CN113710274A - 用于预测癌症免疫疗法中的长期存活的方法及组合物 - Google Patents

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Abstract

提供用于预测癌症免疫疗法中的长期存活/治疗干预的必要性的外周血生物标志物。本发明提供一种方法，其将从受试者获得的样品中的细胞亚群的组成用作受试者在癌症免疫疗法中的长期存活预测的指标。通过将与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的量、或与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群的量与基准进行比较，能够预测受试者在癌症免疫疗法中的长期存活/治疗干预的必要性。

Description

用于预测癌症免疫疗法中的长期存活的方法及组合物
技术领域
本发明涉及癌症治疗领域。具体而言，涉及癌症免疫疗法中的长期存活的预测。
背景技术
以PD-1/PD-L1抑制为作用机制的免疫检查点抑制剂的有效性在黑色素瘤、肺癌、头颈癌、泌尿系肿瘤、胃癌等很多癌症中得以证实，在日本也适用于保险。临床试验表明，无论癌症种类，10～20％的人都可以存活很长时间。在肺癌的研讨中，据报道即使在2年内完成治疗后，这种长期存活率也能存活5年以上且没有恶化。作为与短期响应相关的生物标志物，研讨了肿瘤PD-L1或肿瘤基因突变量等几种，但至今完全未研讨过预测长期存活组的生物标志物。
作为预测PD-1/PD-L1抑制剂的短期响应的生物标志物，在肺癌中使用肿瘤PD-L1表达比例。然而，在肺癌之外，与响应的相关性尚不明确，并且，肺癌的ROC分析中AUC仅为0.6～0.7左右。据报道，在基础研讨中，即使使用通过基因组编辑敲除了PD-L1的肿瘤，也可获得PD-1/PD-L1抑制剂的抗肿瘤效果。通过敲除宿主的PD-L1，抗肿瘤效果消失，因此认为抗原呈递细胞上的PD-L1表达很重要。肿瘤基因突变量也是预测短期响应的有前景的生物标志物，但ROC分析中的AUC仍然停止在0.6～0.7左右。
对于癌症免疫疗法中的单一治疗，响应率不一定很高。例如，虽然抗PD-1抗体看似在临床上取得了极大成功，但基于无恶化生存期(PFS)的数据，在几乎所有抗PD-1抗体临床试验中均可确认在3个月内加重病情的“无效组”为约40％。联合治疗是提高单一疗法中的低响应率的手段。虽然正在进行PD-1抑制剂与细胞毒性抗癌剂或其他免疫检查点抑制剂的联合疗法的开发，但联合疗法存在毒性高的问题。
发明内容
用于解决技术问题的方案
本发明人已经发现，对癌症免疫疗法(例如，抗PD-1治疗或抗PD-L1治疗)的治疗效果为进展(PD)、稳定(SD)、响应(完全响应(CR)+部分响应(PR))的三组分别表现出不同的免疫状态。并且，本发明人已经提供了一种方法，用于预测当对受试者进行癌症免疫疗法时其对癌症免疫疗法的应答为进展(PD)、稳定(SD)或响应(完全响应(CR)+部分响应(PR))中的哪一种(需要说明的是，即使受试者组除了部分响应组(PR)之外还包含完全响应组(CR)的情况，或者不包含部分响应组(PR)而包含完全响应组(CR)的情况，都可以检测为与部分响应组(PR)相同)。
本发明提供一种方法，其将从受试者获得的样品中的细胞亚群的组成用作预测受试者在癌症免疫疗法中长期存活的指标。通过将本说明书中描述的特定的细胞亚群的量与基准比较，可以预测受试者中产生的癌症免疫疗法中的长期存活的有无和/或程度。
在本发明中，可作为指标的细胞亚群没有限制，但可列举与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群、与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群、或与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群。与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群例如为包含在CD62LlowCD4+T细胞群中的细胞亚群(例如，CD62LlowCD4+T细胞亚群本身、或ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群等)。与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群例如为HLA-DR+CD141+CD11c+细胞亚群等。与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群例如为CD137+CD62LlowCD8+T细胞亚群等。
在本发明的另一实施方式中，显示出在受试者中产生的癌症免疫疗法中的长期存活预测，由此能够示出对该受试者是否应该施用治疗干预或者应该在何时施用治疗干预的指标。当未预测出癌症免疫疗法中的长期存活时，虽然认为对癌症施用的治疗干预是有利的，然而至今为止还没有用于预测癌症免疫疗法中的长期存活的生物标志物。
对于治疗干预，代表性地可以为与1种或多种另外药剂的组合给药。或者，治疗干预可以为与放射治疗的组合。1种或多种另外药剂可以为任意的化疗药物、或可以包含第二免疫检查点抑制剂。或者，作为在治疗干预中所使用的其他癌症治疗，包括其他癌症免疫疗法(例如，过继细胞转移)、温热疗法、外科程序等。优选地，治疗干预为与癌症治疗的组合，所述癌症治疗包含抗癌剂的给药，例如放射治疗或者化学治疗药物。
本发明的实施方式的示例示于以下项目中。
(项目1)
一种方法，其将从受试者获得的样品中的细胞亚群的组成用作预测所述受试者在癌症免疫疗法中长期存活的指标，
所述方法包括分析从所述受试者获得的所述样品中的细胞亚群的组成的工序，
通过所述样品中的与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的量与基准之间的比较，预测所述受试者在癌症免疫疗法中的长期存活。
(项目2)
一种方法，其将从受试者获得的样品中的细胞亚群的组成用作预测所述受试者在癌症免疫疗法中长期存活的指标，
所述方法包括分析从所述受试者获得的所述样品中的细胞亚群的组成的工序，
通过所述样品中的与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群的量与基准之间的比较，预测所述受试者在癌症免疫疗法中的长期存活。
(项目3)
一种方法，其将从受试者获得的样品中的细胞亚群的组成用作预测所述受试者在癌症免疫疗法中长期存活的指标，
所述方法包括分析从所述受试者获得的所述样品中的细胞亚群的组成的工序，
通过所述样品中的与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群的量与基准之间的比较，预测所述受试者在癌症免疫疗法中的长期存活。
(项目4)
根据项目1至3中任一项所述的方法，其中，通过选自由所述样品中的与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的量、与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群的量以及与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群的量组成的组中的至少两个量与基准之间的比较，预测所述受试者在癌症免疫疗法中的长期存活。
(项目5)
根据项目1或4所述的方法，其中，所述与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群为包含在CD62LlowCD4+T细胞群中的细胞亚群。
(项目6)
根据项目5所述的方法，其中，所述与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群为CD62LlowCD4+T细胞亚群。
(项目7)
根据项目5所述的方法，其中，所述与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群为ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群。
(项目8)
根据项目2或4所述的方法，其中，所述与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群为HLA-DR+CD141+CD11c+细胞亚群。
(项目9)
根据项目3或4所述的方法，其中，与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群为包含在CD62LlowCD8+T细胞群中的细胞亚群。
(项目10)
根据项目9所述的方法，其中，所述与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群为CD137+CD62LlowCD8+T细胞亚群。
(项目11)
一种方法，其将相对于量(X，Y)的相对值用作预测所述受试者在癌症免疫疗法中长期存活的指标，所述量(X，Y)选自由以下量组成的组：
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的量；
与抗肿瘤免疫应答中的由CD4+T细胞引起的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群的量；
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群的量；
调节性T细胞或与调节性T细胞相关的CD4+T细胞亚群的量；以及
ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量，
所述方法包括：
测量所述X的工序；
测量所述Y的工序，
将X相对于Y而得到的相对值与基准之间的比较用作预测所述受试者在癌症免疫疗法中长期存活的指标。
(项目12)
根据项目11所述的方法，其中，所述量(X)及(Y)分别选自由以下量组成的组：
CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
CCR7-CD4+T细胞亚群的量；
LAG-3+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
PD-1+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
Foxp3+CD25+CD4+T细胞亚群的量；
HLA-DR+树突状细胞亚群的量；
CD80+树突状细胞亚群的量；
CD86+树突状细胞亚群的量；
PD-L1+树突状细胞亚群的量；
CD62LlowCD8+T细胞亚群的量；
CD137+CD8+T细胞亚群的量；以及
CD28+CD62LlowCD8+T细胞亚群的量。
(项目13)
根据项目11所述的方法，其中，所述量(X)为CD62LlowCD4+T细胞亚群的量，以及(Y)为Foxp3+CD25+CD4+T细胞亚群的量。
(项目14)
根据项目11至13中任一项所述的方法，其中，所述相对值为X/Y。
(项目15)
根据项目11至13中任一项所述的方法，其中，所述相对值为X2/Y。
(项目16)
根据项目1至15中任一项所述的方法，其中，所述样品为外周血样品。
(项目17)
根据项目1至16中任一项所述的方法，其中，所述基准为所述癌症免疫疗法前的所述受试者的样品中的所述细胞亚群的量或预定值。
(项目18)
根据项目1至17中任一项所述的方法，其中，所述样品中的所述细胞亚群的量高于所述基准表示在所述受试者中预测到在癌症免疫疗法中长期存活。
(项目19)
根据项目1至17中任一项所述的方法，其中，所述样品中的所述细胞亚群的量低于所述基准表示在所述受试者中未预测出在癌症免疫疗法中长期存活。
(项目20)
根据项目1至19中任一项所述的方法，其中，当在所述受试者中未预测出在癌症免疫疗法中长期存活时，进一步表示应向所述受试者施用联合疗法。
(项目21)
一种方法，其是项目1至20中任一项所述的方法，还进一步被定义为将在多个时间点从受试者获得的样品中的细胞亚群的组成用作预测所述受试者在癌症免疫疗法中的长期存活的指标，所述方法包括分析在多个时间点从所述受试者获得的样品中的细胞亚群的组成的工序。
(项目22)
根据项目15所述的方法，其中，该X2/Y为约324以上时预测到长期存活。
(项目23)
一种药物组合物，其特征在于，
包含用于处置受试者的癌症的免疫检查点抑制剂，
所述药物组合物施用于受试者，所述受试者通过项目1至18或21至22中任一项所述的方法预测到在癌症免疫疗法中长期存活。
(项目24)
根据项目23所述的药物组合物，其中，所述免疫检查点抑制剂为PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。
(项目25)
一种组合药物，其特征在于，
包含用于处置受试者的癌症的免疫检查点抑制剂，
所述组合药物施用于受试者，所述受试者通过项目1至22中任一项所述的方法未预测出在癌症免疫疗法中的长期存活。
(项目26)
根据项目25所述的组合药物，其中，所述免疫检查点抑制剂为PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。
(项目27)
根据项目25所述的组合药物，其中，包含选自由化学治疗药物和另外的癌症免疫疗法组成的组中的药物。
(项目28)
一种试剂盒，其用于判定在受试者中是否预测到癌症免疫疗法中的长期存活，所述试剂盒包含针对标志物组合的检测剂，所述标志物组合选自由下述组合构成的组：
CD4和CD62L的组合；
CD4和CCR7的组合；
CD4、CD62L及LAG-3的组合；
CD4、CD62L及ICOS的组合；
CD4、CD62L及CD25的组合；
CD4、CD127及CD25的组合；
CD4、CD45RA及Foxp3的组合；
CD4、CD25及Foxp3的组合；
CD11c、CD141及HLA-DR的组合；
CD11c、CD141及CD80的组合；
CD11c、CD123及HLA-DR的组合；
CD11c、CD123及CD80的组合；
CD8和CD62L的组合；
CD8和CD137的组合；以及
CD28、CD62L及CD8的组合。
(项目29)
一种试剂盒，其用于判定受试者在癌症免疫疗法中是否需要治疗干预，所述试剂盒包含针对标志物组合的检测剂，所述标志物组合选自由以下组合构成的组：
CD4和CD62L的组合；
CD4和CCR7的组合；
CD4、CD62L及LAG-3的组合；
CD4、CD62L及ICOS的组合；
CD4、CD62L及CD25的组合；
CD4、CD127及CD25的组合；
CD4、CD45RA及Foxp3的组合；
CD4、CD25及Foxp3的组合；
CD11c、CD141及HLA-DR的组合；
CD11c、CD141及CD80的组合；
CD11c、CD123及HLA-DR的组合；
CD11c、CD123及CD80的组合；
CD8和CD62L的组合；
CD8和CD137的组合；以及
CD28、CD62L及CD8的组合。
(项目30)
一种方法，其将从受试者获得的样品中的细胞亚群的组成用作所述受试者的癌症免疫疗法中需要治疗干预的指标，
所述方法包括分析从所述受试者获得的所述样品中的细胞亚群的组成的工序，
通过所述样品中的与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的量与基准之间的比较，提供所述受试者的癌症免疫疗法中需要治疗干预的指标。
(项目31)
根据项目30所述的方法，其中，所述与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群为包含在CD62LlowCD4+T细胞群中的细胞亚群。
(项目32)
根据项目30所述的方法，其中，所述与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群为CD62LlowCD4+T细胞亚群。
(项目33)
一种方法，其将相对于量(X，Y)的相对值用作所述受试者的癌症免疫疗法中需要治疗干预的指标，所述量(X，Y)选自由以下量组成的组：
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的量；
与抗肿瘤免疫应答中的由CD4+T细胞引起的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群的量；
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群的量；
调节性T细胞或与调节性T细胞相关的CD4+T细胞亚群的量，以及
ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量，
所述方法包括：
测量所述X的工序；以及
测量所述Y的工序，
将X相对于Y而得到的相对值与基准之间的比较用作所述受试者的癌症免疫疗法中需要治疗干预的指标。
(项目34)
根据项目33所述的方法，其中，所述量(X)及(Y)分别选自由以下量组成的组：
CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
CCR7-CD4+T细胞亚群的量；
LAG-3+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
PD-1+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
Foxp3+CD25+CD4+T细胞亚群的量；
HLA-DR+树突状细胞亚群的量；
CD80+树突状细胞亚群的量；
CD86+树突状细胞亚群的量；
PD-L1+树突状细胞亚群的量；
CD62LlowCD8+T细胞亚群的量；
CD137+CD8+T细胞亚群的量；以及
CD28+CD62LlowCD8+T细胞亚群的量。
(项目35)
根据项目33所述的方法，其中，所述量(X)为CD62LlowCD4+T细胞亚群的量，以及(Y)为Foxp3+CD25+CD4+T细胞亚群的量。
(项目36)
根据项目33至35中任一项所述的方法，其中，所述相对值为X/Y。
(项目37)
根据项目33至35中任一项所述的方法，其中，所述相对值为X2/Y。
(项目38)
根据项目30至37中任一项所述的方法，其中，所述治疗干预为放射治疗。
(项目39)
根据项目30至37中任一项所述的方法，其中，所述治疗干预为化学治疗药物的治疗。
(项目40)
根据项目37所述的方法，其中，所述X2/Y小于约324是需要治疗干预的指标。
(项目41)
根据项目37所述的方法，其中，所述X2/Y为约174以上且小于约324是需要治疗干预的指标，所述治疗干预包括除了正在给药的癌症免疫疗法之外还进行化学疗法、放射疗法、外科程序或温热疗法，或者进行另外的癌症免疫疗法。
(项目42)
根据项目37所述的方法，其中，所述X2/Y小于约174是需要治疗干预的指标，所述治疗干预包括：中止正在给药的癌症免疫疗法；或者除了正在给药的癌症免疫疗法之外还进行化学疗法、放射疗法、外科程序或温热疗法、或者进行另外的癌症免疫疗法。
(项目43)
一种组合药物，其特征在于，包含用于处置受试者的癌症的免疫检查点抑制剂，所述组合药物施用于受试者，所述受试者通过项目30至42中任一项所述的方法判断为在癌症免疫疗法中需要治疗干预。
(项目44)
根据项目43所述的组合药物，其中，所述免疫检查点抑制剂为PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。
(项目45)
根据项目43所述的组合药物，其中，包含选自由化学治疗药物和另外的癌症免疫疗法组成的组中的药物。
(项目46)
一种方法，其将从作为治疗前的癌症患者的受试者获得的样品中的细胞亚群的组成用作决定对所述受试者的治疗策略的指标，
所述方法包括：
测量从所述受试者获得的所述样品中的CD62LlowCD4+T细胞亚群的量(X)和Foxp3+CD25+CD4+T细胞亚群的量(Y)的工序；以及
求得相对值X2/Y的工序，
所述方法还包括选自由(a)、(b)及(c)组成的组中的工序：
(a)为针对相对值X2/Y设定阈值α，该X2/Y小于阈值α时判断受试者为对癌症免疫疗法的无应答者的工序；
(b)为针对相对值X2/Y设定阈值α和β，其中α＜β，并且，该X2/Y为阈值α以上且小于阈值β时判断受试者为对癌症免疫疗法的短期应答者的工序；以及
(c)为针对相对值X2/Y设定阈值β，该X2/Y为阈值β以上时判断受试者为对癌症免疫疗法的长期应答者的工序。
(项目47)
根据项目46所述的方法，其中，所述阈值β为比所述阈值α至少大50的值。
(项目48)
根据项目47所述的方法，其中，
所述阈值α为100～400范围内的值，
所述阈值β为150～450范围内的值。
(项目49)
一种产品，其中，包含随附文件和免疫检查点抑制剂，所述随附文件记载了项目46至48中任一项所述的方法。
发明效果
通过本发明，可预测癌症免疫疗法中的长期存活。由此，可判断癌症免疫疗法中是否应进行治疗干预，或者应在何时进行治疗干预。
附图说明
图1A为Brahmer等人(2017AARC)展示的图。具体而言，是表示总生存期(OS，％)的图表。
图1B为Brahmer等人(2017AARC)展示的图。具体而言，是表示各患者(n＝16)的治疗的图表。
图2为Brahmer等人(N Eng J Med 2015:373:123-135)修改的图表。
图3的左图为示出早期疾病恶化的无效组(non-responder组)和其以外的响应组(responder组)中的CD62LlowCD4+T细胞比例的图。
图4为示出与CD62LlowCD4+T细胞比例相关的ROC分析及PFS绘图的图。
图5为测量纳武单抗治疗之前(pre-Nivo)和治疗之后(post-Nivo)的各种标志物变化的结果。
图6为示出响应组(Responder，图6的左图)和无效组(Non-responder，图6的右图)中纳武单抗治疗前(pre-Nivo)和治疗4周后(4W treated)的CD62LlowCD4+T细胞比例的图表。
图7的左图为对治疗开始时治疗抗性的患者组(Primary resistance，图表中的右部分)、治疗开始后平均63.3周(28～92周)且治疗开始后获得治疗抗性的患者组(Acquiredresistance，图表中的中间部分)、以及治疗开始后平均64.5周(12～92周)且治疗开始后仍然对治疗产生应答的患者组(On-going response，图表中的左侧)分别示出CD62LlowCD4+T细胞比例的图表。图7的右图为对于治疗开始时治疗抗性的患者组(Primary resistance，图表中的右部分)、治疗开始后平均63.3周(28～92周)且治疗开始后获得治疗抗性的患者组(Acquired resistance，图表中的中间部分)、以及治疗开始后平均64.5周(12～92周)且治疗开始后仍然对治疗产生应答的患者组(On-going response，图表中的左侧部分)分别示出X2/Y的图表，其中，将CD62LlowCD4+T细胞比例设定为“X”，并将CD25+FOXP3+CD4+T细胞比例设定为“Y”。
图8为对于长期无恶化存活组(LR)、短期响应组(SR)、以及无效组(NR)示出CD62LlowCD4+T细胞比例的图表(图8的左图)，以及当将CD62LlowCD4+T细胞比例设为“X”且将CD25+FOXP3+CD4+T细胞比例设定为“Y”时的X2/Y的图表(图8的右图)。
图9为描述与本发明相关的机制的示意图。
图10示出T细胞亚群与对纳武单抗疗法产生应答的NSCLC患者之间的相关性。a：CONSORT图。从171名NSCLC患者获得了知情同意。28名患者在纳武单抗治疗之前未采集外周血样本。在17名患者中未通过第9周的图像进行的评估。b-d：在纳武单抗治疗后直至9周之前达到PR或SD的应答者以及显现出疾病进展的非应答者中的、外周血单核细胞(PBMC)的亚群的差异。使用FITC-conjugated anti-CD4、PE-conjugated anti-CD62L、及PE-Cy5-conjugated anti-CD8 mAb、或FITC-conjugated anti-CD4、PE-conjugated anti-FOXP3及PE-Cy5 conjugated anti-CD25 mAb，对PBMC进行了染色。图b和c：：分别为总CD4+细胞群中和总CD8+细胞群中的CD62Llow细胞的比例；图d：总CD4+细胞群中CD25+FOXP3+细胞的比例。e：针对发现队列的患者的预测式的值。预测式(X2/Y)以总CD4+细胞群中CD62Llow细胞的比例(X)及CD25+FOXP3+细胞的比例(Y)为基础。f：预测发现队列(n＝40)中的非应答者的式子的接收者操作特性曲线。在式子的阈值(192)下，敏感度和特异性分别为85.7％和100％(P＜0.0001)。g：基于预测式的阈值(192)诊断非应答者或应答者的、发现队列的患者的无恶化生存期(PFS)曲线。h：发现队列的总生存期(OS)曲线。i：验证队列患者的预测式的值。j：验证队列的患者的PFS曲线。k：验证队列的患者的OS曲线。在图b-e及i中，以平均值±平均值的标准误差表示数据，符号表示各个患者的值。针对差异的统计学上的显著性，使用Student’s两侧t检验(b-e，i)或数秩检验(g，h，j，k)进行评估。
图11为示出CD62LlowCD4+T细胞与其他T细胞亚群之间的相关性的图。a、b：PBMC中的门控的CD8+CD3+细胞及CD4+CD3+细胞中CCR7和CD45RA表达。c、d：总CD4+细胞群中的CD62LlowCD4+细胞的比例与CCR7-CD45RA-细胞的比例之间的线性相关(c)；以及CD62LlowCD4+细胞的比例与CCR7+CD45RA-细胞的比例或CCR7+CD45RA+细胞的比例之间的线性相关(d)。e-h：总CD4+细胞群中的CD62LlowCD4+细胞的比例与CXCR3+CCR4-CCR6-细胞、CXCR3-CCR4+CCR6-细胞、CXCR3-CCR4-CCR6+细胞或CXCR5+细胞的比例之间的线性相关。i、j：分别为CD62LlowCD4+细胞的比例与CD8+CD3+细胞及(效应)CCR7-CD45RA+CD8+细胞的比例之间的线性相关。
图12为示出CD4+T细胞的质谱流式细胞术及基因表达的分析的图。a：基于29种分子(CD3、CD4、CD8、CD19、CD27、CD28、CD45RA、CD62L、CD69、CD80、CD90、CD103、CD134、CD137、CD152、CD154、CD183、CD194、CD196、CD197、CD223、CD273、CD274、CD278、CD279、T-bet、BCL-6、FOXP3、TIM-3)的表达通过无监督聚类进行的、对门控CD4+CD3+细胞的viSNE分析的代表例。b：示出对于门控的CD45RA+CCR7+、CD45RA-CCR7-、CD62Lhigh及CD62LlowCD4+CD3+T细胞的、CD62L、CCR7、CD45RA、CD27、T-bet、FOXP3、CXCR3、CCR4、CCR6及PD-1的表达(n＝10)。c：门控的CD45RA-CCR7-与CD62LlowCD4+CD3+T细胞之间的CD27、T-bet及CXCR3表达的比较(n＝10)。
图13为示出CD62LlowCD4+T细胞亚群与PD-1、LAG3及CTLA-4表达之间的相关；以及树突状细胞的状态的图。a-d：CD62LlowCD4+细胞的比例与PD-1+CD62LlowCD4+细胞、PD-1+CCR7-CD45RA-CD8+细胞、LAG-3+CD62LlowCD4+细胞、或CTLA-4+CD62LlowCD4+细胞的比例之间的线性相关。
图14示出对应于对纳武单抗治疗的良好应答的基因表达。在来自部分响应(PR)、稳定(SD)及进展(PD)的患者的CD62LhighCD4+T细胞与CD62LlowCD4+T细胞之间，比较基因表达数据以获得特征。然后，将在源自PR和SD、PR和PD、SD和PD、PR+SD和PD、以及PR和SD+PD的细胞之间比较的作为特征的基因(分别为1884、1826、1410、1167及1513基因)在a部分中结合到所有3458个基因中。示出30个免疫相关基因，该30个免疫相关基因在CD62LlowCD4+T细胞与CD62LhighCD4+T细胞之间表现出不同的表达。在上述的特征中已知与抗肿瘤免疫性相关的53个基因之中，从对纳武单抗治疗的应答的观点出发来在b部分示出30个基因的基因表达：示出CD62LlowCD4+T细胞中的基因表达程度，这些基因相对于在PD中在PR中基因表达相对较高，相对于SD中在PR中基因表达相对较高，并且，相对于在PD中在PR及SD中基因表达相对较高。
图15示出长期存活者与短期应答者中的CD62LlowCD4+T细胞的亚群。预测长期应答者的式子的接收者操作特性曲线(n＝126)。预测式的阈值(323.5)中的敏感度和特异性为68.2％及81.7％(P＜0.0001)。
图16为示出纳武单抗治疗后的患者生存期的图。针对在纳武单抗治疗后第9周的最初的肿瘤应答评估期间呈现疾病进展(PD)、稳定(SD)或部分响应(PR)的3个患者部分组(总n＝126)的、总生存期曲线(a)及无恶化性期间曲线(b)。针对基于预测式的阈值(192)被诊断为非应答者或应答者的患者(总n＝143)(包括未能评估第9周的肿瘤应答的患者)的、OS曲线(c)及PFS曲线(d)。(e，f)针对用于预测在验证队列中(n＝86)及所有患者中(n＝126)的非应答者的式子的、接收者操作特性曲线(ROC)。
图17为示出免疫系细胞的部分群的比例之间的相关、以及总CD4+T细胞群中的CD62Llow细胞及CCR7-CD45RA-细胞与预测式的值之间的相关的图。c-e：总CD4+细胞群中CCR7-CD45RA-细胞的比例与总CD4+细胞群中CXCR3+CCR4-CCR6-细胞、CXCR3-CCR4+CCR6-细胞或CXCR3-CCR4-CCR6+细胞的比例之间的相关。a、b：从23名患者获得的总CD4+T细胞群中CD62Llow细胞与CCR7-CD45RA-细胞的比例。以平均值±平均值的标准误差表示数据，符号表示各个患者的值。针对差异的统计学上的显著性，使用Student’s两侧t检验进行评估。
图18为T细胞部分群的比例之间的相关的图。总CD4+T细胞群中的CCR7-CD45RA-细胞的比例、与(a，b)总CD62LlowCD4+细胞群中及总CCR7-CD45RA-CD8+细胞群中的PD-1+细胞的比例之间的线性相关、以及与(c，d)总CD62LlowCD4+细胞群中的LAG-3+细胞的比例及CTLA-4+细胞的比例之间的线性相关。
图19为示出质谱流式细胞术分析的门控策略的图。发明人使用了归一化算法，其识别金属嵌入聚丙烯EQTM四元素校准珠(Four Element Calibration Bead)的信号强度。归一化后，除去珠子利用191Ir门控单峰。通过191Ir及198Pt门控生细胞。
图20为示出流式细胞分析仪(LSR Fortessa)分析的门控策略的图。活的单细胞(singlet)用FSC、SSC及FVD染色进行门控。对于CD3+细胞，作为T细胞门控。
图21为示出作为一线治疗使用派姆单抗(Pembrolizumab)时的结果的图。A：分析患者组。B：派姆单抗治疗中的无恶化存活(PFS)曲线。C：派姆单抗治疗中的总生存期(OS)曲线。D：横轴为CD62LlowCD4+/CD3+，纵轴为PFS的ROC分析结果。E：横轴为CD62LlowCD4+/CD3+，纵轴为OS的ROC分析结果。F：PFS＜490组及PFS≥490的组中的CD62LlowCD4+/CD3+的制图结果。G：以CD62LlowCD4+/CD3+＞17.6作为阈值来对PFS进行ROC分析的结果。H：OS＜637的组及OS≥637的组中的CD62LlowCD4+/CD3+的制图结果。I：以CD62LlowCD4+/CD3+＞15.6作为阈值来对OS进行ROC分析的结果。
图22A和图22B为示出用派姆单抗的一线治疗治疗患者(●)和用纳武单抗的二线治疗患者(〇)之间的比较结果的图表。当调整％CD62Llow/CD4+时，针对已进行治疗的非小细胞肺癌的纳武单抗治疗效果与针对未进行治疗PD-L1＞50％非小细胞肺癌的派姆单抗治疗效果几乎相同(对于PFS，PD-L1＞50％组为良好，但每％CD62Llow/CD4+的PFS增加比例相同)。
具体实施方式
以下，在示出最佳方式的同时描述本发明。应理解，在本说明书全文中，除非另有说明，单数形式的表示还包括其复数形式。因此，应理解，除非另有说明，单数形式的冠词(例如英语中的“a”、“an”、“the”等)还包括其复数形式的概念。还应理解，除非另有说明，本说明书中使用的术语均以本领域通常使用的含义使用。因此，除非另有定义，本说明书中使用的所有专业术语及科技术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。
以下将适当描述本说明书中特别使用的术语的定义和/或基本的技术内容。
(定义)
在本说明书中，“长期应答者”是指无恶化生存期为500天以上的患者，例如，指在纳武单抗治疗后经500天以上的时间内未发生恶化的患者。被推断为长期应答者的患者被预计通过癌免疫疗法长期存活，因此临床医生可判断应将癌免疫疗法终止为最小限量(例如，给与一次)。
在本说明书中，“短期应答者”是指无恶化生存期少于500天的患者，例如，指纳武单抗治疗后少于500天的时间内发生恶化的患者。被推断为短期应答者的患者被预测为无法期待癌免疫疗法的效果，或者被预测为虽然能相应地得到癌免疫疗法的效果但无法长期存活，因此临床医生(1)研讨继续进行进一步的治疗的同时联合使用其他治疗方法、或者(2)改变为其他治疗方法，和/或，研讨与其他治疗方法联合使用。
在本说明书中，“生物标志物”是指作为对通常的生物学过程、病理学过程或治疗介入的药理学应答的指标而被客观测量并评估的特性。
在本说明书中，在本说明书中，“癌症”或“癌”可被互换使用，是指高度非典型性、比正常细胞增殖快、可破坏性地浸润至周围组织或者转移的恶性肿瘤或这种恶性肿瘤存在的状态。在本发明中，癌症包括但不限于实体瘤及造血肿瘤。
在本说明书中，“癌症免疫疗法”是指使用生物防御机制、例如生物所具有的免疫系统来治疗癌症的方法。
在本说明书中，“抗肿瘤免疫应答”是指生物体内对肿瘤的任何免疫应答。
在本说明书中，“抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激”是指在对生物体内肿瘤的免疫应答的过程中发生的、对树突状细胞给与刺激的任何现象。该刺激可成为直接或间接产生抗肿瘤免疫应答的因素之一。没有限制，但代表性地为：抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激可以为由CD4+T细胞(例如，效应T细胞)引起，该刺激的结果，树突状细胞刺激CD8+T细胞，受刺激的CD8+T细胞发挥抗肿瘤效果。
在本说明书中，“相关”是指两个事件具有统计学上显著的相关性关系。例如，“与A相关的B的相对量”是指当发生事件A时，B的相对量在统计学上受到显著影响(例如，增加或减少)。
在本说明书中，“流式细胞术”是指针对悬浮在液体中的细胞、个体及其他生物颗粒的颗粒数量、各自的物理、化学、生物学特性进行检测的技术。
在本说明书中，“免疫激活”是指免疫功能的消除体内异物的功能增大，可通过免疫功能中积极作用的任何因素(例如，免疫细胞或细胞因子)的量的增大来表示。
在本说明书中，“细胞亚群”是指包括多种特性的细胞的细胞群中具有一些共同特征的任意的细胞集合。在本技术领域中已知的特定名称的情况下，可利用所涉及术语来指代特定细胞亚群，也可描述任何特性(例如，细胞表面标志物的表达)来指代特定细胞亚群。
在本说明书中，某细胞亚群的“量”包括某细胞的绝对数量和在细胞群中的比例的相对量。例如，在本说明书中，“CD62LlowCD4+T细胞亚群的量”可以是指相对于CD3+细胞或CD4+细胞或CD3+CD4+细胞的量的相对量。并且，在本说明书中，“细胞比例”是指其细胞亚群的量，例如“CD62LlowCD4+T细胞比例”是指相对于CD3+细胞亚群或CD4+细胞亚群或CD3+CD4+细胞亚群的、相对的CD62LlowCD4+T细胞亚群的量。
在本说明书中，涉及细胞的术语“相对量”可与“比例”互换使用。典型地，术语“相对量”及“比例”是指，相对于形成特定细胞群(例如，CD4+T细胞群)的细胞数量的、形成所需细胞亚群(例如，CD62LlowCD4+T细胞亚群)的细胞数量。
在本说明书中，“基准”是指用于确定本说明书中所描述的标志物的量的增减的成为比较对象的量。当确定在某处置(例如，癌症免疫疗法)前后的某量的增减时，例如，作为“基准”可例举处置之前的该量。
在本说明书中，当修饰数值来使用时，“约”表示包括直至所描述数值的±10％的范围。
在本说明书中，“阈值”是指对于某变化值设定的值，是当变化值为其以上或以下时赋予某种意义的值。在本说明书中，也称为临界(cut-off)值。
在本说明书中，“无效组”是指在根据RECIST ver1.1判定接受了癌症治疗时的治疗效果的情况下被判定为疾病进展(PD，Progressive disease)的受试者组。无效组也被称为PD组、进展组、NR(Non-responder)，在本说明书中可互换使用。
在本说明书中，“部分响应组”是指在根据RECIST ver1.1判定接受了癌症治疗时的治疗效果的情况下被判定为部分响应(PR，Partial response)的受试者组。部分响应组还被称为PR组，在本说明书中可互换使用。
在本说明书中，“稳定组”是指在根据RECIST ver1.1判定接受了癌症治疗时的治疗效果的情况下被判定为疾病稳定(SD，Stable disease)的受试者组。“稳定组”还被称为SD组、中间组、IR(Intermediate Responder)，在本说明书中可互换使用。
在本说明书中，“完全响应组”是指在根据RECIST ver1.1判定接受了癌症治疗时的治疗效果的情况下被判定为完全响应(CR，Complete response)的受试者组。“完全响应组”还被称为CR组，在本说明书中可互换使用。需要说明的是，在本发明中，在受试者组除了部分响应组(PR)之外还包括完全响应组(CR)的情况下，或者包括完全响应组(CR)而不包括部分响应组(PR)的情况下，与部分响应组(PR)相同地被检测。
在本说明书中，“响应组”在综合地提及“部分响应组”和“完全响应组”时使用，还被称为“高效组”、GR(Good Responder)。
在本说明书中，“无效组阈值”是指在给定的受试者组中，用于识别无效组与稳定组+响应组的阈值。当选择给定的受试者组中的无效组时，选择无效组阈值以实现规定的敏感度和特异性。
在本说明书中，“响应组阈值”是指在给定的受试者组中、或者在使用无效组阈值从给定的受试者组排除无效组而获得的组中用于识别稳定组和响应组的阈值。在给定的受试者组中、或者在使用无效组阈值从给定的受试者组排除无效组而获得的组中选择响应组时，选择响应组阈值以实现规定的敏感度和特异性。
在本说明书中，“长期存活阈值”是指在给定的受试者组中、或者在使用无效组阈值从给定的受试者组排除无效组而获得的组中用于识别被预测为长期存活的受试者的阈值。在给定的受试者组中、或者在使用无效组阈值从给定的受试者组排除无效组而获得的组中选择或预测长期存活者时，选择长期存活阈值以实现规定的敏感度和特异性。
在本说明书中，“治疗干预”是指在进行了某治疗之后或者在进行某治疗的同时，以与该治疗相同的疾病作为对象进行的任意治疗。作为治疗干预，可重复已经进行了一次的治疗、或者可进行不同于已经进行过一次的治疗。作为已经进行过的癌症免疫疗法时的治疗干预示例，可例举该癌症免疫疗法与其他癌症治疗组合的疗法，典型地，可以为与一种或多种另外药剂的组合给药。或者，联合疗法可以为与放射治疗的组合。一种或多种另外药剂可以为任意的化疗药物、或者也可包含第二免疫检查点抑制剂。或者，作为联合疗法中使用的其他癌症治疗，可列举其他癌症免疫疗法(例如，过继细胞转移)、温热疗法、外科程序等，但不限定于此。
优选地，在给定的受试者中的细胞亚群的组成高于(或者低于)无效组阈值或响应组阈值、表示为无效组或者表示为不是响应组时进行治疗干预，或者，在给定的受试者中的细胞亚群的组成高于(或者低于)基准、未预测到长期存活时进行治疗干预。为了确定是否需要治疗干预，可以随时间测量给定的受试者中的细胞亚群的组成。治疗干预的目的可以为例如，增加样品中的与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的量。该CD4+T细胞亚群的量没有限定，典型地，可选自由：
CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
CCR7-CD4+T细胞亚群的量；
LAG-3+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；以及
PD-1+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量组成的组中。
“敏感度(sensitivity)”是指在从受试者组中选择具有预期特征的受试者的情况下，相对于受试者组包括的具有预期特征的受试者总数的、被选择对象中具有预期特征的受试者数的比例。例如，当受试者组包括的具有预期特征的受试者全部被选择时，敏感度为100％，当受试者组包括的具有预期特征的受试者的一半被选择时，敏感度为50％，当受试者组包括的具有预期特征的受试者完全没有被选择时，敏感度为0％。敏感度例如可以作为(所选的对象中的具有预期特征的受试者数)/(受试者组包括的具有预期特征的受试者总数)而决定。敏感度高的判定是指：当需要发现处于某状态(例如，癌症免疫疗法的结果为长期存活)的受试者时，该受试者易于可靠地被判定为上述状态。
“特异性(specificity)”是指当从受试者组中选择具有预期特征的受试者时，相对于所选对象总数的、所选对象中具有预期特征的受试者数的比例。例如，当从受试者组中选择的候选全部具有预期特征时特异性为100％，当从受试者组中选择的候补的一半具有预期特征时特异性为50％，当从受试者组中选择的候选全部不具有预期特征时特异性为0％。例如，特异性可以作为(所选对象中的具有预期特征的受试者数)/(所选对象总数)进行确定。特异性高的判定是指：不处于某状态(例如，就癌症免疫疗法而言是响应组)的受试者被错误地判定为不处于某状态(例如，癌症免疫疗法的结果为长期存活)的概率低。
(标志物)
CD62LlowCD4+细胞亚群呈强正相关的T细胞亚群为1型辅助CD4+T细胞(Th1)、效应记忆CD4+T细胞、CD8+T细胞、效应CD8+T细胞。这些是在细胞介导免疫中对细胞杀伤功能很重要的细胞亚群。另一方面，呈负相关的是2型辅助CD4+T细胞(Th2)、调节性T细胞。这些被公知为抑制细胞介导免疫的细胞亚群。因此，CD62LlowCD4+细胞亚群的增加表示抗肿瘤细胞介导免疫的激活，表示阻止它的细胞亚群减少。另外，CD62LlowCD4+细胞亚群通过与CD4+T细胞、CD8+T细胞上的LAG3、ICOS、PD-1、CTLA-4表达具有显著相关关系来控制其抗肿瘤免疫功能。具体而言，CD62LlowCD4+细胞亚群的增加与PD-1、LAG-3、ICOS表达增加相关，与CTLA-4表达减少相关。这认为是，抗肿瘤免疫主要受PD-1、LAG-3的控制，与这种免疫检查点抑制治疗的有效性相关。并且，HLA-DR+CD141+CD11c+树突状细胞亚群与CD62LlowCD4+细胞亚群具有正相关关系。这认为是，被激活的树突状细胞表达MHC classII类限制性抗原，导致识别MHCclassII类限制性抗原的CD62LlowCD4+细胞亚群的增加，认为是与肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群。HLA-DR+CD141+CD11c+树突状细胞亚群被认为是与肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群。在本说明书中，当表达细胞亚群时，例如，CD62Llow/CD4+细胞是指CD62LlowCD4+T细胞相对于CD4+T细胞的比例，分子中描述的细胞具有分母中描述的细胞的所有特征。另外，在本说明书中，例如CD62LlowCD4+/CD3+细胞可以为CD62Llow/CD4+CD3+细胞，所有细胞均表示CD62LlowCD4+CD3+细胞的比例，还可以将母群作为CD4+以CD62Llow/CD4+表达。
从以上结果可以看出，通过使用与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群和/或与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群，可预测癌症免疫疗法中的长期存活。
在本发明的实施方式中提供一种方法，其将接受过癌症免疫疗法的受试者中的细胞亚群的组成用作癌症免疫疗法中的长期存活预测的指标。方法可包括分析样品中的细胞亚群的组成的工序。细胞亚群的组成分析可通过本说明书中记载的、或者本领域技术人员已知的任意方法进行。该方法可以为在体外或在计算机中进行。在本发明的一实施方式中，通过细胞亚群的量与适当的标准之间的比较，示出受试者中有无免疫激活。尤其，细胞亚群可使用与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的细胞亚群。
(1.与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群)
在一实施方式中，成为指标的细胞亚群为与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群。CD62LlowCD4+T细胞在抗肿瘤免疫中负责树突状细胞的刺激。与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群被认为也同样可用作预测癌症免疫疗法中长期存活的指标。
作为与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群，包括但不限于例如：对次级淋巴器官的归巢分子的表达减少的CD4+T细胞亚群、被效应型T细胞引发的CD4+T细胞亚群、受到由抗原识别引起的启动的CD4+T细胞亚群及调节性T细胞亚群。
作为与树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的示例，包括但不限于例如：CD62LlowCD4+T细胞亚群、CCR7-CD4+T细胞亚群、LAG-3+CD62LlowCD4+T细胞亚群、ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群、CCR4+CD25+CD4+T细胞亚群、CD45RA-CD4+T细胞亚群、CD45RO+CD4+T细胞亚群、CD62LhighCD25+CD4+T细胞亚群、CD127+CD25+CD4+T细胞亚群、CD45RA-Foxp3+CD4+T细胞亚群及Foxp3+CD25+CD4+T细胞亚群等。
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群可以为例如：包含在CD62LlowCD4+T细胞群中的细胞亚群。作为与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群，包括但不限于CD62LlowCD4+T细胞亚群(即，CD62LlowCD4+T细胞群本身)、ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群、PD-1+CD62LlowCD4+T细胞亚群及LAG-3+CD62LlowCD4+T细胞亚群等。
就上述细胞亚群而言，代替将细胞亚群的量用作指标或除了将细胞亚群的量用作指标之外，可以将合适细胞中的合适表面标志物分子的表达量用作指标。例如，可将在CD62LlowCD4+T细胞中表达的ICOS、PD-1及LAG-3等的表达量用作指标。
(2.与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群的量)
在一实施方式中，成为指标的细胞亚群为与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群。例如，在本说明书的实施例中，在癌症免疫疗法前后观察到HLA-DR+CD141+CD11c+细胞亚群的增大。HLA-DR介导由CD4+T细胞引起的树突状细胞的刺激。与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群也同样地被认为可用作预测在癌症免疫疗法中长期存活的指标。
作为与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群，包括但不限于例如：因CD4+T细胞群中的归巢分子的表达减少的细胞亚群的增加而增加的树突状细胞亚群、因由CD4+T细胞群中的效应型T细胞引发的CD4+T细胞亚群的增加而增加的树突状细胞亚群、以及因CD4+T细胞群中的受到由抗原识别引起的启动的CD4+T细胞亚群的增加而增加的树突状细胞亚群。并且，作为树突状细胞亚群，包括但不限于例如HLA-DR+树突状细胞亚群、CD80+树突状细胞亚群、CD86+树突状细胞亚群以及PD-L1+树突状细胞亚群。作为树突状细胞，包括但不限于例如骨髓树突状细胞(mDC、CD141+CD11c+树突状细胞)及浆细胞样树突状细胞(pDC、CD123+CD11c+树突状细胞)。
作为与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群，包括HLA-DR+CD141+CD11c+细胞亚群。对于上述的细胞亚群，代替将细胞亚群的量用作指标或除了将细胞亚群的量用作指标之外，可将合适的细胞中的合适的表面标志物分子的表达量用作指标。例如，还可将CD141+CD11c+细胞中表达的HLA-DR等的表达量用作指标。
(3.与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群的量)
在一实施方式中，成为指标的细胞亚群为与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群。受到由CD4+T细胞引起的刺激的树突状细胞刺激CD8+T细胞，最终，受到刺激的CD8+T细胞发挥抗肿瘤活性。CD8+T细胞上的CD137介导由树突状细胞引起的CD8+T细胞的刺激。与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群也同样地被认为可用作预测癌症免疫疗法中长期存活的指标。
作为与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群，包括但不限于例如：因CD4+T细胞群中的归巢分子的表达减少的细胞亚群的增加而增加的CD8+T细胞亚群、因CD4+T细胞群中的由效应型T细胞引发的CD4+T细胞亚群的增加而增加的CD8+T细胞亚群、因CD4+T细胞群中的受到由抗原识别引起的启动的CD4+T细胞亚群的增加而增加的CD8+T细胞亚群、因树突状细胞群中的HLA-DR+树突状细胞亚群的增加而增加的CD8+T细胞亚群、因树突状细胞群中的CD80+树突状细胞亚群的增加而增加的CD8+T细胞亚群、因树突状细胞群中的PD-L1+树突状细胞亚群的增加而增加的CD8+T细胞亚群。并且，作为与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群，包括但不限于例如CD62LlowCD8+T细胞亚群、CD137+CD8+T细胞亚群以及CD28+CD62LlowCD8+T细胞亚群。
对于上述细胞亚群，代替将细胞亚群的量用作指标或者除了将细胞亚群的量用作指标之外还可将合适的细胞中的合适的表面标志物分子的表达量用作指标。例如，还可将CD62LlowCD8+T细胞中表达的CD137等的表达量用作指标。
对于本说明书中描述的细胞亚群的量，可组合多个量用作指标。组合指标可以使长期无恶化存活的预测更加准确。在一实施方式中，可通过选自由样品中的与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的量、与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群的量及与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群的量组成的组中的至少两个量与标准之间的比较，来显示在受试者中有无免疫激活。
本发明一实施方式为一种方法，其将受试者中的选自以下细胞亚群的量用作预测长期无恶化存活的式子的变量(指标)：
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的量；
与抗肿瘤免疫应答中的由CD4+T细胞引起的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群的量；
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群的量；
调节性T细胞亚群的量或与调节性T细胞相关的CD4+T细胞亚群的量；以及
ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量。
在一实施方式中，本发明的变量(X，Y)分别选自由以下量组成的组：
CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
CCR7-CD4+T细胞亚群的量；
LAG-3+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
PD-1+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
CD45RA-CD4+T细胞亚群的量；
CD45RO+CD4+T细胞亚群的量；
CCR4+CD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD62LhighCD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD127+CD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD45RA-Foxp3+CD4+T细胞亚群的量；
Foxp3+CD25+CD4+T细胞亚群的量；
HLA-DR+树突状细胞亚群的量；
CD80+树突状细胞亚群的量；
CD86+树突状细胞亚群的量；
PD-L1+树突状细胞亚群的量；
CD62LlowCD8+T细胞亚群的量；
CD137+CD8+T细胞亚群的量；以及
CD28+CD62LlowCD8+T细胞亚群的量。
例如，在本发明的方法中，可将选自由以下细胞亚群的量组成的组中的值设为(X)：
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的量；
与抗肿瘤免疫应答中的由CD4+T细胞引起的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群的量；以及
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群的量。
在本发明的方法中，还可将选自由以下量组成的组中的值设为(X)，计算变量(X，Y)：
CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
CCR7-CD4+T细胞亚群的量；
LAG-3+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
PD-1+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
CD45RA-CD4+T细胞亚群的量；
CD45RO+CD4+T细胞亚群的量；
HLA-DR+树突状细胞亚群的量；
CD80+树突状细胞亚群的量；
CD86+树突状细胞亚群的量；
PD-L1+树突状细胞亚群的量；
CD62LlowCD8+T细胞亚群的量；
CD137+CD8+T细胞亚群的量；以及
CD28+CD62LlowCD8+T细胞亚群的量。
例如，在本发明的方法中，可将调节性T细胞亚群的量或与调节性T细胞相关的CD4+T细胞亚群的量设为(Y)，计算变量(X，Y)。在本发明的方法中，还可将由选自由以下量组成的组中的值设为(Y)，计算变量(X，Y)：
CCR4+CD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD62LhighCD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD127+CD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD45RA-Foxp3+CD4+T细胞亚群的量；以及
Foxp3+CD25+CD4+T细胞亚群的量。
在本发明的方法中，例如，可将X相对于Y而得到的相对值与阈值之间的比较用作预测长期无恶化存活的指标，其中，包括测量CD4+CD62LlowT细胞的量(X)的工序和测量Foxp3+CD25+CD4+T细胞的量(Y)的工序。作为(Y)，可使用调节性T细胞亚群的量或与调节性T细胞相关的CD4+T细胞亚群的量或比例。尤其，虽然至今未有关于将CD62LlowCD4+T细胞/调节性T细胞比作为生物标志物来进行研讨的报告，但本发明人发现，作为用于预测针对癌症免疫疗法的长期无恶化存活的生物标志物，非常有用。
另外，本发明中可将X相对于Y得到的相对值与阈值之间的比较用作预测长期无恶化存活的指标，其中，包括测量CD80+树突状细胞亚群的量(X)的工序和测量CD28+CD62LlowCD8+T细胞亚群的量(Y)的工序。
由于本发明人发现多个指标独立地显示与长期无恶化存活的相关性，因此，可以组合多个指标以用作长期无恶化存活的指标。当组合两个以上的指标以用作长期无恶化存活的指标时，可使用由利用任意数量的变量的式子表示的指标。当使用多个指标(X1，X2，X3···Xn)时，作为长期无恶化存活的指标，包括但不限于例如：
F＝a1X1 b1+a2X2 b2+a3X3 b3···+anXn bn
F＝X1 c1＊X2 c2＊X3 c3···＊Xn cn
(式中，a、b、c各为任意的实数)。
根据由上述式子计算出的值(指标)与阈值进行比较而得到的大小，可预测长期无恶化存活。对于本发明人发现的新指标，可通过基于判别分析进行的多变量分析(例如，通过逻辑回归进行的估计)，确定各系数，并预测作为受试者癌症免疫疗法结果的长期无恶化存活。
典型地，通过将本说明书中描述的两个指标(X，Y)作为变量的式子F(X，Y)，可预测长期无恶化存活，在特定的实施方式中，式子为X相对于Y而得到的相对值。
作为X相对于Y而得到的相对值，可使用关于X和Y的任意函数(F(X，Y))。尤其，当认为X与长期无恶化存活呈正相关、Y与长期无恶化存活呈负相关时，虽然不做限定，但可使用相对于X是单调增加且相对于Y是单调减少的任意X和Y的函数(F(X，Y))。当已给定表示长期无恶化存活的2个以上的变量时，表示长期无恶化存活的式子可通过计算每个变量对长期无恶化存活的贡献来递归计算。
作为表示长期无恶化存活的式F(X，Y)，可例举但不限定于例如，
F＝aXr+bYs
F＝Xr＊Ys
(式中，a、b、r、s为任意实数)。
作为r、s，为了式子的简单性，可使用整数。在一部分实施方式中，作为X相对于Y的相对值的示例包括Xn/Ym(n及m为任意实数，例如任意整数)，例如可以举出X/Y、X2/Y，但不限定于此。当X、Y因子分别基于不同机制表示针对治疗的长期无恶化存活时，这种指标组合可使长期无恶化存活的预测更加准确。本发明人的验证表明，r和s使用-5～5范围的式子，可预测作为受试者癌症免疫疗法结果的长期无恶化存活。
可以考虑敏感度和特异性来确定阈值。敏感度和特异性可以为针对检测长期无恶化存活的敏感度和特异性。在一实施方式中，优选地，本发明的生物标志物设定阈值，在该阈值下敏感度、特异性均为100％。当使用两个以上作为本发明的生物标志物描述的指标时，可为这些指标分别设定阈值，如果需要，可以区分使用第一阈值、第二阈值、第三阈值、第四阈值等。
可以确定阈值使得针对检测长期无恶化存活的敏感度超过约90％。在另一实施方式中，可以确定阈值使得对检测长期无恶化存活的敏感度为约100％。在又一实施方式中，可以确定阈值使得对检测长期无恶化存活的特异性超过约90％。在又一实施方式中，可以确定阈值使得对检测长期无恶化存活的特异性为约100％。
在参考受试者组中，阈值可以使用通过进行该领域中已知的分析而确定的值。作为这种分析，可以举出机器学习或回归分析，但不限定于此。使用通过回归分析制作的判别式，使用通过回归分析创建的判别式，例如通过进行ROC分析，可获得阈值。考虑到ROC分析中的敏感度和特异性，可以设定任一个参数或两者参数的优异的阈值。
在一实施方式中，受试者的T细胞的组成为从受试者获得的样品的T细胞的组成，优选地，样品为外周血样品。本发明提供的生物标志物可使用外周血样品进行测量，因此临床应用中具有很大优势，即非侵入性、价格低廉、可经时地进行。
在一实施方式中，癌症免疫疗法包括免疫检查点抑制剂的给药。本发明的生物标志物特别是可以准确地预测受试者针对这种癌症免疫疗法的长期无恶化存活。
在本发明的优选实施方式中，可使用X(CD62LlowCD4+细胞比例)和Y(CD25+FOXP3+CD4+T细胞比例)。另外，在本发明的优选实施方式中，作为使用X和Y的函数，可利用X2/Y。例如，在本发明的特别优选的实施方式中，对于患者组，可使用X(CD62LlowCD4+细胞比例)和Y(CD25+FOXP3+CD4+T细胞比例)来对每个患者计算X2/Y，可通过已知方法将特定的数值设定为阈值。例如，将无效组阈值设为“α”，将长期存活阈值设为“β”。接着，测定受试者的样品，比较该受试者的X2/Y值和α、β的值的大小，可判断为如下：
·X2/Y＜α：无法期待由癌免疫疗法产生的效果。应研讨变更为其他治疗法、与其他治疗法联合使用。
·α≦X2/Y＜β：虽然相应地获得由癌免疫疗法产生的效果，但为了获得长期存活，应继续进一步治疗，研讨与其他治疗法联合使用。
·β＜X2/Y：预测到由癌免疫疗法引起的长期存活，因此，应以最小限度(例如以一次给药)结束癌免疫疗法。
上述的数值“α”和“β”可考虑调整敏感度和特异性而确定。虽没有特别限定，但优选地，α可使用约100、约120、约140、约160、约180、约200、约220或约240。更优选地，α可以为约170、约180、约190或约200。α可为约192。
虽没有特别限定，但β可以设为例如，比α大至少50、优选大至少70、更优选大至少90的数值。作为优选β，是比α大至少50的数值，可使用约150、约170、约190、约210、约230、约250、约270、约290、约300、约320、约340、约360、约380、约400、约420或约440。更优选地，β为约310或约320、约330或约340。β可为约324。
虽没有特别限定，但α为约100～400范围内的值，优选地为约100～200范围内的值，可设置为例如约100～110、约110～120、约120～130、约130～140、约140～150、约150～160、约160～170、约170～180、约180～190、约190～200、约200～210、约210～220、约220～230或约230～240范围内的值。
虽没有特别限定，但β为比α大至少50且为约150～450范围内的值，优选地为约300～440范围内的值，例如，可设为约300～310、约310～320、约320～330、约330～340、约340～350、约350～360、约360～370、约370～380、约380～390、约390～400、约400～410、约410～420、约420～430或约430～440范围内的值。
在本发明的优选实施方式中，当示出受试者为无效组时，例如，当判别式小于无效组阈值时，表示应该进行治疗干预。当受试者为无效组时，作为治疗干预，可以代替正在给药的癌症免疫疗法或者除了正在给药的癌症免疫疗法以外进行非癌症免疫疗法的治疗(例如，化学疗法、放射疗法、外科程序、温热疗法等)或者进行另外的癌症免疫疗法(例如，免疫检查点抑制剂，过继细胞转移等)。对于组合治疗，可进行本说明书中所描述的任意治疗。
在本发明的优选实施方式中研讨了：在表示受试者不是长期应答者、或者无法获得长期存活时，例如在判别式小于长期存活阈值时，应进行治疗干预。在这种情况下，可以区分是低于长期存活阈值、进一步低于无效组阈值，还是无效组阈值以上。受试者无法获得长期存活，但当表示为非无效组(短期应答者)时，作为治疗干预，除了正在给药的癌症免疫疗法之外，还进行非癌症免疫疗法的治疗(例如，化学疗法、放射疗法、外科程序、温热疗法等)，或者进行另外的癌症免疫疗法(例如，免疫检查点抑制剂，过继细胞转移等)。典型地，针对已经给药的免疫检查点抑制剂，研讨其他化疗药物或第二免疫检查点抑制剂的联合使用。对于组合治疗，可进行本说明书中所记载的任意治疗。
在一实施方式中，免疫检查点抑制剂包含PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。作为PD-1抑制剂，可以举出用于抑制PD-1与PD-L1之间的相互作用(例如，结合)的抗PD-1抗体，例如，纳武单抗、派姆单抗、斯巴达珠单抗(Spartalizumab)及西米普利单抗(Cemiplimab)等，但不限定于此。作为PD-L1抑制剂，可以举出抑制PD-1和PD-L1的相互作用(例如，结合)抗PD-L1抗体、例如德瓦鲁单抗(Durvalumab)、阿替利珠单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)等抗PD-L1抗体，但不限定于此。
本发明的另一方面，提供一种方法，其使用受试者的T细胞的组成预测受试者针对癌症免疫疗法的长期无恶化存活、并治疗患有癌症的受试者。或者，提供在具有特定T细胞组成的受试者中治疗癌症的方法、或者用于该方法中的组合物。癌症免疫疗法、特别是免疫检查点抑制疗法已知每个受试者的应答性的差较大，通过本发明的生物标志物选择受试者并施用癌症免疫疗法，可显著提高实现肿瘤缩小等治疗效果的概率。
在本发明一实施方式中，提供一种治疗患有癌症的受试者的方法，包括下述工序(1)和工序(2)。
工序(1)，确定来自所述受试者的样品中的CD4+T细胞中的选自由以下相对量组成的组中的相对量：
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的相对量；
与抗肿瘤免疫应答中的由CD4+T细胞导致的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群的相对量；以及
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群的相对量，
工序(2)，当该相对量高于阈值时判定为该受试者为针对癌症免疫疗法的长期无恶化存活组；当该受试者被判定为长期无恶化存活组时，向该受试者施用所述癌症免疫疗法。
在本发明的实施方式中，提供一种方法，其将从受试者获得的样品中的细胞亚群的组成用作预测所述受试者在癌症免疫疗法中长期存活的指标，该方法包括分析从该受试者获得的该样品中的细胞亚群的组成的工序，通过该样品中的与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的量与标准之间的比较，预测该受试者在癌症免疫疗法中的长期存活。其中，CD4+T细胞亚群的量(或相对量)选自由以下比例组成的组：
CD4+T细胞中的CD62LlowT细胞亚群的比例；
CD4+T细胞中的CCR7-T细胞亚群的比例；
CD4+T细胞中的CD45RA-T细胞亚群的比例；
CD4+T细胞中的CD45RO+T细胞亚群的比例；
CD62LlowCD4+T细胞中的LAG-3+T细胞亚群的比例；
CD62LlowCD4+T细胞中的ICOS+细胞亚群的比例；
CD62LlowCD4+T细胞中的PD-1+细胞亚群的比例；
CD4+T细胞中的CCR4+CD25+细胞亚群的比例；
CD4+T细胞中的CD62LhighCD25+细胞亚群的比例；
CD4+T细胞中的CD127+CD25+细胞亚群的比例；
CD4+T细胞中的CD45RA-Foxp3+细胞亚群的比例；
CD4+T细胞中的Foxp3+CD25+细胞亚群的比例；
树突状细胞中的HLA-DR+亚群的比例；
树突状细胞中的CD80+亚群的比例；
树突状细胞中的CD86+亚群的比例；
树突状细胞中的PD-L1+亚群的比例；
CD8+T细胞中的CD62Llow细胞亚群的比例；
CD8+T细胞中的CD137+细胞亚群的比例；以及
CD62LlowCD8+T细胞中的CD28+细胞亚群的比例。
优选地，所述量(或相对量)选自由以下比例组成的组：
CD4+T细胞中的CD62Llow细胞亚群的比例；
CD4+T细胞中的CCR7-细胞亚群的比例；
CD4+T细胞中的CD45RA-细胞亚群的比例；
CD4+T细胞中的CD45RO+细胞亚群的比例；
CD62LlowCD4+T细胞中的LAG-3+细胞亚群的比例；
CD62LlowCD4+T细胞中的ICOS+细胞亚群的比例；
树突状细胞中的HLA-DR+亚群的比例；
树突状细胞中的CD80+亚群的比例；
树突状细胞中的CD86+亚群的比例；
树突状细胞中的PD-L1+亚群的比例；
CD8+T细胞中的CD62Llow细胞亚群的比例；
CD8+T细胞中的CD137+细胞亚群的比例；以及
CD62LlowCD8+T细胞中的CD28+细胞亚群的比例。
在本发明的另一实施方式中，提供一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：确定来自所述受试者的样品中的、CD4+T细胞中Foxp3+CD25+T细胞的比例的工序；CD4+T细胞中的Foxp3+CD25+T细胞的比例低于阈值时，判定所述受试者为对癌症免疫疗法的长期无恶化存活组的工序；当判定所述受试者为对癌症免疫疗法的长期无恶化存活组时，向所述受试者施用所述癌症免疫疗法的工序。在本发明的另一实施方式中，提供一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括如下工序，即，通过确定来自所述受试者的样品中的、CD4+T细胞中的Foxp3+CD25+T细胞的比例的工序、以及当CD4+T细胞中的Foxp3+CD25+T细胞的比例低于阈值时判定所述受试者为对癌症免疫疗法的长期无恶化存活组的工序，来向被判定为长期无恶化存活组的所述受试者施用所述癌症免疫疗法。
在本发明的另一实施方式中，提供一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括下述工序(1)、工序(2)和工序(3)。
工序(1)确定选自由以下量组成的组中的量(X，Y)：
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的相对量；
与抗肿瘤免疫应答中的由CD4+T细胞产生的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群的相对量；以及
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群的相对量；
调节性T细胞或与调节性T细胞相关的CD4+T细胞亚群的量，及
ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量，
工序(2)使用X相对于Y得到的相对值与阈值之间的比较，判定所述受试者为对癌症免疫疗法的长期无恶化存活组；
工序(3)当判定所述受试者为对癌症免疫疗法的长期无恶化存活组时，向所述受试者施用所述癌症免疫疗法。
在本发明的另一实施方式中，提供一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括对受试者施用癌症免疫疗法的工序，所述受试者通过以下工序被判定为对癌症免疫疗法为长期无恶化存活组：
工序(1)确定选自由以下量组成的组中的量(X，Y)：
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的相对量；
与抗肿瘤免疫应答中的由CD4+T细胞产生的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群的相对量；以及
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群的相对量；调节性T细胞或与调节性T细胞相关的CD4+T细胞亚群的量；及
ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量，
工序(2)使用X相对于Y而得到的相对值与阈值(无效组阈值)之间的比较来判定所述受试者为对癌症免疫疗法的长期无恶化存活组。
例如，所述量(X)及(Y)选自由以下量组成的组：
CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
CCR7-CD4+T细胞亚群的量；
LAG-3+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
PD-1+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
CD45RA-CD4+T细胞亚群的量；
CD45RO+CD4+T细胞亚群的量；
HLA-DR+树突状细胞亚群的量；
CD80+树突状细胞亚群的量；
CD86+树突状细胞亚群的量；
PD-L1+树突状细胞亚群的量；
CD137+CD8+T细胞亚群的量；
CD62LlowCD8+T细胞亚群的量；
CD28+CD62LlowCD8+T细胞亚群的量；
Foxp3+CD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD62LhighCD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD45RA-Foxp3+CD4+T细胞亚群的量；
CCR4+CD25+CD4+T细胞亚群的量；以及
CD127+CD25+CD4+T细胞亚群的量。
例如，在本发明的方法中，可将选自由以下量组成的组中的值作为(X)：
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的量；
与抗肿瘤免疫应答中的由CD4+T细胞引起的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群的量；以及
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群的量。
另外，在本发明的方法中，可将选自由以下量组成的组中的值作为(X)，来计算变量(X，Y)：
CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
CCR7-CD4+T细胞亚群的量；
LAG-3+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
PD-1+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
CD45RA-CD4+T细胞亚群的量；
CD45RO+CD4+T细胞亚群的量；
HLA-DR+树突状细胞亚群的量；
CD80+树突状细胞亚群的量；
CD86+树突状细胞亚群的量；
PD-L1+树突状细胞亚群的量；
CD62LlowCD8+T细胞亚群的量；以及
CD137+CD8+T细胞亚群的量；
CD28+CD62LlowCD8+T细胞亚群的量。
例如，在本发明的方法中，可将调节性T细胞或与调节性T细胞相关的CD4+T细胞亚群的量作为(Y)，来计算变量(X，Y)。另外，在本发明的方法中，可将选自由以下量组成的组中的值作为(Y)，计算变量(X，Y)：
CCR4+CD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD62LhighCD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD127+CD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD45RA-Foxp3+CD4+T细胞亚群的量；以及
CD4+Foxp3+CD25+T细胞亚群的量。
在本发明的另一方面中，提供一种用于预测受试者针对癌症免疫疗法的长期无恶化存活的试剂盒，其中包含针对选自CD4、CD25、CD62L及Foxp3等中的一种以上细胞表面标志物、例如选自以下组合中的标志物组合的检测剂。
CD4和CD62L的组合；
CD4、CD45RA及CCR7的组合；
CD4、CD45RO及CCR7的组合；
CD4、CD62L及LAG-3的组合；
CD4、CD62L及ICOS的组合；
CD4、CD62L及PD-1的组合，
CD4、CD62L及CD25的组合；
CD4、CD127及CD25的组合；
CD4、CD45RA及Foxp3的组合；
CD4、CD45RO及Foxp3的组合；
CD4、CD25及Foxp3的组合；
CD11c、CD141及HLA-DR的组合；
CD11c、CD141及CD80的组合；
CD11c、CD123及HLA-DR的组合；
CD11c、CD123及CD80的组合；
CD8和CD62L的组合；
CD8和CD137的组合；以及
CD28、CD62L及CD8的组合。
优选地，试剂盒包含分别针对CD4及CD62L的检测剂。可将这种检测剂的组合用于确定受试者的T细胞组成。这种试剂盒可用于测量受试者中的作为本说明书中描述的新型生物标志物的特定T细胞亚群的比例。
本发明的一实施方式为一种用于预测受试者针对癌症免疫疗法的应答的试剂盒，其中包含针对细胞表面标志物的检测剂。受试者的T细胞表达的这些细胞表面标志物与受试者对癌症免疫疗法的长期无恶化存活有关的这一点是由本发明人发现的。由此，应理解，包含针对这些细胞表面标志物的检测剂的试剂盒在针对癌症免疫疗法的长期无恶化存活的预测中有用。优选地，试剂盒包含针对CD4及CD62L的检测剂。更优选地，试剂盒包含针对CD4、CD25、CD62L及Foxp3的检测剂。在一实施方式中，检测剂为抗体。优选地，抗体被适当标记以易于检测出标志物。
本发明的另一发明为一种组合物，其用于在被预测为长期无恶化存活组的受试者中治疗癌症，其中包含免疫检查点抑制剂。另外，在本发明中提供一种产品，其包括随附文件和免疫检查点抑制剂。随附文件中记载了根据本说明书中描述的方法中任一个或多个工序使用免疫检查点抑制剂的指示。
本发明的一实施方式提供一种组合物，其特征在于，该组合物用于在被预测为长期无恶化存活组的受试者中治疗癌症，其中包含免疫检查点抑制剂，所述受试者的相对量为阈值以上，该相对量为选自以下相对量组成的组：
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的相对量；
与抗肿瘤免疫应答中的由CD4+T细胞产生的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群的相对量；以及
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群的相对量。
例如，典型地，该相对量选自由以下比例组成的组。
CD4+T细胞中的CD62Llow细胞亚群的比例；
CD4+T细胞中的CCR7-细胞亚群的比例；
CD62LlowCD4+T细胞中的LAG-3+细胞亚群的比例；
CD62LlowCD4+T细胞中的ICOS+细胞亚群的比例；
CD62LlowCD4+T细胞中的PD-1+细胞亚群的比例；
CD4+T细胞中的CD62LhighCD25+细胞亚群的比例；
CD4+T细胞中的CD127+CD25+细胞亚群的比例；
CD4+T细胞中的CD45RA-Foxp3+细胞亚群的比例；
CD4+T细胞中的Foxp3+CD25+细胞亚群的比例；
树突状细胞中的HLA-DR+亚群的比例；
树突状细胞中的CD80+亚群的比例；
树突状细胞中的CD86+亚群的比例；
树突状细胞中的PD-L1+亚群的比例；
CD8+T细胞中的CD62Llow亚群的比例；
CD8+T细胞中的CD137+亚群的比例；以及
CD62LlowCD8+T细胞中的CD28+细胞亚群的比例。
本发明的又一实施方式为一种组合物，其特征在于，该组合物用于在被预测为长期无恶化存活组的受试者中治疗癌症，其中包含免疫检查点抑制剂，所述受试者为通过来自所述受试者的样品中的选自由以下量组成的组中的量(X，Y)、与X相对于Y而得到的相对值与阈值之间的比较而被选择的受试者：
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的量，
与抗肿瘤免疫应答中的由CD4+T细胞引起的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群的量，
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群的量，
调节性T细胞或与调节性T细胞相关的CD4+T细胞亚群的量，及
ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群。
典型地，量(X，Y)选自由以下量组成的组：
CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
CCR7-CD4+T细胞亚群的量；
LAG-3+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
PD-1+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
CCR4+CD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD45RA-CD4+T细胞亚群的量；
CD45RO+CD4+T细胞亚群的量；
CD62LhighCD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD127+CD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD45RA-Foxp3+CD4+T细胞亚群的量；
Foxp3+CD25+CD4+T细胞亚群的量；
HLA-DR+树突状细胞亚群的量；
CD80+树突状细胞亚群的量；
CD86+树突状细胞亚群的量；
PD-L1+树突状细胞亚群的量；
CD62LlowCD8+T细胞亚群的量；
CD137+CD8+T细胞亚群的量；以及
CD28+CD62LlowCD8+T细胞亚群的量。
例如，在本发明的方法中，可将选自由以下量组成的组中的值作为(X)：
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的量；
与抗肿瘤免疫应答中的由CD4+T细胞引起的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群的量；以及
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群的量。
另外，在本发明的方法中，将选自由以下量组成的组中的值作为(X)，计算变量(X，Y)：
CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
CCR7-CD4+T细胞亚群的量；
LAG-3+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
PD-1+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
CD45RA-CD4+T细胞亚群的量；
CD45RO+CD4+T细胞亚群的量；
HLA-DR+树突状细胞亚群的量；
CD80+树突状细胞亚群的量；
CD86+树突状细胞亚群的量；
PD-L1+树突状细胞亚群的量；
CD62LlowCD8+T细胞亚群的量；
CD137+CD8+T细胞亚群的量；以及
CD28+CD62LlowCD8+T细胞亚群的量。
例如，在本发明的方法中，可将调节性T细胞亚群的量或与调节性T细胞相关的CD4+T细胞亚群的量作为(Y)，来计算变量(X，Y)。在本发明的方法中，还将选自由以下量组成的组中的值作为(Y)，计算变量(X，Y)：
CCR4+CD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD62LhighCD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD127+CD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD45RA-Foxp3+CD4+T细胞亚群的量；以及
CD4+Foxp3+CD25+T细胞亚群的量。
在本发明的方法中，例如，将X相对于Y而得到的相对值与阈值之间的比较用作预测所述受试者为对癌症免疫疗法的长期无恶化存活组的指标，其中包括测量CD4+CD62LlowT细胞的量(X)的工序和测量CD4+Foxp3+CD25+T细胞的量(Y)的工序。作为(Y)，可使用调节性T细胞或与调节性T细胞相关的CD4+T细胞亚群的量或比例。
本发明的又一实施方式为一种组合物，其特征在于，包含免疫检查点抑制剂，该组合物用于在被预测为长期无恶化存活组的受试者中治疗癌症，所述受试者为通过来自所述受试者的样品中的、选自以下量中的量(X，Y)之间的相对值与阈值之间的比较而被选择的受试者：
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的量；
与抗肿瘤免疫应答中的由CD4+T细胞引起的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群的量；
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群的量；
调节性T细胞或与调节性T细胞相关的CD4+T细胞亚群的量；以及
ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量，
并且，来自所述受试者的样品中CD4+T细胞中的Foxp3+CD25+T细胞亚群的比例或CD62LlowCD4+T细胞中的ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群的比例为阈值以上。
典型地，量(X)及(Y)选自由以下量组成的组：
CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
CCR7-CD4+T细胞亚群的量；
LAG-3+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
PD-1+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
CCR4+CD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD45RA-CD4+T细胞亚群的量；
CD45RO+CD4+T细胞亚群的量；
CD62LhighCD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD127+CD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD45RA-Foxp3+CD4+T细胞亚群的量；
Foxp3+CD25+CD4+T细胞亚群的量；
HLA-DR+树突状细胞亚群的量；
CD80+树突状细胞亚群的量；
CD86+树突状细胞亚群的量；
PD-L1+树突状细胞亚群的量；
CD62LlowCD8+T细胞亚群的量；
CD137+CD8+T细胞亚群的量；以及
CD28+CD62LlowCD8+T细胞亚群的量。
例如，本发明的组合物将选自以下量组成的组中的值作为(X)，将通过变量(X，Y)表征的受试者作为对象：
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的量；
与抗肿瘤免疫应答中的由CD4+T细胞引起的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群的量；以及
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群的量。
本发明的方法还将选自由以下量组成的组中的值作为(X)，计算变量(X，Y)并将由变量(X，Y)表征的受试者作为给药对象
CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
CCR7-CD4+T细胞亚群的量；
LAG-3+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
PD-1+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
CD45RA-CD4+T细胞亚群的量；
CD45RO+CD4+T细胞亚群的量；
HLA-DR+树突状细胞亚群的量；
CD80+树突状细胞亚群的量；
CD86+树突状细胞亚群的量；
PD-L1+树突状细胞亚群的量；
CD62LlowCD8+T细胞亚群的量；
CD137+CD8+T细胞亚群的量；以及
CD28+CD62LlowCD8+T细胞亚群的量。
例如，本发明的组合物可将调节性T细胞亚群的量或与调节性T细胞相关的CD4+T细胞亚群的量作为(Y)，计算变量(X，Y)。在本发明的方法中还可将选自由以下量组成的组中的值作为(Y)，将由变量(X，Y)表征的受试者作为给药对象：
CCR4+CD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD62LhighCD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD127+CD25+CD4+T细胞亚群的量；
CD45RA-Foxp3+CD4+T细胞亚群的量；以及
CD4+Foxp3+CD25+T细胞亚群的量。
本发明的组合物例如基于CD4+CD62LlowT细胞的量(X)、CD4+Foxp3+CD25+T细胞的量(Y)，根据X与Y的相对值与阈值之间的比较，可将被预测对癌症免疫疗法为长期无恶化存活组的受试者作为给药对象。作为(Y)，可使用调节性T细胞或与调节性T细胞相关的CD4+T细胞亚群的量或比例。
在一实施方式中，组合物包含PD-1抑制剂。PD-1抑制剂例如为用于抑制PD-L1与PD-1之间的结合的抗PD-1抗体，例如，可以为纳武单抗、派姆单抗、斯巴达珠单抗或西米普利单抗。在其他实施方式中，组合物包含PD-L1抑制剂。PD-L1抑制剂例如为抑制PD-L1与PD-1之间的结合的抗PD-L1抗体，例如，可以为德瓦鲁单抗(Durvalumab)、阿替利珠单抗(Atezolizumab)或阿维鲁单抗(Avelumab)。对于包含这种免疫检查点抑制剂的组合物，认为当给与至通过本发明的生物标志物选择的受试者时，能够以特别高的概率获得治疗效果。本发明的组合物可与任意其他药剂联合使用。
(本发明的生物标志物)
本发明的生物标志物为用于评估包含CD4+T细胞、树突状细胞和/或CD8+T细胞的抗肿瘤免疫应答整体平衡的生物标志物，被认为是对肿瘤免疫其本身进行整体评估的物质。因此，本发明的方法可以说是对广范围的癌症种类有效。另外，本发明评估抗肿瘤免疫应答整体的平衡，因此能够预测出不仅对于针对PD-1·PD-L1的免疫检查点抑制剂有效，而且对于针对其他免疫检查点作用的抗癌治疗也有效。
在本发明中，代替CD62Llow，或者除了CD62Llow以外，也可以使用成为效应T细胞的指标的标志物、例如CCR7-。或者，还可使用CD45RA-和/或CD45RO+。例如，还可使用CD4+T细胞中的CD45RA-CD4+T细胞亚群的比例，和/或，CD4+T细胞中的CD45RO+CD4+T细胞亚群的比例。判明了LAG3、ICOS、PD-1的表达也能够以与CD62Llow相同的方式使用(可追加或可替换)。同样地，判明了CCR4表达与CD62Llow同样地使用(可追加或可替换)。
代替以实施例中使用的CD4+T细胞(CD62LlowCD4+T细胞)作为指标(或者，除此之外)，也可将骨髓树突状细胞(mDC)和/或浆细胞样树突状细胞(pDC)群中的表达HLA-DR和/或CD80和/或CD86的细胞的数量/比例作为指标。并且，认为树突状细胞上的PD-L1也可用作本发明的标志物。
另外，代替将实施例中使用的CD4+T细胞(CD62LlowCD4+T细胞)作为指标(或者，除此之外)，也可将在CD8+T细胞中表达CD137的细胞的数量/比例作为指标。
(本发明的机制)
尽管不受理论束缚，如示意性地示出本发明人提出的肿瘤部位中的抗肿瘤免疫应答现象，则如图9所示。图9中描述了在外周血可观察到的细胞即CD62LlowCD4+T细胞、骨髓树突状细胞(mDC)、浆细胞样树突状细胞(pDC)及CD62LlowCD8+T细胞，并且，描述了在这些细胞中表达的标志物分子即LAG-3、ICOS、PD-1、HLA-DR、CD80及CD137。PD-L1在树突状细胞中表达，PD-1在CD62LlowCD4+T细胞及CD62LlowCD8+T细胞中表达。
认为在抗肿瘤免疫应答中T细胞组成非常重要。例如，由CD62LlowCD4+T细胞引起的树突状细胞的刺激是重要的，CD62LlowCD4+T细胞不足够时(例如，效应T细胞和初始T细胞的平衡倾向于初始T细胞时)，即使给药免疫检查点抑制剂，也无法充分进行树突状细胞的刺激，其结果，无法充分进行抗肿瘤免疫应答。因此，CD4+T细胞中的CD62LlowCD4+T细胞的比例成为预测由免疫检查点抑制剂产生的抗肿瘤效果的指标。与CD62L相同地，CD4+T细胞中的CD45RA阴性CCR7阴性T细胞的比例也表示效应T细胞和初始T细胞的平衡，因此可用作本发明的指标。
另外，由CD4+T引起的树突状细胞的刺激通过HLA-DR进行，因此，当树突状细胞中的HLA-DR阳性细胞的比例降低时，即使给药免疫检查点抑制剂，也无法充分进行树突状细胞的刺激，其结果，无法充分进行抗肿瘤免疫应答。因此，树突状细胞中的HLA-DR阳性细胞的比例也成为预测因免疫检查点抑制剂带来的抗肿瘤效果的指标。
受到由CD4+T细胞产生的刺激的树突状细胞刺激CD8+T细胞，最终，受到刺激的CD8+T细胞发挥抗肿瘤活性。由树突状细胞引起的CD8+T细胞的刺激通过在树突状细胞上表达的CD80/CD86和CD8+T细胞上的CD137进行，因此，树突状细胞中的CD80阳性细胞的比例及CD8+T细胞中的CD137阳性细胞的比例均成为预测由免疫检查点抑制剂带来的抗肿瘤效果(长期无恶化存活)的指标。
除了从上述机制明确的生物标志物之外，CD4+T细胞中的LAG-3、ICOS、PD-1及CCR4也成为预测因免疫检查点抑制剂带来的抗肿瘤效果(长期无恶化存活)的指标。
在本发明中，将细胞亚群量与合适的基准进行比较，通过比较能够预测受试者在癌症免疫疗法中的长期存活。样品中的细胞亚群的量与基准相比增加可表示在受试者中预测出癌症免疫疗法中的长期存活。或者，样品中的细胞亚群的量与基准相比没有增加可表示在受试者中未预测出癌症免疫疗法中的长期存活。
作为基准，列举有例如癌症免疫疗法前的受试者的样品中对应细胞亚群的量，但不限定于此。此外，作为基准，还可使用由未接受癌症免疫疗法的受试者的样品实验性计算出的值等。
与基准相比增加可通过如下方式表示：癌症免疫疗法后的细胞亚群量为超过基准的量，或者增加超过基准的1、2、3、4、5、10、15、20、30％，或者增加超过基准的1.5倍、2倍、3倍、5倍。典型地，当超过基准值时，认为与基准相比增加。当实验性计算出基准时，在从基准值来看观察到超过合适误差的增加时，可作为与基准相比增加。作为合适误差，包括例如1个标准偏差、2个标准偏差、3个标准偏差或更多。
(放射治疗)
在本发明的实施方式中，提供由放射治疗引起的免疫激活的指标。在放射治疗中，可通过照射放射线来破坏癌症细胞的DNA或RNA以抑制细胞分裂，和/或可通过诱导细胞凋亡(细胞死亡)来减少癌症细胞。通常，将达到正常细胞允许剂量限度(约50～60Gy)的剂量进行分割(每天约2Gy)照射到组织上。正常细胞修复被破坏的基因并存活下来，但自我修复作用比正常细胞慢的癌症细胞在修复被破坏的基因之前被再次照射而无法修复基因，因此导致细胞死亡。由此，在照射视野中实现了肿瘤消退。
据报道，在放射治疗中，除了照射视野内的肿瘤消退之外，还会发生照射视野外的肿瘤消退，被称为远位效应。照射视野外的肿瘤消退无法用上述的放射线引起的癌症细胞的增殖抑制·细胞死亡来解释，被认为是通过某种免疫系统激活的作用，但对于具体机制还存在许多不清楚部分。认为通过由放射治疗产生的免疫系统激活可提高利用抗肿瘤免疫的癌症免疫疗法的有效性，但还未发现用于确认在接受过放射治疗的受试者中是否产生远位效应的生物标志物。在本说明书中提供一种生物标志物，其显示对接受过放射治疗的受试者中的照射视野之外产生影响的免疫激活(远位效应)。
放射线可大致分为电磁波和粒子束的两种类型。电磁波包括X射线、γ线等。粒子束为具有高动能流动的物质粒子，可以举出α射线、β射线、中子束、质子束、重离子束，中间束等。
作为放射治疗中的放射线的照射方法，可分为从体外照射放射线的“外部照射”和从体内向癌症或其周围照射放射线的“内部照射”。可组合使用外部照射和内部照射。
在外部照射中，从体外穿过皮肤照射放射线。最常用的方法是照射高能X射线。作为外部照射，可列举各种模式，包括但不限于例如直线加速器(直线加速器)的X射线照射、三维适形照射(3D-CRT)、调强放射治疗(IMRT)、定位放射治疗(SRT)、粒子束治疗(质子束治疗/重粒子束治疗)、图像诱导放射治疗(IGRT)等。
作为内部照射的模式，包括但不限于例如近距离放射治疗(组织内照射，腔内照射)或使用未密封的放射线同位素的治疗(内用疗法)等。
对于可以作为本发明对象的放射治疗，只要是在可以产生免疫激活的方式下的照射即可，其方式没有限定。例如，放射治疗中的照射视野可以为包括肿瘤组织的照射范围。尽管不受理论束缚，但认为接受过放射治疗的肿瘤细胞产生免疫原性细胞死亡的这一点对抗肿瘤效应T细胞的增加很重要。例如，放射治疗可列举胸部放射线照射、对骨转移部位的放射线照射、对淋巴结转移的放射线照射、对肾上腺转移的放射线照射、对肝转移的放射线照射、对脑转移的放射线照射等。
本发明的生物标志物可用于研讨旨在产生免疫激活的放射治疗计划。例如，通过受试者中未产生由放射治疗引起的免疫激活，可表示应向受试者再次施用放射治疗。或者，通过在受试者中产生由放射治疗引起的免疫激活，可表示应终止放射治疗。
放射治疗可以在每天约1～2次以约1～3Gy的剂量/次照射，进行3周～8周。然而，对于小剂量的多次照射，当研讨与癌症免疫疗法的联合使用时，还会影响免疫细胞(例如，T细胞)，因此优选寡分割照射法(例如，在1～2周内进行少次大剂量照射)。
由于放射治疗中产生副作用的可能性减少，因此在显示发生免疫激活的时间点不用进行另外的放射治疗。尤其，当增加每次的剂量时，在不进行不必要的照射的情况下产生免疫激活是有利的。以往，无法监测什么时间产生免疫激活，而是根据预先凭借经验确定的时间表进行放射治疗，然而根据本发明的生物标志物，可确定终止放射治疗的适当时间。
(细胞的分级/分离)
可通过常规方法从受试者适当地收集用于T细胞的分级/分离的样品。例如，可以从受试者的外周血、骨髓、肿瘤组织、造血组织、脾脏、正常组织、淋巴液等进行。从外周血收集样品是非侵入性的且方便，因此是有利的。
本领域普通技术人员可通过常规方法测量受试者的样品中的T细胞的组成。通常，对于规定样品中的靶细胞亚群的标志物(例如，CD4)，可使用流式细胞术等来测量作为阳性的细胞数量。流式细胞术通常用于测量细胞群的组成，但除此之外，还可使用含有细胞的样品的免疫染色、使用抗体阵列的方法、含有细胞的样品中的蛋白质表达分析(例如，蛋白质印迹(Western blot)、质量分析、HPLC等)、含有细胞的样品中的mRNA表达分析(例如，微阵列、下一代测序等)等。
为了测量CD62LlowCD4+T细胞亚群等的每个细胞亚群的细胞数，可以从总细胞实验性地排除每个细胞的亚群以外的细胞。有一种试剂盒可以实现它。例如，当使用CD4+Effector Memory T cell分离试剂盒、人(Militenyi Biotech公司)时，可在不使用CD4抗体和CD62L抗体的情况下从外周血分离出与CD4+CD62Llow T细胞亚群相当的细胞。对总的活细胞数进行计数和记录，另外可对使用该试剂盒获得的细胞数量进行计数和记录。
另外，可以不使用抗体。抗体可特异性识别并结合单个细胞中表达的分子，进而当抗体与细胞表面上或细胞内部中表达的分子结合时显色从而进行检测，并对显色的细胞数量进行计数。其中，这些细胞表面上或细胞内部表达的分子为蛋白质，因此，当表达该蛋白质时，编码该蛋白质的mRNA也在细胞内部形成。即，可检查单个细胞内部的mRNA检查编码目标蛋白质分子的mRNA的有无。这通过单细胞基因表达分析，即单细胞水平的mRNA分析实现的。作为单细胞的基因表达分析，包括例如，1)使用Quartz-Seq进行下一代测序的方法、2)使用Fluidigm C1 System或ICELL8 SIngle-Cell System分离细胞并使用SMART-Seq v4制备基因库的方法、3)使用细胞分选仪分离细胞、使用Ambion Single Cell-to-CT试剂盒用定量PCR测量的方法、4)CyTOF SYSTEM(Helios公司)等。
获得血液，对活细胞数进行计数，使用细胞分选仪等分离细胞，针对所分离的各个细胞，可使用例如Ambion Single Cell-to-CT试剂盒，针对特定基因通过定量PCR法的装置来测量表达量。基于该结果，调查各个细胞对应于CD62LlowCD4+T细胞亚群等的哪个亚群，并计数对应于每个亚群的细胞的数量。作为调查表达的基因的候选，包括αβTCR、CD3、CD4、CD25、CTLA4、GITR、FoxP3、STAT5、FoxO1、FoxO3、IL-10、TGFbeta、IL-35、SMAD2、SMAD3、SMAD4、CD62Llow、CD44、IL-7R(CD127)、IL-15R、CCR7low、BLIMP1等。
例如，在CD62LlowCD4+T细胞中，作为与CD62LhighCD4+T细胞相比表达更亢进的基因，可以举出AURAKA、CCL17、CD101、CD24、FOXF1、GZMA、GZMH、IL18RAP、IL21、IL5RA、ND2、SMAD5、SMAD7及VEGFA(WO2018147291)。通过调查这些基因的表达，可判定所取得的T细胞属于哪个T细胞亚群，可测量细胞亚群的量和/或比例。
另外，在CD62LhighCD4+T细胞中，作为与CD62LlowCD4+T细胞相比表达更亢进的表达的基因，可以举出BACH2、CCL28、CCR7、CD27、CD28、CD62L、CSNK1D、FOXP1、FOXP3、IGF1R、IL16、IL27RA、IL6R、LEF1、MAL及TCF7(WO2018147291)。通过调查这些基因的表达，可判定所取得的T细胞属于哪个T细胞亚群，可测量细胞亚群的量和/或比例。
本发明中，可使用具有规定信号的标准样品进行细胞亚群的比例的测量或与阈值的比较。将以产生与规定细胞亚群对应的荧光信号的方式进行配制的标准(例如，附着有荧光色素的颗粒)与包含细胞群的样品之间的信号进行比较，并且通过与标准的比较，来测量样品中的细胞亚群的量或比例。另外，将以产生与规定阈值对应的荧光信号的方式进行配制的标准(例如，附着有荧光色素的颗粒)与包含细胞群的样品之间的信号进行比较，并且通过与标准的比较，来判定样品中的T细胞组成中的本发明的标志物的有无或量。
在本发明中，就特定的标志物而言，当判定high(高表达)或low(低表达)时，本领域普通技术人员可使用本技术领域常规使用的表达强度的分类标准来进行。例如，就CD62L而言，将与使用PE标记抗人CD62L抗体时的10E2信号对应的信号强度作为边界，可清楚地划分CD62Llow和CD62Lhigh(WO2018147291)。
本发明的生物标志物可用于是否开始联合疗法或者研讨联合疗法的计划。例如，当在受试者中未预测出癌症免疫疗法中的长期存活时，表明应对受试者施用联合疗法。或者，当在受试者中预测出癌症免疫疗法中的长期存活时，表明不进行联合疗法。
或者，为了降低在联合疗法中产生副作用的可能性，作为联合疗法的结果，在预测到长期存活的时间点中止另外的联合疗法。
(癌症免疫疗法)
癌症免疫疗法是指使用生物所具有的生物防御机制来治疗癌症的方法。癌症免疫疗法中大致分为通过增强对癌症的免疫功能进行的癌症免疫疗法和通过抑制癌症的免疫回避功能进行的癌症免疫疗法。并且，癌症免疫疗法中包括：在体内激活免疫功能的主动免疫疗法；和通过在体外激活免疫功能的或将增殖的免疫细胞返回体内而进行的被动免疫疗法。根据本发明的生物标志物，指示癌症免疫疗法中的长期存活的预测，由此可知道是否施用联合疗法或者知道进行联合疗法的优选时机。
作为癌症免疫疗法的示例，包括非特异性免疫活化剂、细胞因子疗法、癌症疫苗疗法、树突状细胞疗法、过继免疫疗法、非特异性淋巴细胞疗法、癌症抗原特异性T细胞疗法、抗体疗法、免疫检查点抑制疗法等。
免疫检查点抑制剂的典型示例为PD-1抑制剂。作为PD-1抑制剂，包括但不限于作为抗PD-1抗体的纳武单抗(Nivolumab，以OPDIVOTM出售)及派姆单抗(Pembrolizumab)、以及斯巴达珠单抗(Spartalizumab)及西米普利单抗(Cemiplimab)。在一优选实施方式中，可选择纳武单抗作为对象。
在本发明中，PD-L1抑制剂也可与PD-1抑制剂相同地使用。抗PD-1抗体被认为通过消除由PD-1信号引起的T细胞激活的抑制而发挥抗癌症效果。抗PD-L1抗体也被认为通过消除由PD-1信号引起的T细胞激活的抑制而发挥抗癌症效果。虽然PD-1抑制T细胞功能的机制尚未完全阐明，但PD-1(程序性死亡，programmed death 1)与PD-L1或者PD-L2相互作用时，作为酪氨酸脱磷酸酶的一种的SHP-1，2被募集到PD-1的胞质域中，通过使作为T细胞受容体信号转导蛋白质的ZAP70不活化，来抑制T细胞的激活(Okazaki,T.,Chikuma,S.,Iwai,Y.etal.:A rheostat for immune responses:the unique properties of PD-1and theiradvantages for clinical application.Nat.Immunol.,14,1212-1218(2013))。认为这是因为SHP-1，2被募集到所谓ITSM基序的部分中，使附近的T细胞受体的近端信号激酶(proximal signaling kinase)去磷酸化，换言之，也可以说，从受到抗原刺激的T细胞抹去该“受到抗原刺激”的记忆。
PD-1在浸润至癌症组织的杀伤性T细胞和自然杀伤性细胞中以高水平表达。另外，认为通过肿瘤上的PD-L1，介导由PD-1产生的PD-1信号的免疫应答减弱。通过PD-L1，介导该PD-1信号的免疫应答减弱，但是通过抗PD-1抗体来抑制PD-1与PD-L1之间的相互作用和/或因相互作用产生的信号转导时，可获得抗肿瘤免疫应答的增强效果。
作为免疫检查点抑制剂的其他示例，可以举出PD-L1抑制剂(例如，作为抗PD-L1抗体的阿维鲁单抗(Avelumab)、德瓦鲁单抗或阿替利珠单抗(Atezolizumab))。
PD-L1抑制剂将上述的PD-1通路结合在PD-L1侧并进行抑制，并且抑制PD-1与PD-L1之间的相互作用和/或通过相互作用而产生的信号转导，以产生抗肿瘤免疫应答。
作为免疫检查点抑制剂的其他示例，可以举出CTLA-4抑制剂(例如，作为抗CTLA-4抗体的伊匹单抗(Ipilimumab)或曲美木单抗)。CTLA-4抑制剂激活T细胞，产生抗肿瘤免疫应答。T细胞由表面的CD28与CD80或CD86相互作用而被激活。然而，认为即使为暂时被激活的T细胞，表面表达的CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4))以高于CD20的亲和力与CD80或CD86相互作用，从而抑制激活。CTLA-4抑制剂通过抑制CTLA-4来防止CD20与CD80或CD86之间的相互作用被抑制，由此产生抗肿瘤免疫应答。
在另一实施方式中，免疫检查点抑制剂可以靶向TIM-3(T-cell immunoglobulinand mucin containing protein-3、LAG-3(lymphocyte activation gene-3、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)、或TIGIT(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domain)等免疫检查点蛋白质。
虽然认为如上所述的免疫检查点抑制对自身组织的免疫应答，但在病毒等抗原长期存在于生体内的情况下，T细胞中免疫检查点也会增加。对于肿瘤组织也是长期存在于生体内的抗原，因此，认为通过这种免疫检查点来避免抗肿瘤免疫应答，如上所述的免疫检查点抑制剂使这种回避功能失效，而具有抗肿瘤效果。
在本发明中，联合疗法为与适当的其他癌症治疗组合的治疗方法，典型地，可以为与一种或多种另外药剂的组合给药。或者，联合疗法可以为与放射治疗的组合。一种或多种另外药剂可以为任意的化疗药物，或者可包含第二免疫检查点抑制剂。或者，作为在联合疗法中使用的其他癌症治疗，包括但不限定于其他癌症免疫疗法(例如，过继细胞转移)、温热疗法、外科程序等。
在本发明一实施方式中，对预测出在癌症免疫疗法中长期存活的患者提供包含免疫检查点抑制剂的组合物。本发明的包含免疫检查点抑制剂的组合物通常以口服或肠胃外形式全身或局部给药。通过本说明书中描述的方法，本发明的包含免疫检查点抑制剂的组合物给药受试者，由此预测出癌症免疫疗法中的长期存活。
给药量根据年龄、体重、症状、治疗效果、给药方法、治疗时间等而不同，但通常例如，每位成人在一次以0.1mg至100mg的范围内一天口服给药1次至多次，或者每位成人在一次以0.01mg至30mg的范围内一天肠胃外给药(优选地，静脉给药)1次至多次，或者一天在1小时至24小时的范围被静脈持续给药。当然，给药量根据各种条件而有变动，因此有可能少于上述的给药量，或者需要超过上述范围。
包含免疫检查点抑制剂的组合物在给药时可制成用于口服给药的内服用固体制剂、内服用液体制剂及用于肠胃外给药的注射剂、外用制剂、栓剂等剂型。用于口服给药的内服用固体制剂中包含片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂等。胶囊剂中包含硬胶囊和软胶囊。
本发明的组合物根据需要可以直接使用一种或多种活性成分(例如，针对免疫检查点蛋白质的抗体)，或与赋形剂(乳糖、甘露醇、葡萄糖、微晶纤维素、淀粉等)、粘合剂(羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、偏硅酸铝酸镁等)、崩解剂(纤维素乙醇酸钙等)、润滑剂(硬脂酸镁等)、稳定剂、增溶剂(谷氨酸、天冬氨酸等)等混合以常规方法配制使用。另外，根据需要，可用包衣剂(蔗糖、明胶、羟丙基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素等)包覆，或者用2层以上包覆。并且，还包含可吸收物质的胶囊，例如，明胶。
当本发明的组合物配制成内服用液体制剂以用于口服给药时，包括药学上可接受的水性剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂、酏剂等。在这种液体制剂中，一种或多种活性物质溶解、悬浮或乳化在常用的稀释剂(纯净水、乙醇或其混合物等)中。另外，该液体制剂可包含润湿剂、悬浮剂、乳化剂、甜味剂、调味剂、香味剂、防腐剂、缓冲剂等。
作为用于肠胃外给药的注射剂，包含溶解或悬浮于溶液、悬浮液、乳液及使用时溶剂中的固体注射剂。注射剂通过将一种或多种活性物质溶解、悬浮或乳化在溶剂中来使用。作为溶剂，可使用例如注射用蒸馏水、生理盐水、植物油、诸如丙二醇、聚乙二醇、乙醇这样的醇类以及它们的组合。并且，上述注射剂可包含稳定剂、增溶剂(谷氨酸、天冬氨酸、聚山梨醇酯80(注册商标)等)、悬浮剂、乳化剂、舒缓剂、缓冲剂、防腐剂等。这些在最后工序中通过灭菌或无菌操作来进行配制。另外，制备无菌的固体制剂、例如冻干制品，并在使用前溶解于无菌化或无菌的注射用蒸馏水或其他溶剂中。
(癌症)
作为本发明靶向的癌症，包括但不限于黑色素瘤(恶性黑色素瘤)、非小细胞肺癌、肾细胞癌、恶性淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤)、头颈癌、泌尿系统癌症(膀胱癌、尿路上皮癌、前列腺癌)、小细胞肺癌、胸腺癌、胃癌、食道癌、胃食管交界处癌、肝癌(肝细胞癌、肝内胆管细胞癌)、原发性脑肿瘤(胶质母细胞瘤、中枢神经系统原发性淋巴瘤)、恶性胸膜间皮瘤、妇科癌症(卵巣癌、宫颈癌、子宫体癌)、软肉瘤、胆道癌、多发性骨髓瘤、乳腺癌、结肠癌等。
(试剂盒)
在本发明一实施方式中，提供一种试剂盒，用于判定受试者中能否预测出癌症免疫疗法中的长期存活。试剂盒可包含针对适当分子的一种或多种检测剂以检测本说明书中描述的细胞亚群。可将这种检测剂的组合用于受试者的T细胞组成的确定。这种试剂盒可用于测量受试者中作为本说明书中描述的新型生物标志物的特定细胞亚群的比例。
在本发明一实施方式中，试剂盒可包含针对以下物质的检测剂：
CD4及CD62L；
(i)选自ICOS、PD-1、LAG-3及CD28中的标志物、(ii)CD4以及(iii)CD62L；
CD11c、CD141及HLA-DR；或者
CD8、CD62L及CD137。
在一实施方式中，检测剂为抗体。优选地，抗体被适当地标记使标志物易于检测。
实施例
以上，示出优选实施方式来进行了描述以易于理解本发明。以下，基于实施例描述本发明，但上述的说明和以下的实施例仅以示例性的目的而被提供，而不是以限定本发明的目的来提供。因此，本发明的范围不限于本说明书中具体描述的实施方式和实施例，仅由发明要求保护范围来进行限定。
(材料及方法)
(1)患者
从2016年2月至2018年8月期间，来自单一机构(埼玉医科大学国际医学中心)具有NSCLC的171名的持续性患者参加了本研究。登录后，28名的患者因无法获得能够评估的PBMC样本而被排除；并且，17名患者在纳武单抗疗法9周后无法评估其抗肿瘤效果而被排除。将患者的数据分为两部分，获得了40名患者的发现队列和86名患者的独立验证队列。在以下表1中列举了患者的特征和应答。
[表1]
Figure BDA0003310853940000571
Sq是指扁平上皮癌。c-III期/c-IV期是指癌症的临床分期。EGFR是指表皮生长因子受容体。del是指缺失突变。ALK是指间变性淋巴瘤激酶。
患者每2周接受一次3mg/kg体重用量的纳武单抗。在第9周和此后每8周使用实体瘤反应评估标准(RECIST；Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)1.1版本(version1.1)评估了肿瘤应答。数据采集的截止日期为为2018年11月13日。在获得埼玉医科大学国际医学中心的临床试验审查委员会批准的书面知情同意之后采集了样本。
(2)血液样本的分析
采集样本至添加肝素的CPT VacutainerTM管((Becton Dickinson VacutainerSystems,Franklin Lakes,NJ)中，并在室温下以1500×g离心20分钟，在Ficoll梯度上从红细胞和粒细胞分离PBMC。将PBMC在Cellbanker2TM(Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd.,Koriyama,Japan)中于-80℃冷冻，冷冻细胞在1周内转移到液氮罐中。为了分析T细胞的亚群，在染色细胞之前，在培养基中孵育细胞32～48小时。
为了FACS CaliburTM，使用以下mAb对细胞进行染色：fluoresceinisothiocyanate(FITC)-conjugated anti-CD3(HIT3a)和anti-CD4(RPA-T4)、phycoerythrin(PE)-conjugated anti-CD8(RPA-T8)和anti-CD25(M-A251)、PE-Cy7-conjugated anti-CD25(M-A251)、PE-Cy5-conjugated anti-CD62L(Dreg56)(所有BDPharmingen，San Diego，CA)和FITC-conjugated anti-CD62L(Dreg56)(eBioscience，Wien，Austria)。在下表2中列举使用LSR FortessaTM和质谱流式细胞术分析的单克隆抗体。
[表2]
Figure BDA0003310853940000591
BD是指Becton Dickinson&Company的产品。BL是指BioLegend公司产品。eBIO是指eBioscience公司产品。ENZ是Enzo Life Sciences公司产品。
通过用fluorophore-conjugated mAb对1×106细胞进行直接免疫荧光染色来分析细胞细胞表面表型。门控策略如图19及20所示。使用FACS CaliburTM和LSR FortessaTM流式细胞仪(Becton Dickinson,Sunnyvale,CA)和FlowJoTM软件，从各样本分析了10000个细胞。并且，使用CyTOFTM(Fluidigm Corp.,San Francisco,CA)质谱仪和CytobankTM软件分析20000细胞以获得viSNE分析。
(3)细胞的提纯
从各应答组(PR、SD及PD)的2名患者采集PBMC。CD4+T细胞通过人CD4+T细胞分离试剂盒(Dynal Biotech,Oslo,Norway)进行阴性选择以进行纯化。并且，根据制造商的指示顺序，使用anti-CD62L mAb-coated microbeads及MACSTM system(Miltenyi Biotec,Auburn,CA))，将CD4+T细胞分离为CD62Lhigh细胞和CD62Llow细胞。细胞的纯度均为＞90％。
(4)微阵列分析
从各应答者类型的2名患者中提纯PBMC中的CD62LhighCD4+T细胞及CD62LlowCD4+T细胞，并使用TRIzol reagent(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)分离了总RNA。然后，合成cDNA和cRNA，根据制造商指示，使用WT Plus Reagent Kit(Thermo FisherScientific)标记单链cDNA(ssDNA)。将总RNA(0.5μg)逆转录成cDNA，然后合成了A。并且，从15μg的cRNA逆转录ssDNA，之后标记；在GeneChip Hybridization Oven 645中，使用微阵列(Clariom S Assay,human；Thermo Fisher Scientific)，对1.8μg的标记ssDNA进行杂交。使用GCS3000 7G System(Thermo Fisher Scientific)扫描杂交后的阵列。基因表达数据的登录号ID为GSE103157。
为了从两组基因表达数据中鉴定基因表达特征，如下所示推定两组间的基因表达的差异。首先，针对探针的所有值进行异常值测试，并且使用排除异常值的探针值的均值和方差，计算各探针的z分数。为了比较两个基因组的z分数，将各基因的z分数转换为概率，并且在下面计算了各基因概率的两组之间差异(pd)：
式1
Figure BDA0003310853940000601
式中，比较了两个基因组(a，b)之间的第k个基因。在该分析中，选择成为下述式2的基因作为基因特征。
式2
Figure BDA0003310853940000602
(4)统计分析
为了进行统计分析，使用SAS 9.4(SAS Institute Inc.,Cary,NC)及Prism 8(GraphPad,La Jolla,CA)。除非另有说明，以平均值±平均值的标准误差表示数据。对2组之间的差异的检验使用了Student's t检验。多组比较中使用了one-way ANOVA。使用发现队列的数据和逻辑回归模型，开发了预测式。使用独立的验证队列的数据，评估预测式的性能。使用Kaplan-Meier法估计生存期曲线。所有P值为两侧，P＜0.05被认为在统计学上具有显著性。
(实施例1：纳武单抗治疗过程)
针对已治疗进展期肺癌患者用抗PD-1抗体即纳武单抗进行了治疗的患者从治疗开始至5年后的过程，基于图1所示的Brahmer等人(Five-year follow-up from theCA209-003 study of nivolumab in previously treated advanced non-small celllung cancer：clinical characteristics of long-term survivors.Presented at：2017AACR Annual Meeting；April 1-5，2017；Washington，DC.Abstract CTO77)，发明人进行了研讨。
在左图中，表示总生存期的曲线从第3年左右开始没有下降，5年生存率占总数的16％。右图的泳道图(Swimplot)蓝条表示的为治疗期间。在该临床试验中，治疗在2年内结束但存活了5年的16名中的12名(#1，2，3，4，6，7，8，9，10，11，12，及13)在纳武单抗治疗结束后，在没有接受任何治疗的情况下存活了3年以上且无恶化。在如此以抗PD-1抗体接受治疗的患者中，可知有一些患者可以获得“类治疗”的效果，即，即使中止治疗也不会复发复现。据报道，有许多黑色素瘤患者在10年没有进行治疗的情况下没有复发。
图2为由Brahmer等人(N Eng J Med 2015：373：123-135)修改的图表。图1中看到的长期无恶化存活组在图2的无恶化存活曲线中构成18个月后看到的尾部平台(TailPlateau)。该尾部平台表示约5年的总生存期。另一方面，应理解存在疾病在不到3个月内早期恶化的“无效组”和虽然获得抗肿瘤效果从常规治疗的PFS曲线远离但中途病势恶化的“短期响应组”。
基于这些分析可以理解，在以抗PD-1抗体接受治疗的患者之中，以约10～20％的比例，存在“长期无恶化存活组”，该组长时间地显现“类治疗”的效果(即，即使中止治疗也不会复发复现)。应理解，若能够鉴定该“长期无恶化存活组”(LS)，则可以适当判断是否需要联合治疗、联合疗法开始时间、或者联合疗法的中断/中止时期。
(实施例2：FACS Calibur分析)
使用以下顺序进行FACS Calibur分析。
(1)从采血到冷冻保存
-在Becton-Dickinson公司(BD公司)制造的两个7～8mL真空采血管(含有肝素)中采血约14～16mL。
-采完血后2小时～半天内，在室温(18～25℃)下以3200rpm离心20分钟。
-采集血浆后，将残留在凝胶屏障上层的血浆成分和细胞成分通过移液器搅拌并采集，并收集在50mL离心管中(从两个采血管集中在1个中)。加入了所收集的液量(约13mL)和同等量的PBS(+10％FBS)。
-在4℃下，以1600rpm离心5分钟。
-离心之后丢弃上清液，并悬浮在4.5ml的日本宝生物公司制造的cellbanker 2溶液中。
-2.0ml的低温小瓶(外部螺旋盖的圆底)中分别注入了悬浮在cellbanker 2液中的细胞1.5ml(总共3个)。然后，放入BiCell(程序冷冻用容器)中，并储存在-80℃的低温冷冻箱。
-在储存1周以上的情况下，储存在液氮罐中。
(2)从解冻到FMC分析
-取出低温瓶，使用约37℃温水快速解冻。
-将细胞收集在50ml离心管中，加入HBSS制成50ml。
-在4℃下，以1600rpm离心5分钟。
-离心之后丢弃上清液，并用HBSS悬浮细胞。并且，加入HBSS制成50ml，采集50μl并计数细胞数。
-在4℃下，以1600rpm离心5分钟。
-加入CM(RPMI1640+10％FCS)成为1×106细胞/ml，转移到培养皿中，在培养箱中培养36～48小时。
-将培养液转移至50ml的离心管中，计数细胞数，在4℃下，以1600rpm离心5分钟。
-离心后丢弃上清液，用FACS缓冲液使细胞悬浮。基于细胞数计数，加入FACS缓冲液以成为0.3～1×106细胞/ml。FACS用管中加入细胞悬浮液各1ml。
-在4℃下，以1600rpm离心5分钟。
-离心后丢弃上清液，并保留约100μl上清液。使用涡流器等破坏细胞沉淀物，在每个FACS管上做标记之后，按照方案加入抗体溶液，并在4℃下静置30～60分钟。
-向FACS管中加入2ml FACS缓冲液，在4℃下，以1600rpm离心5分钟。
-离心后丢弃上清液，加入0.5ml的1％PFA并用涡流器等破坏沉淀以进行FCM分析。
-将细胞悬浮在FACS缓冲液中。基于细胞数计数加入FACS缓冲液以使制成0.3～1×106细胞/ml。向FACS用管中加入细胞悬浮液各1ml。
用于FACS Calibur分析的抗体和标记的组合如下。
[表3]
T细胞用
FITC PE fl3
1 CD4 CD62L CD8
2 CD4 PD-1 CD62L
3 CD4 LAG-3 CD62L
4 CD4 ICOS CD62L
5 CD4 CD62L CD28
6 CD4 CD137 CD62L
7 CD62L PD-1 CD8
8 CD62L CD137 CD8
9 CD8 CD62L CD28
10 CD4 foxp3 CD25
DC用
FITC PE fl3
1 CD141 同型对照 CD11c
2 CD141 HLA-DR CD11c
3 CD141 CD80 CD11c
进行FACS Calibur分析，疾病在早期恶化的无效组(non-responder组)和除此之外的响应组(responder组)中的CD62LlowCD4+T细胞比例示于图3的左侧中。在响应组中，具有高于无效组的CD62LlowCD4+T细胞比例，但是，响应组中存在一组具有大于40％的CD62LlowCD4+T细胞比例的组(图3的左侧)。
从响应组中分出持续18个月以上无恶化状态的患者组(LS组)和暂时响应之后病势恶化的暂时响应后病势恶化组(R组)，在图3的右侧示出CD62LlowCD4+T细胞比例的制图结果。可知，从具有大于40％的CD62LlowCD4+T细胞比例的一组出现长期无恶化存活组。
(实施例3：ROC分析及PFS绘制)
在图4的左侧示出对实施例2中获得的数据进行ROC分析的结果。即，将18个月以上无恶化存活组进行分层分析中，以P值0.0008显示在将CD62LlowCD4+T细胞比例＞35.85用作阈值时能够以敏感度85.7％、特异性83.3％进行预测。AUC也为非常良好的0.896。
将CD62LlowCD4+T细胞比例作为横轴、将无恶化存活日数(PFS(天))作为纵轴进行制图的结果示于图4的右侧。CD62LlowCD4+T细胞比例小于20％时示出大部分为早期病势恶化组，为35.85％以上时半数以上为长期存活组。
这些结果表明，CD62LlowCD4+T细胞比例为用于预测癌症免疫疗法中的长期存活的优异的生物标志物。
(实施例4：应答者与非应答者之间的CD62LlowT细胞亚群的比例的差异)
本研究中参加了171名NSCLC的持续性患者，这些患者从2016年2月至2018年8月在单一机构(埼玉医科大学国际医学中心)使用纳武单抗进行了治疗(图10a)。本研究为实际治疗的观察研讨，因此，所有患者在纳武单抗疗法之前，根据日本药物品的产品文件，通过细胞破坏性化学疗法进行预先治疗。登录后，因未能获得可评估的PBMC样本，故而排除了28名患者；并且，因为从纳武单抗疗法开始在9周后无法评估其抗肿瘤效果，因此排除了17名患者。在表1中列举发现队列及验证队列中所包括的所有患者的特征。为了识别用于区分显现初期疾病进展的患者的生物标志物，发明人在纳武单抗疗法9周后的时间点进行了计算机断层扫描(CT)评估，将显现疾病进展的患者设为“非应答者”，将显现完全响应(CR)、部分响应(PR)或疾病稳定(SD)的患者设为“应答者”。尤其，在治疗后直至9周显现初期疾病进展的患者的生存期显著短暂，而另一方面，SD患者和PR患者显现出理想的总生存期(OS)(图16)。非应答者中大致包括不受因纳武单抗疗法带来的延长生命效果的患者组。因此，基于研讨数据分析了34个参数(包括白细胞、淋巴细胞及中性粒细胞的数量；IgG、IgA、IgM、IgE及IgD的血清免疫球蛋白水平；癌症胎儿抗原和细胞角蛋白19片段的肿瘤标志物；以及抗核抗体、类风湿因子、AST、ALT、LDH及CRP的生化数据)。然而，应答患者与非应答患者之间未发现显著差异。
近年来，证实了在肿瘤、肿瘤流入区域(LN)及外周血等中，由CD62LlowCD44+CD69+CD90+CD27lowT-bet+CD4+T细胞的部分群组成的全身性T细胞的免疫性是抗肿瘤免疫应答所必需的。并且，已发现大量表型CD4+T细胞为人类黑色素瘤浸润淋巴细胞中的3个抗肿瘤T细胞簇之一。因此，本发明人在NSCLC患者的外周血中对该T细胞的部分群，尤其是CD62Llow部分群进行了调查。
其结果，与非应答者相比，在应答者中，CD4+T细胞的全组中的CD62Llow细胞的比例(图10的b部分，P＜0.0001)和CD8+T细胞的全组中的CD62Llow细胞的比例(图10的c部分，P＝0.0020)显著更高。另一方面，在非应答者中(图10的d部分)，总CD4+T细胞群中的CD25+FOXP3+细胞的比例显著更高(P＝0.034)。本发明人选择总CD4+T细胞群中的CD62Llow细胞的比例作为独立因素之一。这是因为观察到了很大的差异。作为构成与CD62LlowCD4+T细胞簇不同的T细胞簇的、与临床结果呈负相关的其他因素，还选择了总CD4+T细胞群中的CD25+FOXP3+细胞的比例。为了检测非应答患者，使用逻辑回归模型(包括所选择的两个因素)，并获得了下式：
[-31.3+12.0×log[％总CD4+T细胞群中的CD62LlowT细胞：X]-6.1×log[％总CD4+T细胞群中的CD25+FOXP3+T细胞:Y]]；
该式可以与[-31.3+6.0×log(X2/Y)]近似。因此，本发明人获得了使用X2/Y作为式中变量的预测式。
(实施例5：预测纳武单抗应答的式子的值)
本发明人定义关于应答者和非应答者的预测式的值(图10的e部分，P＜0.0047)，并且为了在9周时检测发现队列中的非应答者，进行接收者操作特性(ROC)分析(图10的f部分)。当将预测式的阈值设为192时(这是使ROC曲线的相似比为最大的点)，灵敏度和特异性分别为85.7％和100％。对于通过纳武单抗治疗前采集的PBMC的分析而被确定为应答者类型的患者(X2/Y≥192)和被确定为非应答者类型的患者(X2/Y＜192)，绘制了无恶化生存期(PFS)曲线和OS曲线(图10的g部分、h部分)。发现队列中的应答者和非应答者(阈值＝192)在PSF及OS的两个点显著差异(P＜0.0001)。接着，本发明人验证，在包括86名持续性患者的独立的验证队列中，该预测式的阈值(X2/Y＜192)是否能够区分非应答者：与验证队列中的非应答患者相比，预测式的值在应答者时显著(P＝0.0008)高(图10的i部分)。在验证队列中，应答者类型的患者与非应答者类型的患者相比呈现出显著长的PSF(图10的j部分，P＜0.0001))和OS(图10的k部分，P＜0.0001))。包括无法评估在第9周的肿瘤应答的患者的数据在内的所有存活数据(n＝143)，在非应答类型的患者与应答者类型的患者之间显示显著差异(图16c、d)。为了在第9周检测验证队列(n＝86)中和所有可评估的患者中(n＝126)的非应答者，还进行了预测式的ROC分析(图16e，f)。当预测式的阈值设为192时，灵敏度和特异性在验证队列中为92.9％和72.1％(P＜0.0001)，所有可评估患者中为87.5％和81.2％(P＜0.0001)。从患者(n＝126)获得的组织调查结果与客观应答及预测式的结果之间的关联示于下表4中。
[表4]
Figure BDA0003310853940000671
客观应答和预测式的结果示于上述的表中。对于非应答者类型及应答者类型，分别为根据预测式计算的结果小于192及192以上的患者。Sq是指扁平上皮癌。Driver wt是指EGFR和ALK为野生型。Driver mt+中包括19名携带EGFR激活突变的患者和1名携带ALK融合基因突变的患者。
如下表5中所示，通过多变量分析，明确了预测式作为与PFS和OS相关的独立因素。
[表5]
Figure BDA0003310853940000672
缩写：PS，性能状态；HR，风险比；95％CI，95％置信区间
PS是指性能状态。HR是指风险比。95％CI是指95％置信区间。
(实施例6：CD62LlowCD4+T细胞的部分群和其他T细胞部分群)
目前尚不清楚CD62L的单个标志物如何区分预测了PD-1阻断疗法的抗肿瘤应答的CD4+T细胞的部分群。因此，为了定义CD62LlowCD4+T细胞的部分群，并研究CD62LlowCD4+T细胞的部分群与其他T细胞部分群之间的关联，本发明人除了FCM分析外还进行了质谱流式细胞术和微阵列分析。首先，分析了T细胞部分群的比例之间的相关性。CCR7和CD45RA均可用作区分CCR7+CD45RA+初始T细胞、CCR7+CD45RA-中央记忆细胞(CM)、CCR7-CD45RA-效应记忆T细胞(EM)及CCR7-CD45RA+效应T细胞(EMRA)的基准。因此，本发明人研究了这些与CD62LlowCD4+T细胞的部分群之间的相关性。CD8+T细胞通过CD45RA和CCR7的表达，清楚地分为四个部分群，外周血中的CD4+T细胞显示出缺乏CD45RA+CCR7-部分群的不同模式(图11的a部分、b部分)。CD62LlowCD4+T细胞的比例与CCR7-CD45RA-EM部分群呈正相关(P＜0.0001)，但与其他CCR7+CD45RA-/+部分群显著呈负相关(图11的c部分，d部分)。CCR7-CD45RA-CD4+T细胞的部分群和CD62LlowCD4+T细胞的部分群包含相似的T细胞的部分群。然而，纳武单抗治疗后的临床结果与CCR7-CD45RA-CD4+T细胞的比例不相关(图17的a部分、b部分)。接着，本发明人研究了与1型(Th1)T细胞、2型(Th2)T细胞及1型7(Th17)辅助T细胞以及T滤泡辅助(Tfh)细胞的相关性。CD62LlowCD4+T细胞的部分群与CXCR3+CCR4-CCR6-的经典Th1部分群具有强相关(P＜0.0001)，但与CXCR3-CCR4+CCR6-的Th2部分群呈负相关(图11e-h))(P＝0.0013)。CD62LlowCD4+T细胞的部分群还与CD8+T细胞呈正相关(图11i))(P＜0.0001)，还与效应CD8+T细胞的部分群的比例呈正相关(图11j))(P＝0.0091)。有趣的是，CCR7-CD45RA-CD4+部分群与Th1部分群呈弱相关(P＝0.01)，但不与Th2组相关(图17的c-e部分))。与这些结果一致，通过质谱流式细胞术分析，CD62LlowCD4+簇和CCR7-CD4+簇不相同(图12a)。通过针对门控的CD4+CD3+T细胞的无监督聚类分析可知，大部分CD62LlowCD4+T细胞的部分群属于CD27-T-bet+FOXP3-CXCR3+CCR4-CCR6-部分群。另一方面，CD45RA-CCR7-部分群范围更广，包含CD27+、T-bet-及FOXP3+的部分群。为了示出分子的平均表达量而进行热图分析，结果发现，与CD45RA-CCR7-CD4+T细胞相比，CD62LlowCD4+T细胞中T-bet和CXCR3表达显著强，CD27表达显著弱(图12的b部分，c部分)。通过CD62Llow的单个标志物而不是CD45RA-CCR7-，似乎能够区分相对同质的CD62LlowCD45RA-CCR7-CD27-T-bet+CXCR3+CD4+T细胞的部分群。本发明人研究了CD62LlowCD4+T细胞与PD-1，LAG-3，及CTLA-4的表达的相关性。并不是CCR7-CD45RA-CD4+T细胞而是CD62LlowCD4+T细胞与CD62LlowCD4+细胞中的PD-1及LAG-3的表达呈正相关，与CD8+TEMRA细胞中的PD-1的表达也呈正相关(图13的a-c部分，图18的a-c部分)。并且，与CD62LlowCD4+T细胞中的CTLA-4的表达呈负相关(图13的d部分，图18的d部分)。
(实施例7：应答患者和非应答患者的CD62LlowCD4+T细胞的基因表达)
接着，本发明人进行微阵列分析以研究应答患者与非应答患者之间的分子水平上的CD62LlowCD4+T细胞的差异。为此，首先阐明明确了CD62LhighCD4+T细胞与CD62LlowCD4+T细胞中的基因表达差异。结果，CD62LhighCD4+T细胞和CD62LlowCD4+T细胞具有不同的基因表达谱(图14a)。与之前的报告一致，大部分CD62LhighCD4+T细胞被认为是初始T细胞。这是因为所有的患者的CD62LhighCD4+T细胞中，C-C趋化因子受体型(CCR7，C-C chemokine receptortype 7)、CD28及转录因子7(TCF7)的基因具有强表达。CD62LlowCD4+T细胞强表达极光激酶A(AURKA，aurora kinase A)、C-C motif chemokine ligand 17(CCL17)、颗粒酶A及H(GZMA及GZMH)、NADH脱氢酶2(ND2)及白细胞介素21(IL-21)。并且，将在源自PR(部分响应)及SD(稳定)、PR及PD(进展)、SD及PD、PR+SD及PD、以及PR及SD+PD的细胞之间所比较的特征的基因(分别为1884、1826、1410、1167及1513基因)、与总3458基因组合。其中，对于已知与T细胞免疫相关的53个基因中的30个的表达，从对纳武单抗治疗的应答的观点来表示(图14的b部分)。其表示C型凝集素结构域家族2成员A(CLEC2A；C-type lectin domain family2member A)、白细胞介素7(IL7)、转化生长因子β受体3(TGFBR3)、干扰素α(IFNA)、C-X-C趋化因子受体3型(CXCR3)及组蛋白脱乙酰酶9(HDAC9)在源自应答者的CD62LlowCD4+T细胞中优先表达。
(实施例8：纳武单抗治疗后变化)
测量了在纳武单抗(Nivolumab)治疗前后的各种标志物的变化。作为试验的细胞比例，使用了CD62LlowCD8+T细胞比例、CD28+CD62LlowCD8+T细胞比例、CD62LlowCD4+T细胞比例、ICOS+CD62LlowCD4+T细胞比例及LAG3+CD62LlowCD4+T细胞比例。其中，CD62LlowCD4+T细胞比例最良好相关，纳武单抗治疗后显著降低(P＝0.0001)(图5)。
接着，纳武单抗治疗前和治疗4周后从响应组(Responder，图6的左图)和无效组(Non-responder，图6的右图)配制CD4+T细胞，测试了CD62LlowCD4+T细胞比例。其结果，响应组中的CD62LlowCD4+T细胞比例的降低与无效组中的CD62LlowCD4+T细胞比例的降低相比相关性更好(图6，响应组P＝0.0016，无效组P＝0.32)。该响应组的相关关系比LAG3+CD62LlowCD4+T细胞比例时的相关关系、CD28+CD62LlowCD8+T细胞比例时的相关关系更好(数据未显示)。
接着，由纳武单抗治疗开始后12～92周的患者组配制PBMC。具体而言，针对从治疗开始平均63.3周(28～92周)后的患者组且治疗开始后获得治疗耐药性的患者组(Acquiredresistance，图7图表中的中间部分)中的6名患者、以及从治疗开始平均64.5周(12～92周)后的患者组且治疗开始后仍然对治疗产生应答的患者组(On-going response，图7图表中的左侧部分)中的8名患者，分别配制了PBMC。作为对照，从在治疗开始时产生治疗耐药性的患者组中的5名患者(Primary resistance，图7图表中的右部分)配制PBMC。示出了CD62LlowCD4+T细胞比例(即，总CD4+T细胞群中的CD62LlowT细胞的比例，图7的左图的图表)、以及将CD62LlowCD4+T细胞比例设为“X”、将CD25+FOXP3+CD4+T细胞比例(即，总CD4+T细胞群中的CD25+FOXP3+T细胞的比例)设为“Y”时的X2/Y(图7的右图的图表)。CD62LlowCD4+T细胞比例(图7的左图)及将CD62LlowCD4+T细胞比例设为“X”、将CD25+FOXP3+CD4+T细胞比例设定为“Y”时的X2/Y(图7的右图)，均在治疗开始后仍然对治疗产生应答的患者组中显示显著高的值。其结果判明，对于是否是用纳武单抗这样的检查点抑制剂的治疗后也仍然对治疗产生应答性的患者，CD62LlowCD4+T细胞比例及将CD62LlowCD4+T细胞比例设为“X”、将CD25+FOXP3+CD4+T细胞比例设定为“Y”时的X2/Y均为良好的预测指标。当将CD62LlowCD4+T细胞比例作为指标时，P＝0.0088，将X2/Y作为指标时，P＝0.017。
(实施例9：长期无恶化存活的特征性标志物)
如上所述可知，图1中也可见的长期无恶化存活组构成图2的无恶化存活曲线中的18个月以后可见的尾部平台(Tail Plateau)。其中，本发明人将无恶化生存期＞500天的患者定义为长期应答者，将最初对治疗产生应答但获得耐药性并在纳武单抗治疗后500天以内出现疾病进展的患者定义为短期应答者。
配制从纳武单抗治疗开始后经过500天以上的长期无恶化存活组的患者中获得的PBMC、和从治疗开始时为响应组但之后恶化的患者组中获得的PBMC，并对两者进行比较。其结果示于图8中。图8为对长期无恶化存活组(LR)、短期响应组(SR)及无效组(NR)示出CD62LlowCD4+T细胞比例的图表(图8的左图)，以及示出将CD62LlowCD4+T细胞比例设为“X”并将CD25+FOXP3+CD4+T细胞比例设定为“Y”时的X2/Y的图表(图8的右图)。长期无恶化存活组(LR)表示经过500天以上未显示恶化的患者组。短期响应组(SR)表示治疗开始后至少9周内出现部分响应组(PR)或疾病稳定组(SD)、但此后疾病进展的患者组。无效组(NR)表示纳武单抗治疗开始后9周以内疾病进展的患者组。学生配对t检验用于统计处理。
CD62LlowCD4+T细胞比例(图8的左图)、以及将CD62LlowCD4+T细胞比例设为“X”并将CD25+FOXP3+CD4+T细胞比例设定为“Y”时的X2/Y(图8的右图)均为预测长期无恶化存活组(LR)和短期响应组(SR)的优异的指标。因此，明确了为预测长期存活的优异的指标。
基于该结果，将500天无恶化存活作为长期存活者时，％CD62LlowCD4+T细胞＞35.3％时，实现50％的灵敏度，88.1％的特异性，P＜0.0001。当X2/Y＞404.5时，实现62.5％灵敏度，实现84.2％的特异性，P＜0.0001。
当进一步增加样品并将预测式的阈值设为323.5(为使ROC曲线的相似比最大化的点)时，灵敏度和特异性分别为68.2％和81.7％(图15)。
基于上述结果，当X2/Y为一定数值以上时(例如，X2/Y＞323.5或者X2/Y＞404.5等)时，预测为通过癌免疫疗法实现长期存活。
如WO2018/147291所述，当X2/Y小于一定数值时，预测为无效组。因此，当进行癌免疫疗法的治疗时，使用X(CD62LlowCD4+细胞比例)和Y(CD25+FOXP3+CD4+T细胞比例)，预先确定常数“α”，当X2/Y＜α时，判断为无法期待癌症免疫疗法的效果，和/或应变更为其他治疗法，和/或，应研究与其他治疗法联合使用。并且，除了“α”之外，还预先确定“β”，当β＜X2/Y时，预测到通过癌免疫疗法的长期存活，因此可判断为例如能够以一次性给药结束，或者，应以一次性给药结束。或者，在这些中间，即α≤X2/Y≤β，可获得癌免疫疗法的效果，但为了获得长期存活，可判断为应考虑继续进一步治疗，或与其他治疗法联合使用。
基于ROC曲线的临界值确定，可使用本领域技术领域已知的方法。例如，除了采用上述的“使相似比最大化的值”作为阈值的方法之外，还存在下述方法，即，采用与图表左上角的距离最小的点的值的方法，或者采用使约登指数(Youden Index，灵敏度+特异性-1)最大化的点的值的方法(http://www.med.osaka-u.ac.jp/pub/kid/ clinicaljournalclub6.html，http://www.snap-tck.com/r00m04/c01/stat/stat09/ stat0902.html)。
(讨论1)
CD62LlowCD4+细胞亚群对次级淋巴器官的归巢分子的表达减少，被认为是与肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群。另外，ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群也被认为是与肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群。HLA-DR+CD141+CD11c+树突状细胞亚群是因CD4+T细胞群中的归巢分子的表达减少的细胞亚群的增加而增加的树突状细胞亚群，因此被认为是与肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群。
基于上述的结果，通过使用与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群和/或与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群，表明可预测在癌症免疫疗法中长期存活。
并且，如实施例8及实施例9所示，使用CD62LlowCD4+T细胞比例，以及将CD62LlowCD4+T细胞比例设为“X”并将CD25+FOXP3+CD4+T细胞比例设定为“Y”时的X2/Y，可选择在癌症免疫疗法后继续属于响应组的患者。
CD62LlowCD4+细胞亚群呈强正相关的T细胞亚群为1型辅助CD4+T细胞(Th1)、效应记忆CD4+T细胞、CD8+T细胞、效应CD8+T细胞。这些是在细胞介导免疫中对细胞杀伤功能重要的细胞亚群。另一方面，呈负相关的是2型辅助CD4+T细胞(Th2)、调节性T细胞。这些被公知为抑制细胞介导免疫的细胞亚群。因此，CD62LlowCD4+细胞亚群的增加表示抗肿瘤细胞介导免疫的激活，并表示阻止其的细胞亚群减少。另外，CD62LlowCD4+细胞亚群与CD4+T细胞、CD8+T细胞上的LAG3、ICOS、PD-1、CTLA-4表达具有显著相关关系，因此可控制其抗肿瘤免疫功能。具体而言，CD62LlowCD4+细胞亚群的增加与PD-1、LAG-3、ICOS表达增加相关，与CTLA-4表达减少相关。这表示抗肿瘤免疫主要受PD-1、LAG-3控制，这些被认为与免疫检查点抑制治疗的有效性有关。并且，HLA-DR+CD141+CD11c+树突状细胞亚群与CD62LlowCD4+细胞亚群呈正相关。这被认为是通过激活的树突状细胞表达MHCclassII类限制性抗原，导致识别MHCclassII类限制性抗原的CD62LlowCD4+细胞亚群的增加，并且为与肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群。HLA-DR+CD141+CD11c+树突状细胞亚群被认为是与肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群。
(讨论2)
对于癌症免疫疗法的研讨，聚焦在肿瘤微环境中的CD8+T细胞。这是因为CTL从CD8+T细胞分化，通过识别肿瘤抗原来诱导肿瘤细胞的死亡。然而，发明人证实，外周血中的CD4+T细胞的免疫状态为确定NSCLC患者中PD-1阻断疗法的临床结果的重要因子，并且取决于CD62LlowT细胞的比例与CD25+FOXP3+CD4+T细胞的比例之间的比率的式子不仅区分非应答者还区别长期存活者。通过支持CD4+T细胞而促进CTL的启动、移动能力、损伤活性及存活，故而越来越多证据表明有效的抗肿瘤免疫中需要CD4+T细胞。并且，为了增强CTL的产生、传递及损伤活性，似乎需要全身存在CD4+T细胞。使用质谱流式细胞术，Spitzer等人(SpitzerMH et al.,Cell 2017；168(3):487-502e15)研究了小鼠(这些小鼠已经确定足以根除肿瘤的抗肿瘤免疫)的肿瘤浸润淋巴细胞、肿瘤流入区域淋巴结、外周血、脾脏及骨髓，发现了CD62LlowCD27-T-bet+CD44+CD69+CD90+CD4+T细胞簇在所有研究部位高度浓缩并介导抗肿瘤应答。他们证实，持续性抗肿瘤应答需要通过外周血的抗肿瘤T细胞的持续性募集。另一方面，Wei等人(Wei SC et al.,Cell 2017；170(6):1120-33e17)研究了黑色素瘤浸润淋巴细胞，并证实几乎相同的表型CD4+T细胞(CD62LlowCD27-FOXP3-CD44+CXCR3+ICOS+T-bet+)与对免疫检查点抑制剂的应答相关。与这些研究一致，在本发明人的质谱流式细胞术的研讨中，大部分CD62LlowCD4+T细胞在CD4+组中显示为T-bet+、CD27-、FOXP3-且CXCR3+。另一方面，在非应答者与应答者之间未显示差异的CCR7-CD4+T细胞的部分群包括T-bet-、CD27+及FOXP3+的部分群等更广泛的部分群。CD62LlowCD4+T细胞的部分群与CXCR3+CCR4-CCR6-细胞强相关，即CD62LlowCD4+T细胞的部分群在细胞免疫中作为Th1细胞发挥重要作用。因此，CD62LlowCD4+T细胞的部分群与效应CD8+T细胞的比例呈正相关。有趣的是，CD62LlowCD4+T细胞的部分群与PD-1的表达呈正相关，但与CTLA-4的表达呈负相关。因此，认为CD62LlowCD27-FOXP3-CXCR3+T-bet+CD4+T细胞的部分群构成包含Th1T细胞及效应CD8+T细胞在内的细胞免疫性T细胞网络，表明这些细胞受PD-1的调节而不是CTLA-4。
出乎意料的是，在纳武单抗治疗后，观察到在应答患者中CD62LlowCD4+T细胞的比例减少但在非应答患者中未减少。这是因为已经证实在有效的抗-PD-1治疗后，外周血中PD-1+效应CD8+T细胞增加。然而，Wei等人(Wei SC et al.,Cell 2017；170(6):1120-33e17)证实：PD-1阻断疗法仅使黑色素瘤浸润淋巴细胞内的CD8+抗肿瘤T细胞簇增加，而并不使CD4+抗肿瘤T细胞簇减少。因此，PD-1阻断疗法可能无法促进抗肿瘤CD4+T细胞的增殖。以前有报道过在纳武单抗治疗后的应答患者中肿瘤基因突变量(tumor-mutation burden)减少。有效的PD-1阻断疗法似乎刺激免疫编辑流程，并导致以高基因突变量为特征的癌症克隆减少。因此，本发明人的发现存在如下可能性：由癌症相关抗原的丧失结果产生的特定效应T细胞丧失。仅保持CD62LlowCD4+T细胞的患者才会在纳武单抗疗法之间显示持续的抗肿瘤应答，故而获得耐药性的根本机制之一为肿瘤相关抗原的丧失，这可能会耗尽CD4+T细胞的支持。根据本发明人的研究发现，在纳武单抗疗法之前示出高CD62LlowCD4+T细胞的比例并保持CD62LlowCD4+T细胞部分群的患者没有疾病进展，往往存活500天以上。因此，有前景的疗法必然伴随由治疗(例如，anti-CTLA-4疗法)引起的CD62LlowCD4+T细胞部分群的增加、和同时对外周血T细胞的部分群的监视。
通过基因表达分析表明，CD62LhighT细胞与CD62LlowCD4+T细胞之间基因表达谱不同(图14a)。CD62LlowCD4+T细胞表达编码Aurora A、CD101、颗粒酶(granzyme)A及H、ND2以及IL-21的基因。在G2-M期，AURORA A在有丝分裂细胞中表达，需要维持T细胞中的TCR参与后的Lck活性，CD101在由CD3激活的T细胞中表达。颗粒酶(Granzyme)A及H在CLT及自然杀伤细胞等具有损伤活性的细胞中表达。据报道被激活的CD4+T细胞可表达颗粒酶(granzyme)并介导抗肿瘤应答(Hirschhorn-Cymerman D et al.,J Exp Med 2012；209(11):2113-26)。ND2为NADH脱氢酶(dehydrogenase)的7个线粒体编码的亚基之一。已证实IL-21可增强和维持CD8+T细胞的应答、从而产生持续性抗肿瘤免疫。总之，CD62LlowCD4+T细胞的部分群包含在TCR接合激活后增殖的T细胞，该T细胞呈现出效应功能并增强CD8+T细胞的损伤活性。尤其，CCL19、IL7、CXCR3、CLEC2A、TGFBR3及HDAC9等一部分基因在来源于PR和/或SD的CD62LlowCD4+T细胞中优先表达(图14b)。CCL19与CCR7相结合，吸引包含树突状细胞及CCR7+中央记忆细胞的免疫系统中的一定细胞。IL-7(T细胞增殖的非冗余细胞因子)的信号转导促进抗肿瘤T细胞免疫。有趣的是，据报道CAR-T细胞中的IL-7及CCL19的表达改善了免疫细胞的浸润及肿瘤中的CAR-T的存活(Adachi K et al.,Nat Biotechnol 2018；36(4):346-51)。CLEC2A通过增强由TCR刺激的T细胞的存活率来增值由TCR刺激的T细胞。TGFβ具有影响多个类型的免疫细胞的广泛调节活性。可溶性TGFBR3有可能会抑制TGFβ信号转导。HDAC9抑制FOXP3表达并抑制Treg功能。因此，这些分子似乎在促进T细胞的激活、抑制调节机制和增加抗肿瘤性效应T细胞的量的方面发挥作用。这些可能代表增强抗肿瘤免疫疗法的有前景的目标。
作为结论，发明人证明了使用外周血的全身性CD4+T细胞免疫的监测可以帮助预测抗-PD-1治疗的应答。本发明人开发了一种基于CD62LlowCD4+T细胞及Treg的比例的、用于预测治疗结果的作为生物标志物发挥作用的式子。本发明人的发现支持用于所有潜在应答患者的抗-PD-1治疗的准备，并提供一种针对呈现不同CD4+T细胞免疫状态的患者的、新型治疗策略的基础，因此具有重要的临床意义。
由上述结果表明，通过使用与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群和/或与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群，可预测癌症免疫疗法中的长期存活。
(实施例10：派姆单抗的治疗)
如下确认，在使用派姆单抗的治疗的情况下也可获得与纳武单抗治疗相同的结果。
10-1.材料及方法
(1)患者
以下实验是针对54名年龄在18岁以上且IV期或IIIB-C期的PD NSCLC患者为对象进行的，其中，所述患者的PD-L1的肿瘤比例评分(TPS，Tumor Proportion Score)为50％以上且无EGFR突变·ALK易位。该实验从2017年3月到2018年11月在单一机构(埼玉医科大学国际医学中心)进行的。PD-L1的TPS根据常规方法使用PD-L1 IHC 22C3 pharmaDx进行。
患者每3周以200mg/kg剂量给与派姆单抗作为一线治疗。在获得埼玉医科大学国际医学中心临床试验审查委员会批准的书面知情同意之后采集了样本。
除了无法评估的5名患者之外，对49名的患者进行了分析。综合了完全响应(CR，complete response)和部分响应(PR，partial response)的总响应率(ORR，overallresponse rate)为45.7％，综合了完全响应(CR)、部分响应(PR)及疾病稳定(SD，stabledisease)的疾病控制率(DCR，disease control rate)为73.9％(图21A)。
(2)以与上述实施例1～9的(材料及方法)相同地进行了血液样本的分析和(4)统计分析。
10-2.派姆单抗治疗的过程
以与实施例1相同方法制作的无恶化存活(PFS)曲线和总生存期(OS)曲线分别示于图21B及图21C中。PFS曲线在490天以后，OS曲线在637天以后成为尾部平台。在以后的分析中分别将达到尾部平台的组作为长期存活组。
10-3.FACS Calibur分析
以与实施例2相同的方法进行。取各种细胞亚群的比，将调查该比与PFS之间的相关性的结果示于表6A中，并且将调查与OS的相关性的结果示于表6B中。
[表6A]
A.
Figure BDA0003310853940000771
[表6B]
B.
Figure BDA0003310853940000781
在CD62LLow/CD4+CD3+、CD62LlowCD4+/CD3+、CCR7-CD45RA-/CD4+中呈现显著相关，但在CD62LlowCD4+/CD3+中呈现最强相关，并与Th2呈负相关。
另外，比较PFS曲线中的长期存活组中的细胞亚群之比、OS曲线中的长期存活组中的细胞亚群之比、以及非长期存活组中细胞亚群之比，并将该比较结果示于表7中。
[表7]
Figure BDA0003310853940000791
CD62LLowCD4+/CD3+、CD62Llow/CD4+CD3+、CCR7-CD45RA-/CD4+CD3+、CCR7-CD45RA-/CD8+中具有显著差异，但在CD62LlowCD4+/CD3+呈现出最强相关。
10-4.ROC分析及PFS、OS制图
以与实施例3相同的方法进行。横轴为CD62LlowCD4+/CD3+，纵轴为PFS或OS，进行制图，其结果分别示于图21D及图21E。在CD62LlowCD4+/CD3+与PFS、OS之间确认了相关性。针对PFS＜490组与PFS≥490组、OS＜637组与OS≥637组，将CD62LlowCD4+/CD3+绘制成图，其结果分别示于图21F及图21H中。都确认了相关性。
基于图21F及图21H的结果，对PFS将CD62LlowCD4+/CD3+＞17.6作为阈值进行ROC分析，其结果示于图21G，对OS将CD62LlowCD4+/CD3+＞15.6作为阈值进行ROC分析，其结果示于图21I。
对于PFS，p值为0.0002，灵敏度为72.7％，特异性为86.7％，AUC为0.88，对于OS，p值为0.0065，灵敏度为66.7％，特异性为81.8％，AUC为0.77，均为优异。就CD62LlowCD4+CD3+细胞群的比例而言，存在将CD4+CD3+作为母群的情况(CD62Llow/CD4+CD3+)和将CD3+作为母群的情况(CD62LlowCD4+/CD3+)(分子描述的细胞具有分母描述的细胞的所有特征)，均示出相同结果。此外，上述结果表明，与将CD4+CD3+作为母群的情况相比，将CD3+作为母群时灵敏度和特异性更良好。
10-5.派姆单抗的一线治疗与纳武单抗的二线治疗的比较
针对通过派姆单抗进行一线治疗的患者(●)与通过纳武单抗进行二线治疗的患者(〇)，以横轴为CD62Llow/CD4+且纵轴为PFS或OS进行了制图，其结果分别示于图22A及图22B。
派姆单抗治疗组的PFS更良好，但对于PFS、OS而言，每个CD62Llow/CD4+的PFS的增加比例均相同，当将CD62Llow/CD4+作为指标进行评估时，该疗法的治疗效果显现出与纳武单抗非常相似的趋势。该结果表明，本发明提供对任何癌症免疫疗法(例如，任何免疫检查点抑制疗法)的长期存活预测。
工业上的可利用性
本发明可用于癌症治疗中。根据本发明，可在癌症免疫治疗之前表示出是否处于长期存活型免疫状态。另外，根据本发明，可在癌症免疫治疗开始之后，表示出长期存活型免疫状态持续。由此，可适当确定是否需要联合治疗、确定联合疗法开始时间、或者判断联合疗法的中断/中止时期。

Claims (49)

1.一种方法，其将从受试者获得的样品中的细胞亚群的组成用作预测所述受试者在癌症免疫疗法中长期存活的指标，
所述方法包括分析从所述受试者获得的所述样品中的细胞亚群的组成的工序，
通过所述样品中的与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的量与基准之间的比较，预测所述受试者在癌症免疫疗法中的长期存活。
2.一种方法，其将从受试者获得的样品中的细胞亚群的组成用作预测所述受试者在癌症免疫疗法中长期存活的指标，
所述方法包括分析从所述受试者获得的所述样品中的细胞亚群的组成的工序，
通过所述样品中的与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群的量与基准之间的比较，预测所述受试者在癌症免疫疗法中的长期存活。
3.一种方法，其将从受试者获得的样品中的细胞亚群的组成用作预测所述受试者在癌症免疫疗法中的长期存活的指标，
所述方法包括分析从所述受试者获得的所述样品中的细胞亚群的组成的工序，
通过所述样品中的与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群的量与基准之间的比较，预测所述受试者在癌症免疫疗法中的长期存活。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，通过选自由所述样品中的与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的量、与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群的量及与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群的量组成的组中的至少两个量与基准之间的比较，预测所述受试者在癌症免疫疗法中的长期存活。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其中，所述与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群为包含在CD62LlowCD4+T细胞群中的细胞亚群。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群为CD62LlowCD4+T细胞亚群。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群为ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群。
8.根据权利要求2或4所述的方法，其中，所述与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群为HLA-DR+CD141+CD11c+细胞亚群。
9.根据权利要求3或4所述的方法，其中，与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群为包含在CD62LlowCD8+T细胞群中的细胞亚群。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群为CD137+CD62LlowCD8+T细胞亚群。
11.一种方法，其将相对于量(X，Y)的相对值用作预测所述受试者在癌症免疫疗法中长期存活的指标，所述量(X，Y)选自由以下量组成的组：
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的量；
与抗肿瘤免疫应答中的由CD4+T细胞引起的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群的量；
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群的量；
调节性T细胞或与调节性T细胞相关的CD4+T细胞亚群的量；以及
ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量，
所述方法包括：
测量所述X的工序；以及
测量所述Y的工序，
将X相对于Y而得到的相对值与基准之间的比较用作预测所述受试者在癌症免疫疗法中长期存活的指标。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，
所述量(X)及(Y)分别选自由以下量组成的组：
CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
CCR7-CD4+T细胞亚群的量；
LAG-3+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
PD-1+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
Foxp3+CD25+CD4+T细胞亚群的量；
HLA-DR+树突状细胞亚群的量；
CD80+树突状细胞亚群的量；
CD86+树突状细胞亚群的量；
PD-L1+树突状细胞亚群的量；
CD62LlowCD8+T细胞亚群的量；
CD137+CD8+T细胞亚群的量；以及
CD28+CD62LlowCD8+T细胞亚群的量。
13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述量(X)为CD62LlowCD4+T细胞亚群的量，以及(Y)为Foxp3+CD25+CD4+T细胞亚群的量。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中，所述相对值为X/Y。
15.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中，所述相对值为X2/Y。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，所述样品为外周血样品。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，所述基准为所述癌症免疫疗法之前所述受试者样品中的所述细胞亚群的量或预定值。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，所述样品中的所述细胞亚群的量高于所述基准表示在所述受试者中预测出癌症免疫疗法中的长期存活。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，所述样品中的所述细胞亚群的量低于所述基准表示在所述受试者中未预测出癌症免疫疗法中的长期存活。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中，当在所述受试者中未预测出癌症免疫疗法中的长期存活时，还表示应向所述受试者施用联合疗法。
21.一种方法，其是根据权利要求1至20中任一项所述的方法，还进一步被定义为在多个时间点从受试者获得的样品中的细胞亚群的组成用作预测所述受试者在癌症免疫疗法中长期存活的指标的方法，所述方法包括分析在多个时间点从所述受试者获得的样品中的细胞亚群的组成的工序。
22.根据权利要求15所述的方法，其中，所述X2/Y为约324以上时，预测出长期存活。
23.一种药物组合物，其特征在于，
所述药物组合物包含用于处置受试者的癌症的免疫检查点抑制剂，
所述药物组合物施用于受试者，所述受试者通过权利要求1至18或21至22中任一项所述的方法预测出在癌症免疫疗法中长期存活。
24.根据权利要求23所述的药物组合物，其中，所述免疫检查点抑制剂为PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。
25.一种组合药物，其特征在于，
所述组合药物包含用于处置受试者的癌症的免疫检查点抑制剂，
所述组合药物施用于受试者，所述受试者通过权利要求1至22中任一项所述的方法未预测出在癌症免疫疗法中长期存活。
26.根据权利要求25所述的组合药物，其中，所述免疫检查点抑制剂为PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。
27.根据权利要求25所述的组合药物，其中，包含选自由化学治疗药物和另外的癌症免疫疗法组成的组中的药物。
28.一种试剂盒，其用于判定在受试者中能够预测出癌症免疫疗法中的长期存活，所述试剂盒包含针对标志物组合的检测剂，所述标志物组合选自由以下组合组成的组：
CD4和CD62L的组合；
CD4和CCR7的组合；
CD4、CD62L及LAG-3的组合；
CD4、CD62L及ICOS的组合；
CD4、CD62L及CD25的组合；
CD4、CD127及CD25的组合；
CD4、CD45RA及Foxp3的组合；
CD4、CD25及Foxp3的组合；
CD11c、CD141及HLA-DR的组合；
CD11c、CD141及CD80的组合；
CD11c、CD123及HLA-DR的组合；
CD11c、CD123及CD80的组合；
CD8和CD62L的组合；
CD8和CD137的组合；以及
CD28、CD62L及CD8的组合。
29.一种试剂盒，其用于判定受试者是否在癌症免疫疗法中需要治疗干预，所述试剂盒包含针对标志物组合的检测剂，所述标志物组合选自由以下组合组成的组：
CD4和CD62L的组合；
CD4和CCR7的组合；
CD4、CD62L及LAG-3的组合；
CD4、CD62L及ICOS的组合；
CD4、CD62L及CD25的组合；
CD4、CD127及CD25的组合；
CD4、CD45RA及Foxp3的组合；
CD4、CD25及Foxp3的组合；
CD11c、CD141及HLA-DR的组合；
CD11c、CD141及CD80的组合；
CD11c、CD123及HLA-DR的组合；
CD11c、CD123及CD80的组合；
CD8和CD62L的组合；
CD8和CD137的组合；以及
CD28、CD62L及CD8的组合。
30.一种方法，其将从受试者获得的样品中的细胞亚群的组成用作所述受试者在癌症免疫疗法中需要治疗干预的指标，
所述方法包括分析从所述受试者获得的所述样品中的细胞亚群的组成的工序，
通过所述样品中的与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的量与基准之间的比较，提供所述受试者在癌症免疫疗法中需要治疗干预的指标。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群为包含在CD62LlowCD4+T细胞群中的细胞亚群。
32.根据权利要求30所述的方法，其中，所述与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群为CD62LlowCD4+T细胞亚群。
33.一种方法，其将相对于量(X，Y)的相对值用作受试者在癌症免疫疗法中需要治疗干预的指标，所述量(X，Y)选自由以下量组成的组：
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD4+T细胞亚群的量；
与抗肿瘤免疫应答中的由CD4+T细胞引起的树突状细胞刺激相关的树突状细胞亚群的量；
与抗肿瘤免疫应答中的树突状细胞刺激相关的CD8+T细胞亚群的量；
调节性T细胞或与调节性T细胞相关的CD4+T细胞亚群的量；以及
ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量，
所述方法包括：
测量所述X的工序；以及
测量所述Y的工序，
将X相对于Y而得到的相对值与基准之间的比较用作所述受试者在癌症免疫疗法中需要治疗干预的指标。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，
所述量(X)及(Y)分别选自由以下量组成的组：
CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
CCR7-CD4+T细胞亚群的量；
LAG-3+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
ICOS+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
PD-1+CD62LlowCD4+T细胞亚群的量；
Foxp3+CD25+CD4+T细胞亚群的量；
HLA-DR+树突状细胞亚群的量；
CD80+树突状细胞亚群的量；
CD86+树突状细胞亚群的量；
PD-L1+树突状细胞亚群的量；
CD62LlowCD8+T细胞亚群的量；
CD137+CD8+T细胞亚群的量；以及
CD28+CD62LlowCD8+T细胞亚群的量。
35.根据权利要求33所述的方法，其中，所述量(X)为CD62LlowCD4+T细胞亚群的量，以及(Y)为Foxp3+CD25+CD4+T细胞亚群的量。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中，所述相对值为X/Y。
37.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中，所述相对值为X2/Y。
38.根据权利要求30至37中任一项所述的方法，其中，所述治疗干预为放射治疗。
39.根据权利要求30至37中任一项所述的方法，其中，所述治疗干预为化学治疗药物治疗。
40.根据权利要求37所述的方法，其中，所述X2/Y小于约324是需要治疗干预的指标。
41.根据权利要求37所述的方法，其中，所述X2/Y为约174以上且小于约324是需要治疗干预的指标，所述治疗干预包括除了正在给药的癌症免疫疗法之外还进行化学疗法、放射疗法、外科程序或温热疗法、或者进行另外的癌症免疫疗法。
42.根据权利要求37所述的方法，其中，所述X2/Y小于约174是需要治疗干预的指标，所述治疗干预包括：中止正在给药的癌症免疫疗法；或者除了正在给药的癌症免疫疗法之外还进行化学疗法、放射疗法、外科程序或温热疗法或进行另外的癌症免疫疗法。
43.一种组合药物，其特征在于，包含用于处置受试者的癌症的免疫检查点抑制剂，
所述组合药物施用于受试者，所述受试者通过权利要求30至42中任一项所述的方法被判断为在癌症免疫疗法中需要治疗干预。
44.根据权利要求43所述的组合药物，其中，所述免疫检查点抑制剂为PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。
45.根据权利要求43所述的组合药物，其中，包含选自由化学治疗药物和另外的癌症免疫疗法组成的组中的药物。
46.一种方法，其将从作为治疗前的癌症患者的受试者获得的样品中的细胞亚群的组成用作确定针对所述受试者的治疗策略的指标，
所述方法包括：
测量从所述受试者获得的所述样品中的CD62LlowCD4+T细胞亚群的量(X)和Foxp3+CD25+CD4+T细胞亚群的量(Y)的工序；以及
求得相对值X2/Y的工序，
所述方法还包括选自由以下(a)、(b)以及(c)组成的组中的工序：
(a)针对相对值X2/Y设定阈值α，在所述X2/Y小于阈值α时判断受试者为对癌症免疫疗法的无应答者的工序；
(b)针对相对值X2/Y设定阈值α和β，其中，α＜β，在所述X2/Y为阈值α以上且小于阈值β时判断受试者为对癌症免疫疗法的短期应答者的工序；以及
(c)针对相对值X2/Y设定阈值β，在所述X2/Y为阈值β以上时判断受试者为对癌症免疫疗法的长期应答者的工序。
47.根据权利要求46所述的方法，其中，所述阈值β为比所述阈值α至少大50的值。
48.根据权利要求47所述的方法，其中，
所述阈值α为100～400范围内的值，
所述阈值β为150～450范围内的值。
49.一种产品，其中，包含随附文件和免疫检查点抑制剂，所述随附文件记载有权利要求46至48中任一项所述的方法。
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