KR20210032493A - 백혈병 억제 인자 활성을 억제하기 위한 가용성 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법 - Google Patents

백혈병 억제 인자 활성을 억제하기 위한 가용성 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

가용성 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR) 폴리펩타이드, 가용성 당단백질 130(gp130) 폴리펩타이드, 및 이러한 폴리펩타이드를 포함하는 가용성 융합 단백질 및 이량체가 제공된다. 가용성 폴리펩타이드는 백혈병 억제 인자(LIF)에 결합한다. 특정 측면에서, 상기 가용성 폴리펩타이드는 상응하는 야생형 폴리펩타이드에 비해 LIF에 대한 증가된 결합 친화도를 나타낸다. 또한 그와 같은 가용성 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산, 그와 같은 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 그와 같은 핵산을 포함하는 세포 및/또는 발현 벡터가 제공된다. (예를 들어, 암을 치료하기 위해) 필요로 하는 개체에서 LIF 활성을 억제하는 방법을 포함하는 가용성 폴리펩타이드를 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

백혈병 억제 인자 활성을 억제하기 위한 가용성 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2018년 7월 20일자로 출원된 미국 가특허출원 번호 62/701,399의 이익을 주장하며 상기 출원은 본 명세서에 참조로 전체적으로 포함된다.
백혈병 억제 인자(LIF)는 IL-6 상과(superfamily)에 속하는 다기능성 사이토카인이다. IL-6 상과의 다른 구성원은 온코스타틴 M(OSM), IL-6, IL-11, 섬모 신경친화성 인자(CNTF), 및 카디오트로핀-1(CT-1)을 포함한다. LIF　유전자는 인간과 마우스 사이에 고도로 보존되어 있다(약 75%). LIF 단백질은 당화에 의해 종종 변형되는 단량체성 단백질이다. 당화되지 않은 LIF 단백질의 분자량은 20 내지 25 kDa이고 당화 단백질의 분자량은 37 내지 63 kDa이다.
LIF는 자가 분비 및 파라 크린 방식을 통해 기능한다. LIF는 특정 수용체(백혈병 억제 인자 수용체 - LIFR)에 결합한 다음 당단백질 130(gp130)을 동원하여 JAK/STAT3 신호전달 경로를 포함하는 다운스트림 신호 경로의 활성화를 유도하는 고친화성 수용체 복합체를 형성한다(도 1).
LIF는 종양 발달 및 진행에 역할을 한다. 백혈병 세포의 성장을 억제하는 역할과 달리, LIF는 종종 많은 유형의 고형 종양의 발달과 진행을 촉진한다. LIF의 과발현은 배양된 인간 암세포의 증식을 촉진하고 다양한 인간 종양 세포에 의해 형성된 이종이식 종양의 성장을 증가시킨다. 또한 LIF는 종양 세포의 이동과 침입을 증가시키고 유방암과 횡문근육종의 전이를 촉진한다. 저산소증은 고형 종양에서 LIF 과발현에 중요한 역할을 한다. IL-6 및 IL-1β와 같은 사이토카인도 LIF 발현을 유도할 수 있다.
또한 LIF는 췌장암의 새로운 요인이다. 최근 연구는, - 유전자 조작 또는 항체 억제를 통해 - 췌장암 모델에서 LIF의 억제는 마우스의 수명이 향상되고 종양 부담이 감소하며 종양 개시가 제한됨을 입증한다. 가장 치명적인 암 중 하나 임에도 불구하고 췌장암에 대한 치료 선택권이 부족하다. LIF를 억제하는 현재 방법은 항-LIF 항체를 이용한다. 그러나 항체는 LIF의 특정 면(face) 하나만 표적으로 할 수 있으므로, 완전히 수용체 결합과 경쟁한다. 또한, LIF와 그 수용체의 내인성 상호작용의 친화성은 매우 높으며(~ 50 내지 100pM), 항체 단독 사용과 진정으로 경쟁하기 어려운 친화성 수준이다. 따라서 LIF를 표적화하고 LIF 활성/신호를 억제하는 개선된 방법이 필요하다.
가용성 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR) 폴리펩타이드, 가용성 당단백질 130(gp130) 폴리펩타이드, 및 이러한 폴리펩타이드를 포함하는 가용성 융합 단백질 및 이량체가 제공된다. 가용성 폴리펩타이드는 백혈병 억제 인자(LIF)에 결합한다. 특정 측면에서, 가용성 폴리펩타이드는 상응하는 야생형 폴리펩타이드에 비해 LIF에 대한 증가된 결합 친화도를 나타낸다. 또한 이러한 가용성 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 이러한 핵산 및/또는 발현 벡터를 포함하는 세포가 제공된다. (예를 들어, 암 치료를 위해) 필요로 하는 개체에서 LIF 활성을 억제하는 방법을 비롯하여 가용성 폴리펩타이드를 사용하는 방법도 제공된다.
도 1 LIFR 및 gp130를 통한 LIF 신호전달의 개략적 예시.
도 2 가용성 폴리펩타이드 본 개시내용의 일 구현예에 따른 가용성 폴리펩타이드의 이량체를 사용한 LIF 활성 억제의 개략적 예시.
도 3 패널 A: 여러 종류에 걸쳐 분리된 LIFR Ig-유사 도메인 변이체에서 관찰된 공통 돌연변이. 패널 B: 낮은 (10pM, 100pM) LIF 농도에서 정규화된 적산 형광 결합 값으로부터 계산된 LIFR 변이체의 결합 점수. 모든 점수는 야생형 및 효모 표면에서의 차별적 발현에 대해 정규화되었다.
도 4 패널 A: 부위 지정 돌연변이 유발을 사용하여 생성된 LIFR 변이체 요약. 패널 B: LIFR 변이체의 결합 점수. 야생형(WT)으로 정규화된 발현이 도시된다.
도 5 도 4, 패널 A로부터의 공통 돌연변이는 인간 LIFR(청색)에 결합하는 인간 LIPF(분홍색)의 PyMOL 모델링된 구조에 도시된다. 돌연변이는 적색으로 도시되며, PyMOL을 사용하여 도입된다. 루프 1, 2 및 3에서의 돌연변이 클러스터는 삽입에서 확대된다.
도 6 패널 A: 다중 분류에 걸쳐 분리된 gp130 CBM 도메인 변이체에서 관찰된 공통 돌연변이. 패널 B: 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여 생성된 돌연변이 gp130 변이체의 요약. 패널 C: gp130 변이체의 결합 점수. 야생형(WT)으로 정규화된 발현이 또한 도시된다.
도 7 gp130 ELDME 구조의 공통 돌연변이. 도 6, 패널 A로부터의 공통 돌연변이의 선택은 인간 gp130(분홍색)에 대한 인간 LIF(청색) 결합의 해결된 구조로 나타낸다. PyMOL을 사용하여 삽입된 돌연변이는 티알(teal)에 나타나 있다. 영역 1 및 2에서의 돌연변이 클러스터는 삽입이 확대된다.
도 8 효모의 결합은 인간 LIF에 LIFR VPRVVAID 및 gp130 ELDME를 나타내었다. 패널 A: 인간 LIF에 결합하는 LIFR 야생형(WT)(원), "PDD" 변이체(L218P-N42D-N277D)(정사각형), 및 VPRVAID 변이체(도 4의 돌연변이)(삼각형). VPRVVAID 변이체의 KD는 야생형(WT)에 비해 32배 더 높은 친화도인 30 pM에서 측정되었다. 패널 B: gp130 야생형(WT)(원), "8M" 변이체(E4K-K5R-N14D-K45E-F46L-K83R-Y95D-N100S)(정사각형), 및 ELDME 변이체(도 4의 돌연변이, 패널 A)(삼각형)는 인간 LIF에 결합한다. ELDME 변이체의 KD는 야생형(WT)에 비해 12배 더 높은 친화도인 5 nM에서 측정되었다.
도 9 본 개시내용의 예시적 동종이량체 및 이종이량체 가용성 LIFR 및/또는 gp130 융합 작제물의 개략적 예시(패널 C-F). 패널 A: gp130-결합면을 표적으로 하는 항-LIF 단클론성 항체 'G1'. 패널 B: LIFR 결합면을 표적으로 하는 항-LIF 단클론성 항체 'L1'. 패널 C: gp130 CBM 도메인(ELDME) Fc-융합. 패널 D: LIFR CBMI-Ig-유사-CBMII 도메인(VPRVVAID) Fc-융합. 패널 E: LIFR CBMI-Ig-유사-CBMII 도메인(VPRVVAID) - gp130 CBM 도메인(ELDME) Fc-융합. 이는 5x Gly4Ser 링커를 사용하여 융합된 LIFR 및 gp130을 갖는 동종이량체이다. 패널 F: LIFR CBMI-Ig-유사-CBMII 도메인(VPRVVAID) - gp130 CBM 도메인(ELDME) 이종이량체성 Fc-융합. 이 변이체는 Fc의 하나의 아암에 LIFR을 갖고 다른 아암(arm)에 gp130을 갖는다. 모든 변이체를 성공적으로 발현시키고 정제하였다.
도 10 정제된 LIF 억제제의 결합. LIFR CBMI-Ig-유사-CBMII 야생형 Fc 융합(원), LIFR CBMI-Ig-유사-CBMII(VPRVVAID) Fc 융합(삼각형), 및 KinExA를 사용하여 측정된, 가용성 인간 LIF에 결합하는 LIFR CBMI-Ig-유사-CBMII(VPRVVAID) - gp130 CBM(ELDME) Fc 융합체(다이아몬드). KinExA 소프트웨어에 의해 계산된 KD 값 및 맞춤 곡선이 도시되어 있다.
도 11 동종이량체성 LIF 억제제는 한번에 다수의 LIF에 결합한다. 패널 A: 다중 LIF 결합 검정의 도시적 예시. LIF는 효모의 표면에 표시된다. 억제제는 포화 농도에서 인큐베이션되고 과량은 세척 제거된다. 이어서, LIF-His를 10 nM 및 100 nM의 농도에서 억제제-결합된 효모와 공동-배양한다. 결합은 LIF의 His-tag 도메인을 통해 검출되며, 이는 억제제가 한번에 다수의 LIF'에 결합할 수 있는 경우에만 존재해야 하며, '브릿지'로서 작용한다. 패널 B: 다수의LIF 결합 실험으로부터의 결과. LIF는 표시된 것과 가용성 LIF-His 간의 결합 브릿지로서 사용된 LIFR-WT-Fc, LAFR-VPRVVAID-FC, LFR-gp130 융합-F, 또는 항-LIF mAb, L1과 함께 효모 상에 표시되었다. 각 조건에서 항-His 형광 항체로부터의 형광 방출을 LIF-His가 첨가되지 않은 대조군으로 정규화되었다.
도 12 조작된 억제제는 WT와 비교할 때 경쟁자의 존재 하에 LIF에 결합할 때 개선된 오프-레이트를 나타낸다. 패널 A: 경쟁적 LIF 결합 분석의 개략적 예시. LIF는 효모의 표면에 표시된다. 억제제는 포화 농도에서 인큐베이션되고 과량은 세척 제거된다. 이어서, LIF-His를 10 nM 및 100 nM의 농도에서 억제제-결합된 효모와 공동-인큐베이션된다. 결합은 억제제 Fc-융합의 Fc 도메인을 통해 검출되며, 이는 효모-표시된 LIF로부터 고농도의 가용성 LIF-His에 의해 경쟁될 것이다. 패널 B: 경쟁적 LIF 결합 실험으로부터의 결과. LIF는 LIFR-WT-Fc, LAFR-VPRVVAID-FC, LFR-gp130 융합-F, 또는 항-LIF mAb, L1이 결합 파트너로서 첨가된 효모 상에 표시되었다. 과량의 억제제는 세정되고 가용성 LIF는 경쟁자로서 24시간 동안 첨가되었다. 각 조건에서 항-Fc 형광 항체로부터의 형광 방출은 과량의 억제제가 제거되지 않고 가용성 LIF가 첨가되지 않은 대조군으로 정규화되었다.
도 13 LIF 억제제가 LIF에 동시에 결합한다. 패널 A: 동시 결합 검정의 개략적 예시. Gp130(도시됨) 또는 LIFR은 효모 표면 상에 표시된다. LIF는 포화 농도에서 인큐베이션되고 과잉은 세정된다. 그 다음, 억제제(LIFR-VPRVVAID-Fc 도시됨)는 LIF 결합 효모와 함께 인큐베이션된다. 결합은 억제제의 Fc 도메인을 통해 검출되며, 이는 LIF를 '브릿지'로 사용하여 동시에 수용체 결합이 발생하는 경우에만 존재해야 한다. 패널 B: 동시 결합 실험으로부터의 결과. LIFR 또는 gp130은 결합 브릿지로 사용된 인간 LIF와 함께 효모에 표시되었다. 형광 방출은 LIF 첨가 대조군이 없는 것으로 정규화된 항-Fc 형광 항체의 판독이다. LIFR-VPRVVAID-Fc, gp130-ELDME-Fc, LIFR-gp130 이종이량체성 Fc, LIFR-gp130 동종이량체성 융합-Fc, 항-LIF mAb L1, 및 항-LIF mAb G1의 동시 결합이 표시된다.
도 14 억제제는 야생형 수용체로부터 LIF와 경쟁한다. 패널 A: 경쟁적 결합 분석의 개략도. 야생형 gp130 또는 LIFR(도시됨)은 효모의 표면에 표시된다. 인간 LIF-His는 포화 농도에서 인큐베이션된다. 억제제(LIFR-VPRVVAID-Fc가 도시됨)는 이어서 LIF-결합된 효모와 과량으로 공동 인큐베이션된다. LIF 결합은 LIF 상의 His6-태그를 통해 검출된다. 억제제 인큐베이션 후 결합된 채로 남아있는 LIF가 적을수록, 억제제는 WT 수용체로부터 LIF를 더 잘 경쟁할 수 있다. 패널 B: 경쟁적 결합 실험으로부터의 결과. 야생형 LIFR 또는 gp130은 효모 상에 표시되고 인간 LIF-His로 포화되었다. 분획 결합은 첨가된 억제제 없음으로 정규화된, LIF-His로부터 검출된 형광 방출이다. LIFR-WT-Fc, gp130-ELDME-Fc(Eng.), LIFR-VPRVVAID-Fc(Eng.), LIFR-gp130 융합-Fc(Eng.), LIFR-gp130 이종이량체성 Fc(Eng.), 항-LIF mAb L1, 및 항-LIF mAb G1의 경쟁 결합이 도시된다.
도 15 조작된 억제제는 HeLa 루시퍼라제 리포터 세포에서 다운스트림 STAT3 신호전달을 차단한다. 패널 A: HeLa 리포터 세포에서의 LIF 신호전달의 개략도. LIF는 LIFR 및 gp130의 이량체화를 촉진하여, STAT3 인산화, 다운스크림 신호전달의 활성화, 및 궁극적으로 STAT3 반응 인자의 제어 하에 루시퍼라아제의 생성을 유도한다. 패널 B: LIFR VPRVVAID Fc, LIFR-gp130 융합 조작 Fc, 및 LIFR WT Fc의 농도를 변화시킴으로써 LIF 유래 루시페라제 활성의 억제. 패널 C: LIFR Fc 또는 융합 Fc의 지연 첨가시 LIF 유래 루시페라제 신호. 패널 D: [억제제]의 많은 자릿수의 크기에 걸쳐 LIF 유래 루시페라제 활성의 억제. LIFR VPRVVAID Fc IC50 = 35 pM, LIFR WT Fc에 비해 53x 개선. 패널 E: 카툰-IL-6 패밀리 구성원 LIF 및 OSM 결합 LIFR. 그래프 - LIFR VPRVVAID Fc 또는 LIFR WT Fc와 인큐베이션된 LIF 또는 OSM으로부터 유래된 루시퍼라아제 신호의 측정.
도 16 LIF 억제제는 췌장암 세포에서 LIF 신호전달을 제거한다. 패널 A: LIF 신호전달의 개략적 예시. LIF는 LIFR 및 gp130에 결합하여, 수용체의 이종이량체화를 야기한다. 이량체화는 JAK의 동원을 초래하고, 이는 티로신 705 상에서 STAT3을 인산화시킨다. 이는 STAT3 이량체화, 핵 진입, 및 전사 프로그래밍의 활성화를 초래한다. 따라서, pSTAT3-Y705는 LIF 신호전달의 판독이다. 패널 B: 135 pM 인간 LIF 및 상이한 농도의 LIFR-VPRVVAID-Fc(Eng.), LIFR-WT-Fc, LIFR-VPRVVAID - gp130-ELDME Fc, 및 L1 항-LIF mAb에 노출된 PANC1(인간 췌장 암 세포주) 용해물의 웨스턴 블랏. 패널 C: 튜불린 신호로 정규화된 pSTAT3 신호의 정량화.
가용성 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR) 폴리펩타이드, 가용성 당단백질 130(gp130) 폴리펩타이드, 및 이러한 폴리펩타이드를 포함하는 가용성 융합 단백질 및 이량체가 제공된다. 가용성 폴리펩타이드는 백혈병 억제 인자(LIF)에 결합한다. 특정 양태에서, 가용성 폴리펩타이드는 상응하는 야생형 폴리펩타이드에 비해 LIF에 대한 증가된 결합 친화도를 나타낸다. 또한 이러한 가용성 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 이러한 핵산 및/또는 발현 벡터를 포함하는 세포가 제공된다. (예를 들어, 암 치료를 위해) 필요로 하는 개체에서 LIF 활성을 억제하는 방법을 포함하여, 가용성 폴리펩타이드를 사용하는 방법도 제공된다.
본 개시내용의 가용성 폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 세포 및 방법을 보다 상세하게 기재하기 전, 가용성 폴리펩타이드, 헥산, 발현 벡터, 세포 및 방법이 기재된 특정 구현예에 제한되지 않으며, 당연히 변할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 또한, 본원에 사용된 전문용어는 단지 특정 구현예를 기재하기 위한 목적이며, 가용성 폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 세포 및 방법의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 제한하고자 하는 것이 아니라는 것을 이해해야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 해당 범위의 상한과 하한 사이의, 하한 단위의 1/10까지의 각각의 사이에 있는 값, 그리고 상기 명시된 범위에서 임의의 다른 명시된 또는 사이에 있는 값이, 가용성 폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 세포 및 방법에 포함된다고 이해된다. 이러한 보다 작은 범위의 상한 및 하한은, 독립적으로 보다 작은 범위에 포함될 수 있으며, 이는 또한 명시된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계를 조건으로, 가용성 폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 세포 및 방법에 포함된다. 진술된 범위가 한쪽 또는 양쪽의 한계를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계 중 한쪽 또는 양쪽을 제외한 범위도 역시 가용성 폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 세포 및 방법에 포함된다.
용어 "약"이 선행되는 수치 값을 갖는 특정 범위가 본원에 제시된다. 용어 "약"은, 그것이 선행하는 정확한 숫자에 대한 문자 그대로의 뒷받침뿐만 아니라, 그 용어가 선행하는 숫자의 근사치이거나 그에 근접한 숫자를 제공하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 한 숫자가 구체적으로 인용된 숫자의 근사치이거나 그에 근접한 숫자인지를 결정하는 데 있어서, 인접한 또는 근사치인 미인용된 숫자는, 그것이 제시된 문맥에서, 구체적으로 인용된 숫자와 실질적으로 동등한 것을 제공하는 숫자일 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 가용성 폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 세포 및 방법이 속하는 업계의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 가용성 폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 세포 및 방법이 또한 가용성 폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 세포 및 방법이 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 대표적인 예시적인 가용성 폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 세포 및 방법이 이제 설명된다.
본 명세서에 인용된 모든 공보 및 특허는, 각각의 개별 공보 또는 특허가 구체적으로 및 개별적으로 참조로 편입되는 것으로 지시된 바와 같이, 본원에 참조로 편입되고, 그 인용된 공보와 관련된 물질 및/또는 방법을 개시 및 기재하기 위해 본원에 참조로 편입된다. 임의의 공보의 인용은 출원일 전에 개시된 것에 대한 것이며, 제공된 공개 날짜는 실제 공개 날짜와 상이할 수 있어, 독자적으로 확인해야할 필요가 있을 수 있기 때문에, 본 발명의 가용성 폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 세포 및 방법이 그러한 공보에 앞서 있을 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바, 단수 형태의 표현은, 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 언급 대상을 포함한다는 것에 유의해야 한다. 나아가, 청구범위는 임의의 선택적 요소를 배제하도록 작성될 수 있다는 것에 유의해야 한다. 이와 같이, 이러한 설명은 청구 요소의 인용 또는 "부정적" 한정의 사용과 관련하여 "단독으로", "오로지" 등과 같은 배타적 전문용어의 사용에 대한 선행 기준으로서 역할을 하기 위한 것이다.
명확성을 위해, 별도의 구현예의 맥락에서 기재된, 가용성 폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 세포 및 방법의 특정한 특징은, 또한 단일 구현예에서 조합으로 제공될 수 있다고 이해된다. 반대로, 간결성을 위해, 단일 구현예의 맥락에서 기재된, 가용성 폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 세포 및 방법의 다양한 특징은, 또한 별도로 또는 임의의 적합한 하위 조합으로 제공될 수 있다. 구현예들의 모든 조합은 본 개시내용에 의해 구체적으로 포함되며, 각각의 및 모든 조합이 개별적으로 및 명시적으로 개시된 바와 같이, 그러한 조합이 실행가능한 공정 및/또는 조성물을 포함하는 정도까지 본원에 개시된다. 또한, 그러한 변수를 설명하는 구현예에 열거된 모든 하위 조합이 또한 가용성 폴리펩타이드, 핵산, 발현 벡터, 세포 및 방법에 의해 구체적으로 포함되며, 각각의 및 모든 그러한 하위 조합이 개별적으로 및 명시적으로 본원에 개시된 바와 같이 본원에 개시된다.
본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 기재 및 예시된 각각의 개별 구현예는, 본 발명의 방법의 범위 또는 사상을 벗어나지 않는 한, 임의의 다른 몇몇 구현예의 특징으로부터 쉽게 분리되거나 조합될 수 있는, 개별 구성요소 및 특징을 갖는다. 임의의 인용된 방법은 인용된 사건의 순서대로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
가용성 폴리펩타이드
상기에 요약된 바와 같이, 본 개시내용의 측면은 가용성 폴리펩타이드를 포함한다. 가용성 폴리펩타이드는 백혈병 억제 인자(LIF)(UniProtKB - P15018(인간) 및 UniProtKB - P09056(마우스))에 결합하여 LIF 활성을 억제한다. LIF는 다기능성 사이토카인이고, 그것의 수용체는 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR)(UniProtKB - P42702(인간) 및 UniProtKB - P42703(마우스)) 및 당단백질 130(gp130)(UniProtKB - P40189(인간) 및 UniProtKB - Q00560(마우스))을 포함한다.
도 1, 도 15, 패널 A, 및 도 16, 패널 A에 개략적으로 도시된 바와 같이, LIF는 LIFR 및 gp130에 결합하여 수용체의 이종이량체성화를 유발한다. 이량체화는 JAK의 동원을 초래하여 타이로신 705에서 STAT3을 인산화한다. 이것은 STAT3 이량체화, 핵 진입 및 전사 프로그래밍의 활성화를 초래한다.
본 폴리펩타이드는 LIFR 및/또는 gp130의 세포 외 (따라서 가용성) 부분을 기반으로 하며 다양한 맥락에서 사용된다. 예를 들어, 가용성 폴리펩타이드는 이를 필요로 하는 개체, 예를 들어 LIF 활성의 억제가 유익할 수 있는 암 또는 다른 의학적 상태를 갖는 개체에게 투여될 때 치료제로서 사용을 발견한다. 가용성 폴리펩티드는 LIF 리간드 "트랩(trap)"으로서 작용하는 "유인(decoy)" 수용체로서 사용될 수 있어, 세포(예를 들어, 암 세포)의 표면 상의 그의 천연 수용체에 결합하기 위한 LIF의 이용가능성이 실질적으로 감소되거나 제거됨으로써 LIF 활성/신호전달을 감소시키거나 제거한다. 한 구현예에 따른 이러한 LIF 리간드 트랩의 개략도가 도 2에 개략적으로 도시되어 있다. 이 예에서, 가용성 폴리펩티드는 이량체화되고, 여기서 이량체의 각각의 단량체는 (직접 또는 간접적으로) 단편 결정화가능한 (Fc) 도메인(208)(예를 들어, 인간 IgG1 Fc 도메인, 마우스 IgG2a Fc 도메인 등)에 융합된 LIFR 부분(202)(여기서, 인간 LIFS의 처음 3개의 도메인을 포함하는 부분(사이토카인 결합 모티프 I - Ig-유사-사이토킨 결합 모티프 II))을 포함한다. 도 2에 예시된 바와 같이, 이량체는 세포(210)의 표면 상의 그의 천연 LIFR 및 gp130 수용체로부터 LIF를 격리시키는 LIF 리간드 트랩으로서 작용하여, LIF 신호전달/활성을 억제한다. 본 발명의 가용성 폴리펩타이드는 또한 진단 적용, 예를 들어, 암(예를 들어, 췌장암) 검출을 위한 바이오마커로서 LIF를 검출하기 위한 것, 및 또한 연구 적용, 예컨대, LIF의 생물학적 효과를 결정하기 위해 LIF 신호전달/활성을 억제하기 위한 것이다. 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 이제 추가로 상세히 기재될 것이다.
가용성 LIFR 폴리펩타이드
본 개시내용은 가용성 LIFR 폴리펩타이드를 제공한다. "가용성 LIFR 폴리펩타이드"는 예를 들어 가용성 LIFR 폴리펩타이드가 LIFR의 세포외 부분 또는 이의 단편만을 포함하기 때문에 세포막에 통합되지 않는 LIFR 폴리펩타이드를 의미한다. 일부 구현예에서, 가용성 LIFR 폴리펩타이드는 N-에서 C-말단 순서로 있는 LIFR의 처음 3 개의 도메인을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 구성된다: (1) 사이토카인 결합 모티프 I(CBMI) 도메인; (2) Ig-유사 도메인; 및 (3) 사이토카인 결합 모티프 II(CBMII) 도메인. 아래 표 1은 야생형 인간 LIFR의 아미노산 서열이다(신호 서열 제외). 밑줄 친 아미노산은 CBMI, Ig 유사 및 CBMII 도메인을 구성한다.
Figure pct00001
특정 측면에서, 본 개시내용의 가용성 LIFR 폴리펩타이드는 서열번호:2에서 제시된 아미노산 서열의 400 내지 489, 420 내지 489, 440 내지 489, 460 내지 489, 470 내지 489, 475 내지 489, 480 내지 489, 또는 485 내지 489개의 인접 아미노산을 포함하는 서열번호:2와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 LIF-결합 단편을 포함한다.
가용성 LIFR 폴리펩타이드는 야생형 LIFR 아미노산 서열을 가질 수 있다. 다른 측면에서, 가용성 LIFR 폴리펩타이드는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 상응하는 야생형 LIFR 폴리펩타이드에 비해 LIF에 대한 결합 친화도를 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들어, LIF에 대한 LIFR의 결합 친화도를 증가시키는 본원에 기재된 임의의 아미노산 치환 중 하나 이상)을 함유하는 "변이체"이다, 또는 이들의 조합. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "보존적 치환"은, 아미노산이 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되는 것으로, 펩타이드 화학의 당업자는 폴리펩타이드의 이차 구조 및 친수성 성질이 실질적으로 변경되지 않았다. 특정 구현예에서 고려되는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 구조에서 변형이 이루어질 수 있으며, 폴리펩타이드는 적어도 약을 갖는 폴리펩타이드를 포함하고 바람직한 특성을 갖는 변이체 또는 유도체 폴리펩타이드를 인코딩하는 기능적 분자를 여전히 수득한다. 동등한 또는 심지어 개선된 변이체 폴리펩타이드를 생성하기 위해 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변경하는 것이 바람직한 경우, 당업자는 예를 들어 인코딩 DNA 서열의 코돈 중 하나 이상을 변경할 수 있다.
상기에 요약된 바와 같이, 본 개시내용의 가용성 LIFR 폴리펩타이드 서열번호:2와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LIFR 폴리펩타이드는 상응하는 야생형 LIFR 폴리펩타이드에 비해 LIF에 대한 증가된 결합 친화도를 나타낸다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "상응하는" 야생형 폴리펩타이드는 하나 이상의 친화도-증가 아미노산 치환을 포함하도록 조작된(인간, 마우스, 등으로부터의) 친계 야생형 폴리펩타이드이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "증가된 결합 친화도"는 가용성 LIFR 폴리펩티드 또는 가용성 gp130 폴리펩티드가 상응하는 야생형 폴리펩티드와 비교하여 LIF에 더 엄격한 결합(더 낮은 KD 값으로 나타냄)을 나타냄을 의미한다. LIF에 대한 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩티드의 결합 친화도를 측정하는 방법이 이용가능하다. 예를 들어, 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술(예를 들어, BIAcoreTM 2000 기구를 사용함), KinExA® 동역학 배제 검정(Sapidyne Instruments), Bio-Layer Interferometry(BLI) 기술(예를 들어 ForteBio Octet®), 또는 다른 유사한 검정/기술이 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드가 원하는 결합 친화도를 나타내는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 본 개시내용의 문맥에서 결합 친화도를 측정하기 위한 적합한 접근법은 예를 들어 문헌 [Hunter, S.A. 및 Cochran, J.R. (2016) Methods Enzymol. 580:21-44에 기재된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 직접적인 결합 검정법에서, 평형 결합 상수(KD)는 형광단 또는 방사성동위원소에 컨쥬게이션된 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드, 또는 표지된 항체에 의해 검출하기 위한 N-또는 C-말단 에피토프 태그를 함유하는 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드를 사용하여 측정될 수 있다. 표지 또는 태그가 실행가능하거나 바람직하지 않은 경우, 경쟁 결합 검정법을 사용하여, 표지된 경쟁자의 최대 신호의 50%가 검출가능한 미표지된 가용성 LIFR 또는 GP130 폴리펩타이드의 양인, 반-최대(half-maximal) 억제 농도(IC50)를 결정할 수 있다. 이어서, 측정된 IC50 값으로부터 KD 값을 계산할 수 있다.
특정 측면에서, LIF에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는 가용성 LIFR 폴리펩타이드는 위치 L218에서의 아미노산 치환, 및 위치 N277에서의 아미노산 치환 중 하나 또는 둘 다를 포함하고, 위치의 확인은 서열번호:2에 대한 것이다. 위치 L218 및 N277에서의 아미노산 치환의 비-제한적인 예는 L218P 아미노산 치환, 및 N277D 아미노산 치환 중 하나 또는 둘 다를 포함한다.
일부 구현예에서, LIF에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는 가용성 LIFR 폴리펩타이드는 위치 I257에서의 아미노산 치환, 위치 V262에서의 아미노산 치환, 및 위치 T273에서의 아미노산 치환 중 1개, 2개, 또는 각각을 포함하고 위치의 확인은 서열번호:2에 대한 것이다. 위치 I257, V262, 및 T273에서의 아미노산 치환의 예는, 비제한적으로, I257V 아미노산 치환, V262A 아미노산 치환, 및 T273I 아미노산 치환 중 1개, 2개, 또는 각각을 포함한다.
특정 측면에서, LIF에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는 가용성 LIFR 폴리펩타이드는 위치 I217에서의 아미노산 치환, 위치 H240에서의 아미노산 치환, 및 위치 I260에서의 아미노산 치환 중 1개, 2개, 또는 각각을 포함하고 위치의 확인은 서열번호:2에 대한 것이다. 위치 I217, H240, 및 I260에서의 아미노산 치환의 비-제한적인 예는 중 1개, 2개, 또는 각각을 포함하고 I217V 아미노산 치환, H240R 아미노산 치환, 및 I260V 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, LIF에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는 가용성 LIFR 폴리펩타이드는 위치 N242에서의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 위치의 확인은 서열번호:2에 대한 것이다. N242 아미노산 치환의 비-제한적인 예는 N242D 아미노산 치환이다.
특정 측면에서, 본 개시내용의 가용성 LIFR 폴리펩타이드는 서열번호:2에서 제시된 아미노산 서열의 400 내지 489, 420 내지 489, 440 내지 489, 460 내지 489, 470 내지 489, 475 내지 489, 480 내지 489, 또는 485 내지 489개의 인접 아미노산을 포함하는 서열번호:2와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 LIF-결합 단편을 포함하고, 상기 가용성 LIFR 폴리펩타이드는 임의의 조합으로 임의의 위치 I217, L218, H240, I257, I206, V262, T271, 및 N277에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 가용성 LIFR 폴리펩타이드는 서열번호:2에서 제시된 아미노산 서열의 400 내지 489, 420 내지 489, 440 내지 489, 460 내지 489, 470 내지 489, 475 내지 489, 480 내지 489, 또는 485 내지 489개의 인접 아미노산을 포함하는 서열번호:2와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 LIF-결합 단편을 포함하고, 상기 가용성 LIFR 폴리펩타이드는 임의의 조합으로 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 LIF에 대한 LIFR의 결합 친화도를 증가시키는 본원에 기재된 임의의 아미노산 치환 중 하나 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 각각의 아미노산 치환 I217V, L218P, H240R, I257V, I206V, V262A, T271I, 및 N277D를 포함한다.
가용성 gp130 폴리펩타이드
또한 가용성 gp130 폴리펩타이드가 본 개시내용에 의해 제공된다. "가용성 gp130 폴리펩타이드"는 예를 들어 가용성 gp130 폴리펩타이드가 gp130의 세포외 부분 또는 이의 단편만을 포함하기 때문에 세포막으로 통합되지 않는 gp130 폴리펩타이드를 의미한다. 일부 구현예에서, 가용성 gp130 폴리펩타이드는 gp130의 사이토카인 결합 모티프(CBM) 도메인을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 구성된다. 아래 표 2는 야생형 인간 gp130의 아미노산 서열(신호 서열 제외)이다. 밑줄 친 아미노산이 CBM 도메인을 구성한다.
Figure pct00002
특정 측면에서, 본 개시내용의 가용성 gp130 폴리펩타이드는 서열번호:4에 제시된 아미노산 서열의 150 내지 200, 160 내지 200, 170 내지 200, 180 내지 200, 185 내지 200, 190 내지 200, 또는 195 내지 200개의 인접 아미노산을 포함하는 서열번호:4와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 LIF-결합 단편을 포함한다.
가용성 gp130 폴리펩타이드는 야생형 gp130 아미노산 서열을 가질 수 있다. 다른 측면에서, 가용성 gp130 폴리펩타이드는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 상응하는 야생형 gp130 폴리펩타이드에 비해 LIF에 대한 결합 친화도를 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들어, LIF에 대한 gp130의 결합 친화도를 증가시키는 본 명세서의 임의의 아미노산 치환 중 하나 이상), 또는 이들의 조합을 함유하는 "변이체"이다.
상기에 요약된 바와 같이, 본 개시내용의 가용성 gp130 폴리펩타이드는 서열번호:4와 적어도 70% 동일한 서열을 포함할 수 있으며, 상기 gp130 폴리펩타이드는 상응하는 야생형 gp130 폴리펩타이드에 비해 LIF에 대한 증가된 결합 친화도를 나타낸다.
일부 구현예에서, LIF에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는 가용성 gp130 폴리펩타이드는 위치 K45에서의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 위치의 확인은 서열번호:4에 대한 것이다. 위치 K45에서의 아미노산 치환의 비-제한적인 예는 K45E 아미노산 치환이다.
특정 측면에서, LIF에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는 가용성 gp130 폴리펩타이드는 위치 Y95에서의 아미노산 치환, 및 위치 K184에서의 아미노산 치환 중 하나 또는 둘 다를 포함하고, 위치의 확인은 서열번호:4에 대한 것이다. 위치 Y95 및 K184에서의 아미노산 치환의 비-제한적인 예는 Y95D 아미노산 치환, 및 K184E 아미노산 치환 중 하나 또는 둘 다를 포함한다.
일부 구현예에서, LIF에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는 가용성 gp130 폴리펩타이드는 위치 F46에서의 아미노산 치환, 및 위치 I130에서의 아미노산 치환 중 하나 또는 둘 다를 포함하고, 위치의 확인은 서열번호:4에 대한 것이다. 위치 F46 및 I130에서의 아미노산 치환의 예는, 비제한적으로, F46L 아미노산 치환, 및 I130M 아미노산 치환 중 하나 또는 둘 다를 포함한다.
특정 측면에서, 본 개시내용의 가용성 gp130 폴리펩타이드는 서열번호:4에 제시된 아미노산 서열의 150 내지 200, 160 내지 200, 170 내지 200, 180 내지 200, 185 내지 200, 190 내지 200, 또는 195 내지 200개의 인접 아미노산을 포함하는 서열번호:4와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 LIF-결합 단편을 포함하고, 상기 가용성 gp130 폴리펩타이드는 임의의 조합으로 임의의 위치 K45, F46, Y95, I130, 및 K184에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 가용성 gp130 폴리펩타이드는 서열번호:4에 제시된 아미노산 서열의 150 내지 200, 160 내지 200, 170 내지 200, 180 내지 200, 185 내지 200, 190 내지 200, 또는 195 내지 200개의 인접 아미노산을 포함하는 서열번호:4와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 LIF-결합 단편을 포함하고, 상기 가용성 gp130 폴리펩타이드는 임의의 조합으로 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 LIF에 대한 gp130의 결합 친화도를 증가시키는 본 명세서의 임의의 아미노산 치환, 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 각각의 아미노산 치환 K45E, F46L, Y95D, I130M, 및 K184E 중 하나 이상을 포함한다.
융합 및 이량체성 단백질
또한 본 개시내용의 가용성 LIFR 폴리펩타이드 또는 가용성 gp130 폴리펩타이드 중 임의의 것을 포함하는 융합 단백질이 제공된다. "융합 단백질"이란, 아미노산의 단일 연속 사슬의 일부로서 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드에 융합된 가용성 LIFR 폴리펩타이드 또는 가용성 gp130 폴리펩타이드을 포함하는 융합을 의미한다, 상기 사슬은 자연 발생하지 않는다.. 특정 측면에서, 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드는 Fc 도메인, 알부민, 트랜스페린, XTEN, 호모-아미노산 중합체, 프롤린-알라닌-세린 중합체, 엘라스틴-유사 펩타이드, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 특정 측면에서, 융합 단백질은 가용성 gp130 폴리펩타이드에 융합된 가용성 LIFR 폴리펩타이드를 포함한다.
본 개시내용의 융합 단백질의 2개 이상의 도메인은 직접 또는 간접적으로 융합될 수 있다. 예를 들어, 가용성 LIFR 폴리펩타이드는 링커를 통해 간접적으로 가용성 gp130 폴리펩타이드에 융합될 수 있다. 또한 예로서, 가용성 LIFR 폴리펩타이드 또는 가용성 gp130 폴리펩타이드는 링커를 통해 이종 펩타이드(예를 들어, Fc 도메인)에 융합될 수 있다. 적합한 링커는 펩타이드 링커를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 측면에서, 펩타이드 링커는 글리신 및 세린을 포함하는 링커, 예를 들어 GlySer 링커이다. 관심 대상의 GlySer 링커는 (Gly4Ser)n 링커를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 이종 폴리펩타이드는 Fc 도메인, 예를 들어 인간 Fc 도메인 또는 마우스 Fc 도메인을 포함한다. Fc 도메인은 전장 Fc 도메인 또는 이의 단편일 수 있다. 본 개시내용의 가용성 gp130 폴리펩타이드 중 임의의 것에 융합될 수 있는 인간 Fc 도메인의 비제한적인 예는, 하기 표 3에 기재된 서열(서열번호: 5)을 갖는 인간 IgG1 Fc 도메인, 또는 이의 단편이다.
Figure pct00003
본 개시내용의 예시적인 융합 단백질의 아미노산 서열이 표 4에 제공된다(신호 서열 배제). 링커(여기서, 3x 글리신-세린(GS) 링커; 물결모양 밑줄))를 통해 인간 IgG1 Fc 도메인(이탤릭체)에 융합된 gp130 도메인(밑줄)을 포함하는 융합 단백질("gp130 ELDME hIgG1")의 아미노산 서열이 제공된다(서열번호: 6). gp130 도메인은 본원의 다른 곳에 기재된 아미노산 치환 K45E, F46L, Y95D, I130M, 및 K184E("ELDME")을 포함한다. 이 융합 단백질은 도 9, 패널 C에 개략적으로 도시된 이량체성 단백질의 단량체에 해당한다. 또한 표 4에는 링커(여기서, 3x 글리신-세린(GS) 링커; 물결모양 밑줄)를 통해 인간 IgG1 Fc 도메인(이탤릭체)에 융합된 LIFR 사이토카인 결합 모티프 I(CBMI) - 사이토카인 결합 모티프 II(CBMII) 도메인(밑줄)을 포함하는 융합 단백질("LIFR VPRVVAID hIgG1")의 아미노산 서열이 제공된다(서열번호:7). LIFR 사이토카인 결합 모티프 I(CBMI) - 사이토카인 결합 모티프 II(CBMII) 도메인은 본원의 다른 곳에 기재된 아미노산 치환 I217V, L218P, H240R, I257V, I206V, V262A, T271I, 및 N277D("VPRVVAID")을 포함한다. 이 융합 단백질은 도 9, 패널 D에 개략적으로 도시된 이량체성 단백질의 단량체에 해당한다. 표 4는 또한 링커(여기서, 5x 글리신4-세린1(G4S) 링커; 파선 밑줄)를 통해 "gp130 ELDME hIgG1" 융합 단백질의 ELDME gp130 도메인(이중 밑줄)에 융합된 "LIFR VPRVVAID hIgG1" 융합 단백질의 VPRVVAID LIFR 도메인(밑줄)을 포함하는 융합 단백질("LIFR-gp130 VPRVVAID-ELDME hIgG1")의 아미노산 서열을 제공하고, 상기 ELDME gp130 도메인은 링커(여기서, 3x 글리신-세린(GS) 링커; 물결모양 밑줄) (서열번호:8)를 통해 인간 IgG1 Fc 도메인(이탤릭체)에 융합된다. 이 융합 단백질은 도 9, 패널 E에 개략적으로 도시된 이량체성 단백질의 단량체에 해당한다. 표 4는 또한 도 9, 패널 F에 개략적으로 도시된 이량체성 단백질의 융합 단백질 단량체의 아미노산 서열을 제공한다. 제1 단량체는 링커(여기서, 3x 글리신-세린(GS) 링커; 물결모양 밑줄)를 통해 인간 IgG1 Fc 놉-인-홀(KiH) CH3A 도메인(이탤릭체)에 융합된 "LIFR VPRVVAID hIgG1" 융합 단백질의 VPRVVAID LIFR 도메인(밑줄)을 포함한다(서열번호:9). 제2 단량체는 링커(여기서, 3x 글리신-세린(GS) 링커; 물결모양 밑줄)를 통해 인간 IgG1 Fc 놉-인-홀(KiH) CH3B 도메인(이탤릭체)에 융합된 "gp130 ELDME hIgG1" 융합 단백질의 ELDME gp130 도메인(밑줄)을 포함한다(서열번호:10).
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
또한 임의의 가용성 LIFR 폴리펩타이드, 가용성 gp130 폴리펩타이드, 또는 이를 포함하는 융합 단백질(예를 들어, 표 4의 임의의 융합 단백질, 또는 이의 LIF-결합 변이체)을 포함하는 이량체성 단백질이 임의의 가용성 LIFR 폴리펩타이드, 가용성 gp130 폴리펩타이드, 또는 이를 포함하는 융합 단백질로 이량체화되어 제공된다. 일부 구현예에서, 각각의 단량체는 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질이고, 단량체의 이량체화는 Fc 도메인을 통한 것이다. 본 개시내용의 예시적인 이량체성 단백질은 하기 실험 섹션에 기재된 것들 및 도 9에 개략적으로 예시된 것들을 포함한다.
가용성 LIFR 및 gp130 폴리펩타이드의 조작/개발 및 생산
또한, 본 개시내용에는 하나 이상의 목적하는 기능을 갖는 추가적인 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드를 조작/개발하는 방법이 제공된다. 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드가 개발되는 방식은 다양할 수 있다. 합리적이고 조합적인 접근법은 새로운 특성, 예를 들어 LIF에 대한 증가된 결합 친화도 및/또는 특이성을 갖는 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드를 조작하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드를 개발하기 위해, 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드의 라이브러리는, 예를 들어 박테리아 디스플레이, 파지 디스플레이, 효모 표면 디스플레이, 형광-활성화 세포 분류(FACS) 및/또는 임의의 다른 적합한 스크리닝 방법에 의해 생성 및 스크리닝될 수 있다.
효모 표면 디스플레이는 신규한 분자 인식 특성, 증가된 표적 결합 친화도, 적절한 폴딩(folding) 및 개선된 안정성을 갖는 단백질을 조작하는 데 사용되었던 강력한 조합적인 기술이다. 이러한 플랫폼에서, 단백질 변이체의 라이브러리는 목적하는 생화학적 및 생물리학적 특성을 갖는 돌연변이를 단리하기 위해 고-처리량 방식으로 생성 및 스크리닝된다. 아래 실험 섹션에서 입증된 바와 같이, 본 발명자들은 LIF에 대한 결합 친화도가 증가된 가용성 LIFR 및 gp130 폴리펩타이드를 조작하기 위해 효모 표면 디스플레이를 성공적으로 사용했다. 효모 표면 디스플레이는 진핵 분비 경로의 품질관리 메카니즘, 샤페론-보조 폴딩 및 효율적인 디설파이드 결합 형성에 있어서 이점이 있다.
관심 대상의 바람직한 특성을 갖는 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드를 개발하기 위한 하나의 접근법의 예에는, 효모 세포벽 단백질 Aga1p에 대한 2 개의 디설파이드 결합에 의해 부착된 효모 접합 응집소 단백질 Aga2p에, 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드를 유전적으로 융합시키는 것이 포함된다. 이러한 Aga2p-융합 작제물 및 염색체적으로 통합된 Aga1p 발현 카세트는, 적합한 프로모터, 예컨대 갈락토오스-유도성 프로모터의 조절 하에서 발현될 수 있다. 형광 표지된 일차 또는 이차 항체를 사용하는 유세포 분석에 의해 세포 표면 발현 수준을 측정하기 위해, N-또는 C-말단 에피토프 태그가 포함될 수 있다. 이러한 작제물은 가장 널리 사용되는 디스플레이 포맷을 나타내며, 여기서 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드의 N-말단은 Aga2p에 융합될 수 있지만, 효모 표면 디스플레이 플라스미드의 몇몇 대안적인 변형이 기재되고 본 발명의 가용성 L1FR 또는 gP130 폴리펩타이드를 개발하는데 사용될 수 있다. 파지 또는 mRNA 디스플레이와 함께 사용되는 패닝-기반 방법에 비해 이러한 스크리닝 플랫폼의 이점 중 하나는 2-색상 FACS가 특정 표적에 대한 결합 친화도가 2배 정도로 적게 상이한 클론을 정량적으로 구별하는데 사용될 수 있다는 것이다.
DNA 수준에서 LIFR 또는 gp130을 선택적으로 돌연변이시키기 위해, 예시적인 접근법은 오류 경향이 있는 PCR이며, 이는 프루프리딩(proofreading)(즉, 엑소뉴클레아제) 활성을 갖지 않는 폴리머라제를 사용하는 것, 뉴클레오시드 유사체의 트리포스페이트 유도체의 혼합물을 사용하는 것을 포함하는 임의의 수의 변경된 반응 조건에 의해 돌연변이를 도입하는데 사용될 수 있고, dNTP의 변경된 비, 마그네슘 또는 망간의 다양한 농도 등을 사용한다. 대안적으로, 축퇴 코돈은 예를 들어 중복 연장 PCR을 사용하여 올리고뉴클레오티드 어셈블리에 의해 도입될 수 있다. 다음으로, 유전 물질은 효모에서 상동 재조합을 위해 효모 디스플레이 벡터와 충분히 중첩되는 플랭킹 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다. 이들 방법은 LIFR 또는 gp130 라이브러리가 비교적 낮은 비용 및 노력으로 생성될 수 있게 한다. 라이브러리 조성에 대한 정의된 제어를 허용하는 합성 라이브러리 및 최근 방법이 개발되었다.
특정 측면에서, 디스플레이 라이브러리(예를 들어, 효모 디스플레이 라이브러리)를 FACS에 의해 관심 표적(예컨대, LIF)에 대한 결합에 대해 스크리닝한다. 2색 FACS는 라이브러리 스크리닝을 위해 사용될 수 있으며, 여기서 하나의 형광 표지는 c-myc 에피토프 태그를 검출하는데 사용될 수 있고, 다른 것은 관심 결합 표적에 대한 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드의 상호작용을 측정하는데 사용된다. 상이한 기구 레이저 및/또는 필터 세트를 사용하여 단일-세포 해상도에서 2개의 형광단의 여기 및 방출 특성을 측정할 수 있다. 이는 효모 발현 수준이 결합으로 표준화될 수 있게 한다. 즉, 불량한 효모 발현을 나타내지만 다량의 표적에 결합하는 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드는 높은 수준으로 발현되지만 표적에 약하게 결합하는 가용성 LiFR 또는 gf130 폴리펩타이드와 구별될 수 있다. 따라서, 발현 대 결합의 2차원 유세포분석 플롯은 표적 항원에 결합하는 효모 세포의 대각선 집단을 초래할 것이다. 고친화도 결합제는 라이브러리 소트 게이트를 사용하여 단리될 수 있다. 대안적으로, 초기 분류 라운드에서, 원하는 길이의 폴리펩타이드를 발현하지 않는 원하지 않는 클론의 라이브러리를 제거하는 것이 유용할 수 있다.
관심 대상의 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드를 인코딩하는 클론에 대한 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드 라이브러리의 농축 후, 효모 플라스미드를 회수하고 서열분석한다. FACS의 추가 라운드는 증가된 분류 엄격성 하에서 수행될 수 있다. 이어서, 개별 효모-디스플레이된 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드 클론의 결합 친화도 또는 동력학 오프-레이트를 측정할 수 있다.
관심 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드가 표면 디스플레이(예를 들어, 효모 표면 디스플레이)에 의해 확인되면, 조작된 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드, 또는 이를 포함하는 임의의 융합 단백질은 적합한 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 특정 측면에서, 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 융합 단백질은 재조합 DNA 접근법을 사용하여 생산된다. 다양한 숙주 세포 유형에서 재조합 방법을 사용하여 폴리펩타이드를 생산하기 위한 전략이 개발되었다. 예를 들어, 기능적 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드는, 대장균(E. coli) 주변세포질 공간에서 폴딩을 촉진시키고 유용한 정제 처리로서 역할을 하는, 유전자 융합 파트너로서의 바르나제(barnase)를 이용하여 생산될 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 조작된 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드는 효모(예를 들어, 효모 균주 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) 또는 사카로마이세스 세레베시아에(Saccharomyces cerevisiae)) 또는 포유류 세포(예를 들어 인간 배아 신장 세포 또는 중국 햄스터 난소 세포)에서 발현된다. 발현 작제물은 하나 이상의 태그(예를 들어 금속 킬레이트화 크로마토그래피(Ni-NTA)에 의한, 예를 들어 정제를 위한 C-말단 헥사히스티딘 태그)를 인코딩할 수 있다. 이어서, 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여, 응집물, 미스폴딩된(misfolded) 다량체 등을 제거할 수 있다.
본 개시내용의 측면은 본 개시내용의 가용성 LIFR 및 gp130 폴리펩타이드 (및 이를 포함하는 임의의 융합 단백질)를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 즉, 본원에 기재된 임의의 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드를 포함하여, 본 개시내용의 임의의 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드, 또는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산이 제공된다. 특정 측면에서, 이러한 핵산은 발현 벡터에 존재한다. 발현 벡터는 제제(예를 들어, 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드)를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하며, 상기 프로모터는 제제를 발현시키기 위해 선택된 숙주 세포의 유형을 기준으로 선택된다. 적합한 발현 벡터는 전형적으로 에피솜 또는 숙주 염색체 DNA의 일체부로서 숙주 유기체에서 복제 가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 목적하는 DNA 서열로 형질전환된 세포의 검출을 가능하게 위해, 선택 마커(예를 들어, 암피실린-내성, 하이그로마이신-내성, 테트라사이클린 내성, 카나마이신 내성, 네오마이신 내성, 등)를 함유한다.
또한 본원에 기재된 임의의 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드를 포함하는 본 개시내용의 임의의 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포뿐만 아니라 이를 포함하는 임의의 발현 벡터가 제공된다. 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)은 본 개시내용의 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 클로닝하기 위해 사용될 수 있는 원핵 숙주 세포의 하나의 예이다. 사용에 적합한 다른 미생물 숙주는, 바실러스, 예컨대 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 다른 엔테로박테리아세아에, 예컨대 살모넬라, 세라티아, 및 다양한 슈도모나스 종을 포함된다. 이러한 원핵 숙주에서, 전형적으로 숙주 세포(예를 들어, 복제원)와 상용성인 발현 조절 서열을 함유하는 발현 벡터를 또한 만들 수 있다. 또한, 락토오스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마아제 프로모터 시스템 또는 파아지 람다로부터의 프로모터 시스템과 같은, 임의의 수의 다양한 널리 공지된 프로모터가 존재할 것이다. 프로모터는 전형적으로 임의로 작동자 서열을 이용하여 발현을 조절하며, 전사 및 번역을 개시하고 완료하기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 가질 것이다.
효모와 같은 다른 미생물도 또한 발현에 유용하다. 사카로마이세스(Saccharomyces)(예를 들어, S. 세레비지아에(S. cerevisiae)) 및 피치아(Pichia)는 원하는 경우 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터), 복제 기점, 종결 서열 등을 갖는 적합한 벡터를 갖는, 적합한 효모 숙주 세포의 예이다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 다른 당분해 효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는, 특히, 알코올 탈수소효소, 이소사이토크롬 C, 및 말토오스 및 갈락토오스 이용에 관여하는 효소로부터의 프로모터를 포함한다.
미생물 외에, 포유류 세포(예를 들어, 시험관내 세포 배양에서 성장한 포유류 세포)는 또한 본 개시내용의 가용성 LIFR 및 gp130 폴리펩타이드를 발현 및 제조하는 데 사용될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포는 인간 세포주, 비-인간 영장류 세포주, 설치류(예를 들어, 마우스, 랫트) 세포주, 등을 포함한다. 적합한 포유류 세포주는, 비제한적으로, HeLa 세포(예를 들어, 미국 종균 협회(ATCC) No. CCL-2), CHO 세포(예를 들어, ATCC 번호 CRL9618, CCL61, CRL9096), 293 세포(예를 들어, ATCC 번호 CRL-1573), 베로(Vero) 세포, NIH 3T3 세포(예를 들어, ATCC 번호 CRL-1658), Huh-7 세포, BHK 세포(예를 들어, ATCC 번호 CCL10), PC12 세포(ATCC 번호 CRL1721), COS 세포, COS-7 세포(ATCC 번호 CRL1651), RAT1 세포, 마우스 L 세포(ATCC 번호 CCLI.3), 인간 배아 신장(HEK) 세포(ATCC 번호 CRL1573), HLHepG2 세포, 등을 포함한다. 이러한 세포에 대한 발현 벡터는 복제원, 프로모터 및 인핸서(enhancer)와 같은 발현 조절 서열, 및 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결자 서열과 같은 필요한 가공 정보 부위를 포함할 수 있다. 적합한 발현 조절 서열의 예는, 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 사이토메갈로바이러스 등에서 유도된 프로모터이다.
일단(예를 들어, 재조합으로) 합성되면, 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드는 황산암모늄 침전, 친화도 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 정제, 겔 전기영동, 등을 포함하는 to 당업계에서 알려진 표준 절차에 따라 정제될 수 있다. 대상 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드는 실질적으로 순수할 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 80% 내지 85% 순수하고, 적어도 약 85% 내지 90% 순수하고, 적어도 약 90% 내지 95% 순수하거나, 또는 98% 내지 99% 또는 그 초과로 순수할 수 있고, 예를 들어, 오염물질 예컨대 세포 잔해, 가용성 LIFR 또는 gp130 폴리펩타이드 이외의 거대분자, 등이 없을 수 있다.
조성물
또한, 임의의 융합 및/또는 이량체 단백질을 비롯하여 본 개시내용의 가용성 LIFR 및/또는 가용성 gp130 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 제공된다.
특정 측면에서, 조성물은 액체 매질에 존재하는 본 개시내용의 가용성 LIFR 및/또는 가용성 gp130 폴리펩타이드를 포함한다. 액체 매질은 수성 액체 매질, 예컨대 물, 완충 용액, 등일 수 있다. 하나 이상의 첨가제 예컨대 염(예를 들어, NaCl, MgCl2, KCl, MgSO4), 완충제(Tris 완충제, N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄설폰산 산)(HEPES), 2-(N-모폴리노)에탄설폰산 산(MES), 2-(N-모폴리노)에탄설폰산 산 나트륨 염(MES), 3-(N-모폴리노)프로판설폰산 산(MOPS), N-트리스[하이드록시메틸]메틸-3-아미노프로판설폰산 산(TAPS), 등), 프로테아제 억제제, 글리세롤, 등은 그와 같은 조성물에 존재할 수 있다.
약제학적 조성물이 또한 제공된다. 약제학적 조성물은 본 개시내용의 임의의 가용성 LIFR 폴리펩타이드, 가용성 gp130 폴리펩타이드, 융합 단백질 및/또는 이량체화 단백질(이 중 임의의 것은 본 명세서에서 "LIF-결합제"로 지칭될 수 있음) 및 약제학적으로 허용되는 담체 중 임의의 것을 포함한다. 약제학적 조성물은 일반적으로 LIF-결합제의 치료적 유효량을 포함한다. "치료 유효량"은, 목적하는 결과를 생성하는 데 충분한 투여량, 예를 들어 LIF 신호전달과 관련된 세포 증식성 장애(예를 들어, 암, 예컨대 췌장 암)를 갖는 개체에서 유익한 또는 목적하는 치료적(예방적 포함) 결과, 예컨대 세포 증식의 감소를 이끌어내는 데 충분한 양을 의미한다.
본 개시내용의 LIF-결합제는 치료적 투여를 위한 다양한 제형에 혼입될 수 있다. 더욱 특히, LIF-결합제는 적절한 약학적으로 허용되는 부형제 또는 희석제와의 조합에 의해 약제학적 조성물로 제형화될 수 있으며, 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태, 예컨대 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 주사, 흡입제 및 에어로졸의 제제로 제형화될 수 있다.
개체에의 투여에 적합한(예를 들어, 인간 투여에 적합한) 본 개시내용의 LIF-결합제의 제형은, 일반적으로 멸균된 것이며, 추가로 선택된 투여 경로에 따라 개체에의 투여에 금지된 검출 가능한 발열원 또는 다른 오염물이 없을 수 있다.
약제학적 투여 형태에서, LIF-결합제는 단독으로 또는 적절한 연합으로뿐만 아니라, 다른 약제학적 활성 화합물과 조합으로 투여될 수 있다. 하기 방법 및 부형제는 단지 예시이며, 제한하고자 하는 것이 아니다.
경구 제제의 경우, LIF-결합제는 단독으로, 또는 정제, 분말, 과립 또는 캡슐을 제조하는 데 적절한 첨가제, 예를 들어 통상적인 첨가제, 예컨대 락토오스, 만니톨, 옥수수 전분 또는 감자 전분; 결합제, 예컨대 결정질 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 붕해제, 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 또는 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스; 윤활제, 예컨대 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트; 및 목적하는 경우, 희석제, 완충제, 습윤제, 보존제 및 풍미제와 조합으로 사용될 수 있다.
LIF-결합제는, 목적하는 경우, 통상적인 첨가제, 예컨대 가용화제, 등장제, 현탁제, 유화제, 안정화제 및 보존제와 함께, 수성 또는 비수성 용매, 예컨대 식물성 또는 다른 유사한 오일, 합성 지방족 산 글리세라이드, 고급 지방족 산의 에스테르 또는 프로필렌 글리콜 중에 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 주사용 제제로 제형화될 수 있다.
약제학적 조성물은 액체 형태, 동결건조된 형태, 또는 동결건조된 형태로부터 재구성된 액체 형태일 수 있으며, 여기서 동결건조된 제제는 투여 전 멸균 용액으로 재구성되어야 한다. 동결건조된 조성물을 재구성하기 위한 표준 절차는 일정 부피의 순수한 물(전형적으로 동결건조 동안 제거된 부피와 동일함)을 다시 첨가하는 것이지만; 항균제를 포함하는 용액이 비경구 투여용 약제학적 조성물의 제조를 위해 사용될 수 있다.
LIF-결합제의 수성 제형은 pH-완충 용액 중에, 예를 들어 약 4.0 내지 약 7.0, 또는 약 5.0 내지 약 6.0 범위, 또는 대안적으로 약 5.5의 pH로 제조될 수 있다. 이러한 범위 내 pH에 적합한 완충제의 예는 포스페이트-, 히스티딘-, 시트레이트-, 석시네이트-, 아세테이트-완충제 및 다른 유기 산 완충제를 포함한다. 완충제 농도는, 예를 들어 완충제 및 제형의 목적하는 등장성(tonicity)에 따라, 약 1 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 50 mM일 수 있다.
사용 방법
또한 본 개시내용의 가용성 LIFR 폴리펩타이드, 가용성 gp130 폴리펩타이드, 융합 단백질 및/또는 이량체화 단백질(이 중 임의의 것은 본 명세서에서 "LIF-결합제"로 지칭 될 수 있음)를 사용하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에 따르면, 치료적 유효량의 본 개시내용의 가용성 LIFR 폴리펩타이드, 가용성 gp130 폴리펩타이드, 융합 단백질 및/또는 이량체화 단백질, 또는 임의의 그와 같은 LIF-결합제를 포함하는 약제학적 조성물을 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 특정 측면에서, 필요로 하는 개체는 LIF 신호전달과 관련된 세포 증식성 장애를 갖고, 투여는 세포 증식성 장애를 치료하는 데 효과적이다. 특정 측면에서, 세포 증식성 장애는 암이다. 관심 대상의 암에는 췌장암이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 LIF-결합제 또는 약제학적 조성물은, LIF-결합제 또는 약제학적 조성물이 유효량으로 투여되는 경우, 숙주에서 암 세포(들)의 성장, 전이 및/또는 침입을 억제한다. "암 세포"란, 예를 들어 비정상 세포 성장, 비정상 세포 증식, 밀도 의존적 성장 저해의 손실, 정착-독립적인 성장 잠재력, 면역저하된 비-인간 동물 모델에서 종양 성장 및/또는 발달을 촉진시키는 능력 및/또는 세포 형질전환의 임의의 적절한 지표 중 하나 이상에 의해 특징지어질 수 있는, 신생물성 세포 표현형을 나타내는 세포를 의미한다. "암 세포"는 "종양 세포", "악성 세포" 또는 "암성 세포"와 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 고형 종양, 반고형 종양, 원발성 종양, 전이성 종양 등의 암 세포를 포함한다.
본 개시내용의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 암은, 비제한적으로, 고형 종양, 폐암(예를 들어, 비-소세포 폐암(NSCLC), 유방암, 전립선암, 췌장암, 결장직장 암종, 신장 세포 암종, 및 본 개시내용의 LIF-결합제 또는 약제학적 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 임의의 다른 유형의 암을 포함한다.
LIF-결합제는 단독으로(예를 들어, 단일요법으로) 또는 하나 이상의 부가적인 치료제와 조합으로(예를 들어, 병용 요법으로) 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, LIF-결합제(또는 이를 포함하는 약제학적 조성물)의 유효량은, 단독으로(예를 들어, 단일요법으로) 또는 하나 이상의 부가적인 치료제와 조합으로(예를 들어, 병용 요법으로), 하나 이상의 용량으로 투여되는 경우, 개체에서 세포 증식성 장애(예를 들어, 암)의 증상을, LIF-결합제 또는 약제학적 조성물로 치료받지 않은 개체에서의 증상과 비교하여, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 그 초과 감소시키는 데 효과적인 양이다.
특정 측면에서, 본 개시내용의 방법은, LIF-결합제 또는 약제학적 조성물이 유효량으로 투여되는 경우, 개체에서 암 세포의 성장, 전이 및/또는 침입을 억제한다.
LIF-결합제 또는 약제학적 조성물은 생체내 및 생체외 방법뿐만 아니라, 전신 및 국소 투여 경로를 포함하는, 약물 전달에 적합한 임의의 이용가능한 방법 및 경로를 사용하여 개체에게 투여될 수 있다. 종래의 및 약제학적으로 허용되는 투여 경로는 비강내, 근육내, 기관내, 피하, 진피내, 국부 적용, 안구, 정맥내, 동맥내, 비강, 경구, 및 다른 장관 및 비경구 투여 경로를 포함한다. 투여 경로는, 목적하는 경우, LIF-결합제 및/또는 목적하는 효과에 따라 조합 또는 조정될 수 있다. LIF-결합제 또는 약제학적 조성물은 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, LIF-결합제 또는 약제학적 조성물은 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, LIF-결합제 또는 약제학적 조성물은, 예를 들어 전신 전달(예를 들어, 정맥내 주입)을 위한 또는 국소 부위에의 주사에 의해 투여된다.
다양한 개체가 본 방법에 따라 치료 가능하다. 일반적으로, 이러한 대상은 "포유동물" 또는 "포유류"이며, 여기서 이러한 용어는 육식동물목(예를 들어, 개 및 고양이), 설치류(예를 들어, 마우스, 기니어 피그 및 래트) 및 영장류(예를 들어, 인간, 침팬지 및 원숭이)를 포함하는, 포유류강 내에 있는 유기체를 기재하는 데 광범위하게 사용된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간일 것이다.
"치료하는" 또는 "치료"란, 개체의 세포 증식성 장애(예를 들어, 암)와 관련된 증상에 있어서의 적어도 개선을 의미하며, 여기서 개선은 넓은 의미에서 치료하고자 하는 세포 증식성 장애와 관련된 파라미터, 예를 들어 증상의 크기를 적어도 감소시키는 것을 나타낸다. 이와 같이, 치료는 또한 개체가 더이상 세포 증식성 장애, 또는 적어도 세포 증식성 장애를 특징으로 하는 증상으로 고통받지 않도록, 세포 증식성 장애, 또는 적어도 이와 관련된 증상이, 완전히 억제되는, 예를 들어 발생이 예방되는, 또는 중단되는, 예를 들어 종결되는 상황을 포함한다.
투약은 치료하고자 하는 질환 상태의 중증도 및 반응성에 따라 달라진다. 최적의 투여 계획은 환자의 신체 내 약물 축적의 측정치로부터 계산될 수 있다. 투여하는 의사는 최적의 투여량, 투약 방법 및 반복률을 결정할 수 있다. 최적의 투여량은 개별 LIF 결합제의 상대적 효능에 따라 달라질 수 있고, 일반적으로 시험관내 및 생체내 동물 모델 등에 효과적인 것으로 밝혀진 EC50을 기준으로 추정할 수 있다. 일반적으로 투여량은 체중 kg 당 0.01 μg 내지 100 g이며, 매일, 매주, 매월 또는 매년 1 회 이상 투여할 수 있다. 치료하는 의사는 체액 또는 조직 내에서 약물의 측정된 체류 시간 및 농도에 기초하여 투여의 반복률을 추정할 수 있다. 성공적인 치료 후, 대상체는 질환 상태의 재발을 방지하기 위해 유지 요법을 받는 것이 바람직할 수 있고, LIF-결합제 또는 약제학적 조성물이 체중 kg 당 0.01μg 내지 100g 범위의 유지 용량으로, 매일 1회 이상에서, 수 개월에 1회, 6개월에 1회, 매년 1회로, 또는 임의의 다른 적합한 빈도로 투여된다.
본 개시내용의 치료 방법은 단일 유형의 단일 유형의 LIF-결합제를 대상에게 투여하는 것을 포함할 수 있거나, 또는 상이한 LIF-결합제의 칵테일의 투여에 의해, 2가지 이상의 유형의 LIF-결합제를 대상에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
또한, LIF 신호전달과 관련된 세포 증식성 장애를 갖는 개체를 확인하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. LIF 신호전달과 관련된 세포 증식성 장애를 갖는 개체를 확인하는 것은, 다양한 접근법 및 이들의 조합을 사용하여 수행될 수 있다. 특정 측면에서, 확인은 개체로부터 얻은 샘플(예를 들어, 유체 샘플, 종양 생검 등)에서의 LIF 존재도를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, LIF 포획제로서 본 개시내용의 가용성 LIFR 폴리펩타이드, 가용성 gp130 폴리펩타이드, 융합 단백질 및/또는 이량체화 단백질을 사용하여 LIF 존재도를 정량화한다.
특정 측면에서, 확인은 개체로부터 수득된 샘플에서의 LIF 신호전달 수준에 기초한다. LIF 신호전달의 수준은 Jak-STAT 신호전달 경로의 분자를 포함하는 하나 이상의 LIF 신호전달 경로 분자의 인산화 상태에 기초할 수 있으며, 그의 비제한적인 예는 pSTAT3(예를 들어, pSTAT3-Y705)이다. 특정 구현예에 있어서, 확인은 면역검정법에 기초한다. ELISA, 유세포측정 검정, 조직 절편 샘플 상에서의 면역조직화학, 조직 절편 샘플 상에서의 면역형광, 웨스턴(Western) 분석 등을 포함하는, 다양한 적합한 면역검정 포맷이 이용 가능하다.
일부 구현예에서, 확인은 핵산 서열분석에 기초한다. 예를 들어, 관심 대상의 단백질을 인코딩하는 mRNA에 상응하는 서열분석 판독의 수를 사용하여, 단백질의 발현 수준을 결정할 수 있다. 특정 측면에서, 서열분석은 차세대 서열분석 시스템을 사용하여, 예컨대 Illumina®(예를 들어, HiSeqTM, MiSeqTM 및/또는 Genome AnalyzerTM 서열분석 시스템); Oxford Nanopore Technologies(예를 들어, MinIONTM, GridIONx5TM, PromethIONTM, 또는 SmidgIONTM 나노포어 서열분석 장치), Ion TorrentTM(예를 들어, Ion PGMTM and/or Ion ProtonTM 서열분석 시스템); Pacific Biosciences(예를 들어, PACBIO RS II 서열분석 시스템); Life TechnologiesTM(예를 들어, SOLiD 서열분석 시스템); Roche(예를 들어, 454 GS FLX+ 및/또는 GS Junior 서열분석 시스템); 또는 관심 대상의 임의의 다른 서열분석 플랫폼에 의해 제공된 서열분석 플랫폼 상에서 수행된다. 조직 또는 유체 샘플로부터 핵산을 단리하는 프로토콜뿐만 아니라, 목적하는 서열분석 플랫폼에 적당한 서열분석 어댑터를 갖는 서열분석 라이브러리를 제조하기 위한 프로토콜이 용이하게 이용 가능하다.
일부 구현예에서, LIF 신호전달과 관련된 세포 증식성 장애를 갖는 개체를 확인하는 단계를 포함하는 방법은, 개체로부터 샘플을 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
개체로부터 수득된 샘플은, 개체가 LIF 신호전달과 관련된 세포 증식성 장애를 갖는지를 결정하는 데 적합한 임의의 샘플일 수 있다. 특정 양태에서, 샘플은 유체 샘플, 예컨대 전혈, 혈청, 혈장 등이다. 일부 구현예에서, 샘플은 조직 샘플이다. 관심 대상의 조직 샘플에는, 비제한적으로, 종양 생검 샘플 등이 포함된다.
키트
또한, 키트가 본 개시내용에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 임의의 가용성 LIFR 폴리펩타이드, 가용성 gp130 폴리펩타이드, 융합 단백질 및/또는 이량체화 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 키트가 제공된다. 키트는 약제 학적 조성물을 필요로 하는 개체, 예를 들어, 세포 증식성 장애(예를 들어, 췌장암과 같은 암) 또는 LIF의 활성의 억제가 유익할 수 있는 다른 의학적 상태를 갖는 개체에게 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 키트는 하나 이상의(예를 들어, 둘 이상의) 단위 투여량으로 존재하는 약제학적 조성물을 포함한다.
특정 측면에서, 본 개시내용의 임의의 가용성 LIFR 폴리펩타이드, 가용성 gp130 폴리펩타이드, 융합 단백질 및/또는 이량체화 단백질을 포함하는 키트가 제공되며, 여기서 이러한 키트는 샘플(예를 들어, 유체 샘플, 조직 샘플, 등)에서 LIF를 검출하기 위해 키트를 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 임의의 가용성 LIFR 폴리펩타이드, 가용성 gp130 폴리펩타이드, 융합 단백질 및/또는 이량체화 단백질을 포함하는 키트가 제공되며, 이러한 키트는 예를 들어 연구 목적으로 시험관내에서 또는 생체내에서 LIF 신호 전달/활성을 억제하기 위해 키트를 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함한다.
키트의 구성요소가 별도의 용기에 존재할 수 있거나, 또는 다수의 구성요소는 하나의 용기에 존재할 수 있다. 적합한 용기는 단일 튜브(예컨대, 바이알), 하나 이상의 플레이트 웰(예컨대, 96-웰 플레이트, 384-웰 플레이트 등) 등을 포함한다.
키트의 설명서는 적합한 기록 매체에 기록될 수 있다. 예를 들어, 설명서는 종이 또는 플라스틱 등과 같은 기재 상에 인쇄될 수 있다. 이와 같이, 설명서는 포장 삽입물로서 키트 내에, 키트의 용기 또는 그의 구성요소의 라벨링(즉, 포장 또는 하위 포장과 관련됨) 등에 존재할 수 있다. 다른 구현예에서, 설명서 적절한 컴퓨터 판독가능 저장 매체, 예를 들어, 휴대용 플래시 드라이브, DVD, CD-ROM, 디스켓 등에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 존재한다. 또 다른 구현예에서, 실제 설명서는 키트에 존재하지 않지만, 예를 들어 인터넷을 통해 원격 공급원으로부터 설명서를 수득하기 위한 수단이 제공된다. 이 구현예의 예는 설명서가 보여질 수 있고/거나 설명서가 다운로드될 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다. 설명서와 마찬가지로, 설명서를 획득하기 위한 수단은 적절한 기재 상에 기록된다.
첨부된 청구범위에 불구하고, 본 개시내용은 또한 하기 절 의해 정의된다:
1. 서열번호: 2와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가용성 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR) 폴리펩타이드로서, 상기 LIFR 폴리펩타이드는 상응하는 야생형 LIFR 폴리펩타이드에 비해 백혈병 억제 인자(LIF)에 대해 증가된 결합 친화도를 나타내는 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
2. 절 1에 있어서,
위치 L218에서의 아미노산 치환, 및
위치 N277에서의 아미노산 치환,
중 하나 또는 둘 다를 포함하되, 상기 위치의 확인은 서열번호:2에 대한 것인, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
3. 절 2에 있어서, 하기 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드:
L218P 아미노산 치환, 및
N277D 아미노산 치환.
4. 절 1 내지 3 중 어느 한 절에 있어서,
위치 I257에서의 아미노산 치환,
위치 V262에서의 아미노산 치환, 및
위치 T273에서의 아미노산 치환,
중 1개, 2개 또는 각각을 포함하되, 상기 위치의 확인은 서열번호:2에 대한 것인, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
5. 절 4에 있어서, 하기 중 1개, 2개 또는 각각을 포함하는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드:
I257V 아미노산 치환,
V262A 아미노산 치환, 및
T273I 아미노산 치환.
6. 절 1 내지 5 중 어느 한 절에 있어서,
위치 I217에서의 아미노산 치환,
위치 H240에서의 아미노산 치환, 및
위치 I260에서의 아미노산 치환,
중 1개, 2개 또는 각각을 포함하되, 상기 위치의 확인은 서열번호:2에 대한 것인, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
7. 절 6에 있어서, 하기 중 1개, 2개 또는 각각을 포함하는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드:
I217V 아미노산 치환,
H240R 아미노산 치환, 및
I260V 아미노산 치환.
8. 절 1 내지 7 중 어느 한 절에 있어서, 위치 N242에서의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 위치의 확인은 서열번호:2에 대한 것인, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
9. 절 8에 있어서, N242D 아미노산 치환을 포함하는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
10. 절 1 내지 9 중 어느 한 절에 있어서, 서열번호:2와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
11. 절 1 내지 9 중 어느 한 절에 있어서, 서열번호:2와 적어도 90% 동일하거나 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
12. 절 1 내지 11 중 어느 한 절에 있어서, 상기 가용성 LIFR 폴리펩타이드는 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드에 융합되는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
13. 절 12에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드는 하기로 이루어진 군으로부터 이종성 폴리펩타이드를 포함하는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드: Fc 도메인, 알부민, 트랜스페린, XTEN, 호모-아미노산 중합체, 프롤린-알라닌-세린 중합체, 엘라스틴-유사 펩타이드, 및 이들의 임의의 조합.
14. 절 13에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드는 Fc 도메인을 포함하는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
15. 절 12 내지 14 중 어느 한 절에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드는 절 27 내지 38 중 어느 한 절의 가용성 gp130 폴리펩타이드를 포함하는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
16. 절 15에 있어서, 상기 가용성 LIFR 폴리펩타이드 및 가용성 gp130 폴리펩타이드는 링커를 통해 융합되는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
17. 절 16에 있어서, 상기 링커는 GlySer 링커를 포함하는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
18. 절 17에 있어서, 상기 GlySer 링커는 (Gly4Ser)n 링커를 포함하는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
19. 절 1 내지 18 중 어느 한 절에 있어서, 1 내지 18 중 어느 한 절의 가용성 LIFR 폴리펩타이드로 이량체화된, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
20. 절 19에 있어서, 각각의 가용성 LIFR 폴리펩타이드는 Fc 도메인을 포함하고, 그리고 이량체화는 Fc 도메인을 통한 것인, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
21. 절 1 내지 18 중 어느 한 절의 가용성 LIFR 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산.
22. 절 21의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
23. 하기를 포함하는 세포:
절 1 내지 18 중 어느 한 절의 가용성 LIFR 폴리펩타이드,
절 21의 핵산,
절 22의 발현 벡터, 또는
이들의 임의의 조합.
24. 절 1 내지 18 중 어느 한 절의 가용성 LIFR 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서,
상기 세포가 LIFR 폴리펩타이드를 생산하는 조건 하에 절 22의 발현 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
25. 절 24에 있어서, 상기 세포 배양 전, 상기 발현 벡터를 상기 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
26. 절 24 또는 절 25에 있어서, 상기 세포 배양 후, 세포로부터 상기 LIFR 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
27. 서열번호:4와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가용성 당단백질 130(gp130) 폴리펩타이드로서, gp130 폴리펩타이드는 상응하는 야생형 gp130 폴리펩타이드에 비해 백혈병 억제 인자(LIF)에 대해 증가된 결합 친화도를 나타내는, 가용성 당단백질 130(gp130) 폴리펩타이드.
28. 절 27에 있어서, 위치 K45에서의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 위치의 확인은 서열번호:4에 대한 것인, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
29. 절 28에 있어서, K45E 아미노산 치환을 포함하는, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
30. 절 27 내지 29 중 어느 한 절에 있어서,
위치 Y95에서의 아미노산 치환, 및
위치 K184에서의 아미노산 치환,
중 하나 또는 둘 다를 포함하되, 상기 위치의 확인은 서열번호:4에 대한 것인, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
31. 절 30에 있어서, 하기 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 가용성 gp130 폴리펩타이드:
Y95D 아미노산 치환, 및
K184E 아미노산 치환.
32. 절 27 내지 31 중 어느 한 절에 있어서,
위치 F46에서의 아미노산 치환, 및
위치 I130에서의 아미노산 치환,
중 하나 또는 둘 다를 포함하되, 상기 위치의 확인은 서열번호:4에 대한 것인, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
33. 절 32에 있어서, 하기 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 가용성 gp130 폴리펩타이드:
F46L 아미노산 치환, 및
I130M 아미노산 치환.
34. 절 27 내지 33 중 어느 한 절에 있어서, 서열번호:4와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
35. 절 27 내지 33 중 어느 한 절에 있어서, 서열번호:4와 적어도 90% 동일하거나 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
36. 절 27 내지 35 중 어느 한 절에 있어서, 상기 가용성 gp130 폴리펩타이드는 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드에 융합되는, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
37. 절 36에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드는 하기로 이루어진 군으로부터 이종성 폴리펩타이드를 포함하는, 가용성 gp130 폴리펩타이드: Fc 도메인, 알부민, 트랜스페린, XTEN, 호모-아미노산 중합체, 프롤린-알라닌-세린 중합체, 엘라스틴-유사 펩타이드, 및 이들의 임의의 조합.
38. 절 37에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드는 Fc 도메인을 포함하는, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
39. 절 36 내지 38 중 어느 한 절에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드는 절 1 내지 14 중 어느 한 절의 가용성 LIFR 폴리펩타이드를 포함하는, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
40. 절 39에 있어서, 상기 가용성 gp130 폴리펩타이드 및 가용성 LIFR 폴리펩타이드는 링커를 통해 융합되는, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
41. 절 40에 있어서, 상기 링커는 GlySer 링커를 포함하는, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
42. 절 41에 있어서, 상기 GlySer 링커는 (Gly4Ser)n 링커를 포함하는, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
43. 절 27 내지 42 중 어느 한 절에 있어서, 절 27 내지 42 중 어느 한 절의 가용성 gp130 폴리펩타이드로 이량체화된, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
44. 절 43에 있어서, 각각의 가용성 gp130 폴리펩타이드는 Fc 도메인을 포함하고, 그리고 이량체화는 Fc 도메인을 통한 것인, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
45. 절 27 내지 42 중 어느 한 절의 가용성 gp130 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산.
46. 절 45의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
47. 하기를 포함하는 세포:
절 27 내지 42 중 어느 한 절의 가용성 gp130 폴리펩타이드,
절 45의 핵산,
절 46의 발현 벡터, 또는
이들의 임의의 조합.
48. 절 27 내지 42 중 어느 한 절의 가용성 gp130 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서,
상기 세포가 가용성 gp130 폴리펩타이드를 생산하는 조건 하에 절 46의 발현 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
49. 절 48, 상기 세포 배양 전, 상기 발현 벡터를 상기 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
50. 절 48 또는 절 49에 있어서, 상기 세포 배양 후, 상기 세포로부터 상기 가용성 gp130 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
51. 이종이량체성 단백질로서,
절 27 내지 38 중 어느 한 절의 가용성 gp130 폴리펩타이드로 이량체화된 절 1 내지 14 중 어느 한 절의 가용성 LIFR 폴리펩타이드를 포함하는 이종이량체성 단백질.
52. 절 51에 있어서, 상기 가용성 LIFR 폴리펩타이드 및 가용성 gp130 폴리펩타이드 각각은 상기 가용성 LIFR 폴리펩타이드 및 가용성 gp130 폴리펩타이드가 이량체화되는 이량체화 도메인을 포함하는, 이종이량체성 단백질.
53. 절 52에 있어서, 상기 이량체화 도메인은 Fc 도메인을 포함하는, 이종이량체성 단백질.
54. 하기를 포함하는 약제학적 조성물:
백혈병 억제 인자(LIF)에 결합하고 서열번호:2와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가용성 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR) 폴리펩타이드; 및
약제학적으로 허용되는 담체.
55. 하기를 포함하는 약제학적 조성물:
백혈병 억제 인자(LIF)에 결합하고 서열번호:4와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가용성 당단백질 130(gp130) 폴리펩타이드; 및
약제학적으로 허용되는 담체.
56. 하기를 포함하는 약제학적 조성물:
백혈병 억제 인자(LIF)에 결합하고 서열번호:2와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가용성 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR) 폴리펩타이드로서, 백혈병 억제 인자(LIF)에 결합하고 서열번호:4와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가용성 당단백질 130(gp130) 폴리펩타이드로 이량체화된 가용성 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR) 폴리펩타이드; 및
약제학적으로 허용되는 담체.
57. 하기를 포함하는 약제학적 조성물:
절 1 내지 18 중 어느 한 절의 가용성 LIFR 폴리펩타이드; 및
약제학적으로 허용되는 담체.
58. 하기를 포함하는 약제학적 조성물:
절 27 내지 42 중 어느 한 절의 가용성 gp130 폴리펩타이드; 및
약제학적으로 허용되는 담체.
59. 하기를 포함하는 약제학적 조성물:
절 51 내지 53 중 어느 한 절의 이종이량체성 단백질; 및
약제학적으로 허용되는 담체.
60. 절 54 내지 59 중 어느 한 절의 약제학적 조성물의 치료 유효량을 치료가 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
61. 절 60에 있어서, 상기 치료가 필요한 개체는 암에 걸린 개체인, 방법.
62. 절 61에 있어서, 상기 암은 췌장암인, 방법.
63. 하기를 포함하는 키트:
절 54 내지 59 중 어느 한 절의 약제학적 조성물; 및
약제학적 조성물을 필요로 하는 개체에게 투여하기 위한 설명서.
64. 절 63에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 하나 이상의 단위 투여량으로 존재하는, 키트.
65. 절 63에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 2개 이상의 단위 투여량으로 존재하는, 키트.
66. 절 63 내지 65 중 어느 한 절에 있어서, 상기 치료가 필요한 개체는 암에 걸린 개체인, 키트.
67. 절 66에 있어서, 상기 암은 췌장암인, 키트.
하기 실시예는 제한이 아닌 예시로서 제공된다.
실험
실시예 1 - 조작된 가용성 LIFR 폴리펩타이드
이 예에서, LIFR 변이체는 효모의 표면에 표시된 인간 LIFR의 Ig-유사 도메인의 라이브러리에서 확인되었고 인간 LIF에 대한 최적의 결합제를 위해 FACS를 사용하여 분류되었다. 여러 라운드의 분류 후, 변이체는 선택되었고, 시퀀싱되었고, 특성규명되었다. 분류로부터 분리된 LIFR 변이체는 도 3에 요약된다.
도 3, 패널 A는 여러 종류에 걸쳐 분리된 LIFR Ig-유사 도메인 변이체에서 관찰된 공통 돌연변이를 도시한다. 넘버링은 LIFR Cytokine Binding Motif I(CBMI) 도메인의 시작 부분에서 시작된다. 도 3, 패널 B는 낮은 (10pM, 100pM) LIF 농도에서 정규화되고 적산된 형광 결합 값으로부터 계산된 LIFR 변이체의 결합 점수를 도시한다. 모든 점수는 야생형 및 효모 표면에서의 차별적 발현에 대해 정규화되었다.
확인된 LIFR 돌연변이 (도 3, 패널 A에 도시됨)에 기초하여, 어떤 종류에서도 관찰되지 않은 가능한 돌연변이 LIFR 변이체의 다중 조합이 부위 지정 돌연변이 유발을 사용하여 창출되었다. 도 4, 패널 A는 부위 지정 돌연변이 유발을 사용하여 생성된 변이체를 요약한다. 도 4, 패널 B는 도 3, 패널 B에 대해 위에서 기재된 바와 같이 계산된 이러한 변이체의 결합 점수를 도시한다. 야생형(WT)으로 정규화된 발현도 도시된다. 이 분석에서, VPRVVAID(I217V-L218P-H240R-I257V-I206V-V262A-T271I-N277D)가 최적의 LIFR 변이체로서 확인되었다.
도 5에서, 도 4, 패널 A로부터 공통 돌연변이는 인간 LIFR(청색)에 결합하는 인간 LIF(분홍색)의 PyMOL 모델 구조로 도시된다. 돌연변이는 적색으로 도시되며 PyMOL을 사용하여 도입된다. 루프 1, 2 및 3의 돌연변이 클러스터는 인세트로 확대된다.
실시예 2 - 조작된 가용성 GP130 폴리펩타이드
이 예에서, gp130 변이체는 효모 표면에 표시된 인간 gp130의 CBM 도메인의 라이브러리에서 확인되었고 인간 LIF에 대한 최적의 결합제를 위해 FACS를 사용하여 분류되었다. 여러 라운드의 분류 후, 변이체는 선택되었고, 시퀀싱되었고, 특성규명되었다. 분류로부터 분리된 gp130 변이체는 도 6에 요약되어 있다.
도 6, 패널 A는 여러 종류에 걸쳐 분리된 gp130 CBM 도메인 변이체에서 관찰된 공통 돌연변이를 도시한다. 넘버링은 gp130 Cytokine Binding Motif(CBM) 도메인의 시작 부분에서 시작된다. 도 6, 패널 B는 부위 지정 돌연변이 유발을 사용하여 창출된 돌연변이 gp130 변이체의 요약을 도시한다. 도 6, 패널 C는, 100pM 및 1nM을 낮은 LIF 농도로서 사용하여, 도 3, 패널 B에 기재된 바와 같이 계산된 gp130 변이체의 결합 점수를 도시한다. 야생형(WT)으로 정규화된 발현도 도시된다. 이 분석에서, ELDME(K45E-F46L-Y95D-I130M-K184E)가 최적의 gp130 변이체로서 확인되었다.
도 7에서, 도 6, 패널 A로부터 선택된 공통 돌연변이는 인간 gp130(분홍색)에 결합하는 인간 LIF(청색)의 해결된 구조에서 도시된다. PyMOL을 사용하여 삽입된 돌연변이는 청록색으로 도시된다. 영역 1과 2의 돌연변이 클러스터는 인세트로 확대된다.
실시예 3-인간 LIF에 대한 LIFR 및 gp130 변이체의 결합
이 예에서, LIFR 또는 gp130 변이체는 효모 표면에 표시되었다. 인간 LIF에 대한 결합은 유세포 분석을 사용하여 형광 항체 검출을 통해 측정되었다.
도 8, 패널 A는 인간 LIF에 대한 야생형 LIFR 및 LIFR 변이체를 나타내는 효모의 결합 결과를 도시한다. LIFR 야생형(WT)(원), "PDD" 변이체(L218P-N42D-N277D)(사각형) 및 VPRVVAID 변이체(도 4, 패널 A의 돌연변이)(삼각형)에 대한 결과가 도시된다. VPRVVAID 변이체의 KD는, 야생형(WT)에 비해 32배 더 높은 친화력인, 30 pM에 측정되었다.
도 8, 패널 B는 인간 LIF에 대한 야생형 gp130 및 gp130 변이체를 나타내는 효모의 결합 결과를 도시한다. gp130 야생형(WT)(원), "8M" 변이체(E4K-K5R-N14D-K45E-F46L-K83R-Y95D-N100S)(사각형) 및 ELDME 변이체(도 4, 패널 A의 돌연변이)(삼각형)에 대한 결과가 도시된다. ELDME 변이체의 KD는, 야생형(WT)에 비해 12배 더 높은 친화력인, 5 nM에 측정되었다.
실시예 4-동종이량체성 및 이종이량체성 가용성 LIFR 및 GP130 융합 폴리펩타이드
이 예에서, 동종이량체성 및 이종이량체성 가용성 LIFR 및/또는 gp130 Fc 융합 작 제물이 생성되었다. 도 9, 패널 A 및 B는, 각각 LIF의 gp130- 및 LIFR-결합면을 표적하는, 항-LIF 단클론성 항체 G1 및 L1을 개략적으로 예시한다. 이러한 항체는 효능에 대한 벤치 마크 역할을 한다.
도 9, 패널 C에는 gp130 사이토카인 결합 모티프(CBM) 변이체(ELDME) Fc-융합 동종이량체가 개략적으로 예시되며, 여기서 이량체화는 Fc 도메인을 통해 이루어진다. 이 작제물은 "gp130 ELDME Fc"로서 지칭될 수 있다.
도 9, 패널 D는 LIFR 사이토카인 결합 모티프 1 - Ig-유사 - 사이토카인 결합 모티프 2(CBMI-Ig-유사-CBMII) 변이체(VPRVVAID) Fc-융합 동종이량체를 개략적으로 예시하며, 여기서 이량체화는 Fc 도메인을 통해 이루어진다. 이 작제물은 "LIFR VPRVVAID Fc"로서 지칭될 수 있다.
도 9, 패널 E에는 각각의 단량체가 5x Gly4Ser 링커를 통해 gp130 CBM ELDME 변이체에 융합된 LIFR CBMI-Ig-유사-CBMII VPRVVAID 변이체를 포함하는 동종이량체가 개략적으로 예시된다. Fc 도메인은 gp130 부분에 대한 C-말단이고 이량체화는 Fc 도메인을 통해 이루어진다. 이 작제물은 "LIFR-gp130 V-E 융합 Fc"로서 지칭될 수 있다.
도 9, 패널 F는 패널 C에서 도시된 바와 같이 gp130 ELDME Fc 단량체 그리고 패널 D에서 도시된 바와 같이 LIFR VPRVVAID Fc 단량체를 포함하고 Fc 도메인을 통해 이량체화된 이종이량체를 개략적으로 예시한다.
도 9, 패널 C-F에 개략적으로 예시된 각각의 작제물은 성공적으로 발현되었고 정제되었다.
정제된 LIF 억제제와 가용성 LIF의 결합은 KinExA를 사용하여 테스트되었다. 도 10에 도시된 것은 다음에 대한 결합 결과이다: (1) 각 단량체로서 WT LIFR CBMI-Ig-유사-CBMII Fc 융합을 갖는 동종이량체; (2) 각 단량체로서 LIFR VPRVVAID Fc를 갖는 동종이량체; 그리고 (3) 각 단량체로서 LIFR-gp130 V-E 융합 Fc를 갖는 동종이량체. KinExA 소프트웨어에서 계산된 KD 값과 적합 곡선이 도시된다. LIFR-VPRVVAID-Fc는 인간 LIF에 대해 23pM의 친화도를 가지며, 이는 LIFR-WT-Fc에 비해 43배 개선된 것이다.
실시예 5-다중 LIF 결합 검정
결합 검정은 LIF에 결합된 수용체 유인체가 다른 LIF 분자와도 결합할 수 있는지를 결정하기 위해 도 11, 패널 A에 개략적으로 예시된 바와 같이 수행되었다. 목표는 Fc 융합체로서 동종이량체인 억제제가 동시에 이량체의 각 암과 함께 LIF에 결합할 수 있는지 여부를 입증하는 것이었다. 검정에 따르면, LIF는 효모의 표면에 표시된다. Fc-융합 억제제(묘사된 LIFR-VPRVVAID-Fc)는 포화 농도로 도입되고, 표시된 리간드에 결합하도록 허용되며, 과량은 세정된다. 가용성 LIF-His는 그 다음 Fc-융합 결합된 효모와 코인큐베이션된다. LIF 결합은 LIF-His의 His-태그 도메인을 통해 검출되며, 이는 Fc-융합에 대한 다중 LIF 결합이 발생하는 경우에만 존재해야 하며, 동종이량체는 '브릿지' 역할을 한다.
다중 LIF 결합 검정의 결과는 도 11, 패널 B에 도시된다. LIF는 표시된 LIF와 가용성 LIF 사이의 결합 브릿지로서 사용되는 Fc-융합 억제제와 함께 효모에 표시되었다. 각 조건에서 항-His6 태그 형광 항체로부터의 형광 방출은 LIF-His가 추가된 대조군이 없는 것으로 정규화되었다. 표시된 LIF에 대한 Fc-융합 결합은 또한 항-Fc 태그 형광 항체를 사용하여 확인되었다(데이터는 도 12, 패널 B에 도시됨). LIFR-WT-Fc, LIFR-VPRVVAID-Fc, LIFR-gp130 융합-Fc 및 항-LIF mAb L1에 대한 여러 LIF 결합 결과가 도시된다.
이러한 결과로부터, 테스트된 4 개의 동종이량체 모두가 여러 LIF 분자에 결합할 수 있음이 결정된다. 조작된 LIFR-Fc는 LIFR-WT-Fc에 비해 개선된 다중-LIF 결합을 보여주며, 이는 LIF에 대한 개선된 친화력 및 더 느린 오프-레이트(실시예 6에서 논의됨)로 인한 것 같다. LIFR-gp130 융합-Fc는, 4 개의 LIF 결합 도메인이 존재하기 때문에, 가장 큰 다중-LIF 결합 잠재력을 보여준다. 조작된 두 Fc 융합체는, 잠재적으로 더 높은 친화력으로 인해, 항-LIF mAb, L1과 비교할 때 더 큰 다중-LIF 결합을 보여준다. 전반적으로, 이러한 결과는 Fc-융합체로서 억제제가 2 : 1 LIF : 억제제 화학양론으로 LIF에 결합할 수 있음을 의미하며, 다중-LIF 결합 및 격리를 통해 더 큰 치료 이점을 위한 잠재력을 제공한다.
실시예 6-경쟁적 LIF 결합 검정
결합 검정은 과잉 가용성 LIF 경쟁자의 존재 하에 LIF에 결합된 수용체 유인체가 LIF에 얼마나 잘 결합되어 있는지를 결정하기 위해 도 12, 패널 A에 개략적으로 예시된 바와 같이 수행되었다. 목표는 과도한 경쟁자에 의한 경쟁에 대한 개선된 저항으로 알 수 있듯이 조작 수용체가 더 느린 속도로 이어지는지 여부를 결정하는 것이었다. 검정에 따르면, LIF는 효모의 표면에 표시된다. Fc-융합 억제제(묘사된 LIFR-VPRVVAID-Fc)는 포화 농도로 도입되고, 표시된 리간드에 결합하도록 허용되며, 과량은 세정된다. 가용성 LIF-His는 그 다음 Fc-융합 결합된 효모와 코인큐베이션된다. Fc-융합 결합은 억제제의 Fc 도메인을 통해 검출되며, 이는 고농도의 가용성 LIF-His에 의해 효모 표시된 LIF와 경쟁하게 될 것이다.
경쟁적 LIF 결합 검정의 결과는 도 12, 패널 B에 도시된다. LIF는 결합 파트너로서 첨가된 LIFR-WT-Fc, LIFR-VPRVVAID-Fc, LIFR-gp130 융합-Fc, 또는 항-LIF mAb, L1과 함께 효모에 표시되었다. 과량 억제제는 세정되었고 가용성 LIF는 경쟁자로 24 시간 동안 첨가되었다. 각 조건에서 항-Fc 형광 항체의 형광 방출은 과량 억제제가 제거되지 않고 가용성 LIF가 첨가되지 않은 대조군으로 정규화되었다.
이러한 결과로부터, LIFR-WT-Fc와 비교했을 때 조작된 LIFR-Fc 및 LIFR-gp130 융합-Fc가 오프 레이트를 크게 개선한 것이 결정된다. 이것은 높은 수준의 LIF-His 경쟁자(100 nM)의 존재 하에서 가장 두드러지며, 여기에서 조작된 수용체는 50% 이상 결합되어 있는 반면, LIFR-WT-Fc는 효모 표시된 LIF와 거의 완전히 경쟁한다. 결합된 상태로 남아있는 Fc-융합의 상대적 양은 항-LIF mAb, L1과 비슷하다. 조작된 Fc-융합에 의해 입증된 개선된 오프 레이트는 아마도 부분적으로 개선된 친화력을 설명하고 더 큰 치료 효능으로 이어져야 한다.
실시예 7-동시 수용체 결합 검정
결합 검정은 LIF에 결합된 수용체 유인체가 gp130 또는 LIFR과 동시에 결합할 수 있는지를 결정하기 위해 도 13, 패널 A에 개략적으로 예시된 바와 같이 수행되었다. 목표는 억제제가 LIF에 대한 결합에서 LIFR, gp130 또는 둘 다와 경쟁하는지 여부를 입증하는 것이었다. 검정에 따르면, gp130(묘사됨) 또는 LIFR이 효모 표면에 표시된다. LIF는 포화 농도로 도입되고, 표시된 수용체에 결합하고, 과량은 세정된다. 억제제(묘사된 LIFR-VPRVVAID-Fc)는 그 다음 LIF 결합 효모와 코인큐베이션된다. 결합은 억제제의 Fc 도메인을 통해 검출되며, 이는 LIF를 '브릿지'로서 사용하여 동시에 수용체 결합이 발생하는 경우에만 존재해야 한다. 억제제 결합이 검출되지 않으면, 표시된 수용체가 코인큐베이션된 억제제와 경쟁하여, 억제제의 LIF에의 결합을 방지하는 것으로 결정된다.
동시 결합 검정의 결과는 도 13, 패널 B에 도시된다. LIFR 또는 gp130은 결합 브릿지로서 사용된 인간 LIF와 함께 효모에 표시되었다. 형광 방출은 항-Fc 형광 항체의 판독 값으로, LIF가 첨가되지 않은 대조군으로 정규화되었다. 표시된 수용체에 대한 LIF 결합은 또한 항-His6 태그 형광 항체를 사용하여 확인되었다(데이터는 표시되지 않음). LIFR-VPRVVAID-Fc, gp130-ELDME-Fc, LIFR-gp130 이종이량체성 Fc, LIFR-gp130 동종이량체성 융합-Fc, 항-LIF mAb L1 및 항-LIF mAb G1에 대한 동시 결합 결과가 도시된다.
이러한 결과로부터, LIFR-Fc는 LIF-gp130 복합체에 (그리고 훨씬 적은 정도로, 다소 놀랍게도, LIF-LIFR 복합체와) 결합할 수 있는 반면, gp130-Fc는 LIF-LIFR 복합체에만 결합할 수 있음이 결정된다. 이것은 LIFR-Fc가 LIFR이 LIF에 결합하는 것을 효과적으로 차단하는 반면, gp130-Fc는 gp130이 LIF에 결합하는 것을 차단한다는 것을 의미한다. 두 수용체(이종이량체성-Fc 및 융합-Fc)를 갖는 폴리펩타이드는 상대적으로 동일한 정도로 표시된 두 수용체에 동시 결합을 나타낸다. 항-LIF 단클론성 항체(mAbs) L1 및 G1은 하나의 표시된 수용체-LIF 복합체 각각, gp130-LIF 또는 LIFR-LIF, 각각과 동시에 결합할 수만 있다. 이것은 (LIFR이 표시된 때 억제제 결합이 관찰되지 않으므로) L1이 LIFR과 경쟁적인 반면, (gp130이 표시된 때 억제제 결합이 관찰되지 않으므로) G1이 gp130과 경쟁적인 것을 의미한다. 따라서, 억제 메커니즘 측면에서, L1은 LIFR-Fc와 비슷하지만, G1은 gp130-Fc와 비슷한다. 모든 경우에, LIF가 없을 때 결합이 관찰되지 않았으며, 이는 동시 결합이 필요함을 나타낸다.
실시예 8-경쟁 결합 검정
경쟁 결합 검정은 도 14, 패널 A에 개략적으로 예시된 바와 같이 수행되었다. 검정에 따르면, 야생형 gp130 또는 LIFR(묘사됨)이 효모의 표면에 표시된다. 인간 LIF-His는 포화 농도로 도입된다. 억제제(묘사된 LIFR-VPRVVAID-Fc)는 그 다음 LIF 결합 효모와 코인큐베이션된다. LIF 결합은 LIF의 His6-태그를 통해 검출된다. 억제제 인큐베이션 후 결합된 LIF가 적을수록, 억제제가 WT 수용체에서 멀리 떨어진 LIF와 경쟁할 수 있다.
경쟁 결합 검정의 결과는 도 14, 패널 B에 도시된다. 야생형 LIFR 또는 gp130 중 하나가 효모에 표시되고 인간 LIF-His로 포화되었다. 결합된 분획은 LIF-His에서 검출된 형광 방출이며, 억제제가 첨가되지 않도록 정규화된다. LIFR-WT-Fc, gp130-ELDME-Fc(Eng.), LIFR-VPRVVAID-Fc(Eng.), LIFR-gp130 융합-Fc(Eng.), LIFR-gp130 이종이량체성 Fc(Eng.)의 경쟁 결합, 항-LIF mAb L1 및 항-LIF mAb G1이 도시된다.
이러한 결과로부터 야생형 LIFR-Fc가 야생형 LIFR 및 예기치 않게 gp130 둘 다로부터 떨어져 LIF와 경쟁하는 것이 결정된다. 조작된 LIFR-Fc는 이와 관련하여 야생형 LIFR-Fc보다 개선되어 LIFR 및 gp130 둘 다에서 LIF와 강력하게 경쟁할 수 있다. 조작된 gp130-Fc는 gp130에서 잘 떨어져 LIF와 경쟁하지만, 예상대로 LIF를 결합시키는 LIFR의 능력에는 영향을 미치지 않는다. 동종- 및 이종이량체 둘 다로서, LIFR과 gp130의 융합은, 동일한 억제제에 존재하는 두 조작된 수용체를 가짐으로써 예상되는 바와 같이, LIFR 및 gp130 둘 다로부터 LIF와 경쟁하는 강력한 능력을 증명한다. 항-LIF 단클론성 항체인, L1 및 G1은 하나의 수용체 각각인, LIFR 및 gp130, 각각과 떨어져 효과적으로 LIF와 경쟁하지만, 실제로는 반대 수용체인, gp130 및 LIFR, 각각에 대한 LIF 결합을 향상시킨다.
실시예 9-HeLa 루시퍼라제 리포터 세포에서 다운스트림 LIF 신호전달의 차단
LIF는 LIFR 및 gp130에 결합하여, LIFR 및 gp130의 이종이량체화를 유발한다. 이량체화는 STAT3을 인산화하는 JAK의 동원을 초래한다. 이는 STAT3 응답 요소를 통한 STAT3 이량체화, 핵 진입 및 전사 프로그래밍의 활성화를 초래한다. pSTAT3의 활성화가 루시퍼라제를 생성하도록 STAT3 반응 요소가 선행하는 루시퍼라제에 대한 유전자를 포함하도록 세포주를 변경할 수 있다. 이 상황에서, 루시페린과 함께 표준 루시퍼라제 검정을 사용하여 결정된 경우, 루시퍼라제 활성은 세포에서 LIF 신호전달과 직접적으로 연관될 수 있다. 도 15, 패널 A는 HeLa 세포에서 이 LIF 리포터 세포 시스템을 개략적으로 예시한다.
HeLa 리포터 세포가 0.5 nM LIF 그리고 LIFR-VPRVVAID-Fc, LIFR-VPRVVAID - gp130-ELDME Fc 및 LIFR-WT-Fc의 상이한 농도에 노출된 경우, 루시퍼라제 검정의 결과는 도 15, 패널 B에 도시된다. 세포를 5 시간 동안 인큐베이션한 다음 용해시키고 루시퍼라제 검정을 수행하였다. 결과는 억제제가 첨가되지 않도록 정규화된다. 도 15, 패널 C는 지연된 억제제 첨가 검정의 결과를 도시한다. 검정에 따르면, 0.5nM LIF를 1.5 시간 동안 HeLa 리포터 세포에 첨가한 다음, LIFR-VPRVVAID-Fc, LIFR-WT-Fc 또는 LIFR-VPRVVAID - gp130-ELDME Fc 중 5nM, 25nM 또는 50nM은 웰에 직접 첨가된다. 루시퍼라제 수준은 LIF 첨가 20 시간 후에 측정된다. 결과는 기준선이 차감되고 억제제가 첨가되지 않도록 정규화된다. 도 15, 패널 D는 LIFR-WT-FC-대 LIFR VPRVVAID-FC에 대한 IC50을 결정하는 억제제 농도의 넓은 범위에 걸쳐 LIF 유도 루시퍼라제 억제를 묘사한다. 개선된 억제의 53배 이동이 조작 후에 관찰된다. 도 15, 패널 E는, LIF의 가까운 친척인 온코스타틴-M(OSM)을 포함하여, 다중 IL-6 패밀리 구성원 사이토카인에 반응하는 HeLa 리포터 세포의 능력을 활용한다. 세포를 0.5 nM LIF 또는 OSM 및 1 μM의 LIFR-VPRVVAID-Fc 또는 LIFR-WT-Fc와 함께 5 시간 동안 인큐베이션하고 루시퍼라제 수준을 측정했다.
종합적으로, 이러한 결과는 LIFR-VPRVVAID-Fc 및 LIFR-VPRVVAID -gp130-ELDME Fc가 저농도에서도 LIF 매개 다운스트림 신호전달을 강력하게 감소시킬 수 있으며 치료에 대한 유망한 신호인 LIF가 배지에서 이미 존재한 후 첨가될 때 LIF 신호전달을 상당히 차단할 수 있음을 나타낸다. 두 조작된 억제제는 LIFR-WT-Fc에 비해 LIFR-VPRVVAID-Fc에 의한 IC50의 53배 개선점까지 LIFR-WT-Fc와 비교된 때 매우 우수한 억제를 나타낸다. WT와 조작된 LIFR-Fc는 LIF 둘 다에 대해 높은 수준의 특이성을 나타내어, 높은 수용체 농도에서도 OSM이 LIFR에 결합할 수 있다는 사실에도 불구하고 OSM 유래 루시퍼라제 신호의 감소를 나타내지 않는다. 조작된 억제제가 더 높은 친화력으로 인해 WT보다 LIF에 대해 훨씬 더 선택적이라는 사실은 치료제로서 조작된 트랩과 관련된 부정확한 독성이 없을 가능성이 있음을 나타낼 것이다.
실시예 10-췌장암 세포에서 LIF 신호전달의 제거
LIF는 LIFR 및 gp130에 결합하여 LIFR 및 gp130의 이종이량체화를 유발한다. 이량체화는 JAK의 동원을 초래하여, 타이로신 705에서 STAT3을 인산화한다. 이것은 STAT3 이량체화, 핵 진입 및 전사 프로그래밍의 활성화를 초래한다. 따라서 pSTAT3-Y705는 LIF 신호전달의 판독이다. 도 16, 패널 A는 LIF 선호전달을 개략적으로 예시한다.
135pM 인간 LIF 그리고 상이한 농도의 LIFR-VPRVVAID-Fc("LIFR Fc Eng"), LIFR-WT-Fc("LIFR Fc WT"), LIFR-VPRVVAID - gp130-ELDME Fc("융합 Fc Eng") 및 L1 항-LIF mAb("항-LIF mAb")에 노출된 PANC1(인간 췌장암 세포주)로부터 용해물의 웨스턴 블랏 결과는 도 16, 패널 B에 도시된다. 세포는 프로테아제 및 포스파타아제 억제제의 존재 하에 용해되기 전 37℃에서 20 분 동안 인큐베이션되었다. 단백질 농도를 정규화하고 SDS-PAGE를 통해 겔에서 실행했다. 포스포-STAT3(Y705), STAT3(전체) 및 β-튜불린에 대한 염색은 웨스턴 블랏에서 수행되었다. 도 16, 패널 C는 튜불린 신호로 정규화된 pSTAT3 신호의 정량화를 도시한다.
이 결과는 LIFR-VPRVVAID-Fc 및 LIFR-VPRVVAID - gp130-ELDME Fc가, 단지 ~3배 과량에서 인큐베이션된 경우조차, 암세포에서 LIF 매개 pSTAT3 수준을 감소시킬 수 있음, 그리고 치료적으로 관련될 경우, 더 큰 과량에서 인큐베이션된 때 LIF 신호전달을 완전히 제거할 수 있음을 나타낸다. 억제 정도는 정량화(패널 C)에 도시된 대로 항-LIF mAb, L1보다 개선된다. LIFR-WT-Fc는 LIF 유래 신호전달을 차단하는데 훨씬 덜 효과적이어서, 조작 친화력을 통해 발생하는 이점을 증명한다. KP4 인간 췌장암 세포에서도 강력한 신호 억제가 관찰되었지만, 도시되지 않았다.
따라서, 상술한 내용은 단지 본 개시내용의 원리를 예시하는 것이다. 당업자는, 본원에 명시적으로 기재 또는 제시되지는 않았지만, 본 발명의 원리를 구현하고, 이의 의미 및 범위에 포함되는 다양한 배열을 고안할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 나아가, 본원에 인용된 모든 실시예 및 조건부 언어는, 주로 독자가 본 발명의 원리, 및 본 발명자가 해당 분야를 발전시키는 데 기여한 개념을 이해하는 것을 돕기 위한 것이며, 특히 인용된 실시예 및 조건에 한정되지 않는 것으로서 해석되어야 한다. 나아가, 본 발명의 원리, 양태 및 구현예 뿐만 아니라, 이의 특정예를 인용한 본원의 모든 설명은, 이의 구조적 및 기능적 등가물 양쪽 모두를 포함하기 위한 것이다. 또한, 이러한 등가물은, 현재 공지된 등가물 및 미래에 개발될 등가물, 즉 구조에 관계없이 동일한 기능을 수행하는 임의의 개발된 요소를 모두 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명의 범위는 본원에 제시 및 기재된 예시적인 구현예에 한정되는 것이 아니라고 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Hunter, Sean A Cochran, Jennifer <120> SOLUBLE POLYPEPTIDES AND METHODS OF USING SAME FOR INHIBITING LEUKEMIA INHIBITORY FACTOR ACTIVITY <130> STAN-1475WO <150> US62/701,399 <151> 2018-07-20 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 789 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Lys Lys Gly Ala Pro His Asp Leu Lys Cys Val Thr Asn Asn Leu 1 5 10 15 Gln Val Trp Asn Cys Ser Trp Lys Ala Pro Ser Gly Thr Gly Arg Gly 20 25 30 Thr Asp Tyr Glu Val Cys Ile Glu Asn Arg Ser Arg Ser Cys Tyr Gln 35 40 45 Leu Glu Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ala Leu Ser His Gly Asp Tyr 50 55 60 Glu Ile Thr Ile Asn Ser Leu His Asp Phe Gly Ser Ser Thr Ser Lys 65 70 75 80 Phe Thr Leu Asn Glu Gln Asn Val Ser Leu Ile Pro Asp Thr Pro Glu 85 90 95 Ile Leu Asn Leu Ser Ala Asp Phe Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Leu Lys 100 105 110 Trp Asn Asp Arg Gly Ser Val Phe Pro His Arg Ser Asn Val Ile Trp 115 120 125 Glu Ile Lys Val Leu Arg Lys Glu Ser 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Gly Lys Tyr Val 325 330 335 Arg Leu Lys Arg Ala Glu Ala Pro Thr Asn Glu Ser Tyr Gln Leu Leu 340 345 350 Phe Gln Met Leu Pro Asn Gln Glu Ile Tyr Asn Phe Thr Leu Asn Ala 355 360 365 His Asn Pro Leu Gly Arg Ser Gln Ser Thr Ile Leu Val Asn Ile Thr 370 375 380 Glu Lys Val Tyr Pro His Thr Pro Thr Ser Phe Lys Val Lys Asp Ile 385 390 395 400 Asn Ser Thr Ala Val Lys Leu Ser Trp His Leu Pro Gly Asn Phe Ala 405 410 415 Lys Ile Asn Phe Leu Cys Glu Ile Glu Ile Lys Lys Ser Asn Ser Val 420 425 430 Gln Glu Gln Arg Asn Val Thr Ile Lys Gly Val Glu Asn Ser Ser Tyr 435 440 445 Leu Val Ala Leu Asp Lys Leu Asn Pro Tyr Thr Leu Tyr Thr Phe Arg 450 455 460 Ile Arg Cys Ser Thr Glu Thr Phe Trp Lys Trp Ser Lys Trp Ser Asn 465 470 475 480 Lys Lys Gln His Leu Thr Thr Glu Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 485 490 495 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 500 505 510 Gly Gly Ser Leu Pro Pro Glu Lys Pro Lys Asn Leu Ser Cys Ile Val 515 520 525 Asn Glu Gly Lys Lys Met Arg Cys Glu Trp Asp Arg Gly Arg Glu Thr 530 535 540 His Leu Glu Thr Asn Phe Thr Leu Lys Ser Glu Trp Ala Thr His Glu 545 550 555 560 Leu Ala Asp Cys Lys Ala Lys Arg Asp Thr Pro Thr Ser Cys Thr Val 565 570 575 Asp Tyr Ser Thr Val Tyr Phe Val Asn Ile Glu Val Trp Val Glu Ala 580 585 590 Glu Asn Ala Leu Gly Lys Val Thr Ser Asp His Ile Asn Phe Asp Pro 595 600 605 Val Asp Lys Val Lys Pro Asn Pro Pro His Asn Leu Ser Val Ile Asn 610 615 620 Ser Glu Glu Leu Ser Ser Ile Leu Lys Leu Thr Trp Thr Asn Pro Ser 625 630 635 640 Ile Lys Ser Val Met Ile Leu Lys Tyr Asn Ile Gln Tyr Arg Thr Lys 645 650 655 Asp Ala Ser Thr Trp Ser Gln Ile Pro Pro Glu Asp Thr Ala Ser Thr 660 665 670 Arg Ser Ser Phe Thr Val Gln Asp Leu Lys Pro Phe Thr Glu Tyr Val 675 680 685 Phe Arg Ile Arg Cys Met Lys Glu Asp Gly Glu Gly Tyr Trp Ser Asp 690 695 700 Trp Ser Glu Glu Ala Ser Gly Ile Thr Tyr Glu Asp Gly Ser Gly Ser 705 710 715 720 Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 725 730 735 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 740 745 750 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 755 760 765 Ser His Glu Asp Pro Gln Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 770 775 780 Gln Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gln Gln Tyr Asn Ser 785 790 795 800 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asn Trp Leu 805 810 815 Asp Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 820 825 830 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 835 840 845 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 850 855 860 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 865 870 875 880 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 885 890 895 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 900 905 910 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 915 920 925 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 930 935 940 Leu Ser Pro Gly Lys 945 <210> 9 <211> 723 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 9 Gln Lys Lys Gly Ala Pro His Asp Leu Lys Cys Val Thr Asn Asn Leu 1 5 10 15 Gln Val Trp Asn Cys Ser Trp Lys Ala Pro Ser Gly Thr Gly Arg Gly 20 25 30 Thr Asp Tyr Glu Val Cys Ile Glu Asn Arg Ser Arg Ser Cys Tyr Gln 35 40 45 Leu Glu Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ala Leu Ser His Gly Asp Tyr 50 55 60 Glu Ile Thr Ile Asn Ser Leu His Asp Phe Gly Ser Ser Thr Ser Lys 65 70 75 80 Phe Thr Leu Asn Glu Gln Asn Val Ser Leu Ile Pro Asp Thr Pro Glu 85 90 95 Ile Leu Asn Leu Ser Ala Asp Phe Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Leu Lys 100 105 110 Trp Asn Asp Arg Gly Ser Val Phe Pro His Arg Ser Asn Val Ile Trp 115 120 125 Glu Ile Lys Val Leu Arg Lys Glu Ser Met Glu Leu Val Lys Leu Val 130 135 140 Thr His Asn Thr Thr Leu Asn Gly Lys Asp Thr Leu His His Trp Ser 145 150 155 160 Trp Ala Ser Asp Met Pro Leu Glu Cys Ala Ile His Phe Val Glu Ile 165 170 175 Arg Cys Tyr Ile Asp Asn Leu His Phe Ser Gly Leu Glu Glu Trp Ser 180 185 190 Asp Trp Ser Pro Val Lys Asn Ile Ser Trp Ile Pro Asp Ser Gln Thr 195 200 205 Lys Val Phe Pro Gln Asp Lys Val Val Pro Val Gly Ser Asp Ile Thr 210 215 220 Phe Cys Cys Val Ser Gln Glu Lys Val Leu Ser Ala Leu Ile Gly Arg 225 230 235 240 Thr Asp Cys Pro Leu Ile His Leu Asp Gly Glu Asn Val Ala Ile Lys 245 250 255 Val Arg Asn Val Ser Ala Ser Ala Ser Ser Gly Thr Asn Val Val Phe 260 265 270 Ile Thr Glu Asp Asp Ile Phe Gly Thr Val Ile Phe Ala Gly Tyr Pro 275 280 285 Pro Asp Thr Pro Gln Gln Leu Asn Cys Glu Thr His Asp Leu Lys Glu 290 295 300 Ile Ile Cys Ser Trp Asn Pro Gly Arg Val Thr Ala Leu Val Gly Pro 305 310 315 320 Arg Ala Thr Ser Tyr Thr Leu Val Glu Ser Phe Ser Gly Lys Tyr Val 325 330 335 Arg Leu Lys Arg Ala Glu Ala Pro Thr Asn Glu Ser Tyr Gln Leu Leu 340 345 350 Phe Gln Met Leu Pro Asn Gln Glu Ile Tyr Asn Phe Thr Leu Asn Ala 355 360 365 His Asn Pro Leu Gly Arg Ser Gln Ser Thr Ile Leu Val Asn Ile Thr 370 375 380 Glu Lys Val Tyr Pro His Thr Pro Thr Ser Phe Lys Val Lys Asp Ile 385 390 395 400 Asn Ser Thr Ala Val Lys Leu Ser Trp His Leu Pro Gly Asn Phe Ala 405 410 415 Lys Ile Asn Phe Leu Cys Glu Ile Glu Ile Lys Lys Ser Asn Ser Val 420 425 430 Gln Glu Gln Arg Asn Val Thr Ile Lys Gly Val Glu Asn Ser Ser Tyr 435 440 445 Leu Val Ala Leu Asp Lys Leu Asn Pro Tyr Thr Leu Tyr Thr Phe Arg 450 455 460 Ile Arg Cys Ser Thr Glu Thr Phe Trp Lys Trp Ser Lys Trp Ser Asn 465 470 475 480 Lys Lys Gln His Leu Thr Thr Glu Ala Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 485 490 495 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 500 505 510 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 515 520 525 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 530 535 540 Glu Asp Pro Gln Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Gln Val 545 550 555 560 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gln Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 565 570 575 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asn Trp Leu Asp Gly 580 585 590 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 595 600 605 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 610 615 620 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 625 630 635 640 Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 645 650 655 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 660 665 670 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 675 680 685 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 690 695 700 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 705 710 715 720 Pro Gly Lys <210> 10 <211> 434 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 10 Leu Pro Pro Glu Lys Pro Lys Asn Leu Ser Cys Ile Val Asn Glu Gly 1 5 10 15 Lys Lys Met Arg Cys Glu Trp Asp Arg Gly Arg Glu Thr His Leu Glu 20 25 30 Thr Asn Phe Thr Leu Lys Ser Glu Trp Ala Thr His Glu Leu Ala Asp 35 40 45 Cys Lys Ala Lys Arg Asp Thr Pro Thr Ser Cys Thr Val Asp Tyr Ser 50 55 60 Thr Val Tyr Phe Val Asn Ile Glu Val Trp Val Glu Ala Glu Asn Ala 65 70 75 80 Leu Gly Lys Val Thr Ser Asp His Ile Asn Phe Asp Pro Val Asp Lys 85 90 95 Val Lys Pro Asn Pro Pro His Asn Leu Ser Val Ile Asn Ser Glu Glu 100 105 110 Leu Ser Ser Ile Leu Lys Leu Thr Trp Thr Asn Pro Ser Ile Lys Ser 115 120 125 Val Met Ile Leu Lys Tyr Asn Ile Gln Tyr Arg Thr Lys Asp Ala Ser 130 135 140 Thr Trp Ser Gln Ile Pro Pro Glu Asp Thr Ala Ser Thr Arg Ser Ser 145 150 155 160 Phe Thr Val Gln Asp Leu Lys Pro Phe Thr Glu Tyr Val Phe Arg Ile 165 170 175 Arg Cys Met Lys Glu Asp Gly Glu Gly Tyr Trp Ser Asp Trp Ser Glu 180 185 190 Glu Ala Ser Gly Ile Thr Tyr Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp 195 200 205 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 210 215 220 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 225 230 235 240 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 245 250 255 Asp Pro Gln Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Gln Val His 260 265 270 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gln Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 275 280 285 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asn Trp Leu Asp Gly Lys 290 295 300 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 305 310 315 320 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 325 330 335 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 340 345 350 Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 355 360 365 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 370 375 380 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp 385 390 395 400 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 405 410 415 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 420 425 430 Gly Lys

Claims (67)

  1. 서열번호: 2와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가용성 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR) 폴리펩타이드로서, 상기 LIFR 폴리펩타이드는 상응하는 야생형 LIFR 폴리펩타이드에 비해 백혈병 억제 인자(LIF)에 대해 증가된 결합 친화력을 나타내는 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    위치 L218에서의 아미노산 치환, 및
    위치 N277에서의 아미노산 치환,
    중 하나 또는 둘 다를 포함하되, 상기 위치의 확인은 서열번호:2에 대한 것인, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
  3. 제2항에 있어서, 하기 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드:
    L218P 아미노산 치환, 및
    N277D 아미노산 치환.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    위치 I257에서의 아미노산 치환,
    위치 V262에서의 아미노산 치환, 및
    위치 T273에서의 아미노산 치환,
    중 1개, 2개 또는 각각을 포함하되, 상기 위치의 확인은 서열번호:2에 대한 것인, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
  5. 제4항에 있어서, 하기 중 1개, 2개 또는 각각을 포함하는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드:
    I257V 아미노산 치환,
    V262A 아미노산 치환, 및
    T273I 아미노산 치환.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    위치 I217에서의 아미노산 치환,
    위치 H240에서의 아미노산 치환, 및
    위치 I260에서의 아미노산 치환,
    중 1개, 2개 또는 각각을 포함하되, 상기 위치의 확인은 서열번호:2에 대한 것인, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
  7. 제6항에 있어서, 하기 중 1개, 2개 또는 각각을 포함하는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드:
    I217V 아미노산 치환,
    H240R 아미노산 치환, 및
    I260V 아미노산 치환.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 N242에서의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 위치의 확인은 서열번호:2에 대한 것인, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
  9. 제8항에 있어서, N242D 아미노산 치환을 포함하는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호:2와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호:2와 적어도 90% 동일하거나 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 LIFR 폴리펩타이드는 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드에 융합되는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드는 하기로 이루어진 군으로부터 이종성 폴리펩타이드를 포함하는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드: Fc 도메인, 알부민, 트랜스페린, XTEN, 호모-아미노산 중합체, 프롤린-알라닌-세린 중합체, 엘라스틴-유사 펩타이드, 및 이들의 임의의 조합.
  14. 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드는 Fc 도메인을 포함하는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드는 제27항 내지 제38항 중 어느 한 항의 가용성 gp130 폴리펩타이드를 포함하는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
  16. 제15항에 있어서, 상기 가용성 LIFR 폴리펩타이드 및 가용성 gp130 폴리펩타이드는 링커를 통해 융합되는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
  17. 제16항에 있어서, 상기 링커는 GlySer 링커를 포함하는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
  18. 제17항에 있어서, 상기 GlySer 링커는(Gly4Ser)n 링커를 포함하는, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 가용성 LIFR 폴리펩타이드로 이량체화된, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
  20. 제19항에 있어서, 각각의 가용성 LIFR 폴리펩타이드는 Fc 도메인을 포함하고, 그리고 이량체화는 Fc 도메인을 통한 것인, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 가용성 LIFR 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산.
  22. 제21항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  23. 하기를 포함하는 세포:
    제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 가용성 LIFR 폴리펩타이드,
    제21항의 핵산,
    제22항의 발현 벡터, 또는
    이들의 임의의 조합.
  24. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 가용성 LIFR 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서,
    상기 세포가 LIFR 폴리펩타이드를 생산하는 조건 하에 제22항의 발현 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 세포 배양 전, 상기 발현 벡터를 상기 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 세포 배양 후, 세포로부터 상기 LIFR 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  27. 서열번호:4와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가용성 당단백질 130(gp130) 폴리펩타이드로서, gp130 폴리펩타이드는 상응하는 야생형 gp130 폴리펩타이드에 비해 백혈병 억제 인자(LIF)에 대해 증가된 결합 친화력을 나타내는, 가용성 당단백질 130(gp130) 폴리펩타이드.
  28. 제27항에 있어서, 위치 K45에서의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 위치의 확인은 서열번호:4에 대한 것인, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
  29. 제28항에 있어서, K45E 아미노산 치환을 포함하는, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    위치 Y95에서의 아미노산 치환, 및
    위치 K184에서의 아미노산 치환,
    중 하나 또는 둘 다를 포함하되, 상기 위치의 확인은 서열번호:4에 대한 것인, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
  31. 제30항에 있어서, 하기 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 가용성 gp130 폴리펩타이드:
    Y95D 아미노산 치환, 및
    K184E 아미노산 치환.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    위치 F46에서의 아미노산 치환, 및
    위치 I130에서의 아미노산 치환,
    중 하나 또는 둘 다를 포함하되, 상기 위치의 확인은 서열번호:4에 대한 것인, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
  33. 제32항에 있어서, 하기 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 가용성 gp130 폴리펩타이드:
    F46L 아미노산 치환, 및
    I130M 아미노산 치환.
  34. 제27항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호:4와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
  35. 제27항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호:4와 적어도 90% 동일하거나 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
  36. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 gp130 폴리펩타이드는 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드에 융합되는, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
  37. 제36항에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드는 하기로 이루어진 군으로부터 이종성 폴리펩타이드를 포함하는, 가용성 gp130 폴리펩타이드: Fc 도메인, 알부민, 트랜스페린, XTEN, 호모-아미노산 중합체, 프롤린-알라닌-세린 중합체, 엘라스틴-유사 펩타이드, 및 이들의 임의의 조합.
  38. 제37항에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드는 Fc 도메인을 포함하는, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드는 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 가용성 LIFR 폴리펩타이드를 포함하는, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
  40. 제39항에 있어서, 상기 가용성 gp130 폴리펩타이드 및 가용성 LIFR 폴리펩타이드는 링커를 통해 융합되는, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
  41. 제40항에 있어서, 상기 링커는 GlySer 링커를 포함하는, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
  42. 제41항에 있어서, 상기 GlySer 링커는(Gly4Ser)n 링커를 포함하는, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
  43. 제27항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 제27항 내지 제42항 중 어느 한 항의 가용성 gp130 폴리펩타이드로 이량체화된, 가용성 gp130 폴리펩타이드.
  44. 제43항에 있어서, 각각의 가용성 gp130 폴리펩타이드는 Fc 도메인을 포함하고, 그리고 이량체화는 Fc 도메인을 통한 것인, 가용성 LIFR 폴리펩타이드.
  45. 제27항 내지 제42항 중 어느 한 항의 가용성 gp130 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산.
  46. 제45항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  47. 하기를 포함하는 세포:
    제27항 내지 제42항 중 어느 한 항의 가용성 gp130 폴리펩타이드,
    제45항의 핵산,
    제46항의 발현 벡터, 또는
    이들의 임의의 조합.
  48. 제27항 내지 제42항 중 어느 한 항의 가용성 gp130 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서,
    상기 세포가 가용성 gp130 폴리펩타이드를 생산하는 조건 하에 제46항의 발현 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 세포 배양 전, 상기 발현 벡터를 상기 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 상기 세포 배양 후, 상기 세포로부터 상기 가용성 gp130 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  51. 이종이량체성 단백질로서,
    제27항 내지 제38항 중 어느 한 항의 가용성 gp130 폴리펩타이드로 이량체화된 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 가용성 LIFR 폴리펩타이드를 포함하는 이종이량체성 단백질.
  52. 제51항에 있어서, 상기 가용성 LIFR 폴리펩타이드 및 가용성 gp130 폴리펩타이드 각각은 상기 가용성 LIFR 폴리펩타이드 및 가용성 gp130 폴리펩타이드가 이량체화되는 이량체화 도메인을 포함하는, 이종이량체성 단백질.
  53. 제52항에 있어서, 상기 이량체화 도메인은 Fc 도메인을 포함하는, 이종이량체성 단백질.
  54. 하기를 포함하는 약제학적 조성물:
    백혈병 억제 인자(LIF)에 결합하고 서열번호:2와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가용성 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR) 폴리펩타이드; 및
    약제학적으로 허용되는 담체.
  55. 하기를 포함하는 약제학적 조성물:
    백혈병 억제 인자(LIF)에 결합하고 서열번호:4와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가용성 당단백질 130(gp130) 폴리펩타이드; 및
    약제학적으로 허용되는 담체.
  56. 하기를 포함하는 약제학적 조성물:
    백혈병 억제 인자(LIF)에 결합하고 서열번호:2와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가용성 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR) 폴리펩타이드로서, 백혈병 억제 인자(LIF)에 결합하고 서열번호:4와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가용성 당단백질 130(gp130) 폴리펩타이드로 이량체화된 가용성 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR) 폴리펩타이드; 및
    약제학적으로 허용되는 담체.
  57. 하기를 포함하는 약제학적 조성물:
    제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 가용성 LIFR 폴리펩타이드; 및
    약제학적으로 허용되는 담체.
  58. 하기를 포함하는 약제학적 조성물:
    제27항 내지 제42항 중 어느 한 항의 가용성 gp130 폴리펩타이드; 및
    약제학적으로 허용되는 담체.
  59. 하기를 포함하는 약제학적 조성물:
    제51항 내지 제53항 중 어느 한 항의 이종이량체성 단백질; 및
    약제학적으로 허용되는 담체.
  60. 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 치료 유효량을 치료가 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 치료가 필요한 개체는 암에 걸린 개체인, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 암은 췌장암인, 방법.
  63. 하기를 포함하는 키트:
    제54항 내지 제59항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물; 및
    약제학적 조성물을 필요로 하는 개체에게 투여하기 위한 설명서.
  64. 제63항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 하나 이상의 단위 투여량으로 존재하는, 키트.
  65. 제63항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 2개 이상의 단위 투여량으로 존재하는, 키트.
  66. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 필요한 개체는 암에 걸린 개체인, 키트.
  67. 제66항에 있어서, 상기 암은 췌장암인, 키트.
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