CN110168105B - 用于对t细胞受体进行测序的系统和方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文公开了可使用短读段重建、提取和/或分析TCR序列的方法和系统。所述方法和系统可以应用于单个细胞和批量测序数据。

Description

用于对T细胞受体进行测序的系统和方法及其用途
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2016年12月9日提交的美国临时申请No.62/432,525和2017年5月19日提交的美国临时申请No.62/508,667的优先权，每个临时申请的内容均全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
技术领域
本公开整体涉及生物信息学领域。更具体地讲，本公开涉及用于对T细胞受体(TCR)进行测序、鉴定细胞群中的T细胞克隆和用于批量测序的系统和方法。该方法鉴定与肿瘤反应和患者存活率相关的高频T细胞克隆。
背景技术
使用免疫检查点抑制剂的单一或联合疗法已在癌症患者中显示出显著的疗效。然而，大多数患者要么没有反应，要么只是短暂反应，引发了关于下一代免疫疗法设计的根本问题。为了克服肿瘤微环境的免疫抑制性质并促进持久反应，可进行共抑制通路和共刺激通路的双重靶向以诱导更强的T细胞活化。在一些情况下，抗体组合可以例如通过恢复稳态调节因子的平衡来协同增强CD8+ T细胞效应子功能，从而导致肿瘤排斥和长期反应。T细胞克隆扩增可提供特异性基因特征，从而指明联合疗法的分子机制。现有的TCR序列分析技术不能基于短读测序数据准确可靠地鉴定TCR序列和克隆扩增。这些和其他缺点通过本文所述的方法和系统得到了解决。
发明内容
应当理解，下面的一般性描述和详细描述都仅为示例性和说明性而非限制性的。本发明提供了用于以下操作的方法和系统：对从T细胞获得的RNA的少于约100个碱基对的短读段进行测序(和/或接收指示其的序列数据)，将短读段与参考序列进行比对，其中参考序列不包含TCR基因序列，从而生成包括映射的短读段和未映射的短读段的读段集，丢弃读段集中的映射的短读段，将读段集中剩余的未映射的短读段组装成一个或多个长读段，并由一个或多个长读段生成一个或多个TCR序列。
本发明公开了用于以下操作的方法：对T细胞受体(TCR)进行测序，包括对从T细胞获得的RNA的少于约100个碱基对的短读段进行测序；将短读段与参考序列进行比对，其中参考序列不包含TCR基因序列，从而生成包括映射的短读段和未映射的短读段的读段集；丢弃读段集中的映射的短读段；将读段集中剩余的未映射的短读段组装成一个或多个长读段；将一个或多个长读段翻译成对应的氨基酸序列；将TCR V区和TCR J区氨基酸参考序列分成约六个氨基酸的k串，将k串与来自翻译步骤的对应氨基酸序列进行比对，检测k串中映射到对应氨基酸序列的一个或多个保守TCR CDR3残基，对检测到的保守水平进行评分，选择保守分数高于阈值保守分数的对应氨基酸序列，并检测所选对应氨基酸序列中的候选CDR3区氨基酸序列；鉴定一个或多个长读段中候选CDR3区氨基酸序列的核酸序列；将候选CDR3区核酸序列上游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个TCR V基因参考序列进行比对，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选TCR V基因序列；并且将候选CDR3区核酸序列下游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个TCR J基因参考序列进行比对，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选TCR J基因序列，从而生成TCR序列。
本发明公开了包括一个或多个处理器的装置；以及包含处理器可执行指令的存储器，所述处理器可执行指令当由一个或多个处理器执行时，使得装置接收包含从T细胞获得的RNA的少于约100个碱基对的短读段的序列数据；将短读段与参考序列进行比对，其中参考序列不包含TCR基因序列，从而生成包括映射的短读段和未映射的短读段的读段集；丢弃读段集中的映射的短读段；将读段集中剩余的未映射的短读段组装成一个或多个长读段；将一个或多个长读段翻译成对应的氨基酸序列；将TCR V区和TCR J区氨基酸参考序列分成约六个氨基酸的k串，将k串与来自翻译步骤的对应氨基酸序列进行比对，检测k串中映射到对应氨基酸序列的一个或多个保守TCR CDR3残基，对检测到的保守水平进行评分，选择保守分数高于阈值保守分数的对应氨基酸序列，并检测所选对应氨基酸序列中的候选CDR3区氨基酸序列；鉴定一个或多个长读段中候选CDR3区氨基酸序列的核酸序列；将候选CDR3区核酸序列上游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个TCR V基因参考序列进行比对，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选TCR V基因序列；并且将候选CDR3区核酸序列下游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个TCR J基因参考序列进行比对，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选TCR J基因序列，从而生成TCR序列。
本发明公开了其上包含有计算机可执行指令的计算机可读介质，该计算机可读介质被配置用于执行包括以下操作的方法：对从T细胞获得的RNA的少于约100个碱基对的短读段进行测序；将短读段与参考序列进行比对，其中参考序列不包含TCR基因序列，从而生成包括映射的短读段和未映射的短读段的读段集；丢弃读段集中的映射的短读段；将读段集中剩余的未映射的短读段组装成一个或多个长读段；将一个或多个长读段翻译成对应的氨基酸序列；将TCR V区和TCR J区氨基酸参考序列分成约六个氨基酸的k串，将k串与来自翻译步骤的对应氨基酸序列进行比对，检测k串中映射到对应氨基酸序列的一个或多个保守TCR CDR3残基，对检测到的保守水平进行评分，选择保守分数高于阈值保守分数的对应氨基酸序列，并检测所选对应氨基酸序列中的候选CDR3区氨基酸序列；鉴定一个或多个长读段中候选CDR3区氨基酸序列的核酸序列；将候选CDR3区核酸序列上游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个TCR V基因参考序列进行比对，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选TCR V基因序列；并且将候选CDR3区核酸序列下游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个TCR J基因参考序列进行比对，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选TCR J基因序列，从而生成TCR序列。
本发明公开了用于以下操作的方法：对BCR进行测序，包括对从B细胞获得的少于约100个碱基对的RNA的短读段进行测序；将短读段与参考序列进行比对，其中参考序列不包含BCR基因序列，从而生成包括映射的短读段和未映射的短读段的读段集；丢弃读段集中的映射的短读段；将读段集中剩余的未映射的短读段组装成一个或多个长读段；将一个或多个长读段翻译成对应的氨基酸序列；将BCR V区和BCR J区氨基酸参考序列分成约六个氨基酸的k串，将k串与来自翻译步骤的对应氨基酸序列进行比对，检测k串中映射到对应氨基酸序列的一个或多个保守BCR CDR3残基，对检测到的保守水平进行评分，选择保守分数高于阈值保守分数的对应氨基酸序列，并检测所选对应氨基酸序列中的候选CDR3区氨基酸序列；鉴定一个或多个长读段中候选CDR3区氨基酸序列的核酸序列；将候选CDR3区核酸序列上游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个BCR V基因参考序列进行比对，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选BCR V基因序列；并且将候选CDR3区核酸序列下游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个BCR J基因参考序列进行比对，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选BCR J基因序列，从而生成BCR序列。
本发明公开了包括一个或多个处理器的装置；以及包含处理器可执行指令的存储器，所述处理器可执行指令当由一个或多个处理器执行时，使得装置接收包含从B细胞获得的少于约100个碱基对的RNA的短读段的序列数据；将短读段与参考序列进行比对，其中参考序列不包含BCR基因序列，从而生成包括映射的短读段和未映射的短读段的读段集；丢弃读段集中的映射的短读段；将读段集中剩余的未映射的短读段组装成一个或多个长读段；将一个或多个长读段翻译成对应的氨基酸序列；将BCR V区和BCR J区氨基酸参考序列分成约六个氨基酸的k串，将k串与来自翻译步骤的对应氨基酸序列进行比对，检测k串中映射到对应氨基酸序列的一个或多个保守BCR CDR3残基，对检测到的保守水平进行评分，选择保守分数高于阈值保守分数的对应氨基酸序列，并检测所选对应氨基酸序列中的候选CDR3区氨基酸序列；鉴定一个或多个长读段中候选CDR3区氨基酸序列的核酸序列；将候选CDR3区核酸序列上游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个BCR V基因参考序列进行比对，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选BCR V基因序列；并且将候选CDR3区核酸序列下游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个BCR J基因参考序列进行比对，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选BCR J基因序列，从而生成BCR序列。
本发明公开了其上包含有计算机可执行指令的计算机可读介质，该计算机可读介质被配置用于执行包括以下操作的方法：对从B细胞获得的少于约100个碱基对的RNA的短读段进行测序；将短读段与参考序列进行比对，其中参考序列不包含BCR基因序列，从而生成包括映射的短读段和未映射的短读段的读段集；丢弃读段集中的映射的短读段；将读段集中剩余的未映射的短读段组装成一个或多个长读段；将一个或多个长读段翻译成对应的氨基酸序列；将BCR V区和BCR J区氨基酸参考序列分成约六个氨基酸的k串，将k串与来自翻译步骤的对应氨基酸序列进行比对，检测k串中映射到对应氨基酸序列的一个或多个保守BCR CDR3残基，对检测到的保守水平进行评分，选择保守分数高于阈值保守分数的对应氨基酸序列，并检测所选对应氨基酸序列中的候选CDR3区氨基酸序列；鉴定一个或多个长读段中候选CDR3区氨基酸序列的核酸序列；将候选CDR3区核酸序列上游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个BCR V基因参考序列进行比对，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选BCR V基因序列；并且将候选CDR3区核酸序列下游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个BCR J基因参考序列进行比对，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选BCR J基因序列，从而生成BCR序列。
在所公开的方法、装置和计算机可读介质的一些方面，短读段是由RNA的随机引发获得的。
在所公开的方法、装置和计算机可读介质的一些方面，T细胞是从人或小鼠获得的。
在所公开的方法、装置和计算机可读介质的一些方面，参考序列包括人基因组、小鼠基因组、人转录组或小鼠转录组。
在所公开的方法、装置和计算机可读介质的一些方面，丢弃读段集中的映射的短读段还包括丢弃读段集中小于约35个碱基对或具有低序列分辨率的未映射的短读段。
在所公开的方法、装置和计算机可读介质的一些方面，将读段集中剩余的未映射的短读段组装成一个或多个长读段包括将一个或多个未映射的短读段与TCR序列参考数据库中的一个或多个TCR序列进行比对；并且基于比对结果，将一个或多个未映射的短读段组装成长读段。
在一些方面，本发明公开了方法、装置和计算机可读介质，还包括将TCR C区核酸序列附加到TCR序列。
在一些方面，本发明公开了方法、装置和计算机可读介质，还包括在对从T细胞获得的RNA的少于约100个碱基对的短读段进行测序之前，对由其获得T细胞的受试者施用免疫疗法。在一些方面，免疫疗法包括单一疗法或联合疗法。在一些方面，联合疗法包括共刺激激动剂和共抑制拮抗剂。
在所公开的方法、装置和计算机可读介质的一些方面，对受试者的第一多个T细胞重复所有步骤，其中在施用治疗之前收集T细胞；确定第一多个T细胞中存在的独特TCR序列的出现次数；向受试者施用治疗；对受试者的第二多个T细胞重复所有步骤，其中在施用治疗之后收集T细胞；确定第二多个T细胞中存在的独特TCR序列的出现次数；并且基于第一多个T细胞和第二多个T细胞中存在的独特TCR序列的出现次数，确定经历克隆扩增的一个或多个独特TCR序列。
在一些方面，本发明公开了方法、装置和计算机可读介质，还包括基于经历克隆扩增的一个或多个独特TCR序列，确定T细胞克隆扩增特征。
在一些方面，本发明公开了方法、装置和计算机可读介质，还包括使用T细胞克隆扩增特征查询T细胞克隆扩增特征的数据库和对应的治疗反应；基于查询结果，确定受试者对治疗作出反应的可能性。
在一些方面，本发明公开了方法、装置和计算机可读介质，还包括以下步骤：确定受试者对治疗的反应；将T细胞克隆扩增特征存储在数据库中；并且将受试者对治疗的反应与数据库中的T细胞克隆扩增特征相关联。
在一些方面，本发明公开了方法、装置和计算机可读介质，还包括确定TCR序列存在于响应于治疗而扩增的T细胞克隆中；产生含有TCR序列的一个或多个T细胞；向受试者施用一个或多个T细胞；并且向受试者施用治疗。
在所公开的方法、装置和计算机可读介质的一些方面，其中对从T细胞获得的RNA的少于约100个碱基对的短读段进行测序包括对从多个T细胞获得的RNA的少于约100个碱基对的短读段进行批量测序。
在一些方面，本发明公开了方法、装置和计算机可读介质，还包括执行以下步骤：通过将候选CDR3区核酸序列下游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个TCR J基因参考序列进行比对的步骤来比对短读段，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选TCR J基因序列，从而为多个T细胞中的每一个生成TCR序列。
在所公开的方法、装置和计算机可读介质的一些方面，执行通过将候选CDR3区核酸序列下游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个TCR J基因参考序列进行比对的步骤来比对短读段，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选TCR J基因序列，从而为多个T细胞中的每一个生成TCR序列的步骤包括执行以下步骤：通过将候选CDR3区核酸序列下游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个TCR J基因参考序列进行比对的步骤来比对短读段，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选TCR J基因序列，从而生成TCR序列，这包括对以下步骤中的一个或多个的至少一部分进行归类：通过将候选CDR3区核酸序列下游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个TCR J基因参考序列进行比对的步骤来比对短读段，对比对度进行评分，并将高于阈值比对评分的长读段鉴定为包含候选TCR J基因序列，从而作为作业生成TCR序列；并且并行地跨多个处理器分配每个作业的工作量。
在所公开的方法、装置和计算机可读介质的一些方面，B细胞是从人或小鼠获得的。
在所公开的方法、装置和计算机可读介质的一些方面，将读段集中剩余的未映射的短读段组装成一个或多个长读段包括将一个或多个未映射的短读段与BCR序列参考数据库中的一个或多个BCR序列进行比对；并且基于比对结果，将一个或多个未映射的短读段组装成长读段。
在一些方面，本发明公开了方法、装置和计算机可读介质，还包括将BCR C区核酸序列附加到BCR序列。
在一些方面，本发明公开了方法、装置和计算机可读介质，还包括在对从B细胞获得的少于约100个碱基对的RNA的短读段进行测序之前，对由其获得B细胞的受试者施用免疫疗法。在一些方面，免疫疗法包括单一疗法或联合疗法。在一些方面，联合疗法包括共刺激激动剂和共抑制拮抗剂。
在一些方面，本发明公开了方法、装置和计算机可读介质，还包括对受试者的第一多个B细胞重复所有步骤，其中在施用治疗之前收集B细胞；确定第一多个B细胞中存在的独特BCR序列的出现次数；向受试者施用治疗；对受试者的第二多个B细胞重复所有步骤，其中在施用治疗之后收集B细胞；确定第二多个B细胞中存在的独特BCR序列的出现次数；并且基于第一多个B细胞和第二多个B细胞中存在的独特BCR序列的出现次数，确定经历克隆扩增的一个或多个独特BCR序列。
在一些方面，本发明公开了方法、装置和计算机可读介质，还包括基于经历克隆扩增的一个或多个独特BCR序列，确定B细胞克隆扩增特征。
在一些方面，本发明公开了方法、装置和计算机可读介质，还包括使用B细胞克隆扩增特征查询B细胞克隆扩增特征的数据库和对应的治疗反应；基于查询结果，确定受试者对治疗作出反应的可能性。
在一些方面，本发明公开了方法、装置和计算机可读介质，还包括确定受试者对治疗的反应；将B细胞克隆扩增特征存储在数据库中；并且将受试者对治疗的反应与数据库中的B细胞克隆扩增特征相关联。
在一些方面，本发明公开了方法、装置和计算机可读介质，还包括确定BCR序列存在于响应于治疗而扩增的B细胞克隆中；产生含有BCR序列的一个或多个B细胞；向受试者施用一个或多个B细胞；并且向受试者施用治疗。
在所公开的方法、装置和计算机可读介质的一些方面，对从B细胞获得的少于约100个碱基对的RNA的短读段进行测序包括对从多个B细胞获得的少于约100个碱基对的RNA的短读段进行批量测序。
在一些方面，本发明公开了方法、装置和计算机可读介质，还包括执行以下步骤：通过将候选CDR3区核酸序列下游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个BCR J基因参考序列进行比对的步骤来比对短读段，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选BCR J基因序列，从而为多个B细胞中的每一个生成BCR序列。
在所公开的方法、装置和计算机可读介质的一些方面，执行通过将候选CDR3区核酸序列下游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个BCR J基因参考序列进行比对的步骤来将短读段与参考序列进行比对，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选BCR J基因序列，从而为多个B细胞中的每一个生成BCR序列的步骤包括执行以下步骤：通过将候选CDR3区核酸序列下游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个BCR J基因参考序列进行比对的步骤来将短读段与参考序列进行比对，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选BCR J基因序列，从而生成BCR序列，这包括对以下步骤中的一个或多个的至少一部分进行归类：通过将候选CDR3区核酸序列下游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个BCR J基因参考序列进行比对的步骤来将短读段与参考序列进行比对，对比对度进行评分，并将高于阈值比对评分的长读段鉴定为包含候选BCR J基因序列，从而作为作业生成BCR序列；并且并行地跨多个处理器分配每个作业的工作量。
其他优点将在下面的描述中进行部分阐述或者可以通过实践来了解。所述优点将借助于所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。
附图说明
并入本说明书中并构成其一部分的附图示出了实施方案，并与说明书一起用于解释所述方法和系统的原理。
图1是示出随机测序短重复序列并对未映射读段进行阴性选择以鉴定TCR CDR3序列的方法的流程图。
图2描绘了治疗后肿瘤内CD8+ T细胞中的显著克隆扩增。
图3是示出与单一疗法相比，在aGITR/aPD1组合治疗后肿瘤内CD8+ T细胞中的显著克隆扩增的条形图。
图4示出了使用单T细胞测序观察到的克隆扩增后的T细胞谱系。
图5示出了基于单细胞分选RNAseq数据的肿瘤内CD8T细胞克隆分析。
图6A至图6D示出了肿瘤衍生的TCR的T细胞活化测定。
图7A至图7B示出了单T细胞转录组的基因表达分析；
图8示出了示例性操作环境。
图9A至图9E示出了联合疗法扩增肿瘤内高频CD8+ T细胞克隆。图9a，肿瘤免疫疗法和单细胞分选研究设计的示意图。图9b，肿瘤攻击后第8天和第11天的基于单细胞分选RNAseq数据的肿瘤内CD8+ T细胞克隆分析。每个圆圈代表一个CD8+ T细胞。共享相同TCR序列的T细胞用颜色编码，数字表示单个克隆的频率，后接TCRβ链的CDR3区序列。第8天：同种型-SEQ ID NO:290；抗GITR-SEQ ID NO:269；抗PD1-SEQ ID NO:270；第11天：同种型-SEQID NO:291、SEQ ID NO:292(分别自上而下)；抗GITR-SEQ ID NO:271-273(分别自上而下)；抗PD1-SEQ ID NO:274-279(分别自上而下)；抗GITR+抗PD1-SEQ ID NO:280-289(分别自上而下)9c，T细胞克隆性的定量分析。数据描绘了每组的扩增CD8+ T细胞克隆的累积频率(*，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001，Fisher's检验)。9d、9e，肿瘤内CD8+T细胞克隆的TCR的鉴定、表达和功能验证。将高频TCR克隆克隆到具有AP-1荧光素酶报告基因的J.RT3-T3.5Jurkat T细胞系中(9d)，并且针对MC38(肿瘤特异性)对比无关肿瘤细胞(B16F10.9或TRAMP-C2)体外测试它们的反应性。9e，示出了从组合治疗分离的MC38特异性CD8+ T细胞克隆的代表性AP-1荧光素酶报告基因生物测定结果，使用抗CD3和抗CD28刺激作为阳性对照。
图10A至图10D示出了克隆扩增的CD8+ T细胞中独特基因特征的鉴定。10a，与使用同种型治疗的CD8+ T细胞或使用联合治疗的未扩增CD8+ T细胞相比，来自联合疗法的克隆扩增的CD8+ T细胞中上调的基因(第11天)。Venn图示出了比较指定CD8+ T细胞群的显著增加的基因数(p<0.01，倍数变化≥2)。热图示出了在比较之间重叠的三十个基因。10b，来自联合疗法的克隆扩增的CD8T细胞中特异性上调的基因的鉴定。示意图和Venn图示出了不同的比较。10c，累积分布函数(CDF)图示出了独特调节的基因CD226通过联合治疗在全部、克隆扩增或未扩增的CD8+ T细胞中的表达。10d，所示CD8+ T细胞群之间CD226表达水平的倍数变化(数字表示倍数变化；NS，不显著)。
图11A至图11D示出了联合治疗协同调节CD226/TIGIT通路，以利于抗肿瘤免疫。11a，脾脏和肿瘤抗原特异性CD8+ T细胞群上CD226表达(MFI)的FACS分析，门控策略示于FACS图中。数据示出了两个独立实验中的一个代表性实验(n＝每组9-10只小鼠)。在图中，总CD8是左边的四个条，非特异性CD8是中间的四个条，而Ova特异性CD8是右边的四个条。11b，示意图示出了大单层囊泡(LUV)、参与脂质体上的T细胞信号传导的重建的不同组分(CD3和CD226)以及已知由磷酸化共刺激受体募集的细胞溶质酪氨酸激酶的关键组分lck、Zap70和SLP76、PI3K(p85a)。11c，CD226而非CD3ζ对PD-1结合的Shp2敏感。具有增加的PD-1浓度的含Shp2的反应在30min时终止，并进行SDS-PAGE和磷酸酪氨酸Western印迹(WB)。11d，脾脏和肿瘤T细胞亚群上的TIGIT表达的FACS分析(肿瘤植入后8天)。数据示出了两个独立实验中的一个代表性实验(n＝每组9-10只小鼠)。(*，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001，单因素方差分析，Tukey’s多重比较检验)。
图12A至图12H示出了CD226信号传导通路在介导由联合治疗诱导的抗肿瘤反应中起着关键作用。12a，在使用抗GITR+抗PD-1或同种型IgG的免疫疗法之前，用CD226封闭抗体或同种型IgG治疗携带MC38肿瘤的小鼠。此处示出了存活率百分比。数据示出了三个独立实验中的一个代表性实验(n＝每组5只小鼠)。12b，使用MC38肿瘤细胞攻击CD226KO小鼠或野生型同窝仔，并在肿瘤植入后第6天、第13天使用抗GITR+抗PD-1抗体或同种型抗体进行治疗。数据示出了两个独立实验中的一个代表性实验(n＝每组7-8只小鼠)。(12c-12e)联合治疗的有效性不依赖于CD28、OX40和4-1BB通路。12c，用CTLA-4-Ig(10mg/kg)封闭CD28信号传导。12d，用OX40L封闭抗体(10mg/kg)封闭OX40信号传导。12e，用4-1BBL封闭抗体(10mg/kg)封闭4-1BB信号传导。所示数据是存活率曲线(n＝每组10只小鼠)。12f，抗PD1临床研究的示意图。12g，肿瘤活检的RNA-seq分析表明，在晚期癌症患者中施用抗PD-1抗体治疗后，CD226转录物显著增加(n＝43，配对t检验)。12h，在具有所示癌症类型的患者中CD226转录物表达水平和的总体存活率的TCGA数据分析。(*，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001，存活率分析的对数秩检验)。
图13是示出TCR阴性癌细胞系或非癌细胞系用作MiTCR、TCRklass和rpsTCR管道的阴性对照的表格-阴性对照：人和小鼠非T细胞系(2x100bp)。
图14是示出单细胞测序中TCR靶向测序与rpsTCR管道之间的TCR检测率比较的表格。
图15是示出第11天在克隆扩增的CD8+ T细胞中通过抗体治疗特异性上调的通路的表格。
图16A至图16J示出了抗GITR+抗PD-1组合协同排斥已建立的肿瘤并使功能失调的T细胞恢复活力。16a，使用抗GITR和/或抗PD-1抗体治疗的野生型C57BL/6小鼠中的MC38肿瘤生长(第6、13天)。结果描绘了各个小鼠的肿瘤生长曲线(来自两个实验的累积数据，n＝每组17只小鼠)。顶部的数字表示治疗组中无肿瘤小鼠数量对比小鼠总数。16b，使用所示治疗的累积存活率曲线。16c、16d，通过联合治疗介导的CD8+ T细胞依赖性长期肿瘤保护。用抗CD8、CD4或抗CD25耗尽抗体治疗C57BL/6小鼠，然后施用采用抗GITR+抗PD-1抗体或对照抗体的疗法(参见方法)。C，示出不同抗体的耗尽效率的代表性FACS图。16d，用不同的耗尽抗体治疗后的平均肿瘤生长曲线，示出两个实验的一个代表(n＝每组5只小鼠)。16e、16f，联合治疗增加了肿瘤内效应T细胞/Treg比率。16e，示出第11天的肿瘤T细胞亚群的代表性FACS图(FoxP3对比CD8，在活细胞/单细胞/CD45+/CD3+上预先设门的细胞)。16f，肿瘤攻击后第8天和第11天肿瘤内CD8+ T细胞/Treg和CD4+ TEff细胞/Treg比率的FACS结果汇总。数据代表三个独立实验(n＝每组6-7只小鼠)。16g-16i，联合治疗使肿瘤内功能失调的T细胞恢复活力。在植入后第11至12天收获肿瘤，解离成单细胞悬浮液，在BFA存在下用PMA/离子霉素再刺激。将细胞固定并透化，然后用Ki67(16g)、颗粒酶A(16h)和颗粒酶B(16i)进行细胞内染色。所示数据是阳性细胞的百分比。(n＝每组5-10只小鼠)。16J，抗GITR+抗PD-1协同抑制已建立的小鼠RENCA肿瘤。在第0天通过皮下注射1x106个RENCA肿瘤细胞攻击Balb/c小鼠，并在肿瘤植入后第6、13和20天用抗GITR(5mg/kg)和/或抗PD-1(5mg/kg)抗体进行治疗。所示数据是存活率百分比(n＝每组10只小鼠)。(*，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001，****，p<0.0001；16b、16j，对数秩检验；16f、16g，单因素方差分析，Tukey’s多重比较检验)。
图17示出了rpsTCR管道的概览。rpsTCR管道示意图，使用随机引发短RNA-seq数据进行TCR库分析的生物信息学管道。
图18示出了使用人和小鼠原代血细胞的rpsTCR管道平台验证。使用来自健康人PBMC样品或小鼠全血的靶向TCR-seq数据作为阳性对照，以评估与单独的TCRklass相比的假阳性率或假阴性率。通过rpsTCR管道、MiTCR和TCRklass检测到大部分独特CDR3序列，如Venn图中的数字所示。图中示出了rpsTCR管道、MiTCR和TCRklass之间的相关系数平方(R2)。
图19示出了使用来自LCMV特异性T细胞克隆(P14)的TCR作为生物测定平台的阳性对照。P14 TCR工程化报告细胞系显示出对于LCMV感染的细胞的特异性，但未显示出对于肿瘤细胞系的特异性。使用抗CD3和CD28刺激作为TCR复合物信号传导的阳性对照。
图20示出了小提琴图，其示出了来自联合治疗的克隆扩增CD8+ T细胞中显著富集的三十个基因的表达水平。所示数据是各个测序CD8+ T细胞(cExp，联合治疗，克隆扩增的T细胞；cNon，联合治疗，未扩增；同种型，来自同种型治疗组的全部CD8)中的基因表达(Log2RPMK)。
图21A至图21C示出了联合治疗使肿瘤抗原特异性CD8+ T细胞具有效应子功能。a，通过FACS验证OVA肽-Kb复合物在MC38-OVA-β2m-Kb细胞上的表面表达。使用同种型或抗Kb-SIINFEKL抗体对MC38-OVA-β2m-Kb或空载体对照MC38细胞进行染色。示出了代表性直方图。b，用抗GITR和/或抗PD-1抗体治疗的携带MC38-OVA-β2m-Kb的小鼠的肿瘤和脾脏OVA特异性CD8+ T细胞的频率(左)和归一化为肿瘤重量的计数(计数/mg，右)。(代表两个实验，n＝每组9-10只小鼠)。c，使用联合治疗的脾脏和肿瘤CD8+T细胞中OVA特异性回忆反应的增加。在BFA存在下用或不用SIINFEKL肽再刺激细胞。通过FACS分析IFNγ的细胞内表达。数据代表两个实验，n＝每组9-10只小鼠(*，p<0.05，**，p<0.01；***，p<0.001，b，单因素方差分析，c，双因素方差分析，Tukey’s多重比较检验)。
图22A至图22D示出了单细胞RNA水平下的TIGIT表达以及在不同T细胞亚群上的TIGIT/CD226表达水平的FACS分析。累积分布函数(CDF)图示出TIGIT RNA表达(a)和FACS分析(b)，代表两个实验，n＝每组9-10只小鼠)，示出全部、克隆扩增(OVA特异性)或未扩增(OVA非特异性)CD8+ T细胞中的TIGIT表达。c，在MC38野生型肿瘤植入后8天脾脏和肿瘤T细胞亚群上TIGIT表达的FACS分析，示出每个群体中TIGIT+细胞的百分比。d，在MC38野生型肿瘤植入后11天脾脏和肿瘤T细胞亚群上CD226表达的FACS分析，示出每个群体中CD226+细胞的百分比。数据代表两个实验，n＝每组9-10只小鼠(*，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001，单因素方差分析，Tukey’s多重比较检验)。
图23A至图23F示出了CD226-/-小鼠显示出正常的T细胞发育和稳态功能。a，靶向策略。用自缺失的eGFP-Neo盒(eGFP-polyA-hUb-EM7-neo-polyA-Prm-Crei-polyA)替换小鼠CD226的编码外显子1至2，从3’开始到编码外显子1中的起始ATG，再到编码外显子2的3’末端前13bp。编码外显子1-2之间的内含子也缺失。在盒缺失后，保留eGFP、polyA LoxP和克隆位点(1141bp)。b，T细胞亚群上CD226缺失的FACS验证。c，胸腺中T细胞发育的FACS分析(Tconv，常规T细胞；DP，CD4/CD8双阳性；SP，单阳性；DN，CD4/CD8双阴性)。d，通过FACS分析脾脏和血液中的T细胞亚群。e，TCR刺激后的炎性细胞因子分泌。用抗CD3+抗CD28抗体离体刺激来自CD226-/-或野生型(WT)小鼠的脾细胞16小时。收集上清液用于指示的细胞因子释放。f，PD1和GITR在CD226-/-或WT小鼠的脾脏和血液T细胞亚群中的表达水平。所示数据是平均荧光强度(MFI)(n＝每组3只小鼠)。
图24A至图24G示出了CD226信号传导通路是TIGIT-/-小鼠中增强的肿瘤监测所必需的。用MC38肿瘤攻击野生型或TIGIT-/-小鼠，用抗CD226或对照IgG预治疗，并接受同种型对照(a)或抗GITR+抗PD-1联合疗法(b)。所示数据是代表两个实验的平均肿瘤生长曲线(n＝每组4-5只小鼠)。c，FACS验证CD155在工程化MC38肿瘤细胞上的过表达。d，在MC38肿瘤细胞上过表达CD155(CD226/TIGIT的配体)会减缓肿瘤生长，并与抗GITR或抗PD-1抗体单一疗法(第3、6、10和13天)协同促进肿瘤排斥和长期存活。所示数据是平均肿瘤生长曲线(n＝每组10只小鼠)。e，在体内维持CD155在工程化MC38肿瘤细胞上的过表达。f，CD155在MC38肿瘤细胞上的过表达减少了通过FACS检测的肿瘤内T细胞亚群但非脾脏T细胞亚群上的游离CD226受体。g，用MC38对照或CD155过表达细胞攻击小鼠。在肿瘤攻击后第9天，通过FACS分析肿瘤和脾脏细胞的T细胞活化。对于IFNγ表达，在细胞内染色之前用PMA/离子霉素再刺激细胞(n＝每组10只小鼠)。(**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001，单因素方差分析，Tukey’s多重比较检验)。
图25示出了局部放射与抗GITR+抗PD-1抗体疗法的组合显示出针对已建立的大型MC38肿瘤的功效。用100μg抗GITR和/或抗PD-1抗体或同种型抗体(第17、20、24和27天)结合0或8Gy局部放射(第18天)治疗携带已建立的大型MC38肿瘤的小鼠。a，平均肿瘤生长曲线。b，各个小鼠肿瘤生长曲线。无肿瘤小鼠的数量示于左上图中。c，b的存活率曲线。数据代表两个实验(n＝＝每组5-6只小鼠)。(*，p<0.05，**，p<0.01，对数秩检验)。
图26是用于TCRα/β库测序的文库制备中的引物列表。
图27示出了使用阳性和阴性对照数据集的三种方法的比较。
图28示出了使用50bp引发读段通过miTCR、TCRklass和rpsTCR管道找到的顶部CDR3。
图29示出了使用50bp引发读段在完整VI-Next数据集中找到的顶部CDR3。
图30示出了使用100bp引发读段通过miTCR、TCRklass和rpsTCR管道找到的顶部CDR3。
图31示出了使用100bp引发读段在完整VI-Next数据集中找到的顶部CDR3。
图32示出了单细胞测序和批量RNA测序中CDR3的检测。
具体实施方式
在公开和描述本发明的方法和系统之前，应当理解，所述方法和系统不限于特定方法、特定部件或特定具体实施。还应当理解，本文所用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而非旨在进行限制。
如说明书和所附权利要求书中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。在本文中，范围可以表述为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。在表述此类范围时，另一个实施方案包括从所述一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，通过使用先行词“约”将数值表述为近似值时，应当理解，该特定值构成了另一个实施方案。应当进一步理解的是，每个范围的端点对于另一个端点很重要并且独立于另一个端点。
“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情形可能发生或可能不发生，并且该描述包括所述事件或情形发生的情况和不发生的情况。
在本说明书的描述和权利要求书全篇中，词语“包含”和该词的变型如“含有”意指“包括但不限于”，并非旨在排除例如其他部件、整数或步骤。“示例性”意指“一个实例”，并非旨在表达优选或理想实施方案。“例如”不是在限制性意义上使用，而是用于解释目的。
根据本公开已观察到，使用免疫检查点抑制剂的单一或联合疗法已在癌症患者中显示出显著的治疗功效。然而，大多数患者要么没有反应，要么只是短暂反应，引发了关于下一代免疫疗法设计的根本问题。为了克服肿瘤微环境的免疫抑制性质并促进持久反应，可进行共抑制通路和共刺激通路的双重靶向以诱导更强的T细胞活化。在一些情况下，抗体组合可以例如通过恢复稳态调节因子的平衡来协同增强CD8+ T细胞效应子功能，从而导致肿瘤排斥和长期反应。作为治疗结果的克隆扩增的准确测量可以提供指示受试者对单一或联合疗法的反应的特征。在一个方面，本文公开了可以由通过对受试者的一个或多个T细胞测序获得的短读段生成一个或多个TCR序列的方法和系统。所述方法和系统可以基于一个或多个TCR序列的生成来确定克隆扩增，以提供指示受试者反应和/或潜在反应的特征。
本发明公开了可用于执行所公开的方法和系统的部件，也称为“rpsTCR”管道。本文公开了这些和其他部件，并且应当理解，当公开这些部件的组合、子集、交互作用、分组等时，虽然可能未明确公开对这些中每种不同的单个和集体组合排列的特定提及，但对于所有方法和系统，每一种在本文中都有特别考虑和描述。这适用于本申请的所有方面，包括但不限于所公开方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的多个附加步骤，则应当理解，这些附加步骤中的每一个都可以利用所公开的方法的任何特定实施方案或实施方案的组合来执行。
通过参考以下对优选实施方案和其中包括的实例的详细描述以及附图及其之前和之后的描述，可以更容易地理解本方法和系统。
如本领域技术人员将理解的，所述方法和系统可以采用全硬件实施方案、全软件实施方案或结合软件和硬件方面的实施方案的形式。此外，所述方法和系统可以采用计算机可读存储介质上的计算机程序产品的形式，其具有包含在存储介质中的计算机可读程序指令(例如，计算机软件)。更具体地，本方法和系统可以采用web实现的计算机软件的形式。可以利用任何合适的计算机可读存储介质，包括硬盘、CD-ROM、光存储设备或磁存储设备。
下面参考方法、系统、装置和计算机程序产品的方框图和流程图图解来描述所述方法和系统的实施方案。应当理解，方框图和流程图图解的每个方框以及方框图和流程图图解中方框的组合分别可以通过计算机程序指令实现。这些计算机程序指令可以加载到通用计算机、专用计算机或其他可编程数据处理装置上以产生机器，使得在计算机或其他可编程数据处理装置上执行的指令产生用于实现流程图一个或多个方框中指定的功能的方式。
这些计算机程序指令也可以存储在计算机可读存储器中，该计算机可读存储器可以指示计算机或其他可编程数据处理装置以特定方式起作用，使得存储在计算机可读存储器中的指令产生包括用于实现流程图一个或多个方框中指定的功能的计算机可读指令的制品。计算机程序指令也可以加载到计算机或其他可编程数据处理装置上，使一系列操作步骤在计算机或其他可编程装置上执行，以产生计算机实现的过程，使得在计算机或其他可编程装置上执行的指令提供用于实现流程图一个或多个方框中指定的功能的步骤。
因此，方框图和流程图图解的方框支持用于执行指定功能的方式组合、用于执行指定功能的步骤组合和用于执行指定功能的程序指令装置。还应理解，方框图和流程图图解的每个方框以及方框图和流程图图解中方框的组合可以由执行指定功能或步骤的基于专用硬件的计算机系统、或专用硬件和计算机指令的组合来实现。
需注意，在各种情况下，该详细公开可以指代执行某些动作的给定实体。应当理解，在一些情况下，该语言可能意味着由给定实体拥有和/或控制的系统(例如，计算机)实际上正在执行该动作。
在一个方面，如图1所示，本发明公开了用于对T细胞受体(TCR)进行测序的rpsTCR方法100。方法100的步骤可以任何顺序或同时执行。方法100可包括在110处对核酸样品进行测序以生成序列数据和/或接收序列数据。对核酸样品进行测序可包括对从受试者的T细胞获得的RNA的少于约100个碱基对的短读段(例如，单端75碱基对读段)进行测序。T细胞可以从人或小鼠获得。可以在向受试者施用一种或多种治疗之前或之后获取和/或测序T细胞。短读段可以通过RNA的随机引发获得。随机引物的长度可为4-40个核苷酸。在一些情况下，随机引物的长度可为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。对核酸样品进行测序可以生成可存储在数据结构中的序列数据。数据结构可包含一个或多个核酸序列和/或样品标识符。
在一些实施方案中，可以通过任何方法获得或接收序列数据。例如，可通过对样品执行测序过程来直接获得序列数据。另选地或另外地，序列数据可以例如从第三方、数据库和/或出版物间接地获得。在一些实施方案中，在计算机系统处接收例如来自数据存储设备或来自单独的计算机系统的序列数据。
在一些实施方案中，序列数据可包含批量序列数据。术语“批量测序”或“新一代测序”或“大规模并行测序”是指使DNA和/或RNA测序过程并行化的任何高通量测序技术。例如，批量测序方法通常能够在单次测定中产生超过一百万个多核酸扩增子。术语“批量测序”、“大规模并行测序”和“新一代测序”仅指一般方法，不一定是在单次运行中获得超过1百万个序列标签。任何批量测序方法可以在所公开的方法和系统中实现，例如可逆中止化合物染料(例如，Illumina)、使用polony乳液液滴的焦磷酸测序(例如，Roche)、离子半导体测序(IonTorrent)、单分子测序(例如，Pacific Biosciences)、大规模并行签名测序等。
在一些实施方案中，序列数据可包含多个测序读段。在一些实施方案中，测序读段的平均读段长度不超过35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸。在一些实施方案中，测序读段的平均读段长度为至少30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200或250个核苷酸。在一些实施方案中，测序读段的覆盖度不超过100x、90x、80x、70x、60x、50x、40x、30x或20x。在一些实施方案中，测序读段的覆盖度为至少50x、45x、40x、35x、30x、25x、20x、19x、18x、17x、16x、15x、14x、13x、12x、11x或10x。
在一些实施方案中，序列数据可通过本领域已知的任何测序方法产生。例如，在一些实施方案中，使用链终止测序、边连接边测序、边合成边测序、焦磷酸测序、离子半导体测序、单分子实时测序、基于标签的测序、稀释即测序和/或454测序产生测序数据。
在一些实施方案中，序列数据是执行核酸扩增过程以扩增一个或多个基因组基因座或转录物的至少一部分，然后对所得扩增产物进行测序的过程的结果。可用于执行本文所公开的方法的核酸扩增方法的实例包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、LATE-PCR、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、基于Qβ复制酶的扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)、修复链反应(RCR)、自返式DNA扩增(BDA)和/或滚环扩增(RCA)。
在一些实施方案中，所述方法包括对样品执行测序过程的步骤。可以使用任何样品，只要样品含有能够编码TCR的DNA和/或RNA即可。在一些实施方案中，样品来自有前景的器官、细胞或组织供体。在一些实施方案中，样品来自有前景的器官、细胞或组织受体。样品来源可以是例如实体组织，如来自新鲜、冷冻和/或保存的器官、组织样品、活检或抽吸物；血液或任何血液成分、血清、血液；体液，如脑脊液、羊水、腹膜液或间质液、尿液、唾液、粪便、眼泪；或者来自受试者妊娠或发育的任何时间的细胞。
方法100可包括在120处将短读段与参考序列进行比对。参考序列可包含物种特异性RNA序列的参考数据集。参考数据集可以存储在数据结构中。数据结构可包含一个或多个核酸序列和/或标识符。参考序列不包含TCR基因序列(例如，排除了对应于适应性免疫细胞受体的基因座的参考序列)。因此，比对将产生由映射的短读段和未映射的短读段组成的读段集。在一个方面，将短读段与参考序列进行比对可包括Trapnell C.等人，TopHat:discovering splice junctions with RNA-Seq,Bioinformatics(2009)25(9):1105-1111中描述的一种或多种技术。可在130处丢弃映射的短读段。可以生成包括未映射的短读段的所得数据结构。该方法的其余步骤可以对未映射的短读段进行，所述短读段通常被丢弃并且不在TCR上下文中进行进一步分析。这种对映射短读段的滤除代表着与现有技术TCR分析的背离，并得到准确度和精度的下游改进。
方法100还可包括对一个或多个未映射的短读段执行质量控制过程。对一个或多个未映射的短读段执行质量控制过程可包括移除低质量核苷酸或移除极短读段中的一者或多者。移除极短读段可包括移除任何长度少于35个碱基对的读段。
在一个方面，方法100可在140处将一个或多个未映射的短读段组装成一个或多个长读段，以进行进一步处理。在一个方面，将一个或多个未映射的短读段组装成一个或多个长读段以进行进一步处理可包括将一个或多个未映射的短读段与来自TCR序列参考数据库的一个或多个TCR序列进行比对，并基于TCR序列参考数据库将一个或多个未映射的短读段组装成长读段(候选TCR序列)。在另一方面，将一个或多个未映射的短读段组装成一个或多个长读段以进行进一步处理可包括在不使用TCR序列参考数据库的情况下将一个或多个未映射的读段组装成长读段(候选TCR序列)。
在一个方面，将一个或多个未映射的短读段组装成一个或多个长读段以进行进一步处理可包括Warren,R.L.、B.H.Nelson和R.A.Holt.2009.Profiling model T-cellmetagenomes with short reads.Bioinformatics 25:458-464中公开的一种或多种技术，该参考文献全文以引用方式并入本文(iSSAKE平台)。在一个方面，将一个或多个未映射的短读段组装成一个或多个长读段以进行进一步处理可包括将一个或多个未映射的短读段与所需适应性免疫细胞受体的已知的精选的V基因进行比对。与具有V比对的3’不匹配核苷酸的V基因的3’末端具有最佳正向或反向互补比对的一个或多个未映射的短读段可以被标记为用于从头组装的种子。与受体V基因或恒定区或J基因与恒定区之间的可能连接完全比对的一个或多个未映射的短读段可以从将来的组装序列中被丢弃。
每个种子序列可用于使组装序列成核。例如，子序列长度(k)可以最长的未组装读段长度开始。然后可以生成长度为k的3’最末端子序列(k聚体)。如果k聚体与一个或多个正向或反向互补读段r的5’末端碱基匹配，则匹配的读段r可用于延伸组装序列(如果悬垂的延伸核苷酸不同于r，大多数规则可用于构建共有组装序列)。如果不匹配并且k大于用户指定的最小子序列长度，则可以用短一个碱基的新k重复匹配。如果不匹配并且k等于用户指定的最小子序列长度，则组装完成。当所有种子序列和所得的组装序列达到最大延伸(例如，用户定义的)时，组装完成。可使用新的组装序列重复上述步骤。结果得到包括一个或多个长读段的读段集。
在另一方面，一种用于将一个或多个未映射的短读段组装成一个或多个长读段以进行进一步处理的替代方法可包括Grabherr MG、Haas BJ、Yassour M、Levin JZ、ThompsonDA、Amit I等人，Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without areference genome.Nature biotechnology.2011；29(7):644–52中公开的一种或多种技术，该参考文献全文以引用方式并入本文(Trinity平台)。将一个或多个未映射的短读段组装成一个或多个长读段以进行进一步处理可包括多步骤方法。第一步骤可包括使用贪婪的基于k聚体的转录物组装方法将一个或多个未映射的短读段组装成独特的转录物序列，回收共享k聚体的一组替代变体的单个(最佳)代表(由于可变剪接、基因复制或等位基因变异)。基于k聚体的方法可包括由所有候选TCR序列构建k聚体正向和反向互补子序列的字典(例如，k＝25)。可选择字典中最常见的k聚体来开始重叠群组装，排除具有低复杂性或仅观察到一次的k聚体。种子可通过找到出现频率最高的k聚体而沿任一方向延伸，其中k-1与当前组装序列重叠，并将其悬垂的核苷酸连接到生长的组装序列。一旦k聚体被用于延伸，就可将其从字典中删除。可以重复种子延伸，直到组装序列不能进一步延伸。可使用下一个最频繁的k-聚体重复最频繁k聚体的选择和种子延伸，直到字典耗尽为止。
多步骤方法的第二步骤可包括聚集相关的重叠群，其对应于可变剪接的转录物的部分或旁系同源基因的其他独特部分。然后可以为相关重叠群的每个群集构建de Bruijn图，每个图反映变体之间重叠的复杂性。如果重叠群之间存在k-1个核苷酸的重叠，并且如果在(k-1)聚体连接的每一侧上的具有(k-1)/2个核苷酸匹配的两个重叠群中存在跨越连接的数量最少的读段，则可以聚集重叠群。可以重复分组，直到不能向任何组添加其他重叠群为止。可使用k-1的字长来表示节点，并使用k来定义连接节点的边缘，从而为每个组构建de Bruijn图。de Bruijn图的每个边缘可包括支持它的初始读段集中的k聚体的数量。可将每个读段分配给与其共享最大数量的k聚体的组，并且可以确定每个读段中向该组贡献k聚体的区域。
多步骤方法的第三步骤可包括分析在对应的de Bruijn图的上下文中读段和读段配对所采用的路径，并输出合理的转录物序列，解析可变剪接的同种型和衍生自旁系同源基因的转录物。可实现合并节点和修剪边缘之间的后续迭代，以识别读段或读段对所支持的路径，并将这些路径作为长读段(候选TCR序列)返回。合并节点可包括在de Bruijn图中合并线性路径中的连续节点以形成表示更长序列的节点。修剪边缘可包括修剪表示由可能对应于测序错误的相对较少的读段所支持的微小偏差的边缘。第三步骤还可包括通过使用动态编程过程识别de Bruijn图中实际读段和读段对所支持的那些路径来执行合理的路径评分，所述动态编程过程遍历图中的潜在路径，同时保持支持这些路径的读段(和读段对)。因为读段和序列片段(成对读段)通常比k长得多，所以它们可以解决不定性并将组合数量的路径减少到更少数量的实际转录物，列举为线性序列。结果得到包括一个或多个长读段的读段集。
TCR序列组装可使用若干种平台之一来执行，例如但不限于iSSAKE平台和Trinity平台。表1示出了Trinity平台和iSSAKE平台作为所公开的方法和系统的部件有效地等同于单细胞测序，但iSSAKE平台在批量测序方面表现更佳。iSSAKE平台利用TCR的种子序列，其可通过批量组装提高rpsTCR管道性能。
表1.
方法100可以在150处由一个或多个长读段生成一个或多个TCR序列。在一个方面，由一个或多个长读段生成一个或多个TCR序列可包括Yang,X.等人TCRklass:a new K-string-based algorithm for human and mouse TCR repertoirecharacterization.J.Immunol.194,446–454(2015)中公开的一种或多种技术，该参考文献全文以引用方式并入本文。由一个或多个长读段生成一个或多个TCR序列可包括翻译所有六个框架上的一个或多个长读段中的每一个，将每个翻译框架与参考可变(V)氨基酸序列和连接(J)氨基酸序列的3串分布进行比较，识别具有最高匹配k串数的翻译框架，通过确定具有最高匹配k串数的翻译框架中的长读段中每个残基的保守残基支持分数(Scr)来确定长读段中保守残基的位置，识别翻译框架中长读段的V基因区段和J基因区段中具有最高Scr的候选保守残基，并且将位于V基因区段和J基因区段中两个保守残基之间的CDR3区识别为TCR序列。在一个方面，方法100还可包括将TCR C区核酸序列附加到TCR序列。
在另一方面，由一个或多个长读段生成一个或多个TCR序列可包括将一个或多个长读段翻译成对应的氨基酸序列。TCR V区和TCR J区氨基酸参考序列可以分成约六个氨基酸的k串。可将k串与对应氨基酸序列进行比对。可以在映射到对应氨基酸序列的k串中检测到一个或多个保守的TCR CDR3残基。可对检测到的保守水平进行评分，并且可以选择保守分数高于阈值保守分数的对应氨基酸序列。然后可以在所选的对应氨基酸序列中检测候选CDR3区氨基酸序列。
可鉴定一个或多个长读段中候选CDR3区氨基酸序列的核酸序列。可将候选CDR3区核酸序列上游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个TCR V基因参考序列进行比对。可对比对度进行评分，并且可将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选TCR V基因序列。
可将候选CDR3区核酸序列下游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个TCRJ基因参考序列进行比对。可对比对度进行评分，并且可将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选TCR J基因序列，从而生成TCR序列。在一个方面，方法100还可包括将TCR C区核酸序列附加到TCR序列
方法100还可包括将一个或多个TCR序列与已知TCR序列的TCR序列文库和对一种或多种治疗的对应治疗反应进行比较，鉴定TCR序列文库中一个或多个TCR序列中的哪一个与高对应治疗反应匹配，并鉴定具有一个或多个TCR序列的受试者可能作出反应的一种或多种治疗。一旦受试者被鉴定为具有可能对特定治疗作出反应的TCR序列，就可以向受试者施用特定治疗。
方法100还可包括在针对疾病向受试者施用治疗之前和之后执行方法100以评估克隆扩增。例如，可以在施用治疗之前收集受试者的第一多个T细胞。可以对第一多个T细胞进行测序，并且可以执行方法100。可确定存在的独特TCR序列的出现次数。可向受试者施用治疗，并且可以收集受试者的第二多个T细胞。可以对第二多个T细胞进行测序，并且可以执行方法100。可确定存在的独特TCR序列的出现次数。然后可以确定在第一多个T细胞和第二多个T细胞之间的出现次数。在一些情况下，可以确定特定TCR序列已经历克隆扩增。在其他情况下，在第一多个T细胞和第二多个T细胞之间经历克隆扩增的一些、全部或没有TCR序列是相同的TCR序列。结果是T细胞克隆扩增特征。T细胞克隆扩增特征可包括经历克隆扩增的T细胞的数量、经历克隆扩增的T细胞的标识符、克隆扩增的总量、每个T细胞的克隆扩增量、它们的组合等中的一者或多者。可记录受试者对治疗的反应并且与T细胞克隆扩增特征相关联。可以对多个受试者重复该过程，从而生成T细胞克隆扩增特征和对应治疗反应的数据库。所公开的方法和系统随后可以将新受试者的T细胞克隆扩增特征与数据库进行比较，以确定受试者对治疗的可能反应。
在方法100的一些方面，可以在收集T细胞进行测序之前对受试者施用免疫疗法。免疫疗法可以是单一疗法或联合疗法。例如，免疫疗法可以是共刺激激动剂和共抑制拮抗剂的组合。在一些方面，可以在免疫疗法期间靶向肿瘤细胞上的T细胞抑制受体或受体，包括但不限于PD1、PDL1、CTLA4、LAG3和TIM3。因此，在一些方面，免疫疗法可包括特异性结合PD1、PDL1、CTLA4、LAG3和TIM3中的一者或多者的抗体或其抗原结合片段。作为免疫疗法方案的一部分，可以向受试者施用特异性结合PD1、PDL1、CTLA4、LAG3和TIM3中的一者或多者的抗体或其抗原结合片段，或者可以向受试者施用两种或更多种此类抗体或其抗原结合片段的任何组合。
在一些方面，免疫疗法包括向患者施用结合PD1的抗体或其抗原结合片段。在一些优选的实施方案中，结合PD1的抗体或其抗原结合片段至少包含SEQ ID NO:21的重链可变区(HCVR)序列和SEQ ID NO:22的轻链可变区(LCVR)序列。在一些方面，结合PD1的任一抗体或其抗原结合片段可以是美国申请No.14/603,776(公布No.US 2015-0203579)中描述的任一抗体或其抗原结合片段，该申请据此以引用方式并入本文。例如，在一些实施方案中，结合PD1的抗体或其抗原结合片段包含具有表2所列序列中的氨基酸序列的HCVR和LCVR。在一些实施方案中，结合PD1的抗体或其抗原结合片段包含具有表2所列序列中的氨基酸序列的LCVR和HCVR。在一些实施方案中，结合PD1的抗体或其抗原结合片段包含如表2所示的HCVR和LCVR对。可使用结合PD1的其他抗体(或其抗原结合片段)，这些包括但不限于派姆单抗、纳武单抗、德瓦鲁单抗、阿特朱单抗、pidilizumab、卡瑞利珠单抗、PDR001、MED10680、JNJ-63723283和MCLA-134。
表2：PD1抗体的氨基酸序列标识符
在一些方面，免疫疗法包括向患者施用结合LAG3蛋白(亦称CD223)的抗体或其抗原结合片段。在一些方面，结合LAG3的抗体或其抗原结合片段至少包含SEQ ID NO:93的HCVR序列和SEQ ID NO:94的LCVR序列。在一些方面，结合LAG3的抗体或其抗原结合片段可以是美国申请No.15/289,032(公布No.US 2017-0101472)中描述的任一抗体或其抗原结合片段，该申请据此以引用方式并入本文。例如，在一些方面，结合LAG3的抗体或其抗原结合片段包含具有表3所列序列中的氨基酸序列的HCVR和LCVR。在一些方面，结合LAG3的抗体或其抗原结合片段包含具有表3所列序列中的氨基酸序列的LCVR和HCVR。在一些实施方案中，结合LAG3的抗体或其抗原结合片段包含如表3所示的HCVR和LCVR对。可使用结合LAG3的其他抗体(或其抗原结合片段)，这些包括但不限于BMS-986016和GSK2381781。
表3：LAG3抗体的氨基酸序列标识符
在一些方面，免疫疗法包括向患者施用结合PDL1的抗体或其抗原结合片段。在一些优选方面，结合PDL1的抗体或其抗原结合片段至少包含SEQ ID NO:122的HCVR序列和SEQID NO:123的LCVR序列。在一些方面，结合PDL1的抗体或其抗原结合片段可以是美国申请No.14/603,808(公布No.US 2015-0203580)中描述的任一抗体或其抗原结合片段，该申请据此以引用方式并入本文。例如，在一些方面，结合PDL1的抗体或其抗原结合片段包含具有表4所列序列中的氨基酸序列的HCVR和LCVR。在一些方面，结合PDL1的抗体或其抗原结合片段包含具有表4所列序列中的氨基酸序列的LCVR和HCVR。在一些方面，结合PDL1的抗体或其抗原结合片段包含如表4所示的HCVR和LCVR对。可使用结合PDL1的其他抗体(或其抗原结合片段)，这些包括但不限于阿维鲁单抗、阿特朱单抗和德瓦鲁单抗。
表4：PDL1抗体的氨基酸序列标识符
在一些方面，免疫疗法包括向患者施用结合CTLA4的抗体或其抗原结合片段。在一些方面，结合CTLA4的抗体或其抗原结合片段可以是2017年7月27日提交的美国临时申请No.62/537,753中描述的任一抗体或其抗原结合片段，该申请据此以引用方式并入本文。例如，在一些方面，结合CTLA4的抗体或其抗原结合片段包含具有表5所列序列中的氨基酸序列的HCVR和LCVR。在一些方面，结合CTLA4的抗体或其抗原结合片段包含具有表5所列序列中的氨基酸序列的LCVR和HCVR。在一些方面，结合CTLA4的抗体或其抗原结合片段包含如表5所示的HCVR和LCVR对。可使用结合CTLA4的其他抗体(或其抗原结合片段)，这些包括但不限于伊匹单抗和替西木单抗中的一种或多种，以及美国专利No.6,984,720、No.7,605,238或No.7,034,121中公开的任一抗体或其抗原结合片段，所有这些专利据此以引用方式并入本文。
表5：CTLA4抗体的氨基酸序列标识符
在一些方面，免疫疗法包括向患者施用结合GITR的抗体或其抗原结合片段。在一些优选实施方案中，结合GITR的抗体或其抗原结合片段至少包含SEQ ID NO:261的HCVR序列和SEQ ID NO:259的LCVR序列。在一些方面，结合GITR的任一抗体或其抗原结合片段可以是美国申请No.15/619,068中描述的任一抗体或其抗原结合片段，该申请据此以引用方式并入本文。例如，在一些方面，结合GITR的抗体或其抗原结合片段包含具有表6所列序列中的氨基酸序列的HCVR和LCVR。在一些实施方案中，结合GITR的抗体或其抗原结合片段包含具有表6所列序列中的氨基酸序列的LCVR和HCVR。在一些方面，结合GITR的抗体或其抗原结合片段包含如表6所示的HCVR和LCVR对。可使用结合GITR的其他已知抗体(或其抗原结合片段)。
表6：GITR抗体的氨基酸序列标识符
在一些方面，TCR序列可被鉴定为存在于T细胞克隆中的序列，该T细胞克隆响应于特定治疗而扩增。鉴定的这些TCR序列可用于T细胞疗法。例如，鉴定的TCR序列可用于制备含有该特定TCR序列的T细胞。然后可向受试者施用含有鉴定的TCR序列的这些T细胞，该受试者继而可以用确定TCR序列会作出反应的特定疗法进行治疗。在一些方面，可向鉴定出TCR序列的相同受试者施用T细胞疗法，以便增加响应于特定治疗的T细胞的数量。在一些方面，可向除了鉴定出TCR序列的受试者之外的受试者施用T细胞疗法。向除了鉴定出TCR序列的受试者之外的受试者施用T细胞疗法会给予原本对于特定治疗不一定有反应的受试者对特定治疗作出反应的能力。
在一些方面，可以研究响应于特定药物，含有鉴定的TCR序列的那些T细胞的TCR信号传导。具有存在于扩展到特定治疗的T细胞中的特定TCR序列的那些受体的TCR信号传导提供了对肿瘤免疫监视的见解。
所鉴定的TCR序列的另一种用途可以是用于确定靶标以用所鉴定的TCR序列治疗受试者中存在的肿瘤。与所鉴定的TCR序列结合的抗原是存在于该受试者中的肿瘤的靶标。一旦确定了靶标，就可以确定治疗方法。
在一些方面，克隆扩增中TCR序列的鉴定可用于病毒和细菌感染的预后，并且可用于监测癌症和传染病的疾病进展。
如图27至图33所示，与现有TCR分析技术相比，步骤130中映射短读段的丢弃有助于提高准确度和精度。
图27至图33的方法使用预期不含TCR的阴性对照数据集。这些样品都是随机引发RNA-Seq，读段长度为100个碱基对(bp)。五个数据集来自各种小鼠肿瘤细胞系(这些示于表7中)。两个数据集来自敲除Rag1/2(形成TCR所需的基因)的小鼠的脾脏样品。两个数据集来自人细胞系，一个是神经祖细胞(NeuProgCell)，另一个是成肌细胞(LHCN-M2)。阳性对照数据集(VI-next-小鼠-T细胞)是健康B6小鼠样品的靶向TCR测序，其中读段长度为300bp。操纵该数据集以创建各种测序深度(1000万、5000万、1亿、2亿或5亿个读段)和读段长度(50bp或100bp)的模拟测试数据集。
另一个测试数据集是使用来自小鼠肿瘤样品的读段长度为80bp的分选T细胞的批量随机引发RNA-Seq。对应的阳性对照数据集由来自与分批量数据集相同的分选T细胞的C1Fluidigm平台的读段长度75bp的单细胞RNA-Seq组成。
TCR管道基准的数据集如表7所示。
表7.
图27示出了rpsTCR管道的灵敏度与TCRklass非常相似并且优于miTCR。使用rpsTCR管道检测到的假阳性很少(如果有的话)。rpsTCR管道在任何阴性对照数据集中都不识别TCR。相比之下，TCRklass识别的很少，而MiTCR在每个数据集中平均识别出数十个TCR。rpsTCR管道和TCRklass在VI-next-小鼠-T细胞阳性对照数据集中鉴定TCR CDR3时显示出约80％的相当灵敏度，而MiTCR具有接近75％的较低灵敏度。
图18描绘了rpsTCR管道鉴定MiTCR或TCRklass未检测到的阳性数据的能力。在所有三种方法(MiTCR、TCRklass和rpsTCR管道)中，在阳性对照VI-next数据集中鉴定的TCR计数存在强烈相关性，其中全部TCR的约10％通过rpsTCR管道方法和TCRklass而不是通过MiTCR鉴定。
图28和图30示出了分别使用小鼠T细胞的50bp或100bp的随机引发读段的MiTCR、TCRklass和rpsTCR管道之间的CDR3检测比较。列出了每个顶部CDR3的序列。图29和图31示出了分别使用50bp或100bp在完整VI-next数据集中找到的顶部CDR3。rpsTCR管道显示出更高的灵敏度。
图28和图29概述了通过对VI-next阳性对照数据集进行二次取样形成的模拟50碱基对(bp)读段长度数据集中发现的CDR3的比较。与MiTCR和TCRklass不同，rpsTCR管道实现了将50bp短读段组装成更长的重叠群以更好地鉴定TCR序列。通过MiTCR在5亿读段(MP-50bp-500M)的数据集中找到的顶部CDR3未通过TCRklass或rpsTCR管道在阳性对照数据集或MP-50bp-500M中以任何方法发现(图28，左表)。通过TCRklass在MP-50bp-500M中找到的顶部CDR3在测试数据集和VI-next数据集中通过其他方法找到(图28，中间表)。通过rpsTCR管道鉴定的顶部CDR3在VI-next数据集中通过所有方法以较大数量识别，并且在MP-50bp-500M数据集中部分地通过其他两种方法识别(图28，右表)。在VI-next数据集中找到的顶部CDR3最常通过rpsTCR管道在二次取样的MP中识别，得到长度为50bp的1000万-5亿个读段(图29)。
图30和图31概述了在通过对来自VI-next阳性对照数据集的2亿个读段进行二次取样而形成的模拟100bp数据集中找到的CDR3的比较，以将不包括组装步骤的rpsTCR管道方法与MiTCR和TCRklass进行比较。同样，MiTCR在长度为100bp的5亿个读段(MP-100bp-500M)中找到的顶部CDR3未通过任何其他方法找到(图30，左表)。通过TCRklass找到的前两个CDR3似乎是任何其他方法都未找到的假阳性(图30，中间表)，但其他序列良好地对应于通过rpsTCR管道找到的顶部CDR3(图30，右表)。在识别VI-next数据集中的顶部CDR3时，所有方法在该读段长度上具有相当的灵敏度(图31)。
图32示出了在单细胞测序中检测到的超过一半的CDR3也可以在批量RNA测序中检测到。这三种方法的最终比较涉及量化在单细胞数据中发现的TCR中有多少可以在来自相同样品的批量RNA-Seq数据中找到。在单细胞数据中鉴定的顶部CDR3主要通过所有三种方法鉴定，并且在所有方法中一致地在批量数据集中鉴定(图32)。
当不需要序列组装时，rpsTCR管道方法与读段长度为100bp的数据集中的预先存在的方法相当。然而，在rpsTCR管道实现序列组装的短读段数据集中，灵敏度相对于其他方法大大提高。
图2描绘了通过从肿瘤植入小鼠或小鼠脾脏(来自同一荷瘤小鼠)的肿瘤分离的T细胞测定的CDR3序列(实施例1)。从3个或更多个单T细胞中检测到的相同CDR3序列被确定为克隆扩增的T细胞。联合治疗组(aGITR+aPD-1)在治疗后第11天具有显示不同比例的克隆扩增的T细胞的肿瘤(如来自具有3个或更多个克隆的T细胞的不同TCR序列的数目所示)。在该实例中，扩增的T细胞克隆的总数，而不是特定TCR序列的数目，用于确定治疗后的克隆扩增。在一些方面，通过TCR确定在氨基酸水平上相同的克隆扩增，但核酸序列可包含变体。从脾脏分离的T细胞未进行克隆扩增。值得注意的是在一些经PD-1治疗的小鼠中检测到相同的TCRCDR3序列，但这些不被认为是克隆扩增的(检测到的<3)。
图2示出了已知TCR序列的示例性TCR序列文库和对一种或多种治疗的对应治疗反应。如图2所示，TCR序列1至TCR序列10响应于aGITR和aPD1的组合的治疗而具有3或更大的克隆扩增值。克隆扩增值表示多个细胞中特定TCR序列的出现次数，表示细胞已被克隆的次数。TCR序列11至TCR序列17响应于单独的PD1治疗而具有3或更大的克隆扩增值。TCR序列18至TCR序列20响应于单独的aGITR治疗而具有3或更大的克隆扩增值。对于已经获得细胞序列数据并鉴定TCR序列的受试者，可以将鉴定的TCR序列与TCR文库进行比较，如图2和所确定匹配所示。在一个方面，匹配的数量可以表示对特定治疗的潜在反应。在另一方面，可以使用与基于每个治疗的匹配相关联的克隆扩增值的总和来确定哪个治疗与受试者的较高累积克隆扩增值相关联。举例而言，具有TCR序列1、TCR序列2、TCR序列13、TCR序列14、TCR序列15和TCR序列16的患者序列数据对于组合的aGITR和aPD1具有14的累积克隆扩增值，并且对于单独aPD1具有16的累积克隆扩增值。因此，受试者更可能响应于单独的aPD1。
图3是图2中包含的结果的图示说明。图3是条形图，指示组合的aGITR和aPD1治疗后11天的扩增克隆百分比为31.9％，单独aPD1治疗后11天的扩增克隆百分比为26.7％(治疗后8天为4.8％)，单独aGITR治疗后11天的扩增克隆百分比为20.3％。在一个方面，图2的结果和图3的图表可以基于在对一个或多个受试者施用一种或多种治疗后获得的数据。方法100还可包括向受试者施用一种或多种治疗。方法100还可包括生成TCR序列的TCR序列文库以及与一种或多种治疗相关的对应克隆扩增。图3示出与施用抗PD1(aPD1)或抗GITR(aGITR)的单个(单一)疗法相比，在荷瘤小鼠的联合治疗中鉴定的克隆扩增的T细胞的数量的显著性。与来自用同种型对照治疗的小鼠的肿瘤相比，抗PD1(aPD1)和抗GITR(aGITR)治疗的扩增克隆百分比显著增加。
图4示出了图1的方法100的一个实施方案的示例性输出。图4示出了克隆扩增后的T细胞谱系。通过各治疗类型(例如，组合的aGITR和aPD1、单独的aPD1、单独的aGITR)，克隆扩增发生在各种细胞亚型中，例如天然、T细胞记忆(Tcm)、T细胞效应记忆(Tem)、T细胞效应子(Teff)等。图4示出了与特定治疗相关的序列以及计数(例如，克隆扩增值)，并且包括与克隆扩增值相关的细胞亚型的指示。图4描绘了每组克隆中T细胞的概况。通过表达的TCRCDR3序列鉴定的每个T细胞克隆也被表征(例如，通过细胞表面标志物分类)为a)效应记忆细胞(Tem)(Cd62L-Cd44+Gzmb+)，b)效应T细胞(Teff)(Cd62L-Cd44-Gzmb+)，c)天然T细胞(Cd62L+Cd44-Gzmb-)，或d)中枢记忆T细胞(Tcm)(Cd62L+Cd44+Gzmb-)，或其他未分类细胞(空白的椭圆形)。
本发明公开了确定一个或多个TCR序列的方法，该方法包括获得包含来自受试者的第一细胞的单细胞原始读段的第一序列数据，使用生物信息学工具将第一序列数据映射到包含多个非T细胞受体转录物的第二序列数据，以鉴定第一序列数据中的一个或多个未映射的读段，并由未映射的读段确定一个或多个TCR序列。在一些方面，获得包含来自受试者的第一细胞的单细胞原始读段的第一序列数据包括对获自第一细胞的转录物进行随机引物RNA测序。随机引物的长度可为4-40个核苷酸。在一些情况下，随机引物的长度可为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些方面，在获得第一序列数据之前，向受试者施用免疫疗法。免疫疗法可以是单一疗法或联合疗法。例如，免疫疗法可以是共刺激激动剂和共抑制拮抗剂的组合。
本发明公开了包含TCRβ链的CDR3序列的载体。在一些方面，载体可以是病毒载体或质粒。病毒载体的实例可以是但不限于慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。在一些方面，CDR3序列是编码CASSRNTEVFF(SEQ ID NO:269)、CASSIGNTEVFF(SEQ ID NO:270)、CASSQPGKNTEVFF(SEQ ID NO:271)、CASSLGQGNNSPLYF(SEQ ID NO:272)、CASSQGQGGAETLYF(SEQ ID NO:273)、CASSPPMGGQLYF(SEQ ID NO:274)、CASSQEGANTEVFF(SEQ ID NO:275)、CASSQVQGTGNTLYF(SEQ ID NO:276)、CASSQEGDGYEQYF(SEQ ID NO:277)、CTSAEGGGTEVFF(SEQ ID NO:278)、CASSPPGGGTEVGG(SEQ ID NO:279)、CASSGTDNQDTQYF(SEQ ID NO:280)、CASSPGTGGYEQYF(SEQ ID NO:281)、CASSLELGFYEQYF(SEQ ID NO:282)、CASSLGGAPNERLFF(SEQ ID NO:283)、CASSQEGDSYEQYF(SEQ ID NO:284)、CASSRNTEVFF(SEQ ID NO:285)、CASGDAMGGRDYAEQFF(SEQ ID NO:286)、CGAREGQDTQYF(SEQ ID NO:287)、CGARTGGEQYF(SEQID NO:288)或CTCSAGNQAPLF(SEQ ID NO:289)的核酸序列。因此，在一些方面，本发明公开了慢病毒载体，其包含编码SEQ ID NO:269-289中任一个的序列的核酸序列。
在一个方面，具有相似结合特异性的TCR序列可以如Gupta N.T.等人，Hierarchical clustering can identify B cell clones with high confidence in Igrepertoire sequencing data.J.Immunol.198(6),2489-2499(2017)中所公开的那样聚集。简而言之，可以使用单连锁层次聚类来聚类TCR序列的CDR3区；两个CDR3序列之间的距离可以定义为两个序列之间的核苷酸差异的绝对数量和阈值，在一个方面，该阈值可以从前述参考文献中公开的序列数据集推断。
本发明还公开了包含载体的重组细胞，所述载体包含编码SEQ ID NO:269-289中任一个的序列的核酸序列。
本发明公开了包含TCRβ链的CDR3序列的重组细胞。在一些方面，CDR3序列衍生自与包含CDR3序列的重组细胞不同的细胞类型、细胞系或不同物种。例如，CDR3序列可以来自原代人T细胞，并且包含CDR3序列的细胞可以是衍生自除CDR3序列来源的细胞之外的任何其他T细胞的T细胞系。又如，CDR3序列可以来自人细胞，并且包含CDR3序列的细胞可以是非人细胞。在一些方面，重组细胞包含CDR3序列，包括CASSRNTEVFF(SEQ ID NO:269)、CASSIGNTEVFF(SEQ ID NO:270)、CASSQPGKNTEVFF(SEQ ID NO:271)、CASSLGQGNNSPLYF(SEQID NO:272)、CASSQGQGGAETLYF(SEQ ID NO:273)、CASSPPMGGQLYF(SEQ ID NO:274)、CASSQEGANTEVFF(SEQ ID NO:275)、CASSQVQGTGNTLYF(SEQ ID NO:276)、CASSQEGDGYEQYF(SEQ ID NO:277)、CTSAEGGGTEVFF(SEQ ID NO:278)、CASSPPGGGTEVGG(SEQ ID NO:279)、CASSGTDNQDTQYF(SEQ ID NO:280)、CASSPGTGGYEQYF(SEQ ID NO:281)、CASSLELGFYEQYF(SEQ ID NO:282)、CASSLGGAPNERLFF(SEQ ID NO:283)、CASSQEGDSYEQYF(SEQ ID NO:284)、CASSRNTEVFF(SEQ ID NO:285)、CASGDAMGGRDYAEQFF(SEQ ID NO:286)、CGAREGQDTQYF(SEQIDNO:287)、CGARTGGEQYF(SEQ ID NO:288)或CTCSAGNQAPLF(SEQ ID NO:289)的序列。
在一些方面，所公开的用于通过随机引发RNA测序鉴定TCR序列的方法也可用于鉴定B细胞受体(BCR)。除以下步骤外，管道的步骤几乎相同：1)阴性选择步骤，其中鉴定BCR涉及将短读段与包含多个物种特异性非B细胞受体RNA转录物的第二参考数据集进行比对；2)组装步骤，其中鉴定BCR涉及将一个或多个未映射的短读段组装成一个或多个长读段以进行进一步处理可包括将一个或多个未映射的短读段与来自BCR序列参考数据库的一个或多个BCR序列进行比对，并且基于BCR序列参考数据库将一个或多个未映射的短读段组装成长读段(候选BCR序列)；3)比对步骤，其中鉴定BCR涉及候选BCR序列与BCR V和J参考基因的比对以及BCR CDR3区的鉴定。在一个方面，由一个或多个长读段生成一个或多个BCR序列可包括Alamyar,E.等人IMGT tools for the nucleotide analysis of immunoglobulin(IG)and t cell receptor(TR)V-(D)-J repertoires,polymorphisms,and IG mutations:IMGT/V-QUEST and IMGT/HighV-QUEST for NGS.Methods in Mol.Biol.882,569–604(2012)中公开的一种或多种技术。
在示例性方面，所述方法和系统可以在如图8所示和下面所述的计算机801上实现。类似地，所公开的方法和系统可以利用一个或多个计算机在一个或多个位置执行一种或多种功能。图8是示出用于执行所公开的方法的示例性操作环境的方框图。该示例性操作环境仅为操作环境的实例，并非旨在对操作环境结构的使用范围或功能提出任何限制。也不应将操作环境解释为对示例性操作环境中示出的任一部件或其组合有任何依赖性或要求。
本方法和系统可以用许多其他通用或专用计算系统环境或配置操作。可适于与所述系统和方法一起使用的众所周知的计算系统、环境和/或配置的实例包括但不限于个人计算机、服务器计算机、膝上型计算机设备和多处理器系统。另外的实例包括机顶盒、可编程消费性电子产品、网络PC、小型计算机、大型计算机、包括上述任何系统或设备的分布式计算环境等。
所公开的方法和系统的处理可以由软件部件执行。所公开的系统和方法可以在由一个或多个计算机或其他设备执行的计算机可执行指令(例如程序模块)的一般背景下进行描述。通常，程序模块包括执行特定任务或实现特定抽象数据类型的计算机代码、例程、程序、对象、部件、数据结构等。还可以在基于网格的分布式计算环境中实践所公开的方法，其中任务由通过通信网络链接的远程处理设备执行。在分布式计算环境中，程序模块可以位于包括存储器存储设备的本地和远程计算机存储介质中。
此外，本领域技术人员将理解，本文公开的系统和方法可以通过呈计算机801形式的通用计算设备来实现。计算机801的部件可包括但不限于一个或多个处理器803、系统存储器812以及将包括所述一个或多个处理器803的各个系统部件耦合到系统存储器812的系统总线813。该系统可以利用并行处理。可利用并行处理来执行所公开的方法。例如，所公开方法的一个或多个步骤的至少一部分的执行可被分类为作业。例如，可以对多个样本并行地执行所公开的方法。然后，每个作业的工作量可以分布在若干个处理器上。软件应用程序可用于设计和运行作业以处理数据。作业可以例如从一个或多个数据源提取数据，转换数据，并将其加载到一个或多个新位置中(例如，将数据分级以便在另一个作业中处理)。在并行处理拓扑中，每个作业的工作量可以分布在一台或多台计算机上的若干处理器上，称为计算节点。在一个方面，用户可以修改配置文件或以其他方式与被配置为定义多个处理节点的软件交接。这些节点同时工作以快速有效地完成每个作业。导体节点计算机可以协调工作。并行处理环境可以分类为对称多处理(SMP)或大规模并行处理(MPP)系统。在对称多处理(SMP)环境中，多个处理器共享其他硬件资源。例如，多个处理器可以共享相同的存储器和磁盘空间，但使用单个操作系统。然后，并行作业的工作量分布在系统中的处理器上。作业完成的实际速度可能受到系统中共享资源的限制。为了扩展系统，可以增加处理器的数量，可以添加存储器，或者可以增加存储装置。在大规模并行处理(MPP)系统中，许多计算机可以物理地容纳在同一机架中。MPP系统可以物理地分散。在MPP环境中，由于物理计算机之间不必共享资源，因此性能得到改善。要扩展系统，可以添加计算机以及相关的存储器和磁盘资源。在MPP系统中，文件系统通常在网络上共享。在该配置中，程序文件可以共享，而不是安装在系统中的各个节点上。
系统总线813代表若干种可能类型的总线结构中的一种或多种，包括使用各种总线结构中的任一种的存储器总线或存储器控制器、外围总线、加速图形端口或本地总线。举例来说，这种架构可包括工业标准架构(ISA)总线、微通道架构(MCA)总线、增强型ISA(EISA)总线、视频电子标准协会(VESA)局部总线、加速图形端口(AGP)总线以及外围组件互连(PCI)、PCI-Express总线、个人计算机存储卡行业协会(PCMCIA)、通用串行总线(USB)等。总线813和本说明书中指定的所有总线也可通过有线或无线网络连接实现，并且每个子系统，包括所述一个或多个处理器803、大容量存储设备804、操作系统805、T cell管道软件806、T cell管道数据807、网络适配器808、系统存储器812、输入/输出接口810、显示适配器809、显示设备811和人机界面802，均可包含在一个或多个远程计算设备814a、b、c中的物理分隔位置处，通过这种形式的总线连接，实际上实现了全分布式系统。
计算机801通常包括各种计算机可读介质。示例性可读介质可以是计算机801可存取的任何可用介质，并且包括，例如并且不意味着限制，易失性和非易失性介质、可移动和不可移动介质。系统存储器812包括易失性存储器形式的计算机可读介质，例如随机存取存储器(RAM)，和/或非易失性存储器形式的计算机可读介质，例如只读存储器(ROM)。系统存储器812通常包含数据诸如T cell管道数据807和/或程序模块诸如操作系统805和Tcell管道软件806，其可由一个或多个处理器803立即存取和/或当前由其操作。
另一方面，计算机801还可包括其他可移动/不可移动、易失性/非易失性计算机存储介质。举例而言，图8示出了大容量存储设备804，其可以为计算机801提供计算机代码、计算机可读指令、数据结构、程序模块和其他数据的非易失性存储。例如并且不意味着限制，大容量存储设备804可以是硬盘、可移动磁盘、可移动光盘、磁带盒或其他磁存储设备、闪存卡、CD-ROM、数字通用盘(DVD)或其他光存储器、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、电可擦可编程只读存储器(EEPROM)等。
任选地，任何数量的程序模块均可存储在大容量存储设备804上，包括例如操作系统805和T cell管道软件806。操作系统805和T cell管道软件806(或它们的某些组合)中的每一个可包括编程的元素和T cell管道软件806。T cell管道数据807也可以存储在大容量存储设备804上。T cell管道数据807可以存储在本领域已知的任何一个或多个数据库中。此类数据库的实例包括 Access、 SQL服务器、mySQL、PostgreSQL等。数据库可以集中或分布在多个系统中。
另一方面，用户可以经由输入设备(未示出)将命令和信息输入到计算机801中。这种输入设备的实例包括但不限于键盘、指示设备(例如，“鼠标”)、麦克风、操纵杆、扫描仪、触觉输入设备诸如手套以及其他身体覆盖物等。这些和其他输入设备可经由耦合到系统总线813的人机接口802连接到一个或多个处理器803，但是可通过其他接口和总线结构连接，例如并行端口、游戏端口、IEEE 1394端口(也称为火线端口)、串行端口或通用串行总线(USB)。
在又一方面，显示设备811也可以经由接口诸如显示适配器809连接到系统总线813。可以设想，计算机801可具有多于一个显示适配器809，并且计算机801可具有多于一个显示设备811。例如，显示设备811可以是监视器、LCD(液晶显示器)或投影仪。除显示设备811之外，其他输出外围设备可包括诸如扬声器(未示出)和打印机(未示出)的部件，这些部件可经由输入/输出接口810连接到计算机801。所述方法的任何步骤和/或结果可以任何形式输出到输出设备。此类输出可以是任何形式的视觉再现，包括但不限于文本、图形、动画、音频、触觉等。显示器811和计算机801可以是一个设备的一部分或者是独立设备。
计算机801可以使用与一个或多个远程计算设备814a、b、c的逻辑连接在联网环境中操作。举例而言，远程计算设备可以是个人计算机、便携式计算机、智能电话、服务器、路由器、网络计算机、对等设备或其他公用网络节点等。计算机801与远程计算设备814a、b、c之间的逻辑连接可以经由网络815进行，例如局域网(LAN)和/或通用广域网(WAN)。此类网络连接可以通过网络适配器808进行。网络适配器808可以在有线和无线环境中实现。此类联网环境在住宅、办公室、企业范围的计算机网络、内联网和互联网中是常规并且常见的。
出于说明的目的，本文以离散方框形式说明了应用程序和其他可执行程序组件例如操作系统805，但是应认识到，此类程序和组件在不同时间驻留在计算设备801的不同存储部件中，并且由计算机的一个或多个处理器803执行。T cell管道软件806的具体实施可以存储在某种形式的计算机可读介质上或通过某种形式的计算机可读介质传输。所公开的任何方法均可由计算机可读介质上包含的计算机可读指令来执行。计算机可读介质可以是可由计算机存取的任何可用介质。举例而言并且不意味着限制，计算机可读介质可包括“计算机存储介质”和“通信介质”。“计算机存储介质”包括以用于存储诸如计算机可读指令、数据结构、程序模块或其他数据等信息的任何方法或技术实现的易失性和非易失性、可移动和不可移动介质。示例性计算机存储介质包括但不限于RAM、ROM、EEPROM、闪存或其他存储器技术、CD-ROM、数字通用盘(DVD)或其他光存储器、磁带盒、磁带、磁盘存储器或其他磁存储设备，或可用于存储所需信息并且可由计算机存取的任何其他介质。
提出以下实例以向本领域普通技术人员提供对于如何制备和评价本文要求保护的化合物、组合物、制品、设备和/或方法的完整公开和描述，并且旨在纯粹为示例性的而非旨在限制所述方法和系统的范围。已尽力确保数值(例如量、温度等)的准确性，但对一些误差和偏差应予以说明。除非另外指明，否则份数为重量份，温度以℃表示或处于环境温度下，并且压力等于或接近大气压。
所述方法和系统可以采用人工智能技术，例如机器学习和迭代学习。此类技术的实例包括但不限于专家系统、案例推理、贝叶斯网络(Bayesian networks)、基于行为的人工智能、神经网络、模糊系统、进化计算(例如遗传算法)、群体智能(例如蚂蚁算法)和混合智能系统(例如通过神经网络生成的专家推理规则或来自统计学习的产生式规则)。
提供以下实施例以更详细地描述实施方案。这些实施例旨在说明而非限制所要求保护的实施方案。
实施例1
体内小鼠研究
对于MC38肿瘤研究，分别在C57BL/6或人源化GITR/GITRL双敲入小鼠的右侧腹皮下注射3x105或5x105个MC38细胞(第0天)。在肿瘤植入后第6天，基于肿瘤大小对小鼠进行分组，并通过腹膜内注射5mg kg-1抗GITR(DTA1)和/或抗PD-1(RPM1-14)抗体或同种型对照IgG(大鼠IgG2b、LTF-2和大鼠IgG2a、2A3)以指定剂量(得自Bio X Cell的抗体)进行治疗。在第13天再次施用抗体。用抗-PD-1(aPD-1)和抗-GITR(aGITR)抗体的组合治疗的小鼠保持无肿瘤超过80天。用3x 105个MC38细胞和2.5x 105个B16F10.9细胞再次双侧攻击这些小鼠。使用年幼小鼠作为肿瘤植入对照。
对于T细胞亚群耗尽实验，用300μg耗尽的单抗治疗用联合疗法或同种型对照IgG治疗过的小鼠，所述单抗包括抗CD4克隆GK1.5；抗CD8克隆2.43和大鼠IgG2b同种型(BioXCell)和抗CD25克隆PC61(eBioscience)；在肿瘤攻击前一天(第-1天)给予大鼠IgG1同种型(HPRN，Bio X Cell)耗尽抗体，每周两次，总共八次剂量。通过外周血样品的FACS分析证实耗尽效率。每周使用数字卡尺(VWR,Radnor,PA)盲测2-3次垂直肿瘤直径。使用式L×W×0.5计算体积，其中L为最长尺寸，W为垂直尺寸。通过Kaplan-Meier方法确定每组的存活率差异，并且通过使用Prism版本6(GraphPad Software Inc.)的存活率分析的对数秩检验计算总P值。当肿瘤负荷达到方案指定的2000mm3最大肿瘤体积大小以最小化发病率时，事件被定义为死亡。
实施例2
单细胞分选RNA-seq分析
在肿瘤攻击后第8天和第11天，通过小鼠肿瘤解离试剂盒(Miltenyi Biotec)制备肿瘤的单细胞悬浮液，并用gentleMACS Octo解离器解离脾脏。合并来自同一治疗组的肿瘤和脾脏，并通过FACS分选活的CD8+ T细胞。将经FACS分选的T细胞与C1细胞悬浮试剂(Fluidigm)混合，然后加载到5至10μm的C1集成流体回路(IFC；Fluidigm)上。通过向1.25mLC1细胞洗涤缓冲液(Fluidigm)中加入2.5μL乙锭均二聚物-1和0.625μL钙黄绿素AM(LifeTechnologies)来制备LIVE/DEAD染色溶液(Thermo Fisher)，取20μL加载到C1IFC上。在Zeiss显微镜下以明视野仔细检查每个捕获位点的绿色荧光蛋白(GFP)和德州红通道，以了解细胞双峰和活力。如制造商(方案100-7168E1)所述，在C1Single-Cell Auto Prep IFC上进行细胞裂解、逆转录和cDNA扩增。使用SMARTer Ultra Low RNA试剂盒(Clontech)由单细胞合成cDNA。根据制造商的推荐(方案100-7168E1)，使用Nextera XT DNA样品制备试剂盒(Illumina)构建Illumina NGS文库。通过75个循环的多重单侧运行，在Illumina NextSeq(Illumina)上对总共2,222个单细胞进行测序。
表8：捕获的T细胞概览。
来自这些细胞中的每一个的原始序列数据(BCL文件)经由Illumina Casava1.8.2转换为FASTQ格式。根据其条形码对读段进行解码。使用FastQC(www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)评估读段质量。对于TCR分析，使用所公开的方法(包括随机引发短读段TCR(rpsTCR)分析)重建和提取TCR序列，尤其是来自随机引发短RNA测序读段的TCR-CDR3序列。(参见图1)。rpsTCR方法使用具有默认参数的TopHat43，提供双端和单端短读段并将这些读段映射到小鼠或人基因组和转录组，但不映射到TCR基因座和转录物。因此，阴性选择允许丢弃映射的读段，并且回收未映射的读段以提取TCR序列。修剪未映射读段中的低质量核苷酸(即，使用HTQC工具包过滤掉长度小于35bp的读段)。通过QC的短读段使用iSSAKE默认设置组装成更长的读段。使用TCRklass鉴定CDR3序列，Scr(保守残基支持分数)设定为默认值1.7至2。
实施例3
分析从荷瘤小鼠分离的肿瘤浸润性T细胞。
使用所公开的方法(管道)利用单细胞分选的RNAseq数据重建、提取和分析TCR序列，以鉴定可能与肿瘤反应和患者存活率相关的高频T细胞克隆。使用该管道分析从荷瘤小鼠分离的1379个CD8+ T细胞的转录组。在早期时间点(第8天)，在所有治疗组中检测到非常少的高频T细胞克隆(定义为共享相同TCR序列的至少3个T细胞)(图2)。到第11天为止，我们鉴定出2个高频T细胞克隆，代表来自同种型对照样品的所测序的单个CD8+ T细胞的5.7％；抗GITR样品为3个克隆/20.3％，抗PD-1样品为6个克隆/26.7％，并且联合治疗的样品为10个克隆/31.9％。该结果表明，在第8天和第11天之间，肿瘤内CD8+ T细胞的强克隆扩增主要通过抗PD-1治疗来驱动。与施用抗PD1(aPD1)或抗GITR(aGITR)的单个(单一)疗法相比，在荷瘤小鼠的联合治疗中鉴定的克隆扩增的T细胞的数量的显著性描绘于图3中。抗GITR和/或抗PD-1对外周/脾脏T细胞克隆性没有影响(图2)，与显示出抗PD-1(派姆单抗)治疗不影响外周血T细胞克隆性的患者数据一致。尽管单一试剂疗法扩增了肿瘤内CD8+ T细胞克隆并调节了关键基因通路，但它不足以导致完全肿瘤排斥。数据表明，通过联合疗法对功能失调的肿瘤浸润性T细胞进行深度重编程是完全肿瘤排斥所必需的。
实施例4
肿瘤衍生的TCR的T细胞活化测定。
通过表达分离的TCR的JRT3细胞系中的荧光素酶表达测量T细胞活化测定，所述TCR包含鉴定的CDR3序列(图6A至图6D)。包含从高度扩增(即，鉴定出10个克隆)的抗GITR治疗的肿瘤T细胞分离的CDR3序列的TCR(TCR序列Seq.17)在JRT3细胞系中表达。在表达原始抗原MC38(图6A)的肿瘤存在下，JRT3被活化，表明转染的细胞系识别抗原。当抗CD3/抗CD28被刺激时，表达TCR序列Seq.17的细胞系也被活化(图6B)。使用表达TCR序列Seq.12的细胞系进行类似研究(TCR CDR3序列从克隆数为8的aPD-1刺激的T细胞分离而来)。表达TCR序列Seq.12的细胞系在表达原始抗原的肿瘤的存在下被活化(图6C)，并且在抗CD3/抗CD28的存在下被活化(图6D)。
实施例5
基因表达分析
还利用基因表达分析工具来分析从荷瘤小鼠分离的1379个CD8+ T细胞的转录组(序列的映射部分)。为了鉴定来自联合治疗样品的克隆扩增的CD8+ T细胞中的独特基因特征，进行了治疗组之间的比较。通过表达的TCRCDR3序列鉴定克隆扩增后的T细胞谱系，所述序列与细胞表面标志物的表达模式相关。参见图4。因此，克隆T细胞被分类为效应记忆细胞(Tem)(Cd62L-Cd44+Gzmb+)、效应T细胞(Teff)(Cd62L-Cd44-Gzmb+)(或未分类细胞，即在少于3个T细胞具有表达的TCR时的非克隆扩增，例如天然T细胞(Cd62L+Cd44-Gzmb-)或中枢记忆T细胞(Tcm)(Cd62L+Cd44+Gzmb-))。
基因表达分析还在每个治疗组的克隆扩增细胞和非扩增细胞中产生差异表达的基因谱。CD226被鉴定为在不同比较对中共享的两个基因之一(图5)。图5是Venn图，其示出了在治疗的第11天优选在aGITR+aPD1治疗组的扩增肿瘤内CD8+ T细胞中表达的基因。Venn图汇总了治疗组中克隆扩增/未扩增CD8+ T细胞的基因特征分析。CD226和PDE4D被鉴定为在不同比较对之间共享的两个基因。
图5表明，当比较在aGITR和aPD1治疗以及所有其他治疗下表达的基因时，优选表达两个基因。这两个基因是CD226和Pde4d。Venn图下方的表格提供了当比较在aGITR和aPD1治疗以及所有其他治疗下表达的基因时每种基因的出现率。因此，可使用所公开的方法鉴定在对肿瘤细胞的免疫应答中起作用的特定基因。
CD226是一种共刺激分子，其在抗肿瘤反应中起着重要作用。治疗组之间的不同亚群的肿瘤内CD8+ T细胞(全部、克隆扩增或未扩增)的表达分析显示，通过对克隆扩增的T细胞的联合治疗显著提高了CD226mRNA水平(图7A)，而这种差异在全部和未扩增的CD8+ T细胞中被淡化了。这一观察结果强调了对推定的肿瘤反应性克隆(高频T细胞克隆)进行基因组分析以揭示关键基因变化的重要性，并且还允许鉴定为影响T细胞活性的有效治疗提供信息的生物标志物。
图7A示出了累积分布函数(CDF)图，其示出了关键调节基因CD226在全部、克隆扩增或未扩增CD8T细胞中的表达。克隆扩增的CD8细胞显示出CD226的最高表达。所公开的方法可用于对显示出与特定基因的更好相关性或特定基因的表达的受试者进行归类。这些数据还显示出该方法在鉴定预后基因方面的效用，所述预后基因将表明在特定治疗期间表达是否与T细胞扩增相关，从而指示功效的可能性。当从患有黑素瘤、肺鳞状细胞癌和肉瘤的患者的T细胞进行分析时，CD226与改善的存活率显著相关(图7B)。图7B示出了患有黑素瘤、肺鳞状细胞癌和肉瘤的患者中CD226表达水平和总体存活率的TCGA数据分析。(在所选相关比较之间，*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001)。如图所示，CD226与改善的存活率相关。
实施例6A
CD226/TIGIT轴在PD-1和GITR联合免疫疗法中介导持久的抗肿瘤反应
介绍
针对免疫检查点PD-1和CTLA-4的单一或联合疗法在某些癌症患者群体中显示出显著的临床益处。然而，大多数患者要么具有抗性，要么只是短暂反应，引发了关于选择最佳免疫调节靶标以解决患者特异性肿瘤敏感性的根本问题。靶向特定共抑制通路和共刺激通路以诱导更强的T细胞活化的联合治疗可以导致更持久的抗肿瘤反应。在此，使用目前处于早期临床试验的PD1和GITR联合疗法(一种临床前验证的模式)表征驱动长期反应的分子通路。对由2,000多个肿瘤浸润性CD8+ T细胞制备的单细胞RNA-seq文库进行测序，发现GITR和PD-1抗体的组合通过恢复关键稳态调节因子CD226和TIGIT的平衡来协同增强CD8+T细胞效应子功能，从而得到显著的存活率益处。实际上，抗PD-1治疗增强了CD226细胞表面表达。然而，PD-1单一疗法不足以克服TIGIT介导的抑制性信号传导。抗GITR抗体降低了T细胞上的TIGIT表达。因此，联合疗法协同调节CD8+ T细胞反应的强度，并引发有效的适应性免疫。实际上，经由CD226的共刺激对于抗肿瘤免疫是至关重要的，因为CD226的遗传失活或药理学抑制逆转了通过联合治疗介导的肿瘤消退，而其他TNF受体或B7超家族成员的抑制没有效果。重要的是，对43名晚期癌症患者在抗PD-1治疗前后的肿瘤活检的RNA-seq分析显示，抗PD-1治疗后CD226表达显著增加。更高水平的CD226与不同类型癌症患者的更好预后相关。除PD-1/PDL-1之外的此类生物标志物可以改善患者选择。揭示通过重新平衡稳态调节因子来驱动持久抗肿瘤反应的分子通路的系统方法对于优化联合免疫疗法可能是重要的。
随着PD-1和CTLA4抗体治疗的临床成功，免疫疗法中的药剂治疗库迅速扩大。关键目标是改善在癌症患者中用单一疗法方法实现的抗肿瘤反应的有限反应率和/或持久性。靶向特异性共抑制(PD-1)通路和共刺激(GITR，糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白，TNFRSF18)通路以诱导更强的T细胞活化的联合治疗目前正在针对转移性黑素瘤和其他实体瘤患者的早期临床试验中进行评估。实际上，T细胞在控制多种人类癌症中的临床相关性现在是毋庸置疑的。GITR在Treg细胞上以高水平组成型表达，并且在活化后可以在其他淋巴细胞上被诱导。DTA-1(激动性抗小鼠GITR抗体)减少肿瘤内Treg细胞并介导FcγR依赖性肿瘤排斥。另外，GITR受体与激动性抗体的结合会直接向效应T细胞递送共刺激信号。虽然抗GITR和抗PD-1抗体单一疗法在大型或不良免疫原性肿瘤中具有有限的功效，但联合疗法能提高卵巢肿瘤模型和乳腺肿瘤模型中的长期存活率。然而，协同作用的分子机制仍然未知。在此，使用PD1和GITR联合疗法，并且对小鼠MC38结肠癌模型中超过2000个肿瘤浸润性CD8+T细胞进行基因分析。系统方法揭示了驱动持久抗肿瘤反应的分子通路，为优化现有联合免疫疗法提供了基础，并鉴定了新型潜在生物标志物以改善患者分层和肿瘤敏感性。
方法
细胞系和组织培养。MC38小鼠结肠癌细胞和RENCA小鼠肾腺癌细胞得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并在补充有10％FBS、100U mL-1青霉素和100μg ml-1链霉素、2mM L-谷氨酰胺、100μM NNEA的DMEM培养基(ThermoFisher Scientific)中，于37℃、5％CO2下培养。缺乏内源性TCR表达的J.RT3-T3.5突变型Jurkat细胞系得自ATCC，并保存在含有10％FBS的RPMI-1640培养基中。通过IMPACT试验测得肿瘤细胞系中支原体和常见啮齿动物病原体呈阴性。通过用编码单个三聚体的慢病毒载体(LV)转导MC38肿瘤细胞来生成MC38-OVA-β2m-Kb，所述单个三聚体由SIINFEKL肽-间隔子-β2微球蛋白-间隔子MHC I类(Kb)重链组成。用25D-1.16抗体确认单个三聚体的表面表达(eBioscience，图21A)。用含有1.25μg ml-1嘌呤霉素的选择培养基(ThermoFisher Scientific)保存MC38-OVA-β2m-Kb。通过用LV编码小鼠全长CD155转导，并在顶部5％表达细胞上进行FACS分选，生成过度表达CD155的MC38肿瘤细胞。通过FACS分析证实CD155的表达水平(图24C)。
小鼠。从The Jackson Laboratory获得六至八周龄雌性C57BL/6小鼠。在Regeneron使用方法得到C57BL/6背景中的CD226-/-和TIGIT-/-小鼠。简而言之，将EGFP(对于CD226)或LacZ cDNA(对于TIGIT)框内插入起始密码子，后接选择盒，其破坏基因体的转录并得到CD226或TIGIT无效等位基因。将杂合的靶向小鼠杂交以产生纯合敲除小鼠用于研究。将所有动物维持在无病原体条件下，并根据RegeneronPharmaceuticals,Inc的动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案进行实验。
体内小鼠研究。对于MC38肿瘤研究，在年龄匹配的C57BL/6小鼠的右侧腹皮下注射3x105个MC38细胞(第0天)。在肿瘤植入后第6天，基于肿瘤大小对小鼠(随机分布在不同组中)进行分组，并通过腹膜内注射5mg kg-1抗GITR(DTA1)和/或抗PD-1(RPM1-14)抗体或同种型对照IgG(大鼠IgG2b、LTF-2和大鼠IgG2a、2A3)以指定剂量(抗体得自Bio X Cell)进行治疗。在第13天再次施用抗体。对于抗体耗尽实验，用300μg耗尽或同种型对照单抗治疗通过联合疗法或同种型对照IgG治疗过的小鼠，所述单抗包括抗CD4(克隆GK1.5)；抗CD8(克隆2.43)和大鼠IgG2b同种型(克隆LTF-2)、大鼠IgG1同种型(克隆HPRN，Bio X Cell)和抗CD25(克隆PC61，eBioscience)。在肿瘤攻击前一天(第-1天)给予耗尽抗体，每周两次，总共八次剂量。通过外周血样品的FACS分析证实耗尽效率(图16C)。本研究中使用的封闭抗体包括抗CD226抗体(克隆10E5，大鼠IgG2b，eBioscience，25mg/kg)、CD28封闭(CTLA4-Fc，Orencia，BMS，10mg/kg)、抗OX40L(克隆RM134L，大鼠IgG2b，Bio X Cell，10mg/kg)和抗4-1BBL(克隆TKS-1，大鼠IgG2a，Bio X Cell，10mg/kg)。通过腹膜内注射每周给予两次封闭抗体，从免疫疗法前1-2天开始，持续两周。每周使用数字卡尺(VWR,Radnor,PA)盲测2-3次垂直肿瘤直径。使用式L×W×0.5计算体积，其中L为最长尺寸，W为垂直尺寸。通过Kaplan-Meier方法确定每组的存活率差异，并且通过使用Prism版本6(GraphPad Software Inc.)的存活率分析的对数秩检验计算总p值。当肿瘤负荷达到方案指定的2000mm3最大肿瘤体积大小以最小化发病率时，事件被定义为死亡。
流式细胞术。对于体内实验的流式细胞术分析，在治疗后的指定天数收获血液、脾脏、胸腺、淋巴结和肿瘤。制备单细胞悬浮液，并使用ACK裂解缓冲液(ThermoFisherScientific)裂解红血球。使用Live/dead可固定蓝色死细胞染色试剂盒(ThermoFisherScientific)进行活/死细胞鉴别。首先在4℃下，用表面标志物的抗体对细胞染色20-30min。使用固定/透化试剂盒(eBioscience)进行细胞内染色。为了定量OVA特异性CD8T细胞，首先在室温下用H-2Kb/SIINFEKL五聚体(ProImmune)对单细胞悬浮液染色10分钟，然后进行表面标志物染色。对于细胞内细胞因子染色(ICS)，用或不用SIINFEKL肽刺激细胞36小时，最后用蛋白质转运抑制剂(BD Bioscience)刺激细胞4小时。刺激后，如上所述对细胞的表面和细胞内蛋白质进行染色。为了量化组织中的细胞数，在获取之前将固定数量的CountBright绝对计数微珠(ThermoFisher Scientific)添加到每个样品中。在FortessaX20或LSR II(BD Bioscience)上获取样品，并使用FlowJo软件(TreeStar)进行分析。有关所用抗体的列表，请参见补充方法。
单细胞分选RNA-seq分析。在肿瘤攻击后第8天和第11天，使用小鼠肿瘤解离试剂盒(Miltenyi Biotec)制备肿瘤的单细胞悬浮液，并用gentleMACS Octo解离器解离脾脏。合并来自同一治疗组的肿瘤和脾脏，并通过FACS分选活的CD8+ T细胞。将经FACS分选的T细胞与C1细胞悬浮试剂(Fluidigm)混合，然后加载到5至10μm的C1集成流体回路(IFC；Fluidigm)上。通过向1.25mL C1细胞洗涤缓冲液(Fluidigm)中加入2.5μL乙锭均二聚物-1和0.625μL钙黄绿素AM(Life Technologies)来制备LIVE/DEAD染色溶液，取20μL加载到C1IFC上。在Zeiss显微镜下以明视野仔细检查每个捕获位点的GFP和德州红通道，以了解细胞双峰和活力。如制造商(方案100-7168E1)所述，在C1Single-Cell Auto Prep IFC上进行细胞裂解、逆转录和cDNA扩增。使用SMARTer Ultra Low RNA试剂盒(Clontech)由单细胞合成cDNA。根据制造商的推荐(方案100-7168E1)，使用Nextera XT DNA样品制备试剂盒(Illumina)构建Illumina NGS文库。通过75个循环的多重单侧运行，在Illumina NextSeq(Illumina)上对总共2,222个单细胞进行测序。原始序列数据(BCL文件)经由IlluminaCasava 1.8.2转换为FASTQ格式。根据其条形码对读段进行解码。使用FastQC(bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)评估读段质量。
大单层囊泡(LUV)。将磷脂(79.7％POPC+10％POPS+10％DGS-NTA-Ni+0.3％罗丹明-PE)在氩气流下干燥，干燥至少1小时并悬浮于1x反应缓冲液(50mM HEPES-NaOH，pH7.5，150mM NaCl，10mM MgCl2，1mM TCEP)中。如前所述，通过一对孔径为200nm的聚碳酸酯过滤器挤出20次，以制备LUV。
LUV重建和磷酸酪氨酸Western印迹。将所关注的蛋白质在含有0.5mg/ml BSA的1×反应缓冲液中以所需比例预混合，然后与LUV(1mM总脂质)混合。将蛋白质-LUV混合物在室温下温育1小时，在此期间His标记的蛋白质与脂质体结合，而其他蛋白质保留在囊泡外溶液中。然后注射2mM ATP并快速混合，以触发膜表面的磷酸化、去磷酸化和蛋白质相互作用。使反应在室温下进行30-60min，并用SDS样品缓冲液终止。将样品在95℃下加热5min，并进行SDS-PAGE。使用iBlotTM Dry Blotting系统(ThermoFisher Scientific)将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。用含有0.1％Tween-20的Tris缓冲盐水(pH7.4)中的5％BSA封闭膜，将膜与所需的磷酸酪氨酸特异性抗体一起温育，并用基于HRP的增强化学发光进行检测。使用以下一抗：抗pY142-CD3ζ(BD Biosciences#558402)、抗pY20(Santa CruzBiotechnology#sc-1624，用于在重建测定中检测酪氨酸磷酸化CD28)、抗pY418-Src(BDBiosciences#560095，用于检测pY394-Lck)、抗pY505-Lck(Cell Signaling#2751)、抗pY315-ZAP70(Abcam#ab60970)、抗pY493-ZAP70(Cell Signaling#2704)。
临床活检处理、RNA提取和RNA-seq。将活检在Omni Shredder(Omni-Inc)上，在添加有巯基乙醇(Sigma Aldrich)的至少600uL RLTPlus中，以22,000RPM均化1分钟。根据“AllPrep DNA/RNA Mini Handbook”(2005年11月)中的制造商说明书的第26页上的方案“Protocol:Simultaneous Purification of Genomic DNA and Total RNA from AnimalTissues”，使用Qiagen Allprep DNA/RNA Mini Kit(Qiagen)提取RNA和DNA。在RNA提取期间使用附录E中概述的任选DNA酶消化。在缓冲液AW2洗涤后，但在最后一次干燥旋转之前，进行另外的500uL 70％乙醇洗涤并旋转2分钟，以从DNA提取中去除过量的盐。在Nanodrop(ThermoFisher Scientific)上定量RNA，并根据制造商方案在片段分析仪(AdvancedAnalytical)上使用“标准灵敏度RNA分析试剂盒”(Advanced Analytical)评估质量。根据定制方案“Using the Tecan Microplate Reader for DNA Quantification(BR dsDNAAssay)，在Infinite M200Pro(Tecan)上使用Qubit dsDNA BR测定试剂盒(ThermoFisherScientific)定量DNA。将完成的样品在-80℃下储存在带条形码的螺旋盖管中。对于RNA-seq，使用KAPA stranded mRNA-Seq试剂盒(KAPA Biosystems)由100ng总RNA制备链特异性RNA-seq文库，并使用Pippin系统(Sage Science)选择大小在400-600bp之间的文库。使用Illumina 2500完成双端2x100bp测序。将RNA-seq读段进行QC并与参考基因组比对，并使用Array Studio(Omicsoft)对基因表达进行定量。
统计分析。根据经验选择样品大小以确保足够的统计功效，并且符合研究中所用技术的现场标准。使用方差分析或未配对双尾学生t检验确定统计学显著性，假设P<0.05显著性水平(或图例中指示)的方差不等。
结果
为了检查联合免疫疗法的效果，使用低免疫原性肿瘤模型(MC38和RENCA)。尽管已经报道了肿瘤体积的可变减小和适度延长的存活率，但是使用抗PD-1或抗GITR抗体的单一疗法在已建立的肿瘤中不能有效诱导完全和持久的肿瘤消退。在此，当肿瘤可触知时，在肿瘤攻击后6和13天施用抗体。与公布的数据一致，单独的抗GITR或抗PD-1治疗显示没有或几乎没有效果。联合疗法以CD8+ T细胞依赖性方式(图16C和图16D)协同地根除了小鼠中的大多数肿瘤(清除17个肿瘤中的12个)(图16A)并提升了长期存活率(约70％的小鼠保持无肿瘤>80天)(图16B)，并且增加了肿瘤内CD8+/Treg和CD4+ T效应子(Teff)/Treg细胞的比例(图16E、图16F)，与先前数据一致。50天后，在单一疗法治疗组中，17只小鼠中仅0-2只无肿瘤，0-10％存活(图16A、图16B)。此外，肿瘤内CD8+ T细胞的功能失调状态仅在联合治疗时显著逆转，如通过恢复的离体增殖潜力(Ki67的表达，图16G)和效应子功能(颗粒酶A和颗粒酶B的表达，图16H和图16I)所指示。在第二小鼠RENCA肿瘤模型中也证实了联合治疗的协同抗肿瘤作用与更好的存活率相关(图16J)。
为了从联合治疗样品鉴定克隆扩增的CD8+ T细胞(在第11天收获的肿瘤)中的独特基因特征，在不同治疗组中进行综合比较。首先，观察到联合治疗后30个基因中的RNA特征变化，这在扩增的CD8T细胞群中甚至更显著(图10A和图20)。接下来，跨所有组进行四向比较以鉴定在联合疗法与单一疗法治疗后特异性调节的基因(图10B)。CD226被鉴定为在不同比较对之间共享的两个基因之一(图10B)。CD226是一种共刺激分子，其在抗肿瘤反应中起着重要作用。治疗组之间的不同亚群的肿瘤内CD8+ T细胞(全部、克隆扩增或未扩增)的表达分析(图10C)显示，通过对克隆扩增的T细胞的联合治疗显著提高了CD226mRNA水平(倍数变化＝10.7)，而这种差异在批量(倍数变化＝3.5)和未扩增的CD8+ T细胞(不显著)中被淡化了(图10D)。此外，与抗PD-1(倍数变化＝6.5)和抗GITR(倍数变化＝9.2)相比，通过对克隆扩增的CD8T细胞的联合治疗显著提高了CD226mRNA水平(图10D)。这一观察结果强调了对推定的肿瘤反应性克隆(高频T细胞克隆)进行基因组分析以揭示关键基因变化的重要性。
为了评估联合治疗后肿瘤内CD8T细胞上CD226的表达水平，使用最近公布的突变MC38肿瘤表位在体内跟踪MC38特异性TCR克隆。这种方法并未成功。这些T细胞克隆不能识别先前表征的MC38肿瘤新表位，这可以反映实验室之间肿瘤细胞系的不同突变状态，可能是由于肿瘤细胞的基因组不稳定性造成的。为了对该发现结果进行功能验证，生成了表达具有SIINFEKL肽和β2m的MHC I类的H-2Kb单链三聚体(OVA-β2m-Kb)的MC38肿瘤细胞系(图21A)，并使用SIINFEKL作为替代肿瘤表位。与TCR克隆性分析一致，仅抗PD-1抗体或其与抗GITR的联合治疗诱导了肿瘤浸润性T细胞中OVA特异性CD8+ T细胞(使用Kb/OVA五聚体染色)的显著克隆扩增，但只有联合治疗显著增大了Ag特异性CD8+ T细胞克隆的肿瘤内密度(图21B)。此外，与对照组相比，仅联合治疗显著扩增了脾脏中的OVA特异性CD8+ T细胞(图21B)，从而扩大了先前的发现结果。这些克隆扩增的OVA特异性T细胞是功能性的，并且在用OVA肽再刺激时产生了比对照更高水平的IFNγ(图21C)。重要的是，使用MC38-OVA-β2m-Kb模型时，发现在抗PD1治疗后，脾脏OVA特异性CD8+ T细胞上CD226的基线水平最高(图11A)，并且通过与抗GITR和抗PD-1抗体的联合治疗进一步升高。相同的治疗对非特异性CD8+ T细胞的CD226水平没有显著影响。总体抗PD-1治疗在驱动CD226的增加中起主导作用(图11A)，提供了关于抗PD-1在抗肿瘤免疫中的作用模式的关键信息。
接下来，研究了PD1与CD226分子之间的关联。最近的数据表明PD1使用基于荧光能量转移(FRET)的测定在无细胞重建系统中高度特异性地募集Shp2，其中PD1的细胞质结构域与模拟T细胞的质膜的大单层囊泡(LUV)的表面结合。为了检查CD226是否是PD1-Shp2复合物去磷酸化的靶标，在脂质体上重建参与T细胞信号传导的不同组分(CD3、CD226和图例/方法)(图11B)。通过磷酸酪氨酸(pY)western印迹测量每种组分响应于对LUV的PD-1滴定的敏感性。先前公布的表明TCR/CD3ζ不是PD-1-Shp2去磷酸化的敏感靶标的数据得到证实(图11C)。重要的是，据发现，CD226以剂量依赖性方式被PD1-Shp2非常有效地去磷酸化(图11C)。数据证明了PD-1与CD226之间的关联。
最近已证明，CD8+ T细胞反应的强度受CD226与共抑制性受体TIGIT之间的总体平衡的影响。有趣的是，使用单细胞RNA-seq时，发现抗GITR抗体治疗增加了高频T细胞克隆中的TIGIT转录物(图22A)，而FACS分析显示TIGIT在OVA特异性CD8+ T细胞上的表达显著降低(图22B)。该结果与先前的发现一致，即TIGIT表达在转录后水平受到严格调节。已针对TIGIT/CD226信号传导通路提出了顺式和反式抑制机制，因此净结果可以来自CD8+ T细胞上CD226的表达水平与CD8+ T细胞和支持淋巴细胞上的TIGIT之间的平衡。实际上，联合治疗显著降低了TIGIT+细胞的百分比以及大量肿瘤浸润性CD8+、CD4+ Teff和Treg细胞上基于每个细胞的表达水平，其效果主要由抗GITR抗体治疗驱动(图11D和图22C)。令人惊讶的是，在脾脏T细胞亚群中也发现了这种效果(图11D和图22C)。联合疗法和/或单一疗法治疗对大量CD226+肿瘤浸润或脾脏CD4+和Treg细胞没有影响(图22D)。总体单细胞分选RNA-seq和FACS表型分析数据显示，抗PD-1有利于CD226的表达，而抗GITR治疗下调TIGIT的表面表达，从而协同恢复稳态T细胞功能。
使用CD226封闭单抗，证明了通过联合治疗介导的抗肿瘤免疫需要通过CD226的共刺激信号传导(图12A)。然而，由于CD226抗体可能对CD8T细胞亚群具有潜在的耗尽作用，因此CD226在C57BL/6背景小鼠中遗传失活以重复该研究(图23A、B)。CD226-/-小鼠在T细胞(CD4+、CD8+、Tregs)稳态上未显示缺陷(图23C-E)，并且对TCR活化的反应与野生型小鼠类似(图23F)。重要的是，据发现，联合治疗不再在CD226-/-小鼠中赋予抗肿瘤作用或存活率益处，表明CD226对于观察到的联合治疗的抗肿瘤作用是至关重要的(图12B)。此外，CD226通路介导该作用的特异性得到了验证，因为使用CTLA4-Ig抑制TNF受体超家族的其他成员(OX40L或4-1BBL)或阻断B7共刺激分子(CD28)保留了通过联合疗法介导的抗肿瘤作用(图12C-E)。
此外，CD226信号传导通路是TIGIT-/-小鼠中增强的肿瘤监测所必需的(图24A、B)。有趣的是，携带过度表达CD226、CD155/PVR的主要配体的MC38肿瘤细胞的小鼠(图24C)显示，与MC38空载体(MC38-EV)肿瘤细胞或用同种型对照治疗的小鼠相比，在抗PD-1或抗GITR或联合疗法后肿瘤生长显著延迟(图24D)。移植有MC38-CD155的小鼠的免疫谱分析证实了在植入后MC38-CD155细胞与M38-EV(空载体)相比持续更高的CD155表达水平(图24E)。MC38肿瘤细胞上的CD155过表达与CD4+、CD8+ T和Treg细胞上可检测的CD226表达降低相关，并且这种过表达增强了T细胞活化，如肿瘤内T细胞上增强的IFNγ和4-1BB表达所指示(图24F、图24G)。正如预期的那样，在周边没有观察到任何影响。
接下来，在临床环境中研究PD-1抑制与CD226表达之间的关系。对从PD-1靶向治疗前后的43名晚期癌症患者收集的肿瘤活检进行RNA-seq分析(图12F)。重要的是，在癌症患者中施用两次剂量的抗hPD-1治疗后，CD226表达显著增加(图12G)。此外，对来自癌症基因组图谱(TCGA)的临床数据进行探查，以检查CD226表达水平是否与总体T细胞活化强度相关并且可以预测癌症患者的更好预后。实际上，具有高基线CD226表达的患者在此处评估的二十种不同类型的癌症中的五种(皮肤黑素瘤、肺腺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫体内膜癌和肉瘤)中具有显著更高的存活概率(图12H和图25)。总体而言，这些结果支持免疫疗法策略，其促进CD226信号传导，同时封闭TIGIT以最大化T细胞活化。
在此，利用技术平台揭示驱动共刺激激动剂和共抑制拮抗剂的有效协同作用的分子机制，阐明了持久抗肿瘤反应所需的参数，并揭示了可能影响新一代肿瘤特异性联合疗法的关键功能T细胞调节通路。
实施例6B
TCR库分析生物信息学管道rpsTCR及其验证
TCR序列提取和组装。给定V和J等位基因信息以及CDR3氨基酸序列，从IMGT数据库(imgt.org)中提取V和J等位基因的氨基酸序列。接下来，将CDR3序列与V序列的C末端和J序列的N末端进行比对，以生成连续的VDJ氨基酸序列。然后，对于每个V等位基因，如果可用，则从IMGT鉴定前导序列(L)并将其附加到VDJ序列的C末端。如果前导序列不可用，则使用最常见的前导序列。然后使用EMBOSS Backtranseq工具(ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq)将LVDJ氨基酸序列反向翻译成密码子优化的核苷酸序列。最后，将TCRA/TCRB(得自IMGT)的恒定(C)区的核苷酸序列附加到LVDJ核苷酸序列的N末端，从而获得完整LVDJC序列以用于克隆。
使用从分选的单细胞产生的随机引发RNAseq数据开发并验证生物信息学管道以提取、重建和分析TCR序列，从而允许鉴定可能与肿瘤反应和患者存活率相关的T细胞克隆。与通过使用长读段(2x300bp)的靶向TCR扩增子测序进行的常规TCR-seq方法不同，极小部分的随机引发RNA-seq读段是TCR序列并且读段长度短(通常＝<100bp)，其通常仅覆盖TCR的部分V(D)J区。为了解决这些问题，在管道中整合了阴性TCR序列选择步骤和短读段组装步骤。简而言之，该管道采用配对或单端短读段，并将这些读段映射到人或小鼠基因组和转录组，但不映射到TCR基因座和转录物(图17和方法)。结果表明，该方法是用于随机引发RNA-seq数据的高灵敏度准确CDR3组装方法(图18、图13和上述实施例6A方法)。最后，将该管道应用于1,379个CD8+单细胞RNA-seq数据库。TCRB-CDR3(86％)、TCRA-CDR3(78.2％)和配对TCRB和TCRA(73.1％)的检测率与从单个T细胞使用靶向TCR测序所报道的检测率相当(图14)。
当肿瘤可触知时，在肿瘤攻击后6天施用抗体(图9A)。使用上述生物信息学工具分析在肿瘤攻击后第8天和第11天从荷瘤小鼠分选的1379个CD8+ T细胞单细胞的转录组。在早期时间点(第8天)，在所有治疗组中检测到非常少的高频T细胞克隆(定义为共享相同TCR序列的至少3个T细胞)(图9B)。到第11天为止，鉴定出两个高频T细胞克隆，代表来自同种型对照样品的所测序的单个CD8+ T细胞的5.7％；抗GITR样品为3个克隆/20.3％，抗PD-1样品为6个克隆/26.7％，并且联合治疗的样品为10个克隆/31.9％。实际上，在第8天和第11天之间，通过抗PD-1单一疗法诱导了肿瘤内CD8+ T细胞的显著克隆扩增。该结果与检测抗PD-1疗法(派姆单抗)后TCR克隆性增加的公布数据一致。结果通过证明抗PD-1抗体似乎是克隆扩增的主要驱动因素来扩展这些发现，并且PD-1和GITR的双重靶向进一步增强了肿瘤内CD8T细胞TCR克隆性(图9B和图9C)。抗GITR和/或抗PD-1对外周/脾脏T细胞克隆性没有影响(图9C)，与使用派姆单抗治疗的患者数据一致。
为了验证联合治疗后在MC38肿瘤内富集的TCR的肿瘤抗原特异性，进行生物信息学分析以提取和组装全长配对TCRα/β序列(实施例6A方法)。将得自扩增CD8+ T细胞的全长TCR对克隆到慢病毒构建体中，并转导到缺乏内源性TCR表达的Jurkat T细胞系中。使用AP-1驱动的荧光素酶报告基因作为这些工程化T细胞系的TCR特异性的读出结果(图9D)。使用充分表征的LCMV TCR(P14)验证该测定(图19)。来自高频克隆(共享相同TCR的5个细胞)的TCR可以识别由野生型MC38肿瘤细胞特异性呈递的表位，但不识别由无关的同基因C57BL/6肿瘤细胞系(B16F10.9或TRAMP-C2)特异性呈递的表位(图9E示出代表性TCR克隆)，从而验证它们的特异性。
此外，确定抗GITR和抗PD-1调节这些克隆扩增的CD8+ T细胞中的不同分子通路(图15)。联合治疗协同整合通过单一试剂治疗调节的途径并促进强适应性免疫反应，以及与细胞周期和代谢活性相关的通路的反应。尽管单一试剂疗法扩增了肿瘤内CD8+ T细胞克隆并调节了关键基因通路，但这不足以导致完全且持久的肿瘤排斥。发现结果表明，通过联合疗法对功能失调的肿瘤浸润性T细胞进行深度重编程是完全肿瘤排斥所必需的。此结果得到最近一项研究的支持，该研究表明，CD8+ T细胞在肿瘤发展的早期阶段功能失调并逐渐演变为柔性较低的状态。
新一代测序技术使全基因组和转录组测序变成常规操作，为同时检测全基因组基因表达和提取TCR序列提供了机会。然而，与通过使用长读段(2x300bp)的靶向TCR扩增子测序进行的常规TCR-seq方法不同，极小部分的随机引发RNA-seq读段是TCR序列并且读段长度短(通常＝<100bp)，其通常仅覆盖TCR的部分V(D)J区。开发rpsTCR管道以从随机引发短RNA测序读段组装和提取TCR-CDR3序列，从而解决该问题(图17)。rpsTCR使用具有默认参数的Tophat，提供双端和单端短读段并将这些读段映射到小鼠或人基因组和转录组，但不映射到TCR基因座和转录物。丢弃映射的读段，并且将回收未映射的读段以提取TCR序列。修剪未映射读段中的低质量核苷酸。然后使用HTQC工具包过滤掉长度小于35bp的读段。通过QC的短读段使用iSSAKE默认设置组装成更长的读段。使用TCRklass鉴定CDR3序列，Scr(保守残基支持分数)设定为默认值1.7至2。使用来自健康人PBMC样品的靶向TCR-seq数据作为阳性对照，以评估与单独的TCRklass相比，引入管道的额外步骤是否导致更高的假阳性率或假阴性率。通过rpsTCR和TCRklass检测到来自TCRB(64,031)或TCRA(51,448)的大部分独特CDR3序列。对于TCRB-CDR3和TCRA-CDR3，rpsTCR与TCRklass之间的相关系数平方分别为0.9999和0.9365(图17)。使用六种TCR阴性癌细胞系或非癌细胞系作为阴性对照。rpsTCR未检测到任何CDR3序列，而TCRklass从这些TCR阴性癌细胞系中的一些提取了一些CDR3序列(图13)。为了进一步验证管道的性能，使用靶向TCR-seq方法和随机引发RNA-seq方法(200M，2x100bp)对健康小鼠PBMC样品进行测序。尽管由RNA-seq数据组装的CDR3序列的数量远小于来自靶向TCR-seq方法的CDR3序列的数量，但是在来自靶向TCR-seq的CDR3序列中也观察到使用rpsTCR从RNA-seq数据鉴定的约45％的CDR3序列。由于靶向TCR-seq的技术限制，因此从RNA-seq数据提取的一部分CDR3序列不存在于TCR-seq结果中也就不足为奇了。例如，用于靶向TCR-seq的5’race接头的效率通常较低，并且多重PCR倾向于扩增高频TCR，因此只能靶向一小部分TCR。正如预期的那样，在靶向TCR-seq的高频CDR3序列(>＝0.1％)中也观察到，使用rpsTCR从RNA-seq数据鉴定的CDR3序列具有更高百分比(约70％)，而单独使用TCRklass仅提取约40％。此外，将100bp读段长度切割成50bp片段并随机选择200M读段。在通过靶向TCR-seq方法排序的前10个CDR3序列中，通过rpsTCR检测到8个CDR3序列，而通过TCRklass仅检测到3个序列。然后将rpsTCR管道用于从单细胞RNA-seq数据提取CDR3序列，所述单细胞RNA-seq数据由用不同抗体治疗的MC38的肿瘤内CD8T细胞生成。CDR3_beta和CDR3_alpha序列检测率与使用靶向TCR-seq方法检测来自T细胞的单细胞测序的TCR序列所公布的数据(图14)相当。
虽然已经结合优选实施方案和具体实例描述了所述方法和系统，但是并非旨在将范围限于所阐述的特定实施方案，因为本文的实施方案在所有方面都旨在为说明性而非限制性。
除非另有明确说明，否则决非旨在将本文阐述的任何方法解释为要求其步骤以特定顺序执行。因此，在方法权利要求实际上没有列举其步骤所遵循的顺序，或者在权利要求或说明书中没有另外特别说明将步骤限于特定顺序的情况下，其决非旨在在任何方面都可以推断出顺序。这适用于任何可能的非明确的解释基础，包括：关于步骤安排或操作流程的逻辑问题；从语法组成或标点符号中得出的简单含义；说明书中描述的实施方案的数量或类型。
在本申请中，引用了各种出版物。这些出版物的公开内容全文据此以引用方式并入本申请，以便更充分地描述所述方法和系统所属技术领域的现状。
对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离范围或实质的情况下，可以进行各种修改和变化。考虑到本文公开的说明书和实践，其他实施方案对于本领域技术人员而言将显而易见。其意图是仅将说明书和实例视为示例性，真正的范围和实质由以下权利要求指出。
序列表
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
<120> 用于对T细胞受体进行测序的系统和方法及其用途
<130> 37595.0022P1
<150> 62/432,525
<151> 2016-12-09
<150> 62/508,667
<151> 2017-05-19
<160> 324
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成构建体；抗原结合域
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gly Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr
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<223> 合成构建体；抗原结合域
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Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
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<223> 合成构建体；抗原结合域
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<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 21
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
20 25 30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys Trp Gly Asn Ile Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Ser Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Leu Ser Ile Asn Thr Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu His Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Thr Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Val Val Asp Phe Arg
100 105
<210> 23
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Asp Gly Lys Thr Val Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Trp Gln Tyr Leu Ile Glu Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ser Gly Ile Gly Trp Thr Gly Gly Arg Ser Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Gly Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gln Trp Leu Val Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 27
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Trp Asn Asp Gly Lys Thr Val Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu His
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Trp Gln Tyr Leu Ile Asp Arg Tyr Phe Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Gly Trp Ser Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Tyr Thr Phe Met Ile Thr Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 29
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ser Gly Trp Asn Arg Gly Ser Leu Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Val Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Phe Val Val Val Ser Ala Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Val Thr Phe Arg Asn Phe
20 25 30
Ala Ile Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Phe Phe Ser Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Pro Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
Met Glu Leu Ala Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Glu Arg Gly His Thr Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Arg Gly Arg Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asp Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Glu Gln Trp Leu Asp Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Arg Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Asp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gln Gly Gly Ser Tyr Pro Tyr Tyr Phe His Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Gly Trp Ser Asn Val Lys Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys Ala Tyr Thr Ser Met Leu Thr Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Asp Gly Ser Thr Ser Asn Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Ala Gly Asp Ile Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 35
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
His Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ile Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Pro Val Gly Ala Thr Gly Ala Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ser Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ile Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Thr Gly Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys
85 90 95
Thr Arg Asp Arg Gln Trp Leu Met Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 37
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Ala His Trp Asn Phe Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ala Leu His Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Trp Asn Ser Gly Val Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Val Ser Trp Phe Asp Pro Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 39
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Tyr His Trp Asp Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Thr Ile Thr Tyr Asn Gly Asn Thr Tyr Phe Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Leu Ser Met Thr Ala Ala Glu Thr Ala Val Phe Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg His Leu Gly Tyr Asn Ser Asp Phe Phe Pro Phe Asp Phe
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 40
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Gly Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys Val Arg Asn Tyr Asp Gly Ser Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 41
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 41
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Met Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Ser Val Thr Gly Thr Ser Ser Tyr Tyr Tyr Gly Val Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Arg Thr Pro Leu
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 43
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 43
Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Asp Cys Gly His Ser Gly Asn Asp Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120 125
<210> 44
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 44
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 45
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 45
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Ser His Arg Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser
85 90 95
Arg Asp Glu Glu Leu Glu Phe Arg Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 46
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Val
35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 47
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 47
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Ile Ser Asn
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr
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Cys Ala Ser Tyr Asn Arg Asn Tyr Arg Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 48
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 49
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 49
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Asn Ala Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Ser Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Gly Tyr Cys Ser Ser Pro Thr Cys Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Phe
100 105 110
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 50
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 50
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ile Ser Ser
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 51
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Ala
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp Glu Lys Ser Tyr Ser Thr Ser
50 55 60
Leu Arg Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Thr Asn Leu Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Pro Glu Phe Thr Ser Ser Ser Trp Ala Leu Tyr Tyr
100 105 110
Phe Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 52
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Ser Thr
20 25 30
Tyr Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Asp Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Pro
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Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Asp Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
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65 70 75 80
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Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 54
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Ser Ser Ser
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Tyr Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Val Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
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85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 55
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr His
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Arg Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
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Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Gly Asn Asp Val Lys Asn Tyr Ser Pro Ser
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Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
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Val Thr Val Ser Ser
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<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 56
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Leu Met Tyr Ser
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<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 57
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
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Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 58
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 59
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val His Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 60
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 60
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Ser Tyr
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 61
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Pro Pro Ser Glu
1 5 10 15
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 62
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 63
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Arg Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
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Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Thr Gly Leu Glu Trp Ile
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Arg Gly Glu Asp Tyr Asp Ile Trp Ser Gly Tyr Tyr Arg Glu Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 64
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 64
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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<210> 65
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 65
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Glu Phe
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
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Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Met Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Val Ala Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Phe Gly Tyr Asp Phe Arg Ser Ser Tyr Glu Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 66
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 66
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr
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Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 67
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 67
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
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115 120
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 68
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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Ser Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 70
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<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 71
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<211> 108
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 72
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
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100 105
<210> 73
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 73
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
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20 25 30
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 74
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 74
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
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100 105 110
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 75
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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20 25 30
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50 55 60
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115
<210> 76
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 76
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
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Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Gly Ala Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 77
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 77
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Arg Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 78
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Thr
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 79
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Asn
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Arg Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala His Arg Gly Leu Phe Gly Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 80
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 81
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
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Ser Lys Val Ala Ala Ala Asn Asn Tyr Tyr Tyr Ala Leu Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 82
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Lys Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 83
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 83
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Val Ser Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Gly Glu Val Glu Tyr Ser Ser Ser Asn Tyr Asn Tyr Tyr
100 105 110
Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 84
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 84
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Val Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asp Leu Pro Ile
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
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<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 85
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe His Asn Phe
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Thr Gly Ser Gly Thr Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Lys Asp Arg Gly Tyr Asp Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Trp Phe
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Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 86
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Phe Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Ser
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Leu Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
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<210> 87
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 87
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser His Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
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Ala Arg Asp Gly Asn Ile Trp Ser Gly Tyr Tyr Ala Ala Tyr Tyr Phe
100 105 110
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 88
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Ile Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Val Gln Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 89
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Asn Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ala Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Glu Asp Tyr Asp Ile Trp Asn Gly Tyr Tyr Gln Glu Lys Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 90
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 90
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Val Val Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 91
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 92
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 92
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gly Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Gly Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Ser Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 93
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 93
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Val Ala Thr Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 94
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 94
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Thr Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 95
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 95
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Val Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 96
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 96
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Phe Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ile Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
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100 105 110
<210> 97
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 97
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Asn
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Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 98
<211> 108
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 98
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
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<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 99
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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65 70 75 80
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115 120 125
<210> 100
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 100
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
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50 55 60
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100 105 110
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115 120 125
Ser
<210> 101
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 101
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 102
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 102
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Phe
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
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115 120 125
Ser
<210> 103
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 103
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr
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Ser
<210> 104
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 104
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ile Thr Asn
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Gly Asp Pro Ser Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 105
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 105
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 106
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser His Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Ser Tyr Ser Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Leu Asp Ile Met Ala Thr Val Gly Gly Leu Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 107
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Phe Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Asp Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Asp Gln Gly Ile Ser Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Asn Tyr Tyr Tyr Gly Val Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
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Val Ser Ser
130
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 108
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Ser His Arg Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser
85 90 95
Arg Asp Glu Glu Leu Glu Phe Arg Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 109
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 110
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Tyr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys
85 90 95
Thr Lys Glu Ser Thr Thr Gly Thr Tyr Ser Tyr Phe Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 111
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Ser Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Leu Ser Gly Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 112
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 113
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 114
Gln Glu His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 115
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 115
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
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Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
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65 70 75 80
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 116
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
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85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Asp Asp Ile Val Val Val Pro Ala Val Met Arg Glu
100 105 110
Tyr Tyr Phe Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
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Ser Ser
130
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 117
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 118
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Gln Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Ile Leu Ser Ser Leu Ile Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Glu Asp Trp Asn Phe Gly Ser Trp Phe Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 119
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 119
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
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65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Phe Cys Met Gln Ala
85 90 95
Thr His Phe Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 120
Gln Val His Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Asn Thr Gly Thr Thr Lys Tyr Ile Gln Asn Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Gly Ser Trp Phe Asp Thr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 121
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 121
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Pro Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Thr His Phe Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Arg
100 105 110
<210> 122
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 122
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
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35 40 45
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Ile Val Ser Ser
115 120
<210> 123
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 123
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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100 105
<210> 124
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 124
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
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Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 125
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 126
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 127
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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65 70 75 80
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100 105
<210> 128
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 128
Glu Glu Arg Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Val Gly Thr Asn
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100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 129
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 129
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Met Ser Ser Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 130
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Met Pro Gly Ser
1 5 10 15
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85 90 95
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100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 131
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 131
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Phe Asn Phe Asn
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<210> 132
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 132
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val His Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Asp Glu Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Ser Asn Asn Asn Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Gly Ile Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala
35 40 45
Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
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Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Asn
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<220>
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<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
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<223> 合成构建体；抗原结合域
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<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 143
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<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 144
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<223> 合成构建体；抗原结合域
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<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 147
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<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 148
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<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
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<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 151
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<400> 152
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<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 153
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<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 156
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 157
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<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 158
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100 105
<210> 159
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 159
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 160
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Arg
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Thr Phe Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 161
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 161
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Val Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu
65 70 75 80
Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Glu Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Thr Leu Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 162
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 162
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Thr Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 163
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 163
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Thr Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Tyr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Gly His Leu Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 164
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 164
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 165
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 165
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Ser Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Ile Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Ala Ser Trp Asp Tyr Asn Gly Val Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 166
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 166
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Ser Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
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100 105 110
<210> 167
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 167
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ile Val Ser Gly Gly Ser Thr Ser Ser Asn
20 25 30
Thr Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Thr Ile His Tyr Ser Gly Asn Pro Tyr Tyr Asp Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn His Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Thr Arg Gln Tyr Ile Asn Phe Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 168
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Val Leu Ile
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50 55 60
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 169
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys
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<211> 108
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 170
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Thr
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 171
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 172
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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65 70 75 80
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<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 173
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Val Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Arg Gly Gly Asn Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
Leu Gln Val Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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115 120
<210> 174
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 174
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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100 105
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 175
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Arg Gly Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Tyr His Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 176
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
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Glu Asp Phe Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Thr Pro Phe
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Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
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<210> 177
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 177
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Met Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Thr Ala Tyr Asn Gly Asn Ser Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Gly Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 178
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 178
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 179
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 180
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 180
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ala Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<210> 181
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 181
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
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<210> 182
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 182
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ile Leu Gly
1 5 10 15
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100 105 110
<210> 183
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 183
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 184
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 184
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Lys Ser Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 185
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 185
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
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35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 186
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 186
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
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100 105
<210> 187
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 187
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 188
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 188
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Trp Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val His Ile Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 189
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 189
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Asp Gly Pro Phe Lys Ile Ser Phe Phe Gly Met Asp Val Trp
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Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 190
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
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Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 191
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys His Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Gly Gln Leu Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 192
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
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85 90 95
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 193
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Gly Pro Trp Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 194
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Asn Thr Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Val Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Glu
100 105
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 195
Gln Val Gln Leu His Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Gly
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Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Gln Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ile Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
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Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 196
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Asp
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Leu Gly Trp His Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 197
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Thr Gly Phe Ile Phe Asp Asp Tyr
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Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<211> 108
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 198
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 199
Asp Arg Gln Met Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Ala Ser Gly Phe Ile Ile Ser Arg Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Asn Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
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Gly Arg Val His Gln Phe Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 200
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 200
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Arg Gly Ser Gln Asn Ile Gly Ser Phe
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 201
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Asn Gly
20 25 30
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35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ile Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
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Leu Glu Ser Arg Leu Ser Leu Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
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Cys Ala Arg Ser Ser Leu Ser Val Ser Glu Ala Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 202
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 202
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Phe Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Phe
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 203
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Gly
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Cys Ala Arg Ser Ser Leu Ala Val Ser Glu Ala Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
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115 120
<210> 204
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 204
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Thr Pro Pro
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Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 205
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 205
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro His Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Asp Leu Ile Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Gly Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 206
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 206
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Thr Thr Ala Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 207
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 207
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Ser Gly Ser Gly Leu Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 208
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 208
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Ser Asn Ser
20 25 30
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Pro Thr Phe Gly Gln Gly Ala Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 209
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
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Gly Arg Gly Thr Leu Val Ile Val Ser Ser
115 120
<210> 210
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 210
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Ser Ser Ser
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100 105
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 211
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
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100 105 110
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115 120
<210> 212
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 212
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
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35 40 45
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Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Asn
100 105
<210> 213
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 213
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Asn
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 214
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 214
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ala Gly Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
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100 105
<210> 215
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 215
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Asn Arg Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Gly Leu Phe Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 216
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 216
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Thr Ile Asn Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Asn Ser Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 217
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 217
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Gly Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Phe Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 218
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Pro Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Glu Leu Gly Leu Asp Tyr Tyr Ser Gly Met Asp Val
100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 219
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Asn Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 220
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Pro Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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115 120
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 221
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
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Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 222
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 223
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 224
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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115 120
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<211> 107
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 225
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
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65 70 75 80
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<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 226
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ala Val Gln Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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115 120
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 227
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Lys Asn Asp
20 25 30
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 228
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Phe His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val
35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 229
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 230
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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65 70 75 80
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Ala Arg Asp Gly Glu Leu Gly Leu Asp Tyr Tyr Ser Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 231
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 231
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 232
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 232
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 233
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Thr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
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50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 234
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Ser Glu Ser Asn Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Leu Gly Lys Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 235
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 235
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 236
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Ala Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Gly Gly Glu Leu Arg Leu Asp Tyr Tyr Ser Gly Leu Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 237
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 237
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Asp
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 238
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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115 120
<210> 239
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 239
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1 5 10 15
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100 105
<210> 240
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 240
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Arg Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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Ala Arg Gly Gly Glu Leu Val Arg Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
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115 120
<210> 241
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 241
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
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100 105
<210> 242
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 242
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Ile Phe Ser Thr His
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
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115
<210> 243
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 243
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
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100 105
<210> 244
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 244
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Pro Leu Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 245
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 245
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 246
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 246
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Pro Leu Ser Ser Ser Ser Ser Asp Tyr Tyr Gly Leu
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 247
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 247
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ile Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 248
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Glu Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Thr Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ser Val Ser Arg Glu Asn Ala Arg Ser Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 249
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ala Ala Ser Ser Leu Gln Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Ala Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Glu Tyr Asn Tyr Ala Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 250
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 250
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Val Tyr
20 25 30
Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ser Tyr Ile Gly Ser Ser Gly Phe Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Trp Asn Asp Gly Val Pro Asn Tyr Leu Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 251
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 251
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Arg Tyr His Cys Gln Gln Tyr Asp Lys Ile Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 252
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 252
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Val Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Gly Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Gln Leu Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 253
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 253
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Val Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 254
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Gly Phe His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Ser Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Pro Phe Ser Ser Ser Trp Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 255
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Trp Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ala Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 256
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Thr
20 25 30
Asn His Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Asn Val Tyr Tyr Ile Gly Asn Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Thr Gly Val Thr Phe Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Asn Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Leu Ser Asn Trp Asn Phe Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 257
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 257
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Asn Trp Leu Ser
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 258
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 258
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Val Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr His Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Met Val Arg Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 259
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 259
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 260
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 260
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Asn Phe
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Leu Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Asn Asn Arg Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Ser Leu Gly Ser Pro Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 261
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 261
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ile Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Phe Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Thr Thr Ile Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Ser Tyr Asn Pro Ser Pro Arg Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 262
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 262
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Ser Leu Ala Ala Pro Asp Leu Tyr Lys Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 263
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 263
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ile Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Ser
20 25 30
Phe Leu Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr His Arg Gly Asn Thr Asp Ser Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Thr Asp Pro Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
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85 90 95
Arg Gly Gln Phe Met Glu Trp Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 264
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 264
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 265
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 265
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Leu Phe Pro Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
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65 70 75 80
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Ala Arg Gly Ser Ser Leu Thr Ala Leu Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 266
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 266
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 267
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 267
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn
1 5 10 15
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20 25 30
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Asp Tyr Val Asp Ser Val
35 40 45
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50 55 60
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
65 70 75 80
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85 90 95
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
100 105
<210> 268
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体；抗原结合域
<400> 268
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Ile Lys Tyr Tyr Glu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Val Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 269
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 269
Cys Ala Ser Ser Arg Asn Thr Glu Val Phe Phe
1 5 10
<210> 270
<211> 12
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 270
Cys Ala Ser Ser Ile Gly Asn Thr Glu Val Phe Phe
1 5 10
<210> 271
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 271
Cys Ala Ser Ser Gln Pro Gly Lys Asn Thr Glu Val Phe Phe
1 5 10
<210> 272
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 272
Cys Ala Ser Ser Leu Gly Gln Gly Asn Asn Ser Pro Leu Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 273
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 273
Cys Ala Ser Ser Gln Gly Gln Gly Gly Ala Glu Thr Leu Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 274
<211> 13
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 274
Cys Ala Ser Ser Pro Pro Met Gly Gly Gln Leu Tyr Phe
1 5 10
<210> 275
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 275
Cys Ala Ser Ser Gln Glu Gly Ala Asn Thr Glu Val Phe Phe
1 5 10
<210> 276
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 276
Cys Ala Ser Ser Gln Val Gln Gly Thr Gly Asn Thr Leu Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 277
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 277
Cys Ala Ser Ser Gln Glu Gly Asp Gly Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 278
<211> 13
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 278
Cys Thr Ser Ala Glu Gly Gly Gly Thr Glu Val Phe Phe
1 5 10
<210> 279
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 279
Cys Ala Ser Ser Pro Pro Gly Gly Gly Thr Glu Val Gly Gly
1 5 10
<210> 280
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 280
Cys Ala Ser Ser Gly Thr Asp Asn Gln Asp Thr Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 281
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 281
Cys Ala Ser Ser Pro Gly Thr Gly Gly Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 282
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 282
Cys Ala Ser Ser Leu Glu Leu Gly Phe Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 283
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 283
Cys Ala Ser Ser Leu Gly Gly Ala Pro Asn Glu Arg Leu Phe Phe
1 5 10 15
<210> 284
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 284
Cys Ala Ser Ser Gln Glu Gly Asp Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 285
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 285
Cys Ala Ser Ser Arg Asn Thr Glu Val Phe Phe
1 5 10
<210> 286
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 286
Cys Ala Ser Gly Asp Ala Met Gly Gly Arg Asp Tyr Ala Glu Gln Phe
1 5 10 15
<210> 287
<211> 12
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 287
Cys Gly Ala Arg Glu Gly Gln Asp Thr Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 288
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 288
Cys Gly Ala Arg Thr Gly Gly Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 289
<211> 12
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 289
Cys Thr Cys Ser Ala Gly Asn Gln Ala Pro Leu Phe
1 5 10
<210> 290
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 290
Cys Ala Ser Ser Gly Thr Gly Gly Gly Ala Glu Gln Phe Phe
1 5 10
<210> 291
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 291
Cys Ala Ser Ser Asp Glu Gly Gly Gly Thr Gly Gln Leu Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 292
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 292
Cys Ala Ser Ser Arg Asp Trp Gly Gly Ser Gln Asn Thr Leu Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 293
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 293
Cys Ala Ser Ser Pro Thr Gly Tyr Asn Ser Pro Leu Tyr Phe
1 5 10
<210> 294
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 294
Cys Ala Ser Ser Gln Val Gln Gly Ser Ala Glu Thr Leu Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 295
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 295
Cys Ala Ser Ser Gly Thr Gly Gly Asn Gln Asp Thr Gln Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 296
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 296
Cys Ala Ser Gly Asp Ala Gly Thr Gly Asn Tyr Ala Glu Gln Phe Phe
1 5 10 15
<210> 297
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 297
Cys Ala Ser Ser Leu Arg Thr Gly Tyr Asn Ser Pro Leu Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 298
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 298
Cys Ala Ser Arg Leu Gly Gly Asp Gln Asn Thr Leu Tyr Phe
1 5 10
<210> 299
<211> 12
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 299
Cys Ala Ser Lys Thr Gly Gly Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 300
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 300
Cys Ala Ser Ser Glu Gly Asp Thr Leu Tyr Phe
1 5 10
<210> 301
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 301
Cys Ala Ser Ser Pro Gly Thr Phe Asn Gln Asp Thr Gln Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 302
<211> 13
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 302
Cys Ala Ser Ala Ser Trp Thr Gly Asp Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 303
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 303
Cys Ala Ser Ser Leu Pro Gly Ser Gln Asn Thr Leu Tyr Phe
1 5 10
<210> 304
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 304
Cys Ala Ser Ser Arg Asp Trp Ala Gln Asp Thr Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 305
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 305
Cys Ala Ser Ser Asp Asn Trp Gly Ala Gly Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 306
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 306
Cys Ala Ser Ser Ser Gly Thr Ala Ser Asp Thr Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 307
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 307
Cys Ala Ser Ser Gln Thr Arg Asp Trp Gly Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 308
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 308
Cys Thr Cys Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 309
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 309
Cys Ala Ser Ser Leu Gly Thr Gly Gly Ile Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 310
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 310
Cys Ala Ser Ser Leu Ser Asp Ser Asn Gln Asp Thr Gln Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 311
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 311
Cys Ala Ser Ser Glu Arg Gly Gly Arg Asp Thr Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 312
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 312
Cys Thr Cys Ser Ala Val Arg Glu Gly Asn Ser Pro Leu Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 313
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 313
Cys Ala Ser Ser Leu Thr Gly Val Ser Asn Glu Arg Leu Phe Phe
1 5 10 15
<210> 314
<211> 13
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 314
Cys Ala Ser Ser Arg Gln Leu Asn Ser Asp Tyr Thr Phe
1 5 10
<210> 315
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 315
Cys Ala Ser Ser Leu Arg Gln Gly Ser Asn Thr Glu Val Phe Phe
1 5 10 15
<210> 316
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 316
Cys Ala Ser Ser Gln Asn Arg Asp Ile Ser Ala Glu Thr Leu Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 317
<211> 13
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 317
Cys Ala Ser Ser Trp Thr Ala Asn Thr Glu Val Phe Phe
1 5 10
<210> 318
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 318
Cys Ala Ser Ser Leu Arg Asp Trp Gly Gln Asp Thr Gln Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 319
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 319
Cys Ala Ser Ser His Trp Gly Gly Thr Thr Gly Gln Leu Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 320
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 320
Cys Ala Ser Ser Tyr Ser Lys Gly Ser Ala Glu Thr Leu Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 321
<211> 13
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 321
Cys Ala Val Ser Met Ile Asn Tyr Asn Val Leu Tyr Phe
1 5 10
<210> 322
<211> 12
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 322
Cys Ala Ser Ser Asp Gly Gln Asn Thr Leu Tyr Phe
1 5 10
<210> 323
<211> 13
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 323
Cys Ala Ser Ser Gln Glu Gly Pro Gly Gln Leu Tyr Phe
1 5 10
<210> 324
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 324
Cys Ala Ser Thr Gly Gln Gly Tyr Asn Ser Pro Leu Tyr Phe
1 5 10

Claims (50)

1.一种用于对T细胞受体(TCR)进行测序的方法，包括：
a)对从T细胞获得的RNA的少于100个碱基对的短读段进行测序；其中所述短读段是由RNA的随机引发获得的；
b)将所述短读段与参考序列进行比对，其中所述参考序列不包含TCR基因序列，从而生成包括映射的短读段和未映射的短读段的读段集；
c)丢弃所述读段集中的所述映射的短读段；其中丢弃所述读段集中的映射的短读段还包括丢弃所述读段集中小于35个碱基对的未映射的短读段；
d)将所述读段集中剩余的所述未映射的短读段组装成一个或多个长读段；
e)将所述一个或多个长读段翻译成对应氨基酸序列；
f)将TCR V区和TCR J区氨基酸参考序列分成六个氨基酸的k串，将所述k串与来自步骤(e)的对应氨基酸序列进行比对，检测所述k串中映射到所述对应氨基酸序列的一个或多个保守TCR CDR3残基，对检测到的保守水平进行评分，选择保守分数高于阈值保守分数的对应氨基酸序列，并检测所选对应氨基酸序列中的候选CDR3区氨基酸序列；
g)鉴定所述一个或多个长读段中所述候选CDR3区氨基酸序列的核酸序列；
h)将所述候选CDR3区核酸序列上游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个TCRV基因参考序列进行比对，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选TCR V基因序列；并且
i)将所述候选CDR3区核酸序列下游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个TCRJ基因参考序列进行比对，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选TCR J基因序列，从而生成TCR序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述T细胞是从人或小鼠获得的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述参考序列包括人基因组、小鼠基因组、人转录组或小鼠转录组。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中将所述读段集中剩余的所述未映射的短读段组装成一个或多个长读段包括：
将所述一个或多个未映射的短读段与TCR序列参考数据库中的一个或多个TCR序列进行比对；并且
基于所述比对，将所述一个或多个未映射的短读段组装成长读段。
5.根据权利要求1或2所述的方法，还包括将TCR C区核酸序列附加到所述TCR序列。
6.根据权利要求1或2所述的方法，还包括在对从所述T细胞获得的RNA的少于100个碱基对的所述短读段进行测序之前，向由其获得所述T细胞的受试者施用免疫疗法。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述免疫疗法包括单一疗法或联合疗法。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述联合疗法包括共刺激激动剂和共抑制拮抗剂。
9.根据权利要求1或2所述的方法，还包括：
对受试者的第一多个T细胞重复步骤a-i，其中在施用治疗之前收集所述T细胞；
确定所述第一多个T细胞中存在的独特TCR序列的出现次数；
向所述受试者施用所述治疗；
对所述受试者的第二多个T细胞重复步骤a-i，其中在施用所述治疗之后收集所述T细胞；
确定所述第二多个T细胞中存在的独特TCR序列的出现次数；并且
基于所述第一多个T细胞和所述第二多个T细胞中存在的独特TCR序列的所述出现次数，确定经历克隆扩增的一个或多个独特TCR序列。
10.根据权利要求9所述的方法，还包括基于经历克隆扩增的所述一个或多个独特TCR序列，确定T细胞克隆扩增特征。
11.根据权利要求10所述的方法，还包括：
使用所述T细胞克隆扩增特征查询T细胞克隆扩增特征的数据库和对应的治疗反应；
基于所述查询，确定所述受试者对所述治疗作出反应的可能性。
12.根据权利要求10或11所述的方法，还包括：
确定所述受试者对所述治疗的反应；
将所述T细胞克隆扩增特征存储在数据库中；并且
将所述受试者对所述治疗的反应与所述数据库中的所述T细胞克隆扩增特征相关联。
13.根据权利要求1或2所述的方法，还包括：
确定所述TCR序列存在于响应于治疗而扩增的T细胞克隆中；并且
产生含有所述TCR序列的一个或多个T细胞。
14.根据权利要求1或2所述的方法，其中对从T细胞获得的RNA的少于100个碱基对的短读段进行测序包括对从多个T细胞获得的RNA的少于100个碱基对的短读段进行批量测序。
15.根据权利要求14所述的方法，还包括对所述多个T细胞中的每一个执行步骤b-i。
16.根据权利要求15所述的方法，其中对所述多个T细胞中的每一个执行步骤b-i包括执行步骤b-i，包括：
将步骤b-i中的一个或多个的至少一部分归类为作业；并且
并行地跨多个处理器分配每个作业的工作量。
17.一种用于对T细胞受体(TCR)进行测序的装置，包括：
一个或多个处理器；以及
包含处理器可执行指令的存储器，所述处理器可执行指令在由所述一个或多个处理器执行时，使得所述装置：
a)接收包含从T细胞获得的RNA的少于100个碱基对的短读段的序列数据；其中所述短读段是由RNA的随机引发获得的；
b)将所述短读段与参考序列进行比对，其中所述参考序列不包含TCR基因序列，从而生成包括映射的短读段和未映射的短读段的读段集；
c)丢弃所述读段集中的所述映射的短读段；其中丢弃所述读段集中的映射的短读段还包括丢弃所述读段集中小于35个碱基对的未映射的短读段；
d)将所述读段集中剩余的所述未映射的短读段组装成一个或多个长读段；
e)将所述一个或多个长读段翻译成对应氨基酸序列；
f)将TCR V区和TCR J区氨基酸参考序列分成六个氨基酸的k串，将所述k串与来自步骤(e)的对应氨基酸序列进行比对，检测所述k串中映射到所述对应氨基酸序列的一个或多个保守TCR CDR3残基，对检测到的保守水平进行评分，选择保守分数高于阈值保守分数的对应氨基酸序列，并检测所选对应氨基酸序列中的候选CDR3区氨基酸序列；
g)鉴定所述一个或多个长读段中所述候选CDR3区氨基酸序列的核酸序列；
h)将所述候选CDR3区核酸序列上游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个TCRV基因参考序列进行比对，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选TCR V基因序列；并且
i)将所述候选CDR3区核酸序列下游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个TCRJ基因参考序列进行比对，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选TCR J基因序列，从而生成TCR序列。
18.根据权利要求17所述的装置，其中所述T细胞是从人或小鼠获得的。
19.根据权利要求17或18所述的装置，其中所述参考序列包括人基因组、小鼠基因组、人转录组或小鼠转录组。
20.根据权利要求17或18所述的装置，其中丢弃所述读段集中的映射的短读段还包括丢弃所述读段集中小于35个碱基对或具有低序列分辨率的未映射的短读段。
21.根据权利要求17或18所述的装置，其中将所述读段集中剩余的所述未映射的短读段组装成一个或多个长读段包括：
将所述一个或多个未映射的短读段与TCR序列参考数据库中的一个或多个TCR序列进行比对；并且
基于所述比对，将所述一个或多个未映射的短读段组装成长读段。
22.根据权利要求17或18所述的装置，还包括将TCR C区核酸序列附加到所述TCR序列。
23.根据权利要求17或18所述的装置，还包括在对从所述T细胞获得的RNA的少于100个碱基对的所述短读段进行测序之前，向由其获得所述T细胞的受试者施用免疫疗法。
24.根据权利要求23所述的装置，其中所述免疫疗法包括单一疗法或联合疗法。
25.根据权利要求24所述的装置，其中所述联合疗法包括共刺激激动剂和共抑制拮抗剂。
26.根据权利要求17或18所述的装置，还包括：
对受试者的第一多个T细胞重复步骤a-i，其中在施用治疗之前收集所述T细胞；
确定所述第一多个T细胞中存在的独特TCR序列的出现次数；
向所述受试者施用所述治疗；
对所述受试者的第二多个T细胞重复步骤a-i，其中在施用所述治疗之后收集所述T细胞；
确定所述第二多个T细胞中存在的独特TCR序列的出现次数；并且
基于所述第一多个T细胞和所述第二多个T细胞中存在的独特TCR序列的所述出现次数，确定经历克隆扩增的一个或多个独特TCR序列。
27.根据权利要求26所述的装置，还包括基于经历克隆扩增的所述一个或多个独特TCR序列，确定T细胞克隆扩增特征。
28.根据权利要求27所述的装置，还包括：
使用所述T细胞克隆扩增特征查询T细胞克隆扩增特征的数据库和对应的治疗反应；
基于所述查询，确定所述受试者对所述治疗作出反应的可能性。
29.根据权利要求27或28所述的装置，还包括：
确定所述受试者对所述治疗的反应；
将所述T细胞克隆扩增特征存储在数据库中；并且
将所述受试者对所述治疗的反应与所述数据库中的所述T细胞克隆扩增特征相关联。
30.根据权利要求17或18所述的装置，还包括：
确定所述TCR序列存在于响应于治疗而扩增的T细胞克隆中；并且
产生含有所述TCR序列的一个或多个T细胞。
31.根据权利要求17或18所述的装置，其中对从T细胞获得的RNA的少于100个碱基对的短读段进行测序包括对从多个T细胞获得的RNA的少于100个碱基对的短读段进行批量测序。
32.根据权利要求31所述的装置，还包括对所述多个T细胞中的每一个执行步骤b-i。
33.根据权利要求32所述的装置，其中对所述多个T细胞中的每一个执行步骤b-i包括执行步骤b-i，包括：
将步骤b-i中的一个或多个的至少一部分归类为作业；并且
并行地跨多个处理器分配每个作业的工作量。
34.一种其上包含有计算机可执行指令的计算机可读介质，所述计算机可读介质被配置用于执行包括以下操作的方法：
a)对从T细胞获得的RNA的少于100个碱基对的短读段进行测序；其中所述短读段是由RNA的随机引发获得的；
b)将所述短读段与参考序列进行比对，其中所述参考序列不包含TCR基因序列，从而生成包括映射的短读段和未映射的短读段的读段集；
c)丢弃所述读段集中的所述映射的短读段；其中丢弃所述读段集中的映射的短读段还包括丢弃所述读段集中小于35个碱基对的未映射的短读段；
d)将所述读段集中剩余的所述未映射的短读段组装成一个或多个长读段；
e)将所述一个或多个长读段翻译成对应氨基酸序列；
f)将TCR V区和TCR J区氨基酸参考序列分成六个氨基酸的k串，将所述k串与来自步骤(e)的对应氨基酸序列进行比对，检测所述k串中映射到所述对应氨基酸序列的一个或多个保守TCR CDR3残基，对检测到的保守水平进行评分，选择保守分数高于阈值保守分数的对应氨基酸序列，并检测所选对应氨基酸序列中的候选CDR3区氨基酸序列；
g)鉴定所述一个或多个长读段中所述候选CDR3区氨基酸序列的核酸序列；
h)将所述候选CDR3区核酸序列上游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个TCRV基因参考序列进行比对，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选TCR V基因序列；并且
i)将所述候选CDR3区核酸序列下游的一个或多个长读段的核酸序列与一个或多个TCRJ基因参考序列进行比对，对比对度进行评分，并将高于阈值比对分数的长读段鉴定为包含候选TCR J基因序列，从而生成TCR序列。
35.根据权利要求34所述的计算机可读介质，其中所述T细胞是从人或小鼠获得的。
36.根据权利要求34或35所述的计算机可读介质，其中所述参考序列包括人基因组、小鼠基因组、人转录组或小鼠转录组。
37.根据权利要求34或35所述的计算机可读介质，其中丢弃所述读段集中的映射的短读段还包括丢弃所述读段集中小于35个碱基对或具有低序列分辨率的未映射的短读段。
38.根据权利要求34或35所述的计算机可读介质，其中将所述读段集中剩余的所述未映射的短读段组装成一个或多个长读段包括：
将所述一个或多个未映射的短读段与TCR序列参考数据库中的一个或多个TCR序列进行比对；并且
基于所述比对，将所述一个或多个未映射的短读段组装成长读段。
39.根据权利要求34或35所述的计算机可读介质，还包括将TCR C区核酸序列附加到所述TCR序列。
40.根据权利要求34或35所述的计算机可读介质，还包括在对从所述T细胞获得的RNA的少于100个碱基对的所述短读段进行测序之前，向由其获得所述T细胞的受试者施用免疫疗法。
41.根据权利要求40所述的计算机可读介质，其中所述免疫疗法包括单一疗法或联合疗法。
42.根据权利要求41所述的计算机可读介质，其中所述联合疗法包括共刺激激动剂和共抑制拮抗剂。
43.根据权利要求34或35所述的计算机可读介质，还包括：
对受试者的第一多个T细胞重复步骤a-i，其中在施用治疗之前收集所述T细胞；
确定所述第一多个T细胞中存在的独特TCR序列的出现次数；
向所述受试者施用所述治疗；
对所述受试者的第二多个T细胞重复步骤a-i，其中在施用所述治疗之后收集所述T细胞；
确定所述第二多个T细胞中存在的独特TCR序列的出现次数；并且
基于所述第一多个T细胞和所述第二多个T细胞中存在的独特TCR序列的所述出现次数，确定经历克隆扩增的一个或多个独特TCR序列。
44.根据权利要求43所述的计算机可读介质，还包括基于经历克隆扩增的所述一个或多个独特TCR序列，确定T细胞克隆扩增特征。
45.根据权利要求44所述的计算机可读介质，还包括：
使用所述T细胞克隆扩增特征查询T细胞克隆扩增特征的数据库和对应的治疗反应；
基于所述查询，确定所述受试者对所述治疗作出反应的可能性。
46.根据权利要求44或45所述的计算机可读介质，还包括：
确定所述受试者对所述治疗的反应；
将所述T细胞克隆扩增特征存储在数据库中；并且
将所述受试者对所述治疗的反应与所述数据库中的所述T细胞克隆扩增特征相关联。
47.根据权利要求34或35所述的计算机可读介质，还包括：
确定所述TCR序列存在于响应于治疗而扩增的T细胞克隆中；并且
产生含有所述TCR序列的一个或多个T细胞。
48.根据权利要求34或35所述的计算机可读介质，其中对从T细胞获得的RNA的少于100个碱基对的短读段进行测序包括对从多个T细胞获得的RNA的少于100个碱基对的短读段进行批量测序。
49.根据权利要求48所述的计算机可读介质，还包括对所述多个T细胞中的每一个执行步骤b-i。
50.根据权利要求49所述的计算机可读介质，其中对所述多个T细胞中的每一个执行步骤b-i包括执行步骤b-i，包括：
将步骤b-i中的一个或多个的至少一部分归类为作业；并且
并行地跨多个处理器分配每个作业的工作量。
CN201780075532.3A 2016-12-09 2017-12-11 用于对t细胞受体进行测序的系统和方法及其用途 Active CN110168105B (zh)

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