KR102492057B1 - 골 형태형성 단백질 6(ｂｍｐ6)의 억제제를 사용한 질병의 치료 방법 - Google Patents

골 형태형성 단백질 6(ｂｍｐ6)의 억제제를 사용한 질병의 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 BMP6 길항제를 사용한 치료 방법에 관한 것이다.

Description

골 형태형성 단백질 6(ＢＭＰ6)의 억제제를 사용한 질병의 치료 방법
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되고 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된 서열 목록을 함유한다. 2017년 5월 23일에 생성된 상기 ASCII 복사본은 PAT057354-WO-PCT_SL.txt로 명명되고 크기는 82,879 바이트이다.
서문
본 발명은 골 형태형성 단백질 6(BMP6; bone morphogenetic protein 6)의 억제제를 사용한 빈혈증의 치료 방법에 관한 것이다.
빈혈증은 만성 신장 질병(CKD) 환자에서 일반적이고, 더 낮은 삶의 질 및 심혈관 질환 및 사망을 포함하여 더 높은 유해 결과 위험성과 연관이 있다. CKD 환자에서 몇몇 빈혈증 관리 방식은 적혈구 생성-자극제(ESA)의 사용, 보조적인 경구 및 정맥내 철 및 수혈을 포함한다. 그러나, 많은 환자들은 이들 치료에 적절하게 반응하지 않거나 더 높은 용량의 ESA 및/또는 철을 필요로 한다. 고용량의 철은 또한, 산소 라디칼의 발생 및 알레르기 반응과 연관된 독성을 유발할 수 있다. 이들 치료가 빈혈증의 기저 원인, 즉 철 흡수 및 신체 저장소로부터의 철 동원(mobilization)의 저하를 완전히 해결하지 못하기 때문에 이들 치료는 효능이 부족할 수 있다.
에리스로포이에틴 내성을 관리하려는 시도는 현재, 고용량 비경구 철의 공동-투여에 의해 수행된다. 그러나, 정맥내 조제물 유래의 대부분의 철은 대식세포에 의해 먼저 처리되고, 적혈구 생성을 위한 철의 이용률은 페로포틴(ferroportin)-매개 철 이출(export)에 의존한다.
많은 빈혈증 환자에서, 페로포틴-매개 철 이출은 높은 수준의 헵시딘에 의해 저해된다. 추가 증거는, 증가된 수준의 헵시딘이 혈액투석에서 불량한 ESA 반응성과 상관관계가 있음을 제시한다. 따라서, 헵시딘-저하제는 이러한 환자 집단, 및 철 제한을 특징으로 하는 다른 형태의 만성 질병 빈혈증(ACD; anemia of chronic disease)에서 ESA-불응성 빈혈증을 개선하기 위한 효과적인 전략일 수 있다.
따라서, 순환 헵시딘 수준을 저하시키는 방법은 만성 신장 질병 환자에 존재하는 ESA-불응성 빈혈증에서 철 흡수를 증강시키며, 격리된 철의 방출을 용이하게 하고, 적혈구 생성을 촉진해야 한다.
빈혈증과 연관된 질병 및 장애의 치료를 위한 현재의 치료 옵션에도 불구하고, 효과적이고 잘-관용되는 향상된 빈혈증 치료 방법이 요망되고 있다.
페리틴은 저장된 철을 가리키는 세포내 단백질이다. 페리틴 수준은 체내에 저장된 철의 총 양의 간접 마커로서 사용될 수 있다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, BMP6의 억제제는 세포, 예를 들어 대식세포 및/또는 장세포로부터 저장된 철의 방출을 초래할 수 있는 것으로 여겨진다. 또한, 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명은 부분적으로는, BMP6의 억제제가, 높은 페리틴(예를 들어 500 ng/mL 초과의 치료전 페리틴 수준), 예를 들어 혈청 페리틴 수준, 및 따라서 높은 저장된 철을 갖는 환자에서, 격리된 철과 연관된 질환, 예를 들어 빈혈증의 치료에 효과적일 수 있다는 발견을 기반으로 한다.
제1 양태에서, 본 발명은 하기를 필요로 하는 환자에서
선택적으로,
a. BMP6를 억제하거나;
b. 혈청철 수준, 트랜스페린 포화도(TAST), 망상적혈구 헤모글로빈 함량(CHr), 망상적혈구 수, 적혈구 수, 헤모글로빈 또는 적혈구용적율을 증가시키거나;
c. 헵시딘의 활성 또는 수준을 감소시키거나;
d. 빈혈증을 치료하거나;
e. 헤모글로빈 수준을 증가시키거나 유지시키는 방법에 관한 것으로서,
2000 ng/mL 이하의 페리틴 수준을 갖는 환자로부터의 생물학적 시료를 기준으로 하여 치료학적 유효량의 BMP6 길항제를 환자에게 선택적으로 투여하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 페리틴 수준은 500 ng/mL 이상이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 BMP6 길항제를 사용하여 빈혈증을 가진 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 2000 ng/mL 이하의 페리틴 수준을 갖는 환자로부터의 생물학적 시료를 기준으로 하여 치료학적 유효량의 BMP6 길항제를 환자에게 선택적으로 투여하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 페리틴 수준은 500 ng/mL 이상이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 BMP6 길항제를 사용하여 빈혈증을 가진 환자를 선택적으로 치료하는 방법에 관한 것으로서,
a) 환자로부터의 생물학적 시료를 페리틴 수준에 대해 검정하는 단계; 및
b) 그 후에, 치료학적 유효량의 BMP9 길항제를 환자에게 선택적으로 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 페리틴 수준은 2000 ng/mL 이하이다. 실시형태에서, 페리틴 수준은 500 ng/mL 이상이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 BMP6 길항제를 사용하여 빈혈증을 가진 환자를 선택적으로 치료하는 방법에 관한 것으로서,
a) 환자로부터의 생물학적 시료를 페리틴 수준에 대해 검정하는 단계;
b) 그 후에, 2000 ng/mL 이하의 페리틴 수준을 가진 환자로부터의 생물학적 시료를 기준으로 하여 BMP6 길항제를 사용하는 치료를 위한 환자를 선별하는 단계; 및
c) 그 후에, 치료학적 유효량의 BMP9 길항제를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 페리틴 수준은 500 ng/mL 이상이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기를 필요로 하는 환자에서
선택적으로,
a. BMP6를 억제시키거나;
b. 혈청철 수준, 트랜스페린 포화도(TAST), 망상적혈구 헤모글로빈 함량(CHr), 망상적혈구 수, 적혈구 수, 헤모글로빈 또는 적혈구용적율을 증가시키거나;
c. 헵시딘의 활성 또는 수준을 감소시키거나;
d. 빈혈증을 치료하거나;
e. 헤모글로빈 수준을 증가시키거나 유지시키는 방법에 관한 것으로서,
500 ng/mL 이상의 페리틴 수준을 갖는 환자로부터의 생물학적 시료를 기준으로 하여 치료학적 유효량의 BMP6 길항제를 환자에게 선택적으로 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 BMP6 길항제를 사용하여 빈혈증을 가진 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 500 ng/mL 이상의 페리틴 수준을 갖는 환자로부터의 생물학적 시료를 기준으로 하여 치료학적 유효량의 BMP6 길항제를 환자에게 선택적으로 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 BMP6 길항제를 사용하여 빈혈증을 가진 환자를 선택적으로 치료하는 방법에 관한 것으로서,
a) 환자로부터의 생물학적 시료를 페리틴 수준에 대해 검정하는 단계; 및
b) 그 후에, 치료학적 유효량의 BMP9 길항제를 환자에게 선택적으로 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 페리틴 수준은 500 ng/mL 이상이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 BMP6 길항제를 사용하여 빈혈증을 가진 환자를 선택적으로 치료하는 방법에 관한 것으로서,
a) 환자로부터의 생물학적 시료를 페리틴 수준에 대해 검정하는 단계;
b) 그 후에, 500 ng/mL 이상의 페리틴 수준을 갖는 환자로부터의 생물학적 시료를 기준으로 하여 BMP6 길항제를 사용하는 치료를 위한 환자를 선별하는 단계; 및
c) 그 후에, 치료학적 유효량의 BMP9 길항제를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
상기 언급된 양태들 중 임의의 양태를 포함하여 실시형태에서, 페리틴 수준은 페리틴 단백질 수준이다.
상기 언급된 양태들 중 임의의 양태를 포함하여 실시형태에서, 검정 단계는 면역검정, 면역조직화학, ELISA, 유세포분석, 웨스턴 블롯, HPLC 및 질량 분석으로 구성된 군으로부터 선택되는 기술을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 2000 ng/mL 이하의 페리틴 수준을 갖는 환자로부터의 생물학적 시료를 기준으로 하여 치료학적 유효량의 BMP6 길항제가 환자에게 투여되는 것을 특징으로 하는, 빈혈증을 가진 환자의 치료에 사용하기 위한 BMP6 길항제에 관한 것이다. 실시형태에서, 페리틴 수준은 500 ng/mL 이상이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 500 ng/mL 이상의 페리틴 수준을 갖는 환자로부터의 생물학적 시료를 기준으로 하여 치료학적 유효량의 BMP6 길항제가 환자에게 투여되는 것을 특징으로 하는, 빈혈증을 가진 환자의 치료에 사용하기 위한 BMP6 길항제에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은
a) 환자가, 2000 ng/mL 이하의 페리틴 수준을 갖는 환자로부터의 생물학적 시료를 기준으로 하여 BMP6 길항제를 사용하는 치료를 위해 선별되고;
b) 그 후에, 치료학적 유효량의 BMP6 길항제가 환자에게 투여되는 것을 특징으로 하는,
빈혈증을 가진 환자의 치료에 사용하기 위한 BMP6 길항제에 관한 것이다. 실시형태에서, 페리틴 수준은 500 ng/mL 이상이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은
a) 환자가, 500 ng/mL 이상의 페리틴 수준을 갖는 환자로부터의 생물학적 시료를 기준으로 하여 BMP6 길항제를 사용하는 치료를 위해 선별되고;
b) 그 후에, 치료학적 유효량의 BMP6 길항제가 환자에게 투여되는 것을 특징으로 하는,
빈혈증을 가진 환자의 치료에 사용하기 위한 BMP6 길항제에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은
a) 환자로부터의 생물학적 시료가 페리틴에 대해 검정되고;
b) 치료학적 유효량의 BMP6 길항제가 2000 ng/mL 이하의 페리틴 수준을 갖는 환자로부터의 생물학적 시료를 기준으로 하여 환자에게 선택적으로 투여되는 것을 특징으로 하는,
빈혈증을 가진 환자의 치료에 사용하기 위한 BMP6 길항제에 관한 것이다. 실시형태에서, 페리틴 수준은 500 ng/mL 이상이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은
a) 환자로부터의 생물학적 시료가 페리틴에 대해 검정되고;
b) 치료학적 유효량의 BMP6 길항제가 500 ng/mL 이상의 페리틴 수준을 갖는 환자로부터의 생물학적 시료를 기준으로 하여 환자에게 선택적으로 투여되는 것을 특징으로 하는,
빈혈증을 가진 환자의 치료에 사용하기 위한 BMP6 길항제에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은
a) 환자로부터의 생물학적 시료는 페리틴에 대해 검정되고;
b) 환자가, 2000 ng/mL 이하의 페리틴 수준을 갖는 환자로부터의 생물학적 시료를 기준으로 하여 BMP6 길항제를 사용하는 치료를 위해 선별되고;
c) 치료학적 유효량의 BMP6 길항제가 환자에게 선택적으로 투여되는 것을 특징으로 하는,
빈혈증을 가진 환자의 치료에 사용하기 위한 BMP6 길항제에 관한 것이다. 실시형태에서, 페리틴 수준은 500 ng/mL 이상이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은
a) 환자로부터의 생물학적 시료는 페리틴에 대해 검정되고;
b) 환자가, 500 ng/mL 이상의 페리틴 수준을 갖는 환자로부터의 생물학적 시료를 기준으로 하여 BMP6 길항제를 사용하는 치료를 위해 선별되고;
c) 치료학적 유효량의 BMP6 길항제가 환자에게 선택적으로 투여되는 것을 특징으로 하는,
빈혈증을 가진 환자의 치료에 사용하기 위한 BMP6 길항제에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 환자로부터의 생물학적 시료를 페리틴에 대해 검정하는 단계를 포함하는, 빈혈증을 가진 환자가 BMP6 길항제를 사용하는 치료에 반응할 가능성을 예측하는 방법에 관한 것으로서, 2000 ng/mL 이하의 페리틴 수준은 환자가 BMP6 길항제를 사용하는 치료에 반응할 증가된 가능성을 나타낸다. 실시형태에서, 페리틴 수준은 500 ng/mL 이상이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 환자로부터의 생물학적 시료를 페리틴에 대해 검정하는 단계를 포함하는, 빈혈증을 가진 환자가 BMP6 길항제를 사용하는 치료에 반응할 가능성을 예측하는 방법에 관한 것으로서, 500 ng/mL 이상의 페리틴 수준은 환자가 BMP6 길항제를 사용하는 치료에 반응할 증가된 가능성을 나타낸다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 방법 또는 용도는 환자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서, 수득 단계는 검정 단계 이전에 수행된다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 페리틴 수준은 페리틴 단백질 수준이다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 검정 단계는 면역검정, 면역조직화학, ELISA, 유세포분석, 웨스턴 블롯, HPLC 및 질량 분석으로 구성된 군으로부터 선택되는 기술을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 BMP6 길항제를 사용하는 치료에 대한, 빈혈증을 가진 환자의 반응을 예측하기 위한 전송 가능한 형태의 정보를 생성하는 방법에 관한 것으로서,
a) 환자로부터의 생물학적 시료에 2000 ng/mL 이하의 페리틴 수준의 존재에 기초하여 BMP6 길항제를 사용하는 치료에 대한 환자 반응의 증가된 가능성을 결정하는 단계; 및
b) 전송 시 사용하기 위한 유형 또는 무형의 매체 형태 상에 결정 단계의 결과를 기록하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 페리틴 수준은 500 ng/mL 이상이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 BMP6 길항제를 사용하는 치료에 대한, 빈혈증을 가진 환자의 반응을 예측하기 위한 전송 가능한 형태의 정보를 생성하는 방법에 관한 것으로서,
a) 환자로부터의 생물학적 시료에 500 ng/mL 이상의 페리틴 수준의 존재에 기초하여 BMP6 길항제를 사용하는 치료에 대한 환자 반응의 증가된 가능성을 결정하는 단계; 및
b) 전송 시 사용하기 위한 유형 또는 무형의 매체 형태 상에 결정 단계의 결과를 기록하는 단계를 포함한다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 환자는 빈혈증을 가지고 있다. 실시형태에서, 빈혈증은 만성 질병과 연관되어 있는 빈혈증이다. 실시형태에서, 만성 질병은 만성 신장 질병, 암 또는 염증이다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 환자는 적혈구 생성 자극제(ESA), 예를 들어 에리스로포이에틴(EPO)으로 치료 중이거나 치료받은 적이 있다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 빈혈증은 EPO-저반응성 빈혈증이다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 빈혈증은 철-제한성 빈혈증, 예를 들어 기능성 철-제한성 빈혈증이다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 환자는 만성 혈액투석 환자이다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 방법 또는 용도는 치료학적 유효량의 BMP6 길항제를 사용하는 치료의 부재 시의 환자의 EPO 요구 용량 및/또는 환자의 철 요구 용량에 비례하여, 환자의 철 요구 용량을 감소시키거나, 환자의 EPO 요구 용량을 감소시키거나, 환자의 철 요구 용량 및 환자의 EPO 요구 용량 둘 모두를 감소시키는 단계를 추가로 포함한다. 상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 방법 또는 용도는 환자의 ESA 내성 지수(ERI)의 감소를 추가로 포함하거나 초래한다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 생물학적 시료는 관절 낭액, 혈액, 혈청, 대변, 혈장, 소변, 눈물, 타액, 뇌척수액, 백혈구 시료 또는 조직 시료이다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 생물학적 시료는 혈청 또는 혈액이다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 생물학적 시료는 혈청이다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, BMP6 길항제는 BMP6 결합 분자이다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, BMP6 길항제는 예를 들어 표 1 또는 표 4에 기재된 바와 같은 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) SEQ ID NO: 69, 70 및 71 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 79, 80 및 81 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
(b) SEQ ID NO: 72, 73 및 74 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 82, 83 및 84 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
(c) SEQ ID NO: 29, 30 및 31 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 39, 40 및 41 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
(d) SEQ ID NO: 32, 33 및 34 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 42, 43 및 44 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
(e) SEQ ID NO: 49, 50 및 51 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 59, 60 및 61 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
(f) SEQ ID NO: 52, 53 및 54 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 62, 63 및 64 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
(g) SEQ ID NO: 9, 10 및 11 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 19, 20 및 21 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열; 또는
(h) SEQ ID NO: 12, 13 및 14 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 22, 23 및 24 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) SEQ ID NO: 75의 VH 서열;
(b) SEQ ID NO: 35의 VH 서열;
(c) SEQ ID NO: 55의 VH 서열; 또는
(d) SEQ ID NO: 15의 VH 서열.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) SEQ ID NO: 85의 VL 서열;
(b) SEQ ID NO: 45의 VL 서열;
(c) SEQ ID NO: 65의 VL 서열; 또는
(d) SEQ ID NO: 25의 VL 서열.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) SEQ ID NO: 75의 VH 서열; 및 SEQ ID NO: 85의 VL 서열;
(b) SEQ ID NO: 35의 VH 서열; 및 SEQ ID NO: 45의 VL 서열;
(c) SEQ ID NO: 55의 VH 서열; 및 SEQ ID NO: 65의 VL 서열; 또는
(d) SEQ ID NO: 15의 VH 서열; 및 SEQ ID NO: 25의 VL 서열.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) SEQ ID NO: 77의 중쇄 서열;
(b) SEQ ID NO: 37의 중쇄 서열;
(c) SEQ ID NO: 57의 중쇄 서열; 또는
(d) SEQ ID NO: 17의 중쇄 서열.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) SEQ ID NO: 87의 경쇄 서열;
(b) SEQ ID NO: 47의 경쇄 서열;
(c) SEQ ID NO: 67의 경쇄 서열; 또는
(d) SEQ ID NO: 27의 경쇄 서열.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) SEQ ID NO: 77의 중쇄 서열; 및 SEQ ID NO: 87의 경쇄 서열;
(b) SEQ ID NO: 37의 중쇄 서열; 및 SEQ ID NO: 47의 경쇄 서열;
(c) SEQ ID NO: 57의 중쇄 서열; 및 SEQ ID NO: 67의 경쇄 서열; 또는
(d) SEQ ID NO: 17의 중쇄 서열; 및 SEQ ID NO: 27의 경쇄 서열.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 1 nM 이하의 KD를 갖는 인간 BMP6에 결합한다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 0.1 nM 이하의 KD를 갖는 인간 BMP6에 결합한다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 BMP7보다 인간 BMP6에 대해 적어도 약 100배 더 큰 친화도를 가진다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 BMP2, 인간 BMP5 또는 인간 BMP7보다 인간 BMP6에 대해 적어도 약 100배 더 큰 친화도를 가진다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 BMP2, 인간 BMP5 또는 인간 BMP7보다 인간 BMP6에 대해 적어도 약 500배 더 큰 친화도를 가진다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 ELISA에서 인간 BMP2 및/또는 BMP7에 대해 검출 가능한 결합이 없다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgM 및 IgG로부터 선택된 스캐폴드를 포함한다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG1, IgG2, 및 IgG3 또는 IgG4로부터 선택된 IgG이다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 모노클로날 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, Fab 및 scFv로 구성된 군으로부터 선택된다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 면역접합체의 구성성분이다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fc 영역의 돌연변이를 통해 변경된 이펙터 기능을 가진다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 QTLVHLMNPEYVPKP(SEQ ID NO: 98)을 포함하는, 예컨대 이로 구성된 인간 BMP6 에피토프에 결합한다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 0.001 mg/kg 내지 0.1 mg/kg 범위의 용량으로 투여된다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 0.0063 내지 0.1 mg/kg 범위의 용량으로 투여된다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 0.001 mg/kg, 0.0016 mg/kg, 0.0025 mg/kg, 0.0040 mg/kg, 0.0063 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.016 mg/kg, 0.025 mg/kg, 0.040 mg/kg, 0.063 mg/kg 또는 0.1 mg/kg의 용량으로 투여된다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 정맥내 또는 피하 투여된다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 정맥내 투여된다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 투여는 약 30분 내지 약 60분의 기간에 걸친 주입에 의한 것이다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 페리틴 수준은 1900 ng/mL 이하, 1800 ng/mL 이하, 1700 ng/mL 이하, 1600 ng/mL 이하, 1500 ng/mL 이하, 1400 ng/mL 이하, 1300 ng/mL 이하, 1200 ng/mL 이하, 1100 ng/mL 이하, 1000 ng/mL 이하, 900 ng/mL 이하, 800 ng/mL 이하, 700 ng/mL 이하, 600 ng/mL 이하 또는 500 ng/mL 이하이다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 페리틴 수준은 1500 ng/mL 이하이다. 상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 페리틴 수준은 1000 ng/mL 이하이다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 페리틴 수준은 약 200 ng/mL 이상, 약 250 ng/mL 이상, 약 300 ng/mL 이상, 약 350 ng/mL 이상, 약 400 ng/mL 이상, 약 450 ng/mL 이상, 약 500 ng/mL 이상, 약 600 ng/mL 이상, 약 700 ng/mL 이상, 약 800 ng/mL 이상, 약 900 ng/mL 이상, 약 1000 ng/mL 이상, 약 1100 ng/mL 이상, 약 1200 ng/mL 이상, 약 1300 ng/mL 이상, 약 1400 ng/mL 이상, 약 1500 ng/mL 이상, 약 1600 ng/mL 이상, 약 1700 ng/mL 이상, 약 1800 ng/mL 이상 또는 약 1900 ng/mL 이상이다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 페리틴 수준은 약 500 ng/mL 이상, 약 600 ng/mL 이상, 약 700 ng/mL 이상, 약 800 ng/mL 이상, 약 900 ng/mL 이상, 약 1000 ng/mL 이상, 약 1100 ng/mL 이상, 약 1200 ng/mL 이상, 약 1300 ng/mL 이상 또는 약 1400 ng/mL 이상이다.
상기 언급된 양태 및 실시형태 중 임의의 실시형태를 포함하는 실시형태에서, 페리틴 수준은 약 500 ng/mL 이상이다.
정의
다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 보편적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본원에 사용된 바와 같이 "BMP6"는 단백질 골 형태형성 단백질 6(BMP6), 또는 BMP6를 인코딩하는 유전자 또는 핵산을 의미한다(문헌[Hahn et al. 1992 Genomics 14: 759-62; Sauermann et al. 1993 J. Neurosci. Res. 33: 142-7; NCBI Gene ID: 654]). BMP6는 또한: BMP-6; VGR; VGR1; 외부 ID: OMIM: 112266 MGI: 88182; HomoloGene: 1300; GeneCards: BMP6 유전자. 오르토로그(Ortholog): 종: 인간: Entrez: 654; Ensembl: ENSG00000153162; UniProt: P22004; RefSeq(mRNA): NM_001718; RefSeq(단백질): NP_001709; 위치(UCSC): Chr 6: 7.73 - 7.88 Mb; 종: 마우스: Entrez: 12161; Ensembl: ENSMUSG00000039004; UniProt: P20722; RefSeq(mRNA): NM_007556; RefSeq(단백질): NP_031582; 위치(UCSC): Chr 13: 38.35 - 38.5 Mb로도 공지되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이, BMP6에 결합하는 항체 이의 항원-결합 단편은 BMP6 단백질에 결합한다.
본원에 사용된 바와 같이 "BMP2"는 단백질 골 형태형성 단백질 2(BMP2), 또는 BMP2를 인코딩하는 유전자 또는 핵산을 의미한다. BMP2는 또한: BDA2; 및 BMP2A; 외부 ID OMIM: 112261 MGI: 88177 HomoloGene: 926 GeneCards: BMP2 유전자. 종: 인간; Entrez: 650; Ensembl: ENSG00000125845; UniProt: P12643; RefSeq(mRNA): NM_001200; RefSeq(단백질): NP_001191; 위치(UCSC): Chr 20: 6.75 - 6.76 Mb. 종: 마우스; Entrez: 12156; Ensembl: ENSMUSG00000027358; UniProt: P21274; RefSeq(mRNA): NM_007553; RefSeq(단백질): NP_031579; 위치(UCSC): Chr 2: 133.55 - 133.56 Mb로도 공지되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이, BMP2에 결합하는 항체 이의 항원-결합 단편은 BMP2 단백질에 결합한다.
본원에 사용된 바와 같이 "BMP5"는 단백질 골 형태형성 단백질 5(BMP5), 또는 BMP5를 인코딩하는 유전자 또는 핵산을 의미한다. BMP5는 또한: MGC34244; 외부 ID OMIM: 112265 MGI: 88181 HomoloGene: 22412 GeneCards: BMP5 유전자. 종: 인간; Entrez: 653; Ensembl: ENSG00000112175; UniProt: P22003; RefSeq(mRNA): NM_021073; RefSeq(단백질): NP_066551; 위치(UCSC): Chr 6: 55.62 - 55.74 Mb. 종: 마우스; Entrez: 12160; Ensembl: ENSMUSG00000032179; UniProt: P49003; RefSeq(mRNA): NM_007555; RefSeq(단백질): NP_031581; 위치(UCSC): Chr 9: 75.78 - 75.9 Mb로도 공지되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이, BMP5에 결합하는 항체 이의 항원-결합 단편은 BMP5 단백질에 결합한다.
본원에 사용된 바와 같이 "BMP7"은 단백질 골 형태형성 단백질 7(BMP7), 또는 BMP7을 인코딩하는 유전자 또는 핵산을 의미한다. BMP7는 또한: 골원성(osteogenic) 단백질-1; OP-1; 외부 ID OMIM: 112267 MGI: 103302 HomoloGene: 20410 GeneCards: BMP7 유전자. 종: 인간; Entrez: 655; Ensembl: ENSG00000101144; UniProt: P18075; RefSeq(mRNA): NM_001719; RefSeq(단백질): NP_001710; 위치(UCSC): Chr 20: 55.74 - 55.84 Mb. 종: 마우스; Entrez: 12162; Ensembl: ENSMUSG00000008999; UniProt: P23359; RefSeq(mRNA): NM_007557; RefSeq(단백질): NP_031583; 위치(UCSC): Chr 2: 172.87 - 172.94 Mb로도 공지되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이, BMP7에 결합하는 항체 이의 항원-결합 단편은 BMP7 단백질에 결합한다.
"헵시딘"은 유전자 헵시딘 또는 단백질 헵시딘, 펩타이드 호르몬을 의미한다. 헵시딘은 또한: HAMP(헵시딘 항-미생물 단백질 또는 펩타이드); HEPC; HFE2B; LEAP1(LEAP-1); PLTR; OMIM: 606464; HomoloGene: 81623; GeneCards: HAMP 유전자; Entrez 57817; Ensembl ENSG00000105697; UniProt P81172; RefSeq(mRNA) NM_021175; RefSeq(단백질) NP_066998; 위치(UCSC) Chr 19: 35.77 - 35.78 Mb로도 공지되어 있다(문헌[Krause et al. FEBS Lett. 480: 147-150; and Pigeon et al. 2001 J. Biol. Chem. 276: 7811-9]). 또한: 문헌[Ganz 2003 Blood 102: 783-8; Roy et al. 2005 Curr. Opin. Hemat. 12: 107-111; Fleming et al. 2006 Semin. Liver Dix. 25: 411-9; Park et al. 2001 J. Biol. Chem. 276: 7806-10; Majore et al. 2002 Haematologica 87: 221-2; Kluver et al. 2002 J. Pept. Re　s. 59 : 241-8; Hunter et al. 2002 J. Biol. Chem. 277 : 37597-603; Weinstein et al. 2003 Blood 100 : 3776-81; Nemeth et al. 2003 Blood 101: 2461-3; Roetto et al. 2003 Nat. Genet. 33: 21-2; Strausberg et al. 2003 Proc. Natl. Acad. Sci USA 99: 16899-903; Gehrke et al. 2003 Blood 102: 371-6; Merryweather-Clarke et al. 2004 Human Mol. Genet. 12:2241-7; Clark et al. 2003 Genome Res. 13: 2265-70; Roetto et al. 2004 Blood 103: 2407-9; Jacolot et al. 2004 Blood 103: 2835-40; and Ota et al. 2004 Nat. Genet. 36: 40-45]를 참조한다.
본원에 사용된 바와 같이 "BMP6 길항제"는 (예컨대 BMP6가 BMP6 수용체에 결합하는 것을 차단함으로써) BMP6 기능, 발현 및/또는 신호전달을 길항작용할 수 있는(예컨대 감소시키며, 억제하며, 저하하며, 지연시킬 수 있는) 분자를 지칭한다. BMP6 길항제의 비제한적인 예는 BMP6 결합 분자 및 BMP6 수용체 결합 분자를 포함한다. 개시된 방법, 양생법, 키트, 과정, 용도 및 조성물의 일부 실시형태에서, BMP6 길항제가 이용된다.
본원에 사용된 바와 같이 "BMP6 결합 분자"는 인간 BMP6 항원에 단독으로 또는 다른 분자와 연관되어 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 결합 반응은 관련없는 특이성을 갖지만 이상적으로는 동일한 아이소타입(isotype)를 갖는 항체가 사용되는 음성 대조군 시험을 참조로 하는, BMP6 수용체에 대한 BMP6 결합의 억제를 결정하기 위한 결합 검정법, 경쟁 검정법 또는 생물검정법 또는 다른 종류의 결합 검정법을 포함하는 표준 방법(정성적 검정법)에 의해 나타날 수 있다. BMP6 결합 분자의 비제한적인 예는, B 세포 또는 하이브리도마에 의해 생성되는 바와 같은 BMP6에 결합하는 저분자, BMP6 유인 수용체 및 항체 및 키메라, CDR-이식(grafted) 또는 인간 항체 또는 이의 임의의 단편, 예를 들어, F(ab')2 및 Fab 단편, 뿐만 아니라 단쇄 또는 단일 도메인 항체를 포함한다. 바람직하게는, BMP6 결합 분자는 BMP6 기능, 발현 및/또는 신호전달을 길항작용시킨다(예컨대 감소시키며, 억제하며, 저하하며, 지연시킨다). 개시된 방법, 양생법, 키트, 과정, 용도 및 조성물의 일부 실시형태에서, BMP6 결합 분자가 이용된다.
"BMP6 수용체 결합 분자"는, 인간 BMP6 수용체에 단독으로 또는 다른 분자와 연관되어 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 결합 반응은 관련없는 특이성을 갖지만 이상적으로는 동일한 아이소타입을 갖는 항체가 사용되는 음성 대조군 시험을 참조로 하는, BMP6에 대한 BMP6 수용체 결합의 억제를 결정하기 위한 결합 검정법, 경쟁 검정법 또는 생물검정법 또는 다른 종류의 결합 검정법을 포함하는 표준 방법(정성적 검정법)에 의해 나타날 수 있다. BMP6 수용체 결합 분자의 비제한적인 예는, B 세포 또는 하이브리도마에 의해 생성되는 바와 같은 BMP6 수용체에 대한 저분자, BMP6 유인체 및 항체 및 키메라, CDR-이식 또는 인간 항체 또는 이의 임의의 단편, 예를 들어, F(ab')2 및 Fab 단편, 뿐만 아니라 단쇄 또는 단일 도메인 항체를 포함한다. 바람직하게는, BMP6 수용체 결합 분자는 BMP6 기능, 발현 및/또는 신호전달을 길항작용시킨다(예컨대 감소시키며, 억제하며, 저하하며, 지연시킨다). 개시된 방법, 양생법, 키트, 과정, 용도 및 조성물의 일부 실시형태에서, BMP6 수용체 결합 분자가 이용된다.
본원에 사용된 바와 같이 "빈혈증"은 산소를 운반하는 혈액의 능력 저하와 더불어, 혈액 내 적혈구 수의 저하, 또는 헤모글로빈 또는 철의 양의 저하를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이 "EPO 내성 지수" 또는 "ERI"는 상호호환적으로, 헤모글로빈 수준의 함수로서 ESA, 예를 들어 EPO, 용량(체중 1 kg 당 단위)의 변화를 의미한다. 실시형태에서, ESA 용량/헤모글로빈 수준은 매주 측정된다. 실시형태에서, ESA 용량/헤모글로빈 수준은 매달 측정된다. 실시형태에서, ESA 용량/헤모글로빈 수준은 ERI에 도달하기 위해 다수의 측정들에 걸쳐 비교된다.
빈혈증은 비제한적인 예로서 남성에서는 약 130 내지 140 g/L(13 내지 14 g/dL) 미만의 헤모글로빈 및 여성에서는 약 120 내지 130 g/L(12 내지 13 g/dL) 미만의 헤모글로빈을 기준으로, 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 진단될 수 있다(문헌[Janz et al. 2013 Emerg. Med. Pract. 15: 1-15; and Smith 2010 Am. J. Man. Care 16 Supp. S59-66]).
본원에 사용된 바와 같이 용어 "BMP6 항체," "항-인간 BMP6 항체," "BMP6-결합 항체", "BMP6 길항제 항체" 등(및 이의 항원-결합 단편)은 단백질 BMP6에 결합하는 항체(및 이의 항원-결합 단편)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "항체", "이의 항원-결합 단편", "항원 결합부(binding portion)" 등은 완전 항체 및 이의 임의의 항원-결합 단편(즉, "항원-결합부") 또는 단쇄를 포함한다. 천연 발생 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인인 CH1, CH2 및 CH3로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인인 CL로 구성된다. VH 영역 및 VL 영역은, 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 보다 보존된 영역 사이에 배치된 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성 영역으로 더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역글로불린과, 면역계의 다양한 세포들(예컨대 이펙터 세포) 및 고전 보체계의 제1 구성성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 항체의 "항원-결합 단편", "이의 항원-결합 단편," "항원 결합부" 등은 주어진 항원(예컨대 BMP6)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 온전한 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 온전한 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 용어 항체의 "항원 결합부"에 포함되는 결합 단편의 예는 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편; 힌지(hinge) 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; VH 도메인으로 구성된 단일 도메인 항체(dAb) 단편(문헌[Ward et al., 1989 Nature 341:544-546]); 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
더욱이, Fv 단편, VL 및 VH의 2개의 도메인들이 별개의 유전자에 의해 코딩되더라도, 이들은 재조합 방법을 사용하여 인공 펩타이드 링커에 의해 접합될 수 있고, 이러한 링커는 이들을 VL 영역 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬(단쇄 Fv(scFv)로서 공지됨; 예를 들어, 문헌[Bird et al., 1988 Science 242:423-426; 및 Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883] 참조)로서 만들 수 있다. 이러한 단쇄 항체는 항체의 하나 이상의 "항원 결합부"를 포함한다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 종래의 기술을 사용하여 수득되고, 이러한 단편은 온전한 항체에서와 동일한 방식으로 그 이용성에 대해 스크리닝된다.
항원 결합부는 또한, 단일 도메인 항체, 맥시바디(maxibody), 미니바디(minibody), 인트라바디(intrabody), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), v-NAR 및 비스-scFv 내로 혼입될 수 있다(예컨대 문헌[Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136]). 항체의 항원 결합부는 피브로넥틴 유형 III(Fn3)과 같은 폴리펩타이드를 기초로 하는 스캐폴드 내로 이식될 수 있다(피브로넥틴 폴리펩타이드 모노바디를 기재하고 있는 미국 특허 6,703,199 참조).
항원 결합부는 탠덤 Fv 분절 쌍(VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 단쇄 분자 내로 혼입되며, 이는 상보적 경쇄 폴리펩타이드와 함께 항원 결합 영역 쌍을 형성한다(문헌[Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8 (10):1057-1062]; 및 미국 특허 5,641,870 참조).
본원에 사용된 바와 같이 용어 "친화도"는 단일 항원 부위에서 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 각각의 항원 부위 내에서, 항체 "암"의 가변 영역은 많은 부위들에서 약한 비-공유 힘을 통해 항원과 상호작용하며; 상호작용이 많을수록, 친화도는 더 강하다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "친화력(avidity)"은 항체-항원 복합체의 전체 안정성 또는 강도의 정보적인 표시(measure)를 지칭한다. 친화력은 3개의 주요 인자들: 항체 에피토프 친화도; 항원 및 항체 둘 다의 결합가(valency); 및 상호작용 파트의 구조적 배열에 의해 조절된다. 궁극적으로, 이들 인자는 항체의 특이성, 즉, 특정 항체가 정밀한 항원 에피토프에 결합하는 가능성을 한정한다(define).
용어 "아미노산"은 천연 발생 및 합성 아미노산, 뿐만 아니라 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 천연 발생 아미노산은 유전 암호에 의해 인코딩되는 것들, 뿐만 아니라 이후에 변형되는 아미노산, 예를 들어 하이드록시프롤린, 감마-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉, 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R 기, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭사이드, 메티오닌 메틸 술포늄에 결합되는 알파 탄소를 갖는 화합물을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예컨대 노르류신) 또는 변형된 펩타이드 골격을 갖지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는, 아미노산의 일반 화학 구조와 상이하지만 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 구조를 갖는 화학적 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "결합 특이성"은 오로지 1개의 항원 결정기와 반응하는 개별 항체 조합 부위의 능력을 지칭한다. 항체의 조합 부위는 분자의 Fab 부분에 위치하고, 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역으로부터 구성된다. 항체의 결합 친화도는 단일 항원 결정기와 항체 상의 단일 조합 부위 사이의 반응의 강도이다. 이는, 항원 결정기와 항체의 조합 부위 사이에 작동하는 인력 및 척력의 합계이다.
2개의 엔터티(entity) 사이에서 특이적 결합은 적어도 1 X 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1 또는 1011 M-1의 평형 상수(KA 또는 KA)로 결합하는 것을 의미한다. 구 항체(예컨대 BMP6-결합 항체)에 "특이적으로(또는 선택적으로) 결합한다"는, 단백질 및 다른 생물제제의 불균질한 집단 내에서 동족 항원(예컨대 인간 BMP6 단백질)의 존재의 결정 요인인 결합 반응을 지칭한다. 상기 주지된 평형 상수(KA) 외에도, 본 발명의 BMP6-결합 항체는 전형적으로 또한, 약 1 X 10-2 s-1, 1 X 10-3 s-1 이하의 해리 속도 상수(Kd 또는 KD 또는 KD)를 갖고, 비-특이적 항원(예컨대 BMP2, BMP5 또는 BMP7)에의 결합에 대한 이의 친화도보다 적어도 2배 더 큰 친화도로 BMP6에 결합한다. 구 "항원을 인지하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호호환적으로 사용된다.
2개의 엔터티 사이의 특이적 결합은 적어도 102 M-1, 적어도 5 X 102 M-1, 적어도 103 M-1, 적어도 5 X 103 M-1, 적어도 104 M-1, 적어도 5 X 104 M-1, 적어도 105 M-1, 적어도 5 X 105 M-1, 적어도 106 M-1, 적어도 5 X 106 M-1, 적어도 107 M-1, 적어도 5 X 107 M-1, 적어도 108 M-1, 적어도 5 X 108 M-1, 적어도 109 M-1, 적어도 5 X 109 M-1, 적어도 1010 M-1, 적어도 5 X 1010 M-1, 적어도 1011 M-1, 적어도 5 X 1011 M-1, 적어도 1012 M-1, 적어도 5 X 1012 M-1, 적어도 1013 M-1, 적어도 5 X 1013 M-1, 적어도 1014 M-1, 적어도 5 X 1014 M-1, 적어도 1015 M-1 또는 적어도 5 X 1015 M-1의 평형 상수(KA)(kon/koff)에서의 결합을 의미한다.
용어 "키메라 항체"(또는 이의 항원-결합 단편)는, (a) 불변 영역 또는 이의 일부가, 항원 결합 부위(가변 영역)가 상이한 또는 변경된 부류, 이펙터 기능 및/또는 종의 불변 영역, 또는 키메라 항체에 새로운 특성을 부여하는 전적으로 상이한 분자, 예를 들어 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등에 연결되도록 변경되거나, 대체되거나 또는 교환되거나; (b) 가변 영역, 또는 이의 일부가, 상이한 또는 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변경되거나, 대체되거나 또는 교환된, 항체 분자(또는 이의 항원-결합 단편)이다. 예를 들어, 마우스 항체는 이의 불변 영역을 인간 면역글로불린으로부터의 불변 영역으로 대체함으로써 변형될 수 있다. 인간 불변 영역으로 대체됨으로써, 키메라 항체는 원래의 마우스 항체와 비교하여 인간에서 감소된 항원성을 가지면서도, 항원을 인지하는 데 있어서 이의 특이성을 보유할 수 있다.
용어 "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 서열 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정 핵산 서열에 관하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일한 또는 필수적으로 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 핵산이 필수적으로 동일한 서열에 대한 아미노산 서열을 인코딩하지 않는 핵산을 지칭한다. 유전 암호의 축퇴성때문에, 다수의 기능적으로 동일한 핵산들은 임의의 주어진 단백질을 인코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 인코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 명시되는 모든 위치에서, 이러한 코돈은 인코딩된 폴리펩타이드를 변경시키지 않으면서, 기재된 상응하는 코돈들 중 임의의 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "침묵 변이"이며, 보존적으로 변형된 변이들 중 하나의 종이다. 폴리펩타이드를 인코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한, 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기재하고 있다. 당업자는, 핵산 내 각각의 코돈(본래 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 본래 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG를 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 제공하도록 변형될 수 있음을 인지할 것이다. 이에, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기재된 서열 내에 함축되어 있다.
폴리펩타이드 서열에 대해, "보존적으로 변형된 변이체"는, 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는, 폴리펩타이드 서열에서의 개별 치환, 결실 또는 첨가를 포함한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 호모로그 및 대립유전자 외에도 존재하고 이를 배제하지 않는다. 하기 8개의 그룹은 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 라이신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 및 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예컨대 문헌[Creighton, Proteins (1984)] 참조). 일 실시형태에서, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 유의하게 영향을 주거나 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭하는 데 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "차단한다"는 상호작용 또는 과정을 중단시키거나 방지하는 것, 예를 들어 리간드-의존적 또는 리간드-독립적 신호전달을 중단시키는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "인지하다"는, 구조적(conformational) 에피토프를 찾아 상호작용하는(예컨대 결합하는) 항체 이의 항원-결합 단편을 지칭한다.
용어 "교차-차단하다", "교차-차단되는", "교차-차단하는", "경쟁하다", "교차 경쟁하다" 및 관련 용어들은, 표준 경쟁적 결합 검정법에서 다른 항체 또는 결합제와 BMP6의 결합을 방해하는 항체 또는 다른 결합제의 능력을 의미하기 위해 본원에서 상호호환적으로 사용된다.
항체 또는 다른 결합제가, 또 다른 항체 또는 결합 분자와 BMP6의 결합을 방해할 수 있는 능력 또는 정도, 및 따라서 본 발명에 따라 교차-차단하는 것으로 일컬어질 수 있는지의 여부는 표준 경쟁 결합 검정법을 사용하여 결정될 수 있다. 하나의 적합한 검정법은 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용하여 상호작용의 정도를 측정할 수 있는 Biacore 기술(예를 들어 BIAcore 3000 장비(Biacore, 스웨덴 웁살라 소재)를 사용함으로써)의 사용을 수반한다. 교차-차단을 측정하기 위한 또 다른 검정법은 ELISA-기반 접근법을 사용한다.
용어 "중화시키다"는, 항체가 이의 표적에 결합 시, 표적의 활성, 수준 또는 안정성을 감소시키는 것을 의미하며; 예를 들어, BMP6 항체는 BMP6에 결합 시, BMP6의 활성, 수준 또는 안정성, 예컨대 헵시딘 수준 및 빈혈증에서 신호전달 또는 이의 역할을 적어도 부분적으로 감소시킴으로써 BMP6를 중화시킨다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 의미한다. 에피토프는 통상, 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹핑(grouping), 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되고, 통상, 특이적인 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 가진다. 구조적 및 비구조적 에피토프들은, 변성 용매의 존재 하에 비구조적 에피토프가 아니라 구조적 에피토프가 상실된다는 점에서 구별된다.
용어 "에피토프"는 면역글로불린에 특이적으로 결합하거나 그렇지 않다면 분자와 상호작용할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다. 에피토프 결정기는 일반적으로, 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹핑, 예컨대 아미노산 BMP6, 탄수화물 또는 당 측쇄로 구성되고, 특이적인 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 "선형" 또는 "구조적"일 수 있다.
용어 "선형 에피토프"는, 단백질과 상호작용 분자(예컨대 항체) 사이에서의 상호작용의 모든 지점들이 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 발생하는(연속적인(continuous)) 에피토프를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 IgG 항체에 대한 "고 친화도"는 표적 항원, 예를 들어 BMP6에 대해 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 또는 10-10 M 또는 10-11 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다. 그러나, "고 친화도" 결합은 다른 항체 아이소타입에 대해서 다양할 수 있다. 예를 들어, IgM 아이소타입에 대한 "고 친화도" 결합은 10-7 M 이하 또는 10-8 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "인간 항체"(또는 이의 항원-결합 단편)는, 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다 인간 기원의 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체(및 이의 항원-결합 단편)를 포함하고자 한다. 더욱이, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 이러한 불변 영역 또한, 이러한 인간 서열, 예를 들어 인간 생식선 서열, 또는 인간 생식선 서열의 돌연변이화된 버전으로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체 및 이의 항원-결합 단편은 인간 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예컨대 시험관내에서의 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이생성에 의해 또는 생체내에서의 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이).
본원에 사용된 바와 같이 구 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"(또는 이의 항원-결합 단편)은 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나 동일한 유전 공급원으로부터 유래되는 항체, 항체 단편, 이중특이적 항체 등을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 이 용어는 또한, 단일 분자 조성물의 항체 분자의 조제물을 포함한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
용어 "인간 모노클로날 항체"(또는 이의 항원-결합 단편)는 프레임워크 및 CDR 영역이 둘 다 인간 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는, 단일 결합 특이성을 나타내는 항체(및 이의 항원-결합 단편)를 지칭한다. 일 실시형태에서, 인간 모노클로날 항체는, 불멸화된 세포에 융합된 인간 중쇄 이식유전자 및 경쇄 이식유전자를 포함하는 게놈을 갖는 형질전환(transgenic) 비인간 동물, 예를 들어 형질전환 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.
본원에 사용된 바와 같이 구 "재조합 인간 항체"(또는 이의 항원-결합 단편)는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 모든 인간 항체(및 이의 항원-결합 단편), 예컨대 인간 면역글로불린 유전자 또는 이로부터 제조된 하이브리도마에 대해 형질전환이거나 염색체이식(transchromosomal)인 동물(예컨대 마우스)로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현하도록 형질변환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 단리된 항체, 재조합, 조합적(combinatorial) 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 면역글로불린 유전자, 서열의 모두 또는 일부를 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 단계를 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는, 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 가진다. 일 실시형태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이생성(또는, 인간 Ig 서열에 대해 형질전환인 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이생성) 처리될 수 있고, 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 관련이 있는 한편 생체내에서 인간 항체 생식선 레퍼토리(repertoire) 내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
본원에 사용된 바와 같이 "인간화된" 항체(또는 이의 항원-결합 단편)는 인간에서 덜 면역원성이면서도 비-인간 항체의 반응성을 보유하는 항체(또는 이의 항원-결합 단편)이다. 이는 예를 들어, 비-인간 CDR 영역을 보유하고, 항체의 나머지 부분들을 이들의 인간 대응물들(즉, 불변 영역, 뿐만 아니라 가변 영역의 프레임워크 부분)로 대체함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; 및 Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994]를 참조한다. 인간 조작 기술의 다른 예는 미국 특허 5,766,886에 개시된 Xoma 기술을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
용어 "동일한" 또는 "동일성" 퍼센트는 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서, 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 2개의 서열은, 하기 서열 비교 알고리즘들 중 하나를 사용하거나 수동 정렬 및 시각적 조사에 의해 측정된 바와 같이 비교창 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 상응도(correspondence)를 위해 비교되고 정렬된 경우, 이들 2개의 서열이 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 명시된 퍼센트로 갖는 경우(즉, 명시된 영역에 걸쳐, 또는 특정하지 않은 경우 전체 서열에 걸쳐, 60% 동일성, 선택적으로 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성), "실질적으로 동일"하다. 선택적으로, 동일성은 적어도 약 50개 뉴클레오타이드(또는 10개 아미노산) 길이의 영역에 걸쳐, 또는 보다 바람직하게는 100 내지 500개 또는 1000개 이상의 뉴클레오타이드(또는 20, 50, 200개 이상의 아미노산) 길이의 영역에 걸쳐 존재한다. 선택적으로, 동일성은 적어도 약 50개 뉴클레오타이드(또는 10개 아미노산) 길이의 영역에 걸쳐, 또는 보다 바람직하게는 100 내지 500개 또는 1000개 이상의 뉴클레오타이드(또는 20, 50, 200개 이상의 아미노산) 길이의 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은, 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열이 컴퓨터에 입력되고, 하위서열 코디네이트(coordinate)가 지정되고, 필요하다면, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 디폴트 프로그램 매개변수가 사용될 수 있거나, 대안적인 매개변수가 지정될 수 있다. 그 후에, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수를 기초로 하여, 참조 서열과 비례하여 시험 서열에 대한 서열 동일성 퍼센트를 계산한다.
본원에 사용된 바와 같이 "비교창"은 20 내지 600, 통상 약 50 내지 약 200, 보다 통상 약 100 내지 약 150으로 구성된 군으로부터 선택되는 임의의 하나의 수의 인접한(contiguous) 위치들의 분절에 대한 참조를 포함하며, 여기서 서열 및 참조 서열이 최적으로 정렬된 후, 서열이 동일한 수의 인접한 위치들의 참조 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은 예를 들어, 문헌[Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988]의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.에서 갭, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)의 컴퓨터화된 실시에 의해, 또는 수동 정렬 및 시각적 조사에 의해(예를 들어 문헌[Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003)] 참조) 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 퍼센트를 결정하기에 적합한 알고리즘의 2개 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이들은 각각 문헌[Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977; 및 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990]에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립생물공학 정보 센터를 통해 공개적으로 입수 가능하다. 이러한 알고리즘은 우선, 데이터베이스 서열에서 길이 W의 단어와 함께 정렬된 경우, 일부 양의-값의(positive-valued) 역치 점수 T와 매치하거나 충족시키는, 쿼리(query) 서열 내의 동일한 길이의 짧은 단어를 식별함으로써 고득점 서열쌍(HSP; high scoring sequence pair)을 식별하는 단계를 수반한다. T는 이웃 단어 점수 역치로서 지칭된다(상기 Altschul 등). 이들 처음(initial) 이웃 단어 히트(hit)는 이들을 함유하는 더 긴 HSP를 찾기 위해 검색을 개시하기 위한 시드(seed)로서 작용한다. 단어 히트는, 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한, 각각의 서열을 따라 양방향에서 연장된다. 누적 점수는 뉴클레오타이드 서열의 경우, 매개변수 M(매칭 잔기 쌍에 대한 리워드(reward) 점수; 항상 0 초과) 및 N(미스매칭 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 0 미만)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 누적 점수를 계산하기 위해 득점 매트릭스가 사용된다. 각각의 방향에서 단어 히트의 연장은, 누적 정렬 점수가 이의 최대 달성값(achieved value)으로부터 X 양만큼 하락하는 경우; 누적 점수가 하나 이상의 음의-득점(negative-scoring) 잔기 정렬의 누적으로 인해 0 이하까지 되는 경우; 또는 어느 한 서열의 말단이 도달되는 경우 중단된다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 감수성(sensitivity) 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열의 경우)은 디폴트로서 11의 단어길이(N), 10의 기댓값(E), M=5, N=-4, 및 2개 가닥 모두의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어길이, 10의 기댓값(E)을 사용하고, BLOSUM62 득점 매트릭스(문헌[Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989] 참조)는 50의 정렬(B), 10의 기댓값(E), M=5, N=-4, 및 2개 가닥 모두의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 또한, 2개의 서열들 사이에서 유사성의 통계학적 분석을 수행한다(예를 들어 문헌[Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 하나의 측정은 최소 확률 합계(P(N))이며, 이는 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열들 사이에서 매치가 우연히 발생할 확률의 지표(indication)를 제공한다. 예를 들어, 핵산은, 시험 핵산과 참조 핵산의 비교 시 최소 확률 합계가 약 0.02 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
2개의 아미노산 서열들 사이에서 동일성 퍼센트는 또한, PAM120 중량 잔기 표(weight residue table), 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0) 내에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller(문헌[Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988])의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열들 사이에서 동일성 퍼센트는 Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 입수 가능함)에서 갭 프로그램 내에 통합된 Needleman 및 Wunsch(문헌[J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970]) 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
상기 주지된 서열 동일성 퍼센트 외에, 2개의 핵산 서열 또는 폴리펩타이드들이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는, 제1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가, 하기 기재된 바와 같이 제2 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드에 대해 생성된 항체와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 예를 들어 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우, 2개의 펩타이드들은 전형적으로 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열들이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는, 2개 분자들 또는 이들의 보체가 하기 기재된 바와 같이 엄격한 조건 하에 서로 혼성화한다는 것이다. 2개의 핵산 서열들이 실질적으로 동일하다는 보다 다른 지표는, 서열을 증폭시키기 위해 동일한 프라이머가 사용될 수 있다는 것이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "단리된 항체"(또는 이의 항원-결합 단편)는, 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체(또는 이의 항원-결합 단편)(예컨대 BMP6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 BMP6 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음)를 지칭한다. 더욱이, 단리된 항체는 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
용어 "아이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체 부류(예컨대 IgM, IgE, IgG, 예컨대 IgG1 또는 IgG4)를 지칭한다. 아이소타입은 또한, 이들 부류 중 하나의 변형된 버전을 포함하며, 여기서, 변형은 Fc 기능을 변경하도록, 예를 들어 Fc 수용체에 대한 이펙터 기능 또는 결합을 증강시키거나 감소시키도록 수행되었다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "Kassoc", "Ka", "KA" 또는 "KA"는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도를 지칭하고자 하며, 반면 본원에 사용된 바와 같이 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하고자 한다. 일 실시형태에서, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "KD"는 해리 상수를 지칭하고자 하며, 이러한 해리 상수는 Ka에 대한 Kd의 비율(즉, Kd/Ka)로부터 수득되고 몰 농도(M)로서 표현된다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에 잘 구축된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하거나 바이오센서 시스템, 예컨대 Biacore® 시스템을 사용해서이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "모노클로날 항체"(또는 이의 항원-결합 단편) 또는 "모노클로날 항체(또는 이의 항원-결합 단편) 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자(또는 이의 항원-결합 단편)의 조제물을 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
용어 "핵산"은 본원에서 용어 "폴리뉴클레오타이드"와 상호호환적으로 사용되고, 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 및 이의 중합체를 지칭한다. 이러한 용어는 공지된 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 연결부를 함유하는 핵산을 포함하며, 이들 핵산은 합성, 천연 발생 및 비-천연 발생이며, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 가지고, 참조 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사된다. 이러한 유사체의 예는 비제한적으로, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 펩타이드-핵산(PNA)을 포함한다.
다르게 가리키지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한, 이의 보존적으로 변형된 변이체(예컨대 축퇴 코돈 치환) 및 상보적 서열, 뿐만 아니라 명백하게 가리켜진 서열을 함축적으로 포함한다. 구체적으로 하기 상술된 바와 같이, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 발생시킴으로써 달성될 수 있다(문헌[Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994]).
용어 "작동적으로 연결된"은 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드(예컨대 DNA) 분절들 사이의 기능적 관계를 지칭한다. 전형적으로, 이는 전사되는 서열에 대한 전사 조절 서열의 기능적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열은, 이러한 서열이 적절한 숙주 세포 또는 다른 발현 시스템에서 코딩 서열의 전사를 자극하거나 조정하는 경우, 코딩 서열에 작동적으로 연결된 것이다. 일반적으로, 전사되는 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 전사 조절 서열은 전사되는 서열에 물리적으로 인접하며, 즉, 이들은 cis-작동성이다. 그러나, 일부 전사 조절 서열, 예컨대 인핸서는, 이들 조절 서열이 전사를 증강시키는 코딩 서열에 물리적으로 인접하거나 근접하게 위치할 필요가 없다.
본원에 사용된 바와 같이 용어, "최적화된"은, 뉴클레오타이드 서열이, 생성 세포 또는 유기체, 일반적으로 진핵 세포, 예를 들어 피치아(Pichia) 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 인간 세포에서 바람직한 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 인코딩하도록 변경되었음을 의미한다. 최적화된 뉴클레오타이드 서열은, "부모" 서열로도 공지된 시작 뉴클레오타이드 서열에 의해 원래 인코딩되는 아미노산 서열을 완전히 또는 가능한 한 많이 보유하도록 조작된다. 본원에서 최적화된 서열은 포유류 세포에서 바람직한 코돈을 갖도록 조작되어 왔다. 그러나, 다른 진핵 세포 또는 원핵 세포에서 이들 서열의 최적화된 발현 또한, 본원에 제공된다. 최적화된 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열 또한, 최적화된다고 지칭된다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본원에서 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호호환적으로 사용된다. 이 용어는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산 중합체, 뿐만 아니라 천연 발생 아미노산 중합체 및 비-천연 발생 아미노산 중합체에 적용된다. 다르게 가리키지 않는 한, 특정 폴리펩타이드 서열은 또한, 이의 보존적으로 변형된 변이체를 함축적으로 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "재조합 인간 항체"(또는 이의 항원-결합 단편)는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 모든 인간 항체(및 이의 항원-결합 단편), 예컨대 인간 면역글로불린 유전자 또는 이로부터 제조된 하이브리도마에 대해 형질전환이거나 염색체이식인 동물(예컨대 마우스)로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현하도록 형질변환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, 재조합, 조합적 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 면역글로불린 유전자, 서열의 모두 또는 일부를 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 단계를 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는, 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 가진다. 그러나, 일 실시형태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이생성(또는, 인간 Ig 서열에 대해 형질전환인 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이생성) 처리될 수 있고, 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 관련이 있는 한편 생체내에서 인간 항체 생식선 레퍼토리 내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는, 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 이러한 용어는 특정 대상체 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손까지 지칭하고자 하는 것으로 이해되어야 한다. 다음 세대에서 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 소정의 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손이 사실상 부모 세포와 동일할 수는 없지만, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "숙주 세포"의 범위 내에는 여전히 포함된다.
용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 포함한다. 비-인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어 포유류 및 비-포유류, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다. 주지되는 경우를 제외하고는, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 본원에서 상호호환적으로 사용된다.
용어 "치료하는"은 질병(예컨대 빈혈증)의 증상, 합병증 또는 생화학적 징후의 발병을 예방하거나 지연시키기 위해, 증상을 완화하기 위해, 또는 질병, 질환 또는 장애의 추가 발병을 저지하거나 억제하기 위해 조성물 또는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 치료는 질병의 출현 후 증상의 예방적(질병의 발병을 예방하거나 지연시키기 위해, 또는 이의 임상적 또는 준임상적 증상의 출현을 예방하기 위해) 또는 치료적 저해 또는 완화일 수 있다.
용어 "벡터"는, 폴리뉴클레오타이드 분자가 연결된 또 다른 폴리뉴클레오타이드를 수송할 수 있는 상기 폴리뉴클레오타이드 분자를 지칭하고자 한다. 하나의 유형의 벡터가 "플라스미드"이며, 이는 추가의 DNA 분절이 연결될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서, 추가의 DNA 분절이 바이러스 게놈 내에 연결될 수 있다. 소정의 벡터는, 이들 벡터(예컨대 박테리아 복제 기원을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜(episomal) 포유류 벡터)가 도입된 숙주 세포 내에서 자율 복제할 수 있다. 다른 벡터(예컨대 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내에 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이로써, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 소정의 벡터는, 이들 벡터가 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히, "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 이용성 있는 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는, 플라스미드가 가장 보편적으로 사용되는 형태의 벡터이므로, 상호호환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능의 역할을 하는 이러한 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터(예컨대 복제 결함성 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)를 포함하고자 한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "적혈구용적율(hematocrit)" 또는 "적혈구용적율(haematocrit)"은 또한, 충전 세포 용적(PCV; packed cell volume) 또는 적혈구 용적 비율(EVF; erythrocyte volume fraction)로도 공지되어 있고, 혈액 내 적혈구의 용적(%)이다. 이는 정상적으로 남성에서 약 45%이고, 여성에서 약 50%이다. 적혈구용적율은 헤모글로빈 농도, 백혈구 수 및 혈소판 수와 마찬가지로 사람의 온혈구계산(complete blood count) 결과의 필수적인 부분인 것으로 간주된다. 일 실시형태에서, 빈혈증은, 비정상적으로 높은 적혈구용적율인 적혈구 증가증(polycythemia)과는 대조적으로, 비정상적으로 낮은 적혈구용적율을 지칭한다.
용어 "검정"은 식별, 스크리닝, 탐색(probing), 시험, 측정 또는 결정 행위를 지칭하는 데 사용되며, 이러한 행위는 임의의 종래의 수단에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 시료는 ELISA 검정법, 노던 블롯, 이미징, 혈청형구분(serotyping), 세포형구분(cellular typing), 유전자 시퀀싱, 표현형구분(phenotyping), 하플로타이핑(haplotyping), 면역조직화학, 웨스턴 블롯, 질량 분석 등을 사용함으로써 특정 유전자 또는 단백질 마커의 존재에 대해 검정될 수 있다. 용어 "검출하는"(등)은, 주어진 공급원으로부터 특정 정보를 추출하는 행위를 의미하며, 직접적 또는 간접적일 수 있다. 본원에 개시된 예측 방법의 일부 실시형태에서, 주어진 것의 존재 또는 수준(예컨대 단백질의 수준 등)은 생물학적 시료 내에서 예를 들어 데이터베이스를 쿼리함으로써 간접적으로 검출된다. 용어 "검정" 및 "결정"은, 시료를 물리적 시험 처리하는 수단에 의해 하나의 상태로부터 또 다른 상태로의 물질(matter)의 형질변환, 예를 들어 생물학적 시료, 예를 들어 혈액 시료 또는 다른 조직 시료의 형질변환을 고려한다.
용어 "수득"은 임의의 방식으로, 예를 들어 물리적 개입(예컨대 생검, 채혈) 또는 비-물리적 개입(예컨대 서버를 통한 정보의 전송) 등에 의해 입수하는 것, 예를 들어 소유를 획득하기 위한 절차를 의미한다.
구 "생물학적 시료의 검정..." 등은, 시료가 주어진 마커(예컨대 단백질)의 존재 또는 수준에 대해 (직접적으로 또는 간접적으로) 시험될 수 있음을 의미하는 데 사용된다. 성분의 수준이 확률을 나타내는 상황에서, 이러한 성분의 수준은 치료적 결정을 가이드하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 당업자는, 정량적 또는 비교적-정량적 수단에 의해 페리틴의 존재에 대해 검정함으로써 환자에서 이러한 페리틴의 수준(예컨대 다른 시료 내에서의 수준과 비례한 수준)을 결정할 수 있다. 개시된 방법은 특히, 환자에서 특정 마커, 예를 들어 페리틴의 수준을 결정하는 단계를 수반한다.
본원에 사용된 바와 같이 환자에 관하여 "선별하는" 및 "선별된"은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이, 예정된 기준을 갖는 특정 환자를 기초로 하여(로 인해), 예를 들어 환자가 특정 수준의 페리틴을 갖는지를 기초로 하여(로 인해), 트정 환자가 더 큰 환자 그룹으로부터 특정하게 선택됨을 의미하는 데 사용된다. 유사하게는, "선택적으로 치료"는, 특정 질병을 갖는 환자에 대해 치료를 제공하는 것을 지칭하며, 여기서, 해당 환자는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이, 예정된 기준을 갖는 특정 환자, 예를 들어 특정 페리틴 수준을 갖는 환자로 인해 치료를 위해 특정하게 선택된 빈혈증 환자를 기초로 하여 더 큰 환자 그룹으로부터 특정하게 선택된다. 유사하게는, "선택적으로 투여"는, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이, 예정된 기준, 예를 들어 특정 유전적 또는 다른 생물학적 마커, 예를 들어 특정 페리틴 수준을 갖는 특정 환자를 기초로 하여(로 인해) 더 큰 환자 그룹으로부터 특정하게 선택된 환자에게 약물을 투여하는 것을 지칭한다. 선별, 선택적으로 치료 및 선택적으로 투여란, 특정 질병을 갖는 환자만 기초로 하는 표준 치료 양생법을 전달하기 보다는, 환자에게 이러한 환자의 특정 생물학을 기초로 하여 개인맞춤형 요법이 전달되는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이 치료 방법에 관하여 선별은 특정 마커를 갖는 환자의 우연적 치료를 지칭하지 않으며, 그보다는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이, 특정 마커, 예를 들어 특정 페리틴 수준을 갖는 환자를 기초로 하여 환자에게 BMP6 길항제를 투여하기 위한 신중한 선택을 지칭한다. 따라서, 선별 치료는, 특정 약물을 모든 환자에게 이들의 마커 상태와는 상관없이 전달하는 표준 치료와는 상이하다.
본원에 사용된 바와 같이, "예측"은, 질병, 예를 들어 빈혈증을 갖는 개체가 BMP6 결합 분자를 이용한 치료에 반응할 것인지 또는 보다 선호적으로 반응할 것인지의 가능성을 의료인이 결정할 수 있도록 본원에 기재된 방법이 정보를 제공하는 것을 가리킨다. 예측은 반응을 100% 정확도로 예측하는 능력을 지칭하지는 않는다. 그 대신, 당업자는, 예측이 증가된 확률을 지칭하는 것으로 이해할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "가능성" 및 "공산(likely)"은 사건이 발생할 개연성의 측정이다. 이는 "확률"과 상호호환적으로 사용될 수 있다. 가능성은, 추측보다는 크지만 확실성보다는 작은 확률을 지칭한다. 따라서, 합리적인 사람이 상식, 훈련 또는 경험을 사용하여, 주어진 상황에서 사건이 일어날 것 같다고 결론내리는 경우, 사건은 공산이 있다. 일부 실시형태에서, 일단 가능성이 확인되면, 환자는 BMP6 결합 분자를 이용하여 치료될 수 있거나(또는 치료가 계속되거나, 또는 투여량이 증가되면서 치료가 진행될 수 있거나), 환자는 BMP6 결합 분자를 이용하여 치료되지 않을 수 있다(또는 치료가 중단되거나, 또는 낮춰진 용량을 이용하여 치료가 진행될 수 있음).
구 "증가된 가능성"은 사건이 발생할 확률의 증가를 지칭한다. 예를 들어, 본원의 일부 방법은, 환자가, 마커(예컨대 본원에 기재된 바와 같이 페리틴 수준)를 갖지 않는 동일하거나 유사한 질병을 갖는 환자와 비교하여, BMP6 결합 분자를 이용한 치료에 반응할 증가된 가능성, 또는 BMP6 결합 분자를 이용한 치료에 더 양호하게 반응할 증가된 가능성을 나타낼지의 여부를 예측할 수 있게 한다.
도 1a는 리포터 유전자 검정법에서 길항제 항체 5, 6 및 7에 의한 BMP 활성의 억제를 보여준다. BMP2, BMP5, BMP6 및 BMP7에 대한 활성이 나타나 있다. 도 1b는 인간 BMP6, 인간 BMP7, 인간 BMP5, 마우스 BMP6, hBaffR, BSA 및 Neu에 결합하는 항체 7을 시험하는 ELISA 결합 검정법을 보여준다. 이 도면 및 다양한 다른 도면들, 및 명세서의 다른 부분들에서, Ab 5는 항체 5이며; Ab 6는 항체 6이고; Ab 7은 항체 7이다.
도 2는 단일 용량 래트 중증도분류(triage) PK 연구의 약물력학적 프로파일을 보여준다. 항체 5, 6 및 7이 사용되었다. 혈청 헵시딘 및 철 수준은 투약(10 mg/kg, IV) 후 1시간, 6시간, 1일, 2일, 4일, 8일, 16일째에 측정되었다.
도 3은 철 대사의 혈청 바이오마커에 미치는 BMP6 항체의 용량-의존적 효과를 보여준다. 상단: 지시된 용량에서 항체 6의 단일 IV 주사 후, 시간 경과에 따른 혈청 hIgG 농도이다. 하단: 좌측 패널은 단일 항체 6 또는 대조군 인간 IgG 주사 후, 혈청 헵시딘 농도의 정량적 분석이며, 반면, 우측 패널은 혈청철 농도이다.
도 4는 염증 마우스 모델의 ESA-내성 빈혈증에서 BMP6 항체의 치료적 치료를 보여준다. 상단: 염증 모델의 BA-유도 ESA-내성 빈혈증의 실험 도식도이다. 하단: BA 치료 후 13일째에 적혈구 생성 매개변수이다. HGB: 헤모글로빈; HCT: 적혈구용적율; RETA: 망상적혈구 수; RET-HE: 망상적혈구 헤모글로빈 등가이다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 대(versus) BA+EPO+hIgG1.
도 5는 HDxMS(질량 분광법과 커플링된 수소/중수소 교환)에 의한 선형 에피토프 맵핑을 보여준다. 항체 7에 의해 결합된 BMP6의 에피토프가 나타나 있다(인간 BMP6의 잔기 88-102(QTLVHLMNPEYVPKP(SEQ ID NO: 98))). HDxMS를 사용하여, 상업적으로 입수 가능한 BMP6 항체의 인간화된 버전인 항체 676는 인간 BMP6의 잔기 23-35(VSSASDYNSSELK(SEQ ID NO: 99))로 구성된 에피토프에 결합하는 것으로 확인되었다.
도 6은 BMP6 항체의 안전성 및 효능을 조사하기 위해 임상 프로그램의 파트 1에 대한 프로토콜을 보여준다.
도 7은 BMP6 항체의 안전성 및 효능을 조사하기 위해 임상 프로그램에 대한 용량 조정 의사 결정 분지도를 보여준다.
도 8은 BMP6 항체의 안전성 및 효능을 조사하기 위해 임상 프로그램의 파트 2에 대한 프로토콜을 보여준다.
도 9는 수컷 래트에서 단일 용량 항체 7의 약물동력학적 프로파일을 보여준다.
도 10은 래트에서 철 대사의 혈청 바이오마커에 미치는 항체 7의 용량-의존적 효과를 보여준다. 지시된 용량에서 단일 항체 7 또는 대조군(비히클)을 주사한 후, 혈청 헵시딘 농도의 정량적 분석이 나타나 있다. 좌측 패널은 투여 후, 처음 24시간 이내의 효과의 확대도를 보여준다.
도 11은 래트에서 혈청철에 미치는 항체 7의 의존적 효과를 보여준다. 지시된 용량에서 단일 항체 7 또는 대조군(비히클)을 주사한 후, 혈청철 농도의 정량적 분석이 나타나 있다. 좌측 패널은 투여 후, 처음 24시간 이내의 효과의 확대도를 보여준다.
도 12는 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이에서 항체 7(3mg/kg)의 단일 용량 IV 주사의 농도-시간 프로파일을 보여준다. 총 항체 7 농도(유리(free) 및 BMP6-결합 둘 다)가 도시되어 있다.
도 13은 수컷 시노몰구스 원숭이에서 3 mg/kg 용량의 항체 7을 단일 정맥내 주사한 후, 혈청 헵시딘 및 Fe 농도를 보여준다. 3마리의 상이한 원숭이들로부터의 데이터가 평균과 함께 나타나 있다.
도 14는 치료 전(기준선) 및 0.01 mg/kg 항체 7(Ab7)을 이용한 치료 후 3일 동안(투약 후 3일째) 혈액투석 환자에 대한 피크 TSAT(철 포화도, %)를 보여준다. 모든 코호트 1 환자의 치료전 페리틴 수준은 500 ng/mL 이하이었다. 모든 코호트 2 환자의 치료전 페리틴 수준은 500 내지 1000 ng/mL이었다. 굵은 선은 각각의 그룹에 대한 중앙 TSAT 수준을 보여준다.
본 발명은 감소된 철과 연관된 질환, 예를 들어 빈혈증을 BMP6의 억제제를 이용하여 치료하는 방법을 제공한다.
BMP6 억제제
광범위하게 다양한 BMP6 길항제들, 예를 들어, 항체, 융합 단백질, 애드넥틴(adnectin), 앱타머(aptamer), 안티칼린(anticalin), 리포칼린(lipocalin), 핵산(예컨대 안티센스 분자, 예컨대 RNA 간섭제 및 리보자임), 면역접합체(예컨대 치료제에 접합된 항체), 저분자, 융합 단백질, BMP6-유래 펩타이드 화합물 및 수용체-기반 길항제(예컨대 가용성 BMP6 수용체 도메인)가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
핵산/안티센스 분자
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에 이용되는 BMP6 길항제는, BMP6를 인코딩하는 유전자 또는 해당 유전자의 일부에 상보적인 안티센스 핵산 분자, 또는 이러한 안티센스 핵산 분자를 인코딩하는 재조합 발현 벡터이다. 본원에 사용된 바와 같이, "안티센스" 핵산은, 단백질을 인코딩하는 "센스" 핵산에 상보적인, 예를 들어 이중-가닥 cDNA 분자의 코딩 가닥에 상보적인, mRNA 서열에 상보적인, 또는 유전자의 코딩 가닥에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이에, 안티센스 핵산은 센스 핵산에 수소 결합될 수 있다.
세포에서 특정 단백질의 발현을 하향-조정하기 위한 안티센스 핵산의 사용은 당업계에 잘 공지되어 있다(예를 들어 문헌[Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews―Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986; Askart, F. K. and McDonnell, W. M. (1996) N. Eng. J. Med. 334:316-318; Bennett, M. R. and Schwartz, S. M. (1995) Circulation 92:1981-1993; Mercola, D. and Cohen, J. S. (1995) Cancer Gene Ther. 2:47-59; Rossi, J. J. (1995) Br. Med. Bull. 51:217-225; Wagner, R. W. (1994) Nature 372:333-335] 참조). 안티센스 핵산 분자는 또 다른 핵산 분자의 코딩 가닥(예컨대 mRNA 서열)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 이에 다른 핵산 분자의 코딩 가닥과 수소 결합할 수 있다. mRNA 서열에 상보적인 안티센스 서열은 mRNA의 코딩 영역, mRNA의 5' 또는 3' 비번역 영역, 또는 코딩 영역과 비번역 영역을 가교하는 영역(예컨대 5' 비번역 영역과 코딩 영역의 연접부에서)에서 확인되는 서열에 상보적일 수 있다. 더욱이, 안티센스 핵산은 서열에서, mRNA를 인코딩하는 유전자의 조절 영역, 예를 들어 전사 개시 서열 또는 조절 요소에 상보적일 수 있다. 바람직하게는, 안티센스 핵산은 코딩 가닥 상의 개시 코돈 및/또는 mRNA의 3' 비번역 영역 내에서 선행하거나 스패닝(spanning)하는 영역에 상보적이도록 디자인된다.
안티센스 핵산은 왓슨 및 크릭 염기쌍 형성(base pairing) 규칙에 따라 디자인될 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 BMP6 mRNA의 전체 코딩 영역에 상보적일 수 있으나, 보다 바람직하게는 BMP6 mRNA의 코딩 또는 비코딩 영역의 일부에만 안티센스인 올리고뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 BMP6 mRNA의 번역 시작 부위 주변의 영역에 상보적일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 안티센스 핵산은 당업계에 공지된 절차를 사용하여 화학적 합성 및 효소적 연결 반응을 사용하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산(예컨대 안티센스 올리고뉴클레오타이드)은 천연 발생 뉴클레오타이드, 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 안티센스 핵산과 센스 핵산 사이에 형성된 듀플렉스의 물리적 안정성을 증가시키도록 디자인된 다양하게 변형된 뉴클레오타이드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있고, 예를 들어 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오타이드가 사용될 수 있다. 안티센스 핵산을 발생시키는 데 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오타이드의 예는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시하이드록실메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실쿼오신(queosine), 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실쿼오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신(wybutoxosine), 슈도우라실, 쿼오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실, (acp3)w 및 2,6-디아미노퓨린을 포함한다. 대안적으로, 안티센스 핵산은 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생성될 수 있으며, 이러한 벡터 내에 핵산이 안티센스 배향으로 서브클로닝되어 있다(즉, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA는, 관심 표적 핵산에 대해 안티센스 배향인 경우 하기 하위단락(subsection)에 더 기재될 것임).
본 발명의 방법에 이용될 수 있는 안티센스 핵산 분자는 전형적으로, 이들 분자가 BMP6를 인코딩하는 세포성 mRNA 및/또는 게놈 DNA와 혼성화하거나 결합하여 이로써 전사 및/또는 번역을 억제함으로써 발현을 억제하도록, 대상체에게 투여되거나 인 시츄에서 발생된다. 혼성화는, 안정한 듀플렉스를 형성하기 위해 종래의 뉴클레오타이드 상보성에 의해서이거나, 또는 예를 들어 DNA 듀플렉스에 결합하는 안티센스 핵산 분자의 경우 이중 나선 구조의 주홈에서 특이적인 상호작용을 통해서일 수 있다. 안티센스 핵산 분자의 투여 경로의 일례는 조직 부위에서의 직접 주사를 포함한다. 대안적으로, 안티센스 핵산 분자는 선별된 세포를 표적화하도록 변형된 다음, 전신 투여될 수 있다. 예를 들어, 전신 투여의 경우, 안티센스 분자는, 이들 분자가 선별된 세포 표면 상에 발현된 수용체 또는 항원에 특이적으로 결합하도록, 예를 들어 분자 내의 안티센스 핵산을 세포 표면 수용체 또는 항원에 결합하는 펩타이드 또는 항체에 연결함으로써 변형될 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 또한, 당업계에 잘 공지되고 예를 들어 US20070111230에 기재된 벡터를 사용하여 세포로 운반될 수 있고, 이의 전체 내용은 본원에 포함된다. 안티센스 분자의 충분한 세포내 농도를 달성하기 위해, 안티센스 핵산 분자가 강한 pol II 또는 pol III 프로모터의 조절 하에 놓인 벡터 구축물이 바람직하다.
보다 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 이용되는 안티센스 핵산 분자는 α-아노머 핵산 분자를 포함할 수 있다. α-아노머 핵산 분자는 상보적 RNA와 특이적인 이중-가닥 하이브리드를 형성하며, 이러한 하이브리드에서 통상적인 β-단위와는 대조적으로, 가닥들은 서로에 대해 평행하게 진행된다(문헌[Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641]). 안티센스 핵산 분자는 또한, 2'-o-메틸리보뉴클레오타이드(문헌[Inoue al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:6131-6148]) 또는 키메라 RNA-DNA 유사체(문헌[Inoue al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330])를 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 안티센스 핵산은 RNAi를 매개하는 화합물이다. RNA 간섭제는, BMP6에 상동성인 RNA 분자 또는 이의 단편을 포함하는 핵산 분자, "짧은 간섭 RNA"(siRNA), "짧은 헤어핀" 또는 "작은 헤어핀 RNA"(shRNA), 및 RNA 간섭(RNAi)에 의해 표적 유전자의 발현을 간섭하거나 억제하는 저분자를 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. RNA 간섭은, 이중-가닥 RNA(dsRNA)와 동일한 서열을 함유하는 메신저 RNA(mRNA)를 분해시키기 위해 dsRNA를 사용하는 전사-후, 표적화된 유전자-침묵화 기술이다(문헌[Sharp, P. A. and Zamore, P. D. 287, 2431-2432 (2000); Zamore, P. D. et al. Cell 101, 25-33 (2000]). 이러한 과정은, 내인성 리보뉴클레아제가 더 긴 dsRNA를 작은 간섭 RNA 또는 siRNA로 명명되는 더 짧은 21- 또는 22-뉴클레오타이드-길이 RNA로 절단하는 경우, 발생한다. 그 후에, 더 작은 RNA 분절은 표적 mRNA의 분해를 매개한다. RNAi 합성 키트는 예를 들어, New England Biolabs사 및 Ambion사로부터 상업적으로 입수 가능하다. 일 실시형태에서, 상기 기재된 안티센스 RNA에 사용하기 위한 화학물질들 중 하나 이상이 이용될 수 있다.
보다 다른 실시형태에서, 안티센스 핵산은 리보자임이다. 리보자임은, 이들이 상보적 영역을 갖는 단일-가닥 핵산, 예컨대 mRNA를 절단할 수 있는 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매적 RNA 분자이다. 따라서, 리보자임(예컨대 해머헤드 리보자임)(문헌[Haselhoff and Gerlach, 1988, Nature 334:585-591]에 기재되어 있음)은 BMP6 mRNA 전사체를 촉매적으로 절단하여, 이로써 BMP6 mRNA의 번역을 억제하는 데 사용될 수 있다.
대안적으로, 유전자 발현은, BMP6 유전자의 전사를 방지하는 삼중 나선 구조를 형성하기 위해, BMP6의 조절 영역(예컨대 프로모터 및/또는 인핸서)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 표적화함으로써 억제될 수 있다. 일반적으로, 문헌[Helene, C., 1991, Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. et al., 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; 및 Maher, L. J., 1992, Bioassays 14(12):807-15]를 참조한다.
융합 단백질 및 BMP6-유래 펩타이드 화합물
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 BMP6 길항제는 BMP6 아미노산 서열로부터 유래되는 융합 단백질 또는 펩타이드 화합물이다. 특히, 억제성 화합물은, BMP6와 표적 분자의 상호작용을 매개하는 융합 단백질 또는 BMP6의 일부(또는 이의 모방체)를 포함하여, BMP6와 이러한 융합 단백질 또는 펩타이드 화합물의 접촉이 BMP6와 표적 분자의 상호작용을 경쟁적으로 억제하도록 한다. 이러한 융합 단백질 및 펩타이드 화합물은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 화합물은 표준 펩타이드 합성 기술을 사용하여 화학적 합성에 의해 제조된 다음, 펩타이드를 세포 내로 도입하기 위한 당업계에 공지된 여러 가지 수단들(예컨대 리포좀 등)에 의해 세포 내로 도입될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질 또는 펩타이드 화합물의 생체내 반감기는 펩타이드 변형을 생성함으로써, 예컨대 N-연결 글리코실화 부위를 BMP6 펩타이드 화합물 내에 첨가함으로써, 또는 펩타이드 BMP6 화합물을 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG; 퍼길화(pegylation))에 예를 들어 라이신-모노퍼길화를 통해 접합시킴으로써 향상될 수 있다. 이러한 기술은 치료 단백질 약물의 반감기를 연장시키는 데 있어서 유익한 것으로 판명되었다. 본 발명의 BMP6 폴리펩타이드의 퍼길화는 유사한 약제학적 이점을 초래할 수 있는 것으로 예상된다.
또한, 퍼길화는 본 발명의 폴리펩타이드의 임의의 일부에서 비천연 아미노산의 도입에 의해 달성될 수 있다. 소정의 비천연 아미노산은 문헌[Deiters et al., J Am ChemSoc 125:11782-11783, 2003; Wang and Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wang et al., Science 292:498-500, 2001; Zhang et al., Science 303:371-373, 2004] 또는 미국 특허 7,083,970에 기재된 기술에 의해 도입될 수 있다. 간략하게는, 이들 발현 시스템들 중 일부는 비센스 코돈, 예컨대 앰버(amber) TAG를 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 개방형 해독틀 내로 도입하기 위해 부위-특이적 돌연변이생성을 수반한다. 그 후에, 이러한 발현 벡터는 도입된 비센스 코돈에 특이적인 tRNA를 이용할 수 있는 숙주 내로 도입되고, 선택된 비천연 아미노산으로 충전된다. 모이어티(moiety)를 본 발명의 폴리펩타이드에 접합시킬 목적에 유익한 특정 비천연 아미노산은 아세틸렌 및 아지도 측쇄를 갖는 아미노산을 포함한다. 그 후에, 이들 신규 아미노산을 함유하는 BMP6 폴리펩타이드는 단백질 내 이들 선택된 부위에서 퍼길화될 수 있다.
수용체-기반 길항제
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 BMP6 길항제는 수용체-기반 길항제이다. 수용체-기반 길항제는, 각각 BMP6(또는 이의 일부)에 결합하고, BMP6 활성 및/또는 기능을 방해하는 가용성 BMP6 수용체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 수용체-기반 길항제는 가용성 헤모쥬벨린(hemojuvelin) 또는 BMP 유형 I 또는 유형 II 수용체를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 가용성 헤모쥬벨린 버전은 특허 출원 공개 US2010/0136015에 기재된 것들을 포함한다.
BMP6 항체 및 이의 항원-결합 단편
본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 방법 및 다른 실시형태 및 양태에 유용한 BMP6 억제제로서, 인간 BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
분비된 BMP 패밀리 성장 인자 리간드인 BMP6는 간에서의 철 대사 호르몬 헵시딘의 발현의 중대한 내인성 조절자로서 식별되어 왔다. 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이러한 개시내용은, 헵시딘-저하 요법으로서 BMP6 길항제 항체가, 기저 질병의 이환율(morbidity)에 실질적으로 부가되고 종종 유해 결과의 예측자인 적혈구 생성 자극제(ESA)에 대한 내성을 극복함으로써 철-제한성 빈혈증 환자에게 유익할 것으로 예상된다고 제안한다.
이러한 항-인간 BMP6 항체의 예는, 서열이 표 1에 열거되어 있는 항체 3, 5, 6 및 7, 및 표 14에 기재된 항-인간 BMP6 항체이다.
항체 5, 6 및 7은 모두, 인간 BMP7, 인간 BMP5 및 인간 BMP2를 능가하는 높은 선별성과 함께 인간 BMP6에 대해 고 친화도로 결합한다(도 1a 참조). 이들 항체는 모두 또한, 래트에서 혈청 헵시딘 저하 및 혈청철 증가를 나타낸다(도 2 참조).
항-인간 BMP6 항체의 추가의 예는 LY3113593이다(예를 들어 임상 시험 NCT02604160 참조). 항-인간 BMP6 항체의 추가의 예는 PCT 출원 공개 번호 WO2014/099391에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. WO2014/099391의 특정 항-인간 BMP6 항체는 표 14에 기재된 항체를 포함한다.
[표 14]
항-인간 BMP6 항체의 예
Figure 112019004117535-pct00001
Figure 112019004117535-pct00002
Figure 112019004117535-pct00003
이러한 경로의 표적화가 기능성 종점의 향상을 부여할 수 있다는 추가의 증거를 제공하기 위해, 본 발명자들은 정상 마우스 및 래트에서 철 대사에 대한 혈청 바이오마커를 조정하고 염증의 빈혈증의 마우스 모델에서 ESA-내성 빈혈증을 역전시키는 BMP6-특이적 항체인 항체 5 내지 7의 능력을 시험하였다. 본 발명자들은, 동물에게 BMP6 항체를 단일 주사하면, 순환 헵시딘의 강력한 저해에 의해 수반되는 혈청철 수준의 지속적인 증가가 초래됨을 확인하였다. 더욱이, 염증-유도 빈혈증을 앓고 있는 마우스의 치료적 치료는, 공존하는 에리스로포이에틴 치료에 반응하여 적혈구생성 매개변수를 유의하게 향상시켰다.
이러한 개시내용에서, 염증의 빈혈증의 마우스 모델에서 BMP6 신호전달의 억제는 철-의존적 적혈구 매개변수를 실질적으로 향상시켰다.
본원에 개시된 BMP6 길항제 항체는 에리스로포이에틴 저-반응성을 갖는 빈혈증을 안전하게 향상시키기 위한 신규 치료적 접근법을 나타낸다. 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이러한 개시내용은, 이러한 향상이, 적혈구 구획으로부터 요구 시 철 저장소의 동원 및 이용성을 통해 발생할 수 있음을 제안한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 인간 BMP5 또는 인간 BMP7 단백질 중 임의의 것보다 인간 BMP6 단백질에 대해 100배, 500배 또는 1000배 더 고 친화도로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. BMP7에 결합하지 않으면서 BMP6에 대한 특이성은, BMP6의 녹아웃이 마우스에게 치명적이지 않기 때문에 중요하다. 그러나, BMP7에 대한 녹아웃 마우스는 신장, 눈 및 뼈 결함을 갖고 태어난 후 사망한다. 어느 한 유전자의 개별 녹아웃이 심장발생을 변경하지는 않지만, BMP6 및 BMP7의 이중 녹아웃은 심장에서 몇몇 결함 및 지체를 나타내었으며; 배아는 심부전으로 사망하였다. BMP7은 섬유증과 연관된 만성 심장병의 진행을 예방하는 데 중요하다. 따라서, 항-BMP6 항체와 BMP7의 교차-반응성은 바람직하지 않다. 본원에 제공된 항체는 BMP7을 능가하여 BMP6에 특이적이다; 예를 들어 표 4a를 참조한다. 도 1b는 또한, 인간 BMP2, BMP5 및 BMP7 단백질을 능가하여 인간 BMP6에 대한 결합 특이성의 증거를 보여준다. 대조적으로, 예를 들어 R&D Systems사로부터 상업적으로 입수 가능한 BMP6 항체는 리포터 유전자 검정법에서 BMP7에 대해 강한 교차-반응성을 갖고 BMP6 및 BMP7을 둘 다 억제하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 항체는 실시예(하기 단락 6 참조)에 기재된 바와 같이 단리된 인간 모노클로날 항체를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
이러한 항-인간 BMP6 항체의 예는 항체 3, 5, 6 및 7이고, 이들의 서열은 표 1에 열거되어 있다.
성숙된 항체 7은 부모 IgG 히트 NOV0442(VH3_3-15, Vl1_1e)로부터 유래된 NOV0442_VL(YGQ) 점라이닝(Germlining)/PTM 제거로부터 유래된다. 항체 7은 인간 BMP7을 능가하는 선별성과 함께 ELISA 결합 검정법에서 인간 BMP6에 대해 500배 초과의 고 친화도(즉, 인간 BMP7보다 인간 BMP6에 대해 500배 더 큰 친화도)로 결합한다. 이러한 항체는 또한, 인간 BMP2 또는 BMP5에 대해 검출 가능한 활성을 갖지 않는다. 부모 IgG NOV0442 및 항체 7에 의해 인지되는 BMP6 펩타이드는 도 5에 나타나 있다. 이러한 펩타이드는 인간 BMP6의 아미노산 QTLVHLMNPEYVPKP(SEQ ID NO: 98)를 포함한다. IgG NOV0442 및 항체 7과는 대조적으로, 인간화된 mAb507(R&D Systems)은 인간 BMP6의 서열 VSSASDYNSSELK(SEQ ID NO: 99)에 결합한다. 따라서, IgG NOV0442 및 항체 7에 의해 인지되는 에피토프는 신규 BMP6 에피토프를 나타낸다. 항체 7은 또한, 시험관내에서 BMP6가 수용체에 결합하는 것을 억제한다. BMPR1A에 대한 BMPR1A의 결합은 최대 59% 억제되며; BMPR1B에 대한 결합은 최대 85% 억제되고; RGM-c에 대한 결합은 최대 72% 억제된다. 래트에서 단일 10 mg/kg 치료는 순환 헵시딘의 지속된 저해를 초래하였다. 마우스에서 추정된 최소 유효 용량은 0.1 mg/kg 이하이다. 원숭이에서 3 mg/kg의 단일 항체 투약 후, 혈청철이 또한 증가를 보여주었고, 헵시딘은 저하를 보여주었다. 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus) 항원이 빈혈증의 자극에 사용된 마우스에서, 항체 7(2 mg/kg)의 치료 효과는 만성 EPO 요법에 대한 임상적으로 유의한 적혈구생성 반응과 일치하며, 이때 헤모글로빈은 기준선으로부터 2.0 g/dL 초과까지 점차 증가한다.
항체 7에서, 잠재적인 번역-후 변형 부위가 LCDR2 내에서 N51Q 돌연변이에 의해 제거되어, 이후에 생성물 균질성을 증가시켰다. VH3/람다1 프레임워크로부터 유래된 항체는 최근접 인간 생식선 서열을 매칭하기 위해 VH에서 V40A 돌연변이에 의해, VL에서 D1Q, I2S 돌연변이에 의해, 및 아미노산 Y49 및 G50이 처음에 상실된 프레임워크를 복구하기 위해 이들 2개의 잔기의 도입에 의해 조작되었다.
이러한 작업으로 항체 7이 초래되었다(= NOV0958 = NOV0806_VH[V40A]_VL[D1Q, I2S, Y49, G50, N51Q]).
항체 3, 5, 6 및 7은 모두, 인간 BMP2, BMP5 또는 BMP7 단백질과 비교하여 인간 BMP6 단백질에 대해 높은 특이성을 보여준다. 이들 모든 항체들의 에피토프는, 이들이 모두 친화도 성숙 이전에 단일 부모 Fab로부터 유래되는 것과 동일한 것으로 예측된다. 예를 들어, 항체 3은 동일한 Fab 클론을, HCDR2의 친화도 성숙 이전에 항체 5 및 7 둘 다와 공유한다. 항체 5는 NOV0442(VH3_3-15, VI1_1e) → NOV0442_VL(YGQ) → (HCDR2 친화도 성숙) → 항체 5로부터 유래된다. 항체 3은 NOV0442(VH3_3-15,VI1_1e) → NOV0442_VL(YGS) → (HCDR2 친화도 성숙) → 항체 3으로부터 유래된다. 본원에 기재된 항체의 발생에 관한 추가의 상세 사항은 실시예에 제공된다.
본 발명은 BMP6(예컨대 인간 BMP6 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 표 1 및/또는 표 14에 열거된 VH 도메인을 포함한다. 본 발명은 또한, BMP6 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 표 1 및/또는 표 14에 열거된 VH CDR들 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR을 포함한다. 특히, 본 발명은 BMP6 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 표 1 및/또는 표 14에 열거된 VH CDR들 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 갖는 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 VH CDR을 포함한다(또는 대안적으로 구성됨).
본 발명은 또한, BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1 및/또는 표 14에 열거된 VH 아미노산 서열을 포함하며(또는 대안적으로 구성되며), 여기서, 프레임워크 서열(예를 들어 CDR이 아닌 서열) 내의 약 10개 이하의 아미노산은 돌연변이화되었다(여기서, 돌연변이는 다양한 비제한적인 예로서, 첨가, 치환 또는 결실임). 본 발명은 또한, BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1 및/또는 표 14에 열거된 VH 아미노산 서열을 포함하며(또는 대안적으로 구성되며), 여기서, 프레임워크 서열(예를 들어 CDR이 아닌 서열) 내의 10개 이하의 아미노산은 돌연변이화되었다(여기서, 돌연변이는 다양한 비제한적인 예로서, 첨가, 치환 또는 결실임).
본 발명은 또한, BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1 및/또는 표 14에 열거된 VH 아미노산 서열을 포함하며(또는 대안적으로 구성되며), 여기서, 프레임워크 서열(예를 들어 CDR이 아닌 서열) 내의 약 20개 이하의 아미노산은 돌연변이화되었다(여기서, 돌연변이는 다양한 비제한적인 예로서, 첨가, 치환 또는 결실임). 본 발명은 또한, BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1 및/또는 표 14에 열거된 VH 아미노산 서열을 포함하며(또는 대안적으로 구성되며), 여기서, 프레임워크 서열(예를 들어 CDR이 아닌 서열) 내의 20개 이하의 아미노산은 돌연변이화되었다(여기서, 돌연변이는 다양한 비제한적인 예로서, 첨가, 치환 또는 결실임).
본 발명은 또한, BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1 및/또는 표 14에 열거된 VL 아미노산 서열을 포함하며(또는 대안적으로 구성되며), 여기서, 프레임워크 서열(예를 들어 CDR이 아닌 서열) 내의 약 10개 이하의 아미노산은 돌연변이화되었다(여기서, 돌연변이는 다양한 비제한적인 예로서, 첨가, 치환 또는 결실임). 본 발명은 또한, BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1 및/또는 표 14에 열거된 VL 아미노산 서열을 포함하며(또는 대안적으로 구성되며), 여기서, 프레임워크 서열(예를 들어 CDR이 아닌 서열) 내의 10개 이하의 아미노산은 돌연변이화되었다(여기서, 돌연변이는 다양한 비제한적인 예로서, 첨가, 치환 또는 결실임).
본 발명은 또한, BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1 및/또는 표 14에 열거된 VL 아미노산 서열을 포함하며(또는 대안적으로 구성되며), 여기서, 프레임워크 서열(예를 들어 CDR이 아닌 서열) 내의 약 20개 이하의 아미노산은 돌연변이화되었다(여기서, 돌연변이는 다양한 비제한적인 예로서, 첨가, 치환 또는 결실임). 본 발명은 또한, BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1 및/또는 표 14에 열거된 VL 아미노산 서열을 포함하며(또는 대안적으로 구성되며), 여기서, 프레임워크 서열(예를 들어 CDR이 아닌 서열) 내의 20개 이하의 아미노산은 돌연변이화되었다(여기서, 돌연변이는 다양한 비제한적인 예로서, 첨가, 치환 또는 결실임).
본 발명은 BMP6 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1 및/또는 표 14에 열거된 VL 도메인을 포함한다. 본 발명은 또한, BMP6 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1 및/또는 표 14에 열거된 VL CDR들 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR을 포함한다. 특히, 본 발명은 BMP6 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1 및/또는 표 14에 열거된 VL CDR들 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 갖는 1, 2, 3개 이상의 VL CDR을 포함한다(또는 대안적으로 구성됨).
본 발명의 다른 항체 및 이의 항원-결합 단편은 돌연변이화되었지만 표 1 및/또는 표 14에 기재된 서열에 나타난 CDR 영역과 CDR 영역에서 적어도 60, 70, 80, 90 또는 95 동일성 퍼센트를 갖는 아미노산을 포함한다. 일 실시형태에서, 이는 돌연변이체 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 표 1 및/또는 표 14에 기재된 서열에 나타난 CDR 영역과 비교 시, CDR 영역에서 돌연변이화되었다.
본 발명은 또한, BMP6 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편의 VH, VL, 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 이러한 핵산 서열은 포유류 세포에서 발현을 위해 최적화될 수 있다(예컨대 표 1은 항체 3, 5, 6 및 7의 중쇄 및 경쇄에 대한 핵산 서열 예를 보여줌).
[표 1]
본 발명의 BMP6 항체의 예
Figure 112019004117535-pct00004
Figure 112019004117535-pct00005
Figure 112019004117535-pct00006
Figure 112019004117535-pct00007
Figure 112019004117535-pct00008
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Figure 112019004117535-pct00015
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Figure 112019004117535-pct00018
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Figure 112019004117535-pct00021
Figure 112019004117535-pct00022
본 발명의 다른 항체 및 이의 항원-결합 단편은 아미노산, 또는 이러한 아미노산을 인코딩하는 핵산이 돌연변이화되었으나 표 1 및/또는 표 14에 기재된 서열에 대해 적어도 60, 70, 80, 90 또는 95 동일성 퍼센트를 갖는 것들을 포함한다. 일 실시형태에서, 이는 동일한 치료적 활성을 실질적으로 보유하면서도, 표 1 및/또는 표 14에 기재된 서열에 나타난 가변 영역과 비교 시, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산이 가변 영역에서 돌연변이화된 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 인간 BMP6에 결합하고, SEQ ID NO: 9, 10 및 11 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 19, 20 및 21 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 인간 BMP6에 결합하고, SEQ ID NO: 12, 13 및 14 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 22, 23 및 24 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 인간 BMP6에 결합하고, SEQ ID NO: 29, 30 및 31 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 39, 40 및 41 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 인간 BMP6에 결합하고, SEQ ID NO: 32, 33 및 34 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 42, 43 및 44 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 인간 BMP6에 결합하고, SEQ ID NO: 49, 50 및 51 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 59, 60 및 61 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 인간 BMP6에 결합하고, SEQ ID NO: 52, 53 및 54 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 62, 63 및 64 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 인간 BMP6에 결합하고, SEQ ID NO: 69, 70 및 71 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 79, 80 및 81 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 인간 BMP6에 결합하고, SEQ ID NO: 72, 73 및 74 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 82, 83 및 84 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
이들 항체가 각각 BMP6에 결합할 수 있기 때문에, VH, VL, 전장 경쇄 및 전장 중쇄 서열(아미노산 서열, 및 이러한 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열)은 "혼합 및 매칭되어", 본 발명의 다른 BMP6-결합 항체 및 이의 항원-결합 단편을 생성할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매칭된" BMP6-결합 항체는 당업계에 공지된 결합 검정법(예컨대 ELISA, 및 실시예 섹선에 기재된 다른 검정법)을 사용하여 시험될 수 있다. 이들 사슬이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VH/VL 쌍 형성으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍 형성으로부터의 전장 중쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 중쇄 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 VH/VL 쌍 형성으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍 형성으로부터의 전장 경쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 경쇄 서열로 대체되어야 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 표 1 및/또는 표 14에 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 조합을 포함하는 BMP6-결합 항체를 제공한다. CDR 영역은 Kabat 시스템(문헌[Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242])을 사용하거나 Chothia 시스템(문헌[Chothia et al. 1987 J. Mol. Biol. 196: 901-917; 및 Al-Lazikani et al. 1997 J. Mol. Biol. 273: 927-948])을 사용하여 기술된다.
이들 항체가 각각 BMP6에 결합할 수 있고, 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, 2 및 3 영역에 의해 제공됨을 고려하면, VH CDR1, 2 및 3 서열 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 "혼합 및 매칭"될 수 있다(즉, 상이한 항체들로부터의 CDR들은, 본 발명의 다른 BMP6-결합 결합 분자를 생성하기 위해 각각의 항체가 VH CDR1, 2 및 3 및 VL CDR1, 2 및 3을 함유해야 하더라도, 혼합 및 매칭될 수 있음). 이러한 "혼합 및 매칭된" BMP6-결합 항체는 당업계에 공지된 결합 검정법 및 실시예에 기재된 검정법(예컨대 ELISA)을 사용하여 시험될 수 있다. VH CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 마찬가지로, VL CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 신규 VH 및 VL 서열이, 하나 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 본 발명의 모노클로날 항체에 대해 본원에 제시된 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 돌연변이화함으로써 생성될 수 있다는 것은 당업자에게 쉽게 자명할 것이다.
이에, 본 발명은 SEQ ID NO: 29, 49, 69, 12, 32, 52, 72 또는 9 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; SEQ ID NO: 10, 30, 50, 70, 13, 33, 53 또는 73 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; SEQ ID NO: 11, 31, 51, 71, 14, 34, 54 또는 74 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; SEQ ID NO: 19, 39, 59, 79, 22, 42, 62 또는 82 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; SEQ ID NO: 20, 40, 60, 80, 23, 43, 63 또는 83 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 SEQ ID NO: 21, 41, 61, 81, 24, 44, 64 또는 84 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 영역을 제공하며; 여기서, 항체는 BMP6에 특이적으로 결합한다.
일 실시형태에서, BMP6에 특이적으로 결합하는 항체는 표 1 및/또는 표 14에 기재된 항체이다.
본원에 사용된 바와 같이, 인간 항체는, 항체의 가변 영역 또는 전장 사슬이 인간 생식선 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 수득되는 경우, 특정 생식선 서열"의 생성물"이거나 "이로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 시스템은 인간 면역글로불린 유전자를 운반하는 형질전환 마우스를 관심 항원을 이용하여 면역화시키는 단계, 또는 파지(phage) 상에 나타난 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 관심 항원을 이용하여 스크리닝하는 단계를 포함한다. 인간 생식선 면역글로불린 서열"의 생성물"이거나 "이로부터 유래된" 인간 항체는, 이러한 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식선 면역글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 서열에서 인간 항체의 서열에 최근접(즉, 가장 큰 동일성 %)인 인간 생식선 면역글로불린 서열을 선별함으로써 그와 같이 식별될 수 있다. 특정 인간 생식선 면역글로불린 서열"의 생성물"이거나 "이로부터 유래된" 인간 항체는, 예를 들어 천연 발생 체세포 돌연변이, 또는 부위-특이적 돌연변이의 의도적 도입으로 인해, 생식선 서열과 비교하여 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, VH 또는 VL 프레임워크 영역에서, 선별된 인간 항체는 전형적으로 아미노산 서열에서, 인간 생식선 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고, 다른 종의 생식선 면역글로불린 아미노산 서열(예컨대 뮤린 생식선 서열)과 비교하여 인간인 인강 항체를 식별하는 아미노산 잔기를 함유한다. 소정의 경우, 인간 항체는 아미노산 서열에서, 인간 생식선 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 적어도 95% 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 전형적으로, 재조합 인간 항체는 VH 또는 VL 프레임워크 영역에서 인간 생식선 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 소정의 경우, 인간 항체는 생식선 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.
BMP 패밀리 구성원 및 헵시딘
일 실시형태에서, 본 발명은 BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 결합 단편을 제공하며, 이는 항체이다. 일 실시형태에서, 항체 또는 이의 결합 단편은 표 1 및/또는 표 14에 기재되어 있다.
일 실시형태에서, 항체 또는 이의 결합 단편은 BMP6에는 특이적으로 결합하지만 다른 BMP 단백질(예컨대 BMP2, BMP5 또는 BMP7)에는 그렇지 않다.
분비된 BMP 패밀리 성장 인자 리간드인 BMP6는 이의 성숙한 활성 형태에서 30 kDa 이황화-연결된 동종이량체이다. 단백질은 TGF-베타 슈퍼패밀리의 구성원이다. 골 형태형성 단백질들은 골(bone) 및 연골의 성장을 유도하는 이들의 능력으로 공지되어 있다. BMP6는 중간엽 줄기세포에서 모든 골원성 마커들을 유도할 수 있다.
골 형태형성 단백질(BMP)은 이소성(ectopic) 골 성장을 유도할 수 있는 분비된 신호전달 분자의 패밀리이다. BMP는 형질변환성 성장 인자-베타(TGF-베타) 슈퍼패밀리의 일부이다. BMP는 원래, 생체내에서 프레임워크외 부위에서 연골내 골형성을 유도하는 탈회골(demineralized bone) 추출물의 능력에 의해 식별되었다. 이러한 유전자에 의해 인코딩된 BMP는 배아발생 초기에서 이의 발현을 기초로, 초기 발생에서 제안된 역할을 가진다. 또한, 이러한 BMP가 BMP5 및 BMP7과 밀접하게 관련이 있다는 사실은 가능한 골 유도 활성을 추측할 수 있게 하였다. BMP6의 추가의 기능은 문헌[Nature Genetics April; 41 [4]:386-8]에 기재된 바와 같이 식별되었다.
BMP6가 녹아웃된 마우스는 생존 가능하고 생식력이 있으며, 정상적인 골 및 연골 발생을 보여준다.
BMP6는, 간에 의해 분비되는 작은 펩타이드이며 포유류에서 철 대사의 주요 조절자인 헵시딘의 주된 조절자이다. 헵시딘은 십이지장에서 흡수되는 식이성(dietary) 철 및 망상내피 세포에 의해 방출되는 철의 양을 둘 다 조절한다. 헵시딘은 염증 및 철 과부하(overload)를 포함한 여러 가지 자극에 의해 상향조절되고, 빈혈증, 저산소증 및 철 부족에 의해 하향조절된다.
임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이러한 개시내용은, 헵시딘-저하 요법으로서 BMP6 길항제 항체가, 기저 질병의 이환율에 실질적으로 부가되고 종종 유해 결과의 예측자인 적혈구 생성 자극제(ESA)에 대한 내성을 극복함으로써 철-제한성 빈혈증 환자에게 유익할 것으로 예상된다고 제안한다. BMP6는, 이것과 BMPR1 및 BMPR2 수용체의 상호작용을 통해 수용체 이량체화 및 헵시딘의 전사를 유도한다. BMP6는 또한, 간 및 근육 세포에서 HJV 공동-수용체에 결합한다.
따라서, BMP6는 헵시딘의 발현을 증가시키는 것으로 공지되어 있다. 헵시딘은 철 항상성에 관여하는 주된 호르몬인 것으로 공지되어 있다. 높은 헵시딘 수준은 ACD에서 철-제한성 적혈구 생성과 연관이 있다.
WO 2010/056981은, BMP6에 대한 항체를 마우스에게 투여하면, 헵시딘을 저하하고 철을 증가시켰음을 개시하였다.
BMP6는 당업계, 예를 들어: 문헌[Hahn et al. 1992 Genomics 14: 759-62; Sauermann et al. 1993 J. Neurosci. Res. 33: 142; Celeste et al. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9843; Schluesener et al. 1995 Atherosclerosis 113: 153; Gitelman et al. 1994 J. Cell Biol. 126: 1595; Barnes et al. 1997 W. J. Urol. 13: 337; 및 Hamdy et al. 1997 Cancer Res. 57: 4427]에 더 기재되어 있다.
다른 골 형태형성 단백질처럼 BMP2는 골 및 연골 발생에서 중요한 역할을 한다. BMP2는 헷지호그(hedgehog) 경로, TGF-베타 신호전달 경로 및 사이토카인-사이토카인 수용체 상호작용에 관여한다. BMP2는 또한, 심장 세포에서 분화 및 상피로부터 중간엽으로의 전이(transition)에 관여한다. BMP2는 문헌[Kishimoto et al. 1997 Dev. 124: 4457; Ma et al. 2005 Dev. 132: 5601; Wang et al. Bone 48: 524; 및 Rosen 2009 Cyt. Growth Fact. Rev. 20: 475]에 주지된 바와 같이 많은 필수적인 역할을 가진다. 따라서, BMP6 항체가 BMP2에 결합하지 않는 것이 바람직하다.
BMP2는 특히: 문헌[Sampath et al. 1990 J. Biol. Chem. 265: 13198; Chen et al. 2004 Growth Factors 22: 233; Marie et al. 2002 Histol. Histopath. 17: 877; Nickel et al. 2001 J. Bone Joint Surg. 83-A Supp. 1: S7-14; Kirsch et al. 2000 FEBS Lett. 468: 215; Kirsch et al. 2000 EMBO J. 19: 3314; Gilboa et al. 2000 Mol. Biol. Cell 11: 1023]에 더 기재되어 있다.
BMP5 또한, TGF-베타 슈퍼패밀리의 구성원이다. 다른 BMP처럼, BMP5도 골 및 연골 발생을 유도하는 능력으로 공지되어 있다. BMP5는 섬유주대(trabecular meshwork) 및 시신경 유두(optic nerve head)에서 발현되고, 발달 및 정상 기능에서 역할을 가질 수 있다. BMP5는 또한, 폐 및 간에서 발현된다.
BMP5에 대한 추가의 정보는 당업계에, 예를 들어, 문헌[Hahn et al. 1992 Genomics 14: 759; Beck et al. 2003 BMC Neurosci. 2: 12; Celeste et al. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9843; 및 Sakaue et al. 1996 Biochem. Biophys. Res. Comm. 221: 768]에 공지되어 있다.
BMP7 또한, TGF-베타 슈퍼패밀리의 구성원이다. BMP 패밀리 단백질의 다른 구성원처럼, BMP7은 중간엽 세포로부터 골 및 연골로의 형질변환에서 주된 역할을 한다. BMP7은 SMAD1 및 SMAD5의 인산화를 유도하며, 이는 다시 수많은 골원성 유전자들의 전사를 유도한다.
상기 주지된 바와 같이, BMP6가 녹아웃된 마우스는 생존 가능하고 생식력이 있으며, 정상적인 골 및 연골 발생을 보여준다. 그러나, BMP7에 대한 녹아웃 마우스는 신장, 눈 및 뼈 결함을 갖고 태어난 후 사망한다. 어느 한 유전자의 개별 녹아웃이 심장발생을 변경하지는 않지만, BMP6 및 BMP7의 이중 녹아웃은 심장에서 몇몇 결함 및 지체를 나타내었으며; 배아는 심부전으로 사망하였다. BMP7은 섬유증과 연관된 만성 심장병의 진행을 예방하는 데 중요하다. 따라서, 항-BMP6 항체와 BMP7의 교차-반응성은 바람직하지 않다.
BMP7에 관한 추가의 정보는 당업계, 예를 들어 문헌[Hahn et al. 1992 Genomics 14: 759; Chen et al. 2004 Growth Factors 22: 233; Itoh et al. 2001 EMBO J. 20: 4132; Zeisberg et al. 2003 Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285: F1060; Kallui et al. 2009 J. Clin. Invest. 119: 1420; 및 Wang et al. 2001 J. Am. Soc. Neph. 12: 2392]에 제공되어 있다.
헵시딘은 HAMP(헵시딘 항-미생물 단백질 또는 펩타이드)로도 공지된 펩타이드 호르몬이다.
마우스 진화에서 최근의 유전자 복제 사건은 마우스에서 2개의 유사한 헵시딘 유전자인 헵시딘1 및 헵시딘2의 존재를 초래하였다(문헌[Ilyin et al. 2003 FEBS Lett. 542: 22-26]). 마우스 헵시딘2에서는, 포유류 헵시딘에서 확인되는 몇몇 보존된 잔기들이 결여되어 있다(문헌[Lou et al. 2004 Blood 103: 2816-2821]).
헵시딘 유전자 생성물은 철 항상성의 유지에 관여하고, 이러한 생성물은 대식세포에서 철 저장의 조절 및 장의 철 흡수에 필요하다. 이들 펩타이드는 항미생물 활성을 나타낸다.
프리프로단백질(preproprotein)(또는 프리프로호르몬 또는 프리프로헵시딘)(84 aa) 및 프로단백질(또는 프로호르몬 또는 프로헵시딘)(60 aa)은 20, 22 및 25개의 아미노산의 성숙한 펩타이드로 가공된다. 25-aa 펩타이드는 주로 간에 의해 분비되고, 철 대사의 "마스터 조절자"인 것으로 간주된다. 20-aa 및 22-aa 대사물질이 소변에 존재한다. 헵시딘의 N-말단 영역이 기능에 필요하고; 5개 N-말단 아미노산의 결실은 기능 상실을 초래한다.
활성 헵시딘 펩타이드는 시스테인이 풍부하고, 이들의 베타 병풍 구조를 안정화시키는 분자내 결합을 형성한다.
헵시딘은 주로 간에서 합성되며, 더 적은 양은 다른 조직에서 합성되는 것으로 확인된다(문헌[Bekri et al. 2006 Gastroent. 131: 788-96]).
25-aa 헵시딘 펩타이드는 주로 간에 의해 분비되고, 철 대사의 "마스터 조절자"인 것으로 간주된다. 헵시딘은, 소화관 장세포의 기저측(basolateral) 표면 및 망상내피 세포(대식세포)의 원형질막에 위치하는 철 이출 채널 페로포틴에 결합함으로써 철 수송을 억제한다. 페로포틴을 억제함으로써, 헵시딘은 장의 장세포가 철을 간문맥 시스템 내로 분비하는 것을 방지하며, 이로써 철 흡수를 기능적으로 감소시킨다. 대식세포로부터의 철 방출 또한, 페로포틴 억제에 의해 방지되며; 따라서, 헵시딘은 철 항상성을 유지시킨다. 헵시딘 활성은 또한, 만성 염증, 예컨대 염증성 장질환, 만성 심부전, 암종, 류마티스 관절염 및 신부전의 빈혈증에서 관찰되는 철 격리에 부분적으로 책임이 있다.
헵시딘 유전자에서의 돌연변이는, 심근병증, 간경변 및 내분비 부전(endocrine failure)을 초래하는 심각한 철 과부하에 의해 유발되는 질병인 청소년 혈색소 침착증으로도 공지된 혈색소 침착증 유형 2B를 유발한다. 대부분의 청소년 혈색소 침착증 증례는 헵시딘 생성의 조절자인 헤모쥬벨린에서의 돌연변이로 인한 것이다.
헵시딘을 과발현하도록 조작된 유전적으로 변형된 마우스는 심각한 철 부족으로 생후 얼마 지나지 않아 사망하며, 이는, 철 조절에서 중추적이고 불필요하지 않은 역할을 제안한다. 헵시딘을 염증의 빈혈증에 연결한 최초의 증거는, 연구자들이 철 보조제에 반응하지 않은 중증 소구성 빈혈증(severe microcytic anemia)과 함께 간 종양을 가진 2명의 환자들로부터의 조직을 검사하였을 때, 나왔다. 종양 조직은 헵시딘을 과다생성하였고, 종양을 수술적으로 제거하는 것은 빈혈증을 치유하였다.
적당한 철 흡수의 실패가 철 부족 및 철 부족 빈혈증에 기여하는 많은 질병들이 존재한다. 헵시딘이 장관(enteral) 흡수를 차단하고 있는 경우 경구 치료가 효과적이지 못할 경향이 있을 것이므로, 치료는 헵시딘 수준에 따라 다를 것이다.
일 실시형태에서, BMP6에 대한 항체 또는 이의 결합 단편의 투여는 헵시딘의 활성 및/또는 수준을 감소시키고, 따라서 빈혈증의 치료에 유용하다. 일 실시형태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 환자에서 헵시딘의 활성 또는 수준을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 환자에게 BMP6에 대한 항체 또는 이의 결합 단편을 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 헵시딘의 활성 또는 수준은 적어도 50%만큼 감소된다.
헵시딘에 대한 억제제, 예컨대 BMP6 항체는 헵시딘-관련 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이는, 헵시딘 및/또는 야생형 및/또는 돌연변이체 헵시딘의 돌연변이 및/또는 과발현과 연관된 임의의 질병, 및/또는 질병 진행이 헵시딘 및/또는 야생형 및/또는 돌연변이체 헵시딘의 돌연변이 및/또는 과발현의 존재 및/또는 소변을 통한 헵시딘의 감소된 신장 제거(renal elimination)에 의해 증강되거나 예후가 악화되는 질병을 포함한다. 헵시딘-관련 질병의 비제한적인 예는: 빈혈증, 철-부족 적혈구 생성, 저철혈증, 저하된 식이성 철 섭취, 철 격리, 염증의 빈혈증(AI), 아테롬성 동맥경화증, 당뇨병 및 다발성 신경변성 장애, 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병 및 프리드리히 실조증(Friedrich's ataxia), 심부전, 만성 신장 질병, 심장콩팥-빈혈증 증후군, 감염, 실혈, 용혈, 비타민 B12 또는 엽산 부족, 부갑상선 기능항진, 헤모글로빈병증 및 악성물, 암, AIDS, 수술, 왜소 성장(stunted growth) 및/또는 탈모를 포함한다. 일 실시형태에서, 대상체는 투석 환자이다. 일 실시형태에서, 헵시딘-관련 질병은 빈혈증이고, 대상체는 투석 환자이다. 철 및 ESA-불응성 빈혈증의 유병률(prevalence)은 만성 혈액투석 집단에서 높다.
빈혈증은 특히, 만성 질병 빈혈증(ACD), 만성 신장 질병(CKD)의 빈혈증, 암의 빈혈증, 적혈구 생성 자극제(ESA) 내성 빈혈증, 및/또는 철-제한성 빈혈증을 포함한다.
CKD의 빈혈증은 만성 신장 질병의 보편적인 초기 합병증이다. 암의 빈혈증은 혈액학적 악성물 및 일부 고형 종양에 의해 유발된다. 본원에 정의된 바와 같이, 이 용어는 또한, 화학치료제에 의해 유발되는 빈혈증인 화학요법-유도 빈혈증을 포함한다. 만성 신장 질병에서 빈혈증은 당뇨병성 신경병증, 심혈관 질환, 망막병증 및 다른 문제들을 악화시킬 수 있다. 암-관련 빈혈증은 증가된 사망 위험률과 연관이 있다.
일부 만성 질병, 예컨대 암, 신장 질병 및 자가면역 장애는 빈혈증을 초래할 수 있다. 과활성 염증성 사이토카인은 철 항상성의 조절장애, 적혈구 생성의 감소 및 적혈구 수명의 저하를 유발할 수 있다. 일부 빈혈증 치료는 ESA, 에리스로포이에틴, 철(식이성 보조제로서)의 투여 또는 수혈을 포함한다.
헵시딘은 철 항상성에 관여하는 주된 호르몬이다. 높은 수준의 헵시딘은 ACD에서 철-제한성 적혈구 생성과 연관이 있어 왔다. BMP6는 헵시딘의 발현을 증가시키는 것으로 공지되어 있다.
BMP6에 대한 다양한 유형의 항체 및 이의 항원-결합 단편들은 하기에 기재되어 있다.
상동성 항체
보다 다른 실시형태에서, 본 발명은 표 1 및/또는 표 14에 기재된 서열에 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 항체는 BMP6에 결합하며, 표 1 및/또는 표 14에 기재된 항체의 요망되는 기능적 특성을 보유한다.
예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체(또는 이의 기능성 항원-결합 단편)를 제공하며, 여기서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 16; 36; 56; 또는 76으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하며; 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 26; 46; 66; 또는 86으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하며; 항체는 BMP6 단백질에 특이적으로 결합하고, 항체는 용혈 검정법에서 적혈구 용해를 억제할 수 있고, 여기서, 용혈 검정법은 당업계에 공지되어 있다. 구체적인 예에서, 이러한 항체는 100 pM 인간 BMP6로 재구성된 인간 BMP6-고갈 혈청을 사용하는 경우, 용혈 검정법에서 20-200 pM의 IC50 값을 가진다.
일 실시형태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 표 1 및/또는 표 14에 제시된 서열과 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 일 실시형태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 제외하고는 동일할 수 있다. 표 1 및/또는 표 14에 기재된 것들의 VH 및 VL 영역과 높은(즉, 80% 이상) 동일성을 갖는 VH 및 VL 영역을 갖는 항체는, SEQ ID NO: 16; 36; 56; 또는 76; 및 26; 46; 66; 또는 86을 각각 인코딩하는 핵산 분자의 돌연변이생성(예컨대 부위-특이적 또는 PCR-매개 돌연변이생성), 및 후속해서 인코딩된 변경된 항체를 보유된 기능에 대해 본원에 기재된 기능성 검정법을 사용하여 시험함으로써 수득될 수 있다.
일 실시형태에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 아미노산 서열은 표 1 및/또는 표 14에 제시된 서열과 50% 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. SEQ ID NO: 18; 38; 58; 또는 78 중 임의의 전장 중쇄 및 SEQ ID NO: 28; 48; 68 또는 88 중 임의의 전장 경쇄와 각각 높은(즉, 80% 이상) 동일성을 갖는 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 갖는 항체는, 이러한 폴리펩타이드를 각각 인코딩하는 핵산 분자의 돌연변이생성(예컨대 부위-특이적 또는 PCR-매개 돌연변이생성), 및 후속해서 인코딩된 변경된 항체를 보유된 기능에 대해 본원에 기재된 기능성 검정법을 사용하여 시험함으로써 수득될 수 있다.
일 실시형태에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 뉴클레오타이드 서열은 표 1 및/또는 표 14에 제시된 서열과 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.
일 실시형태에서, 중쇄 및/또는 경쇄 뉴클레오타이드 서열의 가변 영역은 표 1 및/또는 표 14에 제시된 서열과 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 2개의 서열들 사이에서 동일성 퍼센트는 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수로서(즉, 동일성 %는 동일한 위치의 수/위치의 총 수 × 100과 동일함), 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하며, 이들은 2개 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있다. 2개 서열들 사이에서 서열의 비교 및 동일성 퍼센트의 결정은 하기 비제한적 예에 기재된 바와 같이 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 본 발명의 단백질 서열은 예를 들어 관련 서열을 식별하기 위해 공개 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "쿼리 서열"로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 검색은 문헌[Altschul, et al., 1990 J. Mol. Biol. 215:403-10]의 BLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다.
보존적 변형을 갖는 항체
일 실시형태에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가지며, 여기서, 이들 CDR 서열 중 하나 이상은 본원에 기재된 항체 또는 이의 보존적 변형을 기초로 명시된 아미노산 서열을 가지고, 항체는 본 발명의 BMP6-결합 항체 및 이의 항원-결합 단편의 요망되는 기능적 특성을 보유한다. 이에, 본 발명은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역으로 구성된 단리된 모노클로날 항체, 또는 이의 기능성 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서: 중쇄 가변 영역 CDR1은 SEQ ID NO: 29, 49, 69, 12, 32, 52, 72 또는 9 중 임의로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변이체를 포함하며; 중쇄 가변 영역 CDR2는 SEQ ID NO: 10, 30, 50, 70, 13, 33, 53 또는 73 중 임의로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변이체를 포함하며; 중쇄 가변 영역 CDR3은 SEQ ID NO: 11, 31, 51, 71, 14, 34, 54 또는 74 중 임의로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변이체를 포함하며; 경쇄 가변 영역 CDR1은 SEQ ID NO: 19, 39, 59, 79, 22, 42, 62 또는 82 중 임의로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변이체를 포함하며; 경쇄 가변 영역 CDR2는 SEQ ID NO: 20, 40, 60, 80, 23, 43, 63 또는 83 중 임의로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR3은 SEQ ID NO: 21, 41, 61, 81, 24, 44, 64 또는 84 중 임의로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변이체를 포함하며; 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 BMP6에 특이적으로 결합하고, 용혈 검정법에서 적혈구 용해를 억제한다.
일 실시형태에서, 포유류 세포에서 발현을 위해 최적화된 본 발명의 항체는 전장 중쇄 서열 및 전장 경쇄 서열을 가지며, 여기서, 이들 서열 중 하나 이상은 본원에 기재된 항체 또는 이의 보존적 변형을 기초로 명시된 아미노산 서열을 가지고, 항체는 본 발명의 BMP6-결합 항체 및 이의 항원-결합 단편의 요망되는 기능적 특성을 보유한다. 이에, 본 발명은 전장 중쇄 및 전장 경쇄로 구성되며 포유류 세포에서 발현을 위해 최적화된 단리된 모노클로날 항체를 제공하며, 여기서: 전장 중쇄는 SEQ ID NO: 18; 38; 58; 또는 78의 군으로부터 선택된 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형을 갖고; 전장 경쇄는 SEQ ID NO: 28; 48; 68 또는 88의 군으로부터 선택된 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형을 가지며; 항체는 BMP6에 특이적으로 결합하고; 항체는 본원에 기재된 바와 같이 용혈 검정법에서 적혈구 용해를 억제한다. 구체적인 실시형태에서, 이러한 항체는 100 pM 인간 BMP6로 재구성된 인간 BMP6-고갈 혈청을 사용하는 경우, 용혈 검정법에서 20-200 pM의 IC50 값을 가진다.
동일한 에피토프에 결합하는 항체
본 발명은 표 1 및/또는 표 14에 열거된 BMP6-결합 항체가 결합하는 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 항체 7에 의해 결합된 에피토프는 도 5에 나타나 있다. 따라서, 추가의 항체는, BMP6 결합 검정법에서 본 발명의 다른 항체 및 이의 항원-결합 단편과 교차-경쟁하는(예컨대 이의 결합을 통계학적으로 유의한 방식으로 경쟁적으로 억제하는) 능력을 기초로 식별될 수 있다. 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편과 BMP6 단백질의 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은, 이러한 시험 항체가 BMP6와의 결합에 대해 해당 항체와 경쟁할 수 있으며; 이러한 항체는 비제한적 이론에 따르면, 상기 항체가 경쟁하는 항체와 마찬가지로 BMP6 상의 동일한 또는 관련된(예컨대 구조적으로 유사한 또는 공간적으로 근접한) 에피토프에 결합할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편처럼 BMP6 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간 모노클로날 항체이다. 이러한 인간 모노클로날 항체는 본원에 기재된 바와 같이 제조되고 단리될 수 있다.
일단, 항원 상의 요망되는 에피토프가 결정되며, 예를 들어 본 발명에 기재된 기술을 사용하여 해당 에피토프에 대한 항체를 발생시키는 것이 가능하다. 대안적으로, 발견 과정 동안, 항체의 발생 및 특징화는 바람직한 에피토프에 대한 정보를 명시할 수 있다. 그 후에 이 정보로부터, 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 경쟁적으로 스크리닝하는 것이 가능하다. 이를 달성하기 위한 접근법은, 서로 경쟁적으로 결합하는 항체, 예를 들어 항원에 결합하기 위해 경쟁하는 항체를 찾기 위해 교차-경쟁 연구를 수행하는 것이다. 이들의 교차-경쟁을 기초로 한 항체를 "탈락(binning)"시키기 위한 고 처리량 과정은 국제 특허 출원 WO 2003/48731에 기재되어 있다. 당업자가 이해하게 될 바와 같이, 실제로 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 것은 에피토프일 수 있을 것이다. 에피토프는 항체가 결합하는 잔기를 포함할 수 있다.
일반적으로, 특정 표적 항원에 특이적인 항체는, 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물 내의 표적 항원 상의 에피토프를 우선적으로 인지할 것이다.
에피토프를 포함하는 주어진 폴리펩타이드의 영역은 당업계에 잘 공지된 임의의 수의 에피토프 맵핑 기술을 사용하여 식별될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey]를 참조한다. 예를 들어, 선형 에피토프는 예를 들어, 고체 지지체 상에서 다수의 펩타이드들을 동시에 합성하고, 펩타이드를 여전히 지지체에 부착시킨 채 이러한 펩타이드를 항체와 반응시킴으로써 결정될 수 있으며, 상기 펩타이드는 단백질 분자의 일부에 상응한다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 4,708,871; 문헌[Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715]에 기재되어 있다. 유사하게는, 구조적 에피토프는 아미노산 BMP6의 공간적 배치를 예를 들어, 수소/중수소 교환, x-선 결정학 및 2-차원 핵 자기 공명에 의해 결정함으로써 쉽게 식별된다. 예를 들어, 상기 에피토프 맵핑 프로토콜을 참조한다. 단백질의 항원 영역 또한, 표준 항원성 및 수치요법 플롯(hydropathy plot), 예컨대 Oxford Molecular Group사로부터 입수 가능한 Omiga 버전 1.0 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계산된 것을 사용하여 식별될 수 있다. 이 컴퓨터 프로그램은 항원성 프로파일을 결정하기 위해 홉/우즈(Hopp/Woods) 방법을 이용하고(문헌[Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828]); 수치요법 플롯을 위해서는 카이트/둘리틀(Kyte-Doolittle) 기술을 이용한다(문헌[Kyte et al., (1982) J.MoI. Biol. 157:105-132]).
조작된 및 변형된 항체
나아가, 본 발명의 항체는 변형된 항체를 조작하기 위한 시작 물질로서 본원에 제시된 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있으며, 이러한 변형된 항체는 시작 항체로부터 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 1개 또는 2개의 가변 영역(즉, VH 및/또는 VL), 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역 내 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 항체는 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시키기 위해, 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다.
수행될 수 있는 하나의 유형의 가변 영역 조작은 CDR 이식(grafting)이다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유에서, CDR 내의 아미노산 서열은 개별 항체들 사이에서 CDR 외부의 서열보다 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 책임지기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상으로 이식된 특이적 천연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특이적 천연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다(예컨대 문헌[Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033]; Winter의 미국 특허 5,225,539 및 Queen 등의 미국 특허 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 참조).
이러한 프레임워크 서열은 저민(germine) 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참조문헌으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 저민 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식선 서열 데이터베이스(인터넷 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase 상에서 입수 가능함), 뿐만 아니라 문헌[Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798; 및 Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836]에서 찾을 수 있으며; 이들은 각각 그 내용이 원용에 의해 본 명세서에 표현적으로 포함된다.
본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편에 사용하기 위한 프레임워크 서열의 일례는, 본 발명의 선별된 항체 및 이의 항원-결합 단편에 의해 사용된 프레임워크 서열, 예를 들어, 컨센서스(consensus) 서열 및/또는 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것들이다. VH CDR1, 2 및 3 서열 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은, 프레임워크 서열이 유래되는 생식선 면역글로불린 유전자에서 확인되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역 상으로 이식될 수 있거나, CDR 서열은 생식선 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역 상으로 이식될 수 있다. 예를 들어, 소정의 경우, 항체의 항원 결합 능력을 유지시키거나 증강시키기 위해 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이화하는 것이 유익한 것으로 확인되었다(예컨대 Queen 등의 미국 특허 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 참조).
또 다른 유형의 가변 영역 변형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이화하여, 이로써 관심 항체의 하나 이상의 결합 특성(예컨대 친화도)을 향상시키는 것이며, 이는 "친화도 성숙"으로 공지되어 있다. 부위-특이적 돌연변이생성 또는 PCR-매개 돌연변이생성은 돌연변이(들)를 도입하기 위해 수행될 수 있고, 항체 결합 또는 다른 관심 기능적 특성에 미치는 효과는 본원에 기재되고 실시예에 제공된 바와 같이 시험관내 또는 생체내 검정법에서 평가될 수 있다. 보존적 변형(상기 고찰된 바와 같음)이 도입될 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 첨가 또는 결실일 수 있다. 더욱이, 전형적으로 CDR 영역 내의 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.
대안적인 프레임워크 또는 스캐폴드 내로의 항원-결합 도메인 이식
광범위하게 다양한 항체/면역글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드는, 생성된 폴리펩타이드가 BMP6에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합 영역을 포함하는 한, 이용될 수 있다. 이러한 프레임워크 또는 스캐폴드는 5개의 주요 이디오타입(idiotype)의 인간 면역글로불린, 이의 항원-결합 단편을 포함하고, 바람직하게는 인간화된 양태를 갖는, 다른 동물 종의 면역글로불린을 포함한다. 낙타과(camelid)에서 식별된 것들과 같은 단일 중쇄 항체가 이러한 측면에서 특히 관심 있다. 신규 프레임워크, 스캐폴드 및 단편은 당업자에 의해 계속해서 발견 및 개발된다.
일 양태에서, 본 발명은, 본 발명의 CDR이 이식될 수 있는 비-면역글로불린 스캐폴드를 사용하여 비-면역글로불린-기반 항체를 발생시키는 방법에 관한 것이다. 공지된 또는 미래의 비-면역글로불린 프레임워크 및 스캐폴드는, 이들이 표적 BMP6 단백질에 특이적인 결합 영역을 포함하는 한, 이용될 수 있다. 공지된 비-면역글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드는 피브로넥틴(Compound Therapeutics, Inc., Waltham, Mass.), 안키린(Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland), 도메인 항체(Domantis, Ltd., Cambridge, Mass. 및 Ablynx nv, Zwijnaarde, Belgium), 리포칼린(Pieris Proteolab AG, Freising, Germany), 소형 모듈 면역-약제(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, Wash.), 맥시바디(maxybody)(Avidia, Inc., Mountain View, Calif.), 단백질 A(Affibody AG, Sweden) 및 아필린(affilin)(감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴)(SciI Proteins GmbH, Halle, Germany)을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
피브로넥틴 스캐폴드는 피브로넥틴 유형 III 도메인(예컨대 제10 모듈의 피브로넥틴 유형 III(10 Fn3 도메인))을 기초로 한다. 피브로넥틴 유형 III 도메인은 2개의 베타 병풍들 사이에 분포되고 그 자체가 서로에 대해 충전되어 단백질 코어를 형성하는 7 또는 8개의 베타 가닥을 가지고, 추가로, 베타 가닥을 서로 연결하고 용매 노출되는 루프(CDR과 유사함)를 함유한다. 베타 병풍 샌드위치의 각각의 모서리에는 이러한 루프가 적어도 3개 존재하며, 여기서, 모서리는 베타 가닥의 방향에 수직인 단백질의 경계이다(미국 특허 6,818,418 참조). 이들 피브로넥틴-기반 스캐폴드는, 전체 폴드(overall fold)가, 낙타 및 라마 IgG에 전체 항원 인지 단위를 포함하는 최소 기능성 항체 단편, 중쇄의 가변 영역과 밀접하게 관련이 있더라도, 면역글로불린이 아니다. 이러한 구조때문에, 비-면역글로불린 항체는 성질 및 친화도 면에서 항체와 유사한 항원 결합 특성을 모방한다. 이들 스캐폴드는, 생체내에서 항체의 친화도 성숙 과정과 유사한 루프 무작위화 및 시험관내 셔플링 전략에 사용될 수 있다. 이들 피브로넥틴-기반 분자는, 분자의 루프 영역이 표준 클로닝 기술을 사용하여 본 발명의 CDR로 대체될 수 있는 스캐폴드로서 사용될 수 있다.
안키린 기술은 안키린-유래 반복 모듈을 갖는 단백질을, 상이한 표적에 대한 결합에 사용될 수 있는 가변 영역을 갖기 위한 스캐폴드로서 사용하는 것을 기초로 한다. 안키린 반복 모듈은 2개의 역평행 알파-나선 및 베타-턴으로 구성된 33개의 아미노산 폴리펩타이드이다. 가변 영역의 결합은 리보좀 디스플레이를 사용함으로써 대체로 최적화된다.
아비머(avimer)는 단백질, 예컨대 LRP-1을 함유하는 천연 A-도메인으로부터 유래된다. 이들 도메인은 본래 단백질-단백질 상호작용에 사용되고, 인간에서 250개가 넘는 단백질이 구조적으로 A-도메인을 기초로 한다. 아비머는 아미노산 링커를 통해 연결된 많은 상이한 "A-도메인" 단량체(2-10)들로 구성된다. 표적 항원에 결합할 수 있는 아비머는 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 20040175756; 20050053973; 20050048512; 및 20060008844에 기재된 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
아피바디(affibody) 친화도 리간드는 단백질 A의 IgG-결합 도메인들 중 하나의 스캐폴드를 기초로 한 3-나선 꾸러미로 구성된 작고 단순한 단백질이다. 단백질 A는 스타필로콕커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 박테리아로부터의 표면 단백질이다. 이러한 스캐폴드 도메인은 58개의 아미노산으로 구성되며, 이들 중 13개의 아미노산은 다수의 리간드 변이체들을 갖는 아피바디 라이브러리를 발생시키기 위해 무작위화된다(예컨대 미국 특허 5,831,012 참조). 아피바디 분자는 150 kDa인 항체의 분자량과 비교하여, 6 kDa의 분자량을 갖는 항체를 모방한다. 이의 작은 크기에도 불구하고, 아피바디 분자의 결합 부위는 항체의 결합 부위와 유사하다.
안티칼린은 Pieris ProteoLab AG사에 의해 개발된 제품이다. 이들 안티칼린은, 화학적으로 감수성이거나 불용성인 화합물의 생리학적 수송 또는 저장에 통상적으로 관여하는 작고 강력한 단백질들의 광범위한 그룹인 리포칼린으로부터 유래된다. 몇몇 천연 리포칼린은 인간 조직 또는 체액에서 발생한다. 단백질 구조는 면역글로불린을 연상시키며, 초가변 루프는 강성(rigid) 프레임워크의 상부 상에 존재한다. 그러나, 항체 또는 이들의 재조합 단편과는 대조적으로, 리포칼린은 160 내지 180개 아미노산 잔기를 갖는 단일 폴리펩타이드 사슬로 구성되며, 이는 단일 면역글로불린 도메인보다 딱 미미하게 크다. 결합 포켓을 형성하는 4개 루프들의 세트는 확연한 구조적 가소성(structural plasticity)을 보여주고, 여러 가지 측쇄들을 관용한다. 따라서, 결합 부위는 상이한 모양의 규정된 표적 분자를 고 친화도 및 특이성으로 인지하기 위해 프로프리에터리 과정(proprietary process)에서 개조될 수 있다. 리포칼린 패밀리의 하나의 단백질인 피에리스 브라씨카에(Pieris Brassicae)의 빌린(bilin)-결합 단백질(BBP)은 4개 루프의 세트에 돌연변이를 일으킴으로써 안티칼린을 개발하는 데 사용되어 왔다. 안티칼린을 기재하는 특허 출원의 일례는 PCT 공개 WO 199916873에 있다.
아필린 분자는, 단백질 및 저분자에 대해 특이적인 친화도를 갖도록 디자인된 작은 비-면역글로불린 단백질이다. 새로운 아필린 분자는 2개의 라이브러리들로부터 매우 신속하게 선별될 수 있으며, 이들 라이브러리는 각각 상이한 인간-유래 스캐폴드 단백질을 기초로 한다. 아필린 분자는 면역글로불린 단백질과 임의의 구조적 상동성을 보여주지 않는다. 현재, 2개의 아필린 스캐폴드들이 이용되며, 이들 스캐폴드 중 하나는 인간의 구조적 눈 렌즈 단백질인 인간 감마 크리스탈린이고, 또 다른 하나는 "유비퀴틴" 슈퍼패밀리 단백질"이다. 2개의 인간 스캐폴드 모두 매우 작으며, 높은 온도 안정성을 보여주고, pH 변화 및 변성제에 대해 대체로 내성이다. 이러한 높은 안정성은 주로, 단백질의 확장된 베타 병풍 구조로 인한 것이다. 감마 크리스탈린-유래 단백질의 예는 WO200104144에 기재되어 있고, "유비퀴틴-유사" 단백질의 예는 WO2004106368에 기재되어 있다.
단백질 에피토프 모방체(PEM)는, 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 주요 2차 구조인, 단백질의 베타-헤어핀 2차 구조를 모방하는 중간-크기의 환형 펩타이드-유사 분자(MW 1 내지 2 kDa)이다.
인간 BMP6-결합 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 휴머니어링(humaneering) 기술은 비-인간 항체를 조작된 인간 항체로 전환시키는 데 사용된다. 미국 특허 공개 20050008625는, 비인간 항체의 결합 특징과 비례하여 동일한 결합 특징을 유지하거나 더 양호한 결합 특징을 제공하면서도, 항체 내의 비인간 항체 가변 영역을 인간 가변 영역으로 대체하기 위한 생체내 방법을 기재하고 있다. 이러한 방법은 비-인간 참조 항체의 가변 영역을 완전 인간 항체로 에피토프-가이드 대체하는 것에 의존한다. 생성된 인간 항체는 일반적으로, 참조 비인간 항체와 구조적으로 관련이 없지만, 참조 항체와 동일한 항원 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 간략하게는, 일련의 에피토프-가이드 상보성 대체 접근법은, 항원에 대한 시험 항체의 결합에 반응하는 리포터 시스템의 존재 하에, 제한된 양의 항원에 대한 결합을 위해 세포 내에서 "경쟁자"와 참조 항체("레스트(lest) 항체")의 다양한 하이브리드들의 라이브러리 사이에서 경쟁을 설정함으로써 가능해진다. 경쟁자는 참조 항체 또는 이의 유도체, 예컨대 단일-사슬 Fv 단편일 수 있다. 경쟁자는 또한, 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항원의 천연 또는 인공 리간드일 수 있다. 경쟁자의 유일한 요건은, 이러한 경쟁자가 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하고, 이러한 경쟁자가 항원 결합을 위해 참조 항체와 경쟁하는 것이다. 시험 항체는 비인간 참조 항체로부터 공통적인 하나의 항원-결합 V-영역, 및 다양한 공급원, 예컨대 인간 항체의 레퍼토리 라이브러리로부터 무작위로 선별된 다른 V-영역을 가진다. 참조 항체로부터의 공통적인 V-영역은 가이드로서 역할을 하며, 시험 항체를 항원 상의 동일한 에피토프 상에 동일한 배향에서 위치시켜, 선별이 참조 항체에 대한 최고 항원-결합 충실도(fidelity) 쪽으로 평향된다.
많은 유형의 리포터 시스템들이 시험 항체와 항원 사이의 요망되는 상호작용을 검출하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상보적 리포터 단편은 항원 및 시험 항체에 각각 연결될 수 있으며, 따라서 단편 상보에 의한 리포터 활성화는 시험 항체가 항원에 결합할 때만 발생한다. 시험 항체- 및 항원-리포터 단편 융합이 경쟁자와 공동-발현되는 경우, 리포터 활성화는 경쟁자와 경쟁하는 시험 항체의 능력에 의존적이게 되고, 이러한 능력은 항원에 대한 시험 항체의 친화도에 비례한다. 사용될 수 있는 다른 리포터 시스템은 미국 특허 출원 일련 번호 10/208,730(공개 20030198971)에 개시된 바와 같은 자동-억제성 리포터 재활성화 시스템(RAIR) 또는 미국 특허 출원 일련 번호 10/076,845(공개 20030157579)에 개시된 경쟁적 활성화 시스템을 포함한다.
일련의 에피토프-가이드 상보성 대체 시스템을 이용하여, 경쟁자, 항원 및 리포터 구성성분와 마찬가지로 단일 시험 항체를 발현하는 세포를 식별하기 위해 선별이 수행된다. 이들 세포에서, 각각의 시험 항체는 제한된 양의 항원에 결합하기 위해 경쟁자와 일-대-일로 경쟁한다. 리포터의 활성은 시험 항체에 결합된 항원의 양에 비례하며, 이는 다시 항원에 대한 시험 항체의 친화도 및 시험 항체의 안정성에 비례한다. 시험 항체는 처음에, 시험 항체로서 발현된 경우, 참조 항체의 활성과 비례하여 이들 시험 항체의 활성을 기준으로 하여 선별된다. 제1회의 선별 결과는 "하이브리드" 항체 세트이며, 이들 항체는 각각 참조 항체로부터의 동일한 비-인간 V-영역 및 라이브러리로부터의 인간 V-영역으로 구성되고, 이들 항체는 각각 항원 상의, 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 제1회에서 선별된 하나 이상의 하이브리드 항체는 참조 항체와 유사하거나 더 높은, 항원에 대한 친화도를 가질 것이다.
제2 V-영역 대체 단계에서, 제1 단계에서 선별된 인간 V-영역은 잔여 비-인간 참조 항체 V-영역을 동족 인간 V-영역의 다양한 라이브러리로 인간 대체의 선별을 위한 가이드로서 사용된다. 제1회에서 선별된 하이브리드 항체는 또한, 제2회의 선별을 위한 경쟁자로서 사용될 수 있다. 제2회의 선별 결과는, 참조 항체와 구조적으로 상이하지만 동일한 항원에 결합하기 위해 참조 항체와 경쟁하는 완전 인간 항체의 세트이다. 선별된 인간 항체들 중 일부는 참조 항체와 동일한 항원 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 이들 선별된 인간 항체들 중에서, 하나 이상은 동일한 에피토프에, 참조 항체의 친화도와 유사하거나 고 친화도로 결합한다.
상기 기재된 마우스 또는 키메라 BMP6-결합 항체들 중 하나를 참조 항체로서 사용하여, 이러한 방법은, 인간 BMP6에 동일한 결합 특이성 및 동일하거나 더 양호한 결합 친화도로 결합하는 인간 항체를 발생시키는 데 쉽게 이용될 수 있다. 또한, 이러한 인간 BMP6-결합 항체는 인간 항체를 통상적으로 제조하는 회사들, 예를 들어, KaloBios, Inc.사(Mountain View, Calif.)로부터 상업적으로 수득될 수 있다.
낙타과 항체
신세계 구성원, 예컨대 라마 종(라마 팍코스(Lama paccos), 라마 글라마(Lama glama) 및 라마 비쿠그나(Lama vicugna))을 포함하여 낙타 및 단봉 낙타(카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus) 및 카멜루스 드로마데리우스(Calelus dromaderius)) 과(family)의 구성원들로부터 수득된 항체 단백질은 크기, 구조적 복합성 및 인간 대상체에 대한 항원성에 관하여 특징화되어 왔다. 자연상에서 발견되는 바와 같은 이러한 포유류 과로부터의 소정의 IgG 항체에는 경쇄가 결여되어 있고, 따라서 이러한 항체는, 다른 동물로부터의 항체의 경우 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 전형적인 4개 사슬 4차 구조로부터 구조적으로 구별된다. PCT/EP93/02214(1994년 3월 3일에 공개된 WO 94/04678)를 참조한다.
VHH로서 식별된 작은 단일 가변 도메인인 낙타과 항체의 영역은, 표적에 대해 고 친화도를 갖는 작은 단백질을 수득하기 위해 유전자 조작에 의해 수득될 수 있으며, 이로써 "낙타과 나노바디"로 공지된 저분자량 중량 항체-유래 단백질이 초래된다. 1998년 6월 2일에 발행된 미국 특허 5,759,808을 참조하며; 또한, 문헌[Stijlemans, B. et al., 2004 J BiolChem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; 및 Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520]을 참조한다. 낙타과 항체 및 항체 단편의 조작된 라이브러리는 예를 들어 벨기에 헨트 소재의 Ablynx사로부터 상업적으로 입수 가능하다. 비-인간 기원의 다른 항체 및 이의 항원-결합 단편과 같이, 낙타과 항체의 아미노산 서열은 재조합적으로 변경되어 인간 서열을 더 밀접하게 닮은 서열이 수득될 수 있으며, 즉, 나노바디가 "인간화"될 수 있다. 따라서, 인간에 대한 낙타과 항체의 천연적으로 낮은 항원성이 더 감소될 수 있다.
낙타과 나노바디는 인간 IgG 분자의 분자량의 대략 1/10의 분자량을 가지며, 단백질은 단지 수 나노미터의 물리적 직경을 가진다. 작은 크기로 인한 하나의 결과는, 더 큰 항체 단백질에게는 기능적으로 보이지 않는 항원 부위에 결합하는 낙타과 나노바디의 능력으로서, 즉, 낙타과 나노바디는, 그렇지 않으면 은폐적인 항원을 전형적인 면역학적 기술을 사용하여 검출하는 시약으로서, 및 가능한 치료제로서 유용하다. 따라서, 작은 크기로 인한 보다 다른 결과는, 낙타과 나노바디가 표적 단백질의 홈 또는 좁은 틈에서 특이적 부위에 결합한 결과 억제할 수 있고, 따라서, 전형적인 항체의 기능보다는 전형적인 저분자량 약물의 기능을 더 밀접하게 닮은 수용력(capacity)에서 역할을 할 수 있다.
저분자량 및 소형 크기는 추가로, 극도로 내열성이며, 극도의 pH 및 단백용해 분해에 대해 안정하고, 불량하게 항원성인 낙타과 나노바디를 초래한다. 또 다른 결과는, 낙타과 나노바디가 순환계로부터 조직 내로, 심지어 뇌혈관 장벽을 가로질러 쉽게 이동하고, 신경 조직에 영향을 주는 장애를 치료할 수 있다는 것이다. 나아가, 나노바디는 뇌혈관 장벽을 가로질러 약물 수송을 용이하게 할 수 있다. 2004년 8월 19일에 공개된 미국 특허 출원 20040161738을 참조한다. 인간에 대한 낮은 항원성과 조합된 이들 특징은 큰 치료적 잠재성을 가리킨다. 나아가, 이들 분자는 원핵 세포, 예컨대 이. 콜라이에서 완전히 발현될 수 있고, 박테리오파지와 융합 단백질로서 발현되고, 기능적이다.
이에, 본 발명의 특징은 BMP6에 대해 고 친화도를 갖는 낙타과 항체 또는 나노바디이다. 본원의 일 실시형태에서, 낙타과 항체 또는 나노바디는 낙타과 동물에서 천연적으로 제조되며, 즉, BMP6 또는 이의 펩타이드 단편을 다른 항체에 대해 본원에 기재된 기술을 사용하여 면역화한 후 낙타과에 의해 제조된다. 대안적으로, BMP6-결합 낙타과 나노바디는 조작되며, 즉, 예를 들어 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 표적으로서 BMP6를 이용하는 패닝 절차(panning procedure)를 사용하여 적절하게 돌연변이생성된 낙타과 나노바디 단백질을 나타내는 파지 라이브러리로부터의 선별에 의해 제조된다. 조작된 나노바디는 추가로, 수령자(recipient) 대상체에서 45분 내지 2주의 반감기를 갖도록 유전자 조작에 의해 맞춤화될 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 낙타과 항체 또는 나노바디는 예를 들어 PCT/EP93/02214에 기재된 바와 같이 본 발명의 인간 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR 서열을 나노바디 또는 단일 도메인 항체 프레임워크 서열 내로 이식함으로써 수득된다.
이중특이적 분자 및 다가 항체
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 BMP6-결합 항체 또는 이의 단편을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 또 다른 기능성 분자, 예를 들어 또 다른 펩타이드 또는 단백질(예컨대 수용체에 대한 또 다른 항체 또는 리간드)로 유도체화되거나 연결되어, 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 발생시킬 수 있다. 본 발명의 항체는 사실상, 1개 초과의 다른 기능성 분자로 유도체화되거나 연결되어, 2개 초과의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중-특이적 분자를 발생시킬 수 있으며; 이러한 다중-특이적 분자 또한, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "이중특이적 분자"에 포함되고자 한다. 본 발명의 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체는 하나 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 항체 단편, 펩타이드 또는 결합 모방체에 기능적으로(예컨대 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 결합 또는 다른 방법에 의해) 연결될 수 있으며, 따라서 이중특이적 분자가 초래된다.
이에, 본 발명은 BMP6에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다. 예를 들어, 제2 표적 에피토프는 제1 표적 에피토프와 상이한, BMP6의 또 다른 에피토프이다.
추가로, 이중특이적 분자가 다중-특이적인 본 발명에 대해, 이러한 분자는 제1 및 제2 표적 에피토프들 외에도 제3 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 분자는 적어도 하나의 항체 또는 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단쇄 Fv를 포함하여 이의 항체 단편을 결합 특이성으로서 포함한다. 항체는 또한, 경쇄 또는 중쇄 이량체 또는 이의 임의의 최소 단편, 예컨대 Ladner 등의 미국 특허 4,946,778에 기재된 바와 같은 Fv 또는 단쇄 구축물일 수 있다.
디아바디는 2가, 이중특이적 분자이며, 이 분자에서 VH 및 VL 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬 상에서 발현되고, 동일한 사슬 상의 2개의 도메인들 사이에서 쌍을 형성하기에는 너무 짧은 링커에 의해 연결된다. VH 및 VL 도메인은 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루며, 이로써, 2개의 항원 결합 부위를 생성한다(예컨대 문헌[Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poijak et al., 1994 Structure 2:1121-1123] 참조). 디아바디는 동일한 세포 내에서 구조 VHA-VLB 및 VHB-VLA(VH-VL 배치) 또는 VLA-VHB 및 VLB-VHA(VL-VH 배치)를 갖는 2개의 폴리펩타이드 사슬을 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 이들 대부분의 디아바디는 박테리아에서 가용성 형태로 발현될 수 있다. 단쇄 디아바디(scDb)는 2개의 디아바디-형성 폴리펩타이드 사슬들을 대략 15개 아미노산 잔기의 링커를 이용하여 연결함으로써 제조된다(문헌[Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45 (3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2 (1):21-36] 참조). scDb는 박테리아 내에서 가용성, 활성 단량체 형태로 발현될 수 있다(문헌[Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45 (34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2 (1):21-36; Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3 (2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9 (7):617-21] 참조). 디아바디는 Fc에 융합되어, "디-디아바디"를 발생시킬 수 있다(문헌[Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279 (4):2856-65] 참조).
본 발명의 이중특이적 분자에 이용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화된 모노클로날 항체이다.
본 발명의 이중특이적 분자는 구성원 결합 특이성을 본원에 공지된 방법을 사용하여 접합시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각각의 결합 특이성은 개별적으로 발생된 다음, 서로 접합될 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩타이드인 경우, 여러 가지 커플링제 또는 가교제가 공유 접합에 사용될 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-5-아세틸-티오아세테이트(SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(술포-SMCC)를 포함한다(예를 들어, 문헌[Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, M A et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법은 문헌[Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83) 및 Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것들을 포함한다. 접합제는 SATA 및 술포-SMCC이며, 이들은 둘 다 Pierce Chemical Co.사(Rockford, Ill.)로부터 입수 가능하다.
결합 특이성이 항체인 경우, 이들은 2개의 중쇄의 C-말단 힌지의 술피드릴 결합에 의해 접합될 수 있다. 특정 실시형태에서, 힌지 영역은 접합 이전에 홀수, 예를 들어 1개의 술피드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
대안적으로, 2개의 결합 특이성들은 동일한 벡터 내에서 인코딩되고, 동일한 숙주 세포 내에서 발현 및 어셈블리될 수 있다. 이러한 방법은 특히, 이중특이적 분자가 mAb X mAb, mAb X Fab, Fab X F (ab')2 또는 리간드 X Fab 융합 단백질인 경우, 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 1개의 단쇄 항체 및 결합 결정기를 포함하는 단쇄 분자 또는 2개의 결합 결정기들을 포함하는 단쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 2개의 단쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자의 제조 방법은 예를 들어 미국 특허 5,260,203; 미국 특허 5,455,030; 미국 특허 4,881,175; 미국 특허 5,132,405; 미국 특허 5,091,513; 미국 특허 5,476,786; 미국 특허 5,013,653; 미국 특허 5,258,498; 및 미국 특허 5,482,858에 기재되어 있다.
이중특이적 분자들과 이들의 특이적 표적의 결합은 예를 들어, 효소-연결된 면역흡착 검정법(ELISA), 방사성면역검정(REA), FACS 분석, 생물검정법(예컨대 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯 검정법에 의해 확인될 수 있다.이들 검정법은 각각 일반적으로, 관심 복합체에 특이적인 표지된 시약(예컨대 항체)을 이용함으로써 특정 관심의 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 BMP6에 결합하는 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편의 적어도 2개의 동일한 또는 상이한 항원-결합부들을 포함하는 다가 화합물을 제공한다. 항원-결합부는 단백질 융합 또는 공유 또는 비공유 연결부를 통해 함께 연결될 수 있다. 대안적으로, 연결 방법은 이중특이적 분자에 대해 기재되어 왔다. 4가 화합물은 예를 들어, 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편을, 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편의 불변 영역, 예를 들어 Fc 또는 힌지 영역에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편과 가교함으로써 수득될 수 있다.
삼량체화 도메인은 예를 들어 보레안 특허(Borean patent) EP 1 012 280B1에 기재되어 있다. 오량체화 모듈은 예를 들어 PCT/EP97/05897에 기재되어 있다.
반감기가 연장된 항체
본 발명은 생체내에서 연장된 반감기를 갖는, BMP6에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
많은 인자들은 생체내에서 단백질의 반감기에 영향을 미친다. 예를 들어, 신장 여과, 간에서의 대사, 단백용해 효소(프로테아제)에 의한 분해 및 면역원성 반응(예컨대 항체에 의한 단백질 중화 및 대식세포 및 수지상세포에 의한 섭취). 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편의 반감기를 연장하기 위해 여러 가지 전략들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜(PEG), reCODE PEG, 항체 스캐폴드, 폴리시알산(PSA), 하이드록시에틸 전분(HES), 알부민-결합 리간드 및 탄수화물 차폐물에 대한 화학적 연결에 의해; 혈청 단백질, 예컨대 알부민, IgG, FcRn 및 트랜스페린g에 대한 단백질 결합에 대한 유전적 융합에 의해; 혈청 단백질을 결합하는 다른 결합 모이어티, 예컨대 나노바디, Fabs, DARPins, 아비머, 아피바디 및 안티칼린에 대한 커플링(유전적으로 또는 화학적으로)에 의해; rPEG, 알부민, 도메인 of 알부민, 알부민-결합 단백질 및 Fc에 대한 유전적 융합에 의해; 또는 나노담체, 지연 방출 제제 또는 의료 장치 내로의 혼입에 의해.
생체내에서 항체의 혈청 순환을 연장하기 위해, 불활성 중합체 분자, 예컨대 고분자량 PEG가, 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 PEG의 부위-특이적 접합을 통해, 또는 라이신 잔기 상에 존재하는 엡실론-아미노기를 통해, 다기능성 링커와 함께 또는 없이 항체 또는 이의 단편에 부착될 수 있다. 항체를 퍼길화하기 위해, 항체, 이의 항원-결합 단편은 전형적으로, 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)가 항체 또는 항체 단편에 부착되게 되는 조건 하에, PEG, 예컨대 PEG의 재활성 에스테르 또는 알데하이드 유도체와 반응한다. 퍼길화는 재활성 PEG 분자(또는 유사한 재활성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은, 다른 단백질을 유도체화하는 데 사용되어 온 임의의 형태의 PEG, 예컨대 모노(C1-C10)알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함하고자 한다. 일 실시형태에서, 퍼길화되는 항체는 아글리코실화된(aglycosylated) 항체이다. 생물학적 활성의 최소 손실을 초래하는 선형 또는 분지형 중합체 유도체화가 사용될 것이다. 접합도는, 항체에 대한 PEG 분자의 적당한 접합을 보장하기 위해 SDS-PAGE 및 질량 분석에 의해 밀접하게 모니터링될 수 있다. 미반응된 PEG는 크기-배제 또는 이온-교환 크로마토그래피에 의해 항체-PEG 접합체로부터 분리될 수 있다. PEG-유도체화된 항체는 당업자에게 잘 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 본원에 기재된 면역검정에 의해, 결합 활성뿐만 아니라 생체내 효능에 대해 시험될 수 있다. 단백질의 퍼길화 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편에 적용될 수 있다. 예를 들어, Nishimura 등의 EP 0 154 316 및 Ishikawa 등의 EP 0 401 384를 참조한다.
다른 변형된 퍼길화 기술은, 화학적으로 명시된 측쇄를 tRNA 신서타제(synthetase) 및 tRNA를 포함하는 재구성된 시스템을 통해 생합성 단백질 내로 혼입하는 화학적으로 직교 방향 조작 기술(ReCODE PEG)을 재구성하는 단계를 포함한다. 이러한 기술은 이. 콜라이, 효모 및 포유류 세포 내의 생합성 단백질 내로 30개 초과의 새로운 아미노산을 혼입할 수 있다. tRNA는 앰버 코돈이 위치하는 임의의 장소에 규범적인(normative) 아미노산을 혼입하여, 앰버를 정지 코돈으로부터, 화학적으로 명시된 아미노산의 혼입을 신호화하는 것으로 전환시킨다.
재조합 퍼길화 기술(rPEG)이 또한, 혈청 반감기 연장에 사용될 수 있다. 이러한 기술은 300 내지 600개 아미노산의 비구조화된 단백질 꼬리를 기존의 약제학적 단백질에 유전적으로 융합시키는 단계를 수반한다. 이러한 비구조화된 단백질 사슬의 자명한 분자량이 이의 실제 분자량보다 약 15배 더 크기때문에, 단백질의 혈청 반감기가 크게 증가된다. 화학적 접합 및 재정제(repurification)를 필요로 하는 전통적인 퍼길화와 대조적으로, 제조 과정은 크게 간략화되고, 생성물은 균질하다.
폴리시알화는 치료적 펩타이드 및 단백질의 활성 수명을 연장하고 안정성을 향상시키기 위해 천연 중합체 폴리시알산(PSA)을 사용하는 또 다른 기술이다. PSA는 시알산 중합체(당)이다. 폴리시알산은 단백질 및 치료적 펩타이드 약물 운반에 사용되는 경우, 접합에 보호적 미세환경을 제공한다. PSA는 순환에서 치료 단백질의 활성 수명을 증가시키고, 이러한 단백질이 면역계에 의해 인지되는 것을 방지한다. PSA 중합체는 인체 내에서 천연적으로 발견된다. 이러한 PSA는 수백만년에 걸쳐 진화한 소정의 박테리아에 의해, 이들 박테리아의 벽을 PSA로 코팅하도록 채택되었다. 그 후에, 이들 천연적으로 폴리시알화된 박테리아는 분자 모방 덕분에, 신체의 방어 시스템을 포장(foil)할 수 있었다. 자연의 궁극적인 잠행(stealth) 기술인 PSA는 이러한 박테리아로부터 대량으로 및 예정된 물리적 특징을 갖고, 쉽게 제조될 수 있다. 박테리아 PSA는 단백질에 커플링된 경우에조차, 이러한 박테리아 PSA가 인체 내의 PSA와 화학적으로 동일하기 때문에 완전히 비-면역원성이다.
또 다른 기술은 항체에 연결된 하이드록시에틸 전분("HES") 유도체의 사용을 포함한다. HES는 왁스질의(waxy) 옥수수 전분으로부터 유래된 변형된 천연 중합체이고, 신체의 효소에 의해 대사될 수 있다. HES 용액은 통상, 부족 혈액 용적을 치환하고 혈액의 유동학적 특성을 향상시키기 위해 투여된다. 항체의 허실화(hesylation)는 분자의 안정성을 증가시킴으로써, 뿐만 아니라 신장 청소율(renal clearance)을 감소시킴으로써 순환 반감기를 연장시킬 수 있고, 증가된 생물학적 활성을 초래한다. 상이한 매개변수들, 예컨대 HES의 분자량을 다르게 함으로써, 광범위한 HES 항체 접합체들이 맞춤화될 수 있다.
생체내에서 증가된 반감기를 갖는 항체는 또한, 하나 이상의 아미노산 변형(즉, 치환, 삽입 또는 결실)을 IgG 불변 도메인 또는 이의 FcRn 결합 단편(바람직하게는 Fc 또는 힌지 Fc 도메인 단편) 내로 도입하여 발생될 수 있다. 예를 들어, 국제 공개 WO 98/23289; 국제 공개 WO 97/34631; 및 미국 특허 6,277,375를 참조한다.
나아가, 항체는, 항체 또는 항체 단편을 생체내에서 더 안정하게 만들거나 생체내에서 더 긴 반감기를 갖기 위해 알부민에 접합될 수 있다. 기술은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 국제 공개 WO 93/15199, WO 93/15200 및 WO 01/77137; 및 유럽 특허 EP 413,622를 참조한다.
반감기를 증가시키기 위한 전략은 특히, 나노바디, 피브로넥틴-기반 결합제, 및 증가된 생체내 반감기가 요망되는 다른 항체 또는 단백질에 유용하다.
항체 접합체
본 발명은 융합 단백질을 발생시키기 위해, 이종성 단백질 또는 폴리펩타이드(또는 이의 항원-결합 단편, 바람직하게는 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100개 아미노산의 폴리펩타이드)에 재조합적으로 융합되거나 화학적으로 접합된(공유 및 비-공유 접합을 둘 다 포함) BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특히, 본 발명은 본원에 기재된 항체의 항원-결합 단편(예컨대 Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, F (ab)2 단편, VH 도메인, VH CDR, VL 도메인 또는 VL CDR) 및 이종성 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 항체 또는 항체 단편에 융합시키거나 접합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851 및 5,112,946; 유럽 특허 EP 307,434 및 EP 367,166; 국제 공개 WO 96/04388 및 WO 91/06570; 문헌[Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; 및 Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341]을 참조한다.
추가의 융합 단백질은 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링 및/또는 코돈-셔플링(통합해서 "DNA 셔플링"으로 지칭됨)을 통해 발생될 수 있다. DNA 셔플링은 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편(예컨대 더 높은 친화도 및 더 낮은 해리 속도를 갖는 항체 및 이의 항원-결합 단편)의 활성을 변경시키기 위해 이용될 수 있다. 일반적으로, 미국 특허 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252 및 5,837,458; 문헌[Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16 (2):76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; 및 Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24 (2):308-313]을 참조한다(이들 특허 및 공개는 각각 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 항체 및 이의 항원-결합 단편 또는 인코딩된 항체 및 이의 항원-결합 단편은 재조합 이전에, 오류-유발 PCR, 무작위 뉴클레오타이드 삽입 또는 다른 방법에 의해 무작위 돌연변이생성 처리됨으로써 변경될 수 있다. BMP6에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 이종성 분자의 하나 이상의 구성성분, 모티프, 섹션, 파트, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.
더욱이, 항체 및 이의 항원-결합 단편은 정제를 용이하게 하기 위해 마커 서열, 예컨대 펩타이드에 융합될 수 있다. 일 실시형태에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩타이드(SEQ ID NO: 97), 예컨대 특히 pQE 벡터에 제공된 태그(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311)이며, 이들 중 많은 것들이 상업적으로 입수 가능하다. 문헌[Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824]에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 헥사-히스티딘(SEQ ID NO: 97)은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩타이드 태그는, 인플루엔자 혈구 응집소 바이러스 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 혈구 응집소 바이러스("HA"; hemagglutinin) 태그(문헌[Wilson et al., 1984, Cell 37:767]) 및 "플래그(flag)" 태그를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편, 이의 항원-결합 단편은 진단 또는 검출 작용제에 접합된다. 이러한 항체는 임상 시험 절차의 일부로서 질병 또는 장애의 발병, 발달, 진행 및/또는 중증도를 모니터링하거나 전망(prognose)하는 데, 예컨대 특정 요법의 효능을 결정하는 데 유용할 수 있다. 이러한 진단 및 검출은 항체를, 비제한적으로 다양한 효소들, 예컨대 비제한적으로, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스터라제; 보결 분자단(prosthetic group), 예컨대 비제한적으로, 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴; 형광 물질, 예컨대 비제한적으로, 엄벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린; 발광 물질, 예컨대 비제한적으로, 루미놀; 생체발광 물질, 예컨대 비제한적으로, 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿼린(aequorin); 방사성 물질, 예컨대 비제한적으로, 요오드(131I, 125I, 123I 및 121I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(115In, 113In, 112In 및 111In), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브덴(99Mo), 제논(133Xe), 불소(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149 Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn 및 117Tin; 및 다양한 양전자 방사 단층 촬영을 사용하는 양전자 방출 금속 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함하는 검출 가능한 성분에 커플링함으로써 달성될 수 있다.
나아가, 본 발명은 치료적 모이어티에 접합된 항체 및 이의 항원-결합 단편의 용도를 포함한다. 항체 이의 항원-결합 단편은 치료적 모이어티, 예컨대 세포독소, 예를 들어 세포정지 또는 살세포 작용제, 치료제 또는 방사성 금속 이온, 예를 들어, 알파-이미터(emitter)에 접합될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 유해한 임의의 작용제를 포함한다.
나아가, 항체 이의 항원-결합 단편은 주어진 생물학적 반응을 변형시키는 치료적 모이어티 또는 약물 모이어티에 접합될 수 있다. 치료적 모이어티 또는 약물 모이어티는 전형적인 화학적 치료제로 한정되는 것으로 간주되지 않는다. 예를 들어, 약물 모이어티는 요망되는 생물학적 활성을 갖는 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어, 독소, 예컨대 아브린(abrin), 리신(ricin) A, 슈도모나스 외독소, 콜레라 독소 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제, 세포자멸사 작용제, 항-혈관신생 작용제; 또는 생물학적 반응 변형제, 예컨대 림포카인을 포함할 수 있다.
더욱이, 항체는 치료적 모이어티, 예컨대 방사성 금속 이온, 예컨대 알파-이미터, 예컨대 213Bi, 또는 비제한적으로, 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm을 포함하는 방사성금속 이온을 폴리펩타이드에 접합시키는 데 유용한 거대환식(macrocyclic) 킬레이터에 접합될 수 있다. 일 실시형태에서, 거대환식 킬레이터는 링커 분자를 통해 항체에 부착될 수 있는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N',N'',N'''-테트라아세트산(DOTA)이다. 이러한 링커 분자는 당업계에 보편적으로 공지되어 있고, 각각 그 전체가 원용에 의해 포함된 문헌[Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4 (10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10 (4):553-7; 및 Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26 (8):943-50]에 기재되어 있다.
치료적 모이어티를 항체에 접합시키는 기술은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985) 및 Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58]을 참조한다.
항체는 또한, 표적 항원의 면역검정 또는 정제에 특히 유용한 고체 지지체에 부착될 수 있다. 이러한 고체 지지체는 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항체의 제조 방법
항체를 인코딩하는 핵산
본 발명은 상기 기재된 BMP6-결합 항체 사슬의 분절 또는 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 실질적으로 정제된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 일부 핵산은 SEQ ID NO: 16; 36; 56; 또는 76 중 임의로 제시된 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및/또는 SEQ ID NO: 26; 46; 66; 또는 86 중 임의로 제시된 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 핵산 분자는 표 1에 식별된 것들이다. 본 발명의 일부 다른 핵산 분자는 표 1에 식별된 것들의 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 동일한(예컨대 적어도 65, 80%, 95% 또는 99%) 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 적절한 발현 벡터로부터 발현된 경우, 이들 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 폴리펩타이드는 BMP6 항원 결합력을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명에, 표 1 및/또는 표 14에 제시된 BMP6-결합 항체의 중쇄 또는 경쇄로부터 적어도 하나의 CDR 영역 및 통상 모든 3개의 CDR 영역들을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 일부 다른 폴리뉴클레오타이드는 표 1 및/또는 표 14에 제시된 BMP6-결합 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 모든 또는 실질적으로 모든 가변 영역 서열을 인코딩한다. 코드의 축퇴성 때문에, 여러 가지 핵산 서열들은 각각의 면역글로불린 아미노산 서열을 인코딩할 것이다.
본 발명의 핵산 분자는 항체의 가변 영역 및 불변 영역을 둘 다 인코딩할 수 있다. 본 발명의 일부 핵산 서열은, SEQ ID NO: 16; 36; 56; 또는 76 중 임의에 제시된 성숙한 중쇄 가변 영역 서열과 실질적으로 동일한(예컨대 적어도 80%, 90% 또는 99%) 성숙한 중쇄 가변 영역 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 다른 핵산 서열은 SEQ ID NO: 26; 46; 66; 또는 86 중 임의에 제시된 성숙한 경쇄 가변 영역 서열과 실질적으로 동일한(예컨대 적어도 80%, 90% 또는 99%) 성숙한 경쇄 가변 영역 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드 서열은 BMP6-결합 항체 또는 이의 결합 단편을 인코딩하는 기존의 서열(예컨대 하기 실시예에 기재된 바와 같은 서열)의 드 노보(de novo) 고체-상(phase) DNA 합성 또는 PCR 돌연변이생성에 의해 제조될 수 있다. 핵산의 직접적인 화학적 합성은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 문헌[Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90]의 포스포트리에스테르 방법; 문헌[Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979]의 포스포디에스테르 방법; 문헌[Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981]의 디에틸포스포르아미다이트 방법; 및 미국 특허 4,458,066의 고체 지지체 방법에 의해 달성될 수 있다. PCR에 의해 돌연변이를 폴리뉴클레오타이드 서열에 도입하는 것은, 예를 들어 문헌[PCR 기술: Principles and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, N.Y., 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, Calif., 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; 및 Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
또한, 본 발명에, 상기 기재된 BMP6-결합 항체의 제조를 위한 발현 벡터 및 숙주 세포가 제공된다. BMP6-결합 항체 사슬 또는 결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시키기 위해 다양한 발현 벡터들이 이용될 수 있다. 바이러스-기반 및 비-바이러스 발현 벡터 둘 다, 포유류 숙주 세포에서 항체를 제조하는 데 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 및 시스템은, 전형적으로 단백질 또는 RNA를 발현시키기 위한 발현 카세트와 함께 플라스미드, 에피솜 벡터, 및 인간 인공 염색체(예를 들어, 문헌[Harrington et al., Nat Genet. 15:345, 1997] 참조)를 포함한다. 예를 들어, 포유류(예컨대 인간) 세포에서 BMP6-결합 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 발현에 유용한 비-바이러스 벡터는 pThioHis A, B & C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C(Invitrogen, San Diego, Calif.), MPSV 벡터, 및 다른 단백질을 발현시키는 것으로 당업계에 공지된 수많은 다른 벡터들을 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노연관 바이러스, 헤르페스 바이러스를 기초로 한 벡터, SV40, 유두종 바이러스, HBP 엡스타인 바 바이러스, 백시나 바이러스 벡터 및 셈리키 산림열 바이러스(SFV; Semliki Forest Virus)를 기초로 한 벡터를 포함한다. 상기 Brent 등; 문헌[Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; 및 Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992]를 참조한다.
발현 벡터의 선택은, 벡터가 발현되는 의도된 숙주 세포에 따라 다르다. 전형적으로, 발현 벡터는, BMP6-결합 항체 사슬 항원-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결된 프로모터 및 다른 조절 서열(예컨대 인핸서)을 함유한다. 일 실시형태에서, 유도적 프로모터는 유도적 조건 하에서를 제외하고는, 삽입된 서열의 발현을 방지하기 위해 이용된다. 유도적 프로모터는 예를 들어, 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터 또는 열충격 프로모터를 포함한다. 형질변환된 유기체의 배양은, 발현 생성물이 숙주 세포에 의해 더 양호하게 관용되는 코딩 서열에 대해 집단을 편향시키지 않으면서 비유도적 조건 하에 확장될 수 있다. 프로모터 외에도, BMP6-결합 항체 사슬 항원-결합 단편의 효율적인 발현을 위해서는 다른 조절 요소가 또한, 필요하거나 요망될 수 있다. 이들 요소는 전형적으로, ATG 개시 코돈 및 인접한 리보좀 결합 부위 또는 다른 서열을 포함한다. 또한, 발현 효율은 사용되는 세포 시스템에 적절한 인핸서를 포함시킴으로써 증강될 수 있다(예를 들어, 문헌[Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; 및 Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987] 참조). 예를 들어, SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서는 포유류 숙주 세포에서 발현을 증가시키는 데 사용될 수 있다.
발현 벡터는 또한, 삽입된 BMP6-결합 항체 서열에 의해 인코딩된 폴리펩타이드와 함께 융합 단백질을 형성하기 위해 분비 신호 서열 위치를 제공할 수 있다. 보다 종종, 삽입된 BMP6-결합 항체 서열은 벡터에 포함되기 이전에 신호 서열에 연결된다. BMP6-결합 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 서열을 수령하는 데 사용되는 벡터는 이따금 또한, 불변 영역 또는 이의 일부를 인코딩한다. 이러한 벡터는 가변 영역을 불변 영역과의 융합 단백질로서 발현시킬 수 있으며, 이로써, 온전한 항체 및 이의 항원-결합 단편을 생성을 초래한다. 전형적으로, 이러한 불변 영역은 인간이다.
BMP6-결합 항체 사슬을 갖고 발현시키는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵일 수 있다. 이. 콜라이는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 클로닝하고 발현시키는 데 유용한 하나의 원핵 숙주이다. 사용하기에 적합한 다른 미생물 숙주는 바실리(bacilli), 예컨대 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 다른 엔테로박테리아세애, 예컨대 살모넬라, 세라티아(Serratia) 및 다양한 슈도모나스 종을 포함한다. 이들 원핵 숙주에서, 당업자는, 전형적으로 숙주 세포와 화합성(compatible)인 발현 조절 서열(예컨대 복제 기원)을 함유하는 발현 벡터를 제조할 수 있다. 또한, 임의의 수의 여러 가지 잘 공지된 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 전형적으로, 선택적으로 오퍼레이터 서열과 함께 발현을 조절하고, 전사 및 번역을 개시하고 완료하기 위해 리보좀 결합 부위 서열 등을 가진다. 다른 미생물, 예컨대 효모가 또한, 본 발명의 BMP6-결합 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 이용될 수 있다. 바큘로바이러스 벡터와 조합된 곤충 세포가 또한, 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 포유류 숙주 세포는 본 발명의 BMP6-결합 폴리펩타이드를 발현시키고 제조하는 데 사용된다. 예를 들어, 이들 숙주 세포는 내인성 면역글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주(예컨대 실시예에 기재된 바와 같은 1D6.C9 골수종 하이브리도마 클론) 또는 외인성 발현 벡터를 갖는 포유류 세포주(예컨대 하기 예시된 SP2/0 골수종 세포)일 수 있다. 이들은 임의의 정상적인 필멸(mortal) 또는 정상적인 또는 비정상적인 불멸 동물 또는 인간 세포를 포함한다. 예를 들어, CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질변환된 B-세포 및 하이브리도마를 포함하여, 온전한 면역글로불린을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주들이 개발되어 왔다. 폴리펩타이드를 발현시키기 위한 포유류 조직 세포 배양물의 사용은 일반적으로 예를 들어, 문헌[Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987]에 고찰되어 있다. 포유류 숙주 세포에 대한 발현 벡터는 발현 조절 서열, 예컨대 복제 기원, 프로모터 및 인핸서(예를 들어, 문헌[Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986] 참조) 및 필요한 가공 정보 부위, 예컨대 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 이들 발현 벡터는 통상, 포유류 유전자 또는 포유류 바이러스로부터 유래된 프로모터를 함유한다. 적합한 프로모터는 구성적(constitutive), 세포 유형-특이적, 단계-특이적, 및/또는 조정 가능하거나 조절 가능할 수 있다. 유용한 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 구성적 아데노바이러스 주요 후기(major late) 프로모터, 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP poIIII 프로모터, 구성적 MPSV 프로모터, 테트라사이클린-유도성 CMV 프로모터(예컨대 인간 즉시-초기(immediate-early) CMV 프로모터), 구성적 CMV 프로모터 및 프로모터-인핸서 조합을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
관심 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 발현 벡터를 도입하기 위한 방법은 세포성 숙주의 유형에 따라 다르다. 예를 들어, 칼슘 클로라이드 형질감염은 원핵 세포에 보편적으로 이용되는 반면, 칼슘 포스페이트 처리 또는 전기천공은 다른 세포성 숙주에 사용될 수 있다(일반적으로 상기 Sambrook 등 참조). 다른 방법은 예를 들어, 전기천공, 칼슘 포스페이트 처리, 리포좀-매개 형질변환, 주사 및 미세주사, 충격(ballistic) 방법, 비로좀, 면역리포좀, 다가양이온:핵산 접합체, 네이키드(naked) DNA, 인공 비리온, 헤르페스 바이러스 구조 단백질 VP22에의 융합(문헌[Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997]), DNA의 작용제-증강 섭취 및 생체외 형질도입을 포함한다. 재조합 단백질의 장기적인 고-수율 생성을 위해, 안정한 발현이 종종 요망될 것이다. 예를 들어, BMP6-결합 항체 사슬 또는 결합 단편을 안정하게 발현하는 세포주는, 바이러스 복제 기원 또는 내인성 발현 요소 및 선별 마커 유전자를 함유하는 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 제조될 수 있다. 벡터의 도입 후, 세포는, 이들 세포가 선별 배지에 옮겨지기 전에, 농화된 배지 내에서 1 내지 2일 동안 성장하도록 허용될 수 있다. 선별 마커의 목적은 선별에 대한 내성을 부여하는 것이고, 이러한 선별 마커의 존재는, 도입된 서열을 선별 배지 내에서 성공적으로 발현시키는 세포의 성장을 허용한다. 내성의 안정하게 형질감염된 세포는 세포 유형에 적절한 조직 배양 기술을 사용하여 증식될 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체의 발생
모노클로날 항체(mAb)는 종래의 모노클로날 항체 방법, 예를 들어 문헌[Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495]의 표준 체세포 세포 혼성화 기술을 포함하는 여러 가지 기술들에 의해 생성될 수 있다. 모노클로날 항체를 생성하기 위한 많은 기술들, 예를 들어 B 림프구의 바이러스성 또는 종양원성(oncogenic) 형질변환이 이용될 수 있다.
하이브리도마의 제조를 위한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마 생성은 잘 구축된 절차이다. 면역화 프로토콜, 및 융합을 위해 면역화된 비장세포를 단리하기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너(예컨대 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차가 또한, 공지되어 있다. 본 발명의 키메라 또는 인간화된 항체 및 이의 항원-결합 단편은 상기 기재된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열을 기초로 하여 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 인코딩하는 DNA는 관심 뮤린 하이브리도마로부터 수득되고, 비-뮤린(예컨대 인간) 면역글로불린 서열을 함유하도록 표준 분자생물학 기술을 사용하여 조작될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해, 뮤린 가변 영역은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 인간 불변 영역에 연결될 수 있다(예를 들어, Cabilly 등의 미국 특허 4,816,567 참조). 인간화된 항체를 생성하기 위해, 뮤린 CDR 영역은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 인간 프레임워크 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, Winter의 미국 특허 5,225,539 및 Queen 등의 미국 특허 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6180370을 참조한다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. BMP6에 대한 이러한 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템보다는 인간 면역계의 부분을 운반하는 형질전환 또는 염색체이식 마우스를 사용하여 발생될 수 있다. 이들 형질전환 및 염색체이식 마우스는 본원에서 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 지칭되는 마우스를 포함하고, 본원에서 "인간 Ig 마우스"로 통칭된다.
HuMAb 마우스®(Medarex, Inc.)는, 내인성 뮤 및 카파 사슬 유전자좌를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄(뮤 및 감마) 및 카파 경쇄 면역글로불린 서열을 인코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니유전자좌(miniloci)를 함유한다(예를 들어, 문헌[Lonberg, et al., 1994 Nature 368 (6474): 856-859] 참조). 이에, 마우스는 마우스 IgM 또는 IgK의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 이식유전자는 부류 스위칭 및 체세포 돌연변이를 수행하여, 고 친화도 인간 IgG-카파 모노클로날을 발생시킨다(상기 Lonberg, N. 등, 1994; 문헌[Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, 및 Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546]에 검토되어 있음). HuMAb 마우스, 및 이러한 마우스에 의해 운반되는 게놈 변형의 제조 및 용도는 문헌[Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; 및 Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851]에 더 기재되어 있으며, 이들의 내용은 모두 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 구체적으로 포함된다. 추가로, 미국 특허 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429; Lonberg 및 Kay; Surani 등의 미국 특허 5,545,807; Lonberg 및 Kay 등의 PCT 공개 WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 및 WO 99/45962; 및 Korman 등의 PCT 공개 WO 01/14424를 참조한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 인간 항체는, 이식유전자 및 이식염색체 상에 인간 면역글로불린 서열을 운반하는 마우스, 예컨대 인간 중쇄 이식유전자 및 인간 경쇄 이식염색체를 운반하는 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 본원에서 "KM 마우스"로 지칭되는 이러한 마우스는 Ishida 등의 PCT 공개 WO 02/43478 에 상세하게 기재되어 있다.
보다 나아가, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 형질전환 동물 시스템은 당업계에서 입수 가능하고, 본 발명의 BMP6-결합 항체 및 이의 항원-결합 단편을 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, Xenomouse(Abgenix, Inc.)로 지칭되는 대안적인 형질전환 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어, Kucherlapati 등의 미국 특허 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 및 6,162,963에 기재되어 있다.
더욱이, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 염색체이식 동물 시스템은 당업계에서 입수 가능하고, 본 발명의 BMP6-결합 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"로 지칭되는, 인간 중쇄 이식염색체 및 인간 경쇄 이식염색체를 둘 다 운반하는 마우스가 사용될 수 있으며; 이러한 마우스는 문헌[Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 더욱이, 인간 중쇄 및 경쇄 이식염색체를 운반하는 소는 당업계에 기재되어 있으며(Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894), 본 발명의 BMP6-결합 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 또한, 인간 면역글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 당업계에 구축되어 있거나 하기 실시예에 기재되어 있다. 예를 들어: Ladner 등의 미국 특허 5,223,409; 5,403,484; 및 5,571,698; Dower 등의 미국 특허 5,427,908 및 5,580,717; McCafferty 등의 미국 특허 5,969,108 및 6,172,197; 및 Griffiths 등의 미국 특허 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081을 참조한다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 또한, 면역화 시 인간 항체 반응이 발생될 수 있도록 인간 면역 세포가 마우스 안으로 재구성된 SCID 마우스를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어, Wilson 등의 미국 특허 5,476,996 및 5,698,767에 기재되어 있다.
프레임워크 또는 Fc 조작
본 발명의 조작된 항체 및 이의 항원-결합 단편은, 예를 들어 항체의 특성을 향상시키기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 변형이 이루어진 것들을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 저하하기 위해 이루어진다. 예를 들어, 하나의 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 생식선 서열로 "복귀돌연변이시키는" 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 수행한 항체는, 항체가 유래된 생식선 서열과 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을, 항체가 유래된 생식선 서열과 비교함으로써 식별될 수 있다. 프레임워크 영역 서열들을 이들의 생식선 배치로 복귀시키기 위해, 체세포 돌연변이는 예를 들어, 부위-특이적 돌연변이생성에 의해 생식선 서열로 "복귀돌연변이화될" 수 있다. 이러한 "복귀돌연변이화된" 항체 또한, 본 발명에 포함되고자 한다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은, 프레임워크 영역 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이화시켜, T 세포-에피토프를 제거하여, 이로써 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키는 단계를 수반한다. 이러한 접근법은 또한, "탈면역화"로 지칭되고, Carr 등의 미국 특허 공개 20030153043에 더 상세히 기재되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형 외에도 또는 대안적으로, 본 발명의 항체는 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존적 세포성 세포독성을 변경시키기 위해 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형될 수 있거나(예컨대 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음), 항체의 글리코실화를 변경시키기 위해, 즉, 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경시키기 위해 변형될 수 있다. 이들 실시형태는 각각 하기에 더 상세히 기재된다. Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 Kabat의 EU 인덱스의 넘버링이다.
일 실시형태에서, CH1의 힌지 영역은, 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어 증가되거나 저하되도록 변형된다. 이러한 접근법은 Bodmer 등의 미국 특허 5,677,425에 더 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 용이하게 하거나 항체의 안정성을 증가시키거나 저하하도록 변경된다.
또 다른 실시형태에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 저하하도록 돌연변이화된다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는, 항체가 본래의 Fc-힌지 도메인 SpA와 비례하여 저하된 스타필로콕킬(Staphylococcyl) 단백질 A(SpA) 결합을 갖도록, Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 중간면(interface) 영역 내로 도입된다. 이러한 접근법은 Ward 등의 미국 특허 6,165,745에 더 상세히 기재되어 있다.
또 다른 실시형태에서, 항체는 이의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 접근법들이 가능하다. 예를 들어, 하나 이상의 하기 돌연변이가 Ward의 미국 특허 6,277,375에 기재된 바와 같이 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는, Presta 등의 미국 특허 5,869,046 및 6,121,022에 기재된 바와 같이 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프들로부터 취해진 구제(salvage) 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다.
일 실시형태에서, Fc 영역은 항체의 이펙터 기능을 변경시키기 위해 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경된다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산은, 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 부모 항체의 항원-결합 능력을 보유하도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체의 C1 구성성분일 수 있다. 이러한 접근법은 Winter 등의 미국 특허 5,624,821 및 5,648,260에 더 상세히 기재되어 있다.
또 다른 실시형태에서, 아미노산 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은, 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 소멸된 보체 의존적 세포독성(CDC)을 갖도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이러한 접근법은 Idusogie 등의 미국 특허 6,194,551에 더 상세히 기재되어 있다.
또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 변경되어, 항체가 보체를 고정시키는 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은 Bodmer 등의 PCT 공개 WO 94/29351에 더 상세히 기재되어 있다.
보다 다른 실시형태에서, Fc 영역은 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써, 항체가 항체 의존적 세포성 세포독성(ADCC)을 매개하는 능력을 증가시키고/거나 Fc-감마 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변형된다. 이러한 접근법은 Presta의 PCT 공개 WO 00/42072에 더 상세히 기재되어 있다. 더욱이, Fc-감마 RI, Fc-감마 RII, Fc-감마 RIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위가 맵핑되었으며, 향상된 결합을 갖는 변이체가 기재되었다(문헌[Shields, R. L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604] 참조).
보다 다른 실시형태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 아글리코실화된 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체에 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는 예를 들어, "항원"에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 초래하여, 이로써 해당 부위에서 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 아글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 Co 등의 미국 특허 5,714,350 및 6,350,861에 더 상세히 기재되어 있다.
추가로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체, 예컨대 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 하이포푸코실화된(hypofucosylated) 항체 또는 증가된 이등분면(bisecting) GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 언급되었다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 항체를 변경된 글리코실화 머시너리를 갖는 숙주 세포 내에 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 머시너리를 갖는 세포는, 당업계에 기재되어 있고, 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 이로써 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생성하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, Hang 등의 EP 1,176,195는 푸코실 트랜스퍼라제를 인코딩하는 기능적으로 방해된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하고 있으며, 따라서 이러한 세포주에서 발현된 항체는 하이포푸코실화를 나타낸다. Presta의 PCT 공개 WO 03/035835는 푸코스를 Asn(297)-연결된 탄수화물에 부착시키는 능력이 감소되어, 해당 숙주 세포에서 발현되는 항체의 하이포푸코실화를 초래하는 변이체 CHO 세포주, LecI3 세포를 기재하고 있다(또한 문헌[Shields, R. L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). Umana 등의 PCT 공개 WO 99/54342는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제(예컨대 베타 (1,4)--N 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재하고 있으며, 따라서 조작된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 이등분면 GlcNac 구조를 나타내며 이는 항체의 증가된 ADCC 활성을 초래한다(또한 문헌[Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180] 참조).
변경된 항체의 조작 방법
상기 고찰된 바와 같이, 본원에 제시된 VH 및 VL 서열 또는 전장 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 BMP6-결합 항체가 사용되어, 이에 부착된 전장 중쇄 및/또는 경쇄 서열, VH 및/또는 VL 서열 또는 불변 영역(들)을 변형시킴으로써 새로운 BMP6-결합 항체를 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 BMP6-결합 항체의 구조 특징은, 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편의 적어도 하나의 기능적 특성, 예컨대 인간 BMP6에 대한 결합 및 또한 BMP6의 하나 이상의 기능적 특성의 억제(예컨대 용혈 검정법에서 적혈구 용해를 억제시킴)를 보유하는 구조적으로 관련된 BMP6-결합 항체를 생성하기 위해 사용된다.
예를 들어, 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편 또는 이의 돌연변이의 하나 이상의 CDR 영역은 공지된 프레임워크 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합적으로 조합되어, 상기 고찰된 바와 같이 본 발명의 추가의 재조합적으로-조작된 BMP6-결합 항체 및 이의 항원-결합 단편을 생성할 수 있다. 다른 유형의 변형은 이전의 단락에서 기재된 것들을 포함한다. 조작 방법을 위한 시작 물질은 본원에 기재된 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열 또는 이의 하나 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 생성하기 위해, 본원에 기재된 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열 또는 이의 하나 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조하는 것(즉, 단백질로서 발현하는 것)이 필요하지 않다. 그보다는, 서열(들)에 함유된 정보는, 원래의 서열(들)로부터 유래된 "제2 발생" 서열(들)을 생성하기 위한 시작 물질로서 사용되고, 그 후에, "제2 발생" 서열(들)이 제조되고 단백질로서 발현된다.
변경된 항체 서열은 또한, US20050255552에 기재된 바와 같은 고정된 CDR3 서열 또는 최소 필수적인 결합 결정기 및 CDR1 및 CDR2 서열 상에 다양성을 갖는 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 제조될 수 있다. 스크리닝은 항체 라이브러리로부터 항체를 스크리닝하는 데 적절한 임의의 스크리닝 기술, 예컨대 파지 디스플레이 기술에 따라 수행될 수 있다..
표준 분자생물학 기술은 변경된 항체 서열을 제조하고 발현하도록 사용될 수 있다. 변경된 항체 서열(들)에 의해 인코딩된 항체는, 본원에 기재된 BMP6-결합 항체의 기능적 특성 중 하나, 일부 또는 모두를 보유하는 것이며, 이러한 기능적 특성은 인간 BMP6 단백질에 대한 특이적 결합을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니고; 항체는 용혈 검정법에서 적혈구 용해를 억제한다.
변경된 항체의 기능적 특성은 당업계에서 입수 가능하고/거나 본원에 기재된 표준 검정법, 예컨대 실시예에 제시된 것들(예컨대 ELISA)을 사용하여 평가될 수 있다.
본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편의 조작 방법의 일 실시형태에서, 돌연변이는 BMP6-결합 항체 코딩 서열의 모두 또는 일부를 따라 무작위로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 생성된 변형된 BMP6-결합 항체는 본원에 기재된 바와 같이 결합 활성 및/또는 다른 기능적 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Short의 PCT 공개 WO 02/092780은 포화도 돌연변이생성, 합성 연결 어셈블리 또는 이들의 조합을 사용하여 항체 돌연변이를 생성하고 스크리닝하기 위한 방법을 기재하고 있다. 대안적으로, Lazar 등은 PCT 공개 WO 03/074679는 항체의 생리화학적 특성을 최적화하기 위해 컴퓨터 스크리닝 방법을 사용하는 방법을 기재하고 있다.
본 발명의 항체의 특징화
본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편은 다양한 기능성 검정법에 의해 특징화될 수 있다. 예를 들어, 이들은 BMP6를 억제시키는 이들의 능력에 의해 특징화될 수 있다.
BMP6에 결합하는 항체의 능력은 관심 항체를 직접적으로 표지화함으로써 검출될 수 있거나, 항체는 비표지화되고 결합은 당업계에 공지된 다양한 샌드위치 검정법 포맷을 사용하여 간접적으로 검출될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 BMP6-결합 항체 및 이의 항원-결합 단편은 참조 BMP6-결합 항체를 BMP6 폴리펩타이드에 결합하는 것을 차단하거나 경쟁한다. 이들은 상기 기재된 완전 인간 BMP6-결합 항체일 수 있다. 이들은 또한, 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 다른 마우스, 키메라 또는 인간화된 BMP6-결합 항체일 수 있다. 참조 항체 결합을 차단하거나 경쟁하는 능력은, 시험 하에 BMP6-결합 항체가 참조 항체에 의해 정의된 것과 동일하거나 유사한 에피토프, 또는 참조 BMP6-결합 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접한 에피토프에 결합함을 가리킨다. 이러한 항체는 특히, 참조 항체에 대해 식별된 유리한 특성을 유사하게 공유한다. 참조 항체를 차단하거나 경쟁하는 능력은 예를 들어, 경쟁 결합 검정법에 의해 결정될 수 있다. 경쟁 결합 검정법을 이용하여, 시험 하의 항체는, 공통적인 항원, 예컨대 BMP6 폴리펩타이드에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 억제하는 능력에 대해 검사된다. 시험 항체는, 과량의 시험 항체가 참조 항체의 결합을 실질적으로 억제하는 경우, 항원에 대한 특이적 결합을 위해 참조 항체와 경쟁한다. 실질적인 억제는, 시험 항체가 참조 항체의 특이적 결합을 통상적으로 적어도 10%, 25%, 50%, 75% 또는 90%만큼 감소시킴을 의미한다.
특정 단백질, 이 경우에는 BMP6에 결합하기 위해 참조 항체와 항체의 경쟁을 평가하는 데 사용될 수 있는 다수의 공지된 경쟁 결합 검정법들이 존재한다. 이들 검정법은 예를 들어, 고체상 직접 또는 간접 방사성면역검정(RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역검정(EIA), 샌드위치 경쟁 검정법(문헌[Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253, 1983] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(문헌[Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619, 1986] 참조); 고체상 직접 표지된 검정법, 고체상 직접 표지된 샌드위치 검정법(상기 Harlow & Lane 참조); I-125 표지를 사용하는 고체상 직접 표지 RIA(문헌[Morel et al., Molec. Immunol. 25:7-15, 1988] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(문헌[Cheung et al., Virology 176:546-552, 1990]); 및 직접 표지된 RIA(문헌[Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82, 1990])를 포함한다. 전형적으로, 이러한 검정법은 이들, 비표지된 시험 BMP6-결합 항체 및 표지된 참조 항체 중 어느 하나를 갖는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 수반한다. 경쟁적 억제는 시험 항체의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 통상, 시험 항체는 과량으로 존재한다. 경쟁 검정법에 의해 식별되는 항체(경쟁 항체)는, 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 입체 장애가 발생하기 위해 참조 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접한 인접한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
선별된 BMP6-결합 모노클로날 항체가 독특한 에피토프에 결합하는지 결정하기 위해, 각각의 항체는 상업적으로 입수 가능한 시약(예컨대 Pierce사의 시약, Rockford, Ill.)을 사용하여 비오틴화될 수 있다. 비표지된 모노클로날 항체 및 비오틴화된 모노클로날 항체를 사용하는 경쟁 연구는 BMP6 폴리펩타이드 코팅된-ELISA 플레이트를 사용하여 수행될 수 있다. 비오틴화된 MAb 결합은 스트렙타비딘-알칼리 포스파타제 프로브를 이용하여 검출될 수 있다. 정제된 BMP6-결합 항체의 아이소타입을 결정하기 위해, 아이소타입 ELISA가 수행될 수 있다. 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트의 웰들은 1 μg/ml의 항-인간 IgG를 이용하여 4℃에서 밤새 코팅될 수 있다. 플레이트는 1% BSA를 이용하여 블라킹된 후, 1 μg/ml 이하의 모노클로날 BMP6-결합 항체 또는 정제된 아이소타입 대조군과 주위 온도에서 1 내지 2시간 동안 반응한다. 그 후에, 웰들은 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리 포스파타제-접합 프로브와 반응할 수 있다. 그 후에, 플레이트는 발색되고 분석되어, 정제된 항체의 아이소타입이 결정될 수 있다.
모노클로날 BMP6-결합 항체와, BMP6 폴리펩타이드를 발현하는 살아 있는 세포의 결합을 나타내기 위해, 유세포분석이 사용될 수 있다. 간략하게는, BMP6를 발현하는 세포주(표준 성장 조건 하에 성장됨)는 0.1% BSA 및 10% 태아 소 혈청을 함유하는 PBS 내에서 다양한 농도의 BMP6-결합 항체와 혼합되고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션된다. 세척 후, 세포는 1차 항체 염색과 동일한 조건 하에 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG 항체와 반응한다. 시료는 단일 세포를 게이트하기 위해 광 및 사이드 스캐터(side scatter) 특성을 사용하는 FACScan 장비에 의해 분석될 수 있다. 형광 현미경을 사용하는 대안적인 검정법이 유세포분석 검정법(외에도 또는 대신에) 사용될 수 있다. 세포는 상기 기재된 바와 같이 정확하게 염색되고, 형광 현미경에 의해 검사될 수 있다. 이러한 방법은 개별 세포의 시각화를 허용하지만, 항원의 밀도에 따라 저하된 감수성을 가질 수 있다.
본 발명의 BMP6-결합 항체 및 이의 항원-결합 단편은 BMP6 폴리펩타이드 또는 항원 단편과의 반응성에 대해 웨스턴 블로팅에 의해 더 시험될 수 있다. 간략하게는, BMP6를 발현하는 세포로부터의 정제된 BMP6 폴리펩타이드 또는 융합 단백질 또는 세포 추출물은 제조되고, 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 처리될 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원은 니트로셀룰로스 막으로 옮겨지고, 10% 태아 소 혈청을 이용하여 블라킹된 다음, 시험되는 모노클로날 항체를 이용하여 프로브화된다. 인간 IgG 결합은 항-인간 IgG 알칼리 포스파타제를 사용하여 검출되고, CIP/NBT 기질 정제(Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.)를 이용하여 발색될 수 있다.
기능성 검정법의 예는 하기 실시예 단락에 기재되어 있다.
예방적 및 치료적 용도
본 발명은 유효량의 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, 증가된 BMP6 활성과 연관된 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, 빈혈증을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편은 특히, 빈혈증의 진행을 예방하는 데 사용될 수 있다. 이는 또한, 빈혈증 환자의 치료를 위한 다른 요법과 병용될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, BMP6-관련 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 공지된 BMP6-관련 질병 또는 장애의 예는: 비제한적인 예로서: 만성 질병 빈혈증(ACD), 만성 신장 질병(CKD)의(예컨대 연관된) 빈혈증, 암의 빈혈증, 염증의 빈혈증, 적혈구 생성 자극제(ESA) 내성 빈혈증(예를 들어 에리스로포이에틴(EPO) 내성 빈혈증, ESA 저반응성 빈혈증(예컨대 EPO 저반응성 빈혈증), 기능성 철-부족 빈혈증, 및/또는 철-제한성 빈혈증을 포함하여 빈혈증을 포함한다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, BMP6-관련 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 질병 또는 장애는 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증은 만성 질병 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 만성 질병은 만성 신장 질병이다. 일 실시형태에서, 만성 질병은 암이다. 일 실시형태에서, 만성 질병은 염증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증(예컨대 만성 질병 빈혈증)은 ESA(예컨대 EPO)-내성 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증(예컨대 만성 질병 빈혈증)은 ESA(예컨대 EPO)-저반응성 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증(예컨대 만성 질병 빈혈증)은 철-제한성 빈혈증이다. 상기 실시형태들 중 임의를 포함하는 실시형태에서, 대상체는 만성 혈액투석(HD) 대상체이다. 상기 실시형태들 중 임의를 포함하는 실시형태에서, 대상체는 신장 질병, 예를 들어 말기 신장 질병을 가진다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, BMP6-관련 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 질병 또는 장애는 기능성 철 부족 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 대상체는 ESA(예컨대 EPO) 치료되는 만성 혈액투석 환자이다. 일 실시형태에서, 대상체는 만성 신장 질병을 갖는 ESA(예컨대 EPO) 치료되는 만성 혈액투석 환자이다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, 빈혈증을 치료하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, 빈혈증을 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 빈혈증은 만성 신장 질병의 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증은 ESA(예컨대 EPO)-내성 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증은 ESA(예컨대 EPO)-저반응성 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증은 철-제한성 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증은 신장 질병, 예를 들어, 만성 신장 질병과 연관된 빈혈증이다. 상기 실시형태들 중 임의를 포함하는 실시형태에서, 대상체는 만성 혈액투석(HD) 대상체이다. 상기 실시형태들 중 임의를 포함하는 실시형태에서, 대상체는 신장 질병, 예를 들어 말기 신장 질병을 가진다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, BMP6-관련 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 질병 또는 장애는 기능성 철 부족 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 대상체는 ESA(예컨대 EPO) 치료되는 만성 혈액투석 환자이다. 일 실시형태에서, 대상체는 만성 신장 질병을 갖는 ESA(예컨대 EPO) 치료되는 만성 혈액투석 환자이다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명은 빈혈증의 치료 방법을 제공한다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, 대상체의 ESA(예컨대 EPO) 투약 필요성을 감소시키는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 빈혈증은 만성 질병 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 만성 질병은 만성 신장 질병이다. 일 실시형태에서, 만성 질병은 암이다. 일 실시형태에서, 만성 질병은 염증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증(예컨대 만성 질병 빈혈증)은 ESA(예컨대 EPO)-내성 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증(예컨대 만성 질병 빈혈증)은 ESA(예컨대 EPO)-저반응성 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증(예컨대 만성 질병 빈혈증)은 철-제한성 빈혈증이다. 상기 실시형태들 중 임의를 포함하는 실시형태에서, 대상체는 만성 혈액투석(HD) 대상체이다. 상기 실시형태들 중 임의를 포함하는 실시형태에서, 대상체는 신장 질병, 예를 들어 말기 신장 질병을 가진다.
실시형태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 환자에서 ESA 내성 지수(ERI)의 저하를 초래한다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, 대상체의 ESA(예컨대 EPO) 투약 필요성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 대상체는 기능성 철 부족 빈혈증을 가진다. 일 실시형태에서, 대상체는 ESA(예컨대 EPO) 치료되는 만성 혈액투석 환자이다. 일 실시형태에서, 대상체는 만성 신장 질병을 갖는 ESA(예컨대 EPO) 치료되는 만성 혈액투석 환자이다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, 대상체의 ESA(예컨대 EPO) 투약 필요성을 감소시키는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 대상체는 빈혈증을 가진다. 일 실시형태에서, 빈혈증은 만성 질병 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 만성 질병은 만성 신장 질병이다. 일 실시형태에서, 만성 질병은 암이다. 일 실시형태에서, 만성 질병은 염증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증(예컨대 만성 질병 빈혈증)은 ESA(예컨대 EPO)-내성 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증(예컨대 만성 질병 빈혈증)은 ESA(예컨대 EPO)-저반응성 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증(예컨대 만성 질병 빈혈증)은 철-제한성 빈혈증이다. 상기 실시형태들 중 임의를 포함하는 실시형태에서, 대상체는 만성 혈액투석(HD) 대상체이다. 상기 실시형태들 중 임의를 포함하는 실시형태에서, 대상체는 신장 질병, 예를 들어 말기 신장 질병을 가진다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, 대상체의 ESA(예컨대 EPO) 투약 필요성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 대상체는 기능성 철 부족 빈혈증을 가진다. 일 실시형태에서, 대상체는 ESA(예컨대 EPO) 치료되는 만성 혈액투석 환자이다. 일 실시형태에서, 대상체는 만성 신장 질병을 갖는 ESA(예컨대 EPO) 치료되는 만성 혈액투석 환자이다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, 대상체의 철(예컨대 IV 철) 투약 필요성을 감소시키는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 대상체는 빈혈증을 가진다. 일 실시형태에서, 빈혈증은 만성 질병 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 만성 질병은 만성 신장 질병이다. 일 실시형태에서, 만성 질병은 암이다. 일 실시형태에서, 만성 질병은 염증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증(예컨대 만성 질병 빈혈증)은 ESA(예컨대 EPO)-내성 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증(예컨대 만성 질병 빈혈증)은 ESA(예컨대 EPO)-저반응성 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증(예컨대 만성 질병 빈혈증)은 철-제한성 빈혈증이다. 상기 실시형태들 중 임의를 포함하는 실시형태에서, 대상체는 만성 혈액투석(HD) 대상체이다. 상기 실시형태들 중 임의를 포함하는 실시형태에서, 대상체는 신장 질병, 예를 들어 말기 신장 질병을 가진다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, 대상체의 철(예컨대 IV 철) 투약 필요성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 대상체는 기능성 철 부족 빈혈증을 가진다. 일 실시형태에서, 대상체는 ESA(예컨대 EPO) 치료되는 만성 혈액투석 환자이다. 일 실시형태에서, 대상체는 만성 신장 질병을 갖는 ESA(예컨대 EPO) 치료되는 만성 혈액투석 환자이다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, 대상체의 철(예컨대 IV 철) 투약 필요성을 감소시키는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 대상체는 빈혈증을 가진다. 일 실시형태에서, 빈혈증은 만성 질병 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 만성 질병은 만성 신장 질병이다. 일 실시형태에서, 만성 질병은 암이다. 일 실시형태에서, 만성 질병은 염증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증(예컨대 만성 질병 빈혈증)은 ESA(예컨대 EPO)-내성 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증(예컨대 만성 질병 빈혈증)은 ESA(예컨대 EPO)-저반응성 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증(예컨대 만성 질병 빈혈증)은 철-제한성 빈혈증이다. 상기 실시형태들 중 임의를 포함하는 실시형태에서, 대상체는 만성 혈액투석(HD) 대상체이다. 상기 실시형태들 중 임의를 포함하는 실시형태에서, 대상체는 신장 질병, 예를 들어 말기 신장 질병을 가진다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, 대상체의 철(예컨대 IV 철) 투약 필요성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 대상체는 기능성 철 부족 빈혈증을 가진다. 일 실시형태에서, 대상체는 ESA(예컨대 EPO) 치료되는 만성 혈액투석 환자이다. 일 실시형태에서, 대상체는 만성 신장 질병을 갖는 ESA(예컨대 EPO) 치료되는 만성 혈액투석 환자이다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편 또는 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 철(예컨대 IV 철) 투약 필요성을 감소시키고 대상체의 ESA(예컨대 EPO) 투약 필요성을 감소시키는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 빈혈증은 만성 질병 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 만성 질병은 만성 신장 질병이다. 일 실시형태에서, 만성 질병은 암이다. 일 실시형태에서, 대상체는 빈혈증을 가진다. 일 실시형태에서, 만성 질병은 염증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증(예컨대 만성 질병 빈혈증)은 ESA(예컨대 EPO)-내성 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증(예컨대 만성 질병 빈혈증)은 ESA(예컨대 EPO)-저반응성 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 빈혈증(예컨대 만성 질병 빈혈증)은 철-제한성 빈혈증이다. 상기 실시형태들 중 임의를 포함하는 실시형태에서, 대상체는 만성 혈액투석(HD) 대상체이다. 상기 실시형태들 중 임의를 포함하는 실시형태에서, 대상체는 신장 질병, 예를 들어 말기 신장 질병을 가진다.
일 실시형태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, 격리된 철을 동원하는 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, 격리된 철을 동원하는 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 에리스로포이에틴 및/또는 철(예컨대 IV 철)의 투약 필요성을 감소시키면서도, 빈혈증을 갖는 대상체에서 헤모글로빈의 수준을 향상시키는(예컨대 증가시키는) 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 빈혈증은 만성 질병과 연관되어 있는 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 헤모글로빈 수준의 향상은 임상 시험 가이드라인, 예를 들어 문헌[Kidney Disease: Improving Global Outcomes(KDIGO) Anemia Work Group. KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease. Kidney inter., Suppl. 2012; 2: 279-335]에 의해 명시된 바와 같은 수준까지 수준을 향상시키는 단계를 포함하며, 이의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 일 실시형태에서, 헤모글로빈 수준의 향상은 헤모글로빈 수준을 적어도 약 11.0 g/dL, 예를 들어 약 11.0 g/dL 내지 약 12.5 g/dL까지 향상시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 헤모글로빈 수준의 향상은 헤모글로빈 수준을 적어도 11.0 g/dL, 예를 들어 11.0 g/dL 내지 12.5 g/dL까지 향상시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 에리스로포이에틴 및/또는 철(예컨대 IV 철)의 투약 필요성을 감소시키면서도, 빈혈증을 갖는 대상체에서 헤모글로빈의 수준을 향상시키는(예컨대 증가시키는) 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 빈혈증은 만성 질병과 연관되어 있는 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 헤모글로빈 수준의 향상은 임상 시험 가이드라인, 예를 들어 문헌[Kidney Disease: Improving Global Outcomes(KDIGO) Anemia Work Group. KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease. Kidney inter., Suppl. 2012; 2: 279-335]에 의해 명시된 바와 같은 수준까지 수준을 향상시키는 단계를 포함하며, 이의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 일 실시형태에서, 헤모글로빈 수준의 향상은 헤모글로빈 수준을 적어도 약 11.0 g/dL, 예를 들어 약 11.0 g/dL 내지 약 12.5 g/dL까지 향상시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 헤모글로빈 수준의 향상은 헤모글로빈 수준을 적어도 11.0 g/dL, 예를 들어 11.0 g/dL 내지 12.5 g/dL까지 향상시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 에리스로포이에틴 및/또는 철(예컨대 IV 철)의 투약 필요성을 감소시키면서도, 빈혈증을 갖는 대상체에서 헤모글로빈의 수준을 유지시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 빈혈증은 만성 질병과 연관되어 있는 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 헤모글로빈 수준의 향상은 임상 시험 가이드라인, 예를 들어 문헌[Kidney Disease: Improving Global Outcomes(KDIGO) Anemia Work Group. KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease. Kidney inter., Suppl. 2012; 2: 279-335]에 의해 명시된 바와 같은 수준까지 수준을 향상시키는 단계를 포함하며, 이의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 일 실시형태에서, 헤모글로빈 수준의 향상은 헤모글로빈 수준을 적어도 약 11.0 g/dL, 예를 들어 약 11.0 g/dL 내지 약 12.5 g/dL까지 향상시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 헤모글로빈 수준의 향상은 헤모글로빈 수준을 적어도 11.0 g/dL, 예를 들어 11.0 g/dL 내지 12.5 g/dL까지 향상시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 에리스로포이에틴 및/또는 철(예컨대 IV 철)의 투약 필요성을 감소시키면서도, 빈혈증을 갖는 대상체에서 헤모글로빈의 수준을 유지시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 빈혈증은 만성 질병과 연관되어 있는 빈혈증이다. 일 실시형태에서, 헤모글로빈 수준의 향상은 임상 시험 가이드라인, 예를 들어 문헌[Kidney Disease: Improving Global Outcomes(KDIGO) Anemia Work Group. KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease. Kidney inter., Suppl. 2012; 2: 279-335]에 의해 명시된 바와 같은 수준까지 수준을 향상시키는 단계를 포함하며, 이의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 일 실시형태에서, 헤모글로빈 수준의 향상은 헤모글로빈 수준을 적어도 약 11.0 g/dL, 예를 들어 약 11.0 g/dL 내지 약 12.5 g/dL까지 향상시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 헤모글로빈 수준의 향상은 헤모글로빈 수준을 적어도 11.0 g/dL, 예를 들어 11.0 g/dL 내지 12.5 g/dL까지 향상시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 표 1 및/또는 표 14에 기재된 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 본원에 기재된 바와 같거나 당업계에 공지된 것과 같은 치료 방법 또는 절차와 함께 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 방법 또는 절차는 비제한적인 예로서: 치료학적 유효량의 ESA(예컨대 EPO), 에리스로포이에틴 또는 철의 투여 및 수혈을 포함한다. 치료는 전형적으로, 1주, 1개월, 3개월, 6개월 또는 1년의기간 동안 간격을 두고 계속된다. 일부 환자에서, 치료는 환자의 수명의 남은 기간 동안 투여된다.
본 발명의 치료제가 또 다른 작용제와 함께 투여되는 경우, 이 2개는 임의의 순서로 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 제2 작용제 또는 방법(예컨대 ESA, 에리스로포이에틴, 철, 수혈)을 이용한 요법을 또한 수령하고 있는 대상체에게 투여된다. 다른 양태에서, 결합 분자는 수술적 치료와 함께 투여된다.
BMP6-결합 항체와의 조합 치료에 적합한 작용제는, BMP6의 발현, 수준, 안정성 및/또는 활성을 억제하거나 감소시키는 당업계에 공지된 작용제를 포함한다. 이러한 작용제는 BMP6에 대한 항체, siRNA 및 저분자를 포함한다.
BMP6에 대한 다양한 항체들은 특히 하기의 문헌에 기재된 것들을 포함하여 당업계에 공지되어 있으며:
Andriopoulos et al. 2009 Nat. Genet. 41: 482-487;
Arndt et al. 2010 Gastroent. 138: 372-382;
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Schluesener et al. 2004 GLIA 12: 161-164;
Shi et al. 2009 Fert. Steril. 92: 1794-1798;
Varley et al. 1996 Exp. Neur. 140: 84-94;
Wang et al. 2007 Mol. Cell. Neurosci. 34: 653-661; 및
Zhang et al. 2006 Neurosci. 138: 47-53;
미국 특허 8,795,665; 및
WO 2010/056981;
BMP6에 대한 추가의 항체는 당업계에 공지되어 있고; 많은 것들은 상업적으로 입수 가능하다.
BMP6에 대한 다양한 siRNA는 특히 하기의 문헌에 기재된 것들을 포함하여 당업계에 공지되어 있다:
He et al. 2003 Cell. Signal. 25: 1372-1378;
Ikeda et al. 2012 PLoS 0040465;
Kautz et al. 2008 Blood 112: 1503;
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Xia et al. 2007 J. Biol. Chem. 282: 18129-18140;
Xia et al. 2008 Blood 111: 5195; 및
Yang et al. 2009 Int. J. Bioch. Cell Biol. 41: 853-861.
추가의 BMP6의 억제제가 공지되어 있다. 이들 중 임의의 것은 본원에 개시된 임의의 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 조합하여 사용될 수 있다.
조합 요법 양생법은 첨가적일 수 있거나, 이는 상승작용적 결과(예컨대 2개의 작용제들의 병용에 대해 예상된 것보다 큰 BMP6 활성의 감소)를 생성할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 BMP6-결합 항체 및 항-빈혈증 작용제 또는 방법, 예컨대 ESA, 에리스로포이에틴, 철 또는 수혈을 이용하여, 상기 기재된 바와 같이 빈혈증 또는 또 다른 BMP6-관련 질병을 예방하고/거나 치료하기 위한 조합 요법을 제공한다.
진단 용도
일 양태에서, 본 발명은 생물학적 시료(예컨대 혈액, 혈청, 세포, 조직)의 맥락에서, 또는 질병 또는 장애를 앓거나 빈혈증과 연관된 장애가 발병할 위험에 있는 개체로부터 BMP6 및/또는 핵산 발현 뿐만 아니라 BMP6 기능을 결정하기 위한 진단 검정법을 포함한다.
진단 검정법, 예컨대 경쟁적 검정법은 공통적인 결합 파트너 상의 제한된 양의 결합 부위에 대해 시험 시료 분석물과 경쟁하는, 표지된 유사체("트레이서")의 능력에 의존한다. 결합 파트너는 일반적으로, 경쟁 이전에 또는 이후에 불용성이고, 그 후에, 결합 파트너에 결합된 트레이서 및 분석물은 비결합된 트레이서 및 분석물로부터 분리된다. 이러한 분리는 디캔팅(decanting)(결합 파트너가 예비불용성화된 경우) 또는 원심분리(결합 파트너가 경쟁적 반응 후 침전된 경우)에 의해 달성된다. 시험 시료 분석물의 양은 마커 성분의 양에 의해 측정된 바와 같이, 결합된 트레이서의 양에 반비례한다. 공지된 양의 분석물을 이용한 용량-반응 곡선은, 시험 시료에 존재하는 분석물의 양을 정량적으로 결정하기 위해 제조되고 시험 결과와 비교된다. 이들 검정법은 검출 가능한 마커로서 효소가 사용되는 경우 ELISA 시스템이라고 한다. 이러한 형태의 검정법에서, 항체와 BMP6-결합 항체 사이의 경쟁적 결합은 본 발명의 결합된 BMP6, 바람직하게는 BMP6 에피토프를 초래하며, 이는 혈청 시료 내 항체, 가장 특히 혈청 시료 내 중화 항체의 측정값이다.
검정법의 유의한 이점은, 측정이 중화 항체(즉, BMP6, 구체적으로 에피토프의 결합을 간섭하는 것들)에 의해 직접적으로 이루어진다는 것이다. 이러한 검정법, 특히 ELISA 시험 형태의 검정법은 임상 환경 및 일상적인 혈액 스크리닝에서 상당한 적용을 가진다.
빈혈증과 연관된 장애를 갖는 환자의 임상적 진단 또는 모니터링에서, 정상적인 대상체로부터의 상응하는 생물학적 시료 내에서의 수준과 비교하여 BMP6 단백질의 검출은 빈혈증과 연관된 장애를 갖는 환자의 지표이다.
생체내 진단 또는 이미징은 US2006/0067935에 기재되어 있다. 간략하게는, 이들 방법은 일반적으로, 비-침습적 방법에 의해 검출 가능한 마커 또는 표지에 작동적으로 부착된 진단적 유효량의 BMP6 결합 분자를 환자에게 투여하거나 도입하는 단계를 포함한다. 항체-마커 접합체는 BMP6에 위치하고 결합하는 데 충분한 시간 동안 허용된다. 그 후에, 환자는 검출 가능한 마커를 식별하기 위해 검출 장치에 노출되고, 따라서 환자의 조직에서 BMP6 결합 분자의 위치의 이미지를 형성한다. BMP6 결합 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 존재는, 항체-마커가 조직의 구성성분에 결합하는지의 여부를 결정함으로써 검출된다. 빈혈증이 없는 정상적인 개체와 비교하여, BMP6 단백질 또는 단백질의 조합에서 증가된 수준의 검출은 빈혈증과 연관된 장애에 대한 및/또는 세트 상의 소인의 지표이다. 본 발명의 이러한 양태들은 또한, 조직에서 이미징 방법 및 조합된 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 것이다.
본 발명은 또한, 진단 검정법, 예후 검정법, 게놈약학 및 모니터링 임상 시험이 예후(예측) 목적을 위해 사용되어, 이로써 개체를 예방적으로 치료하기 위한 예측 의학 분야에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 개체가 BMP6 경로 활성의 조절장애와 연관된 장애가 발병할 위험에 있는지를 결정하기 위한 예후(또는 예측) 검정법을 제공한다. 예를 들어, BMP6 유전자에서의 돌연변이는 생물학적 시료 내에서 검정될 수 있다. 이러한 검정법은 예후 또는 예측 목적으로 사용될 수 있으며, 이로써 BMP6, 핵산 발현 또는 활성을 특징으로 하거나 연관된 장애의 발병 이전에 개체를 예방적으로 치료할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 개체에서 BMP6 핵산 발현 또는 BMP6 활성을 결정하기 위한 방법을 제공하며, 이로써, 해당 개체에게 적절한 치료적 또는 예방적 작용제(본원에서 "게놈약학"으로 지칭됨)를 선별한다. 게놈약학은 개체의 유전자형(예컨대 특정 작용제에 반응하는 개체의 능력을 결정하기 위해 검사된 개체의 유전자형)을 기초로 개체의 치료적 또는 예방적 치료를 위한 작용제(예컨대 약물)를 선별할 수 있게 한다.
본 발명의 보다 다른 양태는 임상 시험에서 BMP6의 발현 또는 활성에 미치는 작용제(예컨대 약물)의 영향을 모니터링하는 방법을 제공한다.
약제학적 조성물
본 발명은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제제화된 BMP6-결합 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 추가로, BMP6-연관 질병(예컨대 빈혈증)의 치료 또는 예방에 적합한 하나 이상의 다른 치료제를 함유할 수 있다. 약제학적으로 담체는 조성물을 증강시키거나 안정화시키거나, 조성물의 제조를 용이하게 한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리학적으로 화합성인 용매, 분산 배지, 코팅제, 항박테리아 및 항진균 작용제, 등장성 및 흡수 지연 작용제 등을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당업계에 공지된 여러 가지 방법들에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로 및/또는 방식은 요망되는 결과에 따라 다르다. 투여는 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하일 수 있거나, 표적 부위에 근접하게 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 상피 투여(예컨대 주사 또는 주입에 의함)에 적합해야 한다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉, 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자는, 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산의 작용 및 다른 천연 조건으로부터 이러한 화합물을 보호하기 위해 물질 내에서 코팅될 수 있다.
조성물은 멸균되고 유체이어야 한다. 적절한 유체성은 예를 들어, 코팅제, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장성제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨 및 소듐 클로라이드를 조성물에 포함하는 것이 바람직하다. 주사 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 유발될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당업계에 잘 공지되고 일상적으로 실시되는 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; 및 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다. 약제학적 조성물은 바람직하게는, GMP 조건 하에 제조된다. 전형적으로, 치료적 유효 용량 또는 효력 용량의 BMP6-결합 항체가 본 발명의 약제학적 조성물에 이용된다. BMP6-결합 항체는 당업자에게 공지된 종래의 방법에 의해 약제학적으로 허용 가능한 투여량 형태로 제제화된다. 투여량 양생법은 최적의 요망되는 반응(예컨대 치료적 반응)을 제공하기 위해 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스(bolus)가 투여될 수 있으며, 몇몇 분할된 용량들이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 용량은 치료 상황의 응급성에 의해 가리켜진 바와 같이 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 특히, 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태 내에서 비경구 조성물을 제제화하는 것이 유리하다. 본원에 사용된 바와 같이 투여 단위 형태는, 치료되는 대상체에 대한 유니타리(unitary) 투여량으로서 맞춰진 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 요망되는 치료 효과를 생성하는 것으로 계산된 예정된 양의 활성 화합물을 함유한다.
본 발명의 약제학적 조성물 내의 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게 독성이지 않으면서, 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 요망되는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하기 위해 다양해질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 이용되는 본 발명의 특정 조성물 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드, 투여 경로, 투여 시간, 이용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 이용되는 특정 조성물과 조합하여 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 질환, 일반적인 건강 상태 및 과거 병력 및 유사한 인자들을 포함하여 여러 가지 약물동력학적 인자들에 따라 다르다.
의사 또는 수의사는, 약제학적 조성물에 이용되는 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편의 용량을 요망되는 치료 효과를 달성하는 데 필요한 용량보다 낮은 수준에서 시작하고, 요망되는 효과가 달성될 때까지, 투여량을 점차 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 알레르기 염증 장애의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지의 여부, 투여되는 다른 약제, 및 치료가 예방적인지 치료적인지의 여부를 포함하여 많은 상이한 인자들에 따라 다르다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 적정될 필요가 있다. 항체를 전신 투여하는 경우, 투여량은 숙주 체중의 0.0001 내지 100 mg/kg 및 보다 통상 0.001 내지 15 mg/kg의 범위이다. 예시적인 치료 섭생은 1회의 전신 투여(예컨대 정맥내 또는 피하)를 수반하거나, 대안적으로 1회 초과, 예를 들어 2주마다 1회, 3주마다 1회, 또는 1개월마다 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회의 투약 스케쥴(예컨대 반복 투약)을 수반한다. 항체를 유리체내 투여하는 경우, 투여량 범위는 약 0.0001 내지 약 10 mg의 범위이다. 예시적인 치료 섭생은 2주마다 1회, 3주마다 1회, 또는 1개월마다 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회의 전신 투여를 수반한다.
항체는 통상, 여러번 투여된다. 단일 투여량 사이의 간격은 주, 월 또는 년일 수 있다. 간격은 또한, 환자에서 BMP6-결합 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 가리켜진 바와 같이 불규칙할 수 있다. 일부 전신 투여 방법에서, 투여량은 1 내지 1000 g/ml, 일부 방법에서는 25 내지 500 g/ml의 혈장 항체 농도를 달성하기 위해 조정된다. 대안적으로, 항체는 지속 방출 제제로서 투여될 수 있으며, 이러한 경우, 덜 빈번한 투여가 필요하다. 투여량 및 빈도는 환자에서 항체의 반감기에 따라 다르다. 일반적으로, 인간화된 항체는 키메라 항체 및 비인간 항체보다 긴 반감기를 보여준다. 투여량 및 투여 빈도는, 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 다를 수 있다. 예방적 적용에서, 비교적 낮은 투여량이 장기간에 걸쳐 비교적 덜 빈번한 빈도로 투여된다. 일부 환자는 이들의 삶의 남은 기간 동안 치료를 계속 받는다. 치료적 적용에서, 질병 진행이 감소되거나 종료될 때까지, 바람직하게는 환자가 질병 증상의 부분적인 또는 완전한 개선을 보여줄 때까지, 비교적 높은 투여량이 비교적 짧은 간격에서 이따금 필요하다. 그 후에, 환자는 예방적 섭생으로 투여받을 수 있다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 조성물은 0.001 mg/kg 내지 0.1 mg/kg의 용량(항체 또는 이의 항원-결합 단편)으로 투여된다. 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 조성물은 약 0.001 mg/kg 내지 약 0.1 mg/kg의 용량으로 투여된다. 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 조성물은 0.001 mg/kg, 0.0016 mg/kg, 0.0025 mg/kg, 0.0040 mg/kg, 0.0063 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.016 mg/kg, 0.025 mg/kg, 0.040 mg/kg, 0.063 mg/kg 또는 0.1 mg/kg의 용량으로 투여된다. 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 조성물은 약 0.001 mg/kg, 약 0.0016 mg/kg, 약 0.0025 mg/kg, 약 0.0040 mg/kg, 약 0.0063 mg/kg, 약 0.01 mg/kg, 약 0.016 mg/kg, 약 0.025 mg/kg, 약 0.040 mg/kg, 약 0.063 mg/kg 또는 약 0.1 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 조성물은 예를 들어 상기 언급된 용량들 중 임의의 용량에서를 포함하여, 정맥내 투여된다. 실시형태에서, 정맥내 투여는 정맥내 주입이다. 실시형태에서, 주입은 30 내지 60분 동안 소요된다. 실시형태에서, 주입은 약 30 내지 60분 동안 소요된다.
페리틴의 수준
개시된 방법은 생물학적 시료, 예를 들어 혈액 또는 혈청으로부터 페리틴 수준을 결정하는 단계를 수반할 수 있으며, 실시형태에서, 환자, 예를 들어 본원에 기재된 질병, 예를 들어 빈혈증을 갖는 환자는 페리틴 수준을 기초로 하여, BMP6 길항제(예컨대 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 BMP6 항체, 예를 들어 항체 7, 예를 들어 표 1에 기재된 바와 같이)를 이용한 치료를 위해 선별되거나, BMP6 길항제 요법에 대한 반응을 갖는 것으로 예측된다.
실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1500 ng/mL 이하이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1500 ng/mL 이하이다. 실시형태에서, 페리틴 수준은 1500 ng/mL 미만이다. 실시형태에서, 페리틴 수준은 약 2000 ng/mL 이하이다. 실시형태에서, 페리틴 수준은 2000 ng/mL 이하이다. 실시형태에서, 페리틴 수준은 약 2000 ng/mL 미만이다.
실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1450 ng/mL 이하, 예를 들어 약 1400 ng/mL 이하, 약 1350 ng/mL 이하, 약 1300 ng/mL 이하, 약 1250 ng/mL 이하, 약 1200 ng/mL 이하, 약 1150 ng/mL 이하, 약 1100 ng/mL 이하, 약 1050 ng/mL 이하 또는 약 1000 ng/mL 이하 등이다.
실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 200 ng/mL 이상, 예를 들어 약 250 ng/mL 이상, 약 300 ng/mL 이상, 약 350 ng/mL 이상, 약 400 ng/mL 이상, 약 450 ng/mL 이상, 약 500 ng/mL 이상, 약 550 ng/mL 이상, 약 600 ng/mL 이상, 약 650 ng/mL 이상, 약 700 ng/mL 이상, 약 750 ng/mL 이상, 약 800 ng/mL 이상, 약 850 ng/mL 이상, 약 900 ng/mL 이상, 약 950 ng/mL 이상, 약 1000 ng/mL 이상 또는 약 1500 ng/mL 이상 등이다. 실시형태에서, 페리틴 수준은 상기 언급된 수준들 중 임의의 수준 내지 약 2000 ng/mL이다.
실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 500 ng/mL 이상, 약 550 ng/mL 이상, 약 600 ng/mL 이상, 약 650 ng/mL 이상, 약 700 ng/mL 이상, 약 750 ng/mL 이상, 약 800 ng/mL 이상, 약 850 ng/mL 이상, 약 900 ng/mL 이상, 약 950 ng/mL 이상, 약 1000 ng/mL 이상 또는 약 1500 ng/mL 이상 등이다. 실시형태에서, 페리틴 은 상기 언급된 수준들 중 임의의 수준 내지 약 2000 ng/mL이다.
실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 500 ng/mL 이상이다. 실시형태에서, 페리틴 수준은 약 500 ng/mL 내지 약 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준은 약 500 ng/mL 내지 약 1000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준은 약 500 ng/mL 내지 약 1500 ng/mL이다.
실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 200 ng/mL 내지 약 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 300 ng/mL 내지 약 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 400 ng/mL 내지 약 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 500 ng/mL 내지 약 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 600 ng/mL 내지 약 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 700 ng/mL 내지 약 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 800 ng/mL 내지 약 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 900 ng/mL 내지 약 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1000 ng/mL 내지 약 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1100 ng/mL 내지 약 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1200 ng/mL 내지 약 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1300 ng/mL 내지 약 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1400 ng/mL 내지 약 1500 ng/mL이다.
실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 200 ng/mL 내지 약 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 300 ng/mL 내지 약 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 400 ng/mL 내지 약 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 500 ng/mL 내지 약 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 600 ng/mL 내지 약 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 700 ng/mL 내지 약 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 800 ng/mL 내지 약 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 900 ng/mL 내지 약 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1000 ng/mL 내지 약 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1100 ng/mL 내지 약 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1200 ng/mL 내지 약 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1300 ng/mL 내지 약 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1400 ng/mL 내지 약 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1500 ng/mL 내지 약 1600 ng/mL이다.
실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 200 ng/mL 내지 약 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 300 ng/mL 내지 약 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 400 ng/mL 내지 약 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 500 ng/mL 내지 약 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 600 ng/mL 내지 약 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 700 ng/mL 내지 약 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 800 ng/mL 내지 약 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 900 ng/mL 내지 약 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1000 ng/mL 내지 약 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1100 ng/mL 내지 약 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1200 ng/mL 내지 약 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1300 ng/mL 내지 약 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1400 ng/mL 내지 약 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1500 ng/mL 내지 약 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1600 ng/mL 내지 약 1700 ng/mL이다.
실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 200 ng/mL 내지 약 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 300 ng/mL 내지 약 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 400 ng/mL 내지 약 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 500 ng/mL 내지 약 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 600 ng/mL 내지 약 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 700 ng/mL 내지 약 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 800 ng/mL 내지 약 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 900 ng/mL 내지 약 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1000 ng/mL 내지 약 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1100 ng/mL 내지 약 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1200 ng/mL 내지 약 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1300 ng/mL 내지 약 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1400 ng/mL 내지 약 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1500 ng/mL 내지 약 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1600 ng/mL 내지 약 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1700 ng/mL 내지 약 1800 ng/mL이다.
실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 200 ng/mL 내지 약 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 300 ng/mL 내지 약 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 400 ng/mL 내지 약 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 500 ng/mL 내지 약 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 600 ng/mL 내지 약 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 700 ng/mL 내지 약 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 800 ng/mL 내지 약 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 900 ng/mL 내지 약 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1000 ng/mL 내지 약 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1100 ng/mL 내지 약 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1200 ng/mL 내지 약 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1300 ng/mL 내지 약 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1400 ng/mL 내지 약 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1500 ng/mL 내지 약 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1600 ng/mL 내지 약 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1700 ng/mL 내지 약 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1800 ng/mL 내지 약 1900 ng/mL이다.
실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 200 ng/mL 내지 약 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 300 ng/mL 내지 약 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 400 ng/mL 내지 약 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 500 ng/mL 내지 약 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 600 ng/mL 내지 약 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 700 ng/mL 내지 약 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 800 ng/mL 내지 약 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 900 ng/mL 내지 약 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1000 ng/mL 내지 약 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1100 ng/mL 내지 약 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1200 ng/mL 내지 약 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1300 ng/mL 내지 약 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1400 ng/mL 내지 약 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1500 ng/mL 내지 약 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1600 ng/mL 내지 약 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1700 ng/mL 내지 약 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1800 ng/mL 내지 약 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 약 1900 ng/mL 내지 약 2000 ng/mL이다.
실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 200 ng/mL 내지 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 300 ng/mL 내지 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 400 ng/mL 내지 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 500 ng/mL 내지 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 600 ng/mL 내지 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 700 ng/mL 내지 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 800 ng/mL 내지 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 900 ng/mL 내지 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1000 ng/mL 내지 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1100 ng/mL 내지 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1200 ng/mL 내지 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1300 ng/mL 내지 1500 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1400 ng/mL 내지 1500 ng/mL이다. 바람직한 실시형태에서, 모든 범위는 언급된 종점 값을 포함한다.
실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 200 ng/mL 내지 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 300 ng/mL 내지 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 400 ng/mL 내지 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 500 ng/mL 내지 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 600 ng/mL 내지 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 700 ng/mL 내지 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 800 ng/mL 내지 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 900 ng/mL 내지 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1000 ng/mL 내지 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1100 ng/mL 내지 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1200 ng/mL 내지 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1300 ng/mL 내지 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1400 ng/mL 내지 1600 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1500 ng/mL 내지 1600 ng/mL이다. 바람직한 실시형태에서, 모든 범위는 언급된 종점 값을 포함한다.
실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 200 ng/mL 내지 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 300 ng/mL 내지 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 400 ng/mL 내지 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 500 ng/mL 내지 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 600 ng/mL 내지 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 700 ng/mL 내지 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 800 ng/mL 내지 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 900 ng/mL 내지 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1000 ng/mL 내지 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1100 ng/mL 내지 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1200 ng/mL 내지 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1300 ng/mL 내지 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1400 ng/mL 내지 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1500 ng/mL 내지 1700 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1600 ng/mL 내지 1700 ng/mL이다. 바람직한 실시형태에서, 모든 범위는 언급된 종점 값을 포함한다.
실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 200 ng/mL 내지 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 300 ng/mL 내지 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 400 ng/mL 내지 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 500 ng/mL 내지 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 600 ng/mL 내지 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 700 ng/mL 내지 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 800 ng/mL 내지 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 900 ng/mL 내지 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1000 ng/mL 내지 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1100 ng/mL 내지 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1200 ng/mL 내지 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1300 ng/mL 내지 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1400 ng/mL 내지 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1500 ng/mL 내지 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1600 ng/mL 내지 1800 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1700 ng/mL 내지 1800 ng/mL이다. 바람직한 실시형태에서, 모든 범위는 언급된 종점 값을 포함한다.
실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 200 ng/mL 내지 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 300 ng/mL 내지 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 400 ng/mL 내지 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 500 ng/mL 내지 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 600 ng/mL 내지 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 700 ng/mL 내지 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 800 ng/mL 내지 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 900 ng/mL 내지 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1000 ng/mL 내지 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1100 ng/mL 내지 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1200 ng/mL 내지 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1300 ng/mL 내지 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1400 ng/mL 내지 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1500 ng/mL 내지 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1600 ng/mL 내지 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1700 ng/mL 내지 1900 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1800 ng/mL 내지 1900 ng/mL이다. 바람직한 실시형태에서, 모든 범위는 언급된 종점 값을 포함한다.
실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 200 ng/mL 내지 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 300 ng/mL 내지 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 400 ng/mL 내지 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 500 ng/mL 내지 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 600 ng/mL 내지 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 700 ng/mL 내지 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 800 ng/mL 내지 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 900 ng/mL 내지 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1000 ng/mL 내지 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1100 ng/mL 내지 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1200 ng/mL 내지 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1300 ng/mL 내지 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1400 ng/mL 내지 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1500 ng/mL 내지 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1600 ng/mL 내지 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1700 ng/mL 내지 2000 ng/mL이다. 실시형태에서, 페리틴 수준, 예를 들어 BMP6를 이용한 치료에 대한 반응(예컨대 증가된 반응)을 예측하는 페리틴 수준은 1800 ng/mL 내지 2000 ng/mL이다. 바람직한 실시형태에서, 모든 범위는 언급된 종점 값을 포함한다.
실시형태에서, 상기 기재된 페리틴 수준은 혈액 및 혈청으로부터 선별된 생물학적 시료로부터 측정된다. 실시형태에서, 상기 기재된 페리틴 수준은 혈청으로부터 측정된다.
검정 기술, 진단 방법 및 전송 가능한 형태의 정보의 생성 방법
개시된 방법은 낮은 철 수준과 연관된 질병, 예를 들어 본원에 기재된 질병, 예를 들어 빈혈증의 치료, 예방 또는 개선, 뿐만 아니라 BMP6 길항제, 예를 들어 항체 7(예컨대 표 1에 기재된 바와 같음)을 이용한 치료에 대한 질병 환자의 반응 가능성을 예측하는 데 유용하다. 이들 방법은 특히, 환자가 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 특정 페리틴 수준을 갖는지를 환자로부터의 시료 내에서 결정하는 단계를 이용한다.
환자로부터의 생물학적 시료는 임의의 적용 가능한 종래의 수단에 의해 페리틴 수준에 대해 검정될 수 있다.
마커, 예를 들어 단백질의 존재, 유전자 또는 단백질의 발현 수준 및 단백질의 활성을 식별하기 위해, 수많은 생물학적 시료, 예를 들어, 혈액, 관절 낭액, 연막, 혈청, 혈장, 림프, 대변, 소변, 눈물, 타액, 뇌척수액, 구강 면봉(buccal swab), 가래 또는 조직이 사용될 수 있다. 생물학적 시료 내의 다양한 공급원들은 개시된 방법에 사용될 수 있으며, 예를 들어 당업자는 환자로부터의 생물학적 시료, 예를 들어 혈액 또는 혈청을 페리틴 수준에 대해 검정할 수 있다.
본 발명자들은, 페리틴 수준이 BMP9 길항제를 이용한 요법을 결정하거나 예측하는 데 있어서 유용한 바이오마커일 수 있다고 결정하였다. 이에, 당업자는, 환자로부터의 생물학적 시료, 예를 들어 혈액 또는 혈청을 페리틴 수준에 대해 검정함으로써, 대상체가 주어진 페리틴 수준을 갖는지 식별할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 환자 혈청은, 대상체가 특정 페리틴 수준을 갖는지 결정하기 위해 분석된다. 다른 바람직한 실시형태에서, 환자 혈액은, 대상체가 특정 페리틴 수준을 갖는지 결정하기 위해 분석된다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명은 부분적으로는, 빈혈증 또는 본원에 기재된 다른 질병에 대한 BMP6 길항작용(예컨대 항체 7, 표 1에 기재된 바와 같음)에 대한 향상된 반응을 예측하는 데 유용할 수 있다는 결론을 기초로 한다. 페리틴의 검출은 비제한적으로 면역세포화학 염색, ELISA, 유세포분석, 웨스턴 블롯, 분광광도법, HPLC 및 질량 분석을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 시료 내에서 폴리펩타이드 생성물을 검출하기 위한 하나의 방법은, 마커 단백질(예컨대 페리틴 단백질과 결합할 수 있는 항체)과 특이적으로 상호작용할 수 있는 결합 단백질인 프로브에 의해서이다. 바람직하게는, 표지된 항체, 이의 결합부, 또는 다른 결합 파트너가 사용될 수 있다. 항체는 기원이 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있거나, 생합성적으로 생성될 수 있다. 결합 파트너는 또한, 천연 발생 분자이거나 합성적으로 생성될 수 있다. 복합체화된 단백질의 양은 당업계에 기재된 표준 단백질 검출 방법을 사용하여 결정된다. 면역학적 검정법 디자인, 이론 및 프로토콜에 대한 상세한 리뷰는 문헌[Practical Immunology, Butt, W. R., ed., Marcel Dekker, New York, 1984]를 포함하여 당업계의 수많은 텍스트들에서 찾을 수 있다. 여러 가지 검정법들은 표지된 항체를 이용하여 단백질을 검출하는 데 이용 가능하다. 직접 표지는 항체에 부착된 형광 또는 발광 태그, 금속, 염료, 방사성핵종 등을 포함한다. 간접 표지는 당업계에 잘 공지된 다양한 효소들, 예컨대 알칼리 포스파타제, 수소 퍼옥시다제 등을 포함한다. 1-단계 검정법에서, 폴리펩타이드 생성물이 존재하는 경우, 이러한 생성물은 고정되고, 표지된 항체와 함께 인큐베이션된다. 표지된 항체는 고정된 표적 분자에 결합한다. 비결합된 분자를 제거하기 위해 세척한 후, 시료는 표지에 대해 검정된다.
단백질 또는 폴리펩타이드에 특이적인 고정된 항체의 용도 또한, 본 개시내용에 의해 고려된다. 항체는 여러 가지 고체 지지체, 예컨대 자기 또는 크로마토그래피 매트릭스 입자 상, 검정법 장소의 표면(예컨대 마이크로타이터 웰), 고체 기질 물질 조각(예컨대 플라스틱, 나일론, 종이) 등에 고정될 수 있다. 검정법 스트립은 어레이 내의 항체 또는 복수의 항체들을 고체 지지체 상에 코팅함으로써 제조될 수 있다. 그 후에, 이러한 스트립은 시험 시료 내에 침지되고, 그 후에 세척 및 검출 단계를 통해 신속하게 처리되어, 측정 가능한 신호, 예컨대 착색된 스팟을 발생시킬 수 있다.
2-단계 검정법에서, 고정된 마커(예컨대 페리틴)는 비표지된 항체와 함께 인큐베이션될 수 있다. 그 후에, 비표지된 항체 복합체가 존재하는 경우, 이는 상기 비표지된 항체에 특이적인 제2의 표지된 항체에 결합된다. 시료가 세척되고, 표지의 존재에 대해 검정된다. 항체를 표지하는 데 사용되는 마커의 선택은 적용에 따라 다를 것이다. 그러나, 마커의 선택은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 항체는 방사성 원자, 효소, 발색단 또는 형광 모이어티 또는 비색 태그를 이용하여 표지될 수 있다. 태깅 표지의 선택은 또한, 요망되는 검출 한계에 따라 다를 것이다. 효소 검정법(ELISA)은 전형적으로, 효소-태깅된 복합체와 효소 기질의 상호작용에 의해 형성된 착색된 생성물이 검출될 수 있게 한다. 방사성 원자의 일부 예는 32P, 125I, 3H 및 14P를 포함한다. 효소의 일부 예는 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제를 포함한다. 발색단 모이어티의 일부 예는 플루오레세인 및 로다민을 포함한다. 항체는 당업계에 공지된 방법에 의해 이들 표지에 접합될 수 있다. 예를 들어, 효소 및 발색단 분자는 커플링제, 예컨대 디알데하이드, 카르보디이미드, 디말레이미드 등에 의해 항체에 접합될 수 있다. 대안적으로, 접합은 리간드-수용체 쌍을 통해 발생할 수 있다. 일부 적합한 리간드-수용체 쌍은 예를 들어, 비오틴-아비딘 또는 -스트렙타비딘 및 항체-항원을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 생물학적 시료 내에서 폴리펩타이드 생성물을 검출하기 위한 샌드위치 기술의 사용을 고려한다. 이 기술은 관심 단백질에 결합할 수 있는 2개의 항체들을 필요로 한다: 예를 들어, 일부 쉽게 검출 가능한 화학적 화합물로 표지된, 고체 지지체 상에 고정된 항체 및 용액 내에서 유리(free) 상태인 항체. 제2 항체에 사용될 수 있는 화학적 표지의 예는, 반응물 또는 효소 기질에 노출 시, 착색된 또는 전기화학적으로 활성인 생성물을 발생시키는 방사성동위원소, 형광 화합물 및 효소 또는 다른 분자를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 폴리펩타이드 생성물을 함유하는 시료가 이 시스템에 놓이는 경우, 폴리펩타이드 생성물은 고정된 항체 및 표지된 항체 둘 다에 결합한다. 그 결과는, 지지체의 표면 상의 "샌드위치" 면역 복합체이다. 복합체화된 단백질은, 비결합된 시료 구성성분 및 과량의 표지된 항체를 세척해 내고, 지지체의 표면 상의 단백질에 복합체화된 표지된 항체의 양을 측정함으로써 검출된다. 샌드위치 면역검정은, 검출 한계가 양호한 표지가 사용되는 한, 고도로 특이적이고 매우 감수성이다.
바람직하게는, 시료 내에서 폴리펩타이드 생성물의 존재는 방사성면역검정 또는 효소-연결된 면역검정, 경쟁적 결합 효소-연결된 면역검정, 도트 블롯, 웨스턴 블롯, 크로마토그래피, 바람직하게는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 또는 당업계에 공지된 다른 검정법에 의해 검출된다. 항체와 단백질 또는 폴리펩타이드의 특이적인 면역학적 결합은 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다.
도트 블로팅은 항체를 프로브로서 사용하여 요망되는 단백질을 검출하기 위해 당업자에 의해 일상적으로 실시된다(문헌[Promega Protocols and Applications Guide, Second Edition, 1991, Page 263, Promega Corporation]). 시료는 도트 블롯 장치를 사용하여 막에 적용된다. 표지된 프로브는 막과 함께 인큐베이션되고, 단백질의 존재가 검출된다.
웨스턴 블롯 분석은 당업자에게 잘 공지되어 있다(문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989, Vol. 3, Chapter 18, Cold Spring Harbor Laboratory]). 웨스턴 블롯에서, 시료는 SDS-PAGE에 의해 분리된다. 겔은 막으로 옮겨진다. 막은 요망되는 단백질의 검출을 위해 표지된 항체와 함께 인큐베이션된다.
상기 기재된 검정법은 예컨대 비제한적으로, 면역블로팅, 면역확산, 면역전기영동 또는 면역침전 단계를 수반한다. 일부 실시형태에서, 페리틴 존재 및/또는 수준을 결정하기 위해, 자동 분석기가 사용된다.
페리틴 활성의 수준은 당업계에 개시된 다양한 방법들에 의해, 문헌[Kochan et al. (2011) Proc Natl Acad Sci U S A. 108(19):7745-50]에 제시된 방법을 통해 검정될 수 있다.
비교를 위해, 환자로부터의 페리틴 발현, 페리틴 단백질 또는 페리틴 활성의 수준은 대조군으로부터의 페리틴 발현, 페리틴 단백질 또는 페리틴 활성의 수준과 비교될 수 있다. 대조군은 경우에 따라, BMP6 길항제(예컨대 항체 7, 표 1에 기재됨)를 이용한 치료에 양호하게 반응하는 것으로 공지된 대상체(예컨대 빈혈증 환자), 또는 BMP6 길항제(예컨대 항체 7, 표 1에 기재됨)를 이용한 치료에 불량하게 반응하는 것으로 공지된 대상체로부터 유래된 페리틴 발현, 페리틴 단백질 또는 페리틴 활성의 참조 수준일 수 있다. 발현의 대조군 수준은 참조 대상체(즉, BMP6 길항제(예컨대 항체 7, 표 1에 기재됨)를 이용한 치료에 양호하게 반응하는 것으로 공지된 빈혈증 환자, 또는 BMP6 길항제(예컨대 항체 7, 표 1에 기재됨)를 이용한 치료에 불량하게 반응하는 것으로 공지된 대상체)로부터의 생물학적 시료로부터 유래될 수 있거나, 단순히 참조 대상체로부터 이전에 유래된 수치 표준(예컨대 평균, 중앙, 범위, [+/- 표준 편차])일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대조군은 BMP6 길항제를 이용한 치료에 불량하게 반응하는 것으로 공지된 대상체로부터 유래된 페리틴 발현, 페리틴 단백질 또는 페리틴 활성의 참조 수준이고, 환자로부터의 페리틴 발현, 페리틴 단백질 또는 페리틴 활성의 수준(경우에 따라서)이 이러한 대조군과 비교된다. 다른 실시형태에서, 대조군은 BMP6 길항제를 이용한 치료에 양호하게 반응하는 것으로 공지된 대상체로부터 유래된 페리틴 발현, 페리틴 단백질 또는 페리틴 활성의 참조 수준이고, 치료되는 환자로부터의 페리틴 발현, 페리틴 단백질 또는 페리틴 활성의 수준이 이러한 대조군과 비교되며, 여기서, (대조군과 비례하여) 환자에서 유사한(예컨대 통계학적으로 유사한) 페리틴 발현, 페리틴 단백질 또는 페리틴 활성의 수준은, 환자가 BMP6 길항제(예컨대 항체 7, 표 7에 기재됨)를 이용한 치료에 반응할 증가된 가능성을 가질 것이라는 지표를 제공한다.
페리틴 발현, 페리틴 단백질 또는 페리틴 활성의 존재 또는 수준을 결정하는 단계를 필요로 하는 본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법을 수행하는 데 있어서, 이러한 결정은, 환자가 관심 마커(또는 마커의 수준)를 갖는지 결정하기 위해 환자의 조성물에 대한 충분한 정보를 함유하는 데이터 저장소를 참고함으로써 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 데이터 저장소는 개체에서 관심 마커 및 마커의 수준을 열거하고 있다. 데이터 저장소는, 적절한 정보 또는 유전적 데이터가 저장될 수 있는 컴퓨터 또는 다른 전자 또는 비-전자 매체에 의해 접근 가능한 개별 환자의 기록, 의료 데이터 카드, 파일(예컨대 플랫 ASCII 파일)을 포함할 수 있을 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 의료 데이터 카드는 휴대용 저장 장치, 예컨대 자기 데이터 카드, 온-보드 프로세싱 유닛(on-board processing unit)을 갖고 독일 뮌헨 소재의 Siemens사와 같은 판매회사들에 의해 판매되는 스마트 카드, 또는 플래쉬-메모리 카드이다. 데이터 저장소가 컴퓨터에 의해 접근 가능한 파일인 경우; 이러한 파일은 서버, 클라이언트, 하드 디스크, CD, DVD, 개인 휴대용 단말기, 예컨대 스마트폰, 팜 파일럿(Palm Pilot), 테이프 레코더, 집 디스크, 컴퓨터의 내장 ROM(판독-전용-기억장치) 또는 인터넷 또는 월드와이드 웹을 포함하는 다양한 매체들 상에 위치할 수 있다. 컴퓨터에 의해 접근 가능한 파일의 저장을 위한 다른 매체는 당업자에게 명백할 것이다.
전형적으로, 일단 페리틴 발현, 페리틴 단백질 또는 페리틴 활성의 수준이 결정되면, 의사, 유전자 카운셀러, 환자 또는 다른 연구자들이 그 결과를 알게 될 수 있다. 구체적으로, 결과는 다른 연구자, 의사, 유전자 카운셀러 또는 환자에게 소통되거나 전송될 수 있는 전송 가능한 형태의 정보로 캐스트될 수 있다. 이러한 형태는 다양할 수 있고, 유형 또는 무형일 수 있다. 개별 시험에서의 결과는 서술적 진술, 다이어그램, 사진, 챠트, 이미지 또는 임의의 다른 시각적 형태로 구현될 수 있다. 예를 들어, 겔 전기영동 또는 포착 검정법의 이미지가 결과를 설명하는 데 사용될 수 있다. 페리틴 발현, 페리틴 단백질 또는 페리틴 활성의 수준에 관한 진술은 또한, 시험 결과를 가리키는 데 유용할 수 있다. 이들 진술 및 시각적 형태는 유형 매체, 예컨대 종이, 컴퓨터 판독 매체, 예컨대 플로피 디스크, 소형 디스크 등 또는 무형 매체, 예를 들어 이메일 또는 인터넷이나 인트라넷 상의 웹사이트 형태의 전자 매체 상에 기록될 수 있다. 또한, 결과는 사운드 형태로 기록되고, 임의의 적합한 매체, 예를 들어 아날로그 또는 디지털 케이블 선, 광섬유 케이블 등을 통해, 전화기, 팩스, 무선 이동 전화기, 인터넷폰 등을 통해 전송될 수 있다. 이러한 모든 형태들(유형 및 무형)은 "전송 가능한 형태의 정보"를 구성할 것이다. 따라서, 시험 결과 상의 정보 및 데이터는 세계 어디에서나 생성되고, 상이한 장소로 전송될 수 있다. 따라서, 전송 가능한 형태의 시험 결과는 미국에 수입될 수 있다. 이에, 본 개시내용은 또한, 개체에서 페리틴 발현, 페리틴 단백질 또는 페리틴 활성의 수준을 함유하는 전송 가능한 형태의 정보를 생성하는 방법을 포함한다. 이러한 형태의 정보는, 해당 정보를 기초로 하여 치료 경로를 선택하고 해당 정보를 기초로 하여 환자를 선택적으로 치료하기 위해, 본원에 기재된 질병, 예를 들어 빈혈증을 갖는 환자의 반응성을 BMP6 길항제를 이용하여 예측하는 데 유용하다.
본원에, 페리틴 단백질 수준을 갖는 환자가 BMP6 길항제를 이용한 치료에 반응할(예컨대 동일한 또는 유사한 질병을 앓고 있는 일반적인 환자 집단과 비례하여 예를 들어 증강된 효능으로 반응할) 가능성을 예측하는 방법이 개시되어 있으며, 상기 방법은 환자로부터의 생물학적 시료 내에서 페리틴 수준을 검출하는 단계를 포함하고, 여기서, 본원에 기재된 페리틴 수준, 예를 들어 1500 ng/mL 이하가, 환자가 BMP6 길항제를 이용한 치료에 반응할 증가된 가능성의 지표이다.
일부 실시형태에서, 이러한 방법은 환자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서, 수득 단계는 검정 단계 이전에 수행된다.
일부 실시형태에서, 생물학적 시료는 관절 낭액, 혈액, 혈청, 대변, 혈장, 소변, 눈물, 타액, 뇌척수액, 백혈구 시료 및 조직 시료로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 생물학적 시료는 혈액 또는 혈청이다.
일부 실시형태에서, 페리틴 발현, 페리틴 단백질 또는 페리틴 활성의 존재 및/또는 수준은 면역검정, 면역조직화학, ELISA, 유세포분석, 웨스턴 블롯, HPLC 및 질량 분석으로 구성된 군으로부터 선택된 기술에 의해 검출된다.
개시된 방법 및 용도의 일부 실시형태에서, BMP6 길항제는 BMP6 결합 분자 또는 BMP6 수용체 결합 분자이다. 일부 실시형태에서, BMP6 결합 분자 또는 BMP6 수용체 결합 분자는 BMP6 결합 분자이다. 일부 실시형태에서, BMP6 결합 분자는 BMP6 항체 또는 이의 항원-결합부이다.
개시된 방법 및 용도의 일부 실시형태에서, BMP6 항체는 항체 7, 예를 들어 표 1에 기재된 바와 같은 것이다.
치료 방법 및 BMP6 길항제의 용도
개시된 방법은 의사가, 본원에 기재된 질병을 앓고 있는 환자, 예를 들어 빈혈증 환자에게 개인맞춤형 요법을 제공할 수 있게 하며, 즉, 이들 방법은 환자를 BMP6 길항제(예컨대 항체 7, 예를 들어 표 1에 기재된 바와 같음)를 이용하여 선택적으로 치료할 것인지 결정할 수 있게 한다. 이러한 방식으로, 의사는 본원에 기재된 질병, 예를 들어 빈혈증을 앓고 있는 환자의 전체 집단에서 BMP6 길항작용의 이득은 최대화하고 위험성을 최소화할 수 있다. BMP6 길항제, 예를 들어 BMP6 결합 분자(예컨대 BMP6 항체 또는 이의 항원-결합부, 예를 들어 항체 7, 예를 들어 표 1에 기재된 바와 같음) 또는 BMP6 수용체 결합 분자(예컨대 BMP6 수용체 항체 또는 이의 항원-결합부)가 본원에 개시된 바와 같이 본원에 기재된 질병, 예를 들어 빈혈증(예컨대 징후 및 증상 등), 특히 본원에 기재된 페리틴 수준을 갖는 환자에서의 치료, 예방 또는 개선에 유용한 것으로 이해될 것이다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지 않으면서 본 발명을 더 예시하기 위해 제공된다. 본 발명의 다른 변화는 당업자에게 쉽게 자명될 것이고, 첨부된 청구항에 포함된다.
실시예 1 - 항-BMP6 항체의 시험관내 및 생체내 활성 및 PK/PD
재료
시험 화합물은 50 mM 시트레이트 완충제, pH 7.0, 150 mM NaCl 중 약 8 mg/ml의 농도의 항체 5, 6 및 7(표 8)이었으며, 동물에게 투여하기 이전에 PBS 내에서 희석되었다. 수컷 C56BL/6 마우스 또는 Sprague Dawley 래트를 사용하였다(표 9).
[표 8]
BMP6 길항제 항체의 특성
Figure 112019004117535-pct00023
[표 9]
동물 특징
Figure 112019004117535-pct00024
BMP 리포터 유전자 검정법을 위해, pGL4-BRE2-Luc2로부터 유래된 반딧불이 루시퍼라제를 구동하는 프로모터(문헌[Korchynskyi et al. 2002. J. Biol. Chem. 277: 4882-91]) 내에 BMP 반응 요소 BRE를 함유하는 렌티바이러스 벡터를 구축하였다. 이러한 렌티바이러스 벡터를 사용하여, HEP3B 간종양 세포주를 안정하게 형질감염시켰다. 이 세포주를, 10% 태아 소 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 5 μg/ml 블라스티시딘(Blasticidin)을 함유하는 EMEM에서 유지시켰다. 재조합 인간 BMP 단백질을 R&D Systems사로부터 구매하였다.
60 ml 병 내의 브루셀라 아보르투스 링(Ring) 시험 항원(균주 1119-3)을 미국 아이오와주 에임스 소재의 미국 농림동식물 건강 검염소의 미국 수의학 검역 실험실로부터 구매하였다. 부루셀로시스 링(Brucellosis ring) 시험 항원은 페놀화된 완충제 중 사멸, 염색된 비. 아보르투스 균주 1119-3 세포의 현탁액을 함유한다. 각각 60 mL 병의 농도는 대략 109개 입자/ml이다. 5 X 109개 스톡(stock)을 세척하고, 하기 방식으로 제조한다. 우선, 60 ml 병을 냉장고로부터 꺼내고, 완전히 혼합한다. 그 후에, 500 ml의 BA를 500 mL 원심분리 병으로 옮긴다. 그 후에, 이들을 원심분리기를 사용하여 10,000 rpm에서 15분 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고, 100 mL PBS에 재현탁시켜, 5 X 109개 입자/ml 스톡을 생성하고, 이를 분취한 다음 -80℃에서 동결시켰다.
동물 유지 조건
동물을 순응 및 연구 기간 동안 마이크로-아이솔레이터(micro-isolator) 고체-바닥 케이지에서 사회적으로 사육하였다. 동물을 21 내지 23℃의 실온 및 30 내지 70%의 습도에서 하기와 같이 표준 광 주기 하에 유지시켰다: 12시간 명, 12시간 암(점등: 6:30 AM, 소등: 6:30 PM). 순응 및 연구 기간 동안, 동물에게 설치류 사료 및 물을 마음대로(자유자재로) 먹도록 접근을 제공하였다.
실험 조건
BMP 리포터 유전자 검정법에서 항체 활성의 결정
전형적인 검정법에서, 0.6 × 104 BRE-Luc2 HEP3B 세포를 384-웰 플레이트 상에서 25 μl의 기본 배양 배지 내에 접종하되, 혈청을 2%까지 감소시켰다. 이튿날, PBS 내에서 희석된 항체를 첨가하고, 후속해서 BMP6를 10 ng/ml의 최종 농도까지 첨가하였다. 임의의 혈청 없이 EMEM 배지를 이용하여 용적을 50 μl까지 되게 하여, 1%의 최종 혈청 농도를 만들었다. 계수 검정법으로서, BMP2/4/7을 이용한 활성화를 동시에 수행하였다. 항체 첨가 후 24시간째에 BrighGlo 검정법(Promega)을 제조업체의 지시사항에 따라 Envision 플레이트 판독기(PerkinElmer)를 사용하여 수행하였다. 데이터를, 대조군 항체에 의한 완전 리포터 활성화와 비교하여, 각각의 항체에 대한 억제 퍼센트로서 계산하였다.
래트에서 단일 용량 항체 약물동력학연구
래트 PK 중증도분류 연구는, 한정된 통계학적 확실성을 갖는 전형적인 PK 매개변수를 결정하려는 것이 아니며, 그보다는 시험 항체에 대한 혈청 반감기의 추정치를 제공하려는 것이다. 3마리의 동물들에게 단일 IV 용량의 항체를 주사하였다.
마우스 용량-반응 PK/PD 연구를 위해, 동물을 동일한 수의 2개의 별개의 코호트들로 나누었다. 각각의 코호트는 비히클-처리된 및 화합물-처리된 마우스를 둘 다 포함한다. 하나의 코호트는 항체 주사 후 제2일, 제4일에 분석 처리된 반면, 제2 코호트는 제6일, 제8일에 분석 처리되었다. 코호트를 분리시키는 이유는, 일련의 채혈(bleeding)에 대한 필요성을 감소시켜, 혈청철 매개변수에 대한 영향이 최소로 유지되게 하는 것이다. 동물 그룹은 표 10에 제시되어 있다.
[표 10]
디자인, 동물 할당 및 시험품 용량
Figure 112019004117535-pct00025
마우스 및 치료적 치료에서 염증의 빈혈증의 구축
주사용 5 × 108 BA 입자를 하기 방식으로 제조한다(10마리 마우스에 대한 실시예). 200 μl/마우스가 주사될 것이기 때문에, 시작 농도는 2.5 × 109 입자/ml이어야 한다. 스톡을 PBS를 사용하여 2배 희석시킨다. 예를 들어, 10마리의 마우스 × 0.200 μl = 2 ml + 20% 과다량 = 2.2 mL의 2.5 X 109 입자/ml이 필요하다. 1.1 ml BA 스톡 + 1.1 mL PBS. ESA 치료를 하기 전 1 내지 8일째에 BA를 투여하면, 6 내지 7일 이후에 둔화된 HGB 반응을 초래하는 것으로 나타났다.
C57BL/6 마우스에게 BA(3 × 108 입자/마우스)를 주사하고, 5시간 이후에 혈청 IL6 수준을 ELISA(KMC0061, Life Technologies)에 의해 측정하여, 염증 반응을 결정하였다. 모든 BA-치료된 동물들에 대한 평균의 95% 신뢰 구간보다 낮은 IL6 농도를 갖는 동물을 연구에서 배제시켰으며, 이로 인해 일부 그룹에서는 5 내지 6마리 마우스보다 더 적었다. 이러한 배제 과정을 수행하여, ESA 반응을 둔화시키기에 충분한 염증을 갖지 않은 동물을 포함시킴으로써 생성되는 위양성 결과의 확률을 감소시켰다. 배제 과정 후, 마우스에게 제6일에 지시된 바와 같이 항체를 IV 주사하고, 제7일에 BA 치료와 비례하여 EPO(100 g/kg 피하 다르베포에틴 알파(darbepoetin alfa, Amgen)를 100 mg/kg에서 투여하였다. ESA 및 항체 요법에 대한 반응을 6일 후에 측정하였다.
약물동력학, 약물력학 및 효능 종점의 분석
마우스 및 래트 PK/PD 연구를 위해, 혈청 시료를 항체 주사 후, 지시된 시점에서 수합하였다. 혈청 분취물을 사용하여, 비오틴화된 항-인간 IgG를 1차 포착 항체로서 이용하는 자동화된 고-처리량 면역검정 시스템(Gyros)을 통해 순환 항체 농도를 확인하였다. 각각의 시료의 제2 혈청 분취물을 정량적 비색 철 검정법(Quntichrom, DIFE-250, Bioassay Systems)에 사용하였다. 제3 분취물을 래트 또는 마우스 헵시딘-25 펩타이드의 LC-MS 정량화를 위해 이전에 기재된 변형된 절차에 따라 가공하였다. 문헌[Li et al. 2009. J. Pharm. Tox. Meth. 59: 171-80].
BA-유도 빈혈증 및 항체 치료 연구를 위해, EDTA-코팅된 BD Microtainer 튜브 내에서 최종 채혈을 심장 천공을 통한 안락사 시 수득하였다. XT-2000iV 혈액학 분석기 상에서의 온혈구계산 분석을 위해 전혈을 사용하였다. 효능 종점은 HGB, HCT, RETA 및 RET-HE를 포함한다.
통계학적 분석
일원 분류 분산 분석(ANOVA) 및 후속해서 본페로니 사후(Bonferroni's post hoc) 시험을 수행하여, 혈액학 매개변수에서 그룹 차이를 분석하였다(p< 0.05는 유의한 것으로 간주됨). 데이터는 평균 ± SEM으로 기록된다.
결과
세포성 BMP-의존적 전사 검정법에서 BMP6 길항제 항체의 생물학적 활성
3개의 모든 BMP6 길항제 항체 5, 6 및 7은 인간 간종양 세포주 Hep3B에서 재조합 인간 BMP6-유도 BMP 리포터(BRE-luc) 활성의 생물활성을 완전히 억제하고(0.3 nM rhBMP6에 대해 IC50 = 0.4 nM), 따라서 1:1 Ag/mAb 몰비에서 활성이거나 더 양호하다. 항체는 BMP2, 5 및 7를 포함하는 관련된 BMP 패밀리 단백질들을 능가하여 양호한 선별성을 나타내었으며, 이때 창(window)은 500배 이상이었다. 도 1을 참조한다.
래트에서 BMP6 길항제 항체의 스냅숏 약물동력학 및 약물력학 프로파일
Sprague Dawley 래트에서 단일 용량 중증도분류 약물동력학연구를 BMP6 항체 5, 6 및 7에 대해 10 mg/kg 체중에서 경정맥 카테터를 통한 IV 주사를 통해 수행하였다. 혈청에서 3개의 항체의 총 항체 농도-시간 관계(특히 t1/2, MRT)와 표준 프로파일과의 비교는, 전형적인 인간 IgG와 일치하는 특징을 제안하였다(도 2 및 도 11 참조). 표적-매개 약물 배치의 증거는 존재하지 않는다. 이 용량에서, 모든 BMP 항체들은 주사 후 제1일까지 혈청 헵시딘을 검출 수준보다 낮게 저해하였다. 헵시딘 발현의 지속적인 강한 저해는 제16일까지 여전히 명백하였으며, 이는 장기간의 활성을 제안한다. 상응하게는, 순환 철 농도에서 일시적인 피크 상승은 항체 주사 후 제2일에 관찰되었으며, 그 수준은 제16일까지 상승된 채로 유지되었다.
혈청 항체 농도를 단일 항체 주사 후 시간 경과에 따라 측정하였다. 시료를 투약(10 mg/kg, IV) 후, 1시간, 6시간, 1, 2, 4, 8, 16, 28일째에 수합하였다.
[표 11]
단일 용량 래트 중증도분류 PK 연구에서 주요 매개변수
Figure 112019004117535-pct00026
마찬가지로, 항체 7(유리형 및 BMP6-결합형 둘 다)의 총 혈청 농도를, 항체 7(래트에서, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 및 0.03 mg/kg의 용량에서; 원숭이에서, 3 mg/kg에서)의 단일 IV 주사 후, 래트 및 시노몰구스 원숭이에서 지시된 시점에, 래트에서는 46 ng/mL(점선)의 LLOQ 및 원숭이에서는 0.2 μg/mL(점선)의 LLOQ와 함께 ELISA에 의해 측정하였다. 그 결과를 도 9(래트) 및 도 12(원숭이)에 제시한다.
마우스 및 시노몰구스 원숭이에서 BMP6 항체 치료 후, 혈청철 매개변수에서 용량-의존적 반응
BMP6 항체 치료에 대한 철 대사의 용량-의존적 반응을 더 한정하기 위해, 네이브(naive) C57BL/6 마우스에게 지시된 바와 같이 0.02 내지 0.5 mg/kg 범위의 증가하는 용량의 항체 6을 주사하였다. 항체 6은, 3개의 항체들이 유사한 프레임워크, 설치류 PK 프로파일 및 시험관내 활성을 공유하기 때문에, 이들의 대표로서 선택되었다. 0.5 또는 0.1 mg/kg의 단일 용량은 혈청 헵시딘을 유의하게 저해하였고, 이에, 치료 후 2일째에 혈청철 농도를 증가시켰다. 그러나, 0.5 mg/kg에서만, 주사 후 8일까지 관찰된 철 대사에 대한 강한 지속되는 효과가 존재하였다. 도 3을 참조한다. 이들 결과는, 용량-의존적, 포화 가능한 표적 중화가 강력한 BMP6 길항제 항체를 사용하여 쉽게 달성될 수 있음을 제안한다.
철 대사의 혈청 바이오마커에 미치는 BMP6 항체의 용량-의존적 효과는 도 3을 참조한다. 상단: 지시된 용량에서 항체 6의 단일 IV 주사 후, 시간 경과에 따른 혈청 hIgG 농도이다. 하단: 좌측 패널은 단일 항체 6 또는 대조군 인간 IgG 주사 후, 혈청 헵시딘 농도의 정량적 분석이며, 반면 우측 패널은 혈청철 농도이다.
유사한 실험을 항체 7을 이용하여 수행하였다. 항체 7에 의한, 순환 혈청 헵시딘의 용량- 및 시간-의존적 저해를 수컷 Sprague-Dawley 래트에서 시험하였다. 0.03 mg/kg 내지 10 mg/kg 범위의 용량에서 단일 용량의 항체 7을 IV 주사에 의해 투여한 후, 투약 후 0.25, 1, 2, 6시간 및 1, 2, 4, 7 및 14일째에 혈청 시료를 수합하였다. 혈청 헵시딘 수준을, LLOQ = 9 ng/mL와 함께 LC/MS에 의해 측정하였다. 동일한 동물에서, 혈청철 수준을 또한 측정하였다. 그 결과를 도 11에 기록한다.
이들 결과는, 본 발명의 항-BMP6 항체가 혈청철에서 용량-의존적 증가를 유발할 수 있음을 가리킨다. 그 효과는 강력했으며 항체 투여 후 적어도 2주 동안 지속되었다.
항-BMP6 항체에 반응하여 혈청철 매개변수에 미치는 효과를 또한, 시노몰구스 원숭이에서 시험하였다. 수컷 시노몰구스 원숭이에게 항체 7을 3 mg/kg의 용량에서 단일 정맥내 주사에 의해 제공하였다. 주사 후 지시된 일수(day)에, 혈청 시료를 수합하고, 총 혈청철(Fe) 및 헵시딘 농도에 대해 분석하였다. 그 결과를 도 13에 제시한다. 3마리의 개별 동물들로부터의 데이터가 제시된다(투약-전 기준선 수준에 대해 도시됨). 평균값은 "x" 선에 의해 가리켜진다. 혈청철의 증가 및 혈청 헵시딘의 저해는 항체 투여 후 24시간째에 관찰되었고, 그 효과는 28일간의 연구 종료를 통해 유지되었다(투약-전 수준과 비례하여). 이들 결과는, 본 발명의 BMP6 항체가 비-인간 영장류에서 헵시딘 발현을 강력하게 유도하고 순환 철 농도를 감소시킴을 가리킨다.
마우스에서 염증-구동, ESA-내성 빈혈증에서 적혈구 매개변수에 미치는 BMP6 항체의 효과
염증의 빈혈증의 마우스 모델에서 항-BMP6 항체의 치료적 이용성을 평가하기 위해 실험을 수행하였다. 도 4를 참조한다. 아보르투스 항원(BA)으로 처리된 마우스에서 6일 후에 빈혈증이 발병되었다. 빈혈증 동물을 1일간의 간격을 두고 개시된 항-BMP6 + 항체 재조합 에리스로포이에틴(EPO)으로 치료하고, 빈혈증 진행에 미치는 항체 요법의 효과를 제13일에 BA에 비례하여 모니터링하였다. HGB 및 HCT 값은 치료 시작과 제13일 사이에 저하되었고, 이는 EPO 치료 단독에만 내성이었다. 조합된 BMP6 항체 및 EPO 치료는 EPO 반응을 효과적으로 복구시키고, HGB 및 HCT 수준을 유의하게 상승시켰다. 이러한 효과는, RETA에서 지속적인 증가뿐만 아니라 복구된 망상적혈구 헤모글로빈 함량에 의해 반영되는 바와 같이 에리스로포이에틴 활성의 부수적인 자극과 연관이 있었으며, 이는, 적혈구 생성 구획에서 기능성 철 부족으로 인한 헴 합성의 보정(correction)을 제안한다.
ESA-내성 염증의 빈혈증 마우스 모델에서 BMP6 항체의 치료적 치료는 도 4를 참조한다. 상단: BA-유도 ESA-내성 염증의 빈혈증 모델의 실험 도식도이다. 하단: BA 치료 후 13일째에 적혈구 생성 매개변수이다. HGB: 헤모글로빈; HCT: 적혈구용적율; RETA: 망상적혈구 수; RET-HE: 망상적혈구 헤모글로빈 등가물이다.
* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 대 BA+EPO+hIgG1.
실시예 2 - 인간에서 BMP6 항체를 시험하기 위한 임상 계획
임상 시험 계획: 인간 BMP6에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하는 요법의 평가
말기 신장 질병(ESRD) 환자는 에리스로포이에틴(EPO)이 있다면 적게 생성하고, 일반적으로, Hgb의 EPO-유도 합성을 가능하게 하기 위해 외인성 EPO의 주기적인 투여 및 철의 정맥내(IV) 주입을 필요로 한다. 1/3 이하의 만성 혈액투석(HD) 환자는 주로 철의 세포내 격리로 인해, EPO에 적당하게 반응하지 못한다. 헵시딘은 주로 신장에 의해 청소되지만, 투석에 의한 제거는 불충분하다. 따라서, 만성 HD 환자는 유의하게 상승된 헵시딘 수준을 갖는 경향이 있으며, 이는 적혈구 생성을 위한 철의 동원을 차단한다. IV 철 요법은 더 이상 효과적이지 않거나, 일단 신체 철 저장이 중대한 수준(높은 혈청 페리틴 수준에 의해 지시됨)에 도달하면 권고된다. 현재의 가이드라인은 높은 페리틴 수준을 갖는 빈혈증 투석 환자에게 IV 철을 제공하는 것에 대해 권고하고, 따라서, 이들 환자는 훨씬 더 높은 EPO 용량을 수령할 수 있으며, EPO 저-반응성 빈혈증의 잠재적인 연관된 위험성이 존재한다(Kidney Disease Improving Global Outcomes(KDIGO) Anemia Work Group 2012). EPO 저-반응성 빈혈증은 혈액투석(문헌[Kilpatrick et al 2008, Lopez-Gomez et al 2008, Fukuma et al 2012]) 및 복막 투석 환자(Suttorp et al 2013)에서 빈혈증 및 더 높은 EPO 용량 둘 다와 관련된 전-원인(all-cause) 사망률의 유의하게 증가된 위험성을 부여한다. 본 개시내용의 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 헤모글로빈(Hgb) 수준을 향상시키면서 한편으로는 EPO 및 IV 철 투약 필요성을 동시에 감소시킴으로써, 철-제한성 빈혈증을 갖는 만성 신장 질병 환자에게 유익할 수 있다. 더 낮은 EPO 내성 지수(EPO 용량 대 Hgb 수준의 비율)는 더 낮은 사망 위험률과 상관관계가 있다.
요약하자면, 본 개시내용의 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하는 요법의 목적은 격리된 철을 동원하는 것이며, 이는 그 후에 EPO 및 철 용량 필요성을 감소시키고 Hgb 수준을 향상시킬 수 있으며, 이들은 모두 환자의 결과를 향상시킬 것으로 예상된다. 이는 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하는 요법의 퍼스트-인-휴먼(first-in-human), 단일 용량 연구이다. 이러한 연구는 만성 혈액투석 환자 집단에서 안전성, 관용성, 약물동력학, 약물력학 및 효능을 평가할 것이다. 이 연구의 목적은, 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용한 요법이 만성 신장 질병과 연관된 빈혈증에서 추가의 임상적 발달을 보증하는지 평가하는 것이다.
조사 계획
연구 디자인
이는 만성 혈액투석 환자 집단에서 안전성, 관용성, PK, PD 및 효능을 평가하기 위한, 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 퍼스트-인-휴먼, 2-파트, 단일-용량, 비-확증적 연구이다. 파트 1는 퍼스트-인-휴먼, 단일-용량, 오픈-표지 용량-확인 연구이다. 파트 2는 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 2개의 용량 수준을 비교할 무작위화된, 이중-맹검, 플라시보-조절, 단일-용량 연구이다.
안전성 평가는 신체 검사, ECG, 활력 징후, 표준 임상 실험실 평가(혈액학, 혈액 화학, 혈청철 지표) 부작용 및 중증 부작용 모니터링을 포함할 것이다.
파트 1
파트 1의 목적은, 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 (a) 단일-용량 안전성, PK, PD 및 관용성을 평가하는 것, 및 (b) 투약-후 29일째에 Hgb의 증가(기준선으로부터의 중앙 변화 약 0.5 g/dL)를 초래하는 파트 1에서 시험된 최저 용량으로서 정의되는 최소 PAD를 결정하는 것이다.
파트 1 동안, 스크리닝 방문이 발생할 것이며, 이때, 연구에 들어가는 환자의 적격성이 결정될 것이다(도 6). 적격인 환자는 연구 장소에 입장하고, 기준선 방문 동안 적격성 기준에 대해 재평가받을 것이다. 모든 기준선 안전성 평가 결과는 투약 이전에 입수 가능하고 검토되어야 한다.
도 6은 파트 1에 대한 연구 디자인의 개요를 제공한다. 환자는 제1일에 연구 장소에 도착하도록 요청받을 것이며, 이후 바로 이들의 일상적인 투석 방문을 요청받을 것이다. 그 후에, 환자는 인간 BMP6에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편(정확한 용량은 코호트에 따라 다를 것임)의 주입을 수령할 것이다. 가능하다면, 투약은 바람직하게는, 2개의 투석-간 일수(예컨대 금요일 또는 토요일) 이전의 투석일에 발생해야 하고, 그 다음날 투석 세션이 발생할 것이다. 그러나, 가능하지 않다면, 투약은 2개의 투석-간 일수를 선행하지 않는 투석일에 발생할 수 있다. 투약 후, 파트 1의 처음 2명의 환자는 안전성 및 PK/PD 평가를 위해 적어도 48시간 동안 거주할 것이다. 환자는 PK /PD 평가를 위해 제4일 및 제6일에 연구 장소로 되돌아가고, 그 후에 PK 평가를 위해 총 29일 동안 및 안전성 평가를 위해 총 12주 동안 매주 되돌아갈 것이고, 이때 연구-종료 방문은 대략 제85일이다. 투석-후 PK 평가 이외의 모든 실험실 시험을 포함하여 연구 방문은 환자의 스케쥴 짜여진 투석 방문 이전에 발생해야 한다.
파트 1는 약리학적으로 활성이지 않은 것으로 예측되는 용량으로 개시될 것이다. 용량은 단일 용량의 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 후, Hgb에서 각각의 코호트의 중앙 변화 및 통계학적 고려 단락에 고찰되고 도 7에 제시된 바와 같이 트랜스페린 포화도(TSAT) 수준을 기초로, 각각의 후속적인 파트 1 코호트에 대해 조정될 것이다. 이러한 의사 결정 분지도의 목적은, 철 동원을 유도하고 Hgb를 증가시키는 최소 가능(feasible) 용량(투약-후 1주째에 6-환자 코호트에서 적어도 4명의 환자들에서 관찰된 50% 초과의 트랜스페린 포화도(TSAT) 수준에 의해 지시됨)을 식별하는 것이다. 철은 동원되지만 Hgb가 투약-후 29일째에 적어도 0.5 g/dL만큼 증가하지 않는 경우, 임상 데이터는 잠재적인 혼란 인자(예컨대 과도한 비-연구 정맥절개술로 인한 실혈)를 평가하기 위해 분석될 것이다. 적용 가능한 조사자 및 스폰서로부터의 대표자(들)는 각각의 코호트의 부작용을 검토할 것이고, 이들 사건을 (a) 만성 신부전과 연관된 공지된 의료 문제, 및 (b) 비임상적 독성학 발견의 맥락에서 평가할 것이다. 후속적인 코호트는, 조사자 및 스폰서가 이것이 진행하기 안전하다고 가리킬 때까지 투약되지 않을 것이다.
도 7은 파트 1에서 용량의 조정을 위한 알고리즘을 제공한다. Hgb 측정을 포함하는 혈액 작업은 투석 전에 발생할 것이다. 시작 용량은 0.01 mg/kg일 것이다. 파트 1에서, 환자는, 각각 6명 이하의 환자들의 6개 이하의 오픈 표지 용량 코호트들 중 하나에 배정될 것이다. 상기 정의된 바와 같이 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 최소 PAD는 파트 2를 위해 선별된 더 낮은 용량 암(arm)일 것이다. 각각의 후속적인 코호트에 대한 용량은 도 7에 제시된 바와 같이 더 높거나 더 낮게 조정될 수 있다. 최저 가능 용량(0.001 mg/kg)이 0.5 g/dL 이상의 Hgb의 중앙 증가를 초래한다면, 이는 최소 PAD일 것이고, 파트 2를 위해 선별된 더 낮은 용량 및 파트 1에서 평가된 그 다음으로 가장 높은 용량은 파트 2에 대한 더 높은 용량 암일 것이다. 파트 1에서 평가된 최고 용량(0.1 mg/kg)이 최소 PAD이라면, 파트 2는 2개의 암: 플라시보 및 최소 PAD로만 진행될 것이다. 추가의 용량 코호트가 파트 1에 필요한 경우, 이들 코호트는 본원에 기재된 바와 같이 첨가될 것이다.
각각의 파트 1 코호트는 6명의 환자를 포함할 것이다. 파트 1의 제1 코호트 내의 처음 2명의 환자들은 적어도 7일의 간격을 두고 투약을 받을 것이다. 후속적인 파트 1 코호트 환자 투약의 시기는, 각각의 장소의 스케쥴 및 지지 자원에 대해 가능하기 때문에 발생할 것이다. 모든 파트 1 환자들은 투약 후 12주 동안 후속될 것이다.
파트 2
파트 2의 목적은, 단일 용량의, 인간 BMP6에 결합하는 항체 대 플라시보에 반응하여 Hgb 변화를 기초로 하여, (a) 안전성, PK, PD 및 관용성을 평가하는 것, 및 (b) 효능을 결정하는 것이다. 파트 2는 3개 이하의 암: 2개 이하의 Ab 용량 암 및 플라시보 암을 포함할 것이다(도 8). 2개의 Ab 용량 암은 파트 1에서 발생된 데이터로부터 유래될 것이다. 파트 2는 3개의 암들에 1:1:1로 무작위화된 대략 60명의 환자를 포함할 것이다. 파트 1에서, 최소 PAD가 또한, 평가된 최고 용량(0.1 mg/kg)인 경우, 파트 2는 2개의 암: 최소 PAD 및 플라시보만 포함할 것이다. 이러한 경우, 40명의 환자가 2개의 암들에 무작위화될 것이며, 이때 무작위화 비율은 1:1이다. 파트 2의 시료 크기는 파트 1에서 Hgb에서 기준선으로부터의 변화의 변동성을 기초로 조정될 수 있다.
도 8은 파트 2에 대한 연구 디자인을 제공한다. 파트 2 동안, 스크리닝 방문이 발생할 것이며, 이때, 연구에 입장하는 환자의 적격성이 결정될 것이다. 적격인 환자는 기준선 방문 동안 적격성 기준에 따라 재평가받을 것이다. 모든 기준선 안전성 평가 결과는 투약 이전에 입수 가능하고 검토되어야 한다.
환자는 제1일에 연구 장소에 도착하도록 요청받을 것이며, 이후 바로 이들의 일상적인 투석 방문을 요청받을 것이다. 그 후에, 환자는 무작위화 배정에 의해 결정된 바와 같이 Ab 또는 플라시보의 주입을 수령할 것이다. 가능하다면, 투약은 바람직하게는, 2개의 투석-간 일수(예컨대 금요일 또는 토요일) 이전의 투석일에 발생해야 하고, 그 다음날 투석 세션이 발생할 것이다. 그러나, 가능하지 않다면, 투약은 2개의 투석-간 일수를 선행하지 않는 투석일에 발생할 수 있다. 환자는 추적 평가를 위해 제4일 및 제6일에 연구 장소로 되돌아갈 것이다. 추적 방문 동안, 환자는 일상적인 안전성 평가를 수행할 것이고, PK 데이터가 또한 85일째에 수합될 것이다. 환자의 투석 스케쥴에 맞추기 위해, 연구 방문은 환자의 스케쥴 짜여진 투석 방문 이후에 발생할 수 있다. 파트 2에 등록된 모든 환자들은 Ab(또는 플라시보)의 투약 후 12주 동안 추적조사될 것이다.
EPO 용량 관리(파트 1 및 파트 2 둘 다)
파트 1 및 파트 2 둘 다 동안 개별 EPO 용량 조정은 케어 프로토콜의 각각의 투석 부위의 표준에 따라 관리될 것이다. 부위 프로토콜은 부위 평가의 일부로서 검토될 것이고, 케어 가이드라인(KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease Anemia Work Group 2012)의 표준을 준수하는지 체크될 것이다. 연구 동안 임의의 시기에 13 g/dL 이상의 Hgb 수준을 달성하는 환자는, 표적 수준을 초과하는 Hgb 값을 관리하기 위한 부위-특이적 가이드라인 외에도, 조사자의 재량에 따라, 치료적 정맥절개술로 관리될 수 있다.
정맥내 철 관리(파트 1 및 파트 2 둘 다)
로딩(loading) 용량의 IV 철(100 mg/주)을 수령하는 환자는 연구로부터 배제될 것이다. 매주 유지 IV 철(100 mg/주 미만)을 수령하는 환자는 이 연구에 포함될 수 있다. 매주 유지 IV 철 용량은 Ab 투약의 제1주의 시작 시에 유지될 것이다. 철 지표는 Ab 투약-후 제1주 동안 모니터링될 것이고, 구제 철 요법 및 유지 IV 철 관리는 관리 혈액투석 단위의 프로토콜에 따라 케어 가이드라인의 표준을 따를 것이다. 부위 프로토콜은 부위 평가의 일부로서 검토될 것이고, 케어 가이드라인(KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease Anemia Work Group 2012)의 표준을 준수하는지 체크될 것이다.
연구 디자인의 근거
2-파트 연구 디자인에 대한 근거
동일한 환자 집단에서 2개 부에 대한 근거는, 잠재적으로 하위-치료적 용량에 노출된 환자 및 코호트의 수를 최소화하는 것을 목적으로, 최소 PAD를 안전하고 효율적으로 식별하는 것이다. 파트 2는 플라시보 그룹과 비교하여, 최소 PAD, 및 이러한 최소 PAD(파트 1에서 확인된 바와 같음)를 초과하는 하나의 용량 수준의 효능을 평가할 것이다.
파트 1는 오픈 표지 연구에서 Ab의 단일-용량 안전성, 관용성, PK/PD, 뿐만 아니라 최소 PAD를 평가하기 위해 디자인된다. 최소 PAD는 Ab 투약 후 29일째에 Hgb에서 각각의 용량 코호트의 중앙 변화를 기초로 하여 결정될 것이다. PAD 결정 기준에 대한 근거는, EPO에 대한 임상적으로 유의미한 반응이 EPO 용량 변화 후 4주 이하를 필요로 할 수 있다는 것이다. Ab가 표적 집단 내에서 철을 동원하는 경우, 이는 환자의 현재 EPO 용량이 보다 강력한 적혈구생성 효과를 발휘할 수 있게 할 수 있다. PAD 결정 기준에 열거된 29일째 Hgb 범위는 EPO 용량(29일간에 걸쳐 약 0.5 g/dL)에 대한 반응에서 Hgb의 증가의 임상적으로 유의하고 안전한 속도를 기초로 한다. 최대 효과보다는 최소 PAD를 검색하기 위한 근거는, 과도하게 강력한 Hgb 반응이, 케어 가이드라인(Kidney Disease Improving Global Outcomes(KDIGO) Anemia Work Group 2012)의 현재 표준에서 표적 Hgb 범위에 의해 반영되는 바와 같이, 이러한 환자 집단에서 안전성 위험이라는 것이다. 파트 1에서 안전성 및 관용성 평가의 목적은, (a) 안전성 신호를 식별하는 것, 및 (b) 용량 조정 의사 결정을 알리는 것이며, 이는, 파트 2에 대해 선별된 용량(최소 PAD + 1 용량 더 높음)이 플라시보에 비례하여 안전성 및 효능 둘 다의 추가의 평가에 적합함을 보장한다. 파트 1가 안전성의 비편향된 평가를 제공하는 데 부적당하게 힘을 받는 한편, 파트 2에서 플라시보 그룹 및 더 큰 시료 크기는 최소 PAD 및 1 용량 더 높은 용량에서 비편향된 안전성 평가를 가능하게 할 것이다. 안전성, 관용성 및 PK/PD 외에도, 파트 2는 이중-맹검 연구에서 플라시보와 비교하여 효능을 평가하도록 디자인된다. 효능 평가는 주로, Hgb를 기초로 할 것이며, 이때, EPO 내성 지수(ERI = Hgb로 나눈 매주 중량-조정된 EPO 용량)는 주요 2차 종점으로서 존재한다. ERI는 주어진 Hgb 값을 달성하는 데 필요한 EPO의 양의 정량적 측정값을 제공하고, 따라서, Hgb 단독 외에도 임상적으로 중요한 정보를 제공한다.
투석 환자에서 FIH에 대한 근거
이러한 퍼스트-인-휴먼(FIH) 연구는 건강한 지원자(HV)들보다는 만성 혈액투석(HD) 환자에서 수행될 것이다. HV에서 항-인간 BMP6 Ab에 대한 안전성, 관용성 및 PK/PD 반응의 평가는 몇몇 이유에서 만성 HD 환자로 유사하게 번역되지 않는다:
HV와는 달리, 빈혈증을 갖는 만성 HD 환자에서, 높은 혈청 페리틴 및 낮은 TSAT는 세포내 철 저장소를 만성적으로 축적하였다. 따라서, 저용량의 Ab에 반응하여 철 동원과 관련된 안전성, 관용성 및 약리학적 효과는 만성 HD 환자에서 가장 적절하게 평가된다. 정상적인 신장 기능을 갖는 HV에서, 헵시딘(이 중에서 BMP6가 주요 조절자임)은 신장에 의해 여과되고, 소변에서 효율적으로 배출되어, 낮은 순환 수준을 초래한다. 대조적으로, 헵시딘은 투석에 의해 덜 효율적이고 일시적으로 여과되어, 만성 HD 환자에서 더 높은 순환 수준을 초래한다(Zaritsky et al 2010). 더욱이, 정상적인 신장은 내인성 EPO 수준을 급격하게 조정할 것이고, Hgb에서의 변화는 Ab에 대한 반응에서 명백하지 않을 수 있다. 따라서, BMP6 경로에 의한 헵시딘의 조정과 관련된 안전성 및 관용성 및 Hgb에 미치는 Ab의 효과는 만성 HD 환자에서 가장 적절하게 평가된다.
표적 환자 집단에 대한 근거
이 연구는 EPO-저-반응성, 철-제한성 빈혈증의 설정에서 항-인간 BMP6 Ab를 평가하도록 디자인된다. 구축된 임상적 가이드라인(KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease Anemia Work Group 2012)은 안정한 Hgb 농도를 유지시키기 위해, EPO 용량에서 2배 증가에 필요한 EPO 저-반응성을, 안정한 용량 상회치를 50%까지로 한정하고 있다. 제안된 적격성 기준은 빈혈증을 갖는 안정한 만성 HD 환자 및 철 제한의 임상적 지표: 증가된 페리틴 및 낮은 TSAT(TSAT = 혈청철 / 총 철 결합력; TSAT는 혈청철과 매우 밀접하게 상관관계가 있음)를 선별하기 위해 디자인된다. 더욱이, EPO 및 IV 철 용량의 조정은 Hgb, TSAT 및 페리틴에 대한 케어 표적의 엄격한 표준을 고수할 것이다. 이러한 디자인은, 철 및 혈액학적 매개변수의 변화가 표준 케어에 따라 계속 관리될 것이기 때문에, 오버-슈팅 요망되는 Hgb 표적의 위험성을 감소시킨다. 더욱이, 기준선 이전에 1주 이내에 로딩 용량의 IV 철을 수용하는 환자는 배제될 것이다. 유지 IV 철을 수령하는 환자는 포함될 수 있다(모든 다른 적격성 기준들이 충족되는 경우). 이들 환자를 포함시키는 근거는, 미국에서 현재의 표준 케어가, Hgb 및 TSAT가 좁은 한계 내에서 유지되고, 따라서 더 낮은 TSAT 적격성 기준을 충족시키기 위한 유지 철 요법의 완전 철회는 환자를 25% 미만의 TSAT 위험에 놓이게 하여, 표준 케어에 따라 IV 철 로딩 용량의 경로를 필요로 함을 지시한다. 그러나, 유지 IV 철에 적격인 환자는 Ab 투약 주의 시작 시에 유지된 이들의 매주 IV 철 용량을 가질 것이고, 모니터링된 철 지표를 기초로, 부위의 표준 케어 프로토콜에 의해 결정된 바와 같이 유지 IV 철 요법만 재개할 것이다.
용량/양생법의 근거, 치료 기간
시작 용량 근거
최대 권고된 시작 용량(MRSD)을, 래트 및 시노몰구스 원숭이에서 수행된 13주(14-용량) GLP 독성학 연구로부터 무관찰 부작용 수준(NOAEL)을 기초로 하여 계산할 수 있다. 동물에게 0.1, 1, 10 및 100 mg/kg IV 볼루스 용량을 매주 제공하였다. 마지막 용량의 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 후, 1 및 100 mg/kg 용량 그룹(단독)은 후속적으로, 래트에서는 16주 또는 시노몰구스 원숭이에서는 24주 동안 수행되었다. MRSD는, 우선 이들 연구로부터의 NOAEL을 위한 인간 등가 용량(HED)(0.1 mg/kg)을 계산하고 - 100 kDa 초과의 분자량을 갖는 약물에 적절한 것으로 여겨진 접근법 -, 후속적으로, 저장된 철의 양 및 적혈구 생성에 대한 요구와 같은 비임상적 종과 환자 사이의 차이를 설명하기 위해 10의 안전성 인자를 적용함으로써 추정되었다. 비임상적 종에 대한 PK 매개변수는 IND-가능 독성학 연구 동안 수합된 독성역학적(TK) 데이터로부터 추론되었다. 그 후에, 환자에서 상응하는 PK 매개변수를 알로메트릭 스케일링(allometric scaling)을 사용하여 추정하였고, 이들 매개변수를 사용하여 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 농도를 환자에서 주어진 용량에 대한 시간의 함수로서 자유롭게 예측하였다. 독성학 연구로부터의 TK 데이터를 환자에서 모델-기반 Ab PK와 비교하는 것은, NOAEL/HED보다 10배 더 낮은 용량이 Ab 농도를 기초로 (최소) 10배 마진(margin)을 제공하는 것으로 예측되었음을 가리켰다.
동물 연구에서 Ab에 반응하여 관찰된 혈청철의 최대 수준은 Ab에 대한 예측된 인간 철 반응을 과소평가할 수 있는데, 왜냐하면 IV 철 요법을 투여받은 HD 환자가 유사하게는, 건강한 동물보다 철의 더 높은 조직 저장을 갖기 때문이다. 그러나, 건강한, 비-빈혈증 동물과는 달리, HD 환자는 방출된 혈청철을 적혈구 생성에 이용하는 것으로 예상되며; 따라서, 동물 모델은 철 상승 기간을 과대평가할 수 있다. 13주 연구에서 관찰된 간 병리학은 4주 연구에서는 관찰되지 않았으며, 이는, 독성이 철의 급성 방출에 대한 반응보다는 혈청철에 대한 누적된 노출로 인한 것임을 제안한다.
비임상적 종과 환자 사이에서 저장된 철의 예상된 차이를 설명하기 위해, MRSD는 또한, 혈청철 농도의 모델-기반 분석을 기초로 하여 예측되었다. 독성학적 발견을 초래한 혈청철에의 누적된 노출은, 철 곡선하면적(Fe AUC)으로서 나타났다. 이러한 접근법에서, NOAEL 용량(0.1 mg/kg)에 대해 계산된 Fe AUC는 적당하게 안전한 것으로 간주되었다. 그 후에, 환자에서 제안된 MRSD에서 Fe AUC는 예측되었고, NOAEL에서 비임상적 종에서의 Fe AUC와 비교되었다. 환자에서 MRSD에 대한 모델-예측 혈청철 노출이 비임상적 종에서 NOAEL에서보다 10배 미만이었기 때문에, NOAEL/HED를 10의 안전성 인자만큼 감소시키는 것은 MRSD의 추정에 적당한 것으로 여겨졌다. 따라서, 제안된 MRSD는 0.01 mg/kg이다.
용량 조정 근거
이 연구를 위해, 최대 시험 용량(xmax)는 각각의 2 IND-가능 독성학 연구에서 NOAEL에 상응하는 HED일 것이다: 0.1 mg/kg. 최소 가능 시험 용량(xmin)은 화합성 연구를 기초로 하여 기술적으로 가능한 최저 용량이다: 0.001 mg/kg. MRSD(x0)는 안전성, TSAT 및 Hgb 기준에 따라 평가될 것이다(도 7). x0이 투약-전과 비례하여 0.5 g/dL 미만의 중앙 Hgb에서의 변화를 초래하는 경우, x+(도 7)의 선별은 x0 내지 xmax에서 자연 밑 로그 스케일(S자형 용량-반응 관계식을 예상하여) 상에서 선형 외삽함으로써 가이드될 것이다. 이러한 용량 상승에 대한 임시 용량은 상기에 제공된다. 이들 임시 용량은 각각의 코호트 사이에서 통상적인 중간(informal interim) 분석 동안 데이터의 검토를 기초로 조정될 수 있다. 이러한 접근법은, 최소 PAD가 식별되거나 xmax가 도달될 때까지 계속될 것이다. xmax가 0.5 g/dL 미만의 중앙 Hgb에서의 변화를 초래하는 경우, 이 용량의 안전성은 평가될 것이고, 안전성, PK 및 PD 데이터를 기초로 xmax를 초과하는 용량에서 추가의 코호트를 추가하기 위해 프로토콜을 수정할 것인지 의사 결정이 이루어질 수 있다. 파트 1에서 시험된 최고 용량이 0.5 g/dL 미만의 Hg의 중앙 증가를 초래하며, TSAT를 50%보다 높게 증가시키지 않고, 해당 용량이 xmax보다 낮은 경우, 프로토콜은 추가의 코호트를 추가하도록 수정될 수 있다.
대신에, x0이 투약-전과 비례하여 0.5 g/dL 이상의 중앙 Hgb에서의 변화를 초래하는 경우, 다음 코호트에 대한 용량은 xmin까지 조정될 것이다. xmin이 또한, 0.5 g/dL 이상의 중앙 Hgb에서의 변화를 초래하는 경우, xmin이 최소 PAD인 것으로 여겨질 것이고, xmin 및 x0는 파트 2에서 평가될 것이다. xmin이 0.5 g/dL 미만의 중앙 Hgb에서의 변화 및 50% 이하의 TSAT를 초래하는 경우(도 7), 용량은, 최소 PAD가 식별될 때까지 또는 6개의 용량(코호트)이 평가되었을 때까지, 자연 밑 로그 스케일 상에서 간격 내에서(xmin, x0) 선형 외삽에 의해 증가될 것이다. 이러한 용량 상승에 대한 임시 용량은 상기에 제공된다. 간격(xmin, x0) 내에서 임시 용량이 상기에 제공된다. 이들 임시 용량은 각각의 코호트 사이에서 통상적인 중간 분석 동안 데이터의 검토를 기초로 조정될 수 있다. 최소 PAD는 투약-전과 비례하여 0.5 g/dL 이상의 중앙 Hgb에서의 변화를 초래하는 시험된 최저 용량으로서 정의될 것이다.
Ab는 비임상적 독성학 연구에서 부작용 발견과 연관된 것보다 적은 혈청철 노출(Fe AUC)을 보장하기 위해 단일 용량 IV 주입으로서 투여될 것이다. Ab 용액은 PK 또는 즉각적인 투약-후 철 생체이용성에 미치는 투석의 잠재적인 영향을 최소화하기 위해 제1일에 혈액투석 세션 직후, 주입될 것이다. 투석 후 추가의 대략 30분의 투약 주입(투약일에서만)은 임의의 유의한 위험성 또는 불쾌함을 환자에게 제기하는 것으로 예상되지 않는다.
비교기의 선택에 대한 근거
플라시보를 임상 결과의 비편향된 평가를 가능하게 하기 위해, 파트 2에서 비교기로서 이용된다.
중간 분석/디자인 적응의 목적 및 시기
파트 1에서, 6명의 환자의 각각의 코호트가 4주 투약-후 평가를 마친 후, 통상적인 중간 분석은 다음 코호트를 위한 용량 조정 의사 결정을 하기 위해 수행될 것이다. 안전성 및 PD 마커는, 적용 가능한 조사자 및 스폰서로부터의 대표자(들)를 포함하여 용량 조정 팀의 모든 구성원들에 의해 검토될 것이다. 안전성 및 관용성이 확인되는 경우 및 PD 조건이 도 7에 기재된 바와 같이 충족되는 경우에만, 다음 코호트가 유도될 것이다. 파트 1에서 5개 이하의 통상적인 중간 분석이 존재할 것이다. 파트 1의 마지막 코호트로부터의 모든 환자들이 4주 투약-후 평가를 마친 후, 조사된 용량의 임상 효과를 평가하고 잠재적으로 추가의 비-임상 연구를 유도하기 위해, 공식적인 중간 분석이 계획되고, 후속적인 임상 연구에 대한 정보를 알릴 수 있다. 파트 1에서 수행된 마지막 코호트의 제29일을 통해 수합된 체온, 혈압, 맥박수, ECG 평가, 혈액 화학, 혈액학 철 지표, EPO 내성 지수 및 부작용이 포함될 것이다.
최소 PAD, 및 이러한 최소 PAD보다 1 수준 더 높은 용량은 파트 2를 위해 선별될 것이다. 시험되는 가능한 최저 용량이 0.5 g/dL 이상의 Hgb 증가를 유도하는 경우, 시험되는 2개의 최저 용량은 파트 2를 위해 선별될 것이다.
위험 및 이득
이 연구에 참여하는 환자에 대한 잠재적인 이득은 치료 기간 동안 및 이를 지나 어느 정도 동안, 감소된 EPO 및 IV 철 필요성 및 향상된 Hgb 수준을 포함할 수 있다.
이 시험에서 환자에 대한 위험은 Ab 투여 후 처음 48시간 동안 모든 환자들(파트 1에서 처음 2명의 환자는 거주시킴)에 대해 적격성 기준을 고수하고 밀접하게 임상 모니터링함으로써 최소화될 수 있다.
철 동원과 연관된 잠재적인 위험은 (a) 조직 및 기관, 예컨대 비장, 간, 심장, 췌장 및 뇌하수체로의 철 재분포, 및 (b) 특히 유치 혈관 카테터를 갖는 환자에서, 박테리아 감염에 대해 작게 증가된 경향(susceptibility)을 포함한다. 간 기능 시험의 증가된 수준은 철 재분포와 연관하여 관찰될 수 있다. 간 기능은 혈액학적 매개변수 및 철 매개변수를 이용하여 동시에 모니터링될 것이다. 표준 케어 Hgb 표적의 오버슈팅은 적혈구 증가증을 초래할 수 있다. Hgb, EPO 요법 및 철 요법의 관리가 수행될 수 있다.
IV 철 요법을 투여받은 HD 환자는 건강한 동물보다 철의 더 높은 조직 저장을 가질 수 있으며; 따라서, 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 이용하여 치료된 환자에서 관찰된 혈청철의 최대 수준은 동물 연구에서 관찰되는 것들을 초과할 수 있다. 그러나, 건강한 동물과는 달리, HD 환자는 방출된 혈청철을 적혈구 생성에 이용할 것으로 예상되며; 따라서, 동물 모델은 철 상승 기간을 과대평가할 수 있다. MRSD에서 Ab에 대한 모델-예측 노출(예컨대 Cmax, AUC)은 비임상적 연구에서 NOAEL에서 관찰된 것보다 10배 더 적을 것으로 예상된다. 이러한 노출은, 전임상 연구에서 관찰된 간에서 상승된 간 트랜사미나제 및 단일 세포 괴사와 연관된 혈청철 노출(AUC) 수준을 초래하는 것으로 예상되지 않는다. NOAEL에 비해 Ab 용량의 상승은 기재된 안전성 평가 후 발생할 것이다. 만성 철 과부하를 갖는 환자, 뿐만 아니라 비경구 철을 유사하게 수령하는 환자에서 임상적 경험은 필수적으로, Ab에 의해 유도된 세포내 철의 급성 증가로부터 발생할 수 있는 효과를 예측하지 않는다. 따라서, Ab-유도 급성 철 독성의 잠재적인 위험성은 가능하게는 낮다. 급성 철 독성은 심장, 간 및/또는 췌장에 영향을 미칠 수 있다. 급성 철 독성의 임상적 출현은 심장 전도 결함, 상승된 간 트랜사미나제 및 글루코스 내성/과혈당증을 포함할 수 있다. 중증 급성 철 독성은 또한, 대사성 산증, 전해질 비정상 및 신경학적 출현을 포함할 수 있다. 급성 철 독성이 발생하는 경우, 환자는 혈액 투석과 조합된 데페록사민과 같은 철 킬레이트화 요법으로 긴급 치료될 수 있다. 최대 134 mL(파트 1) 및 172 mL(파트 2)의 혈액은 연구의 일부로서 각각의 환자로부터 115일의 기간에 걸쳐 수합되는 것으로 계획된다. 임의의 안전성 확인을 모니터링하기 위한 추가의 시료가 이 외에도 존재할 것이다. 이는 이러한 집단에 대한 위험이 존재하는 것으로 간주되지 않는다.
현재까지, 항-인간 BMP6 항체를 이용하여 번식 독성 연구가 수행된 적이 없다. 수컷 또는 암컷 번식 기관에 대한 잠재적인 효과는 시노몰구스 원숭이에서 13주 독성 연구에서 난소 및 정소 및 부속 번식 기관의 신중한 표준 조직병리학적 검사에 의해 평가되었다. 치료-관련 효과가 관찰되지 않았다. BMP6 녹아웃 마우스는 지연된 흉골 골화(sternum ossification) 및 철 과부하를 보여주었다(Meynard 등 2009).
유의한 태아 및 모계 이환율 및 사망률은 만성 혈액투석과 연관이 있다. 만성 혈액투석 여성(267개월)과 신장 이식을 받은 여성(264개월)과 비교하는 하나의 각각의 코호트 연구에서, 혈액투석 여성은 더 높은 비율의 태반 조기 박리, 수혈, 저체중아, 태아 사망 및 모계 사망을 나타내었다(Saliem 등 2015). 따라서, 가임 여성은 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 투여 동안 및 마지막 투약 후 125일 동안 임신을 예방하기 위해 고도로 효과적인 피임법을 사용해야 한다.
집단
연구 집단은, 1주 동안 적어도 2회의 만성 혈액투석 요법을 필요로 하고, 페리틴 및 트랜스페린 포화도 수준에 의해 결정된 바와 같이 자명하게 충분한 철 저장의 존재 시 빈혈증으로서 정의된 기능성 철-부족 빈혈증의 임상 증거를 갖는, 말기 신장 질병 환자로 구성될 것이다. 파트 1는 처음에 6개 코호트(6명의 환자/코호트)에서 36명 이하의 환자를 평가하는 계획을 포함한다. 6개의 코호트 후, TSAT 및 Hgb에 대한 효과가 관찰되지 않고 안전성 문제가 없는 경우(적용 가능한 조사자 및 스폰서로부터의 대표자(들)에 의해 결정된 바와 같이), 2개 이하의 추가의 6-환자 코호트가 추가될 수 있다(파트 1에서 총 48명의 환자). 파트 2는 3개 이하의 암(파트 1로부터의 추가의 평가를 위해 선별된 2개의 용량 수준, 및 플라시보 그룹)으로 구성되며, 이때 1개 암 당 대략 20명 이하의 환자(파트 2에서 총 60명의 환자)가 존재한다. 따라서, 총 대략 96명의 환자(최대 108명 이하)의 등록이 계획되고, 이 중에서 대략 60명은 파트 2에서 무작위화될 것이다. 대략 60명의 환자(파트 1에서 12명, 파트 2에서 48명)가 연구를 완성시키는 것으로 예상된다. 조사자는, 연구를 위해 간주되는 모든 환자들이 하기 적격성 기준을 충족하는 것을 보장해야 한다. 연구 집단이 모든 적격인 환자들을 대표하기 위해, 조사자에 의해 추가의 기준이 적용되지 않아야 한다.
환자 선별은 스크리닝 및 제1 기준선에서 모든 적격성 기준들을 통해 체크함으로써 구축되어야 한다. 적격성 기준의 관련 기록(예컨대 체크리스트)은 연구 장소에서 공급원 문서화와 함께 저장되어야 한다.
임의의 투입 기준으로부터의 편차는 환자를 연구 등록으로부터 배제한다.
포함 기준(파트 1 및 파트 2 둘 다)
이 연구에 포함시키기에 적격인 환자는 하기 모든 기준들을 충족시켜야 한다:
임의의 평가가 수행되기 이전에, 서면 고지 동의서가 수득되어야 한다. 동의가 서면으로 표현될 수 없는 경우, 이러한 동의는 이상적으로는 독립적인 믿을만한 증인을 통해 공식적으로 문서화되고 입증되어야 한다.
스크리닝 시점에서 연령이 18세 이상일 것
스크리닝 이전에 적어도 2개월 동안 혈액투석-의존적.
말기 신장 질병의 경우 1주 당 적어도 2회의 적절한 혈액투석을 받으며; 적절하다는 것은, 스크리닝 이전에 가장 최근의 매달 평가 시, 1.2 이상의 Kt/V로서 정의된다.
투석 부위의 빈혈증 관리 프로토콜에 따라 만성 에리스로포이에틴(EPO) 요법을 수령한다. EPO는 기준선 이전에 14일 동안 50% 이상만큼 증가되지 않는다. EPO 요법은 단기 작용성 제제일 뿐이어야 하고(다르베포에틴이 아님), IV(SC 아님) 투여되어야 한다.
Hgb는 8.5 이상이며, Hgb 8.5 이상 내지 11.5 g/dL 미만이 포함되고, 기준선 대 14일 이전에서 0.5 g/dL 이상만큼 증가되지 않는다.
페리틴은 기준선(스크리닝을 포함할 수 있음) 이전에 적어도 28일 동안 1500 ng/mL(포함적) 미만이다. 대안적으로, 스크리닝 시 페리틴은 500 ng/mL 초과 내지 1000 ng/mL 이하이다.
기준선 이전 90일 동안 최소 하나의 시점에서 TSAT는 30% 이하이고, 기준선에서 TSAT는 30% 이하이다.
배제 기준 (파트 1 및 파트 2 둘 다)
하기 기준들 중 임의의 기준을 충족시키는 환자는 이 연구에 포함시키기에 적격이지 않다. 연구 집단이 모든 적격인 환자들을 대표할 것임을 보장하기 위해, 어떠한 추가의 배제도 조사자에 의해 적용될 수 없다.
1. 등록의 5 반감기 내에, 또는 예상된 약물력학적 효과가 기준선까지 복귀하였을 때까지, 둘 중 어느 것이 길든지 간에, 다른 조사 약물을 사용한다.
2. 연구 약물 또는 치료적 항체에 대해 초감수성의 이력이 있다.
3. 혈색소 침착증의 진단이 공지되어 있다.
4. 골수 악성물, 림프계 악성물 또는 골수이형성 증후군이 공지되어 있다.
5. 스크리닝 이전에 2개월 이내에 투석 AV 누공 혈전증(fistula thrombosis)의 이력, 또는 스크리닝 이전에 6개월 이내에 AV 누공 혈전증의 2회 이상의 에피소드가 있다.
6. 중증 동시-이환 간 질병/기능장애(6 이상의 Child-Pugh 점수) 또는 간 이식 이전.
7. 심부전(New York Heart Association(NYHA) 기능성 부류 III 또는 IV).
8. 지난 2개월의 스크리닝 이내에 개입을 필요로 하는 위장 출혈이 있다. C형 간염 바이러스(HCV) 감염 환자는, 다른 모든 간 기능 적격성 기준들이 충족되는 경우, 포함될 수 있다.
9. 기준선 이전에 4주 이내에 1.5x ULN 이상의 ALT, AST 또는 빌리루빈.
10. 스크리닝 시, 750 pg/mL 이상의 온전한 PTH로서 정의된 비조절된 신장성 골이영양증.
11. 스크리닝 이전에 2주 동안 임의의 시기에 항생제 요법을 필요로 하는 중증 감염, 예컨대 유치 혈관 카테터(중심 정맥관 또는 혈액투석 카테터) 또는 활성 감염의 증가된 위험의 소인이 있는 질환.
12. 기준선 이전에 4주 이내에 투여된 수혈.
13. 기준선 이전에 1주 이내에 로딩 용량(100 mg/주) IV 철을 수령한다.
14. 투약 이전에 12개월 이내에 약물 또는 알코올 중독의 이력, 또는 스크리닝 동안 수행된 실험실 검정법에 의해 지시된 바와 같이 이러한 중독의 증거.
15. 양성 B형 간염 표면 항원 시험 결과.
16. 양성 HIV(ELISA 및 웨스턴 블롯) 시험 결과를 포함하는, 면역부족 질병의 이력.
17. 가임 여성은, 인간 BMP6에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 이용한 투약 후, 최소 125일 동안 고도로 효과적인 피임법을 사용하는 경우, 이 연구에 등록될 수 있다. 고도로 효과적인 피임법은 하기들 중 하나로서 정의된다: a. 절대 금욕(이것이 환자의 바람직하고 통상적인 생활상과 일치하는 경우). 주기적 금욕(예컨대 칼렌더(calendar), 배란, 증상체온, 배란-후 방법) 및 금단(withdrawal)은 허용 가능한 피임 방법이 아님). b. 남성/여성 불임화. c. 경구, 주사 또는 이식 호르몬 피임 방법 또는 자궁내 장치(IUD) 또는 자궁내 시스템(IUS)의 위치화, 또는 유사한 효능(1% 미만의 실패율)을 갖는 다른 형태의 호르몬 피임법, 예를 들어 호르몬 질 고리 또는 경피 호르몬 피임법.
치료
조사 치료
이 연구에서 조사 요법은 인간 BMP6에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편, 예를 들어 항-BMP6 IgG1, 완전 인간 항체이다. 이 항체는 액체 용액 내에 제공된다. 스톡 농도는 투여되는 용량과 일치하여 부위 상에서 희석될 것이다. 주입 시간은 대략 30분에서 코호트에 걸쳐 상대적으로 일정하게 유지될 것이다. 매칭 플라시보(비히클 대조군)와 비교하여, 파트 1는 오픈 표지 단일 용량일 것이고, 파트 2는 이중-맹검, 단일 용량일 것이다. 항-인간 BMP6 Ab 활성 성분 및 플라시보는 바이얼 내에 액체로서 공급될 것이다. 활성제 및 플라시보 내의 부형제는 동일하다.
치료 암
파트 1에서, 환자는 각각 6명의 환자로 구성된 6개 이하의 용량 코호트들 중 하나에 배정될 것이다. 파트 1는 오픈 표지 치료이다. 시작 용량, 최고(top) 용량 및 용량 조정 근거는 상기 기재되어 있다. 파트 1에 대한 임시 용량은 표 12(MRSD에서 0.5 g/dL 미만의 Hgb) 및 표 13(MRSD에서 0.5 g/dL 이상의 Hgb)에 주어진다.
[표 12]
파트 1에 대한 임시 용량 수준
Figure 112019004117535-pct00027
이 표는 파트 1 용량 조정의 일례로서 지침용으로만 의도된 것이다. 중간 또는 보다 높은 용량 수준이 사용될 수 있고, 일부 용량 수준은 각각의 코호트 사이에서 통상적인 중간 분석 동안 데이터 평가를 기초로 하여, 생략될 수 있다. 실제 용량 수준은 Novartis사에 의한 서면에서 확인되고, 새로운 코호트에서 환자의 치료 이전에 모든 참여 연구 장소에 제공될 것이다.
[표 13]
파트 1에 대한 임시 용량 수준
Figure 112019004117535-pct00028
이 표는 파트 1 용량 조정의 일례로서 지침용으로만 의도된 것이다. 중간 또는 보다 높은 용량 수준이 사용될 수 있고, 일부 용량 수준은 각각의 코호트 사이에서 통상적인 중간 분석 동안 데이터 평가를 기초로 하여, 생략될 수 있다.
연구 치료는 하기와 같이 정의된다:
· A: 단일 용량의 플라시보.
· B: 파트 1에서 확인된 바와 같이, 최소 PAD에서 단일 용량의 항-인간 BMP6 Ab.
· C: 파트 1에서 확인된 바와 같이, 최소 PAD 초과의 하나의 용량 수준에서 단일 용량의 항-인간 BMP6 Ab.
부수적인 치료
연구 시작 이전에 및 연구 동안 투입 기준에 정의된 기간 내에서 투여되거나 취해진 모든 처방 약제, 일반의약품 및 유의한 비-약물 요법(물리적 요법 및 수혈 포함)은 CRF의 부수적인 약제 / 유의한 비-약물 요법 단락에 기록되어야 한다. 약제 투입은 상표명, 단일 용량 및 단위, 투여 빈도 및 경로, 요법의 시작 및 중단일 및 이유에 특이적이어야 한다.
효능 / 약물력학
효능 평가는 하기에 명시되어 있다. 효능 평가를 위한 시료는 다양한 시점들에서 수합될 것이다. 혈액학 실험이 평가될 것이다. Hgb 및 Fe 지표는 연구의 파트 1 동안 용량 조정 평가의 일부로서 각각의 코호트-간 통상적인 중간 분석 동안 검토될 것이다. 처음에 설정된 시료 수합 시점이 철과 PK 사이의 관계식을 이해하는 데 차선인 것으로 여겨지는 경우, 시료 수합 시점은 파트 1에서 후속적인 코호트에서 변경될 수 있다.
철 지표 패널
항-인간 BMP6 Ab는 Fe를 신체 저장소로부터 동원하여, 혈청 Fe, 트랜스페린 포화도(TSAT), 비결합된 Fe 결합력(UIBC), 총 Fe 결합력(TIBC), 페리틴 및 망상적혈구 헤모글로빈 함량(CHr)을 포함하는 혈청 Fe 매개변수의 변화를 초래하는 것으로 예상된다. 이들은 인증된 검정법을 사용하여 혈청 내에서 측정될 수 있다.
안전성
안전성 평가는 하기에 명시된다.
신체 검사
완전 신체 검사는 일반적인 외양, 피부, 목(갑상선 포함), 눈, 코, 귀, 목구멍, 폐, 심장, 복부, 등, 림프절, 사지말단, 혈관 및 신경계의 검사를 포함할 것이다. 의료 이력 및/또는 증상을 기초로 지시된다면, 직장, 외부 생식기, 유방 및/또는 골반 검사가 수행될 수 있다.
연구 약물의 시작 전에 존재하는 유의한 발견은 환자의 eCRF 상에서 관련 의료 이력/현재 의료 상태 스크린에 포함되어야 한다. 부작용의 정의를 충족시키는 연구 약물의 시작 후 수행된 유의한 발견은 환자의 eCRF의 부작용 스크린에 기록되어야 한다.
활력 징후
· 체온
· 혈압(BP)
· 맥박
키 및 중량
· 키
· 체중
· 체질량 지수(BMI)는 (체중 (kg) / [키 (m)]2)로서 계산될 것이다.
실험실 평가
실험실 시험 결과의 임상적으로 관련된 편차는, 부작용을 한정하는 기준에 대해 평가되고, 기준이 충족되는 것과 같이 기록될 것이다. 반복된 평가는, 결과(들)의 정상화까지, 또는 변화가 더 이상 임상적으로 관련이 없을 때까지, 의무적이다.
혈액학
헤모글로빈, 적혈구용적율, 적혈구 수, 차이와 함께 백혈구 수 및 혈소판 수가 측정될 것이다. 철 지표는 모니터링될 것이다.
임상 화학
나트륨, 칼륨, 크레아틴, 우레아, 클로라이드, 알부민, 칼슘, 알칼리 포스파타제, 총 빌리루빈, LDH, GGT, AST 및 ALT가 모니터링될 것이다. 총 빌리루빈 농도가 1.5배보다 높게 증가되는 경우, 정상적인, 직접 및 간접 반응 빌리루빈의 상한은 구별되어야 한다.
심전도(ECG)
PR 간격, QRS 기간, 심박동수, RR, QT, QTc
프리데리카 QT 교정 식(QTcF; Fridericia QT correction formula)은 임상적 의사 결정에 사용되어야 한다.
임신 및 생식력의 평가
임신 시험은 기록된 번식 / 폐경기 상태와 상관 없이, 모든 여성 환자들에게 필요하다.
혈청 임신 시험은 이 연구에 수행될 것이다. 양성인 경우, 환자는 시험으로부터 중단되어야 한다.
스크리닝 및 기준선에서 수행되는 경우, 이러한 시험 결과는 환자가 투약 받을 수 있기 전에 수령되어야 한다.
약물동력학
PK 시료가 수합될 것이다. PK 데이터는 연구의 파트 1 동안 용량 조정 평가의 일부로서 각각의 코호트-간 통상적인 중간 분석 동안 검토될 것이다. 처음에 설정된 시료 수합 시간이 PK 프로파일을 특징화하기에 부적당하거나 부적절한 것으로 여겨지는 경우, 시료 수합 시간은 후속적인 코호트에서 변경될 수 있다. 채혈의 수 및 수합된 총 혈액 용적은 프로토콜에서 언급된 것들을 초과하지 않을 것이다.
PK 시료는 모든 환자에서 모든 용량 수준에서 수합되고 평가될 것이다.
유리 항-인간 BMP6 Ab의 농도는 ELISA 검정법을 사용하여 결정될 것이다. 예상되는 더 낮은 정량화 하한(LLOQ)은 10 pg/mL이다.
비치료된(플라시보) 시료는 분석되지 않을 것이다.
유리 항-인간 BMP6 Ab 농도는 μg/mL으로 표현될 것이다. LLOQ 미만 또는 미싱 데이터의 모든 농도들은 농도 데이터 목록에서와 같이 표지될 것이다. LLOQ 미만의 농도는 농도 데이터에 대한 요약 통계에서만 0으로 처리될 것이다. 이들은 PK 매개변수의 계산에 고려되지 않을 것이다.
유리 항-인간 BMP6 Ab의 결정 후 잔존하는 PK 시료는 탐색 평가 또는 다른 생물분석적 목적(예컨대 상이한 부위들 사이에서의 교차-체크, 안정성 평가)을 위해 사용될 수 있다.
하기 약물동력학적 매개변수는 Phoenix WinNonlin(버전 6.2 또는 그보다 높음)을 이용하는 비-구획적(compartmental) 방법(들)을 사용하여 결정될 것이다(가능하다면): 혈청 농도-시간 데이터를 기초로 Cmax, tmax, AUC(0-t), AUC(0-tlast), Cmax/D 및 AUC/D. 선형 사다리꼴 규칙은 AUC 계산에 사용될 것이다. 인간 BMP6에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편의 종결 반감기(t1/2)는 또한, 데이터 상에서 가능한 경우 추정될 것이다.
다른 평가
면역원성
ELISA 검정법은 항-인간 BMP6 항체를 검출하는 데 사용될 것이다. 면역원성 분석 후 잔존하는 IG 시료는 탐색 평가 또는 다른 생물분석적 목적(예컨대 상이한 부위들 사이에서의 교차-체크)을 위해 사용될 수 있다.
탐색 평가
바이오마커는 객관적으로 측정되고, 치료적 개입에 대한 정상적인 생물학적 과정, 병원성 과정 또는 약물학적 반응의 지표를 평가한다(Biomarkers Definitions Working Group 2001).
BMP6-헵시딘 경로는 하기와 같다: 간세포에서 BMP6 신호전달은, 장세포 철 흡수 및 대식세포 철 이출을 억제하는 헵시딘의 유도 발현에 필요하다. 헵시딘-저하 요법으로서 BMP6-중화 항체는, EPO 요건을 감소시키고 표적 Hgb 수준에 도달하는 환자의 수를 증가시킴으로써, 철-제한성 빈혈증 환자에게 유익해야 한다.
상기 기재된 생물학을 기초로, 탐색 바이오마커 평가는 비제한적으로 헵시딘(LC-MS 검정법을 사용하여 측정됨)을 포함한다.
추가의 탐색 평가는 골 흡수 마커의 잠재적인 역할을 조사할 뿐만 아니라, 작용 메커니즘에 기여하는 인자로서 염증을 강조할 수 있다.
탐색 목적은 하기와 같다:
· 헵시딘 수준과 몇몇 주요 측정값, 예컨대 ERI 및 철 지표 사이의 관계식을 평가하는 것;
· 1차 종점과 2차 종점 사이에서 동역학 및 탐색 바이오마커를 세로방향으로(longitudinally) 연구하는 것;
· 약물유전학을 평가하는 것;
· 면역원성을 평가하는 것.
시료(들)는 다양한 시점(들)에서 수합될 것이다.
시료 수합, 넘버링, 가공 및 운송에 대한 더 상세한 사항은 중심 실험실 매뉴얼에 제공되어 있다.
DNA
탐색 DNA 검색 연구는 (1) 기능성 철-부족 빈혈증을 갖는 에리스로포이에틴-치료된 만성 혈액투석 환자와 관련이 있거나, (2) 항-인간 BMP6 Ab를 이용한 치료에 대한 반응을 예측하거나, (3) 부작용의 유전적 소인을 예측할 수 있는 유전적 인자를 식별할 목적으로 이 연구의 일부로서 계획된다.
또한, 유전자형 기술에서 최근의 진전은 게놈-와이드 접근법을 가능하게 만들었다. 게놈-와이드 접근법은 또한, 상기 기재된 바와 같이 이들 연구의 제한된 범위 내에서 수행될 수 있다.
가용성 바이오마커
헵시딘은 혈장 내에서 잠재적인 PD/ 바이오마커로서 정량화될 것이다.
검정법에 대한 상세한 설명은 생물분석적 데이터 보고서에 포함될 것이다.
다른 바이오마커
가설-프리(hypothesis-free) 플랫폼은 질병 이종성, 작용 방식 및/또는 계층화 마커의 잠재적인 식별화를 이해하는 데 사용될 것이다. 면역원성(IG) 시료는 다양한 시점에서 수합될 것이다. 항-인간 BMP6 Ab의 면역원성은 항-인간 BMP6 항체를 인지하는 항체를 측정함으로써 평가될 것이다.
참조문헌
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실시예 3: 0.01 mg/kg 항체 7을 이용하여 치료된 환자에 대한 TSAT 수준
TSAT(철 포화도, %) 수준을 포함하는 데이터를, 실시예 2에 기재된 임상 프로토콜에 따라 치료된 처음 10명의 환자에 대해 평가하였으며, 이때, 각각의 환자는 0.01 mg/kg 항체 7의 단일 주입을 수령하였다. 이들 환자 중 어떤 환자도, 0.1 mg/kg/주(week)의 무관찰 부작용 수준(NOAEL)을 한정한 임의의 간 안전성 신호를 나타내지 않았다. 코호트 1은 500 ng/mL 이하의 낮은 페리틴 수준을 갖는 5명의 빈혈증 혈액투석 환자를 포함하였으며, 한편 코호트 2는 더 높은(500 내지 1000 ng/mL) 페리틴 수준을 갖는 5명의 빈혈증 혈액투석 환자를 포함하였다.
0.01 mg/kg 항체 7을 수령한 5명의 코호트 1(낮은 페리틴) 환자에서, 투약-후 TSAT 수준은 평균 9.8%(평균 38.6% 투약-후 vs. 24.8% 투약-전)만큼만 증가하였다. 대조적으로, 투약-후 TSAT 수준은, 0.01 mg/kg 항체 7을 수령한 5명의 코호트 2(높은 페리틴) 환자에서 평균 17.6%(평균 48.4% 투약-후 vs. 30.8% 투약-전)만큼 증가하였다. 데이터는 도 14에 도시되어 있으며, 이러한 도면은 2 코호트에서 항체 7의 투여 전 피크 TSAT 수준 대 항체 7의 투여 후 72시간 이내의 피크 TSAT 수준을 보여준다. 놀랍게도, 코호트 1 환자와는 대조적으로, 코호트 2 빈혈증 환자는 기준선과 비교하여 분명한 TSAT 증가를 나타낸다. 이들 데이터는, 500 ng/mL 이상의 페리틴 수준을 갖는 환자가 항-BMP6 요법에 대한 반응의 양호한 후보물질이고, 페리틴 수준, 예를 들어 500 ng/mL 이상의 페리틴 수준은 반응의 지표일 수 있음을 가리킨다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술적 및 과학적 용어들은 본 개시내용이 속한 분야에 친숙한 전문가가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다.
다르게 지시되지 않는 한, 상세히 구체적으로 기재되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작이 수행될 수 있고, 당업자가 알게 될 바오 같이 공지된 방식대로 수행되어 왔다. 예를 들어, 본원에 언급된 표준 안내서 및 일반적인 배경 기술, 및 거기에서 인용된 추가의 참조문헌을 참조한다. 다르게 지시되지 않는 한, 본원에서 인용된 참조문헌들은 각각 그 전체가 원용에 의해 포함된다.
본 발명의 청구항은 비제한적이고 하기에 제공된다.
특정 양태 및 청구항이 본원에 상세히 개시되어 있긴 하지만, 이는 예시를 목적으로 예로서 주어진 것일 뿐이고, 첨부된 청구항의 범위 또는 임의의 상응하는 향후 출원의 청구항의 주제의 범위에 관해 제한하려는 것이 아니다. 특히, 본 발명자들은, 다양한 치환, 변경 및 변형을 청구항에 의해 정의된 바와 같은 본 개시내용의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서, 본 개시내용에 이루어질 수 있다고 여긴다. 핵산 시작 물질, 관심 클론 또는 라이브러리 유형의 선택은 본원에 기재된 양태의 지식과 함께 당업자에게 일상적인 일인 것으로 여겨진다. 다른 양태, 이점 및 변형은 하기 청구항의 범위 내에 있는 것으로 여겨진다. 당업자는, 일상적인 것보다 많은 실험을 사용하지 않고도 본원에 기재된 본 발명의 구체적인 양태의 많은 등가물을 인지하거나 확신할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구항에 의해 포함되고자 한다. 이후에 출원되는 대응 출원에서 청구항 범위를 고쳐쓰는 것은, 다양한 국가들의 특허법에 의한 제한으로 인한 것일 수 있고, 청구항의 주제를 포기하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG <120> METHODS FOR TREATING DISEASE USING INHIBITORS OF BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 6 (BMP6) <130> PAT057354-WO-PCT <140> <141> <150> 62/350,257 <151> 2016-06-15 <160> 99 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Arg Ser Ser Glu Asn Ile Tyr Arg Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Gln Gly Ile Trp Gly Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 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444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 93 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Pro Phe Gly Asn Ala Met Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 <210> 94 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 94 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Arg Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe Lys 1 5 10 15 <210> 95 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 95 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Arg Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Pro Phe Gly Asn Ala Met Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 96 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 96 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Arg Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Pro Phe Gly Asn Ala Met Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 <210> 97 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag" <400> 97 His His His His His His 1 5 <210> 98 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Gln Thr Leu Val His Leu Met Asn Pro Glu Tyr Val Pro Lys Pro 1 5 10 15 <210> 99 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Val Ser Ser Ala Ser Asp Tyr Asn Ser Ser Glu Leu Lys 1 5 10

Claims (63)

  1. 치료학적 유효량의 BMP6 길항제를 포함하는, 빈혈증 치료를 필요로 하는 환자에서 빈혈증을 치료하기 위한 제약 조성물로서, 상기 BMP6 길항제가
    (a) SEQ ID NO: 69, 70 및 71 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 79, 80 및 81 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (b) SEQ ID NO: 72, 73 및 74 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 82, 83 및 84 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (c) SEQ ID NO: 29, 30 및 31 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 39, 40 및 41 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (d) SEQ ID NO: 32, 33 및 34 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 42, 43 및 44 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (e) SEQ ID NO: 49, 50 및 51 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 59, 60 및 61 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (f) SEQ ID NO: 52, 53 및 54 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 62, 63 및 64 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (g) SEQ ID NO: 9, 10 및 11 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 19, 20 및 21 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열; 또는
    (h) SEQ ID NO: 12, 13 및 14 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 22, 23 및 24 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열
    을 포함하는 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고,
    상기 빈혈증 치료를 필요로 하는 환자가 500 ng/mL 내지 2000 ng/mL의 페리틴 수준을 갖는 환자로부터의 혈청 시료를 기준으로 선택되는 것인, 제약 조성물.
  2. 치료학적 유효량의 BMP6 길항제를 포함하는, 빈혈증을 가진 환자를 치료하기 위한 제약 조성물로서, 상기 BMP6 길항제가
    (a) SEQ ID NO: 69, 70 및 71 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 79, 80 및 81 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (b) SEQ ID NO: 72, 73 및 74 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 82, 83 및 84 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (c) SEQ ID NO: 29, 30 및 31 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 39, 40 및 41 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (d) SEQ ID NO: 32, 33 및 34 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 42, 43 및 44 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (e) SEQ ID NO: 49, 50 및 51 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 59, 60 및 61 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (f) SEQ ID NO: 52, 53 및 54 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 62, 63 및 64 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (g) SEQ ID NO: 9, 10 및 11 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 19, 20 및 21 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열; 또는
    (h) SEQ ID NO: 12, 13 및 14 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 22, 23 및 24 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열
    을 포함하는 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고,
    상기 제약 조성물이 500 ng/mL 내지 2000 ng/mL의 페리틴 수준을 갖는 환자로부터의 혈청 시료를 기준으로 환자에게 투여되는 것인, 제약 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 페리틴 수준은 페리틴 단백질 수준인 것인, 제약 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 빈혈증은 만성 질병과 연관되어 있는 것인, 제약 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 만성 질병은 만성 신장 질병, 암 또는 염증인 것인, 제약 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 환자는 적혈구 생성 자극제(ESA)로 치료 중이거나 치료받은 적이 있는 것인, 제약 조성물.
  7. 제6항에 있어서, ESA는 에리스로포이에틴(EPO)인 것인, 제약 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 빈혈증은 EPO-저반응성 빈혈증인 것인, 제약 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 빈혈증은 철-제한성 빈혈증인 것인, 제약 조성물.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 환자는 만성 혈액투석 환자인 것인, 제약 조성물.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 치료학적 유효량의 BMP6 길항제를 사용하는 치료의 부재 시의 환자의 EPO 요구 용량 및 환자의 철 요구 용량에 비례하여, 환자의 철 요구 용량이 감소되거나, 환자의 EPO 요구 용량이 감소되거나, 환자의 철 요구 용량 및 환자의 EPO 요구 용량 둘 모두 감소되는 것인, 제약 조성물.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함하는 것인, 제약 조성물:
    (a) SEQ ID NO: 75의 VH 서열;
    (b) SEQ ID NO: 35의 VH 서열;
    (c) SEQ ID NO: 55의 VH 서열; 또는
    (d) SEQ ID NO: 15의 VH 서열.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함하는 것인, 제약 조성물:
    (a) SEQ ID NO: 85의 VL 서열;
    (b) SEQ ID NO: 45의 VL 서열;
    (c) SEQ ID NO: 65의 VL 서열; 또는
    (d) SEQ ID NO: 25의 VL 서열.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함하는 것인, 제약 조성물:
    (a) SEQ ID NO: 75의 VH 서열; 및 SEQ ID NO: 85의 VL 서열;
    (b) SEQ ID NO: 35의 VH 서열; 및 SEQ ID NO: 45의 VL 서열;
    (c) SEQ ID NO: 55의 VH 서열; 및 SEQ ID NO: 65의 VL 서열; 또는
    (d) SEQ ID NO: 15의 VH 서열; 및 SEQ ID NO: 25의 VL 서열.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함하는 것인, 제약 조성물:
    (a) SEQ ID NO: 77의 중쇄 서열;
    (b) SEQ ID NO: 37의 중쇄 서열;
    (c) SEQ ID NO: 57의 중쇄 서열; 또는
    (d) SEQ ID NO: 17의 중쇄 서열.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함하는 것인, 제약 조성물:
    (a) SEQ ID NO: 87의 경쇄 서열;
    (b) SEQ ID NO: 47의 경쇄 서열;
    (c) SEQ ID NO: 67의 경쇄 서열; 또는
    (d) SEQ ID NO: 27의 경쇄 서열.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함하는 것인, 제약 조성물:
    (a) SEQ ID NO: 77의 중쇄 서열; 및 SEQ ID NO: 87의 경쇄 서열;
    (b) SEQ ID NO: 37의 중쇄 서열; 및 SEQ ID NO: 47의 경쇄 서열;
    (c) SEQ ID NO: 57의 중쇄 서열; 및 SEQ ID NO: 67의 경쇄 서열; 또는
    (d) SEQ ID NO: 17의 중쇄 서열; 및 SEQ ID NO: 27의 경쇄 서열.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
    a) 1 nM 이하의 KD로 인간 BMP6에 결합하거나;
    b) 0.1 nM 이하의 KD로 인간 BMP6에 결합하는 것인, 제약 조성물.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기의 특징 중 적어도 하나를 갖는 것인, 제약 조성물:
    a) 인간 BMP7보다 인간 BMP6에 대해 적어도 100배 더 큰 친화도;
    b) 인간 BMP2, 인간 BMP5 또는 인간 BMP7보다 인간 BMP6에 대해 적어도 100배 더 큰 친화도;
    c) 인간 BMP2, 인간 BMP5 또는 인간 BMP7보다 인간 BMP6에 대해 적어도 500배 더 큰 친화도; 및
    d) ELISA에서 인간 BMP2 및 BMP7 중 적어도 하나에 대해 검출 가능한 결합의 부재.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgM 및 IgG로부터 선택된 스캐폴드를 포함하는 것인, 제약 조성물.
  21. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG1, IgG2, 및 IgG3 또는 IgG4로부터 선택된 IgG인 것인, 제약 조성물.
  22. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 모노클로날 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, Fab 및 scFv로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 제약 조성물.
  23. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 면역접합체의 구성성분인 것인, 제약 조성물.
  24. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fc 영역의 돌연변이를 통해 변경된 이펙터 기능을 가지는 것인, 제약 조성물.
  25. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 QTLVHLMNPEYVPKP(SEQ ID NO: 98)을 포함하는 인간 BMP6 에피토프에 결합하는 것인, 제약 조성물.
  26. 제2항에 있어서, 0.001 mg/kg 내지 0.1 mg/kg 범위의 용량으로 투여되는 것인, 제약 조성물.
  27. 제2항에 있어서, 0.0063 내지 0.1 mg/kg 범위의 용량으로 투여되는 것인, 제약 조성물.
  28. 제2항에 있어서, 0.001 mg/kg, 0.0016 mg/kg, 0.0025 mg/kg, 0.0040 mg/kg, 0.0063 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.016 mg/kg, 0.025 mg/kg, 0.040 mg/kg, 0.063 mg/kg 또는 0.1 mg/kg의 용량으로 투여되는 것인, 제약 조성물.
  29. 제2항에 있어서, 상기 환자에게 1회 이상 투여되는 것인, 제약 조성물.
  30. 제2항에 있어서,
    a) 정맥내; 또는
    b) 피하
    투여되는 것인, 제약 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 투여는 30분 내지 60분의 기간에 걸친 주입에 의한 것인, 제약 조성물.
  32. 제1항 또는 제2항에 있어서, 페리틴 수준은 1900 ng/mL 이하, 1800 ng/mL 이하, 1700 ng/mL 이하, 1600 ng/mL 이하, 1500 ng/mL 이하, 1400 ng/mL 이하, 1300 ng/mL 이하, 1200 ng/mL 이하, 1100 ng/mL 이하 또는 1000 ng/mL 이하인 것인, 제약 조성물.
  33. 제1항 또는 제2항에 있어서, 페리틴 수준은 500 ng/mL 내지 1500 ng/mL인 것인, 제약 조성물.
  34. 제1항 또는 제2항에 있어서, 페리틴 수준은 500 ng/mL 이상, 600 ng/mL 이상, 700 ng/mL 이상, 800 ng/mL 이상, 900 ng/mL 이상, 1000 ng/mL 이상, 1100 ng/mL 이상, 1200 ng/mL 이상, 1300 ng/mL 이상, 1400 ng/mL 이상, 1500 ng/mL 이상, 1600 ng/mL 이상, 1700 ng/mL 이상, 1800 ng/mL 이상 또는 1900 ng/mL 이상인 것인, 제약 조성물.
  35. 제1항 또는 제2항에 있어서, 페리틴 수준은 500 ng/mL 이상, 600 ng/mL 이상, 700 ng/mL 이상, 800 ng/mL 이상, 900 ng/mL 이상, 1000 ng/mL 이상, 1100 ng/mL 이상, 1200 ng/mL 이상, 1300 ng/mL 이상 또는 1400 ng/mL 이상인 것인, 제약 조성물.
  36. 환자로부터의 혈청 시료를 페리틴에 대해 검정하는 단계를 포함하는, 빈혈증을 가진 환자가 BMP6 길항제를 사용하는 치료에 반응할 가능성을 예측하기 위해 필요한 정보를 제공하는 방법으로서, 500 ng/mL 내지 2000 ng/mL의 페리틴 수준이 환자가 BMP6 길항제를 사용하는 치료에 반응할 증가된 가능성을 나타내고, 상기 BMP6 길항제가
    (a) SEQ ID NO: 69, 70 및 71 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 79, 80 및 81 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (b) SEQ ID NO: 72, 73 및 74 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 82, 83 및 84 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (c) SEQ ID NO: 29, 30 및 31 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 39, 40 및 41 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (d) SEQ ID NO: 32, 33 및 34 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 42, 43 및 44 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (e) SEQ ID NO: 49, 50 및 51 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 59, 60 및 61 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (f) SEQ ID NO: 52, 53 및 54 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 62, 63 및 64 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (g) SEQ ID NO: 9, 10 및 11 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 19, 20 및 21 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열; 또는
    (h) SEQ ID NO: 12, 13 및 14 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 22, 23 및 24 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열
    을 포함하는 항-BMP6 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 것인, 방법.
  37. BMP6 길항제를 사용하는 치료에 대한, 빈혈증을 가진 환자의 반응을 예측하기 위한 전송 가능한 형태의 정보를 생성하는 방법으로서,
    i) 환자로부터의 혈청 시료에 500 ng/mL 내지 2000 ng/mL의 페리틴 수준의 존재에 기초하여 BMP6 길항제를 사용하는 치료에 대한 환자 반응의 증가된 가능성을 결정하는 단계; 및
    ii) 전송 시 사용하기 위한 유형 또는 무형의 매체 형태 상에 결정 단계의 결과를 기록하는 단계를 포함하고,
    여기서 각각의 단계 i) 및 ii)가 컴퓨터에 의해 수행될 수 있으며,
    상기 BMP6 길항제가
    (a) SEQ ID NO: 69, 70 및 71 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 79, 80 및 81 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (b) SEQ ID NO: 72, 73 및 74 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 82, 83 및 84 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (c) SEQ ID NO: 29, 30 및 31 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 39, 40 및 41 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (d) SEQ ID NO: 32, 33 및 34 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 42, 43 및 44 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (e) SEQ ID NO: 49, 50 및 51 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 59, 60 및 61 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (f) SEQ ID NO: 52, 53 및 54 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 62, 63 및 64 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    (g) SEQ ID NO: 9, 10 및 11 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 19, 20 및 21 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열; 또는
    (h) SEQ ID NO: 12, 13 및 14 각각의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 SEQ ID NO: 22, 23 및 24 각각의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열
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