KR102177436B1 - Igf-1r 항체 및 암 치료를 위한 운반체를 어드레싱하는 그의 용도 - Google Patents

Igf-1r 항체 및 암 치료를 위한 운반체를 어드레싱하는 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항체, 상세하게는 IGR-1R과 결합할 수 있는 단일클론 항체, 뿐만 아니라 상기 항체를 코딩하는 아미노산 및 핵산 서열들에 관한 것이다. 한 가지 관점으로부터, 본 발명은 IGF-1R과 결합하고, IGF-1R의 내재화를 유도하여 세포 내로 내재화될 수 있는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 독소들, 방사성-원소들 또는 약물들과 같은 기타 항암 화합물들과 결합하는 어드레싱 산물 또는 운반체로서의 상기 항체의 용도, 및 소정의 암들의 치료를 위한 그의 용도를 포함한다.

Description

IGF-1R 항체 및 암 치료를 위한 운반체를 어드레싱하는 그의 용도 {IGF-1R antibody and its use as addessing vehicle for the treatment of cancer}
본 발명은 새로운 항체, 상세하게는 IGR-1R과 결합할 수 있는 단일클론 항체, 뿐만 아니라 상기 항체를 코딩하는 아미노산 및 핵산 서열들에 관한 것이다. 한 가지 관점으로부터, 본 발명은 IGF-1R과 결합하고, IGF-1R의 내재화를 유도하여 세포 내로 내재화될 수 있는 새로운 항체, 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 독소들, 방사성-원소들 또는 약물들과 같은 기타 항암 화합물들과 결합하는 어드레싱 산물 또는 운반체로서 상기 항체의 용도, 및 소정의 암들의 치료를 위한 그의 용도를 포함한다.
IGF-1R라고 불리는 (IGF1R 또는 IGF-IR라고도 역시 불림) 인슐린-유사 성장인자 I 수용체는 인슐린 수용체 IR과 70% 상동성을 가지는, 타이로신 키나제 활성을 가진 수용체이다. IGF-1R은 분자량 대략 350,000의 당단백질이다. 이것은 디설파이드 결합들에 의해 연결된 각각의 절반이 세포외 α-소단위체 및 막통과 β-소단위체로 구성된 헤테로-사량체 수용체이다. IGF-1R은 매우 높은 친화도 (Kd #1 nM)로 IGF1 및 IGF2와 결합하지만, 100 내지 1,000배 더 낮은 친화도로 인슐린과 동일하게 결합할 수 있다. 역으로, IR은 IGF들이 100배 더 낮은 친화도로만 인슐린 수용체와 결합하더라도, 매우 높은 친화도로 인슐린과 결합한다. IGF-1R 및 IR의 타이로신 키나제 도메인들은 상동성이 약한 영역들이 각각 α-소단위체 및 β-소단위체의 C-말단 부분 위에 위치하는 시스테인-강화 부위와 관련되긴 하더라도 매우 높은 서열 상동성을 가진다. α-소단위체에서 관찰되는 서열 차이들은 리간드들의 결합 영역에 위치하고, 따라서 IGF들 및 인슐린 각각에 대한 IGF-1R 및 IR의 상대적 친화도들의 기원이 된다. β-소단위체의 C-말단 부분에서 차이들은 두 가지 수용체들의 신호전달 경로들에서 다양성 (divergence)의 결과를 가져온다; IGF-1R은 분열생성, 분화 및 항-세포사멸 효과들을 매개하는 반면, IR의 활성화는 대사적 경로들의 수준의 효과들에 관여한다.
세포질 타이로신 키나제 단백질들은 수용체의 세포외 도메인과 리간드의 결합에 의해 활성화된다. 키나제의 활성화는 교대로 IRS-1, IRS-2, Shc 및 Grb 10를 포함하는, 서로 다른 세포내 기질들의 자극에 관여한다. IGF-1R의 두 가지 주요한 기질들은 IRS 및 Shc이고, 이들은 수많은 하부 효과기들의 활성화에 의해 IGF들의 이러한 수용체와 부착과 연관된 성장 및 분화 효과들의 대부분을 매개한다. 기질들의 유용성은 결론적으로 IGF-1R의 활성화와 연관된 최종 생물학적 효과를 설명할 수 있다. IRS-1이 우세할 때, 세포들은 증식하고 형질전환되는 경향이 있다. Shc가 우세할 때는, 세포들이 분화되는 경향이 있다. 세포사멸에 대항한 보호작용의 효과들에 기본적으로 관여하는 경로는 포스파디딜-이노시톨 3-키나제들 (PI 3-키나제들) 경로인 것으로 여겨진다.
발암기전에서 IGF 시스템의 역할은 지난 10년간 활발한 연구의 주제가 되어왔다. 이러한 관심은 그의 분열생성 및 항세포사멸 특성들에 추가하여, IGF-1R이 형질전환된 표현형의 확립 및 유지를 위해 요구되는 것으로 여겨지는 사실의 발견으로 이어졌다. 사실상, IGF-1R의 과다발현 또는 전신적 활성화가 다양한 많은 세포들에서 우태아 혈청이 결여된 배지의 사용과는 독립적인 세포들의 성장 그리고 누드 마우스에서 종양들의 형성을 유발하는 점은 잘 확립되어 왔다. 이것은 과다발현된 유전자들의 매우 다양한 산물들이 많은 성장인자들의 수용체들을 포함하여, 세포들을 형질전환할 수 있기 때문에 그 자체로 독특한 특성이 아니다. 그러나, 형질전환에서 IGF-1R가 담당하는 주요한 역할을 명백하게 보여주었던 결정적인 발견으로, IGF-1R을 코딩하는 유전자가 불활성된 IGF-1R- 세포들이 보통 세포들을 형질전환할 수 있는 소의 파필로마 바이러스의 E5, EGFR 또는 PDGFR의 과다발현, SV 40의 T 항원, 활성화된 ras 또는 이들 마지막 인자들 둘의 조합과 같은 서로 다른 제제들에 의한 형질전환과는 완벽하게 구별되는 점이 되었다.
IGF-1R은 매우 다양한 종양들 및 종양 계열들에서 발현되고 IGF들은 그들의 IGF-1R과의 부착을 통해 종양 성장을 증폭시킨다. 발암기전에서 IGF-1R의 역할을 찬성하는 다른 주장들은 수용체들에게로 유도되는 마우스 단일클론 항체들을 사용하거나, IGF-1R의 음성 우성체들을 사용하는 연구들로부터 나온다. 실제로, IGF-1R에게로 유도되는 마우스 단일클론 항체들은 배양에서 수많은 세포주들의 증식 및 생체내에서 종양 세포들의 성장을 억제하고 있다. 마찬가지로 이것은 IGF-1R의 음성 우성체들이 종양 증식을 억제할 수 있는 점을 보여주었다.
이러한 맥락에서 IGF-1R은 오랫 동안 종양학에서 흥미로운 표적으로서 고려되어 왔다. IGF-1R (인간화 또는 인간 항체들, 또는 소분자들)을 목표로 하는 매우 많은 프로젝트들이 암들의 치료를 위한 IGF-1R 항체들을 개발하도록 시작되었으며, 70개 이상의 임상시험들이 다양한 적응증들에서 수행되어 왔다. 그럼에도 불구하고, 지금까지 이들 프로젝트들은 전혀 성공하지 못하였으며 IGF-1R 항체들이 광범위한 일련의 적응증들에서 많은 환자들에 대해 기술된 이러한 표적의 빈번한 과다발현에도 불구하고 전혀 시판되지 못하였다.
더구나, EGFR 및 IGF-1R 둘 다를 표적하기 위하여 항-EGFR 항체들과 조합된 항-IGF-1R 항체들이 관여하는 일련의 임상시험들은 이들 항체들이 전혀 KRAS 돌연변이 환자들을 치료할 수 없었기 때문에 실패로 끝났다.
결론적으로, IGF-1R은 현재 주요한 표적으로서 고려되지 않고, 잠재적인 치료제 항체들의 연구에서 IGF-1R은 더 이상 특정한 관심거리로서 고려되지 않는 것으로 보인다.
그럼에도 불구하고, IGF-1R 항체들을 생성하려는 노력들이 미가공 (naked) 항체들, 예로 그들의 본질적인 특성들에 의해 유용한 항체들에 중점을 두었던 점은 역시 주목되어야 한다. 이러한 의미에서, IGF-1R은 혈관들을 포함하는 정상 세포들에 의해 역시 널리 발현되는 표적으로서 기술되어 있기 때문에, IGF-1R이 항체-약물 결합체 ("ADC"라고도 약칭됨)와 같은 면역결합체의 생성에는 적합하지 않은 표적으로서 고려된다. 이러한 의미에서, 가장 최신의 IGF-1R 항체, 예로 AVE1642가 약물이 장착되지 않은 미가공 항체로서 개발된 점이 주목될 수 있다. 이것은 현재 개발 중인 다른 IGF-1R 항체들 및 임상시험들에서 실패한 다른 모든 것들의 경우에서도 동일하다.
한 가지 관점에서, 본 발명은 이들 논의들을 수정하려는 것이고, 약물이 장착되어 사용되는 데 적합한 것과 같은 특정한 방식으로 IGF-1R과 결합할 수 있는 IGF-1R 항체를 기술하고 있다. 보다 상세하게, 본 발명은 면역결합체의 맥락에서 장착되어 사용되는 데 완벽한 후보가 되는 것과 같은 특정한 특성들을 제시하는 IGF-1R 항체에 관한 것이다.
첫 번째 구현예에서, 본 발명은 항체, 또는 그의 항원 결합 단편으로서, i) 인간 IGF-1R과 결합하고, ii) 상기 인간 IGF-1R과 그의 결합 이후에 내재화되는, 항체에 관한 것이다.
용어들 "항체", "항체들", "ab, "Ab" 또는 "면역글로불린"은 가장 넓은 의미에서 상호교환적으로 사용되고 단일클론 항체들, 분리된, 조작된, 화학적으로 합성된, 또는 재조합 항체들 (예로, 전장의 또는 미가공의 단일클론 항체들), 다중클론 항체들, 다가의 항체들 또는 다중특이적 항체들 (예로, 이중특이적 항체들), 그들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편도 역시 포함한다. 한 가지 구현예에서, 본 발명은 재조합 항체에 관한 것이다.
보다 상세하게, 이러한 분자는 디설파이드 결합들에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄들 (H) 및 2개의 경쇄들 (L)을 포함하는 당단백질로 구성된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 부위 (또는 도메인) (본 명세서에서 HCVR 또는 VH라고 약칭됨) 및 중쇄 불변 부위를 포함한다. 중쇄 불변 부위는 3가지 도메인들, CH1, CH2 및 CH3를 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 부위 (본 명세서에서 LCVR 또는 LH라고 약칭됨) 및 경쇄 불변 부위를 포함한다. 경쇄 불변 부위는 하나의 도메인, CL을 포함한다. VH 및 VL 부위들은 또한 구조틀 부위들 (FR)이라고 명명되는 더욱 보존된 부위들과 함께 산재되어 있는 상보성 결정 부위들 (CDR)이라고 명명되는 과다가변성의 부위들로 소분류될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 다음의 순서로 배열된 3가지 CDR들 및 4가지 FR들로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄들 및 경쇄들의 가변 부위들은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체들의 불변 부위들은 면역계의 다양한 세포들 (예로, 효과기 세포들) 및 고전적인 보체계의 첫 번째 구성성분 (Clq)을 포함하는 숙주 조직들 또는 인자들과 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 "IGF-1R 결합 단편" 또는 "항원 결합 단편"에 의하여, 이것은 항체의 표적 (일반적으로 항원이라고도 역시 약칭됨)과 결합하는 능력을 보유하는 임의의 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질을 가리키도록 의도된다.
한 가지 구현예에서, 이러한 "항원 결합 단편들"은 Fv, scFv (단일 사슬의 sc), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc 단편들 또는 다이아체들, 또는 반감기가 폴리(에틸렌)글리콜 ("PEG화")(Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG 또는 Fab'-PEG라고 불리는 PEG화된 단편들) (폴리(에틸렌)글리콜의 "PEG")과 같은 폴리(알킬렌)글리콜의 첨가와 같은 화학적 변형, 또는 리포좀 내로 도입에 의해 증가되었던 임의의 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 단편들은 본 발명에 따른 항체의 특징적인 CDR들의 적어도 하나를 가진다. 바람직하게, 상기 "항원 결합 단편들"은 그들이 유래된 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 사슬의 부분적 서열로 구성되거나 이를 포함할 것이고, 상기 부분적 서열은 표적에 대하여 이것이 유래된 항체와 동일한 결합 특이도 및 충분한 친화도, 바람직하게는 이것이 유래된 항체의 친화도의 적어도 동등 내지 1/100, 더욱 바람직한 방식으로 적어도 1/10까지의 친화도를 보유하기에 충분하다. 더욱 바람직하게, 상기 "항원 결합 단편들"은 그들이 유래된 중쇄 가변 사슬의 적어도 3가지 CDR들 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 및 경쇄 가변 가슬의 3가지 CDR들 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3로 구성되거나 이들을 포함할 것이다.
"결합하는" 또는 "결합하다" 등에 의하여, 항체, 또는 그의 임의의 항원-결합 단편은 생리적 조건들 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성하는 것으로 의도된다. 특이적 결합은 적어도 약 1 × 10-6 M 이하의 평형 해리 상수를 특징으로 할 수 있다. 두 분자들이 결합하는지 여부를 결정하는 방법들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면 평형 투석법, 표면 플라스몬 공명법 등을 포함한다. 애매함의 회피를 위해, 이것은 상기 항체가 또 다른 항원과 낮은 수준으로 결합 또는 개입할 수 없는 점을 의미하지는 않는다. 그럼에도 불구하고 한 가지 구현예로서, 상기 항체는 상기 항원과 결합한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 표현 "IGF-1R 항체"는 "항-IGF-1R 항체"와 유사한 것으로서 해석되어야 하고, IGF-1R와 결합할 수 있는 항체를 의미한다.
본 출원의 구현예에서, 항체의 에피토프는 인간 IGF-1R의 세포외 도메인 (IGF-1R ECD라고도 역시 약칭됨) 내에 정착된다.
상세한 구현예에서, 항체, 또는 그의 임의의 항원 결합 단편은 10 × 10-10 내지 1 × 10-10 M 사이 범위, 더욱 바람직하게는 8 × 10-10 내지 2 × 10-10 M 사이 범위에 포함되는 EC50으로 IGF-1R과 결합할 수 있다.
이러한 의미에서, "EC50"은 50% 유효 농도를 말한다. 보다 상세하게, 용어 최대의 절반 유효 농도 (EC50)는 일정 특정된 노출 시간 이후에 기저값 및 최대값 사이의 절반의 반응을 유도하는 약물, 항체 또는 독물의 농도에 해당한다. 이것은 약물의 효능의 척도로서 보편적으로 사용된다. 따라서 등급화된 용량 반응 곡선의 EC50은 그의 최대 효과의 50%가 관찰되는 화합물의 농도를 나타낸다. 양적 용량 반응 곡선의 EC50은 특정된 노출 지속 이후에 집단의 50%가 반응을 나타내는 화합물의 농도를 나타낸다. 농도 측정들은 전형적으로 S자형 곡선을 따르고, 농도의 비교적 적은 변화를 거쳐서 신속하게 증가한다. 이것은 최고-적정 선의 유도에 의해 수학적으로 결정될 수 있다.
바람직한 구현예로서, 본 발명에서 결정된 EC50은 인간 종양 세포들에게로 노출된 IGF-1R ECD 상의 항체 결합의 효능을 특성화하였다. EC50 매개변수는 FACS 분석을 사용하여 결정된다. EC50 매개변수는 인간 종양 세포들에서 발현된 인간 IGF-1R 상의 최대 결합의 50%가 획득되는 항체 농도를 반영한다. 각각의 EC50 수치는 4개-매개변수 회귀 곡선 적응 프로그램 (프리즘 소프트웨어)을 사용하여 용량 반응 곡선의 중간점으로서 계산되었다. 이러한 매개변수는 생리학적/병리학적 병태들을 나타내도록 선택되어 왔다.
용어 "에피토프"는 항체들을 포함하는 항원 결합 단백질에 의해 결합되는 항원의 부위이다. 에피토프들은 구조적 또는 기능적으로서 정의될 수 있다. 기능적 에피토프들은 일반적으로 구조적 에피토프들의 부분 집합이고, 상호작용의 친화도에 직접적으로 기여하는 잔기들을 포함한다. 에피토프들은 입체형태도 역시 가지고, 즉 비-선형의 아미노산들로 구성될 수 있고, 다른 말로 하면 입체형태적 에피토프들은 비-연속적 아미노산들로 구성된다. 소정의 구현예들에서, 에피토프들은 아미노산들, 당 측쇄들, 포스포릴 기들, 또는 설포닐 기들과 같은 분자들의 화학적으로 활성을 가진 표면 그룹화가 되는 결정기들을 포함할 수 있고, 소정의 구현예들에서, 특이적인 삼차원 구조적 특징들, 및/또는 특이적인 전하 특징들을 가질 수 있다.
상세한 구현예에서, 본 발명은 인간 인슐린 유사 성장인자 1 수용체 (IGF-1R)와 결합하고, 항체의 IGF-1R과 결합 이후에 내재화되는 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편을 선별하는 방법으로서,
i) 서열번호 52의 IGF-1R과 결합하고,
ii) 서열번호 52의 494번 위치에 히스티딘이 아닌 아미노산 또는 491번 위치에 아스파트산 (ASP)을 가진 서열번호 52의 IGF-1R와는 결합하지 않고, 바람직하게는 서열번호 52의 494번 위치에 히스티딘 및 491번 위치에 아스파트산 (ASP)이 아닌 아미노산을 가진 서열번호 52의 IGF-1R와는 결합하지 않는 항체:
를 선별하는 단계들을 포함하는, 방법에 관한 것이다:
보다 상세한 구현예에서, 본 발명은 인간 인슐린 유사 성장인자 1 수용체 (IGF-1R)와 결합하고, 항체의 IGF-1R과 결합 이후에 내재화되는 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편을 선별하는 방법으로서,
1) i) 서열번호 52의 IGF-1R과 결합하고,
ii) 서열번호 52의 494번 위치에 히스티딘이 아닌 아미노산 또는 491번 위치에 아스파트산 (ASP)을 가진 서열번호 52의 IGF-1R와는 결합하지 않고, 바람직하게는 서열번호 52의 494번 위치에 히스티딘 및 491번 위치에 아스파트산 (ASP)이 아닌 아미노산을 가진 서열번호 52의 IGF-1R와는 결합하지 않는, 항체를 선별하는 단계; 및 다음으로,
2) 이러한 항체로부터 내재화의 백분율이 그의 IGF-1R과 결합 이후에 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%가 되는 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편을 선별하는 단계:
를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또 다른 상세한 구현예에서, 본 발명은 인간 인슐린 유사 성장인자 1 수용체 (IGF-1R)와 결합하고, 항체의 IGF-1R과 결합 이후에 내재화되는 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편을 선별하는 방법으로서,
1) 내재화의 백분율이 그의 IGF-1R과 결합 이후에 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%가 되는, 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편을 선별하는 단계; 및 다음으로
2) 이러한 항체로부터
i) 서열번호 52의 IGF-1R과 결합하고,
ii) 서열번호 52의 494번 위치에 히스티딘이 아닌 아미노산 또는 491번 위치에 아스파트산 (ASP)을 가진 서열번호 52의 IGF-1R와는 결합하지 않고, 바람직하게 서열번호 52의 494번 위치에 히스티딘 및 491번 위치에 아스파트산 (ASP)이 아닌 아미노산을 가진 서열번호 52의 IGF-1R와는 결합하지 않는, 항체를 선별하는 단계:
를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법에서, 항체의 내재화 및 IGF-1R와 결합 또는 미결합의 특징으로 항체를 선별하는 단계는 임의의 연속적 순서로 수행될 수 있다.
상세한 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 인용된 본 발명에 따른 방법들 중 하나에 의해 획득된 바과 같은, 인간 인슐린 유사 성장인자 1 수용체 (IGF-1R)와 결합하는 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편에 관한 것이다.
또 다른 상세한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 52의 인간 인슐린 유사 성장인자 1 수용체 (IGF-1R)와 결합하고, 항체의 IGF-1R과 결합 이후에 내재화되며, 서열번호 82 또는 92, 바람직하게는 서열번호 82 및 92의 IGF-1R과 결합하지 않는, 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항체를 위해, 서열번호 52는 494번 위치에 히스티딘이 존재하는 인간 IGF-1R 수용체, 예로 야생형 IGF-1R의 아미노산 서열에 해당하는 한편, 서열번호 82는 494번 위치에 아르기닌이 존재하는 인간 IGF-1R 수용체의 돌연변이된 아미노산 서열에 해당하는 한편, 서열번호 92는 491번 위치에 알라닌이 존재하는 인간 IGF-1R 수용체의 돌연변이된 아미노산 서열에 해당한다.
보다 상세한 구현예에서, 본 발명은 내재화 항체의 에피토프가 서열번호 52의 494번 위치에 히스티딘 아미노산을 포함하는, 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편에 관한 것이다.
보다 상세한 구현예에서, 본 발명은 내재화 항체의 에피토프가 적어도 8개 아미노산들의 아미노산 서열을 포함하면서 서열번호 52의 494번 위치에 히스티딘 아미노산을 포함하는, 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편에 관한 것이다.
보다 상세한 구현예에서, 본 발명은 내재화 항체의 에피토프가 적어도 8개 아미노산들의 아미노산 서열을 포함하면서 서열번호 52의 491번 위치에 아스파트산 아미노산을 포함하는, 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편에 관한 것이다.
보다 상세한 구현예에서, 본 발명은 내재화 항체의 에피토프가 적어도 8개 아미노산들의 아미노산 서열을 포함하면서, 서열번호 52의 494번 위치에 히스티딘 아미노산 및 서열번호 52의 491번 위치에 아스파트산 아미노산을 포함하는, 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편에 관한 것이다.
보다 상세한 구현예에서, 본 발명은 내재화 항체의 에피토프가 적어도 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 아미노산들의 아미노산 서열을 포함하면서 서열번호 52의 494번 위치에 히스티딘 아미노산을 포함하는, 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편에 관한 것이다.
보다 상세한 구현예에서, 본 발명은 내재화 항체의 에피토프가 적어도 8개 아미노산들의 아미노산 서열을 포함하면서 서열번호 52의 494번 위치에 히스티딘 아미노산을 포함하고, 상기 에피토프는
- 서열번호 52의 487번 위치의 아미노산부터 494번 위치의 아미노산까지의 아미노산 서열과 일치하거나, 적어도 80% 일치도를 나타내는 아미노산 서열,
- 서열번호 52의 488번 위치의 아미노산부터 495번 위치의 아미노산까지의 아미노산 서열과 일치하거나, 적어도 80% 일치도를 나타내는 아미노산 서열,
- 서열번호 52의 489번 위치의 아미노산부터 496번 위치의 아미노산까지의 아미노산 서열과 일치하거나, 적어도 80% 일치도를 나타내는 아미노산 서열,
- 서열번호 52의 490번 위치의 아미노산부터 497번 위치의 아미노산까지의 아미노산 서열과 일치하거나, 적어도 80% 일치도를 나타내는 아미노산 서열,
- 서열번호 52의 491번 위치의 아미노산부터 498번 위치의 아미노산까지의 아미노산 서열과 일치하거나, 적어도 80% 일치도를 나타내는 아미노산 서열,
- 서열번호 52의 492번 위치의 아미노산부터 499번 위치의 아미노산까지의 아미노산 서열과 일치하거나, 적어도 80% 일치도를 나타내는 아미노산 서열, 및
- 서열번호 52의 493번 위치의 아미노산부터 500번 위치의 아미노산까지의 아미노산 서열과 일치하거나, 적어도 80% 일치도를 나타내는 아미노산 서열:
로 이루어진 그룹에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편에 관한 것이다.
보다 상세한 구현예에서, 본 발명은 내재화 항체의 에피토프가 적어도 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 아미노산들의 아미노산 서열을 포함하면서 서열번호 52의 491번 위치에 아스파트산 아미노산을 포함하는, 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편에 관한 것이다.
보다 상세한 구현예에서, 본 발명은 내재화 항체의 에피토프가 적어도 8개 아미노산들의 아미노산 서열을 포함하면서 서열번호 52의 491번 위치에 아스파트산 아미노산을 포함하고, 상기 에피토프는
- 서열번호 52의 484번 위치의 아미노산부터 491번 위치의 아미노산까지의 아미노산 서열과 일치하거나, 적어도 80% 일치도를 나타내는 아미노산 서열,
- 서열번호 52의 485번 위치의 아미노산부터 492번 위치의 아미노산까지의 아미노산 서열과 일치하거나, 적어도 80% 일치도를 나타내는 아미노산 서열,
- 서열번호 52의 486번 위치의 아미노산부터 493번 위치의 아미노산까지의 아미노산 서열과 일치하거나, 적어도 80% 일치도를 나타내는 아미노산 서열,
- 서열번호 52의 487번 위치의 아미노산부터 494번 위치의 아미노산까지의 아미노산 서열과 일치하거나, 적어도 80% 일치도를 나타내는 아미노산 서열,
- 서열번호 52의 488번 위치의 아미노산부터 495번 위치의 아미노산까지의 아미노산 서열과 일치하거나, 적어도 80% 일치도를 나타내는 아미노산 서열,
- 서열번호 52의 489번 위치의 아미노산부터 496번 위치의 아미노산까지의 아미노산 서열과 일치하거나, 적어도 80% 일치도를 나타내는 아미노산 서열, 및
- 서열번호 52의 490번 위치의 아미노산부터 497번 위치의 아미노산까지의 아미노산 서열과 일치하거나, 적어도 80% 일치도를 나타내는 아미노산 서열:
로 이루어진 그룹에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편에 관한 것이다.
보다 상세한 구현예에서, 본 발명은 내재화 항체의 에피토프가 적어도 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 아미노산들의 아미노산 서열을 포함하면서 서열번호 52의 494번 위치에 히스티딘 아미노산 및 491번 위치에 아스파트산 아미노산을 포함하는, 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편에 관한 것이다.
보다 상세한 구현예에서, 본 발명은 내재화 항체의 에피토프가 적어도 8개의 아미노산들의 아미노산 서열을 포함하면서 서열번호 52의 494번 위치에 히스티딘 아미노산 및 491번 위치에 아스파트산 아미노산을 포함하고, 상기 에피토프는
- 서열번호 52의 487번 위치의 아미노산부터 494번 위치의 아미노산까지의 아미노산 서열과 일치하거나, 적어도 80% 일치도를 나타내는 아미노산 서열,
- 서열번호 52의 488번 위치의 아미노산부터 495번 위치의 아미노산까지의 아미노산 서열과 일치하거나, 적어도 80% 일치도를 나타내는 아미노산 서열,
- 서열번호 52의 489번 위치의 아미노산부터 496번 위치의 아미노산까지의 아미노산 서열과 일치하거나, 적어도 80% 일치도를 나타내는 아미노산 서열,
- 서열번호 52의 490번 위치의 아미노산부터 497번 위치의 아미노산까지의 아미노산 서열과 일치하거나, 적어도 80% 일치도를 나타내는 아미노산 서열, 및
- 서열번호 52의 491번 위치의 아미노산부터 498번 위치의 아미노산까지의 아미노산 서열과 일치하거나, 적어도 80% 일치도를 나타내는 아미노산 서열:
로 이루어진 그룹에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편에 관한 것이다.
또 다른 상세한 구현예에서, 본 발명은 인간 인슐린 유사 성장인자 1 수용체 (IGF-1R)와 결합하고 항체의 IGF-1R과 결합 이후에 내재화되는 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편으로서, 서열번호 82의 IGF-1R과 결합하지 않거나 상기 내재화 항체의 에피토프가 서열번호 52의 494번 위치에 히스티딘 아미노산 및/또는 491번 위치에 아스파트산 아미노산을 포함하고, 상기 항체의 내재화 백분율이 그의 IGF-1R과 결합 이후에 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%가 되는, 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편에 관한 것이다. 항체, 또는 그의 항원-결합 단편의 내재화 백분율은 당업자에게 숙지되어 있는, 예를 들면 본 명세서에 기술된 방법과 같은 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다.
상세한 구현예에서, 본 발명은 상기 서열번호 52의 494번 위치에서 히스티딘이 아닌 아미노산은 아르기닌인, 본 발명에 따른 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편 (서열번호 82)에 관한 것이다.
상세한 구현예에서, 본 발명은 상기 서열번호 52의 491번 위치에서 아스파트산이 아닌 아미노산은 알라닌인, 본 발명에 따른 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편 (서열번호 92)에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 본 발명은 인간 인슐린 유사 성장인자 1 수용체 (IGF-1R)와 결합하고 항체의 IGF-1R과 결합 이후에 내재화되는 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편으로서,
i) 서열번호 2의 서열의 CDR-H2 및 서열번호 3의 서열의 CDR-H3 및 서열번호 5의 서열의 CDR-L2를 가진 3가지 중쇄 CDR들을 포함하는 항체;
ii) i)의 항체와 IGF-1R과의 결합을 경쟁하는 항체; 및
iii) i)의 항체가 결합하는 것과 동일한 IGF-1R의 에피토프와 결합하는 항체:
로부터 선택되는, 내재화 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편에 관한 것이다.
IGF-1R과의 결합에 대한 경쟁은, 이에 제한되는 것은 아니지만 방사능, 비아코아 (Biacore), 엘라이자 (ELISA), 유동세포측정법 등과 같은 당업자에게 숙지된 임의의 방법들 또는 기법들에 의해, 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에 따라 결정될 수 있다.
동일한 에피토프와 결합의 결정은, 이에 제한되는 것은 아니지만 방사능, 비아코아, 엘라이자, 유동세포측정법 등과 같은 당업자에게 숙지된 임의의 방법들 또는 기법들에 의해, 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에 따라 결정될 수 있다.
상기에 언급된 바와 같이, 그리고 일반 지식과는 정반대로, 본 발명은 IGF-1R 결합 이후에 내재화될 높은 능력을 제시하는 특이적인 IGF-1R 항체들에 중점을 두고 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, "내재화되다" 또는 "내재화된" (두 가지 용어 표현은 유사함) 항체는 포유동물 세포에서 IGF-1R과 결합 시 세포에 의해 흡수되는 (이것은 "진입하는" 것을 의미함) 항체이다. 이러한 항체는 면역-약물-결합체 성분들 중 하나로서 흥미롭고, 따라서 표적화된 세포들 바람직하게는 암 세포들 내로 연결된 세포독성제를 어드레싱하거나 인도한다. 일단 내재화되면, 세포독성제는 암 세포의 사망을 촉발시킨다.
바람직하게, 본 발명에 따른 항체들은 모두 CDR-H2, CDR-H3 및 CDR-L2에 대한 동일한 서열들을 제시하고, 나머지 3가지의 CDR들은 다르다. 이러한 관찰은 항체의 결합 특이도에 관하여 CDR-H3가 에피토프의 인식에서 가장 중요하고 가장 관련있는 것으로 기술된 일반 지식의 부분과 부합하는 것 같다.
면역결합체 요법으로 성공을 위한 중요한 핵심은 표적 항원 특이도 및 암 세포들 내로 항원-결합 단백질 복합체들의 내재화인 것으로 생각된다. 명백하게, 비-내재화 항원들은 세포독성 제제들을 전달하는 데 내재화 항원들보다 덜 효과적이다. 내재화 공정들은 항원들 간에 다양하고 항체들에 의해 영향을 받을 수 있는 다수의 매개변수들에 의존한다.
면역결합체에서, 세포독성제는 세포독성 활성을 가져오고 사용된 항체는 암 세포들에 대한 특이성, 뿐만 아니라 세포들 내로 진입하는 벡터가 되어 세포독성제를 정확하게 어드레싱한다. 따라서 항체가 표적화된 암 세포들 내로 내재화되는 높은 능력을 나타내어 면역결합체를 개선시킬 수 있다. 항체가 내재화를 매개하는 효율은 표적화된 에피토프에 의존하여 유의하게 달라진다. 강력한 내재화 IGF-1R 항체들의 선별은 IGF-1R 저하조절 (down-regulation) 뿐만 아니라 이어지는 세포들 내로 IGF-1R 항체 내재화를 연구하는 다양한 실험적 데이타를 요구한다.
한 가지 구현예에서, 본 발명에 따른 항체의 내재화는 (본 출원에서 하기 예시되는 바와 같이) 면역형광법, 또는 내재화 기작에 특이적인 당해 기술분야의 당업자에게 숙지되어 있는 임의의 방법 또는 공정에 의해 평가될 수 있다.
복합체 IGF-1R/항체는 상기 IGF-1R의 ECD와 항체의 결합 이후에 내재화되고, 세포들의 표면에서 IGF-1R 정량의 감소가 유도된다. 이러한 감소는, 비제한적인 예들로서 웨스턴-블럿법, FACS, 면역형광법 등과 같은 당업자에게 숙지되어 있는 임의의 방법에 의해 정량화될 수 있다.
한 가지 구현예에서, 이러한 내재화를 반영하는 감소는 바람직하게 FACS에 의해 측정되고, 항체와 4시간 배양 이후에 4℃에서 측정된 평균 형광 강도 (MFI) 및 37℃에서 측정된 MFI 간의 차이 또는 델타값으로서 표현될 수 있다.
본 발명의 비제한적인 예로서, 이러한 델타값은 미처리된 세포들 및 항체로 처리된 세포들로 획득된 MFI들을 기초로 하여, i) 본 명세서에서 기술된 항체와 4시간 배양 기간 이후에 유방암 세포들 MCF17 및 ii) 알렉사 488로 표지된 이차 항체를 사용하여 결정된다. 이러한 매개변수는 다음의 공식으로 계산된 바와 같이 정의된다: .
Figure 112016110224135-pct00001
이러한 MFI들 간의 차이는 MFI들이 세포-표면 상에서 발현된 IGF-1R과 비례하기 때문에 IGF-1R 저하조절을 반영하고 있다.
유리한 관점에서, 항체들 및 그의 임의의 항원 결합 단편은 MCF-7에서 적어도 280, 바람직하게는 적어도 400의
Figure 112016110224135-pct00002
를 촉발시키는 단일클론 항체로 구성된다.
보다 자세하게, 상기 언급된 델타값은 다음의 공정에 따라 측정될 수 있고, 이는 설명적이고 비제한적인 예로서 고려되어야 한다:
a) 관심있는 종양성 세포들을 본 발명의 항체와 함께 차가운 (4℃) 또는 따뜻한 (37℃) 둘 중 하나의 완전 배양 배지에서 처리하고 배양하는 단계;
b) 단계 a)의 처리된 세포들 및 미처리된 세포들을 동시에 이차 항체로 처리하는 단계;
c) 처리된 및 미처리된 세포들에 대한 MFI (표면에 제시된 IGF-1R의 정량을 나타냄)를 본 발명의 항체와 결합할 수 있는 이차 표지된 항체로 측정하는 단계; 및
d) 미처리된 세포들로 획득된 MFI로부터 처리된 세포들로 획득된 MFI의 차감으로서 델타값을 계산하는 단계.
이러한 델타값 MFI로부터, 내재화 백분율이 다음과 같이 결정될 수 있다:
Figure 112016110224135-pct00003
.
본 발명에 따른 항체들, 또는 그의 임의의 항원 결합 단편은 MCF-7에서 70% 및 90% 사이 범위, 바람직하게는 75% 및 87% 사이 범위에 포함되는 내재화 백분율을 제시한다.
본 명세서에서 기술된 항체들의 상세한 장점은 그들의 내재화 속도에 의존한다.
일반적으로 면역결합체의 경우, 사용된 항체들이 바람직하게 생체내 항체의 투여로부터 24시간 이내, 더욱 바람직하게는 12시간 이내, 훨씬 더 바람직하게는 6시간 이내의 신속한 내재화 속도를 나타내는 것이 바람직하다고 알려져 있다.
본 발명에서, 내재화 속도는 세포 표면 결합 항체 감소 또는 세포 표면 항체 붕괴라고도 역시 약칭되며, t1/2 (반감기)로서 표현되고 △MFI의 50% 감소를 획득하는 데 필요한 시간에 해당한다 (이러한 관점은 다음의 실시예들을 고려하여 명백하게 이해될 것이다).
상세한 장점은 본 발명의 항체들이 5분 및 25분 사이 범위, 바람직하게는 10분 및 20분 사이 범위에 포함되는 t1/2를 가지는 것이다.
본 발명의 상세한 구현예는 서열번호 1, 2 및 3의 서열들의 3가지 중쇄 CDR들 및 서열번호 4, 5 및 6의 서열들의 3가지 경쇄 CDR들을 포함하는 항체에 관한 것이다.
한 가지 구현예는 서열번호 1, 2 및 3의 서열들, 또는 서열번호 1, 2 및 3과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열을 포함하거나 이들로 구성되는 3가지 중쇄 CDR들, 및 서열번호 4, 5 및 6의 서열들, 또는 서열번호 4, 5 및 6과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열을 포함하거나 이들로 구성되는 3가지 경쇄 CDR들을 포함하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이다.
또 다른 구현예에서, 항체, 또는 그의 임의의 항원 결합 단편은 서열번호 1, 2 및 3의 서열들을 포함하거나 이들로 구성되는 3가지 중쇄 CDR들 및 서열번호 4, 5 및 6의 서열들을 포함하거나 이들로 구성되는 3가지 경쇄 CDR들을 포함한다.
CDR 부위들 또는 CDR(들)에 의하여, IMGT에 의해 정의되는 바와 같이 면역글로불린들의 중쇄들 및 경쇄들의 과다가변 부위들을 가리키도록 의도된다.
독특한 IMGT 번호매김 (IMGT unique numbering)은 어떤 항원 수용체, 사슬 유형 또는 종이라도 가변 도메인들을 비교하도록 정의되어 왔다 [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M. P., Pommie C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. 독특한 IMGT 번호매김에서, 보존되는 아미노산들은 항상 동일한 위치들, 예를 들면 23번 시스테인 (1번째-CYS), 41번 트립토판 (보존된-TRP), 89번 소수성 아미노산, 104번 시스테인 (2번째-CYS), 118번 페닐알라닌 또는 트립토판 (J-PHE 또는 J-TRP)을 보유한다. 독특한 IMGT 번호매김은 구조틀 부위들 (FR1-IMGT: 1 내지 26번 위치, FR2-IMGT: 39 내지 55번 위치, FR3-IMGT: 66 내지 104번 위치 및 FR4-IMGT: 118 내지 128번 위치) 및 상보성 결정 부위들 (CDR1-IMGT: 27 내지 38번 위치, CDR2-IMGT: 56 내지 65번 위치 및 CDR3-IMGT: 105 내지 117번 위치)의 표준화된 구획을 제공한다. "공간들 (gap)"은 채워지지 않은 위치를 나타내기 때문에, CDR-IMGT 길이들 (괄호들 사이에 나타나고 점들로 분리됨, 예로 [8.8.13])는 결정적인 정보가 된다. 독특한 IMGT 번호매김은 IMGT 진주목걸이라고 명명되는 [Ruiz, M. and Lefranc, M. P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002); Kaas, Q. and Lefranc, M. P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)] 2차원 그래픽 전시들 및 IMGT/3D 구조-DB의 3차원 구조들 [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M. P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]에 사용된다.
본 명세서에서 반대의 특정이 없는 경우라면, 상보성-결정 부위들 또는 CDR들은 IMGT 번호매김 체계에 따라 정의된 바와 같이 면역글로불린의 중쇄들 및 경쇄들의 과다가변 부위들을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
그럼에도 불구하고, CDR들은 카밧 번호매김 체계에 따라 역시 정의될 수 있다 (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 제 5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, 및 나중의 개정판들). 3가지 중쇄 CDR들 및 3가지 경쇄 CDR들이 존재한다. 본 명세서에서, 용어들 "CDR" 및 "CDR들"은 경우에 따라서 그들이 인식하는 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 결합 친화도를 부여하는 대부분의 아미노산 잔기들을 포함하는 부위들의 하나 이상 또는 심지어 전부를 가리키는 데 사용된다. 본 출원의 해석을 단순화하기 위하여, 카밧에 따른 CDR들은 정의되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 당업자에게는 IMGT에 따른 CDR들의 정의를 사용하여 카밧에 따른 CDR들을 정의하는 것이 자명할 것이다.
본 발명의 의미에서, 두 개의 핵산들 또는 아미노산들의 서열들 간의 "일치도 백분율 (percentage identity)"은 최적의 정렬에 따라 획득되어 비교되는 두 개의 서열들 간에 일치하는 뉴클레오타이드들 또는 아미노산 잔기들의 백분율을 의미하고, 이러한 백분율은 순수하게 통계적이고 이 두 서열들 간의 차이들은 그들의 길이를 따라 무작위적으로 분포한다. 두 개의 핵산 또는 아미노산 서열들 간의 서열 비교는 통상적으로 그들을 최적으로 정렬시킨 이후 서열들을 비교하여 수행되고, 상기 비교는 분절마다 또는 "정렬창 (alignment window)"을 사용하여 수행될 수 있다. 비교를 위한 서열들의 최적의 정렬은 수동적인 비교와 더불어 스미스 및 워터맨의 로칼 상동성 알고리즘 [Smith and Waterman (1981) Ad. App. Math. 2:482]에 의해, 네들만 및 운쉬의 로칼 상동성 알고리즘 [Neddleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443]에 의해, 피어슨 및 립만의 유사도 탐색 방법 [Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]에 의해, 또는 이들 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 소프트웨어에 의해 (위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지, 유전학 컴퓨터 그룹, 575 Science Dr., Madison, WI에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 또는 비교 소프트웨어 BLAST N 또는 BLAST P에 의해) 수행될 수 있다.
두 개의 핵산 또는 아미노산 서열들 간의 일치도 백분율은 비교되는 핵산 또는 아미노산 서열이 이들 두 서열들 간 최적의 정렬을 위한 기준 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가들 (addition) 또는 결실들 (deletion)을 포함할 수 있는 두 개의 최적으로 정렬된 서열들을 비교하여 결정된다. 일치도 백분율은 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 두 개 서열들 간에 일치하는 위치의 수를 결정하고, 동일한 위치들의 수를 정렬창에서의 전체 위치들의 수로 나누고, 획득된 결과를 두 개 서열들 간의 일치도 백분율을 얻도록 100으로 곱하여 계산된다.
예를 들면, 웹 사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html 상에서 입수가능한 BLAST 프로그램 "BLAST 2 서열들" (Tatusova et al., "Blast 2 서열- 단백질 및 뉴클레오타이드 서열들을 비교하기 위한 새로운 도구", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174: 247-250)은 디폴트 매개변수 (명확하게, 매개변수 "오픈 갭 페널티 (open gap penalty)"의 경우: 5, 및 "연장 갭 페널티 (extension gap penalty)": 2; 선택된 매트릭스는 예를 들면 프로그램에 의해 제시되는 "BLOSUM 62" 매트릭스일 수 있음)와 함께 사용될 수 있고, 비교될 두 개 서열들 간의 일치도 백분율은 프로그램에 의해 직접 계산될 수도 있다.
기준 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 아미노산 서열을 위해, 바람직한 예들은 기준 서열, 소정의 변형들 (modification), 명확하게는 적어도 하나의 아미노산의 결실 (deletion), 부가 (addition) 또는 치환 (substituiton), 절단 (truncation) 또는 연장 (extension)을 포함한다. 하나 이상의 연속적 또는 비-연속적 아미노산(들)의 치환들 경우에서, 치환된 아미노산은 "동등한" 아미노산에 의해 대체되는 치환이 바람직하다. 본 명세서에서 용어 표현 "동등한 아미노산들"은 해당하는 항체들의 생물학적 활성들을 변형시키지 않고도 구조적 아미노산들 및 하기 정의된 특정한 예들의 하나로 치환될 수 있는 임의의 아미노산들을 가리키도록 의미한다.
동등한 아미노산들은 치환된 아미노산들과의 그들의 구조적 상동성을 기초로 하거나 생성될 수 있는 다양한 항원 결합 단백질들 간의 생물학적 활성의 비교 테스트들의 결과들을 기초로 하여 결정될 수 있다.
비-제한적인 예로서, 하기 표 1은 해당하는 변형된 항원 결합 단백질의 생물학적 활성의 유의한 변형을 유발하지 않고도 수행될 수 있는 가능한 치환들을 정리하고 있고; 역 치환들 (inverse substituiton)도 동일한 조건들 하에서 자연적으로 가능하다.
Figure 112016110224135-pct00004
본 발명의 상세한 관점은 항체, 또는 그의 임의의 항원 결합 단편이 인슐린 수용체 (IR)과 결합하지 않는 것이다. 이러한 관점은 본 명세서에서 기술된 항체가 인슐린 대사를 의미하는 IR에 미치는 임의의 부정적 영향을 가지지 않을 것이기 때문에 흥미롭다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체의 보다 또 다른 관점은 이것이 인간 IGF-1R뿐만 아니라 원숭이 IGF-1R, 보다 상세하게는 머카크 원숭이 (cynomolous) IGF-1R과도 결합할 수 있는 것이다. 이러한 관점은 이것이 독성 및 임상시험들을 용이하게 할 것이기 때문에 역시 흥미롭다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체로 구성된다.
용어 "단일클론 항체" 또는 "Mab"는 본 명세서에서 사용되는 바 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 획득되고, 예로 집단의 개별적인 항체들은 소량들로 존재할 수 있는 가능한 자연적으로 생기는 돌연변이들을 제외하고는 일치한다. 단일클론 항체들은 매우 특이적이어서, 단일한 에피토프에게로 유도된다. 이러한 단일클론 항체들은 B 세포들 또는 하이브리도마의 단일한 클론에 의해 생산될 수 있다. 단일클론 항체들도 역시 재조합일 수 있고, 예로 단백질 공학에 의해 생산된다. 단일클론 항체들은 파지 항체 라이브러리들로부터도 역시 분리될 수 있다. 또한, 다양한 결정기들 또는 에피토프들에게로 유도되는 다양한 항체들을 전형적으로 포함하는 다중클론 항체들의 제조들과는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원의 단일한 에피토프에게로 유도된다. 본 발명은 자연적 출처들로부터의 정제에 의해 분리되거나 획득된 또는 유전적 재조합 또는 화학적 합성에 의해 획득된 항체들에 관한 것이다.
한 가지 구현예에서, 본 명세서에서의 단일클론 항체는 하기에 기술된 바와 같은 마우스, 키메라 및 인간화 항체를 포함한다.
항체는 프랑스 미생물 배양들의 기탁기관 (프랑스 파리 파스퇴르 연구소, CNCM)에 제출된 마우스 기원의 하이브리도마로부터 유래될 수 있고, 상기 하이브리도마는 Balb/C 면역화된 마우스 비장 세포들/림프 세포들 및 골수종 Sp 2/O-Ag 14 세포주의 세포들의 융합에 의해 획득된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 재조합 항체로 구성된다. 용어 "재조합 항체"는 살아있는 세포들 내에서 재조합 DNA의 발현의 결과로부터 나온 항체를 말한다. 본 발명의 재조합 항체는 당업자에게 잘 숙지되어 있는, 생물학적 유기체들에서 발견되지 않을 DNA 서열들을 제작하는 유전적 재조합의 연구실 방법들을 사용하여 획득된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 화학적으로 합성된 항체로 구성된다.
한 가지 구현예에서, 본 발명의 IGF-1R 항체는 마우스 항체로 구성되며, 다음으로 m[항체의 명칭]이라고 언급된다.
한 가지 구현예에서, 본 발명의 IGF-1R 항체는 키메라 항체로 구성되며, 다음으로 c[항체의 명칭]라고 언급된다.
한 가지 구현예에서, 본 발명의 IGF-1R 항체는 인간화 항체로 구성되며, 다음으로 hz[항체의 명칭]라고 언급된다.
애매함의 회피를 위해, 다음의 명세서에서 용어 표현들 "IGF-1R 항체" 및 "[항체의 명칭]"은 유사하고 (반대의 특정이 없는 경우라면), 상기 IGF-1R 항체 및 상기 "[항체의 명칭]"의 마우스, 키메라 및 인간화 버전들을 포함한다. 필요한 때, 접두어 m- (마우스), c- (키메라) 또는 hz- (인간화)가 사용된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는
a) 서열번호 7, 2 및 3의 서열들의 3가지 중쇄 CDR들 및 서열번호 9, 5 및 11의 서열들의 3가지 경쇄 CDR들을 포함하는 항체;
b) 서열번호 7, 2 및 3의 서열들의 3가지 중쇄 CDR들 및 서열번호 10, 5 및 11의 서열들의 3가지 경쇄 CDR들을 포함하는 항체;
c) 서열번호 7, 2 및 3의 서열들의 3가지 중쇄 CDR들 및 서열번호 9, 5 및 12의 서열들의 3가지 경쇄 CDR들을 포함하는 항체; 및
d) 서열번호 8, 2 및 3의 서열들의 3가지 중쇄 CDR들 및 서열번호 9, 5 및 11의 서열들의 3가지 경쇄 CDR들을 포함하는 항체:
로부터 선택된다.
보다 명확하게, 다음의 표 2는 바람직한 항체들을 위한 IMGT에 따라 정의된 CDR 서열들을 도시한다.
Figure 112016110224135-pct00005
상기에 기술된 바와 같은 6가지 CDR들의 임의의 조합이 본 발명의 일부로서 고려되어야 하는 점은 당업자에게 자명할 것이다.
이러한 표 2로부터 관찰될 수 있는 바와 같이, 표에 기술된 모든 항체들은 CDR-H2, CDR-H3 및 CDR-L2에 대한 동일한 서열들을 가지고, 이러한 특성은 상기에 기술된 바와 같이 매우 흥미롭다.
특정한 관점은 마우스와 이종유래의 종, 명백하게 사람의 항체로부터 유래한 중쇄 및 경쇄 불변 부위들도 역시 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스 (m) 항체, 또는 임의의 항원 결합 단편들에 관한 것이다.
또 다른 특정한 관점은 마우스와 이종유래의 종, 명백하게 사람의 항체로부터 유래한 중쇄 및 경쇄 불변 부위들도 역시 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 (c) 항체, 또는 임의의 항원 결합 단편들에 관한 것이다.
본 발명의 한 가지 구현예에서, 항체는 키메라 항체로 구성된다.
키메라 항체는 주어진 종의 항체로부터 유래한 자연적 가변 부위 (경쇄 및 중쇄)를 상기 주어진 종과 이종유래 종의 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 부위들과 조합하여 포함하는 것이다.
항체들, 또는 그의 키메라 단편들은 재조합 유전학의 기법들을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 키메라 항체는 프로모터 그리고 본 발명의 비인간, 명확하게는 마우스 단일클론 항체의 가변 부위를 코딩하는 서열, 및 인간 항체 불변 부위를 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 DNA를 클로닝하여 생산될 수 있다. 한 가지 이러한 재조합 유전자에 의해 코딩되는 본 발명에 따른 키메라 항체는, 예를 들면 마우스-인간 키메라로서, 이러한 항체의 특이도는 마우스 DNA로부터 유래한 가변 부위에 의해 결정되고 그의 이소형은 인간 DNA로부터 유래한 불변 부위에 의해 결정되는 항체일 수 있다.
바람직하지만 이에 제한되지는 않는 구현예에서, 본 발명의 항체는
a) 서열번호 13의 서열 또는 서열번호 13과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 9, 5 및 11의 서열들의 3가지 경쇄 CDR들을 포함하는 항체;
b) 서열번호 14의 서열 또는 서열번호 14와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 10, 5 및 11의 서열들의 3가지 경쇄 CDR들을 포함하는 항체;
c) 서열번호 15의 서열 또는 서열번호 15와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 9, 5 및 12의 서열들의 3가지 경쇄 CDR들을 포함하는 항체;
d) 서열번호 16의 서열 또는 서열번호 16과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 9, 5 및 11의 서열들의 3가지 경쇄 CDR들을 포함하는 항체; 및
e) 서열번호 17의 서열 또는 서열번호 17과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 9, 5 및 12의 서열들의 3가지 경쇄 CDR들을 포함하는 항체:
로부터 선택된다.
"서열번호 13 내지 17과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열"에 의하여, 이것은 서열번호 1, 2 및 3의 3가지 중쇄 CDR들, 또한 CDR들에 해당하는 서열들 (예로, 서열번호 1, 2 및 3) 외부에서 서열번호 13 내지 17의 전장 서열들과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 서열을 각각 지정하도록 의도되고, "CDR들에 해당하는 서열들 외부"는 "CDR들에 해당하는 서열들 제외"로 의도된다.
바람직하지만 이에 제한되지는 않는 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는
a) 서열번호 18의 서열 또는 서열번호 18과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열들의 3가지 중쇄 CDR들을 포함하는 항체;
b) 서열번호 19의 서열 또는 서열번호 19와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열들의 3가지 중쇄 CDR들을 포함하는 항체;
c) 서열번호 20의 서열 또는 서열번호 20과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열들의 3가지 중쇄 CDR들을 포함하는 항체;
d) 서열번호 21의 서열 또는 서열번호 21과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 8, 2 및 3의 서열들의 3가지 중쇄 CDR들을 포함하는 항체; 및
e) 서열번호 22의 서열 또는 서열번호 22와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열들의 3가지 중쇄 CDR들을 포함하는 항체:
로부터 선택된다.
"서열번호 18 내지 22와 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열"에 의하여, 이것은 서열번호 4, 5 및 6의 3가지 경쇄 CDR들, 또한 CDR들에 해당하는 서열들 (예로, 서열번호 4, 5 및 6) 외부에서 서열번호 18 내지 22의 전장 서열들과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 서열을 각각 지정하도록 의도된다.
본 발명의 한 가지 구현예는
a) 서열번호 13의 서열 또는 서열번호 13과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 18의 서열 또는 서열번호 18과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체;
b) 서열번호 14의 서열 또는 서열번호 14와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 19의 서열 또는 서열번호 19와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체;
c) 서열번호 15의 서열 또는 서열번호 15와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 20의 서열 또는 서열번호 20과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체;
d) 서열번호 16의 서열 또는 서열번호 16과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 21의 서열 또는 서열번호 21과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체; 및
e) 서열번호 17의 서열 또는 서열번호 17과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 22의 서열 또는 서열번호 22와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체:
로부터 선택되는, 항체에 관한 것이다:.
본 명세서에 기술된 키메라 항체들은 불변 부위도 역시 특징으로 할 수 있고, 보다 상세하게 상기 키메라 항체들은 이에 제한되지 않지만 IgG1, IgG2, IgG3, IgM, IgA, IgD 또는 IgE와 같이 선별되거나 지정될 수 있다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 맥락에서 상기 키메라 항체는 IgG1 또는 IgG4이다.
본 발명의 구현예는 IgG1 형식에서 상기 기술된 바와 같은 가변 도메인들 VH 및 VL을 포함하는 키메라 항체에 관한 것이다. 더욱 바람직하게, 상기 키메라 항체는 서열번호 43의 서열의 VH를 위한 불변 도메인 및 서열번호 45의 서열의 VL을 위한 카파 도메인을 포함한다.
본 발명의 구현예는 IgG4 형식에서 상기 기술된 바와 같은 가변 도메인들 VH 및 VL을 포함하는 키메라 항체에 관한 것이다. 더욱 바람직하게, 상기 키메라 항체는 서열번호 44의 서열의 VH를 위한 불변 도메인 및 서열번호 45의 서열의 VL을 위한 카파 도메인을 포함한다.
바람직하지만 이에 제한되지는 않는 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는
a) 서열번호 23의 서열 또는 서열번호 23과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 28의 서열 또는 서열번호 28과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체;
b) 서열번호 24의 서열 또는 서열번호 24와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 29의 서열 또는 서열번호 29와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체;
c) 서열번호 25의 서열 또는 서열번호 25와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 30의 서열 또는 서열번호 30과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체;
d) 서열번호 26의 서열 또는 서열번호 26과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 31의 서열 또는 서열번호 31과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체; 및
e) 서열번호 27의 서열 또는 서열번호 27과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 32의 서열 또는 서열번호 32와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체:
로부터 선택된다.
보다 명확하게, 다음의 표 3은 바람직한 키메라 항체들을 위한 VH 및 VL의 서열들을 각각 도시한다.
Figure 112016110224135-pct00006
또한 본 발명의 또 다른 특정한 관점은 인간 항체로부터 유래한 경쇄 및 중쇄의 불변 부위들이 각각 람다 또는 카파 부위 및 감마-1, 감마-2 또는 감마-4 부위인 것을 특징으로 하는, 인간화 항체, 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명의 한 가지 구현예에서, 항체는 인간화 항체로 구성된다.
"인간화 항체들"은 비인간 기원의 항체로부터 유래한 CDR 부위들을 포함하고, 항체 분자의 나머지 부분들은 하나의 (또는 여러) 인간 항체들로부터 유래하는 항체를 의미한다. 또한, 일정 골격 분절 잔기들 (FR이라고 불림)은 결합 친화도를 보존하도록 변형될 수 있다.
인간화 항체들 또는 그의 단편들은 당업자에게 알려진 기법들에 의해 제조될 수 있다. 이러한 인간화 항체들은 시험관내 진단들 또는 생체내 예방적 및/또는 치료적 처치가 관여하는 방법들에서 사용하는 데 바람직하다. 다른 인간화 기법들도 역시, 예를 들면 유럽 특허들 제 EP 0　451 261호, 제 EP 0　682 040호, 제 EP 0　939 127호, 제 EP 0　566 647호 또는 미국 특허들 제 US 5,530,101호, 제 US 6,180,370호, 제 US 5,585,089호 및 제 US 5,693,761호에서 PDL에 의해 기술된 "CDR 접합 (CDR grafting)"과 같은 기술분야의 당업자에게 숙지되어 있다. 미국 특허들 제 5,639,641호 또는 제 6,054,297호, 제 5,886,152호 및 제 5,877,293호도 역시 인용될 수 있다.
본 발명의 상세한 구현예로서, 그리고 다음의 실시예들에서 보다 자세하게 설명될 바와 같이, 본 명세서에서는 hz208F2로 구성되는 항체가 기술된다. 이러한 인간화는 본 발명의 다른 항체들 부분에도 역시 적용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는
i) 각각 서열번호 7, 2 및 3의 서열들의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3,
ii) 인간 생식계열 IGHV1-46*01 (서열번호 46)로부터 유래한 FR1, FR2 및 FR3, 및
iii) 인간 생식계열 IGHJ4*01 (서열번호 48)로부터 유래한 FR4:
를 가지는 중쇄 가변 도메인 (VH)를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는
i) 각각 서열번호 9, 5 및 11의 서열들의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3,
ii) 인간 생식계열 IGKV1-39*01 (서열번호 47)로부터 유래한 FR1, FR2 및 FR3, 및
iii) 인간 생식계열 IGKJ4*01 (서열번호 49)로부터 유래한 FR4:
를 가지는 경쇄 가변 도메인 (VL)를 포함한다.
바람직하지만 이에 제한되지는 않는 본 발명의 구현예에서, 항체는
a) 각각 서열번호 7, 2 및 3의 서열들의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3, 인간 생식계열 IGHV1-46*01 (서열번호 46)로부터 유래한 FR1, FR2 및 FR3, 및 인간 생식계열 IGHJ4*01 (서열번호 48)로부터 유래한 FR4를 가지는 중쇄; 및
b) 각각 서열번호 9, 5 및 11의 서열들의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3, 인간 생식계열 IGKV1-39*01 (서열번호 47)로부터 유래한 FR1, FR2 및 FR3, 및 인간 생식계열 IGKJ4*01 (서열번호 49)로부터 유래한 FR4를 가지는 경쇄:
를 포함한다.
한 가지 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 33 서열의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열번호 35 서열의 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 상기 인간화 항체는 이하 본 명세서에서 hz208F2 ("변이체" 또는 "Var." 1)라고 불릴 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 33 서열의 중쇄 가변 도메인 (VH)으로서, 상기 서열번호 33의 서열은 잔기들 20번, 34번, 35번, 38번, 48번, 50번, 59번, 61번, 62번, 70번, 72번, 74번, 76번, 77번, 79번, 82번 및 95번으로부터 선택된 적어도 1개의 역-돌연변이를 포함하는, 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
용어 표현 "역-돌연변이" 또는 "역 돌연변이"에 의하여, 이것은 처음에 마우스 서열에 존재하는 해당하는 잔기로 생식계열에 존재하는 인간 잔기의 돌연변이 또는 대체를 의미한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 33 서열의 중쇄 가변 도메인 (VH)으로서, 상기 서열번호 33의 서열은 잔기들 20번, 34번, 35번, 38번, 48번, 50번, 59번, 61번, 62번, 70번, 72번, 74번, 76번, 77번, 79번, 82번 및 95번으로부터 선택되는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개 또는 17개의 역-돌연변이들을 포함하는, 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
보다 명확하게, 다음의 표 4는 바람직한 역-돌연변이들을 도시한다.
Figure 112016110224135-pct00007
한 가지 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 35 서열의 경쇄 가변 도메인 (VL)으로서, 상기 서열번호 35의 서열은 잔기들 22번, 53번, 55번, 65번, 71번, 72번, 77번 및 87번으로부터 선택되는 적어도 1개의 역-돌연변이를 포함하는, 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 가지 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 35 서열의 경쇄 가변 도메인 (VL)으로서, 상기 서열번호 35의 서열은 잔기들 22번, 53번, 55번, 65번, 71번, 72번, 77번 및 87번으로부터 선택되는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 역-돌연변이를 포함하는, 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는
a) 서열번호 33의 서열의 중쇄 가변 도메인 (VH)으로서, 상기 서열번호 33의 서열은 잔기들 20번, 34번, 35번, 38번, 48번, 50번, 59번, 61번, 62번, 70번, 72번, 74번, 76번, 77번, 79번, 82번 및 95번으로부터 선택된 적어도 1개의 역-돌연변이를 포함하는, 중쇄 가변 도메인; 및
b) 서열번호 35의 서열의 경쇄 가변 도메인 (VL)으로서, 상기 서열번호 35의 서열은 잔기들 22번, 53번, 55번, 65번, 71번, 72번, 77번 및 87번으로부터 선택된 적어도 1개의 역-돌연변이를 포함하는, 경쇄 가변 도메인:
을 포함한다.
보다 명확하게, 다음의 표 5는 바람직한 역-돌연변이들을 도시한다.
Figure 112016110224135-pct00008
이러한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 상기에 언급된 모든 역-돌연변이들을 포함하고, 서열번호 34 서열의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열번호 36 서열의 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체에 해당한다. 상기 인간화 항체는 이하 본 명세서에서 hz208F2 ("변이체" 또는 "Var." 3)라고 불릴 것이다.
또 다른 구현예에서, 변이체 1 및 변이체 3 사이 범위에 포함되는 모든 인간화 형태들도 역시 본 발명에 의해 포괄된다. 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 41의 "공통" 서열의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열번호 42의 "공통" 서열의 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체에 해당한다. 상기 인간화 항체는 전체적으로, 이하 본 명세서에서 hz208F2 ("변이체" 또는 "Var." 2)라고 불릴 것이다.
바람직하지만 이에 제한되지는 않는 구현예에서, 본 발명의 항체는
a) 서열번호 33의 서열 또는 서열번호 33과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 9, 5 및 11의 서열들의 3가지 중쇄 CDR들을 포함하는 항체;
b) 서열번호 34의 서열 또는 서열번호 34와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 9, 5 및 11의 서열들의 3가지 중쇄 CDR들을 포함하는 항체; 및
c) 서열번호 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 및 80으로부터 선택된 서열 또는 서열번호 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 및 80과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 가진 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 9, 5 및 11의 서열들의 3가지 경쇄 CDR들을 포함하는 항체:
로부터 선택된다.
"서열번호 33, 34, 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 또는 80과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열"에 의하여, 이것은 서열번호 1, 2 및 3의 3가지 중쇄 CDR들, 또한 CDR들에 해당하는 서열들 (예로, 서열번호 1, 2 및 3) 외부에서 서열번호 33, 34, 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 또는 80의 전장 서열들과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 서열을 지정하도록 의도된다.
바람직하지만 이에 제한되지는 않는 구현예에서, 본 발명의 항체는
a) 서열번호 35의 서열 또는 서열번호 35와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열들의 3가지 중쇄 CDR들을 포함하는 항체;
b) 서열번호 36의 서열 또는 서열번호 36과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열들의 3가지 중쇄 CDR들을 포함하는 항체; 및
c) 서열번호 57 및 60 또는 서열번호 57 또는 60과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 가진 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열들의 3가지 중쇄 CDR들을 포함하는 항체:
로부터 선택된다.
"서열번호 35, 36, 57 또는 60과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열"에 의하여, 이것은 서열번호 4, 5 및 6의 3가지 경쇄 CDR들, 또한 CDR들에 해당하는 서열들 (예로, 서열번호 4, 5 및 6) 외부에서 서열번호 35, 36, 57 또는 60의 전장 서열들과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 서열을 지정하도록 의도된다.
본 명세서에서 기술된 인간화 항체들은 불변 부위도 역시 특징으로 할 수 있고, 보다 상세하게 상기 인간화 항체들은 이에 제한되지 않지만 IgG1, IgG2, IgG3, IgM, IgA, IgD 또는 IgE와 같이 선별되거나 지정될 수 있다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 맥락에서 상기 인간화 항체는 IgG1 또는 IgG4이다.
본 발명의 구현예는 IgG1 형식에서 상기 기술된 바와 같은 가변 도메인들 VH 및 VL을 포함하는 인간화 항체에 관한 것이다. 더욱 바람직하게, 상기 인간화 항체는 서열번호 43의 서열의 VH를 위한 불변 도메인 및 서열번호 45의 서열의 VL을 위한 카파 도메인을 포함한다.
본 발명의 구현예는 IgG4 형식에서 상기 기술된 바와 같은 가변 도메인들 VH 및 VL을 포함하는 인간화 항체에 관한 것이다. 더욱 바람직하게, 상기 인간화 항체는 서열번호 44의 서열의 VH를 위한 불변 도메인 및 서열번호 45의 서열의 VL을 위한 카파 도메인을 포함한다.
또한 본 발명의 또 다른 구현예는
a) 서열번호 37의 서열 또는 서열번호 37과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 39의 서열 또는 서열번호 39와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체;
b) 서열번호 38의 서열 또는 서열번호 38과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 40의 서열 또는 서열번호 40과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체; 및
c) 서열번호들 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 및 80으로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 및 80과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 가진 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 57 또는 60의 서열 또는 서열번호 57 또는 60과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 가진 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이들로 구성되는 항체:
로부터 선택되는 항체에 관한 것이다.
보다 명확하게, 다음의 표 6a는 인간화 항체 hz208F2의 변이체 1 (Var. 1) 및 변이체 3 (Var. 3)를 위한 VH 및 VL 서열들의 비제한적인 예들을 도시한다. 이것은 또한 변이체 2 (Var. 2)를 위한 공통 서열도 포함한다.
Figure 112016110224135-pct00009
바람직하지만 이에 제한되지는 않는 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는
a) 서열번호들 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 및 80으로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 및 80과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 가진 임의의 서열로부터 선택된 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호들 9, 5 및 11의 서열들의 3가지 경쇄 CDR들을 포함하는 항체;
b) 서열번호들 57 및 60으로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 57 및 60과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 가진 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호들 7, 2 및 3의 서열들의 3가지 중쇄 CDR들을 포함하는 항체; 및
c) 서열번호들 57 및 60으로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 57 및 60과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 가진 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호들 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 및 80으로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 및 80과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 가진 임의의 서열로부터 선택된 서열의 중쇄 가변 도메인:
으로부터 선택된다.
또한 본 발명의 또 다른 구현예는
a) 서열번호들 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 및 81 또는 서열번호들 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 및 81과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 가진 임의의 서열로부터 선택되는 서열의 중쇄; 및
b) 서열번호들 59 및 61 서열 또는 서열번호들 59 및 61과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 가진 임의의 서열로부터 선택되는 서열의 경쇄:
를 포함하거나 이로 구성되는 항체로부터 선택되는, 항체에 관한 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 구현예는
a) 서열번호들 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 및 80 또는 서열번호들 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 및 80과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열로부터 선택되는 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 57의 서열 또는 서열번호 57과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체; 및
b) 서열번호들 56, 64, 68 및 78 또는 서열번호들 56, 64, 68 및 78과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열로부터 선택되는 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 60의 서열 또는 서열번호 60과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체:
로부터 선택되는, 항체에 관한 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 구현예는
a) 서열번호 58의 서열 또는 서열번호 58과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이로 구성되는 항체;
b) 서열번호 58의 서열 또는 서열번호 58과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 61의 서열 또는 서열번호 61과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이로 구성되는 항체;
c) 서열번호 63의 서열 또는 서열번호 63과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이로 구성되는 항체;
d) 서열번호 65의 서열 또는 서열번호 65와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이로 구성되는 항체;
e) 서열번호 65의 서열 또는 서열번호 65와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 61의 서열 또는 서열번호 61과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이로 구성되는 항체;
f) 서열번호 67의 서열 또는 서열번호 67과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이로 구성되는 항체;
g) 서열번호 69의 서열 또는 서열번호 69와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이로 구성되는 항체;
h) 서열번호 69의 서열 또는 서열번호 69와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 61의 서열 또는 서열번호 61과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이로 구성되는 항체;
i) 서열번호 71의 서열 또는 서열번호 71과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이로 구성되는 항체;
j) 서열번호 73의 서열 또는 서열번호 73과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이로 구성되는 항체;
k) 서열번호 75의 서열 또는 서열번호 75와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이로 구성되는 항체;
l) 서열번호 77의 서열 또는 서열번호 77과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이로 구성되는 항체;
m) 서열번호 79의 서열 또는 서열번호 79와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이로 구성되는 항체;
n) 서열번호 79의 서열 또는 서열번호 79와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 61의 서열 또는 서열번호 61과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이로 구성되는 항체; 및
o) 서열번호 81의 서열 또는 서열번호 81과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이로 구성되는 항체:
로부터 선택되는, 항체에 관한 것이다.
보다 명확하게, 다음의 표 6b는 인간화 항체 hz208F2의 서로 다른 변이체들을 위한 VH 및 VL (가변 도메인 및 전장) 서열들의 비제한적인 예들을 도시한다.
Figure 112016110224135-pct00010
Figure 112016110224135-pct00011
Figure 112016110224135-pct00012
본 발명의 또 다른 관점은
i) 프랑스 파리 75724, 닥터 루 거리 25, 파스퇴르 연구소, CNCM 국립 미생물 배양들의 수집기관에 각각 2013년 5월 30일, 2013년 6월 26일, 2013년 6월 26일, 2013년 4월 24일 및 2013년 6월 26일에 기탁된 하이브리도마 I-4757, I-4773, I-4775, I-4736 또는 I-4774에 의해 생산된 항체;
ii) i)의 항체와 IGF-1R과의 결합을 경쟁하는 항체; 및
iii) i)의 항체가 결합하는 것과 동일한 IGF-1R의 에피토프와 결합하는 항체:
로부터 선택되는 항체이다.
또 다른 관점에 따르면, 본 발명은 프랑스 파스퇴르 연구소, CNCM에 각각 2013년 5월 30일, 2013년 6월 26일, 2013년 6월 26일, 2013년 4월 24일 및 2013년 6월 26일에 기탁된 하이브리도마 I-4757, I-4773, I-4775, I-4736 및 I-4774로부터 선택되는, 마우스 하이브리도마에 관한 것이다.
본 발명의 새로운 관점은 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명에서 상호교환적으로 사용되는 용어들 "핵산 (nucleic acid)", "핵산 서열 (nucleic sequence)", "핵산 서열 (nucleic acid sequence)", "폴리뉴클레오타이드 (polynucleotide)", "올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide)", "폴리뉴클레오타이드 서열 (polynucleotide sequence)" 및 " 뉴클레오타이드 서열 (nucleotide sequence)"은, 변형 여부와 상관없이 핵산의 단편 또는 부위를 정의하고, 비자연적 뉴클레오타이드를 포함하기도 하고, 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA 또는 상기 DNA들의 전사 산물들 중 어느 하나로 존재하는 뉴클레오타이드들의 정확한 서열을 의미한다.
본 발명의 서열들은 분리되었고/거나 정제되었고, 예로 그들은 예를 들면 그들의 환경이 적어도 부분적으로 변형되었던 사본에 의해 직접 또는 간접적으로 수집되었다. 재조합 유전학에 의해, 예를 들면 숙주 세포들에 의해 획득되거나, 화학적 합성에 의해 획득된 분리된 핵산들도 역시 본 명세서에서 언급되어야 한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 명확하게 이러한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 클로닝 및/또는 발현 벡터들을 목표로 한다.
벡터들은 바람직하게 주어진 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열들의 발현 및/또는 분비를 허용하는 요소들을 포함한다. 벡터는 따라서 프로모터, 해독 개시 및 종결 신호들, 뿐만 아니라 적합한 전사 조절 부위들을 포함해야 한다. 이것은 숙주세포에서 안정한 방식으로 유지될 수 있어야 하고, 선택적으로 해독된 단백질의 분비를 특정하는 특이적 신호들을 가질 수 있다. 이들 다양한 요소들은 사용된 숙주 세포에 따라 당업자에 의해 선택되고 최적화된다. 이러한 목적을 위해, 뉴클레오타이드 서열들은 선택된 숙주 내의 자가-복제하는 벡터들 내에 삽입되거나 선택된 숙주의 통합 벡터들일 수 있다.
이러한 벡터들은 당업자에 의해 전형적으로 사용되는 방법들에 의해 제조되고, 결과로 얻은 클론들은 리포펙션, 전기천공법, 열 충격법 또는 화학적 방법들과 같은 표준 방법들에 의해 적합한 숙주 내로 도입될 수 있다.
본 벡터들은 예를 들면 플라스미드 또는 바이러스 기원의 벡터들이다. 그들은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열들을 클론하거나 발현하기 위하여 숙주 세포들을 형질전환하는 데 사용된다.
본 발명은 또한 본 발명에서 기술된 바와 같은 벡터에 의해 형질전환되거나 이를 포함하는 분리된 숙주 세포들에 관한 것이다.
숙주 세포들은 예를 들면 박테리아 세포들뿐만 아니라 효모 세포들 또는 동물 세포들, 명확하게는 포유동물 세포들 (인간을 제외함)과 같은 원핵 또는 진핵 시스템들 중에서 선택될 수 있다. 곤충 또는 식물 세포들도 역시 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 형질전환된 세포를 가지는, 인간이 아닌 동물들에 관한 것이다.
또 다른 관점은 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편의 생산 방법으로서,
a) 본 발명에 따른 숙주 세포에 적합한 배양 조건들을 가진 배지에서 배양하는 단계; 및
b) 이에 따라 배양 배지로부터 또는 상기 배양된 세포들로부터 생산된 항체, 또는 그의 항원 결합 단편들 중 하나를 회수하는 단계:
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법에 관한 것이다:
본 발명에 따른 형질전환된 세포들은 본 발명에 따른 재조합 항체의 제조 방법들에 사용된다. 본 발명에 따른 벡터 및/또는 벡터에 의해 형질전환된 세포를 사용하는, 재조합 형태로의 항체들의 제조 방법들도 역시 본 명세서에 포함된다. 바람직하게, 상기에 기술된 바와 같이 벡터에 의해 형질전환된 세포는 상기 언급된 항체의 발현 및 상기 항체의 회수를 허용하는 조건들 하에서 배양된다.
이미 언급된 바와 같이, 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 시스템들 중에서 선택될 수 있다. 상세하게, 이러한 원핵 또는 진핵 시스템들에서 분비를 용이하게 하는 뉴클레오타이드 서열들을 확인하는 것이 가능하다. 이러한 서열을 보유하는 본 발명에 따른 벡터는 이에 따라 분비될 재조합 단백질들의 생산에 유리하게 사용될 수 있다. 따라서, 이들 관심 있는 재조합 단백질의 정제는 그들이 숙주 세포들 내부가 아닌 세포 배양의 상청액에 존재하는 사실에 의해 용이하게 될 것이다.
항체는 화학적 합성에 의해서도 역시 제조될 수 있다. 이러한 제조 방법도 역시 본 발명의 목적이다. 당업자라면 단편들의 농축에 의하거나 통상적인 용액으로의 합성에 의한 고체-상 기법들 또는 부분적 고체-상 기법들과 같은 화학적 합성의 방법들을 숙지하고 있다. 화학적 합성에 의해 획득되고 해당하는 비천연 아미노산들을 포함할 수 있는 폴리펩타이드들도 역시 본 발명에 포함된다.
상기 기술된 방법에 의해 획득될 수 있는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편들도 역시 본 발명에 포함된다.
상세한 관점에 따르면, 본 발명은 숙주 표적 부위에 세포독성 제제를 전달하는 어드레싱 운반체로서 사용되는, 상기에 기술된 바와 같은 항체, 또는 그의 내재화 항원 결합 단편이고, 상기 숙주 표적 부위는 IGF-1R, 바람직하게 IGF-1R 세포외 도메인, 더욱 바람직하게 인간 IGF-1R (서열번호 50), 훨씬 더 바람직하게는 인간 IGF-1R 세포외 도메인 (서열번호 51), 훨씬 더 바람직하게는 인간 IGF-1R 세포외 도메인의 N 말단 (서열번호 52), 또는 그의 임의의 자연적 변이체 서열 내에 정착된 에피토프로 구성되는, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 상기 숙주 표적 부위는 포유동물 세포, 더욱 바람직하게 인간 세포, 더욱 바람직하게 자연적으로 또는 유전적 재조합에 의해 IGF-1R을 발현하는 세포들의 표적 부위이다.
본 발명의 또 다른 관점은 세포독성 제제와 결합된, 상기에 기술된 바와 같은 항체, 또는 그의 내재화 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 결합체이다.
본 발명은 세포독성 제제와 결합된 본 명세서에서 기술된 바와 같은 항체를 포함하는 면역결합체에 관한 것이다.
용어 표현들 "면역결합체 (immunoconjugate)" 또는 "면역-결합체 (immuno-conjugate)"는 일반적으로 높게 표적화된 화합물을 제작하도록, 하나 이상의 치료적 제제(들)과 물리적으로 결합된, 항체와 같은 적어도 하나의 어드레싱 산물을 포함하는 화합물을 말한다.
바람직한 구현예에서, 이러한 치료적 제제들은 세포독성 제제들로 구성된다.
"세포독성 제제 (cytotoxic agent)" 또는 "세포독성제 (cytotoxic)"에 의하여, 이것은 개체에게 투여될 때 개체의 신체에서 세포 증식의 발생, 바람직하게는 암의 발생을, 세포성 기능을 저해 또는 방해하고/거나 세포 사망을 유발하여 치료하거나 예방하는 제제가 의도된다.
많은 세포독성 제제들이 분리되거나 합성되어 왔고, 세포 증식을 저해하거나, 명확하지 않은 경우라도 적어도 유의하게 종양 세포들을 파괴하거나 감소시키는 것을 가능하게 한다. 그러나, 이들 제제들의 독성 활성은 종양 세포들에 제한되지 않고, 비-종양 세포들도 역시 영향을 받고 파괴될 수 있다. 보다 상세하게, 부작용들이 조혈 세포들 또는 상피 세포들, 상세하게 점막성 막들의 세포들과 같이 신속하게 재생하는 세포들 상에서 관찰된다. 자세하게, 위장관의 세포들은 이러한 세포독성 제제들의 사용에 의해 많이 영향을 받는다.
본 발명의 목적들 중 하나는 또한 정상 세포들에 미치는 부작용들을 제한하는 것을 가능하게 하면서 동시에 종양 세포들에 미치는 높은 세포독성을 보존하는 세포독성 제제를 제공할 수 있는 것이다.
보다 상세하게, 세포독성 제제는 바람직하게, 이에 제한되지 않지만 약물 (예로, "항체-약물 결합체"), 독소 (예로, "면역독소" 또는 "항체-독소 결합체"), 방사성 동위원소 (예로, "방사성 면역결합체" 또는 "항체-방사성 동위원소 결합체") 등으로 구성될 수 있다.
첫 번째 바람직한 구현예에서, 면역결합체는 적어도 하나의 약물 또는 약제와 연결된 항체로 구성된다. 이러한 면역결합체는 항체-약물 결합체 (또는 "ADC")라고 언급된다.
첫 번째 구현예에서, 이러한 약물들은 그들의 작용 방식을 고려하여 기술될 수 있다. 비제한적인 예로서, 질소 머스타드, 알킬-설포네이트들, 니트로소우레아, 옥사조포린들, 아지리딘들 또는 이민-에틸렌들과 같은 알킬화제들, 항-대사물들, 항-종양 항생제들, 세포분열 저해제들, 크로마틴 기능 저해제들, 항-혈관형성제들, 항-에스트로겐들, 항-안드로겐들, 킬레이팅제들, 철 흡수 촉진제, 사이클로옥시게나제 저해제들, 포스포디에스터라제 저해제들, DNA 저해제들, DNA 합성 저해제들, 세포사멸 촉진제들, 티밀레이트 저해제들, T 세포 저해제들, 인터페론 작동제들, 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 환원효소 저해제들, 아로마타제 저해제들, 에스트로겐 수용체 길항제들, 타이로신 키나제 저해제들, 세포 주기 저해제들, 택산 (Taxane), 튜불린 저해제들, 혈관형성 저해제들, 대식세포 촉진제들, 뉴로키닌 수용체 길항제들, 카나비노이드 수용체 작동제들, 도파민 수용체 작동제들, 과립세포 촉진인자 작동제들, 에리트로포이에틴 수용체 작동제들, 소마토스타틴 수용체 작동제들, LHRH 작동제들, 칼슘 민감제들, VEGF 수용체 길항제들, 인터루킨 수용체 작동제들, 파골세포 저해제들, 라디칼 형성 촉진제들, 엔도텔린 수용체 길항제들, 빈카 알칼로이드, 항-호르몬 또는 면역조절제들 또는 세포독성 또는 독소의 활성 판정기준을 충족하는 임의의 기타 새로운 약물이 언급될 수 있다.
이러한 약물들은, 예를 들면 VIDAL 2010에서 종양학 및 혈액학 부분 "세포독성제들 (Cytotoxics)"에 첨부된 화합물들에 할애된 페이지 상에서 인용되고, 이러한 참고문헌을 참조하여 인용된 이들 세포독성 화합물들은 본 명세서에서 바람직한 세포독성 제제들로서 인용된다.
보다 상세하게, 이에 제한되는 것은 아니지만 다음의 약물들은 본 발명에 따라 바람직하다: 메클로르에타민 (mechlorethamine), 클로르암부콜 (chlorambucol), 멜팔란 (melphalen), 클로리드레이트 (chlorydrate), 피포브로멘 (pipobromen), 프레드니머스틴 (prednimustin), 디소딕-포스페이트, 에스트라머스틴 (estramustine), 사이클로포스파마이드, 알트레타민 (altretamine), 트로포스파마이드 (trofosfamide), 설포포스파마이드 (sulfofosfamide), 이포스파마이드 (ifosfamide), 티오테파 (thiotepa), 트리에틸렌아민, 알테트라아민, 카머스틴 (carmustine), 스트렙토조신 (streptozocin), 포테머스틴 (fotemustin), 로머스틴 (lomustine), 부설판 (busulfan), 트레오설판 (treosulfan), 임프로설판 (improsulfan), 다카바진 (dacarbazine), 시스-플라티넘 (cis-platinum), 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 로바플라틴 (lobaplatin), 헵타플라틴 (heptaplatin), 미리플라틴 하이드레이트 (miriplatin hydrate), 카보플라틴 (carboplatin), 메토트렉세이트 (methotrexate), 페메트레세드 (pemetrexed), 5-플루오르우라실 (5-fluoruracil), 플록스우리딘 (floxuridine), 5-플루오로데옥시우리딘 (5-fluorodeoxyuridine), 카페시타빈 (capecitabine), 사이타라빈 (cytarabine), 플루다라빈 (fludarabine), 사이토신 아리비노사이드 (cytosine arabinoside), 6-머캅토퓨린 (6-mercaptopurine, 6-MP), 넬아라빈 (nelarabine), 6-티오구아닌 (6-TG), 클로로데스옥시아데노신 (chlorodesoxyadenosine), 5-아자사이티딘 (5-azacytidine), 젬시타빈 (gemcitabine), 클라드리빈 (cladribine), 데옥시코포르마이신 (deoxycoformycin), 데가퍼 (tegafur), 펜토스타틴 (pentostatin), 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 발루비신 (valrubicin), 미톡산트론 (mitoxantrone), 닥티노마이신 (dactinomycin), 미트라마이신 (mithramycin), 플리카마이신 (plicamycin), 미토마이신 C (mitomycin C), 블레오마이신 (bleomycin), 프로카바진 (procarbazine), 파크리탁셀 (paclitaxel), 도세탁셀 (docetaxel), 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine), 빈데신 (vindesine), 비노렐빈 (vinorelbine), 토포테칸 (topotecan), 이리노테칸 (irinotecan), 에토포사이드 (etoposide), 발루비신 (valrubicin), 앰루비신 염산 (amrubicin hydrochloride), 피라루비신 (pirarubicin), 엘립티늄 아세테이트 (elliptinium acetate), 조루비신 (zorubicin), 에피루비신 (epirubicin), 이다루비신 (idarubicin) 및 데노포사이드 (teniposide), 라족신 (razoxin), 마리마스타트 (marimastat), 배티마스타트 (batimastat), 프리노마스타트 (prinomastat), 태노마스타트 (tanomastat), 일로마스타트 (ilomastat), CGS-27023A, 할로푸지논 (halofuginon), COL-3, 네오바스태트 (neovastat), 탈리도마이드 (thalidomide), CDC 501, DMXAA, L-651582, 스쿠얼아민 (squalamine), 엔도스타틴 (endostatin), SU5416, SU6668, 인터페론-알파, EMD121974, 인터페론-12, IM862, 안지오스타틴 (angiostatin), 타목시펜 (tamoxifen), 토레미펜 (toremifene), 랄옥시펜 (raloxifene), 드롤로옥시펜 (droloxifene), 이오도옥시펜 (iodoxyfene), 아나스트로졸 (anastrozole), 레트로졸 (letrozole), 엑세메스탄 (exemestane), 플루타마이드 (flutamide), 닐루타마이드 (nilutamide), 스프리로노락톤 (sprironolactone), 사이프로테론 아세테이트 (cyproterone acetate), 피나스테라이드 (finasteride), 시미티딘 (cimitidine), 보르테조미드 (bortezomid), 벨카드 (Velcade), 비칼루타마이드 (bicalutamide), 사이프로테론 (cyproterone), 플루타마이드, 풀베스트란 (fulvestran), 엑세메스탄 (exemestane), 다사티닙 (dasatinib), 에를로티닙 (erlotinib), 제피티닙 (gefitinib), 이마티닙 (imatinib), 라파티닙 (lapatinib), 닐로티닙 (nilotinib), 소라페닙 (sorafenib), 수니티닙 (sunitinib), 레티노이드 (retinoid), 렉시노이드 (rexinoid), 메톡사렌 (methoxsalene), 메틸아미노레불리네이트 (methylaminolevulinate), 알데스루킨 (aldesleukine), OCT-43, 데니루킨 디플리톡스 (denileukin diflitox), 인터루킨-2, 타소너민 (tasonermine), 렌티난 (lentinan), 시조필란 (sizofilan), 로퀴니멕스 (roquinimex), 피도티모드 (pidotimod), 페가데마제 (pegademase), 티모펜틴 (thymopentine), 폴리 I:C, 프로코다졸 (procodazol), 틱 BCG, 코리네박테리움 파붐 (corynebacterium parvum), NOV-002, 유크레인 (ukrain), 레바미졸 (levamisole), 1311-chTNT, H-101, 셀모루킨 (celmoleukin), 인터페론 알파2a, 인터페론 알파2b, 인터페론 감마1a, 인터페론-2, 모베나킨 (mobenakin), 렉신-G (Rexin-G), 테세루킨 (teceleukin), 아크라루비신 (aclarubicin), 액티노마이신 (actinomycin), 아르글라빈 (arglabin), 아스파라지나제 (asparaginase), 카르지노필린 (carzinophilin), 크로모마이신 (chromomycin), 다우노마이신 (daunomycin), 류코보린 (leucovorin), 마소프로콜 (masoprocol), 네오카지노스타틴 (neocarzinostatin), 페프로마이신 (peplomycin), 사코마이신 (sarkomycin), 솔라마르진 (solamargine), 트라벡테딘 (trabectedin), 스트렙토조신 (streptozocin), 테스토스테론 (testosterone), 쿠네카테킨들 (kunecatechins), 시네카테킨들 (sinecatechins), 알리트레티노인 (alitretinoin), 벨로테칸 염산 (belotecan hydrocholoride), 칼루스테론 (calusterone), 드로모스타놀론 (dromostanolone), 엘립티늄 아세테이트, 에티닐 에스트라디올, 플루옥시메스테론 (fluoxymesterone), 포르메스탄 (formestane), 포스페트롤 (fosfetrol), 고세렐린 아세테이트 (goserelin acetate), 헥실 아미노레불리네이트, 히스트렐린 (histrelin), 하이드록시프로게스테론, 이자베필론 (ixabepilone), 류프로라이드 (leuprolide), 메드로옥시프로게스테론 아세테이트 (medroxyprogesterone acetate), 메게스테롤 아세테이트 (megesterol acetate), 메틸프레드니졸론 (methylprednisolone), 메틸테스토스테론, 밀테포신 (miltefosine), 미토브로니톨 (mitobronitol), 나드롤론 페닐프로피오네이트 (nadrolone phenylpropionate), 노르에틴드론 아세테이트 (norethindrone acetate), 프레드니졸론, 프레드니존 (prednisone), 템시롤리무스 (temsirrolimus), 테스토락톤 (testolactone), 트리암코놀론 (triamconolone), 트리프토렐린 (triptorelin), 바프레오타이드 아세테이트 (vapreotide acetate), 지노스타틴 (zinostatin), 스티말라머 (stimalamer), 아마크린 (amsacrine), 비소 트리옥사이드, 비산트렌 염산 (bisantrene hydrochloride), 클로르암부실 (chlorambucil), 클로르트리아니센 (chlortrianisene), 시스-디아민디클로로백금, 사이클로포스파마이드, 디에틸스틸베스트롤 (diethylstilbestrol), 헥사메틸멜라민 (hexamethylmelamine), 하이드록시우레아, 레나리도마이드 (lenalidomide), 로니다민 (lonidamine), 메클로르에타민 (mechlorethanamine), 미토탄 (mitotane), 네다프라틴 (nedaplatin), 니머스틴 염산 (nimustine hydrochloride), 파미드로네이트 (pamidronate), 피포브로만 (pipobroman), 소듐 포르피머 (porfimer sodium), 라니머스틴 (ranimustine), 라족산 (razoxane), 세머스틴 (semustine), 소부족산 (sobuzoxane), 메실레이트 (mesylate), 트리에틸렌멜라민, 졸레드론산 (zoledronic acid), 카모스타트 메실레이트 (camostat mesylate), 파드로졸 HCl (fadrozole HCl), 나폭시딘 (nafoxidine), 아미노글루테티마이드 (aminoglutethimide), 카르모퍼 (carmofur), 클로파라빈 (clofarabine), 사이토신 아라비노사이드, 데시타빈 (decitabine), 독시플루리딘 (doxifluridine), 에노시타빈 (enocitabine), 플루다라빈 포스페이트 (fludarabne phosphate), 플루오로우라실, 프로라퍼 (ftorafur), 우라실 머스타드, 아바렐릭스 (abarelix), 벡사로텐 (bexarotene), 랄티터르세드 (raltiterxed), 타미바로텐 (tamibarotene), 테모졸로마이드 (temozolomide), 보리노스타트 (vorinostat), 메가스트롤 (megastrol), 디소듐 클로드로네이트 (clodronate disodium), 레바미졸 (levamisole), 페로목시톨 (ferumoxytol), 철 이소말토사이드 (iron isomaltoside), 셀레콕시브 (celecoxib), 이부디라스트 (ibudilast), 벤다머스틴 (bendamustine), 알트레타민 (altretamine), 미토락톨 (mitolactol), 템시롤리무스 (temsirolimus), 프랄라트레세이트 (pralatrexate), TS-1, 데시타빈, 비칼루타마이드 (bicalutamide), 플루타마이드 (flutamide), 레트로졸 (letrozole), 디소듐 클로드로네이트, 데가렐릭스 (degarelix), 토레미펜 시트레이트 (toremifene citrate), 히스타민 이염산, DW-166HC, 니트라크린 (nitracrine), 데시타빈, 이리노테칸 염산 (irinoteacn hydrochloride), 암사크린 (amsacrine), 로미뎁신 (romidepsin), 트레티오닌 (tretinoin), 카바지탁셀 (cabazitaxel), 반데타니브 (vandetanib), 레나리도마이드 (lenalidomide), 이바드론산, 밀테포신, 비테스펜 (vitespen), 미파머타이드 (mifamurtide), 나드로파린 (nadroparin), 그라니세트론 (granisetron), 온단세트론 (ondansetron), 트로피세트론 (tropisetron), 알리자프라이드 (alizapride), 라모세트론 (ramosetron), 도라세트론 메실레이트 (dolasetron mesilate), 포사프레피탄트 디메글루민 (fosaprepitant dimeglumine), 나빌론 (nabilone), 아프레피탄트 (aprepitant), 드로나비놀 (dronabinol), TY-10721, 리수라이드 수소 말레이트 (lisuride hydrogen maleate), 에피세람 (epiceram), 데피브로타이드 (defibrotide), 다비가트란 에텍시레이트 (dabigatran etexilate), 필그라스팀 (filgrastim), 페그필그라스팀 (pegfilgrastim), 레디턱스 (reditux), 에포에틴 (epoetin), 몰그라모스팀 (molgramostim), 오프렐베킨 (oprelvekin), 시풀루셀-T (sipuleucel-T), M-Vax, 아세틸 L-카르니틴, 도네페질 염산 (donepezil hydrochloride), 5-아미노레불린산 (5-aminolevulinic acid), 메틸 아미노레불리네이트, 세트로레릭스 아세테이트 (cetrorelix acetate), 이코덱스트린 (icodextrin), 류프로렐린 (leuprorelin), 메트빌페니데이트 (metbylphenidate), 옥트레오타이드 (octreotide), 암렉사녹스 (amlexanox), 플레리자포 (plerixafor), 메나테트레논 (menatetrenone), 아네톨 (anethole) 디테오레티온 (dithiolethione), 독셀칼시페롤 (doxercalciferol), 시나칼셋 염산 (cinacalcet hydrochloride), 아레파셉트 (alefacept), 로미플로스팀 (romiplostim), 티모글로불린 (thymoglobulin), 티말파신 (thymalfasin), 유베니멕스 (ubenimex), 이미퀴노드 (imiquimod), 에베롤리무스 (everolimus), 시롤리무스 (sirolimus), H-101, 라소폭시펜 (lasofoxifene), 트리로스탄 (trilostane), 인카드로네이트 (incadronate), 갱글리오사이드들 (ganglioside), 페가프티닙 옥타소듐 (pegaptanib octasodium), 버토포린 (vertoporfin), 미노드론산 (minodronic acid), 졸레드론산 (zoledronic acid), 갈륨 니트레이트, 소듐 아렌드로네이트 (alendronate sodium), 에티드로네이트 디소듐 (etidronate disodium), 디소듐 파미드로네이트 (disodium pamidronate), 듀타스테라이드 (dutasteride), 소듐 스티보글루코네이트 (sodium stibogluconate), 아르모다피닐 (armodafinil), 덱스라족산 (dexrazoxane), 아미포스틴 (amifostine), WF-10, 테모포르핀 (temoporfin), 다르베포에틴 알파 (darbepoetin alfa), 안세스팀 (ancestim), 사그라모스팀 (sargramostim), 팔리페민 (palifermin), R-744, 네피더민 (nepidermin), 오프렐베킨 (oprelvekin), 데니루킨 디프티톡스 (denileukin diftitox), 크리산타스파제 (crisantaspase), 부세렐린 (buserelin), 데스로렐린 (deslorelin), 란레오타이드 (lanreotide), 옥트레오타이드 (octreotide), 필로카르핀 (pilocarpine), 보센탄 (bosentan), 칼리쉐아미신 (calicheamicin), 메이탄시노이드들 (maytansinoid) 및 시클로니케이트 (ciclonicate).
또 다른 구현예에서, 면역결합체는 적어도 하나의 방사성 동위원소와 결합된 항체로 구성된다. 이러한 면역결합체는 항체-방사성 동위원소 결합체 (또는 "ARC")라고 언급된다.
종양의 선택적 파괴를 위해, 항체는 높은 방사성 원소를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소들이, 이에 제한되는 것은 아니지만 At211, C13, N15, O17, Fl19, I123, I131, I125, In111, Y90, Re186, Re188, Sm153, tc99m, Bi212, P32, Pb212, Lu, 가도리늄, 망간 또는 철의 방사성 동위원소들과 같이 ARC의 생산에 사용가능하다.
당업자에게 숙지되어 있는 임의의 방법들 또는 공정들이 ARC에서 이러한 방사성 동위원소를 도입하는 데 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111가 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. Y90는 라이신 잔기를 통해 부착될 수 있다. I123는 IODOGEN 방법을 사용하여 부착될 수 있다.
티오우레아 링커-킬레이팅제에 의해 결합된 항-CD20 단일클론 항체 및 In111 또는 Y90 방사성 동위원소로 구성되는 ARC인 제발린® (Zevalin®); 또는 칼리쉐아미신과 연결된 항-CD33 항체로 구성되는 마일로타르그® (Mylotarg®)과 같은 여러 예들이 ARC 기술분야에서 당업자의 지식을 설명하도록 언급될 수 있다 (미국 특허 제 4,970,198호; 제 5,079,233호; 제 5,585,089호; 제 5,606,040호; 제 5,693,762호; 제 5,739,116호; 제 5,767,285호; 제 5,773,001호). 보다 최근에는, FDA에 의해 호지킨 림프종의 치료에 최근 승인되었던 아드세트리스 (Adcetris) (브렌투시마브 베도틴 (Brentuximab vedotin)에 해당함)라고 명명된 ADC도 역시 언급될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 면역결합체는 적어도 하나의 독소와 연결된 항체로 구성된다. 이러한 면역결합체는 항체-독소 결합체 (또는 "ATC")라고 말한다.
독소들은 살아있는 유기체들에 의해 생산된 효과적이고 특이적인 독물들이다. 그들은 보통 분자량이 이백 (펩타이드들) 및 일십만 (단백질들) 사이 범위로 변화할 수 있는 아미노산 사슬로 구성된다. 그들도 역시 낮은 분자량 유기 화합물들일 수 있다. 독소들은 수많은 유기체들, 예로 박테리아들, 곰팡이들, 조류 및 식물들에 의해 생산된다. 이들 중 많은 것들이 신경 제제들보다 수 배 정도의 독성을 가지며 극도로 유독하다.
ATC에 사용되는 독소들은 이에 제한되는 것은 아니지만, 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라제 저해를 포함하는 기작들에 의해 그들의 세포독성 효과들을 나타낼 수 있는 모든 종류의 독소들을 포함할 수 있다.
효소적으로 활성을 가진, 사용될 수 있는 독소들 및 그들의 단편들은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편들, 엑소톡신 A 사슬 (슈도모나 스 에루기노사로부터 나옴), 라이신 (ricin) A 사슬, 아브린 (abrin) A 사슬, 모데신 (modeccin) A 사슬, 알파-사르신 (alpha-sarcin), 알류라이트 포르디 (Aleurites fordii) 단백질들, 디안틴 (dianthin) 단백질들, 파이토라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질들 (PAPI, PAPⅡ, 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아 (momordica charantia) 저해제, 쿠르신 (curcin), 크로틴 (crotin), 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 저해제, 젤로닌 (gelonin), 미토젤린 (mitogellin), 레스트릭토신 (restrictocin), 페노마이신 (phenomycin), 에노마이신 (enomycin), 및 트리코테센들 (tricothecene)을 포함한다.
돌라스타틴들 (dolastatin), 아우리스타틴들 (auristatin), 트리코테센, 및 CC1065과 같은 소분자 독소들, 및 독소 활성을 가지는 이들 독소들의 유도체들도 역시 본 명세서에서 고려된다. 돌라스타틴들 및 아우리스타틴들은 미세소관 (microtubule) 동력학, GTP 가수분해, 그리고 핵 및 세포 분열에 개입하는 것으로 관찰되어 왔고 항암 및 항진균 활성을 가진다.
"링커 (linker)", "링커 단위 (linker unit)", 또는 "링크 (link)"는 결합 단백질을 적어도 하나의 세포독성 제제와 공유적으로 부착하는 공유 결합 또는 원자들의 사슬을 포함하는 화학적 분체를 의미한다.
링커들은 N-숙시니미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 숙시니미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC), 이미노티오레인 (IT), 이미도에스테르들의 이중기능적 유도체들 (디메틸 아디피미데이트 HCl와 같음), 활성을 가진 에스테르들 (디숙시니미딜 수베레이트와 같음), 알데하이드들 (글루타르알데하이드와 같음), 비스-아지도 화합물들 (비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민과 같음), 비스-디아조니움 유도체들 (비스-(p-디아조니움벤조일)-에틸렌디아민와 같음), 디이소시아네이트들 (톨루엔 2,6-디이소시아네이트와 같음), 및 비-활성을 가진 불소 화합물들 (1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠과 같음)과 같은 다양한 이중기능적 단백질 결합 제제들을 사용하여 만들어질 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 테트라아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 어드레싱 시스템으로 세포독성 제제들의 결합을 위한 대표적인 킬레이팅 제제이다. 기타 교차-링커 시약들은 시판되고 있는 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, SVSB (숙시니미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트) (예로, 미국 일리노이주 록포드시, 피어스 바이오테크놀로지사 (Pierce Biotechnology, Inc)로부터 나옴)일 수 있다.
링커는 "절단 불가능" 또는 "절단가능"할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 이것은 세포에서 세포독성 제제의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"로 구성된다. 예를 들면, 산-불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정 링커, 디메틸 링커 또는 디설파이드-포함 링커가 사용될 수 있다. 링커는, 바람직한 구현예에서, 링커의 절단이 세포내 환경에서 세포독성 제제를 결합 단백질로부터 방출하도록 세포내 조건들 하에서 절단가능하다.
예를 들면, 일정 구현예들에서, 링커는 세포내 환경에 (예로, 리소좀 또는 엔도좀 또는 함몰 소포 (caveolea) 내에) 존재하는 절단화 제제에 의해 절단가능하다. 링커는 예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니지만 리소좀 또는 엔도좀 프로테아제를 포함하는 세포내 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있다. 전형적으로, 펩티딜 링커는 적어도 2개 아미노산들 길이 또는 적어도 3개 아미노산들의 길이이다. 절단 제제들은 카텝신 B 및 D 그리고 플라스민을 포함할 수 있고, 이들 모두는 디펩타이드 약물을 가수분해하여 표적 세포들 내부에 활성을 가진 약물의 방출을 유도하는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 암성 조직에서 높게 발현되는 티올-의존성 프로테아제 카텝신-B에 의해 절단가능한 펩티딜 링커가 사용될 수 있다 (예로, Phe-Leu 또는 Gly-Phe-Leu-Gly 링커). 상세한 구현예들에서, 세포내 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티딜 링커는 Val-Cit 링커 또는 Phe-Lys 링커이다. 세포독성 제제의 세포내 단백질분해성 방출을 사용하는 한 가지 장점은 제제가 전형적으로 결합될 때 약화되고 결합체의 혈청 안정성들이 전형적으로 높은 것이다.
다른 구현예들에서, 절단가능한 링커는 pH-민감하고, 예로 소정의 pH 수치들에서 가수분해에 대해 민감하다. 전형적으로, pH-민감성 링커는 산성 조건들 하에서 가수분해가능하다. 예를 들면, 리소좀에서 가수분해가능한 산-불안정 링커 (예로, 하이드라존, 세미카바존, 티오세미카바존, 시스-아콘니틱 아마이드, 오소에스테르, 아세탈, 케탈 등)이 사용될 수 있다. 이러한 링커들은 혈액에서의 조건들과 같은 중성의 pH 조건들 하에서 비교적 안정하지만, pH 5.5 또는 5.0 미만인 대략적인 리소좀의 pH에서는 불안정하다. 소정의 구현예들에서, 가수분해가능한 링커는 티오에테르 링커 (예로, 아실하이드라존 결합을 통해 치료제와 부착된 티오에테르와 같음)이다.
또한 다른 구현예에서, 링커는 환원화 조건들 하에서 절단가능하다 (예로, 디설파이드 링커). 다양한 디설파이드 링커들이, 예를 들면 SATA (N-숙시니미딜-S-아세틸티오아세테이트), SPDP (N-숙시니미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트), SPDB (N-숙시니미딜-3-(2-피리딜디티오)부틸레이트, SMPT (N-숙시니미딜-옥시카르보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)톨루엔)-, SPDB 및 SMPT를 사용하여 형성될 수 있는 것들을 포함하여 당해 기술분야에 알려져 있다.
절단불가능 또는 "환원불가능" 링커들의 비제한적인 예로서, 트라스투주마브를 연결된 화학요법제, 메이탄신 (maytansine)과 조합하는 면역결합체 트라스투주마브-DM1 (TDM1)이 언급될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 면역결합체는 이에 제한되는 것은 아니지만, i) 세포독성 제제와의 반응에 이어지는 이가의 링커 시약과 항체의 핵친화성 기의 반응, 또는 ii) 항체의 핵친화성 기와의 반응으로 이어지는 이가의 링커 시약과 세포독성 제제의 핵친화성 기의 반응과 같이 당업자에게 숙지되어 있는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.
항체 상의 핵친화성 기들로는 이에 제한되는 것은 아니지만, N-말단 아민기들, 측쇄 아민기들 예로 라이신, 측쇄 티올기들, 및 항원 결합 단백질이 글리코실화될 때 당 하이드록시 또는 아미노기들을 포함한다. 아민, 티올, 및 하이드록시 기들은 핵친화적이고, 이에 제한되는 것은 아니지만 NHS 에스테르들, HOBt 에스테르들, 할로포르메이트들, 및 산 할로겐화물과 같은 활성 에스테르들; 할로아세트아마이드들과 같은 알킬 및 벤질 할로겐화물들; 알데하이드들, 케톤들, 카르복실, 및 말레이미드 기들을 포함하는, 링커 분체들 및 링커 시약들 상의 핵친화성 기들과 공유 결합들을 형성하도록 반응할 수 있다. 항체는 환원가능한 사슬간 디설파이드들, 예로 시스테인 결합들을 가질 수 있다. 항체들은 DTT (디티오트레이톨)과 같은 환원제로의 처리에 의해 링커 시약들과 결합을 위해 반응성이 될 수 있다. 각각의 시스테인 결합은 따라서 이론적으로는 2개의 반응성 티올 핵친화기들을 형성할 것이다. 추가적인 핵친화성 기들이 당업자에게 숙지되어 있는 임의의 반응을 통하여 항체 내로 도입될 수 있다. 비제한적인 예로서, 반응성 티올기들이 하나 이상의 시스테인 잔기들을 도입하여 항체 내로 도입될 수 있다.
면역결합체들은 또한 핵친화성 분체들을 도입하도록 항체의 변형에 의해 생산될 수 있고, 분체들은 링커 시약 또는 세포독성 제제 상의 핵친화성 치환기들과 반응할 수 있다. 글리코실화된 항체의 당들은 산화되어 링커 시약들 또는 세포독성 제제의 아민기와 반응할 수 있는 알데하이드 또는 케톤기들을 형성할 수 있다. 결과로 나온 이민 쉬프 (Schiff) 염기 기들은 안정한 결합을 형성할 수 있거나, 안정한 아민 결합들을 형성하도록 환원될 수 있다. 한 가지 구현예에서, 갈락토스 옥시다제 또는 소듐 메타-페리오데이트 둘 중 하나와 글리코실화된 항체의 탄수화물 부분의 반응은 약물 상의 적당한 기들과 반응할 수 있는 단백질의 카르보닐 (알데하이드 및 케톤) 기들을 수득할 수 있다. 또 다른 구현예에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기들을 포함하는 항체들은 소듐 메타-페리오데이트와 반응하여, 첫 번째 아미노산 대신에 알데하이드의 생산의 결과를 가져올 수 있다.
소정의 바람직한 구현예들에서, 링커 단위는 다음의 일반 공식을 가질 수 있다:
Figure 112016110224135-pct00013
여기에서:
- T-는 연장인자 (stretcher) 단위이고;
a는 0 또는 1이고;
- W-는 아미노산 단위이고;
w는 독립적으로 1부터 12까지 범위의 정수이고;
- Y-는 스페이서 (spacer) 단위이고;
y는 0, 1 또는 2이다.
연장인자 단위 (-T-)는 존재 시 항체를 아미노산 단위 (-W-)와 연결시킨다. 항체 상에 존재할 수 있는 유용한 기능 기들은 자연적으로 또는 화학적 조작을 통해, 설프하이드릴, 아미노, 하이드록실, 탄수화물의 아노머 하이드록실 기, 및 카르복실을 포함한다. 적합한 기능 기들은 설프하이드릴 및 아미노이다. 설프하이드릴 기들은 존재 시 항체의 분자내 디설파이드 결합들의 환원에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 설프하이드릴 기들은 2-이미노티올레인 또는 다른 설프하이드릴을 생성하는 시약들과 항체의 라이신 분체의 아미노 기의 반응에 의해 생성될 수 있다. 상세한 구현예들에서, 항체는 재조합 항체이고 하나 이상의 라이신들을 보유하도록 조작된다. 더욱 바람직하게, 항체는 하나 이상의 시스테인들 (참고로 티오 Mab들)을 보유하도록 조작될 수 있다.
소정의 상세한 구현예들에서, 연장인자 단위는 항체의 황 원자와 결합을 형성한다. 황 원자는 환원된 항체의 설프하이드릴 (-SH) 기로부터 유래될 수 있다.
소정의 다른 상세한 구현예들에서, 연장인자 단위는 항체의 황 원자 및 연장인자 단위의 황 원자 간의 디설파이드 결합을 통해 항체와 결합된다.
다른 상세한 구현예들에서, 연장인자의 반응기는 항체의 아미노기와 반응할 수 있는 반응성 부위를 포함한다. 아미노기는 아르기닌 또는 라이신의 아미노기일 수 있다. 적합한 아민 반응성 부위들은 이에 제한되는 것은 아니지만, 숙시니마이드 에스테르들, 4-니트로페닐 에스테르들, 펜타플루오로페닐 에스테르들, 무수물들, 산 염화물들, 설포닐 염화물들, 이소시아네이트들 및 이소티오시아네이트들과 같은 활성화된 에스테르들을 포함한다.
보다 또 다른 관점에서, 연장인자의 반응성 기능은 항체 상에 존재할 수 있는 변형된 탄수화물 기와 반응하는 반응성 부위를 포함한다. 상세한 구현예에서, 항체는 탄수화물 분체를 제공하도록 효소적으로 글리코실화된다. 탄수화물은 소듐 페리오데이트와 같은 시약으로 온화하게 산화될 수 있고, 결과로 나온 산화된 탄수화물의 카르보닐 단위는 하이드라자이드, 옥심, 반응성 아민, 하이드라진, 티오세미카바자이드, 하이드라진 카르복실레이트, 또는 아릴하이드라자이드와 같은 기능성을 포함하는 연장인자와 응축될 수 있다.
아미노산 단위 (-W-)는 스페이서가 존재하는 경우라면 연장인자 단위 (-T-)를 스페이서 단위 (-Y-)와 결합시키고, 스페이서가 부재하는 경우라면 연장인자를 세포독성 제제와 결합시킨다.
상기에 언급된 바와 같이, -Ww-는 디펩타이드, 트리펩타이드, 테트라펩타이드, 펜타펩타이드, 헥사펩타이드, 헵타펩타이드, 옥타펩타이드, 노나펩타이드, 데카펩타이드, 운데카펩타이드 또는 도데카펩타이드 단위일 수 있다.
일정 구현예들에서, 아미노산 단위는 이에 제한되는 것은 아니지만, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 아세틸 또는 포르밀로 보호된 라이신, 아르기닌, 토실 또는 니트로 기들로 보호된 아르기닌, 히스티딘, 오르니틴, 아세틸 또는 포르밀로 보호된 오르니틴 및 시트룰린과 같은 아미노산 잔기들을 포함할 수 있다. 대표적인 아미노산 링커 성분들은 바람직하게 디펩타이드, 트리펩타이드, 테트라펩타이드 또는 펜타펩타이드를 포함한다.
대표적인 디펩타이드들은 다음을 포함한다: Val-Cit, Ala-Val, Lys-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala-Phe, Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-니트로-Arg.
대표적인 트리펩타이드들은 다음을 포함한다: Val-Ala-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Phe-Phe-Lys, Gly-Gly-Gly, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys.
대표적인 테트라펩타이드는 다음을 포함한다: Gly-Phe-Leu-Gly (서열번호 33), Ala-Leu-Ala-Leu (서열번호 54).
대표적인 펜타펩타이드는 다음을 포함한다: Pro-Val-Gly-Val-Val (서열번호 55).
아미노산 링커 성분을 포함하는 아미노산 잔기들은 자연적으로 발생하는 것들, 뿐만 아니라 시트룰린과 같은 소수의 아미노산들 및 비-자연적으로 발생하는 아미노산 유사체들을 포함한다. 아미노산 링커 성분들은 특정한 효소, 예를 들면 종양-연관된 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단을 위한 그들의 선택도 (selectivity)로 설계되고 최적화될 수 있다.
링커의 아미노산 단위는 이에 제한되는 것은 아니지만, 종양-연관된 프로테아제를 포함하는 효소에 의해 세포독성 제제를 방출하도록 효소적으로 절단될 수 있다.
아미노산 단위는 특정한 종양-연관된 프로테아제에 의한 효소적 절단을 위한 선택도에서 설계되고 최적화될 수 있다. 적합한 단위들은 절단이 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민에 의해 촉매화되는 것들이다.
스페이서 단위 (-Y-)는 존재 시 아미노산 단위를 세포독성 제제와 결합시킨다. 스페이서 단위들은 2가지 일반적인 유형을 가진다: 자가-희생 (self-immolative) 및 비자가-희생. 비자가-희생적 스페이서는 스페이서 단위의 일부 또는 전부가 면역결합체로부터 아미노산 단위의 효소적 절단 이후에도 세포독성 제제와 결합되어 남아있는 것이다. 비자가-희생적 스페이서 단위의 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만, (글리신-글리신) 스페이서 단위 및 글리신 스페이서 단위를 포함한다. 세포독성 제제를 방출하기 위하여, 독립적인 가수분해 반응이 글리신-약물 단위 결합을 절단하도록 표적 세포 내에서 일어나야 한다.
또 다른 구현예에서, 비자가-희생적 스페이서 단위 (-Y-)는 -Gly-이다.
한 가지 구현예에서, 면역결합체는 스페이서 단위 (y = 0)가 결여된다. 대안적으로, 자가-희생적 스페이서 단위를 포함하는 면역결합체는 별도의 가수분해 단계를 필요로 하지 않고도 세포독성 제제를 방출할 수 있다. 이들 구현예들에서, -Y-는 PAB 기의 질소 원자를 통해 -Ww-와 결합되고 카보네이트, 카바메이트 또는 에테르 기를 통해 -D와 직접적으로 연결된 p-아미노벤질 알코올 (PAB)이다.
자가-희생적 스페이서들의 다른 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체들 및 오소 또는 파라-아미노벤질아세탈들과 같은 PAB 기와 전자적으로 동등한 방향족 화합물들을 포함한다. 아마이드 결합 가수분해 시 용이한 고리화를 거치는 스페이서들이 치환 및 미치환된 4-아미노부틸산 아마이드들, 적당하게 치환된 이중고리[2.2.1] 및 이중고리[2.2.2] 고리 시스템들 및 2-아미노페닐프로피온산 아마이드들과 같이 사용될 수 있다.
대안의 구현예에서, 스페이서 단위는 분지된 비스(하이드록시메틸)스티렌 (BHMS) 단위이고, 이는 추가적인 세포독성 제제들을 도입하는 데 사용될 수 있다.
약물-항체 비율 (DAR)이라도 역시 약칭되는 약물 부하 (drug loading)는 세포 결합 제제 당 PBD 약물들의 평균 수이다.
항체 IgG1 이소형의 경우, 약물들이 부분적인 항체 환원 이후에 시스테인들과 결합하는 곳에서, 약물 부하는 항체 당 1개부터 8개까지의 약물 (D)의 범위를 가질 수 있고, 예로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 및 8개의 약물 분체들이 항체와 공유적으로 부착된다.
항체 IgG2 이소형의 경우, 약물들이 부분적인 항체 환원 이후에 시스테인들과 결합하는 곳에서, 약물 부하는 항체 당 1개부터 12개까지의 약물 (D)의 범위를 가질 수 있고, 예로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 및 12개의 약물 분체들이 항체와 공유적으로 부착된다.
ADC의 조성물들은 1개부터 8개까지 또는 1개부터 12개까지 범위의 약물들과 결합된 세포 결합 제제들, 예로 항체들의 집합들을 포함한다.
약물들이 라이신들과 결합되는 곳에서, 약물 부하는 40개, 20개, 10개 또는 8개까지의 상부 한계가 바람직할 수 있더라도, 세포 항체 당 1개부터 80개의 약물들 (D)의 범위를 가질 수 있다. ADC의 조성물들은 1개부터 80개까지, 1개부터 40개까지, 1개부터 20개까지, 1개부터 10개까지 또는 1개부터 8개까지 범위의 약물들과 결합된 세포 결합 제제들, 예로 항체들의 집합들을 포함한다.
결합 반응들로부터 얻은 ADC 조제물들에서 항체 당 약물들의 평균 수는 통상적인 수단으로 특징이 분석될 수 수 있다. 약물 비율의 견지에서 ADC의 정량적인 분포도 역시 결정될 수 있다. 일정 항체-약물 결합체들의 경우, 약물 비율은 항체 상의 부착 부위들의 수에 의해 제한될 수 있다. 예를 들면, 항체는 하나 또는 여럿의 시스테인 티올 기들을 가질 수 있거나 이를 통해 링커가 부착될 수 있는 충분히 반응성을 가지는 하나 또는 여럿의 시스테인 티올 기들을 가질 수 있다. 더 높은 약물 부하는, 예로 약물 비율 > 5, 소정의 항체-약물 결합체들의 응집, 불용성, 독성, 또는 세포 투과성의 소실을 초래할 수 있다.
소정의 항체들은 환원 가능한 사슬간 디설파이드들, 예로 시스테인 결합들을 가진다. 항체들은 DTT (디티오트레이톨)와 같은 환원화 제제로의 처리에 의해 링커 시약들과의 결합을 위한 반응성이 만들어질 수 있다. 각각의 시스테인 결합들이 이에 따라 이론적으로 두 가지 반응성 티올 핵친화기들을 형성할 것이다. 추가적인 핵친화성 기들이 2-이미노티올란 (트라우트 시약)과 라이신들의 반응을 통하여 항체들 내로 도입될 수 있고 아민의 티올로 전환의 결과를 가져온다. 반응성 티올 기들은 1개, 2개, 3개 또는 4개 이상의 시스테인 잔기들을 조작하여 (예로, 하나 이성의 가공된 (non-native) 시스테인 아미노산 잔기들을 포함하는 돌연변이 항체들을 제조하여) 항체 (또는 그의 단편) 내로 도입될 수 있다. 미국 특허 제 US 7521541호는 반응성 시스테인 아미노산들의 도입에 의해 항체들을 조작하는 것을 제시한다.
시스테인 아미노산들은 항체에서 반응성 부위들에서 조작될 수 있고, 이는 사슬내 또는 분자간 디설파이드 결합들을 형성하지 않는다 (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8): 925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13): 2721-2729; 미국 특허 제 US 7521541호; 제 US 7723485호; 국제특허출원 제 20 09/052249호). 조작된 시스테인 티올들은 말레이미드 또는 알파-할로 아마이드들과 같은 티올-반응성 핵친화성 기들을 가지는 본 발명의 링커 시약들 또는 약물-링커 시약들과 반응하여 시스테인 조작된 항체들 및 PBD 약물 분체를 가진 ADC를 형성한다. 약물 분체의 위치는 이에 따라 설계되고, 통제되고, 알려질 수 있다. 약물 부하는 조작된 시스테인 티올 기들이 전형적으로 티올-반응성 링커 시약들 또는 약물-링커 시약들과 높은 수율로 반응하기 때문에 통제될 수 있다. 중쇄 또는 경쇄 상의 단일 부위에서 치환에 의해 시스테인 아미노산을 도입하도록 IgG 항체를 조작하는 것은 대칭적인 항체 상에 두 개의 새로운 시스테인들을 준다. 2 근처의 약물 부하는 결합 산물 ADC의 근접 균질도로 달성될 수 있다.
또한, 본 발명은 약제로서 사용되는, 상기에 기술된 면역결합체 또는 항체-약물 결합체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 암의 치료에 사용되는, 상기에 기술된 면역결합체 또는 항체-약물 결합체에 관한 것이다.
본 발명은 약제로서 사용되는, 상기에 기술된 항체-약물 결합체에 관한 것이다. 상세한 구현예에서, 본 발명은 암의 치료에 사용되는, 상기에 기술된 항체-약물 결합체에도 관한 것이다. 보다 상세한 구현예에서, 본 발명은 IGF-1R을 발현하는 암 또는 IGF-1R과 관련된 암들의 치료에 사용되는, 상기에 기술된 항체-약물 결합체에 관한 것이다.
IGF-1R과 관련된 암들은 그들의 표면에서 IGF-1R의 전부 또는 일부를 발현하거나 과다-발현하는 종양 세포들을 포함한다.
보다 상세하게, 상기 암들은 유방암, 결장암, 식도암, 간세포암, 위암, 신경아교종, 폐암, 흑색세포종, 골육종, 난소암, 전립선암, 횡문근육종, 신장암, 갑상샘암, 자궁내막암 및 임의의 약물 저항성 현상들이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 IGF-1R을 발현하는 암의 치료에 사용되는 본 발명에 따른 항체-약물 결합체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 항체, 또는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 항체-약물 결합체, 또는 면역결합체를 포함하는 약제학적 조성물이다.
보다 상세하게, 본 발명은 본 발명에 따른 항체, 또는 본 명세서에서 기술된 항체-약물 결합체, 또는 면역결합체 및 적어도 하나의 부형제 및/또는 약제학적으로 허용가능한 운반체를 포함하는, 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 기술된 항체, 또는 항체-약물 결합체, 및 적어도 하나의 부형제 및/또는 약제학적으로 허용가능한 운반체를 포함하는, 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상세한 설명에서, 용어 표현 "약제학적으로 허용가능한 운반체" 또는 "부형제"는 이차 반응들을 유발하지 않고, 예를 들면 활성을 가진 화합물(들)의 투여의 용이화, 신체에서 그의 수명에서 및/또는 효능에서 증가, 용액에서 그의 용해도의 증가 또는 이외에도 그의 보존에서 개선을 허용하는, 약제학적 조성물 내로 진입하는 화합물 또는 화합물들의 조합을 가리키도록 의도된다. 이들 약제학적으로 허용가능한 운반체들 및 부형제들은 잘 숙지되어 있고, 선택된 활성을 가진 화합물(들)의 특성의 기능 및 투여의 방식으로서 당업자에 의해 적응될 것이다.
바람직하게, 이들 면역결합체들은 전신적 경로에 의해, 상세하게는 정맥내 경로에 의해, 근육내, 피부내, 복강내 또는 피하 경로에 의해, 또는 경구적 경로에 의해 투여될 것이다. 더욱 바람직한 방식으로, 면역결합체들을 포함하는 조성물은 연속적 방식으로 여러 번 투여될 것이다.
그들의 투여의 방식들, 용량들 및 최적의 약제학적 형태들은, 예를 들면 환자의 연령 또는 체중, 그/그녀의 일반 병태의 중증도, 치료에 대한 내성 및 주목된 부작용들과 같은 일반적으로 환자에게 적응된 치료의 확립에서 고려되는 판정기준들에 따라 결정될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 암의 치료에 사용되는, 본 발명에 따른 항체, 또는 상기에 기술된 항체-약물 결합체, 또는 면역결합체 및 적어도 하나의 부형제 및/또는 약제학적으로 허용가능한 운반체를 포함하는, 약제학적 조성물에 관한 것이다. 보다 상세한 관점에서, 본 발명은 IGF-1R을 발현하는 암의 치료에 사용되는, 본 발명에 따른 항체, 또는 상기에 기술된 항체-약물 결합체, 또는 면역결합체 및 적어도 하나의 부형제 및/또는 약제학적으로 허용가능한 운반체를 포함하는, 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 개체에서 암의 치료, 보다 상세하게는 IGF-1R을 발현하는 암의 치료 방법으로서, 적어도 본 발명에 따른 항체-약물 결합체의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 개체에서 암의 치료, 보다 상세하게는 IGF-1R을 발현하는 암의 치료 방법으로서, 적어도 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 개체에서 IGF-1R을 발현하는 암 세포로 약물 또는 약제를 전달하는 방법으로서, 적어도 본 발명에 따른 항체-약물 결합체 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 특징들 및 장점들은 실시예들 및 하기에 간단한 설명이 주어진 도면들과 함께 상세한 설명과 계속하여 기술된다.
도 1은 항-His-태그 항체에 의해 포집된 hIGF-1R ECD 상에서 3가지 항체들로 획득된 비아코아 결합 프로파일의 예를 나타낸 것이다.
도 2는 5가지의 정의된 에피토프 그룹들을 가지는 15가지의 항-hIGF-1R 단일클론 항체들의 패널로부터 정의된 에피토프 맵핑 설계를 나타낸 것이다.
도 3a 내지 3c는 FACS 분석들에 의해 인간 미가공 IGF-1R과 항체의 결합을 나타낸 것이다. 도 3a는 MCF-7 세포주에서 각각의 에피토프 군집화 그룹을 대표하는 하나의 키메라 항-IGF-1R Ab의 역가측정 곡선을 나타낸다. MFI는 형광 강도의 평균을 나타낸다. 도 3b는 MCF-7 세포주에서 마우스 및 키메라 항-IGF-1R 항체들 둘 다의 EC50을 나타낸다. 도 3c는 MCF-7 세포주에서 키메라 항-IGF-1R 항체의 B최대를 나타낸다.
도 4a 및 4b는 형질전환 대비 미형질전환된 세포들을 사용한 hIGF-1R 인식의 평가를 나타낸 것이다. 도 4a는 IGF-1R+ 세포주에서 각각의 에피토프 군집화 그룹을 대표하는 하나의 키메라 항-IGF-1R Ab의 역가측정 곡선들을 나타낸다. MFI는 형광 강도의 평균을 나타낸다. 도 4b는 IGF-1R- 세포주에서 각각의 에피토프 군집화 그룹을 대표하는 하나의 키메라 항-IGF-1R Ab의 결합을 나타낸다. MFI는 형광 강도의 평균을 나타낸다.
도 5a 및 5b는 형질전환된 세포들을 사용한 Ab들의 hIGF-1R 대비 hIR과 특이도의 평가를 나타낸 것이다. 도 5a는 hIR+ 형질전환된 세포주에서 마우스 항-IGF-1R Ab의 결합을 나타낸다. 도 5b는 IR+ 세포주에서 키메라 항-IGF-1R Ab의 결합을 나타낸다. MFI는 형광 강도의 평균을 나타낸다. 패널 A 및 B에서는 GRO5 (캘바이오켐사)라고 기술된 시판되는 항-hIR 항체가 양성 대조군으로서 도입되었다.
도 6은 IM-9 세포주에서 마우스 항-IGF-1R Ab의 결합을 나타낸 것이다. MFI는 형광 강도의 평균을 나타낸다. GRO5 항-hIR Mab는 양성 대조군으로서 도입되었다.
도 7a, 7b 및 7c은 원숭이 IGF-1R의 인식의 평가를 나타낸 것이다. 도 7a는 COS-7 세포주에서 각각의 에피토프 군집화 그룹을 대표하는 하나의 키메라 항-IGF-1R Ab의 역가측정 곡선들을 나타낸다. MFI는 형광 강도의 평균을 나타낸다. 도 7b는 COS-7 세포주에서 마우스 및 키메라 항-IGF-1R 항체들 둘 다의 EC50을 나타낸다. 도 7c는 hIGF-1R+ 형질전환된 세포들 및 COS-7 둘 다의 세포들에서 키메라 항-IGF-1R 항체들의 EC50을 나타낸다. GR11L (캘바이오켐사)은 양성 대조군으로서 도입되었다.
도 8은 비아코아 (Biacore) 검정법을 사용한 hIGF-1R ECD 또는 머카크 원숭이 IGF-1R ECD 둘 중 하나에서 c208F2 결합의 비교를 나타낸 것이다. 센서그램들은 카르복시메틸 덱스트란 기질에 화학적으로 이식된 11,000 RU 이상의 마우스 항-태그 His 항체로 활성화된 CM5 칩을 사용하여 SRP 기술학 기초한 비아코아 X100으로 획득되었다. 실험은 전개 및 시료 희석 완충액으로서 HBS-EP+를 사용하여 25℃에서 30 μL/분의 유속으로 전개된다. 도면은 분석물들의 첫 번째 주입 시작 시에 X-축 그리고 이러한 첫 번째 주입 직전에 정의된 기저선에 의해 y-축 상에 정렬된 4가지 독립적인 센서그램들의 중복을 보여준다. 재조합 용해성 IGF-1R의 인간 기초한 서열의 포집으로 획득된 센서그램들은 다이아몬드들로 표시된다. 재조합 용해성 IGF-1R의 머카크 원숭이 기초한 서열의 포집으로 획득된 센서그램들은 삼각형들로 표시된다. 흰색 기호들은 공시료 순환들에 해당하고 (전개 완충액의 5번 주입들), 검은색 기호들은 c208F2의 증가하는 농도들 범위 (5, 10, 20, 40 및 80 nM)의 주입에 해당한다.
도 9는 IGF-1과 비교하여 수용체 인산화에 미치는 항-hIGF-1R 항체들의 본질적인 효과의 평가를 나타낸 것이다.
도 10은 마우스 항-hIGF-1R에 의해 IGF-1과 반응한 IGF-1R 인산화의 저해를 나타낸 것이다.
도 11은 항-IGF-1R 항체들의 세포 표면 결합이 37℃에서 저하-조절되는 것을 나타낸 것이다. MCF-7 세포들은 4℃ 또는 37℃에서 4시간 동안 10 μg/mL의 각각의 Ab와 배양되었다. 도면은 △MFI를 나타낸다.
도 12a 및 12b는 항체 표면 붕괴를 나타낸 것이다. 세포 표면 결합 항체는 37℃에서 10, 20, 30, 60 및 120분 이후에 평가되었다. 도 12a는 4℃에서 측정된 신호 강도와 비교하여 잔여 IGF-1R %를 나타낸다. 도 12b는 프리즘 소프트웨어를 사용하고 지수적 붕괴 적정을 사용하는 반감기 계산을 나타낸다.
도 13은 FACS 분석들에 의해 측정된 항체 내재화의 역학을 나타낸 것이다. 세포들은 10 μg/mL의 마우스 Ab들과 37℃에서 0, 30 또는 60분 동안 배양되었다. 세포들은 투과화되는지 여부와 상관없이 이차 항-마우스 IgG-알렉사 488과 배양되었다. 막은 투과화 없는 신호 강도에 해당한다. 전체는 세포 투과화 이후의 신호 강도에 해당하고, 세포질은 내재화된 Ab에 해당한다. 각각의 평가된 항체의 명칭은 각각의 그래프 꼭대기 위에 도시된다.
도 14a 및 14b는 Ab 내재화의 영상화를 나타낸 것이다. 도 14a는 MCF-7 세포들이 m208F2와 4℃에서 20분 동안 배양되었고, 배양 이전에 [a)] 37℃에서 15분 [b)], 30분 [c)] 및 60분 [d)] 동안 세척되었다. 세포들은 고정되고 투과화되었다. m208F2 Ab는 항-마우스 IgG 알렉사 488를 사용하여 시현되었으며, Lamp-1은 토끼 항-Lamp-1 항체 및 이차 항-토끼 IgG 알렉사 555로 시현되었다. 도 14b (파트 Ⅰ내지 Ⅲ)는 MCF-7 세포들이 각각의 테스트될 나머지 항-hIGF-1R 마우스 항체와 37℃에서 30분 동안 배양된 다음 상기에 기술된 바와 같이 염색되었다. 공동정착 (colocalization)은 이미지 J 소프트웨어의 공동정착 하이라이터 플러그-인을 사용하여 확인되었다.
도 15는 항체 분해에서 리소좀 경로의 관여를 나타낸 것이다.
도 16은 서로 다른 pH에서 항-hIG-1R 마우스 항체들의 결합 평가를 나타낸 것이다. 서로 다른 항체들의 결합 EC50들은 pH 5 내지 8 범위의 서로 다른 pH를 가진 완충액을 사용하여 MCF-7에서 평가되었다.
도 17은 Fab-ZAP 검정법 상에서 세포독성을 유도하는 선택된 항-IGF-1R 능력의 평가를 나타낸 것이다. A) MCF-7 세포들은 인간 Fab-ZAP 키트와 조합으로 증가하는 농도들의 키메라 항-IGF-1R 항체들과 배양되었다. 세포 생존도는 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존도 검정법을 사용하여 측정되었다. c9G4 키메라 항체는 부적절한 항체로서 사용되었다. B) A)에 도시된 결과들로부터 얻은 IC50들이다.
도 18은 i) 세포독성 효능, ii) Ab/IGF-1R 결합에 미치는 pH의 효과, iii) IGF-1R의 IGF-1-유도성 인산화에 미치는 Ab들의 효과, 및 iv) 항체 군집화 간의 상관성을 나타낸 것이다.
도 19a 내지 19d는 c208F2 Mab의 첫 번째 인간화 형태의 결합 특징을 나타낸 것이다. hz208F2 VH3/VL3 mAb의 결합 특성들은 인간 세포주 MCF-7 (도 9a), 원숭이 세포주 COS-7 (도 9b) 및 인간 인슐린 수용체를 발현하는 형질전환된 마우스 세포주 (도 19c)에서 평가되었다. 마우스 및 키메라 208F2 mAb들 둘 다의 결합은 동시에 평가되었다. 항-hIR 항체 클론 GRO5가 형질전환된 세포주에서 hIR의 발현을 검증하는 데 사용되었다 (도 19d).
도 20a 및 20d는 IHC 검정법들에 사용되었던 AF305-NA 다중클론 항체의 엘라이자 검증을 나타낸 것이다. 도 20a는 hIGF-1R과 결합, 도 20b는 인간 재조합 IR과 결합을 나타낸다. 형질전환된 세포들에 의해 발현되는 hIR EDC 및 세포 IR은 (도 20d) 이들 hIR 형질전환 세포들 상에서 대조군 Ab GRO5과 비교하여 (도 20c) 전혀 인식되지 않았다.
도 21은 다양한 수준들의 hIGF-1R을 발현하는 이종이식들로부터 얻은 FFPE 절편들 상의 hIGF-1R 염색의 검증을 나타낸 것이다. Hs746T은 음성 대조군으로서 도입되었다.
도 22a 및 22b는 정상 FFPE 조직 절편들에서 hIGF-1R 발현의 평가를 나타낸 것이다. 태반 절편들은 정상 조직들의 양성 대조군으로 사용되었던 한편, 양성 종양 이종이식 조직들은 hIGF-1R 발현을 산정하도록 각각의 진행에 도입되었다.
도 23은 NSCL FFPE 조직 절편들에서 hIGF-1R 발현의 평가를 나타낸 것이다. 분석된 조직의 많은 패널에서 관찰된 강한 염색을 예시하는 4가지 사례들이다.
도 24는 유방암 FFPE 조직 절편들에서 hIGF-1R 발현의 평가를 나타낸 것이다. 분석된 조직의 테스트된 패널에서 관찰된 강한 염색을 예시하는 3가지 사례들이다.
도 25는 다양한 종양들로부터 얻은 FFPE 조직 절편들에서 hIGF-1R 발현의 평가를 나타낸 것이다.
도 26은 전개 완충액으로서 HBS-EP+를 30 μL/분의 유속으로 사용하고, 카르복시메틸 덱스트란 기질에 화학적으로 이식된 약 12,000 RU의 마우스 항-태그 His 단일클론 항체로 둘 다의 플로우셀들 상에 활성화된 CM5 칩을 사용하는 SRP 기술학 기초한 비아코아 X100 장치를 사용하여 온도 25℃에서 획득된 센서그램들의 중복을 나타낸 것이다. 각각의 센서그램들 (첫 번째는 삼각형들로 표시되고 두 번째는 다이아몬드들로 표시됨)은 완전한 순환에 해당한다.
1. 두 번째 플로우셀 상에 재조합 h-IGF-1R (10 μg/mL) 용액의 1분 동안 주입.
2. 첫 번째 센서그램을 위해, 각각 90초 동안 전개 완충액의 5번 주입들,
두 번째 센서그램을 위해, 각각 90초 동안 항-IGF-1R c208F2 항체 용액들의 증가하는 농도들 범위로 5번 주입들.
3. 해리 역학적 속도들의 결정을 위한 300초의 지연.
4. 10 mM 글리신, HCl pH 1.5 완충액의 45초 동안 주입에 의한 표면의 재생.
도 27은 공시료 센서그램 대비 항-IGF-1R c208F2 용액들의 증가하는 농도들 범위로 획득된 센서그램의 차감에 해당하는 센서그램을 나타낸 것이다. 이는 회색으로 표현된다. 이론적인 센서그램은 다음의 변수들을 가진 1 : 1 모델에 해당한다: kon = (1.206 ± 0.036) × 106 M- 1.s-1, koff = (7.81 ± 0.18) × 10-5 s-1, R최대 = 307.6 ± 03. RU는 얇은 검은색 선으로 표현된다. c208F2의 계산된 농도들이 그래프 상에서 보고된다: 최고 농도 (24 nM)만이 상수로서 고려된다.
도 28은 해리 상수들이 각각의 항체의 4번 시험들 진행의 평균에 해당하고, pM 단위로 표현되는 비율: koff/kon x 1012에 해당하는 것을 나타낸 것이다. 오차 막대들은 표준 오차 (n = 4)에 해당한다.
도 29는 반감기들이 각각의 항체의 4번 시험들 진행의 평균에 해당하고, 시간 단위로 표현되는 비율: Ln(2)/koff/3600에 해당하는 것을 나타낸 것이다. 오차 막대들은 표준 오차 (n = 4)에 해당한다.
도 30은 비아코아 X100 장치 상에서 25℃로 30 μL/분의 유속으로 진행하는 실험의 2회 순환에 해당하는 2가지 센서그램들의 중복을 나타낸 것이다.
순환의 첫 번째 단계는 카르복시메틸덱스트란 기질과 그의 아민 기능들에 의해 화학적으로 결합된 10,500 RU 이상의 마우스 항-인간 IgG Fc 단일클론 항체의 이식에 의해 활성화된 CM5 센서칩의 두 번째 플로우셀 상에 10 μg/mL의 농도로 60초 동안 c208F2 항체 용액의 주입에 해당한다. 두 번째 단계는 120초의 지연과 함께 120초 동안 미가공 세포 배지 배양 상청액들의 h-IGF-1R (채운 다이아몬드들) 또는 m-IGF-1R (빈 다이아몬드들) 둘 중 하나의 세포외 도메인의 주입에 해당한다. 이중 화살표들은 본 연구에서 사용된 항체 포집 수준 및 IGF-1R 결합 수준의 척도의 위치들을 표시한다.
도 31은 해당 순환 동안 센서칩의 두 번째 플로우셀 상에서 각각의 키메라 h/m IGF-1R 제작물들을 위해 획득된 IGF-1R 결합 수준 및 포집된 c208F2 수준 간의 비율을 재연하는 막대 그래프들을 나타낸 것이다.
도 32a 및 32b는 pH 5 내지 pH 8에서 hz208F2 H076/L024의 EC50을 보여주는 막대 그래프를 나타낸 것이다. 산성 pH는 인간화 IGF-1R 항체들 hz208F2 H076/L024 (A) 및 hz208F2 (H077/L018 (B)의 결합 능력을 감소시킨다.
도 33은 170 RU의 h-IGF1R의 용해성 버전의 야생형 (검은색 다이아몬드) 또는 120 RU의 이러한 수용체의 돌연변이체 C29 (Asp 491 > Ala) 둘 중 하나에서 Hz208F2 (10 μg/mL)의 결합을 나타낸 것이다. 각각의 수용체는 CM5 센서칩 상에서 그들의 C-말단 66개 His 태그에 의해 포집된다. 실험은 전개 완충액으로서 고전적인 HBS-EP+를 사용하여 비아코아 X100에서 25℃로 30 μL/분의 유속으로 진행된다.
실시예들
본 발명에서 언급된 모든 하이브리도마들은 CNCM (프랑스 파스퇴르 연구소)에 기탁되었고 다음의 표 7에서 확인된다.
Figure 112016110224135-pct00014
실시예 1: IGF -1R 항체들의 생산
인간 IGF-1 수용체 (hIGF-1R)의 인간 세포외 도메인 (ECD)에 대한 마우스 단일클론 항체들 (Mab들)을 생산하기 위하여, 5마리의 BALB/c 마우스들이 10 μg의 rhIGF-1R 단백질 (R&D 시스템사, 카탈로그 번호 391-GR)로 3번 피하로 (s.c.) 면역접종되었다. 대안으로서, 10 μg의 IGF-1R의 마우스 세포외 도메인 (ECD) (R&D 시스템사, 카탈로그 번호 6630-GR/Fc)의 3번 추가적인 면역접종들이 일정 동물들 상에서 수행되었다. 첫 번째 면역접종은 완전한 프런드 아주반트 (시그마사, 미국 MD 세인트루이스시)의 존재 시 수행되었다. 불완전한 프런드 아주반트 (시그마사)가 면역접종들 이후에 첨가되었다. 융합 이전 3일째, 면역접종된 마우스들은 복강내로 (i.p.) 10 μg의 rhIGF-1R 단백질 (연구실 산물)로 추가자극되었다. 다음으로, 비장세포들 및 림프세포들이 각각 비장의 관류에 의해 그리고 말단 림프절들의 분쇄에 의해 제조되었고, 5마리의 면역접종된 마우스들 중 1마리로부터 (모든 마우스의 혈청들의 역가 측정 이후에 선택됨) 수확되었으며, SP2/0-Ag14 골수종 세포들 (ATCC사, 미국 MD 록빌시)와 융합되었다. 융합 프로토콜은 코흘러 및 밀스타인 (Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-497, 1975)에 의해 기술되어 있다. 다음으로 융합된 세포들은 HAT 선별에 착수된다. 일반적으로, 특히 마우스 기원의 단일클론 항체들 또는 그들의 기능적 단편들의 제조를 위해, 상세하게는 "항체들" 매뉴얼 (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 콜드 스프링 하버 연구소, 콜드 스프링 하버 NY, pp. 726, 1988)에서 기술된 기법들을 참조하는 것이 가능하다. 융합 이후 대략 10일째, 하이브리드 세포들의 콜로니들이 검색되었다. 일차 검색을 위해, 인간 유방 MCF7 종양 세포들 (ATCC) 및 원숭이 IGF-1R을 그들의 세포 표면 상에 발현하는 원숭이 COS7 세포들 (아프리카 녹색 원숭이 간-SV40 형질전환됨)을 사용하여 하이브리도마들의 상청액들이 FACS에 의해 rhIGF-1R ECD 단백질에 대해 증가된 Mab들의 분비를 고려하여 평가되었다. 보다 명확하게, 유동세포측정법에 의한 선별을 위해, 105개 세포들 (MCF7 또는 COS7 둘 중 하나)이 4℃에서 1% BSA 및 0.01% 소듐 아자이드를 포함하는 PBS (FACS 완충액)로 96 웰-플레이트의 각 웰에 도말되었다. 2,000 rpm에서 2분 원심분리 이후에, 완충액이 제거되었고 테스트될 하이브리도마 상청액들이 첨가되었다. 4℃에서 20분의 배양 이후에, 세포들은 2회 세척되었으며, FACS 완충액 (#A11017, 몰레귤라 프로브사, 미국 유진시)으로 1/500 희석된 알렉사 488-결합 염소 항-마우스 항체가 첨가되었고, 4℃에서 20분 동안 배양되었다. FACS 완충액으로 최종 세척 이후에, 세포들은 각각의 튜브에 40 ug/mL의 최종 농도로 프로피디움 요오드의 첨가 이후에 FACS (팩스칼리버, 벡튼-디킨슨사)에 의해 분석되었다. 세포들 단독 및 이차 알렉사 488-결합 항체로 배양된 세포들을 포함하는 웰들이 음성 대조군으로서 포함되었다. 이소형 대조군들이 각각의 실험에 사용되었다 (시그마사, 제품 번호 M90351MG). 적어도 5,000개의 세포들이 형광 강도 (MFI)의 평균 수치를 계산하도록 평가되었다.
추가적으로 내재화 검정법이 내재화 항체들만을 선별하기 위하여 수행되었다. 본 검정법을 위해, MCF7 종양 세포주가 페놀 레드 없이 1% L-글루타민 및 10% FACS를 가진 RPMI 1640로 실험 전 3일 동안 배양되었다. 다음으로 세포들은 트립신을 사용하여 탈착되었고, 4 ×105개 세포/mL 농도의 100 uL의 세포 현탁액이 페놀 레드 없이 1% L-글루타민 및 5% FBS를 가진 RPMI 1640으로 96 웰 플레이트에 도말된다. 2,000 rpm에서 2분 원심분리 이후에, 세포들은 50 uL의 하이브리도마 상청액 또는 대조군 항체 용액들 (1 ug/mL에서 양성 및 이소형 대조군)으로 재현탁되었다. 4℃에서 20분 배양 시간 이후에, 세포들은 2,000 rpm에서 2분 원심분리되었고, 차가운 (4℃) 또는 따뜻한 (37℃) 둘 중 하나의 완전 배양 배지에서 재현탁되었다. 다음으로 세포들은 4℃ 또는 37℃ 둘 중 하나에서 2시간 동안 배양되었다. 다음으로 세포들은 FACS 완충액으로 3회 세척되었다. 알렉사 488-표지된 염소 항-마우스 IgG 항체가 20분 동안 배양되었고 세포들은 프로피디움 요오드 음성 세포 집단에 관한 FACS 분석 이전에 3회 세척되었다.
FACS 분석 이후에, 두 가지 변수들이 결정되었다: (i) 37℃에서 하나의 하이브리도마 상청액과 배양된 세포들로 획득된 형광 신호들과 4℃에서 배양된 세포들의 표면 상에서 검출된 형광 신호와의 차이 및 (ii) 세포 표면 상에 잔여 IGF-1R의 백분율.
잔여 hIGF-1R의 백분율이 다음과 같이 계산되었다:
Figure 112016110224135-pct00015
또한 3가지 엘라이자가 재조합 인간 (hIGF-1R) 및 마우스 (mIGF-1R) 단백질들 상, 및 재조합 인간 인슐린 수용체 (hIR) 단백질 상에 항체들의 결합을 연구하도록 수행되었다. rh- 및/또는 rm-IGF-1R 상의 결합 및 rhIR 상의 미결합을 보여주는 항체를 분비하는 하이브리도마가 보유되었다. 간략하게, 96-웰 엘라이자 플레이트들 (Costar 3690, 코닝사, 미국 뉴욕)이 10 uL/웰의 PBS에 넣은 0.6 ug/mL의 rhIGF-1R 단백질 (R & D 시스템사, 카탈로그 번호 391-GR) 또는 1 ug/mL의 rmIGF-1R 단백질 (R & D 시스템사, 카탈로그 번호 6630-GR/Fc) 또는 1 ug/mL의 rhIR 단백질 (R & D 시스템사, 카탈로그 번호 1544-IR/CF) 중 어느 하나와 4℃에서 밤샘 코팅되었다. 다음으로 플레이트들은 0.5% 젤라틴 (#22151, 세르바 전기영동사, 독일 하이델베르그)을 포함하는 PBS로 37℃에서 2시간 동안 차단되었다. 일단 포화 완충액이 플레이트들을 털어 제거되면, 100 uL의 각 상청액 희석물이 웰들로 첨가되었고 (미희석된 하이브리도마 상청액 또는 상청액의 일련 희석물들) 37℃에서 1시간 동안 배양되었다. 3회 세척들 이후에, 100 uL의 호스래디쉬 퍼옥시다제-결합된 다중클론 염소 항-마우스 IgG (#115-035-164, 잭슨 이뮤노-리서치 연구소사, 미국 PA 웨스트그로브)가 0.1% 젤라틴 및 0.05% 트윈 20 (w:w)을 포함하는 PBS로 1/5,000 희석되어 37℃에서 1시간 동안 첨가되었다. 다음으로 엘라이자 플레이트들이 3회 세척되었으며 TMB (#UP664782, 웁티마사, 프랑스 엥테르침) 기질이 첨가되었다. 상온에서 10분 배양 이후에, 반응은 1 M 황산을 사용하여 정지되었고, 450 nm에서 광학 밀도가 측정된다.
관심 있는 항체를 분비하는 하이브리도마는 증식되었고 제한 희석법에 의해 클론되었다. 일단 이소형이 결정되면, 각각의 암호의 한 가지 클론이 증식되었고 냉동되었다. 관심있는 각각의 항체는 추가 특징 분석을 위해 CellLine (인테그라 ㅂ바이오사이언스사)이라고 명명된 시험관내 생산 시스템에서 생산되었다.
FACS 분석들에 의한 결합 특이도를 어드레싱하는 추가적인 검정법들이 IM9 세포들 (인간 IR을 발현하는 B 림프세포들)뿐만 아니라 hIGF-1R 형질전환된 세포들 대비 미형질전환 세포들 상에서 수행되었다.
선별된 항체들에 해당하는 모든 데이타들은 표 8에 요약되었다. i) hIGF-1R 대비 hIR에 대한 그들의 선택도를 기초로, ii) IGF-1R 내재화를 유도하는 능력을 기초로 하여 선별된 항체들 중에서, 일부는 엘라이자 및 FACS 설정 둘 다에서 그들의 표적을 인식할 수 있는 한편, 나머지는 세포측정법에 의해 연구될 때 매우 좋은 결합제들이지만 엘라이자에 의해 평가될 때 매우 약한 결합제들이었다. m280F2, m212A11, m213B10, m214F8 (R & D 시스템사, 카탈로그 번호및 m219D6은 코팅된 단백질을 잘 인식하지 못하는 이러한 후자 그룹에 속한다.
Figure 112016110224135-pct00016
실시예 2: 비아코아의 SPR 기초한 기술학을 사용한 맵핑 실험들에 의한 항-IGF-1R 항체들 에피토프 군집화의 특징 분석
IGF-1R에 대한 반응의 다양성을 연구하기 위하여, 선별된 항체들이 비아코아에 의해 맵핑되었고 경쟁 특성들에 따라 이들 항체들의 군집화가 수행되었다.
간략하게, 에피토프 맵핑 실험들은 항-태그 His 항체 (His 포집 키트, GE 헬스케어사, 카탈로그 번호 28-9950-56)에 의해 활성화된 CM5 센서칩을 사용하여 비아코아 X 장치 위에서 진행되었다. 11,000 RU 이상의 항체들이 아민 키트 화학을 사용하여 카르복시메틸덱스트란 기질 위에 화학적으로 이c식되었다. 실험들은 전개 및 시료 희석 완충액으로서 HBS-EP 완충액 (GE 헬스케어사)을 사용하여 25℃에서 1 uL/분의 유속으로 수행되었다.
에피토프 맵핑 실험은 동일한 설계로 진행되었다:
1. hIGF-1R 헤테로-사량체 (추가적인 c-말단 10개의 His 태그와 함께 발현되는 2개의 α 사슬들 및 2개의 β 사슬들의 세포외 도메인들 (R & D 시스템사 카탈로그 번호 305-GR)))의 용해성 버전의 용액이 1분 동안 5 ug/mL의 농도로 플로우셀들 둘 다에 주입된다.
2. 다음으로 테스트될 항-hIGF-1R 항체의 용액 (고전적으로 50 ug/mL)이 hIGF-1R 결합 부위들의 포화에 도달하도록 60 내지 90초 사이 범위 동안 플로우셀 1 상에만 주입된다.
3. 잠재적 경쟁인자로서 사용되는 이차 항체의 용액이 동일한 조건들에서 플로우셀 둘 다에 또는 두 번째 플로우셀에만 주입된다.
4. 궁극적으로, 세 번째 항체의 용액이 동일한 조건들에서 플로우셀 둘 다에 주입될 수 있다.
5. 다음으로 표면이 30초 동안 10 mM 글리신, HCl pH 1.5 완충액의 주입으로 재생된다.
이러한 종류의 실험은 두 가지 항체들이 hIGF-1R의 동일한 분자 상에 동시에 결합할 수 있는지 여부를 명백하게 보여주고, 각각의 항체의 결합 부위들 (에피토프들)이 이것을 허용하도록 충분히 먼 점을 나타낸다. 대조적으로, hIGF-1R와 항체의 결합이 두 번째 항체의 결합을 방해하는 경우라면 동일한 에피토프가 둘 다의 항체들에 의해 인식되는 점을 제시한다. 마지막으로, 부분적인 경쟁의 경우에, 두 가지의 테스트된 항체들에 의해 인식되는 에피토프들의 중복을 의심할 수 있다. 이에 따라 에피토프 부위 그룹들이 정의된다. 결과의 복합성은 일반적으로 실험에 사용된 항체들 패널의 크기로 증가한다.
도 1은 SPR 기초한 비아코아 X 장치를 사용한 에피토프 맵핑 실험의 전형적 순환의 예를 기술한다. 센서그램들은 플로우셀 1 (검은색 다이아몬드들) 및 2 (흰색 다이아몬드들)의 시간 (초)의 함수로서 반응 (RU)을 보여준다. 단계 1에서, 항원의 용액: 2개의 C-말단 10개-His 태그를 가진 용해성 재조합 hIGF-1R이 카르복시메틸덱스트란 기질과 화학적으로 결합된 항-His 태그 마우스 항체와 함께 CM5 센서칩의 플로우셀 둘 다에 5 ug/mL의 농도로 10 uL/분의 유속으로 주입된다.
단계 2에서, 50 ug/mL의 농도로 테스트될 첫 번째 항체 (219D6)의 용액이 플로우셀 1에 주입된다. 다음으로 단계 3에서, 50 ug/mL의 농도로 두 번째 항체 (101H8)의 용액이 플로우셀 2에 주입되고, 이후 단계 4에서 50 ug/mL의 농도로 세 번째 항체 (201F1)의 용액이 플로우셀들 둘 다에 주입된다. 이러한 주입의 반응은 IGF-1R 상에서 201F1의 결합이 101H8에 의해 방해되지만 219D6에 의해서는 아닌 점을 분명하게 보여준다. 항체들 201F1 및 219D6은 명백하게 서로 다른 에피토프 그룹들에 속한다. 15가지 선별된 후보들의 전체 분석을 가져오는 군집화가 도 2에 기술되고, hIGF-1R로의 마우스의 면역접종이 좋은 다양성을 전시하는 일련의 항체들의 생산을 가져온다. 따라서, 서로 다른 에피토프들을 인식하는 Mab들의 5가지 서로 다른 그룹들이 생산되었다.
실시예 3: FACS 분석들에 의한 인간 미가공 IGF -1R과의 항체 결합
일련의 항-IGF-1R 항체들의 결합 특성들이 인간 MCF-7 유방 샘암종 세포주 (ATCC#HTB-22)에서 증가하는 항체 농도들을 사용하여 FACS에 의해 평가되었다. 이러한 목적을 위해, 세포들 (1 × 106개 세포들/mL)이 FACS 완충액 (PBS, 0.1% BSA, 0.01% NaN3)에서 항-IGF-1R 항체들과 4℃로 20분 동안 배양되었다. 다음으로 3회 세척되었으며, FACS 완충액으로 3회 세척되기 이전에 암소에서 4℃로 추가 20분 동안 적당한 알렉사 488과 결합된 이차 항체와 배양되었다. 항-IGF-1R 항체들의 결합은 생존가능한 세포들에서 즉시 수행되었고, 이는 프로피디움 요오드 (죽은 세포들을 염색함)를 사용하여 확인되었다. 각각의 항체로 획득된 신호 강도의 최대값은 B최대로서 설계되었고, 형광 강도의 평균 (MFI)으로 표현된다. 몰 농도 (M)로 표현되는 결합의 EC50는 비선형 회귀 분석 (GraphPad 프리즘 4.0)을 사용하여 계산되었다.
각각의 마우스 또는 키메라 Ab의 역가 측정 곡선은 생산된 항체들 모두가 전형적인 포화 프로파일을 가지고 미가공 IGF-1R 형태를 인식할 수 있는 점을 보여주었다 (도 3a). 항체들의 순위를 매기고 마우스 및 키메라 Ab들 둘 다의 결합 특성들을 비교하기 위하여, 각각의 화합물의 결합 EC50가 비선형 회귀 분석을 사용하여 결정되었다. 각각의 마우스 Ab의 EC50의 그의 해당하는 키메라 형태와의 비교는 2가지 형태들이 동일한 결합 특성들을 전시하는 점을 보여주었고, Ab 키메라화가 IGF-1R 인식에 영향을 주지 않았던 점을 나타낸다 (도 3b). EC50들은 1.2 × 10-8 및 4.4 × 10-10 사이 범위를 가졌다. 그룹 2에 속하는 항체들 및 그룹 3a에 속하는 c102H8는 더 나은 EC50을 보여주었다. B최대 분석들을 고려하여 (도 3c), 3가지의 Ab들 (414E1 (G3b), 105G2 (G4) 및 832E5 (G5))이 나머지와 비교하여 더 낮은 B최대를 가졌다. EC50 및 B최대 수치들은 표 9에 요약된다.
Figure 112016110224135-pct00017
실시예 4: IGF -1R 또는 IR 형질전환된 세포들 또는 자연적으로 유의한 수준들의 IR을 발현하는 IM9 세포들 둘 중 하나를 사용한 항체 특이도의 검증
hIGF-1R 대비 hIR에 대한 생산된 항체들의 특이성을 검증하기 위하여, hIGF-1R 또는 hIR 둘 중 하나를 발현하는 안정한 형질전환체들이 FACS 분석들에 의해 평가되었다. 간략하게, 증가하는 농도들의 키메라 mAb들이 FACS 완충액 (PBS, 0.1% BSA, 0.01% NaN3)에서 세포들과 4℃로 20분 동안 배양되었다. 다음으로 세포들은 3회 세척되었으며, 암소에서 4℃로 추가 20분 동안 배양되기 이전에 알렉사 488과 결합된 이차 항체와 배양되었고, 다음으로 FACS 완충액으로 3회 세척되었다. 항-IGF-1R 항체들의 결합은 생존가능한 세포들에서 즉시 수행되었고, 이는 프로피디움 요오드 (죽은 세포들을 염색함)를 사용하여 확인되었다. 몰 농도 (M)로 표현되는 결합 EC50는 비선형 회귀 분석 (GraphPad 프리즘 4.0)을 사용하여 계산되었다.
hIGF-1R 형질전환된 세포주 (도 4a) 대비 미형질전환된 세포들 (도 4b)에서 획득된 역가 측정 곡선들이 인간 IGF-1R에 대한 키메라 Ab들의 결합 특이도를 검증하였다. EC50 및 B최대 수치들은 표 10에 요약되었다. 본 검정법에서 G2 및 G3a 그룹들로부터 얻은 항체들은 최고의 EC50를 보여주었다.
Figure 112016110224135-pct00018
hIR 상에서 마우스 및 키메라 항체들 둘 다의 결합 부재를 확인하기 위하여, 인간 IR을 발현하는 안정한 세포주가 사용되었다. 마우스 및 키메라 Ab들 둘 다에 의한 인간 세포 표면 hIR의 인식은 FACS 분석들에 의해 수행되었다. 증가하는 농도들의 마우스 또는 키메라 mAb들 둘 중 하나가 FACS 완충액 (PBS, 0.1% BSA, 0.01% NaN3)에서 hIR+ 형질전환된 세포주와 4℃로 20분 동안 배양되었다. 다음으로 세포들은 3회 세척되었으며, 암소에서 4℃로 추가 20분 동안 배양되기 이전에 알렉사 488과 결합된 이차 항체와 배양되었으며, 다음으로 FACS 완충액으로 3회 세척되었다. 항-IGF-1R 항체들의 결합은 생존가능한 세포들에서 즉시 수행되었고, 이는 프로피디움 요오드 (죽은 세포들을 염색함)를 사용하여 확인되었다. 몰 농도 (M)로 표현되는 결합 EC50는 비선형 회귀 분석 (GraphPad 프리즘 4.0)을 사용하여 계산되었다. 시판되는 특이적 IGF-1R 항체, 클론 GR11L 및 항-hIR 항체 클론 GRO5은 양성 대조군으로서 사용되었다. c9G4은 부적절한 항체로서 도입되었다 (이소형 대조군).
형질전환된 세포들의 세포 표면 위에서 hIR의 높은 수준의 발현은 시판되는 항-hIR 항체 GRO5를 사용하여 검증되었다. 심지어 높은 농도들의 마우스 (도 5a) 또는 키메라 (도 5b) 항-hIGF-1R Ab들을 사용하여도, 결합이 hIR+ 형질전환된 세포들의 표면에서는 전혀 관찰되지 않았다. 이들 결과들은 마우스 또는 키메라 항-hIGF-1R Ab들이 어느 것도 hIR를 인식하지 않는 점을 보여주었다.
IR 대비 hIGF-1R의 이러한 인식의 특이도는 IM9 세포들, hIR을 발현하는 B-림프종 세포주를 사용하여 역시 관찰되었다 (도 6). 이러한 FACS 분석법을 위해, 프로토콜은 이전에 기술된 것과 동일하였고 마우스 항-IGF-1R 항체들이 이차 항-인간 Ab의 교차 반응성을 방해하기 위하여 사용되었다 (IM9 세포들은 그들의 세포 표면에 인간 Ig를 발현한다). 도 6에 제시된 결과들은 예상된 신호가 GRO5 항-hIR 항체를 사용하여 관찰되었던 한편 평가된 마우스 항체는 이러한 세포주에서 임의의 유의한 결합 신호를 전혀 전시하지 않았던 점을 다시 한 번 보여주었다.
실시예 5: FACS 및 비아코아 분석들에 의한 원숭이 미가공 IGF -1R과 항체 결합
조절성 독성학 연구들을 위한 첫 번째 선결조건 중 하나는 선택된 화합물을 평가하도록 적절한 동물 종을 확인하는 것이다. 본 명세서에서 기술된 일련의 항체들이 마우스 IGF-1R을 인식할 수 없기 때문에, 독성학적 평가를 위해 가장 가능한 종은 비인간 영장류 (NHP)이다.
원숭이 IGF-1R에서 항-IGF-1R 항체들의 결합을 평가하기 위하여, 마우스 및 키메라 항-hIGF-1R 항체들 둘 다의 결합이 증가하는 항체 농도들을 사용하여 COS-7에서 FACS 분석에 의해 평가되었다. 세포들 (1 × 106개 세포들/mL)이 FACS 완충액 (PBS, 0.1% BSA, 0.01% NaN3)에서 항-IGF-1R 항체들과 4℃로 20분 동안 배양되었다. 다음으로 세포들은 3회 세척되었고, 암소에서 4℃로 추가 20분 동안 배양되기 이전에 알렉사 488과 결합된 이차 항체와 배양되었으며, 최종적으로 FACS 완충액으로 3회 세척되었다. 항-IGF-1R 항체들의 결합은 생존가능한 세포들에서 즉시 수행되었고, 이는 프로피디움 요오드 (죽은 세포들을 염색함)를 사용하여 확인되었다. 몰 농도 (M)로 표현되는 결합 EC50는 비선형 회귀 분석 (GraphPad 프리즘 4.0)을 사용하여 계산되었다.
COS-7 원숭이 세포주에서 획득된 역가 측정 곡선들은 832E5 mAb를 제외하고 항-hIGF-1R Ab들 모두가 원숭이 세포주의 표면에서 발현되는 IGF-1R를 특이적으로 인식하는 점을 보여주었다 (도 7a). 각각의 마우스 및 키메라 Ab들의 EC50 결정은 2가지 형태들이 원숭이 IGF-1R 상에서 그들의 결합 특성들에 관하여 잘 대비되는 점을 보여주었다 (도 7b). 이들 결과들은 mAb 832E5를 제외하고 생성된 항-hIGF-1R 모두가 원숭이 IGF-1R를 인식하는 점을 보여주었다.
COS-7 세포들 대비 형질전환된 IGF-1R 세포들에서 결합 EC50의 비교는 인간 대비 원숭이 IGF-1R에서 키메라 항체 인식의 크기를 확인하기 위하여 수행되었다. 도 7b에 나타난 결과들은 832E5 mAb를 제외한 인간 및 원숭이 IGF-1R들의 유사한 인식을 보여주었다.
또 다른 유형의 원숭이에서 인식을 검증하기 위하여, 세포들은 용해성 원숭이 IGF-1R ECD를 생산하도록 머카크 원숭이의 IGF-1R 형태로 형질전환되었고, 비아코아 실험들이 키메라 항체들 (c208F2) 중 하나로 hIGF-1R 또는 머커크 IGF-1R 둘 중 하나와 그의 결합 특성들을 비교하기 위하여 수행되었다.
인식 실험들은 항-태그 His 항체 (His 포집 키트, GE 헬스케어사, 카탈로그 번호 28-9950-56)에 의해 활성화된 CM5 센서칩을 사용하여 비아코아 X 장치 위에서 진행되었다. 11,000 RU 이상의 항체들이 아민 키트 화학을 사용하여 카르복시메틸덱스트란 기질 위에 화학적으로 이식되었다. 실험들은 전개 및 시료 희석 완충액으로서 HBS-EP 완충액 (GE 헬스케어사)을 사용하여 25℃에서 30 uL/분의 유속으로 수행되었다. 단일한 순환 역학적 설계가 머커크 IGF-1R과 비교하여 hIGF-1R 상에서 208F2 항-IGF-1R 항체 (c208F2)의 키메라 형태의 결합의 역학적 변수들을 정의하는 데 사용되었다.
인간 (R & D 시스템스사 카탈로그 번호 305-GR-50) 또는 머커크 원숭이 (사육으로 생산됨) 중 하나의 서열을 기초로 하여, 추가적인 c-말단 10개의 His 태그와 함께 발현되는 2개의 α 사슬들 및 2개의 β 사슬들의 세포외 도메인들로 구성되는 IGF-1R 헤테로-사량체의 용해성 재조합 버전의 용액이 약 160 RU의 항원을 포집하도록 정의된 희석으로 두 번째 플로우셀에 1분 주입되었다. 이차 항체의 용액이 동일한 조건들에서 플로우셀 둘 다에 또는 두 번째 플로우셀에만 주입된다. 포집 단계 이후에, 전개 완충액 둘 중 하나가 5번 주입되고 (각각의 주입은 90초), 증가하는 5가지 농도들 범위의 c208F2가 플로우셀 둘 다에 주입되었다 (각각의 주입은 90초). 다섯 번째 주입의 마지막에, 전개 완충액이 해리 속도를 정의하기 위하여 통과되었다. 다음으로 표면은 10 mM 글리신, HCl pH 1.5 완충액의 주입으로 30초 동안 재생되었다.
계산된 신호는 (포집된 IGF-1R을 가진) 플로우셀 2의 반응 및 (포집된 IGF-1R 분자들이 없는) 플로우셀 1의 반응 간의 차이에 해당한다 (도 8).
각각의 IGF-1R 분자 (인간 또는 머카크)의 경우, 증가하는 농도들 범위의 c208F2의 주입들로 인한 신호는 완충액의 5번 주입들로 획득된 신호의 차감에 의해 교정되었다 (이중 기준 참조). 결과로 얻은 센서그램들은 1 : 1 모델로 비아코아 평가 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 역학적 속도들은 독립적으로 (각각의 IGF-1R 상에서 c208F2 결합의 2가지 역학적 속도들) 또는 공통적으로 (인간 및 머커크 원숭이 IGF-1R 상에서 c208F2 결합의 동일한 역학적 속도들) 평가된다. 적정성은 0.05 RU보다 낮은 Chi2/R최대 비율에 의해 평가되었다.
각각의 IGF-1R에 대해 개별적으로 정의되는 결합의 역학 속도들은 밀접하고 (표 11 참조), 동일한 역학 속도들과 센서그램들 둘 다의 적정성은 좋다. c208F2 항체는 재조합 인간 및 머커크 IGF-1R들을 약 0.2 nM의 해리 상수 (KD)로 동시에 인식한다. 본 연구에서 정의된 친화도들은 약 160 RU의 포집된 인간 및 머카크 IGF-1R의 수준에 대한 항체들의 기능적 친화도들 (또는 결합도들)에 해당한다.
Figure 112016110224135-pct00019
실시예 6: IGF -1R 인산화에 미치는 생산된 항체들의 본질적인 효과
항체들이 타이로신 키나제 수용체들과 결합할 때 작동제 효과를 유도할 수 있는 점은 잘 알려져 있다. 우리는 이러한 작동제 항체들을 선별하도록 원하지 않기 때문에, hIGF-1R 인산화의 평가가 키메라 항체들을 사용하여 연구되었다.
이러한 목적을 위해, MCF-7 세포들이 무혈청 배지로 밤샘 동안 배양되었다. 다음으로 테스트될 IGF-1 (100 nM) 또는 Ab들이 37℃에서 10분 동안 첨가되었다. 배지가 제거되었고, 세포들은 10 mM 트리스 HCl 완충액 (pH 7.5), 15% NaCl (1 M), 10% 계면활성제 믹스 (10 mM 트리스-HCl, 10% Igepal 용출 완충액) (시그마 케미칼사), 5% 소듐 데옥시콜레이트 (시그마 케미칼사), 1가지 프로테아제 저해제 칵테일 완전 TM 정제 (로슈사), 1% 포스파타제 저해제 칵테일 세트 Ⅱ (캘바이오켐)을 포함하는 용출 완충액 (pH 7.5)으로 4℃에서 90분 동안 긁어주었다. 용출물들은 4℃에서 원심분리에 의해 정화되었고, 100℃에서 5분 동안 가열되었으며 -20℃로 보관하거나 4 내지 12% SDS-PAGE 젤들 상에 직접 로딩되었다. 일차 항체의 배양은 상온에서 2시간 동안 수행되었고 다음으로 HRP-결합된 이차 항체들과 배양이 상온에서 1시간 동안 시행되었다. 막들은 ECL로 단백질들의 영상화 이전에 TBST로 세척되었다. 블럿들은 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 정량되었다. 인산화-단백질 수치들은 GAPDH로 정상화되었다. IGF-1과 반응한 hIGF-1R의 인산화는 100%의 자극으로서 고려되었다. hIGF-1R의 인산화에 미치는 항-hIGF-1R Ab들의 효과는 IGF-1에 의해 유도되는 인산화 %로서 결정되었다.
도 9에 기술된 결과들은 IGF-1과 비교하여 3번의 독립적인 실험들 +/- S.D.에서 키메라 항-IGF-1R Ab들과 반응한 pIGF-1R의 평균 %를 나타낸다. 도시된 바와 같이 MCF-7 세포들이 10 ug의 항-IGF-1R Ab들과 배양되었을 때, hIGF-1R의 유의한 또는 소수의 (< 20%) 인산화는 전혀 검출되지 않았다.
실시예 7: 마우스 항- hIGF -1R 항체들에 의해 IGF -1과 반응한 IGF -1R 인산화의 저해
선별된 항체들을 특징 분석하기 위하여, IGF-1R-유도성 인산화를 저해하는 그들의 능력이 연구되었다. 이러한 목적을 위해, MCF-7 세포들이 무혈청 배지로 밤샘 동안 배양되었다. 다음으로 세포들이 2분 동안 IGF-1의 첨가 이전에 마우스 항-hIGF-1 Ab들과 37℃에서 5분 동안 배양되었다. 배지가 제거되었고, 세포들은 10 mM 트리스 HCl 완충액 (pH 7.5), 15% NaCl (1 M), 10% 계면활성제 믹스 (10 mM 트리스-HCl, 10% Igepal 용출 완충액) (시그마 케미칼사), 5% 소듐 데옥시콜레이트 (시그마 케미칼사), 1가지 프로테아제 저해제 칵테일 완전 TM 정제 (로슈사), 1% 포스파타제 저해제 칵테일 세트 Ⅱ (캘바이오켐)을 포함하는 용출 완충액 (pH 7.5)으로 4℃에서 90분 동안 긁어주었다. 용출물들은 4℃에서 원심분리에 의해 정화되었고, 100℃에서 5분 동안 가열되었으며, -20℃로 보관하거나 4 내지 12% SDS-PAGE 젤들 상에 직접 로딩되었다. 일차 항체의 배양은 상온에서 2시간 동안 수행되었고, 다음으로 HRP-결합된 이차 항체들과 배양이 상온에서 1시간 동안 시행되었다. 막들은 ECL로 단백질들의 영상화 이전에 TBST로 세척되었다. 블럿들은 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 정량되었다. 인산화-단백질 수치들은 GAPDH로 정상화되었다. IGF-1과 반응한 hIGF-1R의 인산화는 100%의 자극으로서 고려되었다. hIGF-1R의 인산화에 미치는 항-hIGF-1R Ab들의 효과는 IGF-1에 의해 유도되는 인산화 %로서 결정되었다.
부적절한 마우스 항체인 m105G2, m101H8 또는 m9G4 중 어느 하나의 첨가는 IGF-1과 반응한 hIGF-1R 인산화를 저해시키지 않았다 (도 10). m201F1의 첨가는 IGF-1과 반응한 hIGF-1R 인산화를 적당하게 감소시켰다 (~ 40%의 감소). 다른 항-IGF-1R Ab들 모두는 IGF-1과 반응한 hIGF-1R 인산화를 강하게 저해시켰다 (감소 > 80%). IGF-1-유도성 hIGF-1R 인산화의 최고 저해제들은 m208F2, m212A11 및 m214F8 Mab들이다.
실시예 8: FACS 분석들에 의한 생산된 항- IGF -1R 항체들의 결합 이후에 IGF -1R 내재화의 연구
MCF-7 세포들이 10 ug/mL의 키메라 항체들과 4℃에서 20분 동안 배양되었다. 다음으로 세포들이 세척되었으며 4℃ 또는 37℃에서 4시간 동안 배양되었다. 세포-표면 결합된 항체의 정량은 FacsCalibur 유동세포측정기 (벡튼 디킨슨사) 상에서 이차 항체를 사용하여 결정되었다. 4시간 배양 시간 이후에 4℃에서 측정된 MFI 및 37℃에서 측정된 MFI 간의 차이로서 정의된 △MFI는 내재화된 Ab의 정량에 해당하였다. △MFI는 도 11a 및 11b 그리고 표 12에 제시되었다. 10 ug/mL의 Ab의 내재화 백분율이 다음과 같이 100 × (4℃에서 MFI - 37℃에서 MFI)/4℃에서 MFI:로 계산되었고, 표 11에 제시되었다. 각각의 키메라 항체를 위해 계산된 △MFI의 최대값은 그룹 및 내재화의 최대값 간의 상관성을 전혀 보이지 않았다 (도 11a 및 11b).
Figure 112016110224135-pct00020
원숭이 IGF-1R도 역시 인식하였던 항체들이 이러한 수용체를 내재화할 수 있는지 여부를 결정하기 위하여, 동일한 내재화 실험이 수행되었다. 표 13에 요약된 결과들은 테스트된 항체들 모두가 원숭이 IGF-1R 내재화를 매개할 수 있는 점을 보여주었다.
Figure 112016110224135-pct00021
세포 표면 결합 항체의 역학도 또한 평가되었다. 이러한 목적을 위해, MCF-7 세포들이 96-웰 플레이트들에 접종되었고, 10 ug/mL의 마우스 항체와 4℃에서 20분 동안 배양되었다. 다음으로 세포들이 미결합된 항체를 제거하도록 배지로 37℃에서 10, 20, 30, 60 또는 120분 동안 세척되었다. 각각의 시간대에서, 세포들이 원심분리되었고, 다음으로 세포 표면에 남아있는 항체의 양을 결정하도록 얼음 위에서 이차 항-마우스 IgG-알렉사 488로 표면 표지되었다. 각각의 마우스 Ab 및 각각의 시간대의 형광 강도는 4℃에서 신호에 의해 정상화되었고 (잔여 IGF-1R %), 반감기 (t1/2)를 결정하도록 지수적 붕괴로 적정화되었다. t1/2는 4℃에서 측정된 신호의 50% 감소를 획득하는 데 필요한 시간으로서 고려되었다. 도 12a 및 12b에 도시된 바와 같이, 마우스 Ab들 모두의 표면 수준은 첫 번째 30분 동안 신속하게 강하하였고 감소는 60분 배양 이후에 거의 최대이었다 (도 12a). 계산된 반감기는 마우스 Ab에 대하여 10 내지 18분 사이 범위에 포함되었다 (도 12b). 항체 표면 붕괴 및 Ab들 그룹 간의 상관성은 전혀 존재하지 않았다.
세포 표면 신호의 감소가 Ab 내재화로 인하고 수용체 박리로 인하지 않았던 점을 확인하기 위하여, 세포들이 마우스 Ab들과 37℃에서 0, 30 및 60분 동안 배양되었다 (도 13). 다음으로 세포 표면 결합 항체 (투과화 없음) 및 항체 세포-표면 결합 + 내재화된 Ab (투과화 있음)에 해당하는 전체 항체 신호를 결정하도록 투과화되거나 되지 않았다. 내재화된 Ab (세포질)의 정량은 다음과 같이 결정되었다: 투과화 이후 MFI - 투과화 없는 MFI. 이러한 실험은 세포-표면 결합된 Ab의 감소가 Ab들이 내재화되는 것을 보여주는 세포질 Ab들의 증가로 인하는 점을 관찰하였다 (도 13). 또한, Ab들의 분해는 투과화 (전체) 이후에 신호의 감소로 표시된 바와 같이 배양 1시간 이후에 시작하였다.
실시예 9: 공초점 분석들에 의한 생산된 항- IGF -1R 항체들의 결합 이후에 IGF-1R 내재화의 연구
항체들 내재화를 더 검증하기 위하여, 공초점 현미경 분석법이 세포의 이동 (trafficking) 이후에 항체들의 세포하 분포를 평가하도록 시행되었다. 세포들은 항-hIGF-1R Ab들과 37℃에서 배양되었고, 고정되었으며, 투과화되었다. 따라서, 세포들이 이차 항체 알렉사-488를 사용하여 염색되었고, 이차 항-토끼 IgG 알렉사 555를 사용하여 토끼 항-Lamp-1 항체가 시현되었다. 37℃에서 배양 이전에, 마우스 208F2 Ab가 MCF-7 세포들의 막 위에 정착되었고 (도 14a), 리소좀 마커 lamp-1과 공동정착은 이미지 J 소프트웨어의 공동정착 하이라이터 플러그-인을 사용하여 확인되었다. 세포 표면 결합 항체는 15분 배양 이후에 극적으로 감소되었다. 세포 표면 결합 항체의 감소와 동시적으로, 세포내 항체가 소포들 내에서 검출되었다. lamp-1과의 공동정착은 거의 관찰될 수 없었다. 30분 배양 이후에, 세포 표면 결합 항체는 검출되지 않았다. 그러나, 리소좀 내에서 Ab의 공동정착이 증가되었다. 1시간 배양 이후에, 세포내 Ab 염색은 lamp-1과의 공동정착의 수와 마찬가지로 감소되었다. 이러한 세포 표면 결합 항체 및 그의 세포내 축적의 역학은 FACS에 의해 측정된 항체 표면 붕괴의 역학과 상관되었다. 또한, 이미 FACS 연구들로 기술된 바와 같이 공초점 현미경 분석법에 의해 마우스 Ab들의 분해가 1시간 배양 이후에 시작하였다.
나머지 항-hIGF-1R 마우스 항체들 모두의 내재화 및 그들의 Lamp-1와 공동정착도 역시 평가되었다 (도 14b).
실시예 10: 리소좀 저해제, 바필로마이신 A1을 사용한 Ab들 분해의 저해
항체들이 리소좀에 도달하고 분해되는 것을 검증하기 위하여, 세포들은 리소좀 기능들의 강력한 저해제인 바필로마이신 A1으로 처리되거나 처리되지 않았다. 다음으로 세포들은 4℃에서 10 ug/mL의 테스트될 Ab와 배양되었고, 세척되었으며, 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. 내재화된 Ab가 세포 투과화 이후에 이차 항-마우스 IgG-알렉사 488 Ab를 사용하여 검출되었다. 바필로마이신 A1의 첨가는 세포내 Ab의 분해를 방해하였고 (도 15), 이는 Ab들이 효과적으로 내재화되고 리소좀들 내에서 분해되었던 점을 가리킨다.
실시예 11: 항체 IGF -1R 결합에 미치는 pH 효과 및 세포독성 효능과의 상관성
항체들이 그들의 내재화 잠재력을 기초로 하여 선별되고 상기에서 리소좀 구획 내로 진입하기 이전에 초기 엔도좀들과 공동정착하는 것으로 관찰되었기 때문에, 흥미로운 접근법은 Ab-hIGF-1R 결합의 안정성이 pH 환경을 고려하여 조정되는 항체들, 바람직하게는 pH 환경이 산성이 될 때 바람직하게 IGF-1R로부터 해리되는 항체들을 선별하는 단계로 구성되었다. 이에 따라, 초기 엔도좀들 및 리소좀들 간의 일차적인 차이점은 그들의 내부 pH이다: 엔도좀 구획에서 pH는 대략 6인 반면 리소좀 구획에서 pH는 약 4.5이다.
일단 리간드 결합 (IGF-1) 이후에 내재화되면, hIGF-1R은 재생화 경로를 통해 세포 표면으로 다시 돌아간다.
이론으로 결부되지 않더라도, 본 명세서에서 기술된 가설은 산성 pH에서 그들의 표적으로부터 초기에 더욱 방출되는 경향이 있는 항체들이 아마도 막으로의 표적 재생화를 선호할 것이고 결론적으로 면역결합체 접근법들을 위한 더 나은 후보들로서 고려될 수 있는 점이다. 우리 항체들의 일부가 이러한 특성을 전시하는지 여부를 조사하고 이러한 특성을 세포독성 활성과 상관시키기 위하여, MCF-7 세포주들에서 마우스 항-hIGF-1R Mab들의 결합이 서로 다른 pH의 완충액들에서 시행되었다. 마우스 mAb들의 증가하는 농도가 pH 5 내지 8 범위를 가지는 서로 다른 pH로 MCF-7 세포주 상에 4℃로 20분 동안 배양되었다. 다음으로 세포들은 3회 세척되었으며, FACS 완충액에서 알렉사 488과 결합된 적당한 이차 항체와 배양되었다. 세포들은 암소에서 4℃로 추가 20분 동안 배양되었고, 다음으로 FACS 완충액으로 3회 세척되었다. 항-IGF-1R 항체들의 결합은 생존가능한 세포들에서 즉시 수행되었고, 이는 죽은 세포들을 염색한 프로피디움 요오드를 사용하여 확인되었다. 몰 농도 (M)로 표현되는 결합 EC50는 비선형 회귀 분석 (GraphPad 프리즘 4.0)을 사용하여 계산되었다.
에피토프 군집 그룹 3B에 속하는 항-hIGF-1R의 EC50은 pH에 의해 유의하게 영향받지 않았다 (도 16). 에피토프 군집 그룹 3a에 속하는 항-hIGF-1R Mab들의 결합 능력은 종종 산성 pH에서 증진되었다. 정반대로, 에피토프 군집 그룹들 1, 2 및 4에 속하는 항-hIGF-1R Ab들의 결합 능력은 산성 pH에서 감소되었다.
산성 pH가 면역결합체에 의해 유도된 세포독성에 긍정적인 효과를 가지는지 여부를 결정할 목적으로, 시판되는 Fab-ZAP 인간 검정 (ATS BIO)이 사용되었다. 간략하게, MCF7 세포들이 96 웰 플레이트들에 2,000개 세포들/웰로 접종되었고 부착하도록 밤샘 방치되었다. 다음 날, 세포들은 0.45 ug/mL의 Fab-ZAP 및 증가하는 농도들의 키메라 항-IGF-1R Ab들처리되었다. 세포 표면과 결합하지 않는 c9G4 단일클론 항체가 음성 대조군으로서 사용되었다. 6일째, 세포 생존도가 프로메가사 (위스콘신 매디슨)로부터 나온 CellTiter Glo 발광 세포 생존도 검정을 사용하여 측정되었다. 도 17a에 도시된 바와 같이, 그룹들 4 및 5의 항-IGF-1R Ab들은 MCF-7에 미치는 임의의 세포독성을 유도하지 않은 반면, 온화한 세포독성 (그룹 1, 3a 및 3b) 내지 높은 세포독성 (그룹 2)이 나머지 그룹들로 측정되었다. 도 17b에서, IC50 결정은 그룹 2가 가장 높은 세포독성 효과를 가지는 점을 검증하였고, 이들 항체들이 ADC (항체 약물 결합체) 또는 ATC 접근법에 가장 적합할 것이라는 점을 제시한다.
도 17에 요약된 결과들은 평가된 15가지 키메라 mab들 중에서 최고의 세포독성 효과가 모두 그룹 2에 속하는 c208F2, c219D5, c212A11, c213B10 및 c214F8에서 도달하였던 점을 보여주었다. 그러나 IGF-1R 결합의 산성 pH에 대한 민감성을 역시 전시하는 그룹 1 및 4로부터 얻은 기타 항체들은 세포독성을 위한 최고의 후보들로서 역시 군집화되지 않았고, 이러한 특성은 요구될 수는 있지만 그룹 2로부터 얻은 항체들의 상세한 특성들을 설명하는 데 충분하지 않은 점을 제시한다. 이러한 항체들 상관성들 전체의 상세한 특징들을 더 잘 이해하기 위하여, 연구들이 생산된 항체들 모두에 유용한 데이타에 고려하여 수행되었다. 이러한 분석의 결과들은 산성 pH 환경에서 인산화의 저해 및 hIGF-1R과 결합 능력의 감소 둘 다가 최고의 세포독성 활성을 얻는데 요구되는 점을 제시하였다 (도 18). 따라서 결합이 산성 pH 환경에서 감소되지만 약한 인산화 저해제들이었던 101H8 (G1), 201F1 (G1) 및 105G2 (G4)가 낮은 세포독성 활성들을 보여주었다. 다른 한편으로, 102H8 (G3a), 110G9 (G3a), 415A8 (G3a), 410G4 (G3b), 414E1 (G3b) 및 433H9 (G3b)은 IGF1-유도성 인산화의 강력한 저해제들이었지만, pH 변화에 민감하지 않거나 그의 결합이 산성 pH에서 증진되었으며, 이는 Fab-ZAP 인간 검정에서 온화한 세포독성 활성들만을 보여주었다.
MCS-7 세포주에서 인간 항-IGF-1R Mab들의 결합은 서로 다른 pH에서의 완충액들로 시행되었다. 인간화 mAb들의 증가하는 농도들이 pH 5 내지 8 범위를 가지는 서로 다른 pH로 MCF-7 세포주에서 4℃로 20분 동안 배양되었다. 다음으로 세포들은 3회 세척되었으며, FACS 완충액에서 알렉사 488과 결합된 적당한 이차 항체와 배양되었다. 세포들은 암소에서 4℃로 추가 20분 동안 배양되었고, 다음으로 FACS 완충액으로 3회 세척되었다. 항-IGF-1R 항체들의 결합은 생존가능한 세포들에서 즉시 수행되었고, 이는 죽은 세포들을 염색한 프로피디움 요오드를 사용하여 확인되었다. 몰 농도 (M)로 표현되는 결합 EC50는 비선형 회귀 분석 (GraphPad 프리즘 4.0)을 사용하여 계산되었다. 인간화 항-IGF-1R-항체들은 도 32a 및 32b에 도시된바와 같이 산성 pH에서 더 낮은 결합 능력을 보여주었다.
실시예 12: 208F2 Mab의 인간화 형태들의 평가
12.1 첫 번째 인산화 형태 hz208F2 VH3/VL3 ( hz208F2 H026/L024라고도 역시 명명됨)의 결합 및 내재화의 평가
첫 번째 인간화 형태 c208F2 mAb의 결합이 MCF-7, COS-7 및 NIH 3T3 IR+ 세포주들에서 평가되었다. m208F2, c208F2 또는 hz208F2 VH3VL3의 증가하는 농도들이 각각의 세포주 상에 4℃로 20분 동안 첨가되었다. 다음으로 세포들이 세척되었으며 테스트된 Ab의 결합이 해당하는 이하 항체를 사용하여 시현되었다. 형질전환된 세포주 상의 인간 IR의 발현을 검증하기 위하여, 시판되는 항-hIR 항체 클론 GRO5가 사용되었고 그의 인식 프로파일이 예시되었다 (도 19d).
MCF-7 (도 19a) 및 원숭이 COS-7 (도 19b) 세포들에서 인간화 형태의 마우스 또는 키메라 둘 중 하나의 형태와 비교는 3가지 테스트된 형태들의 밀접한 프로파일들을 보여주었다. 인간화 공정은 인간 인슐린 수용체 상의 교차 반응성의 부재를 고려하여 마우스 및 키메라 형태들과 완벽하게 비슷한 항체의 인식 특이도를 변형하지 않았다 (도 19c).
인간 세포주 MCF-7 및 원숭이 세포주 COS-7에서 c208F2의 첫 번째 인간화 형태의 계산된 EC50은 208F2의 마우스 또는 키메라 형태 둘 중 하나로 결정된 것과 유사하였다.
mAb hz208F2 VH3/VL3의 내재화되는 능력은 유동세포측정법에 의해 평가되었다. MCF-7 세포들이 10 ug/mL의 항체들과 4℃에서 20분 동안 배양되었다. 다음으로 세포들이 세척되었으며 4℃ 또는 37℃에서 4시간 동안 배양되었다. 세포-표면 결합된 항체의 정량은 이차 항체를 사용하여 결정되었다. 4시간 배양 시간 이후에 4℃에서 측정된 MFI 및 37℃에서 측정된 MFI 간의 차이로서 정의된 △MFI는 내재화된 Ab의 정량에 해당하였다. △MFI는 도 14a에 제시되었다. 10 ug/mL의 Ab의 내재화 백분율이 다음과 같이 100 × (4℃에서 MFI - 37℃에서 MFI)/4℃에서 MFI:로 계산되었고, 표 14a에 제시되었다. 따라서, 인간화 hz208F2 VH3/VL3는 해당하는 마우스 및 키메라 208F2 항체들로 측정된 것과 유사한 결합 및 내재화 특성들을 가지고 있었다.
Figure 112016110224135-pct00022
12.2 연속적인 hz208F2 인간화 형태의 결합 평가
mAb 208F2가 인간화되었고, 16가지의 인간화 변이체들 (12.1에 기술된 첫 번째 형태를 포함함)의 결합 특성들이 평가되었다. 인간화 변이체들의 결합 특성들은 인간 MCF-7 유방 샘암종 세포주 및 원숭이 세포주 Cos-7 상에서 증가하는 항체 농도들을 사용하여 FACS 분석들에 의해 평가되었다. 이러한 목적을 위해, 세포들 (1 × 106개 세포들/mL)이 FACS 완충액 (PBS, 0.1% BSA, 0.01% NaN3)에서 항-IGF-1R 인간화 항체들과 4℃로 20분 동안 배양되었다. 다음으로 그들은 3회 세척되었으며, FACS 완충액으로 3회 세척되기 이전에 암소에서 4℃로 추가 20분 동안 적당한 알렉사 488과 결합된 적당한 이차 항체와 배양되었다. 항-IGF-1R 항체들의 결합은 생존가능한 세포들에서 즉시 수행되었고, 이는 프로피디움 요오드 (죽은 세포들을 염색함)를 사용하여 확인되었다. 몰 농도 (M)로 표현되는 결합의 EC50는 비선형 회귀 분석 (GraphPad 프리즘 4.0)을 사용하여 계산되었다.
인간화 변이체들의 EC50는 인간화 변이체들이 인간 및 원숭이 세포주들 둘 다에서 동등한 결합 특성들을 전시하는 점을 보여주었다.
인간화 항체들의 EC50는 표 14b에 요약된다.
Figure 112016110224135-pct00023
12.3 또 다른 hz208F2 인간화 형태의 내재화의 평가
MCF-7 세포들이 10 ug/mL의 인간화 항체들과 4℃에서 20분 동안 배양되었다. 다음으로 세포들이 세척되었으며 4℃ 또는 37℃에서 4시간 동안 배양되었다. 세포-표면 결합된 항체의 정량은 FacsCalibur 유동세포측정기 (벡튼 디킨슨사) 상에서 이차 항체를 사용하여 결정되었다. 4시간 배양 시간 이후에 4℃에서 측정된 MFI 및 37℃에서 측정된 MFI 간의 차이로서 정의된 △MFI는 내재화된 Ab의 정량에 해당하였다. △MFI는 도 14c에 제시되었다. 10 ug/mL의 Ab의 내재화 백분율이 다음과 같이 100 × (4℃에서 MFI - 37℃에서 MFI)/4℃에서 MFI:로 계산되었다. 인간화 항체 hz208F2 H077/L018는 IGF-1R의 유의한 내재화를 유도할 수 있다.
Figure 112016110224135-pct00024
실시예 13: 면역결합체 접근법을 위한 표적으로서 IGF -1R
IHC 연구들이 면역결합체 접근법을 위한 표적으로서 IGF-1R를 검증하기 위하여 설정되었다. 따라서 이러한 접근법에 유용한 표적은 정상 세포들과 비교하여 종양 세포들 상의 유의한 과다발현을 요구한다. 면역결합체 접근법을 위한 적당한 표적의 또 다른 특성은 많은 적응증들을 가진 환자 집단의 유의한 백분율에서 그의 과다발현의 유병율이다.
hIGF-IR이 면역결합체 접근법을 위한 적당한 표적으로서 고려될 수 있는지 여부를 평가하기 위하여, hIR 대비한 hIGF-1R 세포외 도메인 (EDC)의 특이적인 것으로 기술된 시판되는 다중클론 항체 (R & D 시스템사로부터 나온 AF305-NA)가 선택되었다. 우리 공정의 첫 번째 단계는 hIGF-1R ECD에 대한 AF305-NA의 특이도 및 그의 hIR 인식의 부재를 확인하는 것이었다. 이러한 목적을 위해 일련의 엘라이자 테스트들이 인간 IGF-1R 및 hIR ECD 단백질 둘 다 상에서 상기에 이미 상술된 프로토콜들을 사용하여 수행되었다.
도 20a에 기술된 결과들은 다중클론 항-hIGF-1R 항체가 hIGF-1R ECD를 효율적으로 인식하는 점을 보여주었다. 양성 대조군으로서 사용된 GR11L 항체 (캘바이오켐사)는 예상된 프로파일을 주었다. 공급자에 의해 기술된 바와 같이, 도 20b는 양성 대조군으로서 사용된 항-hIR GRO5 Mab (캘바이와켐사)와 대조적으로 AF305-Na가 엘라이자에서 hIR을 인식하지 않는 점을 보여주었다. 마찬가지로, FACS 분석들에 의한 hIR+ 형질전환된 세포에서 다중클론 AF305-NA의 결합 평가는 이것이 hIR의 세포 형태를 인식하지 못하는 한편 (도 20d), 항-hIR GRO5 항체는 형질전환 세포들 상에서 예상된 프로파일을 제시하는 (도 20c) 점을 검증하였고, 이는 그들이 높은 수준의 hIR을 발현하는 점을 보여준다. 예상된 바와 같이, hIGF-1R을 인식하고 실험에서 음성 대조군으로서 도입된 GR11L은 hIR+ 형질전환된 세포에서 임의의 신호를 보여주지 않는다.
AF305-NA 항체가 hIGF-1R 분포 연구를 위해 전적으로 검증되었기 때문에, IHC 프로토콜이 디스커버리 울트라 자동염색기 벤타나 상에서 설정되었다. 간략하게, 탈왁싱 이후에 항원 복구가 EDTA pH8 완충액에 해당하는 CC1을 사용하여 96℃에서 32분 동안 수행되었다. 일차 항체 (AF305-NA)가 37℃에서 1시간 동안 배양되었다. 세척 이후에, 중합체 HRP-OMap 항-염소 IgG (벤타나)가 37℃에서 16분 동안 배양되었고, 다음으로 DAB 색소원을 사용하여 시현되었다. 마지막으로, 조직들이 헤마톡실린을 사용하여 반대염색되었다. 다음으로 슬라이드들이 유키트 (Eukitt) 배지에 올려졌다. IHC 염색을 검증하기 위하여, 이종이식으로부터 나온 종양 조직의 패널이 hIGF-1R의 시험관내 발현을 고려하여 선택되었다. 도 21에 나타낸 바와 같이, 강한 막성 염색이 3가지 양성 조직들 (MCF-7, NCI-H23 및 NCI-H82)에서 관찰되었다. 막성 염색은 음성 대조군으로서 선택된 Hs746t에서는 전혀 관찰되지 않았다. 염색 분석을 위해, 슬라이드들이 로슈 벤타나사로부터 나온 HT 스캐너를 사용하여 스캔되었고, IGF-1R 염색이 버튜오소 소프트웨어 (로슈 벤타나사)를 사용하여 정량되었다. 조직 분석을 위해 종양들 당 4개의 관찰 영역들 (FOV들)이, 가능할 때 알고리즘의 통계학적 정확도를 증가시키도록 50개 이상의 세포들을 사용하여 점수가 매겨졌다. 조직들은 HER2 막 알고리즘에 따라 +++ (3+라고도 역시 기술됨), ++ 내지 +++ (2+ 내지 3+ 또는 ++/+++ 라고도 역시 기술됨), ++ (2+라고도 역시 기술됨), + (1+라고도 역시 기술됨)로 점수가 매겨졌다. 점수 매김은 CAP/ASCO 테스팅 가이드라인에 따라 시료의 10% 이하의 세포들에서 약하거나 불완전한 막 염색 또는 약하고 완전한 막 염색의 경우 (+)로서 정의되었다. (++)의 점수는 일정하지 않고 약하지만 적어도 10%의 세포들에서 명확한 주변 분포, 또는 30% 이하의 종양 세포들에서 강하고 완전한 막 염색이 되는 완전한 막 염색으로서 기술되었다. (+++)의 점수는 30% 이상의 침습성 종양 세포들에서 일정하고 강한 막 염색에 해당한다. 종양들이 (++) 내지 (+++)로 점수가 매겨질 때, 이것은 분석된 종양성 조직에서 비균질도를 말한다. (-)는 hIGF-1R의 발현이 전혀 검출되지 않은 점을 의미하고, (c)는 염색이 배타적으로 세포질인 점을 의미한다. 세포질 염색은 분리된 세포들을 만드는 막성 염색의 부재를 특징으로 한다.
다음으로 확장된 연구가 상기 프로토콜을 사용하여 정상 및 종양 조직들에서 수행되었다 (도 22a 및 22b).
이들 연구들을 위해, 슈퍼바이오칩들로부터 얻은 인간 정상 및 종양 TMA가 분포 및 유병율 연구들을 수행하도록 사용되었다. 두 가지 서로 다른 대조군들이 각각의 자동염색기 순환에 도입되었다. 하나의 대조군은 IGF-1R 발현에 대한 양성 대조군인 것으로 알려진 태반 절편들로 구성되었고 정상 TMA 조직들과 함께 제공되었다. 두 번째 일련의 대조군들은 점수 2+ 또는 3+ (각각 MCF-7 및 NCI-H23, NCI-H82)를 제시하는 종양 이종이식 조직들의 3가지 슬라이드들로 구성되었다. 이러한 후자 대조군은 발현을 산정하도록 각각의 염색 진행에 첨가된다.
예상된 바와 같이, 이종이식으로부터 얻은 태반 및 조직은 hIGF-1R에 대해 양성이었다. 강한 막성 염색이 이들 4가지 대조군들에서 관찰되었다. 인간 정상 조직들의 첫 번째 패널에서 (도 22a), 1+를 초과하지 않는 IGF-1R의 약간의 막성 검출이 위장관 (식도, 소장, 결장 및 직장)에서 관찰되었다. 분석된 나머지 조직들 모두의 경우, IGF-1R의 막성 발현이 전혀 관찰되지 않았다. 인간 정상 조직들의 두 번째 패널에서 (도 22b), 1+를 초과하지 않는 IGF-1R의 약간의 막성 검출이 신장 구조들에서 관찰되었다. 강한 막성 염색 (++)이 전립샘의 상피 및 요로상피에서 관찰되었다. 이들 조직들 둘 다를 제외하고, 강한 막성 염색은 전혀 관찰되지 않았다. 이러한 발현의 양상은 hIGF-1R가 ADC 또는 ATC 접근법들을 위한 좋은 표적일 수 있는 점을 강하게 제시하였다.
IGF-1R을 표적하는 면역결합체의 잠재적인 적응증들을 결정하기 위하여, 환자로부터 얻은 폐, 유방, 두경부, 방광 및 신장 종양 시료들이 상기에 기술된 프로토콜을 사용하여 그들의 IGF-1R의 발현에 대하여 분석되었다.
연구된 69개 폐 시료들 중에서, 67가지의 사례들이 해석 가능하였다. IGF-1R 발현은 상기에 기술된 바와 같이 정량되었다. 도 23에 나타낸 바와 같이, 강한 막성 발현이 우리가 상기에 이미 정상 조직들에서 기술하였던 것과 부합하여 음성들이 되는 정상 인접 조직들과 대비하여 많은 암종들에서 검출된다. 분석된 사례들 모두가 표 15에 요약되었다. ++ 또는 +++ 사례들의 55%는 폐암의 모든 아형들을 포함하는 것으로 관찰된다. 편평세포 폐 암종은 70%의 ++, ++/+++, 또는 +++ 사례들을 가진 가장 발현적인 hIGF-1R 종양들이었고, 43%는 단지 +++ 및 ++/+++ 종양들만을 보유하였다. 이들 결과들은 편평세포 폐 암종 환자들에서 빈번한 높은 폴리좀들 또는 hIGF-1R 증폭들을 기술하였던 발표된 데이타와 부합한다.
Figure 112016110224135-pct00025
IGF-1R 발현의 또 다른 연구가 일련의 10가지 유방암 시료들에서 수행되었다. 도 24에 나타낸 결과들은 IGF-1R이 인접한 정상 조직들과 비교하여 암 조직들에서 높게 발현되는 점을 보여주었다. 표 16에 나타낸 염색 데이타는 분석된 사례들의 66%가 ++, ++/+++, 또는 +++이고, 분석된 사례들의 22%는 +++, 또는 ++/+++인 점을 보여주었다.
Figure 112016110224135-pct00026
마지막으로 IGF-1R의 과다발현이 두경부, 비뇨기 방광 및 신장을 포함하여 일련의 종양들에서 관찰되었다 (도 25). 다시 한 번 IGF-1R의 과다발현이 정상 인접 조직들 대비 종양 시료들에서 주목되었다.
종합하여, 이들 결과들은 폐, 유방, 두경부, 비뇨기 방광 및 신장을 포함하여 IGF-1R 양성들인 많은 종양들을 치료하는 면역결합체 접근법과 부합한다.
실시예 14: 용해성 재조합 인간 IGF -1R에서 5가지의 키메라 항- IGF -1R 항체들 ( c208F2 , c213B10 , c212A11 , c214F8 및 c219D6 ) 및 208F2 항체의 인간화 버전 (VH3/VL3)의 해리 상수 (K p )의 정의
재조합 용해성 인간 IGF-1R에서 항체들의 결합의 해리 상수 (Kp)는 해리 속도 (koff) 및 결합 속도 (kon) 간의 비율에 의해 정의되었다. 역학적 실험들은 마우스 항-태그 His 단일클론 항체에 의해 활성화된 CM5 센서칩을 사용하여 비아코아 X100 장치 상에서 진행되었다. 약 12,000 RU의 항체들이 아민 키트 화학을 사용하여 카르복시메틸덱스트란 기질 위에 화학적으로 이식되었다.
실험들은 전개 및 시료 희석 완충액으로서 HBS-EP+ 완충액 (GE 헬스케어사)을 사용하여 25℃에서 30 uL/분의 유속으로 수행되었다.
단일한 순환 역학적 설계가 그의 두 개 C-말단 10개 히스티딘-태그에 의해 포집된 용해성 재조합 인간 IGF-1R 상에서 항-IGF-1R 항체들의 결합의 역학적 변수들을 정의하는 데 사용되었다.
1. 인간 hIGF-1R 헤테로-사량체의 용해성 재조합 버전의 용액: 추가적인 C-말단 10개의 His 태그와 함께 발현되는 2개의 α 사슬들 및 2개의 β 사슬들의 세포외 도메인들 (R & D 시스템사 카탈로그 번호 305-GR-50)이 10 ug/mL의 농도로 두 번째 플로우셀 상에 1분 동안 주입되었다. 평균 587 RU (24 RU의 표준 오차를 가짐)의 용해성 수용체가 본 연구를 위해 실현된 24회 순환들 각각에서 포집되었다.
2. 포집 단계 이후에, 전개 완충액이 플로우셀들 둘 다에 5번 (각각의 주입 90초) 6가지 항체들 중 하나의 증가하는 5가지 농도 범위들로 주입되었다 (각각의 주입 90초). 다섯 번째 주입의 마지막에, 전개 완충액이 해리 속도를 정의하기 위하여 5분 동안 통과되었다.
3. 다음으로 표면은 10 mM 글리신, HCl pH 1.5 완충액의 주입으로 45초 동안 재생되었다.
계산된 신호는 (포집된 IGF-1R을 가진) 플로우셀 2의 반응 및 (포집된 IGF-1R 분자들이 없는) 플로우셀 1의 반응 간의 차이에 해당한다.
각각의 IGF-1R의 경우, 증가하는 농도들 범위의 항체의 주입들로 인한 신호는 완충액의 5번 주입들로 획득된 신호의 차감에 의해 교정되었다 (이중 기준 참조). 도 26 참조.
결과로 얻은 센서그램들은 1 : 1 모델로 비아코아 평가 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.
네 번의 경험들이 두 가지 서로 다른 농도들의 범위들을 사용하여 각각의 항체를 위해 진행되었다: 각각의 항체를 위해 두 번의 첫 번째 실험들의 경우 40, 20, 10, 5 및 2.5 nM 그리고 두 번의 나중 실험들 진행의 경우 24, 12, 6, 3 및 1.5 nM.
본 실험에서는 테스트된 6가지 항체들을 위해, 실험적 데이타는 더 높은 농도가 상수로서 정의되고 나머지 다섯 농도들이 계산될 때 유의한 koff 수치들로 1 : 1 모델과 잘 맞추어졌다 (도 27 참조).
비율 koff/kon로서 계산된 해리 상수들 (Kp) 및 비율 Ln(2)/koff로서 계산된 복합체들의 반감기는 도 28 및 29에 나타내었다. 그들은 각각의 항체들을 위한 독립적인 실험들 진행의 평균에 해당한다. 오차 막대들은 수치들의 표준 오차들 (n = 4)에 해당한다.
해리 상수들은 10 내지 100 pM의 범위이다. c208F2 항체는 h-IGF-1R에 대한 약한 친화도를 제시하고 (KD 약 75 pM), 그의 인간화 버전은 적어도 키메라 버전만큼 좋다 (KD 약 60 pM). 4가지의 나머지 항-IGF-1R 키메라 항체들은 hIGF1-R를 위한 매우 유사한 친화도를 제시한다 (KD 약 30 pM). 친화도들의 차이는 기본적으로 복합체들의 해리 속도 또는 결과로 나온 반감기와 연관되어 있다. 208F2를 사용하여 복합체의 반감기는 키메라 및 인간화 (VH3/VL3) 버전들로 2 및 3시간 사이 범위이다. 4가지의 나머지 항-IGF-1R 키메라 항체들의 경우는 평균 반감기들이 7.0 및 9.4시간 사이 범위이다.
이들 매우 느린 해리 역학은 항체들의 Fab 구조들 둘 다 내지 2개 인접한 h-IGF-1R 분자들에 의해 동시적으로 결합할 수 있는 항체들의 이가 구조와 분명하게 연관된다. 이러한 경우에 포집된 h-IGF-1R 분자들의 수준은 해리 속도에 미치는 영향을 가질 수 있다. 본 연구에서 정의된 친화도들은 포집된 h-IGF-1R의 수준 약 600 RU을 위한 기능적 친화도들 (또는 결합도들)에 해당한다. KD의 3배 차이가 상기에 나타낸 데이타 간에 관찰되었고 (표 10), 실시예 13에 제시된 수치들은 포집된 hIGF-1R의 수준의 변화와 연관된다 (실시예 5에서 600 RU 대비 160 RU).
실시예 15: 키메라형 h/m IGF -1R 재조합 단백질의 용해성 형태들을 사용하여 c208F2의 결합을 방해하는 마우스 IGF-1R 특이적 잔기들의 정의
c208F2 항체 실험들에서 키메라형 h/m IGF-1R 재조합 단백질들의 용해성 형태들의 결합은 마우스 항-인간 IgG Fc 단일클론 항체에 의해 활성화된 CM5 센서칩을 사용하여 비아코아 X100 장치 상에서 진행되었다. 10,500 RU 이상의 항-Fc 항체가 아민 키트 화학을 사용하여 플로우셀들 둘 다의 카르복시메틸덱스트란 기질 위에 화학적으로 이식되었다.
실험들은 전개 및 시료 희석 완충액으로서 HBS-EP+ 완충액을 사용하여 25℃에서 30 uL/분의 유속으로 수행되었다.
실험의 설정은 다음과 같았다:
1. 10 ug/mL 농도의 c208F2 용액이 두 번째 플로우셀에 60초 동안 주입되었다.
2. 테스트된 IGF-1R 제작물들은 전개 완충액으로 10배 희석된 배양 배지의 농축된 상청액들에 해당한다. 한 가지 제작이 120초의 지연으로 120초 동안 각각의 순환에 주입되었다.
3. 플로우셀들 둘 다는 10 mM 글리신, HCl pH 1.7 완충액의 주입으로 30초 동안 재생되었다.
도 30은 2회 순환의 중복을 보여준다. h-IGF-1R 및 m-IGF-1R 상청액들이 첫 번째 및 두 번째 순환 동안 각각 주입되었다. 이러한 실험은 c208F2 항체와 결합하는 m-IGF-1R의 무능력을 분명하게 보여준다. c208F2 포집 수준 및 IGF-1R 결합 수준의 결정에 사용되는 위치는 이중 화살표들에 의해 표시된다.
IGFR의 세포외 도메인들 (신호 펩타이드 없음)은 각각 인간 및 마우스 서열을 위한 805개 및 806개 아미노산으로 구성된다.
869개 잔기들 (96%)이 둘 다의 구조들에서 일치한다. 마우스 서열의 37개 잔기들이 해당하는 인간 서열과 서로 다르다. 하나의 차이는 갭에 해당한다.
도 31에 나타낸 바와 같이, 테스트된 7가지 키메라형 제작물들 중에서 h-IGF-1R로서 4가지 (C1 (서열번호 83), C4 (서열번호 86), C7 (서열번호 88) 및 C8 (서열번호 89)) 뿐만 아니라 가 c208F2와 결합하고, mIGF-1R (서열번호 91)와 같은 3가지 제작물들 (C2 (서열번호 84), C3 (서열번호 85) 및 C6 (서열번호 87))은 c208F2와 결합하지 않았다.
C1의 결합 및 C2의 결합 결여는 c208F2의 결합을 차단하는 마우스 특이적 잔기들이 단백질의 N-말단 절반에 위치하는 점을 제시한다. 따라서 C-말단 절반에 위치하는 마지막 11개의 특이적 마우스 아미노산들은 c208F2의 결합에 전혀 영향을 미치지 않는다.
C3의 결합 결여는 494번 위치에서 His 대신에 하나의 마우스 특이적 잔기 Arg의 주요한 기여를 나타낸다. 이러한 결과는 두 가지 마우스 특이적 잔기를 포함하는 C6의 결합 결여에 의해 검증된다: His 494 > Arg 및 Ser 501 > Trp.
C4의 결합은 이러한 키메라형 IGF-1R의 501번 위치에서 단지 마우스 특이적 잔기 Trp만이 C2 및 C6의 결합 결여를 부여하지 않는 점을 제시한다.
C7의 결합은 이러한 제작물들에 존재하는 17가지의 마우스 특이적 잔기들 어느 것도 c208F2 결합의 차단에서 중요하지 않은 점을 제시한다.
마찬가지로, C8의 결합은 4가지의 나머지 마우스 특이적 잔기들을 배제시킨다.
L1 도메인에서 세 개의 마우스 잔기들 예로 28번 위치에서 Tyr 대신에 Phe, 125번 위치에서 Val 대신에 Ile, 156번 위치에서 Met 대신에 Leu을 제시하는 인간 IGF-1R의 C12 돌연변이체는 나노몰 이하의 해리 상수에서 c208F2와 결합한다. 이러한 실험은 L1 도메인이 항체의 결합에 관여하지 않거나 적어도 마우스 및 인간 서열을 구별하였던 3개 위치들이 IGF-1R의 마우스 형태에서 항체의 결합 부재를 부여하지 않는 점을 검증한다.
도 33에서 나타낸 바와 같이, hz208F2가 항체의 6개 His C-말단에 의해 CM5 센서칩 상에 포집된 h-IGF1R의 용해성 형태의 C29 돌연변이체 (Asp 491 > Ala) 120 RU와 결합할 수 없는 반면 (흰색 다이아몬드들), 동일한 용액의 항체는 용해성 수용체의 야생형 형태 170 RU와 결합한다 (검은색 다이아몬드들). His 494와 같이, Asp 491도 IGF-1R을 위한 hz208F2의 친화도에 결정적이다. 결정분석 데이타는 둘 다의 잔기들이 FnR3 도메인에서 수용체의 표면에 노출되는 점을 보여준다.
종합하여 이들 결과는 hz208F2가 IGF-1R의 FnR3 도메인과 결합하고 이러한 항체에 의해 인식되는 에피토프가 항체 결합에 결정적인 His 494 및 Asp 491을 포함하는 점을 보여주었다.
SEQUENCE LISTING <110> PIERRE FABRE MEDICAMENT <120> IGF-1R ANTIBODY AND ITS USE AS ADDRESSING VEHICLE FOR THE TREATMENT OF CANCER <130> 367603D33596 <150> US61984160 <151> 2014-04-25 <160> 92 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Consensus CDR -H1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Thr may be replaced by Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Tyr may be replaced by Phe <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Consensus CDR-H2 <400> 2 Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr 1 5 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Consensus CDR-H3 <400> 3 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Consensus CDR-L1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Ser may be replaced by Asn <400> 4 Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Consensus CDR-L2 <400> 5 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<221> MISC_FEATURE <222> (77)..(77) <223> Asn may be replaced by Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (79)..(79) <223> Ala may be replaced by Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (82)..(82) <223> Phe may be replaced by Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (95)..(95) <223> Phe may be replaced by Tyr <400> 41 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Phe Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 42 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 (var. 2), light chain, VL <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Ser may be replaced by Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Arg may be replaced by Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> His may be replaced by Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (65)..(65) <223> Arg may be replaced by Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (71)..(71) <223> Tyr may be replaced by Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(72) <223> Ser may be replaced by Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(77) <223> Asn may be replaced by Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87)..(87) <223> Phe may be replaced by Tyr <400> 42 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr 85 90 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Thr Leu Pro Asn Gly 625 630 635 640 Asn Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gln Arg Gln Pro Gln Asp Gly 645 650 655 Tyr Leu Tyr Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg 660 665 670 Lys Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Asp Val Glu Glu Val Thr Glu Asn Pro 675 680 685 Lys Thr Glu Val Cys Gly Gly Asp Lys Gly Pro Cys Cys Ala Cys Pro 690 695 700 Lys Thr Glu Ala Glu Lys Gln Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Arg 705 710 715 720 Lys Val Phe Glu Asn Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Val Pro Arg Pro 725 730 735 Glu Arg Arg Arg Arg Asp Val Met Gln Val Ala Asn Thr Thr Met Ser 740 745 750 Ser Arg Ser Arg Asn Thr Thr Val Ala Asp Thr Tyr Asn Ile Thr Asp 755 760 765 Pro Glu Glu Phe Glu Thr Glu Tyr Pro Phe Phe Glu Ser Arg Val Asp 770 775 780 Asn Lys Glu Arg Thr Val Ile Ser Asn Leu Arg Pro Phe Thr Leu Tyr 785 790 795 800 Arg Ile Asp Ile His Ser Cys Asn His Glu Ala Glu Lys Leu Gly Cys 805 810 815 Ser Ala Ser Asn Phe Val Phe Ala Arg Thr Met Pro Ala Glu Gly Ala 820 825 830 Asp Asp Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu Pro Arg Pro Glu Asn Ser 835 840 845 Ile Phe Leu Lys Trp Pro Glu Pro Glu Asn Pro Asn Gly Leu Ile Leu 850 855 860 Met Tyr Glu Ile Lys Tyr Gly Ser Gln Val Glu Asp Gln Arg Glu Cys 865 870 875 880 Val Ser Arg Gln Glu Tyr Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Lys Leu Asn Arg 885 890 895 Leu Asn Pro Gly Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Gln Ala Thr Ser Leu Ser 900 905 910 Gly Asn Gly Ser Trp Thr Asp Pro Val Phe Phe Tyr Val Pro Ala Lys 915 920 925 Thr Thr Tyr Glu Asn Phe Met His His His His His His His 930 935 940 <210> 92 <211> 512 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated IGF-1R ECD Nterminal with Alanine at position 491 <400> 92 Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu 1 5 10 15 Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile 20 25 30 Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg 35 40 45 Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile 50 55 60 Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val 65 70 75 80 Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu 85 90 95 Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe 100 105 110 Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile 115 120 125 Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu 130 135 140 Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile 145 150 155 160 Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys 165 170 175 Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys 180 185 190 Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr 195 200 205 Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys 210 215 220 Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser 225 230 235 240 Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr 245 250 255 Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu 260 265 270 Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala 275 280 285 Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met 290 295 300 Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr 305 310 315 320 Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys 325 330 335 Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly 340 345 350 Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn 355 360 365 Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val 370 375 380 Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser 385 390 395 400 Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly 405 410 415 Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp 420 425 430 Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe 435 440 445 Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu 450 455 460 Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg 465 470 475 480 Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Ala Val Leu His Phe Thr 485 490 495 Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr 500 505 510

Claims (37)

  1. 서열번호 52의 인간 인슐린 유사 성장인자 1 수용체 (IGF-1R)와 결합하고, IGF-1R과의 결합 이후에 내재화되며, 서열번호 82 및/또는 서열번호 92의 IGF-1R과 결합하지 않는, 내재화 단일클론 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편으로서,
    상기 항체는:
    서열번호 7, 2 및 3의 서열들의 3가지 중쇄 CDR들 및 서열번호 9, 5 및 11의 서열들의 3가지 경쇄 CDR들을 포함하고, 상기 CDR들은 IMGT에 의해 정의되는, 내재화 단일클론 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 내재화 단일클론 항체의 에피토프는 서열번호 52의 494번 위치에 히스티딘 잔기 및/또는 서열번호 52의 491번 위치에 아스파트산 잔기를 포함하는, 내재화 단일클론 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 에피토프는 적어도 8개 아미노산들의 아미노산 서열을 포함하는, 내재화 단일클론 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편.
  4. 제 1항에 있어서,
    내재화의 백분율은 항체의 IGF-1R과 결합 이후에 적어도 40%가 되는, 내재화 단일클론 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 키메라 항체인, 내재화 단일클론 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 항체는
    a) 서열번호 13의 서열 또는 서열번호 13과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 9, 5 및 11의 서열들의 3가지 경쇄 CDR들을 포함하는 항체; 및
    b) 서열번호 18의 서열 또는 서열번호 18와 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열들의 3가지 중쇄 CDR들을 포함하는 항체;
    로부터 선택되는, 내재화 단일클론 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 항체는
    서열번호 23의 서열의 중쇄 및 서열번호 28의 서열의 경쇄를 포함하거나 이로 구성되는, 내재화 단일클론 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 인간화 항체인, 내재화 단일클론 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편.
  9. 제 8항에 있어서,
    a) 각각 서열번호 7, 2 및 3의 서열들의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3, 그리고 인간 생식계열 IGHV1-46*01 (서열번호 46)로부터 유래한 FR1, FR2 및 FR3, 및 인간 생식계열 IGHJ4*01 (서열번호 48)로부터 유래한 FR4를 가지는 중쇄; 및
    b) 각각 서열번호 9, 5 및 11의 서열들의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3, 그리고 인간 생식계열 IGKV1-39*01 (서열번호 47)로부터 유래한 FR1, FR2 및 FR3, 및 인간 생식계열 IGKJ4*01 (서열번호 49)로부터 유래한 FR4를 가지는 경쇄:
    를 포함하는, 내재화 단일클론 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 항체는
    a) 서열번호 33의 서열 또는 서열번호 33과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 9, 5 및 11의 서열들의 3가지 경쇄 CDR들을 포함하는 항체;
    b) 서열번호 34의 서열 또는 서열번호 34와 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 9, 5 및 11의 서열들의 3가지 경쇄 CDR들을 포함하는 항체; 및
    c) 서열번호들 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 및 80으로부터 선택된 서열 또는 서열번호들 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 및 80과 적어도 80% 일치도를 가진 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 9, 5 및 11의 서열들의 3가지 경쇄 CDR들을 포함하는 항체:
    로부터 선택되는, 내재화 단일클론 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편.
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 항체는
    a) 서열번호 35의 서열 또는 서열번호 35와 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열들의 3가지 중쇄 CDR들을 포함하는 항체;
    b) 서열번호 36의 서열 또는 서열번호 36과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열들의 3가지 중쇄 CDR들을 포함하는 항체; 및
    c) 서열번호 57 및 60으로부터 선택된 서열 또는 서열번호 57 또는 60과 적어도 80% 일치도를 가진 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열들의 3가지 중쇄 CDR들을 포함하는 항체:
    로부터 선택되는, 내재화 단일클론 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편.
  12. 제 9항에 있어서,
    상기 항체는
    a) 서열번호 37의 서열 또는 서열번호 37과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 39의 서열 또는 서열번호 39와 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄;
    b) 서열번호 38의 서열 또는 서열번호 38과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 40의 서열 또는 서열번호 40과 적어도 80% 일치도를 나타내는 임의의 서열의 경쇄; 및
    c) 서열번호 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 및 80으로부터 선택된 서열 또는 서열번호 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 또는 80과 적어도 80% 일치도를 가진 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 57 및 60으로부터 선택된 서열 또는 서열번호 57 또는 60과 적어도 80% 일치도를 가진 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체:
    로부터 선택되는, 내재화 단일클론 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는
    프랑스 파스퇴르 연구소, CNCM에 2013년 5월 30일에 기탁된 하이브리도마 I-4757에 의해 생산된, 내재화 단일클론 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편.
  14. 프랑스 파스퇴르 연구소, CNCM에 2013년 5월 30일에 기탁된 마우스 하이브리도마 I-4757.
  15. 제 1항에 있어서,
    IGF-1R을 발현하는 암의 치료를 위한 약제로 사용되고, 상기 항체는 숙주 표적 부위에 세포독성 제제를 전달하고, 상기 숙주 표적 부위는 단백질 IGF-1R 세포외 도메인 내에 정착된 에피토프로 구성되는, 내재화 단일클론 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 단백질 IGF-1R 세포외 도메인은 인간 단백질 IGF-1R 세포외 도메인 (서열번호 51), 또는 그의 임의의 자연적 변이체 서열인, 내재화 단일클론 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편.
  17. 제 15항에 있어서,
    상기 단백질 IGF-1R 세포외 도메인은 인간 단백질 IGF-1R 세포외 도메인 N 말단 (서열번호 52), 또는 그의 임의의 자연적 변이체 서열인, 내재화 단일클론 항체, 또는 그의 내재화 IGF-1R 결합 단편.
  18. 세포독성 제제와 결합되는, 제 1항에 따른 내재화 항체, 또는 그의 내재화 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 결합체.
  19. 제 18항에 있어서,
    약제로서 사용되는, 항체-약물 결합체.
  20. 제 18항에 있어서,
    IGF-1R을 발현하는 암의 치료를 위한 약제로서 사용되는, 항체-약물 결합체.
  21. 제 18항의 항체-약물 결합체, 및 적어도 하나의 부형제 및/또는 약제학적으로 허용가능한 운반체를 포함하는, IGF-1R을 발현하는 암의 치료를 위한 약제학적 조성물.
  22. 제 18항에 있어서,
    개체에서 IGF-1R을 발현하는 암 세포에게로 약물 또는 약제를 전달하는 약제로 사용되는 항체-약물 결합체.
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