ES2955775T3

ES2955775T3 - Métodos para predecir el tiempo de supervivencia de pacientes que padecen cáncer de pulmón

Info

Publication number: ES2955775T3
Application number: ES16757251T
Authority: ES
Inventors: Marie-Caroline Dieu-Nosjean; Wolf Herman Fridman; Catherine Sautes-Fridman; Priyanka Devi
Original assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Sorbonne Universite; Universite Paris Cite
Current assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Sorbonne Universite; Universite Paris Cite
Priority date: 2015-08-27
Filing date: 2016-08-26
Publication date: 2023-12-07
Anticipated expiration: 2036-08-26
Also published as: WO2017032867A1; JP6791951B2; EP3341732A1; EP3341732B1; JP2018530747A; US20180252720A1; US11385231B2

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para predecir el tiempo de supervivencia de pacientes que padecen cáncer de pulmón. En particular, la presente invención se refiere a un método para predecir el tiempo de supervivencia de un sujeto que padece un cáncer de pulmón que comprende las etapas de i) cuantificar la densidad de células T reguladoras (Treg) en una muestra de tejido tumoral obtenida del sujeto, ii) cuantificar la densidad de una población adicional de células inmunitarias seleccionadas del grupo que consiste en células DC maduras con TLS o células TLS-B o células Tconv, células T CD8+ o células T CD8+ Granzima-B+ en dicha muestra de tejido tumoral, iii) comparar la densidades cuantificadas en los pasos i) y ii) con sus correspondientes valores de referencia predeterminados y iv) concluir que el sujeto tendrá un corto tiempo de supervivencia cuando la densidad de células Treg sea mayor que su correspondiente valor de referencia predeterminado y la densidad de la población adicional de células inmunes es menor que su correspondiente valor de referencia predeterminado o concluir que el sujeto tendrá un largo tiempo de supervivencia cuando la densidad de células Treg es menor que su correspondiente valor de referencia predeterminado y la densidad de la población adicional de células inmunes es mayor que su correspondiente valor de referencia predeterminado. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para predecir el tiempo de supervivencia de pacientes que padecen cáncer de pulmón

Campo de la invención:

La presente invención se refiere a métodos para predecir el tiempo de supervivencia de pacientes que padecen cáncer de pulmón.

Antecedentes de la invención:

Tal como se indica que Dieu-Nosjean et al. (J Clin Oncol 26:4410-4417. 2008), el cáncer de pulmón es la causa más común de muerte relacionada con cáncer en el mundo. Aproximadamente del 80 % al 90 % de los casos implican cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), que incluye adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas. Solo los pacientes cuyos tumores pueden extirparse completamente tienen una posibilidad significativa de aumento de la supervivencia. Sin embargo, tanto como el 30 % de los pacientes con enfermedad en estadio I experimentan recaída después de la cirugía. La correlación entre células inmunitarias infiltrantes de tumores y el pronóstico de pacientes con cáncer de pulmón es controvertida. Un tumor se compone de células malignas, estromales, endoteliales e inmunitarias que forman una red heterogénea y presentan interacciones complejas. Aunque la erradicación del tumor por el sistema inmunitario es a menudo ineficaz, hay evidencias de que muchos cánceres en desarrollo no son ignorados por el sistema inmunitario. Regresiones tumorales espontáneas que se producen simultáneamente con manifestaciones autoinmunitarias y la mayor incidencia de tumores en pacientes inmunosuprimidos son indicaciones de la implicación del sistema inmunitario en el rechazo tumoral. Ratones deficientes en funciones inmunitarias desarrollan espontáneamente tumores. La densidad de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) con fenotipos citotóxicos y de memoria es sumamente predictiva de un buen desenlace clínico en muchos tumores sólidos.

Está bien establecido ahora que las respuestas inmunitarias pueden tener lugar a distancia de los órganos linfoides secundarios, en estructuras linfoides terciarias (TLS). Dieu-Nosjean et al. han observado que estas estructuras similares a ganglios linfáticos pueden desarrollarse en pacientes con cáncer de pulmón. Se han denominado inicialmente “tejidos linfoides asociados a bronquios inducidos por tumores” (Ti-BALT) ya que nunca se encontraron en los tejidos no tumorales de pacientes con NSCLC. Ahora, la terminología actual es “estructura linfoide terciaria” (TLS) u “órgano linfoide terciario” (TLO). Dieu-Nosjean et al. han demostrado que la densidad de DC maduras, una población que se detectó selectivamente en TLS, está asociada con un desenlace clínico favorable en pacientes con NSCLC en estadio temprano (Dieu-Nosjean et al., J. Clin. Oncol., 2008) y en estadio metastásico (Remark et al., Clin Cancer Res. 19 de junio de 2013) lo que sugiere que las TLS asociadas a cáncer de pulmón representan un sitio de activación para células T específicas del tumor.

Más recientemente, el equipo de Dieu-Nosjean también demostró que una alta densidad de B células en TLS (denominadas “células TLS-B” o “células B foliculares”) se correlaciona con supervivencia a largo plazo de pacientes con NSCLC en estado tardío y en estadio avanzado, según la respuesta inmunitaria humoral en curso en TLS (Germain et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2014). La combinación de células TLS-B y DC maduras de TLS permitió la identificación de pacientes con NSCLC con el mejor desenlace clínico. Además, en la TLS, la densidad de células B de centros germinales también se correlaciona con la densidad de células plasmáticas que pueden secretar los anticuerpos contra antígenos asociados a tumores endógenos. Estos datos sugieren fuertemente que TLS desempeña un papel protector frente a los tumores al promover una respuesta inmunitaria humoral en pacientes con cáncer de pulmón (Germain et al., Frontiers Immunol., 2015).

Se ha notificado la presencia de TLS en otros tumores humanos incluidos, pero sin limitarse a, cáncer colorrectal (Coppola et al., Am J Pathol., 2011;179(1):37-45; McMullen et al., Clin Exp Immunol. 2010; 161(1):81-8), cáncer de mama (Gobert et al., Cancer Res 2009; 69(5) 2000-2009; Martinet et al., Cancer Res. 2011 ;71(17) 5678-87; Gu-Trantien et al., J Clin Invest. 2013; 123(7):2873-92) y melanoma (Martinet et al., Cancer Res. 2011;71(17) 5678-87; Cipponi et al., Cancer Res. 2012;72(16):3997-4007) lo que indica que surgen estructuras linfoides ectópicas en muchos tumores sólidos (Dieu-Nosjean et al., Trends Immunol., 2014).

Sumario de la invención:

La presente invención se refiere a métodos para predecir el tiempo de supervivencia de pacientes que padecen cáncer de pulmón. En particular, la presente invención se define por lo siguiente

1. Un método para predecir el tiempo de supervivencia de un sujeto que padece cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) que comprende las etapas de:

i) cuantificar la densidad de células T CD3+FoxP3+ reguladoras (Treg) en una muestra de tejido tumoral obtenida del sujeto,

ii) cuantificar la densidad de una población adicional de células inmunitarias seleccionadas del grupo que consiste en DC maduras de TLS o células TLS-B o células Tconv CD3+ FoxP3- o células T CD8+ o células T CD8+ Granzima-B+ en dicha muestra de tejido tumoral,

iii) comparar las densidades cuantificadas en las etapas i) y ii) con sus correspondientes valores de referencia predeterminados y

iv) concluir que el sujeto tendrá un tiempo de supervivencia corto cuando la densidad de células Treg sea mayor que su correspondiente valor de referencia predeterminado y la densidad de la población adicional de células inmunitarias sea menor que su correspondiente valor de referencia predeterminado o concluir que el sujeto tendrá un tiempo de supervivencia prolongado cuando la densidad de células Treg sea menor que su correspondiente valor de referencia predeterminado y la densidad de la población adicional de células inmunitarias sea mayor que su correspondiente valor de referencia predeterminado.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la densidad de células T CD3+FoxP3+ reguladoras (Treg) y la densidad de DC maduras de TLS se cuantifican en las etapas i) y ii) respectivamente.

3. El método según la reivindicación 1, en el que la densidad de células T CD3+FoxP3+ reguladoras (Treg) y la densidad de células TLS-B se cuantifican en las etapas i) y ii) respectivamente.

4. El método según la reivindicación 1, en el que la densidad de células T CD3+FoxP3+ reguladoras (Treg) y la densidad de células Tconv CD3+ FoxP3- se cuantifican en las etapas i) y ii) respectivamente.

5. El método según la reivindicación 1, en el que la densidad de células T CD3+FoxP3+ reguladoras (Treg) y la densidad de células T CD8+ se cuantifican en las etapas i) y ii) respectivamente.

6. El método según la reivindicación 1, en el que la densidad de células T CD3+FoxP3+ reguladoras (Treg) y la densidad de células T CD8+ Granzima-B+ se cuantifican en las etapas i) y ii) respectivamente.

7. El método según la reivindicación 1, en el que la cuantificación de las densidades se determina mediante IHC.

Descripción detallada de la invención:

Un primer objeto de la presente invención da a conocer un método para predecir el tiempo de supervivencia de un sujeto que padece cáncer de pulmón que comprende las etapas de i) cuantificar la densidad de células T reguladoras (Treg) en una muestra de tejido tumoral obtenida del sujeto, ii) cuantificar la densidad de una población adicional de células inmunitarias seleccionadas del grupo que consiste en DC maduras de TLS o células TLS-B o células Tconv CD3+, células T CD8+ o células T CD8+ Granzima-B+ en dicha muestra de tejido tumoral, iii) comparar las densidades cuantificadas en las etapas i) y ii) con sus correspondientes valores de referencia predeterminados y iv) concluir que el sujeto tendrá un tiempo de supervivencia corto cuando la densidad de células Treg sea mayor que su correspondiente valor de referencia predeterminado y la densidad de la población adicional de células inmunitarias sea menor que su correspondiente valor de referencia predeterminado o concluir que el sujeto tendrá un tiempo de supervivencia prolongado cuando la densidad de células Treg sea menor que su correspondiente valor de referencia predeterminado y la densidad de la población adicional de células inmunitarias sea mayor que su correspondiente valor de referencia predeterminado.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cáncer de pulmón” incluye, pero no se limita a, todos los tipos de cánceres de pulmón en todos los estadios de progresión como carcinomas de pulmón, cáncer de pulmón metastásico, carcinomas de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) tales como adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de células escamosas o carcinomas de pulmón de células pequeñas (SCLC). En algunas realizaciones, el sujeto padece carcinomas de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

El método es particularmente adecuado para predecir la duración de la supervivencia global (OS), supervivencia libre de progresión (PFS) y/o supervivencia libre de enfermedad (DFS) del sujeto con cáncer. Los expertos en la técnica reconocerán que el tiempo de supervivencia de OS se basa generalmente en y se expresa como el porcentaje de personas que sobreviven a un cierto tipo de cáncer durante un periodo de tiempo específico. Las estadísticas del cáncer usan a menudo una tasa de supervivencia global a los cinco años. En general, las tasas de OS no especifican si los supervivientes del cáncer están sometiéndose todavía a tratamiento a los cinco años o si ya no tienen cáncer (lograron la remisión). La DSF proporciona más información específica y es el número de personas con un cáncer particular que logran la remisión. Además, las tasas de supervivencia libre de progresión (PFS) (el número de personas que todavía tienen cáncer, pero su enfermedad no progresa) incluyen personas que pueden tener cierto éxito con el tratamiento, pero el cáncer no ha desaparecido completamente. Tal como usa en el presente documento, la expresión “tiempo de supervivencia corto” indica que el sujeto tendrá un tiempo de supervivencia que será menor que la mediana (o media) observada en la población general de sujetos que padecen dicho cáncer. Cuando el sujeto tendrá un tiempo de supervivencia corto, quiere decirse que el sujeto tendrá un “mal pronóstico”. A la inversa, la expresión “tiempo de supervivencia prolongado” indica que el sujeto tendrá un tiempo de supervivencia que será mayor que la mediana (o media) observada en la población general de sujetos que padecen dicho cáncer. Cuando el sujeto tendrá un tiempo de supervivencia prolongado, quiere decirse que el sujeto tendrá un “buen pronóstico”.

Tal como se usa en el presente documento, el término “muestra de tejido tumoral” tiene su significado general en la técnica y abarca trozos o cortes de tejido que se han extirpado incluido después de una resección quirúrgica del tumor. La muestra de tejido tumoral puede someterse a una variedad de técnicas de preparación y almacenamiento tras la recogida bien conocidas (por ejemplo, fijación, almacenamiento, congelación, etc.) antes de determinar las densidades celulares. Normalmente, la muestra de tejido tumoral se fija en formalina y se incrusta en un fijador rígido, tal como parafina (cera) o epoxi, que se coloca en un molde y luego se endurece para producir un bloque que se corta fácilmente. Entonces, pueden prepararse cortes finos de material usando un micrótomo, colocarse sobre un portaobjetos de vidrio y someterlo, por ejemplo, a inmunohistoquímica (IHC) (usando un autómata de IHC tal como BenchMark® XT o Autostainer Dako, para obtener portaobjetos teñidos). Tal como se usa en el presente documento, el término “estructura linfoide inducida por tumor” tiene su significado general en la técnica y se refiere a la organización de leucocitos infiltrantes de tumores en una estructura similar a un ganglio linfático (también denominada TLS o TLO) en el estroma de la masa tumoral, y está compuesta por agrupaciones de células DC-T maduras (áreas de células T) y folículos de células B (áreas de células B). Normalmente, dependiendo de la sección del tumor, solo puede observarse una de las dos áreas o ambas áreas. Esta organización se denominó Ti-BALT para tejidos linfoides asociados a bronquios inducidos por tumores en cáncer de pulmón (Dieu-Nosjean et al., J. Clin. oncol., 2008).

Tal como se usa en el presente documento, el término “célula T reguladora” o “célula Treg” tiene su significado general en la técnica y se refiere a un subconjunto de células T auxiliares dotadas de una especificidad de antígeno dada impresa por el TCR que expresa y con propiedades reguladoras definidas por la capacidad de suprimir la respuesta de los linfocitos T convencionales u otras células inmunes. Tales respuestas se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, actividad citotóxica contra células diana presentadoras de antígenos y secreción de diferentes citocinas. Existen diferentes tipos de células Treg e incluyen, pero no se limitan a, células Treg inducibles y derivadas del timo, caracterizadas por diferentes fenotipos tales como CD4+CD25+/alto, CD4+CD25+/altoCD127-/bajo solos o en combinación con marcadores adicionales que incluyen, pero no se limitan a, FoxP3, neuropilina-1 (CD304), proteína relacionada con TNFR inducida por glucocorticoides (GITR), proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4, CD 152). Normalmente, una célula Treg según la invención es una célula T CD3+ FoxP3+. Normalmente, la densidad de las células Treg puede medirse en varias áreas del tumor: tumor completo, TLS y áreas distintas de TLS.

Tal como se usa en el presente documento, el término “células dendríticas maduras de TLS” o “DC maduras de TLS” o “DC maduras” tiene su significado general en la técnica y se refiere a una población de células que son profesionales para la presentación de antígenos procesados a células T. Las células dendríticas maduras que se infiltran en el tumor se localizan selectivamente en contacto con las células T, en las áreas ricas en células T de la estructura linfoide inducida por el tumor. Normalmente, las DC maduras se caracterizan por la expresión clásica de marcadores en su superficie celular, tales como DC-LAMP (es decir, CD208). Normalmente, una célula dendrítica de la presente invención es una DC madura DC-LAMP+.

Tal como se usa en el presente documento, el término “célula B folicular” o “célula TLS-B” tiene su significado general en la técnica y se refiere a subconjuntos de células B agrupados en el folículo de células B de TLS. Son principalmente de fenotipo virgen y de centro germinal.

Tal como se usa en el presente documento, el término “célula T convencional” o “célula T Tconv” tiene su significado general en la técnica y se refiere a células T CD3+ (incluidas células CD4+ y células T CD8+) con la excepción de células Treg. Se definen por la expresión de CD3 y la nula/baja expresión de FoxP3 (célula CD3+ FoxP3-). En algunas realizaciones, las células Tconv son células T CD3+.

Tal como se usa en el presente documento, el término “célula T CD8+ Granzima-B+” o “célula T CD8+ Gran-B+” tiene su significado general en la técnica y se refiere a un subconjunto de células T CD8+ CD3+ que expresan la molécula citolítica Granzima B, y que tienen la capacidad de destruir la célula diana de manera dependiente de granzima B. Son de fenotipo efector.

En alguna divulgación, la densidad de células T reguladoras (Treg) y la densidad de DC maduras de TLS se cuantifican en las etapas i) y ii) respectivamente.

En alguna divulgación, la densidad de células T reguladoras (Treg) y la densidad de células TLS-B se cuantifican en las etapas i) y ii) respectivamente.

En alguna divulgación, la densidad de células T reguladoras (Treg) y la densidad de células Tconv se cuantifican en las etapas i) y ii) respectivamente.

En alguna divulgación, la densidad de células T reguladoras (Treg) y la densidad de células T CD8+ se cuantifican en las etapas i) y ii) respectivamente.

En alguna divulgación, la densidad de células T reguladoras (Treg) y la densidad de células T CD8+ Gran-B+ se cuantifican en las etapas i) y ii) respectivamente.

En algunas divulgaciones, la cuantificación de las densidades está determinada por IHC.

Por ejemplo, en la divulgación, la cuantificación de la densidad de células Treg se realiza poniendo en contacto la muestra de tejido tumoral con una pareja de unión (por ejemplo, un anticuerpo) específico para un marcador celular de dichas células. Normalmente, la cuantificación de la densidad de las células Treg se realiza poniendo en contacto la muestra tisular de tejido tumoral con ambas parejas de unión (por ejemplo, un anticuerpo) específicas para FoxP3 (marcador intranuclear) y para CD3 (marcador de superficie celular), respectivamente. Por ejemplo, en la divulgación, la cuantificación de la densidad de DC maduras de TLS se realiza poniendo en contacto la muestra de tejido tumoral con una pareja de unión (por ejemplo, un anticuerpo) específica para un marcador celular intracitoplasmático de dichas células. Normalmente, la cuantificación de la densidad de DC maduras de TLS se realiza poniendo en contacto la muestra tisular de tejido tumoral con una pareja de unión (por ejemplo, un anticuerpo) específica para DC-LAMP (CD208, una tinción de puntos).

Por ejemplo, en la divulgación, la cuantificación de la densidad de células TLS-B se realiza poniendo en contacto la muestra de tejido tumoral con una pareja de unión (por ejemplo, un anticuerpo) específica para un marcador de superficie celular de dichas células. Normalmente, la cuantificación de la densidad de células TLS-B se realiza poniendo en contacto la muestra de tejido tumoral con una pareja de unión (por ejemplo, un anticuerpo) específica para CD20.

Por ejemplo, en la divulgación, la cuantificación de la densidad de células Tconv se realiza poniendo en contacto la muestra de tejido tumoral con una pareja de unión (por ejemplo, un anticuerpo) específica para un marcador celular de dichas células, excluyendo células Treg. Normalmente, la cuantificación de la densidad de células Tconv (CD3+ FoxP3-) se realiza poniendo en contacto la muestra de tejido tumoral con ambas parejas de unión (por ejemplo, un anticuerpo) específicas para CD3 (marcador de superficie celular) y FoxP3 (marcador intranuclear), respectivamente.

Por ejemplo, en la divulgación, la cuantificación de la densidad de células T CD8+ se realiza poniendo en contacto la muestra de tejido tumoral con una pareja de unión (por ejemplo, un anticuerpo) específica para un marcador de superficie celular de dichas células. Normalmente, la cuantificación de la densidad de células T CD8+ se realiza poniendo en contacto la muestra de tejido tumoral con una pareja de unión (por ejemplo, un anticuerpo) específica para CD8.

Por ejemplo, en la divulgación, la cuantificación de la densidad de células CD8+ Gran-B+ se realiza poniendo en contacto la muestra de tejido tumoral con una pareja de unión (por ejemplo, un anticuerpo) específica para un marcador celular de dichas células. Normalmente, la cuantificación de la densidad de células T CD8+ Gran-B+ se realiza poniendo en contacto la muestra de tejido tumoral con ambas parejas de unión (por ejemplo, un anticuerpo) específicas para CD8 (marcador de superficie celular) y Granzima-B (marcador intracitoplasmático), respectivamente.

Normalmente, la densidad de células Treg o DC maduras de TLS o células Tconv, células T CD8+ o células T CD8+ Gran-B+ se expresa como el número de estas células que se cuentan por unidad de superficie de muestra de tejido, por ejemplo, como el número de células que se cuentan por mm2 del área de superficie de la muestra de tejido tumoral. En algunas realizaciones, la densidad de células también puede consistir en el porcentaje de células específicas por células totales (establecido en el 100 %). Puesto que las células TLS-B se organizan en un agregado celular en el folículo de células B de TLS, la densidad de células TLS-B puede medirse como una superficie total de folículos de células B por unidad de superficie del tumor, por ejemplo, como el área de superficie de folículos de células B en mm2 por campo de potencia intermedia (aumento original x100) o mm2 del área de superficie del tumor.

La inmunohistoquímica normalmente incluye las siguientes etapas: i) fijar la muestra de tejido tumoral con formalina, ii) incrustar dicha muestra de tejido tumoral en parafina, iii) cortar dicha muestra de tejido tumoral en secciones para teñirlas, iv) incubar dichas secciones con la pareja de unión específica para la marcador, v) enjuagar dichas secciones, vi) incubar dicha sección con un anticuerpo secundario normalmente biotinilado y vii) revelar el complejo antígeno-anticuerpo normalmente con un complejo de avidina-biotina-peroxidasa. Por consiguiente, la muestra de tejido tumoral se incuba en primer lugar con las parejas de unión. Después del lavado, los anticuerpos marcados que están unidos al marcador de interés se revelan mediante la técnica adecuada, dependiendo de la clase de marcador que lleva el anticuerpo marcado, por ejemplo, marcador radioactivo, fluorescente o enzimático. Puede realizarse mareaje múltiple simultáneamente. Como alternativa, el método de la presente invención puede usar un anticuerpo secundario acoplado a un sistema de amplificación (para intensificar la señal de tinción) y moléculas enzimáticas. Tales anticuerpos secundarios acoplados están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Dako, sistema EnVision. Puede usarse contratinción, por ejemplo, hematoxilina y eosina, DAPI, Hoechst. Pueden lograrse otros métodos de tinción usando cualquier método o sistema adecuado como resultaría evidente para un experto en la técnica, incluidos sistemas automatizados, semiautomáticos o manuales. Por ejemplo, pueden unirse uno o más marcadores al anticuerpo, permitiendo de ese modo la detección de la proteína diana (es decir, el marcador). Los marcadores a modo de ejemplo incluyen isótopos radiactivos, fluoróforos, ligandos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el marcador es un punto cuántico. Los ejemplos no limitativos de marcadores que pueden conjugarse con ligandos de afinidad primarios y/o secundarios incluyen tintes o metales fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, fluorescamina), tintes cromóforos (por ejemplo, rodopsina), compuestos quimioluminiscentes (por ejemplo, luminal, imidazol) y proteínas bioluminiscentes (por ejemplo, luciferina, luciferasa), haptenos (por ejemplo, biotina). Se describen una variedad de otros agentes que fluorescen y cromóforos útiles en Stryer L (1968) Science 162:526-533 y Brand L y Gohlke JR (1972) Annu. Rev. Biochem. 41:843-868. Los ligandos de afinidad también pueden marcarse con enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-lactamasa), radioisótopos (por ejemplo, 3H, 14C, 32P, 35S o 125I) y partículas (por ejemplo, oro). Los diferentes tipos de marcadores pueden conjugarse con un ligando de afinidad usando diversas químicas, por ejemplo la reacción de amina o la reacción de tiol. Sin embargo, pueden usarse otros grupos reactivos distintos de aminas y tioles, por ejemplo, aldehídos, ácidos carboxílicos y glutamina. En la técnica se conocen diversos métodos de tinción enzimática para detectar una proteína de interés. Por ejemplo, las interacciones enzimáticas pueden visualizarse usando diferentes enzimas tales como peroxidasa, fosfatasa alcalina o diferentes cromógenos tales como DAB, AEC o Fast Red. En otros ejemplos, el anticuerpo puede conjugarse con péptidos o proteínas que pueden detectarse por medio de un anticuerpo o pareja de unión marcado. En un ensayo de IHC indirecta, es necesario un anticuerpo secundario o una segunda pareja de unión para detectar la unión de la primera pareja de unión, ya que no está marcado. Se obtienen imágenes de cada una de las muestras teñidas resultantes usando un sistema para observar la señal detectable y adquirir una imagen, tal como una imagen digital de la tinción. Los expertos en la técnica conocen bien métodos para la adquisición de imágenes. Por ejemplo, una vez que se ha teñido la muestra, puede usarse cualquier dispositivo de obtención de imágenes óptico o no ópti

por ejemplo, microscopios ópticos verticales o invertidos, microscopios confocales de barrido, cámaras, microscopios electrónicos de barrido o de tunelización, microscopios de sonda enlatada y detectores de obtención de imágenes infrarrojas. En algunos ejemplos, la imagen puede capturarse digitalmente. Las imágenes obtenidas pueden usarse luego para determinar cuantitativa o semicuantitativamente la cantidad de marcador en la muestra, o el número absoluto de células positivas para el fabricante de interés, o la superficie de células positivas para el marcador de interés. En la técnica están disponibles diversos sistemas automatizados de procesamiento, escaneo y análisis de muestras adecuados para su uso con IHC. Tales sistemas pueden incluir tinción automatizada y escaneo microscópico, análisis de imágenes computarizado, comparación de secciones en serie (para controlar la variación en la orientación y el tamaño de una muestra), generación de informes digitales y archivo y seguimiento de muestras (tales como portaobjetos en los que se colocan secciones de tejido). Están disponibles comercialmente sistemas de obtención de imágenes celulares que combinan microscopios ópticos convencionales con sistemas de procesamiento de imágenes digitales para realizar análisis cuantitativos de células y tejidos, incluidas muestras inmunoteñidas. Véase, por ejemplo, el sistema CAS-200 (Becton, Dickinson & Co.). En particular, la detección puede realizarse manualmente o mediante técnicas de procesamiento de imágenes que implican procesadores y software informáticos. Usando tal software, por ejemplo, las imágenes pueden configurarse, calibrarse, estandarizarse y/o validarse basándose en factores que incluyen, por ejemplo, la calidad de tinción o la intensidad de tinción, usando procedimientos conocidos por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense publicada n.° US20100136549). La imagen puede analizarse y puntuarse cuantitativa o semicuantitativamente basándose en la intensidad de tinción de la muestra. Histoquímica cuantitativa o semicuantitativa se refiere al método de escanear y puntuar muestras que se han sometido a histoquímica, para identificar y cuantificar la presencia del biomarcador especificado (es decir, el marcador). Los métodos cuantitativos o semicuantitativos pueden emplear software de obtención de imágenes para detectar densidades de tinción o la cantidad de tinción o métodos de detección de tinciones a simple vista, donde un operario capacitado clasifica los resultados numéricamente. Por ejemplo, las imágenes pueden analizarse cuantitativamente usando algoritmos de recuento de píxeles y patrones de reconocimiento de tejidos (por ejemplo, software Aperio Spectrum, plataforma Automated QUantitatative Analysis (plataforma AQUa ®), o Tribvn con el software Ilastic y Calopix), y otros métodos convencionales que miden o cuantifican o semicuantifican el grado de tinción; véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 8.023.714; patente estadounidense n.° 7.257.268; patente estadounidense n.° 7.219.016; patente estadounidense n.° 7.646.905; la publicación de patente estadounidense publicada n.° US20100136549 y 20110111435; Camp. et al. (2002) Nature Medicine, 8:1323-1327; Bacus et al. (1997) Analyt Quant Cytol Histol, 19:316-328). Puede calcularse y puntuarse una razón de tinción positiva intensa (tal como tinción marrón) con respecto a la suma del área teñida total. La cantidad del biomarcador detectado (es decir, el marcador) se cuantifica y se proporciona como un porcentaje de píxeles positivos y/o una puntuación. Por ejemplo, la cantidad puede cuantificarse como un porcentaje de píxeles positivos. En algunos ejemplos, la cantidad se cuantifica como el porcentaje de área teñida, por ejemplo, el porcentaje de píxeles positivos. Por ejemplo, una muestra puede tener al menos o aproximadamente al menos o aproximadamente el 0, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más píxeles positivos en comparación con el área de tinción total. Por ejemplo, la cantidad puede cuantificarse como un número absoluto de células positivas para el marcador de interés. En algunas realizaciones, se otorga una puntuación a la muestra que es una representación numérica de la intensidad o cantidad de la tinción histoquímica de la muestra y representa la cantidad de biomarcador objetivo (por ejemplo, el marcador) presente en la muestra. A los valores de densidad óptica o área porcentual se les puede dar una puntuación escalada, por ejemplo en una escala entera. Por tanto, en algunas realizaciones, el método de la presente invención comprende las etapas que consisten en i) proporcionar uno o más cortes inmunoteñidos de sección de tejido obtenidos mediante un sistema automatizado de tinción de portaobjetos mediante el uso de una pareja de unión capaz de interaccionar selectivamente con el marcador (por ejemplo, un anticuerpo tal como se describió anteriormente), ii) proceder a la digitalización de los portaobjetos de la etapa i) mediante captura de escaneo de alta resolución, iii) detectar el corte de sección de tejido en la imagen digital iv) proporcionar una cuadrícula de referencia de tamaño con unidades distribuidas uniformemente que tienen una misma superficie, adaptándose dicha rejilla al tamaño de la sección de tejido que va a analizarse, y v) detectar, cuantificar y medir la intensidad o el número absoluto de células teñidas en cada unidad, mediante lo cual se evalúa el número o la densidad de células teñidas de cada unidad.

Normalmente, el valor de referencia predeterminado es un valor umbral o un valor de corte. Normalmente, un “valor umbral” o “valor de corte” puede determinarse de manera experimental, empírica o teórica. También puede seleccionarse arbitrariamente un valor umbral basándose en las condiciones experimentales y/o clínicas existentes, como reconocería un experto habitual en la técnica. Por ejemplo, puede usarse la medición retrospectiva de densidades celulares en muestras de sujetos históricas almacenadas adecuadamente para establecer el valor de referencia predeterminado. El valor umbral tiene que determinarse con el fin de obtener la sensibilidad y especificidad óptimas según la función de la prueba y el equilibrio beneficio/riesgo (consecuencias clínicas de falsos positivos y falsos negativos). Normalmente, la sensibilidad y especificidad óptimas (y, por tanto, el valor umbral) pueden determinarse usando una curva de característica operativa del receptor (ROC) basada en datos experimentales. Por ejemplo, después de cuantificar la densidad celular en un grupo de referencia, puede usarse análisis algorítmico para el tratamiento estadístico de las densidades medidas en las muestras que van a someterse a prueba, y así obtener un patrón de clasificación que tenga importancia para la clasificación de la muestra. El nombre completo de la curva ROC es curva de características del operador-receptor, que también se conoce como curva característica de operación del receptor. Se usa principalmente para pruebas de diagnóstico bioquímico clínico. La curva ROC es un indicador integral que refleja las variables continuas de la tasa de verdaderos positivos (sensibilidad) y la tasa de falsos positivos (1-especificidad). Revela la relación entre sensibilidad y especificidad con el método de composición de imágenes. Una serie de diferentes valores de corte (umbrales o valores críticos, valores límite entre resultados normales y anómalos de una prueba de diagnóstico) se establecen como variables continuas para calcular una serie de valores de sensibilidad y especificidad. Luego se usa la sensibilidad como coordenada vertical y se la especificidad como coordenada horizontal para dibujar una curva. Cuanto mayor sea el área bajo la curva (AUC), mayor será la precisión del diagnóstico. En la curva ROC, el punto más cercano al extremo superior izquierdo del diagrama de coordenadas es un punto crítico que tiene valores altos tanto de sensibilidad como de especificidad. El valor de AUC de la curva ROC está entre 1,0 y 0,5. Cuando AUC>0,5, el resultado del diagnóstico mejora cada vez más a medida que el AUC se aproxima a 1. Cuando el AUC está entre 0,5 y 0,7, la precisión es baja. Cuando el AUC está entre 0,7 y 0,9, la precisión es moderada. Cuando el AUC es superior a 0,9, la precisión es bastante alta. Este método algorítmico se realiza preferiblemente con un ordenador. Puede usarse software o sistemas existentes en la técnica para el dibujo de la curva ROC, tales como: software estadístico médico MedCalc 9.2.0.1, SPSS 9.0, ROCPOWER.SAS, DESIGNROC.FOR, MULTIREADER POWER.SAS, CREATE-ROC.SAS, GB STAT V10.0 (Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, Maryland, EE. UU.), etc.

En alguna divulgación, el valor de referencia predeterminado se determina llevando a cabo un método que comprende las etapas de

a) proporcionar una colección de muestras de tejido tumoral de un sujeto que padece cáncer de pulmón;

b) proporcionar, para cada muestra de tejido tumoral proporcionada en la etapa a), información relacionada con el desenlace clínico real para el correspondiente sujeto (es decir, la duración de la supervivencia libre de enfermedad (DFS) y/o la supervivencia global (OS));

c) proporcionar una serie de valores de cuantificación arbitrarios;

d) cuantificar la densidad celular para cada muestra de tejido tumoral contenida en la colección proporcionada en la etapa a);

e) clasificar dichas muestras de tejido tumoral en dos grupos para un valor de cuantificación arbitrario específico proporcionado en la etapa c), respectivamente: (i) un primer grupo que comprende muestras de tejido tumoral que presentan un valor de cuantificación para el nivel que es menor que dicho valor de cuantificación arbitrario contenido en dicha serie de valores de cuantificación; (ii) un segundo grupo que comprende muestras de tejido tumoral que presentan un valor de cuantificación para dicho nivel que es mayor que dicho valor de cuantificación arbitrario contenido en dicha serie de valores de cuantificación; mediante lo cual se obtienen dos grupos de muestras de tejido tumoral para dicho valor de cuantificación específico, en donde las muestras de tejido tumoral de cada grupo se enumeran por separado;

f) calcular la significación estadística entre (i) el valor de cuantificación obtenido en la etapa e) y (ii) el desenlace clínico real de los sujetos de los cuales se derivan las muestras de tejido tumoral contenidas en los grupos primero y segundo definidos en la etapa f);

g) reiterar las etapas f) y g) hasta que se somete a prueba cada valor de cuantificación arbitrario proporcionado en la etapa d);

h) establecer dicho valor de referencia predeterminado como consistente en el valor de cuantificación arbitrario para el que se ha calculado la significación estadística más alta (valor P más significativo obtenido con una prueba de rangos logarítmicos, significación cuando P<0,05) en la etapa g).

Por ejemplo, en la divulgación se ha evaluado la densidad celular de 100 muestras de tejido tumoral de 100 sujetos. Las 100 muestras se clasifican según la densidad celular. La muestra 1 tiene la densidad más alta y la muestra 100 tiene la densidad más baja. Una primera agrupación proporciona dos subconjuntos: por un lado la muestra número 1 y por el otro las otras 99 muestras. La siguiente agrupación proporciona por un lado las muestras 1 y 2 y por el otro lado las 98 muestras restantes, etc., hasta la última agrupación: por un lado las muestras 1 a 99 y por el otro lado la muestra número 100. Según la información relativa al desenlace clínico real del sujeto con cáncer correspondiente, se preparan curvas de Kaplan-Meier para cada uno de los 99 grupos de dos subconjuntos. También para cada uno de los 99 grupos, se calculó el valor p entre ambos subconjuntos (prueba de rangos logarítmicos). A continuación, se selecciona el valor de referencia predeterminado de manera que la discriminación basada en el criterio del valor P mínimo sea la más fuerte. En otros términos, la densidad celular correspondiente al límite entre ambos subconjuntos para los cuales el valor P es mínimo se considera como el valor de referencia predeterminado. Cabe señalar que el valor de referencia predeterminado no es necesariamente la mediana del valor de las densidades celulares. Por tanto, en algunas realizaciones, el valor de referencia predeterminado permite discriminar entre un pronóstico bueno y malo con respecto a DFS y OS para un sujeto. En la práctica, generalmente se obtienen valores de significancia estadística alta (por ejemplo, valores P bajos) para un intervalo de valores de cuantificación arbitrarios sucesivos, y no solo para un único valor de cuantificación arbitrario. Por tanto, en una realización alternativa de la invención, en lugar de usar un valor de referencia predeterminado definido, se proporciona un intervalo de valores. Por tanto, se establece arbitrariamente un valor de significación estadística mínimo (umbral mínimo de significación, por ejemplo, valor P umbral máximo) y se retiene un intervalo de una pluralidad de valores de cuantificación arbitrarios para los cuales el valor de significancia estadística calculado en la etapa g) es mayor (más significativo, por ejemplo, valor P más bajo), de modo que se proporciona un intervalo de valores de cuantificación. Este intervalo de valores de cuantificación incluye un valor de “corte” tal como se describió anteriormente. Por ejemplo, según esta realización específica de un valor de “corte”, el desenlace puede determinarse comparando la densidad celular con el intervalo de valores que se identifican. En algunas realizaciones, un valor de corte consiste, por tanto, en un intervalo de valores de cuantificación, por ejemplo, centrado en el valor de cuantificación para el cual se encuentra el valor de significación estadística más alto (por ejemplo, generalmente el valor P mínimo que se encuentra).

En alguna divulgación, el método de la invención comprende etapas de comparación que incluyen una clasificación de los valores de cuantificación medidos para cada densidad celular en dos grupos, tal como sigue: (i) un primer grupo denominado “Hi” cuando el valor de cuantificación para la densidad celular es mayor que el valor de referencia correspondiente predeterminado y (ii) un segundo grupo denominado “Lo” cuando el valor de cuantificación para la densidad celular es menor que el valor de referencia correspondiente predeterminado. Del ejemplo se desprende que si el resultado de la etapa de comparación consiste en un valor “Hi” para células Treg y un valor “Lo” para otra población de células inmunitarias, entonces se proporciona un mal pronóstico. Por el contrario, si el resultado de la etapa de comparación consiste en valores “Lo” para células Treg y un valor “Hi” para una población adicional de células inmunitarias, entonces se proporciona un buen pronóstico. Puede calcularse una puntuación que es una combinación de las densidades de células Treg y las densidades de la población adicional de células inmunitarias según la siguiente tabla.

Tabla 1: puntuaciones que son una combinación de las densidades de células Treg y las densidades de la población adicional de células inmunitarias

| Lo una población adicional de células inmunitarias/Hi Treg________ | Malo__________ |_1_________ |

En alguna divulgación, el método de la presente invención es adecuado para determinar si un paciente es elegible o no para un tratamiento, en particular un agente inmunoterapéutico. Por ejemplo, cuando se concluye que el paciente tiene un mal pronóstico, entonces el médico puede elegir administrar al paciente un tratamiento. Normalmente, el tratamiento incluye quimioterapia, radioterapia e inmunoterapia.

En alguna divulgación, al sujeto se le administra un agente quimioterápico. El término “agente quimioterápico” se refiere a compuestos químicos que son eficaces en la inhibición del crecimiento tumoral. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida; alquilsulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluidas altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosfaoramida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); una camptotecina (incluido el análogo sintético topotecán); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluidos sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluidos los análogos sintéticos, KW-2189 y CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clomafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenetesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina (11 y caliqueamicina 211, véase, por ejemplo, Agnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994); dinamicina, incluida dinamicina A; una esperamicina; así como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos de antibióticos de enediina de cromoproteínas relacionadas), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, canninomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluidas morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y desoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idanrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalarnicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptomgrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenérgicos tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reponedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfomitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; rizoxina; sizofirán; espirogenanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2”-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobromtol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.]) y doxetaxel (TAXOTERE®, Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición agentes antihormonales que actúan regulando o inhibiendo la acción hormonal sobre tumores tales como antiestrógenos, incluidos, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston); y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

En alguna divulgación, al sujeto se le administra una terapia dirigida contra el cáncer. Las terapias dirigidas contra el cáncer son fármacos u otras sustancias que bloquean el crecimiento y la propagación del cáncer al interferir con moléculas específicas (“dianas moleculares”) que están implicadas en el crecimiento, la progresión y la propagación del cáncer. Las terapias dirigidas contra el cáncer a veces se denominan “medicamentos dirigidos molecularmente”, “terapias dirigidas molecularmente”, “medicamentos de precisión” o nombres similares. En algunas realizaciones, la terapia dirigida consiste en administrar al sujeto un inhibidor de tirosina cinasa. El término “inhibidor de tirosina cinasa” se refiere a cualquiera de una variedad de agentes terapéuticos o fármacos que actúan como inhibidores selectivos o no selectivos de tirosina cinasas receptoras y/o no receptoras. Los inhibidores de tirosina cinasa y compuestos relacionados se conocen bien en la técnica y se describen en la publicación de patente estadounidense 2007/0254295, que se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad. Un experto en la técnica apreciará que un compuesto relacionado con un inhibidor de tirosina cinasa recapitulará el efecto del inhibidor de tirosina cinasa, por ejemplo, el compuesto relacionado actuará sobre un miembro diferente de la ruta de señalización de tirosina cinasa para producir el mismo efecto que tendría un inhibidor de tirosina cinasa de esa tirosina cinasa. Los ejemplos de inhibidores de tirosina cinasa y compuestos relacionados adecuados para su uso en métodos de realizaciones de la presente invención incluyen, entre otros, dasatinib (BMS-354825), PP2, BEZ235, saracatinib, gefitinib (Iressa), sunitinib (Sutent; SU11248), erlotinib (Tarceva; OSI-1774), lapatinib (GW572016; GW2016), canertinib (CI 1033), semaxinib (SU5416), vatalanib (PTK787/ZK₂22584), sorafenib (BAY 43-9006), imatinib (Gleevec; STI571) , leflunomida (SU101), vandetanib (Zactima; ZD6474), MK-2206 (clorhidrato de 8-[4-aminociclobutil)fenil]-9-fenil-1,2,4-triazolo[3,4-f][1,6]naftiridin-3(2H)-ona), derivados de los mismos, análogos de los mismos y combinaciones de los mismos. Se describen inhibidores de tirosina cinasa adicionales y compuestos relacionados adecuados para su uso en la presente invención, por ejemplo, en la publicación de patente estadounidense 2007/0254295, las patentes estadounidenses n.os 5.618.829, 5.639.757, 5.728.868, 5.804.396, 6.100.254, 6.127.374, 6.245.759, 6.306.874, 6.313.138, 6.316.444, 6.329.380, 6.344.459, 6.420.382, 6.479.512, 6.498.165, 6.544.988, 6.562.818, 6.586.423, 6.586.424, 6.740.665, 6.794.393, 6.875.767, 6.927.293, y 6.958.340, todas las cuales se incorporan en el presente documento como referencia en su totalidad. En determinadas realizaciones, el inhibidor de tirosina cinasa es un inhibidor de cinasa de molécula pequeña que se ha administrado por vía oral y que ha sido objeto de al menos un ensayo clínico de fase I, más preferiblemente al menos un ensayo clínico de fase II, incluso más preferentemente al menos un ensayo clínico de fase III y lo más preferiblemente aprobado por la FDA para al menos una indicación hematológica u oncológica. Los ejemplos de tales inhibidores incluyen, pero no se limitan a, gefitinib, erlotinib, lapatinib, canertinib, BMS-599626 (A^c-480), neratinib, KRN-633, C^eP-11981, imatinib, nilotinib, dasatinib, AZM-475271, CP-724714, TAK-165, sunitinib, vatalanib, CP-547632, vandetanib, bosutinib, lestaurtinib, tandutinib, midostaurina, enzastaurina, AEE-788, pazopanib, axitinib, motasenib, OSI-930, cediranib, KRN-951, dovitinib, seliciclib, SNS-032, PD-0332991, MKC-I (Ro-317453; R-440), sorafenib, ABT-869, brivanib (BMS-582664), SU-14813, telatinib, SU-6668, (TSU-68), L-21649, MLN-8054, AEW-541 y PD-0325901.

En alguna divulgación, al sujeto se le administra un agente inmunoterapéutico. El término “agente inmunoterapéutico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto, composición o tratamiento que directa o indirectamente mejora, estimula o aumenta la respuesta inmunitaria del cuerpo contra células cancerosas y/o que disminuye los efectos secundarios de otras terapias anticancerígenas. Por tanto, la inmunoterapia es una terapia que directa o indirectamente estimula o mejora las respuestas del sistema inmunitario a células cancerosas y/o disminuye los efectos secundarios que pueden haber provocado otros agentes anticancerígenos. La inmunoterapia también se denomina en la técnica terapia inmunológica, terapia biológica, terapia modificadora de la respuesta biológica y bioterapia. Los ejemplos de agentes inmunoterapéuticos comunes conocidos en la técnica incluyen, pero no se limitan a, citocinas, vacunas contra el cáncer, anticuerpos monoclonales y adyuvantes distintos de citocinas. Alternativamente, el tratamiento inmunoterapéutico puede consistir en administrar al sujeto una cantidad de células inmunitarias (células T, células NK, células dendríticas, células B, etc.).

Los agentes inmunoterapéuticos pueden ser no específicos, es decir, refuerzan el sistema inmunológico en general para que el cuerpo humano se vuelva más eficaz en la lucha contra el crecimiento y/o la propagación de las células cancerosas, o pueden ser específicos, es decir, dirigidos a las propias células cancerosas. Los regímenes de inmunoterapia pueden combinar el uso de agentes inmunoterapéuticos específicos y no específicos.

Los agentes inmunoterapéuticos no específicos son sustancias que estimulan o mejoran indirectamente el sistema inmunitario. Se han usado agentes inmunoterapéuticos no específicos solos como terapia principal para el tratamiento del cáncer, así como además de una terapia principal, en cuyo caso el agente inmunoterapéutico no específico funciona como adyuvante para potenciar la eficacia de otras terapias (por ejemplo, vacunas contra el cáncer). Los agentes inmunoterapéuticos no específicos también pueden funcionar en este último contexto para reducir los efectos secundarios de otras terapias, por ejemplo, la supresión de la médula ósea inducida por ciertos agentes quimioterápicos. Los agentes inmunoterapéuticos no específicos pueden actuar sobre células clave del sistema inmunitario y provocar respuestas secundarias, tales como una mayor producción de citocinas e inmunoglobulinas. Alternativamente, los propios agentes pueden comprender citocinas. Los agentes inmunoterapéuticos no específicos se clasifican generalmente como citocinas o adyuvantes distintos de citocinas.

Varias citocinas han encontrado aplicación en el tratamiento del cáncer, o bien como inmunoterapias generales no específicas diseñadas para reforzar el sistema inmunitario o bien como adyuvantes proporcionados con otras terapias. Las citocinas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, interferones, interleucinas y factores estimulantes de colonias.

Los interferones (IFN) contemplados por la presente invención incluyen los tipos comunes de IFN, IFN-alfa (IFN-a), IFN-beta (IFN-P) e IFN-gamma (IFN-y). Los IFN pueden actuar directamente sobre células cancerosas, por ejemplo, retardando su crecimiento, promoviendo su desarrollo en células con un comportamiento más normal y/o aumentando su producción de antígenos, haciendo así que las células cancerosas sean más fáciles de reconocer y destruir para el sistema inmunitario. Los IFN también pueden actuar indirectamente sobre células cancerosas, por ejemplo, ralentizando la angiogénesis, reforzando el sistema inmunitario y/o estimulando células citolíticas naturales (NK), células T y los macrófagos. IFN-alfa recombinante está disponible comercialmente como Roferon (Roche Pharmaceuticals) e Intron A (Schering Corporation).

Las interleucinas contempladas por la presente invención incluyen IL-2, IL-4, IL-11 e IL-12. Los ejemplos de interleucinas recombinantes disponibles comercialmente incluyen Proleukin® (IL-2; Chiron Corporation) y Neumega® (IL-12; Wyeth Pharmaceuticals). Zymogenetics, Inc. (Seattle, Washington) está sometiendo a prueba actualmente una forma recombinante de IL-21, que también se contempla para su uso en las combinaciones de la presente invención.

Los factores estimulantes de colonias (CSF) contemplados por la presente invención incluyen factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF o filgrastim), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF o sargramostim) y eritropoyetina (epoetina alfa, darbepoetina). El tratamiento con uno o más factores de crecimiento puede ayudar a estimular la generación de nuevas células sanguíneas en sujetos que se someten a quimioterapia tradicional. En consecuencia, el tratamiento con CSF puede ser útil en la disminución de los efectos secundarios asociados con la quimioterapia y puede permitir el uso de dosis más altas de agentes quimioterápicos. Están disponibles comercialmente diversos factores estimulantes de colonias recombinantes, por ejemplo, Neupogen® (G-CSF; Amgen), Neulasta (pelfilgrastim; Amgen), Leukine (GM-CSF; Berlex), Procrit (eritropoyetina; Ortho Biotech), Epogen (eritropoyetina; Amgen), Arnesp (eritropoyetina).

Además de tener dianas específicas o no específicas, los agentes inmunoterapéuticos pueden ser activos, es decir, estimular la propia respuesta inmunitaria del cuerpo, o pueden ser pasivos, es decir, comprender componentes del sistema inmunitario que se generaron externamente al cuerpo.

La inmunoterapia pasiva específica normalmente implica el uso de uno o más anticuerpos monoclonales que son específicos para una célula cancerosa que expresa un antígeno particular o que son específicos para un factor de crecimiento celular particular. Pueden usarse anticuerpos monoclonales en el tratamiento del cáncer de varios modos, por ejemplo, para potenciar la respuesta inmunitaria de un sujeto a un tipo específico de cáncer, para interferir con el crecimiento de células cancerosas seleccionando como diana factores de crecimiento celular específicos, tales como aquellos implicados en la angiogénesis, o potenciando la administración de otros agentes anticancerígenos a las células cancerosas cuando se unen o conjugan con agentes tales como agentes quimioterápicos, partículas radiactivas o toxinas.

En alguna divulgación, el agente inmunoterapéutico es un inhibidor de puntos de control inmunitario. Tal como se usa en el presente documento, el término “inhibidor de puntos de control inmunitario” se refiere a moléculas que reducen, inhiben, interfieren o modulan total o parcialmente una o más proteínas de puntos de control. Las proteínas de punto de control regulan la activación o función de células T. Se conocen numerosas proteínas de punto de control, tales como CTLA-4 y sus ligandos CD80 y CD86; y PD1 con sus ligandos _pD_l1 y PDL2 (Pardoll, Nature Reviews Cancer 12: 252-264, 2012). Estas proteínas son responsables de interacciones coestimuladoras o inhibidoras de las respuestas de las células T. Las proteínas de puntos de control inmunitario regulan y mantienen la autotolerancia y la duración y amplitud de las respuestas inmunitarias fisiológicas. Los inhibidores de puntos de control inmunitario incluyen anticuerpos o se derivan de anticuerpos. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos anti-CTLA4 (por ejemplo, Ipilimumab), anticuerpos anti-PD1 (por ejemplo, Nivolumab, Pembrolizumab), anticuerpos anti-PDL1, anticuerpos anti-TIM3, anticuerpos anti-LAG3, anticuerpos anti-B7H3, anticuerpos anti-B7H4, anticuerpos anti-BTLA y anticuerpos anti-B7H6. Se describen ejemplos de anticuerpos anti-CTLA-4 en las patentes estadounidenses n.os 5.811.097; 5.811.097; 5.855.887; 6.051.227; 6.207.157; 6.682.736; 6.984.720; y 7.605.238. Un anticuerpo anti-CTLA-4 es tremelimumab (ticilimumab, CP-675.206). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CTLA-4 es ipilimumab (también conocido como 10D1, MDX-D010), un anticuerpo IgG monoclonal completamente humano que se une a CTLA-4. Otra proteína de punto de control inmunitario es la muerte celular programada 1 (PD-1). Se describen ejemplos de bloqueantes de PD-1 y PD-L1 en las patentes estadounidenses n.os 7.488.802; 7.943.743; 8.008.449; 8.168.757; 8.217.149 y las solicitudes de patente publicadas PCT n.os: WO03042402, WO2008156712, WO2010089411, WO2010036959, WO2011066342, WO2011159877, WO2011082400 y WO2011161699. En algunas realizaciones, los bloqueantes de PD-1 incluyen anticuerpos anti-PD-L1. En ciertas otras realizaciones, los bloqueantes de PD-1 incluyen anticuerpos anti-PD-1 y proteínas de unión similares tales como nivolumab (MDX 1106, BMS 936558, ONO 4538), un anticuerpo IgG4 completamente humano que se une y bloquea la activación de PD-1 por sus ligandos _pD-LI y PD-L2; lambrolizumab (MK-3475 o SCH 900475), un anticuerpo IgG4 monoclonal humanizado contra PD-1; _cT-011, un anticuerpo humanizado que se une a PD-1; AMP-224 es una proteína de fusión de B7-DC; una porción Fc de anticuerpo; BMS-936559 (MDX-1105-01) para el bloqueo de PD-Ll (B7-H1). Otros inhibidores de puntos de control inmunitario incluyen inhibidores del gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3), tales como IMp321, una proteína de fusión de Ig soluble (Brignone et al., 2007, J. Immunol. 179:4202-4211). Otros inhibidores de puntos de control inmunitario incluyen los inhibidores de B7, tales como inhibidores de B7-H3 y B7-H4. En particular, el anticuerpo anti-B7-H3 MGA271 (Loo et al., 2012, Clin. Cancer Res. 15 de julio (18) 3834). También se incluyen inhibidores de TIM3 (dominio de inmunoglobulina de células T y dominio de mucina 3) (Fourcade et al., 2010, J. Exp. Med. 207:2175-86 y Sakuishi et al., 2010, J. Exp. Med. 207:2187-94). En algunas realizaciones, el tratamiento inmunoterapéutico consiste en una inmunoterapia adoptiva, tal como describen Nicholas P. Restifo, Mark E. Dudley y Steven A. Rosenberg (“Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response, Nature Reviews Immunology, volumen 12, abril de 2012). En la inmunoterapia adoptiva, los linfocitos circulantes del paciente, o linfocitos infiltrados en tumores, se aíslan in vitro, se activan mediante linfocinas tales como IL-2 y vuelven a administrarse (Rosenberg et al., 1988; 1989). Lo más preferible es que los linfocitos activados sean células del propio paciente que se aislaron previamente de una muestra de sangre y se activaron (o “expandieron”) in vitro.

En alguna divulgación, el tratamiento inmunoterapéutico consiste en un aloinjerto, en particular, un aloinjerto con células madre hematopoyéticas HSC. El tratamiento inmunoterapéutico también puede consistir en una inmunoterapia adoptiva, tal como lo describe Nicholas P. Restifo, Mark E. Dudley y Steven A. Rosenberg (“Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response, Nature Reviews Immunology, volumen 12, abril de 2012). En la inmunoterapia adoptiva, los linfocitos circulantes del sujeto, células NK, se aíslan y se amplifican ex-vivo y se readministran al sujeto. Los linfocitos activados o células NK son más preferiblemente las propias células del sujeto que se aislaron anteriormente de una muestra de sangre o de tumor y se activaron (o “expandieron”) ex vivo.

En alguna divulgación, al sujeto se le administra un agente radioterápico. El término “agente radioterápico”, tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a cualquier agente radioterápico conocido por un experto en la técnica como eficaz para tratar o mejorar el cáncer, sin limitación. Por ejemplo, el agente radioterápico puede ser un agente tal como los administrados en braquiterapia o terapia con radionúclidos. Tales métodos pueden comprender opcionalmente además la administración de una o más terapias contra el cáncer adicionales, tales como, entre otras, quimioterapias y/u otra radioterapia.

La invención se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse de ninguna manera como limitativos del alcance de la presente invención.

Figuras:

Figura 1: Una alta densidad de Treg infiltrantes de tumores está asociada con un mal desenlace clínico de los pacientes con cáncer de pulmón. Se realizaron inmunotinciones en las 243 secciones de tumores de NSCLC incrustadas en parafina. Se realizaron recuentos automáticos en las imágenes tisulares teñidas y escaneadas. Los gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier se representaron gráficamente para determinar el porcentaje de OS de los pacientes con NSCLC. Se usó la prueba de rangos logarítmicos para determinar la significación estadística de los datos. A: El gráfico muestra la curva de supervivencia basada en la densidad de Treg FoxP3+. La alta densidad de Treg está relacionada con la mala supervivencia de los pacientes (P = 0,0049). B: para n=100 pacientes, se contaron Treg FoxP3+ en las áreas de TLS de los tumores por separado. Los pacientes con Treg en las áreas de TLS se estratificaron según el grupo alto y bajo y se determinó la supervivencia. La alta densidad de Treg en TLS está asociada con la mala supervivencia de los pacientes (P = 0,0245). C,E,G; se encontró que la densidad de DC maduras Dc-lamp+, células B CD20+ y células T CD8+ determinadas usando secciones en serie de los tejidos y la densidad estaba asociada con un buen desenlace clínico de los pacientes (P = 0,0002, P = 0,0020, y P = 0,0027, respectivamente). D, F, H; cuando la densidad de DC maduras CD-Lamp+, células B CD20+ y células T CD8+ se combinó con la densidad de Treg FoxP3+, los pacientes pudieron estratificarse en 4 grupos diferentes (P <0,0001, P <0,0001 y P = 0,0002, respectivamente).

Figura 2: Determinación de valores de corte óptimos para la discriminación de los grupos alto y bajo basándose en las densidades de las células T CD3+, Treg FoxP3+, la razón de células T CD3+ o células T CD8+ o DC maduras con respecto a las Treg, y finalmente la densidad de TLS-Treg. Los valores de corte óptimos son 898,793 Tconv CD3+FoxP3-(A), 21,997 Treg CD3+FoxP3+ (B), 17,94117 Tconv/Treg CD3+ (C), 12,41506 células T CD8+/Treg (D), 0,06297162 DC maduras DC-Lamp+/Treg (E) y 127.0348 TLS-Treg (F).

Figura 3: Curvas de Kaplan Meier para el total de células T CD3+ y la razón de células T CD3+, células T CD8+ y DC maduras con respecto a Treg, respectivamente. Se realizaron inmunotinciones en las 243 secciones de tumores de NSCLC incrustadas en parafina. Se realizaron recuentos automáticos en las imágenes tisulares teñidas y escaneadas. Los gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier se representaron gráficamente para determinar el porcentaje de OS de los pacientes. Se usó la prueba de rangos logarítmicos para determinar la significación estadística de los datos. A: El gráfico muestra la curva de supervivencia basada en la densidad de las células T CD3+ totales. La alta densidad de células T CD3+ está relacionada con la buena supervivencia de los pacientes (OS, CD3 Hi 92 meses frente a OS CD3 bajo 41 meses P = 0,0073). B: La alta razón de células T CD3+/Treg FoxP3+ es beneficiosa para los pacientes (OS = 92 meses) frente a la baja razón (OS = 40 meses, P = 0,0008) C; La alta razón de células DC maduras/Treg FoxP3+ proporciona un buen pronóstico para los pacientes frente a la baja razón (OS = 46 meses, P = 0,0003), D; La alta razón de células T CD8+/Treg FoxP3+ proporciona un buen pronóstico para los pacientes frente a la baja razón (SG = 41 meses, P = 0,0005).

Figura 4: La alta densidad de Treg infiltrantes de tumores está asociada con un mal desenlace clínico de los pacientes con cáncer de pulmón y, en combinación con DC DC-Lamp+ y células T CD8+, permite la identificación de pacientes con alto riesgo de muerte. Se realizaron inmunotinciones en las 338 secciones de tumores de NSCLC incrustadas en parafina. Los gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier se representaron gráficamente para determinar la OS de los pacientes con NSCLC. Se usó la prueba de rangos logarítmicos para determinar la significación estadística de los datos. (A) Se contaron las Treg FoxP3+ en las áreas tumorales (n = 338 pacientes). (B) Las Treg FoxP3+ también se contaron en las áreas de TLS de los tumores por separado (n = 100). Los pacientes se estratificaron en grupos alto y bajo según la densidad de Treg y se determinó la supervivencia. (C, E, G) Las densidades de células T CD3+, células T CD8+ y DC maduras DC-Lamp+ también se determinaron usando secciones en serie de tejidos. (D, F, H) Cuando las densidades de células T CD3+, células T CD8+ y DC maduras DC-Lamp+ se combinaron con la densidad de Treg FoxP3+, los pacientes pudieron estratificarse en 4 grupos diferentes (P<0,001 en los tres casos). La tabla debajo de cada gráfico de curva de Kaplan Meier muestra el número de pacientes en riesgo, el número de eventos y censurados según el grupo de densidad celular. Las tablas también muestran las tasas de OS a 24, 60 y 120 meses (%) según el grupo de pacientes respectivamente.

Figura 5: La alta densidad de Treg infiltrantes de tumores está asociada con un mal desenlace clínico de los pacientes con cáncer de pulmón y en combinación con células TLS-B o células T CD8+ Granzima-B+, permite la identificación de pacientes con alto riesgo de muerte. Se realizaron inmunotinciones en las 338 secciones de tumores de NSCLC incrustadas en parafina. Los gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier se representaron gráficamente para determinar la SG de los pacientes con NSCLC. Se usó la prueba de rangos logarítmicos para determinar la significación estadística de los datos. Las Treg FoxP3+CD3+ totales o bien se contaron en toda la sección tumoral (A, C; n = 338 tumores) o bien selectivamente en TLS (denominadas “TLS-Treg”, B, D; n = 100 tumores). Células B CD20+ infiltrante de tumores (células TLS-B) se contaron selectivamente en TLS y células T CD8+ Granzima-B+ infiltrantes de tumores en la sección tumoral completa usando secciones en serie de los tejidos. Los pacientes se estratificaron en grupos alto (Hi) y bajo (Lo) según la densidad de población inmunitaria y se determinó la supervivencia. La combinación de células ^tLS-B con Treg totales (A), células TLS-B con TLS-Treg (B), células T CD8+Granzima-B+ con Treg totales (C) y células T CD8+Granzima-B+ con TLS-Treg (D) da lugar a 4 grupos de pacientes con NSCLC. Entre paréntesis se menciona el número de pacientes por grupo. Ejemplo:

Material y métodos:

Pacientes:

Después de la resección quirúrgica completa, se obtuvieron muestras de tumores de pulmón primarios de pacientes con NSCLC en los hospitales Institut Mutualiste Montsouris, Hotel Dieu y Cochin (París, Francia). En este estudio, se incluyó una cohorte retrospectiva de 243 pacientes con NSCLC del hospital Hotel Dieu (París) operados entre los años 2001 y 2005. Se excluyeron de esta cohorte pacientes tratados con quimioterapia y radioterapia neoadyuvantes. Se considera como tiempo de observación para esta cohorte el tiempo entre la cirugía y el último seguimiento o la muerte. Los datos sobre los desenlaces a largo plazo se obtuvieron después de la consulta de los registros municipales o de la familia del paciente. Este protocolo fue aprobado por el comité de ética local (n° 2008-133 y n° 2012-0612) en aplicación del artículo L.1121-1 de la ley francesa. Para la cohorte prospectiva, se obtuvieron biopsias recientes de tumores de 55 pacientes con NSCLC. También se obtuvieron muestras de pulmón distante (NTDL) y de ganglios linfáticos (LN) no tumorales de los pacientes sometidos a cirugía. Las muestras se obtuvieron de los pacientes con consentimiento por escrito. Las principales características clínicas y patológicas de los pacientes para las cohortes retrospectiva y prospectiva se presentan en las tablas 2 y 3, respectivamente.

Tabla 2: Características clínicas y patológicas de la cohorte retrospectiva de pacientes con NSCLC. Todos los parámetros se evaluaron en 243 pacientes con NSCLC. La estadificación patológica del cáncer de pulmón se determinó según la nueva clasificación de estadificación TNM46. Los subtipos histológicos se determinaron según la clasificación de la OMS47. Abreviaturas: ADC, adenocarcinoma; ND, no determinado; SCC, carcinoma de células escamosas

Tabla 3: Características clínicas y patológicas de la cohorte prospectiva de pacientes con NSCLC. Todos los parámetros se evaluaron en 55 pacientes con NSCLC. La estadificación patológica del cáncer de pulmón se determinó según la nueva clasificación TNM46. Los subtipos histológicos se determinaron según la clasificación de la OMS47. Abreviaturas: ADC, adenocarcinoma; ND, no determinado; SCC: carcinoma de células escamosas.

Inmunohistoquímica:

Se usaron secciones en serie de tejido fijadas con formalina e incrustadas en parafina con un grosor de 5 |im para la doble tinción inmunohistoquímica para CD3, FoxP3, DC-Lamp, CD8, CD20, CD21 y pancitoqueratinas. En resumen, las secciones de tejido se desparafinaron, se rehidrataron y se trataron con el tampón de recuperación de antígenos TRS (Dako). Las secciones se incubaron en el bloque de proteínas (Dako) durante 30 minutos antes de la adición de los anticuerpos primarios y secundarios apropiados. La actividad enzimática se realizó usando kits de sustrato. Se adquirieron imágenes usando un instrumento Nanozoomer (Hamamatsu) con el software NDPview

Cuantificación celular:

Las células inmunitarias se cuantificaron en la sección tumoral completa usando el software Calopix (Tribvn) y se expresaron como un número de células/mm2 de las áreas de interés. El área de superficie de la región de interés también se determinó usando el mismo software. La región de TLS se determinó manualmente haciendo referencia a la tinción doble de DC-Lamp/CD3 (zona de células T de TLS) y CD20/CD21 (zona de células B de TLS). La densidad de células CD3+FoxP3+ en TLS se determinó con recuento automático. La cuantificación de las DC TLS-DC-Lamp+, células T CD3+, células T CD8+, células B TLS-CD20+ se determinó tal como se describió previamente7, (22).

Citometría de flujo:

En este estudio se incluyeron un total de 34 muestras de tumores recientes de NSCLC. Las muestras de tejido tumoral y no tumoral se desgarraron mecánicamente y se digirieron en una disolución no enzimática (disolución de recuperación celular, BD Biosciences). Las células mononucleares totales se obtuvieron después de un gradiente de ficoll. Las células mononucleares se tiñeron con múltiples paneles de los anticuerpos conjugados fluorescentemente y sus controles de isotipo coincidente. Además, las células se fijaron y permeabilizaron usando un kit de fijación/permanencia (ebioscience) para tinciones intracelulares. Se lavaron las células y se adquirieron los datos en el citómetro Fortessa (BD Biosciences). Los datos se analizaron usando los programas de software Flow Jo 9.7.6 (Tree Star Inc, Ashland, OR) y Spice 5.3.5 (desarrollado por Mario Roederer, Vaccine Research Center, NIAID, NIH).

Clasificación celular:

Se clasificaron cuatro poblaciones de células, concretamente, Treg CD62L+ y CD62L-, células T convencionales (Tconv) CD62L+ y CD62L-CD4+ a partir de muestras recientes de tejido tumoral y no tumoral (n = 20) usando el protocolo diseñado internamente. En resumen, se usaron las combinaciones del kit de células T CD4+ humanas intactas EasysepTM (n.° de referencia de Stem Cell Technologies) y clasificación celular por citometría de flujo para lograr la alta pureza de los subconjuntos de células. Las células se clasificaron directamente en viales que contenían RLT+ p-mercaptoetanol al 10% para obtener la mejor calidad y cantidad del ARNm.

Extracción de ARN y transcripción inversa:

Se extrajo el ARNm total de las células clasificadas con el micro kit RNeasy (Qiagen) según las instrucciones del fabricante, y se determinaron la cantidad y calidad del ARN usando el bioanalizador 2100 (Agilent Technologies). El ARNm se sometió a transcripción inversa a ADNc usando un kit Superscript VILO (Life Technologies). Las muestras por debajo de 1 ng de ARNm se amplificaron mediante 9 ciclos, y las muestras con más de 1 ng de ARNm se amplificaron mediante 7 ciclos de pCr utilizando cebadores Taqman PreAmp 2x y MTE (NanoString technologies, Seatle, EE. UU.).

Análisis de la expresión génica:

La expresión génica se realizó usando el sistema de análisis nCounter (Nanostring Technologies). Se aplicaron dos sondas específicas (de captura e indicadora) para cada gen de interés. Se usaron la sonda indicadora personalizada y el conjunto de códigos de sonda de captura de 125 genes seleccionados, incluidos 5 controles de genes de mantenimiento (p-actina, GAPDH, EEF1G, OAZ1 y RPL19) y controles de linaje celular (CD3, CD4, CD8, CD19, CD138 y EpCAM) para la hibridación según las instrucciones del fabricante (Nanostring Technologies, Seattle, EE. UU.). Se usó agua como control negativo para comprobar el ruido de fondo. Las muestras hibridadas se recuperaron usando la estación NanoString Prep y las moléculas de ARNm se contaron con el instrumento nCounter digital. El número de recuentos representó la expresión de genes. Los controles positivo y negativo, y una muestra de ARN de un paciente como control interno, se usaron para comprobar la coherencia técnica durante diferentes lotes de experimentos.

Análisis estadístico:

Se usó la prueba U de Mann-Whitney y la prueba de rangos de Wilcoxon (P <0,05*, P <0,01**, P <0,001***) para comparar la densidad de células en los diferentes tumores. Las curvas de supervivencia global (OS) se estimaron mediante el método de Kaplan-Meier y las diferencias entre grupos de pacientes se calcularon mediante la prueba de rangos logarítmicos. Los pacientes se estratificaron en dos grupos según las densidades alta y baja de células inmunitarias usando el enfoque de “valor P mínimo”, tal como se publicó anteriormente (7,22). Los valores de corte óptimos son 898,793 Tconv CD3+FoxP3-, 21,997 Treg CD3+FoxP3+, 127,0348 Treg TLS, 1,248 DC DC-Lamp+, 226,5 células T CD8+/mm2 y el 0,3256% de células B TLS-CD20+ de áreas tumorales (figura 2). Todos los análisis se realizaron con los software Prism 5 (GraphPad), Statview (Abacus system) y R (http://www.r-project.org/). Para el estudio de la expresión genética y las demostraciones de mapas de calor, se usaron los softwares 'nSolver' (Nanostring Technologies) y R. Los datos sin procesar se normalizaron con un recuento promedio de los 5 genes de mantenimiento usando el software “nSolver”. Se usaron la prueba T de Student y la prueba de ANOVA para comparar la expresión génica entre los grupos de datos, respectivamente. Para evitar la inclusión de resultados falsos positivos, se calcularon los valores P con el método de tasa de descubrimiento falso (FDR). Los datos se representaron en formato de mapa de calor, gráfico de volcán y matriz de correlación.

Resultados

Las Treg se infiltran en diferentes áreas de los tumores de pulmón que comprenden TLS y presentan un fenotipo de memoria activado.

Se evaluaron la presencia, localización y frecuencia de Treg infiltrantes de tumores en pacientes con NSCLC. Se detectó la presencia de células T CD3+FoxP3+ en diferentes áreas tumorales mediante inmunohistoquímica. Se observaron células T CD3+FoxP3+ poco comunes en los lechos tumorales, al igual que para otros subconjuntos de células T como las células T CD8+. De hecho, la mayoría de las células T entre las células T CD3+FoxP3+ y CD8+ se detectaron en el estroma del tumor. Una caracterización más profunda de la reacción del estroma permitió visualizar Treg en las áreas ricas en células T de TLS, tal como se demuestra por la presencia de agrupaciones de DC maduras DC-Lamp+ y células T CD3+.

A continuación, se descifró el fenotipo de las células T CD3+FoxP3+ infiltrantes de tumores, así como sitios distantes no tumorales, mediante citometría de flujo multicolor. Se observó que esta población expresaba exclusivamente CD4 (no CD8), alto nivel de CD25 y eran CD127-/Lo. Esta observación concordaba con el fenotipo de Treg CD4+ naturales humanas demostrado en la bibliografía (23,24). Incluso con una heterogeneidad de Treg CD3+FoxP3+ entre los pacientes con NSCLC, el porcentaje de Treg entre el total de células T CD4+ siempre fue mayor en el tumor (14,49+ 1,34%) en comparación con su porcentaje en NTDL (4,98+ 0,63%), LN (8,24+ 0,95%) y sangre periférica (6,26+1,48%), lo que sugiere un reclutamiento activo de este subconjunto de células T en el tumor. Dado que CD62L es un marcador específico de las células TLS-T (7,25), a continuación se estudió y comparó el estadio de diferenciación de Treg frente a Tconv CD4+ en áreas de TLS (CD62L+) frente a no TLS (CD62L-) del tumor. Una minoría de Treg se aloja en TLS inducidas por tumores (28,90+4,58 % de CD3+CD4+CD25++FoxP3+CD62L+/Treg totales tal como se observa para Tconv CD4+ (16,07+4,58 % de CD3+CD4+CD62L+/Tconv CD4+ totales (excluyendo Treg). Basándose en la expresión diferencial de CCR7, CD45ra, CD27 y CD28, las TLS-Treg eran principalmente de fenotipo de memoria central (CM) y memoria efectora tipo 1 (EM1); e incluso se detectaron Treg poco comunes, todos vírgenes en TLS, tal como se observó para Tconv CD4+. Sin embargo, se observaron diferencias sustanciales con respecto a la frecuencia de Treg en comparación con Tconv CD4+ con menos Treg vírgenes y CM, y más EM1 que Tconv CD4+ en TLS. Se detectaron los mismos estadios de diferenciación predominantes para Treg y Tconv CD4+ en áreas no TLS pero con una distribución diferente. De hecho, las Treg no de TLS eran principalmente de fenotipo EM1 y, en menor medida, CM y EM4, mientras que estos tres estadios se distribuían por igual entre T conv CD4+. Cabe destacar que no se detectaron Treg EM terminales (TEMRA) (CCR7-CD45ra+) en el tumor. Curiosamente, el análisis de la distribución de los cuatro estadios de células T en el tumor y en sitios distantes no tumorales (NTDL, LN y sangre) indicó que el fenotipo de Treg es el mismo en tumor y NTDL que es distinto de LN y sangre, la principal diferencia fue la frecuencia de las poblaciones CM y EM.

En conjunto, las Treg se infiltran en diferentes áreas tumorales junto con el TLS, sugiriendo los distintos estadios de diferenciación que, en consecuencia, pueden presentar funciones distintas.

Las Treg presentan un fenotipo activado y una firma génica distinta en comparación con las células T CD4+ convencionales en el tumor.

La presencia de diferentes estadios de diferenciación de Treg en distintas áreas tumorales condujo a investigar la naturaleza de su activación, la inmunosupresión y el estado de puntos de control inmunitario (ICP). Así, se investigó la expresión de marcadores de activación e inmunorregulación a nivel molecular (n=169) y proteico (n=14) en Treg, y se comparó su fenotipo con el de Tconv CD4+ en tumores. Junto con FoxP3, IL2Ra e IL2RP, las Treg infiltrantes de tumores sobreexpresaban significativamente algunos factores de transcripción (Helios e IRF4), quimiocinas (CCL22) y receptores (CXCR3, CCR4 y CCR8), citocinas (IL10, IL27 e IFNa) y receptores (TNFR2, IL1R1 e _iL1R2), receptores de activación (GITR, 4-1BB, ICOS y _oX40) y varias moléculas de ICP (CTLA-4 de membrana y soluble, LAG-3, Tim-3, TIG_iT, CD39, B7H3, GARP y PD_l2) en comparación con Tconv CD4+. De acuerdo con el nivel de expresión génica, el porcentaje de Treg positivas para GITR, ICOS, 4-1BB, OX40, CTLA-4, Tim-3 y TIGIT a nivel proteico era notablemente mayor que Tconv CD4+ mientras que no se midieron diferencias estadísticas. medido para LAG-3 entre los dos subconjuntos de células T.

Debido a que TLS se considera el sitio privilegiado para la activación de las células T, a continuación se comparó el perfil de expresión génica de Treg frente a Tconv CD4+, según la presencia de TLS. Los genes significativamente sobreexpresados en Treg fueron similares en TLS y no TLS. Sin embargo, pueden observarse pocas especificidades en T_lS (Tim-3, IL6, CCR5 y CXCR3) y no TLS (ICOS-L, PDL2, B7H3, GATA3 y FoxA1), lo que sugiere que las Treg en TLS y no TLS pueden compartir funciones regulatorias comunes.

En conclusión, las Treg presentan un patrón molecular específico que incluye activación y moléculas de ICP en comparación con Tconv CD4+ en el tumor.

La orientación funcional de Treg infiltrantes de tumores es notablemente diferente a la de sus homólogos sanguíneos, pero no de NTDL.

Debido a que la mayoría de las Treg eran de fenotipo de memoria con supuesta función efectora en los diferentes sitios pero predominantemente infiltraban tumores, se determinó si presentan el mismo patrón molecular cualquiera que sea su localización. Tal como se realizó anteriormente, se comparó el nivel de activación de la expresión génica y proteica, los marcadores inmunosupresores y de ICP en Treg infiltrantes de tumores, NTDL, LN y sangre de pacientes con NSCLC. Sorprendentemente, muy pocos genes (11 de 120 genes analizados) se expresaban diferencialmente por Treg en tumores frente a NTDL, lo que indica que presentan una firma de expresión genética similar en pulmón tumoral y no tumoral. La mayoría de estos genes están relacionados con la quimiotaxis e ICP (PD-1, BTLA, B7-H3, IL-27, BCL6, STAT4, CD44). Al comparar Treg en tumores frente a LN, se observaron más genes sobreexpresados (n = 21 con 17 en tumores y 4 en LN), y la mayoría de ellos ya se identificaron al comparar Treg frente a Tconv CD4+ en tumores. El número más importante de genes expresados diferencialmente en Treg fue entre tumores y sangre. Excepto uno, todos ellos estaban sobreexpresados en tumores e incluyen los genes previamente resaltados (tumores frente a LN). Los genes asociados a tumores en Treg tumorales están relacionados con factores de transcripción (FoxP3, FoxA1, STAT4), activación (ICOS, GITR, Ox-40, 4-1BB, TNFR2, CD26), ICP (mCTLA4, PD1, PDL1, B7-H3, BTLA, TIGIT, Tim3, LAG-3), quimiotaxis (CCL20, CCL22, CXCL5, CX3CL1, CXCR3, CD200, CX3CR1, LTpR), inmunosupresión (IL-10, CD39, GARP) y moléculas citotóxicas (granzima B, granulisina, FasL). A nivel de proteínas, se confirmó que las Treg en los diferentes sitios no expresaban el mismo conjunto de moléculas de activación y de ICP, mostrando la sangre la diferencia más importante con los tumores. El análisis de citometría de flujo permitió estudiar la posible expresión concomitante de los marcadores estudiados. Así, el análisis múltiple de la expresión de CD38, CD40L, CD69 y GITR muestra que el porcentaje de Treg negativas para todas estas moléculas disminuyó fuertemente desde el 80 % en la sangre hasta el 8 % en los tumores. El porcentaje de Treg que expresaban 1 o 2 marcadores fue bastante estable en todos los sitios (alrededor del 60 %), excepto en la sangre donde disminuyó hasta el 20%. Por tanto, la frecuencia de Treg positivas para 3 o 4 marcadores aumentó drásticamente desde el 0 % en la sangre hasta el 35 % en tumores. El análisis de células que expresan al menos 2 moléculas indica que, en la mayoría de los casos, las células positivas individuales son principalmente CD69 (excepto en la sangre con expresión preferente de CD38), las células doblemente positivas son CD69 y GITR, y las células triplemente positivas son CD69, GITR y CD38. Se produjo el mismo escenario para la expresión de 4.1BB, ICOS y OX40. La proporción de Treg triplemente negativas disminuyó significativamente desde el 65 % en la sangre hasta el 26 % en tumores, mientras que aumentó desde el 2 % hasta el 22 % para Treg triplemente positivas. En la mayoría de los casos, en primer lugar se expresó ICOS, seguido de OX40 y luego 4.1BB a partir de células individual a triplemente positivas. En cuanto a los marcadores de activación, el porcentaje de Treg que no expresaban ninguno de los ICP se redujo drásticamente desde el 56 % en la sangre hasta el 10 % en tumores. Los mismos resultados para Treg que expresan un solo marcador. En cambio, la frecuencia de células positivas para al menos 2 marcadores aumentó significativamente desde el 8 % en la sangre hasta el 70 % en tumores. TIGIT, luego Tim-3 o CTLA-4 se expresaron secuencialmente por Treg.

En conjunto, las Treg pulmonares presentan un patrón génico específico en comparación con sitios distantes, es decir, LN y sangre. Y el microentorno del cáncer de pulmón está infiltrado principalmente por Treg que expresan moléculas de activación y de ICP, mientras que las Treg sanguíneas muestran más bien un estado de reposo.

La alta densidad de Treg infiltrantes de tumores está asociada con la supervivencia a corto plazo, y la combinación con células T CD8+, DC maduras de TLS o células TLS-B permitió la identificación de pacientes con el peor desenlace clínico.

Las curvas de Kaplan Meier muestran que la alta densidad de Treg intratumorales se correlacionaba con el mal desenlace clínico de los pacientes con NSCLC (la mediana de OS no se alcanzó para “Treg bajas”, mientras que fue de 51 meses para pacientes con “Treg altas”, P = 0,0049, figura 1A). Dado que las altas densidades de D^cmaduras de TLS, células TLS-B y células T CD8+ efectoras estaban asociadas con la supervivencia a largo plazo de pacientes con NSCLC 4,7,22, figuras 1C,E,G), se sometió a prueba adicionalmente el impacto combinado de estas células inmunitarias con Treg sobre la supervivencia del paciente. Se observó que la baja densidad de Treg estaba asociada con un desenlace clínico favorable independientemente de la densidad de las DC maduras, células TLS-B o células T CD8+. En cambio, los pacientes con alta densidad de Treg y baja densidad de DC maduras (mediana de OS = 25 meses; P <0,0001, figuras 1D), células TLS-B (mediana de OS = 24 meses; P <0,0001, figura 1F) o células T CD8+ (mediana de OS = 40 meses; P = 0,0002, figura 1H) tuvieron el peor desenlace con la mediana de supervivencia más corta en comparación con cada variable sola. Los pacientes con “Treg altas/DC maduras, t LS-B o T CD8+ altas” tenían un riesgo intermedio de muerte, lo que sugiere que, por un lado, las DC maduras, TLS-B y células T CD8+ y, por otro lado, las Treg tienen un doble impacto sobre el desenlace de los pacientes con NSCLC. Dado que se ha mostrado que las Treg en las diferentes áreas del tumor tienen un impacto diferente sobre la supervivencia de los pacientes con cáncer de mama16, se contaron las Treg en las áreas de TLS y no TLS por separado en 100 pacientes con NSCLC. Se observó que las altas densidades de TLS-Treg y no TLS-Treg se correlacionaban con un mal desenlace clínico, similar a las Treg totales (mediana de OS = 57 frente a 34 meses para pacientes con “TLS-Treg bajas” y “TLS-Treg altas”, respectivamente; P = 0,0245, figura 1B). También se determinó la razón de densidades de células T CD3+ o células T CD8+ o DC maduras totales/Treg, y se encontró que la “razón alta” de todos estos marcadores era beneficiosa para los pacientes con NSCLC en comparación con la “razón baja” (figura 3).

En conclusión, el equilibrio entre Treg y otras células inmunitarias como DC maduras, células TLS-B y células T CD8+ es fundamental para el comportamiento de los pacientes con NSCLC. La combinación de Treg con uno de los otros subconjuntos inmunitarios permite una mejor estratificación de la supervivencia de los pacientes que cada subconjunto solo, con la identificación de un grupo de pacientes con NSCLC con un alto riesgo de muerte.

Los inventores han seguido trabajando con más pacientes, particularmente con una cohorte de 338 pacientes con NSCLC operados entre los años 2001 y 2005. Tal como se muestra en las figuras 4 y 5, los inventores han confirmado que la presencia de Treg y otras células inmunitarias como células T CD3+ junto con células T CD8+, células T CD8+ Granzima-B+, células TLS-B así como DC maduras de TLS es fundamental para la supervivencia de los pacientes con NSCLC. La combinación de Treg con otros subconjuntos inmunitarios permitió una mejor estratificación de la supervivencia de los pacientes con NSCLC que cada subconjunto solo, y permitió la identificación de un subgrupo de pacientes con un alto riesgo de muerte.

Discusión

Hay muchos estudios en la literatura que comentan la relevancia pronóstica de las Treg en diferentes cánceres sólidos, pero siempre ha sido discutible debido a diversos factores responsables de la discrepancia. Dependiendo del tipo, el estadio y el tipo histológico del tumor, se encontró que la importancia pronóstica de las Treg era diferente (15). Según su localización, las Treg pueden o bien suprimir o bien ayudar a las respuestas antitumorales. En centros germinales, se ha observado recientemente que las Treg pueden ayudar a la diferenciación de Tfh (26). Por tanto, fue interesante especular sobre los diferentes papeles y fenotipos de las Treg en diferentes áreas de los tumores. Con las técnicas avanzadas disponibles, volvió a abordarse el valor pronóstico de las Treg como población total, y también en función de su localización en las diferentes subáreas de los tumores de pulmón.

Se demostró por primera vez la presencia de células T CD3+FoxP3+ en las diferentes áreas de los tumores de NSCLC. Se observó que las células T CD3+FoxP3+ se encuentran principalmente en el estroma del tumor, y particularmente TLS en el estroma; hay pocas células T CD3+FoxP3+ en los nidos tumorales. Se confirmó que las células T CD3+FoxP3+ eran Treg según su fenotipo CD4+CD25hiCD127-/loFoxP3+ mediante citometría de flujo, tal como se menciona en la bibliografía (27,28).

Dado que se observó que las Treg se infiltran abundantemente en tumores de pulmón (tanto en áreas de TLS como no TLS) en comparación con tejidos no tumorales, se estudió por primera vez su fenotipo en detalle. Se observó que, en general, las Treg tienen el mismo estado de diferenciación en comparación con Tconv7 CD4+. Las Treg infiltrantes de tumores muestran predominantemente los fenotipos CM y _eM. Muy pocas Treg vírgenes se infiltran en tumores pero, curiosamente, todas se alojan en TLS. Las Treg de TLS son principalmente CM y EM1; mientras que las Treg no de TLS mostraron fases de diferenciación adicionales como EM1 y EM4. El estado de diferenciación de Treg no fue el mismo en el tumor en comparación con la sangre o los ganglios linfáticos. Aunque las Treg presentaron un fenotipo similar en pulmón y tumor distante, hubo menos células efectoras de memoria en la sangre y los ganglios linfáticos. Estos resultados llevaron a estudiar adicionalmente el estado de activación de las Treg.

La alta infiltración de las Treg en tumores de pulmón (en comparación con NTDL, LN y sangre) se refleja en la alta expresión de la quimiocina CCL22 y receptores como CCR8, CCR4 y CX3CL1 por Treg intratumorales. También se observó una mayor expresión de CXCR3 en Treg de TLS, lo que podría ser una posible forma de reclutamiento en el sitio inflamatorio (29). Las DC maduras pueden producir CCL2230, que puede reclutar Treg CCR4+. El papel de CCR4, CCL17 y CCL22 en la quimioatracción de Treg hacia los sitios inflamados se comenta suficientemente en estudios en ratones y seres humanos (16,31).

Dado que alrededor del 25 % de las Treg intratumorales totales se infiltran en TLS, puede especularse que TLS-Treg pueden suprimir células T específicas de TAA en TLS, así como en áreas de no TLS de los tumores. Cuando se comparó la expresión genética de Treg en áreas de TLS y no TLS de los tumores, se encontró un perfil similar al de Treg totales. Las Treg de TLS expresaron selectivamente moléculas como Tim3, IL6, CCR5 y CXCR3 en comparación con las Treg no TLS que sobreexpresaron más factores de transcripción GATA3, PDL2, B7H3 e ICOSL. Sorprendentemente, se observó una sobreexpresión de IL-2 Ra e IL-2RP, moléculas coestimuladoras (ICOS, OX40, 4-1BB y GITR) e ICP (CTLA4, TIG_iT, PD1 y PDL2) en Treg en comparación con Tconv CD4+. Esto se confirmó a nivel de proteínas. En los últimos años, se ha demostrado el papel de ICOS en la producción de IL-10 por parte de Treg (32). La expresión de ICOSL y OX-40 por CD plasmocitoides es responsable del reclutamiento de Treg en melanoma y cáncer de mama (33,34). Se descubrió que el tratamiento con IL-2 en melanoma estaba expandiendo la población de Treg ICOS+ (35). Aunque el papel de GITR en Treg ha sido controvertido, se ha descubierto que las Treg expresan constitutivamente GITR. Todas las Ti-Treg expresaron HLA-DR (datos no mostrados), lo que sugiere el mecanismo de supresión dependiente de contacto usado por las T reg. Los receptores de la superfamilia de TNF como TNFR2, 4-1BB y Ox-40 pueden ayudar en su capacidad supresora. Se ha descubierto que la coexpresión de GITR, OX-40 y TNFR2 junto con la señalización de TCR favorece la diferenciación tímica de Treg (36).

Lo más importante es que una proporción de Treg expresa ICP. Se descubrió que las Treg en tumores expresan niveles altos de CTL_a4, TIGIT, Tim-3, B7-H3, PD1 y sus ligandos PDL1 y PDL2. Se discute ampliamente la expresión de CTLA4 en Treg y su interacción con las moléculas CD80 y CD86 en APC (37). CTLA4 podría desencadenar la inducción de la enzima IDO en DC al interaccionar con sus CD80 y CD8638. Se ha descubierto que los bloqueos de CTLA4 y PD1 son eficaces en el melanoma (39) y también están mostrando resultados prometedores en NSCLC, probablemente debido a su acción sobre las Treg que expresan un nivel más alto en comparación con las Tconv CD4+. En el presente estudio, se encontró que la expresión de CTLA4 y TIGIT siempre estaba correlacionada en las Ti-Treg. El ligamiento de TIGIT en Treg puede inhibir respuestas proinflamatorias mediante Th1 y Th17 (40). También se observa ahora que las Treg de memoria Helios+ que expresan TIGIT y FCRL3 son Treg altamente supresoras (41,42). Se observó que las Treg en tumores de pulmón son positivas para Helios y también expresan otros factores de transcripción como FoxA1 y GATA3. La expresión de IRF4 por parte de Treg puede sugerir su papel en el mantenimiento de la proliferación y activación de Treg, tal como se observa en células T CD8+ (43).

Se observó una sobreexpresión de CD40L por Tconv CD4+ frente a Treg, especialmente por Tconv TLS CD4+, lo que puede ser una posible consecuencia de la activación de las células T después de la interacción con DC maduras en TLS, contrarrestando la inmunosupresión por Treg. Sorprendentemente, se descubrió una sobreexpresión de PDL2 por parte de Ti-Treg, especialmente Treg de TLS, en comparación con las Treg de ganglios linfáticos, pero no de manera diferente de los NTDL y la sangre. Se ha descubierto que, en el centro germinal, el ligamiento de PD1-PDL1 inhibe las Treg foliculares CXCR5+ y la producción de anticuerpos in vivo44, pero la regulación por medio de PDL2 está poco estudiada.

Treg intratumorales expresan IL-6, IL-10 y TGF-p, lo que puede conducir a la supresión de la función de células T y a la diferenciación y activación de DC. Se observó que las Treg expresan altamente IL-27, que se especuló que era un regulador negativo de la diferenciación de Th17 en el microentorno tumoral. En otro estudio en pacientes con NSCLC, se observa que IL-27 se correlacionaba negativamente con las células Th17 y la expresión de RORyt (45).

Se observó que una alta densidad de Treg se correlacionaba con una supervivencia global más corta en pacientes con NSCLC. La bibliografía muestra que, en pocos casos, las Treg están asociadas con un desenlace clínico bueno, malo o nulo. En pacientes con cáncer de mama, la presencia de Treg en los agregados linfoides está asociada con la mala supervivencia, mientras que su presencia en los tumores no está asociada con la supervivencia de los pacientes (16), pero faltan evidencias que demuestren que estos agregados linfoides son la TLS funcional. Se mostró que la presencia de un alto número de Treg en TLS y en el tumor completo tiene un impacto negativo sobre la supervivencia de los pacientes, lo que podría deberse a la infiltración exclusiva de Treg en diferentes áreas de los tumores principalmente la región de ^tL^sy el estroma, la diferenciación y activación de Treg en la TLS y su función inmunosupresora frente a Tconv y APC. Se proporciona la evidencia de que las Treg se activan en los tumores en comparación con NTDL, LN y la sangre.

Ya se ha demostrado la presencia y el papel favorable de TLS en la generación de respuesta antiinmunitaria en pacientes con cáncer de pulmón (4,7,22). Se ha descubierto que las HEV están implicadas en el reclutamiento de células T, y se ha descubierto que las DC maduras están implicadas en la activación de células T en TLS. Se ha descubierto que las TLS participan en la orquestación de la firma génica Th1 y orientada citotóxica. Se observó que las Treg expresan T-bet probablemente para cooptar la expresión de factores de transcripción de las células Th1 y pueden suprimir las respuestas Th1.

Cuando la densidad de Treg se combinó con DC maduras DC-Lamp+, células TLS-B CD20+ y células T CD8+, pudo determinarse la estratificación del grupo con la mayor supervivencia. Se encontró que la razón de células T CD3+ o DC maduras o células T CD8+ con respecto a Treg es un factor de pronóstico más fuerte que cada variable sola, y demostró que una alta proporción de células T o DC maduras en comparación con Treg imprime la mejor supervivencia para pacientes con cáncer de pulmón.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para predecir el tiempo de supervivencia de un sujeto que padece cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) que comprende las etapas de:

2. Método según la reivindicación 1, en el que la densidad de células T CD3+FoxP3+ reguladoras (Treg) y la densidad de DC maduras de TLS se cuantifican en las etapas i) y ii) respectivamente.

3. Método según la reivindicación 1, en el que la densidad de células T CD3+FoxP3+ reguladoras (Treg) y la densidad de células TLS-B se cuantifican en las etapas i) y ii) respectivamente.

4. Método según la reivindicación 1, en el que la densidad de células T CD3+FoxP3+ reguladoras (Treg) y la densidad de células Tconv CD3+ FoxP3- se cuantifican en las etapas i) y ii) respectivamente.

5. Método según la reivindicación 1, en el que la densidad de células T CD3+FoxP3+ reguladoras (Treg) y la densidad de células T CD8+ se cuantifican en las etapas i) y ii) respectivamente.

6. Método según la reivindicación 1, en el que la densidad de células T CD3+FoxP3+ reguladoras (Treg) y la densidad de células T CD8+ Granzima-B+ se cuantifican en las etapas i) y ii) respectivamente.

7. Método según la reivindicación 1, en el que la cuantificación de las densidades se determina mediante IHC.