UA122390C2 - Інтерналізоване моноклональне антитіло, що зв'язується з людським рецептором інсуліноподібного фактора росту (igf-1r) - Google Patents

Інтерналізоване моноклональне антитіло, що зв'язується з людським рецептором інсуліноподібного фактора росту (igf-1r) Download PDF

Info

Publication number
UA122390C2
UA122390C2 UAA201611832A UAA201611832A UA122390C2 UA 122390 C2 UA122390 C2 UA 122390C2 UA A201611832 A UAA201611832 A UA A201611832A UA A201611832 A UAA201611832 A UA A201611832A UA 122390 C2 UA122390 C2 UA 122390C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
sequence
rgo
guz
siu
Prior art date
Application number
UAA201611832A
Other languages
English (en)
Inventor
Ліліан Гьотш
Лилиан ГЁТШ
Маттьйо Брусса
Шарлотт БО-ЛАРВОР
Тьєррі Шампьйон
Тьерри Шампьйон
Ален РОБЕР
Original Assignee
Пьєр Фабр Медікамент
Пьер Фабр Медикамент
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Пьєр Фабр Медікамент, Пьер Фабр Медикамент filed Critical Пьєр Фабр Медікамент
Publication of UA122390C2 publication Critical patent/UA122390C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)

Abstract

Винахід стосується інтерналізованого моноклонального антитіла, що зв'язується з людським рецептором інсуліноподібного фактора росту 1 (IGF-1R), кон’югату антитіло-лікарський засіб для лікування рака, експресуючого IGF-1R, фармацевтичної композиції, що містить таке антитіло, для доставки лікарського засобу або медикаменту до ракової клітини, що експресує IGF-1R, а також мишачої гібридоми, депонованої в CNCM під номером І-4757, для одержання даного антитіла.

Description

Даний винахід відноситься до нового антитіла, зокрема, до моноклонального антитіла, яке здатне зв'язуватися з ІЗЕ-1К, а також до аміно- і нуклеїновокислотних послідовностей, що кодують зазначене антитіло. В одному з аспектів даний винахід відноситься до нового антитіла або його антигенз'вязуючого фрагмента, яке здатне зв'язуватися з ІСОБ-1К і, індукуючи інтерналізацію ІСЕ-1К, інтерналізуватися клітиною. Даний винахід також включає застосування зазначеного антитіла як адресуючого продукту або переносника у кон'югації з іншими протираковими сполуками, такими як токсини, радіоактивні елементи або лікарські засоби, а також застосування їх для лікування деяких видів раку.
Рецептор інсуліноподібного фактора росту 1, званий ІСБ-1К (також званий ІСР1К або ІСЕ-
ІК), є рецептором з тирозинкіназною активністю, що має 7095 гомологію з рецептором інсуліну
ІВ. І2Б-1Е є глікопротеїном з молекулярною масою приблизно 350000. Це гетеротетрамерний рецептор, у якого кожна з половин, зв'язаних дисульфідними містками, складається з позаклітинної с-субодиниці і трансмембранної В-субодиниці. ЗЕ-1К. зв'язує ІСЕ1 і ІСЕ2 з дуже високою афінністю (Ка 1 нМ), але в рівній мірі здатний зв'язуватися з інсуліном з афінністю, яка у 1000-1000 разів нижче. | навпаки, ІК зв'язує інсулін з дуже високою афінністю, хоча ІСЕ зв'язуються лише з рецептором інсуліну з афінністю, яка у 100 разів нижче. Тирозинкіназні домени ІСЕ-1К і ІК мають дуже високу міру гомології послідовностей, хоча зони слабкішої гомології, відповідно, зачіпають багаті цистеїном області, розташовані в «-субодиниці і в С- кінцевій частині В-субодиниці. Відмінності послідовностей, спостережувані в а-субодиниці, розташовані в зоні зв'язування лігандів і, отже, формують відносну афінність МЗБ-1К і ІК відносно ІСЕ і інсуліну, відповідно. Відмінності у С-кінцевій частині В-субодиниці приводять до розбіжності у сигнальних шляхах двох рецепторів; ІЗЕ-1ЖК опосередкує мітогенні, диференціювальні і антиапоптотичні ефекти, тоді як активація ІК головним чином включає вплив на рівні метаболічних шляхів.
Цитоплазматичні тирозинкіназні білки активуються шляхом зв'язування ліганду з позаклітинним доменом рецептора. Активація кіназ, у свою чергу, включає стимуляцію різних внутрішньоклітинних субстратів, у тому числі ІК5-1, ІВ5-2, 5пс ії бгр 10. Двома основними субстратами ІСБ-1К є ІКЗ і Зпс, які опосередковують (шляхом подальшої активації численних ефекторів) більшість ефектів росту і диференціювання, пов'язаних з приєднанням ІСЕ до цього
Зо рецептора. Отже, наявність субстратів може диктувати кінцевий біологічний ефект, пов'язаний з активацією ІСЗЕ-1К. Коли переважає ІК5-1, клітини мають тенденцію до проліферації і трансформації. Коли переважає Зпс, клітини мають тенденцію до диференціювання. Мабуть, основним шляхом, що бере участь в ефектах захисту від апоптозу, є шлях фосфатидил-інозит-
З-кіназ (РІ З-кіназ).
Роль системи ЗЕ у канцерогенезі стала предметом інтенсивних досліджень протягом останніх десяти років. Це зацікавлення викликало відкриття того факту, що на додаток до своїх мітогенних і антиапоптотичних властивостей ІСЗЕ-1, мабуть, необхідний для створення і підтримки трансформованого фенотипу. Насправді, добре встановлено, що надекспресія або конститутивна активація ІСЕ-1Щ приводить у великої кількості різних клітин до росту клітин незалежно від підкладки у середовищі, позбавленому фетальної бичачої сироватки, і до утворення пухлин у голих мишей. Це саме по собі не є унікальною властивістю, оскільки клітини можуть трансформуватися під впливом різних продуктів надекспресованих генів, включаючи велику кількість рецепторів факторів росту. Проте, вирішальне відкриття, яке наочно продемонструвало важливу роль, яку відіграє ІСЕ-1К у трансформації, полягало в тому, що
ІЯЕ-1А-клітини, в яких ген, що кодує ІСЕ-1К, був інактивований, виявилися повністю резистентними до трансформації різними агентами, які зазвичай здатні трансформувати клітини, такими як білок Е5 вірусу папіломи великої рогатої худоби, надекспресія ЕСЕК або
РОСРЕРЕ, Т-антиген 5М-40, активований газ або комбінація цих двох останніх факторів.
ІСЕ-1К експресується у великій різноманітності пухлин і пухлинних ліній, і ІЗЕ посилюють ріст пухлини при їх прикріпленні до ІЗЕ-1К. Інші аргументи на користь ролі ІЗБ-1К у канцерогенезі походять з досліджень з використанням мишачих моноклональних антитіл, спрямованих проти рецептора, або з використанням негативних домінант ІЗЕ-1К. Справді, мишачі моноклональні антитіла, спрямовані проти ІСБ-1К, інгібують проліферацію численних клітинних ліній в культурі і ріст пухлинних клітин іп мімо. Також було показано, що негативна домінанта ІСБЕ-1К здатна інгібувати пухлинну проліферацію.
У такому контексті ІСЕ-1К розглядався протягом довгого часу як цікава мішень в онкології.
Для розробки антитіл проти ІСЕ-1К для лікування ракових захворювань було розпочато велику кількість проектів, орієнтованих на ІСЕ-1К (гуманізовані або людські антитіла або малі молекули), і було проведено більше 70 клінічних випробувань при різних показаннях. Проте, на бо сьогоднішній день жоден з цих проектів не був успішним, і на ринку немає антитіл проти ІБЕ-1В8 не дивлячись на часту надекспресію цієї мішені, описану у багатьох пацієнтів при великій різноманітності показань.
Крім того, був невдалим ряд клінічних випробувань із залученням анти-ІСсЕ-1В-антитіл у поєднанні з анти-ЕСЕВ-антитілами для націлювання як на рецептор епідермального фактора росту, так і на ІСЕ-1КЕ, оскільки жодне з цих антитіл не було здатне лікувати пацієнтів з мутацією
КВАБ.
Як наслідок, ІЗЕ-1ЖК в даний час не розглядається як основна мішень, і при пошуку потенційних терапевтичних антитіл ІСЕ-1К, мабуть, більше не викликає особливого інтересу.
Проте, слід також зазначити, що зусилля, спрямовані на створення ІСБЕ-1В-антитіл, були зосереджені на голих антитілах, тобто антитілах, використовуваних завдяки їх власним властивостям. У цьому сенсі ІЗЕ-1К розглядається як мішень, не відповідна для створення імунокон'югата, такого як кон'югат "антитіло - лікарський засіб" (згадуваний як "АОС"), оскільки
ІЯЕ-1ЇК описується як мішень, яка також широко експресується нормальними клітинами, зокрема, клітинами кровоносних судин. У цьому сенсі можна зазначити, що найостанніше ІСЕ- 1ВА-антитіло, тобто АМЕ1642, розроблене як голе антитіло, не озброєне лікарським засобом.
Цей же процес знаходиться в даний час у процесі розробки з іншими антитілами проти ІСБЕ-1К і з усіма тими антитілами, які спіткала невдача у клінічних випробуваннях.
В одному з аспектів даний винахід має тенденцію до усунення цих проблем і описує анти-
ІСЕ-1В-антитіло, здатне зв'язуватися з ІЗЕ-1К певним чином, так що воно може бути використане для озброєння лікарським засобом. Конкретніше, даний винахід відноситься до
ІСЕ-1АВ-антитела, що представляє особливі властивості, такі як те, що воно є ідеальним кандидатом для застосування в озброєному вигляді у контексті імунокон'югата.
У першому втіленні даний винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язучого фрагмента, який і) зв'язується з людським ІСБ-1К, і ії) інтерналізується після зв'язування із зазначеним людським ІСЕ-18.
Терміни "антитіло", "антитіла", "ар" "АБ" або "імуноглобулін" використовуються взаємозамінно в найширшому сенсі і включають моноклональні антитіла, ізольовані, інженерні, хімічно синтезовані або рекомбінантні антитіла (наприклад, повнорозмірні або інтактні моноклональні антитіла), поліклональні антитіла, полівалентні антитіла або мультиспецифічні
Зо антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла), а також фрагменти антитіл доти, доки вони виявляють потрібну біологічну активність. В одному втіленні даний винахід відноситься до рекомбінантного антитіла.
Конкретніше, така молекула складається з глікопротеїну, що містить щонайменше два важких (Н) ланцюга і два легких (І) ланцюга, сполучених дисульфідними зв'язками. Кожний важкий ланцюг містить варіабельну область (або домен) важкого ланцюга (скорочену тут як
НСМК або МН) і константну область важкого ланцюга. Константна область важкого ланцюга складається з трьох доменів, СНІ, СН2 і СНЗ. Кожний легкий ланцюг містить варіабельну область легкого ланцюга (скорочену тут як СМР або МІ) і константну область легкого ланцюга.
Константна область легкого ланцюга містить один домен, СІ... Області МН і МІ можна додатково підрозділити на області гіперваріабельності, звані ділянками, що визначають комплементарність (від англ. - сотріетепіату аегептіпіпуд гедіоп (СОК)), які чергуються з областями, що є більш консервативними, званими каркасними областями (їШатемогк гедіоп,
ЕК). Кожна МН і МІ. складається з трьох СОК і чотирьох ЕК, розташованих у напрямі від аміно- кінця до карбокси-кінця в наступному порядку: ЕК1, СОМКІ, ЕК2, СОК2, ЕКЗ, СО, ЕКА4.
Варіабельні області важких і легких ланцюгів містять зв'язуючий домен, який взаємодіє з антигеном. Константні області антитіл можуть опосередковувати зв'язування імуноглобуліну з тканинами або факторами хазяїна, включаючи різні клітини імунної системи (наприклад, ефекторні клітини) і перший компонент (С14) класичної системи комплементу.
Терміни "ІСЕ-1В-зв'язуючий фрагмент" або "антигензв'язуючий фрагмент" антитіла згідно з
БО винаходом позначають будь-який пептид, поліпептид або білок, що зберігає здатність зв'язуватися з мішенню (також зазвичай званою антигеном), як у зазначеного антитіла.
В одному втіленні такі "антигензв'язуючі фрагменти" вибрані з групи, що включає фрагменти
Ем, 5сЕм (56 означає "одноланцюговий"), аб, Е(ар)», Рар", 5сЕм-Ес або димерні антитіла або будь-який їх фрагмент, час напівжиття якого був збільшений шляхом хімічної модифікації, такої як додавання полі(алкілен)гліколю, такого як полі(етилен)гліколь ("ПЕГілювання") (пегільовані фрагменти називають ЕУ-ПЕГ, 5сЕм-ПЕГ, Раб-ПЕГ, Е(аб)2-ПЕГ або Раб'-ПЕГ) СПЕГ" означає полі(етилен)гліколь), або шляхом включення у ліпосому, при цьому зазначені фрагменти мають щонайменше одну з характерних СОК антитіла згідно з винаходом. Переважно, зазначені "антигензв'язуючі фрагменти" складатимуться або включатимуть часткову послідовність 60 важкого або легкого варіабельного ланцюга антитіла, з якого вони отримані, при цьому зазначена часткова послідовність є достатньою для збереження такої ж специфічності зв'язування, як і в антитіла, з якого вона отримана, і достатньої афінності по відношенню до мішені, переважно рівній щонайменше 1/100, у переважнішому варіанті щонайменше 1/10 від афінності антитіла, з якого вона отримана. Більш переважно зазначені "антигензв'язуючі фрагменти" складатимуться з або міститимуть щонайменше три СОК, СОК-НІ, СОВ-Н2 і СОБ-
НЗ, важкого варіабельного ланцюга, і три СОЖК, СОБК-І1, СОВ-12 і СОК-І3, легкого варіабельного ланцюга антитіла, з якого вони отримані.
Під терміном "зв'язування", "зв'язує" і т. п. мається на увазі, що антитіло або будь-який його антигензв'язуючий фрагмент утворює з антигеном комплекс, який відносно стабільний у фізіологічних умовах. Специфічне зв'язування можна охарактеризувати рівноважною константою дисоціації, яка складає щонайменше приблизно 1х105 М або менше. Способи визначення чи зв'язуються дві молекули, добре відомі в даній області і включають, наприклад, рівноважний діаліз, поверхневий плазмонний резонанс і т.п. Щоб уникнути сумнівів, це не означає, що зазначене антитіло не може зв'язувати або заважати, на низькому рівні, іншому антигену. Проте, як одне з втілень зазначене антитіло зв'язується лише з зазначеним антигеном.
Використовуваний в даному описі вираз "ІЗЕ-1ЩН-антитіло" слід інтерпретувати як аналогічний виразу "антитіло проти ІЗБЕ-1К", і він означає антитіло, здатне зв'язуватися з ІСЕ- 18.
В одному втіленні даної заявки епітоп антитіла локалізується у позаклітинному домені людського ІЗЕ-1Е (також званому ІСЕ-18 ЕСБ).
У конкретному втіленні зазначене антитіло або будь-який його антигензв'язуючий фрагмент здатний зв'язуватися з ІЗЕ-1К з ЕСво, що знаходиться в діапазоні від 10х10-79 до 1х10-719, і переважніше в діапазоні від 8х1079 до 2х10-79 М.
У цьому сенсі термін "ЕСво" відноситься до 50950 ефективної концентрації. Точніше, термін "половина максимальної ефективної концентрації" (ЕСво) відповідає концентрації лікарського засобу, антитіла або токсиканта, що індукує реакцію, що знаходиться на середині між базальним і максимальним рівнем після певного заданого часу експозиції. Він широко використовується як міра сили лікарського засобу. Таким чином, ЕСзхо градуйованої кривої "доза
Зо - відповідь" є концентрацією сполуки, за якої спостерігається 50905 від її максимального ефекту.
ЕСво у квантовій кривій "доза - відповідь" є концентрацією сполуки, за якої 5095 популяції демонструє відповідь після експозиції протягом вказаного часу. Значення концентрації, зазвичай, слідують сигмоподібній кривій, швидко зростаючи при порівняно невеликій зміні концентрації. Їх можна визначити математично шляхом виведення лінії найкращої відповідності.
У переважному втіленні ЕСв5о, визначена в даному винаході, характеризується силою зв'язування антитіла з ІЗЕ-1К ЕСО, експонованим на пухлинних клітинах людини. Параметр
ЕСз5о визначають за допомогою аналізу ГАС5. Параметр ЕСб5о відображає концентрацію антитіла, за якої виходить 5095 від максимального зв'язування людського ІСБ-18, експресованого на пухлинних клітинах людини. Кожне значення ЕСзо розраховували як середню точку кривої "доза - відповідь" за допомогою програми чотирипараметричної підгонки кривої регресії (Ргізт Зоймаге) Цей параметр було вибрано як репрезентативний для фізіологічних/патологічних станів.
Термін "епітоп" являє собою область антигена, яка зв'язується антигензв'язуючим білком, у тому числі антитілом. Епітопи можуть бути визначені як структурні або функціональні.
Функціональні епітопи, зазвичай, є підгрупою структурних епітопів і мають ті залишки, які безпосередньо сприяють афінності взаємодії. Епітопи також можуть бути конформаційними, які складаються з нелінійних амінокислот, іншими словами, конформаційні епітопи складаються з непослідовних амінокислот. У деяких втіленнях епітопи можуть включати детермінанти, які є хімічно активними поверхневими угрупуваннями молекул, такими як амінокислоти, бічні цукрові ланцюги, фосфорильні групи або сульфонільні групи, а також, в деяких втіленнях, вони можуть мати специфічні тривимірні структурні характеристики і/або специфічні характеристики заряду.
У конкретному втіленні даний винахід відноситься до способу вибору інтерналізованого антитіла або його інтерналізованого ІСЕ-1Н-зв'язуючого фрагмента, який зв'язується з людським рецептором інсуліноподібного фактора росту 1 (ІСБ-1К) і інтерналізується після його зв'язування з ІСЕ-1Н, де зазначений спосіб включає етап вибору антитіла: ї) яке зв'язується з ІСЕ-1К послідовності 5ЕО ІЮ МО:52, і ії) яке не зв'язується з ІЗЕ-1К послідовності «ЕО ІЮ МО:52 з амінокислотою у позиції 494 в
ЗЕО ІЮ МО:52, що відрізняється від гістидину, або з аспарагіновою кислотою (АБ5Р) у позиції 491, переважно, яке не зв'язується з ІЗЕ-1К послідовності ЗЕО ІЮ МО:52 з амінокислотою, що бо відрізняється від гістидину, у позиції 494 в 5ЕО ІЮ МО:52 і з аспарагіновою кислотою (АЗР) у позиції 491.
У конкретнішому втіленні даний винахід відноситься до способу вибору інтерналізованого антитіла або його інтерналізованого ІСЕ-1Н-зв'язуючого фрагмента, який зв'язується з людським рецептором інсуліноподібного фактора росту 1 (ІСБ-1К) і інтерналізується після його зв'язування з ІСЕ-1К, де зазначений спосіб включає етапи: 1) вибору антитіла: ї) яке зв'язується з ІСЕ-1К послідовності 5ЕО ІЮ МО:52, і ії) яке не зв'язується з ІЗЕ-1К послідовності «ЕО ІЮ МО:52 з амінокислотою у позиції 494 в
ЗЕО ІЮ МО:52, що відрізняється від гістидину, або з аспарагіновою кислотою (АЗ5Р) у позиції 491, переважно, яке не зв'язується з ІЗЕ-1К послідовності ЗЕО ІЮ МО:52 з амінокислотою, що відрізняється від гістидину, у позиції 494 в 5ЕО ІЮ МО:52 і з аспарагіновою кислотою (АЗР) у позиції 491, і потім з цих антитіл 2) вибору інтерналізованого антитіла або його ІСЕ-1НВ-зв'язуючого фрагмента, відсоток інтерналізації якого після його зв'язування з ІСЕ-1Ж4 складає щонайменше 4095, переважно щонайменше 5095, щонайменше 6095, щонайменше 7095 або щонайменше 8095.
В іншому конкретному втіленні даний винахід відноситься до способу вибору інтерналізованого антитіла або його інтерналізованого ІСЕ-1В-зв'язуючого фрагмента, який зв'язується 3 людським рецептором інсуліноподібного фактора росту 1 (ІСБ-1К) і інтерналізується після його зв'язування з ІСЕ-1К, де зазначений спосіб включає етапи: 1) вибору інтерналізованого антитіла або його ІСЕ-1В-зв'язуючого фрагмента, відсоток інтерналізації якого після його зв'язування з ІСЕ-1К складає щонайменше 4095, переважно щонайменше 5095, щонайменше 6095, щонайменше 7095 або щонайменше 8095, 2) і потім вибір з цих антитіл такого антитіла: ї) яке зв'язується з ІСЕ-1К послідовності 5ЕО ІЮ МО:52, і ії) яке не зв'язується з ІЗЕ-1К послідовності «ЕО ІЮ МО:52 з амінокислотою у позиції 494 в
ЗЕО ІЮ МО:52, що відрізняється від гістидину, або з аспарагіновою кислотою (АЗР) у позиції 491, переважно, яке не зв'язується з ІЗЕ-1К послідовності ЗЕО ІЮ МО:52 з амінокислотою, що відрізняється від гістидину, у позиції 494 в 5ЕО ІЮ МО:52 і з аспарагіновою кислотою (АР) у
Зо позиції 491.
У способі згідно з цим винаходом етап вибору антитіла за його характеристиками інтерналізації і зв'язування або не зв'язування з ІЗЕ-1К може бути виконаний у будь-якому порядку дотримання.
Відповідно до конкретного втілення цей винахід відноситься до інтерналізованого антитіла або його інтерналізованого ІСЕ-1В-зв'язуючого фрагмента, який зв'язується з людським рецептором інсуліноподібного фактора росту 1 (ІСБЕ-1К), наприклад, отриманому за допомогою одного з зазначених вище способів згідно з винаходом.
В іншому конкретному втіленні цей винахід відноситься до інтерналізованого антитіла або його інтерналізваного ІСЕ-1В-зв'язуючого фрагмента, який зв'язується з людським рецептором інсуліноподібного фактора росту 1 (ІСБЕ-1К) послідовності ЗЕО ІЮО МО:52 і інтерналізується після його зв'язування з ІСБЕ-1К, і який не зв'язується з ІЗЕ-1К послідовності ЗЕО ІЮ МО82 або 92, переважно ЗЕО ІЮ МО:82 і 92.
Для антитіла згідно з даним винаходом 5ЕО ІЮ МО:52 відповідає амінокислотній послідовності людського рецептора ІСЕ-1К, в якій є гістидин у позиції 494, тобто ІЗБЕ-1К дикого типу, тоді як 5ЕО ІЮ МО:82 відповідає мутантній амінокислотній послідовності людського рецептора ІСБЕ-1К, в якій є аргінін у позиції 494, а послідовність 5ЕО ІЮ МО:92 відповідає мутантній амінокислотній послідовності людського рецептора ІСЕ-1К, в якій є аланін у позиції 491.
У конкретнішому втіленні даний винахід відноситься до інтерналізованого антитіла або його інтерналізованого ІБ-1Н-зв'язуючого фрагмента, де епітоп зазначеного інтерналізованого антитіла містить амінокислоту гістидин у позиції 494 послідовності ФБЕО ІЮ МО:52.
У конкретнішому втіленні даний винахід відноситься до інтерналізованого антитіла або його інтерналізованого ІСЕ-1-зв'язуючого фрагмента, де епітоп зазначеного інтерналізованого антитіла містить амінокислоту гістидин у позиції 494 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, при цьому зазначений епітоп містить амінокислотну послідовність щонайменше з 8 амінокислот.
У конкретнішому втіленні даний винахід відноситься до інтерналізованого антитіла або його інтерналізованого ІСЕ-1-зв'язуючого фрагмента, де епітоп зазначеного інтерналізованого антитіла містить амінокислоту аспарагінову кислоту у позиції 491 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, при цьому зазначений епітоп містить амінокислотну послідовність щонайменше з 8 амінокислот. 60 У конкретнішому втіленні даний винахід відноситься до інтерналізованого антитіла або його інтерналізованого ІСЕ-1-зв'язуючого фрагмента, де епітоп зазначеного інтерналізованого антитіла містить амінокислоту гістидин у позиції 494 і амінокислоту аспарагінову кислоту в позиції 491 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, при цьому зазначений епітоп містить амінокислотну послідовність щонайменше з 8 амінокислот.
У конкретнішому втіленні даний винахід відноситься до інтерналізованого антитіла або його інтерналізованого ІСЕ-1-зв'язуючого фрагмента, де епітоп зазначеного інтерналізованого антитіла містить амінокислоту гістидин у позиції 494 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, при цьому зазначений епітоп містить амінокислотну послідовність щонайменше з 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 амінокислот.
У конкретнішому втіленні даний винахід відноситься до інтерналізованого антитіла або його інтерналізованого ІСЕ-1-зв'язуючого фрагмента, де епітоп зазначеного інтерналізованого антитіла містить амінокислоту гістидин у позиції 494 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, при цьому зазначений епітоп містить амінокислотну послідовність щонайменше з 8 амінокислот, де зазначений епітоп містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що включає: - амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що демонструє щонайменше 8095 ідентичність з амінокислотною послідовністю від амінокислоти у позиції 487 до амінокислоти у позиції 494 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, - амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що демонструє щонайменше 8095 ідентичність з амінокислотною послідовністю від амінокислоти у позиції 488 до амінокислоти у позиції 495 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, - амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що демонструє щонайменше 8095 ідентичність з амінокислотною послідовністю від амінокислоти у позиції 489 до амінокислоти у позиції 496 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, - амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що демонструє щонайменше 8095 ідентичність з амінокислотною послідовністю від амінокислоти у позиції 490 до амінокислоти у позиції 497 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, - амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що демонструє щонайменше 8095 ідентичність з амінокислотною послідовністю від амінокислоти у позиції 491 до амінокислоти у позиції 498 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52,
Зо - амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що демонструє щонайменше 8095 ідентичність з амінокислотною послідовністю від амінокислоти у позиції 492 до амінокислоти у позиції 499 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, і - амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що демонструє щонайменше 8095 ідентичність з амінокислотною послідовністю від амінокислоти у позиції 493 до амінокислоти у позиції 500 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52.
У конкретнішому втіленні цей винахід відноситься до інтерналізованого антитіла або його інтерналізованого ІСЕ-1-зв'язуючого фрагмента, де епітоп зазначеного інтерналізованого антитіла містить амінокислоту аспарагінову кислоту у позиції 491 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, при цьому зазначений епітоп містить амінокислотну послідовність щонайменше з 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 амінокислот.
У конкретнішому втіленні цей винахід відноситься до інтерналізованого антитіла або його інтерналізованого ІСЕ-1-зв'язуючого фрагмента, де епітоп зазначеного інтерналізованого антитіла містить амінокислоту аспарагінову кислоту у позиції 491 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, при цьому зазначений епітоп містить амінокислотну послідовність щонайменше з 8 амінокислот, де зазначений епітоп містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що включає: - амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що демонструє щонайменше 8095 ідентичність з амінокислотною послідовністю від амінокислоти у позиції 484 до амінокислоти у позиції 491 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, - амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що демонструє щонайменше 8095 ідентичність з амінокислотною послідовністю від амінокислоти у позиції 485 до амінокислоти у позиції 492 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, - амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що демонструє щонайменше 8095 ідентичність з амінокислотною послідовністю від амінокислоти у позиції 486 до амінокислоти у позиції 493 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, - амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що демонструє щонайменше 8095 ідентичність з амінокислотною послідовністю від амінокислоти у позиції 487 до амінокислоти у позиції 494 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, - амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що демонструє щонайменше 8095 ідентичність з амінокислотною послідовністю від амінокислоти у позиції 488 до амінокислоти у 60 позиції 495 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52,
- амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що демонструє щонайменше 8095 ідентичність з амінокислотною послідовністю від амінокислоти у позиції 489 до амінокислоти у позиції 496 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, і - амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що демонструє щонайменше 8095 ідентичність з амінокислотною послідовністю від амінокислоти у позиції 490 до амінокислоти у позиції 497 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52.
У конкретнішому втіленні цей винахід відноситься до інтерналізованого антитіла або його інтерналізованого ІСЕ-1-зв'язуючого фрагмента, де епітоп зазначеного інтерналізованого антитіла містить амінокислоту гістидин у позиції 494 і амінокислоту аспарагінову кислоту у позиції 491 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, при цьому зазначений епітоп містить амінокислотну послідовність щонайменше з 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 амінокислот.
У конкретнішому втіленні цей винахід відноситься до інтерналізованого антитіла або його інтерналізованого ІСЕ-1-зв'язуючого фрагмента, де епітоп зазначеного інтерналізованого антитіла містить амінокислоту гістидин у позиції 494 і амінокислоту аспарагінову кислоту у позиції 491 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, при цьому зазначений епітоп містить амінокислотну послідовність щонайменше з 8 амінокислот, де зазначений епітоп містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що включає: - амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що демонструє щонайменше 8095 ідентичність з амінокислотною послідовністю від амінокислоти у позиції 487 до амінокислоти у позиції 494 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, - амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що демонструє щонайменше 8095 ідентичність з амінокислотною послідовністю від амінокислоти у позиції 488 до амінокислоти у позиції 495 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, - амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що демонструє щонайменше 8095 ідентичність з амінокислотною послідовністю від амінокислоти у позиції 489 до амінокислоти у позиції 496 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, - амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що демонструє щонайменше 8095 ідентичність з амінокислотною послідовністю від амінокислоти у позиції 490 до амінокислоти у позиції 497 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, і
Зо - амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що демонструє щонайменше 8095 ідентичність з амінокислотною послідовністю від амінокислоти у позиції 491 до амінокислоти у позиції 498 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52.
В іншому конкретному втіленні даний винахід відноситься до інтерналізованого антитіла або його інтерналізованого ІСЕ-1 В-зв'язуючого фрагмента, який зв'язується з людським рецептором інсуліноподібного фактора росту 1 (ІСБ-1К) послідовності ЗЕО ІЮ МО:52 і інтерналізуєтся після його зв'язування з ІСЕ-1К, і який не зв'язується з ІЗЕ-1К послідовності зХЕО ІЮ МО:82, або де епітоп зазначеного інтерналізованого антитіла містить амінокислоту гістидин у позиції 494 і/або амінокислоту аспарагінову кислоту у позиції 491 в 5ЕО ІЮ МО:52, де відсоток інтерналізації зазначеного антитіла після його зв'язування з ІСЕ-1К складає щонайменше 4095, щонайменше 5095, щонайменше 6095, щонайменше 7095 або щонайменше 8095. Відсоток інтерналізації антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента може бути визначений будь-яким способом, відомим фахівцеві в даній області, таким як, наприклад, спосіб, описаний в даному документі.
У конкретному втіленні даний винахід відноситься до інтерналізованого антитіла або його інтерналізованого ІСЕ-1Н-зв'язуючого фрагмента згідно 3 винаходом, де зазначена амінокислота у позиції 494 послідовності ЗЕО ІЮ МО:52, що відрізняється від гістидину, є аргініном (ЗЕО ІЮ МО:82).
У конкретному втіленні даний винахід відноситься до інтерналізованого антитіла або його інтерналізованого ІСЕ-1Н-зв'язуючого фрагмента згідно 3 винаходом, де зазначена амінокислота у позиції 491 5ЕО ІЮО МО:52, що відрізняється від аспарагінової кислоти, є аланіном (ЗЕО ІЮ МО:92).
Відповідно до одного з втілень даний винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, який зв'язується з людським рецептором інсуліноподібного фактора росту 1 (ІСБ-1К) і який інтерналізуєтся після його зв'язування з ІСЕ-1К, де зазначене антитіло вибране з наступних: ї) антитіло, що містить три СОМ важкого ланцюга з СОК-Н2 послідовності ЗЕО ІЮ МО22 і
СОВ-НЗ послідовності ЗЕО ІЮ МО:3, і три СОК легкого ланцюга з СОК-12 послідовності ЗЕО ІЮ
МО:5; і) антитіло, яке конкурує за зв'язування з ІСБЕ-1К з антитілом ї); а також ії) антитіло, яке зв'язується з тим самим епітопом ІСБ-1К, з яким зв'язується антитіло і). 60 Конкуренцію за зв'язування з ІЗЕ-1К можна визначити будь-якими способами або методиками, відомими фахівцям в даній області, такими як, але не обмежуючись ними, радіоактивність, Віасоге, ЕГІЗА (ІФА), проточна цитометрія і т.д., або відповідно до способу, описаного в даному документі.
Зв'язування з одним і тим же епітопом можна визначити будь-якими способами або методиками, відомими фахівцеві в даній області, такими як, але не обмежуючись ними, радіоактивність, Віасоге, ЕГІЗА (ІФА), проточна цитометрія і т.д., або відповідно до способу, описаного в даному документі.
Як згадувалося вище, і на відміну від загальних знань даний винахід сфокусовано на специфічних антитілах проти ІОБЕ-ЇК, що представляють високу здатність бути інтерналізованими після зв'язування з ІЗБ-1К. Використовуване в даному документі антитіло, яке "інтерналізоване", є таким антитілом, яке захоплюється клітиною (тобто воно "входить" у клітину) після зв'язування з ІСЕ-1К на клітині ссавця. Таке антитіло цікаве як один з компонентів імуно-лікарських кон'югатів тим, що воно адресує або спрямовує зв'язаний цитотоксичний агент у клітини-мішені, переважно ракові клітини. Будучи інтерналізованим, цитотоксичний агент викликає загибель ракових клітин.
Переважно всі антитіла згідно з даним винаходом представляють ті самі послідовності для
СОов-нг2, СОвВ-НЗ і СОК-І2, решта 3 СОК відрізняються. Це спостереження здається зрозумілим, оскільки є частиною загальних знань, що стосуються специфічності зв'язування антитіла, при цьому СОК-НЗ описується як найбільш важливий і найбільш причетний до розпізнавання епітоп.
Важливими ключами до успіху терапії імунокон'югатами вважаються специфічність "антиген - мішень" і інтерналізація комплексів антигензв'язуючих білків раковими клітинами. Очевидно, що антигени, що не інтерналізуються, є менш ефективними, ніж антигени, що інтерналізуються, під час доставки цитостатичних агентів. Процеси інтерналізації відрізняються серед антигенів і залежать від безлічі параметрів, які можуть знаходитися під впливом антитіл.
У імунокон'югаті цитотоксичний агент несе цитотоксичну активність, а використовуване антитіло несе специфічність відносно ракових клітин, як і вектор для входу в клітини для правильної адресації цитотоксичного агента. Таким чином, щоб поліпшити імунокон'югат, антитіло може мати високу здатність до інтерналізації цільовими раковими клітинами.
Зо Ефективність, з якою антитіло опосередковує інтерналізацію, значно відрізняється залежно від цільового епітопа. Вибір потужних інтерналізуючих антитіл проти ІЗЕ-1К потребує різних експериментальних даних, що вивчають не лише понижуючу регуляцію ІСЕ-1К, а й подальшу інтерналізацію антитіла проти ІСЕ-1К клітинами.
В одному з втілень інтерналізацію антитіла згідно з винаходом можна оцінити за допомогою імунофлуоресценції (як проілюстровано далі в даній заявці) або будь-якого способу або процесу, відомого фахівцеві у даній області, специфічного для даного механізму інтерналізації.
Комплекс ІСЕ-1К/антитіло інтерналізується після зв'язування антитіла з ЕСО зазначеного
ІСЕ-1К, індукується зменшення кількості МЗЕ-1К на поверхні клітин. Це зменшення можна кількісно оцінити будь-яким способом, відомим фахівцям в даній області, наприклад, але не обмежуючись ними, вестерн-блотом, ЕАС5, імунофлуоресценцією і т.п.
В одному з втілень це зменшення, що відображає таким чином інтерналізацію, можна переважно виміряти за допомогою БАС5 і виразити як різницю або дельту між середньою інтенсивністю флуоресценції (Меап РіІпогезсепсе Іпіепзйу, МЕ), виміряної при 4 "С, і МРЕЇ, виміряної при 37 "С, після 4 годин інкубації з антитілом.
Як необмежуючий приклад ця дельта визначається на основі МЕЇ, отриманих з необробленими клітинами і з клітинами, обробленими антитілом, з використанням ії) клітин раку молочної залози МСЕ7 після 4-годинного періоду інкубації з антитілом, описаним в даному документі і її) вторинного антитіла, міченого АІеха 488. Цей параметр розраховується за наступною формулою: Д(МЕ Їх «с- МЕРЇІз7 «с).
Ця різниця між значеннями МЕ! відображає знижувальну регуляцію ІСБЕ-1К, оскільки значення МРЇ пропорційні ІСБЕ-1К, експресованому на поверхні клітини.
У переважному аспекті антитіла або будь-який з їхніх антигензв'язуючих фрагментів складаються з моноклональних антитіл, що дають Д(МЕїІл»есо- МЕЇз7»с) на клітинах МСЕ7 щонайменше 280, переважно щонайменше 400.
Детальніше, згадана вище дельта може бути виміряна відповідно до наступного процесу, який повинен розглядатися як ілюстративний і необмежуючий приклад: а) обробка і інкубація пухлинних клітин, що становлять інтерес, антитілом згідно з винаходом або у холодному (4 "С), або у теплому (37 "С) повному культуральному середовищі;
Б) паралельна обробка вторинними антитілами клітин, оброблених на етапі а), і 60 необроблених клітин,
с) вимірювання МРЇ (показує кількість (ЗЕ-1К, присутнього на поверхні) для оброблених і необроблених клітин за допомогою вторинного міченого антитіла, здатного зв'язуватися з антитілом згідно з даним винаходом, і а) розрахунок дельти шляхом віднімання МЕЇ, отриманої з обробленими клітинами, від МРЇ, отриманої з необробленими клітинами.
З цієї дельти МЕ! відсоток інтерналізації може бути визначений як: 100х(МРЇІв-с-
МЕРЇз7 «с)/МНР а со.
Антитіла або будь-які з їхніх антигензв'язуючих фрагментів згідно з винаходом присутні на
МСЕ? з відсотком інтерналізації, який складає від 7095 до 9095, переважно від 7595 до 87905.
Особлива перевага антитіл, описаних в даному документі, основана на швидкості їх інтерналізації.
Загальновідомо, що для імунокон'юЮптата бажано, щоб використовувані антитіла демонстрували високу швидкість інтерналізації, переважно протягом 24 годин з моменту введення антитіла іп мімо, і переважніше протягом 12 годин, ще переважніше протягом 6 годин.
У даному винаході швидкість інтерналізації, також визначувана як зменшення кількості антитіла, зв'язаного з поверхнею клітини, або як розпад антитіла на клітинній поверхні, виражається як 11/2 (період напівжиття) і відповідає часу, який необхідний для отримання зменшення ЛМЕЇ на 5095 (цей аспект буде чітко зрозумілий у зв'язку з подальшими прикладами).
Особливою перевагою є те, що антитіла згідно з винаходом мають Й/2 від 5 до 25 хвилин, і переважно від 10 до 20 хвилин.
Конкретне втілення даного винаходу відноситься до антитіла, що містить три СОК важкого ланцюга послідовностей 5ЕО ІЮ МО, 2 їі 3, і три СОК легкого ланцюга послідовностей ЗЕО ІЮ
МО:4,516.
Одним з втілень є антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, що містить три СОК важкого ланцюга, які містять або складаються з послідовностей ЗЕО ІЮ МО-1, 2 і З або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, переважно 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з «ЕО ІЮ МО, 2 ї 3; ії три СОК легкого ланцюга, які містять або складаються з послідовностей 5ЗЕО ІЮ МО:4, 5 і 6 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, переважно 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з зФЕО ІЮ МО:4, 5 і 6.
В іншому втіленні антитіло або будь-який його антигензв'язуючий фрагмент містить три СОК важкого ланцюга, які містять або складаються з послідовностей 5ЕО ІЮ МО:1, 2 і З; і три СОК легкого ланцюга, які містять або складаються з послідовностей 5ЕО ІЮ МО:4, 5 і 6.
Під "СОМК-областями" або "СОМ" розуміють гиперваріабельні області важких і легких ланцюгів імуноглобулінів, визначені згідно ІМСТ.
Унікальна нумерація ІМСТ була створена для порівняння варіабельних доменів незалежно від антигенного рецептора, типу ланцюга або вигляду (Реїтапс М.-Р., Іттипоіоду Тодау 18, 509 (1997) / Реїтапс М.-Р., Тне Іттипоіодіві, 7, 132-136 (1999) / Геіїтапс, М.-Р., Роттіеє, С., Виїг, М.,
Сіцаісеїїї, М., Еошдціег, Е., Тишопо, Е., Тпоимепіп-Сопівї, М. апа Реїтапс, Оєм. Сотр. Іттипої., 27, 55-77 (2003)). В унікальній нумерації ІМОТ консервативні амінокислоти завжди мають одну й ту ж позицію, наприклад, цистеїн 23 (151-СУ5), триптофан 41 (СОМ5ЕКМЕО-ТЕР), гідрофобна амінокислота 89, цистеїн 104 (2п4-СУ5), фенілаланін або триптофан 118 (2-РНЕ або 2-ТРР).
Унікальна нумерація ІМСТ пропонує стандартизоване розмежування каркасних областей (ЕК1-
ІМОТ: позиції з 1 по 26, ЕК2-ІМСТ: з 39 по 55, ЕКЗ-ІМСТ: з 66 по 104 і ЕК4-ІМСТ: з 118 по 128) і областей, що визначають комплементарність: СОК1-ІМОТ: з 27 по 38, СОК2-ІМОТ: з 56 по 65,
СОВЗ-ІМОТ: з 105 по 117. Оскільки проміжки представляють незайняті позиції, довжини СОК-
ІМТ (показані в дужках і розділені крапками, наприклад 1І8.8.13Ї) стають важливою інформацією. Унікальна нумерація ІМОТ використовується у 20-графічніх зображеннях, як описано в СоїПег5 де Регієз (Киї, М. апа Реїтапс, М.-Р., Іттиподепеїйсв5, 53, 857-883 (2002) /
Каах, ОО. апа ЕРейїйапс, М.-Р., Ситепі Віоіптоптаїйсв, 2, 21-30 (2007), і у ЗО-структурах в
ІМат/ЗзОвігисіиге-ОВ ІКаав, О., Виї2, М. апа І емапс, М.-Р., Т сеїЇ гесерюг апа МНС 5ігисімчгаї дата.
Мисі. Асіав5. Невз., 32, 0208-0210 (2004)|.
Необхідно розуміти, що, без протиріччя опису в даному документі, області, що визначають комплементарність, або СОК, позначають гиперваріабельні області важких і легких ланцюгів імуноглобулінів, як вони визначені згідно з системою нумерації ІМОТ.
Проте, СОК також можуть бути визначені згідно з системою нумерації Кабат (Кабаї еї аї.,
Зедиєпсев ої ргоївїп5 ої іттипоіодіса! іпієтеві, 5' Еа., 0.5. Оерайтепі ої Неаййп апа Нитап зегмісе5, МІН, 1991, ії пізніші видання). Існує три СОК важкого ланцюга, і три СОК легкого ланцюга. Термін "СОМ" в єдиному числі або у множині застосовується тут для позначення, 60 залежно від випадку, однієї або більше або навіть всіх цих областей, які містять більшість амінокислотних залишків, відповідальних за афінність зв'язування антитіла з антигеном або епітопом, який воно розпізнає. Щоб спростити читання даної заявки, СОК згідно Кабаї не визначені. Проте, для фахівця в даній області було б очевидним використовувати визначення
СОК згідно ІМСТ, щоб визначити СОМ відповідно до Кабаї.
У контексті даного винаходу "відсоток ідентичності" двох послідовностей нуклеїнових кислот або амінокислот означає відсоток ідентичних нуклеотидів або амінокислотних залишків у двох порівнюваних послідовностях, отриманий після оптимального вирівнювання, при цьому даний відсоток є чисто статистичним, і відмінності між цими двома послідовностями розподілені випадковим чином за їх довжиною. Порівняння двох нуклеїновокислотних або амінокислотних послідовностей традиційно проводиться шляхом порівняння послідовностей після їх оптимального вирівнювання, при цьому зазначене порівняння можна проводити по сегментах або за допомогою "вікна вирівнювання". Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння може бути здійснене, окрім порівняння вручну, за допомогою алгоритму локальної гомології Сміта і Вотермана (1981) (Аа. Арр. Маїйб. 2:4821), за допомогою алгоритму локальної гомології Нідлмана і Вунша (1970) |У. Мої. Віої. 48:443), за допомогою способу пошуку схожості
Пірсона і Ліпмана (1988) |Ргос. Маї). Асай. 5сі. ОБА 85:2444) або за допомогою комп'ютерного програмного забезпечення з використанням цих алгоритмів (САР, ВЕ5ТРЇТ, ЕАЗТА і ТЕАЗТА у
Муівсопвіп Сепеїїс5 боймаге РасКаде, Сепеїїс5 Сотршег Сгоцпр, 575 Зсіепсе Ог., Медісон,
Вісконсін, або за допомогою програмного забезпечення для порівняння ВІ АЗТ МК або ВІ А5Т
Р).
Відсоткова ідентичність двох нуклеїновокислотних або амінокислотних послідовностей визначається шляхом порівняння двох оптимально вирівняних послідовностей, в яких порівнювана нуклеїновокислотна або амінокислотна послідовність може мати додавання або делеції в порівнянні з референсною послідовністю для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Відсоткова ідентичність розраховується шляхом визначення числа позицій, в яких амінокислоти, нуклеотиди або залишки ідентичні у двох послідовностях, переважно у двох повних послідовностях, ділення числа ідентичних позицій на загальне число позицій у вікні вирівнювання і множення результату на 100 для отримання відсоткової ідентичності двох послідовностей.
Зо Наприклад, програма ВІ А5Т "ВІ А5Т 2 зедпиепсез" (Тайизома еї аї, "Віазі 2 зедиепсез - а пем/ 100! Тог сотрагіпа ргоїєїп апа писієсіїде зедоепсев5", РЕМ5 Місгобіої, 1999, Гей. 174:247-250), доступна на сайті ПЕр:/Лимли. пері. піт.пій.дом/догі/БІ2.плітІ, може бути використана з параметрами за умовчанням (зокрема, з параметрами "штраф за відкриття делеції": 5 і "штраф за подовження делеції" 2; вибраною матрицею буде, наприклад, матриця "ВГОБОМ 62", запропонована в програмі); відсоткова ідентичність двох послідовностей для порівняння розраховується безпосередньо програмою.
Для амінокислотної послідовності, що демонструє ідентичність з референсною амінокислотною послідовністю щонайменше 8095, переважно 8595, 9095, 95905 і 9895, переважні приклади включають ті, які містять референсну послідовність, певні модифікації, зокрема делеції, додавання або заміни щонайменше однієї амінокислоти, зрізання або подовження. У разі заміни однієї або більше послідовних або непослідовних амінокислот переважними є ті заміни, при яких заміщувані амінокислоти замінюються "еквівалентними" амінокислотами. В даному випадку вираз "еквівалентні амінокислоти" застосовується для позначення будь-яких амінокислот, які можуть замінити одну з структурних амінокислот без зміни біологічної активності відповідних антитіл, а також тих конкретних прикладів, які наведені нижче.
Еквівалентні амінокислоти можуть бути визначені або за їх структурною гомологією з амінокислотами, які вони заміщатимуть, або за результатами порівняльних тестів біологічної активності різних антитіл, які можуть бути отримані.
Як необмежуючий приклад, в таблиці 1 нижче приведені можливі заміщення, які можуть бути проведені без значної зміни біологічної активності відповідного модифікованого антигензв'язуючого білка; зворотні заміни, природно, можливі за тих же умов.
Таблиця 1
Таблиця 1 леФф 7777 це
Конкретним аспектом даного винаходу є те, що дане антитіло або будь-який його антигензв'язуючий фрагмент не зв'язується з рецептором інсуліну (ІК). Цей аспект являє інтерес, оскільки антитіло, описане в даному документі, не матиме жодного негативного впливу на ІК, тобто на метаболізм інсуліну.
В іншому втіленні ще одним переважним аспектом антитіла згідно з винаходом є те, що воно здатне зв'язуватися не лише з людським ІСЕ-1К, але також з ІСБЕ-1К мавпи і, конкретніше, з ІСБ-1К яванського макака. Цей аспект також представляє інтерес, оскільки він полегшуватиме випробування токсичності і клінічні випробування.
В іншому втіленні антитіло згідно з даним винаходом складається з моноклонального антитіла.
Термін "моноклональне антитіло" або "МКА" ("Мар"), використовуваний в цьому документі, відноситься до антитіла, отриманого з популяції по суті гомогенних антитіл, тобто окремі антитіла цієї популяції є ідентичними за винятком можливих мутацій, що зустрічаються у природі, які можуть бути присутні в незначних кількостях. Моноклональні антитіла є високо специфічними, будучи спрямованими проти одного епітопа. Таке моноклональне антитіло може бути отримане за допомогою одного клону В-клітин або за допомогою гібридоми.
Моноклональні антитіла також можуть бути рекомбінантними, тобто отриманими шляхом білкової інженерії. Моноклональні антитіла також можуть бути виділені з фагових бібліотек антитіл. Крім того, на відміну від препаратів поліклональних антитіл, які зазвичай включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант, або епітопів, кожне моноклональне антитіло спрямоване проти одного епітопа антигена. Винахід відноситься до антитіла, виділеного або отриманого шляхом очищення з природних джерел або отриманого за допомогою генетичної рекомбінації або хімічного синтезу.
В одному втіленні моноклональне антитіло згідно 3 даним винаходом включає мишаче, химерне і гуманізоване антитіло, описане нижче.
Антитіло може бути отримане з гібридоми мишачого походження, збереженої у Французькій колекції культур мікроорганізмів (СМОСМ, Інститут Пастера, Париж, Франція), при цьому зазначену гібридому отримують шляхом злиття спленоцитів/лімфоцитів від імунізованих мишей
Зо ВАГ В/С і клітин мієломної клітинної лінії Хра/Оо-Ад14.
В іншому втіленні антитіло згідно з даним винаходом складається з рекомбінантного антитіла. Термін "рекомбінантне антитіло" відноситься до антитіла, яке є результатом експресії рекомбінантної ДНК у живих клітинах. Рекомбінантне антитіло згідно з даним винаходом отримують з використанням лабораторних способів генетичної рекомбінації, добре відомих фахівцям в даній області, шляхом створення ДНК-послідовностей, яких немає в біологічних організмах.
В іншому втіленні антитіло згідно з даним винаходом складається з хімічно синтезованого антитіла.
В одному з втілень антитіло проти ІЗЕ-1К згідно з даним винаходом складається з мишачого антитіла, також позначуваного як тіназва антитіла).
В одному з втілень антитіло проти ІЗЕ-1К згідно з даним винаходом складається з химерного антитіла, також позначуваного як сІназва антитіла).
В одному з втілень антитіло проти ІЗЕ-1К згідно з даним винаходом складається з гуманізованого антитіла, також позначуваного як паІназва антитіла).
Щоб уникнути сумнівів, у наступному описі вираз "ІСБЕ-1В-антитіло" і "(назва антитіла)" є аналогічними і включають (без протиріччя опису) мишачі, химерні і гуманізовані варіанти зазначеного ІСЕ-1В-антитіла і зазначеного "Іназва антитіла|-антитіла. За необхідності використовується префікс т - (мишаче), с - (химерне) або 15 - (гуманізоване).
В іншому втіленні антитіло згідно з даним винаходом вибране серед наступних: а) антитіло, що містить три СОЄ важкого ланцюга послідовностей ЗЕО ІЮ МО:7, 2 і 3, і три
СОК легкого ланцюга послідовностей ЗЕО ІЮ МО:9, 5 і 11; р) антитіло, що містить три СОК важкого ланцюга послідовностей 5ЕО ІЮ МО:7, 2 і 3, і три
СОК легкого ланцюга послідовностей ЗЕО ІЮ МО 10, 5 і 11; с) антитіло, що містить три СОК важкого ланцюга послідовностей 5ЕО ІЮ МО:7, 2 і 3, і три
СОК легкого ланцюга послідовностей ЗЕО ІЮ МО:9, 5 і 12; і а) антитіло, що містить три СОК важкого ланцюга послідовностей 5ЕО ІЮ МО:8, 2 і З, і три
СОК легкого ланцюга послідовностей ЗЕО ІЮ МО:9, 5 і 11.
Для більшої ясності наступна таблиця 2 ілюструє послідовності СОР, визначені згідно ІМСТ, для переважних антитіл.
Таблиця 2 11111111 | Бажкийланцюг | Легкийланцюг./ | 5ЕОЮМО сові ГГ совна/ ЇЇ
Консенсусна 32320200 НУ 20011702220003 сов Є 4 сови |! 5 пн тот: У: НЯ ОО с ПО сові ГГ совна/ ЇЇ соні ГГ ви тп сови 01700708 сови |! 5 сова! сові ГГ совна/ ЇЇ соні ГГ ля Т1соват001013110110101010170 сови |! 5 сова! сові ГГ совна/ ЇЇ пав госовнІ 01011703 п ть т ла НЯ ПО: ПО пе ТТ Гл лов 10117115 пн от: У: НИ ПО Р ТО сові Ї11111гв совна/ ЇЇ соні ГГ п 1 сова 01013118 сови |! 5 п ть: ле: НЯ ПО ПОЛЯ
Фахівцеві в цій області буде ясно видно, що будь-яку комбінацію цих шести СОК, описаних вище, слід розглядати як частину цього винаходу.
Як можна бачити в таблиці 2, усі антитіла, описані в таблиці, мають одні й ті ж послідовності для СОБК-Н2, СОВ-НЗ їі СОВ-І2, причому ця властивість представляє особливий інтерес, як описано вище.
Конкретний аспект відноситься до мишачого (пт) антитіла або будь-якого з його антигензв'язуючих фрагментів, які характеризуються тим, що зазначене антитіло також містить константні області легкого ланцюга і важкого ланцюга, отримані з антитіла виду, гетерологічного по відношенню до миші, зокрема, з людського антитіла.
Інший конкретний аспект відноситься до химерного (с) антитіла або будь-якого з його антигензв'язуючих фрагментів, які характеризуються тим, що зазначене антитіло також містить константні області легкого ланцюга і важкого ланцюга, отримані з антитіла виду, гетерологічного по відношенню до миші, зокрема, з людського антитіла.
В одному втіленні цього винаходу антитіло складається з химерного антитіла.
Химерне антитіло є антитілом, що містить природну варіабельну область (легкого ланцюга і важкого ланцюга), отриману з антитіла цього виду, у поєднанні з константними областями легкого ланцюга і важкого ланцюга з антитіла іншого виду, гетерологічного по відношенню до зазначеного даного виду.
Антитіла або їх химерні фрагменти можуть бути отримані з використанням методик рекомбінантної генетики. Наприклад, химерне антитіло може бути отримане шляхом клонування рекомбінантної ДНК, що містить промотор і послідовність, що кодує варіабельну область нелюдського моноклонального антитіла згідно з винаходом, зокрема мишачого, і послідовність, що кодує константну область людського антитіла. Химерне антитіло відповідно до даного винаходу, яке кодується одним з таких рекомбінантних генів, може бути, наприклад, химерою "миша - людина", при цьому специфічність цього антитіла визначається варіабельною областю, отриманою з мишачої ДНК, а його ізотип визначається константною областю, отриманою з людської ДНК.
У переважному, але не обмежуючому втіленні антитіло згідно з даним винаходом вибране серед наступних: а) антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:1З3 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095 ідентичність з зЗЕО ІЮ МО:13, і три СОК легкого ланцюга послідовностей ЗЕО ІЮ МО:9, 5 і 11;
Б) антитіло, що містить (чи складається з) варіабельний домен важкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО:14 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з 5БО ІО МО:14, і три СОК легкого ланцюга послідовностей 5ЕО ІЮ МО:10, 5 і 11;
Зо с) антитіло, що містить (чи складається 3) варіабельний домен важкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО:15 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з 5БО ІЮО МО:15, і три СОК легкого ланцюга послідовностей 5ЕО ІЮ МО:9, 5 і 12;
Я) антитіло, що містить (чи складається 3з) варіабельний домен важкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО:16 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з 5БО ІЮО МО:16, і три СОК легкого ланцюга послідовностей ЗЕО ІЮО МО:9, 5111; е) антитіло, що містить (чи складається 3) варіабельний домен важкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО:17 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з 5БО ІО МО:17, і три СОМ легкого ланцюга послідовностей 5ЕО ІЮ МО:9, 5 і 12.
Під "будь-якою послідовністю, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з БЕО ІЮ МО:13-17" слід розуміти, відповідно, послідовність, що демонструє три
СОК важкого ланцюга послідовностей ЗЕБЕО ІО МО: 1, 2 їі З ї, крім того, що демонструє щонайменше 8095, переважно 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з повною послідовністю
ЗЕО ІЮ МО:13-17 поза послідовностями, відповідних СОК (тобто 5ЕО ІЮО МО-:1, 2 їі 3), де під виразом "поза послідовностями, відповідних СОК" слід розуміти "виключаючи послідовності, відповідні СО".
У іншому переважному, але не обмежуючому втіленні антитіло згідно 3 даним винаходом вибране серед наступних: а) антитіло, що містить варіабельний домен легкого ланцюга послідовності «ФЕО ІЮ МО:18 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 98905 ідентичність з ФЗЕО ІЮ МО:18, і три СОК важкого ланцюга послідовностей 5ЕО ІЮ МО:7, 2 і 3; р) антитіло, що містить варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:19 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 98905 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:19, і три СОК важкого ланцюга послідовностей 5ЕО ІЮ МО:7, 2 і 3; с) антитіло, що містить варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:20 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 98905 ідентичність з БЕО ІЮ МО:20, і три СОК важкого ланцюга послідовностей 5ЕО ІЮ МО:7, 2 і 3; бо а) антитіло, що містить варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:21 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 98905 ідентичність з БЕО ІЮ МО:21, і три СОК важкого ланцюга послідовностей 5ЕО ІЮ МО:8,213; е) антитіло, що містить варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО:22 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 98905 ідентичність з БЕО ІЮ МО:22, і три СОК важкого ланцюга послідовностей 5ЕО ІЮ МО:7, 2 і 3.
Під "будь-якою послідовністю, що демонструє щонайменше 8095, переважно 8595, 9095, 9590 або 9895 ідентичність з БЕО ІЮ МО:18-22", слід розуміти послідовності, що демонструють три
СОР легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО:4, 5 і 6 і, крім того, що демонструють щонайменше 8095, переважно 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з повною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:18-22 поза послідовностями, відповідних СОК (тобто 5ЕО ІЮ МО 4, 5 і 6).
Одне з втілень згідно з даним винаходом відноситься до антитіла, вибраного серед наступних: а) антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:1З3 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 98905 ідентичність з 5ЕО ІЮ МО:13, і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ
МО:18 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 98905 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:18; р) антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО:14 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 98905 ідентичність з 5ЕО ІЮ МО:14, і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності 5ЕО ІЮ
МО:19 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:19; с) антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО:15 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 98905 ідентичність з 5ЕО ІЮ МО:15, і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ
МО:20 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:20; а) антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:16 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 98905
Ко) ідентичність з 5ЕО ІЮ МО:16, і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності 560 ІЮ
МО:21 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з БЕО ІЮ МО:С21; і е) антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:17 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 98905 ідентичність з 5ЕО ІЮ МО:17, і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ
МО:22 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:22.
Химерні антитіла, описані в даному документі, також можуть характеризуватися константним доменом, і, конкретніше, зазначені химерні антитіла можуть бути вибрані або сконструйовані як ІдсС1, Ідс2, Ід3, І9М, ІА, ДО або ІДЕ, але не обмежуючись ними.
Переважніше у контексті цього винаходу зазначені химерні антитіла є Їдс1 або досі.
Одне з втілень згідно з даним винаходом відноситься до химерного антитіла, що містить варіабельні домени МН і Мі, описані вище, у форматі Ідс1. Переважніше, зазначене химерне антитіло містить константний домен для МН-послідовності 5ЕО ІЮ МО:43 і каппа-домен для МІ - послідовності 5ЕО ІЮ МО:45.
Одне з втілень згідно з даним винаходом відноситься до химерного антитіла, що містить варіабельні домени МН і Мі, описані вище, у форматі Ідс54. Переважніше, зазначене химерне антитіло містить константний домен для МН-послідовності 5ЕО ІЮ МО:44 і каппа-домен для МІ - послідовності 5ЕО ІЮ МО:45.
У іншому переважному, але не обмежуючому втіленні антитіло згідно з цим винаходом вибране серед наступних: а) антитіло, що містить (чи складається з) важкий ланцюг послідовності зХЕО ІЮ МО:23 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ЗЕО ІЮ МО:23, і легкий ланцюг послідовності 5ЕОО ІЮ МО:28 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 90905, 9595 або 9895 ідентичність з БЕО ІЮ
МО:28; р) антитіло, що містить (чи складається з) важкий ланцюг послідовності «ФЕО ІЮ МО:24 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ЗЕО ІЮ МО:24, і легкий ланцюг послідовності 5ЕОО ІЮ МО:29 або будь-якої 60 послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 90905, 9595 або 9895 ідентичність з БЕО ІЮ
МО:29; с) антитіло, що містить (чи складається з) важкий ланцюг послідовності ЗЕО ІЮ МО:25 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ЗЕО ІЮ МО:25, і легкий ланцюг послідовності 5ЕСО ІЮ МО:30 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ФЕО ІЮ
МО:30; а) антитіло, що містить (чи складається з) важкий ланцюг послідовності ХЕО ІЮ МО:26 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ЗЕО ІЮ МО:26, і легкий ланцюг послідовності 5ЕОО ІЮ МО:31 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 90905, 9595 або 9895 ідентичність з БЕО ІЮ
МО:31; і е) антитіло, що містить (або складається з) важкий ланцюг послідовності «ЕО ІЮ МО:27 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ЗЕО ІЮ МО:27, і легкий ланцюг послідовності 5ЕОО ІЮ МО:32 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 90905, 9595 або 9895 ідентичність з БЕО ІЮ
МО:32.
Для більшої ясності таблиця З ілюструє послідовності МН і МІ, відповідно, для переважних химерних антитіл.
Таблиця З 71111111 Важкийланцюго/ | Легкийланцюг./ | 5ЕОЮМО
Варіабельнийдомен(МН)ї | (77777713 с?ОВЕо
Повнорозмрна.ї /-/-:/ ЇЇ 11111111 |Повнорозмрна.//:///ГО|Ї 77/28
Варіабельнийдомен(МН)ї | (//7777777777777111111111111114 с?1оАТ
Повнорозмрна.ї /-/-:/ ОЇ 11111111 |Повнорозмрна.//7/7/:// ОЇ. 291
Варіабельнийдомен(МН)ї | (77777715. с?14ЕВ
Повнорозмрна.ї /-/-:/ ЇЇ 11111111 |Повнорозмрна.//:/ // | 7 30429
Варіабельнийдомен(МН)ї | -(//7777777777777777С7СЇ17711111600 с21906
Повнорозмрна.ї /-/-:/ ЇЇ 261 11111111 |Повнорозмрна.//:/// | 77/31
Варіабельнийдомен(МН)ї | (77777771 с?13810
Повнорозмрна.ї /-/-:/ ОЇ 11111111 |Повнорозмрна.7//:/ // | /-/(32 2
Інший конкретний аспект даного винаходу відноситься до гуманізованого антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, що характеризується тим, що константні області легкого ланцюга і важкого ланцюга, отримані з людського антитіла, є, відповідно, областями лямбда або каппа і гамма-1, гамма-2 або гамма- 4.
В одному з втілень даного винаходу антитіло складається з гуманізованого антитіла.
Під "гуманізованими антитілами" слід розуміти антитіла, які містять СОК області, отримані з антитіла нелюдського походження, при цьому інші частини молекули антитіла отримані з одного (або декількох) людських антитіл. Крім того, деякі залишки сегментів скелета (звані ЕК) можуть бути змінені з метою збереження афінности зв'язування.
Зо Гуманізовані антитіла або їх фрагменти можуть бути отримані за допомогою методик, відомих фахівцям в даній області. Такі гуманізовані антитіла є переважними для їх застосування у способах, використовуваних в діагностиці іп міго, або у профілактичному і/або терапевтичному лікуванні іп мімо. Іншою методикою гуманізації, також відомою фахівцям в даній області, є, наприклад, методика "СОК-щеплення", описана РОЇ. у патентах ЕР 0 451261, ЕР 0 682 040, ЕР 0 9127, ЕР 0 566 647 або 005 5530101, 05 6180370, 005 5585089 і 05 5693761.
Також можна відзначити патенти 05 5639641 або 5 6054297, 5 5886152 і 005 5877293.
Як конкретне втілення цього винаходу і як буде пояснено детальніше в наступних прикладах, в даному документі описане антитіло, що складається з п2208Е2. Така гуманізація також може бути застосована до частин інших антитіл згідно з даним винаходом.
У переважному втіленні антитіло згідно з даним винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга (МН), що має: її СОВ-НІ, СОВ-Н2 і СОК-НЗ послідовностей ЗЕО ІЮ МО:7, 2 і 3, відповідно, її) ЕК1, ЕКЗ і ЕКЗ, отримані з ІЗНМ1-46701 зародкової лінії людини (ЗЕО ІЮ МО 46), і ії) ЕК4, отриманий з ІЗН.)4701 зародкової лінії людини (ЗЕО ІЮ МО:48).
У переважному втіленні антитіло згідно з даним винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга (М), що має: її СОВ-І 1, СОВ-І2 ї СОК-ЇЗ послідовностей ЗЕО ІЮ МО:9, 5 і 11, відповідно, її) ЕК1, ЕКЗ і ЕКЗ, отримані з (ЗКМ1-39701 зародкової лінії людини (ЗЕО ІЮ МО:С47), і ії) ЕК4, отримані з ІЗКО4701 зародкової лінії людини (ЗЕО ІЮ МО 49).
У переважному, але не обмежуючому втіленні згідно з даним винаходом антитіло містить: а) важкий ланцюг, що має СОК-НІ, СОВ-Н2 ї СОВ-НЗ послідовностей 5ЗЕО ІЮО МО:7, 2 і З, відповідно, і ЕК, ЕК2 і ЕКЗ, отримані з ІЗНМ1-46701 зародкової лінії людини (5ЕО ІЮ МО:46), і
ЕКА4, отриману з ІЗН.ОЯ4701 зародкової лінії людини (5ЕО ІЮ МО:48); і р) легкий ланцюг, що має СОК-І 1, СОВ-12 ії СОК-ІЇЗ послідовностей 5ЕО ІЮ МО:9, 5 і 11, відповідно, і ЕК1, ЕК2 і ЕКЗ, отримані з ІЗКМ1-39701 зародкової лінії людини (ЗЕО ІЮ МО:47), і
ЕК4, отриману з ІОК.О4701 зародкової лінії людини (ЗЕО ІЮ МО:49).
В одному втіленні антитіло згідно з даним винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга (МН) послідовності ЗЕО ІЮ МО:33 і варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) послідовності ЗЕО ІЮ МО:35. Зазначене гуманізоване антитіло називатиметься далі п2208Е2 ("варіант" або "вар". 1).
В іншому втіленні антитіло згідно з даним винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга (МН) послідовності «ЕО ІЮ МО:33, де зазначена послідовність зЗЕО ІЮ МО:33 містить щонайменше 1 зворотну мутацію, вибрану серед залишків 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 і 95.
Під виразом "зворотна мутація" мається на увазі мутація або заміна людського залишку,
Зо присутнього в зародковій послідовності, відповідним залишком, що спочатку був присутній у мишачій послідовності.
В іншому втіленні антитіло згідно з даним винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга (МН) послідовності зЗЕО ІЮ МО:33, де зазначена послідовність ЗЕО ІЮ МО:33 містить 2, 3,4,5,6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 або 17 зворотних мутацій, вибраних серед залишків 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82195.
Для більшої ясності в таблиці 4 показані переважні зворотні мутації.
Таблиця 4
Мишачаї///////////Ї мМ ЇЇ 1 17 м 1 к | с їм | Кк
Людськай./.:/ | М | м Ї н | в | м Її 1! | 5 Ї А
Людськй.: | ОО | мМ | в | т | т | 5 | Ум | ЕЕ | М
В одному з втілень антитіло згідно з даним винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) послідовності «ЗЕО ІЮ МО:35, де зазначена послідовність зЗЕО ІЮ МО:35 містить щонайменше 1 зворотну мутацію, вибрану серед залишків 22, 53, 55, 65, 71,72, 77 і 87.
В одному з втілень антитіло згідно з даним винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) послідовності ФЕО ІЮ МО:35, де зазначена послідовність ЗЕО ІЮ МО:35 містить 2,
З, 4, 5, 6, 7 або 8 зворотних мутацій, вибраних серед залишків 22, 53, 55, 65, 71, 72,77 187.
В іншому втіленні антитіло згідно з даним винаходом містить: а) варіабельний домен важкого ланцюга (МН) послідовності «ЕО ІЮ МО:33, де зазначена послідовність 5ЕО ІЮ МО:33 містить щонайменше 1 зворотну мутацію, вибрану серед залишків 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79,821 95; 1 р) варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) послідовності 562 ІЮ МО:35, де зазначена послідовність 5ЕО ІЮ МО:35 містить щонайменше 1 зворотну мутацію, вибрану серед залишків 22, 53, 55, 65, 71, 72,77 і 87.
Для більшої ясності таблиця 5 ілюструє переважні зворотні мутації.
Таблиця 5
Мишачаїд | 5 | В | нН їв ХХ | 5 | м | є
І(Людськаї | ТТ | 5 | ОО | 5 | ЕЕ | т | ЇЇ У
У такому втіленні антитіло згідно з даним винаходом містить усі зворотні мутації, зазначені вище, і відповідає антитілу, що містить варіабельний домен важкого ланцюга (УН) послідовності
ЗЕО ІЮ МО:34 і варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) послідовності 5ЕО ІЮ МО:З6.
Зазначене гуманізоване антитіло далі називатиметься п2208БЕ2 ("варіант" або "вар." 3).
В іншому втіленні усі гуманізовані форми, що містяться між варіантом 1 і варіантом 3, також охоплюються цим винаходом. Іншими словами, антитіло згідно з даним винаходом відповідає антитілу, що містить варіабельний домен важкого ланцюга (УН) "консенсусної" послідовності
ЗЕО ІО МО:41 і варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) "консенсусної" послідовності БЕО ІЮ
МО:42. Зазначене гуманізоване антитіло цілим далі називатиметься п27208Е2 ("варіант" або "вар." 2).
У переважному, але не обмежуючому втіленні антитіло згідно з даним винаходом вибране серед наступних: а) антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:З3З3 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ФЗЕО ІЮ МО:33, і три СОК легкого ланцюга послідовностей ЗЕО ІЮ МО:9, 5 і 11; р) антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності ФЕО ІЮ МО:34 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:34, і три СОК легкого ланцюга послідовностей 5ЕО ІЮ МО:9, 511; і с) антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності, вибраної серед
ЗЕО ІО МО:56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 і 80, або будь-якої послідовності щонайменше з 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичністю з БЕО ІЮ МО:56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78180; і три СОК легкого ланцюга послідовностей ЗЕО ІЮО МО:9, 5 і 11.
Під "будь-якою послідовністю, що демонструє щонайменше 8095, переважно 8595, 9095, 9590 або 9895 ідентичність з ЗЕО ІЮО МО':33, 34, 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 або 80", слід розуміти послідовності, що демонструють три СОК важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО-1, 2 і З і, крім того, демонструють щонайменше 8095, переважно 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з
Зо повною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:33, 34, 56, 62, 64, 66,68, 70, 72, 74, 76, 78 ії 80 поза послідовностями, що відповідають СОК (тобто ЗЕО ІЮ МО-1, 2 і 3).
У переважному, але не обмежуючому втіленні антитіло згідно з даним винаходом вибране серед наступних: а) антитіло, що містить варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:35 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 98905 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:35, і три СОК важкого ланцюга послідовностей ЗЕО ІЮ МО:7,213;ї р) антитіло, що містить варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:36 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 98905 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:36, і три СОК важкого ланцюга послідовностей ЗЕО ІЮ МО:7,213;ї с) антитіло, що містить варіабельний домен легкого ланцюга послідовності, вибраної з БЕО
ІЮ МО:57 їі 60 або будь-якої послідовності щонайменше з 8095, 8595, 9095, 9595 або 98965 ідентичністю з ЗЕО ІЮ МО:57 або 60; і три СОК важкого ланцюга послідовностей 5ЗЕО ІЮ МО:7, 2 і 3.
Під "будь-якою послідовністю, що демонструє щонайменше 8095, переважно 8595, 9095, 9590 або 9895 ідентичність з 5ЕО ІЮ МО:35, 36, 57 або 60" слід розуміти послідовності, що демонструють три СОК легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО:4, 5 і 6 їі, крім того, демонструють щонайменше 8095, переважно 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з повною послідовністю
ЗЕО ІО МО:35,36, 57 або 60 поза послідовностями, що відповідають СОК (тобто ЗЕО ІЮ МО:4, 5 і 6).
Гуманізовані антитіла, описані в цьому документі, також можуть характеризуватися константним доменом, і, конкретніше, зазначені гуманізовані антитіла можуть бути вибрані або сконструйовані як Ідс1, Ідс2, ІдсЗ, ІМ, ІА, ДО або ІДЕ, але не обмежуючись ними.
Переважніше в контексті цього винаходу зазначені гуманізовані антитіла є (91 або Ідсаі.
Одне з втілень згідно з цим винаходом відноситься до гуманізованого антитіла, що містить варіабельні домени МН і Мі, описані вище, у форматі ІдсС1. Переважніше, зазначене гуманізоване антитіло містить константний домен для МН-послідовності зХЕО ІЮ МО:43 їі каппа- домен для Мі -послідовності зЕО ІЮ МО:45.
Одне з втілень згідно з даним винаходом відноситься до гуманізованого антитіла, що містить варіабельні домени МН і Мі, описані вище, у форматі Ід4. Переважніше, зазначене гуманізоване антитіло містить константний домен для МН-послідовності зХЕО ІЮ МО :44 і каппа- домен для Мі -послідовності зЕО ІЮ МО:45.
У ще одному втіленні згідно з даним винаходом антитіло вибране серед наступних: а) антитіло, що містить (або складається з) важкий ланцюг послідовності «ЕС ІЮ МО:37 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:37, і легкий ланцюг, що містить (або складається з) послідовність ЗЕО
ІО МО:39 або будь-яку послідовність, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з БЗЕО ІО МО:39; р) антитіло, що містить (або складається з) важкий ланцюг послідовності ЗЕО ІЮ МО:38 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:38, і легкий ланцюг, що містить (або складається з) послідовність ЗЕО
ІО МО:40 або будь-яку послідовність, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ЗЕО ІО МО :40; і с) антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності, вибраної з ЗЕО
ІО МО:56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 і 80, або будь-якої послідовності щонайменше з 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичністю з ЗЕО ІЮО МО:56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 або 80, і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності, вибраної з зЗЕО ІЮ МО:57 і 60 або будь-якої послідовності щонайменше з 8095, 8595, 90905, 9595 або 9895 ідентичністю з БЕО ІЮ МО:57 або 60.
Для більшої ясності таблиця ба ілюструє необмежуючі приклади послідовностей МН і Мі. для варіанту 1 (вар. 1) і варіанту З (вар. 3) гуманізованого антитіла п2208Е2. Вона також містить консенсусну послідовність для варіанту 2 (вар. 2).
Таблиця ба 71111110, 0 ВБажкийланцюг о | Легкийланцюг | 5ЕОЮМО
Варіабельнийдомен(МмН)ї (77777711 пг208Б2 11111111 ВаріаабельнийдоменіМмО.їд/ | 35 (вар. 1) Повнорозмрна.їд /-/-:/177777777771111111111111111111111Г11115370 11111111 (Повнорозмрна.//:/ 3/7 / 39749
Варіабельнийдомен(МмНн)ї (77777771 пг208Б2 11111111 ВаріаабельнийдоменіМмОї/ | 36 (вар. 3) Повнорозмрна.ї /-/-://::ОЇ77777777777111111111111111111111Г11113840 11111111 (Повнорозмрна./7/7/7/7/7/:/З |. //// 40779 ру кош нн и (вар. 2) 11111111 |ВаріаабельнийдоменіМ3уїЇ | 42
В іншому переважному, але не обмежуючому втіленні антитіло згідно з даним винаходом вибране серед наступних:
Зо а) антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності, вибраної з ЗЕО
ІО МО:56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 і 80, або будь-якої послідовності щонайменше з 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичністю з ЗЕО ІЮО МО:56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 або 80; і три СОК легкого ланцюга послідовностей ЗЕО ІЮ МО:9, 5 і 11; р) антитіло, що містить варіабельний домен легкого ланцюга послідовності, вибраної з Ф»ЕО
ІЮ МО:57 і 60, або будь-якої послідовності щонайменше з 8095, 8595, 9095, 9595 або 98965 ідентичністю з ЗЕО ІЮ МО:57 або 60; і три СОК важкого ланцюга послідовностей 5ЕО ІЮ МО:7, 2 іЗ;і с) антитіло, що містить варіабельний домен легкого ланцюга послідовності, вибраної з БЕО
ІЮ МО:57 і 60, або будь-якої послідовності щонайменше з 8095, 8595, 9095, 9595 або 98965 ідентичністю з 5ЕО ІЮ МО:57 або 60; і варіабельний домен важкого ланцюга послідовності, вибраної з БЕО ІЮ МО:56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 і 80, або будь-якої послідовності щонайменше з 8095, 8595, 90905, 9595 або 9895 ідентичністю з ЗЕО ІЮ МО:56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 або 80.
Ще одне втілення згідно з даним винаходом відноситься до антитіла, вибраного серед антитіл, що містять або складаються з наступних: а) важкий ланцюг послідовності, вибраної з БЕО ІЮО МО:58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75,77, 791 81, або будь-якої послідовності щонайменше з 8095, переважно 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичністю з ЗЕО ІЮ МО:58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 або 81; і р) легкий ланцюг послідовності, вибраної з БЕО ІЮ МО:59 і 61, або будь-якої послідовності щонайменше з 8095, переважно 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичністю з БЕО ІЮ МО:59 або 61.
Ще одне втілення згідно з даним винаходом відноситься до антитіла, вибраного серед наступних: а) антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності, вибраної з ЗЕО
ІО МО:56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 і 80, або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з «ЕО ІЮ МО:56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 або 80; і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:57 або будь- якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з
ЗЕО І МО:57; і р) антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності, вибраної з ФЕО
ІО МО:56, 64, 68 і 78, або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з БЕО ІЮ МО:56, 64, 68 або 78, і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності 56 ІЮ МО:60 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095 ідентичність з зФЕО ІЮ МО:60.
Ще одне втілення згідно з даним винаходом відноситься до антитіла, вибраного серед наступних: а) антитіло, що містить (або складається з) важкий ланцюг послідовності «ЕС ІЮ МО:58 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:58, і легкий ланцюг, що містить (або складається з) послідовність ЗЕО
ІО МО:59 або будь-яку послідовність, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з БЗЕО ІЮ МО:59; р) антитіло, що містить (або складається з) важкий ланцюг послідовності ЗЕО ІЮ МО:58 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ЗЕО І МО:58, і легкий ланцюг послідовності 5ЕСО ІЮ МО:61 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 90905, 9595 або 9895 ідентичність з БЕО ІЮ
МО:61; с) антитіло, що містить (або складається з) важкий ланцюг послідовності «ЕО ІЮ МО:63 або
Ко) будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:63, і легкий ланцюг, що містить (або складається з) послідовність ЗЕО
ІО МО:59 або будь-яку послідовність, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з БЗЕО ІЮ МО:59; а) антитіло, що містить (або складається з) важкий ланцюг послідовності з«»ЕО ІЮ МО:65 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:65, і легкий ланцюг, що містить (або складається з) послідовність ЗЕО
ІО МО:59 або будь-яку послідовність, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з БЗЕО ІЮ МО:59; е) антитіло, що містить (або складається з) важкий ланцюг послідовності зЕО ІЮ МО:65 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:65, і легкий ланцюг, що містить (або складається з) послідовність ЗЕО
ІО МО:61 або будь-яку послідовність, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ЗЕО ІЮ МО:61;
І) антитіло, що містить (або складається з) важкий ланцюг послідовності «ЕО ІЮ МО:67 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:67, і легкий ланцюг, що містить (або складається з) послідовність ЗЕО
ІО МО:59 або будь-яку послідовність, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з БЗЕО ІЮ МО:59; 9) антитіло, що містить (або складається з) важкий ланцюг послідовності зх»ЕО ІЮ МО:69 або
БО будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:69, і легкий ланцюг, що містить (або складається з) послідовність ЗЕО
ІО МО:59 або будь-яку послідовність, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 95965 або 9895 ідентичність з БЗЕО ІЮ МО:59;
Р) антитіло, що містить (або складається з) важкий ланцюг послідовності ЗЕО ІЮ МО:69 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:69, і легкий ланцюг, що містить (або складається з) послідовність ХЕ
ІО МО:61 або будь-яку послідовність, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ЗЕО ІЮ МО:61; ї) антитіло, що містить (або складається з) важкий ланцюг послідовності з«ЕО ІЮ МО:71 або 60 будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:71, і легкий ланцюг, що містить (або складається з) послідовність ЗЕО
ІО МО:59 або будь-яку послідовність, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з БЗЕО ІЮ МО:59;
Ї) антитіло, що містить (або складається з) важкий ланцюг послідовності ЗЕО ІЮ МО:73 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:73, і легкий ланцюг, що містить (або складається з) послідовність ЗЕО
ІО МО:59 або будь-яку послідовність, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з БЗЕО ІЮ МО:59;
К) антитіло, що містить (або складається з) важкий ланцюг послідовності з«ЕО ІЮ МО:75 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:75, і легкий ланцюг, що містить (або складається з) послідовність ЗЕО
ІО МО:59 або будь-яку послідовність, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з БЗЕО ІЮ МО:59;
І) антитіло, що містить (або складається з) важкий ланцюг послідовності з«ЕО ІЮ МО:77 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:77, і легкий ланцюг, що містить (або складається з) послідовність ЗЕО
ІО МО:59 або будь-яку послідовність, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з БЗЕО ІЮ МО:59; т) антитіло, що містить (або складається з) важкий ланцюг послідовності 5ЕО ІЮ МО:79 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:79, і легкий ланцюг, що містить (або складається з) послідовність ЗЕО
ІО МО:59 або будь-яку послідовність, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з БЕО ІЮ МО:59; п) антитіло, що містить (або складається з) важкий ланцюг послідовності ЗЕО ІЮ МО:79 або будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:79, і легкий ланцюг, що містить (або складається з) послідовність ЗЕО
ІО МО:61 або будь-яку послідовність, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ЗЕО ІО МО:61; і о) антитіло, що містить (або складається з) важкий ланцюг послідовності «ЕО ІЮ МО:81 або
Ко) будь-якої послідовності, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:81, і легкий ланцюг, що містить (або складається з) послідовність ЗЕО
ІО МО:59 або будь-яку послідовність, що демонструє щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичність з ЗЕО ІЮ МО:59.
Для більшої ясності таблиця 66 ілюструє необмежуючі приклади послідовностей МН і МІ. (варіабельного домена і повнорозмірну) для різних варіантів гуманізованого антитіла п2208Е2.
Таблиця бр 11111111 | Бажкийланцюг | Легкийланцюг./ | 5ЕОІЮМО 56 п2208Б2 Варіабельний домен (МН) | Варіабельний домен (МІ) 57 нОЗ7/ 018 Повнорозмірна Повнорозмірна 58 59 56 п2208Б2 Варіабельний домен (МН) | Варіабельний домен (МІ) (610) нОЗ7/ 021 Повнорозмірна Повнорозмірна 58 61 62 п2208Б2 Варіабельний домен (МН) | Варіабельний домен (МІ) 57 но47/ 018 Повнорозмірна Повнорозмірна 63 59 64 п2208Б2 Варіабельний домен (МН) | Варіабельний домен (МІ) 57 но49/Г 018 Повнорозмірна Повнорозмірна 65 59 64 п2208Б2 Варіабельний домен (МН) | Варіабельний домен (МІ) (610) ноОо49/ 021 Повнорозмірна Повнорозмірна 65 61
Таблиця бр 11111111 | Важкийланцюг | Легкийланцюг. | 5ЕОЮМО 66 п2208Б2 Варіабельний домен (МН) | Варіабельний домен (МІ) 57
НоОБб1/ 018 Повнорозмірна Повнорозмірна 67 59 68 п2208Б2 Варіабельний домен (МН) | Варіабельний домен (МІ) 57 ноОБ2/Г 018 Повнорозмірна Повнорозмірна 69 59 68 п2208Б2 Варіабельний домен (МН) | Варіабельний домен (МІ) (610) нОБ2/ 021 Повнорозмірна Повнорозмірна 69 61 70 п2208Б2 Варіабельний домен (МН) | Варіабельний домен (МІ) 57 нО57/ 018 Повнорозмірна Повнорозмірна 71 59 72 п2208Б2 Варіабельний домен (МН) | Варіабельний домен (МІ) 57 нобв8/ 018 Повнорозмірна Повнорозмірна 73 59 74 п2208Б2 Варіабельний домен (МН) | Варіабельний домен (МІ) 57 нО70/Г 018 Повнорозмірна Повнорозмірна 75 59 76 п2208Б2 Варіабельний домен (МН) | Варіабельний домен (МІ) 57
НО71/ 018 Повнорозмірна Повнорозмірна 77 59 78 п2208Б2 Варіабельний домен (МН) | Варіабельний домен (МІ) 57 нО76/Г 018 Повнорозмірна Повнорозмірна 79 59 78 п2208Б2 Варіабельний домен (МН) | Варіабельний домен (МІ) (610) нО76/ 021 Повнорозмірна Повнорозмірна 79 61 80 п2208Б2 Варіабельний домен (МН) | Варіабельний домен (МІ) 57 нО77/ 018 Повнорозмірна Повнорозмірна 81 59
Іншим аспектом даного винаходу є антитіло, вибране серед наступних: ї антитіло, яке продукується гібридомами 1-4757, І-4773, І-4775, І-4736 або 1-4774, депонованими у СМСМ, Національній колекції культур мікроорганізмів, Інститут Пастера, 25, вулиця Росіеиг Коих, 75724, Париж, Франція, 30 травня 2013 року, 26 червня 2013, 26 червня 2013, 24 квітня 2013 і 26 червня 2013 року, відповідно, і) антитіло, яке конкурує за зв'язування ІСБЕ-1К з антитілом згідно ії); а також ії) антитіло, яке зв'язується з тим самим епітопом ІЗБЕ-1К, що й антитіло згідно Її).
Відповідно до іншого аспекту даний винахід відноситься до мишачої гібридоми, вибраної серед гібридом 1-4757, І-4773, І-4775, І-4736 або І-4774, депонованих у СМСМ, Інститут Пастера,
Франція, 30 травня 2013 року, 26 червня 2013, 26 червня 2013, 24 квітня 2013 і 26 червня 2013 року, відповідно.
Новий аспект даного винаходу відноситься до виділеної нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент згідно з цим винаходом.
Терміни "нуклеїнова кислота", "нуклеїнова послідовність", "нуклеїновокислотна послідовність", "полінуклеотид", "олігонуклеотид", "полінуклеотидна послідовність" («
"нуклеотидна послідовність", взаємозамінно використовувані в цьому описі, позначають точну послідовність нуклеотидів, модифікованих або ні, таку, що визначає фрагмент або область нуклеїнової кислоти, що містить або не містить неприродні нуклеотиди і є або дволанцюговою
ДНК, або одноланцюговою ДНК, або транскрипційними продуктами зазначених ДНК.
Послідовності даного винаходу були виділені і/або очищені, тобто вони були відібрані прямо або непрямо, наприклад, шляхом копіювання, і їхнє навколишнє середовище щонайменше частково було змінене. Також тут слід згадати виділені нуклеїнові кислоти, отримані шляхом рекомбінантної генетики, наприклад, за допомогою клітин-хазяїв, або шляхом хімічного синтезу.
Також цей винахід відноситься до вектора, що містить нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент згідно з даним винаходом.
Винахід, зокрема, спрямований на клонуючі вектори і/або експресійні вектори, які містять таку нуклеотидну послідовність.
Вектори переважно містять елементи, які дозволяють експресувати і/або секретувати нуклеотидні послідовності в даній клітині-хазяїні. Вектор, таким чином, повинен містити промотор, сигнали ініціації і термінації трансляції, а також відповідні області регуляції транскрипції. Він повинен мати здатність стабільно зберігатися в клітині-хазяїні і може додатково мати специфічні сигнали, які визначають секрецію трансльованого білка. Ці різні елементи відбираються і ооптимізуються фахівцями ов даній області відповідно до використовуваної клітини-хазяїна. Для цього нуклеотидні послідовності можуть бути вставлені у векторах, що самореплікуються, у вибраного хазяїна або можуть бути інтегративними векторами вибраного хазяїна.
Такі вектори виготовляють, зазвичай, за допомогою способів, що використовуються фахівцями в цій області, і отримані в результаті клони можуть бути введені у відповідного хазяїна за допомогою стандартних способів, таких як ліпофекція, електропорація, тепловий шок або хімічні способи.
Вектори є, наприклад, векторами плазмідного або вірусного походження. Вони використовуються для трансформації клітин-хазяїв для клонування або експресії нуклеотидних послідовностей згідно з винаходом.
Даний винахід також відноситься до виділених клітин-хазяїв, трансформованих вектором, описаним вище, або таким, що містять його.
Клітина-хазяїн може бути вибрана серед прокаріотичних або еукаріотичних систем, таких як, наприклад, бактеріальні клітини, а також дріжджові клітини або клітини тварин, зокрема клітини ссавців (за винятком людини). Також можуть бути використані клітини комах або рослин.
Даний винахід також відноситься до тварин, за винятком людини, які містять трансформовану клітину.
Інший аспект відноситься до способу отримання антитіла відповідно до даного винаходу або його антигензв'язуючого фрагмента, при цьому зазначений спосіб характеризується тим, що включає наступні етапи: а) культивування клітини-хазяїна згідно з винаходом у середовищі у відповідних культуральних умовах; і р) витягання зазначеного антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, отриманого таким чином, з культурального середовища або із зазначених клітин, які культивують.
Трансформовані клітини використовуються в способах отримання рекомбінантних антитіл відповідно до цього винаходу. До даного винаходу також входять способи отримання антитіл у рекомбінантній формі за допомогою вектора і/або клітини, трансформованої вектором згідно з винаходом. Переважно клітину, трансформовану вектором, описаним вище, культивують в умовах, які роблять можливою експресію зазначеного вище поліпептиду і витягання зазначеного антитіла.
Як вже згадувалося, клітина-хазяїн може бути вибрана серед прокаріотичних або еукаріотичних систем. Зокрема, можна визначити нуклеотидні послідовності, які полегшують секрецію в такій прокаріотичній або еукаріотичній системі. Вектор згідно з винаходом, що несе таку послідовність, може бути вигідно використаний для продукції рекомбінантних білків, які секретують. Дійсно, очищенню цих рекомбінантних білків, що становлять інтерес, сприятиме той факт, що вони присутні в супернатанті клітинної культури, а не усередині клітин-хазяїв.
Антитіло також може бути отримане шляхом хімічного синтезу. Один такий спосіб отримання також є об'єктом винаходу. Фахівцям в даній області відомі способи хімічного синтезу, такі як твердофазні методики або частково твердофазні методики, шляхом конденсації фрагментів або шляхом звичайного синтезу в розчині. До винаходу також входять поліпептиди, які отримані шляхом хімічного синтезу і можуть містити відповідні неприродні амінокислоти. 60 До даного винаходу також входить антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент,
ймовірно, отриманий описаним вище способом.
Відповідно до конкретного аспекту даний винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, описаного вище, для застосування в якості адресуючого переносника для доставки цитотоксичного агента в місце-мішень хазяїна, при цьому зазначене місце-мішень хазяїна складається з епітопа, локалізованого у ІЕ-1К, переважно у позаклітинному домені ІЗЕ-1К, переважніше в людському ІЗЕ-1А8 (5ЕО ІЮ МО:50), і ще переважніше у позаклітинному домені людського ІЗЕ-18 (5ЕО ІЮ МО':51), і ще переважніше на
М-кінці позаклітинного домена людського ІЗЕ-1А8 (5ЕО ІЮО МО:52), або до послідовності будь- якого їх природного варіанту.
У переважному втіленні зазначене місце-мішень хазяїна є місцем-мішенню клітини ссавця, переважніше клітини людини, переважніше клітини, яка природним чином або шляхом генетичної рекомбінації експресує ІСБ-1Н8.
Іншим аспектом даного винаходу є кон'югат "антитіло - лікарський засіб", що містить антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, описаний вище, кон'югований з цитотоксичним агентом.
Винахід відноситься до имунокон'югата, що містить антитіло, описане в цьому документі, кон'юговане з цитотоксичним агентом.
Вираз "їмунокон'югат" відноситься в загальному випадку до сполуки, що містить щонайменше один адресуючий продукт, такий як антитіло, фізично зв'язаний з одним або більше ніж одним терапевтичним агентом (агентами), що таким чином створює високо націлену сполуку.
У переважному втіленні такі терапевтичні агенти включають цитотоксичні агенти.
Під терміном "цитотоксичний агент" або "цитотоксичний" мається на увазі агент, який при введенні суб'єкту лікує або запобігає проліферації ненормальних клітин, переважно, розвиток раку в організмі суб'єкта, інгібуючи або запобігаючи клітинній функції і/або викликаючи загибель клітин.
Багато цитотоксичних агентів були виділені або синтезовані і роблять можливим інгібування проліферації клітин або руйнування, або зменшення пухлинних клітин, якщо не остаточно, то щонайменше суттєво. Проте, токсична активність цих агентів не обмежена активністю по
Зо відношенню до пухлинних клітин, і непухлинні клітини також страждають і можуть бути знищені.
Конкретніше, побічні ефекти спостерігаються на клітинах, що швидко поновлюються, таких як кровотворні клітини або клітини епітелію, зокрема, клітини слизових оболонок. Як ілюстрація, клітини шлунково-кишкового тракту значною мірою уражаються при використанні таких цитотоксичних агентів.
Однією з цілей даного винаходу також є надання цитотоксичного агента, який дає можливість обмежити побічні ефекти щодо нормальних клітин, у той же час зберігаючи високу цитотоксичність по відношенню до пухлинних клітин.
Конкретніше, цитотоксичний агент може переважно включати, але не обмежуючись ними, лікарський препарат (тобто кон'югат "антитіло - лікарський препарат"), токсин (наприклад, "імунотоксин" або кон'югат "антитіло - токсин"), радіоактивний ізотоп (тобто "радіоіїмунокон'югат" або кон'югат "антитіло - радіоізотоп") і т.д.
У першому переважному втіленні імунокон'югат складається з антитіла, зв'язаного щонайменше з лікарським препаратом або медикаментом. Такий імунокон'югат називають кон'югатом "антитіло - лікарський препарат" (або "АОС", апіроду-агид сопіидаїє).
У першому втіленні такі лікарські препарати можуть бути описані стосовно режиму їхньої дії.
Як необмежуючий приклад можна згадати алкілуючі агенти, такі як азотистий іприт, алкілсульфонати, нітрозосечовина, оксазофорини, азиридини або етиленіміни, антиметаболіти, протипухлинні антибіотики, інгібітори мітозу, інгібітори функції хроматину, антиангіогенні агенти, антиестрогени, антиандрогени, хелатуючі агенти, стимулятори всмоктування заліза, інгібітори циклооксигенази, інгібітори фосфодіестерази, інгібітори ДНК, інгібітори синтезу ДНК, стимулятори апоптозу, інгібітори тимідилатсинтази, інгібітори Т-клітин, агоністи інтерферону, інгібітори рибонуклеозидтрифосфатредуктази, інгібітори ароматази, антагоністи рецепторів естрогену, інгібітори тирозинкінази, інгібітори клітинного циклу, таксан, інгібітори тубуліну, інгібітори ангіогенезу, стимулятори макрофагів, антагоністи рецепторів нейрокінінів, агоністи канабіноїдних рецепторів, агоністи дофамінових рецепторів, агоністи гранулоцитарного стимулюючого чинника, агоністи рецептора еритропоетину, агоністи рецептора соматостатину, агоністи ЇНКН, сенсибілізатори кальцію, антагоністи рецептора МЕСЕ, антагоністи рецепторів інтерлейкінів, інгібітори остеокластів, стимулятори утворення радикалів, антагоністи рецепторів ендотеліну, алкалоїд барвінка, антигормони або імуномодулятори або будь-які інші нові бо препарати, які містять повний набір критеріїв активності цитотоксичного агента або токсину.
Такі препарати, наприклад, приведені у МІСАЇ. 2010 на сторінці, присвяченій сполукам, прикріпленим до колонки онкології і гематології "Дитотоксичні агенти", і ці цитотоксичні сполуки, приведені з посиланням на цей документ, процитовані у цьому документі як переважні цитотоксичні агенти.
Конкретніше, але не обмежуючись ними, наступні лікарські препарати або медикаменти є переважними згідно з винаходом: мехлоретамін, хлорамбукол, мелфален, хлоридрат, піпобромен, преднімустин, динатрію фосфат, естрамустин, циклофосфамід, алтретамін, трофосфамід, сульфофосфамід, іфосфамід, тіотепа, триетиленамін, кармустин, стрептозоцин, фотемустин, ломустин, бусульфан, треосульфан, імпросульфан, дакарбазин; цисплатин, оксаліплатин, лобаплатин, гептаплатин, міриплатин гідрат, карбоплатин, метотрексат, пеметрексед, 5-фторурацил, флоксуридин, 5-фтордезоксиуридин, капецитабін, цитарабін, флударабін, цитозинарабінозид, б-меркаптопурин (6-МР), неларабін, б-тіогуанін (6-1), хлордезоксиаденозин, 5-азацитидин, гемцитабін, кладрибін, дезоксикоформіцин, тегафур, пентостатин, доксорубіцин, даунорубіцин, ідарубіцин, валрубіцин, мітоксантрон, дактиноміцин, мітраміцин, плікаміцин, мітоміцин С, блеоміцин, прокарбазин, паклітаксел, доцетаксел, вінбластин, вінкристин, віндезин, вінорелбін, топотекан, іринотекан, етопозид, валрубіцин, амрубіцин гідрохлорид, пірарубіцин, еліптинію ацетат, зорубіцин, епірубіцин, ідарубіцин і теніпозид, разоксин, марімастат, батімастат, приномастат, таномастат, іломастат, СО5-27023А, галофугінон, СОЇ -3, неовастат, талідомід, СОС 501, ОМХАА, І -651582, скваламін, ендостатин,
ЗИ05416, 506668, інтерферон-альфа, ЕМО121974, інтерлейкін-12, ІМ862, ангіостатин, тамоксифен, тореміфен, ралоксифен, дролоксифен, йодоксифен, анастрозол, летрозол, ексеместан, флутамід, нілутамід, спіронолактон, ципротерон ацетат, фінастерид, цимітидин, бортезомід, велкад, бікалутамід, ципротерон, флутамід, фулвестран, екземестан, дазатиніб, ерлотиніб, гефітиніб, іматиніб, лапатиніб, нілотиніб, сорафеніб, сунітиніб, ретиноїд, рексиноїд, метоксален, метиламінолевулінат, алдеслейкін, ОСТ-43, денілейкін дифлітокс, інтерлейкін-2, тазонермін, лентінан, сизофілан, роквінімекс, підотимод, пегадемаза, тимопентин, полі І:С (поліінозинова-поліцитидилова кислота), прокодазол, Тіс ВСО, Согуперасіегішт рагмит, МОМ- 002, україн, левамізол, 1311-САТМТ, Н-101, целмолейкін, інтерферон альфа га, інтерферон альфа 26, інтерферон гамма а, мобенакін, рексин-С, тецелейкін, акларубіцин, актиноміцин,
Зо арглабін, аспарагіназа, карцинофілін, хромоміцин, дауноміцин, лейковорин, мазопрокол, неокарциностатин, пепломіцин, саркоміцин, соламаргін, трабектедин, стрептозоцин, тестостерон, кунакатехіни, синьокатехіни, алітретиноїн, белотекан гідрохлорид, калустерон, дромостанолон, етиніл естрадіол, етопозид, флюоксиместерон, форместан, фосфетрол, гозерелін ацетат, гексил амінолевулінат, гістрелін, гідроксипрогестерон, іксабепілон, лейпролід, медроксипрогестерон ацетат, мегестрол ацетат, метилпреднізолон, метилтестостерон, мільтефозин, мітобронітол, надролон фенілпропіонат, норетиндрон ацетат, преднізолон, преднізон, темсиролімус, тестолактон, триамконолон, трипторелін, вапреодит ацетат, зиностатин стималамер, амсакрин, тріоксид миш'яку, бісантрен гідрохлорид, хлорамбуцил, хлортрианізен, цис-діаміндихлорплатина, циклофосфамід, діетилстилбестрол, гексаметилмеламін, гідроксисечовина, леналідомід, лонідамін, мехлоретанамін, мітотан, недаплатин, німустин гідрохлорид, памідронат, піпоброман, порфімер натрію, ранімустин, разоксан, семустин, собузоксан, мезілат, триетиленмеламін, золедронова кислота, камостат мезілат, фадрозол НС, нафоксидін, аміноглютетимід, кармофур, клофарабін, цитозинарабінозид, децитабін, доксифлурідин, еноцитабін, флударабін фосфат, фторурацил, фторафур, урацил гірчичний, абареликс, бексаротен, ралтитрексид, тамібаротен, темозоломід, вориностат, мегастрол, клодронат динатрію, левамізол, ферумокситол, заліза ізомальтозид, целекоксиб, ібудиласт, бендамустин, алтретамін, мітолактол, темсиролімус, пралатрексат, Т5- 1, децитабін, бікалутамід, флутамід, летрозол, клодронат динатрію, дегарелікс, тореміфен цитрат, гістамін дигідрохлорид, ОМУ/-166НС, нітракрин, децитабін, іритекан гідрохлорид, амсакрин, ромідепсин, третиноїн, кабазитаксел, вандетаніб, леналідомід, ібандронова кислота, мільтефозин, вітеспен, міфамуртид, надропарин, гранісетрон, ондансетрон, тропісетрон, алізаприд, рамосетрон, доласетрон мезілат, фосапрепітант димеглумін, набілон, апрепітант, дронабінол, ТУ-10721, лізурид гідроген малеат, епіцерам, дефібротид, дабігатран етексилат, філграстим, пегфілграстим, редитукс, епоетин, молграмостим, опрелвекін, сипулейцел-Т, М-
Мах, ацетил | -карнітин, донепезил гідрохлорид, 5-амінолевулінова кислота, метиламінолевулінат, цетрорелікс ацетат, ікодекстрин, лейпрорелін, метилфенідат, октреотід, амлексанокс, плеріксафор, менатетренон, анетол дитіолетіон, доксеркальциферол, цінакальцет гідрохлорид, алефацепт, роміплостим, тімоглобулін, тімалфазин, убенімекс, іміквімод, еверолімус, сиролімус, Н-101, лазофоксифен, трілостан, інкадронат, гангліозиди, пегаптаніб 60 октанатрію, вертопорфін, мінодронова кислота, золедронова кислота, нітрат галію, алендронат натрію, етидронат динатрію, памідронат динатрію, дутастерід, стібоглюконат натрію, армодафніл, дексразоксан, аміфостин, УМ/Е-10, темопорфін, дарбепоетин альфа, анцестим, сарграмостим, паліфермін, К-744, непідермін, опрелвекін, денілейкін-діфтітокс, кризантаспаза, бусерелін, деслорелін, ланреотід, октреотід, пілокарпін, бозентан, каліхеаміцин, мейтанзиноїди, циклонікат і піролобензодіазепіни, особливо ті, які описані в заявці РСТ, опублікованій під номером УМО2011/130598.
В іншому втіленні імунокон'югат складається з антитіла, зв'язаного щонайменше з радіоактивним ізотопом. Такий імунокон'югат називають кон'югатом "антитіло - радіоїзотоп" (або "АВС").
Для селективного руйнування пухлини антитіло може містити високорадіоактивний атом.
Для отримання АКС доступна безліч радіоактивних ізотопів, таких як, але не обмежуючись ними, Аїг!!, ССЗ, М5, 17, Ме, М2гз 131, раб |д'ї, мо Де!86 Ве!88, Упт53, їс991, Віг'2, рзг, рре"», радіоактивні ізотопи І и, гадолінію, марганцю або заліза.
Будь-які способи або процеси, відомі фахівцям в даній області, можуть бути використані для включення такого радіоїзотопу в АКС. Як необмежуючий приклад, їс??т або 123, Ве"86. Ве'88 і
Іп!!! можуть бути приєднані через залишок цистеїну. У може бути приєднаний через залишок лізину. 123 може бути приєднаний за допомогою способу ІОРОСЕМ.
Щоб проілюструвати знання фахівців в області АКС, можна згадати декілька прикладів, таких як 7емарйп?, який є АКС, що складається з моноклонального анти-СО20-антитіла і радіоактивного ізотопу Іп'Її або 90, зв'язаного тіосечовинним лінкером-хелатором; або
Муїоїагає, до складу якого входить анти-СО33-антитіло, зв'язане з каліхеаміцином (05 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). З останніх також можна згадати АОС, відомий як Аайсеїгі5 (що відповідає брентуксимаба ведотіну), який був недавно прийнятий ЕВА для лікування лімфоми Ходжкіна.
В іншому втіленні імунокон'югат складається з антитіла, зв'язаного щонайменше з токсином.
Такий імунокон'югат називають кон'югатом "антитіло - токсин" (або "АТС").
Токсини є ефективними і специфічними отрутами, які виробляються живими організмами.
Вони, зазвичай, складаються з амінокислотного ланцюга, молекулярна маса якого може варіювати в діапазоні пари сотень (пептиди) і сотні тисяч (білки). Вони також можуть бути низькомолекулярними органічними сполуками. Токсини виробляються багатьма організмами, наприклад, бактеріями, грибами, водоростями і рослинами. Багато з них є надзвичайно отруйними, маючи токсичність, яка на декілька порядків вища, ніж у нервово-паралітичних агентів.
Токсини, використовувані в АТС, можуть включати, але не обмежуючись ними, всі види токсинів, які можуть чинити свою цитотоксичну дію за допомогою механізмів, що включають зв'язування тубуліну, зв'язування ДНК або інгібування топоізомерази.
Ферментативно активні токсини і їх фрагменти, які можуть бути використані, включають ланцюг А дифтерійного токсину, незв'язуючі активні фрагменти дифтерійного токсину, ланцюг А екзотоксину (від Рзхепдотопах аегидіпоза), ланцюг А рицину, ланцюг А абріну, ланцюг А модекцину, альфа-сарцин, білки АїІецгез гогаїї, білки-діантіни, білки Рпуїшїаса атегісапа (РАРІ,
РАРІЇ ї РАР-5), інгібітор Мотогаїса спагапійа, курцин, кротин, інгібітор Зараопагіа ойісіпаїї5, гелонін, мітогелін, рестріктоцин, феноміцин, еноміцин і трикотецени.
Низькомолекулярні токсини, такі як доластатини, ауристатини, зокрема монометилауристатин Е (ММАЕ), трихотецин і СС1065, а також похідні цих токсинів, які мають активність токсину, також розглядаються в даному описі. Було показано, що доластатини і ауристатини порушують динаміку мікротрубочок, гідроліз ЗТР, а також ядерне і клітинне ділення, і мають протиракову і протигрибкову активність.
Поняття "лінкер", "лінкерний блок" або "зв'язок" позначають хімічне угрупування, що містить ковалентний зв'язок або ланцюг атомів, який ковалентно приєднує антитіло щонайменше до одного цитотоксичного агента.
Лінкери можуть бути отримані з використанням безлічі біфункціональних агентів, що зв'язують білки, таких як М-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіо)упропіонат (ЗРОР), сукцинімідил-4-(М- малеїмідометил)циклогексан-1-карбоксилат (ЗМСС), імінотіолан (ІТ), біфункціональні похідні імідоефірів (такі як диметиладипімідат НС), активні складні ефіри (такі як дисукцинімідилсуберат), альдегіди (такі як глутаральдегід), біс-азидо-з'єднання (такі як біс(п- азидобензоїл)гександіамін), біс-діазонію похідні (такі як біс(п-діазонію бензоїл)етилендіамін), діззоціанати (такі як толуол-2,б-діїзоціанат) і біс-активні сполуки фтору (такі як 1,5-дифтор-2,4- динітробензол). Мічена вуглецем-14 1-ізотіоціанатобензил-3-метилдіетилентриамінпентаоцтова кислота (МХ-ОТРА) є прикладом хелатуючого агента для кон'югації цитотоксичних агентів з бо адресуючою системою. Іншими зв'язуючими реагентами можуть бути ВМР5, ЕМО5, СМВ5,
НВУ5, 1 0-5МСС, МВ5, МРВН, ВАР, ІА, ЗІАВ, 5МСОС, ЗМРВ, 5МРН, сульфо-ЕМСО5, сульфо-
СМВ5, сульфо-КМО5, сульфо-МВ5, сульфо-5БІАВ, сульфо-ЗМОСС і сульфо-ЗМРВ і 5УЗВ (сукцинімідил-(4-вінілсульфон) бензоат), які є комерційно доступними (наприклад, від Ріегсе
ВіотесппоїІоду, Іпс., Рокфорд, Ілінойс, США).
Лінкер может бути "нерозщеплюваним" або "розщеплюваним".
У переважному втіленні він складається з "розщеплюваного лінкера", що полегшує вивільнення цитотоксичного агента в клітині. Наприклад, може бути використаний кислотно- лабільний лінкер, чутливий до пептидази лінкер, фотолабільний лінкер, диметиловий лінкер або лінкер, що містить дисульфід. У переважному втіленні лінкер, розщеплюється у внутрішньоклітинних умовах таким чином, що розщеплення лінкера вивільняє цитотоксичний агент з антитіла у внутрішньоклітинне середовище.
Наприклад, у деяких втіленнях лінкер розщеплюється розщеплювальним агентом, який присутній у внутрішньоклітинному середовищі (наприклад, у лізосомі або ендосомі, або кавеолі). Лінкер може бути, наприклад, пептидильним лінкером, який розщеплюється внутрішньоклітинним ферментом пептидазою або протеазою, у тому числі, але не обмежуючись ними, лізосомальною або ендосомальною протеазою. Зазвичай, пептидильний лінкер має щонайменше дві амінокислоти у довжину або щонайменше три амінокислоти у довжину.
Розщеплювальні агенти можуть включати катепсини В і 0 і плазмін, які, як відомо, гідролізують дипептидні похідні лікарських засобів, приводячи до вивільнення активного лікарського засобу усередині клітини-мішені. Наприклад, може бути використаний пептидильний лінкер, який розщеплюється тіол-залежною протеазою катепсином В, яка експресується на високому рівні в раковій тканині (наприклад, лінкер, Ріпе-Геи або сіІу-Рпе-І еи-СІу) У конкретних втіленнях пептидильним лінкером, що розщеплюється внутрішньоклітинною протеазою, є лінкер МаІ-Сії або лінкер РПпе-Гух. Одна з переваг використання внутрішньоклітинного протеолітичного вивільнення цитотоксичного агента полягає в тому, що агент, зазвичай, ослаблюється при кон'югації, і сироваткова стабільність кон'югатів, зазвичай, є високою.
В інших втіленнях розщеплюваний лінкер є рН-чутливим, тобто чутливим до гідролізу при певних значеннях рН. Як правило, рН-чутливий лінкер гидролізуєтся у кислих умовах.
Наприклад, може бути використаний кислотно-лабільний лінкер, який гидролізуєтся в лізосомах (наприклад, гідразон, семикарбазон, тіосемикарбазон, цис-аконітовий амід, ортоефір, ацеталь, кеталь і т.п.). Такі лінкери відносно стабільні в нейтральних умовах рн, таких як умови в крові, але нестабільні при рН нижче 5,5 або 5,0, наближеному до рН лізосом. У деяких втіленнях лінкером, який гідролізують, є тіоефірний лінкер, такий як, наприклад, тіоефір, прикріплений до терапевтичного агента через ацилгідразоновий зв'язок.
В інших втіленнях лінкер розщеплюється у відновлюючих умовах (наприклад, дисульфідний лінкер). У даній області відоме велике число дисульфідних лінкерів, включаючи, наприклад, ті, які можуть бути утворені з використанням ЗАТА (М-сукцинімідил-5-ацетилтіоацетату), ЗРОР (М- сукцинімідил-3-(2-піридилдитіо)пропіонової кислоти), ЗзРОВ (М-сукцинімідил-3-(2- піридилдитіо)бутирату) і ЗМРТ (М-сукцинімідил-алкілоксикарбоніл-альфа-метил-альфа-(2- піридил-дитіо)толуолу), 5РОВ і БМРТ.
Як необмежуючий приклад нерозщеплюваних або "невідновних" лінкерів можна згадати імунокон'югат трастузумаб-ОМІ (ТОМІ), який об'єднує трастузумаб із зв'язаним хіміотерапевтичним агентом мейтанзином.
У переважному втіленні імунокон'югат згідно з даним винаходом може бути отриманий будь- яким із способів, відомих фахівцям в даній області, таких як, але не обмежуючись ними, і) реакція нуклеофільної групи антитіла з двовалентним лінкерним реагентом з подальшою реакцією з цитотоксичним агентом, або ії) реакція нуклеофільної групи цитотоксичного агента з двовалентним лінкерним реагентом з подальшою реакцією з нуклеофільною групою антитіла.
Нуклеофільні групи на антитілі, включають, але не обмежуючись ними, М-кінцеві аміно- групи, аміногрупи бічного ланцюга, наприклад, лізину, тіолові групи бічного ланцюга і гідроксильні або аміно-групи цукрів, коли антигензв'язуючий білок глікозильований. Аміно-, тіолові і гідроксильні групи є нуклеофільними і здатні вступати в реакцію з утворенням ковалентних зв'язків з електрофільними групами на лінкерних угрупованнях і лінкерних реагентах, включаючи, але не обмежуючись ними, активні складні ефіри, такі як складні ефіри
МН, складні ефіри НОВІ, галогенформіати і галогеніди кислот; алкіл- і бензилгалогеніди, такі як галогенацетаміди; альдегіди, кетони, карбоксильні і малеімідні групи. Антитіло може мати відновлювані міжланцюгові дисульфіди, тобто цистеїнові містки. Антитіло можна зробити реакційноздатним для кон'югації з лінксерними реагентами шляхом обробки відновлювальним агентом, таким як ОТТ (дитіотреїтол). Кожний цистеїновий місток, таким чином, формуватиме, бо теоретично, два реактивних тіолових нуклеофіла. Додаткові нуклеофільні групи можуть бути введені в антитіло за допомогою будь-якої реакції, відомої фахівцям в даній області. Як необмежуючий приклад, реакційноздатні тіолові групи можуть бути введені в антитіло шляхом введення одного або більше ніж одного залишку цистеїну.
Імунокон'югати також можуть бути отримані за допомогою модифікації антитіла введенням електрофільних угруповань, які можуть вступати в реакцію з нуклеофільними замісниками на лінкерному реагенті або цитотоксичному агенті. Цукри глікозильованого антитіла можуть бути окислені з утворенням альдегідних або кетонових груп, які можуть вступати в реакцію з аміно- групою лінкерних реагентів або цитотоксичного агента. Отримані в результаті імінові групи основ Шиффа можуть формувати стабільний зв'язок або можуть бути відновлені з утворенням стабільних аміно-зв'язків. В одному з втілень реакція вуглеводневої частини глікозильованого антитіла або з галактозооксидазою, або з метаперіодатом натрію може давати карбонільні (альдегідні і кетонові) групи в антитілі, які можуть взаємодіяти з відповідними групами на лікарському засобі. В іншому втіленні антитіла, що містять М-кінцеві залишки серину або треоніну, можуть вступати в реакцію з метаперіодатом натрію, що приводить до утворення альдегіду замість першої амінокислоти.
У деяких переважних втіленнях лінкерний блок може мати наступну загальну формулу: --Та - М/му - Му--, у якій: -Т- є розтяганням (розтягувальний блок); а дорівнює 0 або 1; -М/- є амінокислотним блоком; м незалежно є цілим числом від 1 до 12; -ї- є спейсерним блоком; у дорівнює 0, 1 або 2.
Розтягувальний блок (-Т-), якщо він присутній, зв'язує антитіло з амінокислотним блоком (-
Му-). Використовувані функціональні групи, які можуть бути присутні на антитілі або від природи, або за рахунок хімічних маніпуляцій, включають сульфгідрильну, аміно-, гідроксильну, аномерну гідроксильну групу вуглеводню і карбоксильну групу. Відповідними функціональними групами є сульфгідрильні і аміно-групи. Сульфгідрильні групи можуть бути отримані при відновленні
Зо внутрішньомолекулярних дисульфідних зв'язків антитіл, якщо вони присутні. Як альтернатива, сульфгідрильні групи можуть бути отримані в результаті реакції аміногрупи лізину антитіла з 2- імінотіолзаном або іншими реагентами, що утворюють сульфгідрил. У конкретних втіленнях антитіло є рекомбінантним антитілом, і воно сконструйоване так, щоб нести один або більше ніж один лізин. Переважніше, антитіло може бути сконструйоване так, щоб нести один або більше ніж один цистеїн (див. ТпіоМаб).
У деяких конкретних втіленнях розтягувальний блок утворює зв'язок з атомом сірки антитіла.
Атом сірки може бути отриманий з сульфгідрильної (-5Н) групи відновленого антитіла.
У деяких інших конкретних втіленнях розтягувальний блок зв'язаний з антитілом через дисульфідний зв'язок між атомом сірки антитіла і атомом сірки розтягувального блоку.
У інших конкретних втіленнях реакційноздатна група розтягання містить реакційноздатний сайт, який може реагувати з аміно-групою антитіла. Аміно-група може бути групою аргініну або лізину. Відповідні сайти, здатні реагувати з аміно-групою, включають, але не обмежуючись ними, активовані складні ефіри, такі як сукцинімідний складний ефір, 4-нітрофенілові ефіри, пентафторфенілові ефіри, ангідриди, кислі хлориди, сульфонілхлориди, ізоціанати і ізотіоціанати.
У ще одному аспекті реакційноздатна функціональна група розтягання містить реакційноздатний сайт, який може вступати в реакцію з модифікованою вуглеводневою групою, яка може бути присутня на антитілі. У конкретному втіленні антитіло глікозилюється ферментативно, утворюючи вуглеводневе угруповання. Вуглеводень може бути злегка окислений таким реагентом як періодат натрію, і отриманий в результаті карбонільний блок окисленого вуглеводню може бути конденсований з розтяганням, яке містить функціональну групу, таку як гідразид, оксим, реакційноздатний амін, гідразин, тіосемикарбазид, гідразинкарбоксилат або арилгідразид.
Амінокислотний блок (-М/-) зв'язує розтягувальний блок (-Т-) зі спейсерним блоком (-У-), якщо спейсерний блок присутній, і зв'язує розтягувальний блок з цитотоксичним агентом, якщо спейсерний блок відсутній.
Як згадувалося вище, -М/м- може бути дипептидним, трипептидним, тетрапептидним, пентапептидним, гексапептидним, гептапептидним, октапептидним, нонапептидним, декапептидним, ундекапептидним або додекапептидним блоком. 60 У деяких втіленнях амінокислотний блок може містити амінокислотні залишки, такі як, але не обмежуючись ними, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, метіонін, фенілаланін, триптофан, пролін, захищений ацетилом або формілом лізин, аргінін, захищений тозил- або нітро-групами аргінін, гістидин, орнітин, захищений ацетилом або формілом орнітин і цитрулін. Ілюстративні амінокислотні лінкерні компоненти переважно включають дипептид, трипептид, тетрапептид або пентапептид.
Приклади дипептидів включають: Ма1!-Сії, АІа-Маї, АІа-АІа, Ма!-АІа, І уз-Г ув, Сй-Сії, Ма!-І ув,
Аіа-Рпе, РПе-Гув, Аїа-Г ув, Рпе-Сії, Гец-Сії, Пе-Сії, Ттр-Сії, Ріе-Аїіа, Рпе-Ме-тозил-Аг9, РПе-Ме- нітро-Ага.
Приклади трипептидів включають: Ма1І-АІа-Ма!Ї, АІа-Авп-Маї, Ма!-І еш-Г уз, АІа-Аіа-Азп, РПе-
Рпе-Гуз, Спу-сСту-Сспу, О-Рпе-РНе-Гув, Сіу-РНе-Г ув.
Приклади тетрапептидів включають: сіІу-РНе-І еи-Сіу (ЗЕО 10 МО:53), Аіа-І еи-Аїа-І єи (5ЕО
ІО МО:54).
Приклади пентапептидів включають: Рго-МаІ-сіу-МаІ-Ма! (ЗЕО 10 МО:55).
Амінокислотні залишки, які містять амінокислотний лінкерний компонент, включають природні, а також мінорні амінокислоти і аналоги амінокислот, що не зустрічаються в природі, такі як цитрулін. Амінокислотні лінкерні компоненти можуть бути розроблені і оптимізовані за їх селективністю відносно ферментативного розщеплювання конкретним ферментом, наприклад, асоційованою з пухлиною протеазою, катепсином В, С і О або протеазою плазміном.
Для вивільнення цитотоксичного агента амінокислотний блок лінкера може бути ферментативно відщеплений за допомогою ферменту, включаючи асоційовану з пухлиною протеазу, але не обмежуючись нею.
Амінокислотний блок може бути розроблений і оптимізований за його селективністю відносно ферментативного розщеплювання конкретною асоційованою з пухлиною протеазою.
Відповідними блоками є ті, розщеплювання яких каталізується протеазами, катепсиномВ, Сірі плазміном.
Спейсерний блок (-у-), якщо він присутній, зв'язує амінокислотний блок з цитотоксичним агентом. Спейсерні блоки бувають двох основних типів: такі, що саморуйнуються і такі, що не саморуйнуються. Спейсерний блок, що не саморуйнується, є таким, в якому частина або весь спейсерний блок залишається зв'язаним з цитотоксичним агентом після ферментативного
Зо відщеплення амінокислотного блоку з імунокон'югата. Приклади спейсерного блоку, що не саморуйнується, включають, але не обмежуючись ними, спейсерний блок "гліцин - гліцин" і спейсерний блок "гліцин". Для того, щоб вивільнити цитотоксичний агент, усередині клітини- мішені повинна відбутися незалежна реакція гідролізу, щоб розщепити зв'язок "гліцин - лікарський засіб".
В іншому втіленні спейсерний блок (-у-), що не саморуйнується, є -С1 у-.
В одному з втілень у імунокон'югаті відсутній спейсерний блок (у-0).
Як альтернатива, імунокон'югат, що містить спейсерний блок, що саморуйнується, може вивільнити цитотоксичний агент без необхідності окремого етапу гідролізу. У цих втіленнях -У- є п-амінобензиловим спиртом (РАВ), який зв'язаний з -М/му- через атом азоту групи РАВ і з'єднаний безпосередньо з -О0 через карбонатну, карбаматну або ефірну групу.
Інші приклади спейсерів, що саморуйнуються, включають, але не обмежуючись ними, ароматичні сполуки, які електронно еквівалентні групі РАВ, такі як похідні 2-аміноїмідазол-5- метанолу і орто- або пара-амінобензилацеталі. Можуть бути використані спейсери, які легко піддаються циклізації після гідролізу амідного зв'язку, такі як заміщені і незаміщені аміди 4- аміномасляної кислоти, відповідним чином заміщені біцикло|2.2.1|- ії біцикло|2.2.21-кільцеві системи і аміди 2-амінофенілпропіонової кислоти.
У альтернативному втіленні спейсерний блок є розгалуженим біс(гідроксиметил)стироловим (ВНМ5) блоком, який може бути використаний для включення додаткових цитотоксичних агентів.
Лікарське завантаження, також зване співвідношенням "лікарський засіб - антитіло" (АК), є середнім числом молекул РВО-препаратів на молекулу агента, що зв'язує клітину.
У випадку антитіла ізотипу ДС1, коли лікарські засоби зв'язуються з цистеїнами після часткового відновлення антитіла, лікарське завантаження може знаходитися в діапазоні від 1 до 8 молекул лікарського засобу (2) на молекулу антитіла, тобто коли 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 і 8 молекул лікарського засобу ковалентно приєднані до антитіла.
У випадку антитіла ізотипу ІдДс2, коли лікарські засоби зв'язуються з цистеїнами після часткового відновлення антитіла, лікарське завантаження може знаходитися в діапазоні від 1 до 12 молекул лікарського засобу (0) на молекулу антитіла, тобто коли 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 і 12 молекул лікарського засобу ковалентно приєднані до антитіла. бо Композиції АОС включають колекції агентів, що зв'язують клітину, наприклад антитіла,
кон'юговані з діапазоном лікарських засобів, від 1 до 8 або від 1 до 12.
Якщо лікарські засоби зв'язані з лізинами, лікарське завантаження може знаходитися в діапазоні від 1 до 80 молекул препарату (0) на молекулу клітинного антитіла, хоча переважною може бути верхня межа 40, 20, 10 або 8. Композиції АОС включають колекції агентів, що зв'язують клітину, наприклад, антитіла, кон'юговані з діапазоном лікарських засобів від 1 до 80, від 1 до 40, від 1 до 20, від 1 до 10 або від 1 до 8.
Середнє число молекул лікарського засобу на молекулу антитіла в препаратах АОС з реакцій кон'югації можна охарактеризувати звичайними засобами. Кількісний розподіл АЮС також може бути визначений по відношенню до коефіцієнта лікарського засобу. Для деяких кон'югатів "антитіло - лікарський засіб" коефіцієнт лікарського засобу може бути обмежений числом сайтів приєднання на антитілі. Наприклад, антитіло може мати лише одну або декілька тіолових груп цистеїну або може мати лише одну або декілька досить реакційноздатних тіолових груп, через які може бути приєднаний лінкер. Вище лікарське завантаження, наприклад, коефіцієнт лікарського засобу » 5, може викликати агрегацію, нерозчинність, токсичність або втрату клітинної проникності деяких кон'югатів "антитіло - лікарський засіб".
Деякі антитіла мають відновлювані міжланцюгові дисульфіди, тобто цистеїнові містки.
Антитіла можна зробити здатними до реакції кон'югації з лінксерними реагентами шляхом обробки відовлювальним агентом, таким як ОТТ (дитіотреійтол). Таким чином, кожний цистеїновий місток теоретично формуватиме два реакційноздатних тіолових нуклеофіла.
Додаткові нуклеофільні групи можна вводити в антитіла за допомогою реакції лізинів з 2- імінотіоланом (реагент Траута), що приводить до перетворення аміну в тіол. Реакційноздатні тіолові групи можна ввести в антитіло (або в його фрагмент) шляхом інженерії одного, двох, трьох, чотирьох або більше залишків цистеїну (наприклад, отримуючи мутантні антитіла, що містять один або більше ніж один ненативний залишок амінокислоти цистеїну). У О5 7521541 описана інженерія антитіл шляхом введення реакційноздатних амінокислот цистеїнів.
Амінокислоти цистеїнів можуть бути сконструйовані на реакційноздатних сайтах в антитілі і можуть бути такими, які не формують внутрішньоланцюгові або міжмолекулярні дисульфідні зв'язки (Чипиїша, еї аІ,, 2008р Маїшге Віоїесп., 26(8):925-932; ЮОогпап еї а! (2009) Віоса 114(13)у2721-2729; 005 7521541; 005 7723485; УМО2009/052249). Тіоли інженерних цистеїнів
Зо можуть вступати в реакцію з лінкерними реагентами або реагентами "лікарський засіб - лінкер" згідно з даним винаходом, які мають електрофільні групи, здатні реагувати з тіолами, такі як малеїмід- або альфа-галоген-аміди, для формування АОС з цистеїн-інженерними антитілами і лікарськими угрупованнями РВО. Таким чином, розташування лікарського угруповання може бути розроблене, проконтрольоване і відоме. Лікарське завантаження можна контролювати, оскільки інженерні тіолові групи цистеїну, як правило, вступають в реакцію з лінкерними реагентами, здатними реагувати з тіолами, або з реагентами "лікарський засіб - лінкер" з високим виходом. Інженерія антитіла ІдС для введення амінокислот цистеїнів шляхом заміщення на одному сайті на важкому або легкому ланцюзі дає два нових цистеїна на симетричному антитілі. Лікарське завантаження із приблизним значенням 2 можна отримати з близькою гомогенністю продукту кон'югації АОС.
Крім того, даний винахід також відноситься до імунокон'югата або кон'югата "антитіло - лікарський засіб", описаного вище, для застосування як лікарський засіб.
Крім того, даний винахід також відноситься до імунокон'югата або кон'югата "антитіло - лікарський засіб", описаного вище, для застосування в лікуванні раку.
Даний винахід відноситься до кон'югата "антитіло - лікарський засіб", описаного вище, для застосування як лікарський засіб. У конкретному втіленні даний винахід відноситься до кон'югата "антитіло - лікарський засіб", описаного вище, для застосування у лікуванні раку. У конкретнішому втіленні даний винахід відноситься до кон'югата "антитіло - лікарський засіб", описаного вище, для застосування у лікуванні раку, експресуючого ІСЕ-1К, або ІСБ-18- зв'язаних видів раку.
ІСЕ-1В-зв'язані види раку включають пухлинні клітини, що експресують або надекспресують цілий ІСБЕ-1Е або його частину на своїй поверхні.
Конкретніше, зазначені види раку включають рак молочної залози, товстої кишки, карциному стравоходу, гепатоцелюлярний рак, рак шлунка, гліому, рак легенів, меланому, остеосаркому, рак яєчників, передміхурової залози, рабдоміосаркому, рак нирки, щитоподібної залози, матки і ендометрію, а також будь-які явища лікарської стійкості.
У іншому своєму аспекті даний винахід відноситься до застосування кон'югата "антитіло - лікарський засіб" згідно з даним винаходом для лікування раку, що експресує ІСЕ-18.
Іншим об'єктом даного винаходу є фармацевтична композиція, що містить антитіло згідно з 60 даним винаходом або кон'югат "антитіло - лікарський засіб", або імунокон'югат, описаний в даному документі.
Конкретніше, даний винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що містить антитіло згідно з даним винаходом або кон'югат "антитіло - лікарський засіб", або імунокон'югат, описаний вище, і щонайменше ексципієнт і/або фармацевтично прийнятний носій.
Даний винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що містить антитіло або кон'югат "антитіло - лікарський засіб", описаний вище, і щонайменше ексципієнт і/або фармацевтично прийнятний носій.
У даному описі вираз "фармацевтично прийнятний носій" або "ексципієнт" використовується для позначення сполуки або комбінації сполук, що входять у фармацевтичну композицію, не провокують побічних реакцій, яка, наприклад, полегшує введення активної сполуки (сполук), збільшує тривалість її життя і/або ефективність в організмі, збільшує її розчинність в розчині або покращує її збереження. Ці фармацевтично прийнятні носії і ексципієнти добре відомі і можуть бути адаптовані фахівцем в даній області залежно від природи і способу введення вибраної активної сполуки (сполук).
Переважно ці імунокон'югати будуть введені системним шляхом, зокрема, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, внутрішньошкірно, внутрішньоочеревинно або підшкірно, або пероральним шляхом. У більш переважному способі композицію, що містить ці імунокон'югати, вводитимуть кілька разів послідовним чином.
Способи введення, дозування і оптимальні фармацевтичні форми можуть бути визначені відповідно до критеріїв, які зазвичай беруться до уваги при розробці лікування, адаптованого до пацієнта, наприклад, до віку або ваги тіла пацієнта, тяжкості його/її загального стану, стійкості до лікування і виявлених побічних ефектів.
У іншому аспекті даний винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що містить антитіло згідно з даним винаходом або кон'югат "антитіло - лікарський засіб", або імунокон'югат, описаний вище, і щонайменше ексципієнт і/або його фармацевтично прийнятний носій, для застосування в лікуванні раку. У конкретнішому аспекті даний винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що містить антитіло згідно з даним винаходом або кон'югат "антитіло - лікарський засіб", або імунокон'югат, описаний вище, і щонайменше ексципієнт і/або фармацевтично прийнятний носій, для застосування в лікуванні раку, експресуючого ІСЕ-18.
Зо Винахід також відноситься до способу лікування у суб'єкта раку і, зокрема, лікування ІСЕ-1 В- експресуючого раку, що включає введення зазнченому суб'єкту ефективної кількості щонайменше кон'югата "антитіло - лікарський засіб" згідно з винаходом.
Даний винахід також відноситься до способу лікування у суб'єкта раку і, зокрема, лікування
ІБЕ-1В-експресуючого раку, що включає введення зазначеному суб'єкту ефективної кількості фармацевтичної композиції згідно з винаходом.
У іншому втіленні даний винахід відноситься до способу доставки лікарського препарату або медикаменту до ІСЕ-1Н-експресуючої ракової клітини у суб'єкта, що включає введення зазначеному суб'єкту ефективної кількості щонайменше кон'югата "антитіло - лікарський засіб" згідно з винаходом або фармацевтичної композиції згідно з винаходом.
Інші відмітні ознаки і переваги даного винаходу стануть ясні в продовженні опису з прикладами і графічними матеріалами, підписи до яких надані нижче.
Підписи до графічних матеріалів
Фіг. 1: Приклад профілю зв'язування Віасоге, отриманого з З антитілами на пІСЕ-1А ЕСО, захопленому анти-Ніб- Гад-антитілом.
Фіг. 2: Схема картування епітопів, визначених в панелі 15 моноклональних анти-піст-1 В- антитіл з визначеними 5 групами епітопів. Нумерація груп не пов'язана ні з позицією відносно послідовності, ні з ЗО-структурою антигена.
Фіг. ЗА-3С: Зв'язування антитіл до людських нативних ІЗЕ-1К у ЕАСсЗзЗ-аналізі. Фіг. ЗА представляє криву титрування на клітинній лінії МСЕ-7 одного з химерних анти-ІСЕ-1В-антитіл, репрезентативних для кожної групи кластерів епітопів. МЕ! є середньою величиною інтенсивності флуоресценції. Фіг. ЗВ представляє ЕСво як мишачих, так і химерних анти-ІСсЕ-1 В- антитіл на клітинній лінії МСЕ-7. Фіг. ЗС представляє Втлах химерних анти-ІСсЕ-1В-антитіл на клітинній лінії МСЕ-7.
Фіг. 4А і 48: Оцінка розпізнавання ПІСЕ-ІК за допомогою трансфікованих і нетрансфікованих клітин. Фіг. 4А представляє криві титрування одного з химерних анти-ІС4Е-1В-антитіл, репрезентативного для кожної групи кластерів епітопів, на клітинній лінії зЕ-18:5. МР є середньою величиною інтенсивності флуоресценції. Фіг. 4В представляє зв'язування одного з химерних анти-ІС2Е-1В-антитіл, репрезентативного для кожної групи кластерів епітопів, на людській лінії клітин ІЇЗЕ-1 В. МЕЇ є середньою величиною інтенсивності флуоресценції. бо Філ БА і 58: Оцінка специфічності антитіл проти ПІСЕ-1К ії ПІК з використанням трансфікованих клітин. Фіг. БА представляє зв'язування мишачого анти-ІСЕ-1 В-антитіла на пІК-- трансфікованій клітинній лінії. Фіг. 5В представляє зв'язування химерного анти-ІСсЕ-1В-антитіла на ІВ» клітинній лінії. МЕ! є середньою величиною інтенсивності флуоресценції. У панелі А і В комерційно доступне анти-пІН-антитіло, описане як ОКО5 (СаІріоспет), було введене як позитивний контроль.
Фіг. 6: Зв'язування мишачого анти-ІСЕ-1 В-антитіла на клітинній лінії ІМ-9. МЕРІ є середньою величиною інтенсивності флуоресценції. Анти-пІН-МКА ОКО5 було введене як позитивний контроль.
Фіг. 7А, 7В і 7С: Оцінка розпізнавання мавпячого ІСЕ-1К. Фіг. 7А представляє криві титрування одного з химерних анти-ІС2Е-1В-антитіл, репрезентативного для кожної групи кластерів епітопів, на клітинній лінії СО5-7. МЕ! є середньою величиною інтенсивності флуоресценції. Фіг. 7В представляє ЕСво як мишачих, так і химерних анти-ІС4Е-1В-антитіл на клітинній лінії СО5-7. Фіг. 7С представляє ЕСво химерних анти-ІС4кЕ-1В-антитіл як на ПІСЕ-1В:- трансфікованих клітинах, так і на клітинах СО5-7. ОМК111 (Саїріоспет) був введений як позитивний контроль.
Фіг. 8: Порівняння зв'язування с208Е2 з ПІСБ-1К ЕСО або з ПІСЕ-1К ЕСО яванського макака з використанням аналізу Віасоге. Сенсограми, отримані за допомогою Віасоге Х100 на основі технології поверхневого плазмонного резонансу (5РК), використовуючи сенсорний чіп СМ5, активований більше 11000 резонансних одиниць (РО) мишачого анти-Таяд Ніз-антитіла, хімічно прищепленого до карбоксиметилдекстранової матриці. Експеримент проводять при швидкості потоку 30 мкл/хв при 25С з використанням НВ5О-ЕР- як робочого буфера і буфера для розведення зразків. На цій фіг. представлено накладення 4 незалежних сенсограм, вирівняних на осі х за початком першого введення речовин, які аналізують, і на осі у за базальним рівнем, визначеним безпосередньо перед цим першим введенням. Сенсограмми, отримані при захопленні послідовності на основі людського рекомбінантного розчинного ІСЕ-18В, позначені ромбами. Сенсограми, отримані при захопленні послідовності на основі рекомбінантного розчинного ІЗЕ-1Ж яванського макака, позначені трикутниками. Білі символи відповідають порожнім циклам (5 введень робочого буфера), а чорні символи відповідають введенням зростаючого діапазону концентрацій с208БЕ2 (5, 10, 20, 40 їі 80 нм).
Зо Фіг. 9: Оцінка власного впливу анти-пІСШЕ-1ВН-антитіл на фосфорилювання рецептора порівняно з ІСЕ1.
Фіг. 10: Інгібування фосфорилювання ІСЕ-1К у відповідь на ІСЕ-1 мишачим анти-пІСЕ-1 В.
Фіг. 11: Зв'язування анти-І(Сс-1 В-антитіл на клітинній поверхні пригнічується при температурі 37 "С. Клітини МСЕ-7 інкубували при 4 "С або при 37 "С протягом 4 годин з 10 мкг/мл кожного антитіла. Фігура представляє АМРЇ.
Фіг. 12А ії 128: Розпад антитіла на поверхні. Антитіло, зв'язане з поверхнею клітини, оцінювали через 10, 20, 30, 60 і 120 хв при 37 "С. На фіг. 12А представлений 95 від І(ЗЕ-1К, що залишилося, порівняно з інтенсивністю сигналу, виміряного при температурі 4 "С. Фіг. 128 представляє обчислення періоду напівжиття за допомогою програмного забезпечення Ргіт5 зойпмаге і з використанням налаштувань експоненціального розпаду.
Фіг. 13: Кінетика інтерналізації антитіл, яку оцінювали шляхом ЕАсСз-аналізу. Клітини інкубували з 10 мкг/мл мишачих антитіл протягом 0, 30 або 60 хв при 37 "С. Клітини пермеабілізували або не пермеабілізували і інкубували з вторинним протимишачим антитілом
ІС, кон'югованим з Аіеха 488. Мембранне значення відповідає інтенсивності сигналу без пермеабілізації Загальне значення відповідає сигналу інтенсивності після клітинної пермеабілізації, а цитоплазматичне значення відповідає інтерналізованому антитілу. Назву кожного оцінюваного антитіла приведено у верхній частині кожного графіка.
Фіг. 14А і 14В: Візуалізація інтерналізаціїї антитіла. Фіг. 14а: клітини МСЕ-7 інкубували з т208Б2 протягом 20 хв при 4 "С і промивали перед інкубацією (а)| при 37 "С протягом 15 |Б)І, 30
ІСІ ії 60 (94)) хвилин. Клітини фіксували і пермеабілізували. Антитіло т208Е2 виявляли за допомогою протимишачого ІдбсС-антитіла, кон'югованого з АІеха 488, а Гатр-1 виявляли за допомогою кролячого анти-І атр-1-антитіла і вторинного протикролячого до, кон'югованого з
АІеха 555. Фіг. 14В (частини з І по І): клітини МСЕ-7 інкубували протягом 30 хвилин при 37 "С з кожним з інших мишачих анти-пІСЕ-1В-антитіл, які аналізували, а потім забарвлювали, як описано вище. Колокалізацію ідентифікували за допомогою плагіна для виділення колокалізації в програмному забезпеченні Ітаде у.
Фіг. 15: Участь лізосомального шляху у деградації антитіл.
Фіг. 16: Оцінка зв'язування мишачих анти-пІС-1Р-антитіл при різних значеннях рН. ЕСво зв'язування різних антитіл оцінювали на МСЕ-7 з використанням буфера з різним рН в діапазоні 60 від 5 до 8.
Зо
Фіг. 17: Оцінка здатності вибраних анти-ІСЕ-1В-антитіл індукувати цитотоксичність в аналізі
Еар-72АР. А) Клітини МСЕ-7 інкубували зі зростаючими концентраціями химерних анти-Ісв-1 В- антитіл у поєднанні з набором для людського Бар-2АР. Життєздатність клітин вимірювали з використанням люмінесцентного аналізу життєздатності клітин Се Піег-СІоФ. Химерне антитіло с904 використовували як нерелевантне антитіло. В) ІСво з результатів, зображених на А).
Фіг. 18: Кореляція між ії) цитотоксичною активністю, і) впливом рН на зв'язування антитіло/СвЕ-1К, ії) впливом антитіл на ІСЕ-1-індуковане фосфорилювання ІСБЕ-1К і ім) кластеризацією антитіл.
Фіг. 19А-190: Зв'язуюча характеристика першої гуманізованої форми МКА с208БЕ2. Зв'язуючі властивості МКА п2208Е2 УНЗЛ/ІЗ оцінювали на людській клітинній лінії МСЕ-7 (фіг. 19А), на мавпячій клітинній лінії СбО5-7 (фіг.198) і на трансфікованій мишачій клітинній лиінії, що експресує рецептор людського інсуліну (фіг. 192). Зв'язування як мишачих, так і химерних МКА 208Е2 оцінювали паралельно. Клон анти-пІВ-антитіла ЗКО5 використовували для перевірки експресії ПІК на трансфікованій клітинній лінії (фіг. 190).
Фіг. 20А-200: ЕІ ПІЗА-валідація поліклонального антитіла АЕ305-МА, яке було використане для ІНС-аналізів (тобто імуногістохімічних аналізів). Фіг. 20А: Зв'язування з ПІСЕ-1Е. Фіг. 208:
Зв'язування з людським рекомбінантним ІК. Немає розпізнавання ПІК ЕОС і клітинного ІК, експресованого трансфікованиий клітинами (фіг. 2003) порівняно з контрольним антитілом СКО5 на цих ПІК-трансфікованих клітинах (фіг. 20С).
Фіг. 21: Валідація забарвлення ПІСЕ-ІК на ЕРЕРЕ-зрізах (тобто зафіксованих у формаліні і залитих парафіном) ксенотрансплантатів, що експресують різні рівні ПІСЕ-1К. Неь746Т було введено як негативний контроль.
Фіг. 22А і 22В: Оцінка експресії ПІСБ-ІК на ЕЕРЕ-зрізах нормальних тканин. Зрізи плаценти були використані як позитивний контроль для нормальних тканин, а позитивні пухлинні тканини ксенотрансплантатів були введені у кожний цикл, щоб відкалібрувати експресію ПІСЕ-ІВ.
Фіг. 23: Оцінка експресії ПІСЕ-ІЕ на ЕЕРЕ-зрізах тканини МЗС. (недрібноклітинного раку легені). Чотири випадки, які є репрезентативними для сильного забарвлення, спостережуваного у великій панелі проаналізованих тканин.
Фіг. 24: Оцінка експресії ПІСЕ-ІК на ЕЕРЕ-зрізах тканини раку молочної залози. Три випадки,
Зо які є репрезентативними для сильного забарвлення, спостережуваного в тестованій панелі проаналізованих тканин.
Фіг. 25: Оцінка експресії ПІСЕ-ІК на ЕЕРЕ-зрізах тканин різних пухлин.
Фіг. 26: Суміщення сенсограм, отриманих за допомогою пристрою Віасоге Х100 на основі
ОРЕ при температурі 25 "С з сенсорним чіпом СМ5, активованим на обох проточних комірках за допомогою приблизно 12000 РО мишачих моноклональних анти-Нібз-Гад-антитіл, хімічно прищеплених до карбоксиметилдекстранової матриці, з використанням НВ5-ЕР- в якості робочого буфера при швидкості потоку 30 мкл/хв. Кожна сенсограма (перша позначена трикутниками, а друга позначена ромбами) відповідає повному циклу: 1 - введення протягом однієї хвилини розчину рекомбінантного П-ІСБ-1К (10 мкг/мл) у другу проточну комірку. 2 - для першої сенсограми: 5 введень робочого буфера, кожне по 90 с. - для другої сенсограми: п'ять введень розчинів анти-Їс-1 В-антитіла с208БЕ2 із зростаючим діапазоном концентрацій, кожне по 90 с.
З - затримка 300 с для визначення кінетичних швидкостей дисоціації. 4 - регенерація поверхні за допомогою введення буфера з 10 мМ гліцином, НСЇІ рн 1,5, протягом 45 с.
Фіг. 27: Сенсограма, що відповідає відніманню фонової сенсограми (5 введень НВЗ-ЕР к) з сенсограми, отриманої з розчинами анти-ІСЕ-1В-антитіла с208Е2 із зростаючим діапазоном концентрацій, показана в сірому кольорі. Теоретична сенсограма, що відповідає моделі 1:1 з наступними параметрами: Коп - (1,206 ж 0,036)х105 М.С", Кох - (7,81 ж 0,18)х105 с", Втах - 307,6 ї 0,3 РО показана тонкою чорною лінією. Розраховані концентрації с208Е2 показані на графіку: лише найвища концентрація (24 нМ) розглядається як константа.
Фіг. 28: Константи дисоціації відповідають середньому значенню від чотирьох експериментів для кожного антитіла і відповідають співвідношенню: Кок/Копх10"7, будучи вираженими в одиницях "ПМ". Стовпці помилок відповідають стандартній помилці (п дорівнює 4). Фіг. 29: Періоди напівжиття відповідають середньому значенню від чотирьох експериментів для кожного антитіла і відповідають співвідношенню: І п(2)/Кон/3600, будучи вираженими в одиницях "год". Стовпці помилок відповідають стандартній помилці (п дорівнює 4).
Фіг. 30: Суміщення двох сенсограм, що відповідають двом циклам експерименту, бо проведеним на пристрої Віасоге Х100 при швидкості потоку 30 мкл/хв і при 25 70.
Перший етап циклу відповідає введенню розчину антитіла с208Е2 у концентрації 10 мкг/мл протягом 60 с у другу проточну комірку мікрочіпа СМ5, активованого приєднанням більше ніж 10500 РО мишачого моноклонального антитіла проти людського Ес до, хімічно зв'язаного з карбоксиметилдекстрановою матрицею за рахунок його функціональних аміно-груп. Другий етап відповідає введенню розчинів позаклітинного домена або п-ІСЕ-1К (заштриховані ромби), або т-І2Б-1К (незаштриховані ромби) з неочищених клітинних культуральних супернатантів протягом 120 секунд із затримкою 120 секунд. Двонаправлені стрілки вказують точки вимірювання рівня захоплення антитіла і рівня зв'язування ІСЕ-1К, використовувані в даному дослідженні.
Фіг. 31: Гістограми, що представляють співвідношення рівня зв'язування ІСБР-1К, отриманого для кожної з химерних п/т ІСЕ-1 В-конструкций, і рівня с208Е2, захопленого на другій проточній комірці на сенсорному чіпі протягом відповідного циклу.
Фіг. З2А і В: Гістограми, що представляють ЕСво для п27208Е2 НО76/.024 при значеннях рн від 5 до 8, кислий рН знижує зв'язувальну здатність гуманізованих ІСЕ-1В-антитіл п2208Е2
НО7б/ 024 (А) і п2208Е2 НО77/ 018 (В).
Фіг. 33: Зв'язування п2208Е2 (10 мкг/мл) на 170 РО розчинної версії П-ІЗЕТК дикого типу (чорний ромб) або на 120 РЕ мутанта С29 (Азр491»5Аїа) цього рецептора. Кожний рецептор був захоплений на сенсорному чіпі СМ5 через його С-кінцеву 66Ніз-мітку. Експеримент проводили на пристрої Віасоге Х100 при 25 "С зі швидкістю потоку 30 мкл/хв з використанням класичного
НВ5-ЕР-- як робочого буфера.
Приклади
Всі гибрідоми, згадані в даному винаході, збережені у СМСМ (Інститут Пастера, Франція) і вказані в таблиці 7.
Таблиця 7
Приклад 1: Створення ІСЕ-1 В-антитіл
Для створення мишачих моноклональних антитіл (МКА) проти позаклітинного домену (ЕСО) людського рецептора ІСЕ-1 (пІСЕ-1К) 5 мишей ВАЇ В/с імунізували З рази підшкірно 10 мкг білка
ГІСБ-1К (К8О бувіетв5, кат. Мо 391-ОК). Як альтернатива, деяким тваринам були виконані три
Зо додаткові імунізації з використанням 10 мкг мишачого позаклітинного домену (ЕС) ІББ-1А (КО Бувіет5, кат. Мо 6630-ЗРЕ/Ес). Першу імунізацію проводили у присутності повного ад'юванта Фрейнда (Зідта, Сент-Луіс, Меріленд, США). До наступних імунізацій додавали неповний ад'ювант Фрейнда (5ідта). За три дні до злиття імунізованих мишей бустирували з використанням 10 мкг білка гІСЕ-1К. Потім отримували спленоцити і лімфоцити шляхом перфузії селезінки і подрібнення проксимальних лімфатичних вузлів, відповідно, зібраних від 1 з 5 імунізованих мишей (вибраної після титрування сироваток всіх мишей), і зливали їх з клітинами мієломи ЗР2/0-Ад14 (АТСС, Роквілл, Меріленд, США). Протокол злиття описаний
КопіІег і Міїбієїп (Маїшиге, 256:495-497, 1975). Потім гібридні клітини піддавали НАТ-селекції (селекції з використанням гіпоксантину, аміноптерину і тимідину). Як правило, для отримання моноклональних антитіл або їх функціональних фрагментів, особливо мишачого походження, можна звернутися до методик які описані, зокрема, в керівництві "Апіїродієв" (Нагіоуу апа Гапе,
Апіїродієв: А І арогаїогу Мапиаї, Соїа 5ргіпд Нарог І абогаюгу, Соїд 5рііпд Нагброг МУ, рр. 726,
1988). Приблизно через 10 днів після злиття колонії гібридних клітин піддавали скринінгу. Для первинного скринінгу супернатанти гібридом оцінювали на предмет секреції МКА, вироблених проти білка піСБ-1К ЕСО, за допомогою ЕБАСб-аналізу з використанням клітин людської пухлини молочної залози МСЕ7 (АТСС) і/або клітин мавпи СО57 (клітини нирки африканської зеленої мавпи, трансформовані 5М40), які експресують мавпячий ІЗЕ-1К на своїй клітинній поверхні. Точніше, для відбору за допомогою проточної цитометрії 1097 клітин (МСЕ? або СО57) висівали в кожну лунку 96-лункового планшета в РВ5, що містить 195 ВА і 0,0195 азид натрію (ЕАС5-буфері), при 4 "С. Після 2 хв центрифугування при 2000 об/хв буфер видаляли і додавали гібридомні супернатанти, які потрібно було проаналізувати. Через 20 хв інкубації при температурі 4 "С клітини двічі промивали і додавали АїЇєеха 488-кон'юговане цапине протимишаче антитіло, розведене 1/500 у БАС5-буфері (Мо А11017, МоїЇесшіаг Ргобез Іпс.,
Юджін, США), і інкубували протягом 20 хв при температурі 4 "С. Після фінального промивання
ЕАС5-буфером клітини аналізували за допомогою РГАС5З (РАСсСзсСаїїбиг, Весіоп-ОРіскіпзоп) після додавання пропідію йодиду в кожну пробірку в кінцевій концентрації 40 мкг/мл. Лунки, що містять лише клітини, і лунки, що містять клітини, інкубовані з вторинним АїЇеха 488- кон'югованим антитілом, були включені як негативні контролі. Ізотипічні контролі використовували в кожному експерименті (Зідта, Мо М90351МО). Для обчислення середнього значення інтенсивності флуоресценції (МЕїЇ) оцінювали щонайменше 5000 клітин.
Крім того, проводили аналіз інтерналізації для того, щоб вибрати тільки інтерналізовані антитіла. Для цього аналізу лінію пухлинних клітин МСЕ7 культивували в ЕМРІ 1640 без фенолу червоного, з 195 І -глутаміном і 1095 БАС5 протягом З днів до початку експерименту. Потім клітини відокремлювали за допомогою трипсину, і 100 мкл клітинної суспензії зі щільністю 4х105 клітин/"мл висівали в 9б-лункові планшети в КРМІ 1640 без фенолу червоного, з 1905 І1- глутаміном і 595 ЕВ5. Після 2 хв центрифугування при 2000 об/хв клітини ресуспендували у 50 мкл гібридомного супернатанту або розчинів контрольних антитіл (позитивні і ізотипічні контролі у концентрації 1 мкг/мл). Після інкубації протягом 20 хв при 4 "С клітини центрифугували 2 хв при 2000 об/хв і ресуспендували або в холодному (4 С), або в теплому (37 "С) повному культуральному середовищі. Потім клітини інкубували протягом 2 годин або при 37 "С, або при 4 "б. Потім клітини промивали три рази ЕАС5-буфером. АІеха 488-мічене цапине протимишаче
Зо 9 антитіло інкубували протягом 20 хв і клітини промивали три рази перед ГАС5З-аналізом популяції клітин, негативних при забарвленні пропідію йодидом.
Після РАСб5-анализу визначали два параметри: (ї) різницю флуоресцентного сигналу, виявленого на поверхні клітин, інкубованих при 4 С, і сигналу, отриманого з клітинами, інкубованими при 37 "С, з супернатантом однієї гібридоми і (ії) відсоток ІЗЕ-1К, що залишився, на поверхні клітини.
Відсоток ПІСБЕ-1К, що залишився, обчислюється так:
Фо І2Е-1К, що залишився - (МРЇ при з7 "с/МРЇ при 4с)х100
Крім цього, проводили три ЕГІ5А (або до, або після клонування) для вивчення зв'язування антитіл з рекомбінантним людським (пІСЕ-1К) і мишачим (тіср-ІК) білками, а також з білком рекомбінантного людського рецептора інсуліну (ПІК). Зберігали гібридоми, секретуючі антитіла, які демонстрували зв'язування з гп-, і/або пт-ІСаБ-1Е і не зв'язувалися з ГПК. Коротко, 96-лункові планшети для ЕГІБА (Совзіаг 3690, Согпіпд, Нью-Йорк, США) покривали 100 мкл/лунка або розчину білка гпіСБ-1К (850 Зузіетв5, кат. Мо 391-ОК) з концентрацією 0,6 мкг/мл, або розчину білка гптісСрБ-ІК (КО Зузіетв5, кат. Мо 6630-СОР/ЕС) з концентрацією 1 мкг/мл, або розчину білка
ІК (КО Бузіет»5, кат. Мо 1544-, ІК/СЕ) з концентрацією 1 мкг/мл у РВ5 протягом ночі при температурі 4 "С. Потім планшети блокували за допомогою РВ5, що містить 0,595 желатин (Мо 22151, бегма ЕІесігорпогезіє зтрЬН, Гейдельберг, Німеччина) протягом 2 годин при 37 "с.
Відразу після видалення буфера насичення шляхом струшування планшетів, в лунки додавали по 100 мкл кожного розведення супернатанту (або нерозведеного супернатанту від гібридоми, або серійних розведень супернатантів) і інкубували протягом 1 години при 37 "С. Після трьох промивань додавали 100 мкл кон'югованого з пероксидазою хріну поліклонального цапиного протимишачого антитіла дос (Мо 115-035-164, даскбзоп Іттипо-Кезеагсі І абогайгієв, Іпс., Вест-
Гров, Пенсильванія, США) у розведенні 1/5000 в РВ5, що містить 0,195 желатин і 0,0595 Тмееп 20 (за масою) на 1 годину при температурі 37 "С. Потім ЕГІЗА-планшети промивали З рази і додавали субстрат ТМВ (Ме ОРб64782, Оріїта, Іпіегопіт, Франція). Після 10-хвилинного періоду інкубації при кімнатній температурі реакцію зупиняли за допомогою 1 М сірчаної кислоти і вимірювали оптичну щільність при довжині хвилі 450 нм.
Гібридому, секретуючу антитіло, яке представляє інтерес, розмножували і клонували шляхом серійних розведень. Після ізотипування один клон кожного коду розмножували |і бо заморожували. Кожне антитіло, що представляє інтерес, отримували в системах продукції іп мігго під назвою СеїГіпе (Іптедга Віозсіепсе5) для подальшої характеризації.
Додаткові аналізи для визначення специфічності зв'язування проводили за допомогою
ЕАС5-анализу на клітинах ІМУ (людські ІК-експресуючі В-лімфобласти), а також на пІСЕ-ІВ- трансфікованих клітинах у порівнянні з нетрансфікованими клітинами.
Усі дані, що відповідають вибраним антитілам, підсумовані в таблиці 8. Цікаво зазначити, що серед антитіл, вибраних ії) на підставі їх селективності по відношенню до ПІСЕ-1К порівняно з ІК ії її) на підставі їх здатності індукувати інтерналізацію ІСЕ-1Е, деякі були здатні розпізнавати свою мішень як в ЕГІЗА, так і в РАСЗ-умовах, тоді як інші дуже добре зв'язувалися при дослідженні за допомогою цитометрії і дуже погано зв'язувалися при дослідженні шляхом
ЕГІБЗА. т280Б2, т212А11, т213810, т214Е8 ї т21906 належать до цієї останньої групи, яка добре не розпізнає білок, зв'язаний з планшетом для ЕГГІ5А.
Таблиця 8 с ї цент я при СОУ іюхецкч! Й нерж аю.
РМК НАВ ПОЦАВННЙ С 15: ЗААНННННЕ ЧАДА МАК ОВАК ЛНЕНННВ У АВАДАВІ МОНА З ОО: УА НОАААННААННИЄ - ЗМВИДООН ООН ВОНА ЗНААНАААННІ МОВО ЛОНІ НААН АЛЛА ЗАЛАЛИКХ ЄВА МОКАНН Т ЗАНН
ЕМДААЕ ДН ПОЛА: ЛИМАН МБ АЕС ЗАНИАНИСА СЗМННЙ МАЄ ЗЛА НИК ПОН ЗААННННЯ ВИВНННННОЄ - ВИ ВЕН НИК ЗИ ЗИНИЄТ ЗЕ
ПВ ПОЗИ: НК я шк ЗМ ни ши шк ПИШЕ СЕМ шк
НЕ і 8 ОМ ЗВ Б 52 Я КІ В. КЗ КМ МЕ ЛИ
ШЕ р-р
ШЕ: але бо: ОБО 01 555 М її ПИШНЕ УМИНННИ МЕ ЗНИ ПІНИ ЗИ ВНЕХ: ЛИНИ НЕ 836 001 ВО І ВТО Гу гл. 12 де | й (
З ЗЕ о 0 бажо 13 :ОИ З | г МЕМ МИ С ЗИИИК ВИНЕ: САНИ НИКИ,
МВВ 80, плення удннннннни А опо плн чпоодеотстно і В опо дрсссс В оно етелнняй делнстн пери в т
БНО З | з ОМ БИ
ВИК ИН ЛНИА АК САС ЗА МНС МАС ЕВАНС ЯК ПЛАНИ ЗНКАНВВНВА ЗАКВНННН С ЗНАННЯХ ЯН ЕНН НААНУ УАНМ ЗОНА ЗНА ААНАНЄ ЗАЙ
МК З НИЗ ЛНВ НЕК КС ЛА ИН ЗК ЛАК СА НАНВ ЗНОВ ПОВВНОВНВВИ З ЗАЛОВВОВВНВИХ ВАОВНОВНОНИХ З ЗАВОННОННОЯХ ЗОНООЄ ОНОЛЯ МНОЛНОВОЄ ЗАНОВО МНН ТЗН ОНОВИТИ й "КАБ проведено з зихористяиням очна яиуитіх А паднАААААААААКАКАКАКАКАКАКААКАКА ЧАТАХ АААААКААААКАКА ЛА тА тт дяллятя
Приклад 2: Характеристика кластеризації епітопів анти-ІЩЕ-1В-антитіла в експериментах з картування з використанням технології ВіАсоге на основі БРАК
Щоб вивчити різномаїття відповідей проти ІСЕ-1К, вибрані антитіла картували за допомогою
Віасоге і виконували кластеризацію цих антитіл згідно з конкурентними властивостями.
Коротко, експерименти з картування епітопів проводили на пристрої Віасоге Х з використанням сенсорного чіпа СМ5, активованого анти-Ніз-Тад-антитілом (набір Ні5 Саріиге Кії від СЕ НеайПсаге, кат. номер 28-9950-56). Більше ніж 11000 РО антитіл хімічно приєднували до карбоксиметилдекстранової матриці з використанням набору для амінової хімічної реакції.
Експерименти проводили при 25 "С зі швидкістю потоку 1 мкл/хв з використанням буфера НВ5-
ЕР (СЕ Неайсаге) як робочого буфера і буфера для розведення зразків.
Експеримент з картування епітопів проводили за тією ж схемою: 1 - Розчин розчинного варіанту гетеротетрамеру ПІСРЕ-ІК (ланцюги 2а і позаклітинні домени ланцюгів 28, експресовані з додатковою С-кінцевою 10-Ніз-міткою (КО 5узіетв5, каталожний номер 305-3)) вводять у концентрації 5 мкг/мл з розрахунку на обидві проточні комірки
Зо протягом 1 хвилини. 2 - Потім розчин анти-пІСЕ-ІВ-антитіла, яке аналізують, (класично 50 мкг/мл) вводять тільки в проточну комірку 1 протягом 60-90 секунд, щоб досягти насичення сайтів зв'язування ПІСЕ-1А (або щонайменше наблизитися до цього).
З - Розчин другого антитіла, використовуваного як потенційний конкурент, вводять в тих самих умовах або в обидві проточні комірки, або тільки в другу проточну комірку. 4 - Нарешті, розчин третього антитіла може бути введений в тих самих умовах в обидві проточні комірки. 5 - Потім поверхню регенерують введенням буфера з 10 мМ гліцином, НОСІ, рН 1,5, протягом
ЗО с.
Цей тип експерименту ясно показує, чи можуть два антитіла зв'язуватися одночасно з однією і тією ж молекулою ПІСЕ-1К, демонструючи, що зв'язуючі області (епітопи) кожного антитіла досить віддалені одна від одної, щоб дозволити це. Навпаки, якщо зв'язування антитіла з ПІСЕ-1К запобігає зв'язуванню другого антитіла, то припускається, що обидва антитіла розпізнають один і той же епітоп. Нарешті, у разі часткової конкуренції можна запідозрити перекривання епітопів, розпізнаваних двома антитілами, які аналізують. Таким чином визначаються групи областей епітопів. Складність результату, зазвичай, зростає із збільшенням розміру панелі антитіл, використовуваних у експерименті.
На фіг.1 приведений приклад типового циклу експерименту з картування епітопів з використанням пристрою Віасоге Х на основі 5РК. Сенсограми показують відповідь (РО - у резонансних одиницях) як функцію від часу (у секундах) на проточній комірці 1 (чорні ромби) і 2 (білі ромби). У фазі 1 розчин антигена - розчинний рекомбінантний ПІСЕ-ІЕ. з двома С-кінцевими 10-Ніз-мітками - вводиться в обидві проточні комірки сенсорного чіпа СМ5 з мишачим анти-Нів-
Тад-антитілом, хімічно зв'язаним з карбоксиметилдекстрановою матрицею, у концентрації 5 мкг/мл і зі швидкістю потоку 10 мкл/хв.
У фазі 2 розчин першого антитіла (21906), яке аналізують, у концентрації 50 мкг/мл вводять у проточну комірку 1. Потім у фазі З розчин другого антитіла (101Н8) у концентрації 50 мкг/мл вводять у проточну комірку 2, а потім у фазі 4 вводять розчин третього антитіла (20121) у концентрації 50 мкг/мл в обидві проточні комірки. Відповідь на це введення ясно показує, що зв'язування 201Е1 з ІСЕ-1К запобігається антитілом 101Н8, але не антитілом 21906. Антитіла 20141 ї 21906, вочевидь, належать до різних груп епітопів. Кластеризація, що приводить до цілого аналізу 15 відібраних кандидатів, описана на фіг.2, і показано, що імунізація мишей
МПИЕ-1К дає підвищення серії антитіл, що демонструють хорошу різноманітність. Дійсно, були отримані 5 різних груп моноклональних антитіл, що розпізнають різні епітопи.
Приклад 3: Зв'язування антитіл з людським нативним ІСБЕ-1К у ЕАС5-аналізах
Зв'язувальні властивості серії анти-ІБЕ-1 В-антитіл оцінювали за допомогою БАСз-аналізів на клітинній лінії людської аденокарциноми молочної залози МСЕ-7 (АТСС Мо НТВ-22) з використанням зростаючих концентрацій антитіла. З цією метою клітини (1х106 клітин/мл) інкубували з анти-ІСЕ-1 В-антитілами протягом 20 хв при 4 "С у ЕАС5З-буфері (РВ5, 0,195 В5А, 0,0195 Мам»). Потім їх промивали З рази і інкубували з відповідним вторинним антитілом, кон'югованим з Айеха 488, протягом 20 додаткових хвилин при 4 "С у темряві, а потім промивали
З рази ЕАС5-буфером. Зв'язування анти-ІС4Е-1В-антитіл негайно проводили на життєздатних клітинах, які ідентифікували за допомогою пропідію йодиду (який забарвлює мертві клітини).
Максимум інтенсивності сигналу, отриманий з кожним антитілом, позначали як Влах і виражали в середній інтенсивності флуоресценції (МЕЇ). ЕСзо зв'язування виражали в молярності (М), яку розраховували за допомогою нелінійного регресійного аналізу (сгарпРаа Ргітзв 4.0).
Криві титрування кожного мишачого або химерного антитіла показали, що усі створені
Зо антитіла здатні розпізнавати нативну форму ІСБЕ-1К з типовим профілем насичення (фіг. ЗА).
Для того, щоб ранжирувати антитіла і порівняти зв'язувальні властивості мишачих і химерних антитіл, для кожної сполуки визначали ЕСво зв'язування з використанням нелінійного регресійного аналізу. Порівняння ЕСво кожного мишачого антитіла з ЕСво його відповідної химерної форми показало, що дві форми демонстрували ті самі зв'язувальні властивості, показуючи, що химеризація антитіла не впливала на розпізнавання ІБЕ-1К (фіг. ЗВ). ЕСво коливалися в діапазоні від 1,2х10 до 4,4х10-79, Антитіла, що належать до групи 2, і сС102Н8В, що належить до групи ЗА, показали кращу ЕСво. Що стосується аналізів Влтах (фіг. ЗС), три антитіла (414Е1 (038), 10562 (04) і 832Е5 (05)) мали нижчий В'тлах порівняно з іншими. Значення Врлах і
ЕСово підсумовані в таблиці 9.
Таблиця 9
Приклад 4: Підтвердження специфічності антитіл з використанням ІСЕ-1Щ8- або Ір-
трансфікованих клітин або клітин ІМО, які природним чином експресують суттєві рівні ІВ
Для того, щоб підтвердити специфічність створених антитіл відносно ПІСЕ-1К порівняно з
НІВ, стабільні трансфектанти, що експресують або ПІСЕ-1К, або ПІК, оцінювали за допомогою
ЕАС5-аналізу. Коротко, зростаючі концентрації химерних моноклональних антитіл інкубували з клітинами протягом 20 хв при 4 "С у ГЕАС5-буфері (РВ5, 0,195 ВЗА, 0,0195 Мамі»). Потім клітини промивали З рази і інкубували з відповідним вторинним антитілом, кон'югованим з Аїеха 488, і інкубували протягом 20 додаткових хвилин при 4 "С у темряві, а потім промивали З рази у
ЕАС5-буфері. ЕСзо зв'язування виражали в молярності (М), яку розраховували за допомогою нелінійного регресійного аналізу (СсгарпРаай Ргітв 4.0).
Криві титрування, отримані на клітинній лінії, трансфікованій ПІСЕ-1К (фіг. 4А), порівняно з нетрансфікованими клітинами (фіг. 48) підтвердили специфічність зв'язування химерних антитіл з людським ІСЕ-1К. Значення Втах і ЕСзо підсумовані в таблиці 10. У цьому аналізі антитіла з груп 2 і СЗа показали кращі ЕСбо.
Таблиця 10
Для того, щоб підтвердити відсутність зв'язування мишачих і химерних антитіл з ПІК, використовували клітинну лінію, стабільно експресуючу людський ІК. Розпізнавання людського
НІК клітинної поверхні як мишачим, так і химерним антитілом проводили шляхом ЕАСс5-аналізів.
Зростаючі концентрації мишачих або химерних моноклональних антитіл інкубували з ПІК-- трансфікованою клітинною лінією протягом 20 хв при 4 "С у РГАС5-буфері (РВ5, 0,195 В5А, 0,0195 Мам»). Потім клітини промивали 3 рази і інкубували з відповідним вторинним антитілом, кон'югованим з Аїеха 488, і інкубували протягом 20 додаткових хвилин при 4 "С у темряві, а потім промивали З рази у ЕАС5-буфері. Зв'язування анти-ІС-1 В-антитіл негайно проводили на життєздатних клітинах, які ідентифікували за допомогою пропідію йодиду (який забарвлює мертві клітини). ЕСзо зв'язування виражали в молярності (М), яку обчислювали за допомогою нелінійного регресійного аналізу (сгарпРайд Ргіт5 4.0). Комерційне специфічне анти-ІсЕ-18- антитіло, клон ОК111, ї анти-пІВ-антитіло, клон СКОБ, використовували як позитивні контролі. с904 вводили як нерелевантне антитіло (ізотипічний контроль).
Високий рівень експресії ПІК на клітинній поверхні трансфікованих клітин підтверджували з
Зо використанням комерційного анти-пІН-антитіла СКО5. Навіть з використанням високих концентрацій або мишачого (фіг. 5А), або химерного (фіг. 58) анти-пІСЕ-ІВ-антитіл ніякого зв'язування на клітинній поверхні ПІК:-трансфікованих клітин не спостерігалося. Ці результати показали, що ні мишачі, ні химерні анти-пПІСЕ-ІВ-антитіла не розпізнають ПІК.
Ця специфічність розпізнавання ПІСЕ-1К порівняно з ІК також була продемонстрована з використанням клітин ІМ, клітинної лінії В-лімфоми, яка експресує ПІК (фіг. 6). Для цього ЕАС5- аналізу протокол був такий самий, як описаний вище, а мишачі анти-ІСЕ-1В-антитіла використовували для того, щоб запобігти перехресній реактивності вторинного протилюдського антитіла (клітини ІМО експресують людський імуноглобулін на своїй клітинній поверхні).
Результати, представлені на фіг. 6, ще раз показали, що очікуваний сигнал спостерігався при використанні анти-пІВ-антитіла ЗКО5, тоді як жодне з оцінюваних мишачих антитіл не демонструвало будь-якого істотного сигналу зв'язування на цій клітинній лінії.
Приклад 5: Зв'язування антитіла с нативним мавпячим ІСБЕ-1К в аналізах ЕАСЗ і Віасоге
Однією з перших передумов для контрольних токсикологічних досліджень є виявлення релевантного виду тварини для оцінки вибраної сполуки. Оскільки серія антитіл, описаних в цьому документі, не здатна розпізнавати мишачий ІСЗЕ-1К, то, швидше за все, видом для токсикологічної оцінки буде примат, що не є людиною (поп Питап ргітаїе, МНР).
Для того, щоб оцінити зв'язування анти-ІС2кЕ-1Н-антитіл з мавпячим ІСЕ-1К, оцінювали зв'язування як мишачих, так і химерних анти-пІСЕ-ІВ-антитіл за допомогою БАСЗ-анализу на лінії клітин СО5-7 з використанням зростаючих концентрацій антитіл. Клітини (1х105 клітин/мл) інкубували з анти-ІСЕ-1 В-антитілами протягом 20 хвилин при 4 "С у ГАСЗ-буфері (РВ5, 0,196
ВЗА, 0,0195 МаМ»). Потім клітини промивали З рази і інкубували з відповідним вторинним антитілом, кон'югованим з АїЇеха 488, а потім інкубували протягом 20 додаткових хвилин при 4 "С у темряві, і потім промивали З рази у ГАС5З-буфері. Зв'язування анти-ІСЕ-1В-антитіл негайно проводили на життєздатних клітинах, які ідентифікували за допомогою пропідію йодиду (який забарвлює мертві клітини). ЕСво зв'язування виражали в молярності (М), яку розраховували за допомогою нелінійного регресійного аналізу (сгтарпРай Ргітз 4.0).
Криві титрування, отримані на лінії клітин мавп СО5-7, показали, що всі анти-пІСЬ-ІВ- антитіла, за винятком МКА 832Е5, специфічно розпізнавали ІСЕ-1К, експресований на поверхні лінії клітин мавп (фіг. 7А). Визначення ЕСво для кожного з мишачих і химерних антитіл показало, що два з них є порівняно хорошими стосовно їх властивостей зв'язування мавпячого ІБЕ-18 (фіг. 78). Ці результати показали, що усі створені анти-пІСЕ-ІВ-МКА, за винятком МКА 832Е5, розпізнають мавпячий ІСЕ-18.
Порівняння ЕСово зв'язування на клітинах СО5-7 і ІБЕ-1В-трансфікованих клітинах проводили з метою перевірки величини розпізнавання химерного антитіла на людському ІСЕ-1К порівняно з мавпячим ІСЕ-1К. Результати, показані на фіг. 7В, продемонстрували аналогічне розпізнавання людського і мавпячого ІСБЕ-1К усіма антитілами, за винятком МКА 832Е5.
Для того, щоб підтвердити розпізнавання на іншому типі мавп, клітини трансфікували ІСЕ- 1К від яванського макака, отримуючи розчинний мавпячий ІЗЕ-1К ЕСО, і виконували експерименти Віасоге з одним з химерних антитіл (с208Е2), щоб порівняти його зв'язувальні властивості або на ПІСЕ-ІЕ, або на ІСЕ-1Е яванського макака.
Експерименти з розпізнавання проводили на пристрої Віасоге Х з використанням сенсорного чіпа СМ5, активованого анти-Ніз-Тад-антитілом (набір Ніх Саріиге КИ від СЕ Неайсаге, кат. номер 28-9950-56). Більше ніж 11000 РО антитіл хімічно приєднували до карбоксиметилдекстранової матриці з використанням набору для амінової хімічної реакції.
Експерименти проводили при 25 "С зі швидкістю потоку 30 мкл/хв з використанням буфера
НВ5-ЕР (СЕ Неайсаге) як робочого буфера і буфера для розведення зразків. Кінетичну схему з одним циклом використовували для певних кінетичних параметрів зв'язування химерної форми анти-ІСЕ-1В-антитіла 208Е2 (с208Е2) на ПІСЕ-1Е порівняно з ІСЕ-1К макака.
Розчин розчинного рекомбинатного варіанту гетеротетрамера ПІСЕ-ІК, що складається з ланцюгів 2В і позаклітинних доменів ланцюгів 2а, експресованих з додатковою С-кінцевою 10-
Нів-міїткою, основаного або на людській послідовності (КО бузіетв5, кат. номер 305-48-50), або послідовності яванського макака (отриманий самостійно), вводили протягом 1 хвилини у другу проточну комірку в розведенні, визначеному для захоплення приблизно 160 РЕ антигена.
Розчин другого антитіла вводили в тих самих умовах або в обидві проточні комірки, або тільки в другу проточну комірку. Після фази захоплення 5 разів вводили або робочий буфер (кожне введення по 90 с), або зростаючий діапазон 5 концентрацій с208Г2 (кожне введення по 90 с) в обидві проточні комірки. У кінці п'ятого введення проганяли робочий буфер для визначення швидкості дисоціації. Потім поверхню піддавали регенерації шляхом введення буфера з 10 мМ гліцином, НСІ, рН 1,5, протягом 30 с.
Обчислений сигнал відповідає різниці між відповіддю з проточної комірки 2 (з захопленим
ІСЕ-1К) і відповіддю з проточної комірки 1/(фіг. 8).
Для кожної молекули ІЗЕ-ЇЖ (людини або мавпи) сигнал від введення зростаючого діапазону концентрацій с208Е2 коригували шляхом віднімання сигналу, отриманого з 5 введеннями буфера (подвійний референс). Отримані сенсограми аналізували з використанням програмного забезпечення ВіАемаїЇчайоп з моделлю 1:1. Кінетичні показники оцінювали або незалежно (2 кінетичних швидкості зв'язування с208Е2 на кожному ІСЕ-1К) або разом (одні й ті ж кінетичні швидкості зв'язування с208Е2 на ІСЕ-1ІК людини і яванського макака). Якість підгонки оцінювали за співвідношенням Спі2г/Кітах нижче 0,05 РО.
Кінетичні швидкості зв'язування (див. таблицю 11), визначені окремо для кожного ІСБ-18, були близькі, і підгонка обох сенсограмм з однаковими кінетичними швидкостями має хорошу якість. Антитіло с208Е2 розпізнає рекомбінантні ІЗЕ-1Ж людини і яванського макака з бо константою дисоціації (КО) приблизно 0,2 нМ. Афінності, визначені в цьому дослідженні,
відповідають функціональним афінностям (або авідностям) антитіл з рівнем захопленого ІСЕ- 1К людини і яванського макака в районі 160 РО.
Таблиця 11
Приклад 6: Власний вплив створених антитіл на фосфорилювання ІСБ-1А
Добре відомо, що антитіла можуть індукувати агоністичну дію, коли вони зв'язуються з тирозинкіназними рецепторами. Оскільки ми не хотіли вибирати такі антитіла-агоністи, ми проводили оцінку фосфорилювання ПІСЕ-ІК з використанням химерних антитіл.
З цією метою клітини МСЕ-7 інкубували у безсироватковому середовищі протягом ночі.
Потім додавали або ІСЕ-1 (100 нМ), або антитіла, які аналізували, (10 мкг/мл) на 10 хвилин при 37 "С. Середовище відкидали і клітини зіскоблювали у лізируючий буфер (рН 7,5), що містить 10
ММ буфер Ттгі5-НСЇІ (рН 7,5), 1595 розчин Масі (1 М), 1095 суміш детергентів (10 мМ Ттгі5-НОЇ, 1095 лізируючий буфер Ідераї) (бідта Спетісаї! Со.), 595 дезоксихолат натрію (б5ідта Спетісаї Со.), 1 таблетку суміші інгібіторів протеаз ТМ (Коспе), 195 суміш інгібіторів фосфатаз СоскКіаї! зеї Ії (СаІріоспет), на 90 хвилин при температурі 4 "С. Лізати просвітлювали центрифугуванням при 4 "С, нагрівали протягом 5 хв при 100 "С і зберігали при мінус 20 "С або відразу завантажували у 4-12956 5О5-РАСІЕ-гель. Інкубацію з первинним антитілом проводили протягом 2 год при кімнатній температурі, а потім проводили інкубацію з НЕР-зв'язаними вторинними антитілами протягом 1 год при кімнатній температурі. Мембрани промивали у ТВ5Т, а потім візуалізували білки за допомогою ЕСІ. Блоти оцінювали кількісно, використовуючи програмне забезпечення
Ітаде 9. Значення "фосфор - білок" нормували за САРОН. Фосфорилювання ПІСБ-1К у відповідь на ЗЕ-1 розглядали як 10095 стимуляції. Вплив анти-пІСЕ-ІВ-антитіл на фосфорилювання ПІСЕ-1К визначали як 96 фосфорилювання, індукований ІСЕ-1.
Результати, описані на фіг. 9, є середнім значенням від 95 рісЕ-1К у відповідь на химерні анти-І2Е-1В-антитіла з трьох незалежних експериментів ж/- 5.0. порівняно з ІЗЕ-1. Як було показано, при інкубації клітин МСЕ-7 з 10 мкг анти-І2Е-1В-антитіл не було виявлено ніякого істотного або мінорного («2095 фосфорилювання ПІСЕ-1 8.
Приклад 7: Інгібування фосфорилювання ІСБЕ-1К у відповідь на ІЗЕ-1 мишачими анти-пІСЕ-
ІВ-антитілами
Зо Щоб охарактеризувати вибрані антитіла, досліджували їх здатність інгібувати ІСЕ1- індуковане фосфорилювання. З цією метою клітини МСЕ-7 інкубували у безсироватковому середовищі протягом ночі. Потім клітини інкубували протягом 5 хвилин з мишачими анти-пісскь»-
ІВ-антитілами, а потім додавали ІЗЕ-1 на 2 хв при 37 "С. Середовище відкидали і клітини зіскоблювали у лізируючий буфер (рН 7,5), що містить 10 мМ буфер Тті5-НСІ (рН 7,5), 1595 розчин Масі (1 М), 1095 суміш детергентів (10 мМ Ттгі5-НСІ, 1095 лізируючий буфер Ідераї) (Зідта
Спетіса! Со.), 596 дезоксихолат натрію (Зідта СПпетіса! Со.), 1 таблетку суміші інгібіторів протеаз ТМ (Коспе), 195 суміш інгібіторів фосфатаз СоскКіаї 5еї ІІ (СаіІБбіоспет), на 90 хв при температурі 4 "С. Лізати просвітлювали центрифугуванням при 4 "С, нагрівали протягом 5 хв при 100 "С і зберігали при мінус 20 "С або відразу завантажували у 4-1295 505-РАСІЕ-гель.
Інкубацію з первинним антитілом проводили протягом 2 год при кімнатній температурі, а потім проводили інкубацію з НКР-зв'язаними вторинними антитілами протягом 1 год при кімнатній температурі. Мембрани промивали у ТВ5Т, а потім візуалізували білки за допомогою ЕСІ.
Блоти оцінювали кількісно, використовуючи програмне забезпечення Ітаде .. Значення "фосфор - білок' нормували за САРЮОН. Фосфорилювання пПІСЕ-1К у відповідь на ІСБ-1 розглядали як 10095 стимуляції. Вплив анти-пІСКЕ-ІВ-антитіл на фосфорилювання ПІСБЕ-1А визначали як 96 фосфорилювання, індукований ІСЕ-1.
Додавання т105052, т101н8 або т9ос4, нерелевантних мишачих антитіл, не інгібувало фосфорилювання пПІСБ-1К у відповідь на ІСЕ-1 (фіг. 10). Додавання т201!Е1 помірно знижувало фосфорилювання ПІСЕ-1Е у відповідь на ІЗЕ-1 (приблизно 4095 зниження). Усі інші анти-І(Е- 1ВА-антитіла сильно інгібували фосфорилювання ПІСЕ-1К у відповідь на ІЗЕ-1 (зниження » 8095). Кращими інгібіторами ІСЕ1-індукованого фосфорилювання ПІСЕ-1К є МКА тг208Б2, т212А11 і т214Е8.
Приклад 8: Дослідження інтерналізації ІСЕ-1Е. після зв'язування зі створеними анти-ІСсв-1 В- антитілами за допомогою ЕАСзЗ-аналізу
Клітини МСЕ-7 інкубували з 10 мкг/мл химерних антитіл при 4 "С протягом 20 хв. Потім клітини промивали і інкубували при 4 "С або 37 "С протягом 4 год. Кількість антитіл, зв'язаних з клітинною поверхнею, визначали за допомогою вторинного антитіла на проточному цитометрі
ЕАСсСзЗСаїйбиг (Весіоп БбісКіпзоп). АМРЇ, яке визначали як різницю між МРЇ, виміряною при 4 "С, їі
МРЕЇ, виміряною при 37 "С, після закінчення періоду інкубації 4 години, відповідало кількості інтерналізованого антитіла. ДМЕЇ представлене на фіг. 11А і 118 їі в таблиці 12. Відсоток інтерналізації при 10 мкг/мл антитіла розрахований як 100(МРЇ при 4 "С - МЕЇ при 37 "СУМРЕЇ при 4 "С і представлений у таблиці 11. Максимум АМРЕЇ, розрахований для кожного химерного антитіла (фіг. 11А і 118), не показав ніякої кореляції між групою і максимумом інтерналізації.
Таблиця 12 1171762 | сег 17777771801111117111111322 | 27 71717762 | сгі90617171717171780111111711111353 | 4АЕЛО 770636 сив |17777771768 7777717 177717112297 | ЗлЕО9
Щоб визначити, чи можуть антитіла, які також розпізнають мавпячий ІСБ-1К, інтерналізувати цей рецептор, проводили такий самий експеримент з інтерналізації. Результати, підсумовані у таблиці 13, показують, що всі проаналізовані антитіла здатні опосередкувати інтерналізацію мавпячого ІСЕ-18.
Таблиця 13 а | го | 66 2 2 щЩ | 65 | 76 | 6 762 | гг | 83 77171777 17717987 0 щЩ 62 | 248 | 76 | 7 | 98 2 ЩщЩщ| 72 762 | 21906 | (В |1777171777117|11102 1777740 сбЗза | логнВ | 60777755 | 74 | 54 сбза | пМ0б9 | (69 | 7777/7597 | 93 |. 61 бЗа | 415АВ | (89 2 2 щЩщ | 65 | 121 | 68 е36 | аззнУ | (80 27 2 .ЮюЮюИЙв6б 4 4 | 4498 | 63 Ф 64 | лог | 68 | 767 | 94 | 72
Також оцінювали кінетику зменшення кількості антитіла, зв'язаного з клітинною поверхнею. З цією метою клітини МСЕ-7 висівали в 96-лункові планшети і інкубували з 10 мкг/мл мишачого антитіла протягом 20 хвилин при температурі 4 "С. Потім клітини промивали для видалення незв'язаного антитіла і в середовищах при температурі 37 "С протягом 10, 20, 30, 60 або 120 хв.
У кожний момент часу клітини центрифугували, а потім на льоду мітили поверхню вторинним протимишачим антитілом Ідс-АїІеха 488 для визначення кількості антитіла, що залишилося на поверхні клітини. Інтенсивність флуоресценції для кожного мишачого антитіла і для кожної точки часу нормували за сигналом, отриманим при 4 "С (95 ІЗЕ-1К, що залишилося), і підводили до експоненціального згасання, щоб визначити період напівжиття (1/2). 1/2 розглядали як час, необхідний для отримання зменшення на 5095 сигналу, виміряного при 4 "С. Як показано на фіг. 12А і 128, поверхневий рівень усіх мишачих антитіл швидко падав протягом перших 30 хвилин, і зниження було майже максимальним через 60 хвилин інкубації (фіг. 12А).
Розрахований період напівжиття знаходився в діапазоні від 10 до 18 хв стосовно мишачого антитіла (фіг. 128). Між розпадом антитіла на поверхні і групою антитіл не було виявлено ніякої кореляції.
Для того, щоб підтвердити, що зменшення сигналу з клітинної поверхні обумовлене інтерналізацією антитіла, а не злущуванням рецептора, клітини інкубували з мишачими антитілами протягом 0, 30 і 60 хв при 37 "С (фіг. 13). Потім клітини фіксували і пермеабілізували або не пермеабілізували для того, щоб визначити сигнал від антитіла, зв'язаного з клітинною поверхнею (без пермеабілізації), і загальний сигнал від антитіла, який відповідає антитілу, зв'язаному з клітинною поверхнею « інтерналізованому антитілу (з пермеабілізацією). Кількість інтерналізованого антитіла (цитоплазматичний сигнал) визначали таким чином: МЕ після пермеабілізації - МЕЇ без пермеабілізації. Цей експеримент показав, що зменшення антитіла, зв'язаного з клітинною поверхнею, було пов'язане зі збільшенням цитоплазматичних антитіл, доводячи, що антитіла були інтерналізовані (фіг. 13). Крім того, деградація антитіл починалася через 1 год інкубації що показано зменшенням сигналу після пермеабілізації (загальний сигнал).
Приклад 9: Дослідження інтерналізації ІЗЕ-1Е після зв'язування створених анти-ІСсвЕ-1В8- антитіл шляхом конфокальних аналізів
Для подальшого підтвердження інтерналізації антитіл проводили конфокальну мікроскопію, щоб оцінити субклітинний розподіл антитіл після клітинного переміщення. Клітини інкубували з анти-НІСЕ-ІВ-антитілами при 37 "С, фіксували і пермеабілізували. Потім клітини забарвлювали за допомогою вторинного антитіла АІеха-488 і кролячого анти-І атр-1-антитіла, яке виявляли за допомогою вторинного протикролячого антитіла ІдсС, кон'югованого з АїЇеха 555. Перед інкубацією при 37 "С мишаче антитіло 208Е2 локалізували на мембрані клітин МСЕ-7 (фіг. 14А),
Зо і при використанні плагіна для виділення колокалізації в програмному забезпеченні Ітаде ./ з лізосомним маркером, Іатр-1, колокалізацію не було помічено. Кількість зв'язаних з поверхнею клітини антитіл різко зменшувалася після 15-хвилинної інкубації. Одночасно із зменшенням кількості антитіла, зв'язаного з клітинною поверхнею, внутрішньоклітинне антитіло визначалося у везикулах. Можна було спостерігати рідкісну колокалізацію з Іатр-1. Після 30-хвилинної інкубації антитіло, зв'язане з клітинною поверхнею, майже не виявлялося. Проте, колокалізація антитіла в лізосомах збільшувалася. Через 1 годину інкубації внутрішньоклітинне забарвлення антитіла зменшувалося, як і рівень колокалізації з Іатр-1. Кінетика антитіла, зв'язаного з клітинною поверхнею, і його внутрішньоклітинне накопичення корелювало з кінетикою розпаду поверхневого антитіла, виміряною за допомогою ЕАС5Б. Крім того, як вже було описано в ЕАС5- дослідженнях, деградація мишачих антитіл починалася через 1 годину інкубації за результатами конфокальної мікроскопії.
Також оцінювали інтерналізацію усіх інших мишачих анти-пІСЕ-ІВ-антитіл і їх колокалізацію з Їатр-1 (фіг. 14В).
Приклад 10: Інгібування деградації антитіл за допомогою лізосомального інгібітора, бафіломіцину А1
Для того, щоб підтвердити, що антитіла, які досягли лізосоми, були деградовані, клітини обробляли або не обробляли бафіломіцином Ат, сильним інгібітором лізосомальної функції.
Потім клітини інкубували з 10 мкг/мл антитіла, яке аналізували, при 4 "С, промивали і інкубували протягом 2 годин при 37 "С. Інтерналізоване антитіло виявляли після клітинної пермеабілізації з використанням вторинного протимишачого антитіла Ідс-АїІеха 488. Додавання бафіломіцину А1 запобігало деградації внутрішньоклітинного антитіла (фіг. 15), що вказувало на те, що антитіла були ефективно інтерналізовані і деградували в лізосомах.
Приклад 11: Вплив рН на зв'язування ІСЕ-1Н-антитіла і кореляція с цитотоксичною активністю
Оскільки антитіла вибирали на підставі їх потенціалу інтерналізації, і раніше була показана колокалізація з ранніми ендосомами перед входом у лізосомальний компартмент, підхід, що цікавить, полягав у виборі антитіл, для яких стабільність зв'язування "пПІСЕ-18 - антитіло" модулюється відносно рН середовища, і переважними є такі антитіла, які переважно дисоціюють від ЗЕ-1К, коли рН середовища стає кислим. Справді, основна відмінність між бо ранніми ендосомами і лізосомами полягає в їх порожнинному рН: в ендосомальному компартменті рН складає приблизно 6, тоді як в лізосомальному компартменті рН складає приблизно 4,5.
Добре відомо, що ПІСБЕ-ІК, одного разу інтерналізований після зв'язування ліганда (ІСЕ1), повертається назад на поверхню клітини через шлях рециркуляції.
Без зв'язку з будь-якою теорією, описана в цьому документі гіпотеза полягає в тому, що антитіла, більш схильні до раннього звільнення від їх мішеней при кислому рН, ймовірно, сприятимуть рециркуляції мішені до мембрани, і, отже, їх можна розглядати як більш відповідних кандидатів для підходів з використанням імунокон'югатів. Для того, щоб дослідити деякі з наших антитіл, що демонструють таку властивість, і щоб співвіднести цю властивість з цитотоксичною активністю, було проведено зв'язування мишачих анти-пПІСЕ-ІВ-МКА на клітинній лінії МСЕ-7 у буферах з різними значеннями рН. Зростаючі концентрації мишачих МКА інкубували на клітинній лінії МСЕ-7 протягом 20 хвилин при 4 "С і різних рН в діапазоні від 5 до 8. Потім ці клітини промивали 3 рази і інкубували з відповідним вторинним антитілом, кон'югованим з АЇеха 488, у ГЕАС5З-буфері. Клітини інкубували протягом 20 додаткових хвилин при 4 "С у темряві, а потім промивали З рази ГАС5-буфером. Зв'язування анти-пІСЕ-1 В- антител негайно проводили на життєздатних клітинах, які ідентифікували за допомогою пропідію йодиду, який забарвлює мертві клітини. ЕСзо зв'язування виражали в молярності (М), яку розраховували за допомогою нелінійного регресійного аналізу (СсгарпРаай Ргітз 4.0).
ЕСво анти-пІСЕ-1К, що належить до групи кластерів епітопів ЗВ, по суті не залежала від рн (фіг. 16). Зв'язувальна здатність анти-пІСЕ-ІВ-антител, що належать до групи кластерів епітопів
За, часто посилювалася при кислому рН. Навпаки, зв'язувальна здатність анти-пІСЕ-ІВ-антител, що належать до групи кластерів епітопів 1, 2 і 4, зменшувалася при кислому рн.
Для визначення того, чи чинить кислий рН позитивний вплив на цитотоксичність, індуковану имунокон'югатом, використовували комерційно доступний аналіз для людського Габ-2АР (АТО
ВІО). Коротко, клітини МСЕ-7 висівали у кількості 2000 клітин/лунка в 96-лункові планшети і залишали на ніч для прикріплення. Наступного дня клітини обробляли 0,45 мкг/мл Еар-2АР і зростаючими концентраціями химерних анти-ІСкЕ-1В-антитіл. Моноклональне антитіло с964, яке не зв'язується з поверхнею клітини, використовували як негативний контроль. На 6-й день життєздатність клітин вимірювали за допомогою аналізу СейТйег Со І итіпезепсе Сеї! Міарійу
Зо від Рготеда (Медісон, Вісконсин). Як показано на фіг. 17А, анти-ІСЕ-1В-антитіла з груп4 і 5 не індукували ніякої цитотоксичності на клітинах МСЕ-7, тоді як в інших групах була виміряна цитотоксичність від помірної (групи 1, За і ЗБ) до високої (група 2). На фіг. 17В визначення ІСво показало, що група 2 має найвищу цитотоксичну активність, підтверджуючи, що ці антитіла будуть найбільш відповідними для підходу з використанням АОС (кон'югат "антитіло - лікарський засіб") або АТС.
Результати, представлені на фіг. 17, показали, що серед 15 оцінюваних химерних МКА кращого цитотоксичного ефекту досягли с208Е2, с21905, с212А11, с213810 ї с214Е8, при цьому усі вони належать до групи 2. Проте, інші антитіла з групи 1 і 4, які також демонстрували чутливість до кислого рН при зв'язуванні ІСЕ-1К, не були кластеризовані як кращі кандидати для цитотоксичности, підтверджуючи, що ця властивість може бути необхідною, але не достатньою для пояснення конкретних властивостей антитіл з групи 2. Для того, щоб краще зрозуміти особливі характеристики цього набору антитіл, були проведені дослідження кореляцій стосовно даних, наявних для усіх створених антитіл. Результати цього аналізу підтвердили, що і інгібування фосфорилювання, і зниження здатності зв'язування з ПІСЕ-1К при кислому рн середовища потрібні, щоб отримати кращу цитотоксичну активність (фіг. 18). Дійсно, 101Н8 (С1), 20121 (1) і 105022 (04), зв'язування яких було понижене в кислому середовищі, але які були поганими інгібіторами фосфорилювання, показали низькі цитотоксичні активності. З іншого боку, 102Н8 (С3За), 11059 (За), 415А8 (За), 410054 (535), 414Е1 (35) і 433НО9 (35) були потужними інгібіторами ІСЕ1-індукованого фосфорилювання, але були не чутливими до змінення рН або такими, чиє зв'язування посилювалося при кислому рН, показуючи лише помірну цитотоксичну активність в аналізі для людського Бар-2АР.
Зв'язування гуманізованих анти-І2Е-18-МКА на клітинній лінії МСЕ-7 було проведено у буферах з різними значеннями рН. Зростаючі концентрації гуманізованих МКА інкубували на клітинній лінії МСЕ-7 протягом 20 хв при 4 "С і різних рН у діапазоні від 5 до 8. Потім ці клітини промивали З рази і інкубували з відповідним вторинним антитілом, кон'югованим з Аїеха 488, у
ЕАС5-буфері. Клітини інкубували протягом 20 додаткових хвилин при 4 "С у темряві, а потім промивали З рази РАС5-буфером. Зв'язування анти-ІС4Е-1В-антитіл негайно проводили на життєздатних клітинах, які ідентифікували за допомогою пропідію йодиду, який забарвлює мертві клітини. ЕСво зв'язування виражали в молярності (М), яку обчислювали за допомогою бо нелінійного регресійного аналізу (СгарпРай Р'гіт5 4.0). Гуманізовані анти-ІдкЕ-1В-антитіла показали нижчу зв'язувальну здатність при кислому рн, як показано на фіг. З2А і 328.
Приклад 12: Оцінка гуманізованих форм МКА 208Е2 12.1 Оцінка зв'язування і інтерналізації першої гуманізованої форми п2208Е2 УНЗ/ЛЛ/І з (також згадуваної як п2208Е2 НО2б/ 024)
Звязування першої гуманізованої форми МКА с208Е2 оцінювали на клітинних лініях МСЕ-7,
СО5-7 і МІН-З3ТЗ ІВ». Зростаючі концентрації т2о8Е2, с208Е2 або п2208Е2 МНЗЛ/ІЗ додавали до кожної клітинної лінії протягом 20 хвилин при 4 "С. Потім клітини промивали і зв'язування аналізованого МКА виявляли за допомогою відповідного вторинного антитіла. Для валідації експресії людського ІК на трансфікованій клітинній лінії використовували комерційне анти-пІВ- антитіло, клон ОКО, і його профіль розпізнавання, проілюстрований на фіг. 190.
Порівняння гуманізованої форми або з мишачою, або з химерною формою на МСЕ-7 (фіг. 19А) або мавпячих клітинах СО5-7 (фіг. 198) показало близькі профілі для трьох проаналізованих форм. Процес гуманізації не змінював специфічності розпізнавання антитіла, яка була відмінно порівнювана з мишачою і химерною формами стосовно відсутності перехресної реактивності з рецептором людського інсуліну (фиг. 192).
Розраховані ЕСхо першої гуманізованої форми с208БР2 на лінії клітин людини МСЕ-7 і лінії клітин мавпи СО5-7 були схожі на ті, які були визначені для мишачої або химерної форми 208г2.
Здатність МКА п2208Е2 УНЗЛ/І З бути интерналізованим оцінювали за допомогою проточної цитометрії. Клітини МСЕ-7 інкубували з 10 мкг/мл антитіл при 4 "С протягом 20 хв. Потім клітини промивали і інкубували при 4 С або 37 "С протягом 4 год. Кількість антитіл, зв'язаних з клітинною поверхнею, визначали за допомогою вторинного антитіла. ДАМРЇ, яке визначали як різницю між МРЇ, виміряною при 4 "С, і МЕїЇ, виміряною при 37 "С, після закінчення періоду інкубації 4 години, відповідало кількості інтерналізованого антитіла. ДМЕ! представлене в таблиці 14а. Відсоток інтерналізації при 10 мкг/мл антитіла розрахований як 100(МРНЇ при 4 "С -
МРЇ при 37 "СУМНІ при 4 "С і представлений у таблиці 14а. Таким чином, гуманізоване п2208Е2
МНЗЛ//З мало властивості зв'язування і інтерналізації, схожі з виміряними у відповідного мишачого і химерного антитіл 208Е2.
Таблиця 14а
Коо) 12.2 Оцінка зв'язування наступних гуманізованих форм п2208Е2
МКА 208Г2 гуманізували і оцінювали зв'язувальні властивості шістнадцяти гуманізованих варіантів «у тому числі першої форми, описаної в 12.1). Зв'язувальні властивості гуманізованих варіантів оцінювали шляхом ЕАсСз-аналізів на клітинній лінії людської аденокарциноми молочної залози МСРЕ-7 і лінії клітин мавпи СО5-7 з використанням зростаючих концентрацій антитіл. З цією метою клітини (1х105 клітин/мл) інкубували з гуманізованими анти-ІСв-1 В- антитілами протягом 20 хвилин при 4 "С у ЕАС5З-буфері (РВ5, 0,195 ВБА, 0,0195 МаМз). Потім ці клітини промивали З рази і інкубували з відповідним вторинним антитілом, кон'югованим з АЇеха 488, протягом 20 додаткових хвилин при 4 "С у темряві, а потім промивали З рази БАС5- буфером. Зв'язування анти-Ій4Е-1В-антитіл негайно проводили на життєздатних клітинах, які ідентифікували за допомогою пропідію йодиду (який забарвлює мертві клітини). ЕСв5о зв'язування виражали в молярності (М), яку розраховували за допомогою нелінійного регресійного аналізу (сгарпРаа Ргітз 4.0).
ЕСво гуманізованих варіантів показали, що всі гуманізовані варіанти демонструють еквівалентні зв'язувальні властивості як на людській, так і на мавпячій лінії клітин.
ЕСово гуманізованих антитіл підсумовані в таблиці 1460.
Таблиця 14р
Гуманізовані варіанти 12.3 Оцінка інтерналізації іншої гуманізованої форми п2208Е2
Клітини МСЕ-7 інкубували з 10 мкг/мл гуманізованих антитіл при 4 "С протягом 20 хв. Потім клітини промивали і інкубували при 4 "С або 37 "С протягом 4 год. Кількість антитіл, зв'язаних з клітинною поверхнею, визначали за допомогою вторинного антитіла на проточному цитометрі
ЕАСзСаїрбриг (Весіоп Ріскіпбхоп). АМРЇ, яке визначали як різницю між МЕЇ, виміряною при 4 "С, їі
МРЕЇ, виміряною при 37 "С, після закінчення періоду інкубації 4 години, відповідало кількості інтерналізованого антитіла. АМЕЇ представлене в таблиці 14с. Відсоток інтерналізації при 10 мкг/мл антитіла розрахований як 100(МЕЇ при 4 "С - МЕЇ при 37 "СУМРЇ при 4 "С. Гуманізоване антитіло п2208Е2 НО77/ 018 здатне індукувати значну інтерналізацію ІСЕ-1 8.
Таблиця 14с
Приклад 13: ІСБ-1К як мішень для підходу із застосуванням імунокон'югатів
ІНС- дослідження були розроблені для того, щоб валідувати ПІСЕ-1К в якості мішені для підходу із застосуванням імунокон'югатів. Дійсно, корисна мішень для такого підходу вимагає значної надекспресії на пухлинних клітинах порівняно з нормальними клітинами. Ще одна властивість відповідної мішені для підходу із застосуванням імунокон'югатів полягає в її переважаючій надекспресії у значного відсотка пацієнтів в популяції при багатьох показаннях.
Для того, щоб оцінити, чи можна розглядати ПІСЕ-І як відповідну мішень для підходу із застосуванням імунокон'югатів, було вибране комерційно доступне поліклональне антитіло (АРЗ05-МА від КЯУО БЗувзіет5), описане як специфічний позаклітинний домен (ЕЮС) ПІСБ-ІВ, порівняно з ПІК. Першим етапом нашого процесу було перевірити специфічність АЕ305-МА відносно ПІСЕ-1К ЕСО і відсутність розпізнавання ПІК. З цією метою був виконаний ряд тестів
ЕГІ5А на людських білках ІСБ-1К і ПІК ЕСО з використанням протоколів, вже описаних вище.
Результати, описані на фіг. 20А, показали, що поліклональне анти-пІСЕ-1В-антитіло ефективно розпізнавало ПІСЕ-1їК ЕСО. Антитіло ЗКІ11І (СаїІБіоспет), яке використали як позитивний контроль, давало очікуваний профіль. Як було описано, на фіг. 208 показано, що
Зо АРЗ05-МА не розпізнає ПІК на відміну від анти-пІН-МКА СКОБ (СапІріоспет), використовуваного як позитивний контроль в ЕГІЗА. Так само оцінка зв'язування поліклонального АЕ305-МА на
ПІВ:-трансфікованих клітинах шляхом ЕАСс5З-аналізу підтвердила, що воно не розпізнає клітинну форму ПІК (фіг. 2003), тоді як анти-пПІВ-антитіло СКОБ (фіг. 20С) давало очікуваний профіль на трансфікованих клітинах, демонструючи, що вони експресують ПІК на високому рівні. Як і очікувалося, ОК11Ї, що розпізнає ПІСЕ-ЇК і введений в експеримент в якості негативного контролю, не показує ніякого сигналу на ПІК:-трансфікованих клітинах (фіг. 200).
Коли антитіло АЕ305-МА було повністю валідоване для дослідження розподілу ПІСБЕ-1К, був розроблений протокол ІНС на Оібсомегу ШПйга ашовіаїйпег Мепіапа. Коротко, після депарафінування проводили демаскування антигена за допомогою розчину СС1, що відповідає
ЕОТА-буферу з рН 8, протягом 32 хвилин при температурі 96 "С. Первинне антитіло (АЕ305-МА) інкубували протягом 1 години при 37 "С. Після промивання інкубували полімер НКЕР-Отар протицапиний Ідс (Мепіапа) протягом 16 хвилин при температурі 37 "С, і потім виявляли за допомогою хромогена ЮАВ. Нарешті, забарвлювали тканини з використанням гематоксиліну.
Потім зрізи заливали у середовище Еишкій. Для валідації ІНС-забарвлення була вибрана панель пухлинних тканин ксенотрансплантатів, що стосується експресії ПІСЕ-1К іп міго. Як показано на фіг. 21, сильне мембранозне забарвлення спостерігається у З позитивних тканинах (МСЕ-7,
МСІ-Н2З ї МСІ-Н82). Мембранозне забарвлення не спостерігалося в пухлині Н5746ї, вибраній в якості негативного контролю. Для аналізу забарвлення зрізи сканували за допомогою сканера
НТ від Коспе Мепіапа, і забарвлення ІСЕ-1Е кількісно оцінювали з використанням програмного забезпечення Мігішозо (Коспе Мепіапа). Для аналізу тканини оцінювали 4 поля зору (Пед ої міему, ЕОМ) в кожній пухлині, коли це було можливо, з більше ніж 50 клітинами з метою підвищення статистичної точності алгоритму. Тканини оцінювали як ж--- (також позначається як
З), від до ня (також позначається як від 2-- до 3-4 або ж--/ж--ж), «- (також позначається як 23, ї- (також позначається як 1-4) відповідно до мембранозного алгоритму НЕК2. Оцінку проводили згідно з керівництвом для тестування САР/АЗСО як (Ж) для слабкого або неповного забарвлення мембрани або слабкого повного забарвлення мембрани в менше ніж 1095 клітин у зразку. Оцінка (їж) описувалася як повне забарвлення мембрани, яке є неоднорідним або слабким, але з очевидним периферічним розподілом щонайменше в 1095 клітин, або як інтенсивне повне мембранне забарвлення 3095 або менше пухлинних клітин. Оцінка (жк) відповідає рівномірному інтенсивному забарвленню мембрани більше 3095 інвазивних пухлинних клітин. Якщо оцінка пухлини складала від (ї--) до (ї-), це означало гетерогенність у проаналізованій пухлинній тканині, (-) означає, що не було виявлено ніякої експресії ПІСЕ-1К, а (с) означає, що забарвлення було виключно цитоплазматичним. Цитоплазматичне забарвлення характеризується відсутністю мембранозного забарвлення, яке мають окремі клітини.
Потім проводили поглиблене дослідження на нормальних і пухлинних тканинах з використанням описаного вище протоколу (фіг. 22 А і В).
Для цих досліджень були використані людські нормальні і пухлинні ТМА від Зирегріоспір5 для проведення досліджень з розподілу і поширенню. Два різних контроля були введені в кожний цикл автозабарвлювання. Один контроль складався із зрізів плаценти, відомої як позитивний контроль на предмет експресії ІЗБ-1К ії наданої з нормальними тканинами ТМА.
Друга серія контролів складалася з трьох зрізів тканин пухлинних ксенотрансплантатів, що надають оцінку 2-4 або 3- (МСЕ-7 і МСІ-Н23, МСІ-Н82, відповідно). Цей останній контроль додавали в кожному циклі забарвлювання для калібрування експресії.
Як і слід було чекати, плацента і тканини від ксенотрансплантатів були позитивними відносно ПІСЕ-1К. У цих 4 контролях спостерігалося сильне мембранозне забарвлення. У першій панелі нормальних тканин людини (фіг. 22А) в шлунково-кишковому тракті (стравохід, тонка кишка, товста кишка і пряма кишка) спостерігалося незначне мембранозне виявлення
ІСЕ-1ІК, яке ніколи не перевищувало їж. В усіх інших аналізованих тканинах мембранозна експресія ІСЕ-1К не спостерігалася. У другій панелі нормальних тканин людини (фіг. 228) легке мембранозне виявлення ІЗЕ-1К, що ніколи не перевищувало 1ж, спостерігалося в ниркових структурах Сильне мембранне забарвлення (їж) спостерігалося в епітелії передміхурової залози і в уротелії. За винятком цих обох тканин сильне мембранозне забарвлення не спостерігалося. Цей патерн експресії значно підтвердив, що ПІСЕ-ІК може бути хорошою мішенню для підходів із застосуванням АОС або АТС.
Для того, щоб визначити потенційні показання до застосування імунокон'югатів, націлених на ІСБЕ-1К, були проаналізовані зразки від пацієнтів з пухлиною легенів, молочної залози, голови і шиї, сечового міхура і нирок на предмет експресії ними ІЗЕ-1К з використанням протоколу, описаного вище. 3 69 досліджених зразків легенів 67 випадків були інтерпретовані. Експресію ІСБЕ-18 оцінювали кількісно, як описано вище. Як показано на фіг. 23, сильна мембранозна експресія виявляється на багатьох карциномах порівняно з нормальними навколишніми тканинами, які є негативними відповідно до того, що ми вже описали вище на нормальних тканинах. Усі проаналізовані випадки підсумовані в таблиці 15. Спостерігалося 5595 випадків з оцінкою -- або ж--, включаючи усі підтипи раку легенів. Плоскоклітинні карциноми легенів були найвище бо експресуючі ПІСЕ-ІК пухлинами з 7095 випадків з оцінкою жк, --/---- або ж-- і 4395 випадків, що містять тільки пухлини ж-- ії -/--я. Ці результати узгоджуються з літературними даними, що описують часті високі полісомії або ампліфікації пІСБ-ІК у пацієнтів з плоскоклітинною карциномою легені.
Таблиця 15
Т2рМ2МмО ША 103 6 т2гамомо ІВ 104 6 т2гамомо ІВ 108 6
ТЗМ2МО ША 157 6
Т2рМоМмо ІВ 156 6 т2гамомо ІВ 102 6 т2гамомо ІВ 158 6
ТЗМ2МО ША 159 6
Плоскоклітинна карцинома легені, високо диференційована й
Від со дон
Від со дон 0/15 Т2амомо ІВ 109 6 2/20 ТЗ3М2МО ША 113 6
Плоскоклітинна карцинома легені, високо диференційована й відс досто відн дос) 0/17 Т2гамомо ІВ 120 6 відн дос) 1/46 Т2БМ1МО ІВ 121 6 відн дос) 1/43 Т2аМ1МО ПА 123 6 8/28 Т2амамо ША 136 6 0/17 Т2гамомо ІВ 137 6 0/19 Т2амомо ІВ 139 6 д4/заг т2аМ2МО ША 144 6 0/24 Т2БМОМО ПА 148 6 5/40 Т2БМ1МО ІВ 150 6 0/20 Т2амомо ІВ 155 6 1/115 Т260М1МО ІВ 105 6
Плоскоклітинна карцинома легені, помірно диференційована й
Від со дон 0/16 ТЗМОМО ІВ 110 6 (Плоскоклітинна карцинома легені, помірно диференційована|. (3 | (3
Таблиця 15 пев: 52525252 2 же 1в тканини оибтгамомоів'ї86 77777771
Плоскоклітинна карцинома легені, високо диференційована
Плоскоклітинна карцинома легені, високо диференційована
Плоскоклітинна карцинома легені, високо диференційована
Плоскоклітинна карцинома легені, високо диференційована . відс досто
НЕ ніна інь НН НОСИН 3/21 ТгаміМо А 131 6 о о
Плоскоклітинна карцинома легені, високо диференційована . від со дон)
Плоскоклітинна карцинома легені, високо диференційована
Плоскоклітинна карцинома легені, високо диференційована
Плоскоклітинна карцинома легені, високо диференційована . відс досто
Плоскоклітинна карцинома легені, високо диференційована
Плоскоклітинна карцинома легені, слабо диференційована
НЕ ііі НИНІ ННЯ 1/3 тгамомо А 135 6 о о
Плоскоклітинна карцинома легені, слабо диференційована й від со дон)
Плоскоклітинна карцинома легені, слабо диференційована
Плоскоклітинна карцинома легені, слабо диференційована
Плоскоклітинна карцинома легені, слабо диференційована й
Від со дос олаг т2гамомо ІВ 152 6
НЕ НН ііі ііі НИНІ ННЯ 0/14 ТЗМОМО ІВ 153 6 о о
Плоскоклітинна карцинома легені, веретеноподібна клітина (Карциносаркома легені 0/6 ТЗМОМОПВЛ116Є 777171! (Карциносаркома легені 0/14 Тгамомо!В1546..././/Ї711слссню 1111
Крупноклітинна нейроендокринна карцинома легені 0/7
Крупноклітинна нейроендокринна карцинома легені 0/38
Від(яє)до(нн)у (3 (Крупноклітинний раклегені 0/14 ТТЬМОМОІА 1256... Ї (БО о (Крупноклітинний раклегені0/33 Т2амомоІв1426../:/(хАО./Ї о сю
Ен піні НИНІ НО: ННЯ
ТЗ3М2МО ПА 107 6 о о
КЕ ііі НИНІ ННЯ
ТгЬМОМО А 116 6 о о
Бронхоальвеолярна карцинома легені, не муцинозна 2/24 (Бронхоальвеолярна карцинома легені, муцинознаб/8.д | (3 | (0
Таблиця 15 експресія ІСЕ- нормальні 1в тканини тгамомо ІВ 117 6 нн
Бронхоальвеолярна карцинома легені, муцинозна 0/24 (1-4) (3 т2гамомо ІВ 124 6
Бронхоальвеолярна карцинома легені, муцинозна 0/9 Й
ТЗМОМО ІВ 127 6 немає даних о
Бронхоальвеолярна карцинома легені, муцинозна 1/11 (3 (3
Т16М1 МО ПА 143 6
Інше дослідження експресії ІЗЕ-1К проводили на серії з 10 зразків раку молочної залози.
Результати показані на фіг. 24, яка показує, що ІСЕ-1К високо експресується в ракових тканинах порівняно з навколишніми нормальними тканинами. Дані з забарвлення підсумовані в таблиці 16, яка показує, що 6695 проаналізованих випадків мали оцінку ж, -/н-- або жк, а 2295 проаналізованих випадків мали оцінку ж--- або ж-/жк,
Таблиця 16 експресія . нормальні (забарвлення тканини мембрани)
Інфільтруюча протокова карцинома молочної залози
Інфільтруюча протокова карцинома молочної залози (3 (с) тзМ2гамо
Інфільтруюча протокова карцинома молочної залози томзамо немає даних немає даних
Інфільтруюча протокова карцинома молочної залози (3 (3 тзМіамо
Інфільтруюча папілярна карцинома молочної залози з . перстнеподібно-клітинним раком ТЗ3ЗМтамо» Від (ню) до (кв) (9
Інфільтруюча протокова карцинома молочної залози тзмзамо (ну (9
Змішана інфільтруюча протокова і глобулярна карцинома (1-4) (с) молочної залози Т3ЗМ2амо
Медулярний рак молочної залози Т3ЗМОМО" Від Ск) до (ж) Від 0 до (5)
Атиповий медулярний рак молочної залози Т2М1амо Від 0 до (5)
Інфільтруюча протокова карцинома молочної залози . тгМоМо- (ну Від 0 до (х) х випадки проілюстровані
Нарешті, надекспресія ІЗЕ-1К була показана в серії пухлин, включаючи пухлини голови і шиї, сечового міхура і нирок (фіг. 25). Знову ж таки, висока надекспресія ІСЕ-1Е була виявлена у зразках пухлин у порівнянні з нормальними навколишніми тканинами.
Взяті разом, ці результати узгоджуються з підходом із застосуванням імунокон'югатів для лікування багатьох ІСЕ-1В-позитивних пухлин, у тому числі пухлин легенів, молочної залози, голови і шиї, сечового міхура і нирок.
Приклад 14: Визначення константи дисоціації (Ко) зв'язування п'яти химерних анти-ІСЕ-1 В- антитіл (с208Е2, с213810, с212А11, с214Е8 і с21906) і гуманізованої версії (МНЗЛ/І 3) антитіла 208Е2 на розчинному рекомбінантному людському ІСБ-18
Константи дисоціації (Ко) зв'язування антитіл на рекомбінантному розчинному людському
ІДЕ-1К визначали за співвідношенням між швидкістю дисоціації (Кок) і швидкістю асоціації (Коп).
Кінетичні експерименти проводили на пристрої Віасоге Х100 з використанням сенсорного чіпа
СМ5, активованого мишачим моноклональним анти-Ніз-Тад-антитілом. Приблизно 12000 РО антитіл хімічно приєднували до карбоксиметилдекстранової матриці з використанням набору для амінової хімічної реакції.
Експерименти проводили при 25 "С зі швидкістю потоку 30 мкл/хв з використанням буфера
НВ5-ЕР-- (СЕ Неайсаге) як робочого буфера і буфера для розведення зразків.
Кінетичну схему з одним циклом використали для визначення кінетичних параметрів зв'язування анти-ІЩ4Е-1АВ-антитіл на розчинному рекомбінантному людському ПІСБ-1В, захопленому за допомогою двох його С-кінцевих 10-Нів-міток. 1 - Розчин розчинного рекомбінантного варіанту людського гетеротетрамера ПІСБЕ-ІВ: ланцюги 2а і позаклітинні домени ланцюгів 28, експресовані з додатковою С-кінцевою 10-Нів- міткою (К850О бБузіетв5, кат. номер 305-28-50) вводили протягом 1 хвилини у другу проточну комірку в концентрації 10 мкг/мл. У середньому 587 РО (із стандартним відхиленням 24 РО) розчинного рецептора було захоплено в кожному з 24 циклів, реалізованих у даному дослідженні. 2 - Після фази захоплення в обидві проточні комірки вводили або робочий буфер 5 разів (кожне введення по 90 с), або зростаючий діапазон з 5 концентрацій одного з шести антитіл (кожне введення по 90 с). У кінці п'ятого введення робочий буфер проганяли протягом 5 хвилин для визначення швидкості дисоціації.
З - Потім поверхню піддавали регенерації введенням буфера з 10 мМ гліцином, НС, рН 1,5, протягом 45 с.
Обчислений сигнал відповідає різниці між відповіддю з проточної комірки 2 (із захопленим
ІСЕ-1К) і відповіддю з проточної комірки 1 (без будь-яких молекул ІСЕ-1Н).
Для кожного ІЗЕ-1Ж сигнал від введення зростаючого діапазону концентрацій одного антитіла коригували шляхом віднімання сигналу, отриманого з 5 введеннями буфера (подвійний референс), див фіг. 26.
Отримані сенсограми аналізували з використанням програмного забезпечення ВіАема|чайоп з моделлю 1:1.
Для кожного антитіла були проведені чотири досліди з використанням двох різних діапазонів концентрацій: 40, 20, 10, 5 і 2,5 нМ для двох перших експериментів і 24, 12,6, З і 1,5 НМ для двох останніх експериментів для кожного антитіла.
У цьому експерименті для 6 аналізованих антитіл експериментальні дані підводили з моделлю 1:1 зі значними значеннями Кок, коли більш висока концентрація була визначена як константа, а інші чотири концентрації обчислені (див. фіг. 27).
Зо Константи дисоціації (Ко), розраховані як відношення: Кой/Коп), і періоди напівжиття комплексів, розраховані як відношення І п(2)/Коєї, представлені на фіг. 28 і 29. Вони відповідають середньому значенню від чотирьох незалежних експериментів, проведених для кожного антитіла. Стовпці помилок відповідають стандартним помилкам (п-4) значень.
Константи дисоціації знаходяться в діапазоні від 10 до 100 пМ. Антитіло с208Е2 показує слабкішу афінність (більш високе значення константи дисоціації) по відношенню до ПІСЕ-1К. (з
Ко близько 75 пМ), а його гуманізований варіант є щонайменше таким же хорошим, як химерний варіант (з Ко близько 60 пМ). Чотири інших химерних анти-ІС2Е-1В-антитіла показують дуже схожу афінність по відношенню до пПІСЕ1-Е (з Ко близько 30 пМ). Різниця в афінності головним чином пов'язана зі швидкістю дисоціації або результуючим періодом напівжиття комплексів. У 2082 період напівжиття комплексу складає від 2 до З годин для химерної і гуманізованої (МНЗЛ/ЛІ 3) версій. Для чотирьох інших химерних антитіл середні періоди напівжиття складають від 7,0 до 9,4 годин.
Ці дуже низькі значення кінетики дисоціації однозначно пов'язані з двовалентною структурою антитіл, які здатні зв'язуватися одночасно обома своїми Раб-гілками з двома сусідніми ПІСЕ-1А-молекулами. У цьому випадку рівень захоплених молекул ІЗЕ-1К може вплинути на швидкість дисоціації. Афінності, визначені в цьому дослідженні, відповідають функціональним афінностям (або авідностям) антитіл на рівні захопленого ПІСЕ-1К приблизно 600 РО. 3-кратна різниця Кб, яка спостерігалася між даними, наведеними вище (таблиця 10), і значеннями, представленими в прикладі 13, пов'язана зі зміною рівня захоплення пПІСБЕ-1А (600РО порівняно з 160 РО в прикладі 5).
Приклад 15: Визначення мишачих ІСЕ-1ВН-специфічних залишків, які запобігають зв'язуванню с208Е2, з використанням розчинних форм химерних п/п рекомбінантних білків ІСОЕ- 1в
Зв'язування розчинних форм химерних п/т рекомбінантних білків ІЗЕ-12 в експериментах з антитілом с208ГЕ2 виконували на пристрої Віасоге Х100 з використанням сенсорного чіпа СМ5, який активується мишачим протилюдським ЇдДО Ес моноклональним антитілом. Більше 10500
РО анти-Рс-антитіла хімічно приєднували до карбоксиметилдекстранової матриці обох проточних комірок з використанням набору для амінової хімічної реакції.
Експерименти проводили при 25 "С зі швидкістю потоку 30 мкл/хв з використанням буфера 60 НВ5-ЕР як робочого буфера і буфера для розведення зразків.
Умови експерименту були наступні: 1 - Розчин с208БЕ2 в концентрації 10 мкг/мл вводили протягом 60 с у другу проточну комірку. 2 - Аналізовані конструкції ІСЕ-їК відповідали концентрованим супернатантам культурального середовища, розведеним у 10 разів в робочому буфері. Одну конструкцію вводили в кожному циклі протягом 120 с із затримкою 120 с.
З - Обидві проточні комірки піддавали регенерації шляхом введення буфера з 10 мМ гліцином, НСІ, рН 1,5, протягом 30 с.
На фіг. 30 показано накладення двох циклів. Протягом першого і другого циклів, відповідно, вводили супернатанти йП-ІС2Е-1К і т-ІСЕ-1К. Цей експеримент наочно показує нездатність т-
ІБЕ-1К зв'язуватися з позиціями антитіла с208Е2, використовуваними для визначення рівня захоплення с208БН2, і рівень зв'язування ІСЕ-1К помічений двонаправленими стрілками.
Позаклітинні домени ІСЕК (без сигнального пептиду) складаються з 805 і 806 амінокислот для людської і мишачої послідовності, відповідно. 869 залишків (9695) є однаковими в обох структурах. 37 залишків мишачої послідовності відрізняються від відповідної людської послідовності. Одна з відмінностей відповідає розриву.
Як показано на фіг. 31, серед семи химерних проаналізованих конструкцій чотири (С1 (5ЕО
ІО МО:83), С4 (ЗЕО ІЮ МО:86), С7 (5ЕО ІЮ МО:88) і С8 (ЗЕО ІЮО МО:89)) зв'язуються, як і П-ІСЕ- 1Е, з с208Е2, три конструкції (С2 (ЗЕО ІЮ МО:84), СЗ (5ЕО ІЮ МО:85) і Сб (5ЕО ІЮО МО:87)), як і т-ІаБ-1А (5ЕО ІО МО:91), не зв'язуються з с208Е2.
Зв'язування СІ і відсутність зв'язування С2 підтверджує, що мишачі специфічні залишки, що блокують зв'язування с208Е2, розташовані на М-кінцевій половині білка. Таким чином, останні одинадцять специфічних мишачих амінокислот, розташовані в С-кінцевій половині, не мають ніякого впливу на зв'язування с208гЕ2.
Відсутність зв'язування СЗ3 демонструє великий внесок одного мишачого специфічного залишку Агд замість Ні у позиції 494. Цей результат підтверджується відсутністю зв'язування
Сб, який містить два мишачих специфічних залишки: Ніз494»Агу і зег501»Тгр.
Зв'язування С4 підтверджує, що тільки мишачий специфічний залишок Тгр у позиції 501 даного химерного ІСЕ-1К не несе відповідальності за відсутність зв'язування Са2 і Сб.
Зв'язування С7 підтверджує, що жоден з 17 мишачих специфічних залишків, присутніх в цих
Зо конструкціях, не має ніякого впливу на блокування зв'язування с208гЕ2.
Так само зв'язування С8 виключає 4 інші мишачі специфічні залишки.
С12-мутант людського ІСЕ1Е, який має три мишачі залишки в домені І 1, тобто Ре у позиції 28 замість Туг, Пе у позиції 125 замість Маї і Геи у позиції 156 замість Меї, зв'язує с208БЕ2 з субнаномолярною константою дисоціації. Цей експеримент підтверджує, що домен 1/1 не бере участі в зв'язуванні антитіла, або що щонайменше 3 позиції, які відрізняються в мишачій і людській послідовностях, не несуть відповідальності за відсутність зв'язування антитіла з мишачою формою ІСЕ1К.
Як показано на фіг. 33, п2208Е2 не здатне зв'язуватися з 120 РО мутанта С29 (Азр491»5Аїа) розчинної форми П-ІСЕ1, захопленої на сенсорному чіпі СМ5 через його С-кінцеву бНІів-мітку (білі ромби), тоді як той самий розчин антитіла чітко зв'язує (чорні ромби) до 170 РО форми розчинного рецептора дикого типу. Як і Ніх 494, Азр 491 має вирішальне значення для афінності п2208Е2 відносно ІЗЕ1К. Кристалографічні дані показують, що обидва залишки експоновані на поверхні рецептора в домені ГпкК3.
У сукупності ці результати показують, що п2208БЕ2 зв'язується з доменом ЕГпКЗ ІСБЕ-1К, і епітоп, розпізнаваний цим антитілом, містить Ні 494 і Азр 491, які мають вирішальне значення для зв'язування антитіла.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 РІЕККЕ ЕЄАВКЕ МЕВІСАМЕМТ «1205 АНТИТІЛО ПРОТИ ІСЕ-1К І ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ ЯК АДРЕСУЮЧОГО ПЕРЕНОСНИКА
ДЛЯ ЛІКУВАННЯ РАКУ
«1305 367603033596 «1505 и561984160 «1515 2014-04-25 (510) «1605 192 «1705 РатепсІп мег5топ 3.5
«2105 1 «2115 8 «2125 РЕТ «2135 агтіТісіа! «220» «223» Сопзепзи5 СОК -НІ1 «220» «221» МІ5С ЕЕАТОКЕ «222» (335..(3) «223» Тиг тау Бе геріасей Бу 5ег «220» «221» МІ5С ЕЕАТОКЕ «222» (83..(8) «223» Ттуг тау Бе геріасей Бу Ре «4005 1 с1іу туг Тиг Ре тТиг о 5ег туго туг 1 5 «210» 2 «2115 8 «2125 РЕТ «2135 агтіТісіа! «220» «223» Сопзепзи5 СОК-Н2 «400» 2 че Тер Рго сІу Азр сіу 5ег тег 1 5 «210» з «2115 13 «2125 РЕТ «2135 агтіТісіа! «220» «223» Сопзепзи5 СОоК-НІЗ «400» з
Аїа б5ег Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗп Туг АЇїа Мет дор туг
БО 1 5 10 «210» 4 «2115 6 «2125 РЕТ 55 «213» асктітістза! «220» «223» Сопзепзи5 СОК-І1
Гс10) «220» «221» МІ5С ЕЕАТОКЕ «222» (4)..:(4) «223» бег тау Бе геріасей Бу дз5п 65 «400» 4 сіп А5р І1Іе 5ег Гуз туг 1 5
«2105». 15 «2115 З «2125 РЕТ «2135» агжітісіа!
«220» «223» Сопзепзи5 СОК-12 «4005» 155 туг тНг 5ег 1 «2105» 6 «2115 909 «2125 РЕТ «2135 агтіТісіа! «220» «223» Сопзепзи5 СОК-І 3 «220» «221» МІ5С ЕЕАТОКЕ «222» (53)..05) «223» Тиг тау Бе геріасей Бу Аїа «4005» 6 сіп сіп с1у б5ег ТИйг гей Рго Туг ТЕг 1 5 «2105» 7 «2115 8 «2125 РЕТ «2135 агтіТісіа! «220» «223» СсоК-НІ
«4005 7 сіу туг Тиг Ре тТиг о 5ег туго туг 1 5
«210» 8 «2115 8 «2125 РЕТ «2135 агтіТісіа!
«220» «223» СсоК-НІ «400» 8 сіу туг 5ег Ре Тиг 5ег тТуг Ре 1 5 «210» 1 60 «2115 6 «2125 РЕТ «2135 агтіТісіа! «220» 65 «223» сСОК-І1 «4005» 9 сіп А5р І1Іе 5ег Гуз туг 70 1 5
«2105» 10 «2115 6 «2125 РЕТ «2135 атктітісіа! «220» «223» сСОоК-І1 «400» 10 сіп А5р те А5п Гуз туг 1 5 «2105 11 «2115 9 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» сСОоК-ІЗ «4005 11 сп сіп с1у б5ег Тийг гей Рго Туг ТЕг 1 5 «2105» 12 «2115 9
Зо «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» сСОоК-ІЗ «4005 12 сіп сіп сІіу 5ег АЇа Гей Рго Туг ТЕГ 1 5 «2105» 13 «2115 120 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» с208г2, Пеаму спаїп, МН «4005» 13 сіп ма! сіп ге сіп сіп 5ег сіу Рго сій Ге ма!Ї Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз Мет 5ег Су5 Гуз АЇа бек сіу туг Тйг РМПе тТиг 5ег туг 20 25 30 тукг Пе туг Тер ма! Гуз сп Агд Рго сЇу сЇп сІу гГеи сіи Тер Ге 35 40 45 60 с1у тер І11е Тер Рго сіу А5р сіу б5ег Тиг Гуз Туг А5зп си Гуз РПе 50 55 60
Гуз Азр Гуз ТВг о тиг гей Тиг Аїа А5р Гуз 5ег 5ег Ап Тиг АЇа туг 65 70 75 80 65 мес Ре Ге 5ег б5ег гей Тиг о б5ег сі Азр 5ег АЇїа ма! туг Ре су 85 90 95 70 Аїа б5ег Рго Меж ІЇе Тйг Рго А5п Туг Аїа Мет Азр Туг Тгр Оо1у сіІп
100 105 110 с1у Аїа б5ег ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 «2105» 14 «2115 120 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» с212А11, Неаму спати, мн «400» 14 сіп ма! сіп ге сіп сіп 5ег сіу Рго сій Ге ма!Ї Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз Мет б5ег Суз Гуз АЇїа б5ег сіу Туг ТНг РНе тНг 5ег туг 20 25 30 тукг Пе ніх Тер ма! Гуз сп Агд Рго сЇу сЇп сІу гГеи сіи Тгр Пе 35 40 45 сіу Тер т1Іе Тер Рго сіу А5р сіу 5ег ТИг Гуз Туг А5зп си Гуз Ре 50 55 60
Гуз сіу Гуз ТИг о тТигогеи Тиг Аїа А5р Гуз 5ег 5ег 5ег Тг АїЇа туг 65 70 75 80
Меє Ре Ге 5ег б5ег гей Тиг о б5ег сі Ар 5ег АЇа ма! Ттуг Ре су 85 90 95 АЇїа бег Рго Мет І1е Тийг Рго А5п Туг АЇа Меї дор Туг Тгр с1у сп 100 105 110 с1у Аїа б5ег ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 «2105» 15 «2115 120 «2125 РЕТ «2135 акітісіа! «220» «223» с214Е8, НПеаму спаїп, МН «4005» 15 сіп ма! сіп ге сіп сіп б5ег сіу 5ег сій Ге маЇ Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 зег ма! Гуз Ге б5ег Суз Гуз АЇїа б5ег сіу Туг ТНПг РНе тиг 5ег туг 20 25 30 тукг Пе ніх Тер ма! Гуз сп Агд Рго су сЇп сІу гГеи сіи Тгр Пе 35 40 45 (516) со1у Тер чІІе Тер Рго сіу А5р сіу б5ег Тиг Гуз Ттуг Азп си Ага Ре 50 55 60
Гуз сіу Гуз ТИг о тигогГеи Тиг Аїа А5р Гуз 5ег 5ег 5ег Тг АїЇа туг 65 65 70 75 80 мес Ре Ге 5ег б5ег гей Тиг о б5ег сі Азр 5ег АЇїа ма! туг Ре су 85 90 95 70 Аїа б5ег Рго Меж ІЇе Тйг Рго А5п Туг Аїа Мет Азр Туг Тгр Оо1у сіІп
100 105 110 с1у Аїа б5ег ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 «210» 16 «2115 120 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» с21906, НПеаму спаїп, МН «400» 16 сіп ма! сіп ге сіп сіп б5ег сіу Рго сій Ге маЇ Гуз Рго сІу А5р 1 5 10 15 5зег ма! Гуз Мет б5ег Суз Гуз АЇїа б5ег сіу Туг 5ег РіПе ТиИг 5ег туг 20 25 30
Ре ІІе Ні Тер ма! Гуз сіп Агуд Рго ОсЇу сіп сіу гГеи сіи Тер Пе 35 40 45 сіу Тер т1Іе Тер Рго сіу А5р сіу 5ег ТИг Гуз Туг А5зп си Гуз РНе 50 55 60
Гуз сіу Гуз ТИг о тТигогеи Тиг тс А5р о гуз 5ег о б5ег 5ег ТТГ АЇа туг 65 70 75 80 мес Ре Гей Ап б5ег о їеи ТИг о б5ег сі Азр 5ег АЇїа ма! туг Ре су 85 90 95 АЇїа бег Рго Мет І1е Тийг Рго А5п Туг АЇа Меє Азр Туг Тер с1у сп 100 105 110 с1у Аїа б5ег ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 «2105 17 «2115 120 «2125 РЕТ «2135 акітісіа! «220» «223» с213810, Неаму спати, мн «4005 17 сіп ма! сіп ге сіп сіп б5ег сіу 5ег сій Ге маЇ Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз Мет 5ег Су5 Гуз АЇа бек сіу туг ТИг РМПе тТиг 5ег туг 20 25 30 тукг Пе ніх Тер ма! Гуз сп Агд Рго сЇу сЇп сІу гГеи сіи Тгр Пе бо 35 40 45 со1у Тер чІІе Тер Рго сіу дор сіу б5ег Тиг Гуз туг Азп си Ага Ре 50 55 60 65 Гуз сіу Гуз Тк о тТийгобеи Тйг Аїа А5р Гуз 5ег бег б5ег Ттиг Аа туг 65 70 75 80 мес Ре Ге 5ег б5ег гей Тиг о б5ег сі Азр 5ег АЇїа ма! туг Ре су 85 90 95 70
БА
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа Меє дор Ттуг Тгр с1у сіп 100 105 110 с1у Аїа б5ег ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 «210» 18 «2115 107 «2125 РЕТ «2135 актітістіа! «220» «223» с208г2, І1оапЕ сНаїп, мі. «400» 18
Азр ІІе сіп Меє тйг осіп тйг тег 5ег о б5ег гей 5ег Аа 5ег Гей сі1у 1 5 10 15
А5Зр Агуд Ма! тиг о чІЇе бек сСу5 Аг АЇїа 5ег сіп А5р ІЇе 5ег Гуз тТуг 20 25 30
Гей Азп Тер Туг сіп сіп сіп Рго А5р сіу тс пе уз Гей їеи Пе 35 40 45 тТукг туг Тийг 5ег Агуд Ге Ні 5ег сіу ма! Рго 5ег Агуд Ріпе 5ег су 50 55 60
Агд сіу б5ег сіу Тк Азр Ттуг 5ег Гей Типг ІЇе 5ег А5п ма! си сп 65 70 75 80 сій А5р ч1Іе АЇїа тТийг отуг Ре Су5 сіп сіп сіу бек Ттйг Гей Рго туг 85 90 95
Тиг Ре сіу су сіу тйг Гуз Ге сіи ІІе Гуз 100 105 «210» 19 «2115 107 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» с212А11, Топ сНаїп, мі. «400» 19 А5зр ІчІЇе сіп Мет Тис о сіп Ттиг о Тг б5ег б5ег Гей 5ег АЇа 5ег гей с1у 1 5 10 15
А5Зр Агуд Ма! тиг о чІЇе бек сСу5 Агу АЇа 5ег сіп А5р ІЇе д5п Гуз туг 20 25 30
Гей Азп Тер Туг сіп сіп сій Рго А5р о сіу тег маї Гуз Гей їГеи Пе 35 40 45 тТукг туг Тийг 5ег Агуд Ге Ні 5ег сіу ма! Рго 5ег Агуд Ре 5ег О1У бо 50 55 60
Агд сіу б5ег со1у Тйг А5р Туг 5ег Ге Тиг ІЇе 5ег А5Зп Геи си сп 65 70 75 80 65 си А5р ч11е Аїа тТийг о туг РПе Су5 сіп сіп сіу бег Тиг Ге Рго Туг 85 90 95
Тиг Ре сіу сІу сіу тйг Гуз Ге сіи ІІе Гуз 100 105 70
«2105» 20 «2115 107 «2125 РЕТ «2135 атктітісіа! «220» «223» с214г8, Топ саїп, мі. «4005» 20
Азр ІІе сіп Меє тйг осіп тйг о тг о 5ег о б5ег ге б5ег АїЇа 5ег Гей сі1у 1 5 10 15 А5зр Агуд Ма! Тег Ре 5ег су5 Аг Аїа б5ег сп А5р ІЇе 5ег Гуз туг
Гей Азп Тер Туг сіп сіп сіп Рго А5Зр с1у Тег че Туз Гей їГеи Пе 20 тТукг туг Тийг 5ег Агуд Ге Ні 5ег сіу ма! Рго 5ег Агуд Ре 5ег О1У 60
Агд сіу 5ег со1у Тйг А5р Туг 5ег Геу Тийг ІЇе тНг Ап Геми си сп 25 5655 70 75 80 сій А5р че АЇїа тТийг о туг Ріпе Суб сіп сіп сіу 5ег АЇа Гей Рго туг 85 90 95 30 тс Ре сТу су сіу тпг Гуз Ге сіи ІЇе Гуз 100 105 «2105» 21 35 «2115» 107 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» 40 «223» с21906, І1оапЕ сНаїп, мі. «400» 21
Азр ІІе сіп Меє тТйг осіп тйг тег 5ег о б5ег гей 5ег Аа 5ег Гей сіу 45 1 5 10 15
А5Зр Агуд Ма! тиг о чІЇе бек сСу5 Аг АЇїа 5ег сіп А5р ІЇе 5ег Гуз туг 20 25 30 50 Гей А5п Тер Туг оп сіп сіп Рго Азр соЇу тс ма! Гуз Ге Ге Пе 35 40 45 тТукг туг Тийг 5ег Агуд Ге Ні 5ег сіу ма! Рго 5ег Агуд Ре 5ег О1У 50 55 60 55
Агд сіу б5ег со1у Тйг А5р Туг 5ег Ге Тиг ІЇе 5ег А5Зп Геи си сіп 65 70 75 80 сій А5р ч1Іе АЇїа тТийг отуг Ре Су5 сіп сіп сіу б5ег Ттиг Гей Рго туг бо 85 90 95
Тиг Ре сіу сІу сіу тйг Гуз Ге сіи ІІе Гуз 100 105 65 «2105» 22 «2115 107 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! 70
«223» с213810, Топ сНаїп, мі. «4005» 22
Азр ІІе сіп Меє тйг осіп тйг тег 5ег о б5ег гей 5ег Аа 5ег Гей сі1у 1 5 10 15
А5Зр Агуд Ма! тиг о чІЇе бек сСу5 Аг АЇїа 5ег сіп А5р ІЇе 5ег Гуз туг 20 25 30
Гей Азп Тер Туг сіп сіп сіп Рго А5р сіу тс пе уз Гей їеи Пе 35 40 45 Туг туг ТНг 5ег Агд Гей Ні 5ег сіу ма! Рго 5ег Агд Ре 5ег О1У 50 55 60
Агд сіу 5ег со1у Тйг Ар Туг 5ег Ге Тийг ІЇе тНг Ап Геми си сп 65 70 75 80 сій А5р че АЇїа тТийг о туг Ріпе Суб сіп сіп сіу 5ег АЇа Гей Рго туг 85 90 95
Тиг Ре сіу су сіу тйг Гуз Ге сіи ІІе Гуз 100 105 «2105» 23 «2115» 449 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» с208г2, Пеаму спаїп, Ти11 Тепдатн «4005 23 сіп ма! сіп ге сіп сіп 5ег сіу Рго сій Ге ма!Ї Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз Мет б5ег Суз Гуз АЇїа 5ег сіу Туг Тийг РПе тНг 5ег туг 20 25 30 тукг Пе туг Тер ма! Гуз сп Агд Рго сЇу сЇп сІу гГеи сіи Тер Ге 35 40 45 сіу Тер т1Іе Тер Рго сіу А5р сіу б5ег Тиг Гуз Ттуг А5Зп си Гуз Ре 60
Гуз Азр Гуз ТВг о тиг гей Тиг Аїа А5р Гуз 5ег 5ег Ап Тиг АЇа туг 50 65 70 75 80 мес Ре Ге 5ег б5ег о їеи Тиг о б5ег сій Азр 5ег АЇїа ма! туг Ре су 85 90 95 55 АїЇа бег Рго Мет І1е Тийг Рго А5п Туг АЇа Меї дор Туг Тгр с1у сп 100 105 110 с1у АЇїа б5ег ма! тиг омаї 5ег б5ег АЇа б5ег Тиг Гуз сіу Рго 5ег Умаї 115 120 125 (516)
Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег ТИг 5ег су сіу ТНг Аїа Аїа 130 135 140
Гей сіу Сузх Ге ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сі Рго ма! тТиг ма! 5ег 65 145 150 155 160
Тер А5п о б5ег с1у АїЇа Ге Тийг о5ег сіу ма! нНі5 Тийг Ріе Рго Аїа маї 165 170 175 70 ей сіп бег бек с1у Геи Туг бек Ге 5ег 5ег ма! ма! тиг о маї Рго
180 185 190 5ег б5ег 5ег ей сіу Тийг о сіп Тийг отуг те Су5 Азп маїЇ Азбтп Ні уз 195 200 205
Рго 5ег А5п ТИйгогГуз ма! А5р Гуз Агуд ма! сі Рго Гуз 5ег сСуз др 210 215 220
Гуз ТВг ні Тс Суб Рго Рго Су5 Рго АїЇа Рго сіи Геи Гей сІіу сС1У 10225 230 235 240
Рго 5ег ма! Ре Ге РПе РгО РГО Гуз Рго Гуз АЗзр ТИг Гей Мет Пе 245 250 255 зег Агуд Тиг оРгГоО сіи ма! Тк сСуз ма! ма! ма! Азр маї 5ег ні си 260 265 270
Азр Рго сіи МмаЇ Гуз Ре А5п Тгр Ттуг ма! Азр сіу маїЇ сіи маї ні 275 280 285
А5п АЇа Гуз Тиг Гуз Рго Агуд сої сій сбіп Ттуг АЗп 5ег о ТАйг Ттуг Агд 290 295 з00 ма! ма! 5ег маїЇ Ге тиг маї Гей Ні сіп Азр Тер Гей А5Зп СУ Гуз 305 310 315 320 сі тТуг Гуз Суз Гуз МмаїЇ 5ег Азп Гуз АїЇа Ге Рго АЇа Рго ІЇе Си 325 330 335
Гуз Тийг ІЇе бек Гуз АЇа Гуз сіу сп Рго Агд сіи Рго сіп ма! туг 340 345 350
Тк ге Рго Рго бег Агуд сім сіи Меє Тийг Гуз Азп сіп ма! 5ег Геи 355 360 365
Тиг осСуз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр ІЇе АЇїа ма! си тер 370 375 380 сій 5ег АЗп сіу сіп Рго сій Ап АбЗп о Туг Гуз Тс о тТВг Рго Рго маї 385 390 395 400
Гей А5р б5ег А5Зр сіу б5ег Ре Ре їеи Туг 5ег губ Ге Тиг ма! дор 405 410 415
Гуз 5ег Агуд Тер сп сіп сіу Азп Ма! Ре 5ег Су5 б5ег ма! Мет нів 420 425 430 сій АЇїа Гей Ні А5п Ні Туг Тйг о сіп Гуз 5ег їеи 5ег Гей 5ег РгГО 435 440 445 чу «2105» 24 «211» 449 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» 60 «223» с212А11, пеаму спаїп, Ти11 Тепдатн «4005» 24 сіп ма! сіп ге сіп сіп 5ег сіу Рго сій Ге ма!Ї Гуз Рго сІу АїЇа 65 1 5 10 15 5зег ма! Гуз Мет 5ег Су5 Гуз АЇа бек сіу туг Тйг РМПе тТиг 5ег туг 20 25 30 70 туг Пе ні5 Тер маї Гуз сіп Агд Рго с1у сіп сіу гей си Тер Пе
35 40 45 сіу Тер т1Іе Тер Рго сіу А5р сіу 5ег ТИг Гуз туг А5зп си Гуз РНе 50 55 60
Гуз сіу Гуз ТИг о тигогГеи Тиг Аїа А5р Гуз 5ег 5ег 5ег Тг АїЇа туг 65 70 75 80 мес Ре Ге 5ег б5ег гей Тиг о б5ег сі Азр 5ег АЇїа ма! туг Ре су 85 90 95
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа Меє дор Ттуг Тгр с1у сіп 100 105 110 с1у Аїа 5ег ма! Тис ма! 5ег 5ег Аїа бек Тиг Гуз сІу Рго 5ег ма! 115 120 125
Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег ТИг 5ег су сіу ТНг Аїа Аїа 130 135 140
Гей сіу Суз Ге ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сі Рго ма! Тийг ма! 5ег 145 150 155 160
Тер А5п о б5ег с1у АїЇа Ге Тийг о5ег сіу ма! нНі5 Тийг Ріе Рго Аїа маї 165 170 175
Гей сіп 5ег 5ег сіу Гей Ттуг б5ег Ге б5ег 5ег ма! ма! тик ма! Рго 180 185 190 5зег бег б5ег Ге сіу Тк сіп тийг отуг ІІе Су5 Азп маї А5Зп нів Гуз 195 200 205
Рго б5ег А5п ТИйгогГуз ма! А5р Гуз Агуд ма! сі Рго Гу5 бег Суз др 210 215 220
Гуз ТВг ні Тс Суб Рго Рго Су5 Рго АїЇа Рго сіи Геи Гей сІіу сС1У 225 230 235 240
Рго 5ег ма! Ре Гей Ре РгО РГО Гуз Рго Гуз Азр ТИг Гей Мет Іе 245 250 255 зег Агуд Тиг оРгГоО сіи ма! Тк сСуз ма! ма! ма! Азр маї 5ег ні си 260 265 270 А5зр Рго сіи Ма! губ Ре Азп Тгр Туг ма! Азр оЇу ма! сіи ма! нНі5 275 280 285
А5п АЇа Гуз Тиг Гуз Рго Агуд сої сій сбіп Ттуг АЗп 5ег о ТАйг Ттуг Агд 290 295 з00 ма! ма! 5ег маїЇ Ге тиг маї Гей ні сіп д5р Тер Гей Азп су Гуз 305 310 315 320 сі тТуг Гуз Суз Гуз МмаїЇ 5ег Азп Гуз АїЇа Ге Рго АЇа Рго ІЇе Си 325 330 335
Гуз Тиг ІЇе бек Гуз АТа Гуз сіу сіп Рго Агд сіи Рго сіп ма! туг 340 345 350 60 ТВгогГеи Рго Рго 5ег Агд сіи сіи Мет Тийг Гуз Азп сіп Ма! 5ег Геи 355 360 365
ТВг о осСуз Ге ма! Гуз сІу Ре Туг Рго 5ег А5Зр ІЇе АЇїа ма! си тер 370 375 380 65 сій 5ег АЗп сіу сіп Рго сій Ап АбЗп о Туг Гуз Тс о тТВг Рго Рго маї 385 390 395 400 70 Гей А5р б5ег Ар с1у б5ег Ре РПе Геи Туг 5ег уз Гей Тиг ма! дор
405 410 415
Гуз 5ег Агуд Тер сп сіп сіу Азп Ма! Ре 5ег Су5 б5ег ма! Мет нів 420 425 430 сій АЇїа Гей Ні А5п Ні Туг Тйг о сіп Гуз 5ег їеи 5ег Гей 5ег РгГО 435 440 445 чу «2105» 25 «2115» 449 «2125 РЕТ «2135 акітісіа! «220» «223» с214єг8, Пеаму спаїп, Ти11 Тепдатн «4005» 25 сіп ма! сіп ге сіп сіп б5ег сіу 5ег сій Ге маЇ Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 зег ма! Гуз Ге б5ег Суз Гуз АЇїа б5ег сіу Туг ТНПг РНе тиг 5ег туг 20 25 30 тукг Пе ніх Тер ма! Гуз сп Агд Рго су сЇп сІу гГеи сіи Тгр Пе
Зо со1у Тер чІІе Тер Рго сіу А5р сіу б5ег Тиг Гуз Ттуг Азп си Ага Ре 60
Гуз сіу Гуз ТИг о тигогГеи Тиг Аїа А5р Гуз 5ег 5ег 5ег Тг АїЇа туг 35 65 70 75 80 мес Ре Ге 5ег б5ег гей Тиг о б5ег сі Азр 5ег АЇїа ма! туг Ре су 85 90 95 40 Аїа б5ег Рго Мет І1е ТиИг Рго А5п Туг АЇа Меї дор Туг Тгр с1у сп 100 105 110 с1у АЇїа б5ег ма! тиг омаї 5ег б5ег АЇа б5ег Тиг Гуз сіу Рго 5ег Умаї 115 120 125 45
Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег ТИг 5ег су сіу ТНг Аїа Аїа 130 135 140
Гей сіу Сузх Ге ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сі Рго ма! тТиг ма! 5ег 50 145 150 155 160
Тер А5п о б5ег с1у АїЇа Ге Тийг о5ег сіу ма! нНі5 Тийг Ріе Рго Аїа маї 165 170 175 55 ей сіп бег бек с1у Геи Туг бек Ге 5ег 5ег ма! ма! тиг о маї Рго 180 185 190 5ег б5ег 5ег ей сіу Тийг о сіп Тийг отуг те Су5 Азп маїЇ Азбтп Ні уз 195 200 205 (516)
Рго 5ег А5п ТИйгогГуз ма! А5р Гуз Агуд ма! сі Рго Гуз 5ег сСуз др 210 215 220
Гуз ТВг ні Тс Суб Рго Рго Су5 Рго АїЇа Рго сіи Геи Гей сІіу сС1У 65 (225 230 235 240
Рго 5ег ма! Ре Ге РПе РгО РГО Гуз Рго Гуз АЗзр ТИг Гей Мет Пе 245 250 255 70 зег Агуд ТигоРгГоО сіи ма! Тк сСуз ма! ма! ма! Азр маї 5ег ні си бо
260 265 270
Азр Рго сіи МмаЇ Гуз Ре А5п Тгр Ттуг ма! Азр сіу маїЇ сіи маї ні 275 280 285
А5п АЇа Гуз Тиг Гуз Рго Агуд сої сій сбіп Ттуг АЗп 5ег о ТАйг Ттуг Агд 290 295 з00 ма! ма! 5ег маїЇ Ге тиг маї Гей Ні сіп Азр Тер Гей А5Зп СУ Гуз 305 310 315 320 сі тТуг Гуз Суз Гуз МмаїЇ 5ег Азп Гуз АїЇа Ге Рго АЇа Рго ІЇе Си 325 330 335
Гуз Тийг ІЇе бек Гуз АЇа Гуз сіу сп Рго Агд сіи Рго сіп ма! туг 340 345 350
Тк ге Рго Рго бег Агуд сім сіи Меє Тийг Гуз Азп сіп ма! 5ег Геи 355 360 365
Тиг осСуз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр ІЇе АЇїа ма! си тер 370 375 380 сій 5ег АЗп сіу сіп Рго сій Ап АбЗп о Туг Гуз Тс о тТВг Рго Рго маї 385 390 395 400
Гей А5р б5ег А5Зр сіу б5ег Ре Ре їеи Туг 5ег губ Ге Тиг ма! А5р 405 410 415
Гуз 5ег Агуд Тер сп сіп сіу Азп Ма! Ре 5ег Су5 б5ег ма! Мет нів 420 425 430 сій АЇїа Гей Ні Азп Ні Туг Тйг о сіп Гуз 5ег їеи 5ег гей 5ег РгО 435 440 445 с1у «210» 26 «211» 449 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» с21906, Пеаму спаїп, Ти11 Тепдатн «400» 26 сіп ма! сіп ге сіп сіп б5ег сіу Рго сій Ге маЇ Гуз Рго сІу А5р 1 5 10 15 5зег ма! Гуз Мет 5ег Су5 Гуз АЇа б5ег сіу туг 5ег Ре Тиг 5ег туг 20 25 30
Ре ІІе Ні Тер ма! Гуз сіп Агуд Рго ОсЇу сіп сіу гГеи сіи Тер Пе 35 40 45 сіу Тер т1Іе Тер Рго сіу А5р сіу 5ег ТИг Гуз туг А5зп си Гуз РНе 50 55 60 (516)
Гуз сіу Гуз ТИг о тТигогеи Тиг тс А5р гу 5ег б5ег о 5ег ТТГ АЇа туг 65 70 75 80 мес Ре Ге Ап б5ег о їеи ТИг о б5ег сі Азр 5ег АЇїа ма! туг Ре су 65 85 90 95
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа Мет А5р туг Тгр с1у сіп 100 105 110 70 с1у АТа 5екг ма! тиИг о ма!Ї 5ег б5ег АТа 5ег Тиг гу с1у Рго 5ег маї
115 120 125
Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег ТИг 5ег сіу сіу тпг Аїа Аїа 130 135 140
Гей сіу Сузх Ге ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сі Рго ма! тТиг ма! 5ег 145 150 155 160
Тер А5п о б5ег сІ1у АїЇа Ге Тийг о5ег сіу ма! Ні тйг Ріе Рго Аїа маї 165 170 175 ей сіп 5ег 5ег сіу Гей Ттуг б5ег Ге б5ег 5ег ма! ма! тиг ма! Рго 180 185 190 5зег бег б5ег Ге сіу Ттйг о сіп тийг отуг І1Іе сСу5 Азп маї дАзп Ніз Гуз 195 200 205
Рго 5ег А5п ТИйгогГуз ма! А5р Гуз Агуд ма! сі Рго Гуз 5ег сСуз др 210 215 220
Гуз ТВг ні Тс Суб Рго Рго Су5 Рго АїЇа Рго сіи Геи Гей сІіу с1У 225 230 235 240
Рго 5ег ма! Ре Ге РПе РгО РГО Гуз Рго Гуз АЗзр ТИг Гей Мет Пе 245 250 255 зег Агуд Тиг оРгГоО сіи ма! Тк сСуз ма! ма! ма! Азр маї 5ег ні си 260 265 270
А5р о Рго сій Ма! губ Ре Азп Тгр Туг ма! Азр сіу ма! сіи маї н1і5 275 280 285
А5п АЇа Гуз Тиг Гуз Рго Агуд сої сій сбіп Ттуг АЗп 5ег о ТАйг Ттуг Агд 290 295 з00 ма! ма! 5ег маїЇ Ге тиг маї Гей Ні сіп Азр Тер Гей А5Зп СУ Гуз 305 310 315 320 сі тТуг Гуз Суз Гуз МмаїЇ 5ег Азп Гуз АїЇа Ге Рго АЇа Рго ІЇе Си 325 330 335
Гуз Тийг ІЇе бек Гуз АЇа Гуз сіу сп Рго Агд сіи Рго сіп ма! туг 340 345 350
Тс Гей Рго Рго бег Агуд сіи сіи Меє Тк Гуз А5Зп сіп Ма! 5ег їеи 355 360 365
Тиг осСуз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр ІЇе АЇїа ма! си тер 370 375 380 сій 5ег АЗп сіу сіп Рго сій Ап АбЗп о Туг Гуз Тс о тТВг Рго Рго маї 385 390 395 400
Гей А5р б5ег А5Зр сіу б5ег Ре Ре їеи Туг 5ег губ Ге Тиг ма! дор 405 410 415
Гуз 5ег Агуд Тер сп сіп сіу Азп Ма! Ре 5ег Су5 б5ег ма! Мет нів 420 425 430 60 сій АТа гей Ні Азп Ні Туг Тс о сіп Гуз б5ег їеи бек Геу б5ег Рго 435 440 445 чу 65 «2105 27 «2115» 449 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! 70
«223» с213810, пеаму спаїп, Ти11 Тепдатн «4005 27 сіп ма! сіп ге сіп сіп б5ег сіу 5ег сій Ге маЇ Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз Мет 5ег Су5 Гуз АЇа бек сіу туг Тйг РМПе тТиг 5ег туг 20 25 30 тукг Пе ніх Тер ма! Гуз сп Агд Рго су сЇп сІу гГеи сіи Тгр Пе 35 40 45 су тер ІІе Тер Рго сіу Азр сіу б5ег Тпг Гуз Ттуг А5Зп си Агуд Ре 50 55 60
Гуз сіу Гуз ТИг о тигогГеи Тиг Аїа А5р Гуз 5ег 5ег 5ег Тг АїЇа туг 65 70 75 80 мес Ре Ге 5ег б5ег гей Тиг о б5ег сі Азр 5ег АЇїа ма! туг Ре су 85 90 95 Аїа бег Рго Мет І1е Тийг Рго А5п Туг АЇа Меї дор Туг Тгр с1у сп 100 105 110 с1у АЇїа б5ег ма! тиг омаї 5ег б5ег АЇа б5ег Тиг Гуз сіу Рго 5ег Умаї 115 120 125
Зо
Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег ТИг 5ег су сіу ТНг Аїа Аїа 130 135 140
Гей сіу Сузх Ге ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сі Рго ма! тТиг ма! 5ег 145 150 155 160
Тер А5п о б5ег с1у АїЇа Ге Тийг о5ег сіу ма! нНі5 Тийг Ріе Рго Аїа маї 165 170 175 ей сіп бег бек с1у Геи Туг бек Ге 5ег 5ег ма! ма! тиг о маї Рго 180 185 190 5ег б5ег 5ег ей сіу Тийг о сіп Тийг отуг те Су5 Азп маїЇ Азбтп Ні уз 195 200 205
Рго 5ег А5п ТИйгогГуз ма! А5р Гуз Агуд ма! сі Рго Гуз 5ег сСуз др 210 215 220
Гуз ТВг ні Тс Суб Рго Рго Су5 Рго АїЇа Рго сіи Геи Гей сІіу сС1У 225 230 235 240
Рго 5ег ма! Ре Ге РПе РгО РГО Гуз Рго Гуз АЗзр ТИг Гей Мет Пе 245 250 255 зег Агуд ТигоРгГоО сіи ма! Тйкг сСуз ма! ма! ма! Азр маї 5ег ні си 260 265 270
Азр Рго сіи МмаЇ Гуз Ре А5п Тгр Ттуг ма! Азр сіу маїЇ сіи маї ні 275 280 285 (516)
А5п АЇа Гуз Тиг Гуз Рго Агуд сії сій сбіп Туг АЗп 5ег о Тйг туг Ага 290 295 з00 ма! ма! 5ег маїЇ Ге тиг маї Гей Ні сіп Азр Тер Гей А5Зп СУ Гуз 65 305 310 315 320 сі тує Гуз Суз Гуз МмаЇ 5ег Азп Гуз АїЇа Ге Рго АЇа Рго ІЇе СсЇи 325 330 335 70 Гуз Тийг ІЇе б5ег Гуз АЇа Гуз сіу сп Рго Агд сіи Рго сіп ма! туг
340 345 350
Тк ге Рго Рго бег Агуд сім сіи Меє Тийг Гуз Азп сіп ма! 5ег геи 355 360 365
Тиг осСуз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр ІЇе АЇїа ма! си тер 370 375 380 сі бег Ад5п сіу сіп Рго сій А5п Ап о Туг Гуз ТВг о тТАг Рго РГгО Ммаї 385 390 395 400
Гей А5р б5ег А5Зр сіу б5ег Ре Ре їеи Туг 5ег губ Ге Тиг ма! дор 405 410 415
Гуз 5ег Агуд Тер сп сіп сіу Азп ма! Ре 5ег Суз5 б5ег ма! Мет нів 420 425 430 сій АЇїа Гей Ні А5п Ні Туг Тйг о сіп Гуз 5ег їеи 5ег Гей 5ег РгГО 435 440 445 с1у «2105» 28 «2115 214 «2125 РЕТ «2135 актітісіа!
Зо «220» «223» с208г2, ТіднеЕ спаїп, Ти11 Тепдей «400» 28
А5р ІчІЇе сіп Мет Тис о сіп Ттийг о тТвг б5ег б5ег Гей 5ег АЇа 5ег гей с1у 1 5 10 15
А5Зр Агуд Ма! тиг о чІЇе бек сСу5 Аг АЇїа 5ег сіп Азр ІЇе 5ег Гуз туг 20 25 30
Гей Азп Тер Туг сіп сіп сіп Рго А5р сіу тс пе уз Гей їеи Пе 35 40 45 тТукг туг Тийг 5ег Агуд Ге Ні 5ег сіу ма! Рго 5ег Агуд Ре 5ег О1У 60
Агд сіу б5ег с1у Тйг А5р Туг б5ег Ге Тийг ІЇе 5ег Азп ма! си сп 65 70 75 80 50 сій Азр чІІ1е АЇїа Тйг о Туг Ре Су5з сіп сіп сіу б5ег Тйг Гей Рго Ттуг 85 90 95
Тк Ре су сіу сіу тиг Гуз Ге сій ІчІЇе Гуз Агд тиг ма! Аїа Аїа 100 105 110 55
Рго 5ег ма! Ре ІІе РПе Рго Рго 5ег Азр сіи сіп Ге Гуз 5ег С1У 115 120 125
Тк АТа 5ег ма! ма! суз Ге Ге А5п АЗп РіПе Туг Рго Аг сіи Аїа бо 130 135 140
Гуз ма! сіп тер Гуз маїЇ А5зр Аозп АЇа Гей сіп б5ег сіу Азп 5ег сп 145 150 155 160 65 сій 5ег ма! тк сій сіп д5р бег Гуз А5Зр 5ег ТИг Туг 5ег Геи 5ег 165 170 175 5ег ТИг Ге Тийг Ге б5ег їуз АЇа Азр Туг сій Гу5 Ні Гуз Мма!ї туг 180 185 190 70
АТїа Субз сіи ма! тис о ні5 сіп сіу Гей б5ег б5ег Рго Ма! Ттиг Гуз 5ег 195 200 205
Ре А5п Агу сіу си сСуз 210 «2105» 29 «2115 214 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» с212А11, Тідне снаїп, Ти11 Тепдей «400» 29
Азр ІІе сіп Меє тйг осіп тйг тег 5ег о б5ег гей 5ег Аа 5ег Гей сі1у 1 5 10 15
А5Зр Агуд Ма! тиг о чІЇе бек сСу5 Агу АЇїа 5ег сіп А5р ІЇе д5п Гуз туг 20 25 30
Гей Азп Тер Туг сіп сіп сіп Рго А5р о сіу тег маї Гуз Гей їГеи Пе 35 40 45 тТукг туг Тийг 5ег Агуд Ге Ні 5ег сіу ма! Рго 5ег Агуд Ре 5ег О1У 50 55 60
Агд сіу б5ег сіу ТПг Азр Ттуг 5ег Гей Тпг ІЇе 5ег А5п гей си сп 65 70 75 80 сій А5р ч1Іе АЇїа тТийг отуг Ре Су5 сіп сіп сіу б5ег Ттиг Гей Рго туг 85 90 95
Тк Ре су сіу сіу тиг Гуз Ге сій ІчІЇе Гуз Агд тиг ма! Аїа Аїа 100 105 110
Рго 5ег ма! Ре ІІе РПе Рго Рго 5ег Азр сіи сіп Ге Гуз 5ег С1У 115 120 125
Тк АТа 5ег ма! ма! суз Ге Ге А5Зп АЗп РіПе Туг Рго Агд сіи Аїа 130 135 140
Гуз ма! сіп Тер Гуз ма! дор А5п АЇа ге сіп б5ег с1іу А5зп 5ег сІп 145 150 155 160 сій 5ег ма! тийг сій сіп др б5ег уз Азр 5ег Тиг Туг 5ег їеи 5ег 165 170 175 5ег ТИг Ге Тийг Ге б5ег їуз АЇа Азр Туг сій Гу5 Ні Гуз ма!ї туг 180 185 190 АЇа Су5 сіи Ма! Тийг Ні сіп сіу Гей бег бег Рго Ма! Ттиг Гуз 5ег 195 200 205
Ре А5п Агу сіу си сСуз 210 (516) «2105» 30 «2115 214 «2125 РЕТ 65 «2135» атітісіа! «220» «223» с214єг8, Тідне спаїп, Ти11 Тепдей 70 «4005» 30
Азр ІІе сіп Меє тТйг осіп тйг тег 5ег о б5ег гей 5ег Аа 5ег Гей сіу 1 5 10 15 А5Зр Агуд Ма! тТиг Ре 5ег сСу5 Агу АЇа 5ег сіп А5р ІЇе 5ег Гуз туг 20 25 30
Гей Азп Тер Туг сіп сіп сіп Рго А5р сіу тс пе уз Гей їеи Пе 35 40 45 тТукг туг Тийг 5ег Агуд Ге Ні 5ег сіу ма! Рго 5ег Агуд Ре 5ег О1У 50 55 60
Агд сіу 5ег со1у Тйг А5р Туг 5ег ем Тийг ІЇе тНг Ап Геми си сп 65 70 75 80 сій А5р че АЇїа тТийг о туг Ріпе Суб сіп сіп сіу 5ег АЇа Гей Рго туг 85 90 95
Тс Ре су сіу сіу тиг Гуз Ге сіи ІчІЇе Гуз Агуд тйг ма! Аїа Аїа 100 105 110
Рго 5ег ма! Ре ІІе РПе Рго Рго 5ег Азр сіи сіп Ге Гуз 5ег С1У 115 120 125
Тк АТа 5ег ма! ма! суз Ге Ге А5п АЗп РіПе Туг Рго Аг сіи Аїа 130 135 140
Гуз ма! сіп Тер Гуз маїЇ А5Зр Аозп АЇа Гей сіп 5ег сіу Азп 5ег сп 145 150 155 160 сій 5ег ма! тийг сій сіп др б5ег уз Азр 5ег Тиг Туг 5ег ем 5ег 165 170 175 5зег ТИг Ге Ттийг о Ге бек їу5 Аїа А5р Туг сіи губ Ні Гуз ма! туг 180 185 190
АТїа Субз сіи ма! тис о ні5 сіп сіу Гей б5ег б5ег Рго ма! Ттиг Гуз 5ег 195 200 205
Ре А5Зп Агу сіу си сСуз 210 «210» 31 «2115 214 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» с21906, ТіднеЕ спаїп, Ти11 Тепдей «400» 31 А5зр ІчІЇе сіп Метст Тис о сіп Ттиг о Тг б5ег б5ег Гей 5ег АЇа 5ег гей с1у 1 5 10 15
А5Зр Агуд Ма! тиг о чІЇе бек сСу5 Аг АЇїа 5ег сіп А5р ІЇе 5ег Гуз тТуг 20 25 30 (516)
Гей Азп Тер Туг сіп сіп сіп Рго А5р о сіу тег маї Гуз Гей їГеи Пе 35 40 45 тТукг туг Тийг 5ег Агуд Ге Ні 5ег сіу ма! Рго 5ег Агуд Ре 5ег су 65 50 55 60
Агд сіу 5ег со1у Тйг Ар Туг 5ег Ге Тиг ІЇе 5ег А5Зп Геи си сп 65 70 75 80 70 си А5р ч11е Аїа тийг о туг РПе Су5 сіп сіп сіу б5ег Тиг Гей Рго Ттуг
85 90 95
Тк Ре су сіу сіу тиг Гуз Ге сій ІчІЇе Гуз Агд тиг ма! Аїа Аїа 100 105 110
Рго 5ег ма! Ре ІІе РПе Рго Рго 5ег А5р сім сіп Ге Гуз 5ег сі1у 115 120 125
Тк АТа 5ег ма! ма! Ссуз Ге Ге А5п АЗп РіПе Туг Рго Аг сіи Аїа 130 135 140
Гуз ма! сіп Тер Гуз маїЇ А5Зр Аозп АЇа Гей сіп 5ег сіу Азп 5ег сп 145 150 155 160 сі бег ма! тиг сім сіп А5р 5ег Гуз А5р б5ег ТиИг Туг 5ег їеи 5ег 165 170 175 5ег ТИг Ге Тийг Ге б5ег уз АЇа А5р Туг сіи Гуз Ні Гуз ма!ї туг 180 185 190
АТїа Субз сіи ма! тис о ні5 сіп сіу Гей б5ег б5ег Рго Ма! Ттиг Гуз 5ег 195 200 205
Ре А5Зп Агу сіу соЇи сСуз 210 «2105» 32 «2115 214
Зо «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» с213810, Тідне снаїп, Ти11 Тепдей «4005 32
Азр ІІе сіп Меє тТйг осіп тйг тег 5ег о б5ег гей 5ег Аа 5ег Гей сіу 1 5 10 15
А5Зр Агуд Ма! тиг о чІЇе бек сСу5 Аг АЇїа 5ег сіп А5р ІЇе 5ег Гуз туг 20 25 30
Гей А5п Тер Туг сп сіп сіп Рго Азр су Тс Іч1Їе їу5 Ге Ге Пе 35 40 45 тТукг туг Тийг 5ег Агуд Ге Ні 5ег сіу ма! Рго 5ег Агуд Ре 5ег О1У 60 50
Агд сіу 5ег со1у Тйг Ар Туг 5ег Ге Тийг ІЇе тНг Ап Геми си сп 65 70 75 80 55 сім Азр чІІе АЇа Ттйг туг Ре Суз сіп сіп ос1у 5ег АїЇа гей Рго Ттуг 85 90 95
Тк Ре су сіу сіу тиг Гуз Ге сій ІчІЇе Гуз Агд тиг ма! Аїа Аїа 100 105 110 (516)
Рго 5ег ма! Ре ІІе РПе Рго Рго 5ег Азр сіи сіп Ге Гуз 5ег С1У 115 120 125
Тк АТа 5ег ма! ма! Ссуз Ге Ге А5п АЗп РіПе Туг Рго Аг сіи Аїа 65 130 135 140
Гуз ма! сіп Тер Гуз маїЇ А5Зр Аозп АЇа Гей сіп 5ег сіу Азп 5ег сп 145 150 155 160 70 сій 5ег ма! тийг сій сіп др б5ег уз Азр 5ег Тиг Туг 5ег їеи 5ег 165 170 175 5ег ТИг Ге Тийг Ге б5ег їуз АЇа Азр Туг сій Гу5 Ні Гуз ма!ї туг 180 185 190
АТїа Субз сіи ма! тис о ні5 сіп сіу Гей б5ег б5ег Рго Ма! Ттиг Гуз 5ег 195 200 205
Ре А5п Агу сіу си сСуз 210 «2105» 33 «2115» 120 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» п2208Рг2 (маг.1) Неаму сНаїп, мн «4005 33 сіп ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу АЇа сіи ма! Гу5 Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз маЇ 5ег Су5 Гуз АЇа бек сіу туг Тйг РМПе тТиг 5ег туг 20 25 30 тТуг меє ніх Тгр маїЇ Агуд сіп Аїа Рго сіу сіп с1у Ге сім тер мес сСІіу т1ІЇе ІІе Тер Рго сіу А5р сіу 5ег Тийг 5ег Ттуг АЇа сіп Гуз РНе 60 35 сіп сіу Агуд ма! тийг мес тйг о Агу Ар о тТиг об5ег Тис о бег тис ма! туг 65 70 75 80 40 Меє сій Ге 5ег 5ег Гей Агуд 5ег сій А5р Тийг Аїа ма! Туг туг су 85 90 95
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг Рго АЗзп Туг АЇїа мет А5р Ттуг Тер с1у сіп 100 105 110 45 сіу тйг Ге ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 50 «2105» 34 «2115 120 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! 55 «220» «223» п2208Е2 (маг. 3), МН «4005» 34 60 сі1п ма! сіп Гей ма! сіп 5ег сіу АТа сіи ма! Гуз Гу5 Рго Оо1у АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз Мет 5ег Су5 Гуз АЇа бек сіу туг Тйг РМПе тТиг 5ег туг 20 25 30 65 туг Пе туг тер маї Гуз сіп АЇа Рго СсСІу сіп сіу гей сіи Тер Гей 35 40 45 сіу Тер т1Іе Тер Рго сіу А5р сіу 5ег ТИг Гуз туг А5зп си Гуз РНе 70 50 55 60 сіп с1у Агуд ма! тийгогеи Ттйг Аїа А5р Гуз 5ег бег Ап Ттиг Аа туг 65 70 75 80
Мет Рпе Ге 5ег 5ег Гей Агуд 5ег сі А5зр Тйг АТа ма! Туг РПе су 85 90 95
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа Меє дор туг Тгр с1у сіп 100 105 110 сіу тйг Ге ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 «2105» 35 «2115 107 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» п2208Е2 (маг. 13, мІ «4005 35 А5зр ІІе сіп Мет Тис о сіп 5ег Рго 5ег 5ег Геу 5ег АЇа 5ег ма! ос1у 1 5 10 15
А5Зр Агуд ма! тиг оче Тиск сСу5 Аг Аїа 5ег сіп А5р ІЇе 5ег Гуз тТуг 20 25 30
Зо
Гей Азп Тер Туг сп сіп Гуз Рго сІу Гуз АїЇа Рго Гуз Гей їГеи Пе тТуг туг ТИг 5ег бек Ге сіп 5ег сіу ма! Рго 5ег Агуд Ре 5ег су 35 50 55 60 5ег сіу 5ег сіу ТИг А5р Ре Тиг Гей Тиг ІЇе 5ег 5ег їеи сіп Рго 65 70 75 80 40 сій Ар Ре діа Тийг туго туг Суз сіп сіп сіу 5ег Тийг о Геи Рго туг 85 90 95
Тис Ре сіу сІу сіу тйг Гуз ма! сіи че Гуз 100 105 45 «2105» 36 «2115 107 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» п2208Е2 (масг.3), МІ «4005» 36
Азр ІІе сіп Меє тТийг осіп 5ег Рго 5ег 5ег Ге 5ег АЇа 5ег маї сіу 1 5 10 15 60 А5зр Ага ма! Тис ІЇе 5ег су5з Агуд Аїа 5ег сіп Азр ІЇе 5ег Гуз Туг 20 25 30
Гей Азп Тер Туг сп сіп Гуз Рго сІу Гуз АїЇа Рго Гуз Гей їГеи Пе 35 40 45 65 тТукг туг Тийг 5ег Агуд Ге Ні 5ег сіу ма! Рго 5ег Агуд Ре 5ег О1У 50 55 60
Агд сіу б5ег с1у Тйг Ар Туг б5ег Ге Тийг ІЇе 5ег А5Зп Гей сіп РгОо 70 (65 70 75 80 сі А5р Ре АЇїа Ттийг о туг Ре Су5 сіп сіп сіу б5ег Ттиг Гей Рго туг 85 90 95
Тс Ре су су сіу тик Гуз ма! сім Іе Гуз 100 105 «2105» 37 «211» 449 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» 22082 (маг. 1), Пеаму спаїп, Ти11 Тепдтй «4005 37 сіп ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу АЇа сіи ма! Гу5 Гуз Рго сІу АїЇа го 1 5 10 15 5зег ма! Гуз ма!Ї 5ег Су5 Гуз АЇа бек сіу туг Тйг РМПе тТиг 5ег туг 25 тукг мет ніх Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу сіп сіу гГеи сіи Ттгр мес сСіу т1Їе ІІе Тер Рго сіу А5р сіу 5ег Тийг 5ег Туг АЇа сіп Гуз РНе
Ко) 50 55 60 сіп сіу Агуд ма! тийг мес тйг о Агу АЗр о тиг об5ег тис обег о тиг ма! туг 65 70 75 80 35 Метс сій Ге 5ег 5ег Гей Агуд 5ег сій А5р Тийг Аїа ма! Туг туг су 85 90 95
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа Меє дор туг Тгр с1у сіп 100 105 110 40 сіу тйг Гей ма! тиг омМмаї 5ег б5ег АЇа б5ег Тиг Гуз сіу Рго 5ег маї 115 120 125
Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег ТИг 5ег су сіу ТНг Аїа Аїа 45 130 135 140
Гей сіу Суз Ге ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сі Рго ма! тТиг ма! 5ег 145 150 155 160
Тер Азп б5ег с1іу Аїа Гей Тийг о б5ег сіу ма! нНі5 Тийг РМпе Рго АїЇа маї 165 170 175 ей сіп 5ег 5ег сіу Гей Ттуг б5ег Ге б5ег 5ег ма! ма! тик ма! Рго 180 185 190 5ег б5ег 5ег ей сіу Тийг о сіп Тийг отуг те Су5 А5зп маїЇ Азбтп Ні уз 195 200 205
Рго б5ег А5п ТИйгогГуз ма! А5зр Гуз Агуд ма! сі Рго Гуз 5ег сСуз др бо 210 215 220
Гуз Тс ні Тс Суб Рго Рго Су5 Рго АїЇа Рго сіи гГеи Гей сІіу СТУ 225 230 235 240 65 Рго бег ма! Ре Ге Ре Рго Рго Гуз Рго Гуз Азр ТИг Ге Мет Пе 245 250 255 зег Агуд ТигоРгГо сіи ма! Тк сСуз ма! ма! ма! Азр маї 5ег ні си 260 265 270 70
Азр Рго сіи МмаЇ Гуз Ре А5п Тгр Ттуг ма! Азр сіу маїЇ сіи маї ні 275 280 285
А5п АЇа Гуз Тиг Гуз Рго Агуд сої сій сбіп Ттуг АЗп 5ег о ТАйг Ттуг Агд 290 295 з00 ма! ма! 5ег маїЇ Ге тиг маї Гей Ні сіп Азр Тер Гей А5Зп СУ Гуз 305 310 315 320 сі тТуг Гуз Суз Гуз МаїЇ 5ег Азп Гуз АїЇа Ге Рго АЇа Рго ІЇе Си 325 330 335
Гуз Тийг ІЇе бек Гуз АЇа Гуз сіу сп Рго Агд сіи Рго сіп ма! туг 340 345 350
Тк ге Рго Рго бег Агуд сім сіи Меє Тийг Гуз Азп сіп ма! 5ег Геи 355 360 365
Тис сСуз Ге ма! Гуз с1у Ре Туг Рго 5ег А5р ІЇе АїЇа ма! сіи тер 370 375 380 сіи 5ег АЗп сіу сіп Рго сій Ап АбЗп о Туг Гуз Тс о тТВг Рго Рго маї 385 390 395 400
Гей А5р б5ег А5Зр сіу б5ег Ре Ре їеи Туг 5ег губ Ге Тиг ма! А5р 405 410 415
Гуз 5ег Агуд Тер сп сіп сіу Азп Ма! Ре 5ег Су5 б5ег ма! Мет нів 420 425 430 сій АЇїа Гей Ні Азп Ні Туг Тс сіп Гуз 5ег їеи 5ег гей 5ег РгО 435 440 445 с1у «2105» 38 «2115» 449 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» 22082 (маг.3), Пеаму спаїп Ти11 Тепден «4005 38 сіп ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу АЇа сіи ма! Гу5 Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз Мет 5ег Су5 Гуз АЇа бек сіу туг Тйг РМПе тТиг 5ег туг 20 25 30 туг Ше туг тер маї Гуз сіп АЇа Рго сСІу сіп сІу Гей сіи Тер Ге 35 40 45 сіу Тер т1Іе Тер Рго сіу А5р сіу 5ег ТИг Гуз туг А5зп си Гуз РНе 50 55 60 60 сіп с1у Агуд маї тТийгогГеи Ттийг Аїа А5р Гуз 5ег 5ег Ап ТИг Аа туг 65 70 75 80
Мес Ре їеи бег б5ег Ге Агд бег сі Азр Тйг Аїа ма! туг РНе су 85 90 95 65
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа мет А5р туг Тгр с1у сіп 100 105 110 сіу тйг Гей ма! тиг омМмаї 5ег б5ег АЇа б5ег Тиг Гуз сіу Рго 5ег маї 70 115 120 125
Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег ТИг 5ег сіу сіу ТНг Аїа Аїа 130 135 140
Ге сіу Суз Гей ма! Гуз А5р Туг Ре Рго сіи Рго ма! тНг ма! 5ег 145 150 155 160
Тер АЗп о б5ег сІ1у АїЇа Гей Тийг о5ег сіу ма! нНі5 Тийг Ріе Рго Аїа маї 165 170 175 ей сіп 5ег 5ег сіу Гей Ттуг б5ег Ге б5ег 5ег ма! ма! тик ма! Рго 180 185 190 5ег б5ег 5ег ей сіу Тийг о сіп Тийг отуг те Су5 А5зп маїЇ Азбтп Ні уз 195 200 205
Рго б5ег А5п ТИйгогГуз ма! А5зр Гуз Агуд ма! сі Рго Гу5 5ег сСуз др 210 215 220
Гуз Тийг Ні тк Су Рго Рго Су5 Рго АїЇа Рго сЇіи Гей Ге сТу с1уУ 225 230 235 240
Рго 5ег ма! Ре Ге Ре РгО РГО Гуз Рго Гуз АЗзр ТИг Гей Мет Пе 245 250 255 зег Агуд ТигоРгГо сіи ма! Тк сСуз ма! ма! ма! Азр маї 5ег ні си 260 265 270
Азр Рго сіи МмаЇ Гуз Ре А5п Тер туг ма! Азр сіу маї сіи маї ні 275 280 285
А5п АЇа Гуз ТИг Гуз Рго Агуд сої сій сбіп Ттуг АЗп 5ег ТАйг Ттуг Агд 290 295 з00 ма! ма! 5ег ма! Ге тиг маї Ге ні сіп А5р Тер Геи А5Зп су Гуз 305 310 315 320 сі тТуг Гуз Суз Гуз МаїЇ 5ег Азп Гуз АїЇа Ге Рго АЇа Рго ІЇе Си 325 330 335
Гуз Тийг ІЇе бек Гуз АЇа Гуз сіу сп Рго Агд сіи Рго сіп ма! туг 340 345 350
Тк ге Рго Рго бег Агуд сім сіи Меє Тийг Гуз Азп сіп ма! 5ег Геи 355 360 365
ТВг осСуз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр ІЇе АЇїа ма! си тер 370 375 380 сіи бег А5п сіу сіп Рго сій А5п Ап о Туг Гуз ТВг о тТАг Рго РГгГО маї 385 390 395 400
Гей А5р б5ег А5Зр сіу б5ег Ре Ре їеи Туг 5ег губ Ге Тиг ма! дор 405 410 415
Гуз 5ег Агуд Тер сп сіп сіу Азп Ма! Ре 5ег Су5 б5ег ма! Мет нів 420 425 430 сій АЇїа Гей Ні А5п Ні Туг Тс о сіп Гуз 5ег їеи 5ег Гей 5ег РгО бо 435 440 445 чу 65 «210» 39 «2115 214 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! 70 «220»
«223» 22082 (маг. 13, Тідне спаїп, Ти11 Тепдтй «4005 39 А5Зр ІЇе сіп Мет тТийг о сіп бег Рго 5ег 5ег їеи 5ег АЇа 5ег ма! с1у 1 5 10 15
А5Зр Агуд Ма! тиг о ч1Те Тиск сСу5 Агу АЇїа 5ег сіп А5р ІЇе 5ег Гуз туг 20 25 30
Гей Азп Тер Туг сп сіп Гуз Рго сІу Гуз АїЇа Рго Гуз Гей їГеи Пе 35 40 45 тТуг туг ТИг 5ег бек Ге сіп 5ег сіу ма! Рго 5ег Агуд Ре 5ег О1У 50 55 60 5ег сіу 5ег сіу ТИг А5р Ре Тиг Гей Тиг ІЇе 5ег 5ег їеи сіп Рго 65 70 75 80 си А5зр Ре Аіа Тийг о туг туг Суз сіп сіп с1у б5ег Ттйг Гей Рго Ттуг 85 90 95
Тк Ре сіу сіу сіу тийг Гуз ма! сій ІчІЇе Гуз Агд тйг ма! Аїа Аїа 100 105 110
Рго 5ег ма! Ре ІІе РПе Рго Рго 5ег Азр сіи сіп Ге Гуз 5ег С1У 115 120 125
Тк АТа 5ег ма! ма! суз Ге Ге А5п АЗп РіПе Туг Рго Аг сіи Аїа 130 135 140
Гуз ма! сіп Тер Гуз маїЇ А5Зр Аозп АЇа Гей сіп 5ег сіу Азп 5ег сп 145 150 155 160 сій бег ма! тиг осі сіп А5р б5ег Гуз А5зр б5ег ТИг Туг 5ег їеи 5ег 165 170 175 5ег ТИг Ге Тийг Ге б5ег їуз АЇа Азр Туг сій Гу5 Ні Гуз Мма!ї туг 180 185 190
АТїа Субз сіи ма! тис о ні5 сіп сіу Гей б5ег б5ег Рго ма! Тиг Гуз 5ег 195 200 205
Ре А5Зп Агу сіу си сСуз 210 «2105» 40 «2115 214 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» п2208г2 (маг.3), Тідне спаїп, Ти11 Тепдей «400» 40
Азр ІІе сіп Меє тТийг осіп 5ег Рго 5ег 5ег Ге 5ег АЇа 5ег маї сіу 1 5 10 15 (516)
А5Зр Агуд Ма! тиг о чІЇе бек сСу5 Аг АЇїа 5ег сіп А5р ІЇе 5ег Гуз туг 20 25 30
Гей Азп Тер Туг сп сіп Гуз Рго сІу Гуз АїЇа Рго Гуз Гей їГеи Пе 65 35 40 45 тТукг туг Тийг 5ег Агуд Ге Ні 5ег сіу ма! Рго 5ег Агуд Ре 5ег О1У 50 55 60 70 Агуд с1у 5ег сіу ТиИг Ар тТуг 5ег Ге Тиг ІЇе 5ег А5п Ге сп Рго
65 70 75 80 сі А5р Ре АЇїа Ттийг о туг Ре Су5 сіп сіп сіу б5ег Ттиг Гей Рго туг 85 90 95
Тк Ре сіу сіу сіу тийг Гуз ма! сій ІчІЇе Гуз Агд тйг ма! Аїа Аїа 100 105 110
Рго 5ег ма! Ре ІІе РПе Рго Рго 5ег Азр сіи сіп Ге Гуз 5ег С1У 115 120 125
Тк АТа 5ег ма! ма! Ссуз Ге Ге А5п АЗп РіПе Туг Рго Аг сіи Аїа 130 135 140
Гуз ма! сіп Тер Гуз ма! дор А5п АЇа ге сіп б5ег с1іу А5зп 5ег сІп 145 150 155 160 сій 5ег ма! тийг сій сіп др б5ег уз Азр 5ег Тиг Туг 5ег їеи 5ег 165 170 175 5ег ТИг Ге Тийг Ге б5ег їуз АЇа Азр Туг сій Гу5 Ні Гуз ма!ї туг 180 185 190
АТїа Субз сіи ма! тис о ні5 сіп сіу Гей б5ег б5ег Рго ма! Ттиг Гуз 5ег 195 200 205
Ре А5Зп Агу сіу си сСуз 210
Зо «210» 41 «2115 120 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» п2208Р2 (маг.2) НПеаму сНаїп, Мн «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (203..(20) «223» Мет тау Бе геріасей Бу маї «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (34)..(34) «223» ІІе тау Бе геріасей Бу мес «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (35)..(35) «223» Ттуг тау Бе геріасей Бу нів «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (38)..(38) «223» Гуз тау Бе геріасей Бу Ага «220» 60 «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (483..(48) «223» Гей тау Бе геріасей Бу мес «220» 65 «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (503..(50) «223» Тгр тау Бе геріасей Бу Пе «220» 70 «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ
«222» (593)3..(59) «223» Гуз тау Бе геріасей Бу 5ег «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (61)..(61) «223» Азп тау Бе геріасей Бу Аїа «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (62)..(62) «223» сіи тау Бе геріасей Бу сіп «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (703..(70) «223» Гей тау Бе геріасей Бу мес «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (72)..(72) «223» Аа тау Бе геріасей Бу Ага «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (74)3..(74) «223» Гуз тау Бе геріасей Бу тис «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (76)..(76) «223» бег тау Бе геріасей Бу тис «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (77)..(077) «223» Азп тау Бе геріасей Бу 5ег «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (793..(79) «223» Аа тау Бе геріасей Бу маї «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (82)..(82) «223» Ре тау Бе геріасей Бу си «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (95)..(95) «223» Ре тау Бе геріасей Бу туг «400» 41 сіп ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу АЇа сіи ма! Гу5 Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз Мет 5ег Су5 Гуз АЇа бек сіу туг ТИг РМПе тТиг 5ег туг бо 20 25 30 туг Пе туг тер маї Гуз сіп АЇа Рго СсСІу сіп сіу гей сіи Тер Гей 35 40 45 65 с1у тер І11е Тер Рго сіу д5р сіу б5ег Тиг Гуз Туг А5зп си Гуз РПе 50 55 60 сіп с1у Агуд ма! тийгогеи Ттйг Аїа А5р Гуз 5ег бег Ап Ттиг Аа туг 65 70 75 80 70
Мес Ре їеи бег б5ег Ге Агд бег сі Азр Тйг Аїа ма! туг РНе су 85 90 95
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа Меє дор Ттуг Тгр с1у сіп 100 105 110 сіу тйг Ге ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 «2105» 42 «2115 107 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» 22082 (маг. 2), Т1дне свати, мі. «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (22)..(22) «223» бег тау Бе геріасей Бу тНг «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (53)..(53) «223» Агуд тау Бе геріасей Бу 5ег
Зо «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (55)..(55) «223» Ні тау Бе геріасей Бу сіп «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (65)..(65) «223» Агуд тау Бе геріасей Бу 5ег «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (713..(713 «223» Ттуг тау Бе геріасей Бу Ре «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (72)..(72) «223» бег тау Бе геріасей Бу тис «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (77)..(077) «223» Азп тау Бе геріасей Бу 5ег «220» «221» МІ5С ЕБГЕАТИОКЕ «222» (87)..(87) «223» Ре тау Бе геріасей Бу туг 60 «4005 42
Азр ІІе сіп Меє тТийг осіп 5ег Рго 5ег 5ег Ге 5ег АЇа 5ег маї сіу 1 5 10 15 65 А5зр Ага Ма! Тис о ІЇе 5ег су5з Агуд Аїа 5ег сіп Азр ІЇе 5ег Гуз туг 20 25 30
Гей Азп Тер Туг сп сіп Гуз Рго сІу Гуз АїЇа Рго Гуз Гей їГеи Пе 35 40 45 70 тТукг туг Тийг 5ег Агуд Ге Ні 5ег сіу ма! Рго 5ег Агуд Ріпе 5ег су 50 55 60
Агд сіу б5ег с1у Тйг Ар Туг б5ег Ге Тийг ІЇе 5ег А5Зп Гей сіп РгОо 65 70 75 80 сі А5р Ре АЇїа Ттийг отуг Ре Су5 сіп сіп сіу бек Ттйг Гей Рго туг 85 90 95 тТВйг Ре сТу су сіу тпйг Гуз ма! сіи Іе Гуз 100 105 «2105» 43 «2115 329 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» Соп5тапт дотаїп (мн) Ідс1 «4005» 43
АТїа бек ТтиИг Гуз сіу Рго 5ег ма! Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 5ег Тиг 5ег сіу сіу ТНг АїЇа Аїа гей сІу Су5 Гей маїЇ Гуз Азр туг 20 25 30
Ре Рго сій Рго ма! тик ма! бек Тер Азп 5ег С1Уу АЇа Гей тЕг 5ег
Ко) 35 40 45 сіу ма! ні Тийг РМПе Рго АЇїа маЇ Ге сіп 5ег б5ег сіу Геи Туг 5ег 50 55 60 ей б5ег бег ма! Ма! тийг ма! Рго 5ег 5ег 5ег їеи сіу тНг сп тЕг 65 70 75 80 тукг шІІе Суб Азп мМмаЇ А5зп Ні Гуз Рго 5ег АЗзп ТИг Гуз маї А5р Гуз 85 90 95
Агд ма! си Рго Гуз бек Су5з А5р Гуз ТИг Ні тиг осСуз Рго Рго су 100 105 110
Рго АЇа Рго сіи Гей Гей сіу сіу Рго 5ег ма! Ре Геи Ре Рго РгО 115 120 125
Гуз Рго Гуз Азр ТИг о Геи Мет ІчІЇе 5ег Аг Тйг о Рго сіи Ма! тНг су 130 135 140 ма! ма! ма! А5р ма!їЇ 5екг Ні сім А5р Рго сіи ма! Гуз РПе А5п Тгр 145 150 155 160 тукг ма! А5зр сіу ма! си ма! ніх А5п АЇа Гуз Тийг Гуз Рго Аг си 165 170 175 сі сіп тТуг АбЗп о б5ег Тйг о тТуг Агуд ма! Ма! 5ег ма! гей тиг маї геи 180 185 190
Ні5 сіп Ар тер ге АбЗп сіу Гуз сій Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дп бо 195 200 205
Гуз АЇа Гей Рго АЇа Рго ІЇе сій Гуз Тийг ІЇе 5ег уз АїЇа Гуз СсС1У 210 215 220 65 сій Рго Агд сій Рго сіп Ма! Туг ТНг оГеи Рго Рго 5ег Агд сім си 225 230 235 240
Ммеє тийг Гуз АЗзп о сіп мМмаї 5ег гей Тйг о Суз Ге маїЇ Гуз сІіу Ре туг 245 250 255 70
Рго 5ег А5Зр ІЇе АЇа ма!їЇ сіи тер сіи 5ег А5Зп СІу сіп Рго Си А5П 260 265 270
Азпотуг Гуз Тс Тс о Рго Рго ма Гей А5р б5ег Ар сіу 5ег Ре РІе 275 280 285
Гей туг бек Гуз Ге Тийг ма! Азр Гуз 5ег Агд Тер сіп сп с1У А5П 290 295 з00 ма! Рійе 5ег сСу5 5ег ма! Мес ніх сій Аїа Гей Ні А5п Ні Туг тТиг 305 310 315 320 сіп Гуз 5ег Ге 5ег Гей 5ег Рго сі1у 325 «2105» 44 «2115 326 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» Соп5тапт дотаїп (МН) Ідос4 (5228Р) «4005» 44
Аїа бек тТиг Гуз сІіу Рго бек Ма! Ре Рго Гей АЇїа Рго Су5 5ег Агд 1 5 10 15 5зег ТИг о 5ег соЇи 5ег Тйг Аїа АТа ге сіу Су5з Гей ма! Гуз А5р туг 20 25 30
Ре Рго сій Рго ма! тик ма! бек Тер Азп 5ег С1Уу АЇа Гей тЕг 5ег 35 сіу ма! ні Тийг РМПе Рго АЇїа маЇ Ге сіп 5ег б5ег сіу Геи Туг 5ег 60
Ге 5ег б5ег ма! ма! тис ома!їЇ Рго 5ег 5ег 5ег їеи сіу Ттиг Гуз тиг 4065 70 75 80
Туг ТНг Суб АЗзп о маЇ А5Зр о Ні Гуз Рго 5ег АЗзп ТИг Гуз маї А5р Гуз 85 90 95 45 Агд ма! сіи б5ег о їуб5 Туг с1у Рго Рго Су5 Рго Рго Су Рго АїЇа РГгОо 100 105 110 сі Ре Гей сіу сіу Рго 5ег ма! Ре Гей Ре Рго Рго Гуз Рго Гуз 115 120 125 50
Азр Тс Ге Мет ІЇе бек Агуд Тиг о Рго сіи ма! тиг суз ма! маї ма! 130 135 140
Азр ма! 5ег сіп сі А5р Рго сіи маї сіп Ре А5п Тгр Ттуг маї дор 55 145 150 155 160 сІ1у ма! сіи маї Ні5 А5п АЇа Гуз Тиг Гуз Рго Агд сіи сЇи сіп Ре 165 170 175 60 Абзп об5ег Тйг оТуг Агуд ма! Ма! бек ма! Гей тиг ма! гей ніх сп др 180 185 190
Тер Гей Ап сіу Гуз сіи Туг Гуз Су5з Гуз ма! 5ег А5Зп Гуз СТУ Гей 195 200 205 65
Рго 5ег б5ег ІЇе сЇи Гуз Тийг ІЇе 5ег Гуз АЇа гу5 сіу сп Рго Ага 210 215 220 сі Рго сіп ма! Туг тис Гей Рго Рго 5ег сіп сіи сіи Ме тЕг Гуз 70225 230 235 240
Азп сіп ма! бек їеи Тиг Суз Гей мМмаїЇ Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег др 245 250 255 че АТа ма! сіи Тер сЇи 5ег д5п сіу сіп Рго сі А5п Ап туго Гуз 260 265 270
ТВг оТиг РКО Рго мМаЇ Ге Азр 5ег А5Зр сіу б5ег Ре Ре Гей Туг 5ег 275 280 285
Аг Гей тиг о маї дор Гуз б5ег Аг Тгр сіп сій с1у А5п Ма! РПе 5ег 290 295 00
Суз 5ег ма! мет ні5 сій АТа Гей Ні Азп Ні Туг Тйг сіп Гуз 5ег 305 310 315 320
Гей 5ег Гей 5ег Гей сі1у 325 «2105» 45 «2115 107 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» ротатїп Карра (МІ) «4005» 45
Зо
Агд Тис ома!ї АТа діа Рго бек ма! Ре ІЇе Ре Рго Рго 5ег А5р си 1 5 10 15 сіп ге Гуз 5ег сіу Тйг АТа 5ег ма! маї Суз Гей Ге А5Зп А5п Ре 20 25 30 туг Рго Агуд сім АЇїа Гуз ма! сіп Тер Гуз ма! А5р д5п Аа гей сп 35 40 45 5зег сіу Азп 5ег сіп сій бек ма! тйг сіи сіп А5р 5ег Гуз А5р 5ег 50 55 60
Тиг о туг б5ег Ге б5ег б5ег ТИг Ге Типг Ге 5ег уз АЇа А5р тТуг си 65 70 75 80
Гуз Ніз Гуз ма! туг Аїа Су5 сіи ма! тийг ніх сіп сіу Гей 5ег 5ег 85 90 95
Рго ма! Тиск Гуз 5ег Ре А5п Агу сіу си су 100 105 «210» 46 «2115 98 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» Нитап дегтіїпе ІСНМ1-46701 (516) «400» 46 сіп ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу АЇа сіи ма! Гу5 Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 65 5зег ма! Гуз маЇ 5ег Су5 Гуз АЇа бек сіу туг Тйг РМПе тТиг 5ег туг 20 25 30 тукг мет ніх Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу сіп сіу гГеи сіи Ттгр мес 70 35 40 45 сіу т1Іе ІЇїе А5п Рго 5ег сІіу сіу 5ег Тийг 5ег Туг АЇа сіп Гуз РНе 50 55 60 сіп сіу Агуд ма! тийг мес тйг о Агу АЗр о тиг об5ег тис обег о тиг ма! туг 65 70 75 80 мес сі їеи бек б5ег Ге Агд бег сі Азр Тйг АЇїа ма! туг туг суз 85 90 95
Аїа Агд «2105» 47 «2115 95 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» Нитап дегтіїпе ІсСКМ1-39701 «4005» 47 А5зр ІІе сіп Мет Тис о сіп 5ег Рго 5ег 5ег Геу 5ег АЇа 5ег ма! ос1у 1 5 10 15
А5Зр Агуд Ма! тиг о ч1Їе Тиск сСу5з Агуд Аїа 5ег сіп 5ег ІЇе 5ег 5ег туг 20 25 30
Зо
Гей Азп Тер Туг сп сіп Гуз Рго сІу Гуз АїЇа Рго Гуз Гей їГеи Пе туг АТа Аїа 5ег бек ге сіп 5ег сіу ма! Рго 5ег Агуд Ре 5ег О1У 35 50 55 60 5ег сіу 5ег сіу ТИг А5р Ре Тиг Гей Тиг ІЇе 5ег 5ег їеи сіп Рго 65 70 75 80 40 сі Ар Ре діа Тийг о туг туг Суз сіп сіп 5ег Туг 5ег Тис РГгО 85 90 95 «2105» 48 «2115 15 45 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» Нитап дегтіїпе ІСНО47"01 «400» 48 туг Ре Азр Туг Тгр сіу сіп сіу Тийг оїеи ма! тиг ма! 5ег 5ег 1 5 10 15 «2105» 49 «2115 12 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! (516) «220» «223» Нитап дегтіїпе ІСК24701 «4005» 49 65
Ге Тйг Ре сіу сІу сіу тиг Гуз ма! сіи ІЇе Гуз 1 5 10 70 «2105 50
«2115 1367 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» ІСЕ-1К (пПитап) «4005 «150
Меє уз 5ег сіу 5ег сіу сіу сіу б5ег Рго Тиг 5ег Геи Тгр су Ге 1 5 10 15
Ге Ре Геи 5ег АЇа АЇїа Гей 5екгїеи Тер Рго Тиг 5ег су сіи Іе 20 25 30 суз сІЇу Рго сіу Іїе д5р ІЇе Агуд Ап А5зр Туг сп сіп Геи Гуз Ага 35 40 45
Гей сі Азп Суз Тиг о маїЇ те сіи сіу туг Ге Ні5 ІЇе Гей їеи Іїе 50 55 60 5зег Гуз Аїа сій А5р Туг Агуд 5ег Туг Агдуд Ре Рго Гуз Геи ТЕг ма! 65 70 75 80
ІІе тиг сіи Ттуг Гей Гей Ге Ре Агд ма! АТа сІу гГеи сіи 5ег геи 85 90 95
О1Уу А5р Гей Ре Рго А5п Ге Тиг ма! ІЇе Агд сіу тгр Гуз Геми РПе 100 105 110
Зо туг Азп Туг Аїа Ге ма! ІЇїе Рпе сіи Мет ТНг А5п Гей Гуз А5р ІїЇє 115 120 125 о1Уу Геи Туг А5Зп Гей Аг А5Зп ІЇе Тиг Аг СсС1у АїЇа ІЇе Агд Пе си 130 135 140
Гуз АЗп АЇа А5Зр Гей Суз Туг Гей 5ег Тиг ма! Азр Тгр 5ег їеи Пе 145 150 155 160
Гей А5р Аїа ма! 5ег Ап АЗп Туг Іч1іе маї сіу Азп Гуз Рго Рго Гуз 165 170 175 сіи Суз с1у А5р Гей Суб Рго сіу Тийг мес сій сій Гуз Рго Мет су 180 185 190 сіи Гуз Тс Тс о ІЇе доп доп сій туго Азп Туг Агдуд Суз Тер тег тег 195 200 205 А5п Агуд Суз сіп Гуз Мет Суз Рго 5ег ТИпг Суз су Гуз Агд АїЇа су» 210 215 220
Тк оси Ап о АЗп сі Суз Суб5 Ні Рго сі Суз Ге сІу б5ег Су 5ег 225 230 235 240
АТїа Рго А5р АЗп др о Тйг АЇа Суз ма! АЇа Су5 Агу Ні Туг Туг туг 245 250 255
АТїа сіу ма! Суз ма! Рго АЇа Су5з Рго Рго А5зп ТИг туг Агд РПе си бо 260 265 270 с1у Тер Агдуд Суз ма! дор Аг Ар РПе сСуз АЇа Ап ІЇе Ге 5ег АїЇа 275 280 285 65 сіи 5ег б5ег А5р б5ег сіи сіу Рпе ма! Іїе ніх А5р сіу сЇи Суз Меє 290 295 з00 сіп сій Суз Рго б5ег сіу Ре ІЇе Агд Азп сіу б5ег сіп 5ег Мес туг 305 310 315 320 70 сСуз ІчІЇ1е Рго Су5з сі сіу Рго Суб Рго Гуз ма! Су5з сім сіи сіи Гуз 325 330 335
Гуз ТВгогГуз ТВг о ІІе Азр 5ег ма! тиг 5ег АїЇа сіп мет гей сіп сС1У 340 345 350 суз Тийг ІЇе Рпе Гуз с1у А5п Гей Геи ІЇе А5п ІЇе Агу Агд о1У А5П 355 360 365
А5п ІЇе Аїа 5ег сій Гей сій А5п Рпе Мет су гГеи ІЇе сіи ма! ма! 370 375 380
Тег о сТ1у туг ма! Гуз Іїе Агуд Ні бек Ні АЇїа Ге ма! 5ег геи 5ег 385 390 395 400
Ре Геи Гу5 Ап Гей Агд Геи ІЇе гГеи сТ1у сім сім сіп гГеи си сІ1у 405 410 415
Азп Ттуг 5ег РПпе Туг ма! гГеи А5Зр Азп сп Азп Гей сіп сіп Гей Тер 420 425 430
А5зр Тер Ар НІі5 Агу Ап оїеи Тиг ІЇе Гуз АїЇа сіу Гуз Меє Туг РНе 435 440 445 Аїа Ре А5п Рго Гу5 Гей Суз Ма! 5ег сіи ІІе туг Агд меє сіи си 450 455 460 ма! тик оТу тиг Гуз с1іу Агуд сЇп 5ег Гуз сіу А5р ІЇе доп ТИг Агд 465 470 475 480
Зо
А5п о А5п со1у сої Аг Аїа бек Суз сіи 5ег Ар Ма! Ге Ні РПе тТпг 485 490 495 5ег Тис о тиг о тиг о б5ег уз А5Зп Аг ІЇе ІЇе ІЇе тНг тгр Ні Агд туг 500 505 510
Аг Рго Рго Азр Туг Агуд Ар Ге ІІе 5ег Ріпе тТиг ма! Туг туг Гуз 515 520 525 сі Аїа Рго Рібе Гу5 Азп ма! тТийг сіи Туг Азр с1у сіп Азр АїЇа су» 530 535 540 сіу 5ег АЗп 5ег Тгр Азп Мет мМмаї Азр маїЇ А5р Гени Рго РгОо А5П Гуз 545 550 555 560
Азр ма! сім Рго сіу ІЇе Ге Гей Ні5 СІу Гей їу5 Рго Тгр ТНг сіІп 565 570 575 туг АТа ма! туг маїЇ Гуз АЇїа ма! тийг ге тиг Мет ма! сіи А5бп А5р 580 585 590
Ні ІЇе Агуд сО1Уу АЇа Гуз б5ег сЇи ІЇе Ге Туг ІІе Агд тйг А5п Аїа 595 600 605 5зег ма! Рго 5ег ІЇе Рго Гей Азр Ма! Геи б5ег АЇа 5ег А5зп 5ег 5ег 610 615 620 5ег сіп Ге ІЇе ма! Гуз Тер АЗзп РГгГО Рго 5ег їеи Рго А5п су А5П 625 630 635 640 (516)
Гей б5ег Туг Туг Іе ма! Агд Тер сп Агду сіп Рго сіп А5р су туг 645 650 655
Ге туг Агд Ні Ап Туг Суз бег Гуз Азр Гуз ІЇе Рго ІЇе Ага Гуз 65 660 665 670 туг АТа Азр сіу Тпйг ІЇе Азр ІЇе сій сіи ма! тйг си Азп РГгГО Гуз 675 680 685 70 те оїи маї Ссу5 сіу сі1у сіи Гуз с1у Рго Суз Су5з АЇа су Рго Гуз
690 695 700
Те ом АТа сіи Гуз сп АТа сіи Гуз сій сої Аїа сіи туг Аг Гуз 705 710 715 720 ма! Рпе си Азп Ре Гей Ні Азп 5ег ІЇе Ре ма! Рго Аг Рго си 725 730 735
Аг Гуз Агуд Агу Азр ма! мес сіп ма! АЇа Абп тТиг о тиг мет 5ег 5ег 740 745 750
Аг бек Агуд Ап о Тийг Тс Аа АТа дор тТйг о туг Абп о ІЇе ТИг дор РгО 755 760 765 си сій Гей сій Тйг осі Туб Рго РБе Ре сіи 5ег Агуд ма! А5р дп 770 775 780
Гуз сій Агуд Тс ма! ІЇе б5ег А5Зп Ге Аг Рго Ре Тийг Геи туг Ага (785 790 795 800 ч11е А5р ІЇе Ні5 5ег Суз АЗп Ні сій АЇа сій Гуз Ге сіу Су5 5ег 805 810 815 Аїа б5ег А5п Ре маЇ Ре Аїа Агуд Ттийг Меє рРго АЇа сіи сіу Аїа д5р 820 825 830
Азр ч11е Рго со1у Рго ма! Тийг тер сЇи Рго Агд Рго си А5п 5ег ІїЇе 835 840 845
Зо
Ре Геи Гуз Тер Рго сЇи Рго сЇи А5п РГО Ап сІУу Ге ІЇе Геи мет 850 855 860 Туг сії те Гуз Туг сІу 5ег сіп ма! сій Азр сп Агд сій сСуз маї 865 870 875 880 5ег Агд сп соЇи Туг Агд Гуз туг сІЇу сТ1у Аїа Гуз гГеи А5п Ага гГеи 885 890 895
АЗп о Рго со1у Азп Туг Тйг Аїа Агуд ІЇе сіп АЇїа тТийг 5ег Геу 5ег су 900 905 910
Азп сіу б5ег Тер Тйг о А5Зр Рго ма! Ре РіПе Туг ма! сіп АЇїа Гу5 тег 915 920 925 сіу туг си А5Зп Ріе ІЇеє Ні5 Гей ІЇе ІЇе АЇа гей Рго маї АїЇа ма! 930 935 940 ей Ге чІІе ма! сїу сіу Геи ма! Іїе мет Ге Туг ма! РНе НІі5 Ага 945 950 955 960
Гуз Аг А5п Ап о б5ег Аг Ге сіу Азп сІу ма! Гей туг Аїа 5ег маї 965 970 975
Азп о РгГоО сі Туг Ре 5ег АЇїа АЇїа Азр ма! туг ма! Рго А5р сіи Тер 980 985 990 сіи ма! Аїа Агуд сій Гуз ІІе Тк о Мес 5ег Ага сій Гей су сіп с1у бо 995 1000 1005 5зег Ре сіу Мет ма! туг сі сіу ма! Аїа Гуз сіу маї маї Гуз 1010 1015 1020 65 Ар сої Рго сій Тс Агуд маї Аа ч11е Гуз тТиг о маї д5п си Аїа 1025 1030 1035
Аїа бек Мет Агуд сім Агуд ч1Їе си Рібе Ге А5п сі Аїа 5ег маї 1040 1045 1050 70 мес Гуз сі Рпе Азп Суб Ні Ні ма!ї ма!ї Агд Ге Геи су ма! 1055 1060 1065 ма! 5екг сіп сіу сіп Рго Тйг о їеи ма! ч1іе Ме сі (ей мес тиг 1070 1075 1080
Агуд с1у А5ріеи уз б5ег Ттуг їеи Агуд бек гей Агд Рго сіи мех 1085 1090 1095 сій А5п о АЗп о РГО МаїЇ Ге АЇїа РГО Рго 5ег їец б5ег Туз Меє Пе 1100 1105 1110 сіп мес Аїа сІу сій ч1іе АЇїа зр сіу мМмеї АЇа туг їеи А5Зп АЇа 1115 1120 1125
А5зпогуз Ре ма! Ні Агуд А5р їеи АЇїа діа Агуд А5зп о Су Ме маї 1130 1135 1140
АТїа сій А5р Ре Тийг Ома! уз ІЇе сіу Ад5р РПе сіу Мек тиг Ага 1145 1150 1155
А5зр чІЇе тТуг сій Тийг др туго туг Агу Гуз сіу сіу уз су Ге 1160 1165 1170
Гей Рго ма! Агуд тгр Мет б5его Рго сіи б5ег ем Гуз А5р су ма! 1175 1180 1185
Рпе тТйго тийг отТуг б5ег А5р ма! Тер 5ег РіПе сіу ма!ї маї гГеи тер 1190 1195 1200 сій т1іЇе АїЇа тгіеєй АЇа сій сіп Рго Туг сіп сЇу їеи 5ег деп 1205 1210 1215 сій сіп маїЇ гей Агуд Ре ма! Ммеє сім сіу сіу Ге Геи А5р Гуз 1220 1225 1230
Рго А5р Ап Суб Рго АЗр Мет їеи Ре сіи Геи Мет Адгд мес су 1235 1240 1245
Тер соїйп туго Ап Рго Гуз Меї Ага Рго 5ег Ре Гей си те Пе 1250 1255 1260 5зег б5ег ІЇе Гуз сім сіи Меє сіи Рго сіу Рпе Агуд сіи ма! 5ег 1265 1270 1275
Рпе Ттуг Туг 5ег сім сій Ап о їу5 Ге Рго сі Рго сім сіи Гей 1280 1285 1290
Азр ем сіи Рго сій Азп Мес сі бег ма! Рго Ге Ар Рго 5ег 1295 1300 1305
А1Тїа бек бег бег б5ег їеи Рго еи Рго А5р Агуд Ніб5 5ег су НІі5 1310 1315 1320
Гуз АЇїа сі А5зп с1іу Рго сіу Рго сіу ма! Геи ма!ї гГеи Агд АїЇа 1325 1330 1335 60 5зег Рпе Азр сій Агод сіп Рго Туг Аїа Ні Меє А5п о сіу с1У Ага 1340 1345 1350
Гуз А5п о сі Агуд Аїа Ге Рго їеи Рго сіп 5ег б5ег00 ТЕиг суз 1355 1360 1365 65 «210» 51 «2115 932 «2125 РЕТ 70 «2135 атітісіа!
«223» ІСЕ-1К ЕСО (пПитап) «4005» 51
Меєт Гуз б5ег сіу 5ег сіу сІіу сіу 5ег Рго Тиг 5ег їеи Тгр с1Уу Гей 1 5 10 15
Гей Ре Гей б5ег АТа АЇїа Геи бек ге Тер Рго Тиг 5ег су см Пе 20 25 30 суз сІЇу Рго сіу Іїе д5р ІЇе Агуд Ап А5зр Туг сп сіп Геи Гуз Ага 35 40 45
Гей сі Азп Суз Тиг о маїЇ те сіи сіу туг Ге Ні5 ІЇе Гей їГеи Пе 50 55 60 5зег Гуз Аїа сій А5р Ттуг Агуд 5ег Туг Агдуд Ре Рго Гуз Геи ТЕг ма! 65 70 75 80
ІІе тиг сіи Ттуг тей Гей Ге Ре Агуд ма! АТа сІу гГеи сіи 5ег Геи 85 90 95
О1Уу А5р Гей Ре Рго А5п Ге Тиг ма! ІЇе Агд сіу тгр Гуз Геми РПе 100 105 110 туг Азп Туг Аїа Ге ма! ІЇїе Ре сіи Мет ТНг АЗп Гей Гуз А5Зр ІїЇе 115 120 125 о1Уу Геи Туг А5Зп Гей Аг А5Зп ІЇе Тиг Аг СсС1у АїЇа ІЇе Агд Пе си 130 135 140
Гуз А5п АЇа А5р Гей Суз Туг Гей б5ег Тиг ма! Азр Тгр 5ег Ге Пе 145 150 155 160
Гей А5р Аїа ма! 5ег Ап АЗп Туг Іч1іе маї сіу Азп Гуз Рго Рго Гуз 165 170 175 сіи Суз с1у А5р Гей Суб Рго сіу Тйг о Меє сіи сі Гуз Рго Мет су 180 185 190 сіи Гуз Тс Тс о ІЇе доп доп сій туго Азп Туг Агдуд Суз Тер тег тег 195 200 205
АЗп о Агуд Суз соЇп Гуз Мек Суз Рго 5ег ТИг Су5 су Гуз Агд Аїа су 210 215 220
Тс си Аб5п Ап сій Су5 Суз Ні Рго сій Суз Ге сіу бег сСу5 5ег 225 230 235 240
АТїа Рго А5р АЗп др Тс АЇа Суз ма! АЇа Су5 Агу Ні Туг Туг туг 245 250 255
АТїа сіу ма! Суз ма! Рго АЇа Су5з Рго Рго А5зп ТИг туг Агд РПе си 260 265 270 с1у Тер Агдуд Суз ма! дор Аг Ар РПе сСуз АЇа Ап ІЇе Ге 5ег АїЇа бо 275 280 285 сі 5ег б5ег А5р б5ег сі сІіу Ре ма! ІЇе Ні А5р сіу сіи Суз Мет 290 295 з00 65 сіп сій Суб Рго б5ег сіу Ре ІЇе Агуд Азп сіу б5ег сіп 5ег Мет туг 305 310 315 320 сСуз ІчІЇ1е Рго Су5з сій сіу Рго Суб Рго Гуз ма! Су5з сім сіи сіи Гуз 325 330 335 70
Гуз ТВгогГуз Тийг о ІІе Азр 5ег ма! тиг 5ег АїЇа сіп мет гей сіп сС1У 340 345 350 сСуз ТПг ІЇе РіПе Гуз сІіу Ап Ге їГеи ІЇе Ап ІЇе Ага Агд су А5Пп 355 360 365
А5п ІЇе Аїа 5ег сіи Гей сі А5зп Ре Меї сіу гей ІЇе сіи маї ма! 370 375 380
Тк о сТ1у туг ма! Гуз ІЇїе Агуд Ні бек Ні5 АЇа Ге ма! 5ег геи 5ег 385 390 395 400
Ре Геи Гу5 Ап Гей Агд Геи ІЇе гГеи сТЇу сім сім сіп Ге сЇи су 405 410 415
Азп Ттуг 5ег Ре Туг ма! гГеи А5Зр Азп сп Азп Гей сіп сіп Гей Тер 420 425 430
А5зр Тер А5р Ні Агуд Ап гей Тйг Іч1Їе уз АТа сіу Гуз Мет Ттуг РНе 435 440 445
АТа Ре Азп Рго Гуз Гей Суз Ма! 5ег сіи ІїІе туг Агд Меє си си 450 455 460 ма! тик оТу тиг Гуз сіу Агуд сЇп 5ег Гуз сіу А5р ІЇе А5п ТИг Ага 465 470 475 480
А5п о А5п со1у сої Аг Аїа бек Суз сіи 5ег Ар Ма! Ге Ні РПе тТпг 485 490 495 5ег Тис о тиготиг о б5ег о їу5 Ап Аг ІчІЇе ІчІЇе чІЇе тк тер НІі5 Агд Туг 500 505 510
Аг Рго Рго А5р Туг Агуд Азр Ге ІчІ1е бег РіПе Тийг ма! Туг туг Гуз 515 520 525 сі АЇїа Рго Ре Гуз Азп ма! Тйг сіи Ттуг А5Зр су сіп Азр АЇа су 530 535 540 сіу 5ег АЗп 5ег Тгр Азп Мет мМмаї Азр маїЇ А5р Гени Рго РгОо А5П Гуз 545 550 555 560
Азр ма! сім Рго сіу ІЇе Ге Гей Ні5 сСІу Ге Гуз Рго Тгр Тис сіІп 565 570 575 туг АТа ма! Ттуг маїЇ Гуз АЇїа ма! тийг ге тиг Мет ма! си А5бп А5р 580 585 590
Ні ІЇе Агу сО1Уу АЇа Гуз б5ег сЇи Іїе Ге Туг ІЇе Аг9 ТНг А5п АїЇа 595 600 605 5зег ма! Рго 5ег ІЇе Рго Ге А5зр маЇ Ге 5ег АЇа 5ег А5зп 5ег 5ег 610 615 620 5ег сіп Ге ІЇе ма! Гуз Тер АЗзп Рго Рго 5ег Геи Рго А5п су А5П 625 630 635 640
Гей б5ег Туг Туг Іе ма! Агд Тер сп Агду сіп Рго сіп А5р су туг бо 645 650 655
Ге туг Агд Ні Ап Туг Суз бег Гуз А5зр Гуз ІЇе Рго ІЇе Ага Гуз 660 665 670 65 Ттуг АТа Азр сіу тТийг ІІе А5р ІЇе сЇи сіи ма! тийг сіи Азп РГгО Гуз 675 680 685
Тис о сіи маї Су5 сіу сіу сій Гуз сІу Рго Су5з Суз АЇа Су5 Рго Гуз 690 695 700 70
Те ом АТа сіи Гуз сп АТа сіи Гуз сій сої Аїа сіи туг Агд Гуз 705 710 715 720 ма! Рпе си Азп Ре Гей Ні Азп 5ег ІЇе Ре ма! Рго Аг Рго си 725 730 735
Аг Гуз Агуд Агу Азр ма! мет сіп ма! АЇа Абп тТиг о тиг мес 5ег 5ег 740 745 750
Агд б5ег Ага АЗп Тс о Ттиг АїТа Аїа А5р тис о туг Абп ІЇе ТИг А5р РГО 755 760 765 си сій Гей сій Тйг осі Туб Рго Ре Ре сіи б5ег Агуд ма! А5р дп 770 775 780
Гуз сій Агуд Тс ма! ІЇе б5ег А5Зп Ге Аг Рго Ре Тийг Геи туг Ага 785 790 795 800 ч11е А5р ІЇе Ні5 5ег Суз Азп Ні сій АЇа сій Гуз Гей сіу Су5 5ег 805 810 815
АТїа бек Ап Ре ма! Ре АЇїа Агуд тйг мес Рго Аїа сЇи сІу Аїа А5р 820 825 830 А5зр ІІе Рго сіу Рго ма! тТиг Тгр сЇи Рго Агу Рго сім Азп 5ег Пе 835 840 845
Ре Геи Гуз Тер Рго сЇи Рго сЇи А5п РГО Ап сІУу Ге ІЇе Геи мет 850 855 860
Зо тукг ої ІІе Гуз Тукг оІу 5ег сіп ма! сіи А5р сіп Агд сій су ма! 865 870 875 880 5ег Агд сп соЇи Ттуг Агд Гуз туг сІЇу сТ1у Аїа Гуз гГеи А5бп Ага гГеи 885 890 895
АЗп о Рго с1у Азп Туг Тйг Аїа Агу ч1Їе сіп Аїа тНг 5ег Геи 5ег су 900 905 910
А5п сіу 5ег Тгр Тс о Азр Рго Ма! Рпе Рпе Ттуг ма! сіп Аїа Гуз тНг 915 920 925 сіу туг СЇи А5Пп 930 «2105 52 «2115 512 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» ІСЕ-1К ЕєЕСО МсСегтіпа! (Питап) «4005 52
Меєт Гуз б5ег сіу 5ег сіу сІіу сіу 5ег Рго Тиг 5ег їеи Тер с1Уу Гей 1 5 10 15
Ге Ре Геи 5ег АЇа АЇїа Гей 5екгїеи Тер Рго Тиг 5ег с1у сім Пе бо 20 25 30 суз сІЇу Рго сіу Іїе д5р ІЇе Агуд Ап А5зр Туг сп сіп Геи Гуз Ага 35 40 45 65 Гей сій Азп Суз Тиг ма! ч1Їе сіи сІу туг Геи Ні ІЇе Ге Ге Пе 50 55 60 5зег Гуз Аїа сій А5р Ттуг Агуд 5ег Туг Агдуд Ре Рго Гуз Геи ТЕг ма! 65 70 75 80 70
ІІе тиг сіи Ттуг Гей Гей Ге Ре Агд ма! АїТа сІу гГеи сіи 5ег Геи 85 90 95
О1Уу А5р Гей Ре Рго А5п Ге Тиг ма! ІЇе Агд сіу тгр Гуз Геми РПе 100 105 110 туг Азп Туг Аїа Ге ма! ІЇїе Рпе сіи Мет ТНг Атп Гей Гуз А5р ІїЇє 115 120 125 с1у Гей Туг Азп Ге Агуд Азп ІЇе Тиг Агуд сі1у Аїа Іе Агд Іїе си 130 135 140
Гуз АЗп АЇа А5Зр Гей Суз Туг Гей 5ег ТИг ма! Азр Тгр 5ег їеи Пе 145 150 155 160
Гей А5р Аїа ма! 5ег Ап АЗп Туг Іч1іе маї сІіу Азп Гуз Рго Рго Гуз 165 170 175 сіи Суз с1у А5р Гей Суб Рго сіу Тйг о Мес сіи сій Гуз Рго Мет су 180 185 190 сіи Гуз Тк Тс о ІЇе доп доп сій туго Азп Туг Агдуд Суз Тер тег тег 195 200 205 А5зп Агуд Суз сіп Гуз Мет Суб Рго б5ег Типг Суз оТу Гуз Агд АїЇа су 210 215 220
Тис оси Ап о АЗп сі Суз Суб5 Ні Рго сіи Суз Ге сІу 5ег Су 5ег 225 230 235 240
Зо
АТїа Рго А5р АЗп др Тс АЇа Суз ма! АЇїа сСуз5 Агуд Ні Туг Туг туг 245 250 255 Аїа сіу ма! Су5 маЇ Рго АЇїа Суб Рго Рго Азп Тйг Туг Агуд Рпе си 260 265 270 с1у Тер Агдуд Суз ма! дор Агд Ар Ре Суз АїЇа А5п ІЇе Геи 5ег АїЇа 275 280 285 сі 5ег б5ег А5р б5ег сі сІіу Ре ма! ІЇе Ні А5р сіу сіи Суз Мет 290 295 з00 сіп сій Суз Рго б5ег с1у Ре ІЇе Агуд Азп сІу 5ег сіп 5ег Мет туг 305 310 315 320 сСуз ІчІЇ1е Рго Су5з сій сіу Рго Суб Рго Гуз ма! Су5з сім сіи сіи Гуз 325 330 335
Гуз Тийг огГуз Тс о ІТе А5р 5ег ма! тиг 5ег АЇТа сіп мех ге сп с1у 340 345 350 суз Тийг ІЇе Рпе Гуз с1у А5п Гей Геи ІЇе А5п ІЇе Агу Агд о1У А5П 355 360 365
А5п ІЇе Аїа 5ег сіи Гей сі А5зп Ре Меї сіу гей ІЇе сіи маї ма! 370 375 380
Тк о сТ1у туг ма! Гуз ІЇїе Агуд Ні бек Ні5 АЇа Ге ма! 5ег геи 5ег 60 385 390 395 400
Ре Геи Гу5 Ап Гей Агд Геи ІЇе гГеи сТ1у сім сім сіп гГеи си сІ1у 405 410 415 65 Ап туго б5ег Рпе Туг ма! Геми А5р Азп сп А5п ем сіп сп гГеи Тер 420 425 430
А5зр Тер Ар НІі5 Агу Ап оїеи Тиг ІЇе Гуз АїЇа сіу Гуз Меє Туг РНе 435 440 445 70
АТа Ре Азп Рго Гуз Гей Суз Ма! 5ег сіи ІїІе туг Агд Меє си си 450 455 460 ма! тик оТу тиг Гуз с1іу Агуд сЇп 5ег Гуз сіу А5р ІЇе доп ТИг Агд 465 470 475 480
А5п о А5п со1у сої Аг Аїа бек Суз сіи 5ег Ар Ма! Ге Ні РПе тТпг 485 490 495 5ег Тис о тиг о тиг о б5ег уз А5Зп Аг ІЇе ІЇе ІЇе тНг тгр Ні Агд туг 500 505 510 «2105 53 «2115 4 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» тетгарерстіде (1пКег) «4005 53 с1у Ре Геи су 1 «2105» 54 «2115 4 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» тетгарерстіде (1пКег) «4005» 54
Аїа гей АїТа Геи 1 «2105» 55 «2115 5 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» тетгарерстіде (1пКег) «4005 155
Рго ма! сіу ма! ма! 1 5 «2105» 56 «2115 120 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» п2208Рг2 пПеаму спаїп НОЗ37, Мн 60 «4005 156 сіп ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу АЇа сіи ма! Гу5 Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 65 5зег ма! Гуз маЇ 5ег Су5 Гуз АЇа бек сіу туг Тйг РМПе тТиг 5ег туг 20 25 30 тукг мет ніх Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу сіп сіу гГеи сіи Ттгр мес 70 35 40 45 сіу Тер те Тер Рго сіу А5р сіу 5ег ТИг Гуз Туг АЇа сіп Гуз РНе 50 55 60 сбіп сіу Агуд ма! тис мес Тис Аго Ар огуз бег 5ег о 5ег Тиг ма! туг 65 70 75 80 мес сі їеи бек б5ег Ге Агд бег сі А5р Тйг АїЇа ма! туг РНе су 85 90 95
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа Меє дор туг Тгр с1у сіп 100 105 110 сіу тйг Ге ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 «2105 57 «2115 107 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» п2208Р2 ТіднЕ спатїп 1018, мі. «4005 57
Азр ІІе сіп Меє тТийг осіп 5ег Рго 5ег 5ег Гей 5ег АЇа 5ег маїЇ сС1У 1 5 10 15
Зо
А5Зр Агуд Ма! тиг о ч1Те Тиск сСу5 Агу Аїа 5ег сіп А5р ІЇе 5ег Гуз туг 20 25 30
Гей Азп Тер Туг сп сіп Гуз Рго сІу Гуз АїЇа Рго Гуз Гей їГеи Іїе 35 40 45 тТукг туг Ттийг 5ег Агуд Ге сіп б5ег сіу ма! Рго 5ег Агуд Ре 5ег О1У 50 55 60
Агд сіу 5ег сіу ТПг Азр Ттуг 5ег ем Типг ІЇе 5ег 5ег Геи сіп РгоОо 65 70 75 80 сі А5р Ре АЇїа Ттийг о туг Ре Су5 сіп сіп сіу б5ег Ттиг Гей Рго туг 85 90 95
Тис Ре сіу сІу сіу тйг Гуз ма! сіи че Гуз 100 105 «2105» 58 «211» 449 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» п2208єг2 пПеаму спаїп нОЗ37 Ти Тепатн «4005 58 сіп ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу АЇа сіи ма! Гу5 Гуз Рго сІу АїЇа во 1 5 10 15 5зег ма! Гуз ма!Ї 5ег Су5 Гуз АЇа бек сіу туг Тйг РМПе тТиг 5ег туг 20 25 30 65 Туг мес ні Тер ма! Аг сіп Аїа Рго су сіп сіу гей сЇи тер мес 35 40 45 сіу Тер те Тер Рго сіу А5р сіу 5ег ТИг Гуз Туг АЇа сіп Гуз РНе 50 55 60 70 сіп сіу Агуд ма! тийг мес тТйг Аг Ар о Гуз 5ег бег бег Тиг ма! туг 65 70 75 80 мес сі їеи бек б5ег Ге Агд бег сі Азр Тйг АїЇа ма! туг РНе су 85 90 95
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа Меє дор Ттуг Тгр с1у сіп 100 105 110 сіу тйг Геи ма! Ттиг ма! 5ег 5ег Аїа бек Тиг Гуз сІу Рго 5ег маї 115 120 125
Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег ТИг 5ег с1у сіу ТНг Аїа Аїа 130 135 140
Гей сіу Сузх Ге ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сі Рго ма! тТиг ма! 5ег 145 150 155 160
Тер А5п о б5ег сІ1у Аїа Ге Тийг о5ег сіу ма! ні5 Тийг Ріе Рго Аїа маї 165 170 175 ей сіп 5ег 5ег сіу Гей Ттуг б5ег Ге б5ег 5ег ма! ма! тиг ма! Рго 180 185 190 5зег бег б5ег Ге сіу Тк сіп тийг отуг ІЇе Су5 Азп ма! Азп Ні Гуз 195 200 205
Рго 5ег А5п ТИйгогГуз ма! А5р Гуз Агуд ма! сі Рго Гуз 5ег сСуз др 210 215 220
Зо
Гуз Тк Ні Тс Суб Рго Рго Су5 Рго АїЇа Рго сій Гей Гей сІіу сі1у 225 230 235 240
Рго 5ег ма! Ре Ге РПе РгО РГО Гуз Рго Гуз АЗзр ТИг Гей Мет Пе 245 250 255 зег Агуд ТигоРгГоО сіи ма! Тк сСуз ма! ма! ма! Азр ма! 5ег Ні си 260 265 270
А5р Рго сіи Ма! губ Ре Азп Тгр Туг ма! Азр сіу ма! сіи маї н1і5 275 280 285
А5п АЇа Гуз ТИг Гуз Рго Агуд сої сої сбіп Ттуг Абзп о 5ег Тг о туг Агд 290 295 з00 ма! ма! 5ег маїЇ Ге тиг маї Гей Ні сіп Азр Тер Гей А5Зп СУ Гуз 305 310 315 320 сі тує Гуз Суз Гуз ма! 5ег Азп Гуз АїЇа Гей Рго АїЇа Рго ІЇе Си 325 330 335
Гуз Тийг ІЇе бек Гуз АЇа Гуз сіу сп Рго Агд сіи Рго сіп ма! туг 340 345 350
Тиск Геи Рго Рго б5ег Агуд сіи сіи Меє Тк Гуз А5Зп сіп Ма! 5ег їеи 355 360 365
Тиг осСуз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр ІЇе АЇїа ма! си тер 370 375 380 (516) сій 5ег АЗп сіу сіп Рго сій Ап АбЗп о Туг Гуз Тс о тТВг Рго Рго маї 385 390 395 400
Гей А5р б5ег А5Зр сіу б5ег Ре Ре їеи Туг 5ег губ Ге Тиг ма! дор 65 405 410 415
Гуз 5ег Агуд Тер сп сіп сіу Азп Ма! Ре 5ег Су5 б5ег ма! Мет нів 420 425 430 70 си АТа гей Ніб5 А5зп Ні Туг Тпг о сіп Гуз б5ег їеи бег Геу б5ег Рго
435 440 445 чу «2105» 59 «2115 214 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» п2208є2 Тідне спаїп 1018 ТИ11 Тепатн «4005 159
Азр ІІе сіп Меє тТийг осіп 5ег Рго 5ег 5ег Ге 5ег АЇа 5ег маї сіу 1 5 10 15
А5Зр Агуд Ма! тиг о ч1Те Тиск сСу5 Агу Аїа 5ег сіп А5р ІЇе 5ег Гуз туг 20 25 30
Гей Азп Тер Туг сп сіп Гуз Рго сІу Гуз АїЇа Рго Гуз Гей їГеи Пе 35 40 45 Туг туг ТНг 5ег Агуд Гей сіп 5ег сіу ма! Рго 5ег Агуд Ре 5ег О1У 50 55 60
Агд сіу б5ег с1у Тйг Ар Туг б5ег Ге Тиг ІЇе 5ег 5ег Гей сіп РгОо 65 70 75 80
Зо сі А5р Ре АЇїа Ттийг о туг Ре Су5 сіп сіп сіу б5ег Ттиг Гей Рго туг 85 90 95
Тк Ре сіу сіу сіу тийг Гуз ма! сій ІчІЇе Гуз Агд тйг ма! Аїа Аїа 100 105 110
Рго 5ег ма! Ре ІІе РПе Рго Рго 5ег Азр сіи сіп Ге Гуз 5ег С1У 115 120 125
Тс Аїа 5ег ма! маї сСу5 Гей Ге А5п А5п РіПе Туг Рго Аг сіи Аїа 130 135 140
Гуз ма! сіп Тер Гуз маїЇ А5Зр Аозп АЇа Гей сіп 5ег сіу Азп 5ег сп 145 150 155 160 сій 5ег ма! тийг сій сіп др б5ег уз Азр 5ег Тиг Туг 5ег їеи 5ег 165 170 175 5ег ТИг Ге Тийг Ге б5ег їуз АЇа Азр Туг сій Гу5 Ні Гуз ма!ї туг 180 185 190
АТїа Субз сіи ма! тис о ні5 сіп сіу Гей б5ег б5ег Рго Ма! Ттиг Гуз 5ег 195 200 205
Ре А5п Агу сіу си сСуз 210 «2105» 60 60 «2115 107 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» 65 0о«2235» п2208г2 Т1ідпжЕ спаїп 1021, МІ. «4005 60
Азр ІІе сіп Меє тТийг осіп 5ег Рго 5ег 5ег Гей 5ег АЇа 5ег маїЇ сС1У 70 1 5 10 15
А5Зр Агуд Ма! тиг о ч1Те Тиск сСу5 Агу АЇїа 5ег сіп А5р ІЇе 5ег Гуз туг 20 25 30
Гей А5Зп Тер Туг сп сіп Гуз Рго су Гуз АїЇа Рго їу5 Гей Ге Пе 35 40 45 тТукг туг Тийг 5ег Агуд Ге Ні 5ег сіу ма! Рго 5ег Агуд Ре 5ег О1У 50 55 60
Агд сіу б5ег с1у Тйг А5р Ре 5ег Ге Тийг ІЇе 5ег 5ег Геу сіп Рго 65 70 75 80 сі А5р Ре АЇїа Ттийг о туг Ре Су5 сіп сіп сіу б5ег Ттиг Гей Рго туг 85 90 95
Тис Ре сіу сІу сіу тйг Гуз ма! сіи че Гуз 100 105 «210» 61 «2115» 214 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» п2208є2 Тідне спаїп 1021 ТИ Тепатн «400» 61
Азр ІІе сіп Меє тТийг осіп 5ег Рго 5ег 5ег Ге 5ег АЇа 5ег маї сіу з30 1 5 10 15
А5Зр Агуд Ма! тиг о ч1Те Тиск сСу5 Агу АЇїа 5ег сіп А5р ІЇе 5ег Гуз туг 20 25 30
Гей А5Зп Тер Туг сп сіп Гуз Рго су Гуз АїЇа Рго їу5 Геи Ге Пе 35 40 45 тТукг туг Тийг 5ег Агуд Ге Ні 5ег сіу ма! Рго 5ег Агуд Ре 5ег О1У 50 55 60
Агд сіу б5ег с1у Тйг А5р Ре 5ег Ге Тийг ІЇе 5ег 5ег Гей сіп РгОо 65 70 75 80 сі А5р Ре АЇїа Ттийг о туг Ре Су5 сіп сіп сіу б5ег Ттиг Гей Рго туг 85 90 95
Тк Ре сіу сіу сіу тийг Гуз ма! сій ІчІЇе Гуз Агд тйг ма! Аїа Аїа 100 105 110
Рго 5ег ма! Ре ІІе РПе Рго Рго 5ег Азр сіи сіп Ге Гуз 5ег С1У 115 120 125
Тк АТа 5ег ма! ма! суз Ге Ге А5п АЗп РіПе Туг Рго Аг сіи Аїа 130 135 140
Гуз ма! сіп Тер Гуз маїЇ А5Зр Аозп АЇа Гей сіп 5ег сіу Азп 5ег сп 145 150 155 160 60 сій 5ег ма! тк сій сіп д5р бег Гуз А5Зр 5ег ТИг Туг 5ег Геи 5ег 165 170 175 5ег ТИг Ге Тийг Ге б5ег їуз АЇа Азр Туг сій Гу5 Ні Гуз ма!ї туг 180 185 190 65
АТїа Субз сіи ма! тис о ні5 сіп сіу Гей б5ег б5ег Рго Ма! Ттиг Гуз 5ег 195 200 205
Ре А5п Агу сіу си сСуз 70 210
«2105» 62 «2115 120 «2125 РЕТ «2135 атктітісіа! «220» «223» п2208г2 пПеаму спаїп НО47, МН «4005» 62 сіп ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу Аїа сіи ма! Гу5 Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз ма! 5ег сСуз Гуз АЇїа б5ег сіу Туг ТНПг РНе тиг 5ег туг тукг Пе ніх Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу сіп сЇу ге сіи Ттгр мес 20 сіу Тер те Тер Рго сіу А5р сіу 5ег ТИг Гуз туг АЇа сіп Гуз РНе 60 сіп сіу Агуд ма! тийгоМмет Ттийг о Агу АЗр о тТиг об5ег о бег Ап тТиг о ма! туг 25 5655 70 75 80 мес сі їеи бек б5ег Ге Агд бег сі Азр Тйг АЇїа ма! туг туг суз 85 90 95 30 Аїа бег Рго Мет І1е Тийг Рго А5п Туг АЇа Меї дор Туг Тгр с1у сп 100 105 110 сіу тйг Ге ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 35 «2105» 63 «2115» 449 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! 40 «220» «223» п2208єг2 Пеаму спаїп нОї47 Ти Тепатн «4005 63 45 сіп ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу АЇа сіи ма! Гу5 Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз маЇ 5ег Су5 Гуз АЇа бек сіу туг Тйг РМПе тТиг 5ег туг 50 20 25 30 тукг Пе ніх Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу сіп сіу гГеи сіи Ттгр мес 35 40 45 55 сІу тер ІІе Тер Рго сіу Азр сіу б5ег Тк Гуз Туг АЇа сіп Гу5 РНе 50 55 60 сіп сіу Агуд ма! тийг мес тйг о Агу АЗр о тиг об5ег о бег Ап тТиг о ма! туг 65 70 75 80 (516) мес сі їеи бек б5ег Ге Агд бег сі Азр Тйг АЇїа ма! туг туг суз 85 90 95
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа Меє дор Ттуг Тгр с1у сіп 65 100 105 110 сіу тйг Ге ма! тиг омаї 5ег б5ег АЇа б5ег Ттиг Гуз сіу Рго 5ег маї 115 120 125 70 Ре Рго Гей АЇїа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег Тиг 5ег сіу сіу тиг АТа Аїа
130 135 140
Гей сіу Суз Ге ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сі Рго ма! тТиг ма! 5ег 145 150 155 160
Тер А5п о б5ег с1у АїЇа Ге Тийг о5ег сіу ма! нНі5 Тийг Ріе Рго Аїа маї 165 170 175
Гей сіп 5ег 5ег сіу Гей Ттуг б5ег Ге б5ег 5ег ма! ма! тик ма! Рго 180 185 190 5ег б5ег 5ег ей сіу Тийг о сіп Тийг отуг те Су5 Азп маїЇ Азбтп Ні уз 195 200 205
Рго б5ег А5п ТИйгогГуз ма! А5р Гуз Агуд ма! сім Рго Гуз бег Суз др 210 215 220
Гуз ТВг ні Тс Суб Рго Рго Су5 Рго АїЇа Рго сіи Геи Гей сІіу сС1У 225 230 235 240
Рго 5ег ма! Ре Гей Ре РгО РГО Гуз Рго Гуз Азр ТИг Гей Мет Пе 245 250 255 зег Агуд Тиг оРгГоО сіи ма! Тк сСуз ма! ма! ма! Азр маї 5ег ні си 260 265 270
Азр Рго сіи МмаЇ Гуз Ре А5п Тгр Туг ма! Азр сІу маї сіи маї нів 275 280 285
Зо
А5п АЇа Гуз Тиг Гуз Рго Агуд сої сій сбіп Ттуг АЗп 5ег о ТАйг Ттуг Агд 290 295 з00 ма! ма! 5ег маїЇ Ге тиг маї Гей ні сіп д5р Тер Гей Азп су Гуз 305 310 315 320 сі тТуг Гуз Суз Гуз МмаїЇ 5ег Азп Гуз АїЇа Ге Рго АЇа Рго ІЇе Си 325 330 335
Гуз Тиг ІЇе бек Гуз АТа Гуз сіу сіп Рго Агд сіи Рго сіп ма! туг 340 345 350
Тк ге Рго Рго бег Агуд сім сіи Меє Тийг Гуз Азп сіп ма! 5ег Геи 355 360 365
ТВг о осСуз Ге ма! Гуз сІу Ре Туг Рго 5ег А5Зр ІЇе АЇїа ма! си тер 370 375 380 сій 5ег АЗп сіу сіп Рго сій Ап АбЗп о Туг Гуз Тс о тТВг Рго Рго маї 385 390 395 400
Гей А5р б5ег А5Зр сіу б5ег Ре Ре їеи Туг 5ег губ Ге Тиг ма! дор 405 410 415
Гуз 5ег Агуд Тер сп сіп сіу Азп Ма! Ре 5ег Су5 б5ег ма! Мет нів 420 425 430 сій АЇїа Гей Ні А5п Ні Туг Тйг о сіп Гуз 5ег їеи 5ег Гей 5ег РгГО 435 440 445 (516) чу «2105» 64 65 «2115 120 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» 70 «2235» п2208єг2 Неаму спаїп НО49, мн
«400» 64 сіп ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу АЇа сіи ма! Гу5 Гуз Рго сІу АїЇа 21 5 10 15 5зег ма! Гуз маЇ 5ег Су5 Гуз АЇа бек сіу туг Тйг РМПе тТиг 5ег туг 20 25 30
Туг меє ніх Тер маїЇ Агуд сіп Аїа Рго сіу сіЇп сіу гГеи сіи тгр мес 35 40 45 сіу Тер те Тер Рго сіу А5р сіу 5ег ТИг Гуз туг АЇа сіп Гуз РНе 50 55 60 сіп сіу Агуд ма! тийг мес тТйг Аг Ар о Гуз 5ег бег бег Тиг ма! туг 65 70 75 80 мес сі їеи бек б5ег Ге Агд бег сі Азр Тйг АЇїа ма! туг туг суз 85 90 95
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа Меє дор Ттуг Тгр с1у сіп 100 105 110 сІу тйг Ге ма! тиг ма! 5ег 5ег 115 120 «2105» 65 «211» 449 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «2235» 22082 пеаму спаїп нО49 ТИ Тепатн «4005 65 сіп ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу АЇа сіи ма! Гу5 Гуз Рго сІу АїЇа 434 1 5 10 15 5зег ма! Гуз маЇ 5екг Су5 Гуз АЇа бек сіу туг Тйг РМПе тТиг 5ег туг 20 25 30 Туг меє ніх Тгр маїЇ Агуд сіп Аїа Рго сіу сіп сіу Ге сіи тер мес 35 40 45 сіу Тер те Тер Рго сіу А5р сіу 5ег Тиг Гуз Ттуг АЇа сіп Гуз РНе 60 50 сіп сіу Агуд ма! тийг мес тТйг Аг Ар о Гуз 5ег бег бег Тиг ма! туг 65 70 75 80 55 Мет сі Ге 5ег 5ег Гей Агуд 5ег сій А5р Тийг АЇїа ма! Туг туг су 85 90 95
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа Меє дор Ттуг Тгр с1у сіп 100 105 110 (516) сіу тйг Ге ма! тиг омаї 5ег б5ег АЇа б5ег Тиг Гуз сіу Рго 5ег маї 115 120 125
Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег ТИг 5ег су сіу ТНг Аїа Аїа 65 130 135 140
Гей сіу Суз Ге ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сі Рго ма! Ттиг ма! 5ег 145 150 155 160 70 Тер А5п о 5ег сіу Аїа Геи Тийг бек су ма! ніх тийг РНе Рго Аїа маї
165 170 175 ей сіп 5ег 5ег сіу Гей Ттуг б5ег Ге б5ег б5ег ма! ма! тик ма! Рго 180 185 190 5ег б5ег 5ег ей сіу Тийг о сіп Тийг отуг те Су5 Азп маїЇ Азбтп Ні уз 195 200 205
Рго 5ег Ап ТИйгогГуз ма! А5р Гуз Агуд ма! си Рго Гу5 5ег сСуз др 210 215 220
Гуз ТВг ні Тс Суб Рго Рго Су5 Рго АїЇа Рго сіи Геи Гей сІіу сС1У 225 230 235 240
Рго бег ма! Ре Ге Ре Рго Рго Гу5 Рго Гуз Азр ТИг Ге Мет Пе 245 250 255 зег Агуд Тиг оРгГоО сіи ма! Тк сСуз ма! ма! ма! Азр маї 5ег ні си 260 265 270
Азр Рго сіи мМмаїЇ Гуз Ре А5зп Тгр туг ма! Азр сіу маїЇ сіи маї нів 275 280 285
А5п АЇа Гуз Тиг Гуз Рго Агуд сої сій сбіп Ттуг АЗп 5ег о ТАйг Ттуг Агд 290 295 з00 ма! ма! 5ег маїЇ Ге тиг маї Гей Ні сіп Азр Тер Гей А5Зп СУ Гуз 305 310 315 320 сій туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег А5п уз АїЇа Гей Рго АїЇа Рго ІЇе СсЇи 325 330 335
Гуз Тийг ІЇе бек Гуз АЇа Гуз сіу сп Рго Агд сіи Рго сіп ма! туг 340 345 350
Тк ге Рго Рго бег Агуд сім сіи Меє Тийг Гуз Азп сіп ма! 5ег Геи 355 360 365
Тиг осСуз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр ІЇе АЇїа ма! си тер 370 375 380 сій 5ег АЗп сіу сіп Рго сій Ап АбЗп о Туг Гуз Тс о тТВг Рго Рго маї 385 390 395 400
Гей А5р б5ег Ар с1у б5ег Ре РПе Геи Туг 5ег уз Гей Тиг ма! дор 405 410 415
Гуз 5ег Агуд Тер сп сіп сіу Азп Ма! Ре 5ег Су5 б5ег ма! Мет нів 420 425 430 сій АЇїа Гей Ні А5п Ні Туг Тйг о сіп Гуз 5ег їеи 5ег Гей 5ег РгГО 435 440 445 с1у «210» 66 «2115 120 «2125 РЕТ 60 0«2135» атітісіа! «220» «223» п2208Рг2 Пеаму спаїп НОБ5І, Мн 65 «400» 66 сіп ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу АЇа сіи ма! Гу5 Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 70 5зег ма! Гуз ма! 5ег сСуз Гуз АЇїа б5ег сіу Туг ТНПг РНе тиг 5ег туг
20 25 30 тукг мет ніх Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу сіп сіу гГеи сіи Ттгр мес 35 40 45 сіу Тер те Тер Рго сіу А5р сіу 5ег ТИг Гуз туг АЇа сіп Гуз РНе 50 55 60 сіп сіу Агуд ма! тийг мес тйг о Агу АЗр о тиг об5ег о бег Ап тТиг о ма! туг 1065 70 75 80 мес сі їеи бек б5ег Ге Агд бег сі Азр Тйг АїЇа ма! туг РНе су 85 90 95 Аїа б5ег Рго Мет ІЇе Тийг Рго А5п Туг АЇїа Мет дор Туг Тгр с1у сп 100 105 110 сіу тйг Ге ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 «2105» 67 «2115» 449 «2125 РЕТ «2135 акітісіа! «220» «223» п2208єг2 Пеаму спаїп нОбЗІ ТИ Тепатн «4005 67 сіп ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу АЇа сіи ма! Гу5 Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз ма! 5ег сСуз Гуз АЇїа 5ег сіу туг Тис РПе тНг 5ег туг 20 25 30 тукг мет ніх Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу сіп сіу гГеи сіи Ттгр мес 35 40 45 сіу Тер т1Іе Тер Рго сіу А5р сіу 5ег Ттиг Гуз туг АЇа сіп Гуз РНе 50 55 60 сіп сіу Агуд ма! тийг мес тйг о Агу АЗр о тиг об5ег о бег Ап тТиг о ма! туг 65 70 75 80 мес сі їеи бек б5ег Ге Агд бег сій А5р Тиг АЇїа ма! туг РНе су 85 90 95 Аїа бег Рго Мет І1е Тийг Рго А5п Туг АЇа Меї дор Туг Тгр с1у сп 100 105 110 сіу тйг Гей ма! тиг омМмаї 5ег б5ег Аа б5ег Тиг Гуз сіу Рго 5ег Умаї 115 120 125
Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег ТИг 5ег су сіу ТНг Аїа Аїа 130 135 140
Гей сіу Сузх Ге ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сі Рго ма! тТиг ма! 5ег 60 145 150 155 160
Тер А5п о б5ег с1у АїЇа Ге Тийг о5ег сіу ма! нНі5 Тийг Ріе Рго Аїа маї 165 170 175 65 ей сіп бег бек с1у Ге Туг бек Гей 5ег 5ег ма! ма! тиг о маї Рго 180 185 190 5ег б5ег 5ег ей сіу Тийг о сіп Тийг отуг те Су5 А5зп маїЇ Азбтп Ні уз 195 200 205 70
Рго 5ег Ап ТИйгогГуз ма! Азр Гуз Агуд ма! сі Рго Гуз 5ег сСуз др 210 215 220
Гуз ТВг ні Тс Суб Рго Рго Су5 Рго АїЇа Рго сіи Геи Гей сІіу сС1У (225 230 235 240
Рго 5ег ма! Ре Ге РПе РгО РГО Гуз Рго Гуз АЗзр ТИг Гей Мет Пе 245 250 255 зег Агуд Тиг оРгГоО сіи ма! Тк сСуз ма! ма! ма! Азр маї 5ег ні си 260 265 270
Азр Рго сіи МмаЇ Гуз Ре А5п Тгр Ттуг ма! Азр сіу маїЇ сіи маї ні 275 280 285
А5п АЇа Гуз Тиг Гуз Рго Агуд сої сій сбіп Ттуг АЗп 5ег о ТАйг Ттуг Агд 290 295 з00 ма! ма! 5ег маїЇ Ге тиг маї Гей Ні сіп Азр Тер Гей А5Зп СУ Гуз 305 310 315 320 сі тТуг Гуз Суз Гуз МмаїЇ 5ег Азп Гуз АїЇа Ге Рго АЇа Рго ІЇе Си 325 330 335
Гуз Тийг ІЇе бек Гуз АЇа Гуз сіу сп Рго Агд сіи Рго сіп ма! туг 340 345 350
Тк ге Рго Рго бег Агуд сім сіи Меє Тийг Гуз Азп сіп ма! 5ег Геи 355 360 365
Зо
Тиг осСуз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр ІЇе АЇїа ма! си тер 370 375 380 сій 5ег АЗп сіу сіп Рго сій Ап АбЗп о Туг Гуз Тс о тТВг Рго Рго маї 385 390 395 400
Гей А5р б5ег А5Зр сіу б5ег Ре Ре їеи Туг 5ег губ Ге Тиг ма! дор 405 410 415
Гуз 5ег Агуд Тер сп сіп сіу Азп Ма! Ре 5ег Су5 б5ег ма! Мет нів 420 425 430 сій АЇїа Гей Ні А5п Ні Туг Тйг о сіп Гуз 5ег їеи 5ег Гей 5ег РгГО 435 440 445 с1у «210» 68 «2115» 120 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» п2208Р2 Пеаму спатїп НО52, МН «4005 68 сіп ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу АЇа сіи ма! Гу5 Гуз Рго сІу АїЇа во 1 5 10 15 5зег ма! Гуз ма!Ї 5ег Су5 Гуз АЇа бек сіу туг Тйг РМПе тТиг 5ег туг 20 25 30 65 Туг мес ні Тер ма! Аг сіп Аїа Рго су сіп сіу гей сЇи тер мес 35 40 45 сіу Тер те Тер Рго сіу А5р сіу 5ег ТИг Гуз Туг АЇа сіп Гуз РНе 50 55 60 70 сіп сіу Агуд ма! тийг мес тйг о Агу АЗр о тиг об5ег тис обег о тиг ма! туг 65 70 75 80 мес сі їеи бек б5ег Ге Агд бег сі Азр Тйг АїЇа ма! туг РНе су 85 90 95
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа Меє дор Ттуг Тгр с1у сіп 100 105 110 сІіу тис гГеу ма! тиг ма! 5ег 5ег 115 120 «2105» 69 «211» 449 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» п2208єг2 пПеаму спаїп нО52 Ти Тепатн «4005 69 сіп ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу АЇа сіи ма! Гу5 Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз маЇ 5ег Су5 Гуз АЇа 5ег сіу Туг Тиг Ре тТНг 5ег туг 20 25 30
Туг мес ніх Тгр маїЇ Агуд сіп Аїа Рго сіу сіп сіу Ге сіи тер мес сіу Тер те Тер Рго сіу А5р сіу 5ег Тиг Гуз Ттуг АЇа сіп Гуз РНе 60 35 сіп сіу Агуд ма! тийг мес тйг о Агу АЗр о тиг об5ег тис обег о тиг ма! туг 65 70 75 80 мес сі їеи бек б5ег Ге Агд бег сіи Ар Тйг Аїа ма! туг РНе су 40 85 90 95
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа Меє дор Ттуг Тгр с1у сіп 100 105 110 45 сІіу тйг о Геи ма! Тис ма! 5ег б5ег АЇїа бек Тиг Гуз сІу Рго 5ег маї 115 120 125
Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег ТИг 5ег су сіу ТНг Аїа Аїа 130 135 140 50
Гей сіу Сузх Ге ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сі Рго ма! тТиг ма! 5ег 145 150 155 160
Тер А5п о б5ег с1у АїЇа Ге Тийг о5ег сіу ма! нНі5 Тийг Ріе Рго Аїа маї 55 165 170 175 ей сіп 5ег 5ег сіу Гей Ттуг б5ег Ге б5ег 5ег ма! ма! тиг ма! Рго 180 185 190 60 5зег бег б5ег Ге сіу Тк сіп тийг отуг ІІе Су5 Азп маї А5Зп нів Гуз 195 200 205
Рго 5ег А5п ТИйгогГуз ма! А5р Гуз Агуд ма! сі Рго Гуз 5ег сСуз др 210 215 220 65
Гуз ТВг ні Тс Суб Рго Рго Су5 Рго АїЇа Рго сіи Геи Гей сІіу сС1У 225 230 235 240
Рго 5ег ма! Ре Ге РПе РгО РГО Гуз Рго Гуз АЗзр ТИг Гей Мет Пе 70 245 250 255 зег Агуд ТигоРгГо сіи ма! Тк сСуз ма! ма! ма! Азр маї 5ег ні си 260 265 270 А5зр Рго сім ма! Гуз Ре Ап Тгр Туг ма! Азр су ма! сіи ма! ні 275 280 285
А5п АЇа Гуз ТИг Гуз Рго Агуд сої сій сбіп Ттуг АЗп 5ег ТАйг Ттуг Агд 290 295 з00 ма! ма! 5ег маїЇ Ге тиг маї Гей Ні сіп Азр Тер Гей А5Зп СУ Гуз 305 310 315 320 сі тТуг Гуз Суз Гуз МаїЇ 5ег Азп Гуз АїЇа Ге Рго АЇа Рго ІЇе Си 325 330 335
Гуз Тийг ІЇе бек Гуз АЇа Гуз сіу сп Рго Агд сіи Рго сіп ма! туг 340 345 350
Тк Гей Рго Рго бег Агуд сіи сіи Меє Тк Гуз А5Зп сіп Ма! 5ег їеи 355 360 365
Тиг осСуз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр ІЇе АЇїа ма! си тер 370 375 380 сій 5ег АЗп сіу сіп Рго сій Ап АбЗп о Туг Гуз Тс о тТВг Рго Рго маї 385 390 395 400
Гей А5р б5ег Ар с1у б5ег Ре РПе Геи Туг 5ег уз Гей Тиг ма! дор 405 410 415
Гуз 5ег Агуд Тер сп сіп сіу Азп Ма! Ре 5ег Су5 б5ег ма! Мет нів 420 425 430 сій АЇїа Гей Ні А5п Ні Туг Тйг о сіп Гуз 5ег їеи 5ег Гей 5ег РгГО 435 440 445 с1у «2105 70 «2115 120 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» п2208г2 пПеаму спаїп НО57, МН «4005 70 сіп ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу АЇа сіи ма! Гу5 Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз маЇ 5ег Су5 Гуз АЇа бек сіу туг Тйг РМПе тТиг 5ег туг 20 25 30 тукг Пе ніх Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу сіп сіу гГеи сіи Ттгр мес 35 40 45 60 с1у тер І11е Тер Рго сіу А5р сіу 5ег Тиг Гуз Туг АЇа сЇп Гуз РПе 50 55 60 сіп сіу Агуд ма! тийг мес тйг Аг Ар огГуз 5ег о ТИг Ап тТиг ма! туг 65 70 75 80 65 мес сі їеи бек б5ег Ге Агд бег сі Азр Тйг АЇїа ма! туг туг суз 85 90 95
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа Меє дор Ттуг Тгр с1у сіп 70 100 105 110 сіу тйг Ге ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 «2105 71 «2115» 449 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» п2208єг2 Пеаму спаїп нО57 Ти Тепатн «4005 71 сіп ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу АЇа сіи ма! Гу5 Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз маЇ 5ег сСу5 Гуз АЇа бек сіу туг Тйг РМПе тТиг 5ег туг 20 25 30 тукг Пе ніх Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу сіп сіу гГеи сіи Ттгр мес 35 40 45 су тер тІІе Тер Рго с1у Азр сіу б5ег Тк Гуз Туг АЇа сіп Гу5 РНе 50 55 60 сіп сіу Агуд ма! тийг мес тйг Аг Ар огГуз 5ег о ТИг Ап тТиг ма! туг 65 70 75 80
Зо мес сі їеи бек б5ег Ге Агд бег сі Азр Тйг АЇїа ма! туг туг суз 85 90 95
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа Меє дор Ттуг Тгр с1у сіп 100 105 110 сіу тйг Гей ма! тиг омМмаї 5ег б5ег АЇа б5ег Тиг Гуз сіу Рго 5ег маї 115 120 125
Ре Рго Гей АЇїа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег Тиг 5ег сіу сіу тНг АТа Аїа 130 135 140
Гей сіу Сузх Ге ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сі Рго ма! тТиг ма! 5ег 145 150 155 160
Тер А5п о б5ег с1у АїЇа Ге Тийг о5ег сіу ма! нНі5 Тийг Ріе Рго Аїа маї 165 170 175 ей сіп 5ег 5ег сіу Гей Ттуг б5ег Ге б5ег 5ег ма! ма! тиг ма! Рго 180 185 190 5ег б5ег 5ег ей сіу Тийг о сіп Тийг отуг те Су5 Азп маїЇ Азбтп Ні уз 195 200 205
Рго 5ег А5п ТИйгогГуз ма! А5р Гуз Агуд ма! сі Рго Гуз 5ег сСуз др 210 215 220
Гуз ТВг ні Тс Суб Рго Рго Су5 Рго АїЇа Рго сіи Геи Гей сІіу сС1У 225 230 235 240 (516)
Рго 5ег ма! Ре Ге РПе РгО РГО Гуз Рго Гуз АЗзр ТИг Гей Мет Пе 245 250 255 зег Агуд Тиг оРгГоО сіи ма! Тк сСуз ма! ма! ма! Азр маї 5ег ні си 65 260 265 270
Азр Рго сіи МмаЇ Гуз Ре А5п Тгр Ттуг ма! Азр сіу маїЇ сіи маї ні 275 280 285 70 А5зп АТа Гуз ТИг губ Рго Аго сій сій сіп тТуг Ап о бег тТиг о туг Ага
290 295 з00 ма! ма! 5ег маїЇ Ге тиг маї Гей Ні сіп Азр Тер Гей А5Зп СУ Гуз 305 310 315 320 сі тТуг Гуз Суз Гуз МмаїЇ 5ег Азп Гуз АїЇа Ге Рго АЇа Рго ІЇе Си 325 330 335
Гуз Тийг ІЇе бек Гуз АЇа Гуз сіу сп Рго Агд сіи Рго сіп ма! туг 340 345 350
Тк ге Рго Рго бег Агуд сім сіи Меє Тийг Гуз Азп сіп ма! 5ег Геи 355 360 365
Тиг осСуз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр ІЇе АЇїа ма! си тер 370 375 380 сій 5ег АЗп сіу сіп Рго сій Ап АбЗп о Туг Гуз Тс о тТВг Рго Рго маї 385 390 395 400
Гей А5р б5ег А5Зр сіу б5ег Ре Ре їеи Туг 5ег губ Ге Тиг ма! дор 405 410 415
Гуз 5ег Агуд Тер сп сіп сіу Азп ма! Ре 5ег Суз5 бег ма! Мет ні 420 425 430 сій АЇїа Гей Ні А5п Ні Туг Тс о сіп Гуз 5ег їеи 5ег Гей 5ег РгО 435 440 445 с1у «2105 72 «2115 120 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» п2208г2 пПеаму спаїп НОб8, МН «4005 72 сіп ма! сіп Геи маїЇ сіп 5ег с1у Аїа сіи ма! Гуз Гуз Рго сіу Аїа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз маЇ 5екг Су5 Гуз АЇа бек сіу туг Тйг РМПе тТиг 5ег туг 20 25 30 тукг мет ніх Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу сіп сіу гГеи сіи Ттгр мес 35 40 45 сіу Тер те Тер Рго сіу А5р сіу 5ег Тиг Гуз туг АЇа сіп Гуз РНе 50 55 60 сіп сіу Агуд ма! тийгоМмеє тйг о Агу АЗротиг об5ег Тс о АЗп о тиг омаї туг 65 70 75 80 60 мес сі їеи б5ег б5ег Ге Агод б5ег сій АЗр Ттйг Аа ма! Ттуг РНе су» 85 90 95
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа Меє дор Ттуг Тгр с1у сіп 100 105 110 65 сіу тйг Ге ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 70 «2105 73
«2115» 449 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» п2208єг2 Пеаму спаїп нОб8 Ти Тепатн «4005 73 сіп ма! сіп Геи маїЇ сіп 5ег с1у Аїа сіи ма! Гуз Гуз Рго с1у Аїа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз маЇ 5ег Су5 Гуз АЇа бек сіу туг Тйг РМПе тТиг 5ег туг 20 25 30 тукг мет ніх Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу сіп сіу гГеи сіи Ттгр мес 35 40 45 сіу Тер те Тер Рго сіу А5р сіу 5ег ТИг Гуз туг АЇа сіп Гуз РНе 50 55 60 сіп сіу Агуд ма! тийгоМмеє тйг о Агу АЗротиг об5ег Тс о АЗп о тиг омаї туг 65 70 75 80
Мет сій Ге 5ег 5ег Гей Агуд 5ег сій А5р Тийг Аїа ма! Туг РПе су» 85 90 95
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа Меє дор Ттуг Тгр с1у сіп 100 105 110
Зо сіу тйг Гей ма! тиг омМмаї 5ег б5ег АЇа б5ег Тиг Гуз сіу Рго 5ег маї 115 120 125
Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег ТИг 5ег су сіу ТНг Аїа Аїа 130 135 140
Гей сіу Сузх Ге ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сі Рго ма! тТиг ма! 5ег 145 150 155 160
Тер Азп б5ег с1у Аїа Гей Тийг о б5ег сіу ма! нНі5 Тийг РМпе Рго Аїа маї 165 170 175 ей сіп 5ег 5ег сіу Гей Ттуг б5ег Ге б5ег 5ег ма! ма! тиг ма! Рго 180 185 190 5ег б5ег 5ег ей сіу Тийг о сіп Тийг отуг те Су5 Азп маїЇ Азбтп Ні уз 195 200 205
Рго 5ег А5п ТИйгогГуз ма! А5р Гуз Агуд ма! сі Рго Гуз 5ег сСуз др 210 215 220
Гуз ТВг ні Тс Суб Рго Рго Су5 Рго АїЇа Рго сіи Геи Гей сІіу сС1У 225 230 235 240
Рго бег ма! Ре Гей Ре Рго Рго Гуз Рго Гуз Азр ТИг Ге Мет Пе 245 250 255 зег Агуд Тиг оРгГоО сіи ма! Тк сСуз ма! ма! ма! Азр маї 5ег ні си 260 265 270 (516)
Азр Рго сіи МмаЇ Гуз Ре А5п Тгр Ттуг ма! Азр сіу маїЇ сіи маї ні 275 280 285
А5п АЇа Гуз Тиг Гуз Рго Агуд сії сій сбіп Туг АЗп 5ег ТАйг туг Ага 65 290 295 з00 ма! ма! 5ег маїЇ Ге тиг маї Гей Ні сіп Азр Тер Гей А5Зп СУ Гуз 305 310 315 320 70 сіи туг Гуз Су5 Гуз ма! 5ег А5зп Гуз АїЇа Геи Рго АЇа Рго Пе си
325 330 335
Гуз Тийг ІЇе бек Гуз АЇа Гуз сіу сп Рго Агд сіи Рго сіп ма! туг 340 345 350
Тк ге Рго Рго бег Агуд сім сіи Меє Тийг Гуз АЗзп сіп ма! 5ег геи 355 360 365
Тиг осСуз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр ІЇе АЇїа ма! си тер 370 375 380 сій 5ег АЗп сіу сіп Рго сій Ап АбЗп о Туг Гуз Тс о ТтВг Рго Рго маї 385 390 395 400
Гей А5р б5ег Ар с1у б5ег Ре РПе Геи Туг 5ег уз Гей Тиг ма! дор 405 410 415
Гуз 5ег Агуд Тер сп сіп сіу Азп ма! Ре 5ег Суз5 бег ма! Мет ні 420 425 430 сій АЇїа Гей Ні А5п Ні Туг Тйг о сіп Гуз 5ег їеи 5ег Гей 5ег РгГО 435 440 445 с1у «2105 174 «2115 120 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» п2208г2 пПеаму спаїп НО70, мн «4005 74 сіп ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу АЇа сіи ма! Гу5 Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз ма! 5ег сСуз Гуз АЇїа 5ег сіу туг Тис РПе тНг 5ег туг 20 25 30 тукг мет ніх Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу сіп сіу гГеи сіи Ттгр мес 35 40 45 сіу Тер т1Іе Тер Рго сіу А5р сіу 5ег Ттиг Гуз Ттуг АЇа сіп Гуз РНе 60 50 сіп с1у Ага Ма! тис о Мес Ттиг Аг А5р Тс об5ег о Тйг об5ег о тиг ма! туг 65 70 75 80 мес сі їеи бек б5ег Ге Агд бег сій А5р Тиг АЇа ма! туг туг суз 85 90 95 55
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа Меє дор туг Тгр с1у сіп 100 105 110 сіу тйг Ге ма! тиг ма! 5ег 5ег бо 115 120 «2105 75 «2115» 449 65 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» п2208єг2 Пеаму спаїп нО7О Ти Тепатн 70
«4005 75 сіп ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу АЇа сіи ма! Гу5 Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз маЇ 5ег Су5 Гуз АЇа бек сіу туг Тйг РМПе тТиг 5ег туг 20 25 30 тукг мет ніх Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу сіп сіу гГеи сіи Ттгр мес 35 40 45 сіу Тер те Тер Рго сіу А5р сіу 5ег ТИг Гуз туг АЇа сіп Гуз РНе 50 55 60 сіп с1у Ага Ма! тис о Мес Ттиг о Аго А5р Тс обег Тийг об5ег о тиг ма! туг 65 70 75 80 мес сі їеи бек б5ег Ге Агд бег сі Азр Тйг АЇїа ма! туг туг суз 85 90 95
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа Меє дор Ттуг Тгр с1у сіп 100 105 110 сіу тйг Гей ма! тиг омМмаї 5ег б5ег АЇа б5ег Тиг Гуз сіу Рго 5ег маї 115 120 125
Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег ТИг 5ег су сіу ТНг Аїа Аїа 130 135 140
Ге сіу Суз Гей ма! Гуз А5р Туг Ре Рго сіи Рго ма! тНг ма! 5ег 145 150 155 160
Тер А5п о б5ег с1у АїЇа Ге Тийг о5ег сіу ма! нНі5 Тийг Ріе Рго Аїа маї 165 170 175 ей сіп 5ег 5ег сіу Гей Ттуг б5ег Ге б5ег 5ег ма! ма! тиг ма! Рго 180 185 190 5зег б5ег 5ег Гей сіу Тийг о сіп Тийг отуг те Су5 А5зп маї Аз5тп Ні уз 195 200 205
Рго 5ег А5п ТИйгогГуз ма! А5р Гуз Агуд ма! сі Рго Гуз 5ег сСуз др 210 215 220
Гуз Тийг Ні тк Су Рго Рго Су5 Рго АЇа Рго сіи Гей Ге су с1У 225 230 235 240
Рго 5ег ма! Ре Ге РПе РгО РГО Гуз Рго Гуз АЗзр ТИг Гей Мет Пе 245 250 255 зег Агуд ТигоРгГоО сіи ма! Тк сСуз ма! ма! ма! Азр ма! 5ег Ні си 260 265 270
Азр Рго сіи МмаЇ Гуз Ре А5п Тгр Ттуг ма! Азр сіу маїЇ сіи маї ні 275 280 285
А5п АЇа Гуз Тиг о Гуз Рго Агуд сії сій сбіп Туг Абзп о б5ег о Тиг о туг Ага 290 295 з00 60 ма! ма! 5ег маїЇ Гей тиг ма! гей Ні сп А5р Тер Гей А5Зп оту Гуз 305 310 315 320 сі тує Гуз Суз Гуз МмаЇ 5ег Азп Гуз АїЇа Гей Рго АЇа Рго ІЇе СсЇи 325 330 335 65
Гуз Тийг ІЇе бек Гуз АЇа Гуз сіу сп Рго Агд сіи Рго сіп ма! туг 340 345 350
Тк ге Рго Рго бег Агуд сім сіи Меє Тийг о їу5 Азп сіп ма! 5ег Геи 70 355 360 365
ТВг осСуз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр ІЇе АЇїа ма! си тер 370 375 380 сім бек Ап со1Їу сіп Рго сій А5п АЗп о Туг Гуз Тс тег Рго Рго ма! 385 390 395 400
Гей А5р б5ег А5Зр сіу б5ег Ре Ре їеи Туг 5ег губ Ге Тиг ма! дор 405 410 415
Гуз 5ег Агуд Тер сп сЇп сіу Азп ма! Ре 5ег Су5 б5ег ма! мет нів 420 425 430 сій АЇїа Гей Ні А5п Ні Туг Тс о сіп Гуз 5ег їеи 5ег Гей 5ег РгО 435 440 445 с1у «2105» 76 «2115 120 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» п2208Рг2 Пеаму спаїп НО71, Мн «4005 76 сіп ма! сіп Геи маїЇ сіп 5ег с1у Аїа сіи ма! Гуз Гуз Рго сіу Аїа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз маЇ 5ег сСу5 Гуз АЇа 5ег сіу Туг Тиг Ре тТНг 5ег туг 20 25 30 тукг мет ніх Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу сіп сіу гГеи сіи Ттгр мес 35 40 45 сіу Тер те Тер Рго сІіу А5р сіу 5ег ТИг Гуз Туг АЇа сіп Гуз РНе 50 55 60 сіп сіу Агуд ма! тийгоМмеє тйг о Агу АЗротиг об5ег Тс о АЗп о тиг омаї туг 65 70 75 80
Мет сій Ге 5ег 5ег Гей Агуд 5ег сій А5р Тийг Аїа ма! Туг туг су 85 90 95
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа Меє дор Ттуг Тгр с1у сіп 100 105 110 сіу тйг Ге ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 «2105 77 «2115» 449 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! бо «220» «223» п2208єг2 Пеаму спаїп нО71 ТИ Тепдатн «4005 77 65 с1п ма! сіп Гей ма! сіп 5ег сіу АТа сіи ма! Гуз Гу5 Рго Ос1у АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз ма!Ї 5ег Су5 Гуз АЇа бек сіу туг Тйг РМПе тТиг 5ег туг 20 25 30 70 тукг мет ніх Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу сіп сіу гГеи сіи Ттгр мес 35 40 45 сіу Тер те Тер Рго сіу А5р сіу 5ег ТИг Гуз туг АЇа сіп Гуз РНе 50 55 60 сіп сіу Агуд ма! тийгоМмеє тйг о Агу АЗротиг об5ег Тс о АЗп о тиг омаї туг 65 70 75 80
Мес сіи Ге 5ег 5ег Гей Агуд 5ег сій А5р Тийг Аїа ма! Туг туг су 85 90 95
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа Мех дор Ттуг Тгр с1у сп 100 105 110 сіу тйг Гей ма! тиг омМмаї 5ег б5ег АЇа б5ег Тиг Гуз сіу Рго 5ег маї 115 120 125
Ре Рго Гей АЇїа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег Тиг 5ег сіу сіу тНг АТа Аїа 130 135 140
Гей сіу Суз Ге ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сі Рго ма! тТиг ма! 5ег 145 150 155 160
Тер А5п о б5ег сІ1у АїЇа Ге Тийг о5ег сіу ма! нНі5 Тийг Ріе Рго Аїа маї 165 170 175 ей сіп 5ег 5ег сіу Гей Ттуг б5ег Ге б5ег 5ег ма! ма! тик ма! Рго 180 185 190 5зег б5ег 5ег ей сіу Тийг о сіп Тийг отуг ІІе Суз Азп маїЇ Азп Ні Гуз 195 200 205
Рго б5ег А5п ТИйгогГуз ма! А5зр Гуз Агуд ма! сі Рго Гу5 5ег сСуз др 210 215 220
Гуз Тк Ні Тс Суб Рго Рго Су5 Рго АїЇа Рго сіи Гей Гей сІіу сі1у 225 230 235 240
Рго 5ег ма! Ре Ге Ре РгО РГО Гуз Рго Гуз АЗзр ТИг Гей Мет Пе 245 250 255 зег Агуд ТигоРгГо сіи ма! Тк сСуз ма! ма! ма! Азр ма! 5ег Ні си 260 265 270
Азр Рго сіи МмаЇ Гуз Ре А5п Тер туг ма! Азр сіу маї сіи маї ні 275 280 285 А5п АЇа Гуз Тиг о Гуз Рго Агуд сій сій сбіп Туг Азп 5ег ТтВг туг Ага 290 295 з00 ма! ма! 5ег маїЇ Ге тиг маї Гей Ні сіп Азр Тер Гей А5Зп СУ Гуз 305 310 315 320 сі тує Гуз Суз Гуз ма! 5ег Азп Гуз АїЇа Гей Рго АЇа Рго ІЇе Си 325 330 335
Гуз Тийг ІЇе бек Гуз АЇа Гуз сіу сп Рго Агд сіи Рго сіп ма! туг бо 340 345 350
Тк ге Рго Рго бег Агуд сім сіи Метєт Тийг Гуз Азп сіп ма! 5ег Геи 355 360 365 65 тег осуз Ге маї Гуз с1у Ре Туг Рго 5ег А5р ІЇе АїЇа ма! си Тер 370 375 380 сіи 5ег АЗп сіу сіп Рго сій Ап АбЗп о Туг Гуз Тс о тТВг Рго Рго маї 385 390 395 400 70
Гей А5р б5ег А5Зр сіу б5ег Ре Ре їеи Туг 5ег губ Ге Тиг ма! дор 405 410 415
Гуз 5ег Агуд Тер сп сіп сіу Азп Ма! Ре 5ег Су5 б5ег ма! Мет нів 420 425 430 сій АЇїа Гей Ні А5п Ні Туг Тс о сіп Гуз 5ег їеи 5ег Гей 5ег РгО 435 440 445 чу «2105 78 «2115 120 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» п2208г2 пПеаму спаїп НО76б, мн «4005 78 сп ма! сіп Геи маїЇ сіп 5ег с1у Аїа сіи ма! Гуз Гуз Рго сіу Аїа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз маЇ 5ег Су5 Гуз АЇа бек сіу туг Тйг РМПе тТиг 5ег туг 20 25 30
Зо тукг Пе ніх Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу сіп сіу гГеи сіи Ттгр мес сіу Тер те Тер Рго сіу А5р сіу 5ег ТИг Гуз туг АЇа сіп Гуз РНе 35 50 55 60 сіп сіу Агуд ма! тийг мес тйг о Агу АЗр о тиг об5ег тис обег о тиг ма! туг 65 70 75 80 40 Меє сій Ге 5ег 5ег Гей Агуд 5ег сій А5р Тийг Аїа ма! Туг туг су 85 90 95
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗзп Туг АЇїа Меє дор Ттуг Тгр с1у сіп 100 105 110 45 сіу тйг Ге ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120 «2105» 79 «2115» 449 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» п2208єг2 Пеаму спаїп нО76 ТиИ11 Тепатн «4005 79 60 сі1п ма! сіп Гей ма! сіп 5ег сіу АїТа сіи ма! Гуз Гуз Рго су Аїа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз маЇ 5ег Су5 Гуз АЇа бек сіу туг Тйг РМПе тТиг 5ег туг 20 25 30 65 тукг Пе ніх Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу сЇп сіу ге сіи Ттгр мес 35 40 45 сіу Тер те Тер Рго сіу А5р сіу 5ег ТИг Гуз туг АЇа сіп Гуз РНе 70 50 55 60 сіп сіу Агуд ма! тийг мес тйг о Агу АЗр о тиг об5ег Тис обег о тиг ма! туг 65 70 75 80
Мет сій Ге 5ег 5ег Гей Агуд 5ег сі А5зр Тийг АТа ма! Туг туг су 85 90 95
Аїа бек Рго Мет ІЇе ТНг о Рго АЗп Туг АЇїа Мет А5зр туг Тер с1у сп 100 105 110 сіу тйг Гей ма! тиг омМмаї 5ег б5ег АЇа б5ег Тиг Гуз сіу Рго 5ег маї 115 120 125
Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег ТИг 5ег сіу сіу тпг АїЇа Аїа 130 135 140
Гей сіу Суз Ге ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сі Рго ма! тТиг ма! 5ег 145 150 155 160
Тер Азп 5ег с1у Аїа Гей Тийг о б5ег сіу ма! ніх тиг РМпе Рго АїЇа маї 165 170 175 ей сіп 5ег 5ег сіу Гей Ттуг б5ег Ге б5ег 5ег ма! ма! тик ма! Рго 180 185 190 5ег б5ег 5ег ей сіу Тйг о сіп Тийг отуг те Суз Азп маїЇ Азп Ні уз 195 200 205
Рго б5ег А5п ТИйгогГуз ма! А5зр Гуз Агуд ма! сі Рго Гу5 5ег сСуз др 210 215 220
Гуз ТВг ні Тс Суб Рго Рго Су5 Рго АїЇа Рго сіи Геи Гей сІіу с1У 225 230 235 240
Рго бег ма! Ре Ге Ре Рго Рго Гуз Рго Гуз Азр ТИг Ге Мет Пе 245 250 255 зег Агуд ТигоРгГо сіи ма! Тк сСуз ма! ма! ма! Азр маї 5ег ні си 260 265 270
Азр Рго сіи МмаЇ Гуз Ре А5п Тер туг ма! Азр сіу маї сіи маї ні 275 280 285
А5п АЇа Гуз ТИг Гуз Рго Агуд сої сій сбіп Ттуг АЗп 5ег ТАйг Ттуг Агд 290 295 з00 ма! ма! 5ег маїЇ Ге тиг маї Гей Ні сіп Азр Тер Гей А5Зп СУ Гуз 305 310 315 320 сіи туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег А5п уз АїЇа Гей Рго АїЇа Рго ІЇе СЇи 325 330 335
Гуз Тийг ІЇе бек Гуз АЇа Гуз сіу сп Рго Агд сіи Рго сіп ма! туг 340 345 350
Тк ге Рго Рго бег Агуд сім сіи Меє Тийг Гуз Азп сіп ма! 5ег Геи 355 360 365
ТВг осСуз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр ІЇе АЇїа ма! си тер бо 370 375 380 сіи 5ег АЗп сіу сіп Рго сій Ап АбЗп о Туг Гуз Тс о тТВг Рго Рго маї 385 390 395 400 65 Гей А5р б5ег Ар с1у б5ег Ре РПе Геи Туг 5ег уз Гей Тиг ма! дор 405 410 415
Гуз 5ег Агуд Тер сп сіп сіу Азп Ма! Ре 5ег Су5 б5ег ма! Мет нів 420 425 430 70 сій АЇїа Гей Ні А5п Ні Туг Тйг о сіп Гуз 5ег їеи 5ег Гей 5ег РгГО 435 440 445 чу
«2105» 80 «2115 120 «2125 РЕТ «2135 актітісіа! «220» «223» п2208г2 пПеаму спаїп НО77, МН «4005 80 сіп ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу АЇа сіи ма! Гу5 Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз ма! 5ег сСуз Гуз АЇїа б5ег сіу Туг ТНПг РНе тиг 5ег туг 20 25 30 тукг Пе ніх Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу сіп сіу гГеи сіи Ттгр мес 35 40 45 сіу Тер те Тер Рго сіу А5р сіу 5ег ТИг Гуз Туг АЇа сіп Гуз РНе 50 55 60 сіп сіу Агуд ма! тийг мес тйг о Агу АЗр о тиг об5ег тис обег о тиг ма! туг 65 70 75 80 мес сі їеи бек б5ег Ге Агд бег сі А5р Тйг АїЇа ма! туг РНе су 85 90 95 АЇїа бег Рго Мет І1е Тийг Рго А5п Туг АЇа Меї дор Туг Тгр с1у сп 100 105 110 сіу тйг Ге ма! тиг маї 5ег 5ег 115 120
«210» 81 «2115» 449 «2125 РЕТ «2135 акітісіа! «220» «223» п2208єг2 Пеаму спаїп нО77 Ти Тепатн «4005 81 сіп ма! сіп ге ма! сіп 5ег сіу АЇа сіи ма! Гу5 Гуз Рго сІу АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз ма! 5ег сСуз Гуз АЇїа б5ег сіу Туг ТНПг РНе тиг 5ег туг 20 25 30 тукг Пе ніх Тер ма! Агу сп АїЇа Рго сіу сіп осЇу ге сіи Ттгр мес 35 40 45 (516) сіу Тер те Тер Рго сіу А5р сіу 5ег ТИг Гуз туг АЇа сіп Гуз РНе 50 55 60 сіп сіу Агуд ма! тийг мес тйг о Агу Ар о тТиг об5ег Тис о бег тис ма! туг 65 65 70 75 80 мес сі їеи бек б5ег Ге Агд бег сі Азр Тйг АїЇа ма! туг РНе су 85 90 95 70 Аїа б5ег Рго Меж ІЇе ТИг Рго А5п Туг Аїа Меї А5р Туг Тгр О1у сіІп
100 105 110 сіу тйг Гей ма! тиг омМмаї 5ег б5ег АЇа б5ег Тиг Гуз сіу Рго 5ег маї 115 120 125
Ре Рго Гей АЇа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег ТИг 5ег сіу сіу ТНг Аїа Аїа 130 135 140
Гей сіу Сузх Ге ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сі Рго ма! тТиг ма! 5ег 145 150 155 160
Тер А5п о б5ег с1у АїЇа Ге Тийг о5ег сіу ма! нНі5 Тийг Ріе Рго Аїа маї 165 170 175 ей сіп бег бек с1у Геи Туг бек Ге 5ег 5ег ма! ма! тиг о маї Рго 180 185 190 5ег б5ег 5ег ей сіу Тийг о сіп Тийг отуг те Су5 Азп маїЇ Азбтп Ні уз 195 200 205
Рго 5ег А5п ТИйгогГуз ма! А5р Гуз Агуд ма! сі Рго Гуз 5ег сСуз др 210 215 220
Гуз ТВг ні Тс Суб Рго Рго Су5 Рго АїЇа Рго сіи Геи Гей сІіу сС1У 225 230 235 240
Рго 5ег ма! Ре Ге РПе РгО РГО Гуз Рго Гуз АЗзр ТИг Гей Мет Пе 245 250 255
Зо зег Агуд Тиг оРгГоО сіи ма! Тк сСуз ма! ма! ма! Азр маї 5ег ні си 260 265 270
Азр Рго сіи МмаЇ Гуз Ре А5п Тгр Ттуг ма! Азр сіу маїЇ сіи маї ні 275 280 285
А5п АЇа Гуз Тиг Гуз Рго Агуд сої сій сбіп Ттуг АЗп 5ег о ТАйг Ттуг Агд 290 295 з00 ма! ма! 5ег ма! Ге тиг маї Ге ні сіп А5р Тер Геи А5Зп су Гуз 305 310 315 320 сі тТуг Гуз Суз Гуз МмаїЇ 5ег Азп Гуз АїЇа Ге Рго АЇа Рго ІЇе Си 325 330 335
Гуз Тийг ІЇе бек Гуз АЇа Гуз сіу сп Рго Агд сіи Рго сіп ма! туг 340 345 350
Тк ге Рго Рго бег Агуд сім сіи Меє Тийг Гуз Азп сіп ма! 5ег Геи 355 360 365
Тиг осСуз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг Рго 5ег А5Зр ІЇе АЇїа ма! си тер 370 375 380 сіи бег А5п сіу сіп Рго сій А5п Ап о Туг Гуз ТВг о тТАг Рго РГгГО Ммаї 385 390 395 400
Гей А5р б5ег А5Зр сіу б5ег Ре Ре їеи Туг 5ег губ Ге Тиг ма! дор 405 410 415 (516)
Гуз 5ег Агуд Тер сп сіп сіу Азп Ма! Ре 5ег Су5 б5ег ма! Мет нів 420 425 430 сій АЇїа Гей Ні А5п Ні Туг Тйг о сіп Гуз 5ег їеи 5ег Гей 5ег РгГО 65 435 440 445 с1у 70 «2105» 82
«2115 512 «2125 РЕТ «2135 АгтіТісіа! «220» «223» Митатей ІСЕ-18К ЕСО МКесгтіпа! міс Агдіпіпе ас розіїіоп 494 «4005» 82
Меє уз 5ег сіу 5ег сіу сіу сіу б5ег Рго Тиг 5ег Геи Тгр су Ге 1 5 10 15
Ге Ре Геи 5ег АЇа АЇїа Гей 5екг ге Тгр Рго Тиг 5ег су сім Пе 20 25 30 суз сІЇу Рго сіу Іїе д5р ІЇе Агуд Азп А5р Туг сп сіп Ге Гуз Ага 35 40 45
Гей сі Азп Суз Тиг о маїЇ те сіи сіу туг Ге Ні5 ІЇе Гей їГеи Пе 50 55 60 5зег Гуз Аїа сій А5р Туг Агуд б5ег Туг Агуд Ре Рго Гуз Ге ТЕиг маї 65 70 75 80
ІІе тиг сіи Ттуг Гей Гей Ге Ре Агуд ма! АТа сІу гГеи сіи 5ег Геи 85 90 95
О1Уу А5р Гей Ре Рго А5п Ге Тиг ма! ІЇе Агд сіу тер Гуз Ге Ре 100 105 110
Зо туг Азп Туг Аїа Ге ма! ІЇїе Ре сіи Мет ТНг А5п Гей Гуз А5Зр ІїЇе 115 120 125 о1Уу Геи Туг А5Зп Гей Аг А5Зп ІЇе ТНг Агу С1у АЇїа ІЇе Агд Пе си 130 135 140
Гуз АЗп АЇа А5Зр Гей Суз Туг Гей 5ег ТИг ма!ї Азр Тгр 5ег ге Пе 145 150 155 160
Гей А5р Аїа ма! 5ег д5п доп Туг ІЇІе ма! су А5п Гу5 Рго РГгОо Гуз 165 170 175 сіи Суз с1у А5р Гей Суб Рго сіу ТтТйг о Меє сіи сі Гуз Рго Мет су 180 185 190 сіи Гуз Тк Тс о ІЇе доп доп сій Туг Азп туг Агдуд Суз Тер тег тег 195 200 205
АЗзп Агуд Суз соЇп Гуз Мек Суз Рго 5ег ТИг Су5з су Гуз Агд Аїа су 210 215 220
Тис оси Ап о АЗп сі Суз Суб5 Ні Рго сіи Суб Ге сіу 5ег Су 5ег 225 230 235 240 АїЇа Рго А5р Ап др о Тиг о АЇа Суз ма! Аїа су5 Агд ніх Туг туг туг 245 250 255
АТїа сіу ма! Суз ма! Рго АЇа Суз Рго Рго А5зп ТИг туг Агд РПе си 260 265 270 (516) с1у Тер Агд Суз ма! дор Аг Ар РПе сСуз АЇа Ап ІЇе Ге 5ег АїЇа 275 280 285 сі 5ег б5ег А5р б5ег сіи сІіу Ре ма! ІЇе Ні А5р сіу сіи Суз Мет 65 290 295 з00 сп сій Суз Рго б5ег сіу Ре ІЇе Агд Азп сіу бег сіп 5ег Мес туг 305 310 315 320 70 сСу5 те Рго Су5 сіи сіу Рго Су5 Рго Гуз Ма! Суз сЇи соми си Гуз
325 330 335
Гуз ТВгогГуз ТВг о ІІе Азр 5ег ма! тиг 5ег АїЇа сіп мет гей сіп сС1У 340 345 350 суз Тийг ІЇе Рпе Гуз с1у А5п Гей Геи ІЇе А5п ІЇе Агу Агд о1У А5П 355 360 365
А5п ІЇе Аїа 5ег сіи Гей сі А5зп Ре Меї сіу гей ІЇе сіи маї ма! 370 375 380
Тег о сТ1у туг ма! Гуз Іїе Агуд Ні бек Ні АЇїа Ге ма! 5ег геи 5ег 385 390 395 400
Ре Геи Гу5 Ап Гей Агд Геи ІЇе гГеи сТ1у сім сім сіп гГеи си сІ1у 405 410 415
Азп Ттуг 5ег РПпе Туг ма! гГеи А5Зр Азп сп Азп Гей сіп сіп Гей Тер 420 425 430
А5зр Тер Ар НІі5 Агу Ап оїеи Тиг ІЇе Гуз АїЇа сіу Гуз Меє Туг РНе 435 440 445
АТа Ре Азп Рго Гуз Гей Суз Ма! 5ег сіи ІїІе туг Агд Меє си си 450 455 460 ма! тик оТу тиг Гуз с1іу Агуд сЇп 5ег Гуз сіу А5р ІЇе доп ТИг Агд 465 470 475 480
А5п Ап с1у сій Агуд Аїа б5ег Суз сій бек АЗр ма! Геи Агуд Рпе тНг 485 490 495 5ег Тис о тиг о тиг о б5ег уз А5Зп Аг ІЇе ІЇе ІЇе тНг тгр Ні Агд туг 500 505 510 «2105» 83 «2115 941 «2125 РЕТ «2135 АгтіТісіа! «220» «223» с1 Ггадтепе міїй ніх тад «4005 83
Меєт Гуз б5ег сіу 5ег сіу сІіу сіу 5ег Рго Тиг 5ег їеи Тгр с1Уу Гей 1 5 10 15
Ге Ре Геи 5ег АЇа АЇїа Гей 5екг ге Тгр Рго Тиг 5ег су сім Пе 20 25 30 суз сІЇу Рго сіу Іїе д5р ІЇе Агуд Ап А5зр Туг сп сіп Геи Гуз Ага 35 40 45
Гей сі Азп Суз Тиг ма! чІЇе сіи сІу туг Геи Ні ІЇе Ге Ге Пе 50 55 60 5зег Гуз Аїа сій А5р Туг Агуд 5ег Туг Агдуд Ре Рго Гуз Геи ТЕг ма! 65 70 75 80 (516)
ІІе тиг сіи Ттуг Гей Гей Ге Ре Агуд ма! АТа сІу гГеи сіи 5ег Геи 85 90 95
О1Уу А5р Гей Ре Рго А5п Ге Тиг ма! ІЇе Агд сіу тгр Гуз Геми РПе 65 100 105 110 туг Азп Туг Аїа Ге ма! ІЇїе Ре сіи Мет ТНг А5п Гей Гуз А5Зр ІїЇе 115 120 125 70 су Геи Туг А5п Гей Агд Азп ІІе ТНг Агу СІу Аїа Іїе Агд Пе си
130 135 140
Гуз АЗп АЇа А5Зр Гей Суз Туг Гей 5ег ТИг ма!ї Азр Тгр 5ег ге Пе 145 150 155 160
Гей А5р Аїа ма! 5ег Ап АЗп Туг Іч1іе маї сІіу Азп Гуз Рго Рго Гуз 165 170 175 сіи Суз с1у А5р Гей Суб Рго сіу ТтТйг о Меє сіи сі Гуз Рго Мет су 180 185 190 сіи Гуз Тк Тс о ІЇе доп доп сій туго Азп Туг Агдуд Суз Тер тег тег 195 200 205 А5п Агуд Суз сіп Гуз Мет Суб Рго б5ег Типг Су5з сіу Гуз Агд АїЇа су» 210 215 220
Тис оси Ап о АЗп сі Суз Суб5 Ні Рго сіи Суз Ге сІу 5ег Су 5ег 225 230 235 240
АТїа Рго А5р АЗп дор Тс АЇа Суз ма! АЇїа Су5 Агу Ні Туг Туг туг 245 250 255
АТїа сіу ма! Суз ма! Рго АЇа Су5з Рго Рго А5зп ТИг туг Агд РПе си 260 265 270 с1у Тер Агд Суз ма! дор Аг Ар РПе сСуз АЇа Ап ІЇе Ге 5ег АїЇа 275 280 285 сі бег 5ег д5р 5ег сій с1у Рпе ма! ІЇе Ні5 А5р сіу сіи Су мет 290 295 з00 сп сій Суз Рго б5ег сіу Ре ІЇе Агд Азп сіу бег сіп 5ег Мес туг 305 310 315 320 сСуз ІчІЇ1е Рго Су5з сі сіу Рго Суб Рго Гуз ма! Су5з сім сіи сіи Гуз 325 330 335
Гуз ТВгогГуз ТВг о ІІе Азр 5ег ма! тиг 5ег АїЇа сіп мет гей сіп сС1У 340 345 350 суз Тийг ІЇе Рпе Гуз с1у А5п Гей Геи ІЇе А5п ІЇе Агу Агд су А5Пп 355 360 365 А5п ІчІЇе Аїа 5ег сій Гей сій А5п Рпе Меї су гГеи ІЇе сіи маї ма! 370 375 380
Тк о сТ1у туг ма! Гуз ІЇїе Агуд Ні бек Ні Аїа ге ма! 5ег їеи 5ег 385 390 395 400
Ре Геи Гу5 Ап Гей Агд Геи ІЇе гГеи сТ1у сім сім сіп гГеи си сІ1у 405 410 415
Азп Ттуг 5ег РПпе Туг ма! гГеи А5Зр Азп сп Азп Гей сіп сіп Гей тер 420 425 430
А5зр Тер Ар НІі5 Агу Ап оїеи Тиг ІЇе Гуз АїЇа сіу Гуз Меє Туг РНе 435 440 445 60 Аїа Ре А5п Рго Гу5 Геи Суз ма! 5ег сЇи Іїе туг Агд меє си си 450 455 460 ма! тик оТу тиг Гуз с1іу Агуд сЇп 5ег Гуз сіу А5р ІЇе доп ТИг Агд 465 470 475 480 65
А5п о А5п со1у сої Аг Аїа бек Суз сі 5ег А5р ма! Ге Ні Ре ТЕг 485 490 495 5ег Тис о тиг о тиг о б5ег уз А5Зп Аг ІЇе ІЇе ІЇе тНг тгр Ні Агд туг 70 500 505 510
Аг Рго Рго Азр Туг Агуд Ар Ге ІЇІе 5ег Ре Тийг ма! туг туг Гуз 515 520 525 сім Аїа Рго Ре Гуз А5зп ма! тТиг сіи Ттуг Азр су сп А5р Аїа су 530 535 540 сіу 5ег АЗп 5ег Тгр Азп Мет МмаЇ Азр маїЇ А5Зр Гей Рго Рго А5П Гуз 545 550 555 560 сім сіу сій Рго сСІу ІЇе Гей Гей Ні5 сіу Ге Гу5 Рго Тер Тис сп 565 570 575 туг АТа ма! туг ма! Гуз Аїа ма! Ттийг ге тиг Мет ма! си А5бп А5р 580 585 590
Ні ІЇе Агу сО1Уу АЇа Гуз б5ег сЇи ІЇе Ге Туг ІІе Агд Ттйг А5п Аїа 595 600 605 5зег ма! Рго 5ег ІЇе Рго Гей Азр Ма! Геи б5ег АЇа 5ег А5зп 5ег 5ег 610 615 620 5ег сіп Ге ІЇе ма! Гуз Тер А5п РГгГО Рго ТИг Геи Рго А5п су А5ПпП 625 630 635 640
Гей б5ег Туг Туг Іе ма! Агд Тер сп Агду сіп Рго сіп А5р су туг 645 650 655
Ге туг Агд Ні Ап Туг Суз бег Гуз Азр Гуз ІЇе Рго ІЇе Ага Гуз
Ко) 660 665 670 туг АТа Азр сіу Тйг ІЇе Азр ма! сіи сіи ма! тйг си Азп РГгО Гуз 675 680 685 тс сій ма! Суз сіу с1у Азр Гуз сіу Рго Суз Су5з АЇа Су5 Рго Гуз 690 695 700
Те ом АТа сіи Гуз сп АТа сіи Гуз сій сої Аїа сіи туг Агд Гуз 705 710 715 720 ма! Ре си Азп Ре Гей Ні Азп 5ег ІЇе Ре ма! Рго Аг Рго си 725 730 735
Аг Агуд Агу Агу АЗр ма! мет сіп ма! АЇа А5п тТиг о тиг Мет 5ег 5ег 740 745 750
Аг бек Агуд Ап о Тйг отТйг омаї АТа дор тТйг о туг Абп о ІЇе ТИг дор Рго 755 760 765 сій сій РБе сіи Тйг сій туго Рго Рпе Рпе сіи 5ег Агд ма! А5р А5п 770 7175 780
Гуз сій Агуд Тс ма! ІЇе б5ег А5Зп Ге Аг Рго Ре Тийг Геи туг Ага 785 790 795 800 ч11е А5р ІЇе Ні5 5ег Суз Азп Ні сій АЇа сій Гуз Гей сіу Су5 5ег 805 810 815
АТїа бек Ап Ре ма! Ре АЇїа Агуд тйг мес Рго Аїа сЇи сІу Аїа А5р бо 820 825 830
Азр ч11е Рго со1у Рго ма! Тийг Тер сЇи Рго Агу Рго си А5п 5ег ІЇе 835 840 845 65 Ре Геи Гуз Тер Рго сім Рго сій Азп РгОо А5п сіу гей ІЇе Геми мес 850 855 860
Ттуг ої ІІе Гуз Тукг оІу 5ег сіп ма! сіи А5р сіп Агд сій су ма! 865 870 875 880 70
5ег Агд сп соЇи Ттуг Агд Гуз туг сІЇу сТ1у Аїа Гуз гГеи А5бп Ага гГеи 885 890 895
АЗп о Рго с1у Азп Туг Тйг Аїа Агу І1ІЇе сіп Аїа тНг 5ег Геи 5ег су 900 905 910
Азп сіу б5ег Тер Тйг о А5Зр Рго ма! Ре РіПе Туг ма! Рго АЇа Гуз Тег 915 920 925 тс тує си Абп РВе Мет Ні Ні Ні Ні Ні НІі5 НІі5 930 935 940 «2105» 84 «2115 939 «2125 РЕТ «2135 АгтіТісіа! «220» «223» с2 Тгадтепе міїй ніх тад «4005» 84
Меєт Гуз б5ег сіу 5ег сіу сІіу сіу 5ег Рго Тиг 5ег їеи Тгр с1Уу Гей 1 5 10 15 ма! Ре гГеи 5ег АЇа АЇа ге 5ег ей Тер Рго Тиг 5ег сІу сЇи Іе 20 25 30
Зо суз сІЇу Рго сіу Іїе д5р ІЇе Агуд Ап А5зр Туг сп сіп Геи Гуз Ага
Гей сі Азп Суз Тиг о маїЇ те сіи сіу Ре гГеи Ні5 ІЇе Гей їГеи Пе 35 50 55 60 5зег Гуз Аїа сій А5р Туг Агуд 5ег Туг Агдуд Ре Рго Гуз Геи ТЕг ма! 65 70 75 80 40 ІІе тиг сіи Ттуг Гей Гей Ге Ре Агуд ма! АТа сІу гГеи сіи 5ег Геи 85 90 95
О1Уу А5р Гей Ре Рго А5п Ге Тиг ма! ІЇе Агд сіу тгр Гуз Геми РПе 100 105 110 45 туг Азп Туг Аїа Ге ма! ІЇїе Ре сіи Мет ТНг А5п Гей Гуз А5Зр ІїЇе 115 120 125 о1Уу Геи Туг А5Зп Гей Аг А5Зп ІЇе Тиг Аг СсС1у АїЇа ІЇе Агд Пе си 130 135 140
Гуз АЗп АЇа А5Зр Гей Суз Туг Гей 5ег ТИг ІЇе А5Зр Тгр 5ег Ге Пе 145 150 155 160
Гей А5р Аїа ма! 5ег д5п доп Туг ІЇІе ма! сІіу А5зп Гу5 Рго РГгО Гуз 165 170 175 сіи Суз с1у А5р Ге Суб5 Рго сіу Тйг гей сіи сі Гуз Рго Мет су 180 185 190 (516) сіи Гуз Тк Тс о ІЇе доп доп сій туго Азп Туг Агдуд Суз Тер тег тег 195 200 205
АЗзп Агуд Суз сп Гуз Мек Суз Рго 5ег ма! Су5 оТу Гуз Агд Аїа су 65 210 215 220
Тис оси Ап о АЗп сі Суз Суб5 Ні Рго сіи Суз Ге сІу 5ег Су Ні 225 230 235 240 70 Те РгОо А5р др о АЗп Тиг о тТйг Суз ма! АТа сСуз Агд Ні туг туг туг
245 250 255
Гуз сіу ма! Суз ма! Рго АЇа Су5 Рго Рго сіу Тийг туг Ага Ре си 260 265 270 с1у Тер Агд Суз ма! дор Агд Ар Ре Суз АЇа Ап ІЇе Рго А5п АїЇа 275 280 285 сі 5ег б5ег А5р б5ег Ар сІіу Ре ма! ІЇе Ні А5р А5Зр сіи Суз Мет 290 295 з00 сп сій Суз Рго б5ег сіу Ре ІЇе Агд Азп 5ег Тиг сіп 5ег Мет туг 305 310 315 320 сСуз ІчІЇ1е Рго Су5з сі сіу Рго Суб Рго Гуз ма! Су5 СсІу А5зр си си 325 330 335
Гуз Гуз ТИгогуз Тиг о ІЇе А5р 5ег ма! тиг 5ег АТа сіп мес гГеи сп 340 345 350 сІу Суз Тк ІЇе Гей Гуз сІ1у Азп еп Ге ІЇе Азп ІЇе Аг9 Ага су 355 360 365 А5зп Азп ІІе АЇа 5ег сій Гей сі А5зп Рпе Меї сіу гГеи ІЇе сіи ма! 370 375 380 ма! тик сТу туг ма! Гуз ІЇе Агд ніх 5ег Ні5 АЇа Ге ма! 5ег геи 385 390 395 400
Зо 5ег Рпе Геи Гуз А5Зп Гей Агд Геи ІЇе гГеи сіу сЇми сЇми сіп Геи си 405 410 415 с1Уу А5зп Туг 5ег Ре Туг маї Гей А5р АЗп сіп АЗп ге сіп сіп Гей 420 425 430
Тер А5р Тер Абп Ні Агу Ап Ге Тйг ма! Агу 5ег сіу Гуз мМмеє туг 435 440 445
Ре АЇїа РПпе А5п РГгГоО Гуз Ге Суз Ма! 5ег сіи чІ1е туг Агд Меї си 450 455 460 сіи ма! тк сіу тийг огуз с1у Агуд сп 5ег Гуз сІу Азр ІЇе А5зп ТЕГ 465 470 475 480
Аг А5п Абп о1у сій Агуд Аїа 5ег Суз сі бег А5Зр ма!ї Геи Аг РПе 485 490 495
Тк обег тис о тайгс те тер Гуз АбЗп Аг ІчІЇе ч1Їе ІЇе тйг Тер Ні5 Ага 500 505 510 тукг Аг Рго Рго Ар Туг Аг Азр Гей ІЇе 5ег Ре Тийг ма! туг туг 515 520 525
Гуз сі Аїа Рго Ре Гуз А5п ма! Тийг соЇи туг Азр с1у сіп А5р Аїа 530 535 540
Суз сіу б5ег А5п о б5ег Тер АЗп Мет ма! Азр ма! Азр 'Геи Рго Рго дп 545 550 555 560 (516)
Гуз Азр ма! сім Рго сІу ІЇе гей Гей Ні СсСІу Гей Гуз Рго Тгр ТЕГ 565 570 575 сіп туг АТа ма! туг маїЇ Гуз АїЇа ма! тик Ге тиг мет маї сіи д5п 65 580 585 590
А5зр Ні ІЇе Агу су Аїа гу5 5ег сім ІЇе їеи Ттуг ІЇїе Агд Тйг А5Пп 595 600 605 70 Аїа б5ег маї Рго 5ег ІІе Рго Гей Азр ма! Геи б5ег АЇа 5ег А5п 5ег
610 615 620 5ег б5ег сіп Гей ІІе ма!ї Гуз Тер Азп Рго Рго 5ег Гей Рго Азп су 625 630 635 640
АЗзп о Гей б5ег Ттуг Туг ІІе маї Агд Тер сіп Агу сп Рго сіп А5р су 645 650 655 тукг Ге туг Агд Ні АЗзп Туг Суз бег Туз А5Зр Гуз ІІе Рго ІїЇе Ага 660 665 670
Гуз туг АТа Азр сіу тТйг ІЇе Азр ІЇе сіи сіи ма! тйг си А5пП РГгГО 675 680 685
Гуз ТтТийг сій ма! сСуз сіу сіу сій Гуз со1у Рго Суз Су5 АЇа сСуз Рго 690 695 700
Гуз Тпг сій Аїа сЇи Гуз сіп АїЇа сЇи Гуз сім сім АїЇа сім туг Ага 705 710 715 720
Гуз ма! Рпе сіи Азп Ре Геи Ні Азп 5ег ІЇе Ре ма! Рго Ага Рго 725 730 735 сої Аг Гуз Агуд Агу Азр ма! мес сіп ма! діа А5п тТийг тиг мет 5ег 740 745 750 зег Агд б5ег Аг АЗп о ТИг Тс АТа Аїа А5р тис о туг АЗп ІЇе ТИг А5р 755 760 765
Рго сім сій Гей сій Тйг осі тує Рго Ре Ре сіи б5ег Агд ма! дор 770 775 780
АЗзп о Гуз сої Агуд Тс Ома! Іч11е 5ег А5п Ге Агуд Рго Ре ТЕИг Геи туг 785 790 795 800
Аг ІІе А5р ІЇе Ні бек сСу5 А5Зп Ні сім АїЇа сіи Гуз Ге сіу су 805 810 815 5зег АїЇа 5ег А5зп Ріпе ма! Ре АТа Агуд тйг мес Рго АїЇа сіи сІу Аїа 820 825 830
А5Зр А5р ІЇе Рго сіу Рго ма! тиг Тер сЇи РгОо Агу Рго сі А5п 5ег 835 840 845 ч11е РПе Геи Гуз Тер Рго сЇи Рго сіи Абзп РгГО А5Зп су Гей ІЇе Ге 850 855 860 мес туг сій чІІе Гуз туг сіу 5екг сп ма! сіи Азр сіп Агд си су 865 870 875 880
Уа! 5ег Агуд сп сім Туг Агуд Гуз Туг су с1у АТа Гуз Геи А5п Агд 885 890 895
Гей А5п о Рго сіу Азп Туг Тйг Аїа Агуд ІЇе сіп АЇїа Тйг 5ег Геи 5ег 900 905 910 с1у А5п о сіу 5ег Тер Тйг о А5Зр Рго ма! Ре Ре Туг ма! сіп Аїа Гуз 915 920 925 60 Те су туг сі Абзп Ні Ні Ні Ні Ні Ні 930 935 «2105» 85 65 «211» 938 «2125 РЕТ «2135 АгтіТісіа! «220» 70 «223» сС3 Тгадтепс мій ніх Ттад
«4005 85
Меєт Гуз б5ег сіу 5ег сіу сІіу сіу 5ег Рго Тиг 5ег їеи Тгр с1Уу Гей 21 5 10 15
Ге Ре Геи 5ег АЇа АїЇа Гей 5екгїеи Тер Рго Тиг 5ег су сім Пе 20 25 30 сСу5 с1у Рго су ІЇе Азр ІЇе Аг А5п А5р Туг сіп сіп Гей Гуз Ага 35 40 45
Гей сі Азп Суз Тиг о маїЇ те сіи сіу туг Ге Ні5 ІЇе Гей їГеи Пе 50 55 60 5зег Гуз Аїа сій А5р Туг Агуд 5ег Туг Агдуд Ре Рго Гуз Геи ТЕг ма! 65 70 75 80
ІІе тиг сіи Ттуг Гей Гей Ге Ре Агуд ма! АТа сІу гГеи сіи 5ег Геи 85 90 95
О1Уу А5р Гей Ре Рго А5п Ге Тиг ма! ІЇе Агд сіу тгр Гуз Геми РПе 100 105 110 Туг Азп Ттуг АЇїа Ге ма! ІчІЇе Рпе сіи Меє тиг А5п Гей Гуз Азр Пе 115 120 125 о1Уу Геи Туг А5Зп Гей Аг А5Зп ІЇе Тиг Аг СсС1у АїЇа ІЇе Агд Пе си 130 135 140
Зо
Гуз АЗп АЇа А5Зр Гей Суз Туг Гей 5ег ТИг ма!ї Азр Тгр 5ег ге Пе 145 150 155 160
Гей А5р Аїа ма! 5ег Ап АЗп Туг Іч1іе маї сІіу Азп Гуз Рго Рго Гуз 165 170 175 сіи Суз с1у А5р Гей Суб Рго сіу ТтТйг о Меє сіи сі Гуз Рго Мет су 180 185 190 сій Гуз Тиг отиг те АЗп АЗп сій Туг Ап о тТуг Аг Суз Тер тс тег 195 200 205
АЗзп Агуд Суз соЇп Гуз Мек Суз Рго 5ег ТИг Су5з су Гуз Агд Аїа су 210 215 220
Тис оси Ап о АЗп сі Суз Суб5 Ні Рго сіи Суз Ге сІу 5ег Су 5ег 225 230 235 240 АїЇа Рго А5р Ап др о Тиг о АЇа Суз ма! АЇїа су5 Агд ніх Туг Ттуг туг 245 250 255
АТїа сіу ма! Суз ма! Рго АЇа Су5з Рго Рго А5зп ТИг туг Агд РПе си 260 265 270 с1у Тер Агдуд Суз ма! дор Аг Ар РПе сСуз АЇа Ап ІЇе Ге 5ег АїЇа 275 280 285 сі 5ег б5ег А5р б5ег сі сІіу Ре ма! ІЇе Ні А5р сіу сіи Суз Мет бо 290 295 з00 сіп сій Суз Рго б5ег сіу Ре ІЇе Агд Азп сіу б5ег сіп 5ег Мес туг 305 310 315 320 65 сСуз ІчІІе Рго Суб сім с1іу Рго Су5 Рго Гуз Ма! Суз сЇи соми си Гуз 325 330 335
Гуз ТВгогГуз Тийг о ІІе Азр 5ег ма! тиг 5ег АїЇа сіп мет гей сіп сС1У 340 345 350 70 суз Тийг ІЇе Рпе Гуз с1у А5п Гей Геи ІЇе А5п ІЇе Агу Агд о1У А5П 355 360 365
А5п ІЇе Аїа 5ег сіи Гей сі А5зп Ре Меї сіу гей ІЇе сіи маї ма! 370 375 380
Тег о сТ1у туг ма! Гуз Іїе Агуд Ні бек Ні АЇїа Ге ма! 5ег геи 5ег 385 390 395 400
Ре Геи Гу5 Ап Гей Агд Геи ІЇе гГеи сТ1у сім сім сіп гГеи си сІ1у 405 410 415
Азп Ттуг 5ег РПпе Туг ма! гГеи А5Зр Азп сп Азп Гей сіп сіп Гей Тер 420 425 430
А5зр Тер Ар НІі5 Агу Ап оїеи Тиг ІЇе Гуз АїЇа сіу Гуз Меє Туг РНе 435 440 445
АТа Ре Азп Рго Гуз Гей Суз Ма! 5ег сім ІїІе туг Агд Ммеє си си 450 455 460 ма! тик оТу тиг Гуз с1іу Агуд сЇп 5ег Гуз сіу А5р ІЇе доп ТИг Агд 465 470 475 480 А5п Азп с1у сі Агуд Аїа б5ег Суз сій бек А5р ма! Ге Агд Ре тЕпг 485 490 495 5ег Тис о тиг о тиг о б5ег уз А5Зп Аг ІЇе ІЇе ІЇе тНг тгр Ні Агд туг 500 505 510
Зо
Ага Рго Рго Азр Туг Агуд Азр Ге ІІе 5ег Ре Тийг ма! туг туг Гуз 515 520 525 сі АЇїа Рго Ре Гуз Азп ма! Тйг сіи туг А5зр су сіп А5Зр АЇа су 530 535 540 сіу 5ег АЗп 5ег Тгр Азп Мет МмаїЇ Азр маїЇ А5Зр Гей Рго РГгО А5П Гуз 545 550 555 560
А5зр ма! сЇи Рго сіу ІЇе Гей Геи Ні5 сіу Гей Гуз Рго Тгр Тиг сп 565 570 575 туг АТа ма! туг маїЇ Гуз АїЇа ма! тик оїеи тис мет ма! сіи А5Зп А5р 580 585 590
Ні ІЇе Агуд сО1Уу АЇа Гуз б5ег сЇи ІЇе Ге Туг ІІе Агд тйг А5п Аїа 595 600 605 5зег ма! Рго 5ег ІЇе Рго Ге А5зр ма! Ге 5ег АЇа 5ег А5зп 5ег 5ег 610 615 620 5ег сіп Ге ІЇе ма! Гуз Тер АЗзп РГгГО Рго 5ег їеи Рго А5п су А5П 625 630 635 640
Гей б5ег Туг Туг Іе маї Агд тер сіп Агду сп Рго сіп А5р су туг 645 650 655
Ге туг Агд Ні Ап Туг Суз бег Гуз Азр Гуз ІЇе Рго ІЇе Ага Гуз 660 665 670 (516) туг АТа Азр сіу Тпйг ІЇе Азр ІЇе сіи сіи ма! тйг си Азп РГгГО Гуз 675 680 685
Тис о сіи маї Су5 сіу сіу сій Гуз сІу Рго Су5з Суз АЇа Су5 Рго Гуз 65 690 695 700
Те ом АТа сіи Гуз сп АТа сіи Гуз сій сої Аїа сіи туг Агд Гуз 705 710 715 720 70 ма! Ре сіи А5п РПе Геи Ні Азп б5ег ІЇе Рпе ма! Рго Агд Рго си
725 730 735
Аг Гуз Агуд Агу Азр ма! мет сіп ма! АЇа Абп тТиг о тиг мес 5ег 5ег 740 745 750
Аг бек Агуд Ап о Тийг Тс Аа АТа дор тТйг о туг Абп о ІЇе ТИг дор РгО 755 760 765 си сій Гей сій Тйг осі Туб Рго Ре Ре сіи б5ег Агуд ма! А5р дп 770 775 780
Гуз сій Агуд Тс ма! ІЇе б5ег А5Зп Ге Аг Рго Ре Тийг Геи туг Ага 785 790 795 800 че А5р ІЇе Ні бек сСу5 Азп Ні сій АЇїЇа сі Гуз Ге сіу сСу5 5ег 805 810 815
АТїа бек Ап Ре ма! Ре АЇїа Агуд тйг мес Рго Аїа сЇи сІу Аїа А5р 820 825 830
Азр ч11е Рго со1у Рго ма! Тийг тер сЇи Рго Агу Рго си А5п 5ег ІЇе 835 840 845
Ре Геи Гуз Тер Рго сім Рго сій Азп РгОо А5п сіу гей ІЇе Геми мес 850 855 860 тукг ої ІІе Гуз Тукг оІу 5ег сіп ма! сіи А5р сіп Агд сій су ма! 865 870 875 880
Зо 5ег Агд сп соЇи Ттуг Агд Гуз туг сІЇу сТ1у Аїа Гуз гГеи А5бп Ага гГеи 885 890 895
АЗп о Рго с1у Азп Туг Тйг Аїа Агу І1ІЇе сіп Аїа тНг 5ег Геи 5ег су 900 905 910
Азп сіу б5ег Тер Тйг о А5Зр Рго ма! Ре РіПе Туг ма! сіп АЇїа Гу5 тег 915 920 925 сІу тукг оЇи А5п Ні Ні Ні Ні Ні Ні 930 935 «210» 86 «2115 938 «2125 РЕТ «2135 АгтіТісіа! «220» «223» с4 Тгадтепе міїй ніх тад «4005 86
Меєт Гуз б5ег сіу 5ег сіу сІіу сіу 5ег Рго Тиг 5ег їеи Тер СТУ Геи 5Б Б 1 5 10 15
Ге Ре Геи 5ег АЇа АЇїа Гей 5екг ге Тгр Рго Тиг 5ег су сім Пе 20 25 30 60 сСу5 о1у Рго сіу ІЇе А5р ІЇе Агд А5п А5р Туг сіп сіп гей Гуз Ага 35 40 45
Гей сі Азп Суз Тиг о маїЇ те сіи сіу туг Ге Ні5 ІЇе Гей їГеи Пе 50 55 60 65 5зег Гуз Аїа сій А5р Туг Агуд б5ег туг Агуд Ре Рго Гуз Геи ТЕг ма! 65 70 75 80
ІІе тиг сіи Ттуг Гей Гей Ге Ре Агуд ма! АТа сІу гГеи сіи 5ег Геи 70 85 90 95
О1Уу А5р Гей Ре Рго Азп Ге Тиг ма! ІЇїе Агд сіу тгр Гуз Геми РПе 100 105 110 Туг Азп Ттуг АТа Геи ма! ІЇе Ре сіи Месє Тйг А5Зп Ге Гуз А5р Іе 115 120 125 о1Уу Геи Туг А5Зп Гей Агу А5Зп ІЇе ТНг Аг СсС1у АїЇа ІЇе Агд Пе си 130 135 140
Гуз АЗп АЇа А5Зр Гей Суз Туг Гей 5ег Тиг маї Азр Тгр 5ег ге Пе 145 150 155 160
Гей А5р Аїа ма! 5ег Ап АЗзп Туг ч1іе маї сіу Азп Гуз Рго Рго Гуз 165 170 175 сіи Суз с1у А5р Гей Суб Рго сіу Тйг о Меє сіи сі Гуз Рго Мет су 180 185 190 сіи Гуз Тиг тис те АЗп АЗп сій Туг Ап о тТуг Агд Суз Тер тс тег 195 200 205
АЗп о Агуд Суз соЇп Гуз Мек Суз Рго 5ег ТИг Су5 су Гуз Агд Аїа су 210 215 220
Тк оси Ап о АЗп сі Суз Суб5 Ні Рго сі Суз Ге сІу б5ег Су 5ег 225 230 235 240
АТїа Рго А5р АЗп др Тс АЇа Суз ма! АЇа Су5 Агу Ні Туг Туг туг 245 250 255
АТїа сіу ма! Суз ма! Рго АЇа Су5з Рго Рго А5зп ТИг туг Агд РПе си 260 265 270 сіу тер Ага Суз маї Азр Агуд А5р Рпе Су5 АїЇа А5п ІЇе гей 5ег АїЇа 275 280 285 сі 5ег б5ег А5р б5ег сі сІіу Ре ма! ІЇе Ні А5р сіу сіи Суз Мет 290 295 з00 сіп сій Суз Рго б5ег сіу Ре ІЇе Агд Азп сіу б5ег сіп 5ег Мет туг 305 310 315 320 сСуз ІчІЇ1е Рго Су5з сій сіу Рго Суб Рго Гуз ма! Су5з сім сіи сіи Гуз 325 330 335
Гуз ТВгогГуз Тийг о ІІе Азр 5ег ма! тиг 5ег АїЇа сіп мет гей сіп сС1У 340 345 350 сСу5 Тйг ІІе Ріе Гу5 су Азп Ге Гей ІЇе Азп ІЇе Агуд Агуд су А5Пп 355 360 365
А5п ІЇе Аїа 5ег сіи Гей сі А5зп Ре Меї сіу гей ІЇе сіи маї ма! 370 375 380
Тк о сТ1у туг ма! Гуз ІЇїе Агуд Ні бек Ні5 АЇа Ге ма! 5ег геи 5ег 385 390 395 400
Ре Геи Гу5 Ап Гей Агд Геи ІЇе гГеи сТ1у сім сім сіп гГеи си сІ1у бо 405 410 415
Азп Ттуг 5ег Ре Туг ма! гГеи А5Зр Азп сп Азп Гей сіп сіп Гей Тер 420 425 430 65 Ар Тер А5р о Ніб Агуд АбЗп Ге Тс о ІЇе Гуз Аїа сіу уз Мет туг РПе 435 440 445
АТа Ре Азп Рго Гуз Гей Суз Ма! 5ег сіи ІїІе туг Агд Меє си си 70 450 455 460 ма! тик оТу тиг Гуз сіу Агуд сЇп 5ег Гуз сіу А5р ІЇе доп ТЕИг Агд 465 470 475 480 А5п А5п со1у сої Аг АЇа бек Суз сіи 5ег Ар Ма! Ге Ні РПпе тТпг 485 490 495 5зег Тис о тиг о тиг Тер губ Абп Аго ІЇе ІЇе ІЇе тНг тгр Ні Агд туг 500 505 510
Аг Рго Рго Азр Туг Агуд Азр Ге ІІе 5ег Рпе тТиг ма! Туг туг Гуз 515 520 525 сі АЇїа Рго Ре Гуз Азп ма! Тйг сіи туг А5зр су сіп А5Зр АЇа су 530 535 540 сіу 5ег АЗп 5ег Тгр Азп Мет мМмаї Азр маїЇ А5р Гени Рго РгОо А5П Гуз 545 550 555 560
А5зр ма! сЇи Рго сіу ІЇе Гей Геи Ні сіу Гей Гуз Рго Тгр Тиг сп 565 570 575 туг АТа ма! Ттуг маїЇ Гуз АЇїа ма! тийг ге тиг Мет ма! си А5бп А5р 580 585 590
Ні ІЇе Агу сО1Уу АЇа Гуз б5ег си ІЇе Ге Туг ІІе Аг9 тНг А5п АїЇа 595 600 605 5зег ма! Рго 5ег ІЇе Рго Ге А5зр маЇ Ге 5ег АЇа 5ег А5зп 5ег 5ег 610 615 620 5ег сіп Ге ІЇе ма! Гуз Тер АЗзп РгГО РгОо 5ег їеи РгоО А5ЗпП СУ А5ПпП 625 630 635 640
Гей б5ег Туг Туг Іе ма! Агд Тер сп Агду сіп Рго сіп А5р су туг 645 650 655
Ге туг Агд Ні Ап Туг Суз бег Гуз Азр Гуз ІЇе Рго ІЇе Ага Гуз 660 665 670 туг АТа Азр сіу Тпйг ІЇе Азр ІЇе сій сіи ма! тйг си Азп РГгГО Гуз 675 680 685
Тис осі маї сСу5 сіу сіу сі Гуз с1іу Рго Су5 Суз АЇа Суз РгОо Гуз 690 695 700
Те ом АТа сіи Гуз сп АТа сіи Гуз сій сої Аїа сіи туг Агд Гуз 705 710 715 720
Ма! Рпе сій Азп Ре Геи Ні Ап 5ег ІЇе Ре ма! Рго Агд Рго Си 725 730 735
Аг Гуз Агуд Агу АЗзр ма! Мет сіп ма! АЇа Абп тТиг о тиг Мет 5ег 5ег 740 745 750
Аг бек Агуд Ап о Тийг тс Аїа АТа А5р о тйг о тТуг Ап ІЇе ТИг дор РгОо 755 760 765 си сій Гей сій Тйг осі ТтТуб Рго Ре Ре сіи 5ег Агуд ма! А5р дп бо 770 7175 780
Гуз сій Агуд Тс ма! ІЇе б5ег А5зп Гей Аг Рго Ре Тийг Геи туг Ага 785 790 795 800 65 че А5р ІЇе Ні бек сСу5 Азп Ні сій АЇа сі Гуз Гей сіу Су5 5ег 805 810 815
АТїа бек Азп Ре ма! Ре АЇїа Агуд тйг мес Рго Аїа сЇи сІу Аїа А5р 820 825 830 70
Азр ч11е Рго со1у Рго ма! Тийг тер сЇи Рго Агу Рго си А5п 5ег ІЇе 835 840 845
Ре Геи Гуз Тер Рго сЇи Рго сЇи А5п РГО Ап сІУу Ге ІЇе Геи мет 850 855 860 тукг ої ІІе Гуз Тукг оІу 5ег сіп ма! сіи А5р сіп Агд сій су ма! 865 870 875 880 5ег Агд сп соЇи Ттуг Агд Гуз туг сІЇу сТ1у Аїа Гуз гГеи А5бп Ага гГеи 885 890 895
АЗп о Рго с1у Азп Туг Тйг Аїа Агу І1ІЇе сіп Аїа тНг 5ег Геи 5ег су 900 905 910
Азп сіу б5ег Тер Тйг о А5Зр Рго ма! Ре РіПе Туг ма! сіп АЇїа Гу5 тег 915 920 925 сіу туг си А5Зп НІ Ні НІі5 Ні Ні Ні 930 935 «2105 87 «2115 938 «2125 РЕТ «2135 АгтіТісіа! «220» «223» сб ТГгадтепе міїй ніх тад
Зо «4005 87
Меєт Гуз б5ег сіу 5ег сіу сІіу сіу 5ег Рго Тиг 5ег їеи Тгр с1Уу Гей 1 5 10 15
Ге Ре Геи 5ег АЇа АЇїа Гей 5екгїеи Тер Рго Тиг 5ег су сіи Іе 20 25 30 суз сІЇу Рго сіу Іїе д5р ІЇе Агуд Ап А5зр Туг сп сіп Геи Гуз Ага 35 40 45
Гей сі Азп Суз Тиг маїЇ те сіи сіу туг Ге Ні5 ІЇе Гей їГеи Іїе 50 55 60 5зег Гуз Аїа сій А5р Туг Агуд 5ег Туг Агдуд Ре Рго Гуз Геи ТЕг ма! 65 70 75 80
ІІе тиг сіи Ттуг Гей Гей Ге Ре Агд ма! АТа сТ1у гГеи сіи 5ег геи 85 90 95
О1Уу А5р Гей Ре Рго А5п Ге Тиг ма! ІЇе Агд сіу тгр Гуз Геми РПе 100 105 110 туг Азп Туг Аїа Ге ма! ІЇїе Рпе сіи Мет ТНг А5п Гей Гуз А5р ІїЇє 115 120 125 о1Уу Геи Туг А5Зп Гей Аг А5Зп ІЇе Тиг Аг СсС1у АїЇа ІЇе Агд Пе си 130 135 140 60 Гуз А5п АЇа Ар Гей Суз Туг Гей бег Тиг ма! А5р тгр 5ег Ге Пе 145 150 155 160
Гей А5р Аїа ма! 5ег Ап АЗп Туг Іч1іе маї сІіу Азп Гуз Рго Рго Гуз 165 170 175 65 сіи Суз с1у А5р Гей Суб Рго сіу Тийг о Меє сій сій Гуз Рго Мет су 180 185 190 сіи Гуз Тк Тс о ІЇе доп доп сій туго Азп Туг Агдуд Суз Тер тег тег 70 195 200 205
АЗп о Агуд Суз сп Гуз Мет Суз Рго 5ег ТИг Суз сіу Гуз Ага Аїа су 210 215 220
Тис оси Абп АЗп сій Суз Суз Ні Рго сіи Суз Гей сІу 5ег сСу5 5ег 225 230 235 240
АТїа Рго А5р АЗп др о Тйг АЇа Суз ма! АЇа Су5 Агу Ні Туг Туг туг 245 250 255
АТїа сіу ма! Суз ма! Рго АЇа Су5з Рго Рго А5зп ТИг туг Агд РПе си 260 265 270 с1у Тер Агдуд Суз ма! дор Аг Ар РПе сСуз АЇа Ап ІЇе Ге 5ег АїЇа 275 280 285 сі 5ег б5ег А5р б5ег сі сІіу Ре ма! ІЇе Ні А5р сіу сіи Суз Мет 290 295 з00 сіп сій сСу5 Рго 5ег с1у Ре ІЇе Агуд Азп сіу 5ег сіп бег мес туг 305 310 315 320 сСуз ІчІЇ1е Рго Су5з сій сіу Рго Суб Рго Гуз ма! Су5з сім сіи сіи Гуз 325 330 335
Гуз ТВгогГуз Тийг о ІІе Азр 5ег ма! тиг 5ег АїЇа сіп мет гей сіп сС1У 340 345 350 суз Тийг ІЇе Рпе Гуз с1у А5п Гей Геи ІЇе А5п ІЇе Агу Агд о1У А5П 355 360 365
А5п ІЇе Аїа 5ег сіи Гей сі А5зп Ре Меї сіу гей ІЇе сіи маї ма! 370 375 380
Тег о сТ1у туг ма! Гуз Іїе Агуд Ні бек Ні АЇїа Ге ма! 5ег геи 5ег 385 390 395 400
Ре Геи Гу5 Ап Гей Агд Геи ІЇе гГеи сТ1у сім сім сіп гГеи си сІ1у 405 410 415
Азп Ттуг 5ег РПпе Туг ма! гГеи А5Зр Азп сп Азп Гей сіп сіп Гей Тер 420 425 430 А5зр Тер А5р Ні Агуд Ап Гей Тйг ІчІЇе уз АТа сіу Гуз Ммеє Ттуг РНе 435 440 445
АТа Ре Азп Рго Гуз Гей Суз Ма! 5ег сіи ІїІе туг Агд Меє си си 450 455 460 ма! тик оТу тиг Гуз с1іу Агуд сЇп 5ег Гуз сіу А5р ІЇе доп ТИг Агд 465 470 475 480
А5п о А5п со1у сої Аг Аїа бек Суз сіи 5ег Ар ма! Ге Агд Ре тЕпг 485 490 495 5зег Тис о тиг о тиг Тер губ Абп Аго ІЇе ІЇе ІЇе тНг тгр Ні Агд туг 500 505 510 60 Агуд Рго Рго Ар Туг Аго А5Зр Гей ІЇе 5ег Ре Тийг ма! туг туг Гуз 515 520 525 сі АЇїа Рго Ре Гуз Азп ма! Тйг сіи туг А5зр су сіп А5Зр АЇа су 530 535 540 65 сіу 5ег АЗп 5ег Тгр Азп Мет мМмаї Азр маїЇ А5р Гени Рго РгОо А5П Гуз 545 550 555 560
Азр ма! сім Рго сіу ІЇе Ге Гей Ні5 СІу Гей їу5 Рго Тгр ТНг сіІп 70 565 570 575 туг АТа ма! Ттуг маїЇ Гуз АЇїа ма! тийг ге тиг Мет ма! си А5бп А5р 580 585 590
Ні ІЇе Агу су АЇїЇа гу5 б5ег си ІЇе Ге Туг ІІе Агд Ттйг А5п Аїа 595 600 605 5зег ма! Рго 5ег ІЇе Рго Ге А5зр маЇ Ге 5ег АЇїа 5ег А5зп 5ег 5ег 610 615 620 5ег сіп Ге ІЇе ма! Гуз Тер АЗзп РГгГО Рго 5ег їеи Рго А5п су А5П 625 630 635 640
Гей б5ег Туг Туг Іе ма! Агд Тер сп Агду сіп Рго сіп А5р су туг 645 650 655
Ге туг Агд Ні Ап Туг Суз бег Гуз Азр Гуз ІЇе Рго ІЇе Ага Гуз 660 665 670 туг АТа Азр сІу Тпйг ІЇе Азр ІЇе сіи сіи ма! тйг си Азп РГгГО Гуз 675 680 685
Тис о сіи маї Су5 сіу сіу сій Гуз сІу Рго Су5з Суз АЇа Су5 Рго Гуз 690 695 700
Те ом АТа сіи Гуз сп АТа сіи Гуз сій сої Аїа сіи туг Аг Гуз 705 710 715 720 ма! Рпе сій Азп Ре Геи Ні Ап 5ег ІІе Рпе ма! Рго Агд Рго си 725 730 735
Аг Гуз Агуд Агу Азр ма! мес сіп ма! АЇа Абп тТиг о тиг мет 5ег 5ег 740 745 750
Аг бек Агуд Ап о Тийг Тс Аа АТа дор тТйг о туг Абп о ІЇе ТИг дор РгО 755 760 765 си сій Гей сій Тйг осі Туб Рго Ре Ре сіи 5ег Агуд ма! А5р дп 770 775 780
Гуз сій Агуд Тс ма! ІЇе б5ег А5Зп Ге Аг Рго Ре Тийг Геи туг Ага 785 790 795 800
ІІе А5р ІЇе Ні бек сСу5 А5зп Ні сій АїЇа сій Гуз Ге сіу сСу5 5ег 805 810 815
АТїа бек Ап Ре ма! Ре АЇїа Агуд тйг мес Рго Аїа сЇи сІу Аїа А5р 820 825 830
Азр ч11е Рго со1у Рго ма! Тийг тер сЇи Рго Агд Рго си А5п 5ег ІЇе 835 840 845
Ре Геи Гуз Тер Рго сЇи Рго сЇи А5п РГО Ап сІУу Ге ІЇе Геи мет 850 855 860 тукг ої ІІе Гуз Тукг оІу 5ег сіп ма! си Азр сп Агд сій су ма! 865 870 875 880 60 5ег Агд сп соЇи Ттуг Агд Гуз туг сІЇу сТ1у Аїа Гуз гГеи А5бп Ага гГеи 885 890 895
АЗп о Рго со1у Азп Туг Тйг Аїа Агуд ІЇе сіп АЇїа тТйг 5ег Геи 5ег су 900 905 910 65
Азп сіу б5ег Тер Тйг о А5Зр Рго ма! Ре РіПе Туг ма! сіп АЇїа Гу5 тег 915 920 925 сіу туг си А5Зп НІ Ні Ні5 Ні Ні Ні 70 930 935
«2105» 88 «2115 939 «2125 РЕТ «2135 АгтіТісіа! «220» «223» сС7 Тгадтепе мій ніх тад «4005 88
Меєт Гуз б5ег сіу 5ег сіу сІіу сіу 5ег Рго Тиг 5ег їеи Тгр с1Уу Гей 1 5 10 15
Ге Ре Геи 5ег АЇа АЇїа Гей 5екг ге Тгр Рго Тиг 5ег су сім Пе суз сІЇу Рго сіу Іїе д5р ІЇе Агуд Ап А5зр Туг сп сіп Геи Гуз Ага 20 35 40 45
Гей сі Азп Суз Тиг о маїЇ те сіи сіу туг Ге Ні5 ІЇе Гей їГеи Пе 50 55 60 25 5зег Гуз Аїа сій А5р Туг Агуд 5ег Туг Агдуд Ре Рго Гуз Геи ТЕг ма! 65 70 75 80
ІІе тиг сіи Ттуг Гей Гей Ге Ре Агуд ма! АТа сІу гГеи сіи 5ег Геи 85 90 95
Зо
О1Уу А5р Гей Ре Рго А5п Ге Тиг ма! ІЇе Агд сіу тгр Гуз Геми РПе 100 105 110 туг Азп Туг Аїа Ге ма! ІЇїе Ре сіи Мет ТНг А5п Гей Гуз А5Зр ІїЇе 115 120 125 о1Уу Геи Туг А5Зп Гей Аг А5Зп ІЇе ТНг Аг Сс1у АїЇа ІЇе Агд Пе си 130 135 140
Гуз А5п АЇа А5р Гей Суз Туг Гей б5ег Тиг ма! Азр Тгр 5ег Ге Пе 145 150 155 160
Гей А5р Аїа ма! 5ег Ап АЗп Туг Ііе маї сІіу Азп Гуз Рго Рго Гуз 165 170 175 сіи Суз с1у А5р Гей Суб Рго сіу ТтТйг о Меє сіи сі Гуз Рго Мет су 180 185 190 сіи гГуз Тс о Твйг о ІЇе доп доп сій туго Азп Туг Агдуд Суз Тер тег тег 195 200 205
АЗзп Агуд Суз сп Гуз Мек Суз Рго 5ег ма! Су5 оТу Гуз Агд Аїа су 210 215 220
Тс си А5п Ап сій Су5 Суз Ні Рго сій Суз Ге сіу 5ег сСу5 Ні 225 230 235 240
ТАК оРгОо А5р др Ап о тТиготиг о Суз ма! Аїа су5 АгаДа ніх туг Ттуг туг 245 250 255 (516)
Гуз сіу ма! Суз ма! Рго АЇа Су5 Рго Рго сЇу Тйг туг Агуд Ре си 260 265 270 с1у Тер Агд Суз ма! дор Агд Ар Ре Суз АЇа Ап ІЇе Рго А5п АїЇа 65 275 280 285 сі 5ег б5ег А5р б5ег Ар сіу Ре ма! ІЇе Ні5 А5зр А5р сіи Суз Мет 290 295 з00 70 сіп сіи Суб Рго б5ег с1іу Ре ІЇе Агуд Азп 5ег Тиг сіп 5ег мет туг
305 310 315 320 сСуз ІІ1е Рго Суз сі сіу Рго Су5 Рго Гу5 ма! Су5 СсІ1у Азр СсЇми си 325 330 335
Гуз Гуз ТИгогГуз Тиг о ІЇе А5р 5ег ма! тиг 5ег АїТа сіп мес гГеи сп 340 345 350 сІу Суз Тк ІЇе Гей Гуз сІ1у Азп Гей Ге ІЇе Азп ІЇе Аг9 Ага су 355 360 365
АЗзп АЗп ч1і1е АЇїЇа 5ег сій Ге сій Азп Ре Меї сІіу Гей ІЇе сіи ма! 370 375 380 ма! тйг сІ1у туг маї Гу5 ІЇе Агд Ні 5ег Ні5 АЇа Ге ма! 5ег Геи 385 390 395 400 5ег Рпе Геи Гуз А5Зп Гей Агд ем ІЇе гГеи сіЇу сЇи сЇми сіп Геи си 405 410 415 с1Уу А5зп Туг 5ег Ре Туг маї Гей А5р АЗп сіп АЗп ге сіп сіп Гей 420 425 430
Тер Азр Тер А5р о Ніб Агуд Ап Ге Тс че Гуз АЇїа сіу Гуз мес туг 435 440 445
Ре АЇїа РПпе А5п РГгГоО Гуз Ге Суз Ма! 5ег сіи чІ1е туг Агд Меї си 450 455 460
Зо сіи ма! тк сіу тийг огуз с1у Агуд сЇп 5ег Гуз сіу Ар ІЇе А5п ТЕГ 465 470 475 480
Аг А5п Абп о1у сій Агуд Аїа 5ег Суз сі бег А5Зр ма!ї Гей нів РНе 485 490 495
Тк обег о тийг тис тс о б5ег Гуз А5Зп Агу ІчІЇе ІЇе ІЇе тйг тер Ні5 Ага 500 505 510 тТуг Агуд Рго Рго А5р Туг Агуд А5р Гей І1е 5ег Ре Тийг ма! туг туг 515 520 525
Гуз сі АТа Рго Ре Гуз Азп Ма! Тйг сіи туг Азр сІу сп дор Аїа 530 535 540
Суз сіу б5ег А5п о б5ег Тер АЗп Мет ма! Азр ма! Азр 'Геи Рго Рго дп 545 550 555 560
Гуз Азр ма! сім Рго сіу ІЇе гей їеи Ні сіу Гей Гуз Рго Тгр ТЕГ 565 570 575 сіп туг АТа ма! туг маїЇ Гуз АїЇа ма! тик Ге тиг мет маї сіи д5п 580 585 590 А5зр Ні5 ІІе Ага сіу Аїа Гу5 5ег сіи ІЇе Ге Туг ІЇе Аг Тйг А5п 595 600 605
Аїа б5екг ма! Рго 5ег ІЇе Рго Гей Азр ма! Гей 5ег АЇїа 5ег Азп 5ег 610 615 620 (516) 5ег б5ег сіп Гей ІІе ма!ї Гуз Тер Азп Рго Рго 5ег Гей Рго Азп су 625 630 635 640
АЗзп о Гей б5ег Ттуг Туг ІІе маї Агд Тер сіп Агу сп Рго сіп А5р су 65 645 650 655 тукг Ге туг Агд Ні АЗзп Туг Суз бег Туз А5Зр Гуз ІІе Рго ІїЇе Ага 660 665 670 70 Гуз туг Аїа Азр с1у Тйг ІЇе Азр ІЇе сЇи сіи ма! Тис си А5п РгО
675 680 685
Гуз Тйг осі ма! Су5з сіу сІу сій Гуз сіу Рго Су5 Суз АЇа Суз РгО 690 695 700
Гуз Тпг сій Аїа сЇи Гуз сіп АїЇа сЇи Гуз сім сім АїЇа сім туг Ага 705 710 715 720
Гуз ма! Рпе сіи Азп Ре Геи Ні Азп 5ег ІЇе Ре ма! Рго Ага Рго 725 730 735 сої Аг Гуз Агуд Агу Азр ма! мес сіп ма! діа А5п тТийг тиг мет 5ег 740 745 750 зег Агд б5ег Аг АЗп о ТИг Тс АТа Аїа А5р тис о туг АЗп ІЇе ТИг А5р 755 760 765
Рго сім сій Гей сій Тйг осі тує Рго Ре Ре сіи б5ег Агд ма! дор 770 775 780
АЗзп о Гуз сої Агуд Тс Ома! Іч11е б5ег А5п Ге Агуд Рго Ре ТИг Геи туг 785 790 795 800
Аг ІІе А5р ІЇе Ні бек сСу5 А5Зп Ні сім АїЇа сіи Гуз Ге сіу су 805 810 815 5зег АїЇа 5ег Азп Ріпе ма! Ре АТа Агуд тйг мес Рго АїЇа сім сІ1у Аїа 820 825 830
А5р Ар ІЇе Рго сіу Рго ма! тТйг Тер сЇи Рго Аг Рго сіи Ап 5ег 835 840 845 ч11е Ре Гей Гуз Тер Рго сЇи Рго сі А5Зп РгОо Ап су Ге Пе гей 850 855 860 мес туг сій чІІе Гуз туг сіу 5екг сп ма! сіи Азр сіп Агд си су 865 870 875 880
Уа! 5ег Агуд сп сім Туг Агуд Гуз Туг сіу с1у АїЇа Гуз Геи А5п Ага 885 890 895
Гей А5п о Рго сіу Азп Туг Тйг Аїа Агуд ІЇе сіп АЇїа Тийг 5ег Геи 5ег 900 905 910 с1у Азп сіу б5ег Тер ТиИг о А5Зр Рго ма! Рпе РПпе Туг ма! сіп Аїа Гуз 915 920 925
Тег о сТу тукг си Ап Ні Ні Ні Ні5 Ні НІ15 930 935 «2105» 89 «2115 938 «2125 РЕТ «2135 АгтіТісіа! «220» «223» сС8 Тгадтепе місн ніх тад (510) «400» 89
Меєт Гуз б5ег сіу 5ег сіу сІіу сіу 5ег Рго Тиг 5ег їеи Тер с1Уу Гей 1 5 10 15 65 Гей Ре Гей б5ег АТа АЇїа Геи бек ге Тер Рго Тиг 5ег су см Пе 20 25 30 суз сІЇу Рго сіу Іїе д5р ІЇе Агуд Ап А5зр Туг сп сіп Геи Гуз Ага 35 40 45 70
Гей сі Азп Суз Тиг о маїЇ те сіи сіу туг Ге Ні5 ІЇе Гей їГеи Пе 50 55 60 5зег Гуз Аїа сій А5р Туг Агуд 5ег Туг Агдуд Ре Рго Гуз Геи ТЕг ма! 65 70 75 80
ІІе тиг сіи Ттуг Гей Гей Ге Ре Агуд ма! АТа сІу гГеи сіи 5ег Геи 85 90 95 с1у Азр Ге РіБе Рго Азп Гей Тиг ма! ІЇе Агуд сіу Тер Гуз Гей Ре 100 105 110 туг Азп Туг Аїа Ге ма! ІЇїе Ре сіи Мет ТНг А5п Гей Гуз А5Зр ІїЇе 115 120 125 о1Уу Геи Туг А5Зп Гей Аг А5Зп ІЇе Тиг Аг СсС1у АїЇа ІЇе Агд Пе си 130 135 140
Гуз АЗп АЇа А5Зр Гей Суз Туг Гей 5ег ТИг ма!ї Азр Тгр 5ег ге Пе 145 150 155 160
Гей А5р Аїа ма! 5ег Ап АЗп Туг Іч1іе маї сІіу Азп Гуз Рго Рго Гуз 165 170 175 с сіи Суз с1у А5р Гей Су5 Рго сіу Тк Меє сЇи сіи Гуз Рго Мек су» 180 185 190 сіи Гуз Тк Тс о ІЇе доп доп сій туго Азп Туг Агдуд Суз Тер тег тег 195 200 205
Зо
АЗзп Агуд Суз соЇп Гуз Мек Суз Рго 5ег ТИг Су5з су Гуз Агд АїЇа су 210 215 220
Тис оси Ап о АЗп сі Суз Суб5 Ні Рго сіи Суз Ге сІу 5ег Су 5ег (225 230 235 240
АТїа Рго А5р АЗп др Тс АЇа Суз ма! Аїа Су5 Аг Ні Туг Туг туг 245 250 255
Аїа сіу ма! Су5 маЇ Рго АЇїа Суб Рго Рго Азп Тйг Туг Агуд Рпе си 260 265 270 с1у Тер Агд Суз ма! д5р Аг Ар РПе Су АЇа Ап ІЇе гГеи 5ег АїЇа 275 280 285 сі 5ег б5ег А5р б5ег сі сІіу Ре ма! ІЇе Ні А5р сіу сіи Суз Мет 290 295 з00 сп сій Суз Рго б5ег сіу Ре ІЇе Агуд Азп сіу 5ег сіп б5ег Мет туг 305 310 315 320 сСуз ІчІЇ1е Рго Су5з сі сіу Рго Суб Рго Гуз ма! Су5з сім сіи сіи Гуз 325 330 335
Гуз Тиг огГуз Тс о ІТе Ад5р 5ег ма! тиг 5ег АТа сіп мех геи сп с1Уу 340 345 350 суз Тийг ІЇе Рпе Гуз с1у А5п Гей Геи ІЇе А5п ІЇе Агу Агд о1У А5П 355 360 365 (516)
А5п ІЇе Аїа 5ег сіи Гей сі А5зп Ре Меї сіу Гей ІЇе сіи маї ма! 370 375 380
Тег о сТ1у туг ма! Гуз Іїе Агуд Ні бек Ні АЇїа Ге ма! 5ег геи 5ег 65 385 390 395 400
Ре Геи Гу5 Ап Гей Агд Геи ІЇе гей сТ1у сЇми сім сіп Геи си сІ1у 405 410 415 70 Азп туг 5ег Рпе Туг ма!ї Геми А5р Ап сп А5п ем сіп сп Геи Тер
420 425 430
Азр Тер Абп НІіІ5 Агу АбЗп гей Тийг о ма! Агуд б5ег сіу Гуз Меє Туг РНе 435 440 445
АТа Ре Азп Рго Гуз Гей Суз Ма! 5ег сіи ІїІе туг Агд Меє си си 450 455 460 ма! тик оТу тиг Гуз с1у Агуд сЇп 5ег Гуз сіу А5р ІЇе доп ТИг Агд 465 470 475 480
А5п о А5п со1у сої Аг Аїа бек Суз сіи 5ег Ар Ма! Ге Ні РПе тТпг 485 490 495 5ег Тис о тиг о тиг о б5ег о їу5 АЗп Аг ІЇе ІЇе ІЇе тНг тгр Ні Агд туг 500 505 510
Аг Рго Рго Азр Туг Агуд Ар Ге ІІе 5ег Ріпе тТиг ма! Туг туг Гуз 515 520 525 сі АЇїа Рго Ре Гуз Азп ма! Тйг сіи туг А5зр су сіп А5Зр АЇа су 530 535 540 сіу 5ег АЗп 5ег Тгр Азп Мет мМмаї Азр маїЇ А5р Гени Рго РгОо А5П Гуз 545 550 555 560
Азр ма! сім Рго сіу ІЇе Ге Гей Ні5 СІу Гей їу5 Рго Тгр ТНг сіІп 565 570 575 туг Аїа ма! туг ма!їЇ Гуз Аїа ма! Тис о їеи тийг мет ма! сіи А5Зп Ар 580 585 590
Ні ІЇе Агуд сО1Уу АЇа Гуз б5ег сЇи ІЇе Ге Туг ІІе Агд тйг А5п Аїа 595 600 605 5зег ма! Рго 5ег ІЇе Рго Ге А5зр маЇ Ге 5ег АЇа 5ег А5зп 5ег 5ег 610 615 620 5ег сіп Ге ІЇе ма! Гуз Тер АЗзп РГгГО Рго 5ег їеи Рго А5п су А5П 625 630 635 640
Гей б5ег Туг Туг Іе ма! Агд Тер сп Агду сіп Рго сіп А5р су туг 645 650 655
Ге туг Агд Ні Ап Туг Суз бег Гуз Азр Гуз ІЇе Рго ІЇе Ага Гуз 660 665 670 туг АТа Азр сіу Тпйг ІЇе Азр ІЇе сій сіи ма! тйг си Азп РГгГО Гуз 675 680 685
Тис о сіи маї Су5 сіу сіу сій Гуз сІу Рго Су5з Суз АЇа Су5 Рго Гуз 690 695 700
Те ом АТа сіи Гуз сп АТа сіи Гуз сій сої АїЇа сіи туг Агд Гуз 705 710 715 720 ма! Рпе си Азп Ре Гей Ні Азп 5ег ІЇе Ре ма! Рго Аг Рго си 725 730 735 60 Аг Гуз Агд Агуд АЗр ма! Мет сіп ма! Аїа Азп Тийг Тис Меє б5ег 5ег 740 745 750
Аг бек Агуд Ап о Тийг Тс Аа АТа дор тТйг о туг Абп о ІЇе ТИг дор РгО 755 760 765 65 си сій Гей сій Тйг осі Туб Рго Ре Ре сіи б5ег Агуд ма! А5р дп 770 775 780
Гуз сій Агуд Тс ма! ІЇе б5ег А5Зп Ге Аг Рго Ре Тийг Геи туг Ага 70785 790 795 800 ч11е А5р ІЇе Ні5 5ег Суз Азп Ні сій АЇа сій Гуз Гей сіу Су5 5ег 805 810 815
АТїа бек Ап Ре ма! Ре АЇїа Агуд тйг мес Рго Аїа сЇи сІу Аїа А5р 820 825 830
Азр ч11е Рго со1у Рго ма! Тийг тер сЇи Рго Агу Рго си А5п 5ег ІЇе 835 840 845
Ре Геи Гуз Тер Рго сЇи Рго сЇи А5п РГО Ап сІУу Ге ІЇе Геи мет 850 855 860 Туг сої те Гуз Туг су 5ег сіп ма! сіи А5р сіп Агд сіи сСуз ма! 865 870 875 880 5ег Агд сп соЇи Ттуг Агд Гуз туг сІЇу сТ1у Аїа Гуз гГеи А5бп Ага гГеи 885 890 895
АЗп о Рго со1у Азп Туг Тйг Аїа Агу І1ІЇе сіп Аїа тНг 5ег Геи 5ег су 900 905 910
Азп сіу б5ег Тер Тйг о А5Зр Рго ма! Ре РіПе Туг ма! сіп АЇїа Гу5 тег 915 920 925 сіу туг си А5Зп НІ Ні НІі5 Ні Ні Ні 930 935
Зо «2105» 90 «2115 942 «2125 РЕТ «2135 АгтіТісіа! «220» «223» с9 Тгадтепе міїй ніх тад «4005 90
Меєт Гуз б5ег сіу 5ег сіу сІіу сіу 5ег Рго Тиг 5ег їеи Тер с1Уу Гей 1 5 10 15 ма! Ре гГеи 5ег АЇа АЇа ге 5ег ей Тер Рго Тиг 5ег сІу си Іе 20 25 30 суз сІЇу Рго сіу Іїе д5р ІЇе Агуд Ап А5зр Туг сп сіп Геи Гуз Ага 35 40 45
Гей сій Азп Суз Тиг ма! ч1Їе сіи с1у РіПе Геи Ні ІЇе гГеи Ге Пе 50 55 60 5зег Гуз Аїа сій А5р Ттуг Агуд 5ег Туг Агдуд Ре Рго Гуз Геи ТЕг ма! 65 70 75 80
ІІе тиг сіи Ттуг тей Гей Ге Ре Агуд ма! АТа сІу гГеи сіи 5ег Геи 85 90 95
О1Уу А5р Гей Ре Рго А5п Ге Тиг ма! ІЇе Агд сіу тгр Гуз Геми РПе бо 100 105 110 туг Азп Туг Аїа Ге ма! ІЇїе Ре сіи Мет ТНг А5п Гей Гуз А5Зр ІїЇе 115 120 125 65 о1Уу Геи Туг А5Зп Гей Аг А5Зп ІЇе Тиг Аг СсС1у АїЇа ІЇе Агд Пе си 130 135 140
Гуз АЗп АЇа А5Зр Гей Суз Туг Гей 5ег ТИг ІЇе А5Зр Тгр 5ег Ге Пе 70 145 150 155 160
Гей А5р Аїа ма! 5ег Ап АЗп Туг Іч1іе маї сіу Азп Гуз Рго Рго Гуз 165 170 175 сім Суз с1у А5р Геи Суз Рго сЇу Тйг Ге сіи сіи Гуз Рго Мет су 180 185 190 сіи Гуз Тс Тс о ІЇе доп доп сій туго Азп Туг Агдуд Суз Тер тег тег 195 200 205
АЗп о Агуд Суз сп Гуз Мек Суз Рго 5ег ма! Су5 су Гуз Агд Аїа су 210 215 220
Тк оси Ап о АЗп сі Суз Суб5 Ні Рго сіи Суз Ге сІу 5ег Су Ні 15. (225 230 235 240
ТАК оРгО А5р др Ап о тТиготиг о Суз ма! АЇїа су5 АгаД ніх туг Туг туг 245 250 255
Гуз сіу ма! Суз ма! Рго АЇа Су5 Рго Рго сіу Тийг туг Ага Ре си 260 265 270 с1у Тер Агдуд Суз ма! дор Аг Ар Ре Суз АЇа Ап ІЇе Рго А5п АїЇа 275 280 285 сі 5ег б5ег А5р б5ег Ар сіу Ре ма! ІЇе Ні А5р А5Зр сіи Суз Мет 290 295 з00 сіп сій Суз Рго б5ег сіу Ре ІЇе Агд Азп 5ег Тиг сіп 5ег Мет туг 305 310 315 320 сСуз ІчІЇ1е Рго Су5з сій сіу Рго Суб Рго Гуз ма! Су5 СсІу А5зр сім си 325 330 335
Гуз Гуз Тис огГуз Тийг о ІТе др б5ег ма! тиг 5ег АїЇа сіп мес гГеи сіп 340 345 350 сІу Суз Тк ІЇе Гей Гуз сІ1у Азп Ге Геи ІЇе Ап ІЇе Аг9 Ага с1у 355 360 365
Азп АЗп ч1і1е АїЇа 5ег сій їеи сій Азп Ре Меї СсІіу Гей ІЇе сіи ма! 370 375 380 ма! тик сТу туг ма! гу5 ІЇе Агд ніх 5ег Ні АЇа Ге маї 5ег гГеи 385 390 395 400 5ег Рпе Геи Гуз А5Зп Гей Агд Геи ІЇе гГеи сіЇу сЇи сЇми сіп Геи си 405 410 415 с1Уу А5зп Туг 5ег Ре Туг ма! Гей А5р АЗп сіп Азп Ге сіп сіп Ге 420 425 430
Тер А5р Тер Абп Ні Агу Ап Ге Тйг ма! Аг 5ег сіу Гуз Ммеє туг 435 440 445
Ре АЇа РПпе А5п РГгГО Гуз Ге Суз Ма! 5ег сЇи ІІе туг Агд Меї си 450 455 460 60 сій ма! тс сіу тиг о Гуз с1у Агдуд сіп 5ег Гуз сіу Ар ІЇе А5зп ТтАг 465 470 475 480
Аг А5п АЗп со1у сій Агуд Аїа 5ег Суз сіи 5ег Азр маї Ге Ні РНе 485 490 495 65
Тк обег тис о тайгс те тер Гуз АбЗп Агу ІчІЇе ІЇе ІЇе тйг тер Ні5 Ага 500 505 510 тукг Аг Рго Рго Ар Туг Аг Азр Ге ІЇе б5ег Ре Тийг ма! туг туг 70 515 520 525
Гуз сі АТа Рго Ре Гуз Азп Ма! Тйг сіи туг Азр сІу сп дор Аїа 530 535 540 сСуз сіу 5ег А5п 5ег о Тгр Азп Мет Ма! А5р ма! Азр Ге Рго РгОо А5Пп 545 550 555 560
Гуз сім сІу сі Рго сіу ІЇе гей їеи Ні сіу Гей Гуз Рго Тер ТЕГ 565 570 575 сіп туг АТа ма! туг ма! Гуз АїЇа ма! тик Ге тиг мет ма! сіи д5п 580 585 590
А5зр Ні ІЇе Агу с1у Аїа гу5 5ег сім ІЇе їеи Ттуг ІЇїе Агд Тйг А5Пп 595 600 605
Аїа бек ма! Рго 5ег ІЇе Рго Гей Азр ма! Гей 5ег АЇїа 5ег Азп 5ег 610 615 620 5зег бег сіп Гей ІІе ма! Гуз Тер А5п Рго Рго ТНг Геи Рго А5п СУ 625 630 635 640
АЗзп о Гей б5ег Ттуг Туг ІІе маї Агд Тер сіп Агу сп Рго сіп дор су 645 650 655 тукг Ге туг Агд Ні АЗзп Туг Суз бег Туз А5Зр Гуз ІЇІе Рго ІїЇе Ага 660 665 670
Гуз туг АТа Азр сіу Тйг ІІе Азр ма! сіи сіи ма! тйг си А5пП РГгГО 675 680 685
Гуз Ттйг осі ма! Су5 сіу сІу Азр Гуз с1іу Рго Су5 Суз АЇа Суз РгО 690 695 700
Гуз Тпг сій Аїа сЇи Гуз сіп АїЇа сЇи Гуз сім сім АїЇа сім туг Ага 705 710 715 720
Гуз ма! Рпе сіи Азп Ре Геи Ні Азп 5ег ІЇе Ре ма! Рго Ага Рго 725 730 735 сої Аг Агуд Агуд Агу АЗр ма! мес сіп ма! діа А5п тТийг о тиг мет 5ег 740 745 750 зег Агд б5ег Аг АЗп о ТИг Тс ма! АТа Ад5р о тийг о туг АЗп ІЇе ТИг А5р 755 760 765
Рго сім сій Рпе сіи Тйг осі тує Рго Ре Ре сіи б5ег Агд ма! дор 770 775 780
АЗзп о Гуз сої Агуд Тс Ома! Іч11е 5ег А5п Ге Агуд Рго Ре ТЕИг Геи туг 785 790 795 800
Аг ІІе А5р ІЇе Ні бек сСу5 А5Зп Ні сім АїЇа сіи Гуз Ге сіу су 805 810 815 5зег АїЇа 5ег А5зп Ріпе ма! Ре Аїа Агуд тйг мес Рго АїЇа сіи сІу Аїа 820 825 830 60 А5р А5р Іч11е Рго сіу Рго ма! Тиск тгр сЇи Рго Агу Рго сЇи Ап 5ег 835 840 845 ч11е Ре Гей Гуз Тер Рго сЇи Рго сі А5Зп РгО Ап су Гей Пе ге 850 855 860 65 мес туг сій чІІе Гуз туг сіу 5екг сп ма! сіи Азр сіп Агд си су 865 870 875 880
Уа! 5ег Агуд сп сім Туг Агуд Гуз Туг су с1у АТа Гуз Геи А5п Агд 70 885 890 895
Гей А5п о Рго сіу Азп Туг Тйг Аїа Агуд ІЇе сіп АЇїа Тйг 5ег Геи 5ег 900 905 910 с1у А5п с1у б5ег Тер Тис А5р Рго Ма! Ре Ре туг маї Рго Аїа Гуз 915 920 925
Тег оте тує си АЗп РБе Мет Ні Ні5 Ні НІі5 Ні НІ15 Ні 930 935 940 «210» 91 «2115 942 «2125 РЕТ «2135 акітісіа! «220» «223» ІСЕ-1К (тигіпе), ехегасе!Тшіаг дотаїп міс ніх тад «400» 91
Меєт Гуз б5ег сіу 5ег сіу сІіу сіу 5ег Рго Тиг 5ег їеи Тгр с1Уу Гей 1 5 10 15 ма! Ре Геи 5ег Аїа Аїа Гей 5ег гей Тгр Рго Тйг 5ег с1у сЇи Пе 20 25 30 суз сІЇу Рго сіу Іїе д5р ІЇе Агуд Ап А5зр Туг сп сіп Геи Гуз Ага
Ко) 35 40 45
Гей сі Азп Суз Тиг о маїЇ те сіи сіу Ре гГеи Ні5 ІЇе Гей їГеи Пе 50 55 60 5зег Гуз Аїа сій А5р Ттуг Агуд 5ег Туг Агдуд Ре Рго Гуз Геи ТЕг ма! 65 70 75 80
ІІе тиг сіи Ттуг тей Гей Ге Ре Агуд ма! АТа сІу гГеи сіи 5ег Геи 85 90 95
О1Уу А5р Гей Ре Рго А5п Ге Тиг ма! ІЇе Агд сіу тгр Гуз Геми РПе 100 105 110 туг Азп Туг Аїа Ге ма! ІЇїе Ре сіи Мет ТНг АЗп Гей Гуз А5Зр ІїЇе 115 120 125 о1Уу Геи Туг А5Зп Гей Аг А5Зп ІЇе Тиг Аг СсС1у АїЇа ІЇе Агд Пе си 130 135 140
Гуз А5п АЇа Ар Ге Суз Туг Гей 5ег ТИг ІЇе Азр Тгр 5ег Ге Пе 145 150 155 160
Гей А5р Аїа ма! 5ег Ап АЗп Туг Іч1іе маї сіу Азп Гуз Рго Рго Гуз 165 170 175 сіи Суз сС1у А5р Гей Суб5 Рго сіу Тйг Гей сіи сі Гуз Рго Мет су 180 185 190 сіи Гуз Тс Тс о ІЇе доп доп сій туго Азп Туг Агдуд Суз Тер тег тег бо 195 200 205
АЗзп о Агуд Суз соЇп Гуз Мек Суз Рго 5ег ма! Су5 су Гуз Ага Аїа су 210 215 220 65 Те ої А5п о А5п сій Суз Суз Ні Рго сій Суз Ге сіу 5ег Суз Ні 225 230 235 240
ТАК оРгО А5р др Ап о тТиготиг о Суз ма! АЇїа сСу5 Агда ніх Туг туго туг 245 250 255 70
Гуз сіу ма! Суз ма! Рго АЇа Су5 Рго Рго сіу Тийг туг Ага Ре си 260 265 270 с1у Тер Агд Суз ма! д5р Аг Ар Ре Су5 АїЇа А5п ІЇе Рго А5п АїЇа 275 280 285 сі 5ег б5ег А5р б5ег Ар сІіу Ре ма! ІЇе Ні А5р А5Зр сіи Суз Мет 290 295 з00 сіп сій сСу5 Рго 5ег сіу Ре ІЇе Агуд А5п бек ТиПг сіп 5ег мес туг 305 310 315 320 сСуз ІчІЇ1е Рго Су5з сі сіу Рго Суб Рго Гуз ма! Су5 СсІу А5зр си си 325 330 335
Гуз Гуз ТИгогГуз Тиг о ІЇе А5р 5ег ма! тиг 5ег АїЇа сіп мес гГеи сп 340 345 350 сіу су5 Тиг те Гей Гу5 с1Уу Ап Гей Гей ІЇе А5п ІЇе Агуд Аг с1уУ 355 360 365
Азп АЗп ч1і1е АїЇа 5ег сій Ге сій АЗзп Ре Меї СсСІу Гей ІЇе сіи ма! 370 375 380 ма! тик сТу туг ма! їу5 ІЇе Агд ніх 5ег Ні АЇа Ге ма! 5ег геи 385 390 395 400 5ег Рпе Геи Гуз А5Зп Гей Агд Геи ІЇе гГеи сіЇу сЇи сЇми сіп Геи си 405 410 415 с1Уу А5зп Туг 5ег Ре Туг маї Гей А5р АЗп сіп АЗп ге сіп сіп Гей 420 425 430
Тер А5зр Тер Абп о Ніб Агуд Азп Ге Тс омаї Агуд б5ег сіу Гуз меє туг 435 440 445
Ре діа РПпе А5п РГгГОоО Гуз Ге Суз Ма! 5ег сіи чІ1е туг Агд Меї си 450 455 460 сіи ма! тк сіу тийг огуз с1у Агуд сЇп 5ег Гуз сіу Ар ІЇе А5п ТЕГ 465 470 475 480
Аг А5п Абп о1у сій Агуд Аїа 5ег Суз сі бег А5зр ма!ї Гей Ага РПе 485 490 495
Тк обег тис о твйгс те тер Гуз АбЗп Агу ІчІЇе ІЇе ІЇе тйг тер Ні5 Ага 500 505 510 туг Агуд Рго Рго А5р Туг Агуд А5р Гей ІЇе 5ег Ре Тийг ма! туг туг 515 520 525
Гуз сі АТа Рго Ре Гуз Азп Ма! Тйг сіи туг Азр сІу сп дор Аїа 530 535 540
Суз сіу б5ег А5п о б5ег Тер АЗп Мет ма! Азр ма! Азр о Геи Рго Рго д5бп 545 550 555 560
Гуз сім сІу сі Рго сіу ІЇе гей їеи Ні сіу Гей Гуз Рго Тер ТЕГ бо 565 570 575 сіп туг АТа ма! туг маїЇ Гуз АїЇа ма! тик Ге тиг мет ма! сіи д5п 580 585 590 65 А5р Ні5 ІЇе Агуд сЇу АїЇа Гуз б5ег сЇи Іїе Геи Туг ІЇе Аг9 тНг д5п 595 600 605
Аїа бек ма! Рго 5ег ІЇе Рго Гей Азр ма! Гей 5ег АЇїа 5ег Азп 5ег 610 615 620 70
5ег б5ег сіп Гей ІІе ма!ї Гуз Тер Азп Рго Рго ТИг Гей Рго Азп су 625 630 635 640
АЗзп о Гей б5ег Ттуг Туг ІІе маї Агд Тер сіп Агу сп Рго сіп А5р су 645 650 655 тукг Ге туг Агд Ні АЗзп Туг Суз бег Туз А5Зр Гуз ІІе Рго ІїЇе Ага 660 665 670
Гуз туг Аїа Азр с1у Ттйг ІЇе Азр ма! сЇи сіи ма! тис си А5п РгОо 675 680 685
Гуз Тйг осі ма! Су5 сіу сІу Азр Гуз с1іу Рго Су5 Суз АЇа Суз РгО 690 695 700
Гуз Тпг сій Аїа сЇи Гуз сіп АїЇа сЇи Гуз сім сім АїЇа сім туг Ага 705 710 715 720
Гуз ма! Рпе сіи Азп Ре Геи Ні Азп 5ег ІЇе Ре ма! Рго Ага Рго 725 730 735 сої Аг Агуд Агуд Агу АЗр ма! мес сіп ма! діа А5п тТийг о тиг мет 5ег 740 745 750 зег Агд б5ег Аг АЗп о ТИг Тс ма! АТа Ад5р о тийг о туг АЗп ІЇе ТИг А5р 755 760 765
Рго сім сій Рпе сіи Тйг осі тує Рго Ре Ре сіи б5ег Агд ма! дор 770 775 780
Зо
АЗзп о Гуз сої Агуд Тс Ома! Іч11е 5ег А5п Ге Агуд Рго Ре ТЕИг Геи туг 785 790 795 800
Аг ІІе А5р ІЇе Ні бек сСу5 А5зп Ні сім АїЇа сіи Гуз Ге сіу су 805 810 815 5зег АїЇа 5ег А5зп Ріпе ма! Ре АТа Агуд тйг мес Рго АїЇа сіи сІу Аїа 820 825 830
А5р Ар ІЇе Рго сіу Рго ма! тТийг Тер сЇи РгОо Аг Рго сЇи Ап 5ег 835 840 845 ч11е Ре Гей Гуз Тер Рго сЇи Рго сі А5Зп РгО Ап су Гей Пе ге 850 855 860 мес туг сій чІІе Гуз туг сіу 5екг сп ма! сіи Азр сіп Агуд сім су 865 870 875 880
Уа! 5ег Агуд сп сім Туг Агуд Гуз Туг су с1у АТа Гуз Геи А5п Агд 885 890 895
Гей А5п о Рго сіу Азп Туг Тйг АЇїа Агуд ІЇе сіп АЇа Тийг 5ег Геи 5ег 900 905 910 с1у Азп сіу б5ег Тер Тийг о АЗр Рго ма! Рпе Ре Туг ма! Рго АїЇа Гуз 915 920 925
Тег оте тує си АЗп РБе Мет Ні Ні5 Ні Ні Ні НІ1і5 Ні 930 935 940 (516) «2105» 192 «2115 512 «2125 РЕТ 65 «2135 Агтітісіа! «220» «223» Митатей чІсР-1К5 єСО Мсегтіпа! мій АТапіпе ас розієіїоп 491 70 «4005» 92
Меєт Гуз б5ег сіу 5ег сіу сІіу сіу 5ег Рго Тиг 5ег їеи Тер СТУ Геи 1 5 10 15
Гей Ре Гей б5ег АТа АЇїа Геи бек ге Тер Рго Тиг 5ег су см Пе 20 25 30 суз сІЇу Рго сіу Іїе д5р ІЇе Агуд Азп А5зр Туг сіп сіп гГеи Гуз Ага 35 40 45
Гей сі Азп Суз Тиг о маїЇ те сіи сіу туг Ге Ні5 ІЇе Гей їГеи Пе 50 55 60 5зег Гуз Аїа сій А5р Туг Агуд б5ег туг Агуд Ре Рго Гуз Ге ТЕиг маї 65 70 75 80
ІІе тиг сіи Ттуг тей Гей Ге Ре Агуд ма! АТа сІу гГеи сіи 5ег Геи 85 90 95 с1у Азр Ге Ре Рго Азп Гей Тиг ма! ІЇе Агд су Тер Гуз Гей Ре 100 105 110 туг Азп Туг Аїа Ге ма! ІЇїе Ре сіи Мет ТНг АЗп Гей Гуз А5Зр ІїЇе 115 120 125 о1Уу Геи Туг А5Зп Гей Агуд А5Зп ІЇе Тиг Агу О1у АЇїа ІЇе Агд Пе си 130 135 140
Гуз АЗп АЇа А5Зр Гей Суз Туг Гей 5ег Тиг маї Азр Тгр 5ег ге Пе 145 150 155 160
Гей А5р Аїа ма! 5ег А5п АЗп Туг чІіе маї сІіу Азп Гуз Рго Рго Гуз 165 170 175 сій Суз с1у А5р Гей Су5 Рго сіу Тйг Меє сЇи сіи Гуз Рго Мек су» 180 185 190 сіи Гуз Тс Тс о ІЇе доп доп сій туго Азп Туг Агдуд Суз Тер тег тег 195 200 205
АЗп о Агуд Суз соЇп Гуз Мек Суз Рго 5ег ТИг Су5 су Гуз Агд Аїа су 210 215 220
Тк оси Ап о АЗп сі Суз Суб5 Ні Рго сі Суз Ге сІу б5ег Су 5ег (225 230 235 240
АТїа Рго А5р АЗп др Тс АЇа Суз ма! АЇа Су5 Агу Ні Туг Туг туг 245 250 255 Аїа сіу ма! Су5 маЇ Рго АЇїа Суб Рго Рго Азп Тйг Ттуг Агуд Рпе си 260 265 270 с1у Тер Агдуд Суз ма! дор Аг Ар РПе сСуз АЇа Ап ІЇе Ге 5ег АїЇа 275 280 285 сі 5ег б5ег А5р б5ег сі сІіу Ре ма! ІЇе Ні А5р сіу сіи Суз Мет 290 295 з00 сіп сій Суз Рго б5ег сіу Ре ІЇе Агд Азп сіу б5ег сіп 5ег Мет туг 60 305 310 315 320 сСуз ІчІЇ1е Рго Су5з сій сіу Рго Суб Рго Гуз ма! Су5з сім сіи сіи Гуз 325 330 335 65 Гуз Тийг огГуз Тс о ІТе Ад5р 5ег ма! тиг 5ег АЇТа сіп мех ге сп с1у 340 345 350 суз Тийг ІЇе Рпе Гуз с1у А5п Гей Геи ІЇе А5п ІЇе Агу Агд о1У А5П 355 360 365 70
А5п ІЇе Аїа 5ег сіи Гей сі А5зп Ре Меї сіу гей ІЇе сіи маї ма! 370 375 380
Тег о сТ1у туг ма! Гуз Іїе Агуд Ні бек Ні АЇїа Ге ма! 5ег геи 5ег 385 390 395 400
Ре Геи Гу5 Ап Гей Агд Геи ІЇе гГеи сТ1у сім сім сіп гГеи си сІ1у 405 410 415
А5п Ттуг 5ег Рібе Туг ма! Гей д5р Ап сіп Ап Гей сіп сіп гей Тер 420 425 430
А5зр Тер Ар НІі5 Агу Ап оїеи Тиг ІЇе Гуз АїЇа сіу Гуз Меє Туг РНе 435 440 445
АТа Ре Азп Рго Гуз Гей Суз Ма! 5ег сіи ІїІе туг Агд Меє си си 450 455 460 ма! тик оТу тиг Гуз сіу Агуд сЇп 5ег Гуз сіу А5р ІЇе доп ТИг Агд 465 470 475 480
А5п о А5п со1у сої Аг Аїа бек Суз сі 5ег АїЇа ма! Ге ніх РПпе тТпг 485 490 495 5ег Тис о тиг о тиг о б5ег уз А5Зп Аг ІЇе ІЇе ІЇе тНг тгр Ні Агд туг

Claims (5)

  1. 500 505 510 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Зо 1. Інтерналізоване моноклональне антитіло або його інтерналізований ІСЕ-1В-зв'язуючий фрагмент, що зв'язується з людським рецептором інсуліноподібного фактора росту 1 (ІСЕ-18) послідовності БЕО ІЮО МО:52 та інтерналізується після зв'язування з ІСЕ-1К, і яке не зв'язується з ІСЕ-1Е послідовності 5ЕО ІЮ МО:82 і/або 5ЕО ІЮ МО:92, де зазначене антитіло містить: - три СОК важкого ланцюга послідовностей ЗЕО ІЮ МО:7,213, Її - три СОК легкого ланцюга послідовностей ЗЕО ІЮ МО:9, 5 і 11, де зазначені СОЕ визначені відповідно ІМСТ.
  2. 2. Інтерналізоване моноклональне антитіло за п. 1 або його інтерналізований ІСЕ-1 В-зв'язуючий фрагмент, де епітоп зазначеного інтерналізованого моноклонального антитіла містить амінокислоту гістидин у позиції 494 послідовності 5ЕО ІЮО МО:52 і/або амінокислоту, аспарагінову кислоту у позиції 491 послідовності ЗЕО ІЮО МО:52.
  3. 3. Інтерналізоване моноклональне антитіло за п. 2 або його інтерналізований ІСЕ-1 В-зв'язуючий фрагмент, в якому зазначений епітоп містить амінокислотну послідовність, що складається щонайменше з 8 амінокислот.
  4. 4. Інтерналізоване моноклональне антитіло за п. 1 або його інтерналізований ІСЕ-1В-зв'язуючий фрагмент, відсоток інтерналізації якого після його зв'язування з ІЗЕ-1К складає щонайменше 40
    Чо.
  5. 5. Інтерналізоване моноклональне антитіло за п. 1 або його інтерналізований ІСЕ-1 В-зв'язуючий фрагмент, в якому зазначена амінокислота у позиції 494 послідовності «ЕО ІЮО МО:52, що відрізняється від гістидину, являє собою аргінін, і/або зазначена амінокислота у позиції 491 послідовності зЗЕО ІЮ МО:52, що відрізняється від аспарагінової кислоти, являє собою аланін.
    6. Інтерналізоване моноклональне антитіло за п. 1, де зазначене антитіло є химерним антитілом.
    7. Інтерналізоване антитіло за п. 6, де зазначене антитіло вибране з наступних: а) антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності зХЕО ІЮ МО:13 або будь-якої послідовності, яка демонструє щонайменше 80 95 ідентичність з БЕО ІЮ МО:13, і три СОК легкого ланцюга послідовностей ЗЕО ІЮ МО:9, 5 і 11; і р) антитіло, що містить варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ХЕО ІЮ МО:18 або будь-якої послідовності, яка демонструє щонайменше 80 95 ідентичність з БЕО ІЮ МО:18, і три 60 СОК важкого ланцюга послідовностей 5ЕО ІЮ МО:7, 2 і 3.
    8. Інтерналізоване антитіло за п. 6 або п. 7, де зазначене антитіло містить або складається з важкого ланцюга послідовності зЕО ІЮ МО:23 і легкого ланцюга послідовності зЕО ІЮ МО:28.
    9. Інтерналізоване антитіло за п. 1, де зазначене антитіло являє собою гуманізоване антитіло.
    10. Інтерналізоване антитіло за п. 9, де зазначене антитіло містить:
    а) важкий ланцюг, що має СОВ-НІ, СОВ-Н2 ії СОК-НЗ послідовностей 5ЕО ІЮ МО:7, 2 і 3, відповідно, і ЕКТ, ЕКЗ2 і ЕКЗ, отримані з ІЗНМ1-46701 зародкової лінії людини (ЗЕО ІЮО МО:44), і ЕКА4, отриманий з ІЗН.4"01 зародкової лінії людини (5ЕО ІЮ МО:46); і р) легкий ланцюг, що має СОВК-І1, СОВ-І2 ії СОК-І3 послідовностей 5ЕО ІЮ МО:9, 5 ії 11, відповідно, і ЕК1, ЕК2 ії ЕКЗ, отримані з ІЗКМ1-39501 зародкової лінії людини (ЗЕО ІЮО МО 45), і ЕКА4, отриманий з І6КО4701 зародкової лінії людини (ЗЕО ІЮ МО:47).
    11. Інтерналізоване антитіло за п. 10, де зазначене антитіло вибране з наступних: а) антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності з«»ЕО ІЮ МО:33 або будь-якої послідовності, яка демонструє щонайменше 80 95 ідентичність з БЕО ІЮ МО:33, і три СОВ-ділянки легкого ланцюга послідовностей ЗЕО ІЮО МО:9, 5 і 11; р) антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮ МО:34 або будь-якої послідовності, яка демонструє щонайменше 80 95 ідентичність з БЕО ІЮ МО:34, і три СОВ-ділянки легкого ланцюга послідовностей ЗЕО ІЮ МО:9, 5 і 11; і с) антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності, вибраної з ЗЕО ІЮ МО:56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 і 80 або будь-якої послідовності, яка демонструє щонайменше 80 95 ідентичність з 560 ІЮ МО:56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 781 80, і три СОК легкого ланцюга послідовностей 5ЕО ІЮ МО:9, 5 і 11.
    12. Інтерналізоване антитіло за п. 10, де зазначене антитіло вибране з наступних: а) антитіло, що містить варіабельний домен легкого ланцюга послідовності з«ХЕО ІЮ МО:35 або будь-якої послідовності, яка демонструє щонайменше 80 95 ідентичність з БЕО ІЮ МО:35, і три СОВ-ділянки важкого ланцюга послідовностей 5ЕО ІЮ МО:7, 2 і З; р) антитіло, що містить варіабельний домен легкого ланцюга послідовності 5ХЕО ІЮ МО:36 або будь-якої послідовності, яка демонструє щонайменше 80 95 ідентичність з БЕО ІЮ МО:З6, і три СОВ-ділянки важкого ланцюга послідовностей 5ЕО ІЮО МО:7,2 і 3; і с) антитіло, що містить варіабельний домен легкого ланцюга послідовності, вибраної з 5ЕО ІЮ МО:57 і 60 або будь-якої послідовності, яка демонструє щонайменше 80 95 ідентичність з ЗЕО ІО МО:57 або 60, і три СОК-ділянки важкого ланцюга послідовностей 5ЕО ІЮ МО/:7, 2 і 3.
    13. Інтерналізоване антитіло за п. 10, де зазначене антитіло вибране з наступних: а) антитіло, що містить важкий ланцюг послідовності зЕО ІЮ МО:37 або будь-якої послідовності, Ко) яка демонструє щонайменше 80 95 ідентичність з «ЕО ІО МО:37, і легкий ланцюг послідовності ЗЕО ІЮО МО:39 або будь-якої послідовності, яка демонструє щонайменше 80 95 ідентичність з ЗЕО І МО:39; р) антитіло, що містить важкий ланцюг послідовності 5БЕО ІЮ МО:38 або будь-якої послідовності, яка демонструє щонайменше 80 95 ідентичність з «ЕО ІЮ МО:38, і легкий ланцюг послідовності ЗЕО ІЮ МО:40 або будь-якої послідовності, яка демонструє щонайменше 80 95 ідентичність з ЗЕО ІЮ МО:40; і с) антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності, вибраної з 5ЕО ІЮ МО:56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 і 80 або будь-якої послідовності, яка демонструє щонайменше 80 95 ідентичність з БЕО ІЮ МО:56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 або 80, їі варіабельний домен легкого ланцюга послідовності, вибраної з БЕО ІЮ МО:57 і 60 або будь-якої послідовності, яка демонструє щонайменше 80 95 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:57 або 60.
    14. Інтерналізоване антитіло за п. 10, де зазначене антитіло містить: а) варіабельний домен важкого ланцюга (МН) послідовності 5ЕО ІЮ МО:33, де зазначена послідовність зЗЕО ІЮ МО:33 містить щонайменше 1 зворотну мутацію, вибрану з залишків 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 і 95; а також Б) варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) послідовності 5ЕО ІЮО МО:35, де зазначена послідовність зЗЕО ІЮ МО:35 містить щонайменше 1 зворотну мутацію, вибрану з залишків 22, 53, 55, 65, 71, 72,77 і 87.
    15. Інтерналізоване антитіло за п. 1, де зазначене антитіло продукується гібридомою 1-4757, депонованою в СМСМ, Інститут Пастера, Франція, 30 травня 2013 року.
    16. Мишача гібридома 1І-4757, депонована в СМСМ, Інститут Пастера, Франція, 30 травня 2013 року для одержання антитіла за п. 1.
    17. Інтерналізоване моноклональне антитіло за п. 1 або його інтерналізований антигензв'язуючий фрагмент для застосування як адресуючого переносника для доставки цитотоксичного агента в місце-мішень хазяїна, при цьому зазначене місце-мішень хазяїна складається з епітопа, локалізованого у позаклітинному домені білка ІЗЕ-1К, переважно у позаклітинному домені людського білка ІЗЕ-1К (ЗЕО ІЮ МО:51), переважніше на М-кінці позаклітинного домену людського ІЗЕ-1К (5ЕО ІЮО МО:52), або у послідовності будь-якого їх природного варіанта.
    18. Кон'югат "антитіло-лікарський засіб" для лікування раку, експресуючого ІЗБ-1Е, що містить інтерналізоване моноклональне антитіло за п. 1 або його інтерналізований антигензв'язуючий фрагмент, кон'югований з цитотоксичним агентом.
    19. Фармацевтична композиція для лікування раку, експресуючого ІСЗЕ-1К, що містить інтерналізоване моноклональне антитіло за п. 1 або кон'югат "антитіло-лікарський засіб" за п. 18 і щонайменше ексципієнт і/або фармацевтично прийнятний носій.
    20. Кон'югат "антитіло-лікарський засіб" за п. 18 або фармацевтична композиція за п. 19 для застосування для доставки лікарського засобу або медикаменту до ракової клітини, експресуючої ІСБЕ-1К, у суб'єкта. За у пн нн нн, воо- : ри ; ї та і : ще в» У упро рен і ! 5 | па є | я рен -нш у. Й ГУ ї б ! | ї х і ! ща і : і В сен І КЕ ; х «Фр ще Є ТОМ и зл нан і ков Е Б / уч Воо і і я ово. : ! Та : ДЕ фест ге т щОю зов зда -О Во У вою Чає (с) -- БО шщ--ї 3 ІЗ і Й по Брупа ЗО. ! Група 2 Її : Група 1 ! яОВКЙ и Я су. і - 4 я Кк МОбО 00000 Групаї Група 5 ОМАН о ацюм чане ши кі: нив уки щ-к фо | Ще 0 АМмМЕ 0010565 832Е5 2013 ! 148 Її : ; ооозмеюово 00 АВ Мн 0 аз3НВ
    ФГ.
    в ЯКО я ен В Й че х саввРНВя й шо. | ЯНОМ 0 вари і ЩО | з піша (ж 5 Є да па ОК ШИ Ж ж їй с в/м си У й -- шо ОО жа й Кая ! у ж сш: ши: ше Ше МИ ж іод мі
    ФГ. ЗА схо Жимерні антитпла МН й | ; а. г о ШИ Мишачі антитіпа зр - дк ші ВЕ Б НІ вх и о нн ЕІ ВВ Ен По А 1 їй Еш Нр я о чани ННІ нні ши І | БИК ИНИИНИе ря І Ій ЕЕ ОО, зем в В Ким и и и, Кф Ка Ф Кс я ей Оу
    Без. 5 ща -ь се
    ФІГ. ЗВ що ї І ж ее ен ек ек НИ Не Не Ж Ян шко. ЕЕ ик - ЕЕ нІК и ЕТ за ВВЕ ми ий ний» Сай Оки РА Я я Оу ге ще га 5-6
    ФІГ. Зо а Зоя й «юне ЗЕ а смак) що У сина Вк ра По ЗОМ ж свв з ла в о сібвогаво ЖАЯ -- В Са свзове(ов я ук в Б Є 305» Ж и ОО зда а у «а ою сш: совім
    ФІГ. Яд й о А МШЕВОВ ГЕ ще ж еювесво в КЕ І ж онаті (Зо; Б - ситі ЖК ОМ дросвюввєю ве 255 векаваневнай БЕ кеш: же: Ви З МИ: едімі
    ФІГ. в в 0 Бе «оо ж о щ М Б зосч . У В зво уд Ж й «вон ; ЩЕ ою. Л ср їх ній п «к - Дефенаканкеникн у ака айв . но. ; «я «та «а «і «Ж «В Сов . таСа з те1гАІ « тіце хх тів ч вовка ж тав ее ші О а пи1БАВ ее пИлОСся я тв З тек М пеізкі й по ж пезана чт в нВ ж 1 ВОМ Фе ттгна
    ФІГ. БА Ж Ж авоч м Є зов лі я Ех | Е; ЕЕ Я Ен в 5 зо я Не жи Дн Ф сккжвовня виіснні нн: нн нс Б ч - «еВ не! «В не; В лез І - спра т шРОошнВ ь віісса че» ша т еоовЕЗ м світова - єдино ово Ф собі ж саАтТБАВ а заївака - ен а сіовсе т відо) ш ета на «г, 5 ня че Я з З ти Не й - їй ! Е 0 ВО не мні во Е "іре во ж ве ди що -44 -0 і «В «Х -В Сов МІ ш Я з жала А а вУ за Ж о тезов ж тав я-6 тот е нта зЗЕО же пила ж таня її тварка о гаетава м пила я пет ю о паче чу тане ж (ЗНОВ) ве ЧчОСеНІВ
    ФГ. 6 а НМ д с. зей й СЮВКЕВ а и ще вай, ак і - зе ж ок я т -й пи ОК вно сю КД 2 Б чер її сов КА і. Б че овєтвозо ма я 5 ик ек НУ ж Б ДЯ ИН а сісасссснисясяН ке З Ше ШИ ШЕ ЗА Я Без ФІГ, 7А чвижаея ші иМмерні антитіла ж В Мишачі антитіпа 1 Я зем ДП ЛОВ 0 пн. ша ші НІ ПЕ ни ша: В І НН кї | о ки ши Ше Ши А Щи НН и с сн і ОО С Кз що й мк а ее і сг. ТВ вела суукн зт нав і ан Зозоєюєя ПП. в, п й явно зво БЕ ші ши ши З ЕЕ В В 555 ЗІ ЗК ЗБЕ ЗІБ ЗК КІВ І ЕВ я І І ЗЕ ш щ ше ші ВЕ ВЕ Бі щі ші ші ші ше ЕЕ І нн нн в и ШЕ ШЕ ЖЕ НК ки а и ие А в А і В ШИ Си а и и и ка о м ви і ВЕ М З Ге б са св пе ск
    ЧНг. 7 і РУ 5 нн о в п кон он РАК т тт УТ У У АМКУ КК КУ УК к кка кчит как Кт жу М том 20 вм 30 нм ХОМ 0 кіб2ОВКоІ : кю і . дей СК свя і пу рннь ! Б Що : ї : паж ; / : Без І Е і наБжее : ш ші ж ен дав фев доні фон реч і фр ф-т ДК бойні іно дрів вна вв : їй ! : її о Я Н Ж Бі ! : ву Н Н : ТИНИ: Е в С 0б'Я Е В БО й ' До ними ЗТ: ЗНКККНН о о «Б й Ра кю ВО що ї1щ.о і1роЮ їю 1500 сінях МВС КТ люд оьнИЙ НОМ ян ко лпюдський МОБ сен НЕ ЕР Вазатичии КЛЕЮ «осо о павич пак дин м о р м и ФІ, то з Її БК З Оп ї Е пото й З ще ій Е В о 03 жо Ж | Б б дві 5 о 504 Б Е Е В - Е оо 404 а з Е ЩЕ й 8 го Ева ів во попа і пов но нн но нина нання нини панни ні З й ооо Ба ак Щ з ЩЕ - в | | й хх то я за Фо са ш т щш - т ш т я щ- Щ - ше х Є : се ї й КО: з г - ех Го З роя г 5 ши ши ши ши ши ши ши и и ши ши и Ше Я а ее Б ще
    ФГ. З ян ді ток -- с | не Ж зо р В Ж зо щи ЖЕ ЕВ 5 щ І як ВЕ Б ши що шк щ В и щі щі щ сш що щщ 2 4 ВЗ а о "щ В і са | за 5 8 Би а. стояння В ЩЕ ШЕ щ ж ЩЦ шк шк ши ще й си ши ни нн мн нн Нас НН с НН НН З ЯН Я ЕЗ ЕЕ ши м В В В с В В в ШЕ тт тт тет ке а а и етапі е інеті е іона акжкикжкккикжю юю кю кю кюя ре
    ЕС. ща за се пе пн о спина НД
    «АГ. о 4 СО ві ВХ зо АН ви В ш Б 10000 т ж с ж 5 нн шен литі. з УК и Аля , Мох М Яка Ки й я ай З чн р аа Як я й а і а НК ВК і НК. їх Ес І КЕ са с
    ФГ. 1 ще Нею ж пі НВ з ру В й с кг щі ОС. а пиИдене с ва суд Б ж п З зи У дже Ех а ОБО ше ще в я же ЕН - В вв у НИЙ : : -к Є: ЗАЯВ оооовоооооооооооонннннкну , ч я ВІН пев ОО ! «хан В яв Не чем т щей І т я з еВ ЕВ: и пиши: и С М ВЕ З В я Я - -- щк соч ве Чає інкубації х тож ж пиМмМЕ! ж пебАй Ше я
    ФІГ. 12А х йо й ОЙНТМТЙВ навежитт ді же ША Й й ак | БЕ а | па щкУ Е КЛ, ох ех Ов; і І чЕ МВ ча: фоеосовююютткююк нн нн знаних За вижа 0. Це лсюм нин пи ан кола книвв за оон нн зак ізо ша ОО фреюьхюкикмм нн нин пивних ес ЮНІ ов мо оте 00 42ю, ов Як . М. ов се; ВШ ШЕ і КК | ка ан пила ВИ Же: і екзо а чн. 35в бю АД НЕ яко. дю альне Бах о нини нан піна шко й ех россююнннюсоь ня н ШО нн | ав Ме Шен НК на я о ка Й нори : й вх АНА х 18 дк як ча зх вх ха гЗ «3 дж що « вк що Ко Мід Знкуєнції Час інкубації ті зх ВЕДЕННЯ те тя вена зав: вапальнЕ тяе заеальне кат о зву рппозматеня Ме т реал азиа тин ев нн КН ск ни ЧИ й і ж ха 4 " с лин 5 ка ї тех і ще пн ЧНІ а 4 ну ска Кл ллла кн вка де Ше ооо ВВЕ сн ЕЕ Е. АП вх і нн ся пінні» зінінінівінінінінінінінь хініківінінінінінінінінінінікікігінініінінінінь тівінівінііннііннік У ї - щ ре 5 гум Ж г Ку Ко в ЖЕ Ко 5 ТЯ мас інкусації Час інкубації ЯВНО 0о--- вецйбрунне пунк ва певне: «ефе ЗВ ВВ ВВ вед: саке загавьне яка зав ртеплеЗматичНа ща ЗвеовленвАВтиеКНа СОЯ ї ши жави і по с Її Ше І ква фен Шо вен г жк : Ши | ее дж Панно Е же 3 з, ше ме Ши щи во я Най пов сети са й Шик и
    Я Е. а «5 Е.Ф з в я в жд «ад вою В вдо в ж вия ж Мас інкубації «ес інкубації ЯМЯКВ -»- мевмбрання тЕДАРЬ ее мембран -їв- ЗВгалЬНЕ як ВаГОЬНЕ БЖ пси с ВЖИ схтикютеги тк Висненни с пнккнкют не ше Шин ожевфет Шия пай ри ШИ ; ява) вн . а Ди і нини ВЕ ни поток, Б оон кни ен нини ЕК ЕЕ екеккк кни пн ша г ша , т з й 6 ж ж ж ш м щш а В ж ма я я 5 т Ме інкуації врне вену Ж Н т ЗВКОТИОККВ ВЕ НеН В. ва я Н п МНК рн Й Шин ня В жо Б ин же. Ше че : й р Ши ННЯ ЩЕ «я У т нні сіні кінісінікінінінія зінінінінінінінінінініні» пінінінінінінініннінік 1 - адек ватияя К Її ав в ж в Фо х ФІГ. 13 (частина 1) Час знаеубації яна нЕ сей ЗАМ ТА хесіке ВЖЕ ЯННИХ ач -як-- ЗОВ ВМЕТУН ох нн ча о ; Пвосткжтткнсті у ея о сно г зо. скла чан Ж мае вені шк Н ож Й осно. шдяжжк ; що Я і са Щай ще г жна ЕК сн ке нн здох оо юн вісн 2 ва го в ж ре - як і: їв Ехо ж ща во ро Ко Час інкубації щас неба ВЧ ОВОО 0 маебрання ЖЕ зон ВКДКА рдНЕНЬ у БККО у пн ННІ ее Ше зд орі ЕК жав К- мини НН на: ШИ зе я "кокос, ше ви ДН Ж же йо щас | ен Ши ик ях й посчиккеєк, ес сс, «в й нина мини Ніні пн он х х 85 ЗМО НН нн я за - КТ «а 5 «ее рі БУ Як КУ З а В в У час інкубації піс інкубації ваш В зе» МанбЕанне теза й --я- ВОМОраННа седінса ВВГЯТКНВ мене ВЕВИВУКЬНЕ ко Я каву Що оваханн Шк б змо КМ кое се сосок ше нене кккнкикьннн ок кни кн ан Вена вв 8 хв ї з ях вв в її зе Зв - ща Фа як чає веб Час інкубації ФІ, З ічзаєтина 2
    ППП и шк ан надавапнния С Е: ВМО М ни Са 3 т ОК ЗА удижжиккфии Е: що ок ВК ОО ОН КЕ о Ки 4. ОоКаНЕЗ Кох КН Кв в В о С ок Кв о Хе во ес Ов ново ов ен о но сор ВО ЗВ Е: х ОН М ОО В В Е: ПО в
    1. вік В НН ВН о я С о нн Он ннн МОН В ОО В я ДН со о не о с о В кни ув в ко Зоо в В ом ук нн Кк ов о В в о сн в овен ОНКО вв в В Кн о о в в в В В В НО ЗО в в В В В В В В В В В В Б Б М М ОО В в Ви ВН М в В В в ОН ВН о о КК ОЗ Кох о СоКОО ВН вк ов в Вв В В ДН В ОВ В с в КК нон ск но ВК о У ни в в еВ осн в в с о КК Кк он ння НН и І ДН о но о оо о Вр В о Корок о о кс вв о м ко и в ни вики Б ІІ Ці зм ВпгГгГг До в о ХО СО КВ В Он кн ко ЗУс о хо оо Зо сво в В сн кн КН Кор нн р сн но ПЛИНИ КИНЕ Ве В о З ДИЛИ ЕНН ОЕПЕИИИП ПИТИИ ДМ в о НК ЗХ Ко о КВ о нон В В КО оно о осо в о о в о кн кр ск кв в вх п і ДОН и нн ее о Ко не мо ци о в ск о о о Ко кн о в вк кв о в о о се с в сво юх ПН в в В в вних Ов в Ов в я ППППИШОПИИКИ ПКЕЕ КПП НКИ ПЕД ЕК ЕК КОЖ ПИШИ ПКП ПК ПК и ДО м в но с о ХО сво ки и КК с р о Кк в р КВ Кв о в о о в в Он у КО В НК ХВ и ення пн В о о НВО ПЕН НН КК НН нн о Нв нн овя з ООН в Хо оо ов ок ов о о о В о о оо оо оо оо оо ов зво о ооо о о ооо Е: НВК и ОО ОН в ння з З Я вна аа НН А НН НН А НН НН ПВ В В В В з м А В в В Е м и НН НН уаОВОВВВ в и НН нн ОК в с в ер о кн Вк о о ко ок кв ве о в св с ЗД о Кв Кн сн кв Кк в Кв вв ок ОО в В В ППППИПИИИИКИК НПП ПОПОВ ПИШЕ ШИПИ ПОПИ ШИПИ НИНІШНІ ОО ОВ В В В о В в ЛИПИ ПИЛИП ПИТНЕ, ПИЛИП ППП ППП ОО В ВО В в ДК нн ов о в в о ск но о Ко оо СК ок о с С о о в в с св в в кв в вив о о В В М В В ПЛИНИ КИШКИ ОККО КАТКИ ПИ ПДК ПИШИ Б В М ІМК я я яРвцВЦц ОН в в я ОН В В Он нн нн нн с Он Мн Он нн НН В СУ нн нн В в в в в в ПИЛИП МИКИТИН КИИВПИИИИЕ ЕВ і ГУ ОК В я У ов он нн нн нн ння Е: й Пенн в о ння Е: ОК о у ВН ОК нн нн нн По НН Но в ВН в нн ння ВВ о м М и ПН ППППППИШИНИИ ПИШНЕ И КИМ, ИН, ШИИЕ ИН ШШ ПИ ПИПИПИПИИПИНИПИКИШИОИИКИ ОО в в В ОК ОК Нв НН У В З В нн нн ння КН В в в З З ВВ о ВВ В КВ В во о В ОВ п В В в В В в В В в ОВ ДО в я ВО В я В нн Вин по Нв В ОВ Кн нн нн В нн М М М М М М М М М М М М М М М ев я ВЕН В в о В ОК В В В В В п В В В о в в В В В В Б В Б В В В В В В Б В В В ДНК в ке ні оо в но фе З о вв в в ос ке в с ВН о Ко в Вс Хв в в в в о в в в в о в в ко о в вх ОК о В НН В ВН нн нн нн ння До не ЗК во ви вн о КК в с с с КВ о КК ОКО Кв в и кв КК КК Кк о в и ннХ я ОН нн в вн В ни КИ ин ОО В В В и в Е хх / ДИВНО ва кв В о в В В В В В В в Сов ВК в в в В В В В В В ТОЖ ДВ ве ооо ее о м оно ен ек Кв В ОВО с нн кн в в КК ск КК Кв Кия т ху Ве нн Е; и ВОКр о о ов о о оо рок но пою оо ов оо оо о вк око фрорко в оо оо оо в ко о во о о во ов юХ Е: ФП ПІДП КН ДК МПК КЕПКИ МН В В М о НН НН В В В ОО В 0 Кн В В В КВ вн нн ння ДО у В З нн нн ЛИПИ ПИЛИП ПИ ИН ПКИПИППИ ППП ПИ ЖО ПИШИ ПИПИПИПИДИПИИИК о в в в В ВО в в в В в с В В в В В КК В В Б В В ВК В В В В В о о В Б В В Б Б В В В В ДНК ов в в Кос ДО в Кн Кк св ов КК КК КК с в З в се КО в в в с в в в вв нюХ ДНК ово о в в с В в Ко Ов во В в ов Ко КК р КК Кв КК Кк Ос м с о с Ко в в в св кв в нюх
    НЕ А КК ЕВ ПО М В В М КО В В М ЕК Я СКК ж з де 00000000 полоканізація. во оо и С ОК І ЗО в НН Ж ВІ ЗО ООН В о Вер Воплі вверх хору ВК В КК о м ВОК МО о нн нн нн нн НН Нв ОО и и в М В о ох М М ОКО ОВО ЗК о ОО ОО в ди и и В В М По НН в в о М о В ОО М В ВО ОК в в В В ВИ о оо оо и КН о МН ОК и м КВ МК КК ВОК З ння ОКО оо он во в в в ОО о в В М ОО І М ОО ПО КН о и НН о ПО в о по КО ВО во о ОО ОК В ВО НН В ОО В М КК НО ОО ПН в в в в Кн о М и М В п У ПК о о КН Кн в ПИЛИП ИН КИ І ИН риииКнИИИИ ИКПИ ИМЕНИ Ин ИИКИ ТВ КН во о о и о и КН М в о в их ППП, АПК НИ НИ ШК ИН ОПП ИН ИИШ и КИ ИН ПИШИ ПИ ШИПИ ЕЕ ППО ДИПИИПИИТОВ ДНО не о Я А М я М в р ве 2 ТАН я Копокопаація. С ПОН на вно я Ох а В в о ОО в ОО КО КК КК КК да М М М ПО о о В в НН ОН в в ПЦПОПИИМ НИКИ КИ ПК ОН ОН М НО НН У В и Хо о НН НН НН он в м В В в ОО ко оно око о ЗМО о по Ок корок о о ОКО око кОм оно око ок коном око кон о ко о око но ооо. ни в и КО о о о о о В ОК СО о ХМ В ОК С НН и ОО в КК ОК ОО М В В ОО ОО М В ПО М В В ПЕПИПИПИИ ППП В ООН У У і ОК о о В ОК рн ВК о НК нов во св о оо ов в Кк фо о в кв св ков п В НК КК ЗК НН в но В о КН и "ПО п и КН Кн НН М М В КВ У В КК МКК М х І М М І и Пе Пе в ВН В МН В Нв НН НН в нн По ння З І і Кк в А ОКО НК о и ЗА ВВ ЗОН НН НН о ВВ я вн о нн и КІЗ Р; ЗНОВ МПИПИИИИ ПИККК о Вввех ЗИМИ ОН КК о нари МК реко, п о В ооо оон ОВ оо КОКО о о ХК Ки о КО Мо ПО о о о о р м Ко о КК о КО о о о о о о о Ко о Ок в Ко Ко КК ОО М ОВО ОК КО КН о КВК КВК о ооо Ко КО О и х ОН в В в ЕН НН МЕ В М А винна и НН НН М НН о ОН о В Он в в НОВ оо ОВО о со СВ Кк Вико ооо оно оо око оо Фуко оо ОК Ко ов: ОО М М І М ооо о в о о о о в о о в о нн о ов в со оо Во ки о во ово оо ОО ор ко оо оо о оо Ве с оо о о о о в в ооо ДОКИ ни Он в Ин НН нн нн нн и КН НН В де НН ПКП ПИКА ПИ ОПИСИ ПИ КК ЕИИИИНИИИИШОПИИШОПИШИНШИПИШЕИПИШИШИИПИШИВ ЛИ ДВК в в а я ОО ОЦ г: ПЕК в в КИШОК КИПІТИ ИИИКИКОТ КИНЕ ДАТІ ї ЧО. ПИПИИН ат З Оу п копокапізація. ПИШШИИВ ПИШЕ, ПЕПЕННННННВ, оо МНН Я З ЯК ев в дя М ЕІ ЗК ВИ ко ООН о воно оо ооо опо. ВАН ОО В ЗК о ХТО ово сі В нн нн нн нн ни о о о о о в о ВН В в В В В в ОМ М в о в ИМУИИИИИИДИІПИ ШК И ИИЦИИК ТИДИКИИИИИМИИІИИИИИИИИИИИИИИИИИИИИИИИИИШ ИЙ ще ОО В о В КО Кн о В В В В В В В ДО я ДО ох НН КО нн в нн НК о виБ о ЗО С ОВ ов око о Кон ОК оо ох ово Ко ОК Кв КК Коко ооо шо І В В ПІ В ПВ В В Є Во оо ОК ОО в о в о о ПИЛИ ПК ШИПИ ПП КВ ППП ПКП ПИЛИП ПИЛИ Он о НН у о о о о з Ко Кв о ов ов око зо о Ко о о оо о КК ОК о НН НК НН НН НН ОО о В ОК В в и ОН Ко в ни МЕ В ОН о в у В ен НН ВН В нн нн нин ОО в в в в НН о В нн в ОН нн нн ооо о я КК КА о оо нн Кн о НИППИПИШИИИИИ ПИ ПИШИ ПИШИ ИИПИПИПИИИИИИИИ ШИН НК и Ко о МИ ни ВК и КН в нн По В КО в о В о в в в о в нн
    ЧНГ. 348 (частина
    ОО її Ов и и ша ан ен КЕ НН У З Но Ж МНН ни Бак. и и УВІ НК ТВ е ДИЛИ ЯВИ в Нд КВ ЗКУ нн а ОК п.
    Я в о осо ко р родове воло зві ввввовх НК В в в нон ПИВ в в вн НВК ко о у НВ ВИ о нн кв тн но т о еВ Ко КК о о и в КК кВ КВ КК КВ КК о КК в вх В ПН НН НН В в в в нн вн нн В он нн ОК Кн ВВ нн МНН и нн и ООН В З В М в о в в в ППП КН о В Кн в: Кн й щ- Б М М пп п КК ж ОНИ во В но о в В ОН НН НК НН НН НН нн ОК ОО ВВ о в В в В В ПІНКИ КК ВУЛИКИ ПИ ЕП ПИПИПИИПКИПИПИПИПИПИПИПИИНИПИПИПИПИИПИПИПИИПИКИИПИПИИПИПИЛИИИИИИС о М НК ОК о М М М ППФ ШИПИ КМИН ОО М М І М І ПІ В І В В оо о В НН НН ОН НН НН НН НН нн НН нн пон пон В ПМК М М НН М БВ МО М І М І М М М В І ОНКО Но В я ВК и и КК.
    Еф яв З сс и в и у НН Кв ев Й 5: НЕ с 0 Ба те Кблокавізація.
    ПИШЕ ен ок сов ЗНО нн вн ДК п ок зв ВН НН вон ОКО В Не ЗО о ОВ В во ЗОМ ОВ Ов в во ОО В ЗБОЮ Ов вв В ОВ в вв ПИЛИП УК ПИПИ ИПИПИПИЕ ПИЛИП КИ МПД ПИ ППКП ПИ ОПЖКОПИ ПИ ПИПИПИТИПИПИИИ ПИТИ КЕКВ ПЕКИ ПИЛИП ПИ ПИ КИ ПИПИПИИИИТИТ ОО М оф НН В НН НН НН НН НН НН нн НН о и в а І А пп КК ПДК НК ПОКИ ПОНИНІ ПИШИ ПИСК ПИШИ ШИТИ ПИШИ ОК НН нн в нн ПО ВН и Н ПКП ПИ ЕКО ППП ППП ЕЕ ПИЛИП Ме В і ОКО и ОН ОН В в ЗВ Зо и КН НК НН КОН Не Зх УНН М я ОН ПО В В о п в а М ОВ В В в ПЕ КН и КН ВП и ОК В ну В нн в нн их ПНО о о ОК оон зо ооо уко о ооо ооо о о о оо о ооо оо о ооо о о ооо о ооо о ооо осо оо о Со ок ов о ооо ооо ооо ооо КО ОН НН ни КК КК КК КК КК КК АКА КАКК КК КК КК КК КАК КК КК КК КК КК КК КК КК КК КК КК КК КК КК КК КК КК К КК в и В НН в В и ун о ВК ЗИ ше о У ВУ ща В КЕ КОНЯ Ікеа Ва ПЕШШОЯ о о в и ВХ СУДІ "КОВО В КК В ко ов ово ооо ков аа ОН КН ВВ в ОВ ЗОЗОО о н ЗОВ ВК овх Відново в о КК оо о Кв в в в в вв вх НН в о В в вн ООН в в в в в ОК в ПИТИ КПП ПИТ м нн и ОН Он Нв ОН в Нв ОВО в ни В ня УВК я в ИН Ж НИКИ У А В о в В ння ПКД ПИ Кв КВИТКИ ПИЛИП ШИПШИНИ КК КК о НН НН М ЖИЛИМ ПК КИ Ко ППП, ПИЕ ПЕ ППП НК КЕКВ ПІК ИЙ о в в в в в в в М ПК в В Б У у оо нон кн о ве У сф он ко о о ЗК НВ о о в о С о о с КВ нн кн ев Ки Кн ни кв КК кв о в вве ЗКОНаВи в НК НН нн ИМЕНИ В во М Няни ПЕКИ АКНЕ КВК ФПМ ППП ОПП У М М З У В вн В в нн нн ПН в Ов о в в в нн ОН В В м НН М НК НН КО Бр ех вив оно во он но кв в ую В ВВ ов Ко он ко вв ев Кн вн кн о кв кв Кв кв кв о нини ПН в п НН КК ВК НН Кн МП А М М І пи в ППИНИННИКИ НПП ППД ЛЕП ПИШИ ПОПИ ППКП И ИН ОН Я ІКОНИ ППП ПИТИ ПИШИ КП ИДПИ ПП ИПИИ ПИ ПИПИПИПИПОПИИПИПИКПИПППИИДИПИППИИЕ ПИТИ У и У а и М ВН ПО КА ДИК ня КК ЖК ех 5 дея В г то ДН ов ово соро р воодовютню о КН Х в НН М НН М М А ОН М М ВН ПО В ПОЗ ОК вно умо ОК Зоо до ново ово Сорос Во сок оо оц оо во ко о о о о ово Х вом В В І І І В ПП У М ОО в о Но ЗИ Ки КН З В в КН о в нн ОО М М В и В он в в вх ОО Я ТЕ КК КИ м ОВ о по пнппопонпспопппоппнлоппплипсплпиппсоппсп,посспплпплсПоПлпопитоО ВО в КН НН о Но КН ВО в НН Он нн ПО В В З В и Нв нн НН мом НН Б В Б Б КУ ОК в о ОН в в вних ПК о ВН В Он нн а М І ДО в в в ОО А І А А А А А А КЕ ооо в КО В НН в М В В ОН ОК В В В В В В В В В В В В В В в ОО А ТМ А І І ПП А ПОН ОО ни ОО В В В В В ВО В во ПН КВК АПК ПЕ КПК ПІДЕ ЕК В о о в В с о в о В В ЖЖ дян ОК М Ви о и и и У КВ 1 ЯОБЯ. 11111111 Втр 000000 Копокапзаця.Д/О А М В Б 55. с ВАН ни ОК НИК ни
    Б. Ов в я вен а и а и в 3
    3
    5. НН в В в я ЕН В
    0
    3. А нання С ЯІЧЗАЄ 00010111 ат 00000 Копокапізацно С ПИТИ Пи ЦИМИ шини ие МИЛИ ЦИ и ИИІ М и в М и Й: с п а я В І оон в ооо и ЗК о Ко В о КК о КВК о ОО рю Ко КО М о ДК м КО о КО ПК оо з В в я М М ЕВ МО я и и пп ВИНИ и в НК В М в в в в о в вв В ОО ОО 3 ОВК о о о оо о о и о ОН он ов ох ше ННННЩНЦНЕНБНТГТНТО НЕ ва надвдропяня СО 00010011 Я У 000 Копокапізація.Ї С 555 а щ : ККУ КН ок КОКО КК о КО Ко о о КК о нн ща ОО в В ве о КВК 5: Б ІА зо ьо В ПИЛИП ЖИ ОПП Е ОП ККЕ ПИ ПИПИПИПИПИПИПИПИИПИПИИ ПИЛИП ПИЛИП ПИЛИП ЛИПИ ПИЛИ : ОО В НН М КО В В В В ВВ у а М М Но у В В В Ма В М 0: 33000000 іатвї 0000000 ююлокаліаняїЇГ С С ЯЯЯНОЯ 00101101 то 00000 Колокалюація.їД С МО
    0. г С 00000000 с и и в и и НН ВВ 10 опокапооця.Ї С п в и Б В 0;
    3. 5 М В
    5. 5 Ко ооо но Кн Ка ТНК нн нор я ІІІ, ніц (ф((ф ті ц ц ц( ( ф ц(| я) (4:
    Б. МОБ Б БІОС КОКО поп п а в «ЯНГ. тв (частина 9)
    БАКИ шш Ж ш Ж і-й : й шо й бафіловіцину А! ЩЕ , | й ШЕ 5 ши ше ши щи 52 59щи 55 55 щ й й й о 5 Щі г БЕ й й й мав 000 АН Оома жо |о2мвю ФІГ, 15 д14р8 ЗА група 52 група 2 я З Бу жа ї й рупа бе вка звлві я Я ш до ж вяавЯ в аклй й й ЕВ» НЯ зві Е а 1 ака | З І : акаю: : плин Я Я.М «Я.Я у-ЯЙ вч вна Не вНбе рн вт зн8 ВН ВНяя Мб В Я фе? о знтя вна ЗО щоб група СЯ група 2 ЗЕДО Я. ве ве вик ЗЕ й зва: ЩЕ - 88: Ж БЕН БЕЗ З ве в і ; ня Ж ку шою: : ; ; т поза щ. ! ! я щі ЗЕ м Ба с т : Я щк КО п ака І 2 ОЗ ЩЕ т. ї ОШ п ТОх | й ТЕО Я ї З ї ЗЕ Кх ее - ще ж ше шк 5ЕмЮю ї тий ч ма рНБе НЕ фНед ря НІВ оНе БУ ВНОЖ РН НЕ ву ВНІ вна хо млоба рупа се група 35 КО 4 тру ЕФ ру ме «вові жом ! Ж зва за щОБЕВ; х ! ща У 5 БЕ Я : що НЯ здав! Ки БЕ і с вала» 1684 . ож не дю ЯК Я У «ЖК, ще НЯ вне рий ВНІ рН НЯ нн вне не нах НІ вн вн 433Н9 яма група 590 група ЗВ ФЕВ я жав тка яв і М ве) : не "я дом | : БО ! шк ше ше ШЕ й дю | с За І ї Кт ї ї о вклю і : тя зані | : ; х З яв о, : ; ше ше здив: і Я з-за ЩЕ ї се ще і ІЗ пи ща ЗЕМЮ м й як -- Я ни шк ожчю блю й є В нс НВ З з НА. ї. не РМЗ вНБя вена ВНБУ Мт РНУВ ва На бнеа не фонах от енІВ вне
    ФІГ. 16 (частина 2)
    мо в Я. й». в ж СИ 1004 с і ж же в, з е війн, ваз рожа он Ж іо ях чі З ше В «Жу и м ща хе: 3 ж я ой ож дет, т тло в ВО вх т сіоде а що ше. е сон. : як : Ше З на З ее с ши шш шш шише пише в МІ; ФІГ. ТА ї20ч Е ще мо ча ше см зове Кз -- ек НИЗ пе со Що - во Б а отв оз г. 5 ї Же ях мо оБ1еА й товщі ж «МВВ З : ще Ні : са: є ШИ м пишна о еВ УКВ Се яз якою а ТМ З дкад че с | ш- щ доба шо я люзаз 2 с ння вини ни вин нн ення нин нини нин ни нин ни ши п ння ки ши шини ши Ши ШИ ШИ С Ин и ши ше и а м в п п в Фе се са с Ше Ше
    Фіг. тв
    ДОБИ я і - і Інібування х | і фосфорилювання є | | заз ЗОБ-К, : зво ! індук в | 26, індуковане | | знАн (Р ЕФ ! Зк? 5 «група 2 ї Інгібування п Е ЖИР Відсутність або 5 фосфорилювання |У зюся В чина З ро помірне К, ІРАК, . р | інгібування с ін; Я осфорилювання 8 індуковане я мав : Іф софори о ІСЕї : 542 : ї індуковане з.оовчо З БЕ Підвищення здатності Зниження здатності зв'язування або відсутність зв'язування при кислому рН змінення при киспому рН
    ЧІ. 18 всех соя ; бі ж пюзиве Ше йннні д- ож о сСЕОВКЕ ж ВЕХеРе УНІВ СИ оо песовео уНал я ат Ше дини | | ск с- есе МВ "7 дню г оф пиши - поч и З мл. Ми щи но р Й я ! « р я я Ева ра ПИ МК Ко тр ооо ет ГлКечНо ; «фр пЗУВс ЕЕ ТЯНИ | ; і й ц келік їх її «ие о вязо ЕЕ КЕ возів зелене унанкя | ЗоВИо ШНЕК ГТ юВМо ц шк , «ок ве жо ояю я й п и Си пе пе СЕ тая у
    ФГ. 9А «Фіг. моти муть а Ех В як т евже зно нх ШИ Ї е воша зооч я Зв Би і в кни жавййудиж як» ши НИ ДН ї М М во ке гос Фіг. ор
    Людський ІС К(Нів-мітка) 3 панк код т а сяднню ПОЗРІДЖУВАЧ но аа Крнеени 5 в - о ефчанро я гліднлни ВДОЗДВДЖУНОЧ т (нпротицапича НРК) Е ж стання СВ, Є 4 АН і -а-- АЕЗОБАМА х Е я піштннт- Е ї5 : раки о | " ї Е НЯ щи б мкг/мл
    ФІГ. 20А зах оеріджувач 000 Людський ІК -- Коротамншена НРЕ) «івосн зр, ач з Еннжиинижанваанаанаананааннааннанннананаантланананалатлаааатьнооииии и папи те Гороткцелина МР) Н -н- КН ОД пеннттяттннотятттететтєттенннтнтнтятнтннтнн дятннннаттеттт «ен ЗВОБ о і нка ДЕЗОБ-МА Ки 2 і пен жйнюм мапине ККЗ недел, 2 ' птнттнднтттнннтт тт нянт нут кню ні нини, БО 2 нос ро 1 «фон нн а а нн а п Ка Ї й І я : о ода ' ва сесювеі пото 2 95 зе НІ ти Впр імідж пкт нт ут нь нн осн от тин коні та і о З дю мкг/мл
    Фіг. 208 що : ЕК ! дн ВЕ 785 Е я ха Я аб ї и ой що Е ї пак І зво в я ее ЗзвОк зва З . ех нь 5 Кк і З р чн ВІ 3 р З й 5 й ї 8 8 6 Канцентранції сакглан)
    Фіг. Ос
    ЗШ АЕЗО5-НА (НЕОБувіст) об - 700 - 600 - зн 500 300 - 200 - 100 - о ВЕНИ -:- МИННВН НН, о 1 2 3 456 7 8 9 Концентозції гекгМлі
    ФІГ. 200
    Мо СЕ: ка : жарцив Вехое ма молочної ОВ сковВК еВ ВК БАН с ЗК: і ща о. ее : ооо:
    с п. мезо: ЗМ ОХ ЗХ х ХХ ОКХ ОКХ ХО с о. щ с є МОЗ п 5. УМХ СУХУ СХ. М КЕ МУК КОКОС о ОКО ЗХ МКК КО Є ЗК Ж КОХ ХО ОО «М ОХ ОО Ох Я ЗО о. сх ж с с с о. КО о. ЗО ОО ке ОО. ЗО ОБ ОО о о 0. СК ОВЬ З о 5 В КО 5 ОО ХО хо, п я ОО МКК ЗО ЗО ЕХ ОККО В ОК СОЯ В ОО ОО УЖ ЗОВ ОО ОО ОО ЗА щ жк с : с о й КУ ОКХ ХУ що КОХ ОК ОХ ХХ ек М З Ох п УКХ КОКО ЩЕ ЕОМ ОКО КОМ ВК ХХ ЗЕ есе чн с . ож дк ВИК о Б КО СК Ох ее К ОО АК І ОК її. з СМеТаціЯ ? щЩ-- ВО КК СОКИ шо у В ОУН с Зоя З КОМ СКК о М СХ ЗОМ ОО БО ОК ХО УКХ КОЖНУ Ж: КК ХХ ОХ ККУ ОХ ОХ п. Х п. МО ОО З о.
    о. ОККО ОО ККУ ЗУ с Ох КК ОХ ОО п с с СКК ПАХВКМММ ОК Ж ОК ХК ОХ ПК ХХ с М с Ка що п Є ВОК п КК КК ЖК : ОН ОХ о ох с с ЗУ МКК З СЕКС ЗХ ОО Я ОК с КОЖУХ о :- ОККО КК ХО КВ ЗК ОККО ОХ ХХ ч ОО ОК МОМ ОХ ОК ММ п 0. у с СН Ох ОВНС с СУ І Е В що Я КЗ ОХ КОКО МеВ КЕ в з КОН ОНе п п. Кокс ОВК с ОК З на г БІ тех У ЗК КЕ ОО КЕ КЯ КК КК ОО ОК с 0: с с : Сх МОХ ОХ ЗЕМ ОХ Сх ОХ ЖК ХК оо КОХ ЗО У М о Зх БО ОО ОО ЗХ ОКУ КОКО ОКХ дк ХХ о сх а ОО о З с с с с ОЗ ССС. : З шо о с ОО ОО ОО З КО ОО . Я ХУ ЗХ ЗО ОО Я свя с с Ши п ас до КУХНЯ ОЗ ОХ: КУ ВМ ОМ ОХ З ших: ХК ЗОН: ОЗ МХ КО ОКХ КК КК ЦЕ п с КЗ ок орся МКУ хх о ОО. Б Кук ек і і ях КМ ОН КИ КМИН оо й Бан МНОМе ОМА с п тунка пивний ох КК Я ОВК ов ЕК КО КО ОК ЖК КВ ПМК ОО о КК ТК же ПТАХ ЕК КН БО ее о ну ПЕК оо М: ЗК ЕК ОКО ООДК кн нн. ПЕНЯ КК во ОК АХ ОКХ МОЖ УК ще. с . ха і. 5 а с. КОКО ВЕК ЕК У КЕ КО с о: К ее о о с о Ко КК ЗИ Я С, НІ ЕК В Ми зн п п. шо сш с с ЖИ ші. ОН в ШОКУ ва ІВ ен. ша пн Б: а сх КЕН пок ом ВЕК МО о У шШ п 5 ж ПО З НЯ ЖОВ Я БК КК и КВК Б» Я Св х ООН ПЕНЯ В о. о Я М і; пий Тк
    ГТМА: норманзвні тканини: з ня, х МОМ З о 5 Контроль у зр! шк ЖІ ! ооо в вада: хе : тя певниВ ОВО жах ООН Б ннооовоом м вврооввввоняни ев З донор ння З Полочна в З мк ОК КК КЕ СОУ вовки нан КВ з ОХ ННЯ а ОК. ко Ка ККУ МЕ ПО ОН С Піпачентя и зва с: ї ха а Бо о. п реле г. . КВ ХО Он, и ЗОЗ БО п В пох ж . ВИК ОКО ПК ПО ОК Я ХК КМ ОО ге її В о її и КО ОКХ КО с г К ПЕК ХО КК Кох о. 5 У А ї У в. що ух МОДИ і ОО ХО ех ОО ВК У х В ї : й х В ї в Б М с п о. І і. . и я, Я Ж ЕХО ЗХХВН М пі о о Ех ж У КО ї о ХО У ВХ о . с Б УК и ВЕК дрориуеененнннррвю щ Мо ПАМ ода же КК МОКІЯ др І ОС имя загюза КОКО В фо нови ке сення дя о оно дн сеї І пове тре ееВНВЯНЕ. Гесхололютя пиши мн : ! ще й : о З З КА КУ ЗО моно внннния сах ша по ли, ро 5 сх ХО У ООН як : : чан тт; . У Глен) ї ЕК ; а ТОВ ще явля док абарвлюння З му кВ. ре й од ї - що ЗО п. З В. о о окропі алею засарек ня ОК жа он Ох о ЗШ Б: СОУ Щк- С о авваввнннй ШЕ З Ще шк о ЩЕ по щокт о. й У а пк кан п о ОО ЗКУ ОЗ щоеро ООН ШИ Моя стики ОА С З ОХ МКК фо о ша Сем ке і о. Б о х щ с п я і пи ОО ві п ся й ГУ пл . М І В ОО ОО 5 В о яке по ДСН іч Р ЕОМ Є. ПМК М Ж о ОН а «КК снення ке іде КООКУ ОК ке КО ОХ Стравомія З «цк М МО ОО У КК ту яяча. КОМ Х Мт схе З В шо ОКО рЯКеКеея с АВошіВ Б. М 0 А | о СИН п ро КО ХНА ака СМ У ее туту ВЕУ бе но поча. о ОО о З ЕХ ОО Мн Я «сн кн вве ВО пани В ОО ОБ ОХ о ОВ Зх МО ПКУ с с п М М он ПК ОО В ОВ ОК ОБЕКК В ох п ВЕ я З ЧО ОК о ;
    п п. З Б Ох 5 ВВ ОС ХОМ В ої о п п ше о ких а Й ВО яУ ОКО і о БО ОКХ НЕ пад ї ПО 5 ее КОХ ОКО ОО Б о у КЕ ОО. ВУ ОО І ВЕ ОК, БМВ, М о у ОО а У ОХ 5 ОКХ ОО КК с ОХ МО с КУКА о о ві МОМ я ССО ш пОХОК ОО М ОО. Ох 33 ї ОО ча КЕНЕ М : МОУ КО ОО ДИМ ОХ осо я у; Те щ Я ЗКУ Х КОБОНХ КОМ КО М ПОКИ ВЕС 1 пряма ші 3 с ! Ба ї пів КК хі тка КО ОО ОВ і ВА СОКУ мок СЕ ши Кер Тем. КЕ . - і о. пе урни УК миБКіВ: їх м ОО Я БОБ Ох Ї лою о То У ІЗ 5 ОО 0. зов . о. ОК МО ПО що ХУ о ко с о КУ т р: ОВ с що се п. ТО У МКУ ЕХ КОКО КО АН ТЕ е с. КО За их ОО Оу МЕ о ШЕ с АК В ЗОЗ МО а ОХ МКК о о. СУЯ ке ШЕ З КОХ МК ОКХ Б її х В ОК ОО У К ОН ХІН ТКХ х КУ хи о ше Б ННЯ ОНИ. жи! щ КО ще ле с. З 00 0 як, Го де ще хх
    ФГ. еА -- м: Контроль у зр Х - тт м рення й и меуА КУ Вдромувуювюьях монах ХО ТМ: нормальні за й З о мохова речовина С Сех ее ник п ОБ зви З р М З ХК КОН КО Я СЕ КОХ асавгагегеоговаево оте Моркава ВО Н СЕК с «ОО ОПО о СУ пе, Карховх о. речовина че а Я с ) с Я Да НИК ОК ОК КК їх ОККО КЕ КУСОК ЖК МК с й. о. . с ОО М ОО . с 5 ВО ОВ ОБ В п Я х СО 5 МО ВАХ ОХ шо
    З . КЕ ОО ККХ ЗК ХО КО ЗО ОО жу 5 с М КО о о Ох що що 6. с с п ОО Б ОО ет В В с СО С с й о о о МО В Я ПО ЗК ПОКЖКО КО СН у ОВК ОКУ о. ОО ОО Ох ЗІ що МК З ОМОККК КУ ИН ОККО ХОМ ОК ВВ в 00 ії с ОВ У З Я ХХ ХХ З ОКУ У с ї о. ее шо і шк с ве. ОКХ ОКО ВМ т Й -- ; а А, тролфеватенни ЩО бекротою і й шощ нмбжен с дврнтв 3 п / ковтроті для циклу аабарклення ; Я У саредмуви КО ДСК Кох ЕК ОО ВЕК Ко З Есе; ян: й с о о я оо З 3 ння о о | с о. пічне 0 ; І ЗОМ с о ОО ОВЕ ВЕ ЗО т ВО У т и І с п ЯМ бе с п ПОБУ ОЯ ож ОБ КО ВАК ОО У ЗШЯ ОК У о ОО ОО п. о НА п ЕК ооо КХ о З СКК п т МОЖ СОМ дк КО 5 ГУЗЬ ЕХ ЗК МОХ АХ З ОО ср ОККО КИ С КО ОКУ З о УМО ОО ооо: Пора ве ОХ ОО ОК Кох ши Се Ох Б ОО ОНИ З захо -: ВО я пев нення т шо | Пк ОВО - боосоно Й і то о. ОО ОХ КЕ - ж й ну ОК і ОД Я ОКО ООН Ох що ак о | . о, Ох ОС с - о шо о . ОО жітті рідовосввй п ХХ ЖК ОО УК ОХ КО У ; ЗО ОО я окремо ї ЗХ ОКО КО МОЯ ВООБО ПОКИ ме ОО с о . с Хе о ОО ЗК ОО ПК а ЕК ПО о. с 5 я о о дО ВО ня о ХХ оо ОО ОК с їх КЕ о й п п ОО ММК ОО 3 5 КО ДК о ОК у ОХ нок: ОО с . 0 й КЗ о ; ДО МБО Я
    0. ЛИШ 0. і КО ОК с уууквок 0 пн я 5 о С ок | - с ВОМООХ пек вквй Мозох, ВИ «ее З ща і Вквзк сія | дечевима с й щ Ж НК о. о с Е х ЗХ В Б ОЗ !
    о . . о З З ЗХ ОКУ ! . З : хе У В й Пежо з ХХ ше
    ФГ. В
    ТЕМА; тканини легені рення шо а ОО ХУ я СОС КОВО У ОК ОХ КОКОКХ ОО СООКОХХ в ОКХ ВО ОК Н Ж КО Ки КК НК З о. ОХ о. : п о: ПО В о Е Б Ж виш пови ве НОВО с ОХ у п. с Пов ОВ о. 0... : о о. с її . ОКО ОО ПО ЗОШ 5 ОО ЕКО З Ж ОХ с . о. п ОО ОК . АК АК М БЕ ОМ НК ОК о В Ох о 0 ЗК М ОБО МО КЕКВ ОСНО ВК ОКУ ПОМ ЗВ ЕХ ха ОКОМ ОКХ ОХ ОХ ХХ 3 ки . . її о . . . о. п 0000 її 0. с с СА З В пе о ЗО ВО ХУ о. Оу о. ОО ОМ г МЕ о их 5 о ЗОВ й Е Б ОККО ПМ МКК ОККО ХОМ 0 Б 00 ше 00 ЩІ. в ОМОММ І М - ОХ и: МОЗ ї й кН 00000000 ва чинними: ШИ : Плюсковітинна кушщиноМа р вних ке ПО ее НЕО ПОБУ ответ ве то
    ЕЕ . с с с нс о. 3.
    о. пе КЕ КК ПЕН КК х КМИН ТИ
    0. МА о УВО не А ЕХ С 3. ві шанх о а пн
    0. п а с» Мито 0 - шини їх а КУ п. М в о о Ме ОКО с МКМ В а В В НИ а и М ще ох ЗИ я о В о о кар в а 5 ШО 5 с с ЩЕ п я о Б що ши пОМ я око я МІКлУтВ НН ОХ МОХ Ух Ше я 3 пон о а.
    г о. п я Кв вв нн. я Кф в КВ 5 ПЕН вк її ОщЩ т ня шо В ВО щ В ов Я ОХ КМ жі пжжяж ик юююжжюжжнюютжкж кю: сжжиж рев оо а о ово: КОДЦНАКЕ А ДАДАКИМКН Моя Ко БВН а Ве п їй !
    ЯНГ. нд льстрвиночня претокена ММ М КК ЗМ й п ОК ПО ОО В МОМ КК Ох З ОО КН їде о: с с 1 в, її 0 ШІ 00 кн а 3 ШЕ її 0000000. 3 ШИ. Ки ; с схе В У ВО С ОО Я х Б КО ВОМ Я ОО ОВ т 5 ОО ОК ЕКО ОК ОО НУ КК КВ о 0 ОХ а ОК КК В о Б АК В КВ с о. с с ПО ЗО ОО о я ОБ шо М М с Б и .
    ОО. нс с МО с ши. с с о. с о Я ОО ОСЯХ ОК КК КК хх ем М ВХ о винен МК Б Б БО 5 . ш ОО В М сука С З; УК КК ВВ ща чу я я ЕН МО ЗХ м ШО Морматьні приват тканини пи КВ МО ОКО коор ; ту саке и ней нн У Зх Я: Оу З ГО о З НЕК ВЗН ПЕК КЗ щ ше . а о й с КО У У о р о ОО п ЕЕ пак 5 - а КК у ВК ЕВ У о В М Ко В Кі ; п її її пи В п й їй 00 шо АСК М В Я Ки Ж МК М ОО ГЕ ХОУ Вс ЗК о СЯ Ук МБО КИ в и ОО Я ті ОН ДО В В ООН у о шо ши ша ше й в НИ пл о ОККО КК Я А НН БК а М п шо й и ОК Є Б. Б. а В М ОО а на ОМ ові ХО СУ і Ми НИ КУ ОХ Е ее ВЕ БИ
    ФГ. я іо ТРА он таннн К- ЗОН ОВО НН НН | вин в п п п в п мн пли : щу. вами их Н к руш Ех з са: а Н : Мекку іі Ії а я С Й тЕлевконитивне. п НИ Но ЩЕ Вена ПОВТЖВЬ пеевНеК іл ЖУК ННЯ: ї Варшмюонае спина, сор Ярова ни Те 5: ; ях а Я ; ка : Кі і БОМІДНИМ ММА | висо диовонційоВана 10000 ТЕО другу хом Деу р НН КН нн А Й Яні НВЯ Я Пт Не ТОНН ОК КН М НН КК ж ВК: Іл с ши Р й МІ ОК ОК ОО КК ВУХ 0 ВИКО КК В : ВК. свв: ЗВ ПОМ ОВО О ч КО МК ех У В В Я ГК ОК ПММ Ки Я КОКО Б У ПЕОМ сяк Ж ВО Х Не по І, М БІ ОМА Мт а В у Мов НК В вх Мн ОН БУКВ ЕКО За ЕХ Кон ВОВК у нн Но КО А КК КОНЯ ЖЕ ВВ КО «ЕЕ й З УВО КК В, Хо Я то ВК ОК КК ВИ 5 ОК ОБ ВК їх хх ВОК КВК В р й КК КК Я це В я й хо з Ко Б. М о г о Я Е МЕ Кк ОМ Б. НН и з ВЕ В НЕ ВІВ: Кок З КВ ВО 5 ОС пон М х ОО о В ВИ і и ВО У ОО нн ЩО ВИКОН у: КН ОН МК ОО М В ов вн и й ов о о о ШИ й КК НН КОХ ках МОЯ СО ОВК ОО о я ОО МЖК КК Х ОО Ден НН и ОНКО І КИ ОХ М УЗ А ОО ВВ КК нн М ОНИ В Шен ОО ОК ОБ М АЖ ЦО У ПВ В КК пе: ВК МОХ КВ МКК В А КК На ЗНУНННЯКХ ЗОВНОВИ ово що ЕН я ОМ ХО М ЖК ОК МЕЛЕНІ МК ОН ВОНА
    УМО. ОК СОУ СК ТМ КК де КК ЗХ ЕС ие ЗК ОК КВ ВО ХУ ІМ СХ КК СОМ КА ОВ й НЕ М В ен вин В З щі М с в ВО о Й ОКО ВЕ БО ПОКИ НН о В пи 0. ї- ОО шу в Е. шк КЕ ще 0 ши ж 5 ши и Ж фжда литі т жннннкх ж Ї І СО, ЗКУ КК Ех ре Б ее БВ ОК ХХ о. Ех З 0 З КО Се ші ПО ЖЖ Са К ОМ ОХ ТП ОКОВ БЕ ОК а КОЖ Под М на миМ щощх КВ і я С КО МО Ж 1 щі сі ря ке СН а пи с о ЗУ ОК КЕ КК КК ОКХ МЖК у ВК ЕВ В КВ ІМЕН ЖК У и ТЯ Еко он З Нв ОД Н ОВО КО щу РОКОКО ошй СЯ Бе ЗІЗ КК КК По ж ть т ШО ЖК ЯК ОК КК ЕКО КІ Я ЖЕ ВВ КО пн а НН я сш а се ВО о. ОВК щи ки о ЖІ и. ех ї ; К. : ОК КК Ко а КН САН ОО Я С ВАК ХАКТЖХ ОХ ее ННЯ Ме ж Уа; Н Б п я я ОО ОК КК КОЖ ММ бат по В КЕ ВІН МОЖ ОК пе КК ММ КН В АК У ЗО СО ОЗ АЯ ОЗ в ОО МВ М Ост Олох, ШОК КО Н ОХ о. УВШНИЯН ХК В в КК Ж з нн нн С ЗК ЗАШН о КО Ж ШИ СОКИ ММ щу ПО: ЕВ НН 5 Ух МАМ У КЕ я УК : шо Ви ак нн о о. ОК 5 Жов ХЕ ЧИ ТЕ у МКС: З х Кі ОК в В Я КК вн Ж вм ее зво ШЕ МНВК ННЯ КУ Я о фе ши ГОМ у: Я дю ут у КК ОО ЕК шк ОК В В КИ ММ І ие НК вх Я В ЕН КК В В В У З а ЖК лов ХК МК 00000 ши сн ІН Я ФІГ Я дум УК хфоохююютсс х ї їх х ї 3 Енн в нн нн в и в пп в Я їх хе я х жк зу ж і 3 за ; вм ва . Е ке ї з НК А йксавов Ж кави х ; НД реак ар рніньісьачкаанчеюь СПК Й Я х б Кн Й КОХ ж Х ай ї і Е ЖД вет ке кеюнанач уаянкх етику ктк их кн ня нт днк кфАник м нина вовна ок вні нн МЕНЮ хх З й ня : В їх. В она зас х х х | БМ ж Е ; ; ї ок : і ЖД реко фс Вітер фа ЕТ КВ Ж ВВ КВН КЕ Кв юеюа юю МЕЖ Зк х Е з й ле - і я х і ка З Е х -Е З їй І ши ше о Ех Кі І і шен. ОВ вк «КВ дбай й МРККВХ МКК ММ Ж ММК ЖК КК ВМ КМ КАМЮ КК УКВ Хе АК МХ МКК ВАТ ВМ ДЖ МКТИ КВ КК КК хх ХВ Ж к х ож кох їх ї (У й ї Як хі ї 8 : З З : гу Коб І р ІЗ У ї сх І : їїд Е ВІ : с з -Щ Ж ше й ой ще ОКО орех Б оо В І В и ВИ В Б р» х х ха Я х й ІЗ з Я : щі Ем | ; Ш м де їз ас: Кк;
    «АГ. 25 ше НИ Ж жо нм й ; Е | КЕ " ; ш щЮ. й : В | зляМ і б 100. злим МГ - що З М ! в ЗВ НА о і -е3З С БО а 380 я3Б БУ ОО Ба аж о за 35 маю 1585 Час (с
    ФІГ. 27 105,0 нн Ду рр вхо Е щ : акне нин В ! : ЧИ | : ен нн ее Ї. ї б о нн нн нн нн т ке ж щ р їж т ї В й 5 - 5 ка р Го їз (ВІ вод м о рани «ФІГ. 28
    180 ан нн нн нн пн нан , З ! Е: І о 1004 ши п : я | ПІТОН ї ЯК и» і! о. ; щі ПИПЛИИКИХ: г 8 во. Ше о допо баня с. меж» о. ї У 5 о нн о с і г є | о о о о й г 50 К! шик шк г о я - КК | о ' Е «в | вн ПЕН я п З В що ! ТЕ да - ше (В о і М ИН ПИЛИ ПИШИ. ПІІ гз я ге КО КООВ ТВОЯ ПО І ОХ У я ПОВЕ бек : с "ее о о о о. ШЕ Є а й. п. шен шини ше ПЕ Я М ГОВОООН ПОВ ПО і ве ЕН ОТВНЕВКЯ я ПКЕЕ ех ї ПЕЕЕННЯ ЕЕ ПЕН я ПЕН М: ване ВХ ВО я ЕК ЕОНЕНЯ І ЕК нини ПЕСЕН фони ВЕ: ПІШКИ х гам 2 Е й : - З 5 я я 55 і ся Б) З м же 5 т щі й «3 т Я а З КУ
    ФІГ. 28 с КВ Х ї Кк гІвень з язкВачня у і і | . стжж у їж З ї ее ніжна У си ї г: І ЕК 1ВО0 я і що | / В : ко | : з В ї з Я з : ї Й ж І: х З х : : в : / - : і ш. і В. . : же Я Бу ІЗ Е: : ще і Ж : ТІ преннфекнй КЕ. Ж Одно ; : в ши : І ЕЕ : ЕН ЗО ОВ М Час (г
UAA201611832A 2014-04-25 2015-04-27 Інтерналізоване моноклональне антитіло, що зв'язується з людським рецептором інсуліноподібного фактора росту (igf-1r) UA122390C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461984160P 2014-04-25 2014-04-25
PCT/EP2015/059050 WO2015162292A1 (en) 2014-04-25 2015-04-27 Igf-1r antibody and its use as addressing vehicle for the treatment of cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA122390C2 true UA122390C2 (uk) 2020-11-10

Family

ID=53373391

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201611832A UA122390C2 (uk) 2014-04-25 2015-04-27 Інтерналізоване моноклональне антитіло, що зв'язується з людським рецептором інсуліноподібного фактора росту (igf-1r)

Country Status (29)

Country Link
US (2) US10202458B2 (uk)
EP (2) EP3783033A1 (uk)
JP (2) JP6835591B2 (uk)
KR (3) KR102357032B1 (uk)
CN (2) CN112851808A (uk)
AU (1) AU2015250760C1 (uk)
BR (1) BR112016024575B1 (uk)
CA (1) CA2946795C (uk)
CY (1) CY1123743T1 (uk)
DK (1) DK3134438T3 (uk)
ES (1) ES2841249T3 (uk)
HR (1) HRP20202047T1 (uk)
HU (1) HUE052223T2 (uk)
IL (2) IL248357B (uk)
LT (1) LT3134438T (uk)
MA (2) MA53069B1 (uk)
MX (2) MX2016014000A (uk)
MY (1) MY182444A (uk)
NZ (1) NZ725423A (uk)
PL (1) PL3134438T3 (uk)
PT (1) PT3134438T (uk)
RS (1) RS61379B1 (uk)
RU (1) RU2698977C2 (uk)
SA (1) SA516380131B1 (uk)
SI (1) SI3134438T1 (uk)
TN (1) TN2016000445A1 (uk)
UA (1) UA122390C2 (uk)
WO (1) WO2015162292A1 (uk)
ZA (1) ZA201607095B (uk)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2692563C2 (ru) * 2014-04-25 2019-06-25 Пьер Фабр Медикамент Конъюгат антитела против igf-1r с лекарственным средством и его применение для лечения рака
US10858423B2 (en) 2015-10-26 2020-12-08 Pierre Fabre Medicament Composition for the treatment of IGF-1R expressing cancer
WO2018127709A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Crescendo Biologics Limited Single domain antibodies to programmed cell death (pd-1)
CN118667027A (zh) 2017-11-13 2024-09-20 克雷森多生物制剂有限公司 结合至cd137和psma的分子
GB201802573D0 (en) 2018-02-16 2018-04-04 Crescendo Biologics Ltd Therapeutic molecules that bind to LAG3
CN112740043A (zh) 2018-07-20 2021-04-30 皮埃尔法布雷医药公司 Vista受体
AU2019350536A1 (en) 2018-09-27 2021-05-06 Pierre Fabre Medicament Sulfomaleimide-based linkers and corresponding conjugates
CN113286617A (zh) * 2018-10-19 2021-08-20 免疫医疗有限公司 吡咯并苯并二氮杂䓬缀合物
BR112022003635A2 (pt) 2019-09-04 2022-05-24 Pf Medicament Anticorpo anti-vsig4 ou fragmento de ligação ao antígeno e seu uso
EP4353220A1 (en) 2022-10-12 2024-04-17 Pierre Fabre Medicament Use of a liquid aqueous composition for solubilization and stabilization of an antibody-drug conjugate

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4970198A (en) 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US5079233A (en) 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
FR2661000B1 (fr) 1990-04-12 1992-08-07 Aerospatiale Machine d'essais d'eprouvettes en cisaillement.
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5561427A (en) 1994-12-30 1996-10-01 Psc Inc. Analog to digital converter with continuous conversion cycles and large input signal range
FR2873699B1 (fr) * 2004-07-29 2009-08-21 Pierre Fabre Medicament Sa Nouveaux anticorps anti igf ir rt leurs utilisations
AU2005286607B2 (en) 2004-09-23 2011-01-27 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
FR2888850B1 (fr) * 2005-07-22 2013-01-11 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
EP1999149A4 (en) * 2006-03-28 2010-01-20 Biogen Idec Inc ANTI-IGF-1R ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2008079849A2 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 Genentech, Inc. Antibodies to insulin-like growth factor receptor
US7723485B2 (en) 2007-05-08 2010-05-25 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-MUC16 antibodies and antibody drug conjugates
JP5606916B2 (ja) 2007-10-19 2014-10-15 ジェネンテック， インコーポレイテッド システイン操作抗ｔｅｎｂ２抗体および抗体薬物結合体
TW201138821A (en) * 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
EP2528625B1 (en) 2010-04-15 2013-07-10 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
DK2699602T3 (en) * 2011-04-19 2017-06-06 Merrimack Pharmaceuticals Inc BISPECIFIC ANTI-IGF-1R AND ANTI-ERBB3 ANTIBODIES

Also Published As

Publication number Publication date
IL274226A (en) 2020-06-30
KR20160145110A (ko) 2016-12-19
JP6835591B2 (ja) 2021-02-24
MY182444A (en) 2021-01-25
KR20220018620A (ko) 2022-02-15
MA53069A1 (fr) 2021-10-29
AU2015250760A1 (en) 2016-11-03
RS61379B1 (sr) 2021-02-26
TN2016000445A1 (en) 2018-04-04
MA53069B1 (fr) 2022-04-29
DK3134438T3 (da) 2020-12-07
RU2016145277A (ru) 2018-05-28
US20170267766A1 (en) 2017-09-21
IL248357B (en) 2020-05-31
PT3134438T (pt) 2020-12-31
EP3783033A1 (en) 2021-02-24
BR112016024575B1 (pt) 2024-02-27
IL248357A0 (en) 2016-11-30
HUE052223T2 (hu) 2021-04-28
MA39378A1 (fr) 2018-05-31
AU2015250760C1 (en) 2023-11-16
EP3134438A1 (en) 2017-03-01
RU2698977C2 (ru) 2019-09-02
ZA201607095B (en) 2020-07-29
MX2021002144A (es) 2021-03-09
RU2016145277A3 (uk) 2018-12-13
SI3134438T1 (sl) 2021-04-30
LT3134438T (lt) 2021-01-11
US20190330353A1 (en) 2019-10-31
EP3134438B1 (en) 2020-09-30
JP7191134B2 (ja) 2022-12-16
BR112016024575A2 (pt) 2017-10-10
CN106459204A (zh) 2017-02-22
HRP20202047T1 (hr) 2021-02-19
WO2015162292A1 (en) 2015-10-29
CA2946795C (en) 2021-03-30
US10202458B2 (en) 2019-02-12
JP2021073279A (ja) 2021-05-13
AU2015250760B2 (en) 2020-10-22
US11365259B2 (en) 2022-06-21
ES2841249T3 (es) 2021-07-07
CN106459204B (zh) 2021-02-02
CA2946795A1 (en) 2015-10-29
MA39378B2 (fr) 2021-02-26
KR20200128210A (ko) 2020-11-11
KR102357032B1 (ko) 2022-02-08
CY1123743T1 (el) 2022-03-24
KR102177436B1 (ko) 2020-11-12
NZ725423A (en) 2023-07-28
PL3134438T3 (pl) 2021-04-06
JP2017513898A (ja) 2017-06-01
SA516380131B1 (ar) 2019-12-04
MX2016014000A (es) 2017-05-30
CN112851808A (zh) 2021-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA122390C2 (uk) Інтерналізоване моноклональне антитіло, що зв'язується з людським рецептором інсуліноподібного фактора росту (igf-1r)
AU2017219091B2 (en) Antigen binding protein and its use as addressing product for the treatment of cancer
US9624308B2 (en) Antigen binding proteins
SA515360395B1 (ar) أجسام مضادة ضد Notch3 ومتقارنات جسم مضاد- عقار
UA98762C2 (uk) Моноклональне антитіло, яке зв'язується з tat226, та імунокон'югат
UA127450C2 (uk) Рекомбінантний поліпептид, що зв'язується з cd123
UA120364C2 (uk) Кон'югат антитіла до igf-1r з лікарським засобом
UA123773C2 (uk) ВИДІЛЕНЕ АНТИТІЛО ПРОТИ HtrA1 ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ ПРИ ЛІКУВАННІ ПОВ'ЯЗАНОГО З HtrA1 ПОРУШЕННЯ АБО ХВОРОБИ ОКА