CN109562153A - mRNA介导的免疫方法 - Google Patents

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Abstract

本披露涉及免疫方法以及产生抗体的方法，这些方法使用包含阳离子脂质和编码免疫原(例如，靶蛋白或其片段)的多核苷酸分子的组合物，该多核苷酸分子例如是多核糖核苷酸分子，例如mRNA。

Description

mRNA介导的免疫方法
本申请要求于2016年8月7日提交的美国临时申请号62/371,834以及于2016年9月26日提交的美国临时申请号62/399,544的权益，这些申请中的每个通过引用以其全文结合在此。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表并且该序列表通过引用以其全文并入本文。所述ASCII副本创建于2017年8月3日，名称为PAT057169-WO-PCT_SL.txt并且大小为146,992字节。
技术领域
本披露属于免疫学领域。特别地，本披露涉及使用包含阳离子脂质和多核苷酸分子的组合物的免疫方法，该多核苷酸例如是编码免疫原(例如，靶蛋白或其片段)的多核糖核苷酸分子(例如，mRNA)。本披露还涉及从免疫动物(例如，非人动物)产生抗体(例如，单克隆抗体)以制备治疗性抗体的方法，并且涉及抗体本身。
背景技术
体内治疗性单克隆抗体的开发通常受限于产生可用于免疫的高质量抗原的能力。理想地，抗原应该是高度纯化的蛋白质，具有完整的结构构象并具有足够的来自动物宿主菌株的序列变异，以打破免疫耐受性并诱导强烈的体液反应。然而，对于许多旨在用作抗原的靶蛋白，由于诸如以下的问题，不可能满足这些要求：抑制过表达/纯化的蛋白质的固有差的生物物理特性以及，宿主产生细胞中的细胞毒性以及靶蛋白氨基酸序列的免疫原性差等问题。
传统的动物免疫方法采用了两种用于生成抗体的一般策略。第一种策略涉及在佐剂的存在下重复注射处于纯化形式的全长蛋白质抗原以增强免疫应答。对于小到中等大小的可溶性蛋白质，该程序可以是用于产生针对处于其天然构象的抗原的单克隆抗体的成功方法。对于非常大的蛋白质、跨膜蛋白、具有常见的翻译后修饰的蛋白质或具有较差溶解性的蛋白质，此方法的实用性非常有限，因为难以获得免疫所需量的纯的天然的全长蛋白质。第二种策略需要用编码目的抗原的DNA构建体免疫动物。该策略允许难以其原位天然状态纯化的蛋白质的表达。然而，它受到相对低的抗体滴度产生的影响，这最终可能与低产量的单克隆杂交瘤产生相关(Howard等人.Making and using antibodies:A PracticalHandbook[制作和使用抗体：实用手册],第2版CRC出版社(CRC Press),2013)。
发明内容
本披露涉及用于在动物(例如，非人动物)中诱发免疫应答的方法，该方法包括以下步骤：(a)将至少一种阳离子脂质与编码抗原决定簇的多核苷酸，如多核糖核苷酸(例如，mRNA)混合，从而形成阳离子脂质-多核苷酸复合物；和(b)向该动物给予该脂质-多核苷酸复合物。本披露进一步涉及基因免疫方法，其中多核苷酸是编码免疫原(例如，靶蛋白或其片段)的多核糖核苷酸分子(如mRNA分子)。本披露进一步涉及用于产生抗体(例如，多克隆或单克隆抗体)的方法，该方法包括使用本文所述的基因免疫方法，并且进一步包括从免疫的动物中分离抗体的步骤。
本披露还涉及用于产生单克隆抗体的方法，该方法包括以下步骤：(a)将至少一种阳离子脂质与多核苷酸混合，从而形成脂质-多核苷酸复合物，其中该多核苷酸包含编码免疫原的mRNA序列；(b)向至少一个小鼠给予该脂质-多核苷酸复合物；(c)从免疫的小鼠中去除产生抗体的细胞，如淋巴细胞(例如，B-淋巴细胞)或脾细胞；(d)将来自免疫的小鼠的B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，从而产生杂交瘤；(e)克隆该杂交瘤；(f)选择产生抗免疫原抗体的阳性克隆；(g)培养这些产生抗免疫原抗体的克隆；和(h)从这些培养物中分离抗免疫原抗体。在某些方面，本文提供的用于产生抗体的这些方法包括另外的步骤以确定此类抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列以及相应的编码核酸序列。在特定的方面，本文提供的用于产生抗体的这些方法包含另外的步骤以产生抗免疫原抗体的嵌合抗体或人源化抗体。
本披露还涉及一种方法，其中从用含有阳离子脂质纳米颗粒(LNP)的mRNA免疫的动物中收集免疫组织，并选择性地分离B细胞。直接筛选B细胞以产生具有所希望特性的抗体，并且直接克隆抗体并重组表达，绕过产生杂交瘤的需要。
本披露的包封mRNA的LNP还可以用于从免疫的宿主动物(例如，啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)、兔、鸡、牛、骆驼科动物、猪、绵羊、山羊、鲨鱼和非人灵长类动物等)的免疫组织中产生重组抗体文库的目的。然后可以在异源宿主系统中筛选该文库，例如噬菌体或酵母展示，以获得所希望的性质。
本披露的基于多核苷酸(例如，基于mRNA)的免疫的方法已经解决了与抗原产生和/或抗体生成中固有的上述困难相关的许多问题。其中，所述方法省去了对直接表达和纯化靶蛋白抗原的需要。动物宿主自身的细胞机器用于制造靶蛋白质并将其呈递给免疫系统。对于真核靶蛋白，这具有允许添加真核特异性翻译后修饰和蛋白质加工的附加优点。特别地，用于免疫的未经纯化的mRNA具有高度炎性特征，部分原因在于制备中存在双链RNA实体。双链RNA可以呈现病原体相关的分子模式，该RNA被包含先天免疫系统的受体识别，最显著的是toll样受体。不受任何具体理论的束缚，据信这充当佐剂以加强针对靶蛋白的体液反应并导致高滴度抗体产生。
可以加速免疫原(例如，靶蛋白或其片段)的单克隆抗体开发，特别是通过用编码所述靶蛋白或其片段的mRNA免疫动物。此方法为蛋白质提供了相当大的优势，对于这些蛋白质来说，开发特异性抗体例如跨膜蛋白(例如，多通道跨膜蛋白)，如G蛋白偶联受体(GPCR)在历史上一直具有技术挑战性，因为不存在异源产生和纯化靶蛋白质的需要。不受任何特定理论的束缚，据信由mRNA的佐剂样特性引发的宿主防御机制导致血清滴度的快速发展并使其成为优于DNA免疫或其他常规免疫方法(例如，重组蛋白免疫)的优良选择。
在以下方面中描述了本披露的非限制性实施例：
方面1.一种用于产生针对靶蛋白的抗体(例如，单克隆抗体)的方法，该方法包括以下步骤：(a)将至少一种阳离子脂质与编码该靶蛋白或其片段的多核糖核苷酸(如信使RNA(mRNA))混合，从而形成阳离子脂质-多核糖核苷酸复合物(例如，mRNA-LNP复合物)；(b)向非人动物给予该脂质-多核糖核苷酸复合物；和(c)从该动物获得与该靶蛋白特异性结合的抗体。
方面2.一种用于产生针对靶蛋白的抗体(例如，单克隆抗体)的方法，该方法包括以下步骤：(a)向非人动物给予脂质-多核糖核苷酸复合物(例如，mRNA-LNP复合物)，其中该复合物包含至少一种阳离子脂质和编码该靶蛋白或其片段的多核糖核苷酸(如mRNA)，从而引起对该靶蛋白的免疫应答；和(b)获得由该动物产生的与该靶蛋白特异性结合的抗体。
方面3.如方面1或2所述的方法，其中该靶蛋白是跨膜蛋白。
方面4.如方面3所述的方法，其中该跨膜蛋白选自以下：
(i)G蛋白偶联受体(GPCR)；
(ii)单通道跨膜蛋白受体；
(iii)肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)成员；
(iv)白细胞介素(IL)受体；
(v)离子通道；
(vi)溶质载体；
(vii)免疫受体；以及
(viii)多通道跨膜蛋白。
方面5.如方面3或4中所述的方法，其中该跨膜蛋白是多通道跨膜蛋白，如G蛋白偶联受体(GPCR)。
方面6.如方面5所述的方法，其中该GPCR是RXFP1、TSHR、APJ、GPR40、GPR64、GPR4或GPR15。
方面7.如方面3或4所述的方法，其中该跨膜蛋白是单通路跨膜蛋白受体(如GP130)或多通道跨膜蛋白(如SLC52A2)。
方面8.如方面3或4所述的方法，其中该跨膜蛋白是白细胞介素(IL)受体，如IL-1受体、IL-2受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-5受体、IL-6受体、IL-7受体、IL-8受体、IL-9受体、IL-10受体、IL-11受体、IL-12受体、IL-13受体、IL-14受体、IL-15受体、IL-16受体、IL-17受体、IL-18受体、IL-19受体、IL-20受体、IL-21受体、IL-22受体、IL-23受体、IL-24受体、IL-25受体、IL-26受体、IL-27受体、IL-28受体、IL-29受体、IL-30受体、IL-31受体、IL-32受体、IL-33受体、IL-35受体、或IL-36受体。
方面9.如方面3或4所述的方法，其中该跨膜蛋白是选自下组的肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)成员，该组由以下组成：TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF3、TNFRSF4、TNFRSF5、TNFRSF6、TNFRSF6B、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF10C、TNFRSF10D、TNFRSF11A、TNFRSF11B、TNFRSF12A、TNFRSF13B、TNFRSF13C、TNFRSF14、TNFRSF16、TNFRSF17、TNFRSF18、TNFRSF19、TNFRSF21、TNFRSF25、和TNFRSF27。
方面10.如方面3或4所述的方法，其中该跨膜蛋白是离子通道，如TMEM16A。
方面11.如方面3或4所述的方法，其中该跨膜蛋白是溶质载体。
方面12.如方面1或2所述的方法，其中该靶蛋白选自以下：
ACKR1、ACKR2、ACKR3、ACKR4、ADCYAP1R1、ADGRA1、ADGRA2、ADGRA3、ADGRB1、ADGRB2、ADGRB3、ADGRD1、ADGRD2、ADGRE1、ADGRE2、ADGRE3、ADGRE4P、ADGRE5、ADGRF1、ADGRF2、ADGRF3、ADGRF4、ADGRF5、ADGRG1、ADGRG2、ADGRG3、ADGRG4、ADGRG5、ADGRG6、ADGRG7、ADGRL1、ADGRL2、ADGRL3、ADGRL4、ADGRV1、ADORA1、ADORA2A、ADORA2B、ADORA3、ADRA1A、ADRA1B、ADRA1D、ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、ADRB1、ADRB2、ADRB3、AGTR1、AGTR2、APLNR/APJ、ASGR1、ASGR2、AVPR1A、AVPR1B、AVPR2、BDKRB1、BDKRB2、BRS3、BRS3、C3AR1、C5AR1、C5AR2、CALCR、CALCRL、CASR、CCKAR、CCKBR、CCR1、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCRL2、CELSR1、CELSR2、CELSR3、CHRM1、CHRM2、CHRM3、CHRM4、CHRM5、CMKLR1、CNR1、CNR2、CRHR1、CRHR2、CX3CR1、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CYSLTR1、CYSLTR2、DRD1、DRD2、DRD3、DRD4、DRD5、EDNRA、EDNRB、F2R、F2RL1、F2RL2、F2RL3、FFAR1、FFAR2、FFAR3、FFAR4、FPR1、FPR2、FPR2、FPR3、FSHR、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、GABBR1、GABBR2、GALR1、GALR2、GALR3、GCGR、GHRHR、GHSR、GIPR、GLP1R、GLP2R、GNRHR、GNRHR2、GPBAR1、GPER1、GPR1、GPR4、GPR12、GPR15、GPR17、GPR18、GPR19、GPR20、GPR21、GPR22、GPR25、GPR26、GPR27、GPR3、GPR31、GPR32、GPR33、GPR34、GPR35、GPR37、GPR37L1、GPR39、GPR40、GPR42、GPR42、GPR45、GPR50、GPR52、GPR55、GPR6、GPR61、GPR62、GPR63、GPR65、GPR68、GPR75、GPR78、GPR79、GPR82、GPR83、GPR84、GPR85、GPR87、GPR88、GPR101、GPR107、GPR132、GPR135、GPR137、GPR139、GPR141、GPR142、GPR143、GPR146、GPR148、GPR149、GPR15、GPR150、GPR151、GPR152、GPR153、GPR156、GPR157、GPR158、GPR160、GPR161、GPR162、GPR171、GPR173、GPR174、GPR176、GPR179、GPR182、GPR183、GPRC5A、GPRC5B、GPRC5C、GPRC5D、GPRC6A、GRM1、GRM2、GRM3、GRM4、GRM5、GRM6、GRM7、GRM8、GRPR、HCAR1、HCAR2、HCAR3、HCRTR1、HCRTR2、HRH1、HRH2、HRH3、HRH4、HTR1A、HTR1B、HTR1D、HTR1E、HTR1F、HTR2A、HTR2B、HTR2C、HTR4、HTR5A、HTR5BP、HTR6、HTR7、KISS1R、LGR3、LGR4、LGR5、LGR6、LHCGR、LPAR1、LPAR2、LPAR3、LPAR4、LPAR5、LPAR6、LTB4R、LTB4R2、MAS1、MAS1L、MC1R、MC2R、MC3R、MC4R、MC5R、MCHR1、MCHR2、MLNR、MRGPRD、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRG、MRGPRX1、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、MTNR1A、MTNR1B、NMBR、NMUR1、NMUR2、NPBWR1、NPBWR2、NPFFR1、NPFFR2、NPSR1、NPY1R、NPY2R、NPY4R、NPY5R、NPY6R、NTSR1、NTSR2、OPN3、OPN4、OPN5、OPRD1、OPRK1、OPRL1、OPRM1、OR51E1、OXER1、OXGR1、OXTR、P2RY1、P2RY10、P2RY11、P2RY12、P2RY13、P2RY14、P2RY2、P2RY4、P2RY6、P2RY8、PRLHR、PROKR1、PROKR2、PTAFR、PTGDR、PTGDR2、PTGER1、PTGER2、PTGER3、PTGER4、PTGFR、PTGIR、PTH1R、PTH2R、QRFPR、RXFP1、RXFP2、RXFP3、RXFP4、S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4、S1PR5、SCTR、SMO、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、SUCNR1、TAAR1、TAAR2、TAAR3、TAAR4P、TAAR5、TAAR6、TAAR8、TAAR9、TACR1、TACR2、TACR3、TAS1R1、TAS1R2、TAS1R3、TAS2R1、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R19、TAS2R20、TAS2R3、TAS2R30、TAS2R31、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R4、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R42、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R5、TAS2R50、TAS2R60、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TBXA2R、TPRA1、TRHR、TSHR、UTS2R、VIPR1、VIPR2、XCR1、TCR-α、TCR-β、CD3、δ-链辅助因子(δ-chain accessory)、CD4、CD8、SIGIRR(含单个Ig和TIR结构域)、甘露糖受体(MR)、脱唾液酸糖蛋白受体家族(例如，脱唾液酸糖蛋白受体巨噬细胞半乳糖型凝集素(MGL))、DC-SIGN(CLEC4L)、朗格汉斯蛋白(langerin)(CLEC4K)、髓样DAP12-关联性凝集素(MDL)-1(CLEC5A)、树突状细胞植物血凝素1(dectin 1)/CLEC7A、DNGR1/CLEC9A、髓样C型凝集素样受体(MICL)(CLEC12A)、CLEC2(还被称为CLEC1B)、CLEC12B、DCIR/CLEC4A、树突状细胞植物血凝素2(Dectin 2)/CLEC6A、血DC抗原2(BDCA2)(CLEC4C)、巨噬细胞诱导的C型凝集素(CLEC4E)、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12、TLR13、FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB1(CD32)、FcγRIIB2(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)、FcεRI、FcεRII(CD23)、FcαR1(CD89)、Fcα/μR、FcRn、CD27、CD40、OX40、GITR、CD137、PD-1、CTLA-4、PD-L1、TIGIT、T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(TIM3)、T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、CD28、CD122、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、FAM159B、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLA-DRB1、gp130、IL-1受体、IL-2受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-5受体、IL-6受体、IL-7受体、IL-8受体、IL-9受体、IL-10受体、IL-11受体、IL-12受体、IL-13受体、IL-14受体、IL-15受体、IL-16受体、IL-17受体、IL-18受体、IL-19受体、IL-20受体、IL-21受体、IL-22受体、IL-23受体、IL-24受体、IL-25受体、IL-26受体、IL-27受体、IL-28受体、IL-29受体、IL-30受体、IL-31受体、IL-32受体、IL-33受体、IL-35受体、IL-36受体、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF3、TNFRSF4、TNFRSF5、TNFRSF6、TNFRSF6B、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF10C、TNFRSF10D、TNFRSF11A、TNFRSF11B、TNFRSF12A、TNFRSF13B、TNFRSF13C、TNFRSF14、TNFRSF16、TNFRSF17、TNFRSF18、TNFRSF19、TNFRSF21、TNFRSF25、TNFRSF27、SCN1A、SCN1B、SCN2A、SCN2B、SCN3A、SCN3B、SCN4A、SCN5A、SCN7A、SCN8A、SCN9A、SCN10A、SCN11A、CACNA1A、CACNA1B、CACNA1C、CACNA1D、CACNA1E、CACNA1F、CACNA1G、CACNA1H、CACNA1I、CACNA1S、TRPA1、TRPC1、TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6、TRPC7、TRPM1、TRPM2、TRPM3、TRPM4、TRPM5、TRPM6、TRPM7、TRPM8、MCOLN1、MCOLN2、MCOLN3、PKD1、PKD2、PKD2L1、PKD2L2、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPV5、TRPV6、CATSPER1、CATSPER2、CATSPER3、CATSPER4、TPCN1、TPCN2、CNGA1、CNGA2、CNGA3、CNGA4、CNGB1、CNGB3、HCN1、HCN2、HCN3、HCN4、KCNMA1、KCNN1、KCNN2、KCNN3、KCNN4、KCNT1、KCNT2、KCNU1、KCNA1、KCNA2、KCNA3、KCNA4、KCNA5、KCNA6、KCNA7、KCNA10、KCNB1、KCNB2、KCNC1、KCNC2、KCNC3、KCNC4、KCND1、KCND2、KCND3、KCNF1、KCNG1、KCNG2、KCNG3、KCNG4、KCNH1、KCNH2、KCNH3、KCNH4、KCNH5、KCNH6、KCNH7、KCNH8、KCNQ1、KCNQ2、KCNQ3、KCNQ4、KCNQ5、KCNS1、KCNS2、KCNS3、KCNV1、KCNV2、KCNJ1、KCNJ2、KCNJ3、KCNJ4、KCNJ5、KCNJ6、KCNJ8、KCNJ9、KCNJ10、KCNJ11、KCNJ12、KCNJ13、KCNJ14、KCNJ15、KCNJ16、KCNJ18、KCNK1、KCNK2、KCNK3、KCNK4、KCNK5、KCNK6、KCNK7、KCNK9、KCNK10、KCNK12、KCNK13、KCNK15、KCNK16、KCNK17、KCNK18、HVCN1、HTR3A、HTR3B、HTR3C、HTR3D、HTR3E、CHRNA1、CHRNA2、CHRNA3、CHRNA4、CHRNA5、CHRNA6、CHRNA7、CHRNA9、CHRNA10、CHRNB1、CHRNB2、CHRNB3、CHRNB4、CHRND、CHRNE、CHRNG、GABRA1、GABRA2、GABRA3、GABRA4、GABRA5、GABRA6、GABRB1、GABRB2、GABRB3、GABRD、GABRE、GABRG1、GABRG2、GABRG3、GABRP、GABRQ、GABRR1、GABRR2、GABRR3、GRIA1、GRIA2、GRIA3、GRIA4、GRID1、GRID2、GRIK1、GRIK2、GRIK3、GRIK4、GRIK5、GRIN1、GRIN2A、GRIN2B、GRIN2C、GRIN2D、GRIN3A、GRIN3B、GLRA1、GLRA2、GLRA3、GLRA4、P2RX1、P2RX2、P2RX3、P2RX4、P2RX5、P2RX6、P2RX7、ZACN、ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4、AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、AQP6、AQP7、AQP8、AQP9、AQP10、AQP11、AQP12A、AQP12B、MIP、CLCN1、CLCN2、CLCN3、CLCN4、CLCN5、CLCN6、CLCN7、CLCNKA、CLCNKB、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)、ANO1、ANO2、ANO3、ANO4、ANO5、ANO6、ANO7、ANO8、ANO9、ANO10、BEST1、BEST2、BEST3、BEST4、CLIC1、CLIC2、CLIC3、CLIC4、CLIC5、CLIC6、GJA1、GJA3、GJA4、GJA5、GJA6P、GJA8、GJA9、GJA10、GJB1、GJB2、GJB3、GJB4、GJB5、GJB6、GJB7、GJC1、GJC2、GJC3、GJD2、GJD3、GJD4、GJE1、ITPR1、ITPR2、ITPR3、PANX1、PANX2、PANX3、RYR1、RYR2、RYR3、NALCN、SCNN1A、SCNN1B、SCNN1D、SCNN1G、TEM16A、ADAMTS7、ANGPTL3、ANGPTL4、ANGPTL8、LPL、GDF15、半乳凝素-1、半乳凝素-2、半乳凝素-3、半乳凝素-4、半乳凝素-7、半乳凝素-8、半乳凝素-9、半乳凝素-10、半乳凝素-12、半乳凝素-13、基质gla蛋白(MGP)、PRNP、DGAT1、GPAT3、DMC1、BLM、BRCA2、K型人内源性逆转录病毒(HERV-K)家族的成员、外核苷三磷酸酯二磷酸水解酶1(ENTPD1)、外核苷三磷酸酯二磷酸水解酶2(ENTPD2)、SLC1A1、SLC1A2、SLC1A3、SLC1A4、SLC1A5、SLC1A6、SLC1A7、SLC2A1、SLC2A2、SLC2A3、SLC2A4、SLC2A5、SLC2A6、SLC2A7、SLC2A8、SLC2A9、SLC2A10、SLC2A11、SLC2A12、SLC2A13、SLC2A14、SLC3A1、SLC3A2、SLC4A1、SLC4A2、SLC4A3、SLC4A4、SLC4A5、SLC4A6、SLC4A7、SLC4A8、SLC4A9、SLC4A10、SLC4A11、SLC5A1、SLC5A2、SLC5A3、SLC5A4、SLC5A5、SLC5A6、SLC5A7、SLC5A8、SLC5A9、SLC5A10、SLC5A11、SLC5A12、SLC6A1、SLC6A2、SLC6A3、SLC6A4、SLC6A5、SLC6A6、SLC6A7、SLC6A8、SLC6A9、SLC6A10、SLC6A11、SLC6A12、SLC6A13、SLC6A14、SLC6A15、SLC6A16、SLC6A17、SLC6A18、SLC6A19、SLC6A20、SLC7A5、SLC7A6、SLC7A7、SLC7A8、SLC7A9、SLC7A10、SLC7A11、SLC7A13、SLC7A14、SLC8A1、SLC8A2、SLC8A3、SLC9A1、SLC9A2、SLC9A3、SLC9A4、SLC9A5、SLC9A6、SLC9A7、SLC9A8、SLC9A9、SLC9A10、SLC9A11、SLC9B1、SLC9B2、SLC10A1、SLC10A2、SLC10A3、SLC10A4、SLC10A5、SLC10A6、SLC10A7、SLC11A1、SLC11A2、SLC12A1、SLC12A2、SLC12A3、SLC12A4、SLC12A5、SLC12A6、SLC12A7、SLC12A8、SLC12A9、SLC13A1、SLC13A2、SLC13A3、SLC13A4、SLC13A5、SLC14A1、SLC14A2、SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3、SLC15A4、SLC16A1、SLC16A2、SLC16A3、SLC16A4、SLC16A5、SLC16A6、SLC16A7、SLC16A8、SLC16A9、SLC16A10、SLC16A11、SLC16A12、SLC16A13、SLC16A14、SLC17A1、SLC17A2、SLC17A3、SLC17A4、SLC17A5、SLC17A6、SLC17A7、SLC17A8、SLC17A9、SLC18A1、SLC18A2、SLC18A3、SLC19A1、SLC19A2、SLC19A3、SLC20A1、SLC20A2、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B3、SLCO1C1、SLCO2A1、SLCO2B1、SLCO3A1、SLCO4A1、SLCO4C1、SLCO5A1、SLCO6A1、SLC22A1、SLC22A2、SLC22A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC22A6、SLC22A7、SLC22A8、SLC22A9、SLC22A10、SLC22A11、SLC22A12、SLC22A13、SLC22A14、SLC22A15、SLC22A16、SLC22A17、SLC22A18、SLC22A18AS,SLC22A19、SLC22A20、SLC22A23、SLC22A24、SLC22A25、SLC22A31、SLC23A1、SLC23A2、SLC23A3、SLC23A4、SLC24A1、SLC24A2、SLC24A3、SLC24A4、SLC24A5、SLC24A6、SLC25A1、SLC25A2、SLC25A3、SLC25A4、SLC25A5、SLC25A6、SLC25A7、SLC25A8、SLC25A9、SLC25A10、SLC25A11、SLC25A12、SLC25A13、SLC25A14、SLC25A15、SLC25A16、SLC25A17、SLC25A18、SLC25A19、SLC25A20、SLC25A21、SLC25A22、SLC25A23、SLC25A24、SLC25A25、SLC25A26、SLC25A27、SLC25A28、SLC25A29、SLC25A30、SLC25A31、SLC25A32、SLC25A33、SLC25A34、SLC25A35、SLC25A36、SLC25A37,SLC25A38、SLC25A39、SLC25A40、SLC25A41、SLC25A42、SLC25A43、SLC25A44、SLC25A45、SLC25A46、SLC26A1、SLC26A2、SLC26A3、SLC26A4、SLC26A5、SLC26A6、SLC26A7、SLC26A8、SLC26A9、SLC26A10、SLC26A11、SLC27A1、SLC27A2、SLC27A3、SLC27A4、SLC27A5、SLC27A6、SLC28A1、SLC28A2、SLC28A3、SLC29A1、SLC29A2、SLC29A3、SLC29A4、SLC30A1、SLC30A2、SLC30A3、SLC30A4、SLC30A5、SLC30A6、SLC30A7、SLC30A8、SLC30A9、SLC30A10、SLC31A1、SLC31A2、SLC32A1、SLC33A1、SLC34A1、SLC34A2、SLC34A3、SLC35A1、SLC35A2、SLC35A3、SLC35A4、SLC35A5、SLC35B1、SLC35B2、SLC35B3、SLC35B4、SLC35C1、SLC35C2、SLC35D1、SLC35D2、SLC35D3、SLC35E1、SLC35E2、SLC35E3、SLC35E4、SLC35F1、SLC35F2、SLC35F3、SLC35F4、SLC35F5、SLC35G1、SLC35G3、SLC35G4、SLC35G5、SLC35G6、SLC36A1、SLC36A2、SLC36A3、SLC36A4、SLC37A1、SLC37A2、SLC37A3、SLC37A4、SLC38A1、SLC38A2、SLC38A3、SLC38A4、SLC38A5、SLC38A6、SLC38A7、SLC38A8、SLC38A9、SLC38A10、SLC38A11、SLC39A1、SLC39A2、SLC39A3、SLC39A4、SLC39A5、SLC39A6、SLC39A7、SLC39A8、SLC39A9、SLC39A10、SLC39A11、SLC39A12、SLC39A13、SLC39A14、SLC40A1、SLC41A1、SLC41A2、SLC41A3、RhAG、RhBG、RhCG、SLC43A1、SLC43A2、SLC43A3、SLC44A1、SLC44A2、SLC44A3、SLC44A4、SLC44A5、SLC45A1、SLC45A2、SLC45A3、SLC45A4、SLC46A1、SLC46A2、SLC46A3、SLC47A1、SLC47A2、HCP-1、MFSD5、MFSD10、SLC50A1、OSTα、OSTβ、SLC52A1、SLC52A2和SLC52A3。
方面13.如方面1或2所述的方法，其中该靶抗原难以表达或难以产生针对其的抗体。
方面14.如方面13所述的方法，其中该靶蛋白的表达导致细胞毒性或增加宿主产生细胞中的细胞毒性。
方面15.如方面13所述的方法，其中当对该靶蛋白进行重组表达和/或纯化时，该靶蛋白展示出较差的产率、稳定性、溶解性和/或功能活性。
方面16.如前述方面中任一项所述的方法，其中所述复合物的多核糖核苷酸包含以下的一种或多种：共有Kozak序列；mRNA的5’末端上的7-甲基鸟苷帽；mRNA转录物的3’末端处发现的聚腺苷(聚A)尾；以及5’-和3’-非翻译区(UTR)。
方面17.如前述方面中任一项所述的方法，其中所述给予是肠胃外给予。
方面18.如前述方面中任一项所述的方法，其中所述给予是静脉内给予。
方面19.如前述方面中任一项所述的方法，其中所述给予是肌内给予。
方面20.如前述方面中任一项所述的方法，其中所述给予是皮下给予。
方面21.如方面1-16中任一项所述的方法，其中所述给予是鼻内给予。
方面22.如前述方面中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白是RXFP1或其片段。
方面23.如前述方面中任一项所述的方法，其中所述复合物包含多核糖核苷酸，该多核糖核苷酸包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列或SEQ ID NO:2、4和37中任一者的核苷酸序列。
方面24.如前述方面中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白是SLC52A2或其片段。
方面25.如前述方面中任一项所述的方法，其中所述复合物包含多核糖核苷酸，该多核糖核苷酸包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列或SEQ ID NO:5、7和40中任一者的核苷酸序列。
方面26.如前述方面中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白是ANGPTL8或其片段。
方面27.如前述方面中任一项所述的方法，其中所述复合物包含多核糖核苷酸，该多核糖核苷酸包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列或SEQ IDNO:8、10和43中任一者的核苷酸序列。
方面28.如前述方面中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白是TSHR或其片段。
方面29.如前述方面中任一项所述的方法，其中所述复合物包含多核糖核苷酸，该多核糖核苷酸包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列或SEQ ID NO:14、16和46中任一者的核苷酸序列。
方面30.如前述方面中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白是APJ或其片段。
方面31.如前述方面中任一项所述的方法，其中所述复合物包含多核糖核苷酸，该多核糖核苷酸包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或SEQ ID NO:17、19和49中任一者的核苷酸序列。
方面32.如前述方面中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白是gp130或其片段。
方面33.如前述方面中任一项所述的方法，其中所述复合物包含多核糖核苷酸，该多核糖核苷酸包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或SEQ ID NO:20、22和52中任一者的核苷酸序列。
方面34.如前述方面中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白是半乳凝素3或其片段。
方面35.如前述方面中任一项所述的方法，其中所述复合物包含多核糖核苷酸，该多核糖核苷酸包含SEQ ID NO:55的核苷酸序列或SEQ ID NO:26、55和56中任一者的核苷酸序列。
方面36.如方面1-35中任一项所述的方法，其中所述复合物具有大约30nm-150nm的直径。
方面37.如方面1-35中任一项所述的方法，其中该复合物包含辅助脂质。
方面38.如方面1-35中任一项所述的方法，其中该复合物包含以下项的任何组合：(i)阳离子脂质；(ii)辅助脂质(例如，胆固醇)；(iii)中性脂质(例如，DSPC)；和(iv)隐形脂质(例如，S010、S024、S027、S031、或S033)。
方面39.如方面1-38中任一项所述的方法，其中该动物被给予5μg、10μg、12.5μg、20μg、25μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg或150μg多核糖核苷酸。
方面40.如方面1-39中任一项所述的方法，其中该阳离子脂质选自下组，该组由以下组成：N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)、N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1,2-二油酰基氨甲酰基-3-二甲基铵-丙烷(DOCDAP)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DLINDAP)、二月桂基(C12:0)三甲基铵丙烷(DLTAP)、二-十八烷基氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、DC-Chol、二油酰基氧基-N-[2-精胺甲酰胺基)乙基}-N,N-二甲基-1-丙烷三氟乙酸铵(DOSPA)、1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺,顺-9,12-十八碳二烯酰氧基)丙烷(CLinDMA)、N,N-二甲基-2,3-二油烯基氧基)丙胺(DODMA)、2-[5’-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)-3’-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺,顺-9’,12’-十八碳二烯酰氧基)丙烷(CpLinDMA)和N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄基胺(DMOBA)，以及1,2-N,N’-二油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)。
方面41.如方面40所述的方法，其中该阳离子脂质是DOTAP或DLTAP。
方面42.如方面1-41中任一项所述的方法，该方法进一步包括以下步骤：生成产生特异性结合靶抗原的抗体的杂交瘤。
方面43.如方面1-42中任一项所述的方法，该方法进一步包括以下步骤：纯化与靶蛋白特异性结合的抗体。
方面44.如方面1-43中任一项所述的方法，该方法进一步包括以下步骤：产生衍生自特异性结合靶蛋白的经纯化的抗体的嵌合抗体或人源化抗体。
方面45.如方面1-44中任一项所述的方法，其中所述方法相对于包括用cDNA、蛋白质或肽、病毒颗粒或全细胞免疫的方法在第一次取血或第二次取血的血清中产生更高的抗体滴度。
方面46.如方面1-44中任一项所述的方法，其中所述方法与包括用cDNA、蛋白质或肽、病毒颗粒或全细胞免疫的方法相比产生更多数量的产生靶蛋白-特异性抗体的杂交瘤。
方面47.如方面1-46中任一项所述的方法，其中该靶蛋白是人靶蛋白，并且该非人动物是小鼠、大鼠、兔、绵羊、猫、狗、骆驼科动物、鲨鱼、猴、猪或马。
方面48.一种产生与靶蛋白特异性结合的抗体的杂交瘤，其中该杂交瘤能通过如方面1-47中任一项所述的方法获得。
方面49.一种多克隆抗体的混合物，该多克隆抗体与靶蛋白特异性结合，其中该混合物能根据如方面1-47中任一项所述的方法获得。
方面50.一种分离的单克隆抗体，该单克隆抗体与靶蛋白特异性结合，其中该单克隆抗体能通过如方面1-47中任一项所述的方法获得。
方面51.一种用于在非人动物中诱发对靶蛋白的免疫应答的方法，该方法包括以下步骤：向该动物给予脂质-多核苷酸复合物，其中该脂质-多核苷酸复合物包含阳离子脂质和编码靶蛋白的mRNA，其中该靶蛋白来自不同于该动物的物种。
方面52.如方面51所述的方法，其中所述复合物包含以下的一种或多种：共有Kozak序列；mRNA的5’末端上的7-甲基鸟苷帽；mRNA转录物的3’末端处发现的聚腺苷(聚A)尾；以及5’-和3’-非翻译区(UTR)。
方面53.如方面51所述的方法，其中所述给予是肠胃外给予。
方面54.如方面51所述的方法，其中所述给予是静脉内给予。
方面55.如方面51所述的方法，其中所述给予是肌内给予。
方面56.如方面51所述的方法，其中所述给予是皮下给予。
方面57.如方面51所述的方法，其中所述给予是鼻内给予。
方面58.如方面51-57中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白是RXFP1。
方面59.如方面51-57中任一项所述的方法，其中所述复合物包含多核糖核苷酸，该多核糖核苷酸包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列或SEQ ID NO:2、4和37中任一者的核苷酸序列。
方面60.如方面51-57中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白是SLC52A2。
方面61.如方面51-57中任一项所述的方法，其中所述复合物包含多核糖核苷酸，该多核糖核苷酸包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列或SEQ ID NO:5、7和40中任一者的核苷酸序列。
方面62.如方面51-57中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白是ANGPTL8。
方面63.如方面51-57中任一项所述的方法，其中所述复合物包含多核糖核苷酸，该多核糖核苷酸包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列或SEQ ID NO:8、10和43中任一者的核苷酸序列。
方面64.如方面51-57中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白是TSHR。
方面65.如方面51-57中任一项所述的方法，其中所述复合物包含多核糖核苷酸，该多核糖核苷酸包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列或SEQ ID NO:14、16和46中任一者的核苷酸序列。
方面66.如方面51-57中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白是APJ。
方面67.如方面51-57中任一项所述的方法，其中所述复合物包含多核糖核苷酸，该多核糖核苷酸包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或SEQ ID NO:17、19和49中任一者的核苷酸序列。
方面68.如方面51-57中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白是GP130。
方面69.如方面51-57中任一项所述的方法，其中所述复合物包含多核糖核苷酸，该多核糖核苷酸包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或SEQ ID NO:20、22和52中任一者的核苷酸序列。
方面70.如方面51所述的方法，其中所述靶蛋白是半乳凝素3。
方面71.如方面51所述的方法，其中所述复合物包含SEQ ID NO:55，或SEQ ID NO:26、55和56中任一者。
方面72.如方面51-71中任一项所述的方法，该方法进一步包括从动物获得抗体或产生抗体的细胞的步骤，所述抗体特异性结合靶蛋白。
方面73.如方面51-72中任一项所述的方法，其中该靶蛋白是人靶蛋白，并且该非人动物是小鼠、大鼠、兔、绵羊、猫、狗、骆驼科动物、鲨鱼、猴、猪或马。
方面74.如方面51-73中任一项所述的方法，其中该复合物包含以下项的任何组合：(i)阳离子脂质；(ii)辅助脂质(例如，胆固醇)；(iii)中性脂质(例如，DSPC)；和(iv)隐形脂质(例如，S010、S024、S027、S031、或S033)。
方面75.如方面51-74中任一项所述的方法，其中该动物被给予5μg、10μg、12.5μg、20μg、25μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg或150μg多核糖核苷酸(例如，mRNA)。
方面76.如方面51-75中任一项所述的方法，其中该阳离子脂质选自下组，该组由以下组成：N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)、N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1,2-二油酰基氨甲酰基-3-二甲基铵-丙烷(DOCDAP)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DLINDAP)、二月桂基(C12:0)三甲基铵丙烷(DLTAP)、二-十八烷基氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、DC-Chol、二油酰基氧基-N-[2-精胺甲酰胺基)乙基}-N,N-二甲基-1-丙烷三氟乙酸铵(DOSPA)、1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺,顺-9,12-十八碳二烯酰氧基)丙烷(CLinDMA)、N,N-二甲基-2,3-二油烯基氧基)丙胺(DODMA)、2-[5’-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)-3’-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺,顺-9’,12’-十八碳二烯酰氧基)丙烷(CpLinDMA)和N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄基胺(DMOBA)，以及1,2-N,N’-二油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)。
方面77.如方面76所述的方法，其中该阳离子脂质是DOTAP或DLTAP。
方面78.如方面51-77中任一项所述的方法，其中该靶蛋白选自以下：
ACKR1、ACKR2、ACKR3、ACKR4、ADCYAP1R1、ADGRA1、ADGRA2、ADGRA3、ADGRB1、ADGRB2、ADGRB3、ADGRD1、ADGRD2、ADGRE1、ADGRE2、ADGRE3、ADGRE4P、ADGRE5、ADGRF1、ADGRF2、ADGRF3、ADGRF4、ADGRF5、ADGRG1、ADGRG2、ADGRG3、ADGRG4、ADGRG5、ADGRG6、ADGRG7、ADGRL1、ADGRL2、ADGRL3、ADGRL4、ADGRV1、ADORA1、ADORA2A、ADORA2B、ADORA3、ADRA1A、ADRA1B、ADRA1D、ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、ADRB1、ADRB2、ADRB3、AGTR1、AGTR2、APLNR/APJ、ASGR1、ASGR2、AVPR1A、AVPR1B、AVPR2、BDKRB1、BDKRB2、BRS3、BRS3、C3AR1、C5AR1、C5AR2、CALCR、CALCRL、CASR、CCKAR、CCKBR、CCR1、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCRL2、CELSR1、CELSR2、CELSR3、CHRM1、CHRM2、CHRM3、CHRM4、CHRM5、CMKLR1、CNR1、CNR2、CRHR1、CRHR2、CX3CR1、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CYSLTR1、CYSLTR2、DRD1、DRD2、DRD3、DRD4、DRD5、EDNRA、EDNRB、F2R、F2RL1、F2RL2、F2RL3、FFAR1、FFAR2、FFAR3、FFAR4、FPR1、FPR2、FPR2、FPR3、FSHR、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、GABBR1、GABBR2、GALR1、GALR2、GALR3、GCGR、GHRHR、GHSR、GIPR、GLP1R、GLP2R、GNRHR、GNRHR2、GPBAR1、GPER1、GPR1、GPR4、GPR12、GPR15、GPR17、GPR18、GPR19、GPR20、GPR21、GPR22、GPR25、GPR26、GPR27、GPR3、GPR31、GPR32、GPR33、GPR34、GPR35、GPR37、GPR37L1、GPR39、GPR40、GPR42、GPR42、GPR45、GPR50、GPR52、GPR55、GPR6、GPR61、GPR62、GPR63、GPR65、GPR68、GPR75、GPR78、GPR79、GPR82、GPR83、GPR84、GPR85、GPR87、GPR88、GPR101、GPR107、GPR132、GPR135、GPR137、GPR139、GPR141、GPR142、GPR143、GPR146、GPR148、GPR149、GPR15、GPR150、GPR151、GPR152、GPR153、GPR156、GPR157、GPR158、GPR160、GPR161、GPR162、GPR171、GPR173、GPR174、GPR176、GPR179、GPR182、GPR183、GPRC5A、GPRC5B、GPRC5C、GPRC5D、GPRC6A、GRM1、GRM2、GRM3、GRM4、GRM5、GRM6、GRM7、GRM8、GRPR、HCAR1、HCAR2、HCAR3、HCRTR1、HCRTR2、HRH1、HRH2、HRH3、HRH4、HTR1A、HTR1B、HTR1D、HTR1E、HTR1F、HTR2A、HTR2B、HTR2C、HTR4、HTR5A、HTR5BP、HTR6、HTR7、KISS1R、LGR3、LGR4、LGR5、LGR6、LHCGR、LPAR1、LPAR2、LPAR3、LPAR4、LPAR5、LPAR6、LTB4R、LTB4R2、MAS1、MAS1L、MC1R、MC2R、MC3R、MC4R、MC5R、MCHR1、MCHR2、MLNR、MRGPRD、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRG、MRGPRX1、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、MTNR1A、MTNR1B、NMBR、NMUR1、NMUR2、NPBWR1、NPBWR2、NPFFR1、NPFFR2、NPSR1、NPY1R、NPY2R、NPY4R、NPY5R、NPY6R、NTSR1、NTSR2、OPN3、OPN4、OPN5、OPRD1、OPRK1、OPRL1、OPRM1、OR51E1、OXER1、OXGR1、OXTR、P2RY1、P2RY10、P2RY11、P2RY12、P2RY13、P2RY14、P2RY2、P2RY4、P2RY6、P2RY8、PRLHR、PROKR1、PROKR2、PTAFR、PTGDR、PTGDR2、PTGER1、PTGER2、PTGER3、PTGER4、PTGFR、PTGIR、PTH1R、PTH2R、QRFPR、RXFP1、RXFP2、RXFP3、RXFP4、S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4、S1PR5、SCTR、SMO、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、SUCNR1、TAAR1、TAAR2、TAAR3、TAAR4P、TAAR5、TAAR6、TAAR8、TAAR9、TACR1、TACR2、TACR3、TAS1R1、TAS1R2、TAS1R3、TAS2R1、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R19、TAS2R20、TAS2R3、TAS2R30、TAS2R31、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R4、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R42、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R5、TAS2R50、TAS2R60、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TBXA2R、TPRA1、TRHR、TSHR、UTS2R、VIPR1、VIPR2、XCR1、TCR-α、TCR-β、CD3、δ-链辅助因子、CD4、CD8、SIGIRR(含单个Ig和TIR结构域)、甘露糖受体(MR)、脱唾液酸糖蛋白受体家族(例如，脱唾液酸糖蛋白受体巨噬细胞半乳糖型凝集素(MGL))、DC-SIGN(CLEC4L)、朗格汉斯蛋白(CLEC4K)、髓样DAP12-关联性凝集素(MDL)-1(CLEC5A)、树突状细胞植物血凝素1/CLEC7A、DNGR1/CLEC9A、髓样C型凝集素样受体(MICL)(CLEC12A)、CLEC2(还被称为CLEC1B)、CLEC12B、DCIR/CLEC4A、树突状细胞植物血凝素2/CLEC6A、血DC抗原2(BDCA2)(CLEC4C)、巨噬细胞诱导的C型凝集素(CLEC4E)、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12、TLR13、FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB1(CD32)、FcγRIIB2(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)、FcεRI、FcεRII(CD23)、FcαR1(CD89)、Fcα/μR、FcRn、CD27、CD40、OX40、GITR、CD137、PD-1、CTLA-4、PD-L1、TIGIT、T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(TIM3)、T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、CD28、CD122、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、FAM159B、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLA-DRB1、gp130、IL-1受体、IL-2受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-5受体、IL-6受体、IL-7受体、IL-8受体、IL-9受体、IL-10受体、IL-11受体、IL-12受体、IL-13受体、IL-14受体、IL-15受体、IL-16受体、IL-17受体、IL-18受体、IL-19受体、IL-20受体、IL-21受体、IL-22受体、IL-23受体、IL-24受体、IL-25受体、IL-26受体、IL-27受体、IL-28受体、IL-29受体、IL-30受体、IL-31受体、IL-32受体、IL-33受体、IL-35受体、IL-36受体、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF3、TNFRSF4、TNFRSF5、TNFRSF6、TNFRSF6B、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF10C、TNFRSF10D、TNFRSF11A、TNFRSF11B、TNFRSF12A、TNFRSF13B、TNFRSF13C、TNFRSF14、TNFRSF16、TNFRSF17、TNFRSF18、TNFRSF19、TNFRSF21、TNFRSF25、TNFRSF27、SCN1A、SCN1B、SCN2A、SCN2B、SCN3A、SCN3B、SCN4A、SCN5A、SCN7A、SCN8A、SCN9A、SCN10A、SCN11A、CACNA1A、CACNA1B、CACNA1C、CACNA1D、CACNA1E、CACNA1F、CACNA1G、CACNA1H、CACNA1I、CACNA1S、TRPA1、TRPC1、TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6、TRPC7、TRPM1、TRPM2、TRPM3、TRPM4、TRPM5、TRPM6、TRPM7、TRPM8、MCOLN1、MCOLN2、MCOLN3、PKD1、PKD2、PKD2L1、PKD2L2、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPV5、TRPV6、CATSPER1、CATSPER2、CATSPER3、CATSPER4、TPCN1、TPCN2、CNGA1、CNGA2、CNGA3、CNGA4、CNGB1、CNGB3、HCN1、HCN2、HCN3、HCN4、KCNMA1、KCNN1、KCNN2、KCNN3、KCNN4、KCNT1、KCNT2、KCNU1、KCNA1、KCNA2、KCNA3、KCNA4、KCNA5、KCNA6、KCNA7、KCNA10、KCNB1、KCNB2、KCNC1、KCNC2、KCNC3、KCNC4、KCND1、KCND2、KCND3、KCNF1、KCNG1、KCNG2、KCNG3、KCNG4、KCNH1、KCNH2、KCNH3、KCNH4、KCNH5、KCNH6、KCNH7、KCNH8、KCNQ1、KCNQ2、KCNQ3、KCNQ4、KCNQ5、KCNS1、KCNS2、KCNS3、KCNV1、KCNV2、KCNJ1、KCNJ2、KCNJ3、KCNJ4、KCNJ5、KCNJ6、KCNJ8、KCNJ9、KCNJ10、KCNJ11、KCNJ12、KCNJ13、KCNJ14、KCNJ15、KCNJ16、KCNJ18、KCNK1、KCNK2、KCNK3、KCNK4、KCNK5、KCNK6、KCNK7、KCNK9、KCNK10、KCNK12、KCNK13、KCNK15、KCNK16、KCNK17、KCNK18、HVCN1、HTR3A、HTR3B、HTR3C、HTR3D、HTR3E、CHRNA1、CHRNA2、CHRNA3、CHRNA4、CHRNA5、CHRNA6、CHRNA7、CHRNA9、CHRNA10、CHRNB1、CHRNB2、CHRNB3、CHRNB4、CHRND、CHRNE、CHRNG、GABRA1、GABRA2、GABRA3、GABRA4、GABRA5、GABRA6、GABRB1、GABRB2、GABRB3、GABRD、GABRE、GABRG1、GABRG2、GABRG3、GABRP、GABRQ、GABRR1、GABRR2、GABRR3、GRIA1、GRIA2、GRIA3、GRIA4、GRID1、GRID2、GRIK1、GRIK2、GRIK3、GRIK4、GRIK5、GRIN1、GRIN2A、GRIN2B、GRIN2C、GRIN2D、GRIN3A、GRIN3B、GLRA1、GLRA2、GLRA3、GLRA4、P2RX1、P2RX2、P2RX3、P2RX4、P2RX5、P2RX6、P2RX7、ZACN、ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4、AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、AQP6、AQP7、AQP8、AQP9、AQP10、AQP11、AQP12A、AQP12B、MIP、CLCN1、CLCN2、CLCN3、CLCN4、CLCN5、CLCN6、CLCN7、CLCNKA、CLCNKB、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)、ANO1、ANO2、ANO3、ANO4、ANO5、ANO6、ANO7、ANO8、ANO9、ANO10、BEST1、BEST2、BEST3、BEST4、CLIC1、CLIC2、CLIC3、CLIC4、CLIC5、CLIC6、GJA1、GJA3、GJA4、GJA5、GJA6P、GJA8、GJA9、GJA10、GJB1、GJB2、GJB3、GJB4、GJB5、GJB6、GJB7、GJC1、GJC2、GJC3、GJD2、GJD3、GJD4、GJE1、ITPR1、ITPR2、ITPR3、PANX1、PANX2、PANX3、RYR1、RYR2、RYR3、NALCN、SCNN1A、SCNN1B、SCNN1D、SCNN1G、TEM16A、ADAMTS7、ANGPTL3、ANGPTL4、ANGPTL8、LPL、GDF15、半乳凝素-1、半乳凝素-2、半乳凝素-3、半乳凝素-4、半乳凝素-7、半乳凝素-8、半乳凝素-9、半乳凝素-10、半乳凝素-12、半乳凝素-13、基质gla蛋白(MGP)、PRNP、DGAT1、GPAT3、DMC1、BLM、BRCA2、K型人内源性逆转录病毒(HERV-K)家族的成员、外核苷三磷酸酯二磷酸水解酶1(ENTPD1)、外核苷三磷酸酯二磷酸水解酶2(ENTPD2)、SLC1A1、SLC1A2、SLC1A3、SLC1A4、SLC1A5、SLC1A6、SLC1A7、SLC2A1、SLC2A2、SLC2A3、SLC2A4、SLC2A5、SLC2A6、SLC2A7、SLC2A8、SLC2A9、SLC2A10、SLC2A11、SLC2A12、SLC2A13、SLC2A14、SLC3A1、SLC3A2、SLC4A1、SLC4A2、SLC4A3、SLC4A4、SLC4A5、SLC4A6、SLC4A7、SLC4A8、SLC4A9、SLC4A10、SLC4A11、SLC5A1、SLC5A2、SLC5A3、SLC5A4、SLC5A5、SLC5A6、SLC5A7、SLC5A8、SLC5A9、SLC5A10、SLC5A11、SLC5A12、SLC6A1、SLC6A2、SLC6A3、SLC6A4、SLC6A5、SLC6A6、SLC6A7、SLC6A8、SLC6A9、SLC6A10、SLC6A11、SLC6A12、SLC6A13、SLC6A14、SLC6A15、SLC6A16、SLC6A17、SLC6A18、SLC6A19、SLC6A20、SLC7A5、SLC7A6、SLC7A7、SLC7A8、SLC7A9、SLC7A10、SLC7A11、SLC7A13、SLC7A14、SLC8A1、SLC8A2、SLC8A3、SLC9A1、SLC9A2、SLC9A3、SLC9A4、SLC9A5、SLC9A6、SLC9A7、SLC9A8、SLC9A9、SLC9A10、SLC9A11、SLC9B1、SLC9B2、SLC10A1、SLC10A2、SLC10A3、SLC10A4、SLC10A5、SLC10A6、SLC10A7、SLC11A1、SLC11A2、SLC12A1、SLC12A2、SLC12A3、SLC12A4、SLC12A5、SLC12A6、SLC12A7、SLC12A8、SLC12A9、SLC13A1、SLC13A2、SLC13A3、SLC13A4、SLC13A5、SLC14A1、SLC14A2、SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3、SLC15A4、SLC16A1、SLC16A2、SLC16A3、SLC16A4、SLC16A5、SLC16A6、SLC16A7、SLC16A8、SLC16A9、SLC16A10、SLC16A11、SLC16A12、SLC16A13、SLC16A14、SLC17A1、SLC17A2、SLC17A3、SLC17A4、SLC17A5、SLC17A6、SLC17A7、SLC17A8、SLC17A9、SLC18A1、SLC18A2、SLC18A3、SLC19A1、SLC19A2、SLC19A3、SLC20A1、SLC20A2、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B3、SLCO1C1、SLCO2A1、SLCO2B1、SLCO3A1、SLCO4A1、SLCO4C1、SLCO5A1、SLCO6A1、SLC22A1、SLC22A2、SLC22A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC22A6、SLC22A7、SLC22A8、SLC22A9、SLC22A10、SLC22A11、SLC22A12、SLC22A13、SLC22A14、SLC22A15、SLC22A16、SLC22A17、SLC22A18、SLC22A18AS,SLC22A19、SLC22A20、SLC22A23、SLC22A24、SLC22A25、SLC22A31、SLC23A1、SLC23A2、SLC23A3、SLC23A4、SLC24A1、SLC24A2、SLC24A3、SLC24A4、SLC24A5、SLC24A6、SLC25A1、SLC25A2、SLC25A3、SLC25A4、SLC25A5、SLC25A6、SLC25A7、SLC25A8、SLC25A9、SLC25A10、SLC25A11、SLC25A12、SLC25A13、SLC25A14、SLC25A15、SLC25A16、SLC25A17、SLC25A18、SLC25A19,SLC25A20、SLC25A21、SLC25A22、SLC25A23、SLC25A24、SLC25A25、SLC25A26、SLC25A27、SLC25A28、SLC25A29、SLC25A30、SLC25A31、SLC25A32、SLC25A33、SLC25A34、SLC25A35、SLC25A36、SLC25A37,SLC25A38、SLC25A39、SLC25A40、SLC25A41、SLC25A42、SLC25A43、SLC25A44、SLC25A45、SLC25A46、SLC26A1、SLC26A2、SLC26A3、SLC26A4、SLC26A5、SLC26A6、SLC26A7、SLC26A8、SLC26A9、SLC26A10、SLC26A11、SLC27A1、SLC27A2、SLC27A3、SLC27A4、SLC27A5、SLC27A6、SLC28A1、SLC28A2、SLC28A3、SLC29A1、SLC29A2、SLC29A3、SLC29A4、SLC30A1、SLC30A2、SLC30A3、SLC30A4、SLC30A5、SLC30A6、SLC30A7、SLC30A8、SLC30A9、SLC30A10、SLC31A1、SLC31A2、SLC32A1、SLC33A1、SLC34A1、SLC34A2、SLC34A3、SLC35A1、SLC35A2、SLC35A3、SLC35A4、SLC35A5、SLC35B1、SLC35B2、SLC35B3、SLC35B4、SLC35C1、SLC35C2、SLC35D1、SLC35D2、SLC35D3、SLC35E1、SLC35E2、SLC35E3、SLC35E4、SLC35F1、SLC35F2、SLC35F3、SLC35F4、SLC35F5、SLC35G1、SLC35G3、SLC35G4、SLC35G5、SLC35G6、SLC36A1、SLC36A2、SLC36A3、SLC36A4、SLC37A1、SLC37A2、SLC37A3、SLC37A4、SLC38A1、SLC38A2、SLC38A3、SLC38A4、SLC38A5、SLC38A6、SLC38A7、SLC38A8、SLC38A9、SLC38A10、SLC38A11、SLC39A1、SLC39A2、SLC39A3、SLC39A4、SLC39A5、SLC39A6、SLC39A7、SLC39A8、SLC39A9、SLC39A10、SLC39A11、SLC39A12、SLC39A13、SLC39A14、SLC40A1、SLC41A1、SLC41A2、SLC41A3、RhAG、RhBG、RhCG、SLC43A1、SLC43A2、SLC43A3、SLC44A1、SLC44A2、SLC44A3、SLC44A4、SLC44A5、SLC45A1、SLC45A2、SLC45A3、SLC45A4、SLC46A1、SLC46A2、SLC46A3、SLC47A1、SLC47A2、HCP-1、MFSD5、MFSD10、SLC50A1、OSTα、OSTβ、SLC52A1、SLC52A2、和SLC52A3。
方面79.如前述方面中任一项所述的方法，其中获得与靶蛋白特异性结合的抗体的步骤包括：从动物中获得产生抗体的细胞、用这些产生抗体的细胞生成杂交瘤、选择产生与靶蛋白特异性结合的抗体的杂交瘤、和分离由该杂交瘤产生的抗体。
方面80.如方面79所述的方法，该方法进一步包括以下步骤：确定编码与靶蛋白特异性结合的抗体的核酸序列。
方面81.如方面72、79或80所述的方法，其中这些产生抗体的细胞是淋巴细胞、脾细胞或外周血单核细胞(PBMC)。
方面82.如前述方面中任一项所述的方法，该方法进一步包括以下步骤：基于与靶蛋白特异性结合的抗体生成嵌合抗体或人源化抗体，其中该嵌合抗体或人源化抗体能够以可比较的亲和力结合靶蛋白。
方面83.如前述方面中任一项所述的方法，其中该动物已经被遗传修饰以产生人抗体。
方面84.如前述方面中任一项所述的方法，其中该复合物的多核糖核苷酸包含假尿苷。
方面85.如前述方面中任一项所述的方法，其中该复合物的多核糖核苷酸包含：
(a)胞苷的以下经修饰的核苷酸的一种或多种：5-甲酰基胞苷、5-甲基胞苷、5-甲氧基胞苷、5-羟基胞苷和5-羟基甲基胞苷；
(b)尿苷的以下经修饰的核苷酸的一种或多种：5-甲酰基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、5-羧基甲基酯尿苷、假尿苷和N1-甲基假尿苷；
(c)作为腺苷的经修饰的核苷酸的N6-甲基腺苷：和/或
(d)作为鸟苷的经修饰的核苷酸的噻吩并鸟苷。方面86.如前述方面中任一项所述的方法，其中该复合物包含编码两种或更多种不同靶蛋白的两种或更多种不同多核糖核苷酸，如mRNA，这些靶蛋白能够彼此结合。
方面87.如前述方面中任一项所述的方法，其中所述复合物包含多核糖核苷酸，该多核糖核苷酸包含与表1-7中的序列(例如，SEQ ID NO:2、4、37、5、7、40、8、10、43、14、16、46、17、19、49、20、22、52、26、55或56)的任一者具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
附图说明
图1A-1D描绘了示例性RXFP1免疫策略和所得的基于FACS的血清应答。
图1A是人RXFP1的示例性免疫策略的示意图。
图1B描绘了引发免疫后10天来自动物的基于FACS的血清应答，说明了与过表达人RXFP1(BaF/3)的全细胞或过表达人RXFP1的病毒样颗粒(VLP-300.19)的更传统的免疫形式相比，通过mRNA免疫对靶特异性滴度的快速诱导。
图1C描绘了在最终加强和杂交瘤融合的起始之前免疫小鼠的最终的血清应答。选择8只小鼠进行融合，并用100ug指定的免疫原加强。
图1D描绘了从免疫接种活动获得的三种抗人RXFP1杂交瘤克隆的样品FACS图。总共获得了207个RXFP1特异性克隆。
图2描绘了示例性SLC52A2免疫策略和所得的基于FACS的血清应答。用于生成抗SLC52A抗体和相应血清滴度而采用的免疫策略的说明。传统的免疫原，如过表达细胞、病毒样颗粒和编码细胞外环(EC2)的肽未能引起显著的靶特异性滴度。从8只融合小鼠中产生总共228个能够产生SLC52A2特异性抗体的杂交瘤。
图3描绘了示例性半乳凝素-3免疫策略和所得的ELISA血清应答。
图4示出了经纯化的人RXFP1 mRNA的生物分析仪迹线。表明了每孔加载的mRNA的总量。使用假尿苷合成的样品显示出与用尿苷合成的转录物相比更接近预测大小(2687个碱基)的分子量。
图5描绘了由用递增浓度的人RXFP1 mRNA瞬时转染的HEK293细胞制备的质膜级分的蛋白质印迹。作为对照比较物，还加载了未转染的细胞和用编码人RXFP1的DNA质粒转染的细胞。显示了每个经转染的6孔使用的核酸量。
具体实施方式
本披露涉及使用包含阳离子脂质和多核苷酸分子的组合物的免疫方法，该多核苷酸例如是编码免疫原(例如，靶蛋白或其片段)的多核糖核苷酸分子(例如，mRNA)。本披露还涉及用于从遗传免疫的动物中产生多克隆和单克隆抗体的方法，以及涉及通过本文提供的免疫方法产生的抗体，这些抗体包括此类抗体的嵌合变体和人源化变体。本披露还涉及通过本文提供的免疫方法(例如，mRNA-LNP免疫方法)获得的杂交瘤。
本披露涉及用于在动物(例如，非人动物，如小鼠、大鼠或兔)中诱发免疫应答的方法，该方法包括以下步骤：(a)将至少一种阳离子脂质与编码抗原决定簇的多核苷酸混合，从而形成阳离子脂质-多核苷酸复合物(例如，mRNA-LNP复合物)；和(b)向该动物给予该脂质-多核苷酸复合物。本披露进一步涉及基因免疫方法，其中该多核苷酸是编码免疫原(例如，跨膜蛋白(例如，多通道跨膜蛋白)，如GPCR)的mRNA分子。已经发现mRNA是用于快速产生激发性和复合的蛋白质靶标(例如，多通道跨膜蛋白质，例如GPCR)的抗体的优良多核苷酸。
本披露进一步涉及用于产生多克隆抗体的方法，该方法包括使用本文所述的基因免疫方法，并且进一步包括从免疫的动物中分离多克隆抗体的步骤。
本披露还涉及用于产生单克隆抗体的方法，该方法包括以下步骤：(a)向非人动物(例如，小鼠)给予包含至少一种阳离子脂质和多核苷酸(例如，多核糖核苷酸)的组合物，其中该多核苷酸包含编码免疫原的mRNA序列；和(b)获得与该免疫原特异性结合的抗体。在具体的方面，获得与免疫原特异性结合的抗体的步骤包括以下步骤的一个或多个：(a)从免疫的动物中获得产生抗体的细胞，如淋巴细胞(例如，B-淋巴细胞)或脾细胞；(b)将来自免疫的动物的产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合，从而产生杂交瘤；(c)克隆该杂交瘤；(d)选择产生抗免疫原抗体(即，与免疫原特异性结合的抗体)的阳性克隆；(e)培养这些产生抗免疫原抗体的克隆；和(f)从这些培养物中分离抗免疫原抗体。
本披露还涉及用于产生单克隆抗体的方法，该方法包括以下步骤：(a)将至少一种阳离子脂质与多核苷酸(例如，多核糖核苷酸)混合，从而形成脂质-多核苷酸复合物，其中该多核苷酸包含编码免疫原的mRNA序列；(b)向至少一个小鼠给予该脂质-多核苷酸复合物；(c)从免疫的小鼠中去除产生抗体的细胞，如淋巴细胞(例如，B-淋巴细胞)或脾细胞；(d)将来自免疫的小鼠的B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，从而产生杂交瘤；(e)克隆该杂交瘤；(f)选择产生抗免疫原抗体的阳性克隆；(g)培养这些产生抗免疫原抗体的克隆；和(h)从这些培养物中分离抗免疫原抗体。
已经使用阳离子脂质的各种配制品在体外转染细胞(例如，WO 91/17424；WO 91/16024；美国专利号4,897,355；美国专利号4,946,787；美国专利号5,049,386；和美国专利号5,208,036)。阳离子脂质还已被用于在体内将外源多核苷酸引入蛙和大鼠细胞中(参见，例如，Holt等人，Neuron[神经元]4:203-214(1990)；Hazinski等人，Am.J.Respr.Cell.Mol.Biol.[美国呼吸系统细胞和分子生物学杂志]4:206-209(1991))。在本文提供的具体实施例中，通常使用阳离子脂质递送或引入生物活性物质(例如，参见WO91/17424；WO 91/16024；和WO 93/03709)。在本文所述的具体方面，阳离子脂质体可以提供用于将外源多核苷酸，如多核糖核苷酸(例如，mRNA)引入宿主细胞用于基因免疫的有效载体。
可以将现有技术中熟知的各种阳离子脂质用于本文提供的组合物和方法。一种熟知的阳离子脂质是N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)。使用标准技术可以将DOTMA单独地或按与二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)1:1的组合配制成脂质体。Felgner等人.(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]84:7413-7417(1987))，该全部内容通过引用并入本文，已经示出了此类脂质体可以为培养细胞提供有效的核酸递送。DOTMA:DOPE(1:1)配制品在名称LIPOFECTINTM(GIBCO/BRL:LifeTechnologies,Inc.(生命技术公司)，盖瑟斯堡，马里兰州)下被售卖。另一种可商购的阳离子脂质是1,2-双(油酰基氧基)-3-3-(三甲基胺)丙烷(DOTAP)，该脂质与DOTMA的不同之处在于油酰基部分通过酯键而非醚键与丙胺连接。据信DOTAP更容易被靶细胞降解。
相关的已知化合物基团与DOTMA和DOTAP的不同之处在于三甲铵基团的一个甲基基团被羟乙基基团取代。此类型的化合物类似于磷脂酶A的罗森塔尔抑制剂(RosenthalInhibitor)(Rosenthal等，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]235:2202-2206(1960)，该化合物具有与丙胺核连接的硬脂酰酯。罗森塔尔抑制剂(RI)的二油酰基类似物通常缩写为DORI-醚和DORI-酯，这取决于脂肪酸部分与丙胺核的连接。羟基基团可用作进一步官能化的位点，例如，通过酯化成羧基精胺。
Behr等已经描述了另一类已知的化合物(Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:6982-6986(1989)；EPO公开0 394 111)，其中羧基精胺已经与两种类型的脂质缀合，产生二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺基酰胺(DDPES)。
DOGS和DPPES均已用于包被质粒，形成提供有效转染的脂质聚集体复合物。据称这些化合物比DOTMA更有效且毒性更低，用于转染某些细胞系。DOGS作为TRANSFECTAMTM(普洛麦格公司(Promega)，麦迪逊，威斯康星州)是可商购的。
阳离子胆固醇衍生物(DC-Chol)已经被合成并与DOPE组合配制成脂质体(Gao等人，Biochim.Biophys.Res.Comm.[生物化学与生物物理学研究通讯]179:280-285(1991))。对于某些细胞系，用DC-Chol配制的脂质体提供了比含有DOTMA的脂质体更有效的转染和更低的毒性。
通过将聚赖氨酸与DOPE缀合形成脂质聚赖氨酸。该化合物已经被报道在血清的存在下对转染特别有效(Zhou等人，Biochim.Biophys.Res.Comm.[生物化学与生物物理学研究通讯]165:8-14(1991))。因此,脂质聚赖氨酸可以是用于免疫的有效的载体。
可以在本文提供的方法和组合物中使用的脂质的其他非限制性实例(例如，阳离子脂质、辅助脂质和隐形脂质)包括在WO 2015/095346、WO 2015/095340、WO 2016/037053、WO 2014/136086和WO 2011/076807中描述的那些，其各自通过引用以其全部内容并于本文中。
在某些方面，用于本文所述的组合物和方法的阳离子脂质包括但不限于N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)、N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1,2-二油酰基氨甲酰基-3-二甲基铵-丙烷(DOCDAP)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DLINDAP)、二月桂基(C12:0)三甲基铵丙烷(DLTAP)、二-十八烷基氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、DC-Chol、二油酰基氧基-N-[2-精胺甲酰胺基)乙基}-N,N-二甲基-1-丙烷三氟乙酸铵(DOSPA)、1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺,顺-9,12-十八碳二烯酰氧基)丙烷(CLinDMA)、N,N-二甲基-2,3-二油烯基氧基)丙胺(DODMA)、2-[5’-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)-3’-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺,顺-9’,12’-十八碳二烯酰氧基)丙烷(CpLinDMA)和N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄基胺(DMOBA)，以及1,2-N,N’-二油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)。在一个实施例中，用于本文提供的组合物和方法的阳离子脂质是DOTAP或DLTAP。
这些化合物可单独使用，或与其他形成脂质聚集体的组分(如DOPE或胆固醇)组合用于配制成脂质体或其他脂质聚集体。此类聚集体是阳离子的并且能够与阴离子大分子(如DNA或RNA)复合。
本文提供的基于mRNA免疫的方法已经解决了与抗原产生和/或抗体生成中固有的上述困难相关的许多问题。其中，所述方法省去了对直接表达和纯化靶蛋白抗原的需要。动物宿主自身的细胞机器用于制造靶蛋白质并将其呈递给免疫系统。对于真核靶蛋白，这具有允许添加真核特异性翻译后修饰和蛋白质加工的附加优点。不受限于任何具体理论，用于免疫的未经纯化的mRNA具有高度炎性特征，部分原因在于制备中存在双链RNA实体。在具体的方面，该mRNA充当佐剂以加强针对靶蛋白的体液应答。
在本文提供的特定方面，可以通过用编码所述靶蛋白的mRNA免疫动物来加速靶蛋白的单克隆抗体开发。此方法为蛋白质提供了相当大的优势，对于这些蛋白质来说，开发特异性抗体例如G蛋白偶联受体在历史上一直具有技术挑战性，因为不存在异源产生和纯化靶蛋白质的需要。由mRNA的佐剂样特性引起的宿主防御机制导致血清滴度的快速发展。
在某些方面，使用从动物获得的产生抗体的细胞的杂交瘤融合具有高产率，这些动物被本文提供的基于包封的mRNA的免疫方法免疫。包封的mRNA是有效的并且具有高免疫原性，这可以缩短免疫计划并且需要更少的动物。用本发明的方法可以产生作为抗原的所有形式的蛋白质，例如可溶的、膜结合的、复合的/异聚的等，而不管复杂性如何。表达应该导致抗原的天然确认。
本文提供的本发明的方法还可以导致复合蛋白质(例如，IgG，受体复合物)的多条链的共表达。在本文提供的基于mRNA的免疫方法的具体方面中，表达的抗原是免疫原完全的，即没有污染物会改变体液应答或感染性病原体的特异性，因为它们是合成的。
在特定方面，本发明的方法描述了稳定的抗原生成和试剂储存方法，因为本发明的脂质包封的mRNA能够在4℃下保持稳定数月。此外，不需要IMPACT(传染性微生物PCR扩增测试)病原体测试，因为mRNA都是合成的。
术语
“克隆载体”是指质粒或噬菌体DNA或其他DNA序列，其能够在宿主细胞中自主复制，并且特征在于一个或少数限制性内切核酸酶识别位点，在不丧失载体的基本生物学功能的情况下可以在这些位点处按可测定的方式切割这些DNA序列，并且可以将DNA片段剪接到其中以便于实现这些DNA片段复制和克隆。克隆载体可以进一步包含适合在鉴定用克隆载体转化的细胞中使用的标记物。例如，标记物提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性。
“表达载体”是类似于克隆载体的载体，但是在转化入宿主后能够增强克隆到其中的基因表达。克隆的基因通常被置于某些控制序列(如启动子序列)的控制下(即，可操作地连接)。启动子序列可以是组成型的或诱导型的。
“表达”是细胞过程，通过该过程从结构基因中产生多肽。该过程涉及将基因转录成信使RNA(mRNA)并将这样的mRNA翻译成一种或多种多肽。“表达”还可以在适用的情况下包括但不限于例如转录、翻译、折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA，和通过翻译从基因转录的mRNA获得的多肽。在具体的方面，核酸序列的“表达”是指以下事件的一个或多个：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)加工RNA转录物(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成、和/或3'末端加工)；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质；和(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
“外源”核酸是通过涉及人干预的过程被引入生物系统(如细胞或生物体)中的核酸(例如，本文所述的经修饰的合成mRNA)，在该生物系统中通常不会发现核酸或核酸处于较低含量。如果将因子(例如，本文所述的经修饰的合成mRNA)引入直接的前体细胞或遗传该物质的后代细胞中，则该因子是外源的。相反，“内源的”是对于生物系统或细胞是天然的因子或表达产物(例如，基因的内源表达)。
“分离的”在核酸或多肽的情况下是指从至少一种其他组分(例如，核酸或多肽)中分离的核酸或多肽，其他组分与如在其天然来源中发现的核酸或多肽一起存在和/或当由细胞表达(或在分泌的多肽的情况下分泌)时与该核酸或多肽一起存在。化学合成的核酸或多肽或使用体外转录/翻译合成的核酸或多肽被认为是“分离的”。
“分离的细胞”是从它们最初发现的生物体中去除的细胞，或这些细胞的后代。任选地，已经将该细胞进行了体外培养，例如，在其他细胞存在下。任选地，随后将该细胞引入第二生物体中或重新引入分离出该细胞(或它后代的细胞或细胞群)的生物体中。
“修饰的”意指本文所述分子的改变的状态或结构。可以按许多方式(包括化学地，结构地和功能性地)修饰分子。在一个实施例中，通过引入天然和非天然核苷和/或核苷酸来修饰本文所述的mRNA分子。修饰还可以表示与野生型不同的任何改变。“修饰的”RNA是体外产生的RNA分子，其包含至少一个经修饰的核苷。
“经修饰的核苷”是核糖核苷，其涵盖相对于标准鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞苷(C)和尿苷(U)核苷的一种或多种修饰。此类修饰可包括，例如，通常在转录后引入哺乳动物细胞mRNA的修饰，和本领域技术人员已知的人工化学修饰。在一方面，以下是经修饰的核苷酸的非限制性实例：5-甲酰基胞苷、5-甲基胞苷、5-甲氧基胞苷、5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-甲酰基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、5-羧基甲基酯尿苷、假尿苷、N1-甲基假尿苷、N6-甲基腺苷和噻吩并鸟苷。
“共转录添加”是指在RNA分子转录期间(即，经修饰的RNA在5’帽添加之前未完全转录)向本发明的经修饰的合成mRNA中添加特征，例如5'甲基鸟苷帽或其他经修饰的核苷。
“接触”细胞表示使该细胞与因子(例如，本文所述的经修饰的合成mRNA)接触，任选地，包括使细胞经历转染系统。当这样的细胞在体内时，使该细胞与本文所述的经修饰的合成mRNA接触包括通过适当的给予途径向受试者给予在配制品(如药物组合物)中的本文所述的经修饰的合成mRNA，使得该化合物与细胞在体内接触。
通常，“重组宿主”可以是在表达载体或克隆载体中含有所需克隆基因的任何原核或真核微生物或细胞。该术语还表示包括那些经过基因工程化以在该生物的染色体或基因组中含有所需一种或多种基因的微生物。
“重组载体”是包含所需的一种或多种克隆基因的任何克隆载体或表达载体。
“宿主”是指作为可复制表达载体或克隆载体的接受者的任何原核或真核微生物或细胞。宿主还包括原核或真核微生物或细胞，其可通过熟知的技术进行基因工程化以在其染色体或基因组上含有所需一种或多种基因。对于此类宿主的实例，参见Maniatis等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆:实验室手册],冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory),冷泉港，纽约(1982)。
“启动子”是通常被描述为基因的5'区的DNA序列，位于起始密码子的近端。一个或多个相邻基因的转录在启动子区域开始。如果启动子是诱导型启动子，则转录速率响应诱导剂而增加。相反，如果启动子是组成型启动子，则转录速率不受诱导剂调节。
“基因”是包含用于表达多肽或蛋白质所需信息的DNA序列。
“结构基因”是核苷酸(例如，DNA)序列，该核苷酸序列被转录成信使RNA(mRNA)，之后被翻译成特定多肽特有的氨基酸序列。
“转染”是指用多核苷酸(例如，DNA或RNA)转化宿主细胞。重组宿主细胞表达由转染的多核苷酸(例如DNA或RNA)编码的蛋白质。在具体的方面，“转染”表示使用方法(如化学方法)将外源核酸(如本文所述的经修饰的合成mRNA)引入宿主细胞(如真核细胞)中。如本文使用的，术语“转染”不涵盖将外源核酸引入细胞的基于病毒的方法。转染的非限制性方法包括物理处理(例如，电穿孔、纳米颗粒、磁转染)和基于化学的转染方法。基于化学的转染方法包括但不限于环糊精、聚合物、脂质体和纳米颗粒。
“表位”是抗体可变区结合的非免疫球蛋白抗原的一部分。“抗原决定簇”是含有一个或多个表位的蛋白质或肽。“免疫原”是由于一个或多个表位的存在而能够诱发免疫应答的蛋白质或肽。术语“抗原”、“抗原决定簇”和“免疫原”在本文中同义地使用。在特定方面，表位通常由分子的化学活性表面基团组成，如氨基酸或糖侧链，并且可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。在特定方面，构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，失去与前者的结合但不失去与后者的结合。在某些方面，表位可以是包含抗原的片段或部分的连续氨基酸序列的线性表位。在某些方面，表位可以是包含抗原的非连续氨基酸序列的构象表位。
“转染试剂”是诱导多核苷酸(如DNA或RNA)摄入宿主细胞的试剂。在具体的方面，还涵盖与在这种试剂不存在的情况下给予的本文所述的经修饰的合成mRNA相比增强例如至少50％-90％摄取的试剂。在一个实施例中，在用于制备药物组合物或与本文所述的经修饰的合成mRNA共同给予中有用的阳离子或非阳离子脂质分子用作转染试剂。在其他实施例中，本文所述的经修饰的合成mRNA包含与例如配体、肽基团、亲脂基团、靶向部分等附接的化学键。在其他实施例中，转染试剂包含带电荷的脂质、乳液、脂质体、阳离子或非阳离子脂质、阴离子脂质，或本领域已知的或本文所述的渗透增强剂。
“先天免疫应答”或“干扰素应答”是指由细胞响应于识别外来生物体(比如病毒或细菌或这种生物体的产物，例如缺少受试细胞中产生的RNA特有的修饰的RNA)的感染而引起的细胞防御应答。先天免疫应答通过诱导检测外源核酸的细胞死亡来预防病毒和细菌感染。
“治疗有效量”或“有效量”是主题化合物或组合的量，该量将引起由研究人员、兽医、医生或其他临床医师其正在寻求的组织、系统、动物或人的生物或医学应答。
“引物”也是核酸序列。PCR引物通常是在聚合酶链反应中使用的相当短的长度(例如，8-30个核苷酸)的寡核苷酸。使用来自靶序列的序列信息，本领域技术人员可以容易地开发和产生PCR引物和杂交探针。参见，Sambrook等人.(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual[分子克隆:实验室手册](冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLabs Press))。
“选择性结合”或“特异性结合”表示一种蛋白质与另一种蛋白质(例如，抗体，其片段或与靶蛋白的结合配偶体)的特异性结合，其中通过任何标准测定法(例如，免疫测定)测量的结合水平在统计学上显著高于测定的背景对照。
“保守的”核苷酸或氨基酸分别是多核苷酸序列或多肽序列的残基，该残基在被比较的两个或更多个序列的相同位置处未发生改变。相对保守的核苷酸或氨基酸是在比序列中其他地方出现的核苷酸或氨基酸更相关的序列中保守的那些。如果两个或更多个序列彼此是100％同一性的，则它们是“完全保守的”。在一些实施例中，如果两个或更多个序列彼此至少是90％同一性的，则它们是“高度保守的”。在一些实施例中，如果两个或更多个碱基彼此相同，则它们是“保守的”。序列的保守可适用于寡核苷酸或多肽的整个长度，或可适用于其部分、区域或特征。在多肽的情况下，以下八组包含彼此互为保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见，例如，Creighton,Proteins[蛋白质](1984))。
“递送”是指递送化合物、物质、实体、部分、货物或有效载荷的行为或方式。
“递送剂”是至少部分地促进核酸分子体内递送至靶细胞的任何物质。
“配制品”包括至少一种经修饰的核酸分子和递送剂。
“同源性”是指聚合物分子之间的总体相关性，例如，在核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或在多肽分子之间。在一些实施例中，如果聚合物分子的序列是至少25％相同的，则被认为它们是彼此“同源”的。术语“同源的”必然是指至少两个序列(多核苷酸序列或多肽序列)之间的比较。如果两个多核苷酸序列编码的多肽对于至少约20个氨基酸的至少一个区段至少约50％相同，则这两个多核苷酸序列被认为是同源的。在一些实施例中，同源多核苷酸序列的特征在于编码至少4-5个独特指定的氨基酸的区段能力。对于长度小于60个核苷酸的多核苷酸序列，通过编码至少4-5个独特指定的氨基酸的区段的能力来确定同源性。根据本发明，对于至少约20个氨基酸的至少一个区段，如果蛋白质是至少约50％相同，至少约60％相同，则这两个蛋白质序列被认为是同源的。
“同一性”是指聚合物分子之间，例如寡核苷酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间或多肽分子之间的总体相关性。例如，可以出于最佳比较目的通过比对两个序列(例如，可以在第一和第二核酸序列中的一个或两个中引入空位用于最佳比对并且出于比较目的可以忽略不相同的序列)来进行两个多核苷酸序列的同一性百分比的计算。然后比较相应核苷酸位置处的核苷酸。当第一序列中的位置被与在第二序列中的相应位置处相同的核苷酸占据时，则这些分子在那个位置处是相同的。两个序列之间的百分比同一性是所述序列共享的相同位置的数量的函数，考虑了空位数量以及每个空位的长度，需要引入它们以用于两个序列的最佳比对。序列比较和两个序列之间百分比同一性的测定可以使用数学算法来完成。适合于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的两个非限制性实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人.,Nuc.Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402,1977；和Altschul等人.,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410,1990中。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开地获得。
术语“一种或多种阳离子脂质体”或“一种或多种阳离子脂质”是由带正电荷的脂质构成的结构，这些结构能够与带负电的DNA和细胞膜相互作用。
术语“脂质纳米颗粒”或“LNP”是指包含通过分子间力彼此物理结合的多个(即多于一个)脂质分子的颗粒。脂质纳米颗粒可以是例如微球(包括单层和多层囊泡，例如脂质体)、乳液中的分散相、胶团或悬浮液中的内相。
术语“核酸”在本文中与术语“多核苷酸”可互换地使用，并且是指处于单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)或多核糖核苷酸(包括信使RNA(mRNA))及其聚合物。该术语涵盖包含已知核苷酸类似物或经修饰的主链残基或键的核酸，这些核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的特性，并且以与参考核苷酸相似的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另外指出，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、和互补序列以及明确指明的序列。具体地，如下详述，简并密码子取代可以通过产生如下序列而获得，在这些序列中，一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人.,Nucleic Acid Res[核酸研究].19:5081,1991；Ohtsuka等人.,J.Biol.Chem[生物化学杂志].260:2605-2608,1985；和Rossolini等人.,Mol.Cell.Probes[分子与细胞探针]8:91-98,1994)。
本文使用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围，适合用于与人类和动物的组织接触而不产生过度毒性、刺激、过敏反应、或其他问题或并发症，同时具有相称的合理受益/风险比的那些化合物、材料、组合物、和/或剂型。
“样品”是其组织、细胞或组成部分(例如，体液)的子集。样品可进一步包括由整个生物体或其组织的子集、细胞或组成部分、或其级分或部分(包括但不限于例如，血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤外部、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、泪液、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤、器官)制备的匀浆、裂解物或提取物。样品还指介质(如营养肉汤或凝胶)，该介质可含有细胞组分(如蛋白质或核酸分子)。
“合成”是指通过人为干预生产、制备和/或制造。本文所述的多核苷酸或多肽或其他分子的合成可以是化学的或酶促的。
如本文使用的，“假尿苷”是指核苷尿苷的C-糖苷异构体。
如本文所用，“纯化(purify)”，“纯化的(purified)”，“纯化(purification)”是指从不需要的组分、材料污物、混合物或不完美物中制备基本上纯的或干净的。
如本文使用的，术语“抗体”表示全抗体及其任何抗原结合片段(即，“抗原-结合部分”)或单链。全抗体是包含由二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(在本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域，即CH1、CH2以及CH3组成。每个轻链由轻链可变区(在本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，它们散布着称为框架区(FR)的较保守的区。每个VH和VL由从氨基末端排到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq))的结合。
如本文使用的，术语抗体的“抗原-结合部分”或“抗原结合片段”是指保留与给定抗原特异性结合的能力的完整抗体的一个或多个片段。抗体的抗原-结合功能可以由完整抗体的片段进行。涵盖在术语抗体的抗原-结合部分或抗原结合片段内的结合片段的实例包括Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价体片段；F(ab)2片段，一种包含通过铰链区处的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；和由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单一臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域或VL结构域组成的单结构域抗体(dAb)片段(Ward等人,1989Nature[自然]341:544-546)；以及分离的互补决定区(CDR)。在某些方面，可以根据以下编号系统确定抗体的CDR：(i)Kabat编号系统(Kabat等人.(1971)Ann.NY Acad.Sci.[纽约科学学术年报]190:382-391和Kabat等人.(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest[免疫学重要的蛋白质的序列]，第五版，美国卫生和公共服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，NIH出版号91-3242)；或(ii)Chothia编号方案(参见，例如，Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],196:901-917；Al-Lazikani等人,1997,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],273:927-948；Chothia等人，1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],227:799-817；Tramontano A等人.,1990,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215(1):175-82；以及美国专利号7,709,226)；或(iii)ImMunoGeneTics(IMGT)编号系统，例如，如在Lefranc,M.-P.,1999,TheImmunologist[免疫学者],7:132-136以及Lefranc,M.-P.等人,1999,Nucleic Acids Res.[核酸研究],27:209-212("IMGT CDR")中的描述；或(iv)MacCallum等人,1996,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],262:732-745。还参见，例如，Martin,A.,在AntibodyEngineering[抗体工程]中的“Protein Sequence and Structure Analysis of AntibodyVariable Domains[抗体可变结构域的蛋白质序列及结构分析]”，Kontermann和Diibel,编辑.,第31章,第422-439页，斯普林格出版社(Springer-Verlag)，柏林(2001)。
此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法将这两个结构域通过能够使它们形成为单条蛋白质链的人工肽接头来接合，其中VL区和VH区配对形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426；和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。此类单链抗体包含抗体的一个或多个抗原-结合部分或片段。这些抗体片段是使用本领域的技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用来筛选这些片段。
抗原结合片段还可以掺入到单结构域抗体、大型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、胞内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和bis-scFv中(参见，例如，Hollinger和Hudson,2005Nature Biotechnology[自然生物技术]23,9,1126-1136)。可以基于多肽如III型纤连蛋白(Fn3)将抗体的抗原-结合部分移植到支架中(参见美国专利号6,703,199，该专利描述了纤连蛋白多肽单体)。
可以将抗原结合片段掺入包含一对串联Fv片段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人.(1995)Protein Eng.[蛋白质工程]8(10):1057-1062；和美国专利号5,641,870)。
如本文使用的，术语“亲和力”是指抗体和抗原在单个抗原位点处的相互作用强度。在每个抗原位点内，抗体“臂”的可变区通过弱非共价力在许多位点处与抗原相互作用；相互作用越多，亲和力越强。如本文使用的，对于抗体或其抗原结合片段(例如，Fab片段)术语“高亲和力”通常是指具有KD为10-9M或更低的抗体或抗原结合片段。
如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区两者均源自人来源的序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区还源自此类人序列，例如人种系序列或突变形式的人种系序列。在某些方面，人抗体(例如人单克隆抗体)，可以通过杂交瘤产生，该杂交瘤包括与获自转基因非人动物(例如转基因小鼠)的B细胞融合的永生化细胞，该转基因非人动物具有包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组。
“人源化”抗体是保留非人抗体的反应性同时在人中具有较低免疫原性的抗体。例如，这可以通过保留非人CDR区并用其人对应物(即，恒定区以及可变区的框架部分)替换抗体的其余部分来实现。参见，例如，Morrison等人.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],81:6851-6855,1984；Morrison和Oi,Adv.Immunol.[免疫学进展],44:65-92,1988；Verhoeyen等人.,Science[科学],239:1534-1536,1988；Padlan,Molec.Immun.[分子免疫学],28:489-498,1991；以及Padlan,Molec.Immun.[分子免疫学],31:169-217,1994。人工程化技术的其他实例包括但不限于在US 5,766,886中披露的XOMA技术。
术语“杂交瘤”是指源自产生抗体的细胞(比如，B淋巴母细胞)与融合配偶体(比如，骨髓瘤细胞)融合的永生化细胞。在具体方面，用于产生杂交瘤的抗体产生细胞获自用抗原免疫的动物，例如，根据本文所述的基于mRNA的免疫方法免疫。
术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性和/或不同氨基酸序列的其他抗体的抗体。在特定的方面，特异性结合抗原的分离的抗体可以与其他抗原具有交叉反应性。在具体的方面，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
术语“同种型”是指由重链恒定区基因提供的抗体类型(例如，IgM、IgE、IgG(比如，IgG1、IgG2或IgG4)。同种型还包括这些类型之一的经修饰的形式，其中已经进行了修饰以改变Fc功能，例如，增强或降低效应子功能或结合Fc受体。
术语“单克隆抗体”是本领域熟知的术语，该术语是指从对特定表位显示结合特异性和亲和力的同源或基本上同质的抗体群体获得的抗体。术语“单克隆”不限于制备抗体的任何特定方法。通常，单克隆抗体群可以通过细胞、细胞群或细胞系产生。在特定的方面，单克隆抗体可以是嵌合抗体或人源化抗体。在特定的方面，单克隆抗体是单价抗体或多价(例如，双价)抗体。
如本文所用，术语“多克隆抗体”是指异源抗体群，该抗体群包含与特定抗原反应的各种不同抗体，但这些不同抗体识别抗原内的不同表位。
如本文使用的，术语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，比如从动物(例如，小鼠)(该动物对于人免疫球蛋白是转基因的或转染色体的)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体；从转化以表达人抗体的宿主细胞中分离的抗体(例如，来自转染瘤中)；从重组，组合的人抗体文库中分离的抗体；以及通过任何其他方式(涉及将全部或部分的人免疫球蛋白基因、序列剪接到其他DNA序列)制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有可变区，其中构架区和CDR区衍生自人种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施例中，可以对此类重组人抗体进行体外诱变(或，当使用转基因人Ig序列的动物时，进行体内体细胞诱变)，并因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是衍生自人种系VH和VL序列的和与其相关的序列，这些序列在体内可能不天然存在于人抗体种系库中。
如本文使用的，术语“优化的”是指使用在生产细胞或生物体(通常是真核细胞)中优选的密码子改变核苷酸序列以编码氨基酸序列。在某些方面，优化的核苷酸序列被工程化以完全或尽可能多地保留起始核苷酸序列最初编码的氨基酸序列，该核苷酸序列也被称为“亲本”序列。在特定的方面，本文所述的优化的序列已被工程化以具有在哺乳动物细胞(比如鼠细胞)中优选的密码子。在其他方面，本文还设想了在其他真核细胞或原核细胞中优化的序列表达。
I.靶蛋白/抗原决定簇
本文提供了用于在动物(例如，非人动物)中诱导对靶蛋白(例如，人蛋白质，如人跨膜蛋白，例如，人GPCR)或其片段的免疫应答的方法，其中该动物被给予包含复合物的组合物，该复合物包含脂质和编码靶蛋白或其片段的多核苷酸，如多核糖核苷酸(例如，mRNA)，以及提供产生针对这样的靶蛋白的抗体的相关方法。本文提供的这些方法可用于产生针对任何目的靶蛋白(例如，跨膜蛋白)的抗体(例如，单克隆抗体)或诱导对任何目的靶蛋白(例如，跨膜蛋白)的免疫应答。在具体的方面，这些靶蛋白是人靶蛋白，并且在本文所述的方法中使用的这些免疫的动物是非人动物。
在具体的方面，本文提供了用于在动物(例如，非人动物)中产生针对靶蛋白(例如，人蛋白质，比如人跨膜蛋白，例如，人GPCR)或其片段的抗体的方法，该方法使用包含复合物的组合物，该复合物包含脂质和编码靶蛋白或其片段的多核糖核苷酸(比如mRNA)，其中该靶蛋白是(i)G蛋白偶联受体(GPCR)；(ii)单通道跨膜蛋白受体；(iii)肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)成员；(iv)白细胞介素(IL)受体；(v)离子通道；(vi)溶质载体；(vii)免疫受体；或(viii)多通道跨膜蛋白。
在具体的方面，本文提供了用于在动物(例如，非人动物)中产生针对靶蛋白(例如，人蛋白质，比如人跨膜蛋白，例如，人GPCR)或其片段的抗体的方法，该方法使用包含复合物的组合物，该复合物包含脂质和编码靶蛋白或其片段的多核糖核苷酸(比如mRNA)，其中该靶蛋白选自以下：
ACKR1、ACKR2、ACKR3、ACKR4、ADCYAP1R1、ADGRA1、ADGRA2、ADGRA3、ADGRB1、ADGRB2、ADGRB3、ADGRD1、ADGRD2、ADGRE1、ADGRE2、ADGRE3、ADGRE4P、ADGRE5、ADGRF1、ADGRF2、ADGRF3、ADGRF4、ADGRF5、ADGRG1、ADGRG2、ADGRG3、ADGRG4、ADGRG5、ADGRG6、ADGRG7、ADGRL1、ADGRL2、ADGRL3、ADGRL4、ADGRV1、ADORA1、ADORA2A、ADORA2B、ADORA3、ADRA1A、ADRA1B、ADRA1D、ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、ADRB1、ADRB2、ADRB3、AGTR1、AGTR2、APLNR/APJ、ASGR1、ASGR2、AVPR1A、AVPR1B、AVPR2、BDKRB1、BDKRB2、BRS3、BRS3、C3AR1、C5AR1、C5AR2、CALCR、CALCRL、CASR、CCKAR、CCKBR、CCR1、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCRL2、CELSR1、CELSR2、CELSR3、CHRM1、CHRM2、CHRM3、CHRM4、CHRM5、CMKLR1、CNR1、CNR2、CRHR1、CRHR2、CX3CR1、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CYSLTR1、CYSLTR2、DRD1、DRD2、DRD3、DRD4、DRD5、EDNRA、EDNRB、F2R、F2RL1、F2RL2、F2RL3、FFAR1、FFAR2、FFAR3、FFAR4、FPR1、FPR2、FPR2、FPR3、FSHR、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、GABBR1、GABBR2、GALR1、GALR2、GALR3、GCGR、GHRHR、GHSR、GIPR、GLP1R、GLP2R、GNRHR、GNRHR2、GPBAR1、GPER1、GPR1、GPR4、GPR12、GPR15、GPR17、GPR18、GPR19、GPR20、GPR21、GPR22、GPR25、GPR26、GPR27、GPR3、GPR31、GPR32、GPR33、GPR34、GPR35、GPR37、GPR37L1、GPR39、GPR40、GPR42、GPR42、GPR45、GPR50、GPR52、GPR55、GPR55、GPR6、GPR61、GPR62、GPR63、GPR65、GPR68、GPR75、GPR78、GPR79、GPR82、GPR83、GPR84、GPR85、GPR87、GPR88、GPR101、GPR107、GPR132、GPR135、GPR137、GPR139、GPR141、GPR142、GPR143、GPR146、GPR148、GPR149、GPR15、GPR150、GPR151、GPR152、GPR153、GPR156、GPR157、GPR158、GPR160、GPR161、GPR162、GPR171、GPR173、GPR174、GPR176、GPR179、GPR182、GPR183、GPRC5A、GPRC5B、GPRC5C、GPRC5D、GPRC6A、GRM1、GRM2、GRM3、GRM4、GRM5、GRM6、GRM7、GRM8、GRPR、HCAR1、HCAR2、HCAR3、HCRTR1、HCRTR2、HRH1、HRH2、HRH3、HRH4、HTR1A、HTR1B、HTR1D、HTR1E、HTR1F、HTR2A、HTR2B、HTR2C、HTR4、HTR5A、HTR5BP、HTR6、HTR7、KISS1R、LGR3、LGR4、LGR5、LGR6、LHCGR、LPAR1、LPAR2、LPAR3、LPAR4、LPAR5、LPAR6、LTB4R、LTB4R2、MAS1、MAS1L、MC1R、MC2R、MC3R、MC4R、MC5R、MCHR1、MCHR2、MLNR、MRGPRD、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRG、MRGPRX1、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、MTNR1A、MTNR1B、NMBR、NMUR1、NMUR2、NPBWR1、NPBWR2、NPFFR1、NPFFR2、NPSR1、NPY1R、NPY2R、NPY4R、NPY5R、NPY6R、NTSR1、NTSR2、OPN3、OPN4、OPN5、OPRD1、OPRK1、OPRL1、OPRM1、OR51E1、OXER1、OXGR1、OXTR、P2RY1、P2RY10、P2RY11、P2RY12、P2RY13、P2RY14、P2RY2、P2RY4、P2RY6、P2RY8、PRLHR、PROKR1、PROKR2、PTAFR、PTGDR、PTGDR2、PTGER1、PTGER2、PTGER3、PTGER4、PTGFR、PTGIR、PTH1R、PTH2R、QRFPR、RXFP1、RXFP2、RXFP3、RXFP4、S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4、S1PR5、SCTR、SMO、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、SUCNR1、TAAR1、TAAR2、TAAR3、TAAR4P、TAAR5、TAAR6、TAAR8、TAAR9、TACR1、TACR2、TACR3、TAS1R1、TAS1R2、TAS1R3、TAS2R1、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R19、TAS2R20、TAS2R3、TAS2R30、TAS2R31、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R4、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R42、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R5、TAS2R50、TAS2R60、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TBXA2R、TPRA1、TRHR、TSHR、UTS2R、VIPR1、VIPR2、XCR1、TCR-α、TCR-β、CD3、δ-链辅助因子、CD4、和CD8、甘露糖受体(MR)、脱唾液酸糖蛋白受体家族(例如，脱唾液酸糖蛋白受体巨噬细胞半乳糖型凝集素(MGL))、DC-SIGN(CLEC4L)、朗格汉斯蛋白(CLEC4K)、髓样DAP12-关联性凝集素(MDL)-1(CLEC5A)、树突状细胞植物血凝素1/CLEC7A、DNGR1/CLEC9A、髓样C型凝集素样受体(MICL)(CLEC12A)、CLEC2(还被称为CLEC1B)、CLEC12B、DCIR/CLEC4A、树突状细胞植物血凝素2/CLEC6A、血DC抗原2(BDCA2)(CLEC4C)、巨噬细胞诱导的C型凝集素(CLEC4E)、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12、TLR13、FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB1(CD32)、FcγRIIB2(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)、FcεRI、FcεRII(CD23)、FcαR1(CD89)、Fcα/μR、FcRn、CD27、CD40、OX40、GITR、CD137、PD-1、CTLA-4、PD-L1、TIGIT、T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(TIM3)、T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、CD28、CD122、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、FAM159B、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLA-DRB1、gp130、IL-1受体、IL-2受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-5受体、IL-6受体、IL-7受体、IL-8受体、IL-9受体、IL-10受体、IL-11受体、IL-12受体、IL-13受体、IL-14受体、IL-15受体、IL-16受体、IL-17受体、IL-18受体、IL-19受体、IL-20受体、IL-21受体、IL-22受体、IL-23受体、IL-24受体、IL-25受体、IL-26受体、IL-27受体、IL-28受体、IL-29受体、IL-30受体、IL-31受体、IL-32受体、IL-33受体、IL-35受体、IL-36受体、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF3、TNFRSF4、TNFRSF5、TNFRSF6、TNFRSF6B、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF10C、TNFRSF10D、TNFRSF11A、TNFRSF11B、TNFRSF12A、TNFRSF13B、TNFRSF13C、TNFRSF14、TNFRSF16、TNFRSF17、TNFRSF18、TNFRSF19、TNFRSF21、TNFRSF25、TNFRSF27、SCN1A、SCN1B、SCN2A、SCN2B、SCN3A、SCN3B、SCN4A、SCN5A、SCN7A、SCN8A、SCN9A、SCN10A、SCN11A、CACNA1A、CACNA1B、CACNA1C、CACNA1D、CACNA1E、CACNA1F、CACNA1G、CACNA1H、CACNA1I、CACNA1S、TRPA1、TRPC1、TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6、TRPC7、TRPM1、TRPM2、TRPM3、TRPM4、TRPM5、TRPM6、TRPM7、TRPM8、MCOLN1、MCOLN2、MCOLN3、PKD1、PKD2、PKD2L1、PKD2L2、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPV5、TRPV6、CATSPER1、CATSPER2、CATSPER3、CATSPER4、TPCN1、TPCN2、CNGA1、CNGA2、CNGA3、CNGA4、CNGB1、CNGB3、HCN1、HCN2、HCN3、HCN4、KCNMA1、KCNN1、KCNN2、KCNN3、KCNN4、KCNT1、KCNT2、KCNU1、KCNA1、KCNA2、KCNA3、KCNA4、KCNA5、KCNA6、KCNA7、KCNA10、KCNB1、KCNB2、KCNC1、KCNC2、KCNC3、KCNC4、KCND1、KCND2、KCND3、KCNF1、KCNG1、KCNG2、KCNG3、KCNG4、KCNH1、KCNH2、KCNH3、KCNH4、KCNH5、KCNH6、KCNH7、KCNH8、KCNQ1、KCNQ2、KCNQ3、KCNQ4、KCNQ5、KCNS1、KCNS2、KCNS3、KCNV1、KCNV2、KCNJ1、KCNJ2、KCNJ3、KCNJ4、KCNJ5、KCNJ6、KCNJ8、KCNJ9、KCNJ10、KCNJ11、KCNJ12、KCNJ13、KCNJ14、KCNJ15、KCNJ16、KCNJ18、KCNK1、KCNK2、KCNK3、KCNK4、KCNK5、KCNK6、KCNK7、KCNK9、KCNK10、KCNK12、KCNK13、KCNK15、KCNK16、KCNK17、KCNK18、HVCN1、HTR3A、HTR3B、HTR3C、HTR3D、HTR3E、CHRNA1、CHRNA2、CHRNA3、CHRNA4、CHRNA5、CHRNA6、CHRNA7、CHRNA9、CHRNA10、CHRNB1、CHRNB2、CHRNB3、CHRNB4、CHRND、CHRNE、CHRNG、GABRA1、GABRA2、GABRA3、GABRA4、GABRA5、GABRA6、GABRB1、GABRB2、GABRB3、GABRD、GABRE、GABRG1、GABRG2、GABRG3、GABRP、GABRQ、GABRR1、GABRR2、GABRR3、GRIA1、GRIA2、GRIA3、GRIA4、GRID1、GRID2、GRIK1、GRIK2、GRIK3、GRIK4、GRIK5、GRIN1、GRIN2A、GRIN2B、GRIN2C、GRIN2D、GRIN3A、GRIN3B、GLRA1、GLRA2、GLRA3、GLRA4、P2RX1、P2RX2、P2RX3、P2RX4、P2RX5、P2RX6、P2RX7、ZACN、ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4、AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、AQP6、AQP7、AQP8、AQP9、AQP10、AQP11、AQP12A、AQP12B、MIP、CLCN1、CLCN2、CLCN3、CLCN4、CLCN5、CLCN6、CLCN7、CLCNKA、CLCNKB、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)、ANO1/TMEM16a、ANO2、ANO3、ANO4、ANO5、ANO6、ANO7、ANO8、ANO9、ANO10、BEST1、BEST2、BEST3、BEST4、CLIC1、CLIC2、CLIC3、CLIC4、CLIC5、CLIC6、GJA1、GJA3、GJA4、GJA5、GJA6P、GJA8、GJA9、GJA10、GJB1、GJB2、GJB3、GJB4、GJB5、GJB6、GJB7、GJC1、GJC2、GJC3、GJD2、GJD3、GJD4、GJE1、ITPR1、ITPR2、ITPR3、PANX1、PANX2、PANX3、RYR1、RYR2、RYR3、NALCN、SCNN1A、SCNN1B、SCNN1D、SCNN1G、ADAMTS7、ANGPTL3、ANGPTL4、ANGPTL8、LPL、GDF15、半乳凝素-1、半乳凝素-2、半乳凝素-3、半乳凝素-4、半乳凝素-7、半乳凝素-8、半乳凝素-9、半乳凝素-10、半乳凝素-12、半乳凝素-13、基质gla蛋白(MGP)、PRNP、DGAT1、GPAT3、DMC1、BLM、BRCA2、人内源性逆转录病毒K型(HERV-K)家族的成员、外核苷三磷酸酯二磷酸水解酶1(ENTPD1)、外核苷三磷酸酯二磷酸水解酶2(ENTPD2)SLC1A1、SLC1A2、SLC1A3、SLC1A4、SLC1A5、SLC1A6、SLC1A7、SLC2A1、SLC2A2、SLC2A3、SLC2A4、SLC2A5、SLC2A6、SLC2A7、SLC2A8、SLC2A9、SLC2A10、SLC2A11、SLC2A12、SLC2A13、SLC2A14、SLC3A1、SLC3A2、SLC4A1、SLC4A2、SLC4A3、SLC4A4、SLC4A5、SLC4A6、SLC4A7、SLC4A8、SLC4A9、SLC4A10、SLC4A11、SLC5A1、SLC5A2、SLC5A3、SLC5A4、SLC5A5、SLC5A6、SLC5A7、SLC5A8、SLC5A9、SLC5A10、SLC5A11、SLC5A12、SLC6A1、SLC6A2、SLC6A3、SLC6A4、SLC6A5、SLC6A6、SLC6A7、SLC6A8、SLC6A9、SLC6A10、SLC6A11、SLC6A12、SLC6A13、SLC6A14、SLC6A15、SLC6A16、SLC6A17、SLC6A18、SLC6A19、SLC6A20、SLC7A5、SLC7A6、SLC7A7、SLC7A8、SLC7A9、SLC7A10、SLC7A11、SLC7A13、SLC7A14、SLC8A1、SLC8A2、SLC8A3、SLC9A1、SLC9A2、SLC9A3、SLC9A4、SLC9A5、SLC9A6、SLC9A7、SLC9A8、SLC9A9、SLC9A10、SLC9A11、SLC9B1、SLC9B2、SLC10A1、SLC10A2、SLC10A3、SLC10A4、SLC10A5、SLC10A6、SLC10A7、SLC11A1、SLC11A2、SLC12A1、SLC12A2、SLC12A3、SLC12A4、SLC12A5、SLC12A6、SLC12A7、SLC12A8、SLC12A9、SLC13A1、SLC13A2、SLC13A3、SLC13A4、SLC13A5、SLC14A1、SLC14A2、SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3、SLC15A4、SLC16A1、SLC16A2、SLC16A3、SLC16A4、SLC16A5、SLC16A6、SLC16A7、SLC16A8、SLC16A9、SLC16A10、SLC16A11、SLC16A12、SLC16A13、SLC16A14、SLC17A1、SLC17A2、SLC17A3、SLC17A4、SLC17A5、SLC17A6、SLC17A7、SLC17A8、SLC17A9、SLC18A1、SLC18A2、SLC18A3、SLC19A1、SLC19A2、SLC19A3、SLC20A1、SLC20A2、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B3、SLCO1C1、SLCO2A1、SLCO2B1、SLCO3A1、SLCO4A1、SLCO4C1、SLCO5A1、SLCO6A1、
SLC22A1、SLC22A2、SLC22A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC22A6、SLC22A7、SLC22A8、SLC22A9、SLC22A10、SLC22A11、SLC22A12、SLC22A13、SLC22A14、SLC22A15、SLC22A16、SLC22A17、SLC22A18、SLC22A18AS,SLC22A19、SLC22A20、SLC22A23、SLC22A24、SLC22A25、SLC22A31、SLC23A1、SLC23A2、SLC23A3、SLC23A4、SLC24A1、SLC24A2、SLC24A3、SLC24A4、SLC24A5、SLC24A6、SLC25A1、SLC25A2、SLC25A3、SLC25A4、SLC25A5、SLC25A6、SLC25A7、SLC25A8、SLC25A9、SLC25A10、SLC25A11、SLC25A12、SLC25A13、SLC25A14、SLC25A15、SLC25A16、SLC25A17、SLC25A18、SLC25A19,SLC25A20、SLC25A21、SLC25A22、SLC25A23、SLC25A24、SLC25A25、SLC25A26、SLC25A27、SLC25A28、SLC25A29、SLC25A30、SLC25A31、SLC25A32、SLC25A33、SLC25A34、SLC25A35、SLC25A36、SLC25A37、SLC25A38、SLC25A39、SLC25A40、SLC25A41、SLC25A42、SLC25A43、SLC25A44、SLC25A45、SLC25A46、SLC26A1、SLC26A2、SLC26A3、SLC26A4、SLC26A5、SLC26A6、SLC26A7、SLC26A8、SLC26A9、SLC26A10、SLC26A11、SLC27A1、SLC27A2、SLC27A3、SLC27A4、SLC27A5、SLC27A6、SLC28A1、SLC28A2、SLC28A3、SLC29A1、SLC29A2、SLC29A3、SLC29A4、SLC30A1、SLC30A2、SLC30A3、SLC30A4、SLC30A5、SLC30A6、SLC30A7、SLC30A8、SLC30A9、SLC30A10、SLC31A1、SLC31A2、SLC32A1、SLC33A1、SLC34A1、SLC34A2、SLC34A3、SLC35A1、SLC35A2、SLC35A3、SLC35A4、SLC35A5、SLC35B1、SLC35B2、SLC35B3、SLC35B4、SLC35C1、SLC35C2、SLC35D1、SLC35D2、SLC35D3、SLC35E1、SLC35E2、SLC35E3、SLC35E4、SLC35F1、SLC35F2、SLC35F3、SLC35F4、SLC35F5、SLC35G1、SLC35G3、SLC35G4、SLC35G5、SLC35G6、SLC36A1、SLC36A2、SLC36A3、SLC36A4、SLC37A1、SLC37A2、SLC37A3、SLC37A4、SLC38A1、SLC38A2、SLC38A3、SLC38A4、SLC38A5、SLC38A6、SLC38A7、SLC38A8、SLC38A9、SLC38A10、SLC38A11、SLC39A1、SLC39A2、SLC39A3、SLC39A4、SLC39A5、SLC39A6、SLC39A7、SLC39A8、SLC39A9、SLC39A10、SLC39A11、SLC39A12、SLC39A13、SLC39A14、SLC40A1、SLC41A1、SLC41A2、SLC41A3、RhAG、RhBG、RhCG、SLC43A1、SLC43A2、SLC43A3、SLC44A1、SLC44A2、SLC44A3、SLC44A4、SLC44A5、SLC45A1、SLC45A2、SLC45A3、SLC45A4、SLC46A1、SLC46A2、SLC46A3、SLC47A1、SLC47A2、HCP-1、MFSD5、MFSD10、SLC50A1、OSTα、OSTβ、SLC52A1、SLC52A2、和SLC52A3。
在具体的方面，本文提供的这些方法在产生针对以下的抗体方面是有效的：作为跨膜蛋白(比如跨膜受体)的靶蛋白，以及难以产生针对其的抗体的靶蛋白或例如，由于细胞毒性、产量、溶解度、聚集和/或稳定性问题而难以表达的靶蛋白。
在某些方面，本文所述的靶蛋白(例如，人靶蛋白)包括膜内在蛋白质(IMP)，该膜内在蛋白质被分类为I型、II型、单个锚II型、C末端锚和多元分布型(例如，参加Ott和Lingappa,2002,J.Cell Sci.,[细胞科学杂志]115(Pt 10):2003-2009)。在具体的方面，本文所述的靶蛋白(例如，人靶蛋白)是单通道跨膜蛋白。在具体的方面，本文所述的靶蛋白(例如，人靶蛋白)是多通道跨膜蛋白。
G蛋白偶联受体(GPCR)：
在具体的方面，用于在本文提供的方法中使用的复合物包含脂质和编码靶蛋白的多核苷酸(例如，mRNA)，其中该靶蛋白(例如，人靶蛋白)是GPCR(例如，人GPCR)。GPCR，还被称为七跨膜(7TM)结构域受体和G蛋白连接受体(GPLR)。涉及GPCR的两个主要的信号转导途径是cAMP信号途径和磷脂酰肌醇信号途径。
GPCR的类型包括A型(视紫红质样)、B型(分泌素受体家族)、C(代谢性谷氨酸/信息素)、D(真菌交配信息素受体)、E(环AMP受体)和F(卷曲受体/平滑受体)。
作为GPCR(A、B、C类，卷曲类，以及其他7种跨膜蛋白)的靶蛋白的非限制性实例包括：
ACKR1、ACKR2、ACKR3、ACKR4、ADCYAP1R1、ADGRA1、ADGRA2、ADGRA3、ADGRB1、ADGRB2、ADGRB3、ADGRD1、ADGRD2、ADGRE1、ADGRE2、ADGRE3、ADGRE4P、ADGRE5、ADGRF1、ADGRF2、ADGRF3、ADGRF4、ADGRF5、ADGRG1、ADGRG2、ADGRG3、ADGRG4、ADGRG5、ADGRG6、ADGRG7、ADGRL1、ADGRL2、ADGRL3、ADGRL4、ADGRV1、ADORA1、ADORA2A、ADORA2B、ADORA3、ADRA1A、ADRA1B、ADRA1D、ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、ADRB1、ADRB2、ADRB3、AGTR1、AGTR2、APLNR/APJ、AVPR1A、AVPR1B、AVPR2、BDKRB1、BDKRB2、BRS3、BRS3、C3AR1、C5AR1、C5AR2、CALCR、CALCRL、CASR、CCKAR、CCKBR、CCR1、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCRL2、CELSR1、CELSR2、CELSR3、CHRM1、CHRM2、CHRM3、CHRM4、CHRM5、CMKLR1、CNR1、CNR2、CRHR1、CRHR2、CX3CR1、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CYSLTR1、CYSLTR2、DRD1、DRD2、DRD3、DRD4、DRD5、EDNRA、EDNRB、F2R、F2RL1、F2RL2、F2RL3、FFAR1、FFAR2、FFAR3、FFAR4、FPR1、FPR2、FPR2、FPR3、FSHR、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、GABBR1、GABBR2、GALR1、GALR2、GALR3、GCGR、GHRHR、GHSR、GIPR、GLP1R、GLP2R、GNRHR、GNRHR2、GPBAR1、GPER1、GPR1、GPR4、GPR12、GPR15、GPR17、GPR18、GPR19、GPR20、GPR21、GPR22、GPR25、GPR26、GPR27、GPR3、GPR31、GPR32、GPR33、GPR34、GPR35、GPR37、GPR37L1、GPR39、GPR40、GPR42、GPR42、GPR45、GPR50、GPR52、GPR55、GPR6、GPR61、GPR62、GPR63、GPR65、GPR68、GPR75、GPR78、GPR79、GPR82、GPR83、GPR84、GPR85、GPR87、GPR88、GPR101、GPR107、GPR132、GPR135、GPR137、GPR139、GPR141、GPR142、GPR143、GPR146、GPR148、GPR149、GPR15、GPR150、GPR151、GPR152、GPR153、GPR156、GPR157、GPR158、GPR160、GPR161、GPR162、GPR171、GPR173、GPR174、GPR176、GPR179、GPR182、GPR183、GPRC5A、GPRC5B、GPRC5C、GPRC5D、GPRC6A、GRM1、GRM2、GRM3、GRM4、GRM5、GRM6、GRM7、GRM8、GRPR、HCAR1、HCAR2、HCAR3、HCRTR1、HCRTR2、HRH1、HRH2、HRH3、HRH4、HTR1A、HTR1B、HTR1D、HTR1E、HTR1F、HTR2A、HTR2B、HTR2C、HTR4、HTR5A、HTR5BP、HTR6、HTR7、KISS1R、LGR4、LGR5、LGR6、LHCGR、LPAR1、LPAR2、LPAR3、LPAR4、LPAR5、LPAR6、LTB4R、LTB4R2、MAS1、MAS1L、MC1R、MC2R、MC3R、MC4R、MC5R、MCHR1、MCHR2、MLNR、MRGPRD、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRG、MRGPRX1、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、MTNR1A、MTNR1B、NMBR、NMUR1、NMUR2、NPBWR1、NPBWR2、NPFFR1、NPFFR2、NPSR1、NPY1R、NPY2R、NPY4R、NPY5R、NPY6R、NTSR1、NTSR2、OPN3、OPN4、OPN5、OPRD1、OPRK1、OPRL1、OPRM1、OR51E1、OXER1、OXGR1、OXTR、P2RY1、P2RY10、P2RY11、P2RY12、P2RY13、P2RY14、P2RY2、P2RY4、P2RY6、P2RY8、PRLHR、PROKR1、PROKR2、PTAFR、PTGDR、PTGDR2、PTGER1、PTGER2、PTGER3、PTGER4、PTGFR、PTGIR、PTH1R、PTH2R、QRFPR、RXFP1、RXFP2、RXFP3、RXFP4、S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4、S1PR5、SCTR、SMO、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、SUCNR1、TAAR1、TAAR2、TAAR3、TAAR4P、TAAR5、TAAR6、TAAR8、TAAR9、TACR1、TACR2、TACR3、TAS1R1、TAS1R2、TAS1R3、TAS2R1、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R19、TAS2R20、TAS2R3、TAS2R30、TAS2R31、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R4、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R42、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R5、TAS2R50、TAS2R60、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TBXA2R、TPRA1、TRHR、TSHR、UTS2R、VIPR1、VIPR2和XCR1。
跨膜和膜相关的免疫受体：
在具体的方面，用于在本文提供的方法中使用的复合物包含脂质和编码靶蛋白的多核苷酸(例如，mRNA)，其中该靶蛋白是免疫受体，比如模式识别受体(PRR)、toll样受体(TLR)、杀伤细胞活化的和杀伤细胞抑制剂受体(KAR和KIR)、补体受体、Fc受体、B细胞受体和T细胞受体(例如，TCR-α、TCR-β、CD3、δ-链辅助因子、CD4和CD8)，以及主要组织相容性复合物。
模式识别受体(PRR)的非限制性实例包括甘露糖受体(MR)、脱唾液酸糖蛋白受体家族(例如，脱唾液酸糖蛋白受体巨噬细胞半乳糖型凝集素(MGL))、DC-SIGN(CLEC4L)、朗格汉斯蛋白(CLEC4K)、髓样DAP12-关联性凝集素(MDL)-1(CLEC5A)、树突状细胞植物血凝素1/CLEC7A、DNGR1/CLEC9A、髓样C型凝集素样受体(MICL)(CLEC12A)、CLEC2(还被称为CLEC1B)、CLEC12B、和DC免疫受体(DCIR)亚家族(例如，DCIR/CLEC4A、树突状细胞植物血凝素2/CLEC6A、血DC抗原2(BDCA2)(CLEC4C)，以及巨噬细胞诱导的C型凝集素(CLEC4E))。
在具体的方面，用于在本文提供的方法中使用的复合物包含脂质和编码靶蛋白的多核苷酸(例如，mRNA)，其中该靶蛋白是toll样受体(TLR)。TLR是一类在先天免疫系统中起关键作用的蛋白质。它们是单一的、跨膜的、非催化性受体，通常在细胞(比如巨噬细胞和树突细胞)中表达，这些受体识别源自微生物的结构上保守的分子，并激活免疫细胞应答。TLR的非限制性实例包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13。
Fc受体(例如，Fc-γ受体、Fc-α受体和Fc-ε受体)的非限制性实例包括聚免疫球蛋白受体(pIgR)、FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB1(CD32)、FcγRIIB2(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)、FcεRI、FcεRII(CD23)、FcαR1(CD89)、Fcα/μR和FcRn。
在具体的方面，用于在本文提供的方法中使用的复合物包含脂质和编码靶蛋白的多核苷酸(例如，mRNA)，其中该靶蛋白是选自以下的免疫受体：CD27、CD40、OX40、GITR、CD137、PD-1、CTLA-4、PD-L1、TIGIT、T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(TIM3)、T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、CD28、CD122、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、和淋巴细胞活化基因-3(LAG3)。
在具体的方面，用于在本文提供的方法中使用的复合物包含脂质和编码靶蛋白的多核苷酸(例如，mRNA)，其中该靶蛋白是主要组织相容性复合物I或II(MHC I或II)的一部分或与肽片段复合的MHC。MHC蛋白是获得性免疫系统的一部分，并且在将加工的肽片段呈递给T细胞并引发体液免疫系统激活中起作用。MHC蛋白的非限制性实例包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA和HLA-DRB1。
细胞因子受体：
在具体的方面，用于在本文提供的方法中使用的复合物包含脂质和编码靶蛋白的多核苷酸(例如，mRNA)，其中该靶蛋白是细胞因子受体(例如，白细胞介素(IL)受体或成纤维细胞生长因子(FGF)受体)。细胞因子受体的非限制性实例包括以下的受体：神经生长因子(NGF)、肌生成抑制素(GDF-8)、生长分化因子(GDF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、血小板源生长因子(PDGF)、红细胞生成素(EPO)、促血小板生成素(TPO)、表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、组织抑制剂或金属蛋白酶(TIMP)、基质金属蛋白酶(MMP)、巨噬细胞刺激因子(MSF)、睫状神经营养因子(CNTF)、心肌营养素、制瘤素M、白血病抑制因子(LIF)、转变生长因子(TGF)-α和-β、干扰素(IFN)-β和-γ，以及肿瘤坏死因子(TNF)α。在具体的实施例中，用于在本文提供的方法中使用的复合物包含脂质和编码靶蛋白的多核苷酸(例如，mRNA)，其中该靶蛋白是gp130，其是由若干相关的细胞因子(包括IL-6、IL-11、IL-27、白血病抑制因子(LIF)、制瘤素M(OSM)、睫状神经营养因子(CNTF)、心肌营养素1(CT-1)和心肌营养素样细胞因子(CLC))利用的共有受体。
在具体的方面，用于在本文提供的方法中使用的复合物包含脂质和编码靶蛋白的多核苷酸(例如，mRNA)，其中该靶蛋白是白细胞介素(IL)受体。IL受体的非限制性实例包括IL-1受体、IL-2受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-5受体、IL-6受体、IL-7受体、IL-8受体、IL-9受体、IL-10受体、IL-11受体、IL-12受体、IL-13受体、IL-14受体、IL-15受体、IL-16受体、IL-17受体、IL-18受体、IL-19受体、IL-20受体、IL-21受体、IL-22受体、IL-23受体、IL-24受体、IL-25受体、IL-26受体、IL-27受体、IL-28受体、IL-29受体、IL-30受体、IL-31受体、IL-32受体、IL-33受体、IL-35受体、和IL-36受体。
在具体的方面，用于在本文提供的方法中使用的复合物包含脂质和编码靶蛋白的多核苷酸(例如，mRNA)，其中该靶蛋白是成纤维细胞生长因子(FGF)受体(FGFR)。FGF受体的非限制性实例包括FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4。
在具体的方面，用于在本文提供的方法中使用的复合物包含脂质和编码靶蛋白的多核苷酸(例如，mRNA)，其中该靶蛋白是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)。TNFRSF成员的非限制性实例包括TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF3、TNFRSF4、TNFRSF5、TNFRSF6、TNFRSF6B、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF10C、TNFRSF10D、TNFRSF11A、TNFRSF11B、TNFRSF12A、TNFRSF13B、TNFRSF13C、TNFRSF14、TNFRSF16、TNFRSF17、TNFRSF18、TNFRSF19、TNFRSF21、TNFRSF25、和TNFRSF27。
离子通道：
在具体的方面，用于在本文提供的方法中使用的复合物包含脂质和编码靶蛋白的多核苷酸(例如，mRNA)，其中该靶蛋白是离子通道。
存在超过300种类型的离子通道，并且可以根据它们的门控性质、通过这些门的离子种类、门(孔)的数量以及蛋白质的定位来分类。例如，电压门控性离子通道包括但不限于电压门控性钠通道、电压门控性钙通道、电压门控性钾通道(Kv)、超极化激活的环核苷酸门控性通道、电压门控性质子通道。配体门控性离子通道包括但不限于阳离子可透过性“烟碱”乙酰胆碱受体、离子移变型谷氨酸门控性受体和ATP门控性P2X受体，以及阴离子可透过性-γ-氨基丁酸门控性GABA受体。通过离子类型的离子通道分类包括但不限于氯通道、钾通道(例如，ATP敏感性钾离子通道)、钠通道(例如，NaV、ENaC、CaV)、钙通道、质子通道和非选择性阳离子通道。
电压门控性钠通道的非限制性实例包括SCN1A、SCN1B、SCN2A、SCN2B、SCN3A、SCN3B、SCN4A、SCN5A、SCN7A、SCN8A、SCN9A、SCN10A和SCN11A。
电压门控性钙通道的非限制性实例包括CACNA1A、CACNA1B、CACNA1C、CACNA1D、CACNA1E、CACNA1F、CACNA1G、CACNA1H、CACNA1I和CACNA1S。
瞬时受体电位阳离子通道的非限制性实例包括TRPA1、TRPC1、TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6、TRPC7、TRPM1、TRPM2、TRPM3、TRPM4、TRPM5、TRPM6、TRPM7、TRPM8、MCOLN1、MCOLN2、MCOLN3、PKD1、PKD2、PKD2L1、PKD2L2、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPV5和TRPV6。
CatSper通道的非限制性实例包括CATSPER1、CATSPER2、CATSPER3和CATSPER4。
两孔通道的非限制性实例包括TPCN1和TPCN2。
环核苷酸调节的通道的非限制性实例包括CNGA1、CNGA2、CNGA3、CNGA4、CNGB1、CNGB3、HCN1、HCN2、HCN3和HCN4。
钙活化的钾通道的非限制性实例包括KCNMA1、KCNN1、KCNN2、KCNN3、KCNN4、KCNT1、KCNT2和KCNU1。
电压门控性钾通道的非限制性实例包括KCNA1、KCNA2、KCNA3、KCNA4、KCNA5、KCNA6、KCNA7、KCNA10、KCNB1、KCNB2、KCNC1、KCNC2、KCNC3、KCNC4、KCND1、KCND2、KCND3、KCNF1、KCNG1、KCNG2、KCNG3、KCNG4、KCNH1、KCNH2、KCNH3、KCNH4、KCNH5、KCNH6、KCNH7、KCNH8、KCNQ1、KCNQ2、KCNQ3、KCNQ4、KCNQ5、KCNS1、KCNS2、KCNS3、KCNV1和KCNV2。
内向整流钾通道的非限制性实例包括KCNJ1、KCNJ2、KCNJ3、KCNJ4、KCNJ5、KCNJ6、KCNJ8、KCNJ9、KCNJ10、KCNJ11、KCNJ12、KCNJ13、KCNJ14、KCNJ15、KCNJ16和KCNJ18。
二-P钾通道的非限制性实例包括KCNK1、KCNK2、KCNK3、KCNK4、KCNK5、KCNK6、KCNK7、KCNK9、KCNK10、KCNK12、KCNK13、KCNK15、KCNK16、KCNK17和KCNK18。
氢电压门控性离子通道的非限制性实例包括HVCN1。
离子移变型5-HT(血清素)受体的非限制性实例包括HTR3A、HTR3B、HTR3C、HTR3D和HTR3E。
烟碱乙酰胆碱受体的非限制性实例包括CHRNA1、CHRNA2、CHRNA3、CHRNA4、CHRNA5、CHRNA6、CHRNA7、CHRNA9、CHRNA10、CHRNB1、CHRNB2、CHRNB3、CHRNB4、CHRND、CHRNE和CHRNG。
GABA(A)受体的非限制性实例包括GABRA1、GABRA2、GABRA3、GABRA4、GABRA5、GABRA6、GABRB1、GABRB2、GABRB3、GABRD、GABRE、GABRG1、GABRG2、GABRG3、GABRP、GABRQ、GABRR1、GABRR2和GABRR3。
离子移变型谷氨酸受体的非限制性实例包括GRIA1、GRIA2、GRIA3、GRIA4、GRID1、GRID2、GRIK1、GRIK2、GRIK3、GRIK4、GRIK5、GRIN1、GRIN2A、GRIN2B、GRIN2C、GRIN2D、GRIN3A和GRIN3B。
甘氨酸受体的非限制性实例包括GLRA1、GLRA2、GLRA3和GLRA4
离子移变型嘌呤受体的非限制性实例包括P2RX1、P2RX2、P2RX3、P2RX4、P2RX5、P2RX6和P2RX7。
锌活化的通道的非限制性实例包括ZACN。
酸感受性(质子门控性)离子通道的非限制性实例包括ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4。
水通道蛋白的非限制性实例包括AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、AQP6、AQP7、AQP8、AQP9、AQP10、AQP11、AQP12A、AQP12B和MIP。
电压敏感性氯通道的非限制性实例包括CLCN1、CLCN2、CLCN3、CLCN4、CLCN5、CLCN6、CLCN7、CLCNKA和CLCNKB。
囊性纤维化跨膜传导调节蛋白的非限制性实例包括CFTR。
钙激活的氯通道(CaCC)的非限制性实例包括ANO1、ANO2、ANO3、ANO4、ANO5、ANO6、ANO7、ANO8、ANO9、ANO10、BEST1、BEST2、BEST3和BEST4。
胞内氯通道的非限制性实例包括CLIC1、CLIC2、CLIC3、CLIC4、CLIC5和CLIC6。
间隙连接蛋白(连接蛋白)的非限制性实例包括GJA1、GJA3、GJA4、GJA5、GJA6P、GJA8、GJA9、GJA10、GJB1、GJB2、GJB3、GJB4、GJB5、GJB6、GJB7、GJC1、GJC2、GJC3、GJD2、GJD3、GJD4和GJE1。
IP3受体的非限制性实例包括ITPR1、ITPR2和ITPR3。
Pannexins的非限制性实例包括PANX1、PANX2和PANX3。
兰尼碱受体的非限制性实例包括RYR1、RYR2和RYR3。
非选择性钠泄露通道的非限制性实例包括NALCN。
非电压门控性钠通道的限制性实例包括SCNN1A、SCNN1B、SCNN1D和SCNN1G。
溶质载体蛋白：
在具体的方面，用于在本文提供的方法中使用的复合物包含脂质和编码靶蛋白的多核苷酸(例如，mRNA)，其中该靶蛋白是溶质载体。溶质载体蛋白是膜内在蛋白质，其特征在于它们能够将溶质从脂质膜的一侧输送到另一侧。这组蛋白质包括使溶质在逆电化学梯度上易位的二级活性转运蛋白，以及使溶质在其电化学梯度方向上易位的易化扩散转运蛋白。溶质载体分为52个家族，涵盖300多种蛋白质。52个家族和其非限制性实例成员如下所示：
(1)高亲和力谷氨酸和中性氨基酸转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC1A1、SLC1A2、SLC1A3、SLC1A4、SLC1A5、SLC1A6和SLC1A7；
(2)易化扩散葡萄糖(GLUT)转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC2A1、SLC2A2、SLC2A3、SLC2A4、SLC2A5、SLC2A6、SLC2A7、SLC2A8、SLC2A9、SLC2A10、SLC2A11、SLC2A12、SLC2A13和SLC2A14；
(3)异二聚体氨基酸家族的重亚基，非限制性实例包括：SLC3A1和SLC3A2；
(4)碳酸氢盐家族。实例包括：SLC4A1、SLC4A2、SLC4A3、SLC4A4、SLC4A5、SLC4A6、SLC4A7、SLC4A8、SLC4A9、SLC4A10和SLC4A11；
(5)钠葡萄糖共转运蛋白家族。实例包括：SLC5A1、SLC5A2、SLC5A3、SLC5A4、SLC5A5、SLC5A6、SLC5A7、SLC5A8、SLC5A9、SLC5A10、SLC5A11和SLC5A12；
(6)钠和氯依赖性钠:神经递质同向转运体家族。实例包括：SLC6A1、SLC6A2、SLC6A3、SLC6A4、SLC6A5、SLC6A6、SLC6A7、SLC6A8、SLC6A9、SLC6A10、SLC6A11、SLC6A12、SLC6A13、SLC6A14、SLC6A15、SLC6A16、SLC6A17、SLC6A18、SLC6A19和SLC6A20；
(7)阳离子氨基酸转运蛋白/糖蛋白相关的家族，非限制性实例包括：(i)阳离子氨基酸转运蛋白(SLC7A1、SLC7A2、SLC7A3、SLC7A4)和(ii)糖蛋白相关的/异二聚体氨基酸转运蛋白的轻或催化亚基(SLC7A5、SLC7A6、SLC7A7、SLC7A8、SLC7A9、SLC7A10、SLC7A11、SLC7A13、SLC7A14)；
(8)Na+/Ca2+交换剂家族，非限制性实例包括：SLC8A1、SLC8A2和SLC8A3；
(9)Na+/H+交换剂家族，非限制性实例包括：SLC9A1、SLC9A2、SLC9A3、SLC9A4、SLC9A5、SLC9A6、SLC9A7、SLC9A8、SLC9A9、SLC9A10、SLC9A11、SLC9B1和SLC9B2；
(10)胆汁钠盐共转运家族，非限制性实例包括：SLC10A1、SLC10A2、SLC10A3、SLC10A4、SLC10A5、SLC10A6和SLC10A7；
(11)质子偶联的金属离子转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC11A1和SLC11A2；
(12)电中性阳离子-Cl共转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC12A1、SLC12A1、SLC12A2、SLC12A3、SLC12A4、SLC12A5、SLC12A6、SLC12A7、SLC12A8和SLC12A9；
(13)Na+-SO42-/羧酸盐共转运蛋白家族；非限制性实例包括：SLC13A1、SLC13A2、SLC13A3、SLC13A4和SLC13A5；
(14)尿素转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC14A1和SLC14A2；
(15)质子寡肽共转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4；
(16)单羧酸盐转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC16A1、SLC16A2、SLC16A3、SLC16A4、SLC16A5、SLC16A6、SLC16A7、SLC16A8、SLC16A9、SLC16A10、SLC16A11、SLC16A12、SLC16A13和SLC16A14；
(17)囊泡谷氨酸转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC17A1、SLC17A2、SLC17A3、SLC17A4、SLC17A5、SLC17A6、SLC17A7、SLC17A8和SLC17A9；
(18)囊泡胺转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC18A1、SLC18A2和SLC18A3；
(19)叶酸盐/硫胺素转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC19A1、SLC19A2和SLC19A3；
(20)III型Na+-磷酸盐共转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC20A1和SLC20A2；
(21)有机阴离子转运蛋白家族；非限制性实例包括：(i)亚家族1，SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B3和SLCO1C1；(ii)亚家族2，SLCO2A1和SLCO2B1；(iii)亚家族3，SLCO3A1；(iv)亚家族4，SLCO4A1、SLCO4C1；(v)亚家族5，SLCO5A1；和(vi)亚家族6，SLCO6A1；
(22)有机阳离子/阴离子/两性离子转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC22A1、SLC22A2、SLC22A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC22A6、SLC22A7、SLC22A8、SLC22A9、SLC22A10、SLC22A11、SLC22A12、SLC22A13、SLC22A14、SLC22A15、SLC22A16、SLC22A17、SLC22A18、SLC22A18AS,SLC22A19、SLC22A20、SLC22A23、SLC22A24、SLC22A25和SLC22A31。
(23)Na+依赖性抗坏血酸转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC23A1、SLC23A2、SLC23A3和SLC23A4。
(24)Na+/(Ca2+-K+)交换剂家族，非限制性实例包括：SLC24A1、SLC24A2、SLC24A3、SLC24A4、SLC24A5和SLC24A6；
(25)线粒体载体家族，非限制性实例包括：SLC25A1、SLC25A2、SLC25A3、SLC25A4、SLC25A5、SLC25A6、SLC25A7、SLC25A8、SLC25A9、SLC25A10、SLC25A11、SLC25A12、SLC25A13、SLC25A14、SLC25A15、SLC25A16、SLC25A17、SLC25A18、SLC25A19,SLC25A20、SLC25A21、SLC25A22、SLC25A23、SLC25A24、SLC25A25、SLC25A26、SLC25A27、SLC25A28、SLC25A29、SLC25A30、SLC25A31、SLC25A32、SLC25A33、SLC25A34、SLC25A35、SLC25A36、SLC25A37,SLC25A38、SLC25A39、SLC25A40、SLC25A41、SLC25A42、SLC25A43、SLC25A44、SLC25A45和SLC25A46；
(26)多功能阴离子交换剂家族，非限制性实例包括：SLC26A1、SLC26A2、SLC26A3、SLC26A4、SLC26A5、SLC26A6、SLC26A7、SLC26A8、SLC26A9、SLC26A10和SLC26A11；
(27)脂肪酸转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC27A1、SLC27A2、SLC27A3、SLC27A4、SLC27A5和SLC27A6；
(28)Na+偶联的核苷转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC28A1、SLC28A2和SLC28A3；
(29)易化扩散核苷转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC29A1、SLC29A2、SLC29A3和SLC29A4；
(30)锌外排家族，非限制性实例包括：SLC30A1、SLC30A2、SLC30A3、SLC30A4、SLC30A5、SLC30A6、SLC30A7、SLC30A8、SLC30A9和SLC30A10；
(31)铜转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC31A1和SLC31A2；
(32)囊泡抑制性氨基酸转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC32A1。
(33)乙酰辅酶A转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC33A1；
(34)II型Na+磷酸盐共转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC34A1、SLC34A2和SLC34A3；
(35)核苷-糖转运蛋白家族，非限制性实例包括：(i)亚家族A，SLC35A1、SLC35A2、SLC35A3、SLC35A4、SLC35A5；(ii)亚家族B，SLC35B1、SLC35B2、SLC35B3、SLC35B4；(iii)亚家族C，SLC35C1、SLC35C2；(iv)亚家族D，SLC35D1、SLC35D2、SLC35D3；(v)亚家族E，SLC35E1、SLC35E2、SLC35E3、SLC35E4；(vi)亚家族F，SLC35F1、SLC35F2、SLC35F3、SLC35F4、SLC35F5；(vii)亚家族G，SLC35G1、SLC35G3、SLC35G4、SLC35G5、SLC35G6；
(36)质子偶联的氨基酸转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC36A1、SLC36A2、SLC36A3和SLC36A4；
(37)糖-磷酸盐/磷酸盐交换剂家族，非限制性实例包括：SLC37A1、SLC37A2、SLC37A3和SLC37A4；
(38)系统A&N，钠偶联的中性氨基酸转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC38A1、SLC38A2、SLC38A3、SLC38A4、SLC38A5、SLC38A6、SLC38A7、SLC38A8、SLC38A9、SLC38A10和SLC38A11；
(39)金属离子转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC39A1、SLC39A2、SLC39A3、SLC39A4、SLC39A5、SLC39A6、SLC39A7、SLC39A8、SLC39A9、SLC39A10、SLC39A11、SLC39A12、SLC39A13和SLC39A14；
(40)基底外侧离子转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC40A1；
(41)MgtE样镁转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC41A1、SLC41A2和SLC41A3；
(42)氨转运蛋白家族，非限制性实例包括：RhAG、RhBG和RhCG；
(43)Na+独立的、系统L样氨基酸转运蛋白家族；非限制性实例包括：SLC43A1、SLC43A2和SLC43A3；
(44)胆碱样转运蛋白家族；非限制性实例包括：SLC44A1、SLC44A2、SLC44A3、SLC44A4和SLC44A5；
(45)推定的糖转运蛋白家族，非限制性实例包括：SLC45A1、SLC45A2、SLC45A3和SLC45A4；
(46)叶酸盐转运蛋白家族；非限制性实例包括：SLC46A1、SLC46A2和SLC46A3；
(47)多药和毒素挤出家族；非限制性实例包括：SLC47A1和SLC47A2；
(48)血红素转运蛋白家族，非限制性实例包括：HCP-1；
(49)主要协助超家族转运蛋白，非限制性实例包括MFSD5和MFSD10；
(50)SWEET家族的糖外排转运蛋白，非限制性实例包括SLC50A1；
(51)类固醇衍生分子的转运蛋白，非限制性实例包括OSTα和OSTβ；
(52)核黄素转运蛋白家族RFVT/SLC52，非限制性实例包括SLC52A1、SLC52A2和SLC52A3。
难以表达靶蛋白：
在具体的方面，用于产生抗体的常规方法，例如用经纯化的重组蛋白免疫动物，对于难以表达的靶蛋白可能是无效的。许多因素可能导致表达问题，例如宿主产生细胞中的细胞毒性，固有的不良生物物理特性(例如，尺寸、溶解度、构象，禁止过表达/纯化的蛋白质翻译后修饰(比如，糖基化)。
难以表达的蛋白质特征的非限制性实例包括但不限于大蛋白质(例如，分子量≥150kDa的蛋白质)、跨膜蛋白质、具有不寻常的翻译后修饰的蛋白质或溶解度差的蛋白质、不稳定的蛋白质、不含信号肽的分泌蛋白质、膜相关的蛋白质、本质上无序的蛋白质和半衰期短的蛋白质。
用于在本文提供的方法中使用的难以表达靶蛋白(比如可溶性靶蛋白)的非限制性实例包括：ADAMTS7、ANGPTL3、ANGPTL4、ANGPTL8、LPL、GDF15、半乳凝素-1、半乳凝素-2、半乳凝素-3、基质gla蛋白(MGP)、PRNP、DGAT1、GPAT3、DMC1、BLM和BRCA2。
可以使用本领域中描述的方法评估难以表达的蛋白质的特征，例如，溶解度测定(例如，动态光散射，液相色谱质谱)、稳定性测定(例如，差示扫描荧光测定、差示扫描量热法、圆二色谱)、NMR和色谱。在某些方面，难以表达的蛋白质可能更易于聚集(例如，至少5％聚集、或至少10％聚集、或至少20％聚集、或至少30％聚集、或至少40％聚集、或至少50％聚集、或至少60％聚集)，例如，当在室温或4℃下在溶液中保持超过一周、超过几周、超过一月、超过几个月(例如，3个月、4个月或5个月)，或超过6个月或1年。
在特定的方面，难以表达的蛋白质具有正电荷。在某些方面，难以表达的蛋白质具有负电荷。在某些方面，难以表达的蛋白质是疏水的。
在某些方面，难以表达的蛋白质具有短的半衰期，例如，小于24小时、小于20小时、小于15小时、小于12小时、小于10小时、小于8小时、小于6小时、小于4小时、小于2小时或小于1小时的半衰期。
在某些实施例中，本文所述的靶蛋白包括带正电荷的蛋白质、带负电荷的蛋白质、疏水蛋白质和糖蛋白。
在某些实施例中，本文所述的靶蛋白包括酶，比如分泌的和膜相关的酶。
II.阳离子脂质体
现有技术中已知的任何阳离子脂质均可用于本发明的实践中。参见，例如，Felgner等人.(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]84:7413-7417(1987))；Felgner等人.(Focus[焦点]11:21-25(1989))；Felgner(“用LipofectinTM试剂的阳离子脂质体-介导的转染(Cationic Liposome-Mediated Transfection with)”，在GeneTransfer and Expression Protocols[基因转移和表达方案]第7卷,Murray,E.J.,编辑.,胡马纳出版社(Humana Press)，新泽西，第81-89页(1991)中)；WO 91/17424；WO 91/16024；美国专利号4,897,355；美国专利号4,946,787；美国专利号5,049,386；美国专利号5,208,036；Behr等人.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:6982-6986(1989)；EPO公开0 394 111)；Gao等人.(Biochim.Biophys.Res.Comm.[生物化学与生物物理学研究通讯]179:280-285(1991))；Zhou等人.,(Biochim.Biophys.Res.Comm.[生物化学与生物物理学研究通讯]165:8-14(1991))；和Gebeychu等人.(共同拥有美国申请序列号07/937,508；于1992年8月28日提交)，这些内容通过引用完全结合在此。
可以在本文提供的方法和组合物中使用的脂质(例如，阳离子脂质、中性脂质、辅助脂质和隐形脂质)的其他非限制性实例包括在WO 2016/037053、WO 2016/010840、WO2015/095346、WO 2015/095340、WO 2016/037053、WO 2014/136086和WO2011/076807中描述的那些，其各自通过引用以其全部内容并于本文中。在具体的方面，适用于本文所述方法的阳离子脂质包括具有以下化学结构的脂质A、脂质B和脂质C(详细描述于在WO 2015/095346和WO 2015/095340中)：
脂质A的化学结构：
脂质B的化学结构
脂质C的化学结构
在某些方面，用于本文所述的组合物和方法的阳离子脂质包括但不限于N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)、N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1,2-二油酰基氨甲酰基-3-二甲基铵-丙烷(DOCDAP)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DLINDAP)、二月桂基(C12:0)三甲基铵丙烷(DLTAP)、二-十八烷基氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、DC-Chol、二油酰基氧基-N-[2-精胺甲酰胺基)乙基}-N,N-二甲基-1-丙烷三氟乙酸铵(DOSPA)、1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺,顺-9,12-十八碳二烯酰氧基)丙烷(CLinDMA)、N,N-二甲基-2,3-二油烯基氧基)丙胺(DODMA)、2-[5’-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)-3’-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺,顺-9’,12’-十八碳二烯酰氧基)丙烷(CpLinDMA)和N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄基胺(DMOBA)，以及1,2-N,N’-二油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)。在一个实施例中，用于本文提供的组合物和方法的阳离子脂质是DOTAP或DLTAP。
在具体的实施例中，用于本文所述的组合物和方法的阳离子脂质包括N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)。使用标准技术可以将DOTMA单独地或按与二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)1:1的组合配制成脂质体。DOTMA:DOPE(1:1)配制品在名称LIPOFECTINTM(GIBCO/BRL:Life Technologies,Inc.(生命技术公司)，盖瑟斯堡，马里兰州)下被售卖。在特定的实施例中，可商购的阳离子脂质是1,2-双(油酰基氧基)-3-3-(三甲基胺)丙烷(DOTAP)，该脂质与DOTMA的不同之处在于油酰基部分通过酯键而非醚键与丙胺连接。
在特定的实施例中，用于本文所述的组合物和方法的阳离子脂质的相关基团与DOTMA和DOTAP的不同之处在于三甲铵基团的一个甲基被羟乙基基团取代。此类型的化合物类似于磷脂酶A的罗森塔尔抑制剂(Rosenthal Inhibitor)(Rosenthal等人，同上)，该抑制剂具有与丙胺核连接的硬脂酰酯。罗森塔尔抑制剂(RI)的二油酰基类似物通常缩写为DORI-醚和DORI-酯，这取决于脂肪酸部分与丙胺核的连接。羟基基团可用作进一步官能化的位点，例如，通过酯化成羧基精胺。
在某些实施例中，用于本文所述的组合物和方法的另一类阳离子脂质包括已经与两种类型的脂质缀合的羧基精胺，产生5-羧基精胺基甘氨酸双十八烷基酰胺(DOGS)。DOGS作为TRANSFECTAMTM(普洛麦格公司(Promega)，麦迪逊，威斯康星州)是可商购的。
另一类已知的化合物已经由Behr等人.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:6982-6986(1989)；EPO公开0 394 111)进行了描述，其中羧基精胺已经与两种类型的脂质缀合，产生二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺基酰胺(DDPES)。
在具体的方面，用于本文所述的组合物和方法的另一种阳离子脂质是胆固醇衍生物(DC-Chol)，该胆固醇衍生物已经被合成并配制成与DOPE组合的脂质体。在另一个具体的实施例中，用于本文所述的组合物和方法的阳离子脂质是脂质聚赖氨酸，该脂质聚赖氨酸通过将聚赖氨酸与DOPE缀合而形成。
用于本文提供的组合物和方法的阳离子脂质的另外的非限制性实例包括以下，以及在WO 2015/095346中描述的那些：
2-(10-十二烷基-3-乙基-8,14-二氧代-7,9,13-三氧杂-3-氮杂十八烷-18-基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
2-(9-十二烷基-2-甲基-7,13-二氧代-6,8,12-三氧杂-2-氮杂十七烷-17-基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
2-(9-十二烷基-2-甲基-7,13-二氧代-6,8,12-三氧杂-2-氮杂十五烷-15-基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
2-(10-十二烷基-3-乙基-8,14-二氧代-7,9,13-三氧杂-3-氮杂十六烷-16-基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
2-(8-十二烷基-2-甲基-6,12-二氧代-5,7,11-三氧杂-2-氮杂十七烷-17-基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
2-(10-十二烷基-3-乙基-8,14-二氧代-7,9,13-三氧杂-3-氮杂十九烷-19-基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
2-(9-十二烷基-2-甲基-7,13-二氧代-6,8,12-三氧杂-2-氮杂十八烷-18-基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
2-(8-十二烷基-2-甲基-6,12-二氧代-5,7,11-三氧杂-2-氮杂十八烷-18-基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
2-(10-十二烷基-3-乙基-8,14-二氧代-7,9,13-三氧杂-3-氮杂二十烷-20-基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
2-(9-十二烷基-2-甲基-7,13-二氧代-6,8,12-三氧杂-2-氮杂十九烷-19-基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基4,4-双(辛氧基)丁酸酯；
3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基4,4-双((2-乙基己基)氧基)丁酸酯；3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基4,4-双((2-丙基戊基)氧基)丁酸酯；3-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基4,4-双((2-丙基戊基)氧基)丁酸酯；
3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基4,4-双((2-丙基戊基)氧基)丁酸酯；3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基6,6-双(辛氧基)己酸酯；
3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基6,6-双(己基氧基)己酸酯；
3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基6,6-双((2-乙基己基)氧基)己酸酯；3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基8,8-双(己基氧基)辛酸酯；
3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基8,8-二丁氧基辛酸酯；
3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基8,8-双((2-丙基戊基)氧基)辛酸酯；3-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基8,8-双((2-丙基戊基)氧基)辛酸酯；
3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基8,8-双((2-丙基戊基)氧基)辛酸酯；3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基3-辛基十一烷酸酯；
3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基3-辛基十一碳-2-烯酸酯；
3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基7-己基十三碳-6-烯酸酯；
3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基9-戊基十四烷酸酯；
3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基9-戊基十四碳-8-烯酸酯；
3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基5-庚基十二烷酸酯；
3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十三烷基5-庚基十二烷酸酯；
3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十一烷基5-庚基十二烷酸酯；
1,3-双(辛酰基氧基)丙烷-2-基(3-(((2-(二甲基氨基)乙氧基)羰基)氧基)十五烷基)琥珀酸酯；
1,3-双(辛酰基氧基)丙烷-2-基(3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基)琥珀酸酯；
1-(3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基)10-辛基癸二酸酯；
1-(3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基)10-辛基癸二酸酯；
1-(3-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基)10-辛基癸二酸酯；
1-(3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基)10-(2-乙基己基)癸二酸酯；
1-(3-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基)10-(2-乙基己基)癸二酸酯；
3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基10-(辛酰基氧基)癸酸酯；
8-十二烷基-2-甲基-6,12-二氧代-5,7,11-三氧杂-2-氮杂十九烷-19-基癸酸酯；
3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基10-(辛酰基氧基)癸酸酯；
3-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基10-(辛酰基氧基)癸酸酯；
(9Z,12Z)-3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基十八-9,12-二烯酸乙酯；(9Z,12Z)-3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基十八-9,12-二烯酸乙酯；
(9Z,12Z)-3-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基十八-9,12-二烯酸乙酯；(9Z,12Z)-3-(((2-(二甲基氨基)乙氧基)羰基)氧基)十五烷基十八-9,12-二烯酸乙酯；
1-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酰氧基)十五烷-3-基1,4-二甲基哌啶-4-甲酸酯；
2-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十四基4,4-双((2-乙基己基)氧基)丁酸酯；(9Z,12Z)-(12Z,15Z)-3-((3-(二甲基氨基)丙酰基)氧基)二十一烷-12,15-二烯-1-基十八-9,12-二烯酸乙酯；
(12Z,15Z)-3-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)二十一烷-12,15-二烯-1-基3-辛基十一烷酸酯；(12Z,15Z)-3-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)二十一烷-12,15-二烯-1-基5-庚基十二烷酸酯；(12Z,15Z)-3-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)二十一烷-12,15-二烯-1-基7-己基十三烷酸酯；(12Z,15Z)-3-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)二十一烷-12,15-二烯-1-基9-戊基十四烷酸酯；(12Z,15Z)-1-((((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基)羰基)氧基)二十一烷-12,15-二烯-3-基3-(二甲基氨基)丙酸酯；
(13Z,16Z)-4-(((2-(二甲基氨基)乙氧基)羰基)氧基)二十二碳-13,16-二烯-1-基2,2-双(庚氧基)乙酸酯；
(13Z,16Z)-4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)二十二碳-13,16-二烯-1-基2,2-双(庚氧基)乙酸酯；
2,2-双(庚氧基)乙基3-((3-乙基-10-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)-8,15-二氧代-7,9,14-三氧杂-3-氮杂十七烷-17-基)二磺酰基)丙酸酯；
(13Z,16Z)-4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)二十二碳-13,16-二烯-1-基十七烷-9-基琥珀酸酯；
(9Z,12Z)-2-(((11Z,14Z)-2-((3-(二甲基氨基)丙酰基)氧基)二十-11,14-二烯-1-基)氧基)乙基十八-9,12-二烯酸乙酯；
(9Z,12Z)-3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰基氧基)十三烷基十八-9,12-二烯酸乙酯；
3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰基氧基)十三烷基3-辛基十一烷酸酯；3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-羟基十三烷基5-庚基十二烷酸酯；
3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰基氧基)十三烷基5-庚基十二烷酸酯；3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰基氧基)十三烷基7-己基三癸酸酯；3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-羟基十三烷基9-戊基十四烷酸酯；
3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰基氧基)十三烷基9-戊基十四烷酸酯；
1-(3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰基氧基)十三烷基)10-辛基癸二酸酯；
3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰基氧基)十三烷基10-(辛酰基氧基)癸酸酯；
(9Z,12Z)-3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-5-辛基十三烷基十八-9,12-二烯酸乙酯；
3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-5-辛基十三烷基癸酸酯；
5-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-7-辛基十五烷基辛酸酯；
(9Z,12Z)-5-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-7-辛基十五烷基十八-9,12-二烯酸乙酯；
9-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-11-辛基十九基辛酸酯；
9-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-11-辛基十九基癸酸酯；
(9Z,12Z)-9-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十九基十八-9,12-二烯酸乙酯；9-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十九基己酸酯；
9-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十九基3-辛基十一烷酸酯；
9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十九基己酸酯；
9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十九基3-辛基十一烷酸酯；
(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基双(十八-9,12-二烯酸乙酯)；
(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基双(十八-9,12-二烯酸乙酯)；
(9Z,9'Z,12Z,12'Z,15Z,15'Z)-2-((4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基双(十八-9,12,15-三烯酸酯)；
(Z)-2-((4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基二油酸酯；
2-((4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基二-十四烷酸酯；
2-((4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基二-十四烷酸酯；
2-((4-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基二-十四烷酸酯；
2-((4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基二-十二烷酸酯；
2-((4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基二-十二烷酸酯；
2-((4-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基二-十二烷酸酯；
2-((4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基双(癸酸酯)；
2-((4-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基双(癸酸酯)；
2-((4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
2-((4-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
2-(((13Z,16Z)-4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)二十二碳-13,16-二烯酰基)氧基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
2-(((13Z,16Z)-4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)二十二碳-13,16-二烯酰基)氧基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((2-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十四酰基)氧基)丙烷-1,3-二基双(十八-9,12-二烯酸乙酯)；
(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((2-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基双(十八-9,12-二烯酸乙酯)；
(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((2-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十四酰基)氧基)丙烷-1.3-二基双(十八-9,12-二烯酸乙酯)；
(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((2-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基双(十八-9,12-二烯酸乙酯)；
2-((2-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十四酰基)氧基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
4.4-双(辛氧基)丁基4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酸酯；
4,4-双(辛氧基)丁基2-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十二烷酸酯；
(9Z,12Z)-10-十二烷基-3-乙基-14-(2-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酰氧基)乙基)-8,13-二氧代-7,9-二氧杂-3,14-二氮杂十六烷-16-基十八-9,12-二烯酸乙酯；
2-((4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-11-(辛酰基氧基)十一酰基)氧基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(9-十二烷基-2-甲基-7,12-二氧代-6,8,13-三氧杂-2-氮杂十四烷-14-基)丙烷-1,3-二基双(十八-9,12-二烯酸乙酯)；
3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基4,4-双(辛氧基)丁酸酯；
3-(((3-(哌啶-1-基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基6,6-双(辛氧基)己酸酯；
3-(((3-(哌嗪-1-基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基6,6-双(辛氧基)己酸酯；
3-(((4-(二乙基氨基)丁氧基)羰基)氧基)十五烷基6,6-双(辛氧基)己酸酯；
3-(((3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基6,6-双(辛氧基)己酸酯；3-((((1-甲基哌啶-4-基)甲氧基)羰基)氧基)十五烷基6,6-双(辛氧基)己酸酯；3-(((3-吗啉代丙氧基)羰基)氧基)十五烷基6,6-双(辛氧基)己酸酯；
3-(((2-(二乙基氨基)乙氧基)羰基)氧基)十五烷基6,6-双(辛氧基)己酸酯；
3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基6,6-双(辛氧基)己酸酯；
3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基6,6-双((2-丙基戊基)氧基)己酸酯；3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基6,6-双((2-丙基戊基)氧基)己酸酯LXR420:3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基6,6-双((3-乙基戊基)氧基)己酸酯；
(2R)-1-((6,6-双(辛氧基)己酰基)氧基)十五烷-3-基1-甲基吡咯-2-甲酸酯；(2S)-1-((6,6-双(辛氧基)己酰基)氧基)十五烷-3-基1-甲基吡咯-2-甲酸酯；(2R)-1-((6,6-双(辛氧基)己酰基)氧基)十五烷-3-基吡咯-2-甲酸酯；
1-((6,6-双(辛氧基)己酰基)氧基)十五烷-3-基1,3-二甲基吡咯-3-甲酸酯；3-((3-(1-甲基哌啶-4-基)丙酰基)氧基)十五烷基6,6-双(辛氧基)己酸酯；
1-((6,6-双(辛氧基)己酰基)氧基)十五烷-3-基1,4-二甲基哌啶-4-甲酸酯；3-((5-(二乙基氨基)戊酰基)氧基)十五烷基6,6-双(辛氧基)己酸酯；
3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基5-(4,6-二庚基-1,3-二噁烷-2-基)戊酸酯；
3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十一烷基6,6-双(辛氧基)己酸酯；
3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十三烷基6,6-双(辛氧基)己酸酯；
(12Z,15Z)-3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)二十一烷-12,15-二烯-1-基6,6-双(辛氧基)己酸酯；
6-((6,6-双(辛氧基)己酰基)氧基)-4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)己基辛酸酯；4,4-双(辛氧基)丁基5-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十七烷酸酯；
4,4-双(辛氧基)丁基(3-(二乙基氨基)丙基)十五烷-1,3-二基二碳酸酯；
2-(5-((4-((1,4-二甲基哌啶-4-羰基)氧基)十六烷基)氧基)-5-氧代戊基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
2-(5-((4-((1,3-二甲基吡咯-3-羰基)氧基)十六烷基)氧基)-5-氧代戊基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
2-(5-氧代-5-((4-(((S)-吡咯-2-羰基)氧基)十六烷基)氧基)戊基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
2-(5-((4-(((((S)-1-甲基吡咯-3-基)氧基)羰基)氧基)十六烷基)氧基)-5-氧代戊基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
2-(5-((4-(((((R)-1-甲基吡咯-3-基)氧基)羰基)氧基)十六烷基)氧基)-5-氧代戊基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
2-(5-((4-((((1-乙基哌啶-3-基)甲氧基)羰基)氧基)十六烷基)氧基)-5-氧代戊基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
2-(5-((4-((((1-甲基哌啶-4-基)氧基)羰基)氧基)十六烷基)氧基)-5-氧代戊基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
2-(10-十二烷基-3-乙基-8,15-二氧代-7,9,14-三氧杂-3-氮杂十九烷-19-基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
2-(11-十二烷基-3-乙基-9,15-二氧代-8,10,14-三氧杂-3-氮杂十九烷-19-基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
2-(5-((3-(((3-(1H-咪唑-1-基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基)氧基)-5-氧代戊基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；
2-(5-氧代-5-((3-(((3-(哌啶-1-基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基)氧基)戊基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯；以及
2-(12-十二烷基-3-乙基-8,14-二氧代-7,9,13-三氧杂-3-氮杂十八烷-18-基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯。
在具体的方面，这些阳离子脂质化合物可单独使用，或与其他形成脂质聚集体的组分(如DOPE或胆固醇)组合用于配制成脂质体或其他脂质聚集体。此类聚集体是阳离子的并且能够与阴离子大分子(如DNA或RNA)复合。
适用于本文所述的脂质组合物和方法的“中性脂质”包括，例如，各种中性的、不带电荷的或两性离子脂质。适用于本发明的中性磷脂的实例包括但不限于：5-十七烷基苯-1,3-二醇(间苯二酚)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、磷酸胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酰胆碱(PLPC)、l,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、l-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(MPPC)、l-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(PMPC)、l-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(PSPC)、l,2-二花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)、l-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(SPPC)、l,2-双二十碳烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、溶血磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二亚油酰基磷脂酰胆碱二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺及其组合。在一个实施例中，中性磷脂选自下组，该组由以下组成：二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)和二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)。
“辅助脂质”是在一定程度上增强转染(例如，包括生物活性剂的纳米颗粒的转染)的脂质。辅助脂质增强转染的机制可包括例如增强颗粒稳定性和/或增强膜融合性。辅助脂质包括类固醇和烷基间苯二酚。适用于本文所述的组合物和方法的辅助脂质包括但不限于胆固醇、5-十七烷基间苯二酚和胆固醇半琥珀酸酯。用于本文所述的组合物和方法中的辅助脂质的非限制性实例包括在WO 2015/095346、WO 2015/095340、WO 2016/037053、WO2014/136086和WO 2011/076807中描述的那些，其各自通过引用以其全部内容并于本文中。
隐形脂质是增加纳米颗粒可在体内(例如，在血液中)存在的时间长度的脂质。适用于本文所述的组合物和方法的隐形脂质包括但不限于具有与脂质部分连接的亲水性头基的隐形脂质。用于本文所述的组合物和方法中的隐形脂质的非限制性实例包括在WO2015/095346、WO 2015/095340、WO 2016/037053、WO 2014/136086和WO 2011/076807中描述的那些，其各自通过引用以其全部内容并于本文中。在某个方面，隐形脂质的实例包括如在WO 2011/076807中所述的具有式(XI)的化合物和在WO 2016/010840的表1中列出的化合物。在特定的方面，在本文所述的脂质组合物中适合使用的其他隐形脂质和关于此类脂质的生物化学信息可以在Romberg等人.,Pharmaceutical Research[药学研究],第25卷,第1期,2008,第55-71页和Hoekstra等人.,Biochimica et Biophysica Acta[生物化学与生物物理学报]1660(2004)41-52中发现。
在一方面，适合的隐形脂质包含选自以下的基团：PEG(有时被称为聚(氧化乙烯)以及基于聚(噁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚氨基酸和聚[N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺]的聚合物，以及例如，在WO 2006/007712中披露的另外适合的PEG脂质。
在具体的方面，适合的隐形脂质的非限制性实例包括聚乙二醇-二酰基甘油或聚乙二醇-二酰基甘油酰胺(PEG-DAG)缀合物，包括具有独立地包含从约C4至约C40饱和或不饱和碳的烷基链长度的二烷基甘油或二烷基甘氨酰胺基团的那些。在另外的方面，二烷基甘油或二烷基甘氨酰胺基团可进一步包含一个或多个取代的烷基基团。在本文所述的另外的方面，PEG缀合物可以选自以下：PEG-二月桂基甘油、PEG-二肉豆蔻基甘油(PEG-DMG)(目录号GM-020，来自NOF，东京，日本)、PEG-二棕榈酰基甘油、PEG-二硬脂基甘油、PEG-二月桂基甘氨酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘氨酰胺、PEG-二棕榈酰基甘氨酰胺、和PEG-二硬脂基甘氨酰胺、PEG-胆固醇(l-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰氨基-3',6'-二氧杂辛基]氨基甲酰基-[Ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-双十四碳氧基苄基-[Ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、l,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](目录号880150P，来自Avanti Polar Lipids，阿拉巴斯特，阿拉巴马州，美国)。在一方面，隐形脂质是S010、S024、S027、S031或S033(如在WO 2016/037053中的描述，例如，表1)。在另一方面，隐形脂质是S024(如在WO 2016/037053中的描述，例如，表1)。
III.mRNA分子的组合物
在一个具体实施例中，用于本发明免疫方法的多核苷酸是基于多核糖核苷酸，例如基于mRNA。该mRNA分子应该能够直接编码需要抗体应答的一种或多种靶蛋白和促其进的翻译。因此，该分子应含有若干种组分。在具体的方面，第一组分是对应于一种或多种蛋白质例如人靶蛋白或其片段的氨基酸序列的可读框。可以使用天然密码子序列，可替代地，可以对宿主物种(比如，小鼠或兔)进行密码子优化，以提高靶标的翻译效率和最终蛋白质表达水平。可以对可读框进行另外的修饰以增强蛋白质表达/运输。对于分泌蛋白或膜蛋白，这可包括使用异源信号肽，例如来自白细胞介素2(IL-2)的分泌信号。在分泌蛋白的具体实例中，mRNA分子可包括异源信号肽，例如人IL-2或IgGκ的信号肽。
在具体的方面，第二组分是共有Kozak序列。提供了示例性Kozak DNA序列：GCCACCATG(SEQ ID NO:1)，其中核苷酸ATG代表起始子甲硫氨酸。提供了示例性Kozak RNA序列：GCCACCAUG(SEQ ID NO:11)，其中核苷酸AUG代表起始子甲硫氨酸。如由RNA或DNA编码的，Kozak序列的其他非限制性实例包括：(GCC)GCCRCCAUGG(SEQ ID NO:12)、AGNNAUGN(SEQID NO:13)、ANNAUGG(SEQ IDNO:23)、ACCAUGG(SEQ ID NO:24)、GACACCAUGG(SEQ ID NO:25)、GCCRCCATGG(SEQ ID NO:57)、CAAACATG(SEQ ID NO:58)、AAAAAATGTCT(SEQ ID NO:28)、AAAAAAATGRNA(SEQ ID NO:29)、NTAAAAATGRCT(SEQ ID NO:30)、TAAAAAATGAAN(SEQ IDNO:31)、GNCAAAATGG(SEQ ID NO:32)、NNNANNATGNC(SEQ ID NO:33)和AACAATGGC(SEQ IDNO:34)，其中“N”表示任何核苷酸(例如，在DNA的情况下是A、G、C或T，并且在RNA的情况下是A、G、C或U)，并且“R”表示A或G。众所周知，包含可读框5'的Kozak序列增强真核宿主中的翻译。
在具体的方面，第三组分是mRNA的5'末端上的7-甲基鸟苷帽。该帽对于募集真核起始因子eIF4E和组装成熟核糖体是必需的。可以在生成mRNA转录物后酶促地或化学地添加甲基鸟苷帽。
在具体的方面，第四组分是在mRNA转录物的3'末端发现的聚腺苷(聚A)尾。已知聚A段延长细胞中mRNA的半衰期以及促进有效的核糖体组装和蛋白质翻译。在具体的实施例中，用于本文所述的组合物和方法的mRNA包含120个核苷酸(SEQ ID NO:59)的聚A尾。在某些实施例中，本文所述的组合物和方法的mRNA包含具有60-120个核苷酸的聚A尾。在特定的实施例中，用于本文所述的组合物和方法的mRNA包含60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸、100个核苷酸、110个核苷酸或120个核苷酸的聚A尾。包含聚A段可以通过体外转录或通过使用聚(A)聚合酶的酶促多聚腺苷酸化来完成。
在具体的方面，mRNA分子的第五组分是包含5’-和3’-非翻译区(UTR)。在特定的实施例中，5’UTR衍生自烟草蚀纹病毒，并且3’UTR是人β-珠蛋白中发现的3’UTR的串联重复序列。广泛接受的是，UTR的存在可以增强mRNA的翻译以及增加其在细胞内的半衰期(参见，例如，R.L.Tanguay和D.R.Gallie Molecular and Cellular Biology[分子与细胞生物学]1996第16卷，第1期，第146-156页)。
使用体外转录，然后进行RNA纯化，可以获得足够量的此类RNA分子。使用DNA依赖性RNA聚合酶在体外转录克隆的DNA序列的技术是本领域熟知的(例如，参见Sambrook等人.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆:实验室手册],第2版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),1989)。天然存在的核糖核苷酸，例如尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、假尿嘧啶或经修饰的核糖核苷酸可用于mRNA合成，只要它们仍支持适当的密码子识别和蛋白质翻译。在本发明中，将鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和假尿嘧啶用于mRNA合成。在具体的方面，在BioAnalyzer(如下所述)上的质量控制评估期间，使用假尿嘧啶代替尿嘧啶允许更准确地估计mRNA大小。
IV.脂质/多核苷酸复合物的用途
根据本披露，在具体的方面，将脂质/多核苷酸复合物用于进行体内转染。转染的细胞表达由多核苷酸编码的蛋白质(例如，多核糖核苷酸，如mRNA)，并且可以例如，在细胞表面上表达或呈递外源蛋白质。结果，宿主动物(例如，非人宿主动物)对外源蛋白质或免疫原产生免疫应答。
使用质粒DNA模板、rNTP和T7RNA聚合酶在体外转录合成mRNA。将7-甲基鸟苷帽结构(Cap1)酶促加入mRNA的5′末端以促进有效翻译。将加帽的mRNA配制成阳离子脂质纳米颗粒(LNP)以保护mRNA免于降解并增强细胞质递送。mRNA LNP在4℃下稳定3-4个月，并且可随时用于免疫。
在具体的方面，通过将阳离子脂质溶液与等体积的多核苷酸溶液混合来形成阳离子脂质-多核苷酸复合物。阳离子脂质和多核苷酸可以溶解在任何无菌的生理学相容的水性载体中。在具体的实施例中，将阳离子脂质和多核苷酸溶解在无菌盐水(150mM NaCl)中。将溶液在环境温度下混合。在某些实施例中，将溶液在25℃下混合。混合后，将阳离子脂质-多核苷酸复合物在室温下孵育例如15至45分钟。
本文所述方法的脂质/多核苷酸复合物的给予可以通过肠胃外、静脉内、肌内、皮下、鼻内或任何其他适合的方式进行。在小鼠中，已发现静脉内给予mRNA LNP优于皮下递送(参见图1B)。给予的具体剂量可取决于年龄、体重、当前治疗的类型(如果有的话)以及将表达的免疫原的性质。初始剂量之后可以加强剂量以增强免疫原性应答。用mRNA LNP免疫还可以与其他免疫原形式交替(参见图1C)。
因为免疫在宿主中产生免疫原特异性抗体，所以本披露还涉及产生免疫原特异性抗体的方法。可以使用本领域熟知的方法从宿主动物中分离和纯化多克隆抗体(例如，参见Harlow等人.,Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),1988)。
本披露还涉及基于mRNA LNP的免疫用于产生单克隆抗体的用途。根据该方法，向非人动物(例如，小鼠)注射脂质/mRNA复合物，并从免疫动物(例如，小鼠)中分离产生抗体的细胞(例如，B淋巴细胞或脾细胞)。单克隆抗体通过本领域已知的任何方法产生，例如，遵循Kohler和Milstein的方法(Nature[自然]256:495-497(1975)(例如，参见Harlow等人.,同上)。简言之，单克隆抗体可以通过以下产生：用阳离子脂质-mRNA复合物免疫动物(例如，小鼠)；通过去除血清样品来验证抗体产生的存在；去除脾脏以获得B淋巴细胞；将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤；克隆该杂交瘤；选择产生抗免疫原抗体的阳性克隆；培养产生抗免疫原抗体的克隆；并从杂交瘤培养物中分离抗免疫原抗体。
V.RNA修饰
用于本文所述的组合物和方法的多核糖核苷酸(如mRNA)可以包括修饰以防止由内切核酸酶和外切核酸酶引起的快速降解，并避免或减少细胞对RNA的先天免疫或干扰素应答。修饰包括但不限于，例如，(a)末端修饰，例如5'末端修饰(磷酸化、去磷酸化、缀合、反向连接等)，3'末端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)；(b)碱基修饰，例如用经修饰的碱基、稳定碱基、去稳定碱基或与扩展的配偶体谱库或缀合碱基配对的碱基置换；(c)糖修饰(例如，在2'位或4'位置处)或糖的置换；以及(d)核苷间键修饰，包括磷酸二酯键的修饰或置换。
在具体的方面，本文所述的多核糖核苷酸(如mRNA)可以进一步包含5’帽。在本文所述方面的一些实施例中，该经修饰的合成mRNA包含含有经修饰的鸟嘌呤核苷酸的5’帽，使用5'-5'三磷酸键将该帽连接至RNA分子的5’末端。术语“5'帽”还旨在涵盖其他5'帽类似物，包括例如5'二鸟苷帽，具有亚甲基-双(膦酸酯)部分的四磷酸酯帽类似物(参见，例如，Rydzik,AM等人.(2009)Org Biomol Chem[有机与生物分子化学]7(22):4763-76)；具有硫代磷酸酯修饰的二核苷酸帽类似物(参见，例如，Kowalska,J.等人.(2008)RNA 14(6):1119-1131)；具有硫取代非桥接氧的帽类似物(参见，例如，Grudzien-Nogalska,E.等人.,(2007)RNA 13(10):1745-1755)；N7苄化的二核苷四磷酸酯类似物(参见，例如，Grudzien,E.等人.(2004)RNA 10(9):1479-1487)，或抗反转帽类似物(参见，例如，Jemielity,J.等人.,(2003)RNA 9(9):1108-1122和Stepinski,J.等人.(2001)RNA 7(10):1486-1495)。在一个这样的实施例中，该5’帽类似物是5’二鸟苷帽。在一些实施例中，本发明的经修饰的合成mRNA不包含5'三磷酸。
5'帽对于识别mRNA并将其附接到核糖体以引发翻译是重要的。5'帽还保护本文所述的经修饰的合成mRNA免于5'核酸外切酶介导的降解。
本文所述的多核糖核苷酸(如mRNA)可进一步包含5'和/或3'非翻译区(UTR)。非翻译区是起始密码子(5')之前和终止密码子(3')之后的RNA区域，因此不被翻译机器翻译。具有一个或多个非翻译区的RNA分子的修饰可以改进mRNA的稳定性，因为非翻译区可以干扰核糖核酸酶和参与RNA降解的其他蛋白质。此外，用5'和/或3'非翻译区修饰RNA可以通过结合改变核糖体与mRNA结合的蛋白质来提高翻译效率。用3’UTR修饰RNA可用于维持RNA的细胞质定位，允许翻译发生在细胞的细胞质中。在一个实施例中，本发明的经修饰的合成mRNA不包含5’或3'UTR。在另一个实施例中，本发明的经修饰的合成mRNA包含5’或3'UTR。在另一个实施例中，本发明的经修饰的合成mRNA包含5’和3'UTR。在一个实施例中，5'和/或3'UTR选自已知在细胞中具有高稳定性的mRNA(例如，鼠科动物α-珠蛋白3'UTR)。在一些实施例中，5'UTR、3'UTR，或二者包含一个或多个经修饰的核苷。
在一些实施例中，本文所述的多核糖核苷酸(比如mRNA)进一步包含Kozak序列。“Kozak序列”是指真核mRNA上具有共有序列(gcc)gccRccAUGG(SEQ ID NO:12)的序列，其中R是起始密码子(AUG)上游三个碱基处的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，之后是另一个“G”。核糖体识别Kozak共有序列以启动多肽的翻译。通常，起始发生在靠近转录物5'末端的翻译机器遇到的第一个AUG密码子处。然而，在一些情况下，可以在称为漏洞扫描的过程中绕过该AUG密码子。在AUG密码子附近存在的Kozak序列将强化该密码子作为翻译的起始位点，从而发生正确多肽的翻译。此外，即使没有关于起始密码子的模糊性，向本文所述的经修饰的合成mRNA中添加Kozak序列也可以促进更有效的翻译。因此，在一些实施例中，本文所述的经修饰的合成mRNA在所需位点处进一步包含Kozak共有序列以启动翻译从而产生正确长度的多肽。在一些这样的实施例中，Kozak序列包含一个或多个经修饰的核苷。
在一些实施例中，本文所述的经修饰的合成mRNA进一步包含“聚(A)尾”，该聚(A)尾是指腺嘌呤核苷酸的3'同聚物尾，其长度可变(例如，至少5个腺嘌呤核苷酸)并且可以是长达几百个腺嘌呤核苷酸)。包含3'聚(A)尾可以保护本发明的经修饰的合成mRNA免于细胞中的降解，并且还促进核外定位以提高翻译效率。在一些实施例中，该聚(A)尾包含在1和500个之间的腺嘌呤核苷酸(SEQ ID NO:60)；在其他实施例中，该聚(A)尾包含至少5个腺嘌呤核苷酸或更多。在一个实施例中，该聚(A)尾包含在1和150个之间的腺嘌呤核苷酸。在一个实施例中，该聚(A)尾包含在60和120个之间的腺嘌呤核苷酸。在另一个实施例中，该聚(A)尾包含在90和120个之间的腺嘌呤核苷酸。在一些这样的实施例中，该聚(A)尾包含一个或多个经修饰的核苷。
以下是适于根据本文提供的mRNA免疫方法产生和表达的靶蛋白抗原的代表性实例。如本文所述，其mRNA的产生和用所述mRNA进行的宿主动物免疫证明了所述方法的概念验证。
I.RXFP1
RXFP1或松弛素/胰岛素样家族肽受体1，是757个氨基酸的类G蛋白偶联受体(GPCR)，其包含富含亮氨酸的重复N-末端胞外结构域。在系统发育上，它是相同受体亚家族的一部分，包括促卵泡激素、促黄体激素和促甲状腺激素受体。RXFP1的内源性配体是蛋白质激素松弛素。RXFP1及其配体参与控制月经和一些与妊娠和分娩相关联的生理应答。在患有急性失代偿性心力衰竭的患者中，III期临床试验(RELAX-AHF)已经显示在住院期间48小时的重组松弛素输注显著降低6个月的死亡率。
由于细胞毒性，建立具有高水平RXFP1表达的细胞系是困难的。与许多GPCR一样，纯化的全长重组蛋白的表达在技术上也是被禁止的。
为生成人RXFP1 mRNA，使用针对小鼠的的密码子优化算法对RXFP1可读框的天然人核苷酸序列(例如，登录号NM_021634.3/NP_067647.2)进行密码子优化(参见表1)。除了基于小鼠偏倚改变密码子序列之外，改变序列以去除BamHI、RsrII和BspQI限制性位点，因为这些序列将用于随后的亚克隆和mRNA合成。
II.SLC52A2
SLC52A2(GPR172A)是445个氨基酸的多通道跨膜蛋白，被预测具有10或11个推定的跨膜螺旋。已经显示它介导核黄素的细胞摄取，并且据报道它是猪内源性逆转录病毒亚群A的受体。SLC52A2的某些遗传变体与运动、感觉和颅神经病变相关联。
为生成人SLC52A2 mRNA，使用针对小鼠的密码子优化算法对该蛋白质的可读框的天然人核苷酸序列(例如，登录号NM_001253816.1/NP_001240745)进行密码子优化(参见表2)。除了基于小鼠偏倚改变密码子序列之外，改变序列以去除BamHI、RsrII和BspQI限制性位点，因为这些序列将用于随后的亚克隆和mRNA合成。
III.ANGPTL8
ANGPTL8是一种分泌蛋白，参与脂质代谢，可在人血浆中以低ng/ml浓度被发现。然而，该蛋白质难以其天然和可溶形式在异源系统中表达。此外，尚未描述该蛋白质的生物化学功能，因此没有可用于测量重组产生的蛋白质活性的体外功能测定。鉴于难以产生和验证用作抗原的重组ANGPTL8的质量，该蛋白质是mRNA介导的免疫以产生单克隆抗体的良好候选物。
人ANGPTL8的全长编码序列(例如，登录号NP_061157)经密码子优化以在人细胞中表达，并克隆到可通过T7聚合酶维持mRNA转录并含有有助于mRNA稳定性和可译性的3和5'非翻译区的载体中(参见表3的序列)。如上所述，mRNA被体外转录并包封到脂质纳米颗粒中。
IV.TSHR
促甲状腺激素受体(TSHR)是一种G蛋白偶联受体，对甲状腺生长和甲状腺激素的产生至关重要。它也是格雷夫斯病(Grave’s disease)的自身抗原。TSHR特异性自身抗体长期激活TSHR是格雷夫斯病潜在的主要原因之一(Davies TF(2015)Expert Opin TherTargets[治疗靶标专家评论]；19:835-47)。
TSHR具有大的胞外结构域(ECD)和跨膜结构域(TMD)。ECD具有11个富含亮氨酸的重复结构域(LRD)，该结构域包含TSH和许多自身抗体的结合位点。TSHR经历广泛的翻译后修饰，并且可形成同源二聚体和聚合物。TSHR具有较低的基础组成型活性。它的信号是混杂的，由Gs、Gi/o、Gq/11或G12/13介导。TSHR与促黄体激素，绒毛膜促性腺激素受体(LHCGR)具有51％同一性，与促卵泡激素受体(FSHR)具有48％同一性。
在正常的甲状腺中，TSH激活TSHR，调节甲状腺细胞增殖和甲状腺激素释放。在格雷夫斯病中，患者会产生激动性自身抗体。它们以不受控制的方式取代TSH并过度激活受体：甲状腺肿大，并且T3和T4水平升高。
人TSHR的全长编码序列(例如，蛋白质登录号NP_000360.2)经密码子优化以在人细胞中表达，并克隆到可通过T7聚合酶维持mRNA转录并含有有助于mRNA稳定性和可译性的3和5'非翻译区的载体中(参见表4的序列)。如上所述，mRNA被体外转录并包封到脂质纳米颗粒中。
V.APJ
Apelin受体，还被称为APJ、血管紧张素样-1受体、血管紧张素II样-1受体等，是先前的孤儿G蛋白偶联受体(GPCR)，该受体与内源性配体Apelin同源。apelin/APJ途径在心血管系统中广泛表达，并且apelin在临床前模型中已经显示出主要的有益心血管作用。人体内急性apelin给予会引起外周和冠状动脉血管舒张，并增加心输出量(Circulation.[循环]2010；121:1818-1827)。因此，APJ激动成为作为心力衰竭患者的重要治疗靶点。apelin受体APJ的激活被认为可以增加心肌收缩性并提供心脏保护作用，而不受碍于当前治疗。
APJ不仅广泛分布于心脏中，还广泛分布于其他器官和组织，包括血管、肾、肝、脂肪组织和脑中。
人APJ的全长编码序列(例如，蛋白质登录号NP_005152.1)经密码子优化以在人细胞中表达，并克隆到可通过T7聚合酶维持mRNA转录并含有有助于mRNA稳定性和可译性的3和5'非翻译区的载体中(参见表5的序列)。如上所述，mRNA被体外转录并包封到脂质纳米颗粒中。
VI.GP130
糖蛋白130(GP130)是含有918个氨基酸的蛋白质，并且是I型单通道跨膜蛋白受体家族的成员。它是许多细胞因子使用的信号转导复合物的核心组分，这些细胞因子包括白细胞介素6、白细胞介素11、睫状神经营养因子、白血病抑制因子和制瘤素M。在白细胞介素6(IL6)的情况下，GP130与IL6/IL6R(α链)复合物结合，导致高亲和力的IL6结合位点的形成和信号转导的启动。GP130包含五个纤连蛋白III型结构域和一个Ig样C2型结构域。
人GP130的全长编码序列(例如，蛋白质登录号NP_002175.2或AAI17405)经密码子优化以在人细胞中表达，并克隆到可通过T7聚合酶维持mRNA转录并含有有助于mRNA稳定性和可译性的3和5'非翻译区的载体中(参见表6的序列)。如上所述，mRNA被体外转录并包封到脂质纳米颗粒中。
VII.半乳凝素-3
半乳凝素-3是26kDa蛋白质，并且是β-半乳糖苷结合凝集素家族的成员。它含有胶原蛋白样N-末端结构域和C-末端碳水化合物识别结构域，赋予半乳凝素-3结合碳水化合物的能力。通过其N-末端结构域，半乳凝素-3能够形成更高级的寡聚体。已经提出半乳凝素-3在细胞粘附、分化、转移、胚胎发生、炎症和纤维化中起作用。
人半乳凝素-3的全长编码序列(例如，蛋白质登录号NP_002297)经密码子优化以在人细胞中表达，并克隆到可通过T7聚合酶维持mRNA转录并含有有助于mRNA稳定性和可译性的3和5'非翻译区的载体中(参见表7的序列)。如上所述，mRNA被体外转录并包封到脂质纳米颗粒中。
V.包封的核酸纳米颗粒
术语“脂质纳米颗粒”或“一个LNP”或“多个LNP”是指包含通过分子间力彼此物理结合(例如，共价或非共价)的多个(即多于一个)脂质分子的颗粒。脂质纳米颗粒可以是例如微球(包括单层和多层囊泡，例如脂质体)、乳液中的分散相、胶团或悬浮液中的内相。
术语“脂质纳米颗粒宿主”是指通过分子间力/静电相互作用彼此物理结合的多个脂质分子，以包封一个或多个核酸分子(如mRNA)。
某些实施例提供了包封的核酸纳米颗粒组合物，该组合物包含药学上可接受的载体和包封的核酸纳米颗粒。包封的核酸纳米颗粒包括脂质纳米颗粒宿主和包封在脂质纳米颗粒宿主中的核酸，例如，多核糖核苷酸(如mRNA)。
如本文使用的，术语“药学上可接受的载体”是指无毒的惰性稀释剂。可用作药学上可接受的载体的材料包括但不限于无热原水、去离子水、等渗盐水、林格氏溶液和磷酸盐缓冲溶液。在优选的实施例中，如通过动态光散射测定(例如使用Malvern Zetasizer NanoZS)确定的，包封的核酸纳米颗粒具有约40至约70nm的平均大小和小于约0.1的多分散指数。脂质纳米颗粒宿主包含可降解的阳离子脂质、脂质化的聚乙二醇、胆固醇以及如本文其他地方所述的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱组分。
本文提供制备包封的核酸纳米颗粒组合物的方法，该组合物包含阳离子脂质合另一种脂质组分。另一个实施例提供了使用阳离子脂质和辅助脂质(例如，胆固醇)的方法。另一个实施例提供了使用阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)和中性脂质(例如，DSPC)的方法。本发明的另一个实施例提供了以下方法，该方法使用阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)、中性脂质(例如，DSPC)和隐形脂质(例如，S010、S024、S027、S031或S033)。本发明的另一个实施例提供了在脂质纳米颗粒宿主中包封核酸的方法，其中该纳米颗粒包含阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)、中性脂质(例如，DSPC)、隐形脂质(例如S010、S024、S027、S031或S033)，并且该核酸是例如RNA或DNA。本发明的另一个实施例提供了以下方法，该方法使用阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)、中性脂质(例如，DSPC)和隐形脂质(例如，S010、S024、S027、S031或S033)，其中该核酸是例如mRNA、mRNA或DNA。
在一些实施例中，该脂质溶液/脂质流包含阳离子脂质化合物、辅助脂质(胆固醇)、任选的中性脂质(DSPC)和隐形脂质(例如，S010、S024、S027或S031)。其中配制品包含四种脂质组分，对于阳离子脂质，脂质的摩尔比率可以在从20至70摩尔百分比的范围，其中目标为40至60；辅助脂质的摩尔百分比在从20至70的范围，其中目标为30至50；中性脂质的摩尔百分比在从10至30的范围；PEG脂质的摩尔百分比具有从1至6的范围，其中目标为2至5。
在一些实施例中，一种或多种脂质溶液/流包含30％-60％具有式(III)的化合物、30％-60％胆固醇/5％-10％DSPC、和1％-5％PEG-DMG、S010、S011或S024。
本披露的另一个实施例提供了在脂质纳米颗粒宿主中包封核酸的方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约40-55阳离子脂质/约40-55辅助脂质的阳离子脂质和辅助脂质(例如，胆固醇)。另一个实施例提供了如下方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约40-55阳离子脂质/约40-55辅助脂质/约5-15中性脂质的阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)和中性脂质(例如，DSPC)。另一个实施例提供了如下方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约40-55阳离子脂质/约40-55辅助脂质/约5-15中性脂质/约1-10隐形脂质的阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)、中性脂质(例如，DSPC)和隐形脂质(例如，S010、S024、S027、S031或S033)。
本披露的另一个实施例提供了在脂质纳米颗粒宿主中包封核酸的方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约40-50阳离子脂质/约40-50辅助脂质的阳离子脂质和辅助脂质(例如，胆固醇)。另一个实施例提供了如下方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约40-50阳离子脂质/约40-50辅助脂质/约5-15中性脂质的阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)和中性脂质(例如，DSPC)。另一个实施例提供了如下方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约40-50阳离子脂质/约40-50辅助脂质/约5-15中性脂质/约1-5隐形脂质的阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)、中性脂质(例如，DSPC)和隐形脂质(例如，S010、S024、S027、S031或S033)。
本披露的另一个实施例提供了在脂质纳米颗粒宿主中包封核酸的方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约43-47阳离子脂质/约43-47辅助脂质的阳离子脂质和辅助脂质(例如，胆固醇)。另一个实施例提供了如下方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约43-47阳离子脂质/约43-47辅助脂质/约7-12中性脂质的阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)和中性脂质(例如，DSPC)。另一个实施例提供了如下方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约43-47阳离子脂质/约43-47辅助脂质/约7-12中性脂质/约1-4隐形脂质的阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)、中性脂质(例如，DSPC)和隐形脂质(例如，S010、S024、S027、S031或S033)。
本披露的另一个实施例提供了在脂质纳米颗粒宿主中包封核酸的方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约45％阳离子脂质和约44％辅助脂质的阳离子脂质和辅助脂质(例如，胆固醇)。另一个实施例提供了如下方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约45％阳离子脂质、约44％辅助脂质和约9％中性脂质的阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)和中性脂质(例如，DSPC)。另一个实施例提供了如下方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约45％阳离子脂质、约44％辅助脂质、约9％中性脂质和约2％隐形脂质的阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)、中性脂质(例如，DSPC)和隐形脂质(例如，S010、S024、S027、S031或S033)。
本披露的一个实施例提供了制备包封核酸纳米颗粒组合物的方法，该组合物包含阳离子脂质和另一种脂质组分。另一个实施例提供了使用具有式(I)的化合物和辅助脂质(例如，胆固醇)的方法。另一个实施例提供了使用阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)和中性脂质(例如，DSPC)的方法。本披露的另一个实施例提供了如下方法，该方法使用阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)、中性脂质(例如，DSPC)和隐形脂质(例如S010、S024、S027、S031或S033)。本披露的另一个实施例提供了在脂质纳米颗粒宿主中包封核酸的方法，其中该纳米颗粒包含阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)、中性脂质(例如，DSPC)、隐形脂质(例如，S010、S024、S027、S031或S033)，并且该核酸是例如RNA或DNA。本披露的另一个实施例提供了如下方法，该方法使用阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)、中性脂质(例如，DSPC)和隐形脂质(例如，S010、S024、S027、S031或S033)，其中该核酸是例如mRNA、mRNA或DNA。
本披露的另一个实施例提供了在脂质纳米颗粒宿主中包封核酸的方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约40-55具有式(I)的化合物/约40-55辅助脂质的阳离子脂质和辅助脂质(例如，胆固醇)。另一个实施例提供了如下方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约40-55阳离子脂质/约40-55辅助脂质/约5-15中性脂质的阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)和中性脂质(例如，DSPC)。另一个实施例提供了如下方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约40-55具有式(I)的化合物/约40-55辅助脂质/约5-15中性脂质/约1-10隐形脂质的阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)、中性脂质(例如，DSPC)和隐形脂质(例如，S010、S024、S027、S031或S033)。
本披露的另一个实施例提供了在脂质纳米颗粒宿主中包封核酸的方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约40-50阳离子脂质/约40-50辅助脂质的阳离子脂质和辅助脂质(例如，胆固醇)。另一个实施例提供了如下方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约40-50阳离子脂质/约40-50辅助脂质/约5-15中性脂质的阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)和中性脂质(例如，DSPC)。另一个实施例提供了如下方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约40-50阳离子脂质/约40-50辅助脂质/约5-15中性脂质/约1-5隐形脂质的阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)、中性脂质(例如，DSPC)和隐形脂质(例如，S010、S024、S027、S031或S033)。
本披露的另一个实施例提供了在脂质纳米颗粒宿主中包封核酸的方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约43-47阳离子脂质/约43-47辅助脂质的阳离子脂质和辅助脂质(例如，胆固醇)。另一个实施例提供了如下方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约43-47阳离子脂质/约43-47辅助脂质/约7-12中性脂质的阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)和中性脂质(例如，DSPC)。另一个实施例提供了如下方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约43-47阳离子脂质/约43-47辅助脂质/约7-12中性脂质/约1-4隐形脂质的阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)、中性脂质(例如，DSPC)和隐形脂质(例如，S010、S024、S027、S031或S033)。
本披露的另一个实施例提供了在脂质纳米颗粒宿主中包封核酸的方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约45％阳离子脂质和约44％辅助脂质的阳离子脂质和辅助脂质(例如，胆固醇)。另一个实施例提供了如下方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约45％阳离子脂质、约44％辅助脂质和约9％中性脂质的阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)和中性脂质(例如，DSPC)。另一个实施例提供了如下方法，该方法使用以脂质摩尔比率为约45％阳离子脂质、约44％辅助脂质、约9％中性脂质和约2％隐形脂质的阳离子脂质、辅助脂质(例如，胆固醇)、中性脂质(例如，DSPC)和隐形脂质(例如，S010、S024、S027、S031或S033)。
在本披露的方法中脂质:核酸(例如，多核糖核苷酸，如mRNA)的比率可以是大约15-20:1(wt/wt)。在某些实施例中，脂质:核酸的比率是约17-19:1。在其他实施例中，脂质:核酸的比率是约18.5:1。在其他实施例中，脂质:核酸的比率是至少约30:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、或10:1(wt/wt)。
在某些方面，通过本披露的方法产生的纳米颗粒具有平均直径和围绕平均值的尺寸分布。较窄的粒度范围对应于更均匀的粒度分布。可以在收集纳米颗粒时，在孵育时间之后，或在完全加工(例如，稀释、过滤、透析等)纳米颗粒配制品之后确定粒度。例如，通常在60min的孵育期之后和/或在完整的样品处理之后进行粒度测定。平均粒度被报告为Z均值或数均值。通过在Malvern Zetasizer上的动态光散射测量Z均值。将纳米颗粒样品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释，使得计数率为约200-400kcts。数据被呈现为强度测量的加权平均值。动态光散射还提供多分散指数(PDI)，量化粒度分布的宽度。较大的PDI与较大的粒度分布相关，反之亦然。另一方面，数均值可以通过显微镜下的测量来确定。
在一些实施例中，由本披露的方法产生的包封的核酸纳米颗粒具有平均直径为约30nm至约150nm。在其他实施例中，这些颗粒具有平均直径为约30nm至约40nm。在其他实施例中，这些颗粒具有平均直径为约40nm至约70nm。在其他实施例中，这些颗粒具有平均直径为约65nm至约80nm。在其他实施例中，这些颗粒具有Z均值为约50nm至约80nm和/或数均值为约40nm至约80nm。在仍其他的实施例中，这些颗粒具有Z均值为约50nm至约70nm和/或数均值为约40nm至约65nm。在又其他实施例中，这些颗粒具有Z均值为约70nm至约80nm和/或数均值为约60nm至约80nm。获得的颗粒的具体尺寸可取决于核酸和脂质流的线速度，任选的稀释步骤的使用，以及所用的特定核酸或脂质。更高的线速度和保持第一出口溶液中的有机溶剂浓度<33％倾向于产生更小的粒度。
在一些实施例中，由本披露的方法产生的包封的mRNA纳米颗粒具有平均直径为约30nm至约150nm。在其他实施例中，这些颗粒具有平均直径为约30nm至约40nm。在其他实施例中，这些颗粒具有平均直径为约40nm至约70nm。在其他实施例中，这些颗粒具有平均直径为约65nm至约80nm。在其他实施例中，这些颗粒具有Z均值为约50nm至约80nm和/或数均值为约40nm至约80nm。在仍其他的实施例中，这些颗粒具有Z均值为约50nm至约70nm和/或数均值为约40nm至约65nm。在又其他实施例中，这些颗粒具有Z均值为约70nm至约80nm和/或数均值为约60nm至约80nm。在仍其他的实施例中，由本披露的方法产生的包封的mRNA纳米颗粒可以具有平均直径为约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75或约80nm。在仍其他的实施例中，由本披露的方法产生的包封的mRNA纳米颗粒可以具有平均直径为至少约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75或约80nm。在仍其他的实施例中，由本披露的方法产生的包封的mRNA纳米颗粒可以具有平均直径为小于约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75或约80nm。
使用动态光散射(例如，Malvern Zetasizer NanoZS)，多分散指数(PDI)可以在从0至1.0的范围。在某些实施例中，该PDI小于约0.2。在其他实施例中，该PDI小于约0.1。在一些实施例中，该PDI小于1.5、小于1.4、小于1.3、小于1.2、小于1.1、小于1.0、小于0.9、小于0.8、小于0.7、小于0.6、小于0.5、小于0.4、小于0.3、小于0.2或小于0.1。
本披露的方法可以通过如下被进一步优化：本领域技术人员通过将具有所希望的pKa范围的阳离子脂质、隐形脂质、辅助脂质和中性脂质组合成配制品(包括例如，脂质体配制品、脂质纳米颗粒(LNP)配制品等)用于体内递送至特定细胞和组织。在一个实施例中，通过调节这些不同类型的脂质之间的脂质摩尔比来获得进一步的优化。在一个实施例中，通过调整以下的一种或多种来获得进一步优化：所需的粒度、N/P比率和/或工艺参数。与以上列出的实施例有关的本领域技术人员已知的各种优化技术被认为是本发明的一部分。
在脂质纳米颗粒宿主中包封核酸的方法
可以使用以下方法制备本文提供的脂质纳米颗粒。已经描述了制备脂质纳米颗粒的非限制性方法，例如，参见PCT国际专利申请公开号WO 2016/010840、WO 2016/037053、WO2015/095346、WO 2015/095340、WO 2014/136086和WO 2011/076807，这些申请中的每一个通过引用以其全文结合在此。为了实现尺寸减小和/或增加颗粒尺寸的均匀性，技术人员可以使用下面列出的方法步骤，用不同的组合实验。另外，技术人员可以采用超声处理、过滤或用于脂质体配制品的其他定型技术。
制备本文提供的组合物的方法通常包括提供水溶液(如柠檬酸盐缓冲液)，该水溶液包含在第一储库中的核酸，提供第二储库，该第二储库包含一种或多种脂质的有机溶液的(例如有机醇(例如乙醇))，然后将水溶液与有机脂质溶液混合。第一储库任选地与第二储库处于流体连通。任选地，混合步骤之后是孵育步骤、过滤或透析步骤，以及稀释和/或浓缩步骤。孵育步骤包括使来自混合步骤的溶液在约室温下在容器中静置约0至约24小时(优选约1小时)并任选地避光。在一个实施例中，在孵育步骤之后进行稀释步骤。稀释步骤可包括例如使用泵送装置(例如，蠕动泵)用水性缓冲液(例如，柠檬酸盐缓冲液或纯水)稀释。过滤步骤可以是超滤或透析。超滤包括浓缩稀释溶液，然后渗滤，例如使用适合的泵送系统(例如，泵送设备，如蠕动泵或其等同物)连同适合的超滤膜(例如，GE中空纤维筒或等同物)。透析包括通过合适的膜(例如10,000mwc蛇皮膜)进行溶剂(缓冲液)交换。
在一个实施例中，混合步骤提供澄清的单相。在一个实施例中，在混合步骤之后，去除有机溶剂以提供颗粒悬浮液，其中核酸被一种或多种脂质包封。
有机溶剂的选择将通常包括考虑溶剂极性和在颗粒形成的后期可以去除溶剂的容易程度。还用作增溶剂的有机溶剂优选处于足以提供核酸和脂质的透明单相混合物的量。适合的有机溶剂包括由Strickley,Pharmaceutical Res.[制药学研究](2004),21,201-230描述的，用作可注射配制品的共溶剂。例如，有机溶剂可以选自以下的一种或多种(例如，两种)：乙醇、丙二醇、聚乙二醇300、聚乙二醇400、甘油、二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)和二甲亚砜(DMSO)。在一个实施例中，该有机溶剂是乙醇。
本文披露了用于制备本披露的组合物的设备。该装置典型地包括至少一个用于容纳包含核酸的水溶液的储库和用于容纳有机脂质溶液的另一个或多个储库。该装置通常还包括泵装置，该泵装置构造成将水性和有机脂质溶液泵送到混合区域或混合室中。在一些实施例中，混合区域或混合室包含交叉偶联或其等同物，其允许水性和有机流体流作为输入组合到交叉连接器中，并且所得组合的水性溶液和有机溶液从交叉连接器中排出进入收集储库或其等同物中。在另一些实施例中，混合区域或混合室包含T偶联或其等同物，其允许水性和有机流体流作为输入组合到T连接器中，并且所得组合的水性溶液和有机溶液从T连接器中排出进入收集储库或其等同物中。
在某些实施例中，一个或多个核酸流中核酸的浓度是约0.1至约1.5mg/mL，并且一个或多个脂质流中脂质的浓度是约10至约25mg/mL。在其他实施例中，一个或多个核酸流中核酸的浓度是约0.2至约0.9mg/mL，并且一个或多个脂质流中脂质的浓度是约15至约20mg/mL。在其他实施例中，一个或多个核酸流中核酸的浓度是从约0.225、0.3、0.33或0.45至约0.675mg/mL，并且一个或多个脂质流中脂质的浓度是约16-18mg/mL。在其他实施例中，一个或多个核酸流中核酸的浓度是约0.225、0.3、0.33、0.45或0.675mg/mL，并且一个或多个脂质流中脂质的浓度是约16.7mg/mL。
该脂质流包含有机溶剂中一种或多种脂质的混合物。该一种或多种脂质可以是阳离子脂质、中性脂质、辅助脂质和隐形脂质的混合物，其中每种脂质可以按与上文其他地方描述的针对最终包封的核酸纳米颗粒的大致相同的相对量存在。脂质流中使用的有机溶剂是能够溶解脂质并且也可与水性介质混溶的有机溶剂。适合的有机溶剂包括乙醇、乙二醇、聚乙二醇300、聚乙二醇400、甘油、二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)和二甲亚砜(DMSO)。在一方面，该有机溶剂包含约80％或更多的乙醇。在特定的方面，该有机溶剂包含约90％或更多的乙醇。在具体的方面，该有机溶剂是乙醇。在某些实施例中，该脂质流包含任选的缓冲溶液，如柠檬酸钠的缓冲溶液(例如，25mM)。
该核酸流包含在第一水溶液中适合的核酸的混合物。该第一水溶液可以不包含盐或包含至少一种盐。例如，该第一水溶液可以在去离子水或蒸馏水中包含适合的核酸而不添加盐。在某些实施例中，该第一水溶液是包含至少一种盐，例如像氯化钠和/或柠檬酸钠的第一缓冲溶液。在第一水溶液中，氯化钠可以按从约0至约300mM范围的浓度存在。在某些实施例中，氯化钠的浓度是约50、66、75、100或150mM。该第一水溶液可以包括处于约0mM至约100mM浓度的柠檬酸钠。该第一缓冲溶液优选地具有约4至约6.5，更优选地约4.5-5.5的pH。在一些实施例中，该第一缓冲溶液的pH是约5，并且柠檬酸钠浓度的约25mM。在其他实施例中，该第一缓冲溶液的pH是约6，并且柠檬酸钠的浓度是约100mM。在具体的实施例中，该第一缓冲溶液具有小于阳离子脂质pKa的pH。对于在水溶液中不包含盐的披露的实施例中，该脂质流包括任选的缓冲溶液。核酸流或脂质流中在不存在盐(例如，柠檬酸钠)的情况下，不发生包封。
其他可能的缓冲剂包括但不限于乙酸钠/乙酸、Na2HPO4/柠檬酸、邻苯二甲酸氢钾/氢氧化钠、邻苯二甲酸氢二钠/正磷酸二氢钠、邻苯二甲酸氢二钾/正磷酸二氢钾、正磷酸二氢钾/氢氧化钠。
在某些实施例中，该有机溶剂包含乙醇，并且该第一出口溶液包含约20％-25％乙醇、约0.15-0.25mg/mL核酸和约3-4.5mg/mL脂质。在其他实施例中，该有机溶剂包含乙醇，并且该第一出口溶液包含约20％乙醇、约0.15-0.2mg/mL核酸和约3-3.5mg/mL脂质。在又其他的实施例中，该有机溶剂包含乙醇，并且该第一出口溶液包含约20％乙醇、约0.18mg/mL核酸和约3.3mg/mL脂质。在其他的实施例中，该有机溶剂包含乙醇，并且该第一出口溶液包含约25％乙醇、约0.2-0.25mg/mL核酸和约4-4.5mg/mL脂质。在仍其他是实施例中，该有机溶剂包含乙醇，并且该第一出口溶液包含约25％乙醇、约0.23mg/mL核酸和约4.2mg/mL脂质。
在本披露的一些实施例中，核酸和脂质的浓度可以一起降低或升高。例如，尽管通常希望保持浓度尽可能高以获得更有效的方法，但可以将核酸浓度降低至约0.045mg/mL并将脂质降低至约1.67mg/mL。然而，在更低的浓度下，颗粒聚集趋于增加。
在某些实施例中，一个或多个核酸流中核酸的浓度是约0.1至约1.5mg/mL，并且一个或多个脂质流中脂质的浓度是约10至约25mg/mL。在其他实施例中，一个或多个核酸流中核酸的浓度是约0.2至约0.9mg/mL，并且一个或多个脂质流中脂质的浓度是约15至约20mg/mL。在其他实施例中，一个或多个核酸流中核酸的浓度是从约0.225、0.3、0.33或0.45至约0.675mg/mL，并且一个或多个脂质流中脂质的浓度是约16-18mg/mL。在其他实施例中，一个或多个核酸流中核酸的浓度是约0.225、0.3、0.33、0.45或0.675mg/mL，并且一个或多个脂质流中脂质的浓度是约16.7mg/mL。通常，较高的核酸浓度需要相应增加的来自稀释流50的稀释水平，以将第一出口流60中的核酸浓度维持在优选的范围内(例如，约0.15-0.25mg/mL)。
在特定的实施例中，脂质:核酸的质量比是约15-20:1或约17-19:1，并且在出口溶液中有机溶剂的浓度是约20％-25％。在其他特定的实施例中，脂质:核酸的质量比是约18.5:1，并且在出口溶液中有机溶剂的浓度是约25％。
在特定的实施例中，脂质:核酸的质量比是约17-19:1。在其他特定的实施例中，脂质:核酸的质量比是约18.5:1。
在特定的实施例中，脂质:核酸的质量比是约15-20:1或约17-19:1，并且在出口溶液中有机溶剂的浓度是约20％-25％。在其他特定的实施例中，脂质:核酸的质量比是约18.5:1，并且在出口溶液中有机溶剂的浓度是约20％或25％。
在特定的实施例中，脂质:核酸的质量比是约17-19:1。在其他特定的实施例中，脂质:核酸的质量比是约18.5:1。在特定的实施例中，脂质:核酸的质量比是约15-20:1或约17-19:1，并且在出口溶液中有机溶剂的浓度是约20％-25％。在其他特定的实施例中，脂质:核酸的质量比是约18.5:1，并且在出口溶液中有机溶剂的浓度是约20％。
在特定的实施例中，脂质:核酸的质量比是约17-19:1。在其他特定的实施例中，脂质:核酸的质量比是约18.5:1。
在某些方面，包封率是>60％。在某些方面，包封率是>65％。在某些方面，包封率是>70％。在本披露的一些实施例中，75％或更多的核酸被包封。在其他实施例中，80％或85％的核酸被包封。在仍其他的实施例中，90％或更多的核酸被包封。在其他实施例中，约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或约100％的核酸被包封。
在某些方面，在如本文所述的包封的核酸纳米颗粒形成后，可以将第一出口溶液在室温下孵育约60分钟。孵育后，可以将该溶液与第二稀释溶剂混合以稀释第一出口溶液约2倍从而提供第二出口溶液。该第二稀释溶剂可以是第三缓冲溶液或水。例如，在T连接器中通过将经孵育的第一出口溶液与第二稀释溶剂(水)混合可以进行稀释步骤。可以将经孵育的第一出口溶液和第二稀释溶剂以任何适合的流速或速度(例如像，约0.5至1米/秒)提供到T连接器中。在稀释步骤后，相对于第一出口溶液，第二出口溶液中有机溶剂的浓度降低一半。因此，在一些实施例中，第二出口溶液中有机溶剂(例如，乙醇)的浓度小于16.5％。在其他实施例中，在第二出口溶液中有机溶剂(例如，乙醇)的浓度是约10％-15％、约10％-12.5％、约12.5％、或约10％。可以通过切向流过滤浓缩第二出口溶液，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行15X渗滤，以去除起始缓冲液和乙醇，用PBS替换。在切向流过滤后，可收集PBS中经浓缩的包封的核酸纳米颗粒库并进行无菌过滤。存在于通过前述额外工艺步骤产生的配制品中包封的核酸纳米颗粒可以在4℃下稳定储存超过6个月。
根据本文披露的每个实施例，进一步的实施例中核酸是多核糖核苷酸(如mRNA)。例如，根据本文所述的实施例是进一步的实施例，其中核酸流是mRNA流，其包含缓冲溶液中一种或多种mRNA分子的混合物并具有本文披露的线性速度。
VI.免疫动物
用于免疫的宿主动物涵盖可以产生体液(抗体)介导的免疫应答的任何物种。用于免疫的宿主动物(如非人动物)的非限制性实例包括小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、骆驼科动物、马、鸡、狗、猫、猪、驴、牛、猴和鲨。
在本披露中用于产生针对靶蛋白的人抗体的具体方面，携带部分人免疫系统而不是小鼠免疫系统的转基因或转染色体小鼠可以被用作用本文所述的mRNA-LNP复合物免疫的宿主动物。这些转基因和/或转染色体小鼠的非限制性实例包括分别在本文中被称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在本文中被统称为“人Ig小鼠”。
(梅达瑞克斯公司(Medarex,Inc.))包含编码未重排的人重链(μ和γ)和K轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，以及使内源μ和K链基因座失活的靶向突变(参见，例如，Lonberg,等人.,1994Nature[自然]368(6474):856-859)。因此，小鼠表现出小鼠IgM或K的表达降低，并且响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgGK单克隆(Lonberg,N.等人.,1994同上；在Lonberg,N.,1994Handbook of Experimental Pharmacology[实验药理学手册]113:49-101中的综述；Lonberg,N.和Huszar,D.,1995Intern.Rev.Immunol.[国际免疫学评述]13:65-93，以及Harding,F.和Lonberg,N.,1995Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学学术年报]764:536-546)。HuMAb小鼠的制备和用途以及由这样的小鼠进行的基因组修饰被进一步描述于以下文献中：Taylor,L.等人.,1992Nucleic Acids Research[核酸研究]20:6287-6295；Chen,J.等人.,1993International Immunology[国际免疫性]5:647-656；Tuaillon等人.,1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]94:3720-3724；Choi等人.,1993Nature Genetics[自然遗传学]4:117-123；Chen,J.等人.,1993EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:821-830；Tuaillon等人.,1994J.Immunol.[免疫学杂志]152:2912-2920；Taylor,L.等人.,1994International Immunology[国际免疫学]579-591；以及Fishwild,D.等人.,1996Nature Biotechnology[自然生物技术]14:845-851，这些文献的全部内容通过引用以其全文特此并入本文中。另外参见，美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；全部属于Lonberg和Kay；美国专利号5,545,807(属于Surani等人)；PCT公开号WO 92103918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97113852、WO 98/24884和WO 99/45962(均属于Lonberg和Kay)；以及PCT公开号WO 01/14424(属于Korman等人)。
在另一个实施例中，可以通过本文提供的mRNA免疫方法使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠产生人抗体。此类小鼠，在本文中被称为“KM小鼠”，在PCT公开WO 02/43478(属于Ishida等人)中有详细描述。
此外，表达人免疫球蛋白基因的可替代的转基因动物系统是本领域可获得的，并且可以被用作本文提供的mRNA免疫方法的宿主动物。例如，可以使用被称为Xenomouse(安根尼克斯公司(Abgenix,Inc.))的可替代的转基因系统。这样的小鼠描述于例如，美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963(属于Kucherlapati等人)。
此外，表达人免疫球蛋白基因的可替代的转染色体动物系统是本领域可获得的，并且可以被用作本文提供的mRNA免疫方法的宿主动物。例如，可以使用携带人重链转染色体和人轻链转染色体的被称为“TC小鼠”的小鼠；这样的小鼠描述于Tomizuka等人.,2000Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]97:722-727中。此外，携带人重链和轻链转染色体的牛已经描述于本领域中(Kuroiwa等人.,2002Nature Biotechnology[自然生物技术]20:889-894)并且可以被用作用于本文提供的mRNA-免疫方法的宿主动物。
在包封的mRNA介导的免疫后，可以收获来自宿主动物的分泌抗体的细胞(例如像，淋巴细胞、骨髓细胞、浆细胞或脾细胞)并筛选针对含有所需特性的蛋白质靶标而产生的抗体。这可以通过使用基于杂交瘤的技术，直接筛选产生抗体的B细胞，然后克隆和重组抗体产生，或从B细胞生成重组抗体文库，然后在异源表达系统(如噬菌体或酵母展示)中表达和筛选来完成。
在特定的方面，来自宿主动物的分泌抗体的细胞(例如像，淋巴细胞、骨髓细胞、浆细胞或脾细胞)与融合配偶体细胞(例如，永生B细胞癌细胞，例如，永生化骨髓瘤细胞(如F0细胞(CRL-1646)和SP2/0骨髓瘤细胞(CRL-1581)))融合。细胞融合可以通过各种方法进行，例如电融合或化学方案，例如使用聚乙二醇。
在其中小鼠是宿主动物的免疫的情况下，基于杂交瘤的抗体产生，然后进行基于FACS或ELISA的筛选，提供有效的抗体表达和筛选平台。可以在基于杂交瘤的免疫活动的过程中监测靶特异性抗体(即，血清滴度)的循环水平，以评估体液应答的有效性。鉴于与基于mRNA的免疫相关联的高度靶标特异性，可以使用过表达靶蛋白的细胞通过FACS有效监测内在蛋白或膜蛋白的血清滴度。还可以通过ELISA测定可溶性蛋白质的滴度。根据血清滴度，可以调整剂量以达到被认为适合引发B细胞分离和骨髓瘤融合的水平。还可以改变mRNA给予途径(例如，静脉内、皮下、肌内等)以改变免疫应答的程度和可能的多样性。已发现静脉内给予包封的mRNA是产生快速靶特异性滴度的特别有效的途径。
下面概述了一个一般化的免疫方案，作为实例：
第0天：抽血以在免疫初试小鼠中建立基线滴度
第1天(第1次免疫)：用5-100μg，例如，25-50μg包封的mRNA皮下注射4只小鼠和静脉内注射4只小鼠。
第10天：取血以检测血清滴度。
第21天(第2次免疫)：用5-100μg，例如，25-50μg包封的mRNA皮下注射4只小鼠和静脉内注射4只小鼠。
第31天：取血以检测血清滴度。
第42天(最终免疫)：用5-100μg，例如，25-50μg包封的mRNA静脉内注射小鼠。
第45天：收获脾用于分离脾细胞和杂交瘤融合。
在某些方面，一般化的免疫方案可包括用包封的mRNA免疫的组合和其他常规的免疫方法(如重组蛋白免疫或全细胞/全细胞提取物免疫)。例如，第1次免疫包括用包封的mRNA免疫，然后通过常规的免疫方法(如重组蛋白免疫或全细胞/全细胞提取物免疫)进行第2次免疫。在具体的方面，在免疫、血液抽取之间以监测血清滴度、和随后的免疫轮次之间的天数可以变化1、2、3、4、5、6或7天。
VIII.抗体产生
单克隆抗体生成
单克隆抗体(mAb)可通过多种技术产生，包括常规的单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein,1975Nature[自然]256:495的标准体细胞杂交技术。可以使用许多产生单克隆抗体的技术，例如，B淋巴细胞的病毒或致癌转化。
用于制备杂交瘤的动物系统包括鼠科动物、大鼠和兔系统。小鼠中的杂交瘤产生是建立良好的程序。本文所述的免疫方案和用于分离免疫脾细胞用于融合的技术是本领域已知的。融合配偶体(例如，鼠科动物骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的并且已有描述。
可以基于如本文所述制备的非人(例如，鼠科动物)单克隆抗体的序列来制备本披露的嵌合抗体或人源化抗体。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以获得自目的杂交瘤，并使用标准分子生物学技术工程化为含有非鼠科动物的(例如，人)免疫球蛋白序列。例如，为产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠科动物可变区与人恒定区连接(参见，例如，美国专利号4,816,567(术语Cabilly等人))。为产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠科动物CDR区域插入人框架中。参见，例如，美国专利号5225539(属于Winter)和美国专利号5530101；5585089；5693762和6180370(属于Queen等人)。
嵌合抗体是其中抗体的不同部分衍生自不同免疫球蛋白分子的分子。例如，嵌合抗体可包含融合至人抗体恒定区的小鼠或大鼠单克隆抗体的可变区。用于生产嵌合抗体的方法在本领域中是已知的。参见，例如，Morrison,1985,Science[科学]229:1202；Oi等人.,1986,BioTechniques[生物技术]4:214；Gillies等人.,1989,J.Immunol.[免疫学杂志]。
在某些方面，本披露的抗体是人单克隆抗体。可以使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生这种人单克隆抗体。这些转基因和/或转染色体小鼠包括分别在本文中被称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在本文中被统称为“人Ig小鼠”。
Immunology[免疫学]579-591；以及Fishwild,D.等人.,1996NatureBiotechnology[自然生物技术]14:845-851，这些文献的全部内容通过引用以其全文特此并入本文中。另外参见，美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；全部属于Lonberg和Kay；美国专利号5,545,807(属于Surani等人)；PCT公开号WO 92103918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97113852、WO 98/24884和WO 99/45962(均属于Lonberg和Kay)；以及PCT公开号WO 01/14424(属于Korman等人)。
可使用标准的熟知技术分离使用诸如本文所述的技术产生的抗体或抗原结合片段。例如，可以通过常规的免疫球蛋白纯化方法(例如像，蛋白质A-琼脂糖、_羟基磷灰石
色谱、凝胶电泳、透析或亲和层析)从例如培养基、腹水、血清、细胞裂解物、合成反应物质等中适合地分离抗体或抗原结合片段。
实例
提供以下实例是为了说明，除非另有说明，并且不旨在限制本发明。
实例1
包封的mRNA产生流程
步骤一：设计cDNA并克隆到体外转录载体中
设计cDNA构建体
如果天然cDNA序列不包含在亚克隆策略中或在转录前最终构建体的线性化中使用的限制酶的任何共有序列位点，则其可用于亚克隆的目的。在该特定的实例中，用于亚克隆的限制酶是BamHI和RsrII，用于线性化的限制酶是BspQI。然而，可以使用任何适合的限制酶和相应的限制性位点。例如，可以选择在编码目的靶蛋白的特定cDNA中不存在的某些限制性位点用于亚克隆策略和线性化。
使用常规方法，例如使用软件(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific,Inc.))，还可以对天然cDNA序列进行密码子优化以在非人动物(如小鼠或兔)中表达。密码子优化的方法涉及以下的一种或多种：(i)消除隐蔽的剪接位点和RNA去稳定序列元件以增加RNA稳定性；(ii)添加RNA稳定序列元件；(iii)特定表达系统的密码子优化和G/C含量适应；(iv)内含子去除；以及(v)避免稳定的RNA二级结构。
在使用软件的具体的方面，调整密码子优化设置以保护5’/3’限制并将它们排除在分子的其余部分之外。还应排除BspQ1共有序列(正向[GCTCTTC]和反向[GAAGAGC]，因为BspQ1不是回文序列限制酶)。
载体说明
将编码靶蛋白的cDNA(例如，参见表1-7)克隆到设计用于驱动RNA聚合酶介导的T7RNA聚合酶启动子转录的载体中。紧邻T7启动子下游的是编码烟草蚀纹病毒(TEV)的5'非翻译区(UTR)的序列。该UTR已被证明在真核细胞中可提高翻译效率。在TEV UTR的下游，放置靶蛋白的cDNA。将Kozak共有序列(ccgccacc)插入起始甲硫氨酸/起始密码子的上游以增强翻译。将两个终止密码子置于cDNA的末端，然后是RsrII限制性位点。在cDNA序列后是两个串联的人β-珠蛋白3’UTR。已显示该元件增强细胞中的mRNA稳定性。载体的转录相关组分的C末端元件是聚A尾。在具体的实施例中，编码靶蛋白或其片段的mRNA的聚A尾是大约50bps至120bps或60bps至120bps。在特定的实施例中，编码靶蛋白或其片段的mRNA的聚A尾是大约60bps或120bps。在某些实施例中，编码靶蛋白或其片段的mRNA的聚A尾是大约70bps、80bps、90bps、100bps或110bps。
将cDNA克隆到体外转录载体中
用限制酶BamHI/RsrII消化cDNA构建体和载体产生相容的片段，这些片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化，并然后将经纯化的cDNA连接到消化的载体上以产出所需的转录载体构建体。
将连接混合物转化到stbl3感受态细菌细胞中，并接种到氨苄青霉素平板上。将这些平板在37℃下孵育过夜。
在测序之前，通过用亚克隆限制酶消化来对集落进行分类，以验证适当大小的插入物和骨架。还将集落用RsrII和SapI(在37℃有效切割的BspQ1的同分异构体)平行消化以建立聚A尾的完整性。将来自序列验证的克隆的质粒扩增并用于mRNA生成。
步骤二：转录物线性化、体外转录和加帽
根据常规方法制备环状质粒DNA。用BspQI限制性内切核酸酶消化经纯化的质粒DNA。将质粒DNA与适当的反应缓冲液(缓冲液4，新英格兰生物实验室公司(New EnglandBiolabs)，10X储备液)和BspQI酶(1,250U/mg的DNA)合并。将该反应在50℃下孵育2小时，然后置于冰上或4℃下。在标准琼脂糖电泳凝胶上运行少量反应样品，以确认环状质粒DNA的完全线性化。通过乙醇沉淀纯化线性化的DNA模板。使用无核酸酶的水将来自乙醇沉淀步骤的DNA沉淀溶解至浓度>0.5mg/ml。
体外转录和经修饰的合成mRNA的加帽
通过体外转录(IVT)生成该实例的经修饰的合成mRNA，通过氯化锂(LiCl)纯化来进行纯化，并然后使用来自New England(贝弗利，马萨诸塞州，美国)的可商购的试剂盒加帽。材料和试剂示出在表9中。
例如，如表10中所列，组装转录反应，小心使用不含RNA酶的管，吸头并小心操作。
在该实例中用于制备经修饰的合成mRNA的方法按如下进行：
1.将上述材料在30℃下孵育2小时，同时监测温度。通过添加0.04U/μL DNA酶消化DNA模板，并将该反应混合物在37℃下孵育30分钟。
2.添加LiCl至终浓度为2.81M，并将该反应混合物充分混合并在-20℃下孵育超过1小时。然后将该混合物在4℃下以最大速度为大约20,000xg(最大速度)离心15分钟。去除上清液，并用1mL 70％乙醇洗涤沉淀。如上所述将制备物迅速离心10分钟。然后去除上清液，并如上所述将剩余的沉淀再次离心不到一分钟。
3.去除剩余的乙醇，并将沉淀重悬浮于无核酸酶水中。测量浓度并调节至大约1μg/μL。
4.向该制备物中添加10％体积的3M乙酸钠(pH 5.5)，并将该制备物充分混合。然后，向该制备物中添加1体积处于室温的异丙醇，并充分混合。将该制备物在-20℃下孵育过夜。随后，将该制备物在4℃下以约最大速度为20,000xg(最大速度)离心15分钟，去除上清液，并用1mL 70％乙醇洗涤剩余的沉淀。再次，如上所述将制备物迅速离心10分钟，然后去除上清液，并如上所述再次进行离心步骤不到一分钟。
5.去除剩余的乙醇，并将沉淀重悬浮于无核酸酶水中。测量制备物的浓度并调节至大约4μg/μL。
然后可以将经修饰的合成mRNA在-80℃下储存直到加帽，并且在解冻后再次测量浓度。
对于加帽，使用的程序是来自新英格兰生物实验室公司(New England BioLabs)。将合成的mRNA和水混合物在65℃下热变性10分钟，并然后转移到冷块中淬灭5分钟。在使用前立即将S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的储备溶液(32mM)在水中按1:8稀释至4mM，然后以表11中指定的顺序添加剩余的反应组分。
然后，将混合物在37℃下孵育一小时。如上所述，将该样品通过LiCl沉淀进行纯化，并然后储存在-80℃下。
步骤三：确定mRNA质量和功能性
在初始体外转录反应后和/或加帽反应后使用Agilent 2100生物分析仪
分析合成mRNA的质量和完整性。Agilent 2100BioAnalyzer是一种纳米流体装置，该装置可对DNA、RNA或蛋白质的小样本进行大小分级和定量分析。使用Agilent RNA6000Nano Kit(目录号5067-1511)进行分析。
在使用前，所有试剂盒试剂必须在室温下平衡30分钟。将来自试剂盒的合成mRNA样品和梯储存在冰上。
准备凝胶、凝胶/染料混合物和样品
将凝胶基质(550μL)移液到旋转过滤器中，并在室温下以1,500g离心10分钟，然后在4℃下储存(在1个月内使用)。将染料原液(1μl)添加到65μl等分试样的经过滤的凝胶基质中。将染料和凝胶基质混合物涡旋，并然后在室温下以13,000g离心10分钟(在1天内使用)。将mRNA样品和梯以及试剂盒标准品在70℃下热变性3-5分钟以破环任何更高级的结构，然后在分析之前在冰上淬火。
净化生物分析仪(Bioanalyzer)电极
用350μl的RNaseZap电极清洁仪和无核酸酶水净化生物分析仪电极。
将凝胶/染料混合物加载到芯片上
将新芯片置于生物分析仪的引发站(位置C处的平台，顶部位置处夹住)，并将9μl凝胶/染料混合物添加到孔中。
将样品加载到芯片上
将5μl体积的标记物添加到梯孔和样品孔中，并将1μl体积的mRNA样品(<1μg)添加到样品孔中。使用IKA Vortexer以2400rpm涡旋1分钟。然后使用mRNA测定方法在Agilent2100生物分析仪上运行样品。参见图4，针对使用腺嘌呤、鸟嘌呤、胞苷和尿苷或假尿苷合成的人RXFP1(密码子和非密码子优化的)制备的mRNA的样品生物分析仪迹线。
mRNA转染到培养的哺乳动物细胞中，并且进行蛋白质印迹来确认编码的蛋白质的表达
通过使用来自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)的2000试剂将mRNA体外转染到培养的哺乳动物细胞中来评估可译性。然后在24至48小时后裂解转染的细胞，并使用聚丙烯酰胺凝胶电泳解析裂解物中的蛋白质，然后用对由mRNA编码的蛋白质特异的抗体进行免疫印迹(参见图5中用于说明确认来自mRNA的人RXFP1的表达的样品蛋白质印迹)。
步骤4.在递送运载体中包装经修饰的合成mRNA
在该实例中使用的材料如下所示：
脂质A的化学结构
脂质B的化学结构
脂质C的化学结构
1.将编码靶蛋白的经修饰的合成mRNA(例如，参见表1-7)以阳离子脂质胺基团比mRNA磷酸基团(N:P)的摩尔比＝4:1包装到脂质纳米颗粒中，透析并浓缩。例如，显示了方案的量，得到处于浓度>0.4mg/mL的mRNA约2mg包装的经修饰的合成mRNA。
2.使用不含RNA酶的试剂、试管、吸头和操作，对脂质纳米颗粒混合物试剂称重并如表13中所述在小瓶中混合。
3.将乙醇添加到脂质中，代表所需体积的1.1x比率，以便于加工。将混合物进行短暂超声处理并在37℃下温和搅动5分钟。随后，将混合物在37℃下不搅动孵育直至准备使用。
4.通过将mRNA溶液加载到Amicon Ultra-15离心装置上并在4℃下以4,000rpm离心15分钟，将经修饰的合成mRNA从水交换到pH 6.0的缓冲液中。将浓缩的mRNA重悬于pH6.0柠檬酸盐缓冲液中并测量mRNA浓度。
5.在漂洗的闪烁瓶(8mL中4mg mRNA)中制备在pH 6.0柠檬酸盐缓冲液中的浓度为0.5mg/mL的最终修饰的合成mRNA，并测量mRNA溶液的终浓度。将mRNA稀释液在37℃下孵育直至准备使用。
6.制备三个10ml的注射器，具有8mL的以下每种：(a)脂质混合物；(b)mRNA溶液；(c)柠檬酸盐缓冲液。将注射器(a)和(b)附接到T形接头的鲁尔接头上。简言之，将具有内径为0.5mm的P727T型混合器附接到P652适配器(IDEX，橡树港，华盛顿，美国)上。将注射器(a)和(b)附接到P658鲁尔接头(IDEX)上。将注射器(a)和(b)通过具有P938x螺母和套圈(IDEX)的PTFE 0.8mm内径管(#3200068，白云石，罗伊斯顿，英国)附接到T-混合器上。通过P938x螺母和套圈将注射器(c)附接到与最终单管连接的鲁尔接头上。将管的末端在具有搅拌棒的预先冲洗的烧杯上固定在一起并轻轻搅拌。
7.将注射泵设置设定为符合适合的注射器制造商和尺寸，并输入体积(8mL)和1.0mL/min的流速。启动泵，并将所得材料收集到具有搅拌棒的不含RNA酶的50mL塑料烧杯中。将含有mRNA的脂质纳米颗粒的悬浮液转移至透析袋中(每袋2-3mL)，并在4℃下过夜透析到磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
8.将分开的材料合并到一个15mL锥形管中。使用切向流过滤(TFF)浓缩脂质纳米颗粒(LNP)悬浮液。使用新鲜管将新鲜的500K分子量截留胶囊连接到Minimate系统，通过用500mL不含RNA的水以150rpm的流速冲洗来制备TFF系统。
9.将脂质纳米颗粒/经修饰的合成mRNA悬浮液加载到TFF单元储库中，并以75mL/min的流速浓缩至2-3ml终体积。
10.使用来自生命技术公司(Life Technologies)(格兰德艾兰，纽约，美国)的Quant-iT Ribogreen RNA测定试剂盒测定经修饰的合成mRNA的包封百分比。通过在缓冲液(颗粒外的mRNA)和缓冲液加去污剂(总mRNA)中的荧光测量来测定脂质纳米颗粒/经修饰的合成mRNA悬浮液。制备来自所提供的核糖体RNA的1000ng/mL储备液并用于产生Ribogreen测定的标准曲线。对于测定，样品在TE缓冲液或TE加Triton中制备，并将荧光试剂加入各个样品中。计算的差异是颗粒内的mRNA。
11.以适当的稀释在TE缓冲液和TE缓冲液+0.75％Triton X-100中制备样品，使得读数在标准曲线中(400-600倍)。将100μL标准品/样品添加到96孔板中的每孔。将Ribogreen试剂在TE缓冲液中1:200稀释，并向每个孔中添加100μL。
12.使用荧光酶标仪测量样品荧光，在480nm处激发，在520nm处发射。从每个RNA样品的荧光值中减去试剂空白的荧光值，以产生荧光对RNA浓度的标准曲线。从每个样品的荧光值中减去试剂空白的荧光值，并测定来自标准曲线的样品的RNA浓度。通过将样品加Triton和仅样品之间的浓度差除以样品加Triton浓度来确定该样品的包封百分比。制备6倍稀释的脂质纳米颗粒/经修饰的合成悬浮液，并使用Zetasizer Nano ZS仪器(马尔文仪器公司(Malvern Instruments,Ltd)，伍斯特郡，英国)测定直径和多分散指数。
表15.RXFP1配制品的包封特性的实例。
实例2-RXFP1的免疫策略
GPCR靶蛋白(如人RXFP1)的免疫策略的概述示出在表16中。
表16
经皮下(s.c.)或静脉内(i.v.)途径，用100μg包装的人RXFP1 mRNA(例如，参见表1)、过表达hRXFP1的Ba/F3细胞的106个细胞/ml、或过表达衍生自300.19或HEK293细胞的人RXFP1的50μg病毒样颗粒(VLP)使雌性BALB/c小鼠免疫。在引发免疫后10天检查滴度(如图1A所示)。在先前免疫后21天递送加强免疫。
获得总共207个产生RXFP1特异性抗体的杂交瘤，并进一步筛选以鉴定10个具有在pM和nM范围内的高亲和力的抗RXFP1单克隆抗体。
图1B显示在免疫后10天，用病毒样颗粒或过表达RXFP1的细胞(示例性靶蛋白免疫原)免疫未能引起任何显著的抗体滴度。相比之下，用mRNA-LNP免疫产生的滴度比背景高2至12倍。该数据表明，与常规方法(例如使用病毒样颗粒或过表达靶基因免疫原的细胞)相比，mRNA-LNP免疫赋予针对靶蛋白免疫原更强的免疫应答(例如，血清中更高的抗体滴度)。
图1C显示加强免疫步骤(例如，第2次给予免疫原)后动物的抗体滴度(图1B)。与用mRNA进行两种免疫(引发免疫和加强免疫)中的仅一种进行免疫(s.c.)的小鼠和用VLP或用过表达针对其他免疫之一的RXFP1的细胞进行免疫(s.c.)的小鼠相比，对于第1次和第2次免疫都用mRNA进行免疫(s.c.)的小鼠表现出更高的抗体滴度。对于经静脉内(i.v.)给予的免疫，引发免疫和加强免疫二者都使用mRNA的免疫策略与两种免疫中仅一种使用mRNA的免疫策略的抗体滴度的差异较小。平均地，所有静脉内(i.v.)免疫的滴度高于皮下(s.c.)免疫。
图1D示出了从基于mRNA的免疫获得的三种样品RXFP1特异性单克隆杂交瘤培养物的FACS图。克隆显示出与
非RXFP1表达细胞(300.19亲本的)的最小交叉反应性和与过表达人RXFP1(300.19hRXFP1和Ba/F3hRXFP1)的细胞的显著结合。
图2描绘了多通道跨膜蛋白SLC52A2的免疫策略，和所得的基于FACS的血清应答。用编码SLC52A2的mRNA(例如，参见表2)仅进行两轮免疫是唯一能够引发靶特异性抗体滴度的抗原；用传统抗原(例如过表达细胞、VLP和编码胞外环(EC2)的肽)免疫两到四轮，并且以各种组合，未能引发靶特异性滴度。因为在用这些免疫原形式免疫的小鼠血清中无可检测的靶特异性IgG，所以未启动杂交瘤融合。在用这些传统抗原免疫的动物血浆中未能检测到靶特异性IgG，表明SLC52A2是一种免疫原性差的蛋白质。然而，在用mRNA-LNP免疫的小鼠中，启动了杂交瘤融合。从12,880个杂交瘤孔的库中鉴定出总共228个能够产生SLC52A2特异性抗体的杂交瘤，通常这些孔的约三分之一(1/3)中含有杂交瘤(大约超过4,290个杂交瘤)。因此，图2中显示的数据表明，本文所述的mRNA免疫方法令人惊讶地优于跨膜蛋白(例如多通道跨膜蛋白(例如SLC52A2))的传统抗原形式，因为它是可以产生靶特异性血清滴度的唯一手段。
实例3-ANGPTL8的免疫策略
难以表达的靶蛋白(如人ANGPTL8)的免疫策略的概述示出在表17中。与用于产生特异性抗体的ANGPTL8的重组表达相关联的问题的实例包括低产量、低分泌和聚集。例如，使用标准表达方案，所得蛋白质似乎表现出超过90％聚集。
表17
引发免疫 加强 最终加强
mRNA(iv) mRNA(sc) 融合蛋白(iv)
mRNA(sc) 融合蛋白(sc) mRNA(iv)
融合蛋白(sc) 融合蛋白(sc) mRNA(iv)
用50μg包装的人ANGPTL8 mRNA(例如，参见表3)或50μg HSA-ANGPTL8融合蛋白质免疫雌性BALB/c小鼠。在引发免疫后10天和第一次加强后检查滴度。第一次加强免疫在引发免疫后21天递送，并在第一次加强后25天递送最终加强免疫。将编码人ANGPTL8的mRNA或用经纯化的重组人ANGPTL8蛋白给予小鼠导致在小鼠中针对人ANGPTL8的大致相当的有效免疫应答。生成产生ANGPTL8特异性抗体的杂交瘤，并从进一步筛选中获得高亲和力ANGPTL8抗体。这些结果证实本文提供的mRNA-LNP免疫方法是用于产生针对难以表达的靶蛋白(如人ANGPTL8)的抗体的有效策略。
实例4-半乳凝素-3的免疫策略
凝集素结合蛋白(如半乳凝素-3)的免疫策略的概述示出在表18中。
如表18中所示，用与LNP复合的2mg/kg mRNA或20μg重组蛋白质来免疫BALB/c小鼠。在最终加强后7天测定血浆抗半乳凝素-3IgG滴度，该滴度在第55天递送。
图3显示当与使用经纯化的重组蛋白(传统免疫原)相比时，将半乳凝素-3 mRNA用作最终加强剂导致显著更高的靶特异性IgG滴度。无论抗原是皮下递送还是静脉内递送，都观察到这种效果。
生成产生半乳凝素-3特异性抗体的杂交瘤，并从进一步筛选中获得高亲和力单克隆抗半乳凝素-3抗体。
表18
由mRNA介导的免疫可达到的击中率的概述
表19提供了筛选的杂交瘤孔总数(通常约三分之一(1/3)的孔含有杂交瘤)的靶蛋白特异性汇总，以及使用脂质包封的mRNA作为免疫原后从那些杂交瘤孔中获得的经确认的靶特异性抗体的数量。
表20提供了mRNA-LNP免疫方法与其他常规免疫方法的产生靶特异性抗体的杂交瘤数量的比较。通常，这些数据表明mRNA-LNP免疫是用于诱导针对靶蛋白抗原的免疫应答和用于获得靶蛋白特异性抗体的更高数量/速率的有效方法。特别地，这些结果证实与用于获得对跨膜蛋白(例如，多通道跨膜蛋白，如GPCR，难以产生针对其的抗体)和免疫原性差的蛋白质(例如，在用传统抗原免疫的动物血浆中产生低或不可检测的靶特异性IgG的蛋白质)特异性的抗体的常规免疫方法相比，mRNA-LNP免疫出乎意料地更有效。
表19
表20：免疫方法以及产生靶特异性抗体的杂交瘤的数量
1-用单独地mRNA-LNP或与另一种抗原形式(例如，蛋白质/肽)组合的免疫。
2-Sanders等人.2002Thyroid stimulating monoclonal antibodies[甲状腺刺激的单克隆抗体]Thyroid[甲状腺]12(12):1043-1050。
3-Oda等人.2000.Epitope analysis of the human thyrotropin(TSH)receptorusing monoclonal antibodies[使用单克隆抗体的人促甲状腺激素(TSH)受体的表位分析]Thyroid[甲状腺]10(12):1051-1059。
ND-未确定的；未测试的抗原形式
NST-未检测到特异性滴度。因为在血浆中没有可检测的靶特异性IgG滴度，所以在这些组中没有启动生成杂交瘤。
通常，利用如本文示例的mRNA-LNP免疫方法，已经针对至少15种不同的靶标实现了成功生成产生抗原特异性抗体的杂交瘤。这些结果表明，本文所述的mRNA免疫方法能够在宿主动物中引发针对广泛的抗原(例如，跨膜蛋白，例如多通道跨膜蛋白，如GPCR)的免疫应答，并且是用于产生高亲和力单克隆抗体的有效方法，该单克隆抗体可以作为亲本用于生成嵌合变体、人源化变体和亲和力成熟变体。
引用参考
本文引用的所有参考，包括专利、专利申请、论文、教科书等，以及其中引用的参考，在它们尚未的程度上，在此通过引用以其全部内容结合在此。
等同物
前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。前面的描述和实例详述了本发明的某些实施例。然而，将理解的是无论前述内容如何详细地出现在文本中，本发明可以按多种方式实施，并且本发明应该根据所附权利要求及其任何等同物来解释。

Claims (48)

1.一种用于产生针对靶蛋白的单克隆抗体的方法，该方法包括以下步骤：(a)将至少一种阳离子脂质与编码该靶蛋白或其片段的多核糖核苷酸例如信使RNA(mRNA)混合，从而形成阳离子脂质-多核糖核苷酸复合物；(b)向非人动物给予该脂质-多核糖核苷酸复合物；和(c)从该动物获得与该靶蛋白特异性结合的抗体。
2.一种用于产生针对靶蛋白的单克隆抗体的方法，该方法包括以下步骤：(a)向非人动物给予脂质-多核糖核苷酸复合物，其中该复合物包含至少一种阳离子脂质和编码该靶蛋白或其片段的多核糖核苷酸，例如mRNA，从而引起对该靶蛋白的免疫应答；和(b)从该动物获得与该靶蛋白特异性结合的抗体。
3.一种用于在非人动物中诱发对靶蛋白的免疫应答的方法，该方法包括以下步骤：向该动物给予脂质-多核苷酸复合物，其中该脂质-多核苷酸复合物包含阳离子脂质和编码靶蛋白的mRNA，其中该靶蛋白来自不同于该动物的物种。
4.如权利要求1、2或3所述的方法，其中该靶蛋白是跨膜蛋白。
5.如权利要求4所述的方法，其中该跨膜蛋白选自以下：
(i)G蛋白偶联受体(GPCR)；
(ii)单通道跨膜蛋白受体；
(iii)肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)成员；
(iv)白细胞介素(IL)受体；
(v)离子通道；
(vi)溶质载体；
(vii)免疫受体；以及
(viii)多通道跨膜蛋白。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中该跨膜蛋白是G蛋白偶联受体(GPCR)。
7.如权利要求6所述的方法，其中该GPCR是RXFP1、TSHR、APJ、GPR40、GPR64、GPR4或GPR15。
8.如权利要求4或5所述的方法，其中该跨膜蛋白是单通道跨膜蛋白受体，如GP130。
9.如权利要求4或5所述的方法，其中该跨膜蛋白是多通道跨膜蛋白，如SLC52A2。
10.如权利要求4或5所述的方法，其中该跨膜蛋白是白细胞介素(IL)受体，如IL-1受体、IL-2受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-5受体、IL-6受体、IL-7受体、IL-8受体、IL-9受体、IL-10受体、IL-11受体、IL-12受体、IL-13受体、IL-14受体、IL-15受体、IL-16受体、IL-17受体、IL-18受体、IL-19受体、IL-20受体、IL-21受体、IL-22受体、IL-23受体、IL-24受体、IL-25受体、IL-26受体、IL-27受体、IL-28受体、IL-29受体、IL-30受体、IL-31受体、IL-32受体、IL-33受体、IL-35受体、或IL-36受体。
11.如权利要求4或5所述的方法，其中该跨膜蛋白是选自下组的肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)成员，该组由以下组成：TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF3、TNFRSF4、TNFRSF5、TNFRSF6、TNFRSF6B、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF10C、TNFRSF10D、TNFRSF11A、TNFRSF11B、TNFRSF12A、TNFRSF13B、TNFRSF13C、TNFRSF14、TNFRSF16、TNFRSF17、TNFRSF18、TNFRSF19、TNFRSF21、TNFRSF25、和TNFRSF27。
12.如权利要求4或5所述的方法，其中该跨膜蛋白是离子通道，如TMEM16A。
13.如权利要求4或5所述的方法，其中该跨膜蛋白是溶质载体。
14.如权利要求1、2或3所述的方法，其中该靶蛋白选自以下：
ACKR1、ACKR2、ACKR3、ACKR4、ADCYAP1R1、ADGRA1、ADGRA2、ADGRA3、ADGRB1、ADGRB2、ADGRB3、ADGRD1、ADGRD2、ADGRE1、ADGRE2、ADGRE3、ADGRE4P、ADGRE5、ADGRF1、ADGRF2、ADGRF3、ADGRF4、ADGRF5、ADGRG1、ADGRG2、ADGRG3、ADGRG4、ADGRG5、ADGRG6、ADGRG7、ADGRL1、ADGRL2、ADGRL3、ADGRL4、ADGRV1、ADORA1、ADORA2A、ADORA2B、ADORA3、ADRA1A、ADRA1B、ADRA1D、ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、ADRB1、ADRB2、ADRB3、AGTR1、AGTR2、APLNR/APJ、ASGR1、ASGR2、AVPR1A、AVPR1B、AVPR2、BDKRB1、BDKRB2、BRS3、BRS3、C3AR1、C5AR1、C5AR2、CALCR、CALCRL、CASR、CCKAR、CCKBR、CCR1、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCRL2、CELSR1、CELSR2、CELSR3、CHRM1、CHRM2、CHRM3、CHRM4、CHRM5、CMKLR1、CNR1、CNR2、CRHR1、CRHR2、CX3CR1、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CYSLTR1、CYSLTR2、DRD1、DRD2、DRD3、DRD4、DRD5、EDNRA、EDNRB、F2R、F2RL1、F2RL2、F2RL3、FFAR1、FFAR2、FFAR3、FFAR4、FPR1、FPR2、FPR2、FPR3、FSHR、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、GABBR1、GABBR2、GALR1、GALR2、GALR3、GCGR、GHRHR、GHSR、GIPR、GLP1R、GLP2R、GNRHR、GNRHR2、GPBAR1、GPER1、GPR1、GPR4、GPR12、GPR15、GPR17、GPR18、GPR19、GPR20、GPR21、GPR22、GPR25、GPR26、GPR27、GPR3、GPR31、GPR32、GPR33、GPR34、GPR35、GPR37、GPR37L1、GPR39、GPR40、GPR42、GPR42、GPR45、GPR50、GPR52、GPR55、GPR6、GPR61、GPR62、GPR63、GPR65、GPR68、GPR75、GPR78、GPR79、GPR82、GPR83、GPR84、GPR85、GPR87、GPR88、GPR101、GPR107、GPR132、GPR135、GPR137、GPR139、GPR141、GPR142、GPR143、GPR146、GPR148、GPR149、GPR15、GPR150、GPR151、GPR152、GPR153、GPR156、GPR157、GPR158、GPR160、GPR161、GPR162、GPR171、GPR173、GPR174、GPR176、GPR179、GPR182、GPR183、GPRC5A、GPRC5B、GPRC5C、GPRC5D、GPRC6A、GRM1、GRM2、GRM3、GRM4、GRM5、GRM6、GRM7、GRM8、GRPR、HCAR1、HCAR2、HCAR3、HCRTR1、HCRTR2、HRH1、HRH2、HRH3、HRH4、HTR1A、HTR1B、HTR1D、HTR1E、HTR1F、HTR2A、HTR2B、HTR2C、HTR4、HTR5A、HTR5BP、HTR6、HTR7、KISS1R、LGR3、LGR4、LGR5、LGR6、LHCGR、LPAR1、LPAR2、LPAR3、LPAR4、LPAR5、LPAR6、LTB4R、LTB4R2、MAS1、MAS1L、MC1R、MC2R、MC3R、MC4R、MC5R、MCHR1、MCHR2、MLNR、MRGPRD、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRG、MRGPRX1、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、MTNR1A、MTNR1B、NMBR、NMUR1、NMUR2、NPBWR1、NPBWR2、NPFFR1、NPFFR2、NPSR1、NPY1R、NPY2R、NPY4R、NPY5R、NPY6R、NTSR1、NTSR2、OPN3、OPN4、OPN5、OPRD1、OPRK1、OPRL1、OPRM1、OR51E1、OXER1、OXGR1、OXTR、P2RY1、P2RY10、P2RY11、P2RY12、P2RY13、P2RY14、P2RY2、P2RY4、P2RY6、P2RY8、PRLHR、PROKR1、PROKR2、PTAFR、PTGDR、PTGDR2、PTGER1、PTGER2、PTGER3、PTGER4、PTGFR、PTGIR、PTH1R、PTH2R、QRFPR、RXFP1、RXFP2、RXFP3、RXFP4、S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4、S1PR5、SCTR、SMO、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、SUCNR1、TAAR1、TAAR2、TAAR3、TAAR4P、TAAR5、TAAR6、TAAR8、TAAR9、TACR1、TACR2、TACR3、TAS1R1、TAS1R2、TAS1R3、TAS2R1、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R19、TAS2R20、TAS2R3、TAS2R30、TAS2R31、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R4、TAS2R40、TAS2R41、TAS2R42、TAS2R43、TAS2R45、TAS2R46、TAS2R5、TAS2R50、TAS2R60、TAS2R7、TAS2R8、TAS2R9、TBXA2R、TPRA1、TRHR、TSHR、UTS2R、VIPR1、VIPR2、XCR1、TCR-α、TCR-β、CD3、δ-链辅助因子、CD4、CD8、SIGIRR、甘露糖受体(MR)、脱唾液酸糖蛋白受体家族(例如，脱唾液酸糖蛋白受体巨噬细胞半乳糖型凝集素(MGL))、DC-SIGN(CLEC4L)、朗格汉斯蛋白(CLEC4K)、髓样DAP12-关联性凝集素(MDL)-1(CLEC5A)、树突状细胞植物血凝素1/CLEC7A、DNGR1/CLEC9A、髓样C型凝集素样受体(MICL)(CLEC12A)、CLEC2(还被称为CLEC1B)、CLEC12B、DCIR/CLEC4A、树突状细胞植物血凝素2/CLEC6A、血DC抗原2(BDCA2)(CLEC4C)、巨噬细胞诱导的C型凝集素(CLEC4E)、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12、TLR13、FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB1(CD32)、FcγRIIB2(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)、FcεRI、FcεRII(CD23)、FcαR1(CD89)、Fcα/μR、FcRn、CD27、CD40、OX40、GITR、CD137、PD-1、CTLA-4、PD-L1、TIGIT、T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(TIM3)、T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、CD28、CD122、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、FAM159B、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLA-DRB1、gp130、IL-1受体、IL-2受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-5受体、IL-6受体、IL-7受体、IL-8受体、IL-9受体、IL-10受体、IL-11受体、IL-12受体、IL-13受体、IL-14受体、IL-15受体、IL-16受体、IL-17受体、IL-18受体、IL-19受体、IL-20受体、IL-21受体、IL-22受体、IL-23受体、IL-24受体、IL-25受体、IL-26受体、IL-27受体、IL-28受体、IL-29受体、IL-30受体、IL-31受体、IL-32受体、IL-33受体、IL-35受体、IL-36受体、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF3、TNFRSF4、TNFRSF5、TNFRSF6、TNFRSF6B、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF10C、TNFRSF10D、TNFRSF11A、TNFRSF11B、TNFRSF12A、TNFRSF13B、TNFRSF13C、TNFRSF14、TNFRSF16、TNFRSF17、TNFRSF18、TNFRSF19、TNFRSF21、TNFRSF25、TNFRSF27、SCN1A、SCN1B、SCN2A、SCN2B、SCN3A、SCN3B、SCN4A、SCN5A、SCN7A、SCN8A、SCN9A、SCN10A、SCN11A、CACNA1A、CACNA1B、CACNA1C、CACNA1D、CACNA1E、CACNA1F、CACNA1G、CACNA1H、CACNA1I、CACNA1S、TRPA1、TRPC1、TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6、TRPC7、TRPM1、TRPM2、TRPM3、TRPM4、TRPM5、TRPM6、TRPM7、TRPM8、MCOLN1、MCOLN2、MCOLN3、PKD1、PKD2、PKD2L1、PKD2L2、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPV5、TRPV6、CATSPER1、CATSPER2、CATSPER3、CATSPER4、TPCN1、TPCN2、CNGA1、CNGA2、CNGA3、CNGA4、CNGB1、CNGB3、HCN1、HCN2、HCN3、HCN4、KCNMA1、KCNN1、KCNN2、KCNN3、KCNN4、KCNT1、KCNT2、KCNU1、KCNA1、KCNA2、KCNA3、KCNA4、KCNA5、KCNA6、KCNA7、KCNA10、KCNB1、KCNB2、KCNC1、KCNC2、KCNC3、KCNC4、KCND1、KCND2、KCND3、KCNF1、KCNG1、KCNG2、KCNG3、KCNG4、KCNH1、KCNH2、KCNH3、KCNH4、KCNH5、KCNH6、KCNH7、KCNH8、KCNQ1、KCNQ2、KCNQ3、KCNQ4、KCNQ5、KCNS1、KCNS2、KCNS3、KCNV1、KCNV2、KCNJ1、KCNJ2、KCNJ3、、KCNJ4、KCNJ5、KCNJ6、KCNJ8、KCNJ9、KCNJ10、KCNJ11、KCNJ12、KCNJ13、KCNJ14、KCNJ15、KCNJ16、KCNJ18、KCNK1、KCNK2、KCNK3、KCNK4、KCNK5、KCNK6、KCNK7、KCNK9、KCNK10、KCNK12、KCNK13、KCNK15、KCNK16、KCNK17、KCNK18、HVCN1、HTR3A、HTR3B、HTR3C、HTR3D、HTR3E、CHRNA1、CHRNA2、CHRNA3、CHRNA4、CHRNA5、CHRNA6、CHRNA7、CHRNA9、CHRNA10、CHRNB1、CHRNB2、CHRNB3、CHRNB4、CHRND、CHRNE、CHRNG、GABRA1、GABRA2、GABRA3、GABRA4、GABRA5、GABRA6、GABRB1、GABRB2、GABRB3、GABRD、GABRE、GABRG1、GABRG2、GABRG3、GABRP、GABRQ、GABRR1、GABRR2、GABRR3、GRIA1、GRIA2、GRIA3、GRIA4、GRID1、GRID2、GRIK1、GRIK2、GRIK3、GRIK4、GRIK5、GRIN1、GRIN2A、GRIN2B、GRIN2C、GRIN2D、GRIN3A、GRIN3B、GLRA1、GLRA2、GLRA3、GLRA4、P2RX1、P2RX2、P2RX3、P2RX4、P2RX5、P2RX6、P2RX7、ZACN、ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4、AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、AQP6、AQP7、AQP8、AQP9、AQP10、AQP11、AQP12A、AQP12B、MIP、CLCN1、CLCN2、CLCN3、CLCN4、CLCN5、CLCN6、CLCN7、CLCNKA、CLCNKB、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)、ANO1、ANO2、ANO3、ANO4、ANO5、ANO6、ANO7、ANO8、ANO9、ANO10、BEST1、BEST2、BEST3、BEST4、CLIC1、CLIC2、CLIC3、CLIC4、CLIC5、CLIC6、GJA1、GJA3、GJA4、GJA5、GJA6P、GJA8、GJA9、GJA10、GJB1、GJB2、GJB3、GJB4、GJB5、GJB6、GJB7、GJC1、GJC2、GJC3、GJD2、GJD3、GJD4、GJE1、ITPR1、ITPR2、ITPR3、PANX1、PANX2、PANX3、RYR1、RYR2、RYR3、NALCN、SCNN1A、SCNN1B、SCNN1D、SCNN1G、TEM16A、ADAMTS7、ANGPTL3、ANGPTL4、ANGPTL8、LPL、GDF15、半乳凝素-1、半乳凝素-2、半乳凝素-3、半乳凝素-4、半乳凝素-7、半乳凝素-8、半乳凝素-9、半乳凝素-10、半乳凝素-12、半乳凝素-13、基质gla蛋白(MGP)、PRNP、DGAT1、GPAT3、DMC1、BLM、BRCA2、K型人内源性逆转录病毒(HERV-K)家族的成员、外核苷三磷酸酯二磷酸水解酶1(ENTPD1)、外核苷三磷酸酯二磷酸水解酶2(ENTPD2)、SLC1A1、SLC1A2、SLC1A3、SLC1A4、SLC1A5、SLC1A6、SLC1A7、SLC2A1、SLC2A2、SLC2A3、SLC2A4、SLC2A5、SLC2A6、SLC2A7、SLC2A8、SLC2A9、SLC2A10、SLC2A11、SLC2A12、SLC2A13、SLC2A14、SLC3A1、SLC3A2、SLC4A1、SLC4A2、SLC4A3、SLC4A4、SLC4A5、SLC4A6、SLC4A7、SLC4A8、SLC4A9、SLC4A10、SLC4A11、SLC5A1、SLC5A2、SLC5A3、SLC5A4、SLC5A5、SLC5A6、SLC5A7、SLC5A8、SLC5A9、SLC5A10、SLC5A11、SLC5A12、SLC6A1、SLC6A2、SLC6A3、SLC6A4、SLC6A5、SLC6A6、SLC6A7、SLC6A8、SLC6A9、SLC6A10、SLC6A11、SLC6A12、SLC6A13、SLC6A14、SLC6A15、SLC6A16、SLC6A17、SLC6A18、SLC6A19、SLC6A20、SLC7A5、SLC7A6、SLC7A7、SLC7A8、SLC7A9、SLC7A10、SLC7A11、SLC7A13、SLC7A14、SLC8A1、SLC8A2、SLC8A3、SLC9A1、SLC9A2、SLC9A3、SLC9A4、SLC9A5、SLC9A6、SLC9A7、SLC9A8、SLC9A9、SLC9A10、SLC9A11、SLC9B1、SLC9B2、SLC10A1、SLC10A2、SLC10A3、SLC10A4、SLC10A5、SLC10A6、SLC10A7、SLC11A1、SLC11A2、SLC12A1、SLC12A2、SLC12A3、SLC12A4、SLC12A5、SLC12A6、SLC12A7、SLC12A8、SLC12A9、SLC13A1、SLC13A2、SLC13A3、SLC13A4、SLC13A5、SLC14A1、SLC14A2、SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3、SLC15A4、SLC16A1、SLC16A2、SLC16A3、SLC16A4、SLC16A5、SLC16A6、SLC16A7、SLC16A8、SLC16A9、SLC16A10、SLC16A11、SLC16A12、SLC16A13、SLC16A14、SLC17A1、SLC17A2、SLC17A3、SLC17A4、SLC17A5、SLC17A6、SLC17A7、SLC17A8、SLC17A9、SLC18A1、SLC18A2、SLC18A3、SLC19A1、SLC19A2、SLC19A3、SLC20A1、SLC20A2、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B3、SLCO1C1、SLCO2A1、SLCO2B1、SLCO3A1、SLCO4A1、SLCO4C1、SLCO5A1、SLCO6A1、SLC22A1、SLC22A2、SLC22A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC22A6、SLC22A7、SLC22A8、SLC22A9、SLC22A10、SLC22A11、SLC22A12、SLC22A13、SLC22A14、SLC22A15、SLC22A16、SLC22A17、SLC22A18、SLC22A18AS,SLC22A19、SLC22A20、SLC22A23、SLC22A24、SLC22A25、SLC22A31、SLC23A1、SLC23A2、SLC23A3、SLC23A4、SLC24A1、SLC24A2、SLC24A3、SLC24A4、SLC24A5、SLC24A6、SLC25A1、SLC25A2、SLC25A3、SLC25A4、SLC25A5、SLC25A6、SLC25A7、SLC25A8、SLC25A9、SLC25A10、SLC25A11、SLC25A12、SLC25A13、SLC25A14、SLC25A15、SLC25A16、SLC25A17、SLC25A18、SLC25A19,SLC25A20、SLC25A21、SLC25A22、SLC25A23、SLC25A24、SLC25A25、SLC25A26、SLC25A27、SLC25A28、SLC25A29、SLC25A30、SLC25A31、SLC25A32、SLC25A33、SLC25A34、SLC25A35、SLC25A36、SLC25A37,SLC25A38、SLC25A39、SLC25A40、SLC25A41、SLC25A42、SLC25A43、SLC25A44、SLC25A45、SLC25A46、SLC26A1、SLC26A2、SLC26A3、SLC26A4、SLC26A5、SLC26A6、SLC26A7、SLC26A8、SLC26A9、SLC26A10、SLC26A11、SLC27A1、SLC27A2、SLC27A3、SLC27A4、SLC27A5、SLC27A6、SLC28A1、SLC28A2、SLC28A3、SLC29A1、SLC29A2、SLC29A3、SLC29A4、SLC30A1、SLC30A2、SLC30A3、SLC30A4、SLC30A5、SLC30A6、SLC30A7、SLC30A8、SLC30A9、SLC30A10、SLC31A1、SLC31A2、SLC32A1、SLC33A1、SLC34A1、SLC34A2、SLC34A3、SLC35A1、SLC35A2、SLC35A3、SLC35A4、SLC35A5、SLC35B1、SLC35B2、SLC35B3、SLC35B4、SLC35C1、SLC35C2、SLC35D1、SLC35D2、SLC35D3、SLC35E1、SLC35E2、SLC35E3、SLC35E4、SLC35F1、SLC35F2、SLC35F3、SLC35F4、SLC35F5、SLC35G1、SLC35G3、SLC35G4、SLC35G5、SLC35G6、SLC36A1、SLC36A2、SLC36A3、SLC36A4、SLC37A1、SLC37A2、SLC37A3、SLC37A4、SLC38A1、SLC38A2、SLC38A3、SLC38A4、SLC38A5、SLC38A6、SLC38A7、SLC38A8、SLC38A9、SLC38A10、SLC38A11、SLC39A1、SLC39A2、SLC39A3、SLC39A4、SLC39A5、SLC39A6、SLC39A7、SLC39A8、SLC39A9、SLC39A10、SLC39A11、SLC39A12、SLC39A13、SLC39A14、SLC40A1、SLC41A1、SLC41A2、SLC41A3、RhAG、RhBG、RhCG、SLC43A1、SLC43A2、SLC43A3、SLC44A1、SLC44A2、SLC44A3、SLC44A4、SLC44A5、SLC45A1、SLC45A2、SLC45A3、SLC45A4、SLC46A1、SLC46A2、SLC46A3、SLC47A1、SLC47A2、HCP-1、MFSD5、MFSD10、SLC50A1、OSTα、OSTβ、SLC52A1、SLC52A2、和SLC52A3。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该靶抗原难以表达或难以产生针对性抗体。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中该靶蛋白的表达导致宿主产生细胞中的细胞毒性。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中当对该靶蛋白进行重组表达和/或纯化时，该靶蛋白展示出差的产率、稳定性、溶解性和/或功能活性。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该复合物的所述多核糖核苷酸或mRNA包含以下的一种或多种：共有Kozak序列；该mRNA的5’末端上的7-甲基鸟苷帽；该mRNA转录物的3’末端处发现的聚腺苷(聚A)尾；以及5’-和3’-非翻译区(UTR)。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述给予是肠胃外给予、静脉内给予、肌内给予、鼻内给予或皮下给予。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白是RXFP1。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述复合物包含多核糖核苷酸或mRNA，该多核糖核苷酸或mRNA包含SEQ ID NO:4的核酸序列或SEQ ID NO:2、4和37中任一者的核酸序列。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白是SLC52A2。
23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述复合物包含多核糖核苷酸或mRNA，该多核糖核苷酸或mRNA包含SEQ ID NO:7的核酸序列或SEQ ID NO:5、7和40中任一者的核酸序列。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白是ANGPTL8。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述复合物包含多核糖核苷酸或mRNA，该多核糖核苷酸或mRNA包含SEQ ID NO:10的核酸序列或SEQ ID NO:8、10和43中任一者的核酸序列。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白是TSHR。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述复合物包含多核糖核苷酸或mRNA，该多核糖核苷酸或mRNA包含SEQ ID NO:16的核酸序列或SEQ ID NO:14、16和46中任一者的核酸序列。
28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白是APJ。
29.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述复合物包含多核糖核苷酸或mRNA，该多核糖核苷酸或mRNA包含SEQ ID NO:19的核酸序列或SEQ ID NO:17、19和49中任一者的核酸序列。
30.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白是gp130。
31.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述复合物包含多核糖核苷酸或mRNA，该多核糖核苷酸或mRNA包含SEQ ID NO:22的核酸序列或SEQ ID NO:20、22和52中任一者的核酸序列。
32.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白是半乳凝素3。
33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述复合物包含多核糖核苷酸或mRNA，该多核糖核苷酸或mRNA包含SEQ ID NO:55的核酸序列或SEQ ID NO:26、55和56中任一者的核酸序列。
34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述复合物具有大约30nm-150nm的直径。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中该复合物包含辅助脂质。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中该复合物包含以下项的任何组合：(i)阳离子脂质；(ii)辅助脂质，例如胆固醇；(iii)中性脂质，例如DSPC；和(iv)隐形脂质，例如S010、S024、S027、S031或S033。
37.如权利要求1-36中任一项所述的方法，其中该动物被给予10μg、12.5μg、20μg、25μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg或150μg多核糖核苷酸。
38.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中该阳离子脂质选自下组，该组由以下组成：N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)、N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1,2-二油酰基氨甲酰基-3-二甲基铵-丙烷(DOCDAP)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DLINDAP)、二月桂基(C12:0)三甲基铵丙烷(DLTAP)、二-十八烷基氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、DC-Chol、二油酰基氧基-N-[2-精胺甲酰胺基)乙基}-N,N-二甲基-1-丙烷三氟乙酸铵(DOSPA)、1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺,顺-9,12-十八碳二烯酰氧基)丙烷(CLinDMA)、N,N-二甲基-2,3-二油烯基氧基)丙胺(DODMA)、2-[5’-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)-3’-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺,顺-9’,12’-十八碳二烯酰氧基)丙烷(CpLinDMA)和N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄基胺(DMOBA)，以及1,2-N,N’-二油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)。
39.如权利要求38所述的方法，其中该阳离子脂质是DOTAP或DLTAP。
40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，该方法进一步包括以下步骤：生成产生特异性结合该靶抗原的抗体的杂交瘤。
41.如权利要求1-40中任一项所述的方法，该方法进一步包括以下步骤：纯化与该靶蛋白特异性结合的抗体。
42.如权利要求1-41中任一项所述的方法，该方法进一步包括以下步骤：产生衍生自特异性结合该靶蛋白的经纯化的抗体的嵌合抗体或人源化抗体。
43.如权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述方法相对于包括用cDNA、蛋白质或肽、病毒颗粒或全细胞免疫的方法在第一次取血或第二次取血的血清中产生更高的抗体滴度。
44.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述方法与包括用cDNA、蛋白质或肽、病毒颗粒或全细胞免疫的方法相比产生更多数量的产生靶蛋白特异性抗体的杂交瘤。
45.如权利要求1-44中任一项所述的方法，其中该靶蛋白是人靶蛋白，并且该非人动物是小鼠、大鼠、兔、绵羊、猫、狗、骆驼科动物、鲨鱼、猴、猪或马。
46.一种产生抗体的杂交瘤，该抗体与靶蛋白特异性结合，其中通过如权利要求1-45中任一项所述的方法获得该杂交瘤。
47.一种多克隆抗体的混合物，这些多克隆抗体与靶蛋白特异性结合，其中从如权利要求1-45中任一项所述的方法获得该混合物。
48.一种分离的单克隆抗体，该单克隆抗体与靶蛋白特异性结合，其中通过如权利要求1-45中任一项所述的方法获得该单克隆抗体。
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