ES2308857T3 - Estimulacion de celulas t contra autoantigenos mediante el uso de agentes bloqueadores de ctla-4. - Google Patents
Estimulacion de celulas t contra autoantigenos mediante el uso de agentes bloqueadores de ctla-4. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de un anticuerpo anti-CTLA-4 o su fragmento y una preparación de autoantígeno para la fabricación de un medicamento para tratar metástasis establecida.
Description
Estimulación de células T contra autoantígenos
mediante el uso de agentes bloqueadores de
CTLA-4.
La puesta en práctica de la inmunoterapia es un
objetivo altamente deseado en el tratamiento de enfermedades de
seres humanos. Promete una especificidad de acción que rara vez se
encuentra con el uso de fármacos convencionales. La base de la
inmunoterapia es la manipulación de la respuesta inmune,
particularmente las respuestas de las células T. Las células T
poseen complejos y sutiles sistemas para el control de sus
interacciones, utilizando numerosos receptores y factores solubles
para el proceso. El efecto que puede tener cualquier señal
particular sobre la respuesta inmune puede variar según los
factores, receptores y contrarreceptores que intervienen.
La activación total de las células T requiere no
sólo una señal específica de antígeno, a través del receptor de
antígeno de la célula T (TCR), sino también otras señales a través
de moléculas de superficie coestimuladoras tales como CD28. Los
ligandos para CD28 son las proteínas B7-1 (CD80) y
B7-2 (CD86), que se expresan en células
presentadoras de antígeno tales como células dendríticas, células B
activadas o monocitos. La estimulación de células T por el antígeno
en ausencia de dichas señales coestimuladoras puede dar por
resultado una estimulación de células T no productiva o tolerancia
a células T. La falta de expresión de B7 por las células tumorales,
por ejemplo, es un factor que puede contribuir a su falla en la
generación de de respuestas inmunes productivas.
Las vías para regular hacia abajo las respuestas
son tan importantes como las requeridas para la activación. La
educación tímica conducente a la tolerancia periférica a células T
es un mecanismo para la prevención de una respuesta inmune contra
un antígeno particular. También se conocen otros mecanismos, tales
como la secreción de citoquinas supresoras. Más recientemente, se
identificó CTLA-4 como un segundo contrarreceptor de
células T para B7, y ahora se ha demostrado que juega un papel
esencial en la atenuación de las respuestas de células T. Thompson
y Allison, Immunity 7:445-450 (1997).
Los tumores no inmunogénicos o poco
inmunogénicos presentan desafíos especiales. Loa antígenos ausentes
o inefectivos por alteración o los antígenos virales impiden la
activación de una respuesta de células T específica de antígeno, lo
cual permite que el tumor crezca sin impedimentos. Las estrategias
para montar una respuesta inmune citotóxica contra estos tipos de
células tumores también se complican debido a la tolerancia inmune
natural del organismo contra los antígenos propios que están
presentes en células normales y tumorales. En consecuencia, puede
ser necesario superar la tolerancia inmune a fin de montar una
respuesta efectiva de células T citotóxicas. Sin embargo, hasta la
fecha aún resta lograr un método seguro y efectivo para romper la
tolerancia inmune y estimular las células T autorreactivas.
Sería ventajoso si, en el tratamiento de
infecciones y tumores, se pudiera activar una fuerte respuesta
inmune celular mediante la manipulación de receptores que
intervienen en la coestimulación. Otra ventaja se lograría si se
pudiera romper la tolerancia inmune para un autoantígeno
deseado.
El uso de proteína B7 para mediar la inmunidad
antitumor se describe en Chen et al. (1992) Cell
71:1093-1102 y Townsend y Allison (1993) Science
259:368. Schwartz (1992) Cell 71:1065 revisa el papel de CD28,
CTLA-4 y B7 en la producción de
IL-2 y la inmunoterapia. Harding et al.
(1994) Nature 356:607-609 demostraron que las
señales mediadas por CD28 coestimula las células T murinas e impide
la inducción de anergia en los clones de células
T.
T.
CTLA-4 es una molécula de
superficie de las células T que se identificó originalmente por
análisis diferencial de una biblioteca citolítica murina de cADN de
células T, Brunet et al. (1987) Nature
328:267-270. El papel de CTLA-4
como segunda receptor para B7 es analizado por Linsley et al.
(1991) J. Exp. Med. 174:561-569. Freeman et
al. (1993) Science 262:907-909 estudia
CTLA-4 en ratones deficientes en B7. Los ligandos
para CTLA-4 se describen en Lenschow et al.
(1993) P.N.A.S. 90:11054-11058.
Linsley et al. (1992) Science
257:792-795 describen la inmunosupresión in
vivo por una forma soluble de CTLA-4. Lenschow
et al. (1992) Science 257:789-792 analiza la
supervivencia a largo plazo de injertos de islotes pancreáticos
inducida por CTLA- Ig4. Se ha sugerido en Walunas et al.
(1994) Immunity 1:405-413, que
CTLA-4 puede actuar como regulador negativo de la
activación de células T. Thompson y Allison, Immunity
7:445-450 (1997) revisa los datos acumulados que
sugieren que CTLA- 4 sirve para atenuar las respuestas de células
T.
La invención se refiere a composiciones para
estimular células T a responder a autoantígenos a través de un
bloqueo de las señales CTLA-4. Los agentes
bloqueadores de CTLA-4 se combinan con preparaciones
de autoantígenos y opcionalmente otros agentes estimuladores de
respuesta inmune en estrategias de coestimulación para romper la
tolerancia inmune y estimular un aumento de la respuesta de las
células T contra el autoantígeno. Este aumento de la respuesta es
útil para el tratamiento de tumores no inmunogénicos y poco
inmunogénios, así como otras condiciones médicas que requieren
ablación selectiva de tejidos.
La invención provee el uso de un anticuerpo
anti-CLA-4 o su fragmento y una
preparación de autoantígeno para la fabricación de un medicamento
para tratar metástasis establecidas.
En una forma de realización de la invención, se
combina un agente bloqueador de CTLA-4 con una
preparación de autoantígeno que comprende una vacuna de células
tumorales para el tumor de interés. En una forma de realización
particularmente preferida, la vacuna de células tumorales comprende
células tumorales irradiadas transducidas para expresar citoquinas
tales como factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos
(GM-CSF), a fin de mejorar el cebado cruzado de
células T por las células presentadoras de antígeno (APC).
Alternativamente el autoantígeno purificado o una mezcla de
autoantígenos se pueden combinar con agentes bloqueadores de
CTLA-4, ya sea solos o en combinación con otros
agente estimulantes de respuesta inmune tales como coadyuvantes o
células dendríticas.
La Figura 1A es un gráfico que ilustra el
crecimiento in vivo de la línea de células tumorales
V51Blim10 en presencia o ausencia de anticuerpos dirigidos contra
CTLA-4 o CD28. La Figura 1B es un gráfico que
ilustra el tamaño promedio de tumor en ratones inyectados con 2 x
10^{6} células V51Blim10 y anticuerpos. La Figure 1C es un
gráfico que ilustra el tamaño del crecimiento de tumores
individuales en ratones inyectados con células V51Blim10.
La Figura 2 es un gráfico que muestra el
crecimiento in vivo de tumores B7-51BLim10 en
presencia o ausencia de anticuerpos dirigidos contra
CTLA-4 o CD28. La Figura 3 muestra el rechazo de
células de carcinoma de colon de tipo salvaje por parte de ratones
tratados previamente con células V51BLim10 y anticuerpo
anti-CTLA-4.
La Figura 4 muestra el crecimiento de tumores
establecidos después del tratamiento con anticuerpo
anti-CTLA-4.
La Figura 5 muestra el crecimiento de
fibrosarcoma SA1N murino en ausencia o presencia de anticuerpos
anti-CTLA-4.
Las Figuras 6A a 6E ilustran el efecto
coadyuvante de anticuerpos
anti-CTLA-4 en la respuesta de
células T a antígenos peptídicos.
Las Figuras 7A a 7F ilustran el efecto del
bloqueo de CTLA-4 sobre el cambio de clase.
La Figura 8 muestra el efecto de retrasar el
bloqueo de CTLA-4 sobre un fibrosarcoma.
La Figura 9 muestra el efecto de tratar un
carcinoma de mama con anti-CTLA-4
solo, células transducidas GM-CSF solas o una de
sus combinaciones.
Las Figuras 10A y 10B demuestran el efecto del
bloqueo retrasado de CTLA-4 sobre un carcinoma
renal.
La Figura 11 muestra el efecto del tratamiento
por bloqueo de CTLA-4 solo o en combinación con
inmunización con células tumorales irradiadas B 16 sobre tumores
B16.
La Figura 12 muestra el efecto de combinar el
bloqueo de CTLA-4 con células irradiadas B16 y/o
tratamiento con citoquinas.
Las Figuras 13A y 13B muestran el efecto del
tratamiento por bloqueo de CTLA-4 solo o en
combinación con células irradiadas B16-BL6
transducidas con GM-CSF en tumores
B16-BL6.
La Figura 14 demuestra producción de IFN\gamma
por parte de células T específicas para B 16 inducidas in
vivo.
La Figura 15 muestra la tasa de supervivencia de
ratones portadores de metástasis de pulmón B 16-F 10
cuando son tratados con bloqueo de CTLA-4 y vacuna
F 10/GM.
La Figura 16A muestra que ratones TRAMP tratados
con vacunas TRAMP-C y
anti-CTLA-4 tienen menor incidencia
de tumores que los animales tratados con control.
La Figura 16B muestra la incidencia de tumores
como función de la edad en el momento del tratamiento, lo cual
demuestra una significativa reducción de la incidencia de tumores en
ratones tratados a 14 semanas de edad, pero no en ratones tratados
a 16 semanas de edad.
La Figura 17A demuestra la reducción de
severidad de lesiones prostáticas en ratones TRAMP tratados con
vacunas TRAMP-C y
anti-CTLA-4.
La Figura 17B muestra que los ratones TRAMP
tratados con GMTRAMP-C1/C2 y
anti-CTLA-4 tenían una reducción
del grado de tumor cuando se trataron a las 14 semanas de edad, pero
no cuando se trataban a las 16 semanas.
La Figura 18 muestra la producción de
IFN-\gamma tras la estimulación peptídico in
vivo.
La Figura 19 muestra el crecimiento de tumor de
melanoma B16 en ratones inmunizados con péptido con y sin bloqueo
de CTLA-4.
La secuencia completa de cADN de
CTLA-4 humano tiene el número de acceso de Genbank
L15006. La región de los aminoácidos 1-37 es el
péptido guía; 38-161 es el dominio símil V
extracelular; 162-187 es el dominio extracelular; y
188-223 es el dominio citoplasmático. Se han
informado variantes de la secuencia de nucleótidos, incluso una
transición G a A en la posición 49, una transición C a T en la
posición 272, y una transición A a G en la posición 439. La
secuencia completa de ADN de CTLA-4 murino tiene el
número de acceso EMBL X05719 (Brunet et al. (1987) Nature
328:267-270). La región de los aminoácidos
1-35 es el péptido guía.
La secuencia completa de ADN de
B7-1 humano (CD80) tiene el número de acceso Genbank
X60958; el número de acceso para la secuencia murina es X60958; el
número de acceso para la secuencia de rata es U05593. La secuencia
completa de cADN de B7-2 humano (CD86) tiene el
número de acceso Genbank L25259; el número de acceso para la
secuencia murina es L25606.
Los genes codificadores de CD28 han sido
extensamente caracterizados. La secuencia de mARN de pollo tiene el
número de acceso Genbank X67915. La secuencia de mARN de rata tiene
el número de acceso Genbank X55288. La secuencia de mARN humana
tiene el número de acceso Genbank J02988. La secuencia de mARN de
ratón tiene el número de acceso Genbank M34536.
La invención se refiere a composiciones para
estimular una respuesta de células T a autoantígenos. Se emplean
agentes bloqueadores de CTLA-4 a saber un anticuerpo
anti-CLA-4 o su fragmento, en las
estrategias de coestimulación para activar las células T
autorreactivas existentes y/o las células T no expuestas T para que
respondan a autoantígenos, para reducir selectivamente la
tolerancia inmune. Una preparación de autoantígeno se administra
con los agentes bloqueadores objeto para ayudar a estimular una
respuesta periférica autorreactiva de células T. Las preparaciones
de autoantígeno preferidas incluyen proteína purificada, lisados de
células tumorales, o vacunas tumorales que comprende células
tumorales irradiadas. De particular interés son las vacunas de
tumores transducidos con genes de interés, tales como genes
codificadores de citoquinas que estimulan las células presentadoras
de antígeno, por ejemplo factor estimulador de colonias de
granulocitos-macrófagos (GM-CSF),
factor estimulador de colonias de macrófagos
(M-CSF), o factor estimulador de colonias de
granulocitos (G-CSF). Otras estrategias adicionales
y alternativas de coestimulación se describen con mayor detalle en
la presente. El objeto de la invención es útil para el tratamiento
tumores poco inmunogénicos y no inmunogénicos, así como técnicas de
ablación de tejidos en general.
La terapia libera células T de las señales
inhibitorias mediadas por CTLA-4. Se cree que la
intervención de CTLA-4 regula hacia abajo las
respuestas de células T al elevar el umbral de las señales
necesarias para la efectiva activación de células T, o también
puede jugar un papel importante en la terminación de respuestas de
células T en marcha. La respuesta de células T al antígeno y las
señales coestimuladoras de CD28 se regulan así hacia arriba en
presencia de agentes bloqueadores de CTLA-4. Cuando
se emplea en una estrategia adecuada de coestimulación, el bloqueo
de CTLA-4 estimula las células T autorreactivas de
baja avidez y/o las células T no expuestas para responder al
autoantígeno. Los métodos objeto no promueven una proliferación
generalizada de células T no estimuladas.
De acuerdo con la invención, un agente
bloqueador CTLA-4 objeto, es decir un anticuerpo
anti-CLA-4 o su fragmento, se usa
para la fabricación de un medicamento para tratar metástasis
establecidas.
Los medicamentos son útiles cuando hay una
respuesta mediada por células T inadecuada ante un estímulo
antigénico.
Las situaciones caracterizadas por una respuesta
deficiente de células T huésped al antígeno incluyen los tumores.
La administración de los bloqueadores CTLA-4 objeto
a dichos huéspedes cambia específicamente el fenotipo de las
células T activadas, lo cual da por resultado un incremento de la
respuesta a la activación mediada por antígeno. El tratamiento de
primates, más particularmente seres humanos es de interés, pero
otros mamíferos también se pueden beneficiar del tratamiento,
particularmente animales domésticos tales como equinos, bovinos,
ovinos, felinos, caninos, murinos, lagomorfas, y similares.
La formulación se administra en una dosis
efectiva para incrementar la respuesta de las células T a la
estimulación antigénica. La respuesta de las células T activadas es
afectada por el tratamiento objeto en mayor grado que las células T
en reposo. La determinación de la respuesta de células T varía con
la condición que se trata. Las medidas útiles de actividad de
células T son la proliferación, la liberación de citoquinas, por
ejemplo IL-2, IFNg, TNFa; la expresión en células T
de marcadores tales como CD25 y CD69; y otras medidas de actividad
de células T conocidas en la técnica.
Los agentes bloqueadores de
CTLA-4 son moléculas que se fijan específicamente al
dominio extracelular de la proteína CTLA-4, y
bloquean la fijación de CTLA-4 a sus
cotrarreceptores, por ejemplo CD80, CD86, etc. Usualmente la
afinidad de unión por el agente bloqueador será de al menos
aproximadamente 100 \muM. El agente bloqueador será
sustancialmente no reactivo con moléculas relacionadas a CTLA- 4,
tales como CD28 y otros miembros de la superfamilia de
inmunoglobulinas. Moléculas tales como CD80 y CD86 en consecuencia
están excluidas como agente bloqueadores. Además, los agentes
bloqueadores no activan las señales CTLA-4.
Convenientemente, esto se logra mediante el uso de moléculas
fijadoras monovalentes o bivalentes. Los expertos en la técnica
comprenderán que los siguientes análisis sobre reactividad cruzada
y competencia entre diferentes moléculas pretende referirse a
moléculas que tienen el mismo origen de especie, por ejemplo
CTLA-4 humano fija CD80 y 86 humano, etc.
Los candidatos a agentes bloqueadores son
analizados en cuanto a su actividad para cubrir estos criterios.
Los ensayos para determinar la afinidad y especificidad de fijación
son conocidos en la técnica, incluso ensayos competitivos y no
competitivos. Los ensayos de interés incluyen ELISA, RIA, citometría
de flujo, etc. Los ensayos de fijación pueden usar proteína
CTLA-4 purificada o semipurificada, o
alternativamente puede usar células T que expresan
CTLA-4, por ejemplo células transfectadas con una
contracción de expresión para CTLA-4; células T que
ha sido estimuladas por enlaces cruzados de CD3 y CD28; la adición
de células alogénicas irradiadas, etc. Como ejemplo de un ensayo de
fijación, se fija proteína CTLA-4 purificada a un
soporte insoluble, por ejemplo una placa de microtitulación, perlas
magnéticas, etc. El candidato de agente bloqueador y CD80 o CD86
soluble rotulado se agregan a las células, y los componentes no
fijados se eliminan por lavado. La capacidad del agente bloqueador
para competir con CD80 y CD86 por la fijación a
CTLA-4 se determina por cuantificación de CD80 o
CD86 fijado rotulado. La confirmación de que el agente bloqueador no
forma enlaces cruzados con CD28 se puede lograr con un ensayo
similar, al sustituir CD28 por CTLA-4. Las moléculas
adecuadas tendrán al menos aproximadamente 10' menos fijación a
CD28 que a CTLA-4, más usualmente al menos
aproximadamente 10^{4} menos fijación.
En general, una molécula fijadora soluble
monovalente o bivalente no activa la señal CTLA-4.
Se puede usar un ensayo funcional que detecta la activación de
células T para la confirmación. Por ejemplo, se puede estimular una
población de células T con células alogénicas irradiadas que
expresan CD80 o CD86, en presencia o ausencia del candidato a
agente bloqueador. Un agente que bloquea la señal
CTLA-4 causará un incremento de la activación de
células T, medida por la proliferación y la progresión del ciclo
celular, la liberación de IL-2, la regulación hacia
arriba de CD25 y CD69, etc. Los expertos en la técnica comprenderán
que la expresión en la superficie de una célula, el empaquetamiento
en un liposoma,
\hbox{la adherencia a una partícula o cavidad,
etc. Incrementarán la valencia efectiva de una molécula.}
Los agentes bloqueadores son anticuerpos. Los
anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales; intactos o
truncados, por ejemplo F(ab'), Fab, Fv; xenogénicos,
alogénicos, singénicos o sus formas modificadas, por ejemplo
humanizados, quiméricos, etc.
El agente bloqueador en consecuencia es un
anticuerpo o su fragmento. En general, la afinidad será de al menos
aproximadamente 10^{-6}, más usualmente de aproximadamente
10^{-8} M, es decir las afinidades normalmente observadas con
anticuerpos monoclonales específicos.
Un número de ensayos de búsqueda están
disponibles para los agentes bloqueadores. Los componentes de tales
ensayos generalmente incluyen la proteína CTLA-4; y
opcionalmente un agente activador de CTLA-4, por
ejemplo CD80, CD86, etc. La mezcla de ensayo también comprende un
candidato de agente farmacológico. En general se ejecuta una
pluralidad de mezclas de ensayo en paralelo con diferentes
concentraciones de agente, a fin de obtener una respuesta
diferencial a las diversas concentraciones. Generalmente, una de
estas concentraciones sirve como control negativo, es decir con
concentración cero o por debajo del nivel de detección.
Convenientemente, en estos ensayos una o más de
las moléculas se unen a un rótulo, en donde el rótulo puede proveer
en forma directa o indirecta una señal detectable. Diversos rótulos
incluyen radioisótopos, fluorescentes, quimioluminiscentes,
enzimas, moléculas fijadoras específicas, partículas, por ejemplo
partículas magnéticas, y similares. Las moléculas de fijación
específicas incluyen pares tales como biotina y estreptavidina,
digoxina y antidigoxina, etc. Para los miembros de fijación
específicos, el miembro complementario normalmente se rotula con
una molécula que provee la detección, de acuerdo con procedimientos
conocidos.
Un ensayo de barrido de interés está dirigido a
agentes que interfieren con la activación de CTLA-4
por sus contrarreceptores. La cuantificación de la activación se
puede lograr por numerosos métodos conocidos en la técnica. Por
ejemplo, la inhibición de la activación de células T se puede
determinar por la cuantificación de la proliferación celular, la
liberación de citoquinas, etc.
Otros ensayos de interés están dirigidos a
agentes que bloquean la fijación de CTLA-4 a sus
contrarreceptores. La mezcla de ensayo comprende al menos una
porción del contrarreceptor natural, o un oligopéptido que comparte
suficiente similitud de secuencia para proveer una fijación
específica, y el candidato de agente farmacológico. El oligopéptido
puede tener cualquier longitud adecuada a las condiciones y
requerimientos del ensayo, usualmente al menos aproximadamente 8 aa
de longitud y hasta la proteína de longitud total o de fusión
correspondiente. El CTLA-4 se puede fijar a un
sustrato insoluble. El sustrato se puede preparar en una amplia
variedad de materiales y formas, por ejemplo placa de
microtitulación, microperlas, tira reactiva, partícula de resina,
etc. El sustrato se elige para minimizar el fondo y maximizar la
relación entre señal y ruido. La fijación se puede cuantificar por
diversos métodos conocidos en la técnica. Después de un periodo de
incubación suficiente para permitir que la fijación alcance el
equilibrio, se lava el soporte insoluble, y se cuantifica el rótulo
remanente. Los agentes que interfieren con la fijación disminuyen el
rótulo detectado.
Diversos otros reactivos se pueden incluir en el
ensayo de barrido. Estos incluyen reactivos tales como sales,
proteínas neutras, por ejemplo albúmina, detergentes, etc., que se
pueden usar para facilitar la fijación óptima de
proteína-ADN y/o reducir las interacciones no
específicas o de fondo. También se pueden usar reactivos que de
otro modo mejoran la eficiencia del ensayo, tales como inhibidores
de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes antimicrobianos,
etc.
Los anticuerpos adecuados para el uso como
agentes bloqueadores se obtienen al inmunizar un animal huésped con
péptidos que comprenden la totalidad o una porción de la proteína
CTLA-4. Los animales huésped adecuados incluyen
ratón, rata, oveja, cabra, hámster, conejo, etc. El origen del
inmunógeno proteico puede ser de ratón, humano, rata, mono, etc. El
animal huésped en general es de una especie diferente que el
inmunógeno, se usa CTLA-4 murino para inmunizar
hámsteres, CTLA-4 humano para inmunizar ratones,
etc. El CTLA-4 humano y murino contiene extensiones
altamente conservadas en el dominio extracelular (Harper et
al. (1991) J. Immunol. 147:1037-1044). Los
péptidos derivados de dichas regiones altamente conservadas se
pueden usar como inmunógenos para generar anticuerpos con enlaces
cruzados específicos.
El inmunógeno puede comprender la proteína
completa, o fragmentos y sus derivados. Los inmunógenos preferidos
comprenden la totalidad o una parte del dominio extracelular de
CTLA-4 humano (residuos de aminoácido
38-161), en donde dichos residuos contienen las
modificaciones posteriores a la traducción tales como glucosilación,
que se encuentra en CTLA-4 nativo. Los inmunógenos
que comprenden el dominio extracelular son producidos de diversas
formas conocidas en la técnica, por ejemplo la expresión de genes
clonados mediante el uso de métodos convencionales recombinantes,
aislamiento de células T, poblaciones celulares seleccionadas que
expresan niveles elevados de CTLA- 4, etc.
Cuando se desea la expresión de una proteína
recombinante o modificada, se usa un vector que codifica la porción
deseada de CTLA-4. En general, se diseña un vector
de expresión de manera tal que el dominio extracelular de la
molécula de CTLA-4 esté en la superficie de una
célula transfectada o alternativamente el dominio extracelular es
secretado de la célula. Cuando el dominio extracelular se secreta,
la secuencia codificadora para el dominio extracelular será
fusionada, en marco, con secuencias que permiten la secreción,
incluso un péptido señal. Los péptidos señal pueden ser exógenos o
nativos. Una proteína de fusión de interés para la inmunización se
une al dominio CTLA-4 extracelular de la región
constante de una inmunoglobulina. Por ejemplo, se puede usar una
proteína de fusión que comprende el dominio extracelular de
CTLA-4 murino unido al dominio de la región bisagra
de Cg 1 humano (bisagra -CH2-CH3) para inmunizar
hámsteres.
Cuando se quiere expresar CTLA-4
en la superficie de la célula, la secuencia codificadora para el
dominio extracelular se puede fusionar en marco con secuencias
codificadoras de un péptido que se ancla en el dominio extracelular
dentro de la membrana y una secuencia señal. Dichas secuencias de
anclaje incluyen un dominio extracelular CTLA-4
nativo, o dominios extracelulares provenientes de otras proteínas de
superficie celular, por ejemplo CD4, CDB, sIg, etc. Las células
murinas transfectadas con el gen CTLA-4 humano se
pueden usar para inmunizar ratones y generar anticuerpos
específicos para la proteína CTLA-4 humana.
Los anticuerpos monoclonales son producidos
mediante técnicas convencionales. En general, el bazo y los ganglios
linfáticos de un animal huésped inmunizado proveen una fuente de
células plasmáticas. Las células plasmáticas se inmortalizan por
fusión con células de mieloma para producir células de hibridoma. El
sobrenadante del cultivo de hibridomas individuales se analiza
mediante técnicas estándar para identificar los que producen
anticuerpos con la especificidad deseada. Los animales adecuados
para la producción de anticuerpos monoclonales contra la proteína
humana incluyen ratón, rata, hámster, etc. Para generar anticuerpos
contra la proteína murina, el animal en general es un hámster,
cobayo, conejo, etc. El anticuerpo se puede purificar del
sobrenadante de las células de hibridoma o líquido ascítico por
técnicas convencionales, por ejemplo cromatografía por afinidad
mediante el uso de CTLA-4 fijado a un soporte
insoluble, proteína A sefarosa, etc.
El anticuerpo puede ser producido como cadena
única, en lugar de la estructura multimérica normal. Los anticuerpos
de cadena única se describen en Jost et al. (1994) J.B.C.
269:26267-73, y otros. Las secuencias de ADN
codificadoras de la región variable de la cadena pesada y la región
variable de la cadena liviana están ligadas a un espaciador que
codifica al menos aproximadamente 4 aminoácidos de pequeños
aminoácidos neutros, incluso glicina y/o serina. La proteína
codificada por esta fusión permite el ensamblado de una región
variable funcional que retiene la especificidad y la afinidad del
anticuerpo original.
Para uso in vivo, particularmente para
inyección en humanos, es deseable reducir la antigenicidad del
agente bloqueador. Una respuesta inmune de un receptor contra el
agente bloqueador potencialmente reduce el periodo de eficacia de
la terapia. Los métodos para humanizar anticuerpos son conocidos en
la técnica. El anticuerpo humanizado puede ser el producto de un
que tiene genes de región constante de inmunoglobulina humana (ver
por ejemplo las solicitudes de patente internacional WO 90/10077 y
WO 90/04036). Alternativamente, el anticuerpo de interés puede ser
obtenido por ingeniería mediante técnicas de ADN recombinante para
sustituir el CH1, CH2, CH3, los dominios de bisagra, y/o el dominio
de marco con la correspondiente secuencia humana (ver WO
92/02190).
El uso de cADN de Ig para la construcción de
genes de inmunoglobulina quimérica genes es conocido en la técnica
(Liu et al. (1987) P.N.A.S. 84:3439 y (1987) J. Immunol.
139:3521). Se aísla mARN de un hibridoma u otra célula productora
de anticuerpo y se usa para producir cADN. El cADN de interés se
puede amplificar por reacción en cadena de polimerasa mediante
cebadores específicos (patentes de los Estados Unidos N.º 4.683.195
y 4.683.202). Alternativamente, se prepara una biblioteca y se
analiza para aislar la secuencia de interés. La secuencia de ADN
codificadora de la región variable del anticuerpo luego se fusiona
con las secuencias de la región constante. Las Las secuencias de
los genes de las regiones constantes humanas se encuentran en Kabat
et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological
Interest, publicación de N.I.H. n.º 91-3242. Los
genes de la región C humana están fácilmente disponibles de clones
conocidos. La elección de isotipo estará guiada por las funciones
efectoras deseadas, tales como fijación de complemento, o actividad
en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. Los isotipos
preferidos son IgG1, IgG3 e IgG4. Se puede usar cualquiera de las
regiones constantes de las cadenas livianas humanas, kappa o lambda.
El anticuerpo quimérico humanizado luego se expresa mediante
métodos convencionales.
Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo,
tales como Fv, F(ab')2 y Fab por escisión de la proteína
intacta, por ejemplo por escisión con proteasa o química.
Alternativamente se diseña un gen truncado. Por ejemplo, un gen
quimérico que codifica una porción del fragmento F(ab')
incluiría las secuencias de ADN que codifican el dominio CH1 y la
región bisagra de la cadena H, seguido del codón de detención de la
traducción, para dar la molécula
truncada.
truncada.
Las secuencias de consenso de las regiones H y L
J se pueden usar para diseñar oligonucleótidos para usarlos como
cebadores para introducir sitios de restricción útiles en la región
J para la posterior unión de los segmentos de la región V a los
segmentos de la región C humana. El cADN can de la región C se puede
modificar mediante mutagénesis dirigida a sitio para ubicar un
sitio de restricción en la posición análoga de la secuencia
humana.
Los vectores de expresión incluyen plásmidos,
retrovirus, YAC, epitomas derivados de EBV, y similares. Un vector
conveniente es el que codifica una secuencia humana funcionalmente
completa de inmunoglobulina CH o CL, con adecuados sitios de
restricción obtenidos por ingeniería de manera tal que se puede
insertar y expresar fácilmente cualquier secuencia VH o VL. En
dichos vectores, usualmente se produce el empalme entre el sitio
donante del empalme en la región J insertada y el sitio aceptor del
empalme que precede la región C humana, y también en las regiones
de empalme que ocurren dentro de los exones CH humanos. La
poliadenilación y la terminación de transcripción ocurren en sitios
cromosómicos nativos corriente debajo de las regiones codificadoras.
El anticuerpo quimérico obtenido se puede unir a cualquier promotor
fuerte, incluso LTR retrovirales, por ejemplo promotor temprano
SV-40, (Okayama et al. (1983) Mol. Cell. Bio.
3:280), LTR de virus de sarcoma de Rous (Gorman et al.
(1982) P.N.A.S. 79:6777), y LTR de virus de molones murino
(Grosschedl et al. (1985) Cell 41:885); promotores nativos
de Ig, etc.
El agente bloqueador CTLA-4 se
puede usar solo o en combinación con un agente estimulador de
respuesta inmune. Tal como se usa en la presente, un "agente
estimulador de respuesta inmune" se refiere a cualquier agente
que estimula en forma directa o indirecta una respuesta inmune en
combinación con un agente bloqueador CTLA-4. Por
ejemplo, los agentes estimulantes de inmune respuesta incluyen
citoquinas así como diversos antígenos que incluyen antígenos
específicos de tumor y antígenos derivados de patógenos. Además, los
agentes estimulantes de inmune respuesta incluyen células tumorales
transducidas por citoquinas, por ejemplo células tumorales
transducidas con GM-CSF, así como células tumorales
que han sido irradiadas y/o tratadas con un agente quimioterápico
ex vivo o in vivo. Tal como se demuestra en los
ejemplos provistos en la presente, los agentes estimulantes de
inmune respuesta pueden tener significativo efecto sobre el
tratamiento de tumores cuando se usan en combinación con un agente
bloqueador CTLA-4.
En algunas instancias, los restos celulares
provenientes de células tumorales muertas o moribundas proveen una
estimulación de respuesta inmune que se puede combinar in
vivo o ex vivo con un agente bloqueador
CTLA-4. El uso de agentes quimioterápicos es un
ejemplo de producción de un agente estimulante de respuesta inmune
por medios indirectos. El uso de una fuente para irradiar células
tumorales ex vivo o in vivo también constituye un
método que produce indirectamente agentes estimulantes de inmune
respuesta, al igual que la reducción quirúrgica o la
citorreducción, la ablación androgénica (en cáncer de próstata) y la
ablación con estrógenos (en cáncer de mama).
La base para el uso de agentes quimioterápicos y
similares con agentes bloqueadores de CTLA-4 es la
siguiente. Tal como se indica en los ejemplos, el bloqueo de
CTLA-4 trabaja bien con tumores establecidos y
aumenta la inmunogenicidad de las células tumorales irradiadas.
Esto sugiere que el bloqueo CTLA-4 se puede combinar
con métodos más convencionales de tratamiento de cáncer para
producir un efecto sinérgico. Por ejemplo, el bloqueo
CTLA-4 se puede iniciar poco después del tratamiento
con un agente quimioterápico. La dosis de agentes quimioterápicos
se ajusta a un nivel que destruye una cantidad razonable de masa
tumoral y genera restos que actúan como agente para estimular una
respuesta inmune por las células T como consecuencia del bloqueo
CTLA-4. Esto permite dar el agente quimioterápico
en niveles muy inferiores a los ahora usados para obtener la máxima
destrucción de las células tumorales, dado que la respuesta inmune
facilitada por CTLA-4 elimina la masa tumoral
residual. Esto minimiza los efectos secundarios a menudo molestos,
incluso inmunosupresión, asociados con la aplicación convencional
de la quimioterapia. Consideraciones similares se aplican a la
radioterapia y las terapias de ablación. En cáncer de próstata, por
ejemplo, la ablación por andrógenos puede ser seguida de reducción
quirúrgica y bloqueo CTLA-4. La dosis de agente
quimioterápico o radiación usada en conjunción con un agente
bloqueador CTLA-4 de preferencia es inferior a la
mitad, con mayor preferencia entre el 2-20%, y con
aún mayor preferencia es de entre 5-10% de la dosis
utilizada generalmente.
Cuando el agente bloqueador
CTLA-4 es distinto de un anticuerpo contra el
dominio extracelular de CTLA-4 o su fragmento, por
ejemplo el fragmento Fab', dichos agentes bloqueadores se pueden
usar independientemente, es decir sin un agente estimulador de
respuesta inmune. Sin embargo, los agentes bloqueadores de
CTLA-4, especialmente los que consisten de un
anticuerpo contra la porción extracelular de CTLA-4,
de preferencia se usan en combinación con uno o más agentes
estimuladores de respuesta inmune. Los agentes bloqueadores de
CTLA-4 también se pueden usar en conjunción con
tratamiento por radiación y/o quimioterápico que indirectamente
produce agentes estimuladores de respuesta inmune. Dicho uso
combinado puede incluir el uso simultáneo o en secuencia de agente
bloqueador de CTLA-4 y agente estimulador de
respuesta inmune y puede ocurrir en diferentes sitios. Por ejemplo,
el agente bloqueador de CTLA-4 se puede administrar
en un sitio lejano de un tumor después de que el tumor ha sido
irradiado directamente. Alternativamente, se puede usar un agente
quimioterápico para tratar células tumorales en forma local o
sistémica seguido del uso de un agente bloqueador de
CTLA-4.
El tratamiento objeto se puede realizar en
combinación con la administración de citoquinas que estimulan las
células presentadoras de antígeno, por ejemplo factor estimulador de
colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF),
factor estimulador de colonias de macrófagos
(M-CSF), factor estimulador de colonias de
granulocitos (G-CSF), interleuquina 3
(IL-3), interleuquina 12 (IL-12),
etc. Se pueden usar proteínas adicionales y/o citoquinas conocidas
por incrementar la proliferación y secreción de células T, tales
como IL-1, IL-2, B7,
anti-CD3 y anti- CD28 en forma simultánea o en
secuencia con los agentes bloqueadores, a fin de aumentar la
respuesta inmune.
Las células tumorales cuyo crecimiento se puede
reducir por la administración de los agentes bloqueadores objeto
incluyen carcinomas por ejemplo adenocarcinomas, que pueden tener un
sitio de tumor primario en mama, ovario, endometrio, cérvix, colon,
pulmón, páncreas, esófago, próstata, intestino delgado, recto, útero
o estómago; y carcinomas de células pavimentosas, las cuales pueden
tener un sitio primario en pulmones, cavidad oral, lengua, laringe,
esófago, piel, vejiga, cérvix, párpados, conjuntiva, vagina, etc.
Otras clases de tumores que se pueden tratar incluyen sarcomas, por
ejemplo sarcomas miogénicos; neuromas; melanomas; leucemias, ciertos
linfomas, tumores de células trofoblásticas y germinales; tumores
neuroendocrinos y neuroectodérmicos.
Los tumores de interés incluyen los que
presenten antígenos específicos de tumor. Dichos antígenos pueden
estar presentes en un contexto hormonal, expresarse exclusivamente
en las células tumorales, o pueden ser una forma mutada de un
autoantígeno normal, no alterado. El antígeno específico de tumor se
puede administrar con los agentes bloqueadores objeto para
incrementar la respuesta de células T huésped contra las células
tumorales. Dichas preparaciones de antígeno pueden comprender
proteína purificado, o lisados de células tumorales.
Los ejemplos de antígenos de tumor son
citoqueratinas, particularmente citoqueratina 8, 18 y 19, como
antígeno de carcinomas. El antígeno de membrana epitelial (EMA), el
antígeno embrionario humano (HEA-125); los glóbulos
de grasa de leche humana, MBr1, MBr8, Ber-EP4,
17-1A, C26 y T16 son también antígenos de carcinoma
conocidos. La desmina y la actina específica de músculos son
antígenos de sarcomas miogénicos. La fosfatasa alcalina
placentaria, la gonadotropina coriónica humana beta, y la
alfa-fetoproteína son antígenos de tumores de
células trofoblásticas y germinales. El antígeno prostático
específico es un antígeno de los carcinomas de próstata, antígeno
carcinoembrionario de adenocarcinomas de colon.
HMB-45 es un antígeno de melanomas. En cáncer
cervical, se pudieron codificar antígenos útiles mediante virus de
papiloma humano. La cromagranina-A y la
sinaptofisina son antígenos de tumores neuroendocrinos y
neuroectodérmicos. De particular interés son los tumores agresivos
que forman masas tumorales sólidas con áreas de necrosis. La lisis
de dichas células necróticas es una fuente rica de antígenos para
las células presentadoras de antígeno.
La terapia objeto se puede combinar con la
transfección de células tumorales o linfocitos infiltrantes de
tumor con genes que codifican diversas citoquinas o receptores de
superficie celular (ver Ogasawara et al. (1993) Cancer Res.
53:3561-8; y Townsend et al. (1993) Science
259:368-370). Por ejemplo, se demostró que la
transfección de células tumorales con cADN que codifica CD80 conduce
al rechazo de células tumorales transfectadas, y puede inducir
inmunidad a una posterior exposición a células tumorales originales
no transfectadas (Townsend et al. (1994) Cancer Res.
54:6477-6483). La terapia objeto aumenta este
efecto.
Las células T huésped específicas de tumor se
pueden combinar ex vivo con los agentes bloqueadores objeto
y antígenos o células tumorales y reinfundir en el paciente. Cuando
se administran a un huésped, las células estimuladas inducen una
reacción tumoricida que resulta en regresión del tumor. Las células
huésped se pueden aislar de diversas fuentes, tales como ganglios
linfáticos, por ejemplo inguinales, mesentéricos, superficiales
distales, auxiliares, etc.; médula ósea; bazo o sangre periférica,
así como del tumor, por ejemplo linfocitos infiltrantes de tumor.
Las células pueden ser alogénicas o, de preferencia, autólogas. Para
la estimulación ex vivo, las células huésped se extraen
asépticamente y se suspenden en cualquier medio adecuado, como es
conocido en la técnica. Las células son estimuladas por cualquiera
de diversos protocolos, particularmente combinaciones de B7,
anti-CD28, etc., en combinación con los agentes
bloqueadores. Las células estimuladas se reintroducen en el huésped
por inyección, por ejemplo intravenosa, intraperitoneal, etc. En
diversas formulaciones farmacéuticas, incluyendo aditivos tales
como aglutinantes, rellenos, portadores, conservantes, agentes
estabilizantes, emulsionantes y buffer. Los diluyentes y
excipientes adecuados son agua, solución salina, glucosa y
similares.
De particular interés son los tumores poco
inmunogénicos y no inmunogénicos, los cuales representan desafíos
especiales debido a su incapacidad para proporcionar adecuada
estimulación antigénica para provocar una respuesta inmune. En
estos casos, un autoantígeno común al tejido normal y canceroso
puede ser el blanco, o alternativamente productos génicos normales
con distribución celular altamente restringida. En este aspecto de
la invención, se administra una preparación de autoantígeno en
combinación con los agentes bloqueadores de CTLA-4
para ayudar a estimular una respuesta autorreactiva a células T
periféricas contra las células que expresan el autoantígeno o
producto génico.
La preparación de autoantígeno puede comprender
una mezcla de antígenos, tales como lisados tumorales o vacunas de
células tumorales irradiadas, así como antígeno purificado que
comprende un autoantígeno específico de interés (por ejemplo,
proteína, hidrato de carbono y similares) o una mezcla de
autoantígenos. Un antígeno "purificado" que comprende una
proteína se distingue de la proteína natural en al menos una o más
características. Por ejemplo, la proteína se puede aislar o
purificar de algunas o todas las proteínas y compuestos con los
cuales se asocia normalmente en el huésped de tipo salvaje, y en
consecuencia puede ser sustancialmente puro. Por ejemplo, una
proteína purificada no está acompañada por al menos parte del
material con el cual normalmente se asocia en su estado natural, de
preferencia que constituye al menos aproximadamente 0,5%, con mayor
preferencia al menos aproximadamente 5% en peso del total de
proteínas en determinada muestra. Una proteína sustancialmente pura
comprende al menos aproximadamente 75% en peso de la proteína total,
con al menos aproximadamente 80% de preferencia, y al menos
aproximadamente 90% de particular preferencia.
De preferencia, el autoantígeno es un
autoantígeno específico de tejido. Los autoantígenos que se pueden
usar en la terapia objeto incluyen tirosinasa, trp1, trp2,
melanA/MART 1, gp 100 y otras proteínas que intervienen en la
síntesis de melanina; antígeno específico prostático (PSA),
fosfatasa ácida prostática (PAP), antígeno de membrana específico
de próstata (PMSA), antígeno de células prostáticas (PSCA),
productos génicos de prostasa u otro gen específico de próstata;
Her2/neu u otros productos génicos específicos de mama. Otros
autoantígenos que sirven como blancos para las respuestas inmunes
generados por la terapia objeto se pueden identificar por métodos
bien conocidos en la técnica, tales como clonación de expresión, a
fin de permitir la inmunización contra antígenos definidos de
distribución conocida y proveer una respuesta inmune más focalizada.
Alternativamente, la preparación del antígeno puede comprender
autoantígeno o antígenos modificados o un antígeno xenogénico (por
ejemplo, la correspondiente versión murina de un antígeno human de
interés) a fin de asistir en la ruptura de la tolerancia inmune al
autoantígeno.
Los agentes estimuladores de respuesta inmune
antes reseñados también se pueden incorporar en la terapia objeto
para aumentar la respuesta al autoantígeno. En una forma de
realización preferida, por ejemplo, la preparación de antígeno
comprende vacunas contra el tumor que comprenden células tumorales
irradiadas transducidas con genes de interés, tales como genes que
codifican las citoquinas que estimulan las células presentadoras de
antígeno, por ejemplo factor estimulante de colonias de
granulocitos-macrófagos (GM-CSF),
factor estimulante de colonias de macrófagos
(M-CSF), o factor estimulante de colonias de
granulocitos (G-CSF). Las terapias más
convencionales tales como quimioterapia, radioterapia o ablación con
andrógenos también se pueden emplear para inducir suficiente muerte
de células tumorales para lograr cierta imprimación de las células T
reactivas de tumor, tal como se analizó con anterioridad. De modo
similar, también se pueden usar estrategias alternativas de
coestimulación tales como células dendríticas pulsadas con péptidos
o ARN para proveer inmunización en el contexto de un potente APC, o
anticuerpos anti-CD40 para mejorar la expresión de
ligandos coestimuladores en las APC.
El tratamiento provee un método para romper la
tolerancia inmune y montar una respuesta citotóxica efectiva y
controlada contra un autoantígeno o antígeno deseado. Esta terapia
inmunológica hallará particular uso con tumores tales como
melanoma, cáncer de mama, cáncer testicular, cáncer de ovario,
cáncer de próstata y similares, en donde la pérdida o modificación
de parte o todo el tejido normal es un efecto secundario aceptable,
o incluso deseable. Alternativamente, se puede usar el tratamiento
para mejorar o efectuar la ablación del antígeno de un tejido
seleccionado, como medida preventiva contra el desarrollo de cáncer
o por otras causas médicas. Un método inmunológico de ablación
tisular selectiva ofrece considerables ventajas sobre métodos
quirúrgicos más invasivos.
La administración de los agentes bloqueadores
objeto puede estar contraindicada para ciertos linfomas. En
particular, los linfomas de células T pueden no tener beneficio del
aumento de la activación. El antígeno CD80 se expresa fuertemente
en las células de Reed-Sternberg en la enfermedad de
Hodgkin, las cuales frecuentemente están rodeadas por células T que
expresan CD28 (Delabie et al. (1993) Blood
82:2845-52). Se ha sugerido que la función celular
accesoria de las células de Reed-Sternberg conduce a
la
\hbox{activación de las células T, y contribuye al síndrome
de Hodgkin.}
Muchas terapias de cáncer convencionales, tales
como quimioterapia y terapia de radiación, reducen severamente las
poblaciones de linfocitos. Si bien la terapia objeto puede aliviar
esta inmunosupresión en cierto grado, un curso preferido de
tratamiento combinado usará dichas terapias linfotóxicas antes o
después de la terapia objeto.
Los coadyuvantes potencian la respuesta inmune a
un antígeno. Los agentes bloqueadores de CTLA-4 se
usan como coadyuvantes para incrementar la activación de células T,
y aumentar el cambio de clase de las células productoras de
anticuerpo, por lo que se incrementa la concentración de anticuerpos
de clase IgG producidos en respuesta al inmunógeno. Los agentes
bloqueadores se combinan con un inmunógeno en un medio
fisiológicamente aceptable, de acuerdo con técnicas convencionales
para emplear coadyuvantes. El inmunógeno se puede combinar en una
única formulación con el agente bloqueador o se puede administrar
por separado. Los inmunógenos incluyen polisacáridos, proteínas,
fragmentos de proteínas, haptenos, etc. De particular interés es el
uso con inmunógenos peptídicos. Los inmunógenos peptídicos pueden
incluir antígenos tumorales y antígenos virales o sus fragmentos,
tal como se describió con anterioridad.
El uso de los agentes bloqueadores objeto en
conjunción con la inmunización genética también es de interés. Se
inyecta ADN de vector de expresión que codifica un vector que
codifica un péptido o antígeno proteico de interés en el animal
huésped, en general en el músculo o la piel. Los productos génicos
se glucosilan correctamente, se pliegan y son expresados por la
célula huésped. El método es ventajoso cuando los antígenos son
difíciles de obtener con la pureza deseada, la cantidad o la forma
glucosilada correcta o cuando sólo se conocen las secuencias
génicas. Generalmente, se inyecta ADN en los músculos o se provee
recubierto en micropartículas de oro en la piel mediante un
dispositivo de bombardeo de partículas, una "pistola génica".
La inmunización génica ha demostrado la inducción de una respuesta
inmune específica humoral pero también una respuesta inmune celular
de reacción más amplia en modelos animales de cáncer, micoplasma,
TB, malaria, y muchas infecciones virales que incluyen gripe y HIV.
Ver, por ejemplo, Mor et al. (1995) J Immunol 155:
2039-46; Xu y Liew (1995)
\hbox{Immunology
84:173-6; y Davis et al , (1994) Vaccine
12:1503-9.}
Se pueden emplear diversos métodos para la
administración. La formulación de agentes bloqueadores de
CTLA-4 se puede inyectar por vía intravascular,
subcutánea, peritoneal, etc. Las dosis de la formulación terapéutica
varían ampliamente, según la naturaleza de la enfermedad, la
frecuencia de administración, la forma de administración, el objeto
de la administración, la depuración del agente del huésped, y
similares. La dosis administrada variará según factores conocidos,
tales como las características farmacodinámicas del agente
particular, el modo y la vía de administración, la edad, la salud y
el peso del receptor, la naturaleza y la extensión de los síntomas,
los tratamientos concurrentes, la frecuencia de tratamiento y el
efecto deseado. La dosis se puede administrar con tan poca
frecuencia como semanalmente o quincenalmente, o fraccionar en dosis
más pequeñas y administrar diariamente, dos veces por semana, etc.
A fin de mantener un nivel de dosis efectivo. En general, una dosis
diaria de ingrediente active puede ser de aproximadamente 0,1 a 100
mg/kg de peso corporal. Las formas de dosificación adecuadas para
la administración interna en general contiende de aproximadamente
0,1 mg a 500 mg de ingrediente activo por unidad. El ingrediente
activo puede variar de 0,5 a 95% en peso sobre la base del peso
total de la composición.
En algunos casos puede ser deseable limitar el
periodo de tratamiento debido a la excesiva proliferación de
células T. Las limitaciones se determinarán empíricamente, según la
respuesta del paciente a la terapia, la cantidad de células T en el
paciente, el tipo de antígeno dirigido por la terapia objeto, etc.
La cantidad de células T puede ser monitoreada en un paciente por
métodos conocidos en la técnica, incluso la tinción con anticuerpos
específicos para células T y citometría de flujo.
Los bloqueadores de CTLA-4 se
preparan como formulaciones en una dosis efectiva en medios
farmacéuticamente aceptables, por ejemplo solución salina normal,
aceites vegetales, aceite mineral, PBS, etc. Las preparaciones
terapéuticas pueden incluir líquidos fisiológicamente tolerables,
portadores de gel o sólidos, diluyentes, coadyuvantes y
excipientes. Los aditivos pueden incluir agentes bactericidas,
aditivos que mantienen la isotonicidad, por ejemplo NaCl, manitol;
y estabilidad química, por ejemplo buffer y conservantes, o
similares. Los bloqueadores de CTLA-4 se pueden
administrar como cóctel, o como agente único. Para la administración
parenteral, el agente bloqueador se puede formular como solución,
suspensión, emulsión o polvo liofilizado en asociación con un
vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. También se pueden
usar liposomas o vehículos no acuosos, tales como aceites fijos. La
formulación se esteriliza por técnicas conocidas en la técnica.
El efecto funcional del bloqueo de
CTLA-4 también se puede inducir por la
administración de otros agentes que simular el cambio de las
señales intracelulares observado con la invención objeto. Por
ejemplo, es sabido que quinasas citoplasmáticas específicas pueden
ser activadas en respuesta a la fijación de receptores
extracelulares. Los agentes que bloquean la actividad de quinasa
tendrían un efecto fisiológico similar al bloqueo de la fijación
del receptor. De manera similar, los agentes que incrementan las
concentraciones de AMPcíclico, GTP y los niveles intracelulares de
calcio pueden producir efectos fisiológicos que son análogos a los
observados la fijación extracelular de receptor.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de
ilustración y no de limitación. Sólo el Ejemplo 10 contiene un
ejemplo de tratamiento de metástasis establecida.
Ejemplo
1
Se obtuvo una proteína de fusión que comprende
las porciones extracelulares del gen murino de
CTLA-4 y la región constante de IgGI humana,
denominada mCTLA4-Hgl, de los Dr. P. Lane y K.
Karjalainen (Basel Institute for Immunology, Basilea, Suiza). Se
construyó un vector de expresión capaz de expresar la proteína
mCTLA4-Hg 1 tal como se describió [Lane, et
al. Immunol. 80:56 (1993)]. Brevemente, se generaron las
secuencias codificadoras de las porciones extracelulares de la
molécula de CTLA-4 murino mediante PCR. El siguiente
par de cebadores se usó para amplificar estas secuencias de
CTLA-4 a partir de un plásmido que contiene
secuencias de CTLA-4 de ratón:
5'-TTACTCTACTCCCTGAGG
AGCTCAGCACATTTGCC-3'(SEQ ID NO:1) y
5'-TATACTTACCAGAATCCG GG
CATGGTTCTGGATCA-3' (SEQ ID NO:2). Las secuencias amplificadas CTLA-4 luego se insertaron en un vector de expresión que permite la inserción de un gene de interés corriente arriba de las secuencias que codifican los dominios de la bisagra, CH2 y CH3 de la proteína humana IgG1 [Traunecker, et al. Trends Biotech. 9:109 (1991)]. Cada cebador contenía sitios de restricción apropiados para subclonar en el vector de expresión de IgG1 humana, junto con un sitio donante de empalme 3' dentro del cebador 3' para empalmarse en los exones de la Ig humana correctamente. El plásmido que contiene las secuencias codificadoras de la proteína de fusión mCTLA-4-Hgl se denominó pH \beta-APr-1-neo-mCTLA4-Hgl. La secuencia de aminoácidos de la proteína mCTLA4- Hgl está listada en SEQ ID NO:3.
CATGGTTCTGGATCA-3' (SEQ ID NO:2). Las secuencias amplificadas CTLA-4 luego se insertaron en un vector de expresión que permite la inserción de un gene de interés corriente arriba de las secuencias que codifican los dominios de la bisagra, CH2 y CH3 de la proteína humana IgG1 [Traunecker, et al. Trends Biotech. 9:109 (1991)]. Cada cebador contenía sitios de restricción apropiados para subclonar en el vector de expresión de IgG1 humana, junto con un sitio donante de empalme 3' dentro del cebador 3' para empalmarse en los exones de la Ig humana correctamente. El plásmido que contiene las secuencias codificadoras de la proteína de fusión mCTLA-4-Hgl se denominó pH \beta-APr-1-neo-mCTLA4-Hgl. La secuencia de aminoácidos de la proteína mCTLA4- Hgl está listada en SEQ ID NO:3.
Para expresar la proteína
mCTLA4-Hgl, se transfectó el vector de expresión pH
\beta-APr-1-neo-mCTLA4-Hgl
en la línea de plasmacitoma murino, J558L (J558L es idéntico a la
línea celular J558 disponible de ATCC [ATCC TIB 6]) mediante la
técnica estándar de fusión de protoplasto. Las células J558L se
cultivaron con 5 x 10^{4} células/ml. Las células J558L
transfectadas luego se seleccionaron en presencia de medio que
contiene xantina (Sigma) y ácido micofenólico (Calbiochem, LaJolla,
CA) (medio selectivo). El medio selectivo se aplicó 24 h después de
la transfección y se analizaron los clones positivos (es decir los
clones que crecieron en el medio selectivo) dos semanas más tarde.
Los clones que secretaban la proteína de fusión se identificaron
mediante un ELISA para IgG1 humana. Se detectó un clon buen
secretor y se designó clon n.º 15. Las células del clon n.º 15 se
rotularon metabólicamente con [^{35}S]metionina y las
proteínas secretadas se inmunoprecipitaron con proteína A y las
proteínas precipitadas se resolvieron en un SDS de gel de
poliacrilamida. Se halló que la proteína mCTLA4-Hgl
migra en los geles de SDS-PAGE como un monómero de
aproximadamente 60.000 MW en condiciones reductoras y como dímero
en condiciones no
reductoras.
reductoras.
Se obtuvieron preparaciones purificadas de
proteína mCTLA4-Hg 1 cromatografía por afinidad de
sobrenadantes de cultivo de células del clon n.º 15 en una columna
de proteína A-Sefarosa (Zymed, South San Francisco,
CA). Brevemente, se cultivaron células J558 que expresan la
proteína mCTLA4-Hgl en IMDM suplementado con 5% de
FCS, glutamina, 2ME y antibióticos. Los sobrenadantes de cultivo se
recolectaron de las células y se centrifugaron a 1500 x g para
extraer cualquier remanente de células y el sobrenadante clarificado
se filtró por un tamaño de poro de 0,4 micrómetros. El sobrenadante
filtrado se ajustó a pH 8,5 mediante 1 N de NaOH; el sobrenadante
luego se pasó por una columna de 2 ml (volumen empaquetado) de
proteína A-Sefarosa a una velocidad de flujo de 2
ml/min. Cabe destacar que la línea celular J558 produce una
inmunoglobulina adicional (es decir además de la proteína de fusión
CTLAIg murina) que se fija a la proteína G; en consecuencia, no se
recomienda el uso de resinas de proteína G para la purificación de
la proteína mCTLA4- Hgl de células J558 transfectadas.
La columna de proteína A se lavó con 20 a 30
volúmenes de columna de PBS y la proteína de fusión se eluyó con 50
mM de dietilamina (pH 11,0). Se juntaron fracciones de dos
mililitros en tubos que contenían 0,2 ml de 1M de
Tris-HCl para neutralizar el pH de la muestra. Se
determinó la absorbancia a 280 nm y se usó para evaluar la
concentración de proteína de cada fracción. Las fracciones que
contenían proteína se combinaron y se dializaron durante la noche
contra 2 a 3 cambios de PBS (1 litro por cambio). Se confirmó la
presencia de proteína mCTLA4-Hgl por
SDS-PAGE, que mostró una banda de aproximadamente 40
kD (el peso molecular previsto de la proteína de fusión). Además,
se analizó la proteína purificada mCTLA4-Hgl en un
ELISA usando un anticuerpo antihumano de IgG1 (HP6058; el hibridoma
HP6058 (ATCC CRL 1786) se usó como fuente de anticuerpos
HP6058).
Para inmunizar hámsteres con la proteína de
fusión murina CTLA-4, se usó proteína purificada
mCTLA4-Hgl (en adelante referida como
CTLA-4Ig) para recubrir células bacterianas muertas
por calor de Staphylococcus aureus (StaphA) (Calbiochem,
LaJolla, CA). Hámsteres Golden Sirian de seis semanas de edad
(Harlan Sprague Dawley, Indianápolis, IN) se inyectaron en la
plantilla de la pata con 50Pl (volumen empaquetado) de bacterias
StaphA muertas por calor recubiertas con aproximadamente 100 \mug
de CTLA-4Ig suspendidas en 0,2 ml de PBS. Las
células StaphA se recubrieron como sigue.
Las células StaphA se prepararon de acuerdo con
el protocolo del fabricante a una concentración de 10% p/v en
solución salina (0,9% de NaCI). Un ml de la suspensión de células
bacterianas se centrifugó a 1.400 x g para sedimentar las bacterias
y se extrajo el sobrenadante. Se agregó 1 ml de solución que
contiene aproximadamente 100 \mug de CTLA-4Ig
purificada en PBS al sedimento y la mezcla se incubó a 37ºC durante
2 horas con agitación. Las bacterias luego se sedimentaron por
centrifugación tal como se describió con anterioridad; el sedimento
se lavó dos veces con 1 ml de PBS/lavado. Las células bacterianas
recubiertas con CTLA-4Ig luego se resuspendieron en
aproximadamente 200 \mul de PBS; se inyectaron 50 \mul de esta
preparación en cada almohadilla de la pata.
Se aplicó un total de cinco inyecciones por
hámster. El día del refuerzo final y anterior a la inyección, se
obtuvo aproximadamente 100 \mul de suero por sangrado intraocular
realizado en la oficina del personal de cuidado de animales de
laboratorio (Univ. de Calif, Berkeley). Este suero se analizó en
comparación con el suero obtenido por la metodología idéntica
anterior a la primera inyección.
Se utilizó un ELISA de fijación de
CTLA-4Ig para demostrar la presencia de anticuerpo
que reconoce la proteína de fusión CTLA- 4Ig en el sangrado
posinmunización. El ELISA fijador de CTLA-4Ig se
condujo como sigue. Se usó proteína de fusión
CTLA-4Ig o proteína de fusión CD4Ig para recubrir
las cavidades de placas de ELISA de base plana modificadas de 96
cavidades (Corning, Corning, NY).
CD4Ig es una proteína de fusión que consiste del
dominio extracelular de CD4 murino y los dominios de bisagra, CH2 y
CH3 de IgG1 humana [Traunecker et al., supra.]; se usó
la proteína CD4Ig como control negativo en los ensayos por ELISA.
La proteína de fusión CD4Ig se preparó a partir de células
transfectadas J558 y se purificó por cromatografía por afinidad en
proteína A Sefarose tal como se describió para la proteína de fusión
mCTLA4-H\mul (es decir CTLA-4Ig)
en la sección (a) anterior.
Se colocaron 50 microlitros de las proteínas de
fusión a una concentración de 1 \mug/ml en 0,4% de gelatina en
PBS en las cavidades. Las placas se incubaron a 37ºC durante
2-3 horas para permitir que las proteínas se
absorbieran; las placas luego se lavaron tres veces con 150 \mul
de 0,9% de NaCl que contiene 0,05% de Tween-20.
Entonces se bloqueó el resto de los sitios de fijación de la
proteína en las cavidades con 0,4% de gelatina en PBS (buffer de
bloqueo) durante 30 min a 37ºC; después de la etapa de bloqueo se
lavaron las placas dos veces con 0,9% de NaCl que contiene 0,05% de
Tween-20. Se añadieron 50 microlitros de la solución
que contiene anticuerpos
anti-CTLA-4 (es decir suero de los
hámsteres inmunizados, anticuerpos purificados o sobrenadantes de
cultivo) en cavidades por triplicado y las placas se incubaron
durante 2-3 horas a 37ºC. Para evaluar la cantidad
de anticuerpos anti-CTLA-4 presentes
en el suero de hámsteres inmunizados, se analizó el sangrado
inicial posterior a la inmunización usando diluciones que variaban
entre 1:1000 y 1:100 (diluido en PBS que contiene 0,4% de
gelatina).
Las cavidades luego se lavaron tres veces usando
150 \mul de 0,9% de NaCl que contiene 0,05%
Tween-20. Se agregaron 50 microlitros de una
solución que contiene suero de cabra antihámster IgG policlonal
conjugado con peroxidasa de rábano (CalTag, South San Francisco,
CA) en una concentración de 1 \mug/ml en buffer de bloqueo a las
cavidades y las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Las
placas luego se lavaron cuatro veces con 0,9% de NaCl que contiene
0,05% de Tween-20. Se añadió una solución que
contiene 0,55 mg/ml de ABTS ácido
2,2'-azino-bis
(3-etilbenztiazolin-6-sulfónico)]
en buffer citrato [0,1 M de ácido cítrico (pH 4,35)] y las placas
se incubaron durante aproximadamente 20 min a 37ºC. Luego se leyeron
las placas a 405 nm con un lector de placa BioTech (Beckman
Instruments, Palo Alto, CA) para evaluar la absorbancia del producto
de reacción verde.
Los resultados de ELISA de fijación de
CTLA-4Ig demostraron la presencia de anticuerpo que
reconocía la proteína de fusión CTLA- 4Ig en el sangrado posterior
a la inmunización con diluciones de suero 1000 veces superiores a
la dilución detectada de fondo en el sangrado previo a la
inmunización.
Tres días después de la inyección final, se
extrajeron los ganglios linfáticos de drenaje de los hámsteres. Se
aislaron los linfocitos de los ganglios linfáticos poplíteos que
drenan las patas traseras. Se prepararon suspensiones celulares de
los ganglios linfáticos aislados como sigue. Los ganglios extraídos
se colocaron en una placa de cultivo de tejidos (Falcon Plastics,
Mountain View, CA) que contiene medio RPMI (GibcoBRL, Gaithersburg,
MD) suplementado con 10% de FCS (BioWhittaker, Walkersville, MD).
Los linfocitos se liberaron de los ganglios mediante molienda suave
de los ganglios con portaobjetos de vidrio helados; se contó la
suspensión de linfocitos mediante un hemocitómetro.
Los linfocitos aislados de los hámsteres
inmunizados se fusionaron a la contrapartida celular de fusión,
P3X3.
Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las células P3X3.Ag8.653 se dividieron 1:20 cada 3 días antes de la fusión en IMDM (Univ. of Calif., San Francisco Tissue Culture Facility) que contiene 20% FCS (suero fetal bovino) (BioWhittaker, Walkersville, MD), 50 PM 2-ME, 50 PM de gentamicina.
Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las células P3X3.Ag8.653 se dividieron 1:20 cada 3 días antes de la fusión en IMDM (Univ. of Calif., San Francisco Tissue Culture Facility) que contiene 20% FCS (suero fetal bovino) (BioWhittaker, Walkersville, MD), 50 PM 2-ME, 50 PM de gentamicina.
La fusión con la línea de mieloma usó una
técnica estándar de fusión de polietilenglicol [McKeam et
al., Immunol. Rev. 47:91 (1979)]. Brevemente, se prepararon
suspensiones de células de linfocitos estériles en medio sin suero
Iscove's Modified Dulbecco's (IMDM). Los linfocitos se lavaron dos
veces con IMDM y se ajustaron a una densidad de 12,5 x 10^{6}
células/ml.
Las células P3X3.Ag8.653 (cultivadas tal como se
describió con anterioridad) se lavaron dos veces con IMDM sin suero
[estas células se centrifugaron durante 5 minutos a 1000 r.p.m. en
una centrífuga TJ-6 (Beckman Instruments, Palo
Alto, CA) a 25ºC para sedimentar las células] y se ajustó la
densidad celular de P3X3.Ag8.653 a 5 x 10^{6} células/ml.
Se mezclaron cuatro mililitros de la suspensión
de células linfocitos con 1 ml de las células lavadas P3X3.Ag8.653
en placas de cultivo de tejido de 60 mm (Falcon). Los discos de
cultivo de tejido se colocaron en portadores de placas de
microtitulación (Beckman Instruments, Palo Alto, CA) y se
centrifugaron a 250 x g (1200 r.p.m.; centrífuga
TJ-6) durante 5 minutos para generar una monocapa
adherente de células en la parte inferior del disco. El
sobrenadante se aspiró de los discos y los discos se inundaron
suavemente con 1 ml de 50% de polietilenglicol (PEG 1500,
Boehringer Mannheim) en IMDM; la solución de PEG se preparó al
calentar 4 ml de PEG 1500 y 4 ml de IMDM por separado en baño de
agua a 60ºC y luego se combinaron por aspiración de PEG en una
pipeta seguido de IMDM y se mezcló bien. Después de 30 segundos a
temperatura ambiente, los discos se inundaron con 5 ml de IMDM sin
suero.
Después del lavado final el día de la fusión,
las células se dejaron en el disco de 60 mm con 5 ml de medio IMDM
que contiene FCS durante 12 horas a 37ºC con 5% de CO_{2}. El día
siguiente, las células fusionadas se diluyeron en 100 ml de IMDM
que contiene 20% de FCS y 1 X de medio HAT (Boehringer Mannheim, NJ)
y se plaquearon 100 \mul por cavidad en placas de base plana de
96 cavidades. Después de 5 y 9 días, se añadieron 50 \mul de
medio adicional a cada cavidad. Luego se extrajeron, 50 \mul de
medio y se añadió medio fresco con intervalos de 3 días. Una vez
que las cantidades de células estaban en el rango de
1000-5000 por cavidad, los sobrenadantes de
hibridoma se analizaron para la reactividad a
CTLA-4Ig y para la falta de reactividad a CD4Ig por
ELISA tal como se describe en la sección (b) anterior. Los
sobrenadantes de hibridoma se usaron sin diluir en ELISA (50
\mul/cavidad).
Los hibridomas de las cavidades positivas se
clonaron repetidas veces por dilución limitante en presencia de
capas de alimentación de timocitos de ratón irradiados. Se
seleccionó una línea de hibridoma que secreta un anticuerpo
monoclonal, denominado anticuerpo 9H 10, según los siguientes
criterios: 1) reactividad contra CTLA-4Ig pero no
CD4Ig en ELISA; 2) la capacidad de bloquear CTLA-4Ig
fijado a transfectantes B7; 3) la capacidad para teñir células T
activadas pero no las células T recién aisladas; y 4) la capacidad
para teñir un transfectante CTLA- 4 pero no los transfectantes
control.
La capacidad del anticuerpo 9H10 para bloquear
la fijación de CTLA4Ig a transfectantes B7 se demostró como sigue.
Aproximadamente 10 \mul de mAb 9H 10 se incubó a 22ºC durante 30
min con 1 \mug de proteína de fusión CTLA-4Ig en
un volumen final de 50 \mul de una solución que comprende PBS. A
esta mezcla se añadió 2 x 10^{5} células
B7-EL-4, suspendidas en 10 \mul de
PBS helado que contiene 1% de suero bovino y 0,05% de azida sódica.
Las células B7-EL-4 son la línea
celular de timoma EL4 derivada de C57BL/6 transfectada con un
vector de expresión codificado por la proteína de superficie B7
murina, tal como se describe en Townsend et al. Cancer Res.
54:6477-83 (1994).
La mezcla obtenida luego se incubó sobre hielo
durante 30 minutos, seguido de dos lavados con 4 ml/lavado de PBS
que contiene 1% suero bovino y 0,05% azida sódica. Las células luego
se tiñeron con IgG antihumano conjugado con isotiocianato de
fluoresceína (FITC) (Caltag, South San Francisco, CA). Como control
negativo para este experimento, se incubó la proteína de fusión
CTLA-41g con un IgG control de hámster o la línea
celular original de EL-4. Las células se analizaron
en FACScan (BectonDickinson, Mountain View, CA); se usó el programa
LYSIS II (Becton Dickinson) como portal electrónico de las
poblaciones relevantes. En la mayoría de los experimentos se
recolectaron 10.000 eventos de portales vivos para el análisis. Los
resultados mostraron que el anticuerpo 9H 10 bloquea la fijación de
CTLA-4 a las células
B7-EL-4.
La capacidad del anticuerpo 9H10 para teñir las
células T activadas pero no las células T recién aisladas se
demostró como sigue. Se generaron esplenocitos frescos y activados.
Se cosecharon y picaron los bazos de ratones BALB/c de 4 a 6
semanas, y se trataron las suspensiones con solución hemolítica de
Gey para extraer las células rojas sanguíneas, una técnica estándar
en el arte [Mishell y Shiigi, Selected Methods in Celular
Immunology, W.H. Freeman y Co., San Francisco (1980) pp,
23-24]. Las células se cultivaron en RPMI que
contiene 10% de suero fetal bovino, con anticuerpo soluble
anti-CD-3 a 10 \mug/ml agregado
para activar una porción de la población celular. La otra porción
de los esplenocitos no se trató con anti-CD3 y
representa los frescos (pero no los esplenocitos activados). Las
dos poblaciones celulares luego se tiñeron con 1) una combinación
de 9H10 conjugado con FITC (el anticuerpo
anti-CTLA-4; 5 \mug de anticuerpo)
y Thil.2 conjugado con PE o 2) una combinación de Ig de hámster
conjugado con FITC y Thil.2 conjugado con PE. Los datos se
analizaron en un FACScan y se obtuvieron los portales para células
Thil.2 positivas para analizar sólo la población celular T
relevante. Los resultados de este experimento demostraron que el
anticuerpo 9H10 tiñe células T activada (es decir que expresan
CTLA-4) pero no las recién aisladas.
La capacidad del anticuerpo 9H10 para teñir un
transfectante CTLA-4 pero no los transfectantes
control se demostró como sigue. Una línea original CHO (ovario de
hámster chino, células CHO-K1) (ATCC CCL 61) se
transfectó con pSRlneo.CTLA-4.
pSRlneo.CTLA-4 contiene todo el cADN de 1,9 kb que
codifica la proteína murina CTLA-4 [Brunet et
al., Nature 328:267 (1987)] insertada en el vector de expresión
pSRlneo. Las células transfectadas con el vector pSRlneo.CTLA
expresan la proteína murina CTLA-4 en la superficie
celular.
Las células originales (es decir, células
CHO-K1) y las células transfectadas se tiñeron con
1) una combinación de FITC conjugado con 9H 10 (el anticuerpo
anti-CTLA-4; 5 \mug de anticuerpo)
y PE conjugado con Thil.2 o 2) una combinación de Ig de hámster
conjugado con FITC y PE conjugado con Thi1.2. Los datos se
analizaron electrónicamente para células Thi1.2 positivas para
analizar sólo la población celular T relevante. Los resultados de
este experimento demostraron que el anticuerpo 9H 10 tiñe
CTLA-4 transfectantes pero no los transfectantes
control.
Los resultados anteriores demostraron que el
anticuerpo monoclonal 9H 10 reacciona específicamente con la
proteína CTLA- 4 murina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El anticuerpo monoclonal CTLA-4
antimurino, 9H10, se usó para tratar ratones que recibieron
inyecciones de una línea celular de carcinoma de colon. La
inyección de mAb 9H10 junto con células tumorales V51BLim 10 dio
por resultado el completo rechazo de las células tumorales en los
animales de experimentación. En contraste, los ratones inyectados
con un mAb anti-CD28 y células V51BLim 10 o ratones
inyectados con células V51BLim10 solas desarrollaron tumores que
exhibieron un incremento constante del tamaño promedio de tumor
durante un periodo de cuatro semanas.
La línea celular V51BLim10 se generó por
transfección del vector de expresión SRlneo en la línea celular 5
1BLim10. La línea celular 5 1BLim es una línea celular de carcinoma
de colon que provee un modelo animal exacto para metástasis de
cáncer de colon en humanos. Bresalier, et al., Cancer Res.
47:1398 (1987).
La línea celular V51BLim10 usada en el presente
experimento se generó como sigue. La línea celular de cáncer de
colon murino 51B establecida por Corbett et al., Cancer Res.
35:2434-9 (1975) fue inyectada en la pared cecal de
ratones BALB/c; se halló que los tumores colónicos obtenidos hacían
metástasis espontáneamente en el hígado en una minoría de los
ratones inyectados. Bresalier et al., Cancer Res. 47:1398
(1987). Las líneas celulares que tenían actividad metastático en
progresivo incremento fueron desarrolladas al recolectar las
células de las metástasis originales, las cuales luego se usaron
para la sucesiva reinyección en el ciego de otros ratones. Estas
líneas celulares se denominaron 51BLim-1 a
51BLim-5 en donde el número que sigue al guión se
refiere a la cantidad de ciclos de metástasis.
Un derivados metastático 51B obtenido del Dr.
Warren de la Universidad de California San Francisco fue designada
51BLim 10; la línea celular 51 BLim 10 correspondes a la línea
celular 51BLiM5 descrita por Bresalier, et al., Cancer Res.
47:1398 (1987).
El vector de expresión SR1neo fue transfectado a
la línea celular 51 BLiM-10 para generar la célula
V51BLim10 tal como se describe [Townsend et al. Cancer Res.
54:6477-83 (1994)]. El vector de expresión SR1neo
(obtenido de L. Lanier en ADNX Research Institute of Molecular and
Celular Biology, Palo Alto, CA) permite la expresión de un gene de
interés bajo el control de transcripción de HTLV-1
LTR. El vector de expresión SR1neo también contiene el gen neo bajo
el control de transcripción del promotor/mejorador SV40. La
presencia del gen neo gene permite seleccionar células que
contienen el vector SRlneo.
El vector de expresión SRlneo fue transfectado
en células 51 BLiM-10 por electroporación con un
electroporador BTX T 800 (BTX, Inc., San Diego, CA). Se aplicaron
cinco pulsos de 99 \mus cada uno a 450 o 600 V. La electroporación
se llevó a cabo en un volumen final de reacción de 750 \mul de
una solución que comprende 270 mM de sacarosa, 7 mM de NaPO4 (pH
7,4), 1 mM de MgCl2, 5 x 10^{6} células 51B LiM-10
y 50 \mug del vector de expresión SRlneo. Después de la
electroporación, las células se cultivaron durante 24 horas en medio
completo [Eagle's MEM (Univ. of Calif. at San Francisco Cell
Culture Facility, San Francisco, CA) suplementado con 10% de FCS
(Sigma), aminoácidos no esenciales, solución MEM de vitamina,
L-glutamina, piruvato de sodio, gentamicina (todos
de Irvine Scientific, Santa Ana, CA) y 7,5% de bicarbonato de sodio
(Sigma)] a 37ºC. Se usó medio de selección [medio completo que
contiene 1 mg/ml de Geneticina (G418 de sulfato, GIBCO, Grand
Island, NY)]. Después de 14 días de cultivo en el medio de
selección, se juntaron las células resistentes a fármacos y se
usaron en posteriores experimentos como la población policlonal
referida como V51BLim10.
Las células tumorales V51BLim10 se mantuvieron
en Eagle MEM (Univ. of Calif. at San Francisco Cell Culture
Facility, San Francisco, CA) suplementado con 10% FCS (Sigma),
aminoácidos no esenciales, solución de vitamina MEM,
L-glutamina, piruvato de sodio, gentamicina,
penicilina- estreptomicina (todos de Irvine Scientific, Santa Ana,
CA) y 1 mg/ml de Geneticina. Los cultivos celulares se establecieron
de alícuotas congeladas de pocos pasajes (es decir menos de 10
pasajes) y se mantuvieron en cultivo durante no más de 30 días antes
del uso.
Se halló que las células V51BLim10 y las células
originales 51BLim10 exhiben tasas de crecimiento similares in
vitro e in vivo. La expresión del gen de resistencia a
neomicina en las células V51BLim10 y una variedad de otras líneas
celulares de tumor no tuvo ningún efecto sobre la tumorigenicidad o
la tasa de crecimiento de los tumores provenientes de las células
inyectadas.
Las células tumorales V51BLim10 fueron
cosechadas de las placas de cultivo de tejido con
tripsina-EDTA (Sigma), se lavaron tres veces en
medio sin suero (Eagle's MEM) y se suspendieron en una concentración
de 2 x 10^{7} células/ml.
Los ratones usados en este experimento eran
ratones hembra BALB/c de 6-8 semanas (Charles River
Laboratories, Wilmington, MA). Grupos de cinco ratones fueron
anestesiados por inhalación de metoxiflurano, se marcaron las
orejas para la identificación, y se inyectaron con 200 \mul de
suspensión de células tumorales V51BLim10 (4 x 10^{6}) por vía
subcutánea en el flanco izquierdo. Los grupos tratados recibieron
100 \mug inyecciones intraperitoneales de mAb
antiCTLA-4 9H10 antes descrito, o alternativamente
el mAb anti-CD28, 37, 51, el mismo día, y otras
inyecciones de 50 \mug i.p. los días 3 y 6 posteriores a la
inyección de las células tumorales (designadas por las flechas
oscuras en la Figura 1). El anti-CD28 monoclonal,
37,51, está dirigido contra la proteína murina CD28 [Gross et
al., J. Immunol. 149:380 (1992)] y sirvió como control
negativo.
\newpage
Se monitorearon los ratones respecto del
crecimiento subcutáneo del tumor y se midieron los diámetros
bisectrices de los tumores en desarrollo con calibres. Todos los
ratones no tratados, o tratados con anticuerpo
anti-CD28 desarrollaron tumores de crecimiento
progresivo y requirieron eutanasia 35 días después de la
inoculación. En contraste, todos los ratones tratados con
anticuerpo anti-CTLA-4 rechazaron
completamente sus tumores después de un corto periodo de
crecimiento limitado. Tal como se muestra en la Figura 1A, el área
promedio de tumor en mm^{2} (mostrado a lo largo del eje)
disminuyó gradualmente a partir de aproximadamente el día 14
posterior a la inyección del tumor (mostrado a lo largo del eje x),
disminuyendo a cero aproximadamente el día 24. El tratamiento con
anti-CTLA-4 era menos efectivo con
menores dosis de tumor. La Figura 1B muestra el tamaño promedio de
tamaño de tumor en ratones inyectados con 2 x 10^{6} células
tumorales y tratados tal como se describió antes con anticuerpo
anti-CTLA-4 o un anticuerpo
irrelevante de hámster. El tratamiento con anticuerpo
anti-CTLA-4 continuó teniendo un
efecto notable sobre el crecimiento del tumor, pero un ratón
desarrolló un tumor rápidamente, y otro mucho más tarde. La Figura
1C ilustra el crecimiento individual de los tumores en ratones
inyectados con 2 x 10^{6} de células V51BLim10. Tres de los
ratones se mantuvieron sin tumores más de 80 días. Es obvio que el
bloqueo de CTLA-4 mejora significativamente el
rechazo de las células tumorales B7 negativas.
Células 51BLim10 fueron transfectadas tal como
se describió antes, con un plásmido que contiene el gen de
B7-1 murino, y se clonaron por dilución limitante.
Las células tumorales B7-51BLim10 se cosecharon de
placas de cultivo de tejidos con tripsina-EDTA
(Sigma), se lavaron tres veces en medio sin suero (Eagle's MEM) y
se suspendieron en una concentración de 2 x 10^{7}.
Los ratones usados en este experimento eran
ratones hembra BALB/c de 6-8 semanas (Charles River
Laboratories, Wilmington, MA). Grupos de cinco ratones fueron
anestesiados por inhalación de metoxiflurano, se marcaron las
orejas para la identificación, y se inyectaron con 100 \mul de
suspensión de células tumorales B7-51BLim10 (4 x
10^{6}) por vía subcutánea en el flanco izquierdo. Los grupos
tratados recibieron 100 \mug inyecciones intraperitoneales de mAb
anti-CTLA-4 9H10 antes descrito, o
alternativamente el mAb anti-CD28, 37,51. Se
aplicaron Inyecciones de 100, 50 y 50 \mug los días 0, 3 y 6,
respectivamente (los días de inyección están designados por las
flechas oscuras en la Figura 2). El anti-CD28
monoclonal, 37,51, está dirigido contra la proteína murina CD28
[Gross et al., J. Immunol. 149:380 (1992)] y sirvió como
control negativo.
Se monitorearon los ratones respecto del
crecimiento subcutáneo del tumor y se midieron los diámetros
bisectrices de los tumores en desarrollo con calibres. Los datos de
este experimento se muestran en la Figura 2. El tratamiento con
anticuerpo anti-CTLA-4 inhibió el
crecimiento tumoral de B7-51BLim10 comparado con los
grupos anti-CD28 y control. Todos los ratones no
tratados, o tratados con anticuerpo anti-CD28
desarrollaron tumores de crecimiento progresivo durante 5 a 10 días
y luego finalmente mostraron regresión en ocho de los diez ratones
aproximadamente el día 23 posterior a la inyección. Los dos tumores
pequeños que no mostraron regresión permanecieron estáticos durante
más de 90 días. En contraste, 3 de los 5 ratones tratados con
anticuerpo anti-CTLA-4 desarrollaron
tumores muy pequeños, y todos mostraron regresión completa al día
17.
Cinco ratones tratados con
anti-CTLA-4 que habían rechazado
completamente las células tumorales V51BLim10 fueron expuestos
nuevamente 70 días después con 4 x 10^{6} células tumorales
51BLim10 de tipo salvaje inyectadas por vía subcutánea en el flanco
opuesto. También se inyectaron cinco ratones no expuestos como
controles. Se midieron los diámetros de tumor y se informaron tal
como se describe. El rechazo previo al tumor resultó en
significativa protección contra la exposición secundaria, comparado
con controles no expuestos. Todos los ratones control desarrollaron
tumores de crecimiento progresivo, desarrollaron cargas tumorales
masivas, y fueron sacrificados el día 35 posterior a la
inoculación. 3 de los 5 ratones previamente inmunizados se
mantuvieron libres de tumor 70 días después de la exposición. Sólo
uno de los ratones previamente inmunizados tenía un tumor
detectable el día 14, y el crecimiento de este tumor era muy lento.
Por último, otros dos tumores se desarrollaron en los ratones
inmunizados 42 días después de la exposición. Los datos se muestran
en la Figura 3. Estos resultados demuestran que el rechazo de tumor
mediado por bloqueo CTLA-4 resulta en memoria
inmunológica.
Grupos de ratones fueron inyectados s.c. con 2 x
10^{6} células tumorales 51BLim10. Animales control (n = 10)
fueron inyectados i.p. con 100 \mug de anticuerpo de irrelevante
hámster los días 0, 3, 6 y 9, tal como se indica con las flechas
que apuntan hacia arriba en la Figura 4. Un grupo de tratamiento
anti-CTLA-4 recibió inyecciones
i.p. los mismos días. El otro grupo tratado de ratones (n = 5)
recibieron inyecciones i.p. de anticuerpo
anti-CTLA-4 a partir del día 7 y
luego los días 10, 13 y 16 (flechas hacia abajo). Los datos se
muestran en la Figura 4. Los ratones tratados con anticuerpo
anti-CTLA-4 en cualquier punto
temporal tenían significativa reducción del crecimiento del tumor
comparado con controles no tratados. El retraso del tratamiento
parecía ser más efectivo, con 2 de 5 ratones que permanecían libres
de tumor más de treinta días después de la inoculación.
Los efectos de tratamiento con
anti-CTLA-4 no se limitaron a las
líneas celulares de carcinoma. Se obtuvieron resultados similares
obtenidos con una línea celular de fibrosarcoma de crecimiento
rápido de ratones A/JCr. Grupos de ratones fueron inyectados s.c.
en el flanco con una suspensión de 1 x 10^{6} células de
fibrosarcoma SA1N. Los grupos tratados fueron inyectados i.p. con
100 \mug de anti-CTLA-4 o
anticuerpo irrelevante de hámster control los días 0, 3 y 6, tal
como se indica con las flechas en la Figura 5. Todos los animales
control fueron sacrificados el día 30. Dos de cinco animales
tratados con anti-CTLA-4 se
\hbox{mantenían libres de tumor al día 55. Los datos se
muestran en la Figura 5.}
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se obtuvo DNP-KLH de Calbiochem
(San Diego, CA) y se suspendió en agua desionizada a 1 mg/ml, 100
ng/ml o 10 \mug/ml. Se añadió un ml de coadyuvante completo de
Freund (Difco, MI) a cada 1 ml de las preparaciones de
DNP-KLH. Estos luego fueron emulsionados en dos
jeringas de 5 ml conectadas con un conector de dos extremos por
pasaje rápido por el cierre luer, tal como se describe en Current
Protocols in Immunology, Colligan et al., eds., sección
2,4.
30 minutos antes de la inyección del inmunógeno,
se inyectaron ratones C57B1/6 de 4-6 semanas en el
peritoneo mediante una jeringa de calibre 23 con 200 \mug de
anticuerpo control de hámster no específico o con 200 \mug de
anticuerpo anti-CTLA-4 9H10 (ambos
en 200 \mul de volumen total). Los ratones luego se inyectaron
por vía subcutánea con una jeringa de calibre 21 en dos sitios del
lomo, con 200 \mul del inmunógeno en la forma antes descrita,
para dar una dosis de 100 \mug, 10 ng o 1 pg/ratón,
respectivamente. Después de tres días se repitieron las inyecciones
de anticuerpo.
Diez días después del primer tratamiento se
sacrificaron los animales. Se obtuvo sangre por punción cardíaca y
se pasó a tubos de Eppendorf. Estas muestras se dejaron coagular a
4ºC durante la noche, y luego se centrifugaron para obtener el
suero.
Los sueros se analizaron para anticuerpos
específicos de isotipo que reconocen DNP usando un ELISA de isotipo
estándar tal como se describe en Current Protocols in Immunology
(supra.) sección 2,1. Brevemente, DNP se plaqueó a 100 ng/ml
en un volumen de 50 \mul en cada cavidad de una placa de ELISA de
96 cavidades Corning modificada de base redonda. Las cavidades se
bloquearon usando buffer tal como se describe. Se agregaron
diluciones seriadas al tercio de cada suero, a partir de 1:100, en
cada cavidad. Estas se incubaron durante una hora a 25ºC, y se
lavaron con buffer de lavado. Se detectaron isotipos mediante el uso
de agentes detectores de anticuerpos murinos específicos a 1
\mug/ml en 50 \mul de buffer de bloqueo incubados durante una
hora. Los anticuerpos de isotipo se biotinilaron y la detección se
logró al incubar con avidina-peroxidasa de rábano,
lavar y agregar sustrato de peroxidasa (ABTS, Sigma, Mo.). Se añadió
buffer de detención, y se leyó la absorbancia de cada cavidad con
un lector de ELISA a una longitud de onda de 490-498
nm dentro de los 5-8 min de detener la
reacción.
Los resultados se muestran en las Figures 6A a
6E. Cada uno de los paneles ilustra la concentración de un isotipo
diferente en la muestra del suero. El eje y muestra la lectura de
D.O., en donde un incremento de D.O. indica aumento de la
concentración de anticuerpos en el suero que tiene dicho isotipo. El
eje x muestra la cantidad de antígeno inyectado, 100 \mug, 10 ng
o 1 pg por animal, respectivamente. Se puede ver que el anticuerpo
anti-CTLA-4 aumenta el cambio de
clase a IgG1, IgG2a e IgG2b con mayores dosis de antígeno.
El análisis de la función de las células T se
realizó como sigue. Se aislaron células de ganglio linfático y se
estimularon in vitro durante 72 horas con KLH. Se extrajeron
los ganglios linfáticos axilar, inguinal, mesentérico, braquial,
cervical y poplíteo a un disco que contiene
RPMI-completo (10% FCS (Hyclone, Montana), 2 mM de
glutamina, 50 \muM de b-mercaptoetanol, 50
\mug/ml de gentamicina). Los ganglios linfáticos se picaron para
obtener suspensiones de células aisladas, se filtraron por una malla
tejida para eliminar partículas, y se contaron mediante un
hemocitómetro. Las células se plaquearon en 150 \mul de
RPMI-completo en placas de cúmulo de 96 cavidades
de base redonda a 5 x 10^{5}, 2,5 x 10^{5}, o 1,25 x 10^{5}
células/cavidad. Se añadieron soluciones de KLH en RPMI completo
hasta concentraciones finales de 100, 10, 1 o 0 \mug/ml y las
placas se incubaron a 37ºC durante 64 horas incubadores
humidificadas con 5% de CO_{2}. Después de 64 horas, se añadió 20
\mul de RPMI completo que contiene 1 \muCi de
3H-timidina a cada cavidad, y las placas se
incubaron otras ocho horas. En este momento, los cultivos se
cosecharon en filtros de fibra de vidrio mediante un cosechador
Inotech de 96 cavidades. Los filtros se secaron y se contaron con un
contador Packard Matrix. Cada condición se realizó por triplicado,
y los datos representan la media de valores por triplicado.
Los resultados se muestran en las Figuras 7A a
7B. La hilera superior muestra una cantidad constante de células (5
x 10^{5} células), con concentraciones variables de antígeno
(mostrado en el eje x). El eje y muestra la incorporación de
3H-timidina, una medida de proliferación celular. El
panel inferior muestra una concentración constante de antígeno (10
\mug/ml), con cantidades variables de células (mostrado en el eje
x). Los datos indican que el bloqueo CTLA-4 regula
fuertemente hacia arriba la respuesta de células T a las mayores
dosis de antígeno.
Los resultados anteriores demuestran que el
tratamiento objeto con agentes bloqueadores de
CTLA-4 incrementa la respuesta de las células T a
la estimulación antigénica. El crecimiento de las células tumorales
in vivo está muy disminuido en presencia de los agentes
bloqueadores objeto. Los efectos se observan respecto de tumores de
tipo salvaje no manipulados. Los agentes bloqueadores de
CTLA-4 no sólo representan un nuevo enfoque a la
terapia tumoral, sino que al extraer señales inhibitorias
potencialmente competentes, puede ser un adjunto particularmente
útil para otros abordajes terapéuticos en los que interviene la vía
coestimuladora. El cambio de clase de las células productoras de
inmunoglobulina, una medida de la ayuda de las células T, está muy
aumentado. La respuesta de células T a la inmunización con antígenos
peptídicos también está muy aumentada por el tratamiento con los
agentes
objeto.
objeto.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Los anticuerpos antihumanos
CTLA-4 son generados como sigue.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inmunógenos que comprenden las proteínas
humanas CTLA-4 contienen la totalidad o una porción
del dominio extracelular de la proteína CTLA-4
humana. El dominio extracelular de la proteína
CTLA-4 humana comprende los residuos de aminoácidos
38-161, según está listado en las referencias de la
base de datos.
El inmunógeno CTLA-4 humano
comprende toda la proteína CTLA-4 humana o una
proteína de fusión que comprende el dominio extracelular de
CTLA-4 humano y una contrapartida de fusión. El
inmunógeno comprende toda la proteína CTLA-4 humana
insertada en la membrana de una célula; se usa la célula que expresa
CTLA-4 humano en la superficie para inmunizar un
animal huésped.
Los inmunógenos que comprenden porciones de la
proteína CTLA-4 humana son generados mediante el uso
de PCR para amplificar secuencias de ADN codificadoras de la
proteína CTLA-4 humana a partir de mARN proveniente
de células H38, una línea de leucemia asociada a HTLV II (R. Gallo,
National Cancer Institute). El mARN se transcribe de reversa para
generar el cADN de la primera cadena. Luego se amplifica el cADN.
Estas secuencias se ligan a secuencias que codifican una
contrapartida de fusión, tal como se describe en Linsley et
al. [J. Exp. Med. 174:561 (1991)]. El vector de expresión
codifica una proteína de fusión denominada CTLA4Ig, la cual
comprende (desde el terminal amino a la terminal carboxi) el péptido
señal de oncostatina M, el dominio extracelular de
CTLA-4 human y los dominios H, CH2 y CH3 de IgG1
humana. El péptido señal de oncostatina M se usa en lugar del
péptido señal natural CTLA-4 humano. Los residuos de
cisteína hallados en el dominio de bisagra de tipo salvaje de la
molécula de IgG1 humana se mutaron a serinas en la construcción del
vector que codifica la proteína CTLA41 g (Linsley et al.,
supra).
\vskip1.000000\baselineskip
Para inmunizar animales con inmunógenos que
comprenden proteínas CTLA-4 humanas se emplean
animales huésped no humanos. El inmunógeno que comprende una
proteína de fusión CTLA-4/IgG humana (por ejemplo,
CTLA4Ig), se usa para recubrir células bacterianas destruidas por
calor de Staphylococcus A (StaphA) tal como se describe en el
Ejemplo 1b. Ratones BALB/c de seis semanas fueron inyectados en la
almohadilla del pie con 50 \mul (volumen empaquetado) de
bacterias muertas por calor StaphA recubiertas con aproximadamente
100 \mug de CTLA-4Ig suspendidas en 0,2 ml de
PBS.
Se da un total de cinco inyecciones por ratón.
El día del refuerzo final y antes de la inyección, se obtuvieron
aproximadamente 100 \mul de suero por sangrado intraocular tal
como se describe en el Ejemplo 1b. El suero se analizó junto con
suero obtenido por la metodología idéntica antes de la primera
inyección (es decir suero preinmune).
Se utilizó un ELISA de fijación de
CTLA-4Ig humano para demostrar la presencia de
anticuerpo que reconoce la proteína de fusión
CTLA-4Ig humana en el sangrado posterior a la
inmunización. El ELISA de fijación de CTLA-4Ig
humano fue conducido tal como se describió con anterioridad en el
Ejemplo 1b con la excepción de que las placas de ELISA estaban
recubiertas con proteína CTLA-4 humana.
Se obtuvieron suero y ganglios linfáticos de los
ratones inmunizados que contienen anticuerpo que reconoce la
proteína de fusión CTLA-4Ig humana en el sangrado
posterior a la inmunización con diluciones de suero 1000 veces
superiores a la dilución a la cual se podía detectar el fondo. Se
prepararon linfocitos de los ganglios linfáticos drenados en los
ratones inmunizados y luego se usaron para la generación de
anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína
CTLA-4 humana tal como se describió antes en el
Ejemplo 1c.
Los inmunógenos que comprenden células
transformadas que expresan la proteína CTLA-4 humana
en la superficie celular se prepararon como sigue. Se usaron
vectores de expresión codificadores de toda la proteína
CTLA-4 humana para transfectar la línea celular de
linfoma murino EL4 (ATCC TIB 39). Las células transfectadas EL4
fueron inyectadas en ratones a razón de 1 x 10^{6} a I x 10^{7}
células transfectadas/inyección. Las células transfectadas se
inyectaron en una solución que comprende PBS. Los ratones se pueden
inyectar por vía i.p. o en la almohadilla plantal de la pata
trasera. Cuando se dan inyecciones i.p., se administra un total de
aproximadamente 4 inyecciones. Cuando se usa la almohadilla plantal
como sitio de inyección, se administra un total de aproximadamente
5 inyecciones. Se junta el suero de los animales inmunizados y se
analiza la presencia de anticuerpos dirigidos contra la proteína
CTLA-4 humana mediante un ELISA tal como se describe
en el Ejemplo 1b, con la excepción de que las placas están
recubiertas por proteínas CTLA-4 humanas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron linfocitos de ganglios linfáticos
drenados o los bazos de animales inmunizados con el inmunógeno
CTLA-4 humano y se fusionaron a células P3X3.Ag8.653
para generar líneas celulares de hibridoma mediante el protocolo de
fusión PEG descrito en el Ejemplo 1c. Los sobrenadantes de los
cultivos de las cavidades que contienen 1000-5000
células/cavidad se analizaron en cuanto a su reactividad a
CTLA-4 humana y a la falta de reactividad contra
una proteína distinta de CTLA-4 tal como CD4 humano
mediante un ensayo ELISA.
Los hibridomas provenientes de cavidades
positivas se clonaron repetidas veces por dilución limitante tal
como se describe en el Ejemplo 1c. Las líneas de hibridoma
secretoras de anticuerpos monoclonales que son reactivas contra
proteínas CTLA-4 humanas, pero no contra proteínas
humanas irrelevantes (por ejemplo, CD4 humano), y que tienen la
capacidad para teñir transfectantes de células
CTLA-4 humanas, pero no los controles de
transfectantes se seleccionan para la producción de anticuerpos
monoclonales antihumanos CTLA-4.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Las células huésped son estimuladas ex
vivo, lo cual les permite diferenciarse a células efectoras
inmunes específicas de tumor. Las células luego son reintroducidas
en el mismo huésped para mediar los efectos terapéuticos
anticáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
Los linfocitos infiltrantes de tumor se obtienen
mediante técnicas estándar. Tumores sólidos (recién resecados o
crioconservados) se dispersan en suspensiones de células únicas por
digestión enzimática durante la noche [por ejemplo, agitación
durante la noche a temperatura ambiente en medio RPMI 1640 que
contiene 0,01% de hialuronidasa tipo V, 0,002% de ADNsa tipo I,
0,1% de colagenasa tipo IV (Sigma, St. Louis), y antibióticos]. Las
suspensiones de tumor luego se pasan por gradientes de
Ficoll-Hypaque (medio de separación de linfocitos,
Organon Teknika Corp., Durham, NC). Las interfaces de gradiente que
contienen células tumorales viables y células mononucleares se
lavan, se ajustan a una concentración total de células de 2,5 a 5,0
x 10^{5} células/ml y se cultivan en medio completo. El medio
completo comprende RPMI 1640 con 10% suero humano de tipo compatible
inactivado por calor, penicilina 50 IU/ml y estreptomicina 50
\mug/ml (Biofluids, Rockville, MD), gentamicina 50 \mug/ml
(GIBCO Laboratories, Chagrin Falls, OH), anfotericina 250 ng/ml
(Fungizone, Squibb, Flow Laboratories, McLean, VA), HEPES buffer 10
mM (Biofluids), y L-glutamina 2 mM (MA Bioproducts,
Walkersville, MD). Se agrega medio condicionado proveniente de
cultivos de células killer activadas por linfoquinas (LAK)
alogénicas o autólogas de 3 a 4 días (ver más adelante) a una
concentración final de 20% (v/v). Se añade IL-2
recombinante a una concentración final de 1000
U/ml.
U/ml.
Los cultivos se mantienen a 37ºC en atmósfera
humidificada con 5% de CO_{2}. Los cultivos se alimentan
semanalmente con cosechas, sedimentación y resuspensión de las
células hasta 2,5 x 10^{6} células/ml en medio fresco. Durante un
periodo inicial (por ejemplo, 2 a 3 semanas) de cultivo, los
linfocitos proliferan selectivamente, mientras que las células
tumorales remanentes generalmente desaparecen por completo.
Para preparar cultivos celulares LAK, se
obtuvieron linfocitos de sangre periférica (PBL) de pacientes o
donantes normales. Después del pasaje por gradientes de
Ficoll-Hypaque, se cultivaron las células hasta una
concentración de 1 x 10^{6}/ml en medio RPMI 1640 con 2% de suero
humano, antibióticos, glutamo, y buffer HEPES. Se agregó
IL-2 recombinante hasta 1000 U/ml. Los cultivos se
mantienen durante 3 a 7 días en atmósfera humidificada con 5% de
CO_{2} a 37º.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incuban 4 x 10^{6} células en 2 ml de medio
de cultivo contiene el mAb
anti-CTLA-4 en una cavidad de
placas de 24 cavidades a 37ºC en atmósfera de 5% CO_{2} durante 2
días. El medio de cultivo comprende medio RPMI 1640 suplementado
con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor, 0,1 mM de
aminoácidos no esenciales, 1 \muM de piruvato de sodio, 2 mM de
L-glutamina recién preparada, 100 \mug/ml de
estreptomicina, 100 U/ml de penicilina, 50 \mug/ml de
gentamicina, 0,5 \mug/ml de fungizona (todos de GIBCO, Grand
Island, NY) y 5 x 10^{-5} M de 2-ME (Sigma). Las
células se cosecharon y se lavaron.
Las células estimuladas inicialmente se
cultivaron luego hasta 3 x 10^{5}/cavidad en 2 ml de medio de
cultivo con IL-2 humana recombinante (disponible de
Chiron Corp., Emeryville, CA; actividad específica de 6 a 8 x
10^{6} U/mg de proteína; unidades equivalentes a
2-3 U Internacionales). Después de 3 días de
incubación en IL-2, las células se recolectaron, se
lavaron, se contaron para determinar el grado de proliferación, y
se resuspendieron en un medio adecuado para la administración
intravenosa (i.v.) (por ejemplo soluciones fisiológicas salinas con
buffer). Se realizaron cultivos bacterianos para determinar la
existencia de contaminación bacteriana antes de la reinfusión de
las células
activadas.
activadas.
Después de haber resuspendido las TIL activadas
en un medio adecuado para la inyección, se realizó acceso IV en el
huésped y se infundió la suspensión celular. Opcionalmente, se trata
el huésped con agentes para promover la función in vivo y la
supervivencia de las células estimuladas (por ejemplo
IL-2). De modo alternativo, se administran agentes
bloqueadores de CTLA-4 en combinación con los TIL
activados a fin de mejorar la estimulación de las células
autorreactivas in vivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
SA1 es un fibrosarcoma. Tal como se muestra en
la Figura 8, el bloqueo de CTLA-4 mediante 10 \mug
de anticuerpo anti-CTLA-4 por dosis
es efectivo incluso cuando se retrasa 7 o 14 días después de la
implantación del tumor. Esto indica que el bloqueo de
CTLA-4 puede ser efectivo para el tratamiento de
tumores establecidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
SM1 es un carcinoma de mama que es poco
inmunogénico. Es resistente al rechazo por transfección con B7. Sin
embargo, se ha obtenido cierta inhibición de crecimiento mediante el
uso de B7 e IFN\gamma. En el experimento mostrado en la Figura 9,
los ratones recibieron implantes subcutáneos de células tumorales SM
1 no modificadas, y los tratamientos indicados en los días 0, 3 y
6. Tal como se muestra, el tratamiento con
anti-CTLA-4 (10º \mug/dosis) por
sí mismo no tuvo efecto sobre el crecimiento del tumor. La
inmunización de un sitio contralateral con células transducidas
GM-CSF irradiadas tampoco tuvo efecto. Sin embargo,
la combinación de los dos dio por resultado el rechazo completo de
4 de 5 ratones. Esto demuestra claramente que el bloqueo de
CTLA-4 puede producir sinergismo con GMCSF, y
probablemente otras linfoquinas, para obtener el rechazo del
tumor.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
RENCA es un tumor poco inmunogénico de
crecimiento lento. Tal como se muestra en las Figuras 10 A y B, el
bloqueo de CTLA-4 (100 \mug de anticuerpo
anti-CTLA-4 por dosis) sólo es poco
efectivo cuando se inicia en el momento de la implantación del
tumor. Sin embargo, es bastante efectivo si se inicia 9 días después
de la implantación del tumor. Esto sugiere que la generación de
restos tumorales a partir de una masa de tumor relativamente grande
es importante como agente para estimular una respuesta inmune para
obtener rechazo efectivo. Esto sugiere que el bloqueo de
CTLA-4 se podría usar en el momento o poco después
de la irradiación o la quimioterapia.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
B16-BL6 fue derivado
originalmente de la línea celular de melanoma murino espontáneo
B16-F0, por selección in vitro de
características invasivas (Hart, Am. J. Path. 97, n.º
3:587-600 (1979)). Tanto la línea original como su
variante expresan niveles bajos de H-2Kb y Db, y son
negativos cuando se tiñen para MHC de clase II. La vacunación con
B16-BL6 irradiado no protege contra exposiciones
posteriores con células B16-BL6 vivas, y la
expresión de B7.1 tampoco da por resultado un cambio significativo
del crecimiento tumoral in vivo (Chen et al., J. Exp.
Med. 179:523-532 (1994), resultados no publicados
del autor). En consecuencia, se puede considerar que
B16-BL6 son poco inmunogénicos. Los autores han
investigado medios para atacar este tumor mediante el bloqueo de
CTLA-4.
En el experimento mostrado en la Figura 11, los
ratones recibieron implantes subcutáneos de células tumorales no
modificadas y los tratamientos indicados los días 0, 3 y 6. El
bloqueo de CTLA-4 por sí mismo (100 \mug de
9H10/dosis) no tuvo efecto alguno, ni la inmunización con células
irradiadas B16 células en un sitio contralateral. Sin embargo, el
tratamiento con ambos mostró una pequeña pero significativa y
reproducible inhibición del crecimiento del, aunque no se obtuvo
ninguna cura.
Este abordaje también se usó en condiciones de
inmunización protectora. En el experimento mostrado en la Figura
12, los ratones fueron inmunizados con células irradiadas B 16 con y
sin bloqueo CTLA-4 (100 \mug 9H10/dosis) y con y
sin microesferas de gelatina que contienen citoquina (que contiene
50 ng de \gamma-interferón y 50 ng de
GM-CSF). Los ratones fueron nuevamente expuestos a
células tumorales vivas, no modificadas dos semanas más tarde. Los
ratones inmunizados con células irradiadas con bloqueo
CTLA-4 mostraron significativo deterioro del
crecimiento del tumor, comparado con los ratones que recibieron
solamente células irradiadas. El mejor efecto protector se obtuvo
con microesferas que contienen citoquinas junto con bloqueo de
CTLA-4.
En conjunto, estos datos indican que el bloqueo
de CTLA-4 puede mejorar las estrategias de
inmunización mediante el empleo de inmunización activa con células
tumorales modificadas o fragmentos de tumor, y que puede tener un
efecto sinérgico con citoquinas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
En este estudio se demostró que la combinación
de bloqueo de CTLA-4 y vacunas productoras de
GM-CSF era terapéuticamente efectiva contra el
melanoma altamente tumorogénico y poco inmunogénico
B16-BL6, en u mecanismo que depende de células CD8+
y NK1.1+, pero independiente de las células T CD4+. Los ratones
curados de tumores subcutáneos preestablecidos B
16-BL6 resisten la exposición a
B16-BL6 o el B16-F0 de la línea
progenitora después de 4 meses. Además, las metástasis pulmonares
inducidos por B16-F10 puede ser erradicados mediante
el tratamiento de combinación, y las lesiones metastáticos de estos
ratones muestran extensa infiltración de
linfocitos.
linfocitos.
Es importante destacar que en ambos modelos de
melanoma, subcutáneo y metastático, los ratones sobrevivientes
desarrollaron despigmentación de la piel y el pelo, lo cual indica
que concurrentemente se indujo autoinmunidad dirigida contra las
células pigmentadas. Dado que los animales en los cuales se eliminó
CD4 también desarrollaron despigmentación, es muy probable que este
fenómeno autoinmune sea inducido por linfocitos T citotóxicos (CTL)
dirigidos contra antígenos de pigmentación. Este modelo es muy
adecuado para estudiar la significancia de los CTL autorreactivos
en respuestas antitumorales, así como para investigar el papel de
CTLA-4 en la tolerancia periférica en un contexto
relevante para la inmunoterapia de cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
Ratones: se mantuvieron ratones hembras
C57BL/6 (obtenidos de Charles River Laboratories/NCI) de acuerdo
con las reglamentaciones del Instituto, que se usaron para los
experimentos de tumor cuando tenían 8-12 semanas de
edad. Todas las inyecciones subcutáneas se aplicaron después de la
inhalación del anestésico metoxiflurano.
Anticuerpos: la generación y purificación
del anticuerpo de hámster antimurino CTLA-4 9H10 se
describen en el Ejemplo 1 anterior. De modo similar, se prepararon
GK1.5 (anti-CD4), 2,43 (CD8), PK136 (NK1.1), 116,3
(Lit2,1, IgG de rata, obtenidos de B. Fowlkes) en el laboratorio de
los autores como ascitis o purificados del sobrenadante mediante el
uso de procedimientos estándar. Las IgG murina e IgG de hámster
fueron adquiridas de Jackson Immuno Research Labs (West Grove, PA),
la IgG de rata era de Sigma (St. Louis, MO). Se usaron
RM4,4-PE (CD4),
anti-CD8b2-PE y DX5 (Pharmingen, San
Diego, CA) para confirmar las eliminaciones de la poblaciones
relevantes.
relevantes.
Líneas celulares y transducción del gen de
GM-C SF: se cultivó B 16-BL6,
B16-F10 (obtenido del Dr. 1. Fidler, MD Anderson
Cancer Center, Houston TX), B 16-F0 (ATCC), y DC2.4
(Shen et al., J. Immunol. 158, n.º 6:2723 (1997)) en DMEM
suplementado con 1 U/ml de penicilina, 1 \mug/ml de
estreptomicina, 50 \mug/ml de gentamicina, 2 \muM de
L-glutamina y 8% de suero fetal bovino (en adelante
referido como DMEM completo). Las líneas celulares tumorales
derivadas de C57B1/6 EL4 (timoma) y MC38 (carcinoma colorectal,
obtenidas del Dr. N. Restifo) se mantuvieron en RPMI, suplementado
con antibióticos, L-glutamina, 20 \muM
\beta-mercaptoetanol, y 8% de FCS. Se obtuvieron
B16-BL6 y B16-F10 productoras de
GM-CSF por transducción retroviral tal como es
conocido en la técnica (ver Dranoff et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90:3539-43 (1993). La producción de
GM-CSF mediante líneas cortas (F10) o clones (BL6)
fue analizada mediante ELISA en emparedado, mediante el uso de
anticuerpos disponible en el comercio contra GM-CSF
murino (Pharmingen). Los clones BL6/GM-E,
/GM-18 (productores de 5 ó 20 ng de
mGM-CSF/10^{6} células/24 h), y la línea corta
F10/GM (30-40 ng/10^{6}/24 h) fueron cultivadas
mediante DMEM completo. La producción de GM-CSF fue
confirmada de rutina in vitro durante el curso de de
experimentos de vacunación. La irradiación de las vacunas antes de
la inyección mejoró la producción de GM-CSF
\sim1,5-2
veces.
veces.
Experimentos de exposición subcutánea y
tratamiento: los ratones fueron afeitados en el lomo y expuestos
por vía subcutánea (s.c.) con 10^{4} células B
16-BL6 en PBS. En el mismo día o más tarde, según se
indica, se inició el tratamiento mediante la inyección de 10^{6}
células irradiadas (16.000 Rad) productoras de
GM-CSF (en PBS) s.c. en el flanco izquierdo, y se
repitió 3 y 6 días más tarde, según se indica. La vacuna consiste
en una mezcla 1:1 de BL6/GM-E y
BL6/GM-18. El tratamiento con 9H10 o IgG control de
hámster se inició simultáneamente o tres días más tarde, con
resultados similares. Los anticuerpos se suministraron por vía
intraperitoneal (i.p.) hasta 100 \mug en PBS, usualmente seguido
de dos inyecciones de 50 \mug cada 3 días. El crecimiento del
tumor se controló dos o tres veces por semana mediante la medición
de diámetros perpendiculares. De conformidad con las
reglamentaciones del instituto, los ratones fueron sacrificados
cuando los tumores mostraron ulceración severa o alcanzaron un
tamaño de 300 mm^{2}. La eliminación de células T o NK se llevó a
cabo por inyección de los anticuerpos relevantes (500 \mug i.p.)
7, 6, y 5 días antes de la exposición, y se mantuvieron mediante
inyecciones repetidas cada diez días durante el experimento. Se
confirmaron las eliminaciones en ganglios linfáticos y bazos, 1 día
antes de la exposición por citometría de flujo mediante el uso de
anticuerpos no formadores de bloques cruzados. De rutina, se
detectaron < 1% de células CD4+, células T CD8+ o células NK1.1+
en ganglios linfáticos (después de la eliminación de CD4 o CD8) o
bazos (eliminación de NK1.1) en los respectivos ratones, mientras
que el tratamiento de ratones con anticuerpos de control (IgG
murino, IgG de rata, o 116,3) demostraron perfiles linfocitarios no
modificados, en comparación con ratones no tratados.
Tratamiento de metástasis pulmonar: A fin
de establecer metástasis pulmonares, se inyectaron ratones i.v. con
5 x 10^{4} o 10^{5} células B 16-F10. El
tratamiento mediante células irradiadas F10/GM y anticuerpos se
inició después de 24 horas, según en mismo protocolo que se reseñó
para el tratamiento de tumores subcutáneos. Después de 25 días, se
cosecharon los pulmones de cada grupo de tratamiento y se contaron
las metástasis de superficie mediante el uso de un microscopio de
disección. Los cortes de pulmón incluidos en parafina se tiñeron
con hematoxilina-eosina mediante el uso de
procedimientos estándar. Para los experimentos de supervivencia se
inyectaron células 5 x 10^{4} células B16-F10 i.v.
y se inició el tratamiento al día siguiente.
Ensayo de generación de cultivos de CTL y
liberación de IFN\gamma: Se cosecharon los bazos de ratones
que rechazaron B16-BL6 y se reestimularon in
vitro con B16-BL6/B7.1 o una mezcla de
B16-F0 y la línea de células dendríticas DC2,4
después de cocultivo durante la noche. Se picaron 5 x 10^{6}
células de bazo con 10^{5} células estimuladoras irradiadas
(16.000 rad) y se añadió IL2 humana recombinante hasta una
concentración final de 30 IU/ml. Después de 7 días, se juntaron las
células y se purificaron mediante centrifugación por gradiente con
Histopaque. Se estimularon las células vivas (2,5 x 10^{5} por
cavidad) mediante células blanco (5 x 10^{4} por cavidad) en
placas de 96 cavidades de base redonda durante 24 horas, después de
lo cual se cosechó el sobrenadante y se analizó la presencia de
IFN\gamma mediante ELISA de emparedado.
\vskip1.000000\baselineskip
El bloqueo de CTLA-4 junto
con vacunas celulares productoras de GM-C SF causa
el rechazo de tumores establecidos por B16BL6. Partiendo de la
hipótesis de que la presentación de antígenos asociados con tumor
podría ser limitante, se combinó el bloqueo de
CTLA-4 con células de B 16-BL6
irradiadas productoras de GM-CSF como fuente óptima
de antígeno. Ratones C57BL/6 fueron expuestos a 10^{4} células
B16-BL6 por vía subcutánea y luego tratados a
partir del mismo día o 4-12 días más tarde. Se
presenta un experimento representativo en la Figura 13A. Como era
de esperar, la inyección de anticuerpo 9H 10 bloqueador de
CTLA-4 o IgG control de hámster no indujo rechazo
de tumores preestablecidos de B16-BL6. Cuando se
combinó con IgG control de hámster, la vacunación con células de B
16-BL6 irradiadas productoras de
GM-CSF mostró escaso o ningún efecto sobre el
crecimiento de tumores ya establecidos. Sin embargo, la combinación
de vacuna productora de GM-CSF y de bloqueo de
CTLA-4 indujo el rechazo de todos los tumores
inyectados el mismo día o 4 días después. Uno de cinco ratones
portadores de un tumor de 8 días de células B16-BL6
rechazó un pequeño tumor palpable después del tratamiento de
combinación que incluye bloqueo de CTLA-4. No se
halló efecto significativo sobre los tumores establecidos 12 días
antes. Con la combinación de todos los experimentos, se logró una
tasa de éxitos global de los tratamientos de combinación del 80%
(68 de 85 ratones se curaron de tumores de células B
16-BL6 de entre 0 y 4 días). Estos resultados
corroboran el hallazgo del Ejemplo 7, de que el bloqueo de
CTLA-4 y las vacunas productoras de
GM-CSF actúan en forma sinérgica para causar el
rechazo de tumores poco inmunogénicos.
Al disminuir la cantidad de vacunaciones, los
autores hallaron que una dosis única de vacuna productora de
GM-CSF administrada el mismo día que la exposición
al tumor era suficiente para erradicar los tumores en todos los
ratones, cuando se combinaba con bloqueo de CTLA-4
(Figura 13B). De modo similar, una dosis única de
anti-CTLA-4 posterior a tres
vacunaciones con células productoras de CSF era suficiente para
inducir el rechazo de B16-BL6 (no mostrado). Se
halló que la producción de GM-CSF por la vacuna era
esencial para el efecto sinérgico, dado que la vacunación con
células B 16-BL6 irradiadas no transducidas en
combinación con anticuerpos
anti-CTLA-4 no era efectiva (datos
no mostrados).
La combinación de bloqueo de
CTLA-4 y vacunas productoras de GM-C
SF induce la resistencia efectiva contra la exposición de
B16-B L6. Para determinar si los ratones curados de
la exposición inicial de B 16-BL6 había
desarrollado resistencia contra la nueva exposición, los ratones
sobrevivientes fueron sometidos a una nueva exposición de 2 x
10^{4} B16-BL6 en el flanco izquierdo 128 días
después de la exposición primaria. Además, se analizó la
resistencia a la línea celular original de melanoma B
16-F0 mediante la inyección de 2 x 10^{4} al
flanco derecho. Ratones control no expuestos de edad comparable
desarrollaron ambos tumores y fueron sacrificados dentro de los 30
días. Todos los ratones curados de una exposición primaria con
B16-BL6, con independencia del bloqueo de CTLA4,
rechazaron B 16-F0, mientras que 7 de 9 que
recibieron la vacuna de BL6/GM más anti-CTLA4
también rechazaron B16-BL6 (Tabla I siguiente).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Dentro de este experimento, los dos ratones que
habían rechazado la exposición primaria después de la vacunación
BL6/GM sola no pudieron rechazar una segunda exposición a
B16-BL6 (Tabla I). En contraste, 7 de 9 ratones que
recibieron vacuna BL6/GM más
anti-CTLA-4 también rechazaron
B16-BL6. En dos experimentos de reexposición, 20 de
24 ratones curados de B16-BL6 por el tratamiento de
combinación eran inmunes a la exposición secundaria con
B16-BL6, y 11 ratones eran resistentes a la
reexposición con B16-F0. Sólo 4 de 8 ratones curados
tras la vacunación con células productoras de
GM-CSF solo eran resistentes a la reexposición. Si
bien no se halló resistencia a la reexposición con
B16-BL6 en el 100% de los ratones, el hecho de que
todos los ratones rechazaron B16-F0 sugiere que los
ratones que sobrevivieron a una exposición primaria con
B16-BL6 habían montado una memoria adecuada contra
antígeno(s) compartido(s) por la línea original y si
variante más
invasiva.
invasiva.
CD8+ y NKI. Se requieren células 1+ para el
tratamiento de combinación de B16-B L6. A fin
de evaluar si las células T y NK intervienen en el rechazo de B
16-BL6, se eliminaron las células CD4+, CD8+, o NK
1.1 + antes de la exposición a B16-BL6. El
tratamiento se inició el mismo día que la implantación de tumor,
según el esquema general de tres inyecciones simultáneas de vacuna y
anti-CTLA-4. La eliminación de
células CD8+ células anuló el efecto del tratamiento (Tabla II). Los
ratones carentes de células NK1.1+ eran también en gran medida
incapaces de rechazar su tumor (8/10). Observamos que los ratones
portadores de tumor y carentes de NK habían desarrollado múltiples
tumores en el sitio de la exposición, lo cual sugiere que las
células NK podrían intervenir en la primera línea de defensa contra
la exposición a B16-BL6 de MHC clase I^{lo} al
reducir la carga de tumor inicialmente
inyectada.
inyectada.
Sorprendentemente, no se requirieron células T
CD4+ para el rechazo del tumor. De hecho, el 80% de los ratones
rechazó el tumor, en condiciones subóptimas, en donde el
50-60% de los grupos control rechazó
B16-BL6 (Tabla II). La eliminación de las células
CD4+ y CD8+ abolió el efecto terapéutico. En apariencia, las células
T CD8+ y las células NK1.1+ son necesarias para el rechazo de
B16-BL6 mediante el bloqueo de
CTLA-4 y las vacunas productoras de
GM-CSF. La activación de las células T CD8+ que
intervienen en el rechazo de melanoma B16-BL6 no
parece ser dependiente de la contribución de CD4.
La actividad de CTL contra
B16-B L6 está fuertemente mejorada con el bloqueo de
CTLA-4 in vivo . Para determinar si los
CTL reactivos de tumor eran inducidos por la terapia de combinación,
se inmunizaron ratones con BL6/GM más
anti-CTLA-4 o IgG control, y se
expusieron a B 16-BL6 después de 4 semanas. Diez
días después de la exposición se juntaron los bazos de cuatro
ratones de cada grupo y se reestimularon con
B16-BL6/B7.1, o una mezcla de
B16-F10 y una línea de células dendríticas
inmortalizada DC2.4. Después de una ronda de reestimulación in
vitro, se estudió la liberación específica de IFN\gamma
respecto de diferentes variantes de B 16 y dos líneas de células
tumorales no relacionadas que expresan el haplotipo
H-2^{b}, el timoma EL4 y el carcinoma colorrectal
MC38. Tal como se muestra en la Figura 14, las células T
provenientes de ratones vacunados con BL6/GM en presencia de IgG
control de hámster produjeron niveles muy bajos de producción
detectable de IFN\gamma en este ensayo, mientras que las células
T provenientes de ratones tratados con
anti-CTLA-4 in vivo tenían
secreción muy incrementada de IFN\gamma específica para B16.
Estos resultados indican que el bloqueo de
CTLA-4 durante la vacunación con BL6/GM mejora
específicamente la reactividad para un antígeno (o antígenos)
expresados por B16 y sus variantes. Además, se halló que todos los
cultivos de esplenocitos establecidos de ratones que eran
sobrevivientes a largo plazo (3-10 meses) después
del tratamiento de combinación reaccionaban específicamente con B16
y sus variantes, según se analizó por liberación de IFN\gamma
después de una ronda de reestimulación in vitro (datos no
mostrados). El rechazo exitoso de B16-BL6 coincide
con la generación de actividad de células T específica de tumor.
Supresión de metástasis pulmonares de
B16-F 10 y cura a largo plazo por tratamiento de
combinación. A fin de evaluar si
anti-CTLA-4 combinado con vacunación
sería efectivo contra enfermedad metastática, se inyectaron
10^{5} células B16-F10 (seleccionadas de
metástasis exclusivamente a los pulmones; Fidler, Cancer Res.
35:218-234 (1975)) por vía intravenosa y se inició
el tratamiento un día después. El día 25, se sacrificaron los
ratones y se contaron las metástasis en la superficie de los
pulmones. El tratamiento con
anti-CTLA-4 solo no mostró efecto
apreciable sobre el recuento de las metástasis pulmonares, comparado
con la IgG de control (Tabla III siguiente). La inmunización con
F10/GM redujo la cantidad de metástasis en unos pocos ratones y en
combinación con anti-CTLA4 suprimió aún más la
colonización pulmonar e inhibió por completo las metástasis
pulmonares en dos de los cinco ratones de muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis histológico de estas muestras de
pulmón demostró que el bloqueo de CTLA-4 en
combinación con vacunación con F 10/GM se asociaba con infiltración
de células mononucleares en todas las metástasis teñidas y observada
en 3 de los 5 pulmones portadores de tumores (los dos conjuntos
remanentes de pulmones se hallaron libres de tumores). El
tratamiento con anti-CTLA-4 o con
vacunación con F10/GM solos no causó infiltración linfocitaria en
los tumores pulmonares o el tejido circundante. Se observaron
escasas células polimorfonucleares en las metástasis más pequeñas
de vacunados con F10/GM en presencia de IgG de control, pero ningún
infiltrado extenso en las lesiones más grandes de cualquiera de los
grupos control.
La eliminación de metástasis pulmonares por
tratamiento de combinación fue confirmada en un experimento de
supervivencia (Figura 15). Ratones expuestos con 5 x 10^{4}
células B16-F10, y tratados con IgG control de
hámster sucumbieron todos (10/10) por insuficiencia pulmonar debido
a la enfermedad metastática extensa al día 75 posterior a la
inyección. El anti-CTLA-4 prolongó
por sí mismo la supervivencia, al igual que la vacunación con
F10/GM. Sin embargo, 13 de 13 ratones que recibieron el tratamiento
de combinación sobrevivieron al día 80, y parecían curados (Figura
15). En consecuencia, el bloqueo de CTLA-4 in
vivo es terapéuticamente efectivo contra la enfermedad
diseminada.
Ratones sobrevivientes de tumores subcutáneos
B16-B L6 o metástasis pulmonares
B16-F 10 desarrollan despigmentación de piel y
pelo. Dentro de las 4 a 8 semanas posteriores a la exposición,
56% (38 de 68 ratones curados) de los ratones sobrevivientes
desarrollaron despigmentación de la piel y el pelo, comenzando en
los sitios de vacunación (flanco izquierdo) y de exposición (lomo).
Además, se observó despigmentación en el sitio de vacunación en una
proporción similar de ratones sobrevivientes a metástasis pulmonares
de B16-F10. El rechazo de un tumor
B16-BL6 establecido 8 días antes del inicio del
tratamiento indujo rápida y progresiva despigmentación que apareció
dentro de los 25 días posteriores a la exposición y se diseminó a
sitios distantes, lo cual indica que la respuesta antitumoral
relativamente fuerte dio por resultado una rápida manifestación de
despigmentación progresiva. La despigmentación ocurrió en ratones
que recibieron tratamiento de combinación en un contexto
preventivo, pero con frecuencia reducida. Es interesante destacar
que la despigmentación no dependía de la presencia de células T
CD4+, dado que 4 de 8 ratones en los que se había eliminado CD4 y
que rechazaron el tumor también desarrollaron despigmentación
progresiva (Tabla II, no mostrado). En algunos casos, se halló que
los ratones portadores de tumor (moribundos a pesar del tratamiento
con anti-CTLA4 y BL6/GM) desarrollaron pequeñas
zonas de despigmentación del pelo en el sitio de crecimiento
progresivo del tumor. Nunca se observó despigmentación en los
ratones tratados con vacunación de BL6/GM-CSF sin
bloqueo de CTLA-4, o en cualquiera de los demás
grupos de tratamiento. Estos hallazgos sugieren que el bloqueo
CTLA-4 permite la activación de células linfoides
autorreactivas que intervienen específicamente en el rechazo de un
tumor derivado del linaje melanocítico, y también puede mediar el
rechazo de células que contienen pigmento normal en la piel y los
folículos pilosos que expresan antígenos de pigmentación.
Los datos anteriores demuestran que el
tratamiento de combinación del melanoma B16-BL6
altamente tumorigénica y escasamente inmunogénico da por resultado
un índice de curación global del 80%, y que el mejoramiento de la
activación de las células T en etapas tempranas de crecimiento
tumoral in vivo podría inducir el rechazo de la exposición
primaria y secundaria con B16-BL6, en forma
dependiente de CD8+ CTL. Además, se suprimió el sobrecrecimiento de
metástasis pulmonar de B16-F10 previamente
establecida después de un programa de terapia de combinación
similar. En particular, las metástasis pulmonares podrían ser
consideradas una fuente pobre de antígeno para la inducción de
respuestas antitumorales. La provisión de antígeno subcutáneo y de
bloqueo de CTLA-4 era suficiente para suprimir el
sobrecrecimiento de metástasis pulmonar y curar todos los ratones
en las condiciones estudiadas, además de destacar la validez de este
enfoque terapéutico.
Sin pretender quedar ligado por la teoría, es
probable que se pueda atribuir la potencia de la combinación de la
vacuna y el anticuerpo anti-CTLA-4
al aumento de la imprimación cruzada de las células T por las APC
del huésped debido a la vacuna, junto con la altamente potenciada
respuesta de las células T como resultado de la remoción de los
efectos inhibidores de CTLA-4 por bloqueo del
anticuerpo. Esto causa un mejoramiento sinérgico de la respuesta de
las células T hasta un nivel capaz de eliminar la masa preexistente
de las células tumorales. Esto podría ocurrir como consecuencia de
la activación de una mayor cantidad de células T no expuestas
debido a la disminución del umbral de activación, o a una respuesta
más sostenida debido a la remoción temporaria de las señales que
intervienen en la terminación de la respuesta. El rechazo es
acompañado por memoria de largo plazo, tal como indica el hecho de
que los ratones curados rechazaron la reexposición en ausencia de
tratamiento cuatro meses después del tratamiento inicial.
Tras la erradicación de tumores
B16-B16, el 56% de los ratones sobrevivientes
desarrolló despigmentación que comenzó en los sitios de vacunación
y exposición y se diseminó a sitios distantes. La pérdida de color
del pelo indica que se desarrolló autoinmunidad sistémica y
progresiva respecto de las células portadoras de pigmento. Para los
pacientes con melanoma humano se ha documentado una buena
correlación entre despigmentación autoinmune y mejoramiento de la
respuesta clínica. Richards et al., J. Clin. Oncol. 10:
1338-43 (1992).
En la presente invención, se desarrollaron a la
vez despigmentación y rechazo de tumor sin introducir secuencias
proteicas extrañas, lo cual indica que el bloqueo de
CTLA-4 permite la (re)activación de células
efectoras inmunes transformadas en tolerantes o ignorantes en el
reconocimiento de autoantígenos. El tratamiento objeto provee una
cura exitosa a largo plazo para este modelo de tumor, dado que todos
los ratones tratados con éxito en este experimento han sobrevivido
ahora más de 18 meses, sin efectos adversos fácilmente observables
además de la despigmentación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Tal como se demostró en los ejemplos anteriores,
la administración de anticuerpo
anti-CTLA-4s es suficiente para
inducir el rechazo de tumores recién implantados y, en algunos caso,
bien establecidos en varios sistemas tumorales murinos
trasplantables. La efectividad del bloqueo de CTLA-4
en estos sistemas parece ser dependiente de la inmunogenicidad
inherente del tumor. Si bien el bloqueo de CTLA-4 no
es por sí solo efectivo en el tratamiento de tumores trasplantables
poco inmunogénicos tales como el carcinoma de mama SMI 23 o el
melanoma B16, ser puede lograr la erradicación de estos tumores
cuando se administra anti-CTLA-4
junto con una vacuna celular para tumor irradiado que expresa
GM-CSF. Tal como se mostró por primera vez en el
Ejemplo 10, en el caso del melanoma B16, el rechazo de tumor
normalmente es acompañado de una despigmentación progresiva similar
al vitíligo que acompaña a la inmunoterapia en muchos pacientes con
melanoma humano. Este resulto sugiere que en los ratones, como en
el hombre, la respuesta antimelanoma está al menos en parte dirigida
a los antígenos específicos de melanocitos normales.
Debido a la potencia del bloqueo de
CTLA-4 combinado con vacunas celulares en modelos de
tumor trasplantables poco inmunogénicos, este estudio examinó la
efectividad de esta estrategia en el tratamiento de cáncer
prostático primario en ratones TRAMP (adenocarcinoma de próstata en
ratón transgénico). En estos ratones, la expresión transgénica del
antígeno SV40 T está bajo el control de la transcripción del
promotor de probasina de rata que dirige la expresión del oncogén
contra epitelio prostático en una forma regulada por andrógenos. La
patogenia de la neoplasia en ratones TRAMP refleja la del hombre.
Cuando la expresión transgénica comienza en la pubertad, los
ratones TRAMP machos desarrollan hiperplasia (a los
5-8 semanas de edad), neoplasia franca
(8-12 semanas) y por último adenocarcinoma invasivo
con metástasis en los pulmones, ganglios linfáticos y huesos
(15-20 semanas). Gingrich et al., Prost
Cancer and Prost Dis 6:1-6 (1999).
Tal como se muestra en la presente, el bloqueo
de CTLA-4 en combinación con vacunas celulares de
tumores irradiados fue efectivo en la reducción de a incidencia de
tumores y la severidad de las lesiones prostáticas. Además, hubo
significativa acumulación de células inflamatorias en las próstatas
de algunos ratones TRAMP vacunados. Por último, la respuesta
antitumor está dirigida en parte a antígenos expresados por la
próstata normal, dado que la inmunización de ratones no
transgénicos con vacunas de células tumorales que expresan
GM-CSF en condiciones de bloqueo de
CTLA-4 da por resultado marcada prostatitis. Este
estudio demostró la efectividad de este régimen inmunoterapéutico
en cáncer primario, e indica que los tumores prostáticos expresan
antígenos específicos de tejido que pueden proporcionar objetivos
de la inmunoterapia.
Ratones: Todos los procedimientos en
animales fueron realizados de acuerdo con las patas de NIH según
protocolos aprobados por la Comisión para atención y uso de animales
de la Universidad de California. Los ratones TRAMP fueron criados
en la colonia de los autores con antecedentes puros C57BL/6. Para
estos experimentos, los ratones TRAMP fueron retrocruzados una vez
con ratones FVB/N y analizados respecto de la presencia del
transgén mediante PCR, tal como se describió previamente (Greenberg,
et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3439-43
(1995)).
Los ratones fueron vacunados por vía subcutánea
con 1 x 10^{6} células, cada una de ellas de
TRAMP-C 1 y TRAMP-C2 irradiados
(12.000 rads) o sus derivados transducidos por
GM-CSF, GMTRAMP-C1/C2. A fin de
maximizar la exposición antigénica, este tratamiento se repitió
otras dos veces, separadas por tres días. Incluso días después de
la iniciación de la vacunación, los ratones se inyectaron por vía
intraperitoneal con 100 \mug de
anti-CTLA-4 (clon 9H10, Ejemplo 1) o
con IgG de hámster purificado (Jackson Immunoresearch Corp., West
Grove, PA). Dosis adicionales de anticuerpo se administraron 3 y 6
días después del primer tratamiento. Se hizo el seguimiento de los
ratones respecto de morbilidad y se sacrificaron cuando la carga de
tumor superaba aproximadamente los 50 mm de diámetro o la
respiración animal era extenuante. Los ratones se sacrificaron a la
edad indicada y se microdisecó el complejo prostático bajo
estereomicroscopio. La incidencia de tumores se evaluó inicialmente
en la necropsia y se confirmó por examen histopatológico.
Análisis histopatológicos: El complejo
prostático se microdisecó en lóbulos individuales y se fijó en 10%
de formol neutral con buffer. Los tejidos se procesaron y se tiñeron
con hematoxilina y eosina para los análisis histopatológicos de
rutina. Los tejidos de TRAMP fueron examinados con microscopio
óptico y calificados mediante los siguientes criterios: al epitelio
normal se le asignó una calificación de 1,0; los signos tempranos
de neoplasia intraepitelial prostática (PIN) con penachos del
epitelio y aumento de la relación núcleo:citoplasma se calificaron
como 2,0; la PIN más avanzada con notables estructuras cribiformes y
aumento de las figuras mitóticas y/o apoptóticas se calificó como
3,0; la pérdida de espacios interductales y la invasión de las
membranas basales por epitelio neoplásico se calificó como 4,0; la
pérdida total de lúmenes ductales con evidencia de adenocarcinoma
se calificó como 5,0; y las láminas de células tumorales
anaplásticas se calificó como 6,0. A fin de generar una
calificación para cada animal, se usó la máxima calificación
histológica para los lóbulos ventral, dorsal o lateral de la
próstata para calcular una media para el grupo de tratamiento. La
calificación pico predominante para todos los animales TRAMP era de
4,0, con escasas calificaciones hidrológicas inferiores a 3,0.
Cultivos celulares: Las células
TRAMP-C con células tumorales epitelioides no
clonadas de pasaje temprano (10-15 pasajes in
vitro), derivadas independientemente de un ratón TRAMP. Las
células se propagaron en cultivo mediante DMEM (Biowhittaker,
Walkersville, MD) suplementado hasta una concentración final de 5%
de suero fetal bovino (Biowhittaker), 5% de
Nu-Serum (Collaborative Biomedical Products,
Bedford, MA), 5 \mug/ml de insulina (Sigma Chemical, St. Louis,
MO), y 0,01 \muM de dihidrotestosterona.
A fin de obtener las líneas que expresan
GM-CSF, las células se infectaron con un retrovirus
que contiene el gen gm-c sf murino derivado del
virus LTR de leucemia murina de Maloney, mediante el uso de la línea
productora \psiCRIP (presente de Somatix, Inc, Alameda, CA). Los
sobrenadantes que contienen retrovirus se agregaron a los cultivos
de TRAMP-C y se incubaron durante la noche en
presencia de 8 \mug/ml de polibreno (Sigma). La producción de
GM-CSF fue analizada por ELISA (Pharmingen, San
Diego, CA). Tanto GMTRAMPC1 como GMTRAMP-C2
secretaron GM-CSF a 150-200
ng/ml/1x10^{6} células/24 horas. Las células usadas para la
inyección fueron liberadas de los discos de cultivo de tejido con
tripsina (BioWhittaker) y se lavaron tres veces en solución salina
equilibrada de Hank (BioWhittaker). Las células se resuspendieron
hasta una densidad de 1x10^{6} células/ml, se irradiaron con
12.000 rads mediante un irradiador de fuente de cesio y se
inyectaron por vía subcutánea en un volumen de 0,1 ml.
De la incidencia de tumor primario en ratones
TRAMP después del tratamiento con vacunas celulares y anti-
CTLA-4. Los ratones TRAMP machos fueron vacunados
con una combinación de TRAMP-C 1 y
TRAMP-C2 irradiados (TRAMP-C 1/C2)
o TRAMP-C 1/C2 transducidos para expresar el gen
murino gm-c sf (GMTRAMP-C1/C2) a las
14-16 semanas de edad. El tratamiento con
anticuerpo comenzó 7 días después de la vacunación. A fin de obtener
una indicación temprana de la efectividad de los tratamientos,
cuatro ratones de cada grupo fueron sacrificados tres semanas
después de comenzar con el tratamiento y examinados respecto de la
incidencia de tumor en la necropsia macroscópica y en el nivel
microscópico tras la microdisección de los lóbulos prostáticos. Si
bien no hubo significativas diferencias en el peso medio de los
animales o el tracto urogenital entre los grupos de tratamiento,
hubo una notable diferencia en la incidencia de tumores. Con
independencia de la vacuna, 11 de 12 ratones (92%) en los grupos de
tratamiento que recibieron anticuerpo control tenían tumor
detectable. En contraste, sólo 3 de 12 (25%) ratones que recibieron
anti-CTLA-4 tuvieron tumor
detectable.
A las tres semanas después de tratamiento, los
tumores de los ratones tratados con anticuerpo control eran
suficientemente grandes para justificar la preocupación sobre la
supervivencia de los restantes 150 ratones. En consecuencia, a fin
de evaluar la incidencia de tumores y el grado de tumor, los
restantes 25 ratones de cada grupo fueron sacrificados 5 semanas
más tarde (u ocho semanas después del tratamiento), y se evaluaron
los siguientes criterios en la necropsia macroscópica y la
microdisección del complejo prostático: peso del animal, peso de la
próstata, incidencia de tumores e histopatología de la enfermedad
prostática. De modo similar a los análisis a las 3 semanas después
del tratamiento, no hubo significativas diferencias de peso de los
animales o peso de las próstatas entre cualquiera de los grupos de
tratamiento. Sin embargo, hubo diferencias significativas en
incidencia de tumores (Figura 16A). Se observó una incidencia de
tumor significativamente inferior en ratones tratados con
anti-CTLA-4 y la vacuna
TRAMP-C1/C2 (43%, P = 0,05) o la vacuna
GMTRAMP-C1/C2 (33%, P = 0,009) respecto de los
ratones tratados con anticuerpo control solo (69%).
El tratamiento con
anti-CTLA-4 solo no tuvo ningún
efecto significativo sobre la incidencia de tumor (64%), ni hubo
reducción significativa de incidencias de tumores en ratones que
recibieron tratamiento con anticuerpo control y con cualquiera de
las vacunas (55% de TRAMP-C1/C2 y 75% de
GMTRAMPC1/C2). En consecuencia, ni el bloqueo de
CTLA-4 ni la vacunación sola fueron efectivos para
el tratamiento de tumores primarios en ratones TRAMP. No obstante,
la combinación de anti-CTLA-4 y
cualquiera de las vacunas tuvo un efecto sinérgico sobre la
incidencia de tumores. La expresión de GM-CSF por la
vacuna puede potenciar la respuesta antitumor, dado que la
incidencia de tumores era ligeramente inferior en ratones vacunados
con GMTRAMP-CI/C2 (33% de
anti-CTLA4+GMTRAMP-C1/C2
versus 43% de anti-
CTLA-4+TRAMP-CUC2).
Dado que cada grupo contenía ratones
provenientes de camadas con fechas de nacimiento separadas por dos
semanas, se reevaluó la incidencia de los tumores en función de la
edad de iniciación del tratamiento. Tal como se muestra en la
Figura 16B para ratones vacunados con GMTRAMPC1/C2, hubo una
significativa reducción de la incidencia de tumores en los ratones
tratados a las 14 semanas de edad (p = 0,003), pero no en el grupo
tratado a las 16 semanas de edad (p = 0,1). Esto sugiere que la
etapa de desarrollo del tumor en el momento de la inmunoterapia de
los ratones TRAMP influye sobre la eficacia del tratamiento. La
incidencia de tumor en ratones tratados con
TRAMP-C1/C2 y
anti-CTLA-4 era equivalente en
cualquier edad de tratamiento y no era significativamente diferente
de los ratones control.
Reducción del grado del tumor en ratones
TRAMP tratados con inmunoterapia de combinación. A fin de
evaluar la severidad de las lesiones prostáticas en ratones TRAMP,
se preparó cada lóbulo individual de la próstata apara el análisis
histopatológico de rutina. Se usó una escala de calificación para
evaluar el grado de transformación o grado de tumor observado en
las próstatas de ratones TRAMP, tal como se describió con
anterioridad. La calificación histológica pico para los lóbulos
prostáticos ventral, dorsal o lateral se determinó para cada animal
y se calculó el promedio para el grupo de tratamiento como
calificación pico media. Tal como se muestra en la Figura 17A, hubo
una significativa reducción de la severidad de las lesiones en
ratones tratados con anti-CTLA-4 y
cualquiera de las vacunas. Específicamente, los ratones TRAMP
tratados con TRAMP-C1/C2 y
anti-CTLA-4 tuvieron una
calificación significativamente inferior (calificación media de pico
4,6) que los ratones control tratados con Ig (calificación media de
pico 5,5, p = 0,03). Aún más notable fue el descubrimiento de que
los ratones tratados con GMTRAMP-CI/C2 y
anti-CTLA-4 tenían un grado de tumor
significativamente inferior (calificación media de pico 3,9) que
todos los tres grupos de control: control Ig/sin vacuna (p =
0,0009), control Ig/GMTRAMP-C1/C2 (calificación
media de pico 5,5, p = 0,0002), y tratamiento
anti-CTLA-4 solo (calificación media
de pico 4,8, p = 0,04). El tratamiento con cualquiera de las
vacunas sin bloqueo de CTLA-4 o con bloqueo de CTLA-
4 solo no tenía efecto significativo sobre el grado de tumor. Estos
hallazgos demuestran que además de reducir la incidencia de tumores
primarios a las 8 semanas después del tratamiento, la vacunación con
una vacuna basada en células de tumor en combinación con bloqueo de
CTLA-4 reduce la severidad de las lesiones
prostáticas en ratones TRAMP.
Tal como se realizó para el análisis de la
incidencia de tumores, los datos histológicos se volvieron a
analizar para el grado de tumor en función de la edad al momento
del tratamiento (Figura 17B). De modo similar a la incidencia de
tumor, la máxima significancia estadística residió en ratones
tratados a las 14 semanas de edad. Los ratones tratados con
GMTRAMP-C1/C2 y
anti-CTLA-4 (calificación media de
pico = 3,5) tenían menor grado de tumor que los ratones tratados
con GMTRAMP-C 1/C2 e Ig control (calificación media
de pico = 5,3, p = 0,0002) y los ratones tratados con Ig control
sola (calificación media de pico = 4,7, p = 0,0002). Es interesante
destacar que, al ser tratados a las 16 semanas de edad, los ratones
TRAMP que recibieron la vacuna GMTRAMP-C 1/C2 y
anti-CTLA-4 (calificación media de
pico = 4,5) solo tuvieron una calificación media de pico ligeramente
inferior a los ratones tratados con GMTRAMP-C 1/C2
e Ig control (calificación media de pico = 5,6, p = 0,03).
Quizás la propiedad histológica más destacada de
estos análisis haya sido observada en los ratones tratados con
GMTRAMPC1/C2 y anti-CTLA-4, en los
cuales hubo una acumulación de células inflamatorias en los espacios
interductales. En estos ratones, las células inflamatorias se
asociaron estrechamente con la vasculatura hallada en el estroma.
En contraste, no hubo acumulación detectable de células
inflamatorias en cualquiera de los ratones tratadas con Ig control.
En ratones TRAMP tratados con una vacuna que expresa
GM-CSF sola, hubo áreas ocasionales en las cuales
se detectaron células inflamatorias, pero estos sitios no eran tan
extensos como los observados en ratones tratados también con
anti-CTLA-4. Las propiedades
morfológicas de las células infiltrativas sugieren que la
inflamación perivascular comprendía células mieloides, así como
células linfoides.
Inducción de prostatitis en ratones no
transgénicos por vacunación y bloqueo CTLA-4. La
reducción de incidencia y la severidad de tumores junto con los
infiltrados inflamatorios de la próstata en ratones TRAMP ocho
semanas después de la inmunización eran indicadores de una potente
respuesta inmune. El hecho de que la tumorogénesis en estos ratones
es impulsada por la expresión específica de próstata de SV40 Tag
planteó la posibilidad de que la respuesta antitumoral esté
dirigida contra epitopos derivados de este oncogen viral. Los
autores consideraron esto poco probable, dado que la expresión TAg
no pudo ser detectada en las células tumorales de la vacuna
mediante RT-PCR, y las células tumorales lisadas por
CTL no eran reactivas contra restringidos por
H-2^{b} de Tag (comunicación personal, S.
Tevethian y L. Mylin, Pennsylvania State University).
A fin de determinar si la respuesta inmune
generada por el régimen terapéutico se limitaba a antígenos
codificados por el oncogén, se vacunaron ratones C57/BL6 no
transgénicos y se examinaron las próstatas para buscar evidencias
de inflamación 28 días después. No hubo evidencia de inflamación
significativa o daño tisular en los lóbulos dorsolateral o ventral
de las próstatas de los ratones vacunados solo con la vacuna
GMTRAMP-C1/C2. Sin embargo, hubo extensa
infiltración de células mononucleares y destrucción de epitelio
glandular del tracto reproductivo masculino, incluso de la próstata
dorsolateral en ratones vacunados con GMTRAMP-C1/C2
y tratados con anti-CTLA-4. Estos
resultados demuestran que la respuesta desencadenada por el régimen
de vacunación está dirigido en parte a antígenos expresados por
células prostáticas normales.
Los datos anteriores demuestran que el bloqueo
de CTLA-4 se puede combinar sinérgicamente con
vacunas celulares que expresan citoquinas a fin de producir un
régimen de tratamiento efectivo para el tratamiento de tumores
primarios. La reducción la incidencia de tumores, así como del grado
histológico del tumor indica que la combinación de una vacuna
celular junto con anti-CTLA-4 era
suficiente para enlentecer la progresión de tumores prostáticos
primarios. No es sorprendente que el sistema inmune es incapaz de
eliminar completamente los tumores en este modelo agresivo, pero es
notable que una respuesta inmune antitumoral pueda tener un impacto
significativo sobre la progresión de la enfermedad en una situación
en la cual todo el órgano presenta transformación. La capacidad de
una vacuna celular en combinación con el bloqueo de
CTLA-4 para reducir significativamente la
incidencia y la carga de tumores en un modelo TRAMP agresivo subraya
la destacada eficacia de este enfoque inmunoterapéutico.
Los ratones TRAMP tratados con la vacuna o con
anticuerpo solo no mostraron reducción de la incidencia de tumores
o el grado de tumor, mientras que la combinación de ambos dio por
resultado una significativa reducción de ambos criterios. Esto
sugiere que una fuente adicional de antígeno proveniente de la
vacuna celular contribuye a la imprimación de las células T, lo
cual es incentivado por el bloqueo de las interacciones con CTLA-
4/B7. El hecho de que la incidencia de tumores y el grado de tumor
fueran inferiores en ratones que recibieron la vacuna
GMTRAMP-C1/C2, respecto de los que recibieron la
vacuna TRAMP-C1/C2 sugiere que el efecto es
incentivado por el reclutamiento y la activación de las APC por la
expresión de GM-CSF.
La vacunación de ratones no transgénicos con la
misma estrategia terapéutica que demostró ser efectiva para el
tratamiento de ratones TRAMP condujo a prostatitis autoinmune y a la
destrucción de parte del epitelio prostático. Este descubrimiento
sugiere que el enfoque de la vacunación es capaz de inducir una
respuesta autoinmune contra antígenos prostático normales. Estos
resultados sostienen aún más el concepto de que la inmunidad
tumoral efectiva de hecho está estrechamente ligada a la
autoinmunidad.
Más que ser vista como un efecto secundario
problemático de la inmunoterapia tumoral, la inducción intencional
de la autoinmunidad contra antígenos específicos de tejido definidos
puede proporcionar una estrategia práctica para la generación de
respuestas antitumorales efectivas. Tal como se demuestra en la
presente, el bloqueo de CLTA-4 de la presente
invención provee un efectivo tratamiento inmunológico de tumores
originados de tejidos no
esenciales.
esenciales.
\newpage
Ejemplo
12
gp100 es una proteína específica de melanocitos
identificada como blanco frecuente de células T provenientes de
pacientes con melanoma humana. Los trabajos previos demostraron que
los ratones no pueden ser inmunizados con péptidos derivados de los
péptidos murinos normales, pero dicha inmunidad contra el péptido
murino podría ser obtenida si se inmunizaban los ratones con la
correspondiente secuencia humana. Esto sugirió que la inmunización
con humanos rompió la tolerancia para el ratón, lo cual permite
desarrollar la autoinmunidad. Este estudio estuvo dirigido a
determinar si el bloqueo de CTLA-4 podría ser
efectivo para la inducción de autoinmunidad contra el péptido
singénico murino.
Se aislaron células dendríticas (DC) esplénicas
de ratones C57BL6 (H-2b) por técnicas
convencionales. Las DC luego se incubaron con y sin un péptido
fijador de H-2b correspondiente a la secuencia
normal de gp100 murino (Mgp100). El día -21, se inmunizaron los
ratones con DC pulsadas o no pulsadas con péptido, seguido de
inyección de 100 \mug de
anti-CTLA-4 (MAb 9H10) o anticuerpo
control de hámster (MAb 560). Los días -14 y -7, los ratones
recibieron refuerzo por inyección de DC apropiados, pero sin ningún
tratamiento de anticuerpo. El día 0, los ratones de cada cohorte de
tratamiento se separaron en dos grupos para el análisis.
Grupo A: células T de ganglio linfático fueron
purificadas y examinadas en su capacidad para producir IFN\gamma
en respuesta a la estimulación por células presentadoras de antígeno
singénicas pulsadas con Mgp100. Tal como se muestra en la Figura
18, sólo los ratones inmunizados en condiciones de bloqueo de
CTLA-4 fabricaron cantidades significativas de
IFN\gamma.
Grupo B: se expusieron los ratones a células de
melanoma B16 implantadas subcutáneamente en el lomo. Se evaluó el
crecimiento del tumor por medición del diámetro en dos dimensiones
mediante calibres. Tal como se muestrea en la Figura 19, sólo el
grupo inmunizado en condiciones de bloqueo de CTLA-4
mostró inhibición de crecimiento del tumor. Aunque finalmente todos
los ratones sucumbieron al tumor, este resultado muestra la
inducción de una respuesta antitumoral muy efectiva.
Los ejemplos anteriores proporcionan contundente
apoyo al potencial terapéutico del bloqueo de la señal inhibidora
de activación de células T mediada por CTLA-4 como
estrategia para mejorar las respuestas antitumorales por inducción
de la inmunidad contra autoantígenos específicos de tejido.
Si bien la invención precedente ha sido descrita
con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo a objeto de
claridad de comprensión, será fácilmente aparente para los expertos
en la técnica, a la luz de las enseñanzas de la presente invención
que se le pueden hacer ciertos cambios y modificaciones sin
apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Los Regentes de la Universidad de California
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Estimulación de células T contra autoantígenos mediante agentes bloquea- {}\hskip4,5cm dores de CTLA-4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: FLEHR HOHBACH TEST ALBRITTON & HERBERT LLP
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 4 Embarcadero Center, Suite 3400
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: San Francisco
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE. UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 94111-4187
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA EN COMPUTADORA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO MEDIO: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTADORA: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD PRESENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN PARA APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Lorenz, Todd A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE INSCRIPCIÓN: 39.754
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO: FP-68668 REFERENCIA/EXPEDIENTE
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (415) 781-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (415) 398-3249
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTACTCTACT CCCTGAGGAG CTCAGCACAT TTGCC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATACTTACC AGAATCCGGG CATGGTTCTG GATCA
\hfill35
Claims (27)
1. Uso de un anticuerpo
anti-CTLA-4 o su fragmento y una
preparación de autoantígeno para la fabricación de un medicamento
para tratar metástasis establecida.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que la preparación de autoantígeno comprende células
tumorales.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 2, en
el que las células tumorales son células tumorales irradiadas.
4. El uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que además comprende el uso de una citoquina
en la fabricación de dicho medicamento.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en
el que la citoquina se provee como células tumorales transducidas
con la citoquina.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 5, en
el que las células tumorales son células irradiadas.
7. El uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6, en el que la citoquina es GM o
GM-CSF.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 1,
que además comprende el uso de una vacuna de tumor en la fabricación
de dicho medicamento.
9. El uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que el medicamento es para tratar
metástasis en las cuales la pérdida o modificación de parte o la
totalidad del tejido normal es aceptable.
10. El uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que dichas metástasis son metástasis
pulmonares de un melanoma.
11. El uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho medicamento es para tratar
un humano.
12. El uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal.
13. El uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo
humanizado.
14. Un anticuerpo
anti-CTLA-4 o su fragmento para ser
usado en el tratamiento de metástasis establecidas en combinación
simultánea o secuencial con una preparación de autoantígeno.
15. El anticuerpo o su fragmento de acuerdo con
la reivindicación 14, en el que la preparación de autoantígeno
comprende células tumorales.
16. El anticuerpo o su fragmento de acuerdo con
la reivindicación 15, en el que las células tumorales son células
tumorales irradiadas.
17. El anticuerpo o su fragmento de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, para ser usado en el
tratamiento de metástasis establecidas en combinación simultánea o
secuencial con una citoquina, además de la preparación de
autoantígeno.
18. El anticuerpo o su fragmento de acuerdo con
la reivindicación 17, en el que la citoquina se proporciona como
células tumorales transducidas con la citoquina.
19. El anticuerpo o su fragmento de acuerdo con
la reivindicación 18, en el que las células tumorales son células
irradiadas.
20. El anticuerpo o su fragmento de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que la citoquina
es GM o GM-CSF.
21. El anticuerpo o su fragmento de acuerdo con
la reivindicación 14, para ser usado en combinación simultánea o
secuencial con una vacuna de tumor.
22. El anticuerpo o su fragmento de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21, que es para usar en el
tratamiento de metástasis en las cuales la pérdida o modificación de
parte o la totalidad del tejido normal es aceptable.
23. El anticuerpo o su fragmento de acuerdo con
la reivindicación 22, que es para usar en el tratamiento de
metástasis pulmonar de un melanoma.
24. El anticuerpo o su fragmento de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 14 a 23, que es para usar en el
tratamiento de un ser humano.
25. El anticuerpo o su fragmento de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 14 a 24, que es un anticuerpo
monoclonal o su fragmento.
26. El anticuerpo o su fragmento de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 14 a 25, que es un anticuerpo
humanizado o su fragmento.
27. Una preparación de autoantígeno para usar
como agente estimulador de respuesta inmune en el tratamiento de
metástasis establecidas en combinación simultánea o en secuencia con
un anticuerpo anti-CTLA-4 o su
fragmento.
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