RS61379B1

RS61379B1 - Antitelo na igf-1r i njegova upotreba kao usmerenog nosioca za lečenje kancera

Info

Publication number: RS61379B1
Application number: RS20201589A
Authority: RS
Inventors: Liliane Goetsch; Matthieu Broussas; Charlotte Beau-Larvor; Thierry Champion; Alain Robert
Original assignee: Pf Medicament
Priority date: 2014-04-25
Filing date: 2015-04-27
Publication date: 2021-02-26
Also published as: MA53069B1; CN106459204B; TN2016000445A1; KR20220018620A; MA39378B2; KR20200128210A; CN112851808A; IL274226A; MY182444A; MA39378A1; MX2016014000A; IL248357B; SI3134438T1; JP7191134B2; HRP20202047T1; PT3134438T; CA2946795C; CN112851808B; UA122390C2; KR20160145110A

Description

Opis

[0001] Ovde su opisana nova antitela, naročito monoklonska antitela, sposobna da se vežu za IGF-1R, kao i aminokiselinske sekvence i sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju navedena antitela. Sa jednog aspekta, prijava obezbeđuje novo antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, sposoban da se veže za IGF-1R i, indukujući internalizaciju IGF-1R, biva internalizovan u ćeliju. Upotreba navedenog antitela kao usmerenog proizvoda ili nosioca u konjugaciji sa drugim anti-kancerskim jedinjenjima kao što su toksini, radioaktivni elementi ili lekovi, i upotreba istih za lečenje određenih kancera, su takođe opisane.

[0002] Receptor faktora rasta 1 sličan insulinu, koji se zove IGF-1R (zove se i IGF1R ili IGF-IR), je receptor sa aktivnošću tirozin kinaze koja ima 70% homologije sa insulinskim receptorom IR. IGF-1R je glikoprotein molekulske težine približno 350000. To je heterotetrameran receptor čija je svaka polovina -vezana disulfidnim mostovima- sastavljena od vanćelijske α-podjedinice i transmembranske β-podjedinice. IGF-1R vezuje IGF1 i IGF2 sa vrlo visokim afinitetom (Kd #1 nM), ali je jednako sposoban da veže insulin sa 100 do 1000 puta nižim afinitetom. Obrnuto, IR vezuje insulin sa vrlo visokim afinitetom, mada se IGF samo vezuju za insulinski receptor sa 100 puta nižim afinitetom. Tirozin kinazni domeni IGF-1R-a i IR-a imaju vrlo visoku sekvencnu homologiju, mada se zone niže homologije respektivno odnose na region bogat cisteinom smešten na α-podjedinici i C-terminalnom delu β-podjedinice. Razlike u sekvencama uočene u α-podjedinici su smeštene u zoni vezivanja liganada i zato su u osnovi relativnih afiniteta IGF-1R i IR za IGF i insulin, respektivno. Razlike u C-terminalnom delu β-podjedinice dovode do razlaza signalnih puteva dva receptora; IGF-1R posreduje u efektima mitogeneze, diferencijacije i anti-apoptoze, dok aktivacija IR u principu uključuje efekte na nivou metaboličkih puteva.

[0003] Citoplazmatski proteini tirozin kinaze se aktiviraju vezivanjem liganda za vanćelijski domen receptora. Aktivacija kinaza sa svoje strane uključuje stimulaciju različitih unutarćelijskih supstrata, uključujući IRS-1, IRS-2, Shc i Grb 10. Dva glavna supstrata IGF-1R su IRS i Shc koji posreduju, aktivacijom brojnih efektora nizvodno, u većini efekata rasta i diferencijacije spojenih sa vezom IGF-ova sa ovim receptorom. Dostupnost supstrata može sledstveno da diktira konačan biološki efekat povezan sa aktivacijom IGF-1R. Kad preovladava IRS-1, ćelije teže da proliferuju i da se transformišu. Kad prevladava Shc, ćelije teže da se diferenciraju. Izgleda da je put, koji je u principu uključen u efekte zaštite protiv apoptoze, put fosfatidil-inozitol 3-kinaza (PI 3-kinaze).

[0004] Uloga sistema IGF u karcinogenezi je postala predmet intenzivnog istraživanja u poslednjih deset godina. Ovaj interes je počeo posle otkrića činjenice da je, pored svojih mitogenih i antiapoptotičnih osobina, IGF-1R, izgleda, potreban za ustanovljavanje i održavanje transformisanog fenotipa. U stvari, dobro je utvrđeno da prekomerna ekspresija ili konstitutivna aktivacija IGF-1R dovodi, u širokom spektru ćelija, do rasta ćelija nezavisno od podrške u medijumima bez fetalnog telećeg seruma i do formiranja tumora u golim miševima. Ovo samo po sebi nije jedinstvena osobina pošto širok spektar proizvoda prekomerno eksprimiranih gena, uključujući dobar broj receptora faktora rasta, može da transformiše ćelije. Međutim, suštinsko otkriće, koje je jasno demonstriralo da glavnu ulogu u transformisanju igra IGF-1R, je bila demonstracija da su IGF-1R<->ćelije, u kojima je gen koji kodira IGF-1R inaktiviran, potpuno refraktorne na transformaciju različitim agensima koji su obično u stanju da transformišu ćelije, kao što je protein E5 goveđeg papiloma virusa, prekomerna ekspresija EGFR ili PDGFR, T antigen SV 40, aktivirani ras ili kombinacija ova dva poslednja faktora.

[0005] IGF-1R je eksprimiran u širokom spektru tumora i tumorskih linija i IGF amplifikuje rast tumora preko njihovog vezivanja za IGF-1R. Drugi argumenti u prilog ulozi IGF-1R u karcinogenezi dolaze iz studija sa korišćenjem mišjih monoklonskih antitela usmerenih protiv receptora ili sa korišćenjem negativnih dominanti IGF-1R. U stvari, mišja monoklonska antitela usmerena protiv IGF-1R inhibiraju proliferaciju brojnih ćelijskih linija u kulturi i rast tumorskih ćelija in vivo. Takođe je pokazano da je negativna dominanta IGF-1R sposobna da inhibira proliferaciju tumora.

[0006] U takvom kontekstu, IGF-1R je u dugom periodu smatran za interesantnu metu u onkologiji. Veliki broj projekata usmerenih na IGF-1R (humanizovana ili humana antitela ili mali molekuli) je inicirano da se razviju antitela na IGF-1R za lečenje kancera i više od 70 kliničkih ispitivanja je izvedeno u raznim indikacijama. Na primer, WO 2008/079849 otkriva antitela na IGF-1R i njihovu antitumorsku aktivnost. Ipak, do danas, nijedan od ovih projekata nije bio uspešan i na tržištu ne postoje antitela na IGF-1R uprkos čestoj prekomernoj ekspresiji ove mete opisane kod mnogih pacijenata u širokom spektru indikacija.

[0007] Štaviše, niz kliničkih ispitivanja koja uključuju antitela na IGF-1R kombinovana sa anti-EGFR antitelima da bi se gađali i EGFR i IGF-1R, je propao, jer nijedno od ovih antitela nije bilo u stanju da leči pacijente sa KRAS mutacijom.

[0008] Kao posledica, IGF-1R se sada ne smatra glavnom metom i, u istraživanju za potencijalna terapijska antitela, IGF-1R više nije od naročitog interesa.

[0009] Ipak, mora se primetiti da su napori u generisanju IGF-1R antitela bili fokusirani na gola antitela, tj. antitela koja su korisna zbog svojih intrinsičnih osobina. U tom smislu, IGF-1R se ne smatra pogodnom metom za generisanje imunokonjugata kao što je konjugat antitelo-lek (pominjan kao "ADC"), jer je IGF-1R opisan kao meta, koju takođe uveliko eksprimiraju normalne ćelije, uključujući krvne sudove. U tom smislu, može se primetiti da je najnovije antitelo na IGF-1R, tj. AVE1642, razvijeno kao golo antitelo, "nenaoružano" lekom. Isto je i sa drugim antitelima na IGF-1R koja su trenutno u razvoju i sa svima onima koja nisu uspela u kliničkim ispitivanjima.

[0010] Pronalazak je definisan u dodatim zahtevima i svi drugi dati aspekti ili rešenja su samo za informisanje.

[0011] Predmetna prijava teži da popravi ove probleme i opisuje antitelo na IGF-1R sposobno da se veže za IGF-1R na specifičan način čime je pogodno da se koristi “naoružano” lekom. Konkretnije, prijava se odnosi na antitelo na IGF-1R koje ispoljava određene osobine kao što je to da je savršen kandidat za korišćenje “naoružano” u kontekstu imunokonjugata.

[0012] U prvom rešenju, obezbeđeno je antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, koje i) se vezuje za humani IGF-1R i ii) biva internalizovano posle vezivanja za navedeni humani IGF-1R.

[0013] Termini "antitelo", "antitela", "ab", "Ab" ili "imunoglobulin" se koriste u istom značenju u najširem smislu i uključuju monoklonska antitela, izolovana, konstruisana, hemijski sintetisana, ili rekombinantna antitela (npr., cele dužine ili intaktna monoklonska antitela), poliklonska antitela, multivalentna antitela ili multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela), a i fragment antitela, dok god ispoljavaju željenu biološku aktivnost. Posebno, obezbeđeno je rekombinantno antitelo.

[0014] Konkretnije, takav molekul sesastoji od glikoproteina koji sadrži bar dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki težak lanac obuhvata varijabilni region (ili domen) teškog lanca (ovde skraćeno sa HCVR ili VH) i konstantan region teškog lanca. Konstantan region teškog lanca obuhvata tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki lak lanac obuhvata varijabilni region lakog lanca (ovde skraćeno sa LCVR ili VL) i konstantan region lakog lanca. Konstantan region lakog lanca obuhvata jedan domen, CL. VH i VL regioni se dalje mogu podeliti na regione hipervarijabilnosti, nazvane regioni koji određuju komplementarnost (CDR), prožete regionima koji su više očuvani, nazvanim okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDR i četiri FR, poređanih od aminoterminusa do karboksi-terminusa sledećim redom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu da posreduju u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.

[0015] Pod "fragment koji vezuje IGF-1R" ili "fragment koji vezuje antigen" antitela, podrazumeva se bilo koji peptid, polipeptid ili protein koji zadržava sposobnost da se veže za metu (koja se generalno zove antigen) antitela.

[0016] U jednom rešenju, takvi "fragmenti koji vezuju antigene" su izabrani iz grupe koja se sastoji od Fv, scFv (sc od single chain, što znači jedan lanac), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc fragmenata ili dijatela, ili bilo kog fragmenta čije bi poluvreme života bilo povećano hemijskom modifikacijom, kao što je dodavanje poli(alkilen) glikola, kakav je poli(etilen) glikol ("PEGilacija") (pegilovani fragmenti, koji se zovu Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG ili Fab'-PEG) ("PEG" za Poli (Etilen) Glikol), ili ugrađivanje u lipozom, gde navedeni fragmenti imaju bar jednu od osobina CDR-ova antitela od interesa. Poželjno, navedeni "fragmenti koji vezuju antigene" će biti konstituisani ili će sadržati delimičnu sekvencu teškog ili lakog varijabilnog lanca antitela iz kog su izvedeni, gde je navedena parcijalna sekvenca dovoljna da zadrži istu specifičnost vezivanja kao antitelo iz kog je potekla i dovoljan afinitet, poželjno bar jednak 1/100, na poželjniji način, do bar 1/10 afiniteta antitela iz kog je potekao, u odnosu na metu. Još poželjnije, navedeni "fragmenti koji vezuju antigene" će biti konstituisani ili će sadržati bar tri CDR-a CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 teškog varijabilnog lanca i tri CDR-a CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 lakog varijabilnog lanca antitela iz kog su izvedeni.

[0017] Pod "vezivanje", "vezuje" ili slično, podrazumeva se da antitelo, ili bilo koji njegov fragment koji vezuje antigen, formira kompleks sa antigenom koji je relativno stabilan u fiziološkim uslovima. Specifično vezivanje se može okarakterisati ravnotežnom konstantom disocijacije od bar oko 1x10<-6>M ili manjom. Metodi za određivanje da li se dva molekula vezuju su dobro poznati u struci i uključuju, na primer, ravnotežnu dijalizu, površinsku plazmonsku rezonancu i slično. Da bi se izbegla sumnja, to ne znači da navedeno antitelo ne bi moglo da se veže ili da interferira, na niskom nivou, sa nekim drugim antigenom. Ipak, kao rešenje, navedeno antitelo se vezuje samo za navedeni antigen.

[0018] Kao što se koristi u predmetnoj specifikaciji, izraz "antitelo na IGF-1R" bi trebalo da se interpretira slično kao "anti-IGF-lR antitelo" i označava antitelo sposobno da se veže za IGF-1R.

[0019] U jednom specifičnom primeru, epitop antitela je smešten u vanćelijski domen humanog IGF-1R (zvanog i ECD IGF-1R).

[0020] Poželjno, antitelo, ili bilo koji njegov fragment za vezivanje antigena, je u stanju da se veže za IGF-1R sa EC50između 10x10<-10>i 1x10<-10>, a još poželjnije, između 8x10<-10>i 2x10<-10>.

[0021] U tom smislu, "EC50" se odnosi na 50% efektivne koncentracije. Preciznije, termin polovina maksimalne efektivne koncentracije (EC50) odgovara koncentraciji leka, antitela ili toksikanta koji indukuje odgovor do polovine između osnovne linije i maksimuma posle nekog specifikovanog vremena izlaganja. On se obično koristi kao mera potentnosti leka. EC50krive doza-odgovor, prema tome, predstavlja koncentraciju jedinjenja pri kojoj se vidi 50% njegovog maksimalnog efekta. EC50krive kvantalnog odnosa doze i efekta leka predstavlja koncentraciju jedinjenja pri kojoj 50% populacije pokazuje odgovor, posle nekog specifikovanog trajanja izlaganja. Mere koncentracije tipično prate sigmoidnu krivu, rastući brzo tokom relativno male promene koncentracije. Ovo se može odrediti matematički pravljenjem izvoda linije sa najboljim fitom.

[0022] Poželjno, određenim EC50karakteriše se potentnost antitela da se veže za ECD IGF-1R izložen na humanim tumorskim ćelijama. Parametar EC50se određuje pomoću FACS analize. Parametar EC50odražava koncentraciju antitela za koju se dobija 50% maksimalnog vezivanja za humani IGF-1R eksprimiran na humanim tumorskim ćelijama. Svaka vrednost EC50je izračunata kao središnja tačka krive doza-odgovor korišćenjem programa za fitovanje regresione krive sa četiri parametra (Prism Software). Ovaj parametar je odabran da predstavlja fiziološke/patološke uslove.

[0023] Termin "epitop" je region antigena koji je vezan proteinom koji vezuje antigen, uključujući antitela. Epitopi se mogu definisati kao strukturni ili funkcionalni. Funkcionalni epitopi su generalno podskup strukturnih epitopa i imaju one ostatke koji direktno doprinose afinitetu interakcije. Epitopi mogu biti i konformacioni, odnosno, sastavljeni od nelinearnih aminokiselina, drugim rečima, konformacioni epitopi se sastoje od aminokiselina koje nisu deo sekvence. U određenim rešenjima, epitopi mogu da uključuju determinante koje su hemijski aktivne površinske grupacije molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforil grupe ili sulfonil grupe i, u određenim rešenjima, mogu da imaju specifične trodimenzione strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja.

[0024] Obezbeđen je i metod biranja antitela koje se internalizuje, ili njegovog fragmenta za vezivanje IGF-1R koji se internalizuje, koji se vezuje za humani receptor faktora rasta 1 sličan insulinu (IGF-1R) i internalizuje se posle vezivanja za IGF-1R, gde navedeni metod obuhvata korak biranja antitela:

i) koje se vezuje za IGF-1R sekvence SEQ ID N°52 i

ii) koje se ne vezuje za IGF-1R SEQ sekvence ID N°52 sa aminokiselinom koja nije histidin na poziciji 494 sekvence SEQ ID N°52 ili sa asparaginska kiselina (ASP) na poziciji 491, naročito koje se ne vezuje za IGF-1R sekvence SEQ ID N°52 sa aminokiselinama koje nisu histidin na poziciji 494 sekvence SEQ ID N°52 i asparaginska kiselina (ASP) na poziciji 491.

[0025] Obezbeđen je i metod biranja antitela koje se internalizuje, ili njegovog fragmenta za vezivanje IGF-1R koji se internalizuje, koje se vezuje za humani receptor faktora rasta 1 sličan insulinu (IGF-1R) i internalizuje posle vezivanja za IGF-1R, gde navedeni metod obuhvata korake:

1) biranja antitela:

i) koje se vezuje za IGF-1R sekvence SEQ ID N°52 i

ii) koje se ne vezuje za IGF-1R SEQ sekvence ID N°52 sa aminokiselinom koja nije histidin na poziciji 494 sekvence SEQ ID N°52 ili sa asparaginskom kiselinom (ASP) na poziciji 491, koje se naročito ne vezuje za IGF-1R sekvence SEQ ID N°52 sa aminokiselinom koja nije histidin na poziciji 494 sekvence SEQ ID N°52 i asparaginska kiselina (ASP) na poziciji 491,

a onda, iz takvog antitela,

2) biranja antitela koje se internalizuje, ili njegovog fragmenta za vezivanje IGF-1R koji se internalizuje, gde je procenat internalizacije posle njegovog vezivanja za IGF-1R bar 40%, poželjno bar 50%, bar 60%, bar 70% ili bar 80%.

[0026] Obezbeđen je i metod biranja antitela koje se internalizuje, ili njegovog fragmenta za vezivanje IGF-1R koji se internalizuje, koje se vezuje za humani receptor faktora rasta 1 sličan insulinu (IGF-1R) i internalizuje posle vezivanja za IGF-1R, gde navedeni metod obuhvata korake:

1) biranja antitela koje se internalizuje, ili njegovog fragmenta za vezivanje IGF-1R koji se internalizuje, gde je procenat internalizacije posle njegovog vezivanja za IGF-1R bar 40%, poželjno bar 50%, bar 60%, bar 70% ili bar 80%,

2) a onda, iz takvog antitela:

i) koje se vezuje za IGF-1R sekvence i

ii) koje se ne vezuje za IGF-1R SEQ sekvence ID N°52 sa aminokiselinom koja nije histidin na poziciji 494 sekvence SEQ ID N°52 ili sa asparaginskom kiselinom (ASP) na poziciji 491, naročito koje se ne vezuje za IGF-1R sekvence SEQ ID N°52 sa aminokiselinom koja nije histidin na poziciji 494 sekvence SEQ ID N°52 i asparaginska kiselina (ASP) na poziciji 491.

[0027] U metodu opisanom gore, korak biranja antitela po njegovim karakteristikama internalizacije i vezivanja, ili nevezivanja, za IGF-1R može se izvoditi bilo kojim redosledom.

[0028] Specifično, predmetna prijava se odnosi na antitelo koje se internalizuje, ili na njegov fragment za vezivanje IGF-1R koji se internalizuje, koje se vezuje za humani receptor faktora rasta 1 sličan insulinu (IGF-1R), kao što se dobija jednim od gore navedenih metoda.

[0029] Opisano je i antitelo koje se internalizuje, ili njegov fragment za vezivanje IGF-1R koji se internalizuje, gde se navedeno antitelo vezuje za humani receptor faktora rasta 1 sličan insulinu (IGF-1R) sekvence SEQ ID N°52 i internalizuje se posle vezivanja za IGF-1R, a ne vezuje se za IGF-1R sekvence SEQ ID N°82 ili 92, poželjno SEQ ID N°82 i 92.

[0030] Za antitelo opisano ovde, SEQ ID N°52 odgovara aminokiselinskoj sekvenci humanog receptora IGF-1R, gde je histidin na poziciji 494, tj. prirodnog IGF-1R, dok SEQ ID N°82 odgovara mutiranoj aminokiselinskoj sekvenci humanog receptora IGF-1R, gde je arginin na poziciji 494, dok SEQ ID N°92 odgovara mutiranoj aminokiselinskoj sekvenci humanog receptora IGF-1R, gde je alanin na poziciji 491.

[0031] Opisano je i antitelo koje se internalizuje, ili njegov fragment za vezivanje IGF-1R koji se internalizuje, čiji epitop sadrži aminokiselinu histidin na poziciji 494 sekvence SEQ ID N° 52.

[0032] Opisano je i antitelo ili njegov fragment za vezivanje IGF-1R koji se internalizuje, čiji epitop sadrži aminokiselinu histidin na poziciji 494 sekvence SEQ ID N°52, sa navedenim epitopom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od bar 8 aminokiselina.

[0033] Opisano je i antitelo koje se internalizuje, ili njegov fragment za vezivanje IGF-1R koji se internalizuje, čiji epitop sadrži aminokiselinu asparagin na poziciji 491 sekvence SEQ ID N°52, čiji epitop sadrži aminokiselinsku sekvencu od bar 8 aminokiselina.

[0034] Opisano je i antitelo koje se internalizuje, ili njegov fragment za vezivanje IGF-1R koji se internalizuje, čiji epitop sadrži aminokiselinu histidin na poziciji 494 i aminokiselinu asparagin na poziciji 491 sekvence SEQ ID N°52, sa navedenim epitopom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od bar 8 aminokiselina.

[0035] Opisano je i antitelo koje se internalizuje, ili njegov fragment za vezivanje IGF-1R koji se internalizuje, čiji epitop sadrži aminokiselinu histidin na poziciji 494 sekvence SEQ ID N°52, sa navedenim epitopom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 aminokiselina.

[0036] Opisano je i antitelo koje se internalizuje, ili njegov fragment za vezivanje IGF-1R koji se internalizuje, čiji epitop sadrži aminokiselinu histidin na poziciji 494 sekvence SEQ ID N°52, sa navedenim epitopom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od bar 8 aminokiselina, gde navedeni epitop sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: - aminokiselinske sekvence identične sa, ili koja ispoljava bar 80% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom od aminokiseline na poziciji 487 do aminokiseline na poziciji 494 sekvence SEQ ID N°52,

- aminokiselinske sekvence identične sa, ili koja ispoljava bar 80% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom od aminokiseline na poziciji 488 do aminokiseline na poziciji 495 sekvence SEQ ID N°52,

- aminokiselinske sekvence identične sa, ili koja ispoljava bar 80% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom od aminokiseline na poziciji 489 do aminokiseline na poziciji 496 sekvence SEQ ID N°52,

- aminokiselinske sekvence identične sa, ili koja ispoljava bar 80% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom od aminokiseline na poziciji 490 do aminokiseline na poziciji 497 sekvence SEQ ID N°52,

- aminokiselinske sekvence identične sa, ili koja ispoljava bar 80% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom od aminokiseline na poziciji 491 do aminokiseline na poziciji 498 sekvence SEQ ID N°52,

- aminokiselinske sekvence identične sa, ili koja ispoljava bar 80% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom od aminokiseline na poziciji 492 do aminokiseline na poziciji 499 sekvence SEQ ID N°52, i

- aminokiselinske sekvence identične sa, ili koja ispoljava bar 80% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom od aminokiseline na poziciji 493 do aminokiseline na poziciji 500 sekvence SEQ ID N°52.

[0037] Opisano je i antitelo koje se internalizuje, ili njegov fragment za vezivanje IGF-1R koji se internalizuje, čiji epitop sadrži aminokiselinu asparagin na poziciji 491 sekvence SEQ ID N°52, sa navedenim epitopom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 aminokiselina.

[0038] Opisano je i antitelo koje se internalizuje, ili njegov fragment za vezivanje IGF-1R koji se internalizuje, čiji epitop sadrži aminokiselinu asparagin na poziciji 491 sekvence SEQ ID N°52, sa navedenim epitopom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od bar 8 aminokiselina, gde navedeni epitop sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od:

- aminokiselinske sekvence identične sa, ili koja ispoljava bar 80% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom od aminokiseline na poziciji 484 do aminokiseline na poziciji 491 sekvence SEQ ID N°52,

- aminokiselinske sekvence identične sa, ili koja ispoljava bar 80% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom od aminokiseline na poziciji 485 do aminokiseline na poziciji 492 sekvence SEQ ID N°52,

- aminokiselinske sekvence identične sa, ili koja ispoljava bar 80% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom od aminokiseline na poziciji 486 do aminokiseline na poziciji 493 sekvence SEQ ID N°52,

- aminokiselinske sekvence identične sa, ili koja ispoljava bar 80% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom od aminokiseline na poziciji 487 do aminokiseline na poziciji 494 sekvence SEQ ID N°52,

- aminokiselinske sekvence identične sa, ili koja ispoljava bar 80% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom od aminokiseline na poziciji 489 do aminokiseline na poziciji 496 sekvence SEQ ID N°52, i

- aminokiselinske sekvence identične sa, ili koja ispoljava bar 80% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom od aminokiseline na poziciji 490 do aminokiseline na poziciji 497 sekvence SEQ ID N°52.

[0039] Specifično, opisano je antitelo koje se internalizuje, ili njegov fragment za vezivanje IGF-1R koji se internalizuje, čiji epitop sadrži aminokiselinu histidin na poziciji 494 i asparagin na poziciji 491 sekvence SEQ ID N°52, sa navedenim epitopom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 aminokiselina.

[0040] Opisano je i antitelo koje se internalizuje, ili njegov fragment za vezivanje IGF-1R koji se internalizuje, čiji epitop sadrži aminokiselinu histidin na poziciji 494 i asparagin na poziciji 491 sekvence SEQ ID N°52, sa navedenim epitopom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od bar 8 aminokiselina, gde navedeni epitop sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od:

- aminokiselinske sekvence identične sa, ili koja ispoljava bar 80% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom od aminokiseline na poziciji 490 do aminokiseline na poziciji 497 sekvence SEQ ID N°52 i

- aminokiselinske sekvence identične sa, ili koja ispoljava bar 80% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom od aminokiseline na poziciji 491 do aminokiseline na poziciji 498 sekvence SEQ ID N°52.

[0041] Opisano je i antitelo koje se internalizuje, ili njegov fragment za vezivanje IGF-1R, koje se internalizuje i koje se vezuje za humani receptor faktora rasta 1 sličan insulinu (IGF-1R) sekvence SEQ ID N°52 i internalizuje se posle vezivanja za IGF-1R, a koje se ne vezuje za IGF-1R sekvence SEQ ID N°82 ili čiji epitop sadrži aminokiselinu histidin na poziciji 494 i/ili aminokiselinu asparagin na poziciji 491 sekvence SEQ ID N°52, gde je procenat internalizacije navedenog antitela posle njegovog vezivanja za IGF-1R bar 40%, bar 50%, bar 60%, bar 70%, ili bar 80%. Procenat internalizacije antitela, ili njegovog fragmenta za vezivanje, se može odrediti bilo kojim metodom poznatim stručnjaku, kao što je, na primer, metod opisan u predmetnoj specifikaciji.

[0042] Poželjno je da navedena aminokiselina različita od histidina na poziciji 494 sekvence SEQ ID N°52, opisana gore, bude arginin (SEQ ID N°82).

[0043] Poželjno je da navedena aminokiselina različita od asparagina na poziciji 491 sekvence SEQ ID N°52, opisana gore, bude alanin (SEQ ID N°92)

[0044] Ovde je opisano antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, gde se navedeno antitelo vezuje za humani receptor faktora rasta 1 sličan insulinu (IGF-1R) i internalizuje posle vezivanja za IGF-1R i gde je navedeno antitelo odabrano od:

i) antitela koje sadrži tri CDR teškog lanca sa CDR-H2 sekvence SEQ ID br. 2 i CDR-H3 sekvence SEQ ID br.3 i tri CDR lakog lanca sa CDR-L2 sekvence SEQ ID br.5;

ii) antitelo koje je u kompeticiji za vezivanje IGF-1R sa antitelom iz i) i

iii) antitelo koje se vezuje za isti epitop IGF-1R kao antitelo iz i).

[0045] Kompeticija za vezivanje za IGF-1R se može odrediti bilo kojim metodima ili tehnikama poznatim stručnjaku, kao što su, bez ograničenja, radioaktivnost, Biacore, ELISA, protočna citometrija, itd, ili prema metodu kao što je ovde opisano.

[0046] Određivanje vezivanja za isti epitop se može odrediti bilo kojim metodima ili tehnikama poznatim stručnjaku, kao što su, bez ograničenja, radioaktivnost, Biacore, ELISA, protočna citometrija, itd. ili prema metodu kao što je opisano u predmetnoj prijavi.

[0047] Kao što je gore pomenuto, i suprotno opštem znanju, predmetna prijava se fokusira na specifična antitela na IGF-1R koja imaju visoku sposobnost da budu internalizovana posle vezivanja za IGF-1R. Kao što se ovde koristi, antitelo koje "je internalizovano" ili koje se "internalizovalo" (ova dva izraza su slična) je ono koje je uzela ćelija (u značenju ono "ulazi") posle vezivanja za IGF-1R na sisarskoj ćeliji. Takvo antitelo je interesantno kao jedna od komponenata imuno-lek konjugata, tako da se ono obraća ili usmerava vezan citotoksični agens u ciljane ćelije, poželjno kancerske ćelije. Jednom kad je internalizovan, citotoksični agens uključuje smrt kancerske ćelije.

[0048] Poželjno je da sva antitela opisana ovde imaju iste sekvence za CDR-H2, CDR-H3 i CDR-L2, a da su ostala 3 CDR različita. Ova opservacija deluje koherentno kao deo opšteg znanja, u vezi sa specifičnošću vezivanja antitela, da je CDR-H3 opisan kao najvažniji i najviše impliciran u prepoznavanje epitopa

[0049] Smatra se da je važan ključ za uspeh terapije imunokonjugatima specifičnost ciljanog antigena i internalizacija kompleksa proteina koji vezuje antigen u kancerske ćelije. Očigledno su antigeni koji se ne internalizuju manje efektivni u dostavljanju citotoksičnih agenasa nego oni koji se internalizuju. Procesi internalizacije su različiti za različite antigene i zavise od mnogo parametara na koja mogu da utiču antitela.

[0050] U imunokonjugatu, citotoksični agens donosi citotoksičnu aktivnost, a upotrebljeno antitelo donosi specifičnost protiv kancerskih ćelija, kao i vektor za ulazak u ćelije da korektno usmeri citotoksičan agens. Dakle, da bi se popravio imunokonjugat, antitelo može da ispolji visoku sposobnost da se internalizuje u ciljane kancerske ćelije. Efikasnost internalizacije posredovane antitelom se značajno razlikuje u zavisnosti od ciljanog epitopa. Izbor antitela na IGF-1R potentnih u internalizaciji zahteva razne eksperimentalne podatke ne samo o nishodnoj regulaciji IGF-1R, nego i o internalizaciji antitela na IGF-1R u ćelije.

[0051] U jednom rešenju, internalizacija antitela opisanog ovde se može proceniti imunofluorescencijom (kao što je dato u primeru dalje u predmetnoj prijavi) ili bilo kojim metodom ili postupkom poznatim stručnjaku specifičnom za mehanizam internalizacije.

[0052] Kompleks IGF-1R/antitelo se internalizuje posle vezivanja antitela za ECD navedenog IGF-1R i indukuje se smanjenje količine IGF-1R na površini ćelije. Ovo smanjenje se može kvantifikovati bilo kojim metodom poznatim stručnjaku, kao što su, kao neograničavajući primeri, vestern blot, FACS, imunofluorescencija i slično.

[0053] U jednom rešenju, ovo smanjenje koje, dakle, odražava internalizaciju, se može poželjno meriti FACS-om i izraziti kao razlika ili delta između srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI) merenog na 4°C sa MFI merenim na 37°C posle 4 sata inkubacije sa antitelom.

[0054] Kao neograničavajući primer, ova delta se određuje na osnovu MFI dobijenih sa netretiranim ćelijama i ćelijama tretiranim antitelom, korišćenjem i) ćelija kancera dojke MCF7 posle perioda inkubacije od 4 sata sa ovde opisanim antitelom i ii) sekundarnog antitela, obeleženog pomoću Alexa488. Ovaj parametar se definiše kao što je izračunat po sledećoj formuli: Δ(MFI4 C-MFI37 C).

[0055] Ova razlika između MFI-ova odražava nishodnu regulaciju IGF-1R, jer su MFI proporcionalni IGF-1R eksprimiranim na površini ćelije.

[0056] U jednom preimućstvenom aspektu, antitela, ili bilo koji njihov fragment za vezivanje antigena, se sastoje od monoklonskih antitela koja trigeruju Δ(MFI4 C-MFI37 C) na MCF7 od bar 280, poželjno od bar 400.

[0057] U više detalja, gore pomenuta delta se može meriti prema sledećem postupku, koji se mora smatrati ilustrativnim i neograničavajućim primerom:

a) tretiranje i inkubiranje tumorskih ćelija od interesa sa ovde opisanim antitelom, bilo u hladnom (4°C), bilo u toplom (37°C) kompletnom medijumu za kulturu;

b) tretiranje tretiranih ćelija iz koraka a) i, paralelno, netretiranih ćelija sekundarnim antitelom;

c) merenje MFI (reprezentativnog za količinu IGF-1R prisutnog na površini) za tretirane i netretirane ćelije sekundarnim obeleženim antitelom, sposobnim da se veže za antitelo opisano gore i

d) izračunavanje delte oduzimanjem MFI dobijenog na tretiranim ćelijama od MFI dobijenog na netretiranim ćelijama.

[0058] Iz ove delte MFI, procenat internalizacije se može odrediti kao:

[0059] Antitela, ili bilo koji njihov fragment za vezivanje antigena, opisana ovde, predstavljaju na MCF7 procenat internalizacije koji je između 70% i 90%, poželjno između 75% i 87%.

[0060] Naročita prednost ovde opisanih antitela leži u njihovom stepenu internalizacije.

[0061] Opšte je poznato da je, za imunokonjugat, poželjno da antitela koja se koriste ispoljavaju brzu internalizaciju, poželjno u okviru 24 sata od administracije antitela in vivo, a poželjnije u okviru 12 sati, a još poželjnije u okviru 6 sati.

[0062] Kao što je ovde opisano, stepen internalizacije, o kom se govori i kao o smanjenju antitela vezanog na površini ćelije ili raspadu antitela na površini ćelije, se izražava kao t1/2(poluživot) i odgovara vremenu neophodnom da se dobije smanjenje ΔMFI od 50% (ovaj aspekt će biti potpuno jasan kroz sledeće primere).

[0063] Posebna prednost da predmetna antitela imaju t1/2između 5 i 25 minuta, a poželjno između 10 i 20 minuta.

[0064] Posebno rešenje pronalaska se odnosi na antitelo koje sadrži tri CDR teškog lanca sa CDR-H2 sekvenci SEQ ID br.1, 2 i 3 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.4, 5 i 6.

[0065] Jedno rešenje je antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje sadrži tri CDR teškog lanca koji sadrže ili se sastoje od sekvenci SEQ ID br. 1, 2 i 3, ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br. 1, 2 i 3 i tri CDR lakog lanca koji sadrže ili se sastoje od sekvenci SEQ ID br. 4, 5 i 6, ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br.

4, 5 ili 6.

[0066] U jednom drugom rešenju, antitelo, ili bilo koji njegov fragment koji vezuje antigen, obuhvata tri CDR teškog lanca koji sadrže ili se sastoje od sekvenci SEQ ID br. 1, 2 i 3 i tri CDR lakog lanca koji sadrže ili se sastoje od sekvenci SEQ ID br.4, 5 i 6.

[0067] Pod CDR regionima ili CDR-ovima, se podrazumevaju hipervarijabilni regioni teških i lakih lanaca imunoglobulina, kao što je definisano u IMGT.

[0068] Jedinstvena numeracija IMGT je definisana za poređenje varijabilnih domena na kom god antigenskom receptoru, tipu lanca, ili vrsti [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. i Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. U jedinstvenoj numeraciji IMGT, konzervisane aminokiseline uvek imaju istu poziciju, na primer, cistein 23 (1st-CYS), triptofan 41 (CONSERVED-TRP), hidrofobna aminokiselina 89, cistein 104 (2nd-CYS), fenilalanin ili triptofan 118 (J-PHE ili J-TRP). Jedinstvena numeracija IMGT obezbeđuje standardizovano razgraničenje okvirnih regiona (FR1-IMGT: pozicije 1 do 26, FR2-IMGT: 39 do 55, FR3-IMGT: 66 do 104 i FR4-IMGT: 118 do 128) i regiona koji određuju komplementarnost: CDR1-IMGT: 27 do 38, CDR2-IMGT: 56 do 65 i CDR3-IMGT: 105 do 117. Pošto jazovi (gaps) predstavljaju pozicije koje nisu zauzete, dužine CDR-IMGT (prikazane u zagradama i razdvojene tačkama, npr. [8.8.13]) postaju krucijalna informacija. Jedinstvena numeracija IMGT se koristi u 2D grafičkim reprezentacijama, označenim kao IMGT Colliers de Perles [ Ruiz, M. i Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. i Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], i u 3D strukturama u IMGT/3D structure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. i Lefranc, M.-P., T cell receptor i MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

[0069] Mora se razumeti da, bez kontradiktorne specifikacije u predmetnoj specifikaciji, regioni koji određuju komplementarnost ili CDR-ovi, označavaju hipervarijabilne regione teških i lakih lanaca imunoglobulina, kao što je definisano prema sistemu numeracije IMGT [0070] Ipak, CDR se mogu definisati i prema Kabatovom sistemu numeracije (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, i kasnija izdanja). Postoje tri CDR teškog lanca i tri CDR lakog lanca. Ovde, termini "CDR" i "CDR-ovi" se koriste da označe, u zavisnosti od slučaja, jedan ili više, ili čak sve, regione koji sadrže većinu aminokiselinskih ostataka odgovornih za afinitet vezivanja antitela za antigen ili epitop koji ono prepoznaje. Da bi se uprostilo čitanje predmetne prijave, CDR-ovi prema Kabatu nisu definisani. Ipak, za stručnjaka bi bilo očigledno, primenom definicije CDR prema IMGT, da definiše CDR prema Kabatu.

[0071] Kao što se ovde koristi, "procenat identičnosti" dve sekvence nukleinskih kiselina ili aminokiselina znači procenat identičnih nukleotida ili aminokiselinskih ostataka u dve sekvence koje se porede, dobijen posle optimalnog poravnanja, gde je ovaj procenat čisto statistički i razlike između dve sekvence su nasumično distribuirane duž njihovih dužina. Poređenje dve sekvence nukleinskih kiselina ili aminokiselina se tradicionalno vrši poređenjem sekvenci pošto su one optimalno poravnate, gde navedeno poređenje može da se vrši po segmentima ili korišćenjem "prozora poravnanja". Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje se može vršiti, pored poređenja rukom, putem algoritma lokalne homologije Smitha i Waterman-a (1981) [Ad. App. Math. 2:482], putem algoritma lokalne homologije Neddleman-a i Wunsch-a (1970) [J. Mol. Biol.48:443], metodom traženja sličnosti Pearson-a i Lipman-a (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444] ili ili pomoću kompjuterskog softvera koji koristi ove algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ili pomoću softvera za poređenje BLAST NR ili BLAST P).

[0072] Procenat identičnosti dve sekvence nukleinskih kiselina ili aminokiselina se određuje poređenjem dve optimalno poravnate sekvence u kojima sekvenca nukleinske kiseline ili aminokiselina za poređenje može da ima adicije ili delecije u poređenju sa referentnom sekvencom za optimalno poravnanje dve sekvence. Procenat identičnosti se izračunava određivanjem broja pozicija na kojima je aminokiselina, nukleotid ili ostatak identičan u dve sekvence, poželjno u dve kompletne sekvence, deljenjem broja identičnih pozicija ukupnim brojem pozicija u prozoru poravnanja i množenjem rezultata sa 100, da bi se dobio procenat identičnosti dve sekvence.

[0073] Na primer, "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174:247-250), dostupan na sajtu http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, može da se koristi sa datim (default) parametrima (naročito za parametre "open gap penalty": 5 i "extension gap penalty": 2; gde je izabrana matrica, na primer, matrica "BLOSUM 62" predložena u programu); program direktno računa procenat identičnosti dve sekvence koje se porede.

[0074] Za aminokiselinsku sekvencu koja ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa referentnom aminokiselinskom sekvencom, poželjni primeri uključuju one koji sadrže referentnu sekvencu, određene modifikacije, naročito deleciju, adiciju ili supstituciju bar jedne aminokiseline, skraćivanje ili produžavanje. U slučaju supstitucije jedne ili više uzastopnih ili neuzastopnih aminokiselina, poželjne su supstitucije u kojima su supstituisane aminokiseline zamenjene "ekvivalentnim" aminokiselinama. Ovde je izraz "ekvivalentne aminokiseline" namenjen da označava bilo koje aminokiseline koje će verovatno biti supstituisane jednom od strukturnih aminokiselina, ali ne modifikujući biološke aktivnosti odgovarajućih antitela i onih iz specifičnih primera definisanih niže.

[0075] Ekvivalentne aminokiseline se mogu odrediti bilo po njihovoj strukturnoj homologiji sa aminokiselinama kojima su supstituisane, bilo na osnovu rezultata komparativnih testova biološke aktivnosti različitih antitela koja će verovatno biti generisana.

[0076] Kao neograničavajući primer, tabela 1 ispod sumira moguće supstitucije koje će se verovatno izvršiti, a da ne dovedu do značajnih modifikacija biološke aktivnosti odgovarajućeg modifikovanog proteina koji vezuje antigen inverzne supstitucije su prirodno moguće u istim uslovima.

Tabela 1

[0077] Predmetno antitelo, ili bilo koji njegov fragment koji vezuje antigen, se ne vezuje za insulinski receptor (IR). Ovaj aspekt je od interesa jer antitelo opisano ovde neće imati nikakav negativan impakt na IR, što znači ni na metabolizam insulina.

[0078] Još jedan preimućstven aspekt predmetnog antitela je da je ono sposobno da veže ne samo humani IGF-1R, nego i majmunski IGF-1R, a konkretnije, cinomolgusov IGF-1R. Ovaj aspekt je takođe od interesa jer će olakšati toksičnost i klinička ispitivanja.

[0079] U jednom drugom rešenju, antitelo je monoklonsko antitelo.

[0080] Termin "monoklonsko antitelo" ili "Mab", kao što se ovde koristi, se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela u populaciji su identična osim za moguće prirodne mutacije koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična i usmerena na jedan jedini epitop. Takvo monoklonsko antitelo može da proizvede jedan jedini klon B ćelija ili hibridoma. Monoklonska antitela mogu biti i rekombinantna, tj. proizvedena proteinskim inženjeringom. Monoklonska antitela se mogu i izolovati iz fagnih biblioteka antitela. Pored toga, za razliku od pripremanja poliklonskih antitela koja tipično uključuju različita antitela usmerena na različite determinante, ili epitope, svako monoklonsko antitelo je usmereno na jedan jedini epitop antigena. Predmetno antitelo je izolovano ili dobijeno prečišćavanjem iz prirodnih izvora ili dobijeno genskom rekombinacijom ili hemijskom sintezom.

[0081] U jednom rešenju, monoklonsko antitelo ovde uključuje mišje, himerno i humanizovano antitelo, kao što je kasnije opisano.

[0082] Antitelo može poželjno biti izvedeno iz hibridoma mišjeg porekla, zavedenog u okviru francuske kolekcije kultura mikroorganizama (CNCM, Pasteur Institute, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), gde su navedeni hibridomi dobijeni fuzijom splenocita/limfocita Balb/C imunizovanih miševa i ćelija mijeloma ćelijske linije Sp 2/O-Ag 14.

[0083] U jednom drugom rešenju, predmetno antitelo je rekombinantno antitelo. Termin "rekombinantno antitelo" se odnosi na antitelo koje je dobijeno ekspresijom rekombinantne DNK unutar živih ćelija. Rekombinantno antitelo je dobijeno primenom laboratorijskih metoda genske rekombinacije, dobro poznatih stručnjaku, kreiranjem sekvenci DNK koje se bi našle u biološkim organizmima.

[0084] U jednom drugom rešenju, antitelo je hemijski sintetisano antitelo.

[0085] U jednom rešenju, antitelo na IGF-1R je mišje antitelo, tada označeno kao m[naziv antitela].

[0086] U jednom rešenju, antitelo na IGF-1R je himerno antitelo, tada označeno kao c[naziv antitela].

[0087] U jednom rešenju, antitelo na IGF-1R je humanizovano antitelo, tada označeno kao hz[naziv antitela].

[0088] Da bi se izbegla sumnja, izrazi "antitelo na IGF-1R" i "[naziv antitela]" su slični i uključuju (ukoliko nije naznačeno drukčije) mišju, himernu i humanizovanu verziju navedenog antitela na IGF-1R i navedenog "[naziva antitela]". Kad je neophodno, koristi se prefiks m- (mišje), c- (himerno) ili hz- (humanizovano).

[0089] U jednom drugom rešenju, antitelo je odabrano od:

a) antitela koje sadrži tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br. 7, 2 i 3 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11;

b) antitela koje sadrži tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br. 7, 2 i 3 i i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.10, 5 i 11;

c) antitela koje sadrži tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br. 7, 2 i 3 i i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 12 i

d) antitela koje sadrži tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br. 8, 2 i 3 i i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11.

[0090] Da bi bilo jasnije, sledeća tabela 2 ilustruje CDR sekvence, definisane prema IMGT, za poželjna antitela.

Tabela 2

[0091] Stručnjaku će biti očigledno da bilo koja kombinacija 6 CDR-ova, kao što su gore opisani, može da se smatra opisanom ovde.

[0092] Kao što se može videti iz ove tabele 2, sva antitela opisana u tabeli imaju iste sekvence za CDR-H2, CDR-H3 i CDR-L2, gde je ova osobina od posebnog interesa, kao što je gore opisano.

[0093] Jedan specifičan aspekt se odnosi na mišje (m) antitelo, ili bilo koji njegov fragment za vezivanje antigena, koje se odlikuje time što navedeno antitelo obuhvata konstantne regione i lakog lanca i teškog lanca izvedene iz antitela vrste heterologne sa mišem, naročito čoveka.

[0094] Još jedan specifičan aspekt se odnosi na himerno (c) antitelo, ili bilo koji njegov fragment za vezivanje antigena, koje se odlikuje time što navedeno antitelo obuhvata konstantne regione i lakog lanca i teškog lanca, izvedene iz antitela vrste heterologne sa mišem, naročito čoveka.

[0095] Specifičnije, antitelo je himerno antitelo.

[0096] Himerno antitelo je ono koje sadrži prirodan varijabilan region (lakog lanca i teškog lanca) izveden iz antitela date vrste u kombinaciji sa konstantnim regionima lakog lanca i teškog lanca antitela vrste heterologne sa navedenom datom vrstom.

[0097] Antitela, ili himerni fragmenti istih, se mogu dobijati upotrebom tehnika rekombinantne genetike. Na primer, himerno antitelo bi se moglo praviti kloniranjem rekombinantne DNK koja sadrži promotor i sekvencu koja kodira varijabilni region nehumanog monoklonskog antitela, naročito mišjeg, i sekvencu koja kodira konstantni region humanog antitela. Himerno antitelo koje kodira jedan takav rekombinantni gen bi moglo da bude, na primer, himera miš-čovek, gde bi specifičnost ovog antitela bila određena varijabilnim regionom izvedenim iz mišje DNK, a njegov izotip bi bio određen konstantnim regionom izvedenim iz humane DNK.

[0098] U poželjnom, ali neograničavajućem rešenju, antitelo je odabrano od:

a) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.13 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 13 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11;

b) antitela koje sadrži, ili se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca sekvence SEQ ID br. 14 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.14 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.10, 5 i 11;

c) antitela koje sadrži, ili se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca sekvence e SEQ ID br. 15 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.15 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 12; d) antitela koje sadrži ili se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca sekvence SEQ ID br. 16 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.16 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11 i

e) antitela koje sadrži ili se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca sekvence SEQ ID br. 17 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.17 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 12.

[0099] Pod "bilo koja sekvenca koja ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br. 13 do 17", podrazumeva se, respektivno, sekvenca koja ispoljava tri CDR teškog lanca SEQ ID br. 1, 2 i 3 i, pored toga, ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98%, identičnosti sa celom sekvencom SEQ ID br. 13 do 17 van sekvenci koje odgovaraju CDR-ovima (tj. SEQ ID br. 1, 2 i 3), gde "van sekvenci koje odgovaraju CDR-ovima" stoji za "izuzimajući sekvence koje odgovaraju CDR-ovima".

[0100] U jednom drugom poželjnom, ali neograničavajućem, rešenju, antitelo je odabrano od:

a) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 18 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br. 18 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3;

b) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 19 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br. 19 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3;

c) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 20 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br. 20 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3;

d) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 21 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br. 21 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.8, 2 i 3 i

e) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 22 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br. 22 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3.

[0101] Pod "bilo koja sekvenca koja ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br. 18 do 22", podrazumevaju se sekvence koje respektivno ispoljavaju tri CDR lakog lanca SEQ ID br. 4, 5 i 6 i, pored toga, ispoljavaju bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa celom sekvencom SEQ ID br. 18 do 22 van sekvenci koje odgovaraju CDR-ovima (tj. SEQ ID br.4, 5 i 6).

[0102] Poželjno, antitelo je odabrano od:

a) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.13 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 13 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 18 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.18;

b) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 14 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 14 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 19 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID NO.19;

c) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.15 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.15 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 20 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.20;

d) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.16 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.16 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 21 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.21 i

e) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.17 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% identičnosti sa SEQ ID br. 17 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 22 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% identičnosti sa SEQ ID br.22.

[0103] Himerna antitela opisana ovde se mogu odlikovati i konstantnim domenom i, konkretnije, navedena himerna antitela mogu biti odabrana ili dizajnirana kao što su, bez ograničenja, IgG1, IgG2, IgG3, IgM, IgA, IgD ili IgE. Poželjnije, navedena himerna antitela su IgG1 ili IgG4.

[0104] Poželjno, navedeno himerno antitelo sadrži varijabilne domene VH i VL, kao što je gore opisano, u formatu IgG1. Poželjnije, navedeno himerno antitelo sadrži konstantan domen za VH sekvence SEQ ID br.43 i kapa domen za VL sekvence SEQ ID br.45.

[0105] Alternativno, navedeno himerno antitelo sadrži varijabilne domene VH i VL, kao što je gore opisano, u formatu IgG4. Poželjnije, navedeno himerno antitelo sadrži konstantan domen za VH sekvence SEQ ID br.44 i kapa domen za VL sekvence SEQ ID br.45.

[0106] Poželjno, antitelo je odabrano od:

a) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 23 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br. 23 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 28 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.28;

b) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 24 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br. 24 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 29 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.29;

c) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 25 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br. 25 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 30 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.30;

d) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 26 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.26 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 31 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.31 i

e) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 27 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.27 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 32 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.32.

[0107] Da bi bilo jasnije, sledeća tabela 3 ilustruje sekvence VH i VL, respektivno, za poželjna himerna antitela.

Tabela 3

[0108] Još jedan specifičan aspekt predmetnih antitela se odnosi na humanizovano antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, koje se odlikuje time što su konstantni regioni lakog lanca i teškog lanca, izvedeni iz humanog antitela, respektivno, lambda ili kapa region i gama-1, gama-2 ili gama-4 region.

[0109] Specifično, predmetno antitelo je humanized antitelo.

[0110] "Humanizovana antitela" označava antitelo koje sadrži CDR regione izvedene iz antitela koje nije humanog porekla, a ostali delovi molekula antitela su izvedeni iz jednog (ili nekoliko) humanih antitela. Pored toga, neki od ostataka segmenta skeleta (zvani FR) se mogu modifikovati da sačuvaju afinitet vezivanja.

[0111] Humanizovana antitela ili fragmenti istih se mogu dobijati tehnikama poznatim stručnjaku. Takva humanizovana antitela su poželjna zbog upotrebe u metodima koji uključuju in vitro dijagnoze ili preventivan i/ili terapijski tretman in vivo. Ostale tehnike humanizacije, takođe poznate stručnjaku, kao što je, na primer, tehnika "transplantacije CDR" opisana pomoću PDL u patentima EP 0451216, EP 0682040, EP 0939127, EP 0566 647 ili US 5,530,101, US 6,180,370, US 5,585,089 i US 5,693,761. US patenti 5,639,641 ili 6,054,297, 5,886,152 i 5,877,293 se takođe mogu citirati.

[0112] Specifično, i kao što će biti objašnjeno sa više detalja u sledećim primerima, ovde je opisano antitelo koje se sastoji od hz208F2. Takva humanizacija se može primeniti i na druge delove antitela predmetne prijave.

[0113] U poželjnom rešenju, predmetno antitelo obuhvata varijabilni domen teškog lanca (VH) koji ima:

i) CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3, respektivno,

ii) FR1, FR2 i FR3 izvedene iz humane embrionske linije IGHV1-46*01 (SEQ ID br. 46) i

iii) FR4 izvedene iz humane embrionske linije IGHJ4*01 (SEQ ID br.48).

[0114] U jednom poželjnom rešenju, predmetno antitelo obuhvata varijabilni domen lakog lanca (VL) koji ima:

i) CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11, respektivno,

ii) FR1, FR2 i FR3 izvedene iz humane embrionske linije IGKV1-39*01 (SEQ ID br. 47) i

iii) FR4 izvedene iz humane embrionske linije IGKJ4*01 (SEQ ID br.49).

[0115] Poželjno, navedeno antitelo obuhvata:

a) težak lanac koji ima CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 sekvence SEQ ID br. 7, 2 i 3, respektivno i FR1, FR2 i FR3 izvedene iz humane embrionske linije IGHV1-46*01 (SEQ ID br.46), i FR4 izveden iz humane embrionske linije IGHJ4*01 (SEQ ID br.48) i b) lak lanac koji ima CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 sekvence SEQ ID br. 9, 5 i 11, respektivno, i FR1, FR2 i FR3 izvedene iz humane embrionske linije IGKV1-39*01 (SEQ ID br.47), i FR4 izveden iz humane embrionske linije IGKJ4*01 (SEQ ID br.49).

[0116] U jednom rešenju, predmetno antitelo obuhvata varijabilni domen teškog lanca (VH) sekvence SEQ ID br. 33 i varijabilni domen lakog lanca (VL) sekvence SEQ ID br. 35. Navedeno humanizovano antitelo će se ubuduće nazivati hz208F2 ("varijanta" ili "Var.1").

[0117] U jednom drugom rešenju, predmetno antitelo obuhvata varijabilni domen teškog lanca (VH) sekvence SEQ ID br. 33 gde navedena sekvenca SEQ ID br. 33 obuhvata bar 1 povratnu mutaciju odabranu od ostataka 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 i 95.

[0118] Pod izrazom "povratna mutacija" misli se na mutaciju ili zamenu humanog ostatka prisutnog u embrionskoj liniji odgovarajućim ostatkom koji je inicijalno bio prisutan u mišjoj sekvenci.

[0119] U jednom drugom rešenju, predmetno antitelo obuhvata varijabilni domen teškog lanca (VH) sekvence SEQ ID br. 33 gde navedena sekvenca SEQ ID br. 33 obuhvata 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ili 17 povratne mutacije odabrane od ostataka

20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 i 95.

[0120] Da bi bilo jasnije, sledeća tabela 4 ilustruje poželjne povratne mutacije.

Tabela 4

[0121] U jednom rešenju, predmetno antitelo obuhvata varijabilni domen lakog lanca (VL) sekvence SEQ ID br. 35, gde navedena sekvenca SEQ ID br. 35 obuhvata bar 1 povratnu mutaciju odabranu od ostataka obuhvata varijabilni domen lakog lanca (VL) sekvence SEQ ID br. 35, gde navedena sekvenca SEQ ID br. 35 obuhvata bar 1 povratnu mutaciju odabranu od ostataka 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 i 87.

[0122] U jednom rešenju, predmetno antitelo obuhvata varijabilni domen lakog lanca (VL) sekvence SEQ ID br. 35, gde navedena sekvenca SEQ ID br. 35 obuhvata 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 povratnih mutacija odabranih od ostataka 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 i 87.

[0123] U jednom drugom rešenju, predmetno antitelo obuhvata:

a) varijabilni domen teškog lanca (VH) sekvence SEQ ID br. 33 gde navedena sekvenca SEQ ID br. 33 obuhvata bar 1 povratnu mutaciju odabranu od ostataka 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 i 95 i

b) varijabilni domen lakog lanca (VL) sekvence SEQ ID br. 35, gde navedena sekvenca SEQ ID br. 35 obuhvata bar 1 povratnu mutaciju odabranu od ostataka 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 i 87.

[0124] Da bi bilo jasnije, sledeća tabela 5 ilustruje poželjne povratne mutacije.

Tabela 5

[0125] U takvom rešenju, navedeno antitelo obuhvata sve gore pomenute povratne mutacije i odgovara antitelu koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) sekvence SEQ ID br. 34 i varijabilni domen lakog lanca (VL) sekvence SEQ ID br. 36. Navedeno humanizovano antitelo će se ubuduće nazivati hz208F2 ("Varijanta" ili "Var.3").

[0126] U jednom drugom rešenju, sve humanizovane forme između Varijante 1 i Varijante 3 su takođe obuhvaćene predmetnim pronalaskom. Drugim rečima, predmetno antitelo odgovara antitelu koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) "konsenzus" sekvence SEQ ID br. 41 i varijabilni domen lakog lanca (VL) "konsenzus" sekvence SEQ ID br. 42. Navedeno humanizovano antitelo, kao celina, će se ubuduće nazivati hz208F2 ("Varijanta" ili "Var. 2").

[0127] U jednom poželjnom, ali neograničavajućem, rešenju, predmetno antitelo je odabrano od:

a) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br.33 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br. 33 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11;

b) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 34 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br. 34 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11 i

c) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br.

56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 i 80 ili bilo koju sekvencu sa bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 7880 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11.

[0128] Pod "bilo koja sekvenca koja ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br.33, 34, 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 ili 80", podrazumevaju se sekvence koje ispoljavaju tri CDR teškog lanca SEQ ID br. 1, 2 i 3 i, pored toga, ispoljavaju bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98%, identičnosti sa celom sekvencom SEQ ID br. 33, 34, 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 van sekvenci koje odgovaraju CDR-ovima (tj. SEQ ID br.1,2 i 3).

[0129] U poželjnom, ali neograničavajućem rešenju, predmetno antitelo je odabrano od:

a) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 35 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br. 35 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3;

b) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 36 ili bilo koju sekvencu koja ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br. 36 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3 i

c) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br. 57 i 60 ili bilo koju sekvencu sa bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.

57 ili 60 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3.

[0130] Pod "bilo koja sekvenca koja ispoljava bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br. 35, 36, 57 ili 60", podrazumevaju se sekvence koje ispoljavaju tri CDR lakog lanca SEQ ID br. 4, 5 i 6 i, pored toga, ispoljavaju bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98%, identičnosti sa celom sekvencom SEQ ID br. 35, 36, 57 ili 60 van sekvenci koje odgovaraju CDR-ovima (tj. SEQ ID br.4, 5 i 6).

[0131] Humanizovana antitela opisana ovde se mogu odlikovati i konstantnim domenom, a konkretnije, navedena humanizovana antitela mogu biti izanrana ili dizajnirana, kao što su, bez ograničenja, IgG1, IgG2, IgG3, IgM, IgA, IgD ili IgE. Poželjnije, navedena humanizovana antitela su IgG1 ili IgG4.

[0132] Poželjno, navedeno humanizovano antitelo sadrži varijablilne domene VH i VL, kao što je gore opisano, u formatu IgG1. Poželjnije, navedeno humanizovano antitelo obuhvata konstantan domen za VH sekvence SEQ ID br. 43 i kapa domen za VL sekvence SEQ ID br.

45.

[0133] Alternativno, navedeno humanizovano antitelo sadrži varijablilne domene VH i VL, kao što je gore opisano, u formatu IgG4. Poželjnije, navedeno humanizovano antitelo obuhvata konstantni domen za VH sekvence SEQ ID br. 44 i kapa domen za VL sekvence SEQ ID br.45.

[0134] Poželjno, navedeno antitelo je odabrano od:

a) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 37 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.37 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 39 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.39;

b) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 38 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.38 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 40 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.40;

56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 i 80 ili bilo koju sekvencu sa bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br. 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 ili 80 i varijabilni domen lakog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br. 57 60 ili bilo koju sekvencu sa bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.57 ili 60.

[0135] Da bi bilo jasnije, sledeća tabela 6a ilustruje neograničavajuće primere sekvenci VH i VL za varijantu 1 (Var. 1) i varijantu 3 (Var. 3) humanizovanog antitela hz208F2. Ona obuhvata i konsenzus sekvencu za varijantu 2 (Var.2).

Tabela 6a

[0136] U jednom drugom poželjnom, ali neograničavajućem, rešenju, predmetno antitelo je odabrano od:

a) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br.

56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 i 80 ili bilo koju sekvencu sa bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br. 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 i 80 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 1

b) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br. 57 i 60 ili bilo koju sekvencu sa bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa SEQ ID br.57 ili 60 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3 i

c) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br. 57 i 60 ili bilo koju sekvencu sa bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br. 57 ili 60 i varijabilni domen teškog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br.56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 i 80 ili bilo koju sekvencu sa bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 ili 80.

[0137] Poželjno je da predmetno antitelo bude odabrano od antitela koja obuhvataju ili se sastoje od:

a) teškog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br. 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 i 81 ili bilo koje sekvence sa bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 ili 81 i

b) lakog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br. 59 i 61 ili bilo koje sekvence sa bar 80%, poželjno 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.59 ili 61.

[0138] Poželjno je da predmetno antitelo bude odabrano od:

56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 i 80 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br. 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 ili 80 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 57 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.57 i

b) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br.

56, 64, 68 i 78 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.56, 64, 68 ili 78 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br.60 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.60.

[0139] Poželjno je da predmetno antitelo bude odabrano od:

a) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 58 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.58 i lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID br.59 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.59;

b) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 58 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.58 i lakog lanca sekvence SEQ ID br. 61 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.61;

c) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 63 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.63 i lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID br.59 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.59;

d) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 65 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.65 i lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID br.59 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.59;

e) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 65 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.65 i lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID br.61 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.61;

f) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 67 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.67 i lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID br.59 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.59;

g) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 69 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.69 i lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID br.59 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.59;

h) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 69 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.69 i lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID br.61 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.61;

i) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 71 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.71 i lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID br.59 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.59;

j) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 73 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.73 i lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID br.59 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.59;

k) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 75 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.75 i lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID br.59 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.59;

l) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 77 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.77 i lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID br.59 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.59;

m) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 79 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.79 i lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID br.59 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.59;

n) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 79 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.79 i lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID br.61 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.61 i

o) antitela koje sadrži ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 81 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.81 i lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID br.59 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80%, 85%, 90%, 95%, ili 98% identičnosti sa SEQ ID br.59.

[0140] Da bi bilo jasnije, sledeća tabela 6b ilustruje neograničavajuće primere sekvenci VH i VL (varijablilni domen i puna dužina) za različite varijante humanizovanog antitela hz208F2.

Tabela 6b

[0141] Poželjno je da predmetno antitelo bude odabrano od:

i) antitela koje je proizveo hibridom I-4757, I-4773, I-4775, I-4736 ili I-4774 deponovan u CNCM, Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris, France, 30. maja, 2013., 26. juna, 2013., 26. juna, 2013., 24. aprila, 2013. i 26. juna, 2013., respektivno,

ii) antitela koje je u kompeticiji za vezivanje IGF-1R sa antitelom iz i) i

iii) antitela koje se vezuje za isti epitop IGF-1R kao antitelo iz i).

[0142] Obezbeđen je i mišji hibridom, gde je navedeni hibridom odabran od hibridom I-4757, I-4773, I-4775, I-4736 i I-4774 deponovan u CNCM, Institut Pasteur France, 30. maja, 2013., 26. juna, 2013., 26. juna, 2013., 24. aprila, 2013. i 26. juna, 2013., respektivno.

[0143] Novi aspekt predmetnog opisa se odnosi na izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, opisano ovde.

[0144] Termini "nukleinska kiselina", "nukleinska sekvenca", "sekvenca nukleinske kiseline", "polinukleotid", "oligonukleotid", "polinukleotidna sekvenca" i "nukleotidna sekvenca", koji se ovde koriste u istom značenju, označavaju preciznu sekvencu nukleotida, modifikovanu ili ne, koja definiše fragment ili region nukleinske kiseline, koji sadrži ili ne sadrži neprirodne nukleotide i koja je ili dvolančana DNK, jednolančana DNK ili proizvod transkripcije navedenih DNK.

[0145] Predmetne sekvence su izolovane i/ili prečišćene, tj., uzorkovane su direktno ili indirektno, na primer, kopiranjem, gde je njihovo okruženje bar delimično modifikovano. Izolovane nukleinske kiseline dobijene rekombinantnom genetikom, putem, na primer, ćelija domaćina, ili dobijene hemijskom sintezom, bi takođe ovde trebalo pomenuti. Ovde je obezbeđen i vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, opisan ovde.

[0146] Prijava naročito cilja vektore za kloniranje i/ili ekspresiju koji sadrže takvu nukleotidnu sekvencu.

[0147] Poželjno je da vektori sadrže elemente koji dozvoljavaju ekspresiju i/ili sekreciju nukleotidnih sekvenci u datoj ćelija domaćinu. Vektor, dakle, mora da sadrži promotor, signale za početak i kraj translacije, kao i pogodne regione za regulaciju transkripcije. On mora da bude u stanju da se održi na stabilan način u ćeliji domaćinu i može opciono da ima specifične signale koji specifikuju sekreciju transliranog proteina. Ovi različiti elementi su izabrani i optimizovani od strane stručnjaka u skladu sa upotrebljenom ćelijom domaćinom. U ovu svrhu, nukleotidne sekvence se mogu insertovati u samoreplicirajuće vektore unutar izabranog domaćina ili biti integrativni vektori izabranog domaćina.

[0148] Takvi vektori se dobijaju metodima koje stručnjak tipično koristi i dobijeni klonovi mogu da se uvedu u pogodnog domaćina standardnim metodima kao što je lipofekcija, elektroporacija, toplotni šok ili hemijski metodi.

[0149] Vektori su, na primer, vektori plazmidnog ili virusnog porekla. Koriste se za transformaciju ćelija domaćina da bi se klonirale ili eksprimirale nukleotidne sekvence opisane gore.

[0150] Prijava se odnosi i na izolovane ćelije domaćine, transformisane ili koje sadrže vektor kao što je gore opisan.

[0151] Ćelija domaćin se može odabrati od prokariotskih ili eukariotskih sistema, kao što su bakterijske ćelije, na primer, ali i ćelije kvasca ili životinjske ćelije, naročito sisarske ćelije (sa izuzetkom čoveka). Insekt ili biljka se takođe može koristiti.

[0152] Prijava se odnosi i na životinje, koje nisu čovek, koje imaju transformisanu ćelija.

[0153] Jedan drugi aspekt se odnosi na metod za proizvodnju antitela opisanog ovde, ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena, koji se odlikuje time što navedeni metod obuhvata sledeće korake:

a) kultura u medijumu sa pogodnim uslovima za kulturu za ćeliju domaćina opisanu gore i b) sakupljanje ovako proizvedenog antitela, ili jednog od njegovih fragmenata za vezivanje antigena, iz medijuma za kulturu ili iz navedenih gajenih ćelija.

[0154] Transformisane ćelije su od upotrebe u metodima za dobijanje rekombinantnih antitela opisanih ovde. Metodi za dobijanje antitela u rekombinantnoj formi pomoću vektora i/ili ćelije transformisane vektorom opisanim ovde, su takođe obuhvaćeni ovde. Poželjno je da se ćelija transformisana vektorom, kao što je gore opisano, gaji u uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju gorenavedenog antitela i sakupljanje navedenog antitela.

[0155] Kao što je već pomenuto, ćelija domaćin se može izabrati od prokariotskih ili eukariotskih sistema. Konkretno, moguće je identifikovati nukleotidne sekvence koje olakšavaju sekreciju u takvom prokariotskom ili eukariotskom sistemu. Vektor koji nosi takvu sekvencu se, dakle, može prvenstveno koristiti za proizvodnju rekombinantnih proteina koje treba sekretovati. Zaista, prečišćavanje ovih rekombinantnih proteina od interesa će biti olakšano činjenicom da su oni prisutni u supernatantu ćelijske kulture više nego u ćelijama domaćinima.

[0156] Antitelo se može dobijati i hemijskom sintezom. Jedan takav metod dobijanja je takođe predmet ove prijave. Stručnjak poznaje metode hemijske sinteze, kao što su tehnike čvrste faze ili tehnike parcijalne čvrste faze, kondenzacijom fragmenata ili konvencionalnom sintezom u rastvoru. Polipeptidi dobijeni hemijskom sintezom i sposobni da sadrže odgovarajuće neprirodne aminokiseline su takođe obuhvaćene u ovoj prijavi.

[0157] Antitelo, ili bilo koji fragmenti istog za vezivanje antigena, koje će se verovatno dobiti gore opisanim metodom je takođe obuhvaćeno predmetnom prijavom.

[0158] Specifično, ovde je obezbeđeno antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, kao što je gore opisano, za upotrebu kao prenosioca za usmeravanje citotoksičnog agensa na ciljno mesto u domaćinu, gde se navedeno ciljno mesto u domaćinu sastoji od epitopa lokalizovanog u IGF-1R, poželjno u vanćelijskom domenu IGF-1R, poželjnije humanom IGF-1R (SEQ ID br. 50), a još poželjnije, u humanom vanćelijskom domenu IGF-1R (SEQ ID br. 51), a još poželjnije u N-terminusu humanog vanćelijskog domena IGF-1R (SEQ ID br. 52), ili bilo koja prirodna varijanta njegove sekvence.

[0159] U jednom poželjnom rešenju, navedeno ciljno mesto u domaćinu je ciljno mesto sisarske ćelije, poželjnije humane ćelije, poželjnije, ćelije koja prirodno ili putem genske rekombinacije, eksprimira IGF-1R.

[0160] Ovde je obezbeđen i konjugat antitelo-lek koji sadrži antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, kao što je gore opisano, konjugovano sa citotoksičnim agensom.

[0161] Navedeni imunokonjugat sadrži antitelo, kao što je ovde opisano, konjugovano sa citotoksičnim agensom.

[0162] Izraz "imunokonjugat" se uopšteno odnosi na jedinjenje koje sadrži bar proizvod za usmeravanje, kao što je antitelo, fizički povezan sa jednim ili više terapijskih agenasa, time praveći jedinjenje sa dobrim ciljanjem.

[0163] U poželjnom rešenju, takvi terapijski agensi su citotoksični agensi.

[0164] Pod "citotoksičan agens" se podrazumeva agens koji, kad se administrira subjektu, leči ili sprečava razvoj proliferacije abnormalnih ćelija, poželjno razvoj kancera u subjektovom telu, inhibiranjem ili sprečavanjem ćelijske funkcije i/ili izazivanjem smrti ćelije.

[0165] Mnogi citotoksični agensi su izolovani ili sintetisani i omogućavaju inhibiciju proliferacije ćelija, ili ako ne definitivno, bar značajno uništenje ili smanjenje tumorskih ćelija. Međutim, toksična aktivnost ovih agenasa nije ograničena na tumorske ćelije i pogođene su i mogu biti uništene i netumorske ćelije. Konkretnije, uočeni su bočni efekti na ćelijama koje se brzo obnavljaju, kao što su haematopoetske ćelije ili ćelije epitela, naročito mukoznih membrana. Kao ilustracija, ćelije gastrointestinalnog trakta su jako pogođene upotrebom takvih citotoksičnih agenasa.

[0166] Jedan od ciljeva predmetne prijave je i da bude u stanju da obezbedi citotoksičan agens koji omogućava da se ograniče bočni efekti na normalnim ćelijama, dok se istovremeno očuvava visoka citotoksičn za tumorske ćelije.

[0167] Konkretnije, citotoksični agens poželjno može da se sastoji, bez ograničenja, od leka (tj. "konjugat antitelo-lek"), toksina (tj. "imunotoksin" ili "konjugat antitelo-toksin"), radioizotopa (tj. "radioimunokonjugat" ili "konjugat antitelo-radioizotop"), itd.

[0168] U prvom poželjnom rešenju, imunokonjugat se sastoji od antitela vezanog bar za lek ili medikament. Takav imunokonjugat se naziva konjugat antitelo-lek (ili "ADC").

[0169] U prvom rešenju, takvi lekovi se mogu opisati u odnosu na njihov način delovanja. Kao neograničavajući primer, mogu se pomenuti agensi za alkilovanje kao što su azotni senf, alkil-sulfonati, nitrozourea, oksazoforini, aziridini ili imin-etileni, antimetaboliti, antitumorski antibiotici, mitotički inhibitori, inhibitori funkcije hromatina, antiangiogenetski agensi, antiestrogeni, antiandrogeni, agensi za heliranje, stimulans apsorpcije gvožđa, inhibitori ciklooksigenaze, inhibitori fosfodiesteraze, inhibitori DNK, inhibitori sinteze DNK, stimulansi apoptoze, inhibitori timidilata, inhibitori T ćelija, agonisti interferona, inhibitori ribonukleozid-trifosfat reduktaze, inhibitori aromataze, antagonisti estrogenskih receptora, inhibitori tirozin kinaze, inhibitori ćelijskog ciklusa, taksani, inhibitori tubulina, inhibitori angiogeneze, stimulansi makrofaga, antagonisti neurokininskih receptora, agonisti kanabinoidnih receptora, agonisti dopaminskih receptor, agonisti faktora stimulacije granulocita, agonisti eritropoietinskih receptora, agonisti somatostatinskih receptora, agonisti LHRH, sensitizatori kalcijuma, antagonisti VEGF receptora, antagonisti interleukinskih receptora, inhibitori osteoklasta, stimulansi formiranja radikala, antagonisti endotelinskih receptora, vinka alkaloid, anti-hormoni ili imunomodulatori ili bilo koji drugi novi lekovi koji ispunjavaju kriterijume delovanja citotoksika ili toksina.

[0170] Takvi lekovi su, na primer, citirani u VIDAL 2010, na strani posvećenoj jedinjenjima vezanim za kolumnu o kancerologiji i hematologiji "Citotoksici", gde su ova citotoksična jedinjenja, citirana sa referencom na ovaj dokument, citirana ovde kao poželjni citotoksični agensi.

[0171] Konkretnije, bez ograničenja, poželjni su sledeći lekovi ili medikamenti: mehloretamin, hlorambukol, melfalen, hloridrat, pipobromen, prednimustin, dinatrijum fosfat, estramustin, ciklofosfamid, altretamin, trofosfamid, sulfofosfamid, ifosfamid, tiotepa, trietilenamin, altetramin, karmustin, streptozocin, fotemustin, lomustin, busulfan, treosulfan, improsulfan, dakarbazin, cis-platina, oksaliplatina, lobaplatina, heptaplatina, miriplatina hidrat, karboplatina, metotreksat, pemetreksed, 5-fluoruracil, floksuridin, 5-fluorodezoksiuridin, kapecitabin, citarabin, fludarabin, citozin arabinozid, 6-merkaptopurin (6-MP), nelarabin, 6-tioguanin (6-TG), hlorodezoksiadenozin, 5-azacitidin, gemcitabin, kladribin, dezoksikoformicin, tegafur, pentostatin, doksorubicin, daunorubicin, idarubicin, valrubicin, mitoksantron, daktinomicin, mitramicin, plikamicin, mitomicin C, bleomicin, prokarbazin, paklitaksel, docetaksel, vinblastin, vinkristin, vindesin, vinorelbin, topotekan, irinotekan, etopozid, valrubicin, amrubicin hidrohlorid, pirarubicin, eliptinijum acetat, zorubicin, epirubicin, idarubicin i tenipozid, razoksin, marimastat, batimastat, prinomastat, tanomastat, ilomastat, CGS-27023A, halofuginon, COL-3, neovastat, talidomid, CDC 501, DMXAA, L-651582, skvalamin, endostatin, SU5416, SU6668, interferon-alfa, EMD121974, interleukin-12, IM862, angiostatin, tamoksifen, toremifen, raloksifen, droloksifen, jodoksifen, anastrozole, letrozol, eksemestan, flutamid, nilutamid, sprironolakton, ciproteron acetat, finasterid, cimitidin, bortezomid, Velcade, bikalutamid, ciproteron, flutamid, fulvestran, eksemestan, dasatinib, erlotinib, gefitinib, imatinib, lapatinib, nilotinib, sorafenib, sunitinib, retinoid, reksinoid, metoksalen, metilaminolevulinat, aldesleukin, OCT-43, denileukin diflitoks, interleukin-2, tasonermin, lentinan, sizofilan, rokinimeks, pidotimod, pegademaza, timopentin, poli I:C, prokodazol, Tic BCG, corynebacterium parvum, NOV-002, ukrain, levamizol, 1311-chTNT, H-101, celmoleukin, interferon alfa2a, interferon alfa2b, interferon gama1a, interleukin-2, mobenakin, reksin-G, teceleukin, aklarubicin, aktinomicin, arglabin, asparaginaza, karzinofilin, hromomicin, daunomicin, leukovorin, masoprokol, neokarzinostatin, peplomicin, sarkomicin, solamargin, trabektedin, streptozocin, testosteron, kunekatehini, sinekatehini, alitretinoin, belotekan hidrohlorid, kalusteron, dromostanolon, eliptinijum acetat, etinil estradiol, etopozid, fluoksimesteron, formestan, fosfetrol, goserelin acetat, heksil aminolevulinat, histrelin, hidroksiprogesteron, iksabepilon, leuprolid, medroksiprogesteron acetat, megesterol acetat, metilprednizolon, metiltestosteron, miltefosin, mitobronitol, nadrolon fenilpropionat, noretindron acetat, prednizolon, prednizon, temsirolimus, testolakton, triamkonolon, triptorelin, vapreotidacetat, zinostatin stimalamer, amsakrin, arsenik trioksid, bisantren hidrohlorid, hlorambucil, hlortrianisen, cisdiamindihloroplatina, ciklofosfamid, dietilstilbestrol, heksametilmelamin, hidroksiurea, lenalidomid, lonidamin, mehloretanamin, mitotan, nedaplatin, nimustin hidrohlorid, pamidronat, pipobroman, porfimer natrijum, ranimustin, razoksan, semustin, sobuzoksan, mesilat, trietilenmelamin, zoledronska kiselina, kamostat mesilat, fadrozol HCl, nafoksidin, aminoglutetimid karmofur, klofarabin, citozin arabinozid, decitabin, doksifluridin, enocitabin, fludarabin fosfat, fluorouracil, ftorafur, uracil senf, abareliks, beksaroten, raltiterksed, tamibaroten, temozolomid, vorinostat, megastrol, klodronat dinatrijum, levamisol, ferumoksitol, gvožđe izomaltozid, celekoksib, ibudilast, bendamustin, altretamin, mitolaktol, temsirolimus, pralatreksat, TS-1, decitabin, bikalutamid, flutamid, letrozol, klodronat dinatrijum, degareliks, toremifencitrat, histamin dihidrohlorid, DW-166HC, nitracrin, decitabin, irinoteakan hidrohlorid, amsakrin, romidepsin, tretinoin, kabazitaksel, vandetanib, lenalidomid, ibandronska kiselina, miltefosin, vitespen, mifamurtid, nadroparin, granisetron, ondansetron, tropisetron, alizaprid, ramosetron, dolasetron mesilat, fosaprepitant dimeglumin, nabilon, aprepitant, dronabinol, TY-10721, lizurid hidrogen maleat, epiceram, defibrotid, dabigatran eteksilat, filgrastim, pegfilgrastim, redituks, epoetin, molgramostim, oprelvekin, sipuleucel-T, M-Vax, acetil L-karnitin, donepezil hidrohlorid, 5-aminolevulinska kiselina, metil aminolevulinat, cetroreliks acetat, ikodekstrin, leuprorelin, metbilfenidat, oktreotid, amleksanoks, pleriksafor, menatetrenon, anetol ditioletion, dokserkalciferol, cinakalcet hidrohlorid, alefacept, romiplostim, timoglobulin, timalfasin, ubenimeks, imikvimod, everolimus, sirolimus, H-101, lasofoksifen, trilostan, inkadronat, gangliozidi, pegaptanib oktanatrijum, vertoporfin, minodronska kiselina, zoledronska kiselina, galijum nitrat, alendronat natrijum, etidronat dinatrijum, dinatrijum pamidronat, dutasterid, natrijum stiboglukonat, armodafinil, deksrazoksan, amifostin, WF-10, temoporfin, darbepoetin alfa, ancestim, sargramostim, palifermin, R-744, nepidermin, oprelvekin, denileukin diftitoks, krizantaspas, buserelin, deslorelin, lanreotid, oktreotid, pilokarpin, bosentan, kaliheamicin, majtanzinoidi, ciklonikat i pirolobenzodiazepini, naročito oni opisani u PCT prijavi objavljenoj pod brojem WO2011/130598.

[0172] U jednom drugom rešenju, imunokonjugat se sastoji od antitela vezanog bar za radioizotop. Takav imunokonjugat se naziva konjugat antitelo-radioizotop (ili "ARC").

[0173] Za selektivno uništenje tumora, antitelo može da sadrži visoko radioaktivan atom. Spektar radioaktivnih izotopa je dostupan za proizvodnju ARC kao što su, bez ograničenja, At<211>, C<3>, N<15>, O<17>, Fl<19>, I<123>, I<131>, I<125>, In<111>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, tc<99>m, Bi<212>, P<32>, Pb<212>, radioaktivni izotopi Lu, gadolinijuma, mangana ili gvožđa.

[0174] Mogu se koristiti bilo koji metodi ili postupci poznati stručnjaku za ugradnju takvog radioizotopa u ARC. Kao neograničavajući primer, Tc<99>m ili I<123>, Re<186>, Re<188>i In<111>se mogu vezati preko cisteinskog ostatka. Y<90>se mogu vezati preko lizinskog ostatka. I<123>se može vezati primenom metoda sa jodogenom.

[0175] Može se pomenuti nekoliko primera kao ilustracija stručnog znanja u oblasti ARC kao što je Zevalin®, koji je ARC sastavljen od anti-CD20 monoklonskog antitela i radioizotopa In<111>ili Y<90>vezanih pomoću tioureinskog linkera-helatora ili Mylotarg® koji je sastavljen od anti-CD33 antitela vezanog za kaliheamicin, (US 4,970,198; 5,079,233; 5,585,089; 5,606,040; 5,693,762; 5,739,116; 5,767,285; 5,773,001). Odnedavno, može se pomenuti i ADC koji se naziva Adcetris (koji odgovara brentuksimabu vedotinu) koji je nedavno prihvaćen od strane FDA u lečenju Hočkinovog limfoma.

[0176] U jednom drugom rešenju, imunokonjugat se sastoji od antitela vezanog za toksin. Takav imunokonjugat se naziva konjugat antitelo-toksin (ili "ATC").

[0177] Toksini su efektivni i specifični otrovi koje prave živi organizmi. Oni se obično sastoje od lanca aminokiselina koji može da varira u molekulskoj težini između par stotina (peptidi) i sto hiljada (proteini). Oni mogu biti i organska jedinjenja niske molekulske težine. Toksine proizvode brojni organizmi, npr., bakterije, gljivice, alge i biljke. Mnogi od njih su ekstremno otrovni, sa toksičnošću koja je nekoliko redova veličine veća od one nervnih agenasa.

[0178] Toksini koji se koriste u ATC mogu da uključuju, bez ograničenja, sve vrste toksina koji mogu da ispoljavaju svoje citotoksične efekte putem mehanizama koji uključuju vezivanje tubulina, vezivanje DNK ili inhibiciju topoisomeraze.

[0179] Enzimski aktivni toksini i njihovi fragmenti koji se mogu koristiti uključuju A lanac difterije, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, A lanac egzotoksina (iz Pseudomonas aeruginosa), A lanac ricina, A lanac abrina, A lanac modecina, alfa-sarcin, proteine Aleurites fordii, proteine diantina, proteine Phytolaca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor momordica charantia, curcin, krotin, inhibitor sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trihoteceni.

[0180] Toksini malih molekula, kao što su dolastatini, auristatini, naročito monometilauristatin E (MMAE), trihotecen i CC1065, i derivatiovih toksina koji imaju aktivnost toksina, su takođe ovde uračunati. Pokazano je da dolastatini i auristatini interferiraju sa dinamikom mikrotubula, hidrolize GTP i jedarnom i ćelijskom deobom i imaju antikancersko i fungicidno dejstvo.

[0181] "Linker" ili "linkerska jedinica" označava hemijsku funkcionalnu grupu koja sadrži kovalentnu vezu ili lanac atoma koji kovalentno vezuje antitelo za bar jedan citotoksičan agens.

[0182] Linkeri mogu da se prave upotrebom niza bifunkcionalnih agenasa za kuplovanje proteina kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (pazidobenzoil) heksandiamin), derivati bis-diazonijuma (kao što je bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) obeležena ugljenikom 14 je primer sredstva za heliranje za konjugaciju citotoksičnih agenasa sa sistemom za usmeravanje. Ostali reagensi za unakrsno vezivanje (kros-linkeri) mogu da budu BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC i sulfo-SMPB i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr., od Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Ill., U.S.A).

[0183] Linker može da bude "nerazgradiv" ili "razgradiv".

[0184] U jednom poželjnom rešenju, linker je "razgradiv" oslobađajući otpuštanje citotoksičnog agensa u ćeliju. Na primer, mogu se koristiti kiselo-labilan linker, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilan linker, dimetil linker ili linker koji sadrži disulfid. U jednom poželjnom rešenju, linker je razgradiv u uslovima unutar ćelije, tako da razgradnja linkera oslobađa citotoksičan agens iz antitela u unutarćelijskoj sredini.

[0185] Na primer, u nekim rešenjima, linker je razgradiv pomoću agensa za razgradnju koji je prisutan u unutarćelijskoj sredini (npr., unutar lizozoma ili endozoma ili kaveole). Linker može biti, na primer, peptidil linker koji razgrađuje unutarćelijska peptidaza ili enzim proteaza, uključujući, ali bez ograničenja, lizozomsku ili endozomsku proteazu. Tipično, peptidil linker je dug bar dve aminokiseline ili je dug bar tri aminokiseline. Agensi za razgradnju mogu da uključuju katepsine B i D i plazmin, koji su svi poznati da hidrolizuju dipeptidne derivate leka što dovodi do oslobađanja aktivnog leka unutar ciljne ćelije. Na primer, može da se koristi peptidil linker koji je razgradiv pomoću katepsin-B tiol-zavisne proteaze, koji se jako eksprimira u kancerskom tkivu (npr., linker sa Phe-Leu ili Gly-Phe-Leu-Gly). U specifičnim rešenjima, peptidil linker, razgradiv pomoću unutarćelijske proteaze, je linker sa Val-Cit ili Phe-Lys. Jedna prednost upotrebe unutarćelijskog proteolitičkog oslobađanja citotoksičnog agensa je da je agens tipično oslabljen kad je konjugovan i stabilnosti konjugata u serumu su tipično visoke.

[0186] U drugim rešenjima, razgradiv linker je osetljiv na pH, tj., osetljiv na hidrolizu pri određenim vrednostima pH. Tipično, linker osetljiv na pH je hidrolizabilan u kiselim uslovima. Na primer, može da se koristi kiselo-labilan linker koji je hidrolizabilan u lizozomu (npr., hidrazon, semikarbazon, tiosemikarbazon, cis-akonitinski amid, ortoestar, acetal, ketal ili slično). Takvi linkeri su relativno stabilni u uslovima neutralnog pH, kao što su oni u krvi, ali su nestabilni ispod pH 5,5 ili 5,0, što je približan pH lizozoma. U određenim rešenjima, hidrolizabilan linker je tioetarski linker (kao što je, npr., tioetar spojen sa terapijskim agensom preko acilhidrazonske veze).

[0187] A u nekim drugim rešenjima, linker je razgradiv u reduktivnim uslovima (npr., disulfidni linker). Spektar disulfidnih linkera je poznat u struci, uključujući, na primer, one koji se mogu formirati pomoću SATA (N-sukcinimidil-S-acetiltioacetat), SPDP (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat), SPDB (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)butirat) i SMPT (N-sukcinimidil-oksikarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)toluen)-, SPDB i SMPT.

[0188] Kao neograničavajući primer nerazgradivih linkera ili onih "koji se ne mogu redukovati", može se pomenuti imunokonjugat trastuzumab-DM1 (TDM1), koji kombinuje trastuzumab sa spojenim hemoterapijskim agensom, majtanzinom.

[0189] U jednom poželjnom rešenju, imunokonjugat se može dobijati bilo kojim metodom poznatim stručnjaku kao što je, bez ograničenja, i) reakcija nukleofilne grupe antitela sa bivalentnim linkerskim reagensom praćena reakcijom sa citotoksičnim agensom ili ii) reakcija nukleofilne grupe citotoksičnog agensa sa bivalentnim linkerskim reagensom praćena reakcijom sa nukleofilnom grupom antitela.

[0190] Nukleofilne grupe na antitelu uključuju, bez ograničenja, N-terminalne amino grupe, amino grupe bočnih lanaca, npr. lizin, tiol grupe bočnih lanaca i hidroksil ili amino grupe šećera kad je protein za vezivanje antigena glikozilovan. Amin, tiol i hidroksil grupe su nukleofilne i sposobne da reaguju da formiraju kovalentne veze sa elektrofilnim grupama na funkcionalnim grupama linkera i linkerskih reagenasa uključujući, bez ograničenja, aktivne estre kao što su NHS estri, HOBt estri, haloformijati i kiseli halidi; alkil i benzil halide kao što su haloacetamidi; aldehidi, ketoni, karboksil i maleimidne grupe. Antitelo može da ima međulančane disulfide koji se mogu redukovati, tj. cisteinske mostove. Antitelo se može napraviti reaktivno za konjugaciju sa linkerskim reagensima pomoću obrade redukcionim sredstvima kao što je DTT (ditiotreitol). Svaki cisteinski most će tako formirati, teorijski, dva reaktivna tiolna nukleofila. Dodatne nukleofilne grupe se mogu uvesti u antitelo bilo kojom reakcijom poznatom stručnjaku. Kao neograničavajući primer, reaktivne tiol grupe se mogu uvesti u antitelo uvođenjem jednog ili više cisteinskih ostataka.

[0191] Imunokonjugati se mogu dobijati i modifikacijom antitela gde se uvedu elektrofilne grupe, koje mogu da reaguju sa nukleofilnim supstituentima na linker reagensu ili citotoksičnom agensu. Šećeri glikozilovanog antitela mogu da se oksiduju da formiraju aldehidne ili ketonske grupe koje mogu da reaguju sa amino grupom linker reagenasa ili citotoksičnih agenasa. Dobijene imino grupe Schiff-ove baze mogu da formiraju stabilan spoj, ili mogu da se redukuju da formiraju stabilne amino veze. U jednom rešenju, reakcija ugljovodoničnog dela glikozilovanog antitela sa bilo galaktoznom oksidazom ili natrijum meta-perjodatom može da dâ karbonilne (aldehidne i ketonske) grupe u antitelu koje mogu da reaguju sa odgovarajućim grupama na leku. U jednom drugom rešenju, antitela koja sadrže N-terminalni serin ili treonin mogu da reaguju sa natrijum meta-perjodatom, dovodeći do proizvodnje aldehida na mestu prve aminokiseline.

[0192] U određenim poželjnim rešenjima, linkerska jedinica može imati sledeću opštu formulu:

--Ta--Ww--Yy--gde je:

-T- produžna (stretcher) jedinica;

a je 0 ili 1;

-W- je aminokiselinska jedinica;

w je nezavisno ceo broj u opsegu od 1 do 12;

-Y- je spejser jedinica;

y je 0, 1 ili 2.

[0193] Produžna jedinica (-T-), kad je prisutna, vezuje antitelo sa aminokiselinskom jedinicom (-W-). Korisne funkcionalne grupe koje mogu biti prisutne na antitelu, bilo prirodno bilo hemijskom manipulacijom, uključuju sulfhidril, amino, hidroksil, anomernu hidroksilnu grupu ugljovodonika i karboksil. Pogodne funkcionalne grupe su sulfhidril i amino. Sulfhidril grupe se mogu generisati redukcijom intramolekulskih disulfidnih veza antitela, ako su prisutne. Alternativno, sulfhidril grupe se mogu generisati reakcijom amino grupe iz lizinske grupe antitela sa 2-iminotiolanom ili nekim drugim reagensima koji generišu sulfhidril. U specifičnim rešenjima, antitelo je rekombinantno antitelo i konstruiše se tako da nosi jedan ili više lizina. Poželjnije, antitelo se može konstruisati tako da nosi jedan ili više cisteina (cf. ThioMabs).

[0194] U određenim specifičnim rešenjima, produžna jedinica formira vezu sa atomom sumpora iz antitela. Atom sumpora može biti izveden iz sulfhidril (--SH) grupe redukovanog antitela.

[0195] U drugim određenim specifičnim rešenjima, produžna jedinica je spojena sa antitelom preko disulfidne veze između atoma sumpora iz antitela i atoma sumpora iz produžne jedinice.

[0196] U nekim drugim specifičnim rešenjima, reaktivna grupa produžnice sadrži reaktivno mesto koje može da bude reaktivno na amino grupu antitela. Amino grupa može da bude ona iz arginina ili lizina. Pogodna reaktivna mesta na amin uključuju, ali bez ograničenja, aktivirane estre kao što su sukcinimid estri, 4-nitrofenil estri, pentafluorofenil estri, anhidridi, kiseli hloridi, sulfonil hloridi, izocijanati i izotiocijanati.

[0197] U još jednom drugom aspektu, reaktivna grupa produžnice sadrži reaktivno mesto koje je reaktivno na modifikovanu ugljovodoničnu grupu koja može da bude prisutna na antitelu. U jednom specifičnom rešenju, antitelo je enzimski glikozilovano da bi obezbedilo ugljovodoničnu grupu. Ugljovodonik može da bude blago oksidovan reagensom kao što je natrijum perjodat i dobijena karbonilna jedinica oksidovanog ugljovodonika može biti kondenzovana sa produžnicom koja sadrži funkcionalnu grupu kao što je hidrazid, oksim, reaktivni amin, hidrazin, tiosemikarbazid, hidrazin karboksilat, ili arilhidrazid.

[0198] Aminokiselina jedinica (-W-) spaja produžnu jedinicu (-T-) sa spejser jedinicom (-Y-) ako je spejser jedinica prisutna i spaja produžnu jedinicu sa citotoksičnim agensom ako je spejser jedinica odsutna.

[0199] Kao što je gore pomenuto, -Ww- može biti dipeptidna, tripeptidna, tetrapeptidna, pentapeptidna, heksapeptidna, heptapeptidna, oktapeptidna, nonapeptidna, dekapeptidna, undekapeptidna ili dodekapeptidna jedinica.

[0200] U nekim rešenjima, aminokiselina jedinica može da sadrži aminokiselinske ostatke kao što su, bez ograničenja, alanin, valin, leucin, izoleucin, metionin, fenilalanin, triptofan, prolin, lizin zaštićen ili ne acetilom ili formilom, arginin, arginin zaštićen ili ne tozil ili nitro grupama, histidin, ornitin, ornitin zaštićen acetilom ili formilom i citrulin. Primeri komponenata aminokiselinskih linkera poželjno uključuju dipeptid, tripeptid, tetrapeptid ili pentapeptid.

[0201] Primeri dipeptida uključuju: Val-Cit, Ala-Val, Ala-Ala, Val-Ala, Lys-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala-Phe, Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N<9>-tosyl-Arg, Phe-N<9>-Nitro-Arg.

[0202] Primeri tripeptida uključuju: Val-Ala-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Phe-Phe-Lys, Gly-Gly-Gly, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys.

[0203] Primeri tetrapeptida uključuju: Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO. 53), Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO.54).

[0204] Primeri pentapeptida uključuju: Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO.55).

[0205] Aminokiselinski ostaci koji sadrže aminokiselinsku komponentu linkera uključuju one koji se javljaju prirodno, kao i manje aminokiseline i aminokiselinske analoge koji se ne javljaju prirodno, kao što je citrulin. Aminokiselinske komponente linkera mogu da budu dizajnirane i optimizovane u njihovoj selektivnosti za enzimsko razlaganje određenim enzimom, na primer, proteazom vezanom za tumor, catepsinom B, C i D ili plazminskom proteazom.

[0206] Aminokiselinska jedinica linkera se može enzimski razložiti enzimom uključujući, ali bez ograničenja, proteazu vezanu za tumor da oslobodi citotoksični agens.

[0207] Aminokiselinska jedinica može biti dizajnirana i optimizovana u njenoj selektivnosti za enzimsko razlaganje konkretnom proteazom vezanom za tumor. Pogodne jedinice su one čije razlaganje je katalizovano proteazama, katepsinom B, C i D i plazminom.

[0208] Spejser jedinica (-Y-), kad je prisutna, spaja aminokiselinsku jedinicu sa citotoksičnim agensom. Spejser jedinice su dva opšta tipa: samožrtvujuća i nesamožrtvujuća. Nesamožrtvujuća spejser jedinica je ona čiji deo ili cela spejser jedinica ostaje vezana za citotoksični agens posle enzimskog odvajanja aminokiselinske jedinice od imunokonjugata. Primeri nesamožrtvujuće spejser jedinice uključuju, ali nisu ograničeni na (glicin-glicin) spejser jedinicu i glicinsku spejser jedinicu. Da bi se oslobodio citotoksični agens, nezavisna reakcija hidrolize bi trebalo da se desi unutar ciljne ćelije da bi se pocepala veza u jedinici glicin- citotoksični agens.

[0209] U jednom drugom rešenju, nesamožrtvujuća spejcer jedinica (-Y-) je -Gly-.

[0210] U jednom rešenju, imunokonjugatu nedostaje spejcer jedinica (y=0). Alternativno, imunokonjugat koji sadrži samožrtvujuću spejser jedinicu može da oslobodi citotoksični agens bez potrebe za odvojenim korakom hidrolize. U ovim rešenjima, (-Y-) je p-aminobenzil alkoholna (PAB) jedinica koja je spojena sa -Ww- putem azotovog atoma iz PAB grupe i spojena direktno sa -D preko karbonatne, karbamatne ili etarske grupe.

[0211] Ostali primeri samožrtvujućih spejsera uključuju, ali bez ograničenja, aromatična jedinjenja koja su elektronski ekvivalentna sa PAB grupom, kao što su 2-aminoimidazol-5-metanol derivati i orto ili para-aminobenzilacetali. Mogu se koristiti spejseri koji se podvrgavaju lakoj ciklizaciji posle hidrolize amidne veze, kao što su supstituisani i nesupstituisani amidi 4-aminobuterne kiseline, odgovarajuće supstituisani sistemi biciklo[2.2.1] i biciklo[2.2.2] prstena i amidi 2-aminofenilpropionske kiseline.

[0212] U jednom alternativnom rešenju, spejser jedinica je razgranata bis(hidroksimetil)stirenska (BHMS) jedinica, koja se može koristiti za ugrađivanje dodatnih citotoksičnih agenasa.

[0213] Punjenje leka, koje se još naziva odnos lek-antitelo (DAR) je prosečan broj lekova po agensu koji se vezuje za ćeliju.

[0214] U slučaju izotipa antitela IgG1, gde su lekovi vezani za cisteine posle parcijalne redukcije antitela, punjenje leka može da se kreće od 1 do 8 lekova (D) po antitelu, tj. gde je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 i 8 funkcionalnih grupa leka kovalentno vezano sa antitelom.

[0215] U slučaju izotipa antitela IgG2, gde su lekovi vezani za cisteine posle parcijalne redukcije antitela, punjenje leka može da se kreće od 1 do 12 lekova (D) po antitelu, tj. gde je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 i 12 funkcionalnih grupa leka kovalentno vezano sa antitelom.

[0216] Sastavi ADC uključuju skupove agenasa koji se vezuju za ćeliju, npr. antitela konjugovana sa nizom lekova, od 1 do 8 ili 1 do 12.

[0217] Kad su lekovi vezani za lizine, punjenje leka može da se kreće od 1 do 80 lekova (D) po antitelu ćelije, mada gornja granica od 40, 20, 10 ili 8 može biti poželjna. Sastavi ADC uključuju skupove agenasa koji se vezuju za ćeliju, npr. antitela konjugovana sa nizom lekova od 1 do 80, 1 do 40, 1 do 20, 1 do 10 ili 1 do 8.

[0218] Prosečan broj lekova po antitelu u preparatima ADC iz reakcija konjugacije se mogu okarakterisati konvencionalnim sredstvima. Kvantitativna distribucija ADC u terminima odnosa leka se takođe može odrediti. Za neke konjugate antitelo-lek, odnos leka može biti ograničen brojem mesta vezivanja na antitelu. Na primer, antitelo može da ima samo jednu ili nekoliko tiol grupa cisteina, ili može da ima samo jednu ili nekoliko dovoljno reaktivnih tiol grupa preko kojih se linker može zakačiti. Veće punjenje leka, npr. gde je odnos leka >5, može da da izazove agregiranje, nerastvorljivost, toksičnost, ili gubitak ćelijske propustljivosti određenih konjugata antitelo-lek.

[0219] Određena antitela imaju reducibilne međulančane disulfide, tj. cisteinske mostove. Antitela mogu da se naprave reaktivnim za konjugaciju sa linker reagensima tretmanom sa reduktivnim sredstvom kao što je DTT (ditiotreitol). Svaki cisteinski most će tako formirati, teorijski, dva reaktivna tiolna nukleofila. Dodatne nukleofilne grupe se mogu uvesti u antitela reakcijom lizina sa 2-iminotiolanom (Trautov reagens), što dovodi do konverzije amina u tiol. Reaktivne tiol grupe mogu da se uvedu u antitelo (ili njegov fragment) konstruisanjem jednog, dva, tri, četiri ili više cisteinskih ostataka (npr., dobijanje mutantnih antitela koja sadrže jednu ili više nenativnih cisteinskih ostataka). US 7521541 govori o inženjerisanju antitela uvođenjem reaktivnih aminokiselina cisteina.

[0220] Aminokiseline cisteini se mogu inženjerisati na reaktivnim mestima u antitelu i tako da ne formiraju međulančane ili međumolekulske disulfidne spojeve (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249). Inženjerisani tioli cisteina mogu da reaguju sa linker reagensima ili reagensima lek-linker koji imaju elektrofilne grupe reaktivne sa tiolom, kao što je maleimid ili alfa-halo amidi, da formiraju ADC sa antitelima inženjerisanim cisteinom i funkcionalnim grupama PBD leka. Lokacija funkcionalne grupe leka se tako može dizajnirati, kontrolisati i znati. Punjenje leka se može kontrolisati, jer inženjerisane tiol grupe cisteina tipično reaguju sa linker reagensima koji su reaktivni sa tiolom ili lek-linker reagensima sa visokim prinosom. Inženjerisanje IgG antitela da se uvede cisteinska aminokiselina supstitucijom na jednom mestu na teškom ili lakom lancu daje dva nova cisteina na simetričnom antitelu. Punjenje leka od skoro 2 se može postići uz približnu homogenost proizvoda konjugacije ADC.

[0221] Pored toga, ovde je obezbeđen imunokonjugat ili konjugat antitelo-lek, kao što je gore opisan, za upotrebu kao lek.

[0222] Ovde je dalje obezbeđen i imunokonjugat ili konjugat antitelo-lek, kao što je gore opisan, za upotrebu u lečenju kancera.

[0223] Konjugat antitelo-lek, kao što je gore opisan, je ovde obezbeđen za upotrebu kao lek. Specifično, konjugat antitelo-lek, kao što je gore opisan, je obezbeđen za upotrebu u lečenju kancera. Specifičnije, konjugat antitelo-lek kao što je gore opisan, je obezbeđen za upotrebu u lečenju kancera koji eksprimiraju IGF-1R ili kancera vezanih za IGF-1R.

[0224] Kanceri vezani za IGF-1R uključuju tumorske ćelije koji eksprimiraju ili prekomerno eksprimiraju ceo ili deo IGF-1R na svojoj površini.

[0225] Konkretnije, navedeni kanceri su dojke, kolona, ezofagusni karcinom, hepatoćelijski kancer, gastrični kancer, gliom, kancer pluća, melanom, osteosarkom, kancer jajnika, prostate, rabdomiosarkom, renalni kancer, tiroidni kancer, kancer endometrijuma, švanom, neuroblastom, oralni skvamozni karcinom, mezoteliom, sarkom glatkih mišića i bilo koji fenomen rezistencije na lekove.

[0226] U jednom drugom aspektu, upotreba konjugata antitelo-lek opisanog gore za lečenje kancera koji eksprimira IGF-1R je obezbeđen ovde.

[0227] Još jedan predmet obezbeđen ovde je farmaceutski sastav koji sadrži antitelo ili konjugat antitelo-lek, ili imunokonjugat, kao što je opisano gore.

[0228] Konkretnije, ovde je obezbeđen farmaceutski sastav koji sadrži antitelo ili konjugat antitelo-lek, ili imunokonjugat opisan gore i bar ekscipijent i/ili farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0229] Poželjnije, farmaceutski sastav sadrži antitelo ili konjugat antitelo-lek opisan gore i ekscipijent i/ili farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0230] Kao što se ovde koristi, izraz "farmaceutski prihvatljiv nosač" ili "ekscipijent" treba da označava jedinjenje ili kombinaciju jedinjenja koja ulaze u farmaceutski sastav i koja ne izazivaju sekundarne reakcije i koja dozvoljavaju, na primer, olakšavanje administracije aktivnih jedinjenja, povećanje njihovog trajanja i/ili efikasnosti u telu, povećanje njegove rastvorljivosti u rastvoru ili poboljšanje njegove konzervisanosti. Ovi farmaceutski prihvatljivi nosači i ekscipijenti su dobro poznati i stručnjak će ih prilagoditi kao funkciju prirode i načina administracije izabranog aktivnog jedinjenja.

[0231] Poželjno, ovi imunokonjugati će biti administrirani sistemskim putem, pogotovo intravenoznim putem, intramuskularnim, intradermalnim, intraperitonealnim ili subkutanim putem ili oralnim putem. Na jedan poželjniji način, sastav koji sadrži imunokonjugate će biti administriran nekoliko puta, sekvencijalno.

[0232] Njihovi načini administracije, doze i optimalni farmaceutski oblici se mogu odrediti prema kriterijumima koji se uopšteno uzimaju u obzir prilikom utvrđivanja tretmana prilagođenog pacijentu kao što su, na primer, starost ili telesna težina pacijenta, ozbiljnost njegovog opšteg stanja, tolerancija tretmana i primećeni sekundarni efekti.

[0233] U jednom drugom aspektu, obezbeđen je farmaceutski sastav koji sadrži antitelo ili konjugat antitelo-lek ili imunokonjugat opisan gore i bar ekscipijent i/ili farmaceutski prihvatljiv nosač za upotrebu u lečenju kancera. U jednom konkretnijem aspektu, obezbeđen je farmaceutski sastav koji sadrži antitelo ili konjugat antitelo-lek ili imunokonjugat opisan gore i bar ekscipijent i/ili farmaceutski prihvatljiv nosač za upotrebu u lečenju kancera IGF-1R koji eksprimira IGF-1R.

[0234] Prijava se odnosi i na metod lečenja kancera u subjektu, a naročito lečenja kancera koji eksprimira IGF-1R, koji obuhvata administriranje navedenom subjektu efektivne količine bar konjugata antitelo-lek opisanog gore. Predmetna prijava se dalje odnosi na metod lečenja kancera u subjektu, a naročito lečenja kancera koji eksprimira IGF-1R, koji obuhvata administriranje navedenom subjektu efektivne količine farmaceutskog sastava opisanog gore.

[0235] Jedno drugo rešenje obezbeđuje metod dostavljanja leka do ćelije kancera koji eksprimira IGF-1R u subjektu, koji obuhvata administriranje navedenom subjektu efektivne količine bar konjugata antitelo-lek ili farmaceutskog sastava opisanog gore.

LEGENDE SLIKA

[0236]

Slika 1: Primer Biacore profila vezivanja dobijen sa 3 antitela na ECD hIGF-1R uhvaćenim pomoću antitela na His marker.

Slika 2: Šema mapiranja epitopa definisana iz panela 15 anti-hIGF-1R monoklonskih antitela gde je definisano 5 grupa epitopa. Numeracija grupa nije vezana za poziciju u sekvenci, niti za 3D strukturu antigena.

Slike 3A do 3C: Vezivanje antitela za humani nativni IGF-1R FACS analizom. Slika 3A predstavlja titracionu krivu, na MCF-7 ćelijskoj liniji, po jednog himernog anti-IGF-1R antitela reprezentativnog za svaki klaster epitopa. MFI predstavlja srednju vrednost intenziteta fluorescencije. Slika 3B predstavlja EC50i mišjeg i himernog anti-IGF-1R antitela na MCF-7 ćelijskoj liniji. Slika 3C predstavlja Bmaxhimernog anti-IGF-1R antitela na MCF-7 ćelijskoj liniji.

Slike 4A i 4B: Procena prepoznavanja hIGF-1R pomoću transfektovanih prema netransfektovanim ćelijama. Slika 4A predstavlja titracione krive po jednog himernog anti-IGF-1R Ab reprezentativnog za svaki klaster epitopa na IGF-1R<+>ćelijskoj liniji. MFI predstavlja srednju vrednost intenziteta fluorescencije. Slika 4B predstavlja vezivanje himernog anti-IGF-1R Ab reprezentativnog za svaki klaster epitopa na humanoj IGF-1R-ćelijskoj liniji. MFI predstavlja srednju vrednost intenziteta fluorescencije.

Slike 5A i 5B: Procena specifičnosti Ab na hIGF-1R u odnosu na hIR pomoću transfektovanih ćelija. Slika 5A predstavlja vezivanje mišjeg anti-IGF-1R Ab na hIR<+>transfektovanoj ćelijskoj liniji. Slika 5B predstavlja vezivanje himernog anti-IGF-1R Ab na IR+ ćelijskoj liniji. MFI predstavlja srednju vrednost intenziteta fluorescencije. U panelima A i B komercijalno dostupno anti-hIR antitelo opisano kao GRO5 (Calbiochem) je uvedeno kao pozitivna kontrola.

Slika 6: Vezivanje mišjeg anti-IGF-1R Ab na IM-9 ćelijskoj liniji. MFI predstavlja srednju vrednost intenziteta fluorescencije. GRO5 anti-hIR Mab je uveden kao pozitivna kontrola.

Slike 7A, 7B i 7C: Procena prepoznavanja majmunskog IGF-1R. Slika 7A predstavlja titracione krive po jednog himernog anti-IGF-1R Ab reprezentativnog za svaki klaster epitopa na COS-7 ćelijskoj liniji. MFI predstavlja srednju vrednost intenziteta fluorescencije. Slika 7B predstavlja EC50i mišjeg i himernog anti-IGF-1R antitela na COS-7 ćelijskoj liniji. Slika 7C predstavlja EC50himernog anti-IGF-1R antitela i na hIGF-1R+ transfektovanim ćelijama i COS-7 ćelijskoj liniji. GR11L (Calbiochem) je uveden kao pozitivna kontrola.

Slika 8: Poređenje vezivanja c208F2 na ili ECD hIGF-1R ili ECD IGF-1R cinomolgus majmuna testom Biacore. Senzogrami dobijeni na osnovu SPR tehnologije pomoću Biacore X100 korišćenjem senzorskog čipa CM5 aktiviranog sa više od 11000 RU mišjeg antitela na His-marker, hemijski nakalemljenog na karboksimetil dekstransku matricu. Eksperiment se odvijao pri brzini protoka od 30 µl/min na 25°C uz HBS-EP+ kao elucioni pufer i pufer za razblaživanje uzoraka. Slika pokazuje superpoziciju 4 nezavisna senzograma poređana na x-osi na početku prve injekcije analita i na y-osi uz osnovnu liniju definisanu pred ovu prvu injekciju. Senzogrami dobijeni hvatanjem sekvence rekombinantnog rastvorljivog IGF1R zasnovane na čoveku su označeni romboidima. Senzogrami dobijeni hvatanjem sekvence rekombinantnog rastvorljivog IGF-1R zasnovane na cinomolgusu su označeni trouglovima. Beli simboli odgovaraju praznim kružićima (5 injekcija elucionog pufera), a crni simboli odgovaraju injekcijama rastućih koncentracija c208F2 (5, 10, 20, 40 i 80 nM).

Slika 9: Procena intrinsičnog efekta anti-hIGF-1R antitela na fosforilaciju receptora u poređenju sa IGF1.

Slika 10: Inhibicija fosforilacije IGF-1R kao odgovor na IGF-1 od strane mišjeg antihIGF-1R.

Slika 11: Vezivanje anti-IGF-1R antitela na površini ćelije je nishodno regulisan na 37°C. MCF-7 ćelije c 4 h na 4°C ili 37°C sa po 10 µg/ml svakog Ab. Slika predstavlja ΔMFI. Slike 12A i 12B: Raspad antitela na površini. Antitelo vezano za površinu ćelije je procenjeno posle 10, 20, 30, 60 i 120 min na 37°C. Slika 12A predstavlja % preostalog IGF-1R u poređenju sa intenzitetom signala merenim na 4°C. Slika 12B predstavlja izračunavanje poluživota primenom softvera Prims Software i fitovanjem na eksponencijalni raspad.

Slika 13: Kinetika internalizacije antitela procenjena FACS analizom. Ćelije su inkubirane sa 10 µg/ml mišjih Ab 0, 30 ili 60 min na 37°C. Ćelije su ili permeabilizovane ili ne i inkubirane sa sekundarnim anti-mišjim IgG-Alexa 488. “Membrana” odgovara intenzitetu signala bez permeabilizacije. “Ukupan” odgovara intenzitetu signala posle permeabilizacije ćelija, a “citoplazmatski” odgovara internalizovanim Ab. Naziv svakog procenjenog antitela je označen na vrhu svakog grafika.

Slike 14A i 14B: Snimci internalizacije Ab. Slika 14A: MCF-7 ćelije inkubirane 20 min sa m208F2 na 4°C i prane pre inkubacije [a)] na 37°C 15 [b)], 30 [c)] i 60 [d)] min. Ćelije su fiksirane i permeabilizovane. m208F2 Ab je otkriven pomoću anti-mišjeg IgG Alexa488, a Lamp-1 je otkriven pomoću zečjeg anti-Lamp-1 antitela i sa sekundarnim anti-zečjim IgG Alexa 555. Slika 14B (I do III deo): MCF-7 ćelije su inkubirane 30 minuta na 37°C sa svakim od drugih anti-hIGF-1R mišjih antitela koja se testiraju, a zatim obojene kao što je gore opisano. Kolokalizacija je identifikovana pomoću priključka za obeležavanje kolokalizacije softvera ImageJ.

Slika 15: Uključenost lizozomskog puta u raspad antitela.

Slika 16: Procena vezivanja anti-hIG-1R mišjih antitela na različitim pH. EC50 vezivanja različitih antitela je procenjena na MCF-7 uz pufere sa različitim pH u opsegu od 5 do 8. Slika 17: Procena sposobnosti izabranih anti-IGF-1R Ab da indukuju citotoksičnost u testu Fab-ZAP. A) MCF-7 ćelije su inkubirane sa rastućim koncentracijama himernih antitela na IGF-1R u kombinaciji sakompletom za humani Fab-ZAP. Vijabilnost ćelija je merena pomoću testa vijabilnosti luminiscentnih ćelija CellTiter-Glo®. c9G4 himerno antitelo je korišćeno kao irelevantno antitelo. B) IC50iz rezultata je prikazano u A).

Slika 18: Korelacija između i) citotoksične potentnosti, ii) uticaja pH na vezivanje Ab/IGF-1R, iii) efekat Ab na fosforilaciju IGF-1R indukovanu pomoću IGF-1 i iv) klasterizovanje antitela.

Slike 19A do 19D: Vezivanje karakteristično za prvu humanizovanu formu c208F2 Mab. Osobine vezivanja hz208F2 VH3/VL3 mAb su procenjene na humanoj ćelijskoj liniji MCF-7 (Slika 19A), na majmunskoj ćelijskoj liniji COS-7 (Slika 19B) i na transfektovanoj mišjoj ćelijskoj liniji koja eksprimira humani insulinski receptor (Slika 19C). Vezivanje i mišjih i himernih 208F2 mAb je procenjeno paralelno. Klon GRO5 anti-hIR antitela je korišćen za potvrđivanje ekspresije hIR na transfektovanoj ćelijskoj liniji (Slika 19D).

Slike 20A do 20D: Validacija pomoću ELISA AF305-NA poliklonskog antitela koje je korišćeno za IHC eseje. Slika 20A: Vezivanje za hIGF-1 R. Slika 20B: Vezivanje za humani rekombinantni IR. Nema prepoznavanja EDC hIR, ni ćelijskog IR koji su eksprimirale transfektovane ćelije (Slika 20D), u poređenju sa kontrolnim Ab GRO5 na ovim ćelijama transfektovanim hIR-om (Slika 20C).

Slika 21: Validacija bojenja hIGF-1R na FFPE presecima iz ksenografta koji eksprimiraju različite nivoe hIGF-1 R. Hs746T je uveden kao negativna kontrola.

Slike 22A i 22B: Procena ekspresije hIGF-1R na normalnim FFPE presecima tkiva. Preseciplacente su korišćeni kao pozitivna kontrola za normalna tkiva, dok su pozitivna tumorska tkiva ksenografta uvedena u svaki turnus da bi se kalibrisala ekspresija hIGF-1R.

Slika 23: Procena ekspresije hIGF-1R na FFPE presecima tkiva NSCL. Četiri slučaja koji su reprezentativni za jako bojenje, nađeni u velikom panelu analiziranog tkiva.

Slika 24: Procena ekspresije hIGF-1R na FFPE presecima tkiva kancera dojke. Tri slučaja koji su reprezentativni za jako bojenje, nađeni u ispitivanom panelu analiziranog tkiva. Slika 25: Procena ekspresije hIGF-1R na FFPE presecima tkiva iz raznih tumora.

Slika 26: Superpozicija senzograma dobijena uređajem Biacore X100 na bazi SPR na temperaturi od 25°C sa senzorskim čipom CM5 aktiviranim na obe protočne ćelije pomoću oko 12000 RU mišjeg monoklonskog antitela na His marker, hemijski nakalemljenog na karboksimetil dekstransku matricu uz upotrebu HBS-EP+ kao elucionog pufera pri brzini protoka od 30 µl/min. Svaki senzogram (prvi je označen trouglovima, a drugi je označen romboidima) odgovara kompletnom ciklusu:

1. Injektiranje tokom jednog minuta rastvora rekombinantnog h-IGF-1R (10 µg/ml) u drugoj protočnoj ćeliji.

2. Za prvi senzogram: 5 injekcija elucionog pufera, svaka tokom 90 s.

Za drugi senzogram: pet injekcija pri rastućim koncentracijama rastvora anti-IGF-1R c208F2 antitela, svaka tokom 90 s

1. Kašnjenje od 300 s za određivanje kinetičkih brzina disocijacije.

2. Regeneracija površine injekcijom od 10 mM glicina, HCl pufera pH 1,5 tokom 45 s. Slika 27: Senzogram koji odgovara oduzimanju praznog senzograma (5 injekcija HBS-EP+) od senzograma dobijenog pri rastućim koncentracijama rastvora anti-IGF-1R c208F2 je predstavljen sivim. Teorijski senzogram koji odgovara 1:1 modelu sa sledećim parametrima: kon = (1,206 ± 0,036) x 10<6>M<-1>.s<-1>, koff= (7,81 ± 0,18) x 10<-5>s<-1>, Rmax = 307,6 ± 0,3 RU je predstavljen tankom crnom linijom. Izračunate koncentracije c208F2 su date na grafiku: samo najviša koncentracija (24 nM) se računa kao konstantna).

Slika 28: Konstante disocijacije odgovaraju srednjim vrednostima iz četiri eksperimenta rađena za svako antitelo i odgovaraju odnosu: koff/konx 10<12>, koji treba izraziti u pM jedinicama. Stubići greške odgovaraju standardnim greškama (n=4).

Slika 29: Poluživoti odgovaraju srednjim vrednostima iz četiri eksperimenta rađena za svako antitelo i odgovaraju odnosu: Ln(2)/koff/3600 koji treba izraziti u h jedinicama. Stubići greške odgovaraju standardnim greškama (n=4).

Slika 30: Superpozicija dva senzograma koji odgovaraju dvama ciklusima eksperimenta rađenog na uređaju Biacore X100 pri brzini protoka od 30µl/min na 25°C.

Prvi korak ciklusa odgovara injektiranju rastvora c208F2 antitela u koncentraciji od 10 µg/ml tokom 60s na drugoj protočnoj ćeliji senzorskog čipa CM5, aktiviranog kalemljenjem više od 10500 RU mišjeg anti-humanog IgG Fc monoklonskog antitela, hemijski vezanog za karboksimetildekstransku matricu preko njegovih funkcionalnih amino grupa. Drugi korak odgovara injektiranju vanćelijskog domena bilo h-IGF-1R (prosti romboidi), bilo m-IGF-1R (prazni romboidi) rastvora sirovih supernatanata medijuma za kulturu ćelija tokom 120 s sa kašnjenjem od 120 s. Dvosmerne strelice ukazuju na položaje mere nivoa hvatanja antitela i nivoa vezivanja IGF-1R korišćenih u ovoj studiji.

Slika 31: Histogrami koji predstavljaju odnos između nivoa vezivanja IGF-1R dobijenog za svaki himerni h/m IGF-1R konstrukt i nivoa c208F2 uhvaćenog na drugoj protočnoj ćeliji senzorskog čipa tokom odgovarajućeg ciklusa.

Slike 32A i B: Histogrami koji predstavljaju EC50 hz208F2 H076/L024 na pH 5 do pH 8. Kiseli pH smanjuje kapacitet vezivanja humanizovanih antitela na IGF-1R hz208F2 H076/L024 (A) i hz208F2 (H077/L018 (B).

Slike 33: Vezivanje Hz208F2 (10µg/ml) bilo za 170 RU rastvorljive verzije prirodnog h-IGF1R (crni romboid), bilo za 120 RU mutanta C29 (Asp491>Ala) ovog receptora. Svaki receptor je uhvaćen preko svog C-terminalnog 66His markera na senzorskom čipu CM5. Eksperiment je rađen na uređaju Biacore X100 na 25°C pri brzini protoka od 30µl/min uz upotrebu klasičnog HBS-EP+ kao elucionog pufera.

PRIMERI

[0237] Svi hibridomi pomenuti ovde su deponovani u CNCM (Institut Pasteur, France) i identifikovani su u sledećoj tabeli 7.

Tabela 7

Primer 1: Generisanje antitela na IGF-1R

[0238] Da bi se generisala mišja monoklonska antitela (Mab) na humani vanćelijski domen (ECD) humanog IGF-1 receptora (hIGF-1R), 5 BALB/c miševa je imunizovano 3 puta s.c. pomoću 10 µg rhIGF-1R proteina (R&D Systems, Cat N°391-GR). Kao alternativa, tri dodatne imunizacije pomoću 10 µg mišjeg vanćelijskog domena (ECD) IGF-1R (R&D Systems, Cat N° 6630-GR /Fc) su urađene na nekim životinjama. Prva imunizacija je urađena u prisustvu kompletnog Freund-ovog adjuvanta (Sigma, St Louis, MD, USA). Nekompletan Freund-ov adjuvant (Sigma) je dodat za sledeće imunizacije. Tri dana pre fuzije, imunizovani miševi su bustovani pomoću 10 µg rhIGF-1R proteina. Zatim su splenociti i limfociti pripremljeni perfuzijom slezine i sitnjenjem susednih limfnih čvorova, respektivno, sakupljeni iz 1 od 5 imunizovanih miševa (izabranog posle titracije seruma svih miševa) i fuzionisani sa SP2/0-Ag14 ćelijama mijeloma (ATCC, Rockville, MD, USA). Protokol fuzije su opisali Kohler i Milstein (Nature, 256:495-497, 1975). Fuzionisane ćelije su zatim podvrgnute HAT selekciji. U opštem slučaju, za pravljenje monoklonskih antitela ili njihovih funkcionalnih fragmenata, pogotovo mišjeg porekla, moguće je koristiti tehnike koje su posebno opisane u priručniku "Antitela" (Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, str. 726, 1988). Približno 10 dana posle fuzije, pretražene su kolonije hibridnih ćelija. Za primarni pregled, supernatanti hibridoma su procenjeni na sekreciju Mab podignutih na ECD rhIGF-1R proteina FACS analizom uz korišćenje humanih ćelija MCF7 tumora dojke (ATCC) i/ili majmunskih COS7 ćelija (bubreg afričkog zelenog majmuna transformisan pomoću SV40) koje eksprimiraju majmunski IGF-1R na svojoj površini. Preciznije, za odabir pomoću protočne citometrije, 10<5>ćelija (bilo MCF7, bilo COS7) je zasejano u svako udubljenje ploča sa 96 udubljenja u PBS koji sadrži 1% BSA i 0,01% natrijum azid (FACS pufer) na 4°C. Posle 2 min centrifugiranja na 2000 rpm, pufer je uklonjen i dodati su supernatanti hibridoma za testiranje. Posle 20 min inkubacije na 4°C, ćelije su oprane dvaput i dodato je Alexa 488-konjugovano kozje antimišje antitelo 1/500°, razblaženo u FACS puferu (#A11017, Molecular Probes Inc., Eugene, USA) i inkubirane su 20 min na 4°C. Posle konačnog pranja FACS puferom, ćelije su analizirane pomoću FACS (Facscalibur, Becton-Dickinson) posle dodavanja propidijum jodida u svaku epruvetu u konačnoj koncentraciji od 40 µg/ml. Udubljenja koja sadrže same ćelije i ćelije inkubirane sa sekundarnim Alexa 488-konjugovanim antitelom su uključujena kao negativne kontrole. Izotipske kontrole su korišćene u svakom eksperimentu (Sigma, ref M90351MG). Bar 5000 ćelija je procenjeno da bi se izračunala srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI).

[0239] Dodatno je urađen test internalizacije da bi se izabrala samo antitela koja se internalizuju. Za ovaj test, MCF7 tumorska ćelijska linija je gajena u RMPI 1640 bez fenolnog crvenog, sa 1% L-glutaminom i 10% FACS 3 dana pre eksperimenta. Ćelije su zatim odlepljene pomoću tripsina i 100 µl ćelijske suspenzije, sa 4·10<5>ćelija/ml, je stavljeno na ploče sa 96 višestrukih udubljenja u RPMI1640 bez fenolnog crvenog, sa 1% L-glutaminom i 5% FBS. Posle 2 min centrifugiranja na 2000 rpm, ćelije su ponovo supendovane u 50 µl ili supernatanta hibridoma ili rastvora kontrolnog antitela (pozitivna i izotipska kontrola pri 1 µg/ml). Posle 20 min inkubacije na 4°C, ćelije su centrifugirane 2 min na 2000 rpm i ponovo supendovane bilo u hladnom (4°C), bilo u toplom (37°C) kompletnom medijumu za kulture. Ćelije su zatim inkubirane 2 sata ili na 37°C, ili na 4°C. Zatim su ćelije oprane tri puta FACS puferom. Alexa 488-obeleženo kozje anti-mišje IgG antitelo je inkubirano 20 minuta i ćelije su oprane tri puta pre FACS analize na ćelijskoj populaciji bez propidijum jodida.

[0240] Posle FACS analize, određena su dva parametra: (i) razlika fluorescentnog signala detektovanog na površini ćelija inkubiranih na 4°C i onog dobijenog sa ćelija inkubiranih na 37°C sa jednim supernatantom hibridoma i (ii) procenat preostalog IGF-1R na površini ćelija.

[0241] Procenat preostalog hIGF- 1R je izračunat na sledeći način:

% preostalog IGF-1R = (MFIAb 37 C/MFIAb 4 C) x 100.

[0242] Dodatno su urađene tri ELISA-e (ili pre ili posle kloniranja) da bi se ispitalo vezivanje antitela za rekombinantni humani (hIGF-1R) i mišji (mIGF-1R) protein i za rekombinantni humani insulinski receptorski (hIR) protein. Hibridomi koji sekretuju antitelo koje pokazuje vezivanje za rh- i/ili rm-IGF-1R, a ne pokazuje vezivanje za rhIR, su zadržani. Ukratko, ELISA ploče sa 96 udubljenja (Costar 3690, Corning, NY, USA) su obložene sa po 100 µl/udubljenje ili rhIGF-1R proteina (R&D Systems, kat. br.391-GR) pri 0,6 µg/ml ili rmIGF-1R proteina (R&D Systems, cat N°6630-GR/Fc) pri 1 µg/ml ili rhIR proteina (R&D Systems, kat. br. 1544-IR/CF) pri 1 µg/ml u PBS preko noći na 4°C. Ploče su blokirane PBS-om koji sadrži 0,5% želatin (#22151, Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany) 2 h na 37°C. Kad je saturacioni pufer odbačen pomoću uređaja na ploči, po 100 µl svakog razblaženja supernatanta je dodato u udubljenja (ili nerazblažen supernatant hibridoma ili serijska razblaženja supernatanta) i inkubirana su 1 h na 37°C. Posle tri pranja, 100 µl poliklonskog kozjeg anti-mišjeg IgG (#115-035-164, Jackson Immuno-Research Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA) konjugovanog sa peroksidazom rena je dodato u 1/5000 razblaženju u PBS koji sadrži 0,1% želatin i 0,05 tež.% Tween 20 na 1 h na 37°C. Zatim su ELISA ploče oprane 3 puta i dodat je TMB (#UP664782, Uptima, Interchim, France) supstrat. Posle 10 min inkubacije na sobnoj temperaturi, reakcija je zaustavljena 1 M sumpornom kiselinom i merena je optička gustina na 450 nm.

[0243] Hibridomi koji sekretuju antitelo od interesa su umnoženi i klonirani graničnim razblaživanjem. Kad su izotipirani, jedan klon od svakog koda je umnožen i zamrznut. Svako antitelo od interesa je napravljeno u sistemima za in vitro proizvodnju pod nazivom CellLine (Integra Biosciences) za dalju karakterizaciju.

[0244] Dodatni testovi za ispitivanje specifičnosti vezivanja FACS analizama su urađeni na IM9 ćelijama (humani B limfoblasti koji eksprimiraju IR), kao i na ćelijama transfektovanim pomoću hIGF-1R, u odnosu na netransfektovane ćelije.

[0245] Svi podaci koji odgovaraju izabranim antitelima su sumirani u Tabeli 8. Interesantno je primetiti da među antitelima odabranim i) na osnovu njihove selektivnosti za hIGF-1R prema hIR i ii) na osnovu njihovog kapaciteta da indukuju internalizaciju IGF-1R, neka su u stanju da prepoznaju svoju metu i u ELISA i u FACS postavci, dok su druga vrlo dobro vezivala kad su ispitivana citometrijom, a vrlo loše vezivala kad su procenjivana ELISA-om. m280F2, m212A11, m213B10, m214F8 i m219D6 pripadaju ovoj drugoj grupi koja nije dobro prepoznavala obložen protein.

Primer 2: Karakterisanje klasterizacije epitopa anti-IGF-1R antitela eksperimentima mapiranja primenom Biacore tehnologije na osnovu SPR

[0246] Da bi se ispitao diverzitet odgovora na IGF-1R, izabrana antitela su mapirana pomoću Biacore i izvršeno je grupisanje ovih antitela prema osobinama kompetitcije.

[0247] Ukratko, eksperimenti sa mapiranjem epitopa su rađeni nauređaju Biacore X uz upotrebu senzorskog čipa CM5 aktiviranog pomoću antitela na His marker (komplet za hvatanje His GE Healthcare kataloški broj 28-9950-56). Više od 11000 RU antitela je hemijski nakalemljeno na karboksimetildekstransku matricu primenom kompleta za hemiju amina. Eksperimenti su vršeni na 25°C sa brzinom protoka od 1 µl/min korišćenjem HBS-EP pufera (GE Healthcare) kao elucionog i kao pufera za razblaživanje uzoraka.

[0248] Eksperimenti sa mapiranjem epitopa su sledili istu šemu:

1- Rastvor rastvorljive rekombinantne verzije hetero-tetramera IGF-1R (2α lanca i vanćelijski domeni 2β lanaca eksprimirani sa dodatnim C-terminalnim 10-His markerom (R&D Systems, kataloški broj 305-GR)) je ubrizgavan 1 minut u obe protočne ćelije, u koncentraciji od 5 µg/ml.

2- Rastvor anti-hlGF-1R antitela (klasično, 50 µg/ml) koje treba testirati se zatim ubrizgava samo u protočnu ćeliju 1 tokom 60 do 90 s, da bi se dostigla (ili se bar približila) saturacija mesta za vezivanje hIGF-1R.

3- Rastvor drugog antitela, korišćenog kao potencijalnog kompetitora, se ili ubrizgava pod istim uslovima u obe protočne ćelije ili samo u drugu protočnu ćeliju.

4- Konačno, rastvor trećeg antitela može da se ubrizga pod istim uslovima u obe protočne ćelije.

5- Površina se zatim regeneriše ubrizgavanjem 10 mM glicina, HCl pH 1,5 pufera tokom 30 s.

[0249] Ova vrsta eksperimenta jasno pokazuje da dva antitela mogu simultano da se vežu za isti molekul hIGF-1R, demonstrirajući da su regioni za vezivanje (epitopi) svakog antitela dovoljno daleko da to dozvole. Nasuprot tome, ako vezivanje antitela za hIGF-1R sprečava vezivanje drugog antitela, to sugeriše da isti epitop prepoznaju oba antitela. Konačno, u slučaju delimične kompeticije, može se pretpostaviti preklapanje epitopa koje prepoznaju dva testirana antitela. Tako se definišu grupe epitopskog regiona. Složenost rezultata uopšteno raste sa veličinom panela antitela korišćenog u eksperimentu.

[0250] Slika 1 opisuje primer tipičnog ciklusa eksperimenta sa mapiranjem epitopa primenom uređaja Biacore X na bazi SPR. Senzorgrami pokazuju odgovor (RU) kao funkciju vremena (sekonde) protočne ćelije 1 (crni romboidi) i 2 (beli romboidi). U fazi 1, rastvor antigena: rastvorljiv rekombinantni hIGF-1R sa dva 10-His markera na C-kraju je injektiran u obe protočne ćelije senzorskog čipa CM5 sa anti-His Tag mišjim antitelom hemijski spojenim sa karboksimetildekstranskom matricom u koncentraciji od 5µg/ml pri brzini protoka od 10 µl/min.

[0251] U fazi 2, rastvor prvog antitela za testiranje (219D6), koncentracije od 50 µg/ml, je ubrizgan u protočnu ćeliju 1. Zatim, u fazi 3, rastvor drugog antitela (101H8) koncentracije od 50 µg/ml, je ubrizgan u protočnu ćeliju 2, iza čega je, u fazi 4, sledila injekcija rastvora trećeg antitela (201F1) koncentracije od 50 µg/ml, u obe protočne ćelije. Odgovor na ovu injekciju jasno pokazuje da je vezivanje 201F1 za IGF-1R sprečeno pomoću 101H8, ali ne pomoću 219D6. Antitela 201F1 i 219D6 jasno pripadaju različitim grupama epitopa. Klasterizacija koja je rezultat cele analize 15 izabranih kandidata je opisana na Slici 2 i demonstrira da imunizacija miševa pomoću hIGF-1R podiže seriju antitela koja ispoljavaju dobru raznolikost. Zaista, generisano je 5 različitih grupa Mab koja prepoznaju različite epitope. Primer 3: FACS analiza vezivanja antitela za humani nativni IGF-1R

[0252] Osobine vezivanja seriju antitela na IGF-1R su procenjene FACS analizama na humanoj ćelijskoj liniji MCF-7 adenokarcinoma dojke (ATCC#HTB-22) korišćenjem rastućih koncentracija antitela. U tu svrhu, ćelije (1x10<6>ćelije/ml) su inkubirane sa antitelima na IGF-1R 20 min. na 4°C u FACS puferu (PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN3). Zatim su oprane 3 puta i inkubirane sa odgovarajućim sekundarnim antitelom kuplovanim sa Alexa 488 još 20 minuta na 4°C u mraku, pre nego što su oprane 3 puta u FACS puferu. Do vezivanja anti-IGF-1R antitela je došlo odmah na vijabilnim ćelijama koje su identifikovane pomoću propidijum jodida (koji boji mrtve ćelije). Maksimalan intenzitet signala dobijen sa svakim antitelom je označen sa Bmaxi izražen kao srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI). EC50vezivanja, izražen u molaritetu (M), je izračunat primenom nelinearne regresione analize (GraphPad Prims 4.0).

[0253] Titraciona kriva za svako mišje ili himerno Ab je demonstrirala da su sva generisana antitela sposobna da prepoznaju nativnu formu IGF-1R sa tipičnim saturacionim profilom (Slika 3A). Da bi se antitela rangirala i da bi se uporedile osobine vezivanja mišjih i himernim Ab, EC50vezivanja svakog jedinjenja je određeno primenom nelinearne regresione analize. Poređenje EC50svakog mišjeg Ab sa njegovom odgovarajućom himernom formom je pokazalo da 2 forme ispoljavaju iste osobine vezivanja, što demonstrira da himerizacija Ab nije uticala na prepoznavanje IGF-1R (Slika 3B). Vrednosti EC50su bile u opsegu od 1,2x10<-8>do 4,4x10<-10>. Antitela koja pripadaju grupi 2 i c102H8 koji pripadaju grupi 3a su pokazali bolji EC50. Što se toče analiza Bmax( Slika 3C), tri Ab (414E1 (G3b), 105G2 (G4) i 832E5 (G5) su imala niži Bmaxu poređenju sa drugim. Vrednosti EC50i Bmaxsu sumirane u Tabeli 9.

Tabela 9

Primer 4: Potvrđivanje specifičnosti antitela korišćenjem ili IGF-1R ili IR transfektovanih ćelija ili IM9 ćelija koje prirodno eksprimiraju značajne nivoe IR

[0254] Da bi se potvrdila specifičnost generisanih antitela na IGF-1R u odnosu na IR, stabilni transfektanti koji eksprimiraju ili hIGF-1R ili hIR su procenjeni FACS analizama. Ukratko, rastuće koncentracije himernih mAb su inkubirane sa ćelijama 20 min na 4°C u FACS puferu (PBS, 0,1%BSA, 0,01% NaN3). Ćelije su zatim oprane 3 puta i inkubirane sa odgovarajućim sekundarnim antitelom kuplovanim sa Alexa 488 pre inkubiranja još 20 minuta na 4°C u mraku, a zatim oprane 3 puta u FACS puferu. Do vezivanja anti-IGF-1R antitela došlo je odmah na vijabilnim ćelijama koje su identifikovane pomoću propidijum jodida (koji boji mrtve ćelije). EC50vezivanja, izražen u molaritetu (M), je izračunat primenom nelinearne regresione analize (GraphPad Prims 4.0).

[0255] Titracione krive dobijene na ćelijskoj liniji transfektovanoj hIGF-1R-om (Slika 4A) prema netransfektovanim ćelijama (Slika 4B) su potvrdile specifičnost vezivanja himernih Ab za humani IGF-1R. Vrednosti EC50i Bmaxsu sumirane u Tabeli 10. U ovom eseju, antitela iz grupa G2 i G3a su pokazala najbolji EC50.

Tabela 10

[0256] Da bi se proverilo odsustvo vezivanja i mišjeg i himernog antitela za hIR, korišćena je stabilna ćelijska linija koja eksprimira humani IR. Prepoznavanje hIR sa površine humanih ćelija od strane i mišjeg i himernog Ab je izvedeno FACS analizama. Rastuće koncentracije bilo mišjih bilo himernih mAb su inkubirane na ćelijskoj liniji transfektovanoj hIR<+>-om 20 minuta na 4°C u FACS puferu (PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN3). Ćelije su zatim oprane 3 puta i inkubirane sa odgovarajućim sekundarnim antitelom kuplovanim sa Alexa 488 pre inkubiranja još 20 minuta na 4°C u mraku, a zatim oprane 3 puta u FACS puferu. Do vezivanja anti-IGF-1R antitela došlo je odmah na vijabilnim ćelijama koje su identifikovane pomoću propidijum jodida (koji boji mrtve ćelije). EC50vezivanja, izražen u molaritetu (M), je izračunat primenom nelinearne regresione analize (GraphPad Prims 4.0). Komercijalno specifično antitelo na IGF-1R, klon GR11L i klon GRO5 anti-hIR antitela su korišćeni kao pozitivne kontrole. c9G4 je uvedeno kao irelevantno antitelo (izotipska kontrola).

[0257] Visok nivo ekspresije hIR na ćelijskoj površini transfektovanih ćelija je potvrđen korišćenjem komercijalnog anti-hIR antitela GRO5. Čak i kad se koriste visoke koncentracije bilo mišjih (Slika 5A) bilo himernih (Slika 5B) hIGF-1R Ab, ne vidi se vezivanje na ćelijskoj površini hIR<+>transfektovanih ćelija. Ovi rezultati su demonstrirali da ni mišja ni himerna anti-hIGF-1R Ab ne prepoznaju hIR.

[0258] Ova specifičnost prepoznavanja hIGF-1R u odnosu na IR je takođe demonstrirana upotrebom IM9 ćelija, B-limfomske ćelijske linije koja eksprimira hIR (Slika 6). Za ovu FACS analizu, protokol je bio isti kao onaj prethodno opisan i mišja antitela na IGF-1R su korišćena da bi se sprečila unakrsna reaktivnost sekundarnog anti-humanog Ab (IM9 ćelije eksprimiraju humani Ig na svojoj površini). Rezultati koji su predstavljeni na Slici 6 demonstrirali su još jednom da je očekivani signal viđen uz korišćenje GRO5 anti-hIR antitela, dok nijedno od procenjenih mišjih antitela nije ispoljilo nikakav značajan signal vezivanja na ovoj ćelijskoj liniji.

Primer 5: FACS i Biacore analize vezivanja antitela za majmunski nativan IGF-1R [0259] Jedan od prvih preduslova za ispitivanja u regulatornoj toksikologiji je da se identifikuje relevantna životinjska vrsta da bi se procenilo izabrano jedinjenje. Pošto niz antitela opisanih ovde nije u stanju da prepozna mišji IGF-1R, najpogodnija vrsta za toksikološku procenu je ne-humani primat (NHP).

[0260] Da bi se procenilo vezivanje anti-IGF-1R antitela za majmunski IGF-1R, vezivanje i mišjih i himernih anti-hIGF-1R antitela je procenjeno FACS analizama na COS-7 ćelijskoj liniji primenom rastućih koncentracija antitela. Ćelije (1x10<6>ćelije/ml) su inkubirane sa anti-IGF-1R antitelima 20 minuta na 4°C u FACS puferu (PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN3). Zatim su ćelije oprane 3 puta i inkubirane sa odgovarajućim sekundarnim antitelom kuplovanim sa Alexa 488 pre inkubacije još 20 minuta na 4°C u mraku i konačno oprane 3 puta u FACS puferu. Vezivanje anti-IGF-1R antitela je odmah procenjeno na vijabilnim ćelijama koje su identifikovane pomoću propidijum jodida (koji boji mrtve ćelije). EC50vezivanja, izražen u molaritetu (M), je izračunat primenom nelinearne regresione analize (GraphPad Prims 4.0).

[0261] Titracione krive dobijene na COS-7 majmunskoj ćelijskoj liniji su pokazale da su svi anti-hIGF-1R Ab, osim 832E5 mAb, specifično prepoznali IGF-1R eksprimiran na površini majmunske ćelijske linije (Slika 7A). Određivanje EC50za svaki mišji i himerni Ab je pokazalo da su 2 oblika vrlo uporediva po svojim osobinama vezivanja za majmunski IGF-1R (Slika 7B). Ti rezultati su pokazali da su sva generisana anti-hIGF-1R Ab, osim 832E5 mAb, prepoznala majmunski IGF-1R.

[0262] Napravljeno je poređenje EC50vezivanja na COS-7 ćelijama u odnosu na ćelije transfektovane IGF-1R-om da bi se potvrdila veličina prepoznavanja humanog u odnosu na majmunski IGF-1R od strane himernog antitela. Rezultati prikazani na Slici 7B su demonstrirali slično prepoznavanje humanog i majmunskog IGF-IR od strane svih antitela osim 832E5 mAb.

[0263] Da bi se potvrdilo prepoznavanje na drugom tipu majmuna, ćelije su transfektovane pomoću IGF-1R iz majmuna cinomolgusa da bi se proizveo rastvorljiv majmunski ECD IGF-1R i eksperimenti na Biacore-u su izvedeni sa jednim od himernih antitela (c208F2) da bi se uporedile njegove osobine vezivanja bilo sa hIGF-1R bilo sa cinomolgusovim IGF-1R.

[0264] Eksperimenti sa prepoznavanjem su vođeni na uređaju Biacore X100 uz upotrebu senzorskog čipa CM5 aktiviranog antitelom na His marker (komplet za hvatanje His GE Healthcare, kataloški broj 28-9950-56). Više od 11000 RU antitela je hemijski nakalemljeno na karboksimetildekstransku matricu primenom kompleta za hemiju amina. Eksperimenti su vršeni na 25°C sa brzinom protoka od 30 µl/min korišćenjem HBS-EP pufera (GE Healthcare) kao elucionog i kao pufera za razblaživanje uzoraka. Kinetička šema jednog ciklusa je primenjena za definisanje kinetičkih parametara vezivanja himerne forme 208F2 antitela za hIGF-1R u poređenju sa IGF-1R makakija.

[0265] Rastvor rastvorljive rekombinantne verzije heterotetramera IGF-1R, sastavljenih od 2β lanca i vanćelijskih domena 2α lanaca, eksprimirane sa dodatnim C-terminalnim 10-His markerom, na osnovu ili sekvence humanog (R&D Systems, kataloški broj 305-GR-50) ili onog cinomolgusa (u domaćoj proizvodnji) je ubrizgavan 1 minut u drugu protočnu ćeliju u razblaženju definisanom da uhvati oko 160 RU antigena. Rastvor drugog antitela je ili ubrizgavan u istim uslovima u obe protočne ćelije ili samo u drugu protočnu ćeliju. Posle faze hvatanja, ubrizgavan je ili elucioni pufer 5 puta (90 s svaka injekcija) ili 5 rastućih koncentracija c208F2 (90 s svaka injekcija) u obe protočne ćelije. Na kraju pete injekcije, elucioni pufer je propušten da bi se definisala brzina disocijacije. Površina je zatim regenerisana ubrizgavanjem pufera 10mM glicina, HCl pH 1,5 tokom 30s.

[0266] Izračunati signal odgovara razlici između odgovora protočne ćelije 2 (sa uhvaćenim IGF-1R) i odgovora protočne ćelije 1 (bez ikakvih IGF-1R molekula) (Slika 8).

i

[0267] Za svaki molekul IGF-1R (human iili cinomolgusa), zbog injekcija rastućih koncentracija c208F2, signal je korigovan oduzimanjem signala dobijenog sa 5 injekcija pufera (dupla referenca). Dobijeni senzogrami su analizirani pomoću softvera Biaevaluation sa modelom 1:1. Kinetičke brzine su određene ili nezavisno (2 kinetičke brzine vezivanja c208F2 za svaki IGF-1R) ili zajedno (iste kinetičke brzine vezivanja c208F2 za humani i cinomolgusov IGF-1R). Kvalitet fitovanja je procenjen odnosom Chi2/Rmax nižim od 0,05 RU.

[0268] Kinetičke brzine vezivanja (videti Tabelu 11) definisane odvojeno za svaki IGF-1R su blizu jedna drugoj i fitovanje oba senzograma sa istim kinetičkim brzinama je dobrog kvaliteta. Antitelo c208F2 prepoznaje isto tako dobro rekombinantni humani kao i cinomolgusov IGF-1R sa konstantom disocijacije (KD) od oko 0,2 nM. Afiniteti definisani u ovoj studiji odgovaraju funkcionalnim afinitetima (aviditetima) antitela za nivo uhvaćenog humanog i cinomolgusovog IGF-1R od oko 160 RU.

Tabela 11

Primer 6: Intrinsični efekat generisanig antitela na fosforilaciju IGF-1R

[0269] Dobro je poznato da antitela mogu da indukuju agonistički efekat kad se vežu za receptore tirozin kinaze. Pošto ne bismo želeli da izaberemo takva agonistička antitela, određivanje fosforilacije hIGF-1R je ispitano uz korišćenje himernih antitela.

[0270] U tu svrhu, MCF-7 ćelije su inkubirane u medijumu bez seruma preko noći. Zatim je dodavan ili IGF-1 (100 nM) ili antitela koja se testiraju (10 µg/ml) 10 minuta na 37°C. Medijum je odbačen i ćelije su sastrugane u puferu za liziranje (pH 7,5) koji sadrži 10 mM Tris HCl pufer (pH 7,5), 15% NaCl (1 M), 10% mešavinu deterdženta (10 mM Tris-HCl, 10% Igepal pufer za liziranje) (Sigma Chemical Co.), 5% natrijum dezoksiholat (Sigma Chemical Co.), 1 TM tabletu (Roche) kompletnog koktela inhibitora proteaze, koktel 1% inhibitora fosfataze Set II (Calbiochem), 90 min na 4°C. Lizati su izbistreni centrifugiranjem na 4°C, zagrevani 5 min na 100°C i čuvani na -20°C ili direktno stavljani na 4-12% SDS-PAGE gelove. Inkubacija primarnog antitela je vršena 2 hr na sobnoj temperaturi, a zatim inkubacija sa sekundarnim antitelom sa vezanim HRP je rađena 1 sat na sobnoj temperaturi. Membrane su oprane u TBST pre vizuelizacije proteina pomoću ECL. Blotovi su kvantifikovani pomoću softvera J software. Fosfo-proteinske vrednosti su normalizovane pomoću GAPDH. Fosforilacija hIGF-1R kao odgovor na IGF-1 je smatrana 100 %-nom stimulacijom. Efekat anti-hIGF-1R Ab na fosforilaciju hIGF-1R je određen kao % fosforilacije indukovane pomoću IGF-1.

[0271] Rezultati opisani na Slici 9 predstavljaju srednju vrednost % pIGF-1R kao odgovor na himerna anti-IGF-1R Ab iz 3 nezavisna eksperimenta /- S.D. u poređenju sa IGF-1. Kao što je ilustrovano, nije detektovana značajna ni manja (<20%) fosforilacija hIGF-1R kad su MCF-7 ćelije inkubirane sa 10 µg anti-IGF-1R Ab.

Primer 7: Inhibicija fosforilacije IGF-1R kao odgovor mišjeg anti-hIGF-1R antitela na IGF-1 [0272] Da bi se okarakterisala izabrana antitela, proučavana je njihova sposobnost da inhibiraju fosforilaciju indukovanu IGF1-om. U tu svrhu, MCF-7 ćelije su inkubirane u medijumu bez seruma preko noći. Zatim su ćelije inkubirane 5 minuta sa mišjim anti-hIGF-1R Ab pre dodavanja IGF-12 minuta na 37°C. Medijum je odbačen i ćelije su sastrugane u puferu za liziranje (pH 7,5), koji sadrži 10 mM Tris HCl pufer (pH 7,5), 15% NaCl (1 M), 10% mešavinu deterdženta (10 mM Tris-HCl, 10% Igepal pufer za liziranje) (Sigma Chemical Co.), 5% natrijum dezoksiholat (Sigma Chemical Co.), 1 TM tabletu (Roche) kompletnog koktela inhibitora proteaze, koktel 1% inhibitora fosfataze Set II (Calbiochem), 90 min na 4°C. Lizati su izbistreni centrifugiranjem na 4°C, zagrevani 5 min na 100°C i čuvani na -20°C ili direktno stavljani na 4-12% SDS-PAGE gelove. Inkubacija primarnog antitela je vršena 2 hr na sobnoj temperaturi, a zatim inkubacija sa sekundarnim antitelom sa vezanim HRP je rađena 1 sat na sobnoj temperaturi. Membrane su oprane u TBST pre vizuelizacije proteina pomoću ECL. Blotovi su kvantifikovani pomoću softvera J software. Fosfo-proteinske vrednosti su normalizovane pomoću GAPDH. Fosforilacija hIGF-1R kao odgovor na IGF-1 je smatrana 100 %-nom stimulacijom. Efekat anti-hIGF-1R Ab na fosforilaciju hIGF-1R je određen kao % fosforilacije indukovane pomoću IGF-1.

[0273] Dodavanje bilo m105G2, m101H8 ili m9G4, irelevantnog mišjeg antitela, nije inhibiralo fosforilaciju hIGF-1R kao odgovor na IGF-1 (Slika 10). Dodavanje m201F1 je umereno smanjilo fosforilaciju hIGF-1R kao odgovor na IGF-1 (∼40% smanjenje). Sva druga anti-IGF-1R Ab su jako inhibirala fosforilaciju hIGF-1R kao odgovor na IGF-1 (smanjenje > 80%). Najbolji inhibitori fosforilacije hIGF-1R indukovane IGF1-om su m208F2, m212A11 i m214F8 Mab.

Primer 8: Studija internalizacije IGF-1R posle vezivanja generisanih antitela na IGF-1R FACS analizama

[0274] MCF-7 ćelije su inkubirane sa himernim antitelom od 10µg/ml na 4°C 20 min. Zatim su ćelije oprane i inkubirane na 4°C ili 37°C 4 h. Količina antitela vezanih za površinu ćelija je određena pomoću sekundarnog antitela na protočnom citometru FacsCalibur (Becton Dickinson). ΔMFI, definisan kao razlika između MFI merenog na 4°C i MFI merenog na 37°C posle 4 sata inkubacije, odgovara količini internalizovanih Ab. ΔMFI je predstavljen na Slikama 11A i 11B i u Tabeli 12. Procenat internalizacije pri 10 µg/ml Ab je izračunat na sledeći način: 100*(MFI na 4°C - MFI na 37°C)/MFI na 4°C i predstavljen u Tabeli 12. Maksimalan ΔMFI, izračunat za svako himerno antitelo (Slike 11A i 11B), nije pokazao nikakvu korelaciju između grupe i maksimuma internalizacije.

Tabela 12

[0275] Da bi se odredilo da li su antitela koja prepoznaju i majmunski IGF-1R sposbna da internalizuju ovaj receptor, izveden je isti eksperiment sa internalizacijom. Rezultati sumirani u Tabeli 13 su demonstrirali da su sva testirana antitela bila u stanju da posreduju u internalizaciji majmunskog IGF-1R.

Tabela 13

[0276] Smanjenje kinetike antitela vezanog za površinu ćelije je dalje procenjivano. U tu svrhu, MCF-7 ćelije su zasejane na ploče sa 96 ležišta i inkubirane sa 10 µg/ml mišjeg 20 min na 4°C. Ćelije su zatim oprane da bi se uklonilo nevezano antitelo i u medijumu na 37°C 10, 20, 30, 60 ili 120 min. U svakoj vremenskoj tački, ćelije su centrifugirane, a zatim im je na ledu površina obeležena sekundarnim anti-mišjim IgG-Alexa 488 da bi se odredila količina antitela koja je ostala na ćelijskoj površini. Intenzitet fluorescencije za svaki mišji Ab i za svaku vremensku tačku je normalizovan signalom na 4°C (% preostalog IGF-1R) i fitovan na eksponencijalni raspad da bi se odredio poluživot (t1/2). t1/2je uzet kao vreme potrebno da se dobije smanjenje signala od 50% mereno na 4°C. Kao što je ilustrovano na Slikama 12A i 12B, nivo na površini svih mišjih Ab je naglo padao tokom prvih 30 min i smanjenje je bilo skoro maksimalno posle 60 min inkubacije (Slika 12A). Izračunati poluživot se nalazio između 10 i 18 min u odnosu na mišje Ab (Sl. 12B). Nije bilo korelacije između raspada antitela na površini i grupe Ab.

[0277] Da bi se validiralo da je smanjenje signala sa ćelijske površine usled internalizacije Ab, a ne usled rasipanja receptora, ćelije su inkubirane sa mišjim Ab 0, 30 i 60 min na 37°C (Slika 13). Ćelije su zatim pričvršćene i permeabilizovane ili ne da bi se odredilo antitelo vezano za površinu ćelija (bez permeabilizacije) i ukupan signal antitela koji odgovara Ab vezanom za površinu ćelija internalizovano Ab (sa permeabilizacijom). Količina internalizovanog Ab (citoplazmatskog) je određena na sledeći način: MFI posle permeabilizacije - MFI bez permeabilizacije. Ovaj eksperiment je pokazao da je smanjenje Ab vezanog za površinu ćelija zbog povećanja citoplazmatskih Ab, što demonstrira da su Ab internalizovani (Slika 13). Pored toga, degradacija Ab je počela posle 1 sata inkubacije, kao što je indikovano smanjenjem signala posle permeabilizacije (ukupno).

Primer 9: Studija internalizacije IGF-1R posle vezivanja generisanih anti-IGF-1R antitela primenom konfokalnih analiza

[0278] Da bi se dalje potvrdila internalizacija antitela, urađena je konfokalna mikroskopija da bi se procenila unutarćelijska distribucija antitela posle kretanja u ćeliji. Ćelije su inkubirane sa anti-hIGF-1R Ab na 37°C, fiksirane i permeabilizovane. Prema tome, ćelije su bojene korišćenjem sekundarnog antitela Alexa-488 i zečjim anti-lamp-1 antitelom, što je otkriveno korišćenjem sekundarnog anti-zečjeg IgG Alexa 555. Pre inkubacije na 37°C, mišji 208F2 Ab je lokalizovan na membrani MCF-7 ćelija (Slika 14A) i nije primećena nikakva kolokalizacija sa lizozomskim markerom lamp 1, korišćenjem aplikacije za obeležavanje kolokalizacije softvera Image J. Antitelo vezano za površinu ćelije se dramatično smanjilo posle 15 min inkubacije. Istovremeno sa smanjenjem antitela vezanih za površinu ćelije, unutarćelijska antitela su detektovana u vezikulama. Retko se mogla videti kolokalizacija sa lamp 1. Posle 30 min inkubacije, antitelo vezano za površinu ćelije je jedva detektovano. Međutim, kolokalizacija Ab u lizozomu je porasla. Posle 1 h inkubacije, bojenje unutarćelijskog Ab se smanjilo, kao i broj kolokalizacija sa lamp 1. Ova kinetika antitela vezanog za površinu ćelije i njegova unutarćelijska akumulacija su korelisale sa kinetikom raspada antitela na površini, merenom pomoću FACS. Pored toga, kao što je već opisano u studijama FACS-om, degradacija mišjih Ab je počela posle 1 sata inkubacije, što je određeno pomoću konfokalne mikroskopije.

[0279] Internalizacija svih drugih anti-hIGF-1R mišjih antitela i njihova kolokalizacija sa Lamp 1 je takođe procenjena (Slika 14B).

Primer 10: Inhibicija degradacije Ab korišćenjem inhibitora lizozoma, bafilomicina A1

[0280] Da bi se potvrdilo da su antitela stigla do lizozoma gde bivaju razgrađena, ćelije su tretirane ili ne bafilomicinom A1, potentnim inhibitorom lizozomskih funkcija. Ćelije su zatim inkubirane na 4°C sa 10 µg/ml Ab koji se testiraju, oprane i inkubirane još 2 h na 37°C. Internalizovan Ab je detektovan posle permeabilizacije ćelija upotrebom sekundarnog antimišjeg IgG-Alexa 488 Ab. Dodatak bafilomicina A1 je sprečio degradaciju unutarćelijskog Ab (Slika 15) ukazujući na to da su Ab efektivno internalizovani i razgrađeni u lizozomima. Primer 11: Efekat pH na vezivanje anti-IGF-1R antitela i korelacija sa potentnošću citotoksičnosti

[0281] Dok su antitela birana na osnovu njihovog potencijala internalizacije i pokazano je gore da kolokalizuju sa ranim endozomima pre ulaska u lizozomski odeljak, interesantan pristup je bio biranje antitela za koja je stabilnost vezivanja Ab/hIGF-1R modulsana s obzirom na pH okoline i poželjna su antitela koja poželjno disosuju od IGF-1R kad pH okoline postane kiseo. Zaista, primarna razlika između ranih endozoma i lizozoma je njihov luminalni pH: u endozomskom odeljku, pH je približno 6, dok je u lizozomskom odeljku pH oko 4,5.

[0282] Dobro je poznato da jednom kad se internalizuje posle vezivanja liganda (IGF1), hIGF-1R se vraća na površinu ćelije putem recikliranja.

[0283] Bez vezivanja za teoriju, hipoteza opisana ovde je da će antitela sklonija da budu oslobođena od svoje mete rano, pri kiselom pH, verovatno favorizovati recikliranje mete do membrane i sledstveno tome, mogla bi se smatrati boljim kandidatima za pristupe preko imunokonjugata. Da bi se ispitalo da li neka od naših antitela ispoljavaju takvu osobinu i da bi se ta osobina korelisala sa citotoksičnom aktivnošću, vezivanje mišjih anti-hIGF-1R Mab na MCF-7 ćelijskoj liniji je rađeno sa puferima pri različitim pH. Rastuće koncentracije mišjih mAb su inkubirane na MCF-7 ćelijskoj liniji 20 min na 4°C na različitim pH u opsegu od 5 do 8. Ćelije su zatim oprane 3 puta i inkubirane sa odgovarajućim sekundarnim antitelom kuplovanim sa Alexa 488 u FACS puferu. Ćelije su inkubirane još 20 minuta na 4°C u mraku, a zatim oprane 3 puta u FACS puferu. Do vezivanja anti-hIGF-1R antitela je došlo odmah na vijabilnim ćelijama koje su identifikovane pomoću propidijum jodida koji boji mrtve ćelije. EC50vezivanja, izražen u molaritetu (M), je izračunat primenom nelinearne regresione analize (GraphPad Prims 4.0).

[0284] EC50anti-hIGF-1R koji pripada grupi klastera epitopa 3B nije značajno pogođeno pomoću pH (Slika 16). Kapacitet vezivanja anti-hIGF-1R Ab koji pripadaju grupi klastera epitopa 3A je često povećan na kiselim pH. Nasuprot tome, kapacitet vezivanja anti-hIGF-1R Ab koji pripadaju grupama klastera epitopa 1, 2 i 4 je smanjen na kiselim pH.

[0285] Sa ciljem da se odredi da li kiseli pH ima pozitivan uticaj na citotoksičnost indukovanu imunokonjugatom, korišćen je komercijalno dostupan humani test Fab-ZAP (ATS BIO). Ukratko, MCF7 ćelije su zasejane pri 2000 ćelija/ležište na ploče sa 96 ležišta i ostavljene preko noći da adheruju. Sledećeg dana, ćelije su tretirane pomoću 0,45 µg/mL Fab-ZAP i rastućih koncentracija himernih anti-IGF-1R Ab. c9G4 monoklonsko antitelo koje se ne vezuje na površini ćelije je korišćeno kao negativna kontrola. Šestog dana, vijabilnost ćelija je merena primenom testa vijabilnosti CellTiter Glo Luminesence od Promega (Madison, Wi). Kao što je ilustrovano na Slici 17A, anti-IGF-1R Ab iz grupa 4 i 5 nisu indukovali nikakvu citotoksičnost na MCF-7, dok je u ostalim grupama izmerena umerena (grupe 1, 3a i 3b) do visoke citotoksičnosti (grupa 2). Na Slici 17B, određivanje IC50je potvrdilo da grupa 2 ima najveću citotoksičnu potentnost, sugerišući da će ova antitela biti najpogodnija za pristup preko ADC (konjugat antitelo-lek) ili ATC.

[0286] Rezultati sumirani na Slici 17 pokazuju da je među 15 procenjenih himernih mab, najbolji citotoksični efekat postignut sa c208F2, c219D5, c212A11, c213B10 i c214F8, koji svi pripadaju grupi 2. Međutim, ostala antitela iz grupa 1 i 4, koja takođe ispoljavaju osetljivost na kiseli pH za vezivanje IGF-1R, nisu klasterizov kao najbolji kandidati za citotoksičnost, sugerišući da bi ova osobina mogla biti potrebna, ali ne i dovoljna da objasni određene osobine antitela iz grupe 2. Da bi se bolje razumele konkretne karakteristike ovog skupa antitela, urađene su studije korelacija na podacima dostupnim za sva generisana antitela. Rezultati ove analize sugerišu da su i inhibicija fosforilacije i smanjenje kapaciteta vezivanja za hIGF-1R na kiselom pH sredine potrebni da bi se dobila najbolja citotoksična aktivnost (Slika 18). Zaista, 101H8 (G1), 201F1 (G1) i 105G2 (G4), čije vezivanje se smanjilo na kiselom pH sredine, ali koji su bili slabi inhibitori fosforilacije, su pokazali niske citotoksične aktivnosti. S druge strane, 102H8 (G3a), 110G9 (G3a), 415A8 (G3a), 410G4 (G3b), 414E1 (G3b) i 433H9 (G3b) su bili potentni inhibitori fosforilacije indukovane pomoću IGF1, ali nisu bili osetljivi na variranje pH ili čije vezivanje je pojačano na kiselim pH, su demonstrirali samo umerene citotoksične aktivnosti u humanom testu Fab-ZAP.

[0287] Vezivanje humanizovanih anti-IGF-1R Mab na MCF-7 ćelijskoj liniji je rađeno u puferima na različitim pH. Rastuće koncentracije humanizovanih mAb su inkubirane na MCF-7 ćelijskoj liniji 20 min na 4°C na različitim pH u opsegu od 5 do 8. Ćelije su zatim oprane 3 puta i inkubirane sa odgovarajućim sekundarnim antitelom kuplovanim sa Alexa 488 u FACS puferu. Ćelije su inkubirane još 20 minuta na 4°C u mraku, a zatim oprane 3 puta u FACS puferu. Do vezivanja anti-IGF-1R antitela je došlo odmah na vijabilnim ćelijama koje su identifikovane pomoću propidijum jodida koji boji mrtve ćelije. EC50vezivanja, izražen u molaritetu (M), je izračunat primenom nelinearne regresione analize (GraphPad Prims 4.0). Humanizovana anti-IGFR-antitela su pokazala niži kapacitet vezivanja pri kiselim pH, kao što je ilustrovano na Slikama 32A i 32B.

Primer 12: Procena humanizovanih formi 208F2 Mab

12.1 Procena vezivanja i internalizacije prve humanizovane forme hz208F2 VH3/VL3 (zvane i hz208F2 H026/L024)

[0288] Vezivanje prve humanizovane forme c208F2 mAb je procenjeno na MCF-7, COS-7 i NIH 3T3 IR<+>ćelijskim linijama. Rastuće koncentracije m208F2, c208F2 ili hz208F2 VH3VL3 su dodavane svakoj ćelijskoj liniji po 20 min. na 4°C. Ćelije su zatim oprane i vezivanje testiranih mAb je otkriveno korišćenjem odgovarajućeg sekundarnog antitela. Da bi se validirala ekspresija humanog IR na transfektovanoj ćelijskoj liniji, korišćen je komercijalni klon GRO5 anti-hIR antitela i njegov profil prepoznavanja je dat kao primer (Slika 19D).

[0289] Pređenje humanizovane forme bilo sa mišjom, bilo sa himernom, na MCF-7 (Slika 19A) ili majmunskim COS-7 (Slika 19B) ćelijama, je pokazalo bliske profile za ove 3 testirane forme. Postupak humanizacije nije modifikovao specifičnost prepoznavanja antitela koji je savršeno uporediv sa mišjom i himernom formom u vezi sa odsustvom unakrsne reaktivnosti na humanom insulinskom receptoru (Slika 19C).

[0290] Izračunati EC50prve humanizovane forme 208F2 na humanoj ćelijskoj liniji MCF-7 i majmunskoj ćelijskoj liniji COS-7 su slični sa onim određenim bilo na mišjoj, bilo na himernoj formi mAb 208F2.

[0291] Kapacitet mAb hz208F2 VH3/VL3 da bude internalizovan je procenjen protočnom citometrijom. MCF-7 ćelije su inkubirane 20 min sa 10 µg/ml antitela na 4°C. Zatim su ćelije oprane i inkubirane 4 h na 4°C ili 37°C. Količina antitela vezanih za površinu ćelije je određena uz upotrebu sekundarnog antitela. ΔMFI, definisan kao razlika između MFI merenog na 4°C i MFI merenog na 37°C posle 4 sata inkubacije, odgovara količini internalizovanih Ab. ΔMFI je predstavljen u Tabeli 14a. Procenat internalizacije pri 10 µg/ml Ab je izračunat na sledeći način: 100*(MFI na 4°C - MFI na 37°C)/MFI na 4°C i predstavljen u Tabeli 14a. Prema tome, humanizovani hz208F2 VH3/VL3 ima slične osobine vezivanja i internalizacije kao one merene u odgovarajućem mišjem i himernom 208F2 antitelu.

Tabela 14a

12.2 Procena vezivanja sledećih humanizovanih formi hz208F2

[0292] mAb 208F2 je humanizovan i određene su osobine vezivanja šesnaest humanizovanih varijanti (uključujući prvu formu opisanu u 12.1). Osobine vezivanja humanizovanih varijanti su procenjene FACS analizama na humanoj ćelijskoj liniji MCF-7 adenokarcinoma dojke i majmunskoj ćelijskoj liniji Cos-7 uz korišćenje rastućih koncentracija antitela. U tu svrhu, ćelije (1x10<6>ćelija/ml) su inkubirane sa anti-IGF-1R humanizovanim antitelima 20 min. na 4°C u FACS puferu (PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN3). Zatim su oprane 3 puta i inkubirane sa odgovarajućim sekundarnim antitelom kuplovanim sa Alexa 488 još 20 minuta na 4°C u mraku pre nego što su oprane 3 puta u FACS puferu. Do vezivanja anti-IGF-1R antitela je došlo odmah na vijabilnim ćelijama koje su identifikovane pomoću propidijum jodida (koji boji mrtve ćelije). EC50vezivanja, izražen u molaritetu (M), je izračunat primenom nelinearne regresione analize (GraphPad Prims 4.0).

[0293] EC50humanizovanih varijanti je pokazao da su sve humanizovane varijante ispoljile ekvivalentne osobine vezivanja i na humanoj i na majmunskoj ćelijskoj liniji.

[0294] EC50humanizovanih antitela su sumirani u Tabeli 14b.

Tabela 14b

12.3 Procena internalizacije jedne druge humanizovane forme hz208F2

[0295] MCF-7 ćelije su inkubirane sa 10 µg/ml humanizovanog antitela na 4°C 20 min. Zatim su ćelije oprane i inkubirane na 4°C ili 37°C 4 h. Količina antitela vezanih za površinu ćelije je određena uz upotrebu sekundarnog antitela na protočnom citometru FacsCalibur (Becton Dickinson). ΔMFI, definisan kao razlika između MFI merenog na 4°C i MFI merenog na 37°C, posle 4 sata inkubacije, odgovara količini internalizovanih Ab. ΔMFI je predstavljen u Tabeli 14c. Procenat internalizacije pri 10 µg/ml Ab je izračunat na sledeći način: 100*(MFI na 4°C - MFI na 37°C)/MFI na 4°C. Humanizovano antitelo hz208F2 H077/L018 je sposobno da indukuje značajnu internalizaciju IGF-1R.

Tabela 14c

Primer 13: IGF-1R kao cilj pristupa preko imunokonjugata

[0296] IHC studije su postavljene da bi se validirao hIGF-1R kao cilj pristupa preko imunokonjugata. Zaista, korisna meta za takav pristup zahteva značajnu prekomernu ekspresiju na tumorskim ćelijama u poređenju sa normalnim ćelijama. Jedna druga osobina odgovarajuće mete za pristup preko imunokonjugata je da kod nje preovladava prekomerna ekspresija u značajnom procentu populacije pacijenata u mnogo indikacija.

[0297] Da bi se procenilo da li bi se hIGF-IR mogao razmatrati kao odgovarajuća meta za pristup preko imunokonjugata, izabrano je komercijalno dostupno poliklonsko antitelo (AF305-NA od R&D Systems) opisano kao specifično za vanćelijski domen hIGF-1R (EDC) nasuprot hIR. Prvi korak našeg postupka je bio da proverimo specifičnost AF305-NA za ECD hIGF-1R i njegovo odsustvo prepoznavanja hIR. U tu svrhu, urađen je niz testova ELISA i na humani ECD IGF-1R i na ECD hIR proteina primenom protokola koji su gore već dati detaljno.

[0298] Rezultati opisani na Slici 20A su demonstrirali da poliklonsko anti- anti-hIGF-1R antitelo efikasno prepoznaje ECD hIGF-1R. GR11L antitelo (Calbiochem), koje je korišćeno kao pozitivna kontrola, je dalo očekivan profil. Kao što je snabdevač opisao, Slika 20B pokazuje da AF305-NA ne prepoznaje hIR za razliku od anti-hIR GRO5 Mab (Calbiochem) koji je korišćen kao pozitivna kontrola u ELISA. Isto tako, procena FACS analizama vezivanja poliklonskog AF305-NA na ćelijama transfektovanim hIR<+>-om je potvrdila da ono ne prepoznaje ćelijsku formu hIR (Slika 20D), dok anti-hIR GRO5 antitelo (Slika 20C) daje očekivan profil na transfektovanim ćelijama demonstrirajući da one eksprimiraju visok nivo hIR. Kao što se očekivalo, GR11L, koji prepoznaje hIGF-1R i uveden je u eksperiment kao negativna kontrola, ne daje nikakav signal na ćelijama transfektovanim hIR<+>-om (Slika 20C) [0299] Kako je AF305-NA antitelo potpuno validirano za studiju raspodele hIGF-1R, ustanovljen je IHC protokol na Discovery Ultra autostainer Ventana. Ukratko, posle skidanja voska, povraćaj antigena je urađen pomoću CC1 koji odgovara EDTA pH8 puferu, 32 minuta na 96°C. Primarno antitelo (AF305-NA) je inkubirano 1 h na 37°C. Posle pranja, polimerni HRP-OMap anti-kozji IgG (Ventana) je inkubiran 16 minuta na 37°C, a zatim razvijen primenom DAB hromogena. Konačno, tkiva su kontraobojena hematoksilinom. Predmetna stakla sa preparatima su zatim stavljena u Eukitt medijum. Da bi se validiralo IHC bojenje, panel tumorskih tkiva iz ksenografta je odabran prema njihovoj in vitro ekspresiji hIGF-1R. Kao što je prikazano na Slici 21, vidi se jako membransko bojenje na 3 pozitivna tkiva (MCF-7, NCI-H23 i NCI-H82). Nikakvo membransko bojenje se ne vidi na Hs746t izabranom kao negativan tumor. Za analizu bojenja, preparati su skenirani pomoću HT skenera od Roche Ventana i bojenje IGF-1R je kvantifikovano pomoću softvera Virtuoso (Roche Ventana). Za analizu tkiva, ocenjena su 4 vidna polja (FOV) po tumoru, kad je moguće, sa više od 50 ćelija, da bi se povećala statistička preciznost algoritma. Tkiva su ocenjena ++ (ili 3+), + do ++ (ili 2+ do 3+ ili +/+++), + (ili 2+), (ili 1+) prema algoritmu za HER2 membranu. Ocenjivanje je definisano prema smernicama CAP/ASCO testiranja kao (+) za slabo ili nepotpuno bojenje membrane ili slabo, nepotpuno bojenje membrane u manje od 10% ćelija u uzorku. Ocena (++) opisuje potpuno bojenje membrane koje nije uniformno ili slabo, ali sa očiglednom prefernom distribucijom u bar 10% ćelija, ili intenzivno potpuno bojenje membrane u 30% tumorskih ćelija ili manje. Ocena (+++) odgovara uniformnom intenzivnom bojenju membrane više od 30% ćelija invazivnog tumora. Kad su tumori ocenjeni sa (++) do (+++), to predstavlja heterogenost u analiziranom tumorskom tkivu; (-) znači da nikakva ekspresija hIGF-1R nije detektovana i (c) znači da je bojenje isključivo citoplazmatsko. Citoplazmatsko bojenje karakteriše odsustvo membranskog bojenja koje prave izolovane ćelije.

[0300] Zatim je izvedena produžena studija na normalnim i tumorskim tkivima primenom gornjeg protokola (Slike 22 A i B).

[0301] Za ove studije, korišćeni su humani normalni i tumorski TMA od Superbiochips da bi se izvele studije distribucije i prevalencije. Dve različite kontrole su uvedene u svaki ciklus autostainera. Jedna kontrola se sastojala od preseka placente za koje se zna da su pozitivna kontrola zbog njihove ekspresije IGF-1R i obezbeđena su normalna TMA tkiva. Druga serija kontrola se sastojala od 3 preseka tumorskih tkiva iz ksenografta sa ocenom 2+ ili 3+ (MCF-7 i NCI-H23, NCI-H82 respektivno). Ova poslednja kontrola je dodata u svaki turnus bojenja da bi se kalibrisala ekspresija.

[0302] Kao što se očekivalo, placenta i tkivo iz ksenografta su bili pozitivni na hIGF-1R. Jako membransko bojenje je viđeno u ove 4 kontrole. U prvom panelu humanih normalnih tkiva (Slika 22A), malo membranskog IGF-1R, koji nikad nije prešao 1+, detektovano je u gastričnom traktu (ezofagus, tanko crevo, kolon i rektum). U svim ostalim analiziranim tkivima, nije viđena membranska ekspresija IGF-1R. U drugom panelu normalnih humanih tkiva (Slika 22B), malo membranskog IGF-1R, koji nikad nije prešao 1+, detektovano je u bubrežnim strukturama. Jako membransko bojenje (++) je viđeno na epitelijumu prostate i na urotelijumu. Očekivano za oba ova tkiva, nije viđeno jako membransko bojenje. Ovaj obrazac ekspresije je jako sugerisao da bi hIGF-1R mogao da bude dobra meta za pristupe preko ADC ili ATC.

[0303] Da bi se odredile potencijalne indikacije za ciljanje IGF-1R imunokonjugatom, uzorci tumora pluća, dojke, glave i vrata, bešike i bubrega iz pacijenata su analizirani na ekspresiju IGF-1R, primenom protokola opisanog gore.

[0304] Od 69 proučenih uzoraka pluća, 67 slučajeva je bilo interpretabilno. Ekspresija IGF-1R je kvantifikovana kao što je opisano gore. Kao što je prikazano na Slici 23, jaka membranska ekspresija je detektovana na mnogim karcinomima u poređenju sa normalnim susednim tkivima koji su negativni u skladu sa onim što smo već opisali gore na normalnim tkivima. Svi analizirani slučajevi su sumirani u Tabeli 15. U svim podtipovima kancera pluća, nađeno je 55% slučajeva bilo sa + bilo sa ++. Karcinomi pluća skvamoznih ćelija su tumori sa najizraženijom ekspresijom hIGF-1R sa 70% +, +/+++, ili ++ slučajeva i 43% tumora sa svega ++ i +/+++. Ovi rezultati su u skladu sa objavljenim podacima koji opisuju česte visoke polizomije ili amplifikacije hIGF-1R u karcinomu pluća skvamoznih ćelija pacijenata.

Tabela 15

[0305] Jedna druga studija ekspresije IGF-1R je izvedena na nizu od 10 uzoraka kancera dojke. Rezultati prikazani na Slici 24 su demonstrirali da je IGF-1R visoko eksprimiran u kancerskom tkivu u poređenju sa susednim normalnim tkivima. Podaci sa bojenjem sumirani u Tabeli 16 su demonstrirali da je 66% analiziranih slučajeva +, +/+++ ili ++ i 22% analiziranih slučajeva je ++ ili +/+++.

Tabela 16

[0306] Konačno, prekomerna ekspresija IGF-1R je prikazana u nizu tumora uključujući glave i vrata, mokraćne bešike i bubrega (Slika 25). Još jednom, jako prekomerna ekspresija IGF-1R je primećena u uzorcima tumora u odnosu na normalna susedna tkiva.

[0307] Sveukupno, ovi rezultati su uskladu sa pristupom preko imunokonjugata za lečenje mnogih IGF-1R-positivnih tumora uključujući tumore pluća, dojke, glave i vrata, mokraćne bešike i bubrega.

Primer 14: Definisanje konstanti disocijacije (KD) vezivanja pet himernih anti-IGF-1R antitela (c208F2, c213B10, c212A11, c214F8 i c219D6) i humanizovane verzije (VH3/VL3) antitela 208F2 za rastvorljiv rekombinantni humani IGF-1R

[0308] Konstante disocijacije (KD) vezivanja antitela za rekombinantni rastvorljiv humani IGF-1R su definisane odnosom između brzine disocijacije (kd) i brzine asocijacije (ka).

Kinetički eksperimenti su vođeni na uređaju Biacore X100 uz upotrebu senzorskog čipa CM5 aktiviranog mišjim monoklonskim antitelom na His marker. Oko 12000 RU antitela je hemijski nakalemljeno na karboksimetildekstransku matricu korišćenjem kompleta za hemiju amina.

[0309] Eksperimenti su vršeni na 25°C sa brzinom protoka od 30 µl/min uz upotrebu HBS-EP+ pufera (GE Healthcare) kao elucionog i pufera za razblaživanje uzoraka.

[0310] Kinetička šema jednog ciklusa je korišćena za definisanje kinetičkih parametara vezivanja anti-IGF-1R antitela za rastvorljiv rekombinantni humani IGF-1R, uhvaćen preko svoja dva C-terminalna 10-histidinska markera.

1- Rastvor rastvorljive rekombinantne verzije humanog IGF-1R hetero-tetramera - 2α lanci i vanćelijski domeni 2β lanaca eksprimirani sa dodatnim C-terminalnim 10-His markerom (R&D Systems kataloški broj 305-GR-50) - je ubrizgavan 1 minut u drugu protočnu ćeliju u koncentraciji od 10µg/ml. Srednja vrednost od 587 RU (sa standardnom devijacijom od 24 RU) rastvorljivog receptora je uhvaćena u svakom od 24 ciklusa realizovana za ovu studiju.

2- Posle faze hvatanja, ubrizgavan je ili elucioni pufer 5 puta (90 s svaka injekcija) ili 5 rastućih koncentracija jednog od šest antitela (90s svaka injekcija) u obe protočne ćelije. Na kraju pete injekcije, elucioni pufer je propuštan tokom 5 minuta da bi se definisala brzina disocijacije.

3- Zatim je regenerisana površina injekcijom 10mM glicina, HCl pufera pH 1,5 tokom 45 s.

[0311] Izračunati signal odgovara razlici odgovora protočne ćelije 2 (sa uhvaćenim IGF-1R) i odgovora protočne ćelije 1 (bez molekula IGF-1R).

[0312] Za svaki IGF-1R, signal zbog injekcija rastućeg opsega koncentracija jednog antitela je korigovan oduzimanjem signala dobijenog sa 5 injekcija pufera (dupla referenca), videti Sliku 26.

[0313] Dobijeni senzogrami su analizirani pomoću softvera Biaevaluation sa modelom 1:1.

[0314] Četiri eksperimenta je vršeno za svako antitelo primenom dva različita opsega koncentracija: 40, 20, 10, 5 i 2,5 nM za prva dva eksperimenta i: 24, 12, 6, 3 i 1,5 nM za poslednja dva eksperimenta izvedena za svako antitelo.

[0315] Za 6 antitela testiranih u ovom eksperimentu, eksperimentalni podaci su lepo fitovali u model 1:1 sa značajnim vrednostima kdkad je viša koncentracija bila definisana kao konstantna, a ostale četiri koncentracije su izračunate (videti Sliku 27).

[0316] Konstante disocijacije (KD) izračunate kao odnos: kd/kai poluživot komplekasa izračunat kao odnos Ln(2)/kdsu predstavljeni na Slikama 28 i 29. Oni odgovaraju srednjim vrednostima iz četiri nezavisna eksperimenta urađena za svako antitelo. Stubići greške odgovaraju standardnim greškama (n=4) vrednosti.

[0317] Konstante disocijacije su u opsegu od 10 do 100 pM. c208F2 antitelo ima slabiji afinitet (višu vrednost konstante disocijacije) za h-IGF-1R (sa KDoko 75 pM) i njegova humanizovana verzija je bar isto toliko dobra kao himerna verzija (sa KDoko 60 pM). Ostala četiri anti-IGF-1R himerna antitela imaju prilično sličan afinitet za hIGF1-R (sa KDoko 30 pM). Razlika afiniteta je u principu vezana za brzinu disocijacije ili rezultujući poluživot kompleksa. Sa 208F2 poluživot kompleksa je između 2 i 3 sata sa himernom i humanizovanom (VH3/VL3) verzijom. Za ostala četiri himerna antitela, srednje vrednosti poluživota su između 7,0 i 9,4 h.

[0318] Ove vrlo spore kinetike disocijacije su očito vezane za bivalentnu strukturu antitela, koja su u stanju da se vežu simultano sa oba svoja Fab kraka za dva susedna h-IGF-1R molekula. U tom slučaju, nivo uhvaćenih molekula IGF-1R može da ima uticaj na brzinu disocijacije. Afiniteti definisani u ovoj studiji odgovaraju funkcionalnim afinitetima (ili aviditetima) antitela za nivo uhvaćenog h-IGF-1R oko 600 RU. Nađena razlika KDod 3 puta između podataka pokazanih gore (tabela 10) i vrednosti predstavljenih u primeru 13 je ovezana za promenu nivoa hvatanja hIGF-1R (600RU prema 160 RU u Primeru 5).

Primer 15: Definicija mišjih specifičnih aminokiselina IGF-1R koji sprečavaju vezivanje c208F2 korišćenjem rastvorljivih formi himernih rekombinantnih proteina h/m IGF-1R [0319] Eksperimenti sa vezivanjem rastvorljivih formi himernih rekombinantnih proteina h/m IGF-1R za c208F2 antitelo su rađeni na uređaju Biacore X100 uz upotrebu senzorskog čipa CM5 aktiviranog mišjim anti-humanim Fc IgG monoklonskim antitelom. Više od 10500 RU antitela na Fc je hemijski nakalemljeno na karboksimetildekstransku matricu obe protočne ćelije pomoću kompleta za hemiju amina.

[0320] Eksperimenti su sprovođeni na 25°C, uz brzinu protoka od 30 µl/min, uz korišćenje HBS-EP pufera kao elucionog i pufera za razblaživanje uzoraka.

[0321] Postavka eksperimenta je bila sledeća:

1- Rastvor c208F2 u koncentraciji od 10µg/ml je ubrizgavan tokom 60 s u drugu protočnu ćeliju.

2- Testirani IGF-1R konstrukti su odgovarali koncentrovanim supernatantima medijuma za kulturu, razblaženim 10 puta u elucionom puferu. Jedna konstrukcija je ubrizgavana u svakom ciklusu tokom 120 s sa kašnjenjem od 120 s.

3- Obe protočne ćelije su regenerisane injekcijom pufera 10mM glicin, HCl, pH 1,7 tokom 30 s.

[0322] Slika 30 prikazuje superpoziciju dva ciklusa. Supernatanti h-IGF-1R i m-IGF-1R su ubrizgavani tokom prvog i drugog ciklusa, respektivno. Ovaj eksperiment jasno pokazuje nesposobnost m-IGF-1R da se veže za c208F2 antitelo. Pozicije korišćene za određivanje nivoa hvatanja c208F2 i nivoa vezivanja IGF-1R su označene dvosmernim strelicama.

[0323] Vanćelijski domeni IGFR (bez signalnog peptida) su sastavljeni od 805 i 806 aminokiselina za humanu i mišju sekvencu, respektivno.

[0324] 869 ostataka (96%) je identično u obe strukture. 37 ostataka mišjih sekvenci se razlikuje od odgovarajućih humanih sekvenci. Jedna razlika odgovara prekidu.

[0325] Kao što je prikazano na Slici 31, od 7 testiranih himernih konstrukata, 4 (C1 (SEQ ID br. 83), C4(SEQ ID br. 86), C7(SEQ ID br. 88) i C8(SEQ ID br. 89)) se vezuju isto tako dobro kao h-IGF-1R za c208F2, 3 konstrukta (C2(SEQ ID br. 84), C3(SEQ ID br. 85) i C6(SEQ ID br.87)) kao mIGF-1R (SEQ ID br.91) se ne vezuju za c208F2.

[0326] Vezivanje C1 i izostanak vezivanja C2 sugerišu da su mišji specifični ostaci koji blokiraju vezivanje c208F2 locirani u N-terminusnoj polovini proteina, tako da poslednjih jedanaest specifičnih mišjih aminokiselina lociranih u C-terminusnoj polovini nemaju uticaj na vezivanje c208F2.

[0327] Nedostatak vezivanja C3 demonstrira glavni doprinos jednog mišjeg specifičnog ostatka, Arg umesto His na poziciji 494. Ovaj rezultat je potvrđen izostankom vezivanja C6, koji sadrži dva mišja specifična ostatka: His494>Arg i Ser501 >Trp.

[0328] Vezivanje C4 sugeriše da samo mišji specifičan ostatak Trp na poziciji 501 ovog himernog IGF-1R nije odgovoran za izostanak vezivanja C2 i C6.

[0329] Vezivanje C7 sugeriše da nijedan od 17 mišjih specifičnih ostataka prisutnih u ovom konstruktu nema nikakvo učešće u blokiranju vezivanja c208F2.

[0330] Isto tako, vezivanje C8 isključuje ostala 4 mišja specifična ostatka.

[0331] C12 mutant humanog IGF1R koji predstavlja tri mišja ostatka u L1 domenu, tj. Phe umesto Tyr na poziciji 28, Ile umesto Val na poziciji 125 i Leu umesto Met na poziciji 156, se vezuje za c208F2 sa subnanomolarnom konstantom disocijacije. Ovaj eksperiment potvrđuje da L1 domen nije uključen u vezivanje antitela ili bar da 3 pozicije koje razlikuju mišju od humane sekvence nisu odgovorne za odsustvo vezivanja antitela za mišju formu IGF1R.

[0332] Kao što je prikazano na slici 33, hz208F2 nije sposoban da se veže za 120 RU C29 mutanta (Asp491>ALa) rastvorljive forme h-IGF1R uhvaćenog na senzorskom čipu CM5 preko njegovog 6His C-terminalnog markera (beli romboidi), dok se isti rastvor antitela jasno vezuje (crni romboidi) za 170 RU prirodne forme rastvorljivog receptora. Kao i His 494, Asp 491 je kritičan za afinitet hz208F2 za IGF1R. Kristalografski podaci pokazuju da su oba ostatka izložena na površini receptora u FnR3 domenu.

[0333] Sveukupno, ovi rezultati demonstriraju da se hz208F2 vezuje za FnR3 domen IGF-1R i da epitop koji prepoznaje ovo antitelo sadrži His 494 i Asp 491 koji su krucijalni za vezivanje antitela.

Claims

PATENTNI ZAHTEVI

1. Monoklonsko antitelo koje se internalizuje, ili njegov fragment za vezivanje IGF-1R koji se internalizuje, i koje se vezuje za humani receptor faktora rasta 1 sličan insulinu (IGF-1R) sekvence SEQ ID N°52 i internalizuje se posle vezivanja za IGF-1R, i koje se ne vezuje za IGF-1R sekvence SEQ ID N°82 i/ili SEQ ID N°92,

gde navedeno antitelo obuhvata:

• tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3 i

• tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11,

gde su navedeni CDR kao što su definisani u IMGT.

2. Monoklonsko antitelo koje se internalizuje, ili njegov fragment za vezivanje IGF-1R koji se internalizuje, prema zahtevu 1, gde epitop navedenog monoklonskog antitela koje se internalizuje sadrži histidinski ostatak na poziciji 494 sekvence SEQ ID N°52 i/ili asparaginski ostatak na poziciji 491 sekvence SEQ ID N°52.

3. Monoklonsko antitelo koje se internalizuje, ili njegov fragment za vezivanje IGF-1R koji se internalizuje, prema zahtevu 2, gde navedeni epitop sadrži aminokiselinsku sekvencu od bar 8 aminokiselina.

4. Monoklonsko antitelo koje se internalizuje, ili njegov fragment za vezivanje IGF-1R koji se internalizuje, prema bilo kom od zahteva 1 do 3, gde je procenat internalizacije posle njegovog vezivanja za IGF-1R bar 40%.

5. Monoklonsko antitelo koje se internalizuje iz bilo kog od zahteva 1 do 4, gde je navedeno antitelo himerno antitelo.

6. Antitelo koje se internalizuje iz zahteva 5, gde je navedeno antitelo odabrano od:

a) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 13 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 13 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11 i

b) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 18 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 18 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3.

7. Antitelo koje se internalizuje iz bilo kog od zahteva 5 ili 6, gde navedeno antitelo obuhvata ili se sastoji od teškog lanca sekvence SEQ ID br. 23 i lakog lanca sekvence SEQ ID br.28.

8. Antitelo koje se internalizuje iz bilo kog od zahteva 1 do 4, gde je navedeno antitelo humanizovano antitelo.

9. Antitelo koje se internalizuje iz zahteva 8, gde navedeno antitelo obuhvata:

a) težak lanac koji ima CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 sekvenci SEQ ID br. 7, 2 i 3, respektivno i FR1, FR2 i FR3 izvedene iz humanog embrionskog IGHV1-46*01 (SEQ ID br.46) i FR4 izveden iz humanog embrionskog IGHJ4*01 (SEQ ID br.48) i b) lak lanac koji ima CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 sekvenci SEQ ID br. 9, 5 i 11, respektivno i FR1, FR2 i FR3 izvedene iz humanog embrionskog IGKV1-39*01 (SEQ ID br.47) i FR4 izveden iz humanog embrionskog IGKJ4*01 (SEQ ID br.49).

10. Antitelo koje se internalizuje iz zahteva 9, gde je navedeno antitelo odabrano od:

a) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 33 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 33 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11;

b) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID br. 34 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 34 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11 i

c) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br. 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 i 80 ili bilo koje sekvence sa bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 i 80 i tri CDR lakog lanca sekvenci SEQ ID br.9, 5 i 11.

11. Antitelo koje se internalizuje iz zahteva 9, gde je navedeno antitelo odabrano od:

a) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 35 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 35 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3;

b) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID br. 36 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 36 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3 i

c) antitela koje sadrži varijabilni domen lakog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br.

57 i 60 ili bilo koje sekvence sa bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.57 ili 60 i tri CDR teškog lanca sekvenci SEQ ID br.7, 2 i 3.

12. Antitelo koje se internalizuje iz zahteva 9, gde je navedeno antitelo odabrano od:

a) antitela koje sadrži težak lanac sekvence SEQ ID br. 37 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.37 i lak lanac sekvence SEQ ID br.39 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.39;

b) antitela koje sadrži težak lanac sekvence SEQ ID br. 38 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.38 i lak lanac sekvence SEQ ID br.40 ili bilo koje sekvence koja ispoljava bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.40 i

c) antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br. 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 i 80 ili bilo koje sekvence sa bar 80% identičnosti sa SEQ ID br. 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 ili 80 i varijabilni domen lakog lanca sekvence odabrane od SEQ ID br. 57 i 60 ili bilo koje sekvence sa bar 80% identičnosti sa SEQ ID br.57 ili 60.

13. Antitelo koje se internalizuje prema bilo kom od zahteva 1 do 12, gde navedeno antitelo proizvodi hibridom I-4757, deponovan u CNCM, Institut Pasteur France, 30. maja, 2013.

14. Mišji hibridom I-4757 koji je deponovan u CNCM, Institut Pasteur France, 30. maja,

15. Monoklonsko antitelo koje se internalizuje, ili njegov fragment za vezivanje antigena koji se internalizuje, iz bilo kog od zahteva 1 do 13, za upotrebu kao lek za lečenje kancera koji eksprimira IGF-1R, gde navedeno antitelo dostavlja citotoksični agens na ciljnom mestu domaćina, gde se navedeno ciljno mesto domaćina sastoji od epitopa lokalizovanog u vanćelijskom domenu proteina IGF-1R, poželjno vanćelijskom domenu humanog proteina IGF-1R (SEQ ID br. 51), poželjnije N-kraju vanćelijskog domena humanog proteina IGF-1R (SEQ ID br.52) ili bilo koje prirodne varijante njegove sekvence.

16. Konjugat antitelo-lek koji obuhvata monoklonsko antitelo koje se internalizuje, ili njegov fragment za vezivanje antigena koji se internalizuje, iz bilo kog od zahteva 1 do 13, konjugovan sa citotoksičnim agensom.

17. Konjugat antitelo-lek iz zahteva 16, za upotrebu kao lek.

18. Konjugat antitelo-lek iz zahteva 16, za upotrebu kao lek za lečenje kancera koji eksprimira IGF-1R.

19. Farmaceutski sastav koji sadrži konjugat antitelo-lek iz zahteva 16 i bar jedan ekscipijent i/ili farmaceutski prihvatljiv nosilac.

20. Farmaceutski sastav iz zahteva 19 za upotrebu kao lek za lečenje kancera koji eksprimira IGF-1R.

21. Konjugat antitelo-lek iz zahteva 16 ili farmaceutski sastav iz zahteva 19, za upotrebu kao lek za dostavljanje leka ili medikamenta u ćeliju kancera koji eksprimira IGF-1R u subjektu.