CN111484558A

CN111484558A - 信号调节蛋白α片段-抗FcRn单链抗体融合蛋白及其制备与应用

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Publication number: CN111484558A
Application number: CN201910082014.5A
Authority: CN
Inventors: 徐宇虹; 吴凤岚; 邱阳生
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2019-01-28
Filing date: 2019-01-28
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2039-01-28
Also published as: CN111484558B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种信号调节蛋白α片段‑抗FcRn单链抗体融合蛋白及其制备与应用。本发明所述融合蛋白为含有信号调节蛋白α片段和抗FcRn单链抗体的融合蛋白，所述信号调节蛋白α片段通过连接肽与所述抗FcRn单链抗体连接。本发明所述的融合蛋白很好的保留了与hFcRn结合特异性和pH依赖性，半衰期长，可以作为融合蛋白载体用于长效大分子药物开发研究，在长效多肽和蛋白药物的开发上具有广阔的应用前景和巨大的经济、社会价值，同时SIRPα‑F8与靶向肿瘤细胞的单克隆抗体联用可以治疗肿瘤。

Description

信号调节蛋白α片段-抗FcRn单链抗体融合蛋白及其制备与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种信号调节蛋白α片段-抗FcRn单链抗体融合蛋白及其制备与应用。

背景技术

信号调节蛋白α(SIRPα)是广泛表达在巨噬细胞和树突状细胞等髓系细胞表面的跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族分子。SIRPα胞外区包含了一个IgV和两个IgC免疫球蛋白样的结构域，其中这个具有多样性的IgV样结构域可以和其配体CD47有效结合。CD47广泛表达与组织细胞中，CD47通过和巨噬细胞表面的SIRPα结合，可以产生“别吃我”信号，组织巨噬细胞的吞噬作用。现有一些抗CD47抗体或SIRP-Ig融合蛋白，蛋白结构内都含有Fc片段。该Fc片段的作用主要有两点：一是可以延长蛋白分子的半衰期；二是可以募集巨噬细胞等来吞噬高表达CD47的肿瘤细胞。由于红细胞表面有大量CD47表达，因此，以上抗体或蛋白在抗肿瘤的同时会引起溶血等副作用。因此急需一种不含Fc结构的抗CD47蛋白药物来减少溶血等毒副作用，但是仍能保持蛋白分子的较长半衰期。

FcRn是在血管内皮细胞和髓系细胞中高表达的一类Fc受体，它与维持血液中高浓度的IgG和白蛋白水平密切相关。脉管系统通过内吞作用清除血液中废物和异物的同时，也通过FcRn以pH依赖的结合方式维持IgG和白蛋白在血液中的高浓度。FcRn功能主要是介导IgG跨细胞屏障的转运和保护IgG和血清球蛋白(Serum albumin,SA)避免在胞内的降解从而延长它们在生物体内的半衰期。其跨细胞转运和对IgG及SA的保护机制主要在于FcRn与IgG抗体和SA结合的pH依赖性，即在酸性pH条件下FcRn与IgG的Fc片段和SA结合，而在生理pH的条件下，两者因结合力微弱而发生解离。这一机制在过去的数十年中被深入研究并逐渐运用到临床以延长大分子药物在体内的存留时间和跨越细胞屏障给药。如Fc融合蛋白，SA融合蛋白以及SA结合蛋白或多肽均被广泛用于多肽和蛋白药物的半衰期延长研究，有多个Fc融合蛋白和SA结合蛋白药物已被批准上市。但除了少部分治疗性抗体药物对Fc进行基因工程改造使得半衰期延长到与天然抗体相当(～21天)的时间，大部分抗体药物及其他融合蛋白药物的半衰期仍然只有几天甚至几个小时，这主要是这些药物与FcRn的亲和力比较低或者与其结合的pH依赖性较弱造成的。因此迫切需要研发一种对FcRn有高亲和力、高pH依赖性、且易于表达的融合蛋白。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，提供一种信号调节蛋白α片段-抗FcRn单链抗体融合蛋白及其制备与应用。本发明的融合蛋白与现有的同类产品比较，对FcRn有高亲和力、高pH依赖性、且易于表达。

本发明的第一方面，提供一种融合蛋白，为含有信号调节蛋白α片段和抗FcRn单链抗体的融合蛋白，所述信号调节蛋白α片段通过连接肽与所述抗FcRn单链抗体连接。

所述融合蛋白中，所述信号调节蛋白α片段是指信号调节蛋白α的胞外IgV样结构域，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。具体为：

EEELQVIQPD KSVSVAAGES AILHCTVTSL IPVGPIQWFR GAGPARELIY NQKEGHFPRVTTVSESTKRE NMDFSISISN ITPADAGTYY CVKFRKGSPD TEFKSGAGTE LSVRAKPS

所述融合蛋白中，信号调节蛋白α片段核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：GAAGAAGAGCTGCAGGTCATCCAGCCCGATAAGAGCGTGTCAGTGGCCGCCGGAGAATCAGCCATTCTGCATTGCACCGTGACCAGCCTGATCCCAGTGGGCCCAATCCAGTGGTTTAGGGGTGCAGGACCAGCCAGGGAGCTGATCTACAACCAGAAGGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACAACAGTGTCCGAGAGCACCAAGCGGGAGAACATGGACTTCAGCATCAGCATCAGCAACATCACCCCAGCAGACGCCGGCACCTACTATTGCGTGAAGTTCCGGAAGGGCAGCCCAGATACCGAGTTCAAGAGCGGAGCCGGAACAGAACTGAGCGTGAGAGCCAAGCCCAGC

所述融合蛋白中，抗FcRn单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

QAVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSGSSSNIG SNSVNWYQQL PGTAPKLLIY SNNQRPSGVPDRFSGSKSGT SASLAISGLQ SEDEADYYCA AWDDSLNGRV LFGGGTKLTV LGSRGGGGSG GGGSGGGGSLEMAQVQLVQS GAEVKKPGAS VKVSCKTSGY TFTGYYIHWV RQAPGQGLEW MGHISPHSGG TDYAQKFQGRVTMTRDTSIS TAYMELSRLR SDDTAVYYCA RGVYGMDRWG QGTLVTVSS

所述融合蛋白中，抗FcRn单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

CAGGCAGTGCTGACACAGCCTCCTTCAGCTAGCGGAACACCAGGACAGAGGGTGACCATCTCTTGCAGCGGCTCTAGCAGCAACATCGGCAGCAACAGCGTGAACTGGTACCAGCAGCTGCCAGGAACAGCTCCTAAGCTGCTGATCTACAGCAACAACCAGCGGCCTAGCGGAGTGCCAGATAGATTCAGCGGCAGCAAAAGCGGCACAAGCGCTTCTCTGGCCATTAGCGGACTGCAGAGCGAGGACGAAGCCGACTACTATTGCGCCGCTTGGGACGACTCCCTGAATGGCAGAGTGCTCTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACAGTGCTGGGCAGCAGAGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCTCTGGAGATGGCTCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAAGTGAAGAAGCCAGGCGCCAGCGTGAAAGTGTCTTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCGGCTACTACATCCATTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGACAGGGACTCGAGTGGATGGGACACATCAGCCCTCACAGCGGAGGAACCGATTACGCTCAGAAGTTCCAGGGCAGGGTGACCATGACCAGGGACACCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGACTGAGAAGCGACGACACAGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGGAGTGTACGGCATGGATCGCTGGGGACAGGGAACACTGGTGACAGTGTCCTCT

所述融合蛋白中，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。具体为：

GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：5)。

所述融合蛋白中，所述连接肽的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。具体为：

GGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCT(SEQ ID NO：6)

所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSKLGGGGSGGGGSGGGGSQAVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNSVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGRVLFGGGTKLTVLGSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTGYYIHWVRQAPGQGLEWMGHISPHSGGTDYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGVYGMDRWGQGTLVTVSSTSGQAGQHHHHHHGLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO:7)

所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

GAAGAAGAGCTGCAGGTCATCCAGCCCGATAAGAGCGTGTCAGTGGCCGCCGGAGAATCAGCCATTCTGCATTGCACCGTGACCAGCCTGATCCCAGTGGGCCCAATCCAGTGGTTTAGGGGTGCAGGACCAGCCAGGGAGCTGATCTACAACCAGAAGGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACAACAGTGTCCGAGAGCACCAAGCGGGAGAACATGGACTTCAGCATCAGCATCAGCAACATCACCCCAGCAGACGCCGGCACCTACTATTGCGTGAAGTTCCGGAAGGGCAGCCCAGATACCGAGTTCAAGAGCGGAGCCGGAACAGAACTGAGCGTGAGAGCCAAGCCCAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCTGCAGTGCTGACACAGCCTCCTTCAGCTAGCGGAACACCAGGACAGAGGGTGACCATCTCTTGCAGCGGCTCTAGCAGCAACATCGGCAGCAACAGCGTGAACTGGTACCAGCAGCTGCCAGGAACAGCTCCTAAGCTGCTGATCTACAGCAACAACCAGCGGCCTAGCGGAGTGCCAGATAGATTCAGCGGCAGCAAAAGCGGCACAAGCGCTTCTCTGGCCATTAGCGGACTGCAGAGCGAGGACGAAGCCGACTACTATTGCGCCGCTTGGGACGACTCCCTGAATGGCAGAGTGCTCTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACAGTGCTGGGCAGCAGAGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCTCTGGAGATGGCTCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAAGTGAAGAAGCCAGGCGCCAGCGTGAAAGTGTCTTGCAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCGGCTACTACATCCATTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGACAGGGACTCGAGTGGATGGGACACATCAGCCCTCACAGCGGAGGAACCGATTACGCTCAGAAGTTCCAGGGCAGGGTGACCATGACCAGGGACACCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGACTGAGAAGCGACGACACAGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGGAGTGTACGGCATGGATCGCTGGGGACAGGGAACACTGGTGACAGTGTCCTCT(SEQ ID NO：8)。

本发明第二方面提供了一种多核苷酸，其编码所述融合蛋白。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。

编码所述融合蛋白的多核苷酸序列可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技术制备。所述技术见于本领域的一般描述，包括但不限于重组DNA技术、化学合成等方法；优选采用重叠延伸PCR法。

在本案的较佳实施例中，所述融合蛋白其核苷酸编码序列如SEQ ID NO：8所示。

在一种实施方式中，所述融合蛋白其核苷酸编码序列如SEQ ID NO：9所示。

本发明第三方面提供了一种表达载体，其含有所述多核苷酸。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述载体。这些方法包括重组DNA技术、DNA合成技术等。可将编码所述融合蛋白的DNA有效连接到载体中的多克隆位点上，以指导mRNA合成进而表达蛋白，或者用于同源重组。

较佳的，所述载体为pTT5载体。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其被所述载体所转化。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门菌、李斯特细菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO,COS.293细胞、HEK293-6E细胞或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

其中，特别优选HEK293-6E细胞，其可良好地表达本发明的融合蛋白，可获得结合性良好、稳定性良好的融合蛋白。

本发明第五方面公开了所述融合蛋白的制备方法，包括下列步骤：

1)获得编码融合蛋白的融合基因序列；

2)将获得的融合基因序列插入到合适的表达载体中，得到相应的核酸构建体；

3)将获得的核酸构建体转染适宜的宿主细胞；

4)在适宜的培养条件下，培养步骤3)的转染细胞，并从中分离纯化所表达的融合蛋白。

步骤1)中，所述融合基因序列如SEQID NO：8所示。

优选地，步骤2)中，所述载体为pTT5载体。

优选地，步骤3)中，所述宿主细胞为HEK293-6E细胞。

优选地，步骤4)中，分离纯化的方法具体为：先将细胞培养液离心后使用离子交换层析，包括阴离子交换层析或阳离子交换层析捕获大量的融合蛋白，然后通过八因子亲和层析纯化得到纯度超过90％的融合蛋白后，再利用离子交换层析包括阴离子交换层析或阳离子交换层析精细纯化，最后通过凝胶过滤层析进一步精细纯化得到最终产品。

本发明第六方面，提供了所述的融合蛋白在用于延长大分子药物半衰期或用于制备抗肿瘤药物的用途。

在一种实施方式中，在用于延长大分子药物半衰期的用途中，所述大分子药物可以为GLP-1与本发明所述信号调节蛋白α片段-抗FcRn单链抗体融合蛋白融合制成的融合蛋白。

在一种实施方式中，在用于制备抗肿瘤药物的用途中，所述SIRPα-F8制成的药物与靶向肿瘤细胞的单克隆抗体药物联用来治疗肿瘤。

本发明第七方面，提供一种药物，包括如本发明第一方面所述融合蛋白或包括具有所述融合蛋白结构的大分子，及至少一种药学可接受的载体或赋形剂。

在一种实施方式中，所述大分子可为GLP-1与本发明所述信号调节蛋白α片段-抗FcRn单链抗体融合蛋白融合制成的融合蛋白。

本发明所提供的大分子药物可以多种剂型存在，如用于静脉注射等的注射剂，用于皮下注射、表皮外敷等的经皮吸收剂，用于喷鼻、喉、口腔、表皮、粘膜等的喷雾剂，用于滴鼻、眼、耳等的滴剂，用于肛肠等的栓剂、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式，及肺部给药制剂及其他非肠道给药的组合物。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。该药用组合物还可以加入香味剂、甜味剂等。

如上所述的大分子药物可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以经静脉注射或者口、鼻、皮肤、肺吸入等途径给药。无论采用何种给药方法，个体人的最佳剂量应根据具体的治疗而定。

本发明的有益效果为：

本发明所述的融合蛋白很好的保留了与hFcRn结合特异性和pH依赖性，半衰期长，可以作为融合蛋白载体用于长效大分子药物开发研究，在长效多肽和蛋白药物的开发上具有广阔的应用前景和巨大的经济、社会价值，同时SIRPα-F8与靶向肿瘤细胞的单克隆抗体联用可以治疗肿瘤。

附图说明

图1：本发明的分离纯化后的融合蛋白SDS-PAGE变性电泳鉴定结果，其中1号泳道为还原性的融合蛋白，2号泳道为非还原性的融合蛋白。

图2：SIRPα-F8的凝胶过滤层析图。

图3：流式细胞术检测pH 6.0条件下SIRPα-F8与hFcRn的结合图。

图4：流式细胞术检测pH 7.4条件下SIRPα-F8与hFcRn的结合图。

图5：流式细胞术检测pH 6.0条件下SIRPα-F8与hHLA的结合图。

图6：SIRPα-F8在人源化FcRn小鼠体内的药物动力学曲线。

图7：SIRPα-F8结合于Raji细胞表面(A，小鼠IgG1同型对照；B，SIRPα-F8)。

图8：SIRPα-F8剂量依赖的结合于Raji细胞表面。

图9：SIRPα-F8结合于CHO-HuCD47细胞表面(A，小鼠IgG1同型对照；B，SIRPα-F8)。

图10：SIRPα-F8剂量依赖的结合于CHO-HuCD47细胞表面。

图11：SIRPα-Ig-Biotin剂量依赖的结合于Raji细胞表面。

图12：SIRPα-F8剂量依赖性的与SIRPα-Ig-Biotin竞争结合于Raji细胞表面。

图13：巨噬细胞吞噬CCRF-CEM细胞。A-G,依次为hIgG4,2D3,B6H12,SIRPα-Ig,SIRPα-his,SIRPα-F8和scFv F8。所有蛋白摩尔浓度为66.7nM。红色荧光标记的为巨噬细胞，绿色荧光标记的为CCRF-CEM细胞。

图14：巨噬细胞吞噬CCRF-CEM细胞的统计结果。**p<0.01。

图15：巨噬细胞吞噬Raji细胞的统计结果。*p<0.05，**p<0.01。

图16：SIRPα-F8与anti-CD20联合使用对巨噬细胞吞噬功能的增强。

图17：Raji异种移植小鼠动物模型。

图18：Raji异种移植模型中肿瘤生长曲线。*p<0.05，组合用药组v.s.溶剂组。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

实施例1信号调节蛋白α片段-抗FcRn单链抗体融合蛋白(SIRPα-F8)的融合基因的表达载体的构建

1.1实验材料

1.1.1试剂耗材

HEK293-6E细胞株：中科院上海细胞库

FreeStyle^TM293培养基:Cat#12338018

Gibco opti-MEM培养基:Cat#31985-070

G418:50mg/ml Solution,Invitrogen,Cat#10131-027

293fectin(Invitrogen):Cat#12347

DNA Marker:DL100,DL500,D12000

HotStarTaq Plus Master Mix试剂盒(1000):QIAGEN,Cat#203645

凝胶回收试剂盒：Qiagen，Cat#28606

质粒小抽试剂盒：Qiagen,Cat#12123

去内毒素质粒大抽试剂盒：Qiagen,Cat#12165

Plus2Pre-Stained Standard，Invitrogen，Cat#LC5925

HisTrap FF：GE Healthcare，Cat#11-0004-58

Protein-free blocking buffer:Pierce，Cat#37573

Amine Coupling Kit：GE医疗，BR100050

PBS:GIBCO,Cat#14190

pTT5载体

BCA kit：Pierce,Cat#23227

美洲鲎试剂LAL kit：Wako

1.1.2仪器

细胞培养箱：ThermoFisher,Model3100

紫外分光光度计：ThermoFisher,Nanodrop2000c

高压液相色谱仪：AKTA explorer100,GE Healthcare

蛋白电泳仪：Invitrogen,XCell

Mini-Cell

DNA电泳仪：BioRad

台式低温离心机：BeckmanCoulter,

16台式微量离心机

台式低温离心机：BeckmanCoulter,Avanti J-26S系列高效离心机

超净工作台：苏净仪器有限公司,HS-1300-U双

温控二氧化碳摇床：New Brunswick,S41i

1.2表达载体的构建

设计目的基因片段：选取信号调节蛋白α片段(SIRPα)基因片段(SEQ ID NO.6)，通过连接肽(G₄S)₃基因与抗FcRn单链抗体(F8)基因连接；

在信号调节蛋白α片段(SIRPα)基因片段的C段插入6x His标记蛋白基因，6x His标记蛋白基因用于在纯化时识别融合蛋白。

其中，His蛋白氨基酸序列为：

HHHHHH(SEQ ID NO：10)。

His蛋白核苷酸序列为：

CATCACCACCACCACCAC(SEQ ID NO：11)。

1)表达载体设计：分析SIRPα的基因序列，确定其胞外段IgV结构域基因片段；选取目的基因片段，通过连接肽(G₄S)₃与单链抗体F8、F0或人IgG1的Fc片段分别连接；在蛋白的C段插入6x His标记蛋白。

2)基因合成：将上述设计采用基因合成的方式合成于表达载体pTT5。

3)转化：将合成的表达载体pTT5转化DH5a细菌感受态并在琼脂糖凝胶平板上划线培养过夜；

4)大量抽提质粒用于HEK293-6E细胞转染和蛋白表达。

①将选取的含正确基因序列的菌落培养液于加有氨苄的LB培养基中扩增，37℃，250rpm，扩增至OD600为1.5左右，然后将菌液以1：1000的比例扩增到1升上述LB培养基中，37℃，250rpm，过夜培养12-16小时；

②离心收集细菌沉淀，6000g，4℃,15分钟；

③每500ml菌液收获的沉淀用20ml缓冲液P1重悬；

④加入20ml缓冲液P2，剧烈混匀，倒转4-6次；

⑤加入20ml缓冲液P3，充分混匀，倒转4-6次；

⑥离心弃沉淀，12000g，4℃,30分钟，然后用质粒抽提试剂盒中的过滤柱将上清中的絮状悬浮物弃除；

⑦在上述滤过液中加入6ml的缓冲液ER，充分混匀，冰浴30分钟；

⑧用4ml的QBT缓冲液平衡QIAGEN-tip100并流干；

⑨将步骤8的上清加入平衡好的QIAGEN-tip100中，让其依靠重力流过质粒吸附凝胶，流干后加入2 10ml缓冲液QC洗涤柱子并流干；

⑩用7ml缓冲液QN洗脱质粒

√加入4.9ml(0.7体积)室温储存的异丙醇，混匀后立即离心，20000g，4℃,30分钟，小心的去除上清液；

√用2ml室温储存的70％乙醇洗涤DNA沉淀，离心20000g，10分钟，弃上清；

√将沉淀在超净工作台中风干10-20分钟，用去离子水溶解到适当的体积(根据沉淀大小判断)；

实施例2信号调节蛋白α片段-抗FcRn单链抗体融合蛋白(SIRPα-F8)的融合基因的表达与纯化

2.1转化：

将合成的表达载体pTT5转化DH5a细菌感受态并在琼脂糖凝胶平板上划线培养过夜；

2.2大量抽提质粒用于HEK293-6E细胞转染和蛋白表达。

将选取的含正确基因序列的菌落培养液于加有氨苄的LB培养基中扩增，37℃，250rpm，扩增至OD600为1.5左右，然后将菌液以1：1000的比例扩增到1升上述LB培养基中，37℃，250rpm，过夜培养12-16小时；

离心收集细菌沉淀，20000g，4℃,15分钟；

每500ml菌液收获的沉淀用20ml缓冲液P1重悬；

加入20ml缓冲液P2，剧烈混匀，倒转4-6次；

加入20ml缓冲液P3，充分混匀，倒转4-6次；

离心弃沉淀，20000g，4℃,30分钟，然后用质粒抽提试剂盒中的过滤柱将上清中的絮状悬浮物弃除；

在上述滤过液中加入6ml的缓冲液ER，充分混匀，冰浴30分钟；

用4ml的QBT缓冲液平衡QIAGEN-tip100并流干；

将步骤8的上清加入平衡好的QIAGEN-tip100中，让其依靠重力流过质粒吸附凝胶，流干后加入2×10ml缓冲液QC洗涤柱子并流干；

用7ml缓冲液QN洗脱质粒

2.3表达

1)将HEK2936E细胞复苏培养在125ml的摇瓶中，Freestyle 293培养基(含50ug/mlG418),0.3×10E6/ml,37℃保湿平转摇床，8％CO₂，125rpm培养；

2)将细胞连续扩增，并保持活力在98％以上；

3)转染前一天，离心收集细胞，1500rpm,5分钟，用不含G418的Freestyle 293培养基重悬，传为6-7×10E5/ml，过夜培养；

4)转染当天，测定细胞活力和密度，细胞活力应在90％以上，用Freestyle 293培养基调整细胞密度为1×10E6/ml；

5)用Opti-MEMI培养基稀释200ug FcRn alpha链质粒和200ug相应种属的b2M质粒至5ml，混匀；

6)用Opti-MEMI培养基稀释400ul 293Fectin到5ml，混匀后室温孵育5分钟；

7)将稀释的质粒和转染试剂混合，充分混匀，室温孵育20-30分钟以形成质粒和转染试剂的复合物；

8)将10ml质粒和转染试剂复合物加入准备好的200ml步骤4准备好的细胞中；

9)37℃保湿平转摇床，8％CO₂，125rpm培养；

10)转染72小时后，10000rpm离心30分钟，收获细胞上清用于蛋白纯化。

2.4纯化与鉴定

1)将螯合镍柱连接到仪器，以1ml/min流速，用结合缓冲液洗涤纯化柱10个柱体积；

2)将200ml上清以1ml/min流速流过纯化柱；

3)以1ml/min流速，用结合缓冲液洗涤纯化柱5个柱体积或至流穿物中没有可见的蛋白杂质峰；

4)洗脱缓冲液洗脱；

5)收集洗脱峰，SDS-PAGE电泳鉴定，纯化结果如图1所示，然后将纯度相近的组分合并；

6)过脱盐柱，去除洗脱缓冲液，将溶液替换成储存缓冲液DPBS，分装，测定OD280，计算蛋白浓度，冻存于-20℃备用；

7)将纯化的蛋白过凝胶过滤层析柱；

8)测量纯化蛋白的内毒素含量，经美洲鲎试剂测定内毒素含量小于10EU/mg。

2.5结果

纯化的蛋白跑SDS-PAGE电泳(图1)。纯化产物过Superdex 75pg SEC柱，用于测量纯度(图2)。

实施例3融合蛋白的延长半衰期功能鉴定

3.1实验材料与仪器

3.1.1实验材料

HEK293/EGFP-HLA-A2细胞株：采用文献1中的方法制备(文献1：YS Qiu,Singlechain antibody fragments with pH dependent binding to FcRn enabled prolongedcirculation of therapeutic peptide in vivo.Journal of Controlled Release 229(2016)37-47.)

HEK293/EGFP-hFcRn细胞株：采用文献1中的方法制备

潮霉素Hygromycin B:invitrogen,Cat#10687-010

DMEM培养基:GIBCO,Cat#11995065

青霉素-链霉素：GIBCO，Cat#15140122

不含蛋白成分的封闭缓冲液:Pierce，Cat#37573

PBS1:PBS,pH7.4,含0.05％Tween20

PBS2:PBS,pH6.0,含0.05％Tween20

半孔高吸附96孔板：Corining，Cat#3690

链霉亲和素:PROZYME,Cat#SA26

HRP连接的抗His抗体:Genscript,Cat#A00612

3.1.2实验仪器

细胞培养箱：ThermoFisher,Model3100

紫外分光光度计：ThermoFisher,Nanodrop2000c

台式低温离心机：BeckmanCoulter,

16台式微量离心机

台式低温离心机：BeckmanCoulter,Avanti J-26S系列高效离心机

超净工作台：苏净仪器有限公司,HS-1300-U双

温控二氧化碳摇床：New Brunswick,S41i

洗板机：Biotek，ELx50

酶标仪：Biotek，Neo

流式细胞检测仪：BD，FACS Celesta

3.2实验方法

采用如实施例1和实施例2的方法，设计表达SIRPα蛋白与非特异单链抗体的融合蛋白SIRPα-F0、SIRPα与人免疫球蛋白IgG1的Fc片段的融合蛋白SIRPα-Ιg作为对照组进行实验。

SIRPα-F0的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。

SIRPα-Ιg核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。

3.2.1流式细胞术检测

1)将HEK293/EGFP-hFcRn,HEK293/EGFP-HLA-A2细胞培养到汇合度90％左右，用0.25％胰酶缓冲液消化细胞成单细胞悬液，用含血清的培养基终止消化后，收集细胞至离心管，1000rpm,离心5分钟，弃上清；

2)用2％FBS/DPBS重悬细胞，离心，洗涤细胞3遍，最后以2％FBS/PBS1(Ph7.4)或2％FBS/PBS2(pH6.0)重悬，计数；

3)将细胞分装到96孔圆底板中，1*10E5细胞/50ul/孔，1000rpm,离心5分钟；

4)将待测融合蛋白用2％FBS/PBS1(Ph7.4)或2％FBS/PBS2(pH6.0)配置到相应2X浓度，50ul/孔加入到96孔板的细胞中，4℃孵育45min；

5)1000rpm,4℃，离心5分钟，弃上清，用冰浴的相应pH值的PBS洗涤细胞三次；

6)加入APC标记的小鼠抗His抗体100ul，重悬细胞，4℃孵育45min；

7)1000rpm,4℃，离心5分钟，弃上清，用冰浴的相应pH值的PBS洗涤细胞三次；

8)最后用200ul相应pH值的PBS重悬细胞，FACS Celesta进行流式分析；

9)用Flowjo软件分析流式结果。

3.2.2融合蛋白的人源化FcRn小鼠体内药代动力学的测试

3.2.2.1生物素化标记融合蛋白

1)按照生物素标记试剂盒说明书，计算需要的活化生物素(Sulfo-NHS-SS-Biotin)的毫摩尔数

2)将待标记的信号调节蛋白α片段-抗FcRn单链抗体融合蛋白与适量的生物素混合，室温孵育半小时

3)用葡聚糖凝胶脱盐柱(Prod#43240，ThermoFisher Scientific)去除多余的未标记上的生物素；

3.2.2.2动物实验方法

1)选取健康，6-8周的人源化FcRn小鼠，在动物房内适应5-7天；

2)按0.5mg/kg体重剂量，将生物素标记的融合蛋白尾静脉注射给药；

3)在给药前(t0),给药后10分钟,1，4，8,24,48,96,168,336,504小时时间点分别采血50ul,血样用含有EDTA的采血管收集；

4)1200g,4℃离心10分钟，分离血浆，冻存于-80℃备用。

3.2.2.3药物血药浓度测定方法

1)包被酶标板：10ug/ml链霉亲和素,25ul/孔，加入半孔平底高吸附96孔板，4℃过夜；

2)酶标板封闭：PBST(0.05％Tween-20),洗板三遍，然后加入不含蛋白成分的封闭缓冲液，封闭未结合的位点，室温孵育1小时，同时进行步骤3，4；

3)标准品制备：将生物素标记的融合蛋白用阴性的小鼠血浆进行倍比稀释(从20ug/ml起，作11个稀释点至0.02ug/ml)，然后将稀释好的标准品用PBS稀释10倍备用；

4)样品制备：将血浆样品用PBS稀释10倍备用；

5)弃除封闭液，同上洗板3遍，然后加入100ul用PBS稀释10倍的标准品和血浆样品到微孔板中，室温孵育1小时；

6)同上洗板3遍；

7)每孔加入100ul HRP标记的抗His标签的抗体(1:2000倍稀释，用1.5％BSA,PBS溶液)，室温孵育1小时；

8)同上洗板3遍；

9)每孔加入100ulTMB/H₂O₂显色液，室温显色5-15分钟；

10)每孔加50ul1M H₂SO₄终止反应，酶标仪读取OD450吸光值；

11)按浓度和OD450绘制标准曲线，选取呈线性相关区段作为计算血浆中药物浓度的标准，计算血浆中的药物浓度；

12)对于超过标准曲线范围的样品，增加或减少稀释比例，重复进行测定。

将测定的血浆药物浓度与时间绘制药物代谢动力学曲线，分析PK的各项参数。

3.3结果分析

3.3.1融合蛋白与细胞表面的FcRn结合呈pH依赖的特性

为测定SIRPα-F8与FcRn的亲和力，我们在pH6.0和pH7.4条件下测试了SIRPα-F8、SIRPα-F0、SIRPα-Ig与HEK293/EGFP-hFcRn细胞的结合情况，又在H6.0条件下测试了SIRPα-F8、SIRPα-F0、SIRPα-Ig与HEK293/EGFP-HLA-A2细胞的结合情况。结果表明，SIRPα-F8与hFcRn在pH6.0时结合良好(图3)，而在pH7.4时，SIRPα-F8基本不与hFcRn结合(图4)。这一结果与SIRPα-Ig类似。而SIRPα-F0在pH6.0时与hFcRn结合很弱。

即使在pH6.0时，SIRPα-F8与阴性对照HLA几乎不结合(图5)。

3.3.2融合蛋白SIRPα-F8在人源化FcRn小鼠体内的药代动力学测试

为了研究融合蛋白SIRPα-F8与hFcRn的pH依赖性结合是否可以转化为体内半衰期的延长，我们开展了SIRPα-F8的体内药代动力学测试。由于SIRPα-F8与mFcRn的亲和力低，我们选择在人源化FcRn小鼠进行这一实验。作为对照实验，同时研究了同分子量的融合蛋白SIRPα-F0的体内药代动力学表现。

为了方便采血后测定血浆中的SIRPα-F8融合蛋白，我们预先将SIRPα-F8进行了生物素标记。采血后，测定血浆中的SIRPα-F8，得出血浆中药量与时间关系，绘制剂量时间曲线(图6)，并运用非房室模型计算其体内清除半衰期和平均保留时间等(表1)，结果表明SIRPα-F8在人源化FcRn小鼠体内的半衰期达到11.14小时，平均保留时间平均可以达到约13.30小时，明显长于SIRPα-F0在体内的半衰期(0.53小时)和平均保留时间(0.21小时)。

表1 SIRPα-F8在人源化FcRn小鼠体内的药物动力学参数

流式细胞术结果表明SIRPα-F8与细胞表面的FcRn的结合保持了pH依赖性，而与细胞表面的HLA几乎不结合。

进一步的，我们开展了SIRPα-F8的体内药代动力学测试。由于SIRPα-F8与mFcRn的亲和力低，本发明选择人源化FcRn小鼠上进行这一实验。结果同分子量的SIRPα-F0的半衰期为0.53小时，平均滞留时间为0.21小时，而SIRPα-F8的半衰期11.14小时，平均滞留时间为13.30小时。

实施例4 SIRPα-F8融合蛋白的抗肿瘤功能

4.1实验材料

4.1.1试剂耗材

Raji细胞:中科院上海细胞库

过表达人CD47的CHO细胞:参见4.1.3

潮霉素Hygromycin B:invitrogen,Cat#10687-010

EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin:ThermoFisher,Cat#21328

AlexaFluor647标记羊抗鼠IgG(H+L):Jackson,Cat#115-605-166

人外周血单核细胞PBMC:AllCELLS，Cat#PB-002

1640培养基:Thermofisher，Cat#11875-093

胎牛血清FBS:Cat:Thermofisher，Cat#10099-141

磷酸盐缓冲液PBS:GIBCO,Cat#14190

青霉素-链霉素:GIBCO，Cat#15140122

葡聚糖凝胶脱盐柱:ThermoFisher Scientific,Cat#43240

CD14分离试剂盒:Milteny，Cat#130-050-201

巨噬细胞集落刺激因子M-CSF:R&D，Cat#Cat#216-MC

细胞分离缓冲液：ThermoFisher，Cat#13151014

荧光染料CFSE:Invitrogen,Cat#C34554

荧光染料PKH26:Sigma-Aldrich,Cat#MINI26

小鼠抗人CD47抗体B6H12:e-Bioscience,Cat#16-0479-85

小鼠抗人CD47抗体2D3:e-Bioscience,Cat#14-0478-82,

小鼠IgG1kappa同型对照:e-Bioscience,Cat#16-4714-85

NOD/SCID小鼠:雌鼠，8～12周龄，北京华阜康生物科技股份有限公司

30％Matrigel，Extracellular Matrix Proteins:BD，Cat#356234

3V锂电数显卡尺:桂林广陆数字测控股份有限公司，0-150mm

4.1.2仪器

细胞培养箱：ThermoFisher,Model3100

分子相互作用检测仪：Biacore T100，GE Healthcare

台式低温离心机：BeckmanCoulter,

16台式微量离心机

台式低温离心机：BeckmanCoulter,Avanti J-26S系列高效离心机

超净工作台：苏净仪器有限公司,HS-1300-U双

温控二氧化碳摇床：New Brunswick,S41i

洗板机：Biotek，ELx50

酶标仪：Biotek，Synergy 2

流式细胞分选仪：BD，FACS ARIAII

流式细胞检测仪：BD，FACS Calibur4.2实验方法

4.2.1细胞结合实验

4.2.1.1Raji细胞结合实验

1)将处于对数生长期的Raji细胞收集至离心管，1000rpm,离心5分钟，弃上清；

2)用冰浴DPBS重悬细胞，离心，洗涤细胞3遍，最后以PBS重悬，计数；

3)将细胞分装到96孔圆底板中，1x10E5细胞/50ul/孔；

4)用含2％FBS的PBS稀释待测蛋白，连续3倍稀释；

5)将待测蛋白稀释液加入96孔圆底板中，50ul/孔，4℃孵育45min；1000rpm,4℃，离心5分钟，弃上清，用冰浴的含2％FBS的PBS洗涤细胞三次；

6)加入APC标记的小鼠抗His荧光抗体100ul，重悬细胞，4℃孵育45min；1000rpm,4℃，离心5分钟，弃上清，用冰浴的含2％FBS的PBS洗涤细胞三次；

7)最后用200ul PBS重悬细胞，FACS Celesta进行流式分析；

8)用Flowjo软件分析流式结果。

4.2.1.2CHO-HuCD47/CHO-MsCD47细胞结合实验

1)将CHO-HuCD47和CHO-MsCD47细胞培养到汇合度90％左右，用0.25％胰酶缓冲液消化细胞成单细胞悬液，用含血清的培养基终止消化后，收集细胞至离心管，1000rpm,离心5分钟，弃上清；

3)将细胞分装到96孔圆底板中，1x10E5细胞/50ul/孔；

4)用含2％FBS的PBS稀释待测蛋白，连续3倍稀释；

6)加入APC标记的小鼠抗His荧光抗体100ul/孔，重悬细胞，4℃孵育45min；1000rpm,4℃，离心5分钟，弃上清，用冰浴的含2％FBS的PBS洗涤细胞三次；

7)最后用200ul PBS/孔重悬细胞，FACS Celesta进行流式分析；

8)用Flowjo软件分析流式结果。

4.2.2细胞结合竞争实验

4.2.2.1 SIRPα-Ig生物素标记

1)按照生物素标记试剂盒说明书，计算需要的活化生物素(Sulfo-NHS-SS-Biotin)的毫摩

尔数

2)将待标记的SIRPα-Ig与适量的生物素混合，室温孵育半小时

4.2.2.2.SIRPα-Ig-Biotin与Raji细胞的结合实验

3)将细胞分装到96孔圆底板中，1x10E5细胞/50ul/孔；

4)用含2％FBS的PBS稀释待测蛋白，连续3倍稀释；

6)加入APC标记的SA 100ul/孔，重悬细胞，4℃孵育45min；1000rpm,4℃，离心5分钟，弃上清，用冰浴的含2％FBS的PBS洗涤细胞三次；

7)最后用200ul/孔PBS重悬细胞，FACS Celesta进行流式分析；

8)用Flowjo软件分析流式结果，通过结合曲线计算出EC₉₀值。

4.2.2.3 SIRPα-F8与SIRPα-Ig的竞争实验

3)将细胞分装到96孔圆底板中，1x10E5细胞/50ul/孔；

4)用含2％FBS的PBS将SIRPα-Ig-Biotin稀释至上述结合实验EC₉₀值的2倍。用SIRPα-Ig-Biotin溶液稀释SIRPα-F8蛋白，连续3倍稀释；

5)将稀释好的蛋白溶液加入96孔圆底板中，50ul/孔，4℃孵育45min；1000rpm,4℃，离心5分钟，弃上清，用冰浴的含2％FBS的PBS洗涤细胞三次；

7)最后用200ul PBS/孔重悬细胞，FACS Celesta进行流式分析；

8)用Flowjo软件分析流式结果。

4.2.3巨噬细胞吞噬实验

4.2.3.1单核细胞分离

1)人外周血单核细胞300g离心，重悬至10e7细胞/80ul

2)按10e7细胞/20ul加入CD14分离磁珠，混合后静置于2-8℃，15分钟

3)加1-2ml缓冲液，离心10分钟后，把上清吸去

4)将细胞重悬至10e8/500ul缓冲液，待用

5)将LS柱置于磁架上，3ml缓冲液润洗，待用

6)将重悬好的细胞加入LS柱内，用缓冲液将未被标记的细胞去除(反复3次)

7)将LS柱置于50ml离心管上，收集被标记的CD14阳性细胞

8)将细胞离心，计数，待用

4.2.3.2巨噬细胞分化在CD14阳性单核细胞培养基内加入巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)100ng/ml,培养7-10天后可收集到贴壁的巨噬细胞。

4.2.3.3吞噬实验(Raji细胞)

1)用细胞分离缓冲液处理巨噬细胞5分钟，用橡皮刮将细胞轻轻刮离培养皿

2)300g离心，5分钟，重悬。加入PKH26(红色)染料进行细胞膜染色

3)300g离心，重悬于10％FBS-IMDM培养基，按10e4细胞/孔置于96孔平底板中

4)24小时后，用不含FBS的IMDM培养基培养2小时后，待用

5)用荧光染料CFSE对Raji细胞进行荧光染色

6)配置相应浓度的待测蛋白、抗体

7)5*10e4CFSE标记的Raji细胞和待测蛋白加入步骤4)96孔板中，孵育2小时

8)IMDM将细胞离心2次，用2％PFA将细胞固定

9)高内涵Cellomics仪器拍照、分析

10)巨噬细胞吞噬指数的定义为平均100个巨噬细胞中共吞噬的肿瘤细胞数

4.2.3.4吞噬实验(人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞，即CCRF-CEM细胞)

3)300g离心，重悬于不含FBS的IMDM培养基，按5*10e4细胞/孔置于96孔平底板中培养2小时后，待用

4)用荧光染料CFSE对CCRF-CEM细胞进行荧光染色

5)配置相应浓度的待测蛋白、抗体

6)1*10e5CFSE标记的CCRF-CEM细胞和待测蛋白加入步骤3)96孔板中，孵育2小时

7)IMDM将细胞离心2次，用2％PFA将细胞固定

8)高内涵Cellomics仪器拍照、分析

9)巨噬细胞吞噬指数的定义为平均100个巨噬细胞中共吞噬的肿瘤细胞数

4.2.4小鼠肿瘤模型

4.2.4.1动物

SPF级、雌性、7-9周龄、16-22克NOD/SCID小鼠购于北京华阜康生物科技股份有限公司。动物饲养于上海美迪西生物医药公司动物房，在开始正式动物实验前适应环境5-7天。

动物房环境保持温度23±2℃,湿度:30-70％,12小时明暗交替。动物每笼4只饲养，每周更换两次垫料。动物饲料购自北京科澳协力饲料有限责任公司。实验动物用水采用过滤灭菌水。用于实验的动物将保持健康状况。实验过程中动物自由饮食和饮水。

4.2.4.2实验设计

表4-1动物实验设计。

ip：腹腔注射；it：瘤内注射；TIW：每周三次；wks：周。

4.2.4.2肿瘤模型

1)Raji细胞培养于含10％FBS的RPMI1640培养基中。培养在37℃，5％CO₂培养箱内。接种前取对数生长期细胞，用不含血清的培养基重新悬浮细胞计数，调整细胞浓度至3×10^7cells/ml

2)每个小鼠在无菌状态下，右侧腋下皮下接种0.1mL细胞悬液(3×106cells/mouse)。肿瘤长至体积100mm³左右时，选出20只肿瘤体积相近、形状较好的小鼠(形状尽量为单一圆球形，无不规则的形状或多个肿瘤聚在一起),分为4组，分组情况见表4-1。

3)各组动物按表3-1，每周给予受试物3次，共给药3周，每周两次测量肿瘤体积和动物体重。

4)观察各组动物接种部位肿瘤的形成状况，每周2次用游标卡尺测量肿瘤结节的长径(Y)和短径(X)，并按如下公式计算：肿瘤的体积(V)：V＝(X²Y)/2。

5)抗肿瘤活性的评价指标：肿瘤生长抑制率TGI(％)，相对肿瘤体积(RTV)相对肿瘤增殖率T/C(％)。

5.1)肿瘤生长抑制率TGI(％)：TGI(％)＝(1-(Vtx-Vt0)/(Vcx-Vc0))*100％。其中Vcx为模型对照组在给药后X天的肿瘤体积，Vc0为对照组在分组当天肿瘤体积，Vtx为受试物组在给药后X天肿瘤体积，Vt0为受试物组在分组当天的肿瘤体积。

5.2)相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)：RTV＝Vn/V0。其中V0为分组给药时的肿瘤体积，Vn为测量时的肿瘤体积。

5.3)相对肿瘤增殖率T/C(％)：T/C(％)＝TRTV/CRTV×100。其中TRTV为治疗组RTV，CRTV为阴性对照组RTV。

6)实验结束对动物实施安乐死：实验动物在给药结束后或期间有肿瘤体积超过2800mm³的动物，采用吸入过量CO₂的方法安乐死。

7)实验数据除特别指出外，均以Mean±SEM表示；数据采用非配对t检验，p<0.05认为有显著性差异。

4.3实验结果

4.3.1 Raji细胞结合实验

如图7、8所示，经流式细胞仪检测，融合蛋白SIRPα-F8可以特异的结合在Raji细胞表面。

4.3.2 CHO-HuCD47细胞结合实验

如图9、10所示，经流式细胞仪检测，融合蛋白SIRPα-F8可以特异的结合在CHO-HuCD47细胞表面。如图9所示，融合蛋白SIRPα-F8呈剂量依赖性的结合在CHO-HuCD47细胞表面。

4.3.3细胞结合竞争实验

如图11所示，经流式细胞仪检测，生物素化的融合蛋白SIRPα-Ig可以特异的结合在Raji细胞表面。如图12所示，融合蛋白SIRPα-F8呈剂量依赖性与SIRPα-Ig-Biotin竞争结合于Raji细胞表面。

4.3.4巨噬细胞吞噬实验

为了检测融合蛋白本身是否具有促巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力，我们将人外周血来源的巨噬细胞和人急性淋巴细胞白血病CCRF-CEM细胞混合，同时加入一定浓度的蛋白，通过高通量Cellomics系统来观察巨噬细胞的吞噬情况。如图13、14所示，和对照scFv蛋白F8相比，SIRPα-his,SIRPα-F8几乎不能促使巨噬细胞吞噬肿瘤细胞。CD47非阻断型抗体2D3也不能促吞噬，而SIRPα-Ig和CD47阻断型抗体B6H12类似，可以显著的提高巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬。

类似的，在人外周血来源的巨噬细胞和人非霍奇金淋巴瘤Raji细胞的吞噬实验中，如图15所示，SIRPα-his、SIRPα-F8、SIRPα-F0和scFv F8都不能促使巨噬细胞吞噬肿瘤细胞，而SIRPα-Ig可以明显的提高巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬。

为了检测融合蛋白是否可以提高靶向抗体的促吞噬能力，我们在人外周血来源的巨噬细胞和人非霍奇金淋巴瘤Raji细胞的吞噬实验中同时添加了靶向Raji细胞的anti-CD20抗体。结果如图16所示，融合蛋白SIRPα-F8呈剂量依赖性的提高anti-CD20抗体的促吞噬作用。

4.3.5肿瘤动物模型

如图17、18所示，在Raji异种移植NOD/SCID小鼠模型里，融合蛋白SIRPα-F8本身没有抗肿瘤活性。但是在和anti-CD20联合给药组，小鼠肿瘤体积有显著的减小(p<0.05)。如表2所示，在给药第10天，联合给药组的肿瘤抑制率为70％。

表2 Raji异种移植模型中各处理组在第10天时的肿瘤抑制率

ip：腹腔注射；it：瘤内注射

首先，本发明采用了人源CD47过表达的CHO细胞和人非霍奇金淋巴瘤Raji细胞观察了SIRPα-F8的细胞结合特性，又采用Raji细胞检测了SIRPα-F8的CD47竞争结合特性。SIRPα-F8可以特异性的与人细胞表面的CD47结合，并且可以与天然受体SIRPα蛋白竞争与CD47结合。

体外功能学实验主要从巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的实验入手，这包括以人急性淋巴细胞白血病CCRF-CEM细胞为代表的血液瘤和以人非霍奇金淋巴瘤Raji细胞为代表的实体瘤。检测结果表明了SIRPα-F8本身不能促进肿瘤细胞对肿瘤细胞的吞噬功能。然而，当SIRPα-F8与靶向肿瘤细胞的单克隆抗体联用时，呈剂量依赖性的提高巨噬细胞吞噬功能。

本发明在NOD/SCID小鼠体内建立了Raji细胞异种移植肿瘤模型来检测SIRPα-F8的体内疗效。一般情况下，小鼠的SIRPα与人源CD47亲和力很弱，而NOD品系小鼠的SIRPα与人源CD47亲和力比人源SIRPα甚至更高，这为小鼠模型的建立提供了便利条件。该肿瘤模型的结果也进一步证明体外实验中观察到的现象，即SIRPα-F8与靶向肿瘤细胞的单克隆抗体联用时，抗肿瘤疗效有明显提高。

本发明所述的SIRPα-F8可以不仅可以与肿瘤细胞表面CD47结合，而且可以阻断CD47与其天然受体SIRPα的结合。当与靶向肿瘤细胞的单克隆抗体联用时，SIRPα-F8呈剂量依赖性的提高巨噬细胞吞噬功能，而且联合使用明显提高了抗体在小鼠体内动物模型中的疗效。SIRPα-F8具有pH依赖性的与FcRn结合的特性，在溶酶体等酸性条件下，与FcRn紧密结合，而在正常中性条件下，与FcRn解离。SIRPα-F8在FcRn人源化小鼠体内，具有明显延长的半衰期。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 信号调节蛋白α片段-抗FcRn单链抗体融合蛋白及其制备与应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro Ser

115

<210> 2

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaagaagagc tgcaggtcat ccagcccgat aagagcgtgt cagtggccgc cggagaatca 60

gccattctgc attgcaccgt gaccagcctg atcccagtgg gcccaatcca gtggtttagg 120

ggtgcaggac cagccaggga gctgatctac aaccagaagg agggccactt ccccagagtg 180

acaacagtgt ccgagagcac caagcgggag aacatggact tcagcatcag catcagcaac 240

atcaccccag cagacgccgg cacctactat tgcgtgaagt tccggaaggg cagcccagat 300

accgagttca agagcggagc cggaacagaa ctgagcgtga gagccaagcc cagc 354

<210> 3

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Arg Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Leu Glu Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

130 135 140

Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr

145 150 155 160

Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln

165 170 175

Gly Leu Glu Trp Met Gly His Ile Ser Pro His Ser Gly Gly Thr Asp

180 185 190

Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser

195 200 205

Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr

210 215 220

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Val Tyr Gly Met Asp Arg Trp Gly

225 230 235 240

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 4

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caggcagtgc tgacacagcc tccttcagct agcggaacac caggacagag ggtgaccatc 60

tcttgcagcg gctctagcag caacatcggc agcaacagcg tgaactggta ccagcagctg 120

ccaggaacag ctcctaagct gctgatctac agcaacaacc agcggcctag cggagtgcca 180

gatagattca gcggcagcaa aagcggcaca agcgcttctc tggccattag cggactgcag 240

agcgaggacg aagccgacta ctattgcgcc gcttgggacg actccctgaa tggcagagtg 300

ctcttcggcg gaggaaccaa gctgacagtg ctgggcagca gaggaggagg aggaagcgga 360

ggaggaggaa gcggaggagg aggatctctg gagatggctc aggtgcagct ggtgcagagc 420

ggagcagaag tgaagaagcc aggcgccagc gtgaaagtgt cttgcaagac cagcggctac 480

accttcaccg gctactacat ccattgggtc cggcaggctc caggacaggg actcgagtgg 540

atgggacaca tcagccctca cagcggagga accgattacg ctcagaagtt ccagggcagg 600

gtgaccatga ccagggacac cagcatcagc accgcctaca tggagctgag cagactgaga 660

agcgacgaca cagccgtgta ctattgcgcc aggggagtgt acggcatgga tcgctgggga 720

cagggaacac tggtgacagt gtcctct 747

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggaggaggag gaagcggagg aggaggaagc ggaggaggag gatct 45

<210> 7

<211> 412

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro Ser Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser

130 135 140

Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser

145 150 155 160

Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro

165 170 175

Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser

180 185 190

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser

195 200 205

Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Arg Val Leu Phe Gly Gly Gly

225 230 235 240

Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Gln Val Gln Leu

260 265 270

Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val

275 280 285

Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Ile His Trp

290 295 300

Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly His Ile Ser

305 310 315 320

Pro His Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val

325 330 335

Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser

340 345 350

Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Val

355 360 365

Tyr Gly Met Asp Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

370 375 380

Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln His His His His His His Gly Leu Asn

385 390 395 400

Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu

405 410

<210> 8

<211> 1143

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaagaagagc tgcaggtcat ccagcccgat aagagcgtgt cagtggccgc cggagaatca 60

gccattctgc attgcaccgt gaccagcctg atcccagtgg gcccaatcca gtggtttagg 120

ggtgcaggac cagccaggga gctgatctac aaccagaagg agggccactt ccccagagtg 180

acaacagtgt ccgagagcac caagcgggag aacatggact tcagcatcag catcagcaac 240

atcaccccag cagacgccgg cacctactat tgcgtgaagt tccggaaggg cagcccagat 300

accgagttca agagcggagc cggaacagaa ctgagcgtga gagccaagcc cagcggagga 360

ggaggaagcg gaggaggagg aagcggagga ggaggatctg cagtgctgac acagcctcct 420

tcagctagcg gaacaccagg acagagggtg accatctctt gcagcggctc tagcagcaac 480

atcggcagca acagcgtgaa ctggtaccag cagctgccag gaacagctcc taagctgctg 540

atctacagca acaaccagcg gcctagcgga gtgccagata gattcagcgg cagcaaaagc 600

ggcacaagcg cttctctggc cattagcgga ctgcagagcg aggacgaagc cgactactat 660

tgcgccgctt gggacgactc cctgaatggc agagtgctct tcggcggagg aaccaagctg 720

acagtgctgg gcagcagagg aggaggagga agcggaggag gaggaagcgg aggaggagga 780

tctctggaga tggctcaggt gcagctggtg cagagcggag cagaagtgaa gaagccaggc 840

gccagcgtga aagtgtcttg caagaccagc ggctacacct tcaccggcta ctacatccat 900

tgggtccggc aggctccagg acagggactc gagtggatgg gacacatcag ccctcacagc 960

ggaggaaccg attacgctca gaagttccag ggcagggtga ccatgaccag ggacaccagc 1020

atcagcaccg cctacatgga gctgagcaga ctgagaagcg acgacacagc cgtgtactat 1080

tgcgccaggg gagtgtacgg catggatcgc tggggacagg gaacactggt gacagtgtcc 1140

tct 1143

<210> 9

<211> 1290

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgcctctgc tgctgctgct gcctctgctc tgggccggag ctctggctat ggaagaagag 60

ctgcaggtca tccagcccga taagagcgtg tcagtggccg ccggagaatc agccattctg 120

cattgcaccg tgaccagcct gatcccagtg ggcccaatcc agtggtttag gggtgcagga 180

ccagccaggg agctgatcta caaccagaag gagggccact tccccagagt gacaacagtg 240

tccgagagca ccaagcggga gaacatggac ttcagcatca gcatcagcaa catcacccca 300

gcagacgccg gcacctacta ttgcgtgaag ttccggaagg gcagcccaga taccgagttc 360

aagagcggag ccggaacaga actgagcgtg agagccaagc ccagcaagct tggaggagga 420

ggaagcggag gaggaggatc tggaggagga ggatctcagg cagtgctgac acagcctcct 480

tcagctagcg gaacaccagg acagagggtg accatctctt gcagcggctc tagcagcaac 540

atcggcagca acagcgtgaa ctggtaccag cagctgccag gaacagctcc taagctgctg 600

atctacagca acaaccagcg gcctagcgga gtgccagata gattcagcgg cagcaaaagc 660

ggcacaagcg cttctctggc cattagcgga ctgcagagcg aggacgaagc cgactactat 720

tgcgccgctt gggacgactc cctgaatggc agagtgctct tcggcggagg aaccaagctg 780

acagtgctgg gcagcagagg aggaggagga agcggaggag gaggaagcgg aggaggagga 840

tctctggaga tggctcaggt gcagctggtg cagagcggag cagaagtgaa gaagccaggc 900

gccagcgtga aagtgtcttg caagaccagc ggctacacct tcaccggcta ctacatccat 960

tgggtccggc aggctccagg acagggactc gagtggatgg gacacatcag ccctcacagc 1020

ggaggaaccg attacgctca gaagttccag ggcagggtga ccatgaccag ggacaccagc 1080

atcagcaccg cctacatgga gctgagcaga ctgagaagcg acgacacagc cgtgtactat 1140

tgcgccaggg gagtgtacgg catggatcgc tggggacagg gaacactggt gacagtgtcc 1200

tctacaagcg gacaggccgg acagcatcac caccaccacc acggactgaa cgacatcttc 1260

gaggcccaga agatcgagtg gcacgagtga 1290

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

His His His His His His

1 5

<210> 11

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys

1 5 10 15

Ala Cys

<210> 12

<211> 1188

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgcctctgc tgctgctgct gcctctgctc tgggccggag ctctggctat ggaagaagag 60

ctgcaggtca tccagcccga taagagcgtg tcagtggccg ccggagaatc agccattctg 120

cattgcaccg tgaccagcct gatcccagtg ggcccaatcc agtggtttag gggtgcagga 180

ccagccaggg agctgatcta caaccagaag gagggccact tccccagagt gacaacagtg 240

tccgagagca ccaagcggga gaacatggac ttcagcatca gcatcagcaa catcacccca 300

gcagacgccg gcacctacta ttgcgtgaag ttccggaagg gcagcccaga taccgagttc 360

aagagcggag ccggaacaga actgagcgtg agagccaagc ccagcctgcc agtgcctaca 420

cagcctcctt cagtgtccgt ggctccaggc aaaacagcca agatcacttg cggcggcgac 480

aacatcggca gcaagaccgt gcattggtac cagcagaagc caggacaggc tccagccctg 540

ctgatctact acgacagcga cagacctagc ggcatcccag agaggttcag cggctctaac 600

agcggcaaca ccgctaccct gaccatcagc agagtggagg caggagacga ggccggatac 660

ttttgccagg tgtgggacgg aagcagcgat cacgtgatct ttggcggcgg aaccaagctg 720

acagtgctgg gaagcagagg aggaggagga agcggaggag gaggaagcgg aggaggagga 780

tctctggaga tggccgaagt gcagctggtg gaaagcggac caggactggt gaaacctagc 840

gagaccctga gcctgacttg cacagtgtcc ggctacagca tcagcagcgg ctactattgg 900

ggttggatca ggcagccacc aggaaaagga ctcgagtgga tcggcagcat ctaccacagc 960

ggaagcacct actacaaccc cagcctgaag agccgcgtga caatcagcgt ggacaccagc 1020

aagaaccagt tctccctgaa gctgagcagc gtgacagccg ccgataccgc catgtactat 1080

tgcgccagga gcgtgccagg cagctacagc gactattggg gacagggcac actggtgaca 1140

gtgtctagca caagcggaca ggccggacag catcatcacc accaccac 1188

<210> 13

<211> 1152

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgcctctgc tgctgctgct gcctctgctc tgggccggag ctctggctat ggaagaagag 60

ctgcaggtca tccagcccga taagagcgtg tcagtggccg ccggagaatc agccattctg 120

cattgcaccg tgaccagcct gatcccagtg ggcccaatcc agtggtttag gggtgcagga 180

ccagccaggg agctgatcta caaccagaag gagggccact tccccagagt gacaacagtg 240

tccgagagca ccaagcggga gaacatggac ttcagcatca gcatcagcaa catcacccca 300

gcagacgccg gcacctacta ttgcgtgaag ttccggaagg gcagcccaga taccgagttc 360

aagagcggag ccggaacaga actgagcgtg agagccaagc ccagcgacaa gacccacact 420

tgccctcctt gtccagctcc agaactgctg ggaggcccta gcgtgtttct gttccctcct 480

aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg accccagaag tgacttgcgt ggtggtggac 540

gtgtctcacg aggaccccga ggtcaagttc aattggtacg tggacggcgt ggaggtgcac 600

aacgctaaga ccaagcccag ggaggagcag tacaacagca cctaccgggt ggtgtccgtg 660

ctgacagtgc tgcaccagga ttggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgtccaac 720

aaagccctgc cagcccctat cgagaagacc atcagcaagg ccaagggcca gcctagagag 780

cctcaggtgt acaccctgcc tcctagcaga gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctc 840

acctgcctcg tgaagggctt ctaccctagc gacatcgccg tcgagtggga aagtaacggg 900

cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc ccagtgctgg atagcgacgg cagcttcttc 960

ctgtacagca agctgaccgt ggacaagagc aggtggcagc agggcaacgt gttctcttgc 1020

agcgtgatgc acgaggccct gcataaccac tacacccaga agagcctgag cctgagccca 1080

ggcaaacatc accaccacca ccacggactg aacgacatct tcgaggccca gaagatcgag 1140

tggcacgagt ga 1152

Claims

1.一种融合蛋白，为含有信号调节蛋白α片段和抗FcRn单链抗体的融合蛋白，所述信号调节蛋白α片段通过连接肽与所述抗FcRn单链抗体。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白中，所述信号调节蛋白α片段是指信号调节蛋白α的胞外IgV样结构域，氨基酸序列如SEQID NO：1所示；抗FcRn单链抗体的氨基酸序列如SEQID NO：3所示。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白中，所述连接肽的氨基酸序列如SEQID NO：5所示。

4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示。

5.一种多核苷酸，其编码权利要求1-4任一权利要求所述融合蛋白。

6.一种表达载体，其含有权利要求5所述多核苷酸。

7.一种宿主细胞，其被权要求6所述载体转化。

8.一种如权利要求1-7任一权利要求所述融合蛋白的制备方法，包括下列步骤：

1)获得编码融合蛋白的融合基因序列；

3)将获得的核酸构建体转染适宜的宿主细胞；

9.如权利要求1-4任一权利要求所述融合蛋白用于延长大分子药物半衰期或用于制备抗肿瘤药物的用途。

10.一种药物，包括如权利要求1-4任一权利要求所述融合蛋白或包括具有所述融合蛋白结构的大分子，及至少一种药学可接受的载体或赋形剂。