NL1029605C2 - Nieuwe uit menselijke kiemlijnsequenties gewonnen antilichaamstructuren. - Google Patents

Description

r

Korte aanduiding: Nieuwe uit menselijke kiemlijnsequenties gewonnen anti 1i chaamstructuren.

Beschrijving.

5 De onderhavige uitvinding heeft betrekking op nieuwe primaire sequenties van volledige menselijke anti lichamen, in het bijzonder sequenties die zeer waarschijnlijk uit menselijke kiemlijngenen afkomstig zijn en het vermogen van dergelijke sequenties om op specifieke wijze aan menselijk CD152 (CTLA-4) te binden, zowel in oplossing als aan 10 een cel oppervlak. Op grond van de menselijke oorsprong daarvan kunnen deze structuren een reactie van de gastheer op het toedienen van anti lichamen, zoals deze gewoonlijk bij de antilichaamtherapie optreedt, verbeteren of zelfs opheffen.

Immunoglobulinen (Ig's, anti lichamen) zijn als eiwitten met 15 een Y-vormige structuur, bij wijze van voorbeeld aan het oppervlak van B-cellen, bekend, die als antwoord op een anti geenstimulus zoals een bacterie, een virus een parasiet of een getransplanteerd orgaan, in het bloed, de lymfe en andere lichaamsvloeistoffen worden afgegeven. Ze neutraliseren het overeenkomstige anti geen, doordat ze op specifieke 20 wijze daaraan binden. Figuur 1 toont hoe, op grond van de huidige kennis, een anti lichaam structureel is opgebouwd uit variabele gebieden (la) en constante gebieden (lb). Binnen ieder variabel gebied zijn er drie hypervariabele deelgebieden (lf). In deze hypervariabele deelgebieden liggen aminozuren die bijdragen tot het binden van een antigeen, zodat ze 25 ook als complementariteitsbepalende gebieden (complemententeitsbepaald gebied CDR) worden aangeduid.

Om een toereikende hoeveelheid aan anti lichamen te winnen worden gewoonlijk muizen onder toepassing van een injectie van het overeenkomstige antigeen geïmmuniseerd, om specifieke B-cellen te 30 verkrijgen. B-cellen van verdoofde muizen worden dan gefusioneerd met myelomacell en, om een hybridoma-cellijn te genereren die in staat is om 1029605 2 gedurende een onbeperkte tijdsduur monoklonale anti lichamen af te scheiden. De op deze wijze gewonnen anti lichamen hebben echter nog sequenties van de muis, welke sequenties een nadelig menselijk anti-muis-immuunantwoord in het organisme van de patiënt opwekken. Het 5 therapeutische nut van monoklonale mui zenanti lichamen is derhalve begrensd. Om dit probleem op te lossen worden zogenaamde gehumaniseerde anti lichamen bereid, doordat men gebieden van de anti lichamen van muizen die voor de antigeenspecificiteit niet belangrijk zijn vervangt door een menselijk tegenstuk. Protocollen voor het humaniseren om deze 10 doelstelling te bereiken werden onlangs gepubliceerd. U.S. patent 5.585.089 beschrijft bij wijze van voorbeeld hoe een overdracht van bindingsplaats (CDR's) van een mui zenanti lichaam op een menselijk anti lichaam kan worden uitgevoerd, en ook hoe substituties van aminozuren in de ranggebieden van het mui zenanti lichaam voor het vormen van het 15 gehumaniseerde antilichaam worden ingevoerd. Bij een klinische toepassing vertoonden deze gehumaniseerde anti lichamen doorgaans een minimale menselijke anti-muis-reactie en werden ze met succes als therapeutische werkstoffen tegen verschillende ziekten toegepast. Traditioneel zijn deze ziekten infectieziekten, zoals bij wijze van voorbeeld infecties door het 20 Respiratory Syncytial Virus (RSV). Recent worden anti lichamen in toenemende mate toegepast bij de therapie van andere ziekten, met inbegrip van auto-immuunziekten en kwaadaardige kankervormen zoals metastasenvormende borstkanker, niet-Hodgkïns-lymfoom, chronische lymfocytenleukemie en acute myeloïdenleukemie. Ook een profylactische 25 toepassing tegen afstoting van een orgaan of bloedstolling gedurende een angioplastie was mogelijk. Ondanks de omvang van positieve gegevens met betrekking tot gehumaniseerde antilichamen zijn overblijvende sequenties van de muis en nadelige werkingen nog steeds aanwezig. Derhalve is het wenselijk om volledig menselijke antilichamen te bereiden, die geen niet-30 menselijke sequenties bevatten.

Inderdaad werd beschreven dat door het immuniseren van 1029605 » 3 transgene muizen, die menselijke immunoglobulinegenen hadden, volledig menselijke anti lichamen kunnen worden verkregen. Jammer genoeg vormt de betrekkelijk begrensde genetische speelruimte, die een transgene muis biedt, een aanzienlijke hindernis om alle menselijke immunoglobuline-5 kiemcel genen te omvatten. Zoals reeds besproken door Jakobovits (Curr Opin Biotechnol., 6:561, 1995) is het uitwisselen in de lichte keten beperkt tot menselijke κ-kiemcelgenen en is een gezamenlijk menselijk repertorium moeilijk te bereiken. Ondanks de bestaande grenzen stelt dit bijzondere, zij het beperkte hulpmiddel, een aantrekkelijke oplossing 10 voor het bereiden van volledige menselijke monoklonale anti lichamen. Zo beschrijft bij wijze van voorbeeld WO 01/14424 een CD152-specifiek anti lichaam, dat met behulp van een menselijk κ-kiemcelgen werd gewonnen.

De onderhavige uitvinding is een substantiëring en voortzetting van U.S. octrooiaanvrage Nr. 10/866.120, die op 22 juni 2004 15 is ingediend, die een verbetering van de technologie van de "plaatsgerichte in vitro immunisering" ("site-directed in vitro immunization", Chin, e.a., Immunol., 81:428, 1994; Eur. J. Immunol., 25:657, 1995) vormt, die door de uitvinders werd bedacht en ontwikkeld. Technieken van de plaatsgerichte in vitro immunisering zijn in vitro 20 werkwijzen voor het stimuleren van menselijke lymfocyten, om een antiüchaamreactie op een eiwitantigeen door het toepassen van een breukstuk van een beoogd eiwit op te wekken en zijn aan de deskundige bekend. Bij wijze van voorbeeld slaagden Zafiropoulos, e.a. (J. Immunol. Methods, 200:181, 1997) erin de bereiding, karakterisering en toepassing 25 van de technologie te herhalen zoals deze door de uitvinder is beschreven. Door het toepassen van een eerder onbegrensde genetische combinatie en daardoor een diversiteit, die inherent is aan menselijke lymfocyten uit verschillende individuen, konden nieuwe structuren worden geïdentificeerd. De nieuwheid kan bij wijze van voorbeeld worden 30 aanschouwelijk gemaakt door de omstandigheid dat een belangrijk λ-kiemcel lijngen kon worden geïdentificeerd, hetgeen een uiterst moelijke, 1029605 t 4 alhoewel in beginsel niet onmogelijke, onderneming zou zijn wanneer een zoals een hierboven beschreven transgeen dier zou worden toegepast.

Opgave van de onderhavige uitvinding is het om een werkingsvolle structuurinformatie van menselijke oorsprong voor het 5 bereiden van menselijke anti lichamen tegen CD152 ter beschikking te stellen, die niet gepaard gaat met ongewenste reacties, zoals een menselijke anti-muis-reactie of allergische reacties.

Om deze opgave op te lossen, omvat de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding voor het bereiden van menselijke anti lichamen de 10 hiernavolgende stappen: (a) het stimuleren van menselijke lymfocyten met CD152-immunogenen in vitro; (b) het identificeren van eventueel screenen (doorzoeken) op menselijke lymfocyten, die antilichamen produceren, die CD152 kunnen 15 herkennen, en (c) het bepalen van de sequentiegegevens van gekloneerde lymfocyten.

Het diagram van Figuur 1 toont de primaire structuur van een IgG-anti lichaam, waarbij dit uit twee zware en twee lichte 20 polypeptidenketens bestaat. Ongebruikelijke eigenschappen wat betreft diversiteit zijn gedeeltelijk op het aanwezig zijn van variabele gebieden en constante gebieden in dezelfde individuele polypeptidenketen terug te voeren. Bovendien is de antigeenbindende plaats, die aan een epitoop bindt en de karakteristieke eigenschap van een anti lichaam uitmaakt, een 25 zak die door gevouwen variabele gebieden van de zware ketens (VH) en de lichte ketens (VL) wordt gevormd. Een analyse van de sequentie van de constante gebieden toonde aan dat alle antilichamen een van twee vormen van de L-keten bezitten, met name κ of λ. Ieder anti lichaam heeft twee identieke κ-ketens of twee identieke λ-ketens. Daarentegen zijn vijf 30 verschillende H-ketens beschreven, μ, δ, γ, β en ε.

Anderzijds zijn Ig-genen in afzonderlijke stukken 1029605 5 gesegmenteerd en kunnen ze toevallig onderhevig zijn aan gezamenlijke splicing. Bij wijze van voorbeeld worden bij menselijke Ig's stukken van een gen die voor Ig coderen, voor H-ketens, κ-ketens en λ-ketens aangetroffen op chromosomen 14, 2, respectievelijk 22. Ig-genstukken zijn | 5 echter niet toevallig in het genoom van zoogdieren verspreid maar zijn geschikt in groepen van variabele (V), veelvuldige (diversity, D), j aangrenzende (joining J) en constante (constant, C) exons (verwezen wordt naar Figuur 2). Voor de variabele gebieden van een antilichaameiwit die bijdragen tot de antigeenbinding wordt gecodeerd door de producten van 10 splicing van de kiemlijngrensstukken V, (D) en J, waarbij V de belangrijkste rol speelt. Het is algemeen aanvaard dat de kiemlijngenen van de zware keten als VH1 tot VH7 worden geklassificeerd, terwijl de kiemlijngenen van de lichte keten als κ tot λ worden geklassificeerd.

Onder fysiologische omstandigheden treden mutaties vooral 15 op in de zogenaamde hypervariabele CDR-gebieden, waarvoor in wezen wordt gecodeerd door het V-kiemlijngrensstuk. Mutaties treden ook op in de raamgebieden (framework regions, FR1s) die afzonderlijke CDR-gebieden flankeren, zij het echter minder frequent. Gedurende het voortschrijden van het immuunantwoord verzekert deze "somatische hypermutatie" dat de 20 gemiddelde affiniteit van de gevormde anti lichamen ten aanzien van het antigeen toeneemt (affiniteitsrijping). Het idee van de onderhavige uitvinding is gebruik te maken van de geschiktheid van de menselijke Ig-kiemlijnstructuren voor anti-CD152-antilichamen, doordat de gerichte in vitro immuniseringstechnieken worden toegepast.

25 Na de sequent! ebepaling van VHn1euw en VLn1euw werd een homologie-onderzoek uitgevoerd om VHnieuw en VLnieuw met alle verschillende V-genen van zoogdieren in één grote GenBank Gegevensbank (National Center for Biotechnology Information; NCBI, Washington, D.C., U.S.A.) te vergelijken, en om andere homologe eiwitten te vinden waarvan de 30 sequenties in de gegevensbanken de beste overeenstemming of de hoogste homologie hadden. Een onderzoek met betrekking tot de homologie werd via 1029605 » 6 het internet onder gebruikmaking van het programma BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) van het NCBI uitgevoerd.

De resulterende nieuwe antilichaamsequenties die uit menselijke kiemlijngenen zijn afgeleid zijn aminozuursequenties van VH 5 (VHn1euw, SEQ ID NR: !) en VL (vLnieuW. SEQ ID NR: 2). Zoals is aangegeven in Figuur 3 en Figuur 4 zijn VH en VL zeer waarschijnlijk afgeleid van de menselijke kiemlijngenen VHn1euw respectievelijk νλ en hebben ze de hoogste homologie ten opzichte daarvan. Bij een vergelijking van de VHn1euw-gegevens met de beschikbare Ig-sequenties komen we tot het besluit dat 10 VHnieuw (SEQ ID NR: 1) zou kunnen zijn geassocieerd met een allelische vorm van het menselijke VH3-kiemlijnstuk. De identiteit met de genen met toegangsnummer AB019439, VH3.30 en VH33 bedraagt 89,8% (88/98 Figuur 3). Uit aligneringen bleek ook een homologie van VLnieuw (SEQ ID NR: 2) ten opzichte van bestaande menselijke Vx-kiemlijngenen. Daarbij werd een 15 waarde van een gelijkenis van 92,13% ten opzichte van genen met de toegangsnummers BAC01778, S78058 en CAA38313 bepaald (Figuur 4). Een hoge gelijkenis ten opzichte van toegankelijke V-kiemlijngenen van menselijke oorsprong, echter niet van een andere oorsprong, is tegelijkertijd een aanwijzing voor een volledig menselijk antiüchaam.

20 Naast de menselijke oorsprong, die door het homologie- algoritme werd bevestigd, vertonen VHnieuw en VLn1euw een specifieke binding aan recombinant menselijk CD152 (Figuur 5). Bovendien bewerkstelligen antilichamen die dergelijke nieuwe structuren omvatten een specifieke binding aan geactiveerde menselijke perifere T-cellen, wanneer de 25 expressie van CD152 is verhoogd (Figuur 6).

De onderhavige uitvinding omvat antilichamen met aminozuursequenties van de zware keten, die volgens enkele uitvoeringsvormen een sequentie-identiteit van bij wijze van voorbeeld meer dan 70%, 75%, 80%, 85%, 90% of 95% met de sequentie van SEQ ID NR: 1 vertonen. Verder omvat 30 de uitvinding antilichamen met aminozuursequenties van de lichte keten, die volgens enkele uitvoeringsvormen een sequentie-identiteit van bij 1029605 7 wijze van voorbeeld meer dan 70%, 75%, 80%, 85%, 90% of 95% met de sequentie van SEQ ID NR: 2 vertonen. Verder omvat de onderhavige uitvinding alle antilichaamfragmenten die uit de volledige anti lichamen volgens de onderhavige uitvinding kunnen worden gewonnen, en die 5 bindingsactiviteit ten aanzien van CTLA-4 vertonen. Voorbeelden van dergelijke fragmenten zijn Fab-fragmenten, (Fab,)2-fragmenten,

Fv-fragmenten, die goed bekend zijn aan de deskundige op het betrokken gebied, en die bij wijze van voorbeeld proteolytisch uit de intacte anti lichamen kunnen worden gewonnen. Dergelijke antilichaamfragmenten 10 kunnen eveneens op recombinante wijze worden bereid, bij wijze van voorbeeld in E. coli of in gisteel 1 en. Voorbeelden voor op recombinante wijze bereide antilichaamfragmenten, die eveneens goed bekend zijn aan de deskundige op het betrokken gebied, zijn Fv-fragmenten, Fab-fragmenten, Fv-fragmenten met enkelvoudige keten (scFv-fragmenten), of dialichamen 15 ("diabodies") om maar slechts enkele van te vermelden.

De anti lichamen volgens de onderhavige uitvinding kunnen volgens een verdere uitvoeringsvorm worden toegepast als antagonisten van menselijke CD152 (CTLA4)-receptoren. Volgens deze uitvoeringsvorm blokkeren ze de signaaltransductie van deze receptoren, zoals reeds is 20 beschreven in U.S.-octrooien 6.051.277, 5.855.887 en 5.811.097. CD152-

Receptoren nemen op remmende wijze deel aan het reguleren van het immuunantwoord door perifere T-cellen. De signaaltransductie van deze CD152-receptoren lijkt onder meer de klonale voorziening van T-cellen met in hoge mate affine T-celreceptoren te begrenzen. Het is bekend dat een 25 blokkeren van CD152-receptoren door anti lichamen de afstoting van een reeks van immunogeen overdraagbare tumorcel lijnen uitlokt, met inbegrip van colorectale carcinoomcellijnen, renale carcinoomcellijnen, lymfoom-cellijnen en fibrosarcoom-cellijnen. Derhalve kunnen de antilichamen volgens de onderhavige uitvinding worden toegepast voor het behandelen 30 van tumorziekten. Voorbeelden voor tumorziekten die kunnen worden behandeld zijn longkanker, darmkanker, maagkanker, botkanker, huidkanker, 1029605 8 baarmoederkanker, ovariumkanker, beenmergkanker, slokdarmkanker, strottenhoofdkanker, leverkanker, borstkanker, testiskanker of prostaatkanker. De behandeling van de hierboven vermelde tumorziekten met behulp van anti lichamen die aan CD152 binden is bij wijze van voorbeeld 5 beschreven in de internationale octrooiaanvrage WO 2005/003298.

Volgens een verdere uitvoeringsvorm kunnen anti lichamen volgens de onderhavige uitvinding worden toegepast voor het behandelen van auto-immuunziekten. Overeenkomstige uitvoeringsvormen zijn bij wijze van voorbeeld beschreven in U.S. octrooiaanvrage 2002/0086014.

10 Voorbeelden voor auto-immuunziekten die kunnen worden behandeld zijn multipele sclerose, myasthenia gravis, morbus Crohn, morbus Basedow, reuma, colitis ulcerosa, myositis, sarcoïdose, lupus erythematodes, het syndroom van Sjögren, het syndroom van Cogan of het syndroom van Guillain-Barré.

15 Volgens een andere uitvoeringsvorm kunnen anti lichamen volgens de onderhavige uitvinding bij de therapie van de infectieziekten worden toegepast. Deze uitvoeringsvorm wordt als bijzonder nuttig beschouwd bij het behandelen van infectieziekten waartegen gebruikelijke entstoffen op dit ogenblik geen of geen volledige bescherming bieden.

20 Daartoe behoren, bij wijze van voorbeeld, HIV, hepatitis, malaria, influenza, herpes, Leishmania of Giardia. De behandeling van de vermelde en verdere infectieziekten zijn beschreven in de hierboven vermelde octrooiaanvrage WO 2005/003298.

Figuur 1 is een schematische weergave van de goed bekende 25 structuur van Ig.

Figuur 2 is een genkaart van de zware keten van menselijke

Ig's.

Figuur 3 toont een alignering van VHl)1euw (SEQ ID NR: 1) met bekende VH-kiemlijnsequenties met de hoogste homologieën.

30 Figuur 4 toont een alignering van VHn1euw (SEQ ID NR: 2) met bekende VL-kiemlijnsequenties met de hoogste homologieën.

1029605 9

Figuur 5 stelt ELISA-reactieprofielen voor van een anti lichaam dat de nieuwe structuren bevat. De probe werd reeksvormig tienvoudig verdund en werd voor het beoordelen van de specificiteit gebruikt.

5 Figuur 6 is een afgebeelde weergave van de rsultaten van een doorstroomcytometrische analyse van CD3+-T-cellen die CD152 tot expressie brengen.

10 1029605 10

In de figuren gebruikte symbolen.

11: variabel gebied 12: lichte keten 13: constant gebied 14: zware keten 15: hypervariabel gebied 17: disulfidenbrug 5 20: lichte kappa-keten (k) 22: lichte lambda-keten (λ)

24: zware keten 30: FR1 van VH

31: CDR1 van VH 32: FR2 van VH

33: CDR2 van VH 34: FR3 van VH

1 ~9S:Aminozuursequentie van VH 10 *: overeenstemming van aminozuren van

het nieuwe gen 40: FR1 van VL

41: CDR1 van VL 42: FR2 van VL

43: CDR2 van VL 44: FR3 van VL

15 1 ~95:Aminozuursequentie van VL

aminozuurdeletie in het nieuwe gen ·: menselijk CD152 : Monoklonaal muis-IgG2a 0: runderserumalbumine tetanusoxoïde (tetanus-entstof)

60: merking van rustende CD3+-T-cellen met behulp van een met het 20 isotype overeenkomende maar irrelevant IgG, evenals een met FITC

gemerkt tweede anti lichaam 62: merking van rustende CD3+-T-cellen met behulp van een anti lichaam dat uit de nieuwe structuren bestond, evenals een met FITC gemerkt tweede anti lichaam 25 64: merking van rustende CD3+-T-cellen met behulp van een met het isotype overeenkomende maar irrelevant IgG, evenals een met FITC gemerkt tweede anti lichaam 66: merking van rustende CD3+-T-cellen met behulp van een anti lichaam dat uit de nieuwe structuren bestond, evenals een met FITC gemerkt 30 tweede anti lichaam 1029605 11

De onderhavige uitvinding verschaft informatie met betrekking tot het bereiden van volledige menselijke anti lichamen die CD152 als het specifieke anti geen herkennen. Met dit doel worden lymfocyten uit natieve menselijke donors in vitro met het CD152-5 immunogeen geïmmuniseerd. Cellen die anti lichamen tegen het anti geen vormen worden geïdentificeerd, geselecteerd en de sequentie daarvan wordt bepaald.

De onderhavige uitvinding omvat ook farmaceutische samenstellingen die als actief bestanddeel een of meer anti lichamen of 10 fragmenten daarvan bevatten, eventueel in combinatie met een farmaceutisch aanvaardbare drager of hulpstoffen. Bij het bereiden van de samenstellingen volgens de onderhavige uitvinding wordt in de regel het actieve bestanddeel/antilichaam/het fragment daarvan met een hulpstof gemengd of in een dergelijke drager ingesloten. De drager kan de vorm van 15 een capsule, een portieverpakking, een papier of een andere houder hebben. Wanneer de farmaceutisch aanvaardbare hulpstof als verdunningsmiddel dient, kan deze ook bestaan uit een vast, een halfvast of een vloeibaar materiaal, dat als vehikel, drager of medium voor het actieve bestanddeel fungeert. De samenstellingen kunnen derhalve de vorm 20 van oplossingen (in het bijzonder van steriele injectie-oplossingen), tabletten, pillen, poeders, bonbons, kussens, capsulen, elixirs, suspensies, emulsies, siroop, aerosol en (in vaste vorm of in een | vloeibaar medium), zalven of zetpillen aannemen. Zalven kunnen bij wijze van voorbeeld tot 10 gewichtsprocent van een anti lichaam bevatten, 25 capsulen kunnen zachte of harde gelatinecapsulen zijn en bij wijze van voorbeeld kan poeder steriel verpakt zijn.

De hiernavolgende voorbeelden die dienen als toelichting van de onderhavige uitvinding. Zij mogen niet op zodanige wijze worden opgevat dat de omvang van de onderhavige uitvinding op om het even welke 30 wijze zou moeten worden beperkt.

1029605 « 12

Voorbeeld 1: Opwekken van anti lichamen teoen CD152.

Buffy coats (leukocytenfilmen) van gezonde bloeddonors, onderzocht op afwezigheid van HIV-1/2, HTLV-I/II, HCV, HbsAg en met een normaal gehalte aan alaninetransferase (ALT), werden betrokken van het 5 Hualien Blood Center, Chinese Blood Services Foundation (Hualien,

Taiwan). Perifere mononucleaire bloedcellen ("peripheral blood mononuclear cells", PBMC's) werden onder toepassing van dichtheidsgradiënt-centrifugatie (400 x g) met behulp van Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Zweden) gewonnen.

10 De verkregen PBMC's werden door middel van CD45R0 MACS- "microbeads" (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) magnetische gemerkt. Aansluitend werden ze met behulp van een VarioMACS-instrument (Miltenyi Biotec) in ondergroepen gescheiden. De geëlueerde CD45RO+-cellen werden door centrifugeren bij 100 x g gewonnen en werden onmiddellijk 15 aansluitend in cultuur genomen, met een dichtheid van 2 x 106 cellen/ml in RPMI-1640-medium (HyQ(merk); HyClone, Logan, UT), verrijkt met 1 x niet essentiële aminozuren (Life Technologies, Grand Island, NY), 10% menselijk serum, 50 pg/ml gentamycine/kanamycine (China Chemical & Pharmaceutical, Taipeh, Taiwan), 50 μΜ β-mercaptoëthanol en 10 pg/ml van 20 "pokeweed"-mitogeen; PWM Sigma Chemicals, St. Louis, MO). Na een incubatietijd van 24 uren werden de cellen door een centrifugatie bij i 400 x g gepelleteerd en uitgenomen. Tenslotte werd een CD45R0+-T-cel-vervangoplossing in de vorm van het bovenstaande gewonnen. Daartoe wordt het overblijvende bovenstaande uit de cel cultuur door een filter met 25 poriën met 0,45 mm gevoerd en in ingevroren vorm bij -20 *C opgeslagen.

Een magnetische cel vermindering van de PBMC's werd uitgevoerd om cytotoxische celpopulaties te verwijderen die een immunisering in vitro remmen. Colloïdale superparamagnetische microbeads, die met monoklonale anti-muis-CD8- en anti-CD56-antilichamen (Miltenyi 30 Biotec) geconjugeerd waren, werden gebruikt zoals hierboven is beschreven. PBMC's, waarvan het gehalte aan cytotoxische cellen was 1029605

V

13 verlaagd, werden in vitro onder toepassing van een protocol in twee stappen geïmmuniseerd. Een aanvankelijke immunisering werd door een incubatie van 6 dagen van de cellen bereikt in een medium dat CD152-immunogenen evenals 50 μΜ van β-mercaptoëthanol, 10% door verhitting 5 geïnactiveerd menselijk serum, 0,05 ng/ml van rIL2 (Calbiochem, San Diego, CA) en 25% (v/v) CD45R0+-T-cel-vervangoplossing bevatte. Op de | zevende dag werden cellen die aan de aanvankelijke immunisering waren | onderworpen gewonnen en door 40% Ficol-Paque gesedimenteerd. Voor een secundaire immunisering werden 3 x 107 cellen in een fles met CD152-10 immunogenen in contact gebracht, welke overnacht met 5 μg/ml en CD40L (CD154; Vinei-Biochem, Vinei, Italië) waren geïmmobiliseerd. De cellen werden gedurende 3 dagen tot 5 dagen in cultuur gebracht in een medium waaraan 5% menselijk serum, 50 μπι van β-mercaptoëthanol en 10 nM van peptidenantigeen was toegevoegd.

15 De in vitro geïmmuniseerde cellen werden dan geïnfecteerd met EBV. Kort samengevat werden 107 lymfocyten gedurende 2 uren bij 37 eC onder af en toe opnieuw in suspensie brengen geïncubeerd met 1 ml van een bovenstaande dat EBV bevatte. Dit bovenstaande was verkregen uit de cultuur van EBV-producerende klauwapencellijn B95-8 (American Type 20 Culture Collection, ATCC CRL 1612; bereidwillig ter beschikking gesteld door Dr. L.-F. Shu, Tri-Service General Hospital, Taipeh). De geïnfecteerde cellen werden met een dichtheid van 105 cellen/vakje in een I standaardcultuurplaat met 96 vakjes samen met feeder-cell en uitgezaaid.

Als feeder-cell en dienden PBMC's (104 cellen/vakje), die met mytomycine 25 (Kyowa Hakko Kogyo, Tokio, Japan) waren behandeld. Het voorkomen van een reatievermogen ten aanzien van CD152 werd onder toepassing van een antigeen-specifieke enzym-gekoppelde immunosorbenttest (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) onderzocht.

Voorbeeld 2: Karakteriseren van menseli.ike antilichamen 30 tegen CD152 onder toepassing van ELISA.

Voor het uitvoeren van een ELISA werden bij een eerste stap 1029605 t 14 microtiterplaten overnacht bij kamertemperatuur met één van de hiernavolgende eiwitten verzadigd: (1) een recombinant menselijk CD152 (CTLA-4)-muis-Ig-fusie-eiwit, dat door BHK-cellen tot expressie gebracht was (Ancell 5 Corporation, Bayport, MN), in een concentratie van 1 μg/ml; (2) een monoklonaal muis-IgG2a (Ancell) in een concentratie van 1 μg/ml; (3) runderserumalbumine (Sigma) in een concentratie van 10 pg/vakje, of 10 (4) tetanustoxoïde (tetanus-entstof, TT, ADImmune

Corporation, Taichung, Taiwan) in een concentratie van 10 pg/vakje. Bovenstaanden van de cel cultuur werden op het gewenste niveau verdund in 10 mm natriumfosfaat, pH 8,0, dat 0,5 M natriumchloride en 0,1% Tween-20 bevatte. De verzadigde microtiterplaten werden met de verdunde 15 bovenstaanden van cel cultuur geïncubeerd en gewassen. Aansluitend werden ze geïncubeerd met gei tenanti lichaam en gemerkt met peroxidase, die tegen menselijk IgG waren gericht (Zymed Laboratories, So. San Francisco, CA). Door het toevoegen van 100 μΐ van het chromogene substraat orthofenyldiamine (0PD) werd de detectiereactie op gang gebracht. De 20 reactie werd na 30 minuten beëindigd door het toevoegen van 1 M

zwavelzuur en de absorptie bij 490 nm werd gemeten. Er werden met EPB geïnfecteerde lymfoblastoïde cellen geïdentificeerd die vermoedelijk anti lichamen tegen CD142 afscheiden, en werden onder toepassing van beperkende verdunning gekloneerd. Zoals aangegeven in Figuur 5 reageerde 25 het geïdentificeerde antilichaam op specifieke wijze met CD152, echter niet met antigenen die daarmee niet verwant zijn zoals, bij wijze van voorbeeld, IgG2a van de muis, runderserumalbumine of tetanus-toxoïde.

Voorbeeld 3: Identificeren van nieuwe structuren.

De primaire structuren van de nieuwe anti lichamen werden 30 door het bepalen van de sequentie van cDNA verkregen uit gekloneerde

anti-CD152-specifieke cellen afgeleid. Kort samengevat werd poly(A)+-RNA

1 029605 15 uit 2 x 104 cellen met behulp van de Dynabeads(merk) mRNA DIRECT (merk) Micro Kit (Dynal Biotech, Oslo, Noorwegen) afgezonderd. Het gezuiverde mRNA werd dan als een matrijs voor de reverse-transcriptiepolymerase-kettingreactie (reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) 5 toegepast. De RT-PCR werd met behulp van het Titan One Tube RT-PCR-systeem (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) uitgevoerd. Gebruikte PCR-primer-probes (1 μΜ) waren: HuVH-JH (SEQ ID NR: 3 en SEQ ID NR: 4) voor het amplificeren van menselijk VH en HuVA (SEQ ID NR: 5 en SEQ ID NR: 6) voor het amplificeren van menselijk VL. De 10 37 temperatuur-cycli omvatten het volgende: een denatureringscyclus van 2 minuten bij 94 “C, 35 cycli van een denaturering van 3 minuten bij 94 °C, 30 seconden annealing bij 51 #C en een verlenging van 1 minuut bij 68 °C; evenals een afsluitende cyclus van verlenging van 10 minuten bij 68 °C. De PCR-fragmenten die bij de agarosegelelektroforese één enkele 15 band vertoonden werden onderworpen aan een bepaling van de sequentie van de nucleotiden. De sequenties werden geverificeerd (Molecular Clinical Diagnostic Laboratory, DR: Chip Biotechnology, Inc., Taipei, Taiwan) en werden omgezet in aminozuren.

Voorbeeld 4: Identificerino van nieuwe structuren.

20 Voor het karakteriseren van de specificiteit van de binding van het menselijke antilichaam tegen CD152 werd de binding daarvan aan het celoppervlak van menselijke perifere T-lymfocyten onderzocht, welke in vitro waren gestimuleerd. Daartoe werden culturen van PBMC's met aantoonbaar verhoogde expressie van CD152 aan het oppervlak tot stand 25 gebracht. Kort samengevat werden culturen van 10 ml met 2 x 106 cellen/ml, die 10 μο/ιηΐ van fytohemagglutinine (PHA; GE Healthcare), 10 ng/ml van forbol-12-myristaat-13-acetaat (PMA, Sigma), 10% autoloog (dit wil zeggen van hetzelfde individu afkomstig) plasma en RPMI-164-medium bevatten, in een bevochtigde atmosfeer van 50% C02 in de lucht bij 30 37 *C gedurende 72 uren geïncubeerd. De op deze wijze verkregen cellen werden onderworpen aan een doorstroomcytometrische analyse met twee 1 02960 5 1 » 16 kleuren, om de expressie van CD152 aan het oppervlak te bepalen. Er werd gebruikgemaakt van een FACSCalibur-cytometer (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, CA) die verbonden was met een j

Macintosh computer. De uitwerking van de gegevens werd uitgevoerd met 5 behulp van het programma Cell Quest (Becton Dickinson). Logaritmisch geamplificeerde fluorescent!egegevens werden van 10.000 CD3-cellen gewonnen. Alle doorstroomcytometrische kleurstappen werden uitgevoerd bij 4 *C in een doorstroomcytometrische buffer (13 PBS, 0,01% NaN3, 12% runderserumalbumine; Sigma). Voor de extracellulaire detectie van CD152 10 werden geactiveerde cellen eerst met monoklonale anti-CD3-PE-antilichamen en met het nieuwe menselijke anti-CD152-antilichaam of met een isotype-controle behandeld. De kleuring van het oppervlak werd uitgevoerd met FITC-geconjugeerd anti-mensel ijk IgG. De in Figuur 6 weergegeven resultaten tonen aan dat de nieuwe menselijke anti lichamen tegen CD152 15 bij voorkeur met geactiveerde CD3+-T-cellen reageren (7,31% ten opzichte van 2,38%) die CD152 in grotere hoeveelheden tot expressie brengen. Het weergegeven resultaat is representatief voor vier onafhankelijk uitgevoerde proefnemingen.

Alhoewel de onderhavige uitvinding is toegelicht aan de 20 hand van een de voorkeur verdienende uitvoeringsvorm, zou het vanzelfsprekend moeten zijn dat veel andere mogelijke wijzigingen en variaties kunnen worden uitgevoerd, zonder van de geest en de omvang van de onderhavige uitvinding, zoals hierna in de conclusies vermeld, af te wijken.

1029605 17 ί

Seauentieli.ist <110> Chishih Chu

Shu-Ching Hsu Li-Te Chin <120> Nieuwe uit menselijke kiemlijnsequenties gewonnen antilichaam-structuren <160> 6 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens <221> BINDING: voor een specifieke binding aan recombinant menselijk CD152 noodzakelijk; VERGELIJKBAAR: menselijke VH3 kiemlijngenen.

<:222> (1)...(98) <400>

Gin Val Asn Leu Arg Glu Sér Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 IS

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala lie lie Tyr Tyr Asp Gly Arg Lys lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr val Ser 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg

<210> 2 <211> 89 <212> PRT

<213> Homo sapiens <221> BINDING: voor een specifieke binding aan recombinant menselijk CD152 noodzakelijk; VERGELIJKBAAR: menselijke V* kiemlijngenen.

<222> (1)...(89) <400>

Ser Tyr Val Leu Thr Gin Pro Pro -Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gin 1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn ïle Gly Asn Ash 20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gin His Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45

Ile Tyr Arg Ser Lys Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 · 55 60

Gly ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala ;ïle Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 1029605 ' * 18 <210> 3 <211> 23 <212> DMA <213» Kunstmatig <220> <221> V_Segment <223> Voor een primer voor RT-PCR ontworpen aan de hand van lengte, sequentiehomologie en smeltpunt.

<400> caggtcaact taagggagtc tgg 1 23 <210> 4 <2X1> 23 <212> DNA <213> Kunstmatig <22.0> <221> V_Segment <223> Voor een primer voor RT-PCR ontworpen aan de hand van lengte, sequentiehomologie en smeltpunt.

<400> tgagagacgg tgaccgtggt ccc 1 23 <210> 5 <211>· 23 <212> DMA <213> Kunstmatig <220> <221.> V_segment <223> Voor een primer voor RT—PCR ontworpen aan de hand van lengte, sequentiehomologie en smeltpunt.

<400> tcctatgtgc tgactcagcc acc 1 23 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Kunstmatig <220> <221> V_Segmént <223> Voor een primer voor RT-PCR ontworpen aan de hand van lengte, sequentiehomologie en smeltpunt.

<400> acctaggacg gtgaccttgg tecc 1 24 1029605

Claims (5)

1. Menselijk anti lichaam, dat in staat is om menselijk CD152 (CTLA-4) te binden, of een antilichaamfragment daarvan, waarbij de zware 5 keten van het antilichaam uit het menselijke kiemlijngen VH3 en de lichte keten uit het menselijke kiemlijngen νλ zijn afgeleid.

2. Antilichaam volgens conclusie 1, waarbij de aminozuur-sequentie van de zware keten een sequentie-identiteit van ten minste 70% met de sequentie van SEQ ID NR: 1 heeft.

3. Antilichaam volgens conclusie 1, waarbij de aminozuur- sequentie van de lichte keten een sequentie-identiteit van ten minste 70% met de sequentie van SEQ ID NR: 2 heeft.

4. Toepassing van een antilichaam volgens conclusie 1 voor de diagnose of de behandeling van menselijke ziekten die door overexpressie 15 of onderexpressie van CD152 worden veroorzaakt.

5. Farmaceutische samenstelling die een antilichaam volgens een der conclusies 1 tot 3 bevat. 1029605