Tabela 5) . Estes dados sugerem que o epitopo de CTLA-4 para 10D1 é conservado entre macacos e humanos, deste modo, o macaco é um bom modelo para avaliar in vivo a segurança do HuMAb 10D1 anti-CTLA4. 135
Tabela 5
Espécie reactividade do reactividade de 10D1 isotipo controlo (MFI) (MFI) CTLA4 humana 3 662 CTLA4 de macaco 4 606 CTLA4 de murideo 5 5 (controlo negativo) MAb 10D1 (10 yg/mL) foi incubado com linhas de células que expressam CTLA-4 recombinante de várias espécies, e detectado por FITC-anti IgG humana. A fluorescência associada às células foi determinada por FACScan e reportada como a intensidade de fluorescência média (MFI). Estes dados mostram que MAb 10D1 reage bem com CTLA-4 de macaco e humana, mas não com CTLA-4 de murideo.
Exemplo 6. Bloqueio de CTLA-4 aos Ligandos B7 por 10D1
De modo a mostrar que a ligação de 10D1 a CTLA-4 bloqueia a interacção de CTLA-4 com os ligandos de CTLA-4, B7.1 e B7.2, os ensaios de competição foram efectuados por citometria de fluxo (Figura 11 e Figura 12) . Como apresentado na Figura 11, a proteína de fusão B7.2 humana-lg marcada com FITC foi incubada com células T 58abCTLA4 e várias concentrações de 10D1 MAb. Na Figura 12, a proteína de fusão CTLA4-Ig marcada com FITC foi incubada com células de murideo transfectadas com B7.1 e várias concentrações de 10D1 MAb. 136
Os ensaios de competição demonstram a capacidade de 10D1 inibir eficientemente as interacções CTLA4-B7 a baixas concentrações (1-10 yg/mL). A concentração eficaz seria, provavelmente, muito inferior sob condições fisiológicas, que teria concentrações muito mais baixas de moléculas CTLA-4 e B7. foram obtidos dados semelhantes utilizando reagentes biotinilados em ensaios ELISA.
Estes estudos in vitro demonstram que MAb 10D1 se liga a CTLA-4 humana com afinidade elevada e especificidade e essa ligação de 10D1 impede a interacção entre as moléculas co-estimuladoras B7 e CTLA-4. Estes dados para 10D1 são consistentes com os perfis de actividade in vitro para anticorpos anti-CTLA-4 de murídeo que demonstraram eficácia em modelos de tumor de murídeos.
Exemplo 6. Mapeamento de Epitopos de 10D.1
As ELISAs competitivas foram efectuadas com anticorpos marcados com biotina e não marcados para determinar a especificidade para o epitopo de CTLA-4. Foram identificados grupos de ligação para o epitopo anti-CTLA-4 entre os anticorpos humanos, e foram definidos dois epitopos adicionais pelos anticorpos monoclonais comerciais de murideo BNI3 (Pharmingen, San Diego, Ca), e 8H5 (Ancell Corp. Bayport, Mn). As Figuras 3, e 13A-13G apresentam os resultados dos ensaios de ligação competitiva que demonstram competição diferencial entre os anticorpos para ligação a CTLA-4. Estes resultados estão resumidos na Tabela 6. 137
Os anticorpos nos grupos de ligação do epitopo anti-CTLA-4 epitopo 4a e 4b possuem caracteristicas de ligação semelhantes, e adicionalmente são bloqueadores fortes da ligação de CTLA-4-lg a B7.1 expressa a superfície celular (Tabela 6). Por exemplo, a Figura 3 apresenta os resultados com anticorpo 11E8 marcado com biotina e 10 anticorpos não marcados (3A4, 9A5, 2E2, 2E7, 4B6, 4E10, 5C4, 5G1, 11E8 e 11G1) . A ligação do anticorpo 11E8 foi auto-bloqueada e 7 dos outros anticorpos não humanos nos grupos 4a e 4b do epitopo. Contudo, a ligação de 11E8 não foi bloqueada pelos anticorpos 3A4 ou 9A5 (grupos 1 e 2 do epitopo) . As experiências de ligação reciproca mostraram que a ligação de 11E8 não bloquearam a ligação de 9A5 ou 3A4 a CTLA-4 (Figura 13A e 13B). São apresentados resultados semelhantes para anticorpos 10D1 com epitopo do grupo 4a e anticorpo de murídeo 147 (Fig 13D e 13F) . Os anticorpos com epitopo do grupo 4b (Figura 13E) são semelhantes aos anticorpos do grupo 4a com a excepção que os anticorpos de epitopo 4b competem com os anticorpos de epitopo do grupo 2 em experiências de ligação reciproca (Figura 13B). Os anticorpos humanos que pertencem aos grupos de epitopo 3, 4a e 4b são bloqueadores eficazes da ligação CTLA-4/B7.1 (Figura 3, e Tabela 6). 138
Tabela 5. MABs contra CTLA-4: Epitopo e propriedades de Bloqueio de CTLA-4/B7.1
Epitopo Anticorpo Competição para a ligação a CTLA-Monoclonal 4 1 2 3 4a 9A5 Sem competição dos grupos 3, 4a, 4b, 5, e 6 Competição fraca do grupo 2 3A4 Competição de uma via dos grupos 1, 4b, 5 e 6 Sem competição com 4a. 1E2 Fraca competição do grupo 3 5A8. Compete com 4a e 4b. Alguma competição com 2 Sem competição para 1 e 5 10D1 Competição cruzada com todos os membros de 4b 147* Competição de 6 (não reciproca) Sem competição com 1, 2, e 5. 11E8 Competição fraca com 3. 11G1 4E10 5C4 3F10
Bloqueia a ligação de CTLA-4-Ig a B7.1 em Ltk mB7.1 Não Não
Sim
Sim 4b 5 486 Competição cruzada com todos os membros de 4a 4A1 Compete com 2 2E2 Competição fraca com 3. 2E7 Sem competição com 1, e 5. Competição de 6 (não-reciproca) 2G1 BNI3** Competes com 6, sem competição com os grupos 1 a 4
Sim
Sim 139
Epitopo Anticorpo Competição para a ligação a CTLA-
Monoclonal 4
Bloqueia a ligação de CTLA-4-Ig a B7.1 em Ltk 6 8H5*** Compete com 5, sem competição com mB7.1 Sim grupos 1 a 4
Competição com grupo 3 não testada * Anticorpo monoclonal de murideo ** Disponível de Pharmingen. Catálogo BNI3 # 34580 D, San Diego CA. *** Disponível de Ancell, ANC 152.2/8H5 Catalog # 359-020, Ancell Corp. Bayport, Mn.
Exemplo 7. 10D1 liga-se a células T humanas activadas A capacidade do anticorpo 10D1 se ligar a CTLA-4 expressa por células T humanas normais foi investigada por análise de citometria de fluxo de células T em repouso e activadas (Figura 14). Células mononucleares humanas isoladas de sangue periférico a 2 x 106/mL foram incubadas na presença ou ausência de 2 pg/mL do mitogénio de células T, fito-hemaglutinina (PHA). Após quatro dias de incubação, as células foram lavadas e coradas com os seguintes anticorpos: 1) sem anticorpo; 2) HuIgGl-FITC, um anticorpo humano IgGl anti-receptor de EGF; 3) 10D1-FITC, anticorpo humano IgGl anti-CTLA-4; e 4) 147-FTTC - anticorpo de murganho anti-CTLA-4 humana. Após incubação para 1 hr., as células foram lavadas e coradas com IgG de coelho anti-FITC seguido por anti-PE de coelho de cabra. A análise foi efectuada em linfócitos conduzidos por dispersão frontal versus lateral. Como apresentado na Figura 14, os linfócitos em repouso não se ligam ao anticorpo 10D1, enquanto que as células T PHA-activadas expressam níveis baixos de CTLA-4 à superfície da célula. 140
Exemplo 8. 10D1 não medeia a lise de células T dependente do complemento ou dependente do anticorpo A capacidade de MAb 10D1 mediar a citotoxicidade celular dependente do complemento (CDCC) ou citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC) de células que expressam CTLA-4 foi investigada.
Para as experiências de CDCC, foi utilizado soro de coelho como uma fonte do complemento, de modo a proporcionar condições óptimas para CDCC. Foi demonstrado que o complemento de coelho era mais eficaz em mediar CDCC com IgGi humana do que com o complemento humano (Jurianz, Maslak et al.. 1999). As células T estimuladas com PHA foram marcadas com 51Cr e incubadas com várias concentrações de MAb 10D1 anti-CTLA4 ou MAb anti-CD3 com ou sem soro de coelho como uma fonte do complemento. Após 1 hora de incubação, o 51Cr libertado pelas células moribundas foi determinada utilizando um contador gama. As células alvo incubadas com 2% de SDS serviram como controlo da lise a 100%. O MAb 10D1 anti-CTLA-4 não mediou CDCC das células T activadas (Figura 15) . Sob as mesmas condições, MAb IgG2a anti-CD3 de murideo levou a uma CDCC significativa. A IgG2a e a IgGi humana fixam eficientemente o complemento de coelho; deste modo, estas diferenças reflectem, provavelmente, a expressão fortemente reduzida de CTLA-4 em comparação com CD3 em células T activadas.
Do mesmo modo, não foi observada actividade ADCC para o MAb 10D1 utilizando células mononucleares análogas autólogas como células efectoras (Figura 16). As células T estimuladas por PHA foram marcadas com 51Cr e incubadas com várias concentrações de MAb 10D1 anti-CTLA4 ou MAb anti-CD3 e células mononucleares autólogas frescas. A proporção efectora para célula alvo foi 141 100:1. Após 4 horas de incubação, o 51Cr libertado pelas células moribundas foi determinado utilizando um contador gama. As células alvo incubadas com 2% de SDS serviram como controlo de lise a 100%. Embora o MAb anti-CD3 seja uma IgG2a de murideo, que pode mediar ADCC eficiente com células efectoras humanas, apenas foram observados niveis baixos de ADCC. Estes dados são consistentes com a necessidade de niveis elevados de expressão do antigénio à superfície das células alvo para ADCC eficiente. Uma vez que MAb 10D1 é uma IgGi humana, um isotipo geralmente capaz de mediar CDCC e ADCC, a ausência destas actividades é provavelmente devida a uma expressão muito baixa de CTLA-4 em células T activadas. Além disso, a observação de que aumentou o número de células T activadas nos estudos primários de toxicologia (ver abaixo) é consistente com a ausência de actividade ADCC e CDCC de células T activadas por MAb 10D1 in vi vo.
Exemplo 9. Estudos de toxicidade pré-clínica de 10D1 em macacos cynomolgus
Foram realizados dois estudos independentes de toxicologia do anticorpo 10D1 e macacos. Foi analisado um total de oito macacos. Quatro macacos (dois machos e duas fêmeas) toleraram três doses de bolus i.v. de 3 mg/Kg anti-CTLA4 humano, e quatro macacos (dois machos e duas fêmeas) toleraram três doses de bolus i.v. de 10 mg/kg de anti-CTLA4 humana sem observações clínicas, imunotoxicológicas, ou histopatológicas significativas. 142 A. Estudo de toxicologia primária de 10D1 (3,0 mg/Kg)
Para investigar os efeitos de 10D1 in vivo, foi efectuado um estudo de toxicologia com dois macacos. Num estudo de toxicidade de dose múltipla de MAb 10D1, este anticorpo foi administrado via injecção intravenosa de macacos. 0 objectivo deste estudo foi determinar a tolerabilidade de MAb 10D1 administrado em dois macacos a uma dose e horário compatível com tratamento eficaz num modelo de regressão de tumor em murídeo e dose proposta em estudos clínicos humanos. Dois macacos cynomolgus fêmeas (Macaca fascicilaris) foram tratados com três bolus de doses intravenosas de 3,0 mg/Kg de 10D1 nos dias 1, 4, e 7 para avaliar a segurança e activação de células T nestes animais. Os animais foram observados para qualquer reacção adversa, perda/ganho de peso, e morbidez e mortalidade até 14 dias após a administração da primeira dose. Sete dias após a última dose, os animais foram sacrificados e necropsiados para examinar os seus órgãos individualmente. Foram rerecolhidas amostras de sangue antes de cada dose e antes da necropsia para exame das populações de células T e expressão de marcadores de activação por citometria de fluxo. 0 plasma foi também recolhido a partir de amostras de sangue para determinar os níveis de anticorpo 10D1 e respostas anti-anticorpo 10D1 por ELISA.
Os animais toleraram três doses de anticorpo 10D1 sem quaisquer sintomas clínicos durante a realização do tratamento. O peso destes animais não se alterou significativamente. Não foram documentadas grandes observações em 47 órgãos/tecidos examinados na necropsia de cada animal.
Os estudos de histopatologia foram efectuados nos laboratórios Redfield, Redfield, AR. Os resultados destes 143 estudos indicaram que doses múltiplas de MAb 10D1 não produziram toxicidade aguda em qualquer dos órgãos e tecidos examinados. A análise farmacocinética revelou a presença de niveis significativos (até 97,3 yg/mL) de MAb 10D1 no plasma de ambos os macacos (ver Tabela 7) . Os niveis de 10D1 no plasma foram determinados por um ensaio de competição com FITC-10D1 utilizando citometria de fluxo e células T 58αβΟΤύΑ-4.
Tabela 7. Niveis de 10D1 no plasma
Tempo Macaco #1 Macaco #2 Pré-la dose 0,0 (pg/mL de plasma) 0,0 (pg/mL de plasma) Dia 4, pré-2a dose 17,4 (pg/mL de plasma) 43,6 (pg/mL de plasma) Dia 7. pré-3a dose 83,6 (pg/mL de plasma) 97,3 (pg/mL de plasma) Dia 14 902 (pg/mL de plasma) 70,9 (pg/mL de plasma) A avaliação da resposta ao anticorpo anti-lODl foi efectuada por ELISA. Não foi observada resposta anti-lODl significativa em qualquer animal durante a realização do estudo (Figura 17) . As placas de microtitulação foram revestidas com MAb 10D1 (durante o ensaio com IgM) ou 10D1 F(ab')2 (para o ensaio com IgG) . As diluições das amostras de plasma de vários tempos foram incubadas com as placas, e foram detectados anticorpos anti-lODl com reagentes de fosfatase alcalina específicos para FC de anti-IgM ou IgG. Os anticorpos IgM anti-lODl parecem ter aparecido pelo dia 14, contudo, os títulos são muito baixos. Estes dados demonstram que os macacos não desenvolveram respostas de anticorpos anti-lODl após 3 doses do anticorpo. 144
Estes dados demonstram que os animais não desenvolvem uma resposta significativa de anticorpo contra o MAb 10D1 durante a realização deste estudo. A imunotoxicologia foi investigada por análise de citometria de fluxo de populações de linfócitos durante a realização do estudo. Os subconjuntos de linfócitos examinados incluíram CD3 como um marcador para células T totais e CD20 como um marcador para células B totais. As células T, foram ainda subdivididas para a expressão de CD4 (marcador de célula T auxiliar) e CD8 (marcador de célula T citotóxico) , assim como para os marcadores de activação CD25, CD29, CD69 e HLA-DR. Não foram registadas alterações notáveis nas populações de células T ou de expressão de marcadores de activação. Os resultados estão resumidos na Tabela 8 abaixo.
Tabela 8. Análise de citometria de fluxo de populações de linfócitos
Tempo Macaco #1 Macaco #2 Pré-la dose %CD3 = 61, %CD20 = 16 %CD4 = 43, %CD8 = 50 %CD25 < 1, %CD29 = 41 %CD69 = < 1, %HLA-DR = 4 %CD3 = 54, %CD20 = 22 %CD4 = 59, %CD8 = 36 %CD25 < 1, %CD29 = 29 %CD69 < 1, %HLA-DR = 1 Dia 4, pré-2a dose %CD3 = 58, %CD20 = 13 %CD4 = 38, %CD8 = 52 %CD25 < 1, %CD29 = 52 %CD69 < 1, %HLA-DR = 2 %CD3 = 56, %CD20 = 16 %CD4 = 62, %CD8 = 37 %CD25 <1, %CD29 = 36 %CD69 < 1, %HLA-DR £1 Dia 7, pré-3a dose %CD3 = 59, %CD20 = 15 %CD4 = 47, %CD8 = 59 %CD3 = 51, %CD20 = 17 %CD4 = 51, %CD8 = 39 145 (continuação)
Tempo Macaco #1 Macaco #2 %CD25 = 2, %CD2 9 = 44 %CD25 = 1, %CD29 = 39 %CD69 = 1, %HLA-DR = 4 %CD69 = 1, %HLA-DR = 2 Dia 14 %CD3 = 64, %CD20 =14 %CD3 = 59, %CD20 = 20 %CD4 = 49, %CD8 = 44 %CD4 = 60, %CD8 = 35 %CD25 = 1, %CD2 9 = 44 %CD25 < 1, %CD29 = 34 %CD69 < 1, %HLA-DR = 15 %CD69 < 1, %HLA-DR =1
As amostras de sangue heparinizadas foram analisadas em fresco por citometria de fluxo utilizando reagentes anti-linfócito marcadas com FITC ou PE. As %CD3 e %CD20 são baseadas num portal de linfócitos. Os marcadores de células T adicionais e os marcadores de activação são todos baseadas em células positivas para CD3. Estes dados indicam que doses múltiplas de MAb 10D1 não têm efeito significativo nas populações de células B e T ou marcadores de células T. B. Estudo primário da toxicologia de 10D1 (3,0 e 10,0 mg/Kg)
Seis macacos cynomolgus (quatro machos e duas fêmeas), experimentalmente não naives e pesando 2,4 a 3,8 kg no início do estudo, foram distribuídos por grupos de tratamento como apresentado na Tabela 9 abaixo. 146
Tabela 9
Grupo N° Número de Machos/Fêmeas Nível da dose (mg/kg) Vol. Dose (mL/kg) Cone. da Solução da Dose (mg/mL) 1 2/0 3 0, 6 5,0 2 2/2 10 2,0 5,0
Cada animal recebeu uma dose de anti-CTLA4 humano (concentração de 5 mg/mL) por injecção intravenosa (i. e., injecção de bolus "lentamente") cada três dias durante uma semana (i. e., nos Dias 1, 4 e 7) . As observações clinicas detalhadas foram conduzidas, pelo menos, duas vezes por dia ("observações da gaiola"), e foram efectuados exames clinicos completos em cada animal antes do estudo e no Dia 12. Os pesos corporais foram medidos semanalmente (pré-estudo e Dias 7 e 14), e o exame oftalmoscópico foi conduzido em todos os animais antes do estudo e no Dia 12. As amostras de sangue para avaliação da química do soro, hematologia e parâmetros de coagulação foram rerecolhidas de todos os animais no pré-estudo e no Dia 14. As amostras adicionais para parâmetros de hematologia seleccionados (apenas células brancas do sangue totais e diferenciais) foram rerecolhidas antes da dosagem em cada dia de dosagem (Dias 1, 4, e 7). As amostras de urina para análise convencional de urina foram obtidas por drenagem a partir de tabuleiros de recolha especialmente desenhados para gaiolas antes da dosagem e no Dia 13. As amostras de sangue foram também rerecolhidas antes de cada dose (Dias 1, 4 e 7) e antes da terminação (Dia 14) para várias análises conduzidas por Medarex. Estas incluíam a análise da concentração do artigo de teste (farmacocinética) , 147 determinação da presença de anticorpos contra o artigo de teste, e análise de citometria de fluxo. Todos os animais foram eutanizados no Dia 14, altura em que, foi conduzida uma vasta necropsia, foram pesados os órgãos principais, e um conjunto completo de tecidos convencionais foi recolhido de cada animal e processado para exame por microscopia óptica. A administração intravenosa de anti-CTLA4 humana a níveis de dose de 3 mg/kg e 10 mg/kg administrada em cada três dias durante um total de três doses foi muito bem tolerada por macacos cynomolgus. Não se verificaram sinais clínicos de toxicidade a partir das observações das gaiolas e exames físicos, e não se observaram efeitos no peso corporal, exames oculares, parâmetros de patologia clínica, observações grosseiras em necropsia, peso de órgãos ou histomorfologia dos tecidos.
Os resultados das análises da concentração do artigo de teste em amostras de soro (i. e., através dos níveis medidos em amostras obtidas antes da dosagem nos Dias 4 e 7, e antes da necropsia no Dia 14) indicaram exposição ao artigo de teste dependente da dose. No Dia 7, as concentrações médias pré-dose foram aproximadamente 84 e 240 pg/mL para os grupos de doses de 3- e 10-mg/kg, respectivamente.
Foi evidente um potencial para acumulação do artigo de teste no soro com a modalidade de dose de três-em-três dias, em macacos, a partir da diferença entre o Dia 4 e Dia 7 através dos níveis (i. e., as concentrações médias no Dia 7 foram, aproximadamente, duas vezes tão elevadas como no Dia 4), assim como a partir dos elevados níveis residuais no Dia 14 (uma semana depois da última dose), que foram semelhantes ao Dia 7 148 através dos níveis. Foi detectada a evidência da formação de anticorpo contra o artigo de teste em dois dos seis animais do estudo (um do grupo 1 e outro do grupo 2) . No último caso, parecia que a resposta ao anticorpo podia ter afectado a eliminação do artigo de teste da circulação. A análise de citometria de fluxo dos subconjuntos de linfócitos revelou um modesto aumento no total das células positivas para CD3 entre o Dia 1 e o Dia 14, que estava relacionado com o aumento nas células positivas para CD3/CD4, e uma diminuição respectiva nas células positivas para CD3/CD8 (apenas Grupo 2) . A percentagem de células CD3 que expressam CD29 e HLA-DR moderadamente aumentou ao longo do estudo, o que foi consistente com as observações prévias de que anticorpos anti-CTLA4 podem aumentar células T específicas para o antigénio.
Em conclusão, à parte de alterações menores sub-populações circulantes de linfócitos, o nível de dose mais elevada testado neste estudo (i. e., três doses de 10 mg/kg administradas com intervalos de três dias) foi um nível de dose sem efeito absoluto em macacos cynomolgus.
Exemplo 10. Um ensaio clínico humano de Fase I de MAb 10D1 no cancro da próstata (MDXCTLA4-01) e melanoma (MDXCTLA4-02) MDXCTLA4-01 é um estudo de rótulo aberto de anticorpo monoclonal contra o antigénio 4 associado a linfócitos T (anti-CTLA-4) anti-citotóxico 10D1 (MAb 10D1) em doentes com cancro da próstata progressivo, metastásico, refractário a hormonas. 0 tratamento é uma dose única de MAb 10D1 que é administrado intravenosamente, como uma infusão, numa dosagem de 3,0 mg/Kg. 149
Os objectivos deste ensaio foram a determinação de se i. a administração de MAb 10D1 causa activação não especifica de células T, ii. estabelecer um perfil de segurança/tolerabilidade para o MAb 10D1 nestes doentes e, iii. determinar o perfil farmacocinético de MAb 10D1 e permitir o desenvolvimento no hospedeiro de uma resposta imunitária contra MAb 10D1. Adicionalmente, o estudo tenta identificar evidências preliminares de eficácia. 0 estudo é um estudo multicentro, de marca conhecida de uma dose única de MAb 10D1 em 14 indivíduos. 0 estudo consiste quatro fases: Selecçâo, Infusão, Pós-infusão, e Seguimento (ver Tabela 10 abaixo).
Tabela 10
Fase Selecçâo Infusão Pós-infusão Seguimento Tempo Dias ~30 a 145 160 190 250 370 24 h 48h 72 h Dia Dia Dia Dia mensalmente 14 a 0 130 min min min min min min 7 14 21 28
Estão a ser seleccionados doentes com diagnóstico histológico de adenocarcinoma primário da próstata, e carcinoma progressivo metastásico da próstata após privação de androgénio e, pelo menos, uma manipulação sistémica não hormonal, para participação neste estudo. Os indivíduos devem apresentar doença progressiva mensurável, PSA progressiva, PSA >5 ng/mL, testosterona <50 ng/dL, supressão de androgénio gonadal primário, esperança de vida >12 semanas, e Estado de Desempenho de Karnofsky h 60%.
Os indivíduos são submetidos a exame físico, ECG, radiografia do tórax, imagiologia de diagnóstico, e colheita de sangue para avaliação hematológica, bioquímica, e de função 150 imunitária, e monitorização dos sinais vitais. São utilizadas entrevistas telefónicas mensais para recolher e registar informação num subconjunto de eventos adversos, incluindo eventos adversos auto-imunes após a progressão da doença, até seis meses após o tratamento. São monitorizadas a PSA (declínio, duração do declínio, progressão, tempo para a progressão) e a resposta à doença (completa, parcial, estável, progressiva) . As concentrações no plasma de MAb 10D1 estão a ser avaliadas imediatamente antes de, durante, e até dois meses após, infusão.
Os dados de quatro indivíduos com cancro da próstata que foram tratados são apresentados na Tabela 11. Não foram registados eventos adversos. Para todos os indivíduos tratados, MAb 10D1 parece ser bem tolerado.
Devido à importância de monitorizar o estado imunitário dos doentes no ensaio e ao objectivo específico de monitorizar os efeitos gerais na activação de células T pelo anticorpo anti-CTLA-4, os critérios de entrada neste estudo incluem níveis mínimos de células T CD4 e CD8 á500/mL e ^500/mL respectivamente. Contudo, foi observado no estudo, durante o acréscimo inicial, que os doentes com cancro da próstata tinham números significativamente reduzidos de células T embora as células T CD4 e CD8 estejam claramente presentes. Muitos doentes foram inicialmente rejeitados com base nos critérios de entrada acima (ver Tabela 11) . A contagem de células T aparentemente reduzidas observada é uma observação previamente não documentada em doentes de cancro da próstata doentes que podem ter relevância em tratamentos que envolvem vacinação contra o cancro nestes doentes. Subsequente a estas observações, os critérios de entrada foram corrigidos para incluir doentes possuindo uma contagem de CD4 e CD8 de >300/mL e >200/mL, respectivamente. 151
De modo a avaliar se a administração de MAb 10D1 pode induzir activação de células T não especifica indesejável, foram analisados linfócitos do sangue periférico dos indivíduos com cancro da próstata por citometria de fluxo para cada um dos marcadores seguintes: CD4, CD8, CD25, CD44, CD69 e HLA-DR. As amostras de sangue foram rerecolhidas nos intervalos de tempo indicados na Tabela 10. Não foi observada alteração significativa na frequência de qualquer destes marcadores durante o decorrer do tratamento para cada um dos indivíduos com cancro da próstata tratados até agora. Um exemplo desta análise é apresentado na Tabela 12 que apresenta a frequência de células positivas para CD4, CD25, CD69 e células positivas para CD8, CD25, CD69 nos tempos antes de, durante, e subsequentes à administração de MAb 10D1 em dois dos indivíduos. Estes dados demonstram que a administração de MAb 10D1 não resulta na activação de células T não específica. 152
Tabela 12. Análise de citometria de fluxo de marcadores da activação de células T em indivíduos com cancro da próstata tratados com 3,0 mg/Kg de MAb 10D1. Número do Doente Tempo CD(4+25+69)% CD (8+25+69) % 3 Pesquisa 1,7 0,8 3 -30MIN (Pré-Infusão) 2,6 0,8 3 40 MIN 2,5 0,7 3 130 MIN 1,9 0, 9 3 145 MIN 1,7 0,5 3 160 MIN 1,7 1 3 190 MIN 1,5 1,5 3 250 MIN 2,1 1,2 3 370 MIN 1,3 0, 9 3 24 HR 1,6 1,6 3 4 8 HR 2,7 3 3 72 HR 0,9 0,5 3 Dia 7 0,9 0,1 3 Dia 14 0,4 0,5 3 Dia 21 2,3 1,9 4 Pesquisa 1,4 0,8 4 -30 MIN (Pré-Infusão) 0,5 0,3 4 40 MIN 0,3 0,1 4 130 MIN 0,3 0,1 4 145 MIN 0,4 0,2 4 160 MIN 0,2 0,2 4 190 MIN 0,8 0,3 4 250 MIN 0,1 0 4 370 MIN 0,3 0,1 4 24 HR 0,2 0,3 4 48 HR 0,4 0, 6 4 72 HR 0,8 0,3 4 Dia 7 1 0,7 4 Dia 14 1,1 0,8 153
Foi também iniciado um segundo ensaio clinico (MDXCTLA4-02) utilizando MAb 10D1 em indivíduos com melanoma maligno Estádio IV. Uma dose única de MAb 10D1 é administrada intravenosamente, como uma infusão, numa dosagem de 3,0 mg/Kg. Este estudo também consiste de quatro fases (Selecção, Infusão, Pós-Infusão e Seguimento) como descrito na Tabela 9, acima.
Os objectivos deste estudo são os relacionados com o estudo acima descrito em cancros da próstata, assim como estabelecer especificamente um perfil de segurança/tolerabilidade para MAb 10D1 em doentes com melanoma maligno no Estádio IV. Foi tratado um doente neste estudo (ver Tabela 13) . Como no estudo do cancro da próstata, MAb 10D1 parece ser bem tolerado. A análise de citometria de fluxo de marcadores de activação de células T neste sujeito, análoga à que foi efectuada para o ensaio de tumor da próstata, também não demonstrou evidência da activação de células T não específica. 154 pCKT-96 (SEQ ID N°:40)
AGGAGAATGAATAAATAAAGTCAATCTTTGCACCTGTGGTTTCTCTCTTTCCTCAATTTAATAATTATTATCTGT
TGTTTACCAACTACTCAATTTCTCTTATAAGGGfiCTAAATATGTAGTCATCCTAAGGCGCATAACCATTTftTAAA
AATCATCCTTCATTCTATfTrACCCTATCATCCrCTGCAAGACAGTCCTCCCTCAAACCCACAAGCCTTCTGTCC
TCACAGTCCCCTGGGCCATGGATCCTCACATCCCAATCCGCGGCCGCAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGnTC ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtg
CCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGGTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCC agctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgc pCG7-96 (SEQ ID N°:41)
GMCTCGAGWGCTGAAGCrmrTGGGGCAt^CCAGGCCtCACCTlGGCTTTGGGGCAGGGAGGGGGCTAAGGTG aôgcaggtggcgccagccaggtgcacacccaatgcccatgagcccagacactggacgctgaacctcgcggacagt taagaacccaggggcctctgcgccctgggcccagctctgtcccacaccgcggtcacatggcaccacctctcttgc
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GGGCTGCCTGGTCAAGGACTACtTCCCCGAACCGGTGACGGtGrCGTGGAACTCAGGCGCCCTÔACCAGCGGCGT GCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAa
CTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATGACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGGTGA
GAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGOAAGCCAGGCTCAGCGerCCTGCCTGGACGCATCCCGGCTATG
CAGCCCCAGTCCAGGGCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTGCCrCrrCACCCOOAGGCCTCTGCCCGCCÇCACTCATGC tcagggagagggtcttctggctttttccccaggctctgggcaggcacaggctaggtgcccctaacccaggckctg
CACACAAAGGGGCAGGmrrGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCeGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCC
CACCCCAAAGGCCAAACrCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACCTrCTCTCCTCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATC
TTCTCTCTGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGGTAAGCCAGCCCAGGCCT
CaCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGAGTAGCCTGCAtCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGAC
ACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAGGACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCXCTrCCCCCCAAAACCC
AAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCGACGAAGACCCTGAG
GTCAAGTTCLAACTGGTACGIX^ACGGCGTGGAGGIXSCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaag gtctccaagaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaaggtgggacccgtggggtgcga
GGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCCTCTGCCCrrGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCCTAC agggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcct gacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaa
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CAGGTGGCAaCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAG cctctccctgtctccgggtaaatgagtgcgacggccggcaagcccccgctccccgggctctcgcsktcggacgag
GAtGCTtGGCACGTACCCCCTGTACATAClTCCCGGGCGCCCAGCATOGAAATAAAGCACCCAGCGCTGCCCTGG GCCCCTGCGAGACTGTGATGGrrCrrTCCACGGGTCAGGCCGAGTCTGAGGCCTGAGTGGCATGAGGGAGGCAGA GCGGGTCCCACTGTCCCCACACTGGCCCAGGCTGTGCAGGTGTGCCTGGGCCCCCTAGGGTGGGGCrCAGCCAGG GGCTGCCCTCGGCAGGGTGGGGGATrTGCCAGCGTGGCCC X CCCTCCAGCAGCACCTGCCCTGOGCTGGGCCACG GGAAGCCCTAGGAGCCCCTGGGGACAGACÀCACAGCCCCTGCCTCTGTAGGAGACTGTCCTGTTCTGTGAGCGCC CCTGTCCTCCCGACCTCCATGCCCACTCGGGGGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGC TCGAATTCATCGATGATAXCAGATCtGCCGGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGATAAGGCASGTTAAC CTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTrrGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCrCACT GACTCGCrGCGCl’CGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGG'rTA'rcCACA GAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCG TTGCTGGCGTriTrCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGA AACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTG CCGCITACCGCmTACCTGTCaKrCTTTCTCCCTltGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTAT CTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGGPGGGCTGTCTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACÇGCTGCGCC TTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACCACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAAC AGGArrAGCAGAGCGAGÕTATGTAGGCGGTGrrACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGA AGGACAGTATrrGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTrACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGC AAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGrnTmGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAA GAAGATCCTTTGATCnTTCTACGGGGrCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATG AGATTATCAAAAAGGATerrCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATAT GAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCA tccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgataccggagggcttaccatctggccccagtgctgca 155
AlGATACCX^GAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAftCCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGC AGAAGTGGTCCTCCAACTTTATCCGCCTCC^TCCAJGGCTATTAAl^TTGCCGGGAAGCTí^GTAAGTAGTrcG CCAGTTAATAí5tTrCOGCftACGTTGTTGCCATrGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTT<3€TATGGCT TC^ri^GCTCCGWrrcCCAACGATCAAGGCGft.GTTACA.TGATCCCCCATGTTGTGCaAAAAAGCGGTTAGCTCC TrCGGTCCTCCGAtCGTTGTCAGAAGTAAâ!fftí<3CCGCAGTGTTAXCACTCATGGTrATGGCAGCftCTGCATAAT TCTCTTACTGtCATGCCATCCQTAAGATXSCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAG TGTATGCGGCGACCGAGrXGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAG&ACXTTAAAA GTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGXTGAGATCCAGITCGATe TAACCCACTCGTGCACCCAAÇTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTtCTGGGTG/iGCAAAAACAGGA AGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGMTAAGGGCGACACGGAMTGTTCftÀTACTCATACTCTTCCTTTTTCAATAT TATTG AAGCATTTATCAGGGTTATTG TCTCATG AG CG GATACATATTTGAATGTATTTAG AAAAATAAACAAATA GGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTAT AAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCXCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCrCTGACACATGCAG CTCCCGGAGAGGOTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGT GTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCITAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGGACATA ttgtcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgattxaggxgacactata pG4HE (SEQ ID N°:42)
GAACTCGAGCAGCTGAAGCITTCTGGGGCAGGCCGGGCCTGACTTTGGCTGGGGGCAGGGAGGÕGGCTAAGGTGA cgcaggtggcgccagccaggtgcacacccaatocccatgagcccagacactggaccctgcatggaccatcgcgga tagacaagaaccgaggggcctctgcgccctgggcccagctctgtcccacaccgcggtcacatggcaccacctctc
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CACATGGACAGAGGTCAGCTCGGCCCACCCTCrGCCCTGGGAGTaACCGCrGTGCCAACCTCTGTCCCTACAGGG cagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacc tgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcggcgtggagtgggagagcaatgggcagccgoagaacaactac aagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcagg
'rGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTC tccctgtctctgggtaaatgagtgcgagggccggcaagcccccgctccccgggctctcggggtcgcgcgaggatg
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CCTCCGACCCCCCATGCCCACTCGGGG®3ATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCATCGATGATATCAGATCTGCC
GGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGATAAGCCAGGTTAACCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCaCGGG gagaggcggtttgcgtattgggcgcxgttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcg gcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacggaggaaagaacat
GTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTrrCCAtAGGCTCCGCCC 156
CCCTGACGAGCATCÁCAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGC gtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttct cccttcgggaagcgyggcgctttctcaatgctcacgctgtagôtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaa GCTGGGCTGTGTGCACGAA.CCCCCCGTTCAGCCCGACCGCtGCGCCTTATCCGGTAACTATCGICTTCA.GTCCAA. cccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcgg
TGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACrAGAAGGACAGTATTTGGmTCTGCGCXCTGCT
GAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTrGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTT
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CArrGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAG gcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaa gttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatg
CTrrrCrGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCC ggcgtcaatacgggataataccgogccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaaogttcttcggg gcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttc agcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataag
GGCGACACGGAAATGTrGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATtTATCAGGGTTATTGTCT
CATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTXCCGCGCACATTTCCCCGàAAAGT gccacc?tgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcg tctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagagggtcacagcttgtctgta agcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaacta tgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatggacatattgtcgttagaacgcggctacaattaata cataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactata 10D1 VH (SEQ ID N°:16) 50 100 ISO 200 250 300 350
CAGGTGCAGC CCTGAGACTCtgcacxggõtatatcatatg ATTCACCATC ACAGCCTGAG TGGCTGGGGC CTCftG
TGGTGGAGTC TCCTGTGCAG CCGCCAGGCT ATGGAAACAA TCCAGAGACA AGCTGAGOÀC CCTTTGACTA
TGCGGGAGGC CCtCTSGATTccaggo\agg TAAATACTAC ATTCCAAGAA ACGGCTATAT CTGGOGCCAG
GÍX3GTCCAGC CACCTXCA6T GGCTGGAGTG GCAGACTCCG CACGCTGTAT ATTACTGTGC GGAACCCTSG
CTGGGAGGTC AGCTATACTA GGTGÃCATTI TGAAGGGCCG CTGCAAATGA GAGGACCGGC TCACCGTCTC 10D1 VK (SEQ ID N°:6) GAAATTGTGT TGACGCAGTC TCCAGGCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA 50 aagagccacc ctctcctgca GGGCCAGTCA OAGTGTTGGC AGCAGCTACT 100 TAGCCTGGTA CCAGCAGAAA CCTGGCCAGG CTCCCAGGCT CCTCATCTAT ISO GGTGCATTCA GCAGGGCCAC TGGCATCCCA GACAGGTTCA GTGGCAGTGG 200 GTCTGGGACA GACTTCACTC TCACCATCAG CAGACTGGAG CCXX3AAGATT 250 TTGCAGfGTA TTACTGTCAG CAGTATGGTA GCTCACCGTG GACGTTCGGC 300 CAAGGGACCA AGGTGGAAAT CAAAC 325 157 4Β6 VH (SEQ ID N°:18) 56 100 ISO 200 250 300 350
CAGGTGCAGC CCTGAGACTC TGÇACTGGGT ATATCATATG ATTCACCGTC ACAGCCTGAG TGGCTGGGGC CTCAG
TGGTGGAGTC TCCTGTGCAG CCGCCAGGCT ATGGAAGCAA TCCAGAGACA AGCTGAGGAC CCTTTGACTA
TGGGGGAGGC CCTCTGGATr CCAGGCAAGG TAAACACTAC ATTCCAAGAA ACGGCTATAT CTGGGGCCAS
gtggtccagc CACCTTCAGT GGCTGGAGTG GCAGACTCCG CACGCTGTAT ATTACTGTGC GGAACCCTOG
CTGGGftGGTC AGCTATACTA GGTGACATTT TGAAGGGCCG CTGCAAATGA GAGGACCGGC TCACCGTCTC 4B6 VK (SEQ ID N°:8) GAAATTGTGT TGACGCAGTC TCCAGOCACC CimCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCACC CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCAGCTTCT TAGCCTGGTA CCAGCAGAAA CCIGGCCAGG CTCCCAGGCT CCTCATCTAT GGTGCAtCCA GÇAGGGCCAC TGGCATCCGA GACAGGTTGA GTGGCAGTGG GTCTGGGACA GACTTCACTC TCACCATCAG CAGACTGGAG CCTGAAGATT TTGCAGTGTA TTACTGTCAG CAGTATGGTA GCTCACCGTG GACGTTCGGC CAAGGGÂCCA AGGTGGAAAT CAAAC 325 1E2 VH (SEQ ID N°:22)
CAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC GTGGTCCAGC CTGGGAGOTC CCTGAGACTC TCCTGTGCAG CGTCTGGATT CACCTTCAGT AGCTATGGCA TQCACTGGGt CCGCCAGGCT CCAGGCAAGG GGCTGGAGTG GGTGGCAGTT ATATGGTATG ATGGAAGTAA TAAATftCTAT GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGAG agçcgaggac acggctgtgt tttactgtgc gagagctccc AATTATATTG GTGCTTTTGA TGTCTGGGGC CAAGGGACAA TGGTCACCGT CTCTTCAG 1E2 VK (SEQ ID N°:12)
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCA CTGTCTGCAT CTQTAGGAGA cagagtcacc atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag CCTGGTATCA GCAGAAACCA GAGAAAGCCC CTAAGTCCCT GATCTATGCT GCATCCAGTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA AGGTTCAGCG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTGCAGCCT GAAGATTTTG CAACTTATTA CTGCCAACAG TATAATAGTT ACCCTCCGAC GTTCGGCCAA GGGACCAAGG TGGAAATCAA AC 322 50 100 ISO 200 250 300 50 100 150 200 250 300 350 50 100 150 200 250 300 158
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> MEDAREX, INC. <120> Anticorpos Contra CTLA-4 Humana e Suas Utilizações
<130> P033834EP <140> EP 00959399.7 <141> 2000-08-24 <150> US 60/150,452 <151> 1999.08.24 <160> 42 <170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1 <211> 3159 <212> ADN <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: vector de clonagem pGPlk <400> 1 159 aattagcggc cgctgtcgac aagcttcgaa ttcagtafccg atgfcggggta cctactgtcc 60 cgggattgcg gatccgcgat gatatcgttg atcctcgagt gcggccgcag tatgcaaaaa 120 aaagcccgct cattaggcgg gctcttggca gaacatatcc atcgcgtccg ccafcctccag 180 cagccgcacg cggcgcatct cgggcagcgt tgggtcctgg ccacgggtgc gcatgatcgt 240 gctcctgtcg ttgaggaccc ggctaggctg gcggggttgc cttactggtt agcagaatga 300 atcaccgata cgcgagcgaa cgtgaagcga ctgctgctgc aaaacgtctg cgacctgagc 360 aaeaacatga atggtettcg gtttcçgtgt ttcgfcaaagt cfcggaaaçgç ggaagtcagc 420 gccctgcacc attatgttcc ggatctgcat cgcaggatgc tgctggctac cctgtggaac 480 acctacatct gtattaacga agcgctggca ttgaccctga gtgatttttc tctggtcccg 540 ccgcatccat accgccagtt gtttaccctc acaacgttcc agtaaccggg catgttcatc 600 atcagtaacc cgtatcgtga gcatcctctc tcgtttcatc ggtatcatta cceccatgaa 660 cagaaattcc cccttacacg gaggcatcaa gtgacçaaac aggaaaaaac cgcccttaac 720 atggcccgct ttatcagaag ccagacatta acgcttetgg agaaactcaa cgagctggac 780 gcggatgaac aggcagacat ctgtgaatcg cttcacgacc acgctgatga gctttaccgc 840 agctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag 900 acggtcacag cttgtctgta agcggatgce gggagcagac aageccgtca gggcgcgtca 960 gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg 1020 tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt. 1080 gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct 1140 cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 1200 aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 1260 aaggccagca aaaggccagg aaccgfcaaaa aggccgcgtt gctggcgtfct ttccataggc 1320 tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 1380 caggactata aagataccag gcgtttccce ctggaagctc cctegtgcgc tctcctgttc 1440 cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaage gtggcgcttt 1500 ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggcc 1560 gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 1620 agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccagçcgc gccttggcct 1680 aagaggccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 1740 tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgetctgc 1800 tgaagceagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 1860 ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagafctac gcgcagaaaa aaaggatctc 1920 aagaagatcc tfctgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 1980 aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 2040 aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 2100 gcttaatcag tgaggcacct atcteagcga tctgtcfcacfc tcgttcatcc atagttgcct 2160 gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctc accatctggc cccagtgctg 2220 caatgatacc gcçagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag 2280 ccggaogggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcetccatc cagtctatta 2340 attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg 2400 ccatcgctgc aggcatcgtg gtgtcacgct cgtegttcgg tatggcttca ttcagctccg 2460 gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cecccatgtt gtgcaaaaaa geggttagct 2520 ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccge agtgttatca ctcatggtta 2580 tggcagcact geataattcc cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg 2640 gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgce 2700 cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcsgaac cttaaaagtg ctcatcattg 2760 gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga 2820 tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcace agegtttctg 2880 ggcgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat 2940 gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc 3000 160 tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttecgcgca 3060 catttccccg aaaagtgccs cctgacgtct âagaaaccat tattatcatg acattaacct 3120 ataaaaatag gcgtâtcacg aggccctttc gtcttcasg 3159 <210> 2 <211> 349
<212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> sequência preliminar do fragmento da cadeia pesada 10D1.3 < 4 0 0 > 2 tgggggaggc gtggtecagc ctgggaggtc cctgagactc tcctgtgcag cetctggatt 60 caccttcagt agctatacta tgcactgggt ccgccaggct ccagqcaagg ggctggagtg 120 ggtgacattfc atatcatatg atggaaacaa taaatactac gcagactccg tgaagggccg 180 attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtafc ctgcaastga acagcctgag 240 agctgaggac acggctatat attactgtgc gaggaccggc tggctggggc cctttgacta 300 ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcctcc accaagggc 349
<210> 3 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> sequência preliminar do fragmento da cadeia leve 10D1.3 <400> 3 aaagagecac cctctcctgc agggccagtc 60 accagcagaa acetggccag gctcccaggc 120 ctggcatccc agacaggttc agtggcagtg 180 gcagaetgga geetgaagat tctgcagtgt 240 ggaegttcgg ccaagggacc aaggtggaaa 300 321 ctccaggcac cctgtetttg tctccagggg agagtgttgg càgcâgctâc ttagcctggt tcctcatcta tggtgcatfcc agcagggcca ggtctgggac agacttcact ctcaccatca attactgtca geagtatggt agctcaccgt tcaaacgaac tgtggctgca c
<210> 4 <211> 287 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> sequência da linha germinal Vk A-27 161 <4Ο0> 4 aagagccacc 60 ccagcagaaa 120 tggcatccca 180 cagactggag 240 287 gaaattgtgt tgacgcagtc tecaggcacc ctgtctttgt ctccagggga ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta cctggccagg ctcccsggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcacte tcaccatcag cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacc
<210> 5 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sequência prevista da região variável da cadeia leve para a linha germinal Vk A-47 <400> 5
Glu lie Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 Ϊ5 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Vai Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly He Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser 85 90 95
<210> 6 <211> 325 <212> ADN <213> Homo sapiens <2 2 0 > <223> região variável da cadeia leve (Vk), 10D1 de Vk A-27 <400> 6 162 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtccttgt ctccagggga aagagccaee 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttggc agcagctact tagcetggta ecagcagaaa 120 cctggccagg crcccággct cctcatctat ggfcgcattca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgç gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 ccfcgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacegtg gaegttcggc 300 caagggacca aggtggaaat caaac 325
<210> 7 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sequência prevista da região variável da cadeia leve para 10D1 de Vk A-47 <400> 7
Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Gly Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 He Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr I le Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu ASp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys 100 105 sapiens <210> 8 <211> 325 <212> ADN <213> Homo 163 <220> <223> região variável da cadeia leve (Vk), 4B6 de Vk A-27 <400> 8 gaaattgtgt tgacgcagtc tceaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagcttct cagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatetat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gaefcfccactc tcaccatcag cagactggag 240 ccfcgaagatt ttgcagtgta ítactgtcag cagtatggta gcteaccgtg gacgttcggc 300 caagggacca aggtggaaat caaac 325
<210> 9 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sequência prevista da região variável da cadeia leve para 4B6 de Vk A-47 < 4 0 0 > 9
Glu He Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Ser 20 25 30 Phe Leu Alâ Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Alâ Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 <210> 10 <211> 287 164
<212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> sequência da linha germinal Vk L-15 < 4 0 0 > 10 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtea gggtattage agctggttag cctggfcatca gcagaaacca 120 gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgceaacag tataatagtt accctcc 287
<210> 11 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> sequência prevista da região variável da cadeia leve para a linha germinal Vk L-15 < 4 0 0 > 11
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 ?0 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr 90 85 165
<210> 12 <211> 322 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> região variável da cadeia leve Vk 1E2 de Vk L-15 tccatcctca ctgtctgcat gggtattagc agctggttag gatctatgct gcatccagtt tgggacagat ttcactctca ctgceaacag tataafcagtt ac <400> 12 gacatccaga tgacccagtc atcacttgtc gggcgagtca gagaaagccc ctaagtccct aggttcagcg gcagtggatc gaagattttg caacttatta gggaccaagg tggaaatcaa ctgtaggaga cagagtcacc 60 cctggtatca gcagaaacca 120 tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ecatcagcag cctgcagcct 240 accctccgac gttcggecaa 300 322
<210> 13 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sequência prevista da região variável da cadeia leve para 1E2 de Vk L-15 <4 0 0> 13
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro 85 90 95 166
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105
<210> 14 <211> 294 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> sequência da linha germinal VH 3-30.3 <4 0 0> 14 caggtgcagc tggtggagtc tgggggagçc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagfct atatcatatg atggaagcaa taaatactac 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggec acggctgtgt attactgtgc gaga 294
<210 > 15 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sequência prevista da região variável da cadeia pesada para a linha germinal VH 3-30.3 <400> 15
Gin Vâl Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 46 45 Ala Vai Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 167
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg <210> 16 <211> 355
<212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> região variável da cadeia pesada VH 10D1 de VH 3-30.3 < 4 0 0 > 16 caggtgcagc tggtggagtc tgggggagge gtggtccagc ctgggaggte cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt eaccttcagt agctatacta tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggetggagtg ggtgacatfct afcatcatatg atggaaacaa taaatactac 180 gcagaetccg tgaagggecg attcaccatc tccagagaca attecaagaa cacgctgtat 240 cfcgcaaatga acagcctgag sgctgaggac acggetatat attactgtgc gaggaccggc 300 tggctggggc cctttgacta ctggggccag ggaaecctgg tcaccgtctc ctcag 355
<210> 17 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0> <223> sequência prevista da região variável da cadeia pesada para 10D1 de VH 3-30.3 < 4 0 0 > 17
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala $çr Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60 168
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp As« $er Lyg A$n Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 30 35
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115
<210> 18 <211> 355 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> região variável da cadeia pesada VH 4B6 de VH 3-30.3 < 4 0 0 > 18 eaggf.gcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatacta tgcactgggt ccgecagget 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtgacattt atatcatatg afcggaagcaa taaacactac 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca afctccaagaa eacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggetatat attactgtgc gaggaccggc 300 tggctgggge cctttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcag 355 <210 > 19 <211> 118
<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> sequência prevista da região variável da cadeia pesada para 4B6 de VH 3-30.3 <4 0 0> 19
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 169
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Thr Phe lie Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Vai Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Xle Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115
<210> 20 <211> 296 <212> ADN <213> Homo sapiens <2 2 0 > <223> sequência da linha germinal VH VH 3-33 <400> 20 caggtgcagc tggfcggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggcc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtfc atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180 çcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa eacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 21 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sequência prevista da região variável da cadeia pesada para a linha germinal VH 3-33 170 <4Ο0> 21
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Met Mis Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60
Gly Arg 'Phe Thr Tle Ser Arg Asp Asn Ser Xys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg <210> 22 <211> 358 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> região variável da cadeia pesada VH 1E2 de VH 3-33 <400> 22 gtggtccagc ctgggaggtc cctgagacte 60 agctatggça tgcactgggt ccgccaggct 120 atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180 tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 acggetgtgt tttactgtgc gagagcteec 300 caagggacaa tggtcaccgfc ctcttcag 358 caggtgcagc tcctgtgcag ceaggcaagg gcagactccg ctgcaaatga aattatattg tggtggagtc egtctggatt ggctggagtg tgaagggccg acagcctgag gtgcttttga tgggggaggc eacctteagt ggtggcagtt attcaccate agccgaggac tgtctggggc
<210> 23 <211> 119 <212> PRT 171 <213> Homo sapiens <220> <223> sequência prevista da região variável da cadeia pesada para 1E2 de VH 3-33 <400> 23
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 1 5 10 1.5 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Kis Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ala Vai Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Mefc Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Phe Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Pro Asn Tyr Ile Gly Ala Phe Asp Vai Trp Gly Gin Gly 100 105 110 Thr Met vai Thr Vai Ser Ser 115
<210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> CDR1 de cadeia leve (HuMab 10D1) <400> 24
Arg Ala Ser Gin Ser Vai Gly Ser Ser Tyr Leu Ala l 5 10 172 <210> 25 <211> 12 <212> PRT A co T-1 Cs] V Homo sapiens <220> <223> CDR1 de cadeia leve (HuMab 4B6) A o o V 25
Arg AÍ a Ser Gin Ser Vai Ser Ser Ser Píie Leu Ala 15 10 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR1 de cadeia leve (HuMab 1E2 A o o ^T1 V 26
Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp Leu Ala 15 10
<210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <223> CDR1 de cadeia leve (HuMab 10D1 4B6) <400> 27
Ser Tyr Thr Het His 1 5 173 <210> 28 <211> 5 <212> PRT A co T-1 Cs] V Homo sapiens <220> <223> CDR1 de cadeia leve (HuMab 1E2) A o o V 28
Ser Tyr Giy Met His 1 5
<210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR2 de cadeia leve (HuMab 10D1) <400> 29
Gly Ala Phe Ser Arg Ala Tbr 1 s <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR2 de cadeia leve (HuMab 4B6) < 4 0 0 > 30
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 S 174 <210 > 31 <211 > 7 <212 > PRT Λ co Τ-1 Cs] V Homo sapiens <2 2 0 > <223> CDR2 de cadeia leve (HuMab 1E2) < 4 0 0 > 31 <210> 32 Ala Ala Ser Ser Leu G. 1 5 <211> 17 <212 > PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR2 de cadeia pesada (HuMab 10D1) < 4 0 0 > 32 Phe I.le Ser Tyr Asp Gly Asft Asn Ly$ Tyr 1 S 10 Gly <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR2 de cadeia pesada (HuMab 4B6) <400> 33 15 175
Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 1 S 10Gly 15
<210> 34 <2ll> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> CDR2 de cadeia pesada (HuMab 1E2) <400> 34
Vai Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 1 5 10 Gly <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <223> CDR3 de cadeia leve (HuMab 10D1, 4B6) Λ o o V 35 Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Fro Trp Thr 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <2 2 3> CDR3 de cadeia leve (HuMab 1E2) 176 <400> 36
Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr 1 5
<210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 de cadeia pesada (HuMab 10D1) <400> 37
Thr Gly Trp Leu Giy Pro Phe Asp Tyr 1 5 <210 > 38 <211> 9 <212 > PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <2 2 3> CDR3 de cadeia pesada (HuMab 4B6) <4 0 0> 38
Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr 1 5
<210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens 177 <220> <223> CDR3 de cadeia pesada (MuMab 1E2) <400> 39
Ma Pro Asn Tyr Ile Gly Ala Phe Âsp Vai 1 5 10
<210> 40 <211> 506 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> adeia leve kappa <223> Descrição da Sequência Artificial: plasmídeo pCK7-96 (parcial) da <400> 40 aggagaatga ataaataaag ataattatta tcfcgttgtft gtcatcetaa ggcgcataac tcetetgcaa gacagtcctc ccatggatcc tcacatccca ctgtgtgaaa ttgfctatccg gtaaagcctg gggtgcctaa ccgctttcca gtcgggaaac ggagaggcgg tttgQgtatt çctcaattta 60 taaafcatgfca 120 taccctatca 180 gtcccctggg 240 tagctgtttc 300 agcataaagt 360 cgctcactgc 420 caacgcgcgg 480 506 tgaatctttg accaactact catttataaa cctcaaaccc atccgcggcc ctcacaattc tgagtgagct ctgtcgtgcc gggcgc cacctgtggt caatttctct aatcatcctt acaagccttc gcaattcgta cacacaacat aactcacatt agctgcatta ttctctcttt tataagggac cattctattt tgtcctcaca atcatggtca acgagccgga aattgcgttg atgaatcggc <210> 41 <211> 4723 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <2 2 3> Descrição da Sequência Artificial: plasmideo pCG-96 da cadeia pesada gamai <400> 41 178 gaactcgagc agctgaagct ttctggggca ggccaggcct gaccttggct ttggggcagg 60 gagggggcta aggtgaggea ggtggcgcca gccaggtgca cacccaatgc ccatgagccc 120 agacactgga cgctgaacct cgccgacagt taagaaccca ggggcctctg cgccctgggc ISO ccagctctgfc cccacaccgc ggtcacatgg caccacctct cttgeagcct ccaccaaggg 240 cccatcggtc ttccccctgg caccetcccc caagagcacc tetgggggca cagcggccct 300 gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc 360 cctgaccagc ggcgtgcaca ccttçccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct 420 cagcagcgtg gtgaeegtgc cctccagcag cttgggeacc cagacctaca tctgcaacgt 480 gaatcacaag cccagcaaea ccaaggtgga caagaaagtt ggtgagaçgc cagcacaggg 540 agggagggtg tctgctggaa gceaggetea gcgctcctgc ctggacgcat cccggctatg 600 cagccccagt ccagggcagc aaggcaggcc ccgtctgcct cttcacccgg aggcctctgc 660 ccgccccact catgctcagg gagagggtct tctggctttt tccccaggct ctgggcaggc 720 aeaggctagg tgcccctaac ccaggccctg cacacaaagg ggcaggtgct gggctcagac 780 ctgccaâgag ccatatccgg gaggaccctg cccctgacct aagcccaccc caaaggccaa 840 actctccact ccctcacctc ggacacctte tctcctccca gattccagta actcccaatc 900 ttctctçtgc agagcecaaa tcttgtgaca aaacteaeac atgcccaccg tgcccaggta 960 agecagceca ggcctcçcco tccagctcaa ggcgggacag gtgccctaga gtagcctgca 1020 tccagggaca ggccccagcc gggtgctgac acgtccacct ccatctcttc ctcagcacct 1080 gaaetectgg ggggaccgtc agtcttcctc tteeecccaa aacccaagga cacccccatg 1140 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 1200 gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 1260 gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1320 tggctgaatg gcaaggagta eaagfcgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1380 gagaaaacca tctccaaago caaaggtggg acccgtgggg tgcgagggcc acatggacag 1440 aggccggctc ggcccaccct ctgccctgag agtgaccgct gtaccaacct ctgtccctac 1500 agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa 1560 gaaccaggtc agectgacct gcccggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga 1620 gtggçagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc aegcctcccg tgctggactc 1680 cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg 1740 gaaegtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccaetaea cgeagaagag 1800 cctctccctg cctccgggta aatgagtgcg acggccggca agcccccgct ccccgggctc 1860 tcgcggtcgc acgaggatgc ttggcacgta ccccetgtac atacttcccg ggcgcccagc 1920 atggaaataa agcacccagc gctgccctgg geccctgcga gactgtgatg gttctttcca 1980 egggtcaggc cgagtctgag gcctgagtgg catgagggag geagagcçgg tcccactgtc 2040 cccacactgg cccaggctgt gcaggtgtgc ctgggccccc tagggtgggg ctcagccagg 2100 ggctgocctc ggcagggtgg gggatttgcc agcgtggccc tccctccagc agcacctgcc 2160 ctgggctggg ccacgggaag ccctaggagc ccctggggac agacacacag cccctgcctc 2220 tgtaggagac tgtcctgttc tgtgagcgcc cctgtcctcc cgacctccat gcccactcgg 2280 gggcatgcct gcaggtcgac tctagaggat ceccgggtac cgagctcgaa ttcatcgatg 2340 atatcagatc tgccggtctc cctatagtga gtcgtattea tttcgataag ccaggttaac 2400 etgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 2460 gcttectcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 2520 cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 2580 tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgegttgct ggcgtttttc 2640 cataggctec gcccccctga cgagcatcae aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 2700 aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 2760 cetgttccga ccctgccgct tsecggataç ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 2820 gcgctttctc aatgcfccacg ctgtaggtat ctcagttcgg fcgtaggtcgt tcgctccaag 2880 ctgggctgtg tgeacgaacc ecccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 2940 cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcage eactggtaac 3000 aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 3060 tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 3120 ggaaaaagag ttggtagcte ttgatccgge aaacaaacca ccgetggtag cggtggtttt 3180 fcttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 3240 ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaacteac gttaagggat tttggtcatg 3300 agattateaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatea 3360 atctaaagtâ tatatgagta aacttggtct. gacag.t.tacc aatgcttaat cagtgaggca 3420 cctátetcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 3480 179 ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggcceeagtg ctgcaatgat accgcgagac 3540 ccacgetcac cggctccaga tttatcagea ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 3500 agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 3560 agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 3720 gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca açgatcaagg 3780 cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 3840 gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta teactcatgg ttatggcagc actgcataat 3900 tctctCactg fccatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta cteaaecaag 3960 tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 4020 aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 4080 cgaaaactct eaaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 4140 cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 4200 aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat acccatactc 4260 ttccttfcttc aatattattg aagcatttat cagggctatt gtctcatgag cggatacata 4320 tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc geacatttcc ccgaaaagtg 4380 ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc 4440 acgaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag 4500 ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag 4560 ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc atcagagcag 4620 ôttgtactga gagtgcacca tatggacata ttgtcgttag aacgcggcta caattaatac 4680 ataacctfcat gtatcatsca cafcacgattt aggtgacacfc ata 4723
<210> 42 <211> 4694 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <22 3> Descrição da Sequência Artificial: plasmideo pG4HE da cadeia pesada gama4 <400> 42 gaactcgagc agctgaagct ttçtggggca ggccgggcct gactttggct gggggcaggg 60 agggggctaa ggtgacgcag gtggcgccag ccaggtgcac acccaatgcc catgagccca 120 gaeaefcggac cctgcatgga ccatcgcgga tagacaagaa ccgaggggcc tctgcgccct 180 gggeeeagct etgtcccaca ccgcggtcac atggcaccac ctctcttgca gcttccacca 240 agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag agcacagccg 300 ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag 360 gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact 420 ccctcagcag cgtggtgacc gtgcccteea gcagcttggg cacgaagacc tacacctgca 480 acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttggtgag aggceagcac 540 agggagggag ggtgtetgct ggaagccagg ctcagccctc stgcctggac gcaccccggc 600 tgtgcageec cagcccaggg cagcaaggca tgccccatct gtctcctcac ccggaggcct 660 ctgaccaccc cactcatgct eagggagagg gtcttctgga tttttccacc aggctccggg 720 cagccacagg etggatgcce ctaccçcagg ccctgcgcat acaggggcag gtgctgcgct 790 cagacctgcc aagagccata tccgggagga ccctgcccct gacctaagcc caccccaaag 840 gccaaactct ccactccctc agctcagaca ccttctctcc tcccsgatct gagtaactcc 900 180 caatcttctc tctgcagagt ecaaatatgg tcccccatgc ceatcatgcc caggtaagec 960 aacccaggcc tcgcccfccca gctcaaggcg ggaeaggtgc cctagagfcag cctgcatcca 1020 gggacaggcc ccagccgggt gctgacgcat ccaoctccat ctcttcctea gcacctgagt 1080 tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct 1140 cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg cggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc 1200 agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg 1260 agcagttcaa cagcacgtac çgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc 1320 tgaacggcaa ggâgtacaag tgcaâggtct ccaacaaâgg cctcccgtcc tccatcgaga 1380 aaaccatctc caaagccaaa ggtgggaccc acggggtgcg agggceacat ggacagaggt 1440 cagctcggcc caccctctgc cctgggagtg accgctgtgc caacctctgt ccctacaggg 1300 cagccccgag agccacaggt gtacaccctg cccccatccc aggaggagat gaccaagaac 1560 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gagaggcggt ttgegtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 2460 ggtegttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 2520 agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 2580 ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ecataggctc cgcccccctg acgagcatca 2640 caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 2700 gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tccfcgttccg accctgccgc ttaccggata 2760 cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgcttfcct caatgctcac gctgtaggta 2820 tctcagttcg gtgtsggteg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 2880 gçccgaccgc tgcgccttat ccggtaaeta tcgtcttgag tccaacccgç taagacacga 2940 cttatcgcca ctggeagcag ccaetggfcaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 3000 tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 3060 fcatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gtfcggtaget cttgatccgg 3120 caaacaaacc accgctggta gcggtggttfc ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 3180 aaaaaaagga teteaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg cteagtggaa 3240 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gagatceagt tegatgtaac ccactcgtgc acceaactga tcttcagcat ettttacttt 4140 eaccagegtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 4200 ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagçattta 4260 tcagggttat tgtetcatga goggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat 4320 aggggttccg cgcacatttc eecgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattafctat 4380 catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg cgegtttcgg 4440 tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta 4500 agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gegggtgtcg 4560 gggetggett aactatgcgg catcagagca gatfcgtactg agagtgcacc atatggacat 4620 attgtcgtfca gaacgcggct acaattaata cataacctta tgtateatac acatacgatt 4680 taggtgacac tata 4694
Lisboa, 11 de Abril de 2007 182

Claims (78)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo humano terapeuticamente eficaz ou uma sua porção de ligação ao antigénio que se liga a CTLA4 na superfície de células T humanas com uma afinidade de ligação de cerca de 101 2 3 4 M"1 ou superior, cujo anticorpo compreende: (a) uma região variável da cadeia pesada de um gene de VH humana 3-30.3; e (b) uma região variável da cadeia leve de um gene de VK A-27 humana.
  2. 2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo é capaz de ligação a CTLA4 humana com uma afinidade de ligação de cerca de 109 M_1 ou superior.
  3. 3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o anticorpo inibe a ligação da CTLA 4 humana a R7-1 ou B7-2.
  4. 4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpo reduz a ligação da CTLA4 humana a B7-1 em, pelo menos, 50%, pelo menos 60%, pelo menos, 70%, pelo menos, 80%, ou, pelo menos, 90%. 1 1 Anticorpo de acordo com a reivindicação 3, em que o 2 anticorpo reduz a ligação da CTLA4 humana a B7-2 em, pelo 3 menos, 50%, pelo menos 60%, pelo menos, 70%, pelo menos, 4 80%, ou, pelo menos, 90%.
  5. 6. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o anticorpo não se liqa a CTLA4 de murganho.
  6. 7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o anticorpo é capaz de ligação a CTLA4 de macaco cinomolgus.
  7. 8. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1-7, em que o referido anticorpo compreende a região variável da cadeia pesada possuindo sequências de uma região complementar determinante apresentada em SEQ ID Nos: 27, 32 e 37.
  8. 9. Anticorpo de acordo com a reivindicação 8, em que o referido anticorpo compreende a região variável da cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N° : 17.
  9. 10. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1-7, em que o referido anticorpo compreende a região variável da cadeia leve possuindo sequências de uma região complementar determinante apresentadas em SEQ ID Nos: 24, 29 e 35.
  10. 11. Anticorpo de acordo com a reivindicação 10, em que o referido anticorpo compreende a região variável da cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°: 7 .
  11. 12. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1-7, em que o referido anticorpo compreende a região variável da cadeia pesada possuindo sequências de uma região 2 complementar determinante apresentadas em SEQ ID Nos: 27, 33 e 38.
  12. 13. Anticorpo de acordo com a reivindicação 12, em que o referido anticorpo compreende a região variável da cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°: 19.
  13. 14. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1-7, em que o referido anticorpo compreende a região variável da cadeia leve possuindo sequências de uma região complementar determinante apresentadas em SEQ ID Nos: 25, 30 e 35.
  14. 15. Anticorpo de acordo com a reivindicação 14, em que o referido anticorpo compreende a região variável da cadeia leve possuindo as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID N°: 9.
  15. 16. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1-7 compreendendo: (a) uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável possuindo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°: 19; e (b) uma sequência de aminoácidos da cadeia leve variável possuindo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°:9 .
  16. 17. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1-7 compreendendo: 3 (a) uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável possuindo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°: 17; e (b) uma sequência de aminoácidos da cadeia leve variável possuindo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°: 7.
  17. 18. Anticorpo de acordo com qualquer reivindicação anterior em que a cadeia pesada do anticorpo é IgG.
  18. 19. Anticorpo de acordo com a reivindicação 18 em que a cadeia pesada do anticorpo é IgGi, IgG2, IgG3, ou IgG4.
  19. 20. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17 em que a cadeia pesada do anticorpo é IgM.
  20. 21. Anticorpo de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o anticorpo não causa activação não-especifica de células T.
  21. 22. Anticorpo de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o anticorpo diminui o tamanho do tumor ou abranda o crescimento do tumor.
  22. 23. Anticorpo de acordo com qualquer reivindicação anterior em que o anticorpo ou uma sua porção que se liga ao antigénio não reage em reacção cruzada com tecido não linfóide humano. 24. Ácido nucleico isolado que codifica o dominio variável da cadeia leve ou da cadeia pesada de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23. 4 25. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 24, em que o referido ácido nucleico compreende a sequência de nucleótidos apresentada em SEQ ID N°: 6 ou 8. 26. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 24, em que o referido ácido nucleico compreende a sequência de nucleótidos apresentada em SEQ ID N°: 16 ou 18.
  23. 27. Vector compreendendo o ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 24 a 26.
  24. 28. Vector da reivindicação 27, em que o referido vector é um plasmídeo.
  25. 29. Vector da reivindicação 27, em que o referido vector é um vector virai.
  26. 30. Recombinante de célula hospedeira isolado transformado com um vector de acordo com a reivindicação 27, reivindicação 28 ou reivindicação 29.
  27. 31. Célula ou linha celular isolada que é capaz de produzir um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23.
  28. 32. Célula ou linha celular isolada de acordo com a reivindicação 31, em que a referida célula ou linha celular é transformada com um vector das reivindicações 27, 28 ou 29. 5
  29. 33. Composição farmacêutica compreendendo: (a) um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23 numa quantidade eficaz para induzir, aumentar ou prolongar a resposta imunitária ao antigénio; e (b) um veiculo farmaceuticamente aceitável.
  30. 34. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 33, em que o antigénio é: (a) um antigénio de tumor, ou (b) um antigénio de um patogénico.
  31. 35. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 33, em que o antigénio é um antigénio de um patogénico seleccionado do grupo consistindo de um virus, uma bactéria, um fungo ou um parasita.
  32. 36. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 33-35 compreendendo ainda um agente quimioterapêutico ou antigénio.
  33. 37. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 33-35, em que o antigénio e/ou adicionalmente o antigénio é derivado de um virus seleccionado do grupo consistindo em: HIV, hepatite A, hepatite B, hepatite C, virus do herpes, adenovirus, virus influenza, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virus coxsackie, cornovirus, vírus respiratório sincicial, virus da papeira, rotavirus, vírus do sarampo, vírus da rubéola, parvovírus, vírus vacínia, vírus HTLV, vírus dengue, papilomavírus, vírus dos moluscos, 6 poliovírus, vírus da raiva, vírus JC e vírus da encefalite arboviral.
  34. 38. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 33-35, em que o antiqénio e/ou adicionalmente o antigénio é derivado de uma bactéria seleccionada do grupo consistindo em: clamídia, bactéria rickettsia, micobacteria, estafilococos, estreptococos, pneumonococos, meningococos e conococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonella, bacilli, cólera, tétano, botulismo, antrax, peste, leptospirose e bactéria da doença de Lyme.
  35. 39. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 33-35, em que o antigénio e/ou adicionalmente o antigénio é derivado de um fungo seleccionado do grupo consistindo em: Candida, Criptococcus neoformans, Aspergillus, Género Mucorales, Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum.
  36. 40. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 33-35, em que o antigénio e/ou adicionalmente o antigénio é derivado de um parasita seleccionado do grupo consistindo em: Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleria fowleri, Acantamoeba, Giardia lamblia, Cryptosporidium, Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondi e Nippostrongylus brasiliensis. 7
  37. 41. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 33-35, em que o antiqénio e/ou adicionalmente o antigénio é um antigénio de tumor.
  38. 42. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 41, em que o referido antigénio de tumor é de um tumor seleccionado do grupo consistindo em: um tumor de cancro da próstata, um melanoma, e um tumor epitelial.
  39. 43. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 41, em que o antigénio é gplOO, MAGE, Trp-2, telomerase ou proteina de choque térmico (HSP).
  40. 44. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 41, em que o antigénio é o péptido αβ de amilóide num doente que sofre da doença de Alzheimer.
  41. 45. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 41, que compreende ainda uma preparação de células completas.
  42. 46. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 41, em que as células da preparação de células completas é uma preparação de células completas de tumor.
  43. 47. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 45 ou 46, em que as células da preparação de células completas expressa GM-CSF, GCSF, IL-2, IL-1 ou IL-6.
  44. 48. Utilização do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23 para a preparação de um medicamento para induzir, aumentar ou prolongar, num indivíduo, uma resposta imunitária a um antigénio. 8
  45. 49. Utilização de acordo com a reivindicação 48, em que o antigénio é: (a) um antigénio de tumor, ou (b) um antigénio de um patogénico.
  46. 50. Utilização de acordo com a reivindicação 49, em que o antigénio é um antigénio de um patogénico, sendo o referido patogénico um virus, uma bactéria, um fungo ou um parasita.
  47. 51. Utilização de acordo com a reivindicação 50, em que o patogénico é HIV.
  48. 52. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 48-51, em que o antigénio do medicamento é utilizado no referido medicamento com o anticorpo.
  49. 53. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 48-51, em que é utilizado um agente terapêutico no referido medicamento com o anticorpo.
  50. 54. Utilização de acordo com a reivindicação 49, em que o antigénio tumoral é um antigénio de tumor da próstata, um antigénio de melanoma, ou um antigénio de cancro epitelial.
  51. 55. Método para preparar uma composição farmacêutica, que compreende misturar um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23 com um veiculo farmaceuticamente aceitável sob condições estéreis. 9
  52. 56. Método de acordo com a reivindicação 55, em que o veiculo é um solvente ou meio de dispersão.
  53. 57. Método de acordo com a reivindicação 56, em que a composição é uma solução.
  54. 58. Método da reivindicação 55, compreendendo ainda incorporar um agente tensioactivo na composição.
  55. 59. Método da reivindicação 55, compreendendo ainda esterilizar a composição.
  56. 60. Método da reivindicação 59, em que a composição é esterilizada por microfiltração.
  57. 61. Método da reivindicação 55, compreendendo ainda a incorporação de agentes antibacterianos e/ou antifúngicos na composição.
  58. 62. Método da reivindicação 61, em que agentes antibacterianos e/ou antifúngicos são seleccionados a partir do grupo consistindo de parabeno, clorobutanol, e fenol ácido sórbico.
  59. 63. Método da reivindicação 55, em que o veículo é seleccionado a partir do grupo consistindo em água, etanol, poliol, e suas misturas adequadas.
  60. 64. Método da reivindicação 63, em que o poliol é seleccionado a partir do grupo consistindo em glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol líquido, e suas misturas adequadas. 10
  61. 65. Método da reivindicação 57, em que a solução é substancialmente isotónica.
  62. 66. Método da reivindicação 56, compreendendo ainda a incorporação de um agente isotónico.
  63. 67. Método da reivindicação 66, em que o agente isotónico é seleccionado a partir do grupo consistindo num açúcar, um poliálcool, e cloreto de sódio.
  64. 68. Método da reivindicação 67, em que o poliálcool é manitol ou sorbitol.
  65. 69. Método da reivindicação 55, compreendendo ainda a formulação da composição numa forma de dosagem farmaceuticamente aceitável.
  66. 70. Método da reivindicação 69, em que a forma de dosagem é uma forma de dosagem unitária.
  67. 71. Método da reivindicação 55, em que o anticorpo anti-CTLA-4 está presente numa forma de dosagem de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg.
  68. 72. Método da reivindicação 71, em que a dosagem é 0,01 mg/kg a 5 mg/kg.
  69. 73. Método da reivindicação 71, em que a dosagem é 1 mg/kg a 10 mg/kg.
  70. 74. Método da reivindicação 55, em que a composição é uma solução injectável. 11
  71. 75. Método da reivindicação 55, em que a composição é uma solução para administração intravenosa.
  72. 76. Método da reivindicação 56, compreendendo ainda a secagem da composição para produzir um pó.
  73. 77. Método da reivindicação 76, compreendendo secagem a vácuo ou liofilização da solução.
  74. 78. Método da reivindicação 76, compreendendo ainda a incorporação de um agente que atrasa a absorção.
  75. 79. Método da reivindicação 78, em que o agente é um sal monoestearato ou gelatina.
  76. 80. Método da reivindicação 79, em que o sal monoestearato é monoestearato de alumínio.
  77. 81. Método da reivindicação 55, compreendendo produzir o anticorpo anti-CTLA-4 por cultura de uma célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 30, 31 ou 32.
  78. 82. Método da reivindicação 81, em que as células hospedeiras são células hospedeiras de mamífero. Lisboa, 11 de Abril de 2007 12
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