RS61590B1 - Monoklonsko antitelo protiv ctla4 ili njegov antigen-vezujući fragment, medicinska kompozicija i upotreba - Google Patents

Monoklonsko antitelo protiv ctla4 ili njegov antigen-vezujući fragment, medicinska kompozicija i upotreba

Info

Publication number
RS61590B1
RS61590B1 RS20210312A RSP20210312A RS61590B1 RS 61590 B1 RS61590 B1 RS 61590B1 RS 20210312 A RS20210312 A RS 20210312A RS P20210312 A RSP20210312 A RS P20210312A RS 61590 B1 RS61590 B1 RS 61590B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
antigen
seq
ctla4
binding fragment
Prior art date
Application number
RS20210312A
Other languages
English (en)
Inventor
Baiyong Li
Yu Xia
Zhongmin Wang
Peng Zhang
Xinghua Pang
Original Assignee
Akeso Biopharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Akeso Biopharma Inc filed Critical Akeso Biopharma Inc
Publication of RS61590B1 publication Critical patent/RS61590B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70521—CD28, CD152

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis
Oblast tehnike
[0001] Predmetni pronalazak pripada oblasti terapije tumora i molekularnoj imunologiji. Predmetni pronalazak se odnosi na monoklonsko antitelo protiv CTLA4 ili njegov antigenvezujući fragment, njegovu farmaceutsku kompoziciju, sekvence koje ga kodiraju, i njegovu upotrebu u postupcima za dijagnozu, prevenciju, terapiju i/ili adjuvantnu terapiju.
Stanje tehnike
[0002] Antigen 4 povezan sa citotoksičnim T-limfocitima (skraćeno CTLA4) je veoma blisko povezan sa molekulom CD28 po genskoj strukturi, hromozomskoj lokaciji, homologiji sekvence i genskoj ekspresiji. Oba predstavljaju receptore za ko-stimulativni molekul B7, koji se uglavnom eksprimira na površini aktiviranih T ćelija. Međutim, kao ko-stimulatorni signal aktivacije limfocita, CTLA4 ima suprotnu funkciju u odnosu na CD28. Posle vezivanja za B7, CTLA4 može da inhibira aktivaciju mišjih i humanih T ćelija, igrajući negativnu regulatornu ulogu u aktivaciji T ćelija.
[0003] CTLA4 mAbs ili CTLA4 ligandi mogu da spreče vezivanje CTLA4 za njegove nativne ligande, čime blokiraju transdukciju negativnog regulatornog signala sa CTLA4 na T ćelije i pojačavaju responsivnost T ćelija na različite antigene. U ovom aspektu, rezultati in vivo i in vitro studija u osnovi se podudaraju. Do sada su neka od CTLA4 mAbs (10D1, 11.2.2) ispitivana u kliničkim studijama za lečenje kancera prostate, kancera bešike, kolorektalnog kancera, kancera gastrointestinalnog trakta, kancera jetre, malignog melanoma, itd. (CTLA-4 blockade in tumor models: an overview of preclinical and translational research. Grosso JF., Jure-Kunkel MN., Cancer Immun. 2013; 13:5. Epub 2013 Jan 22; US 6984720 B1; i US 6682736 B1). Smatra se da, među ovim anti-CTLA4 monoklonskim antitelima, 10D1 i 11.2.2 imaju najbolja dejstva.
[0004] T ćelije proizvode interleukin 2 (IL-2). To je faktor rasta koji reguliše podgrupu T ćelija. Takođe je važan faktor koji moduliše imuni odgovor. Može da podstakne i aktivira ekspanziju B ćelija, i uključen je u reakciju antitela, hematopoezu i nadzor nad tumorom. Uprava za hranu i lekove SAD odobrila je rekombinantni humani IL-2 za lečenje malignih tumora (uključujući melanom, tumor bubrega, itd.). On se takođe ispituje u kliničkim studijama za lečenje hroničnih virusnih infekcija (Pharmacologic administration of interleukin-2. Chavez, A.R., et al., Ann N Y Acad Sci, 2009.1182: 14-27).
[0005] Kao važni faktori koji utiču na funkciju T ćelija, CTLA4 i CTLA4 mAbs mogu da proizvedu specifično terapijsko dejstvo na bolesti interferirajući sa imunološkom mikrosredinom u telu. Veoma su efikasni i otklanjaju određene nedostatke tradicionalnih lekova, otvarajući novi put genske terapije. CTLA4 i CTLA4 mAbs se ispituju u eksperimentima i različitim fazama kliničkih ispitivanja. Na primer, kod autoimunih bolesti, oni su efikasno inhibirali hiperreaktivnost disajnih puteva u životinjskom modelu astme, sprečavali razvoj reumatskih bolesti, posredovali u imunološkoj toleranciji na alograft u organizmu, i slično. S druge strane, iako biološka genska terapija nije pokazala nikakav neželjeni efekat u kratkotrajnim kliničkim ispitivanjima, treba obratiti pažnju na potencijalni efekat nakon dugotrajne primene. Na primer, prekomerna blokada CTLA4-B7 signalizacije pomoću CTLA4 mAbs može da dovede do razvoja autoimunih bolesti. Kako antitela mogu specifično da se vežu za svoje ligande i indukuju lizu ciljnih ćelija ili da blokiraju napredovanje patološkog procesa, razvoj i upotreba lekova zasnovanih na antitelima, posebno humanizovanim antitelima, imaju važan značaj u kliničkom lečenju malignih tumora i drugih imunih bolesti kod čoveka.
[0006] Za sada, još uvek postoji potreba da se razviju nova antitela koja blokiraju vezivanje CTLA4 za B7, i njihova humanizovana antitela.
Izlaganje suštine pronalaska
[0007] Posle intenzivnih studija i kreativnog rada pronalazača, rekombinantni CTLA4 je eksprimiran upotrebom ekspresionog sistema na bazi sisarskih ćelija, i upotrebljen kao antigen za imunizaciju miševa. Ćelije hibridoma su dobijene fuzijom ćelija slezine miša sa ćelijama mijeloma. Nakon što su pronalazači sproveli skrining velikog broja uzoraka, dobijena je linija ćelija hibridoma koja može da sekretuje i proizvodi specifično monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za CTLA4 i može da blokira vezivanje CTLA4 za B7 veoma efikasno. Osim toga, stvorena su humanizovana antitela. Time su obezbeđeni sledeći pronalasci.
[0008] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se vezuje za humani CTLA4, izabran iz grupe koja se sastoji od:
(a) antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji sadrži varijabilni region teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 14 i varijabilni region lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 16; i
(b) antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji sadrži varijabilni region teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 14 i varijabilni region lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 16, pri čemu u sekvenci SEQ ID NO: 14 na poziciji 18, metionin može da bude supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koja se sastoji od: leucina, valina, izoleucina i alanina.
[0009] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje jedan ili više izolovanih molekula nukleinske kiseline koji kodiraju antitelo ili antigen-vezujući fragment prema pronalasku, pri čemu specifično jedan ili više izolovanih molekula nukleinske kiseline imaju nukleotidnu sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 13 ili SEQ ID NO: 15.
[0010] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema pronalasku za upotrebu u postupku za lečenje kancera, kao što je melanom, tumor bubrega/renalni tumor, kancer prostate, kancer bešike, kolorektalni kancer, kancer gastrointestinalnog trakta, i/ili kancer jetre/hepatični kancer kod humanog subjekta.
[0011] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema pronalasku za upotrebu u postupku za lečenje limfoma.
[0012] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje in vitro postupak koji obuhvata korak primene na ćelije efikasne količine antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema pronalasku, pri čemu je postupak odabran od sledećeg:
(a) postupka za detekciju nivoa CTLA4 u uzorku,
(b) postupka za blokiranje vezivanja humanog CTLA4 za humani B7,
(c) postupka za regulisanje aktivnosti humanog CTLA4 ili nivoa humanog CTLA4, (d) postupka za ublažavanje imunosupresivnog dejstva humanog CTLA4 na organizam, (e) postupka za aktivaciju T limfocita, ili
(f) postupka za povećanje ekspresije IL-2 u T limfocitima.
[0013] Jedan aspekt se odnosi na monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu monoklonsko antitelo sadrži regione koji određuju komplementarnost (CDR’s) odabrane od sledećih:
HCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27,
HCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28, i
HCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29;
i/ili
LCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30,
LCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31, i
LCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, i SEQ ID NO: 34.
[0014] Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od aspekata predmetnog otkrića, pri čemu je aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca (VH) monoklonskog antitela odabrana od SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, i SEQ ID NO: 18;
i/ili
aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca (VL) monoklonskog antitela odabrana od SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, i SEQ ID NO: 24.
[0015] Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od aspekata predmetnog otkrića, gde monoklonsko antitelo sadrži
(1) VH kako je navedeno u SEQ ID NO: 6 i VL kako je navedeno u SEQ ID NO: 8;
(2) VH kako je navedeno u SEQ ID NO: 10 i VL kako je navedeno u SEQ ID NO: 12; (3) VH kako je navedeno u SEQ ID NO: 14 i VL kako je navedeno u SEQ ID NO: 16; (4) VH kako je navedeno u SEQ ID NO: 18 i VL kako je navedeno u SEQ ID NO: 20; (5) VH kako je navedeno u SEQ ID NO: 14 i VL kako je navedeno u SEQ ID NO: 22; ili (6) VH kako je navedeno u SEQ ID NO: 14 i VL kako je navedeno u SEQ ID NO: 24.
[0016] U predmetnom otkriću, gornje grupe (1) do (6) prikazuju aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca 8D2/8D2(Re), 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 i 8D2H2L17, redom.
[0017] Specifično, metionin (Met) na poziciji 18 u SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, i SEQ ID NO: 14 je nezavisno supstituisan aminokiselinom odabranom od sledećih: leucina (Leu), valina (Val), izoleucina (Ile), ili alanina (Ala).
[0018] Terapijski lekovi koji se zasnivaju na antitelima, naročito na monoklonskim antitelima (MAB) dostigli su izuzetnu efikasnost u lečenju nekoliko bolesti. Uobičajeni postupak za dobijanje takvog terapijskog antitela je imunizacija životinje antigenom, čime se dobijaju antitela protiv antigena iz imunizovane životinje, ili poboljšanjem antitela koje ima nizak afinitet za antigen sazrevanjem imuniteta. Međutim, takav postupak zahteva mnogo vremena i rada, i često se njime ne dobijaju antitela usmerena na specifični epitop antigena.
[0019] Vezivanje antigena zavisi od varijabilnih regiona lakog lanca i teškog lanca; varijabilni region svakog lanca sadrži tri hipervarijabilna regiona, označena i kao region koji određuje komplementarnost (CDR) (teški lanac (H) sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3, i laki lanac (L) sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3; za definiciju, videti Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition (1991), Vol.1-3, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md).
[0020] Aminokiselinske sekvence CDRs u sekvencama monoklonskog antitela prema gore navedenim aspektima (1) do (6) analizirane su tehničkim sredstvima koja su dobro poznata stručnjacima u ovoj oblasti, npr., analizom baze podataka VBASE2. Rezultati su dati u nastavku. (1) Aminokiselinske sekvence 3 CDR regiona varijabilnog regiona teškog lanca prikazane su ispod:
HCDR1: GFTFSDNW (SEQ ID NO: 27),
HCDR2: IRNKPYNYET (SEQ ID NO: 28),
HCDR3: TAQFAY (SEQ ID NO: 29).
Aminokiselinske sekvence 3 CDR regiona varijabilnog regiona lakog lanca prikazane su ispod:
LCDR1: ENIYGG (SEQ ID NO: 30),
LCDR2: GAT (SEQ ID NO: 31),
LCDR3: QNVLRSPFT (SEQ ID NO: 32).
(2) Aminokiselinske sekvence 3 CDR regiona varijabilnog regiona teškog lanca prikazane su ispod:
HCDR1: GFTFSDNW (SEQ ID NO: 27),
HCDR2: IRNKPYNYET (SEQ ID NO: 28),
HCDR3: TAQFAY (SEQ ID NO: 29).
Aminokiselinske sekvence 3 CDR regiona varijabilnog regiona lakog lanca prikazane su ispod:
LCDR1: ENIYGG (SEQ ID NO: 30),
LCDR2: GAT (SEQ ID NO: 31),
LCDR3: QNVLRSPFT (SEQ ID NO: 32).
(3) Aminokiselinske sekvence 3 CDR regiona varijabilnog regiona teškog lanca prikazane su ispod:
HCDR1: GFTFSDNW (SEQ ID NO: 27),
HCDR2: IRNKPYNYET (SEQ ID NO: 28),
HCDR3: TAQFAY (SEQ ID NO: 29).
Aminokiselinske sekvence 3 CDR regiona varijabilnog regiona lakog lanca prikazane su ispod:
LCDR1: ENIYGG (SEQ ID NO: 30),
LCDR2: GAT (SEQ ID NO: 31),
LCDR3: QNVLRSPFT (SEQ ID NO: 32).
(4) Aminokiselinske sekvence 3 CDR regiona varijabilnog regiona teškog lanca prikazane su ispod:
HCDR1: GFTFSDNW (SEQ ID NO: 27),
HCDR2: IRNKPYNYET (SEQ ID NO: 28),
HCDR3: TAQFAY (SEQ ID NO: 29).
Aminokiselinske sekvence 3 CDR regiona varijabilnog regiona lakog lanca prikazane su ispod:
LCDR1: ENIYGG (SEQ ID NO: 30),
LCDR2: GAT (SEQ ID NO: 31),
LCDR3: QNVLRSPFT (SEQ ID NO: 32).
(5) Aminokiselinske sekvence 3 CDR regiona varijabilnog regiona teškog lanca prikazane su ispod:
HCDR1: GFTFSDNW (SEQ ID NO: 27),
HCDR2: IRNKPYNYET (SEQ ID NO: 28),
HCDR3: TAQFAY (SEQ ID NO: 29).
Aminokiselinske sekvence 3 CDR regiona varijabilnog regiona lakog lanca prikazane su ispod:
LCDR1: ENIYGG (SEQ ID NO: 30),
LCDR2: GAT (SEQ ID NO: 31),
LCDR3: QNVLSRHPG (SEQ ID NO: 33).
(6) Aminokiselinske sekvence 3 CDR regiona varijabilnog regiona teškog lanca prikazane su ispod:
HCDR1: GFTFSDNW (SEQ ID NO: 27),
HCDR2: IRNKPYNYET (SEQ ID NO: 28),
HCDR3: TAQFAY (SEQ ID NO: 29).
Aminokiselinske sekvence 3 CDR regiona varijabilnog regiona lakog lanca prikazane su ispod:
LCDR1: ENIYGG (SEQ ID NO: 30),
LCDR2: GAT (SEQ ID NO: 31),
LCDR3: QNVLSSRPG (SEQ ID NO: 34).
[0021] Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od primera izvođenja predmetnog pronalaska, gde je monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment odabran od Fab, Fab’, F(ab’)2, Fd, Fv, dAb, fragmenta regiona koji određuje komplementarnost, jednolančanog antitela (npr., scFv), humanizovanog antitela, himernog antitela, ili diatela.
[0022] Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od primera izvođenja predmetnog pronalaska, gde se monoklonsko antitelo vezuje za protein CTLA4 sa KDmanjom od oko 10-5 M, npr., manjom od oko 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, ili 10-10 M ili manjom.
[0023] Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od primera izvođenja predmetnog pronalaska, gde monoklonsko antitelo sadrži ne-CDR regione, i navedeni ne-CDR regioni potiču iz antitela vrste koja nije mišja, npr., čoveka.
[0024] Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment predmetnog pronalaska je monoklonsko antitelo protiv CTLA4 ili njegov antigen-vezujući fragment koji može specifično da se veže za CTLA4.
[0025] Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od aspekata predmetnog otkrića za upotrebu u prevenciji i/ili terapiji i/ili adjuvantnoj terapiji i/ili dijagnozi tumora; posebno, tumora odabranog od melanoma, tumora bubrega/renalnog tumora, kancera prostate, kancera bešike, kolorektalnog kancera, kancera gastrointestinalnog trakta i kancera jetre/hepatičnog kancera.
[0026] Monoklonsko antitelo prema bilo kom od primera izvođenja predmetnog pronalaska za upotrebu u:
blokiranju vezivanja CTLA4 za B7,
regulisanju (npr., nishodnom regulisanju) aktivnosti CTLA4 ili nivoa CTLA4, ublažavanju imunosupresivnog dejstva CTLA4 na organizam, ili
kao agensa koji aktivira T limfocite ili povećava ekspresiju IL-2 u T limfocitima.
[0027] Još jedan aspekt predmetnog otkrića odnosi se na izolovani molekul nukleinske kiseline, koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja može da kodira varijabilni region teškog lanca antitela, pri čemu varijabilni region teškog lanca antitela sadrži CDRs sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NOs: 27-29; specifično, varijabilni region teškog lanca antitela ima aminokiselinsku sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, ili SEQ ID NO: 18; specifičnije, molekul nukleinske kiseline ima nukleotidnu sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, ili SEQ ID NO: 17.
[0028] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje izolovane molekule nukleinske kiseline, koji kodiraju monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment predmetnog pronalaska. Takvi molekuli nukleinske kiseline mogu da budu izolovani iz ćelija hibridoma, ili dobijeni rekombinantnim tehnologijama genetskog inženjeringa ili postupcima hemijske sinteze.
[0029] Sledeći aspekt predmetnog otkrića odnosi se na izolovani molekul nukleinske kiseline, koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja može da kodira varijabilni region lakog lanca antitela, pri čemu varijabilni region lakog lanca antitela sadrži:
1) CDRs sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NOs: 30-32;
2) CDRs sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 i SEQ ID NO: 33; ili
3) CDRs sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 i SEQ ID NO: 34;
specifično, varijabilni region lakog lanca antitela ima aminokiselinsku sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, ili SEQ ID NO: 24;
specifičnije, molekul nukleinske kiseline ima nukleotidnu sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, ili SEQ ID NO: 23.
[0030] Sledeći primer izvođenja predmetnog pronalaska odnosi se na vektor koji sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline prema bilo kom od primera izvođenja predmetnog pronalaska. Vektor predmetnog pronalaska može da bude vektor za kloniranje ili ekspresioni vektor. U poželjnom primeru izvođenja, vektor predmetnog pronalaska je, na primer, plazmid, kozmid, bakteriofag, koemid, ili slično.
[0031] Sledeći primer izvođenja predmetnog pronalaska odnosi se na ćeliju-domaćina, koja sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline prema bilo kom od primera izvođenja predmetnog pronalaska, ili vektor prema predmetnom pronalasku. Takve ćelije-domaćini uključuju, ali nisu ograničene na, prokariotske ćelije kao ćelije E. coli i eukariotske ćelije kao ćelije kvasca, insekatske ćelije, biljne ćelije i životinjske ćelije (kao sisarske ćelije, uključujući mišje ćelije, humane ćelije, ili slično). Ćelije predmetnog pronalaska mogu da predstavljaju i ćelijsku liniju, kao što su ćelije 293T.
[0032] Sledeći aspekt primera izvođenja predmetnog pronalaska odnosi se na postupak za pripremu monoklonskog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema bilo kom od primera izvođenja predmetnog pronalaska, gde postupak obuhvata korake kultivisanja ćelijadomaćina predmetnog pronalaska pod pogodnim uslovima i izdvajanja monoklonskog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta iz ćelijske kulture.
[0033] Sledeći aspekt odnosi se na konjugat, koji sadrži monoklonsko antitelo ili njegov antigenvezujući fragment i konjugovani fragment, pri čemu monoklonsko antitelo predstavlja monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od primera izvođenja predmetnog pronalaska, a konjugovani fragment je detektabilna oznaka. Specifično, konjugovani fragment je radioizotop, fluorescentna supstanca, luminescentna supstanca, hromogena supstanca, ili enzim (npr., peroksidaza rena).
[0034] Sledeći aspekt predmetnog otkrića odnosi se na komplet, koji sadrži monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od primera izvođenja predmetnog pronalaska, ili konjugat prema predmetnom pronalasku;
specifično, komplet dodatno sadrži drugo antitelo, koje specifično prepoznaje navedeno monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment; opciono, navedeno drugo antitelo dodatno sadrži detektabilnu oznaku, npr., radioizotop, fluorescentnu supstancu, luminescentnu supstancu, hromogenu supstancu, ili enzim (npr., peroksidazu rena).
[0035] Sledeći aspekt predmetnog otkrića odnosi se na upotrebu monoklonskog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema bilo kom od primera izvođenja predmetnog pronalaska u pripremi kompleta za upotrebu u detekciji prisustva ili nivoa CTLA4 u uzorku.
[0036] Sledeći aspekt odnosi se na farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od primera izvođenja predmetnog pronalaska ili konjugat prema predmetnom pronalasku; opciono, dodatno sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili ekscipijens.
[0037] Sledeći aspekt odnosi se na upotrebu monoklonskog antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta prema bilo kom od primera izvođenja predmetnog pronalaska ili konjugata prema predmetnom pronalasku u pripremi leka za upotrebu u prevenciji i/ili terapiji i/ili adjuvantnoj terapiji i/ili dijagnozi tumora; specifično, tumora odabranog od melanoma, tumora bubrega/renalnog tumora, kancera prostate, kancera bešike, kolorektalnog kancera, kancera gastrointestinalnog trakta i kancera jetre/hepatičnog kancera.
[0038] Sledeći aspekt odnosi se na upotrebu monoklonskog antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta prema bilo kom od primera izvođenja predmetnog pronalaska ili konjugata prema predmetnom pronalasku u pripremi sledećeg agensa:
agensa koji omogućava detekciju prisustva ili niva CTLA4 u uzorku,
agensa koji blokira vezivanje CTLA4 za B7,
agensa koji reguliše (npr., nishodno reguliše) aktivnost CTLA4 ili nivo CTLA4, agensa koji ublažava imunosupresivno dejstvo CTLA4 na organizam,
agensa koji aktivira T limfocite, ili
agensa koji povećava ekspresiju IL-2 u T limfocitima.
[0039] Sledeći aspekt odnosi se na in vivo ili in vitro postupak koji obuhvata primenu na ćelije efikasne količine monoklonskog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema bilo
1
kom od primera izvođenja predmetnog pronalaska ili konjugata prema predmetnom pronalasku, pri čemu je postupak odabran od sledećih:
postupka za detekciju prisustva ili nivoa CTLA4 u uzorku,
postupka za blokiranje vezivanja CTLA4 za B7,
postupka za regulisanje (npr., nishodno regulisanje) aktivnosti CTLA4 ili nivoa CTLA4, postupka za ublažavanje imunosupresivnog dejstva CTLA4 na organizam,
postupka za aktivaciju T limfocita, ili
postupka za povećanje ekspresije IL-2 u T limfocitima.
[0040] Navedeni postupci mogu da se koriste u dijagnostičke ili terapijske svrhe, ili nedijagnostičke ili neterapijske svrhe (npr., kada je uzorak ćelijski uzorak, a ne uzorak uzet od pacijenta).
[0041] Sledeći aspekt odnosi se na postupak za prevenciju i/ili terapiju i/ili adjuvantnu terapiju i/ili dijagnozu tumora, koji obuhvata primenu kod subjekta efikasne količine monoklonskog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema bilo kom od aspekata predmetnog otkrića ili konjugata prema predmetnom pronalasku; specifično, tumora odabranog od melanoma, tumora bubrega/renalnog tumora, kancera prostate, kancera bešike, kolorektalnog kancera, kancera gastrointestinalnog trakta i kancera jetre/hepatičnog kancera.
[0042] U predmetnom pronalasku, osim ako nije drugačije naglašeno, naučni i tehnički pojmovi koji se ovde koriste imaju isto značenje koje uobičajeno podrazumevaju stručnjaci u ovoj oblasti. Osim toga, procedure ćelijske kulture, molekularne genetike, hemije nukleinskih kiselina, imunologije, koje su ovde upotrebljene, predstavljaju metodologije koje se uobičajeno koriste u relevantnoj oblasti. Istovremeno, u cilju boljeg razumevanja predmetnog pronalaska, u nastavku su date definicije i objašnjenja relevantnih pojmova.
[0043] Kako je ovde upotrebljeno, kada se pominje aminokiselinska sekvenca proteina CTLA4 (antigen 4 povezan sa citotoksičnim T-limfocitima), ona uključuje celu dužinu proteina CTLA4, ili ekstracelularni fragment CTLA4, CTLA4ECD (SEQ ID NO: 2), ili fragment koji sadrži CTLA4ECD; takođe uključuje fuzioni protein CTLA4ECD, npr., fragment fuzionisan sa fragmentom Fc proteina mišjeg IgG (mFc) (SEQ ID NO: 3). Međutim, kao što stručnjaci u ovoj oblasti znaju, mutacija ili varijacija (uključujući, ali bez ograničenja, supstituciju, deleciju i/ili adiciju) može da bude prirodno proizvedena ili veštački uvedena u aminokiselinsku sekvencu proteina CTLA4, a da pri tome ne utiče na njegove biološke funkcije. Stoga, u predmetnom pronalasku, pojam "protein CTLA4" treba da uključuje sve takve sekvence, uključujući sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO: 2, kao i njene prirodne ili veštačke varijante. Osim toga, kada se pominje fragment sekvence proteina CTLA4, on ne uključuje samo fragment sekvence SEQ ID NO: 2, već takođe uključuje odgovarajuće fragmente sekvence njenih prirodnih ili veštačkih varijanti.
[0044] Kako je ovde upotrebljeno, osim ako nije specifično navedeno, B7 se odnosi na B7-1 i/ili B7-2; i njihove specifične proteinske sekvence odnose se na sekvence poznate u stanju tehnike. Mogu da se pominju sekvence opisane u literaturi prethodnog stanja tehnike ili iz GenBank, npr., B7-1 (CD80, NCBI ID gena: 941), B7-2 (CD86, NCBI ID gena: 942).
[0045] Kako je ovde upotrebljen, pojam EC50se odnosi na koncentraciju za 50% maksimalnog dejstva, tj., koncentraciju koja dovodi do 50% maksimalnog dejstva.
[0046] Kako je ovde upotrebljen, pojam "antitelo" se odnosi na imunoglobulinski molekul koji se uopšteno sastoji od dva para polipeptidnih lanaca (svaki par ima "laki" (L) lanac i "teški" (H) lanac). Laki lanci antitela mogu da se klasifikuju kao κ i λ laki lanac. Teški lanci mogu da se klasifikuju kao µ, δ, γ, α ili ε, a izotipovi antitela su definisani kao IgM, IgD, IgG, IgA i IgE, redom. Unutar lakog lanca i teškog lanca, varijabilni region i konstantni region su spojeni preko "J" regiona od oko 12 ili više aminokiselina, a teški lanac dodatno sadrži "D" region od oko 3 ili više aminokiselina. Svaki teški lanac sastoji se od varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i konstantnog regiona teškog lanca (CH). Konstantni region teškog lanca sastoji se od 3 domena (CH1, CH2 i CH3). Svaki laki lanac sastoji se od varijabilnog regiona lakog lanca (VL) i konstantnog regiona lakog lanca (CL). Konstantni region lakog lanca sastoji se od CLdomena. Konstantni region antitela može da posreduje u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunog sistema (npr., efektorske ćelije) i prvu komponentu klasičnog sistema komplementa (C1q). VHi VLregioni mogu da budu dodatno podeljeni na regione koji imaju visoku varijabilnost (označeni kao region koji određuje komplementarnost (CDR)), ispresecane regionima nazvanim regioni okvira (FR) koji su relativno konzervativni. Svaki VHili VLsastoji se od 3 CDR regiona i 4 FR regiona, raspoređenih sledećim redom od amino-terminalnog kraja ka karboksi-terminalnom kraju: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni (VHi VL) svakog para teški lanac/laki lanac formiraju vezujuće mesto antitela, redom. Pripisivanje aminokiselina svakom regionu ili domenu prati definiciju datu u Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)), ili Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol.196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 878-883. Pojam "antitelo" nije ograničen nijednim specifičnim postupkom za proizvodnju antitela. Na primer, on uključuje, naročito, rekombinantna antitela, monoklonska antitela i poliklonska antitela. Antitela mogu da budu antitela različitih izotipova, npr., IgG (npr., IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 podtipa), IgA1, IgA2, IgD, IgE ili IgM antitela.
[0047] Kako je ovde upotrebljen, pojam "antigen-vezujući fragment" antitela odnosi se na polipeptid koji sadrži fragment celog antitela koji zadržava sposobnost da se specifično veže za antigen koji vezuje antitelo cele dužine, i/ili da kompetira sa antitelom cele dužine za specifično vezivanje za antigen. Označen je i kao "antigen-vezujući deo". Uopšteno, videti Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., Second Edition, Raven Press, N.Y. (1989)). Antigen-vezujući fragmenti antitela mogu da budu proizvedeni tehnikama rekombinantne DNK ili enzimskim ili hemijskim cepanjem intaktnih antitela. U nekim slučajevima, antigen-vezujući fragmenti uključuju Fab, Fab’, F(ab’)2, Fd, Fv, dAb i fragment regiona koji određuje komplementarnost (CDR), jednolančano antitelo (npr., scFv), himerno antitelo, diatelo i takve polipeptide koji sadrže bar deo antitela dovoljan da polipeptidu obezbedi sposobnost specifičnog vezivanja za antigen.
[0048] Kako je ovde upotrebljen, pojam "Fd fragment" odnosi se na fragment antitela koji se sastoji od VHi CH1 domena; pojam "Fv fragment" se odnosi na fragment antitela koji se sastoji od VLi VHdomena jedne ručice antitela; pojam "dAb fragment" se odnosi na fragment antitela koji se sastoji od VHdomena (Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989)); pojam "Fab fragment" se odnosi na fragment antitela koji se sastoji od VL, VH, CLi CH1 domena; i pojam "F(ab’)2fragment" se odnosi na fragment antitela koji sadrži dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostovima u regionu zgloba.
[0049] U nekim slučajevima, antigen-vezujući fragment antitela je jednolančano antitelo (npr., scFv), u kome se VLi VHdomeni međusobno sparuju preko linkera koji omogućava proizvodnju jednog polipeptidnog lanca da bi se formirao monovalentni molekul (videti, npr., Bird et al., Science 242: 423-426 (1988) i Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)). Takav scFv molekul može da ima opštu strukturu: NH2-VL-Linker-VH-COOH ili NH2-VH-Linker-VL-COOH. Pogodni linkeri stanja tehnike sastoje se od ponovljene aminokiselinske sekvence GGGGS ili njenih varijanti. Na primer, može da se upotrebi linker koji ima aminokiselinsku sekvencu (GGGGS)4, ali mogu da se koriste i njene varijante (Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). Drugi linkeri koji su korisni u predmetnom pronalasku opisani su u Alfthan et al. (1995) Protein Eng. 8: 725-731; Choi et al. (2001) Eur. J. Immunol. 31: 94-106; Hu et al. (1996) Cancer Res. 56: 3055-3061; Kipriyanov et al. (1999) J. Mol. Biol.293: 41-56 i Roovers et al. (2001) Cancer Immunol.
[0050] U nekim slučajevima, antigen-vezujući fragment antitela je diatelo (bivalentno antitelo), u kome su VHi VLdomeni eksprimirani na jednom polipeptidnom lancu. Međutim, korišćeni linker je vrlo kratak, tako da dva domena na istom lancu ne mogu međusobno da se spare, i prinuđeni su da se spare sa komplementarnim domenom na drugom lancu. Na taj način,
1
formiraju se dva antigen-vezujuća mesta (videti, npr., Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) i Poljak R. J. et al., Structure 2: 1121-1123 (1994)).
[0051] Antigen-vezujući fragmenti antitela (npr., gore navedeni fragmenti antitela) mogu da se dobiju od datih antitela (npr., monoklonskih antitela 4B3, 13A10, 12B9, ili 4H4 obezbeđenih u predmetnom pronalasku) upotrebom uobičajenih tehnologija poznatih stručnjacima u ovoj oblasti (npr., tehnike rekombinantne DNK ili postupak enzimskog ili hemijskog cepanja), i mogu da se podvrgnu skriningu za specifičnost na isti način kao intaktna antitela.
[0052] U ovom dokumentu, osim ako u kontekstu nije izričito naglašeno, kada se pominje pojam "antitelo", to ne uključuje samo intaktna antitela, već uključuje antigen-vezujuće fragmente antitela.
[0053] Kako su ovde upotrebljeni, pojmovi "mAb" ili "monoklonsko antitelo" se odnose na antitelo ili fragment antitela iz populacije visoko homogenih molekula antitela, tj., pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična osim mogućih prirodnih mutacija. Monoklonska antitela su visoko specifična za jedan epitop na antigenu. Nasuprot monoklonskom antitelu, preparati poliklonskog antitela tipično uključuju najmanje dva ili više različitih antitela koja prepoznaju različite epitope na antigenu. Monoklonska antitela mogu uopšteno da se dobiju upotrebom tehnike hibridoma koju je prvi opisao Kohler et al. (Nature, 256: 495, 1975), ili mogu da se dobiju upotrebom tehnika rekombinantne DNK (videti SAD patent 4,816,567, na primer).
[0054] Kako se ovde upotrebljava, monoklonsko antitelo pomenuto pod određenim brojem identično je sa monoklonskim antitelom dobijenim iz hibridoma pomenutim pod istim brojem. Na primer, monoklonsko antitelo 4B3 (ili 13A10, 12B9 ili 4H4) identično je sa antitelom dobijenim iz ćelijske linije hibridoma 4B3 (ili 13A10, 12B9 ili 4H4) ili njenih subklonova ili potomačkih ćelija.
[0055] Kako je ovde upotrebljen, pojam "himerno antitelo" se odnosi na takvo antitelo, u kome deo lakog lanca i/ili teškog lanca potiče iz antitela (koje može da potiče od određene vrste ili da pripada određenoj klasi ili potklasi antitela), dok drugi deo lakog lanca i/ili teškog lanca potiče iz drugog antitela (koje može da potiče od identične ili drugačije vrste, ili da pripada identičnoj ili drugačijoj klasi ili potklasi antitela), sve dok zadržava aktivnost vezivanja za ciljni antigen (SAD patent 4,816,567, Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)).
[0056] Kako je ovde upotrebljen, pojam "humanizovano antitelo" se odnosi na antitelo ili fragment antitela dobijen posle zamene svih ili nekih CDRs humanog imunoglobulina (recipijentno antitelo) CDR regionima ne-humanog antitela (donorsko antitelo), pri čemu donorsko antitelo može da bude ne-humano (npr., mišje, pacovsko ili zečje) antitelo koje ima željenu specifičnost, afinitet ili reaktivnost. Osim toga, neke aminokiselinske rezidue regiona okvira (FRs) recipijentnog antitela mogu da se zamene odgovarajućim aminokiselinskim reziduama ne-humanog antitela ili aminokiselinskim reziduama drugog antitela kako bi se dodatno poboljšale ili optimizovale karakteristike antitela. Za više detalja o humanizovanim antitelima, videti, npr., Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992); i Clark, Immunol. Today 21: 397-402 (2000).
[0057] Kako je ovde upotrebljeno, "neutrališuće antitelo" se odnosi na antitelo ili fragment antitela koje može da otkloni ili značajno smanji virulentnost ciljnog virusa (npr., sposobnost da inficira ćelije).
[0058] Kako je ovde upotrebljen, pojam "epitop" se odnosi na deo na antigenu za koji se specifično vezuje imunoglobulin ili antitelo. U stanju tehnike, "epitop" se naziva i "antigenom determinantom". Epitop ili antigena determinanta se uopšteno sastoji od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula, npr., aminokiselina ili jedinjenja ugljenih hidrata ili bočnih lanaca šećera, i uopšteno ima specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i specifične karakteristike naelektrisanja. Na primer, epitop uopšteno sadrži najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ili 15 uzastopnih aminokiselina ili aminokiselina koje nisu uzastopne u specifičnoj prostornoj konformaciji. Može da bude "linearni" ili "konformacioni" epitop. Videti, npr., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996). U linearnom epitopu, sve tačke kontakta između proteina i interagujućeg molekula (npr., antitela) prisutne su duž primarne aminokiselinske sekvence proteina u nizu. U konformacionom epitopu, tačke kontakta prisutne su kao nizovi aminokiselinskih rezidua proteina koji su međusobno razdvojeni.
[0059] Kako je ovde upotrebljen, pojam "izolovani" znači dobijen iz prirodnog stanja na veštački način. Ako se "izolovana" supstanca ili komponenta javlja u prirodi, verovatno je da se njeno prirodno okruženje promenilo, ili je supstanca izolovana iz prirodnog okruženja, ili oba. Na primer, neizolovani polinukleotidi ili polipeptidi se prirodno javljaju kod žive životinje in vivo, a identični polinukleotidi ili polipeptidi visoke čistoće izolovani iz takvog prirodnog stanja opisani su kao "izolovani". Pojam "izolovani" ne isključuje smešu sa veštačkim ili sintetskim supstancama, i ne isključuje prisustvo drugih nečistoća koje ne utiču na aktivnost supstance.
[0060] Kako je ovde upotrebljen, pojam "ekspresioni sistem E. coli" se odnosi na ekspresioni sistem koji se sastoji od E. coli (soj) i vektora, pri čemu E. coli (soj) potiče od komercijalno dostupnih sojeva, npr., ali bez ograničenja, GI698, ER2566, BL21(DE3), B834(DE3) i BLR(DE3).
1
[0061] Kako je ovde upotrebljen, pojam "vektor" odnosi se na sredstvo za prenošenje nukleinske kiseline u koje može da se umetne polinukleotid. Kada vektor omogućava ekspresiju proteina kodiranog insertovanim polinukleotidom, vektor se naziva ekspresionim vektorom. Vektor može da se introdukuje u ćeliju-domaćina transformacijom, transdukcijom ili transfekcijom, tako da se komponenta genetske supstance koju vektor nosi eksprimira u ćeliji-domaćinu. Vektori su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući, ali bez ograničenja: plazmid; fagmid; kozmid; veštački hromozom, npr., veštački hromozom kvasca (YAC), bakterijski veštački hromozom (BAC) ili veštački hromozom koji potiče od P1 (PAC); bakteriofag, npr., λ fag ili M13 fag, kao i životinjski virus, i slično. Životinjski virusi koji mogu da se upotrebe kao vektor, uključuju, ali bez ograničenja, retrovirus (uključujući lentivirus), adenovirus, adeno-asocirani virus, herpes virus (npr., herpes simpleks virus), poksvirus, bakulovirus, papiloma virus, papova virus (npr., SV40). Vektor može da sadrži nekoliko komponenata za kontrolu ekspresije, uključujući, ali bez ograničenja, sekvencu promotora, sekvencu za inicijaciju transkripcije, sekvencu pojačivača, selekcionu komponentu i reporterski gen. Osim toga, vektor može da sadrži i mesto za inicijaciju replikacije.
[0062] Kako je ovde upotrebljen, pojam "ćelija-domaćin" se odnosi na ćelije koje mogu da se upotrebe za introdukciju vektora, uključujući, ali bez ograničenja, prokariotske ćelije kao ćelije E. coli ili Bacillus subtilis, ćelije gljiva kao ćelije kvasca ili Aspergillus, insekatske ćelije kao ćelije S2 Drosophila ili Sf9, ili životinjske ćelije kao što je fibroblast, CHO ćelija, COS ćelija, NSO ćelija, HeLa ćelija, BHK ćelija, HEK 293 ćelija ili humana ćelija.
[0063] Kako je ovde upotrebljen, pojam "identičnost" koristi se da opiše podudaranje sekvence između dva polipeptida ili između dve nukleinske kiseline. Kada su odgovarajuće pozicije dve upoređene sekvence zauzete istom bazom ili aminokiselinskom monomernom subjedinicom (na primer, odgovarajuće pozicije u dva DNK molekula su obe zauzete adeninom, ili su obe odgovarajuće pozicije u dva polipeptida zauzete lizinom), molekuli su identični na toj poziciji. "Procenat identičnosti" između dve sekvence zavisi od broja podudarnih pozicija koje dele te dve sekvence podeljenog brojem upoređenih pozicija x 100. Na primer, ako su 6 od 10 pozicija dve sekvence podudarne, te dve sekvence imaju 60% identičnosti. Na primer, DNK sekvence CTGACT i CAGGTT dele 50% identičnosti (podudaraju se 3 od 6 pozicija ukupno). Uopšteno, dve sekvence se porede nakon što se poravnaju tako da se dobije maksimalno podudaranje. Na primer, takvo poravnanje može pogodno da se postigne upotrebom kompjuterskog programa, npr., programa Align (DNAstar, Inc.), metodom prema Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol.48: 443-453. Osim toga, algoritam autora E. Meyers i W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988)) ugrađen u program ALIGN (verzija 2.0) može da se upotrebi za određivanje procenta
1
identičnosti između dve aminokiselinske sekvence, upotrebom tabele PAM120 za težinu rezidue, penala za dužinu praznine od 12 i penala za prazninu od 4. Pored toga, algoritam autora Needleman i Wunsch (J Mol Biol. 48: 444-453 (1970)) ugrađen u program GAP programskog paketa GCG (dostupnog na www.gcg.com) može da se upotrebi za određivanje procenta identičnosti između dve aminokiselinske sekvence, upotrebom matrice Blossum 62 ili matrice PAM250, težine praznine od 16, 14, 12, 10, 8, 6, ili 4 i težine dužine praznine od 1, 2, 3, 4, 5, ili 6.
[0064] Kako je ovde upotrebljen, pojam "konzervativna supstitucija" se odnosi na aminokiselinske supstitucije koje ne utiču nepovoljno ili ne menjaju suštinska svojstva proteina/polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu. Na primer, konzervativne supstitucije mogu da budu uvedene standardnim tehnikama poznatim u ovoj oblasti, kao što je usmerena mutageneza i PCR-posredovana mutageneza. Konzervativne aminokiselinske supstitucije uključuju one kod kojih se aminokiselinska rezidua zamenjuje aminokiselinskom reziduom koja ima sličan bočni lanac, npr., reziduom sličnom odgovarajućoj aminokiselinskoj rezidui u fizičkom smislu ili u smislu funkcionisanja (npr., ima sličnu veličinu, oblik, naelektrisanje, hemijska svojstva, uključujući sposobnost formiranja kovalentne veze ili vodonične veze, ili slično). Familije aminokiselinskih rezidua koje imaju slične bočne lance su definisane u stanju tehnike. Ove familije uključuju aminokiseline koje imaju bazni bočni lanac (npr., lizin, arginin i histidin), kiseli bočni lanac (npr., asparaginsku kiselinu i glutaminsku kiselinu), nenaelektrisani polarni bočni lanac (npr., glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein i triptofan), nepolarni bočni lanac (npr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin i metionin), betagranati bočni lanac (npr., treonin, valin i izoleucin), i aromatični bočni lanac (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan i histidin). Prema tome, poželjno je zameniti odgovarajući aminokiselinsku reziduu drugom aminokiselinskom reziduom iz iste familije bočnih lanaca. Postupci za identifikovanje konzervativnih aminokiselinskih supstitucija su dobro poznati u stanju tehnike (videti, npr., Brummell et al., Biochem., 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng.
12(10): 879-884 (1999); i Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 412-417 (1997)).
[0065] Kako je ovde upotrebljen, pojam "imunogenost" se odnosi na sposobnost stimulisanja organizma da proizvodi specifična antitela ili senzibilizacije limfocita. To se ne odnosi samo na svojstva antigena, koja mogu da stimulišu specifične imune ćelije, na taj način što indukuju aktivaciju, proliferaciju i diferencijaciju imunih ćelija, i na kraju proizvodnju imunoefektorskih supstanci kao što su antitela, i mogu da senzibilizuju limfocite, već se odnosi i na izazivanje specifičnih imunih odgovora imunološkog sistema organizma koji dovode do proizvodnje antitela ili senzibilisanih T limfocita nakon stimulacije organizma antigenom. Imunogenost je
1
najvažnije svojstvo antigena. Mogućnost uspešnog indukovanja imunološkog odgovora kod domaćina zavisi od tri faktora: prirode antigena, reaktivnosti domaćina i načina imunizacije.
[0066] Kako je ovde upotrebljen, pojam "specifično vezivanje" se odnosi na reakciju vezivanja između dva molekula koja nije nasumična, kao što je reakcija između antitela i njegovog ciljnog antigena. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje se specifično vezuje za antigen (ili antitelo specifično za antigen) označava antitelo koje se vezuje za antigen sa afinitetom (KD) manjim od oko10-5 M, npr., manjim od oko 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, ili 10-10 M ili manjim.
[0067] Kako je ovde upotrebljen, pojam "KD" se odnosi na ravnotežnu konstantu disocijacije određene interakcije antitelo-antigen, koja se koristi da opiše afinitet vezivanja između antitela i antigena. Što je ravnotežna konstanta disocijacije manja, to je jače vezivanje antitelo-antigen i veći je afinitet između antitela i antigena. Uopšteno, antitelo (npr., monoklonska antitela 4B3, 13A10, 12B9, ili 4H4 predmetnog pronalaska) vezuju se za antigen (npr., protein L1) sa ravnotežnom konstantom disocijacije (KD) manjom od oko10-5 M, npr., manjom od oko 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, ili 10-10 M ili manjom, npr., utvrđeno upotrebom rezonancije površinskog plazmona (SPR) na instrumentu BIACORE.
[0068] Kako su ovde upotrebljeni, pojmovi "monoklonsko antitelo" i "mAb" imaju isto značenje, i mogu da se koriste kao sinonimi. Takođe, pojmovi "poliklonsko antitelo" i "pAb" imaju isto značenje, i mogu da se koriste kao sinonimi. Ponovo, pojmovi "polipeptid" i "protein" imaju isto značenje, i mogu da se koriste kao sinonimi. Osim toga, u predmetnom pronalasku, aminokiseline su uglavnom predstavljene skraćenicama od jednog slova ili tri slova koje su dobro poznate u stanju tehnike. Na primer, alanin može da bude prikazan kao A ili Ala.
[0069] Kako su ovde upotrebljeni, pojmovi "hibridom" i "ćelijska linija hibridoma" mogu da se koriste kao sinonimi. Osim toga, kada se pominje pojam "hibridom" ili "ćelijska linija hibridoma", on takođe obuhvata subklonove i potomačke ćelije hibridoma. Na primer, kada se pominje ćelijska linija hibridoma 4B3, pojam takođe obuhvata subklonove i potomačke ćelije ćelijske linije hibridoma 4B3.
[0070] Kako je ovde upotrebljen, pojam "farmaceutski prihvatljiv vektor i/ili ekscipijens" se odnosi na vektor i/ili ekscipijens koji su kompatibilni sa subjektom i aktivnom komponentom u farmakološkom i/ili fiziološkom smislu, koji su dobro poznati u stanju tehnike (videti, npr., Remington’s Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995), i uključuju, ali bez ograničenja: agens za podešavanje pH, surfaktant, adjuvans, pojačivač jonskog intenziteta. Na primer, agens za podešavanje pH uključuje, ali bez ograničenja fosfatni pufer; surfaktant uključuje, ali bez ograničenja katjonski,
1
anjonski ili nejonski surfaktant, npr., Tween-80; i pojačivač jonskog intenziteta uključuje, ali bez ograničenja natrijum hlorid.
[0071] Kako je ovde upotrebljen, pojam "adjuvans" se odnosi na nespecifični pojačivač imuniteta, koji može da pojača imuni odgovor organizma na antigen ili da promeni tip imunog odgovora kada se dostavi u organizam zajedno sa antigenom, ili pre njega. Postoje mnogi adjuvansi, uključujući, ali bez ograničenja aluminijumski adjuvans (npr., aluminijum hidroksid), Freundov adjuvans (npr., kompletni Freundov adjuvans i nekompletni Freundov adjuvans), Corynebacterium parvum, lipopolisaharid, citokin, i slično. Freundov adjuvans se za sada najviše koristi u studijama na životinjama, a aluminijum hidroksid se široko koristi u kliničkim eksperimentima.
[0072] Kako je ovde upotrebljen, pojam "efikasna količina" se odnosi na količinu dovoljnu da se postignu, ili bar delimično postignu željena dejstva. Na primer, profilaktički efikasna količina za bolest (npr., bolest povezanu sa prekomernim vezivanjem CTLA4 za B7 ili aktivnost CTLA4, kao što je tumor) odnosi se na količinu dovoljnu da spreči, zaustavi, ili odloži razvoj bolesti (npr., bolesti povezane sa prekomernim vezivanjem CTLA4 za B7 ili aktivnošću CTLA4, kao što je tumor); a terapijski efikasna količina za bolest se odnosi na količinu dovoljnu da izleči ili bar delimično zaustavi bolest i njene komplikacije kod pacijenta koji pati od te bolesti. U okviru znanja stručnjaka u ovoj oblasti je da odrede takvu efikasnu količinu. Na primer, terapijski efikasna količina zavisiće od težine bolesti koja treba da se leči, opšteg statusa imunog sistema pacijenta, opšteg statusa pacijenta, npr., starosti, telesne težine i pola, načina primene agensa, drugih terapija koje se istovremeno primenjuju, i slično.
Povoljni efekti pronalaska
[0073] Monoklonsko antitelo 8D2 i njegova humanizovana antitela predmetnog pronalaska mogu veoma dobro da se specifično vežu za CTLA4. Među njima, antitela 8D2 i 8D2(Re) se vezuju za mišji CTLA4 antigen sa efikasnošću vezivanja boljom od kontrolnih antitela 10D1 (Alan J. Korman, Edward L. Halk, et al., HUMAN CTLA-4 ANTIBODIES, SAD patent br. US 6984720 B1) i 11.2.1 (Douglas Charles Hanson, Mark Joseph Neveu, et al., Human monoclonal antibodies to CTLA-4, SAD patent br. US 682736 B1). Humanizovano antitelo 8D2H1L1 vezuje se za mišji CTLA4 antigen sa efikasnošću vezivanja boljom od kontrolnog antitela 10D1, i uporedivom sa 11.2.1. Humanizovano antitelo 8D2H2L2 vezuje se za humani CTLA4 antigen sa efikasnošću vezivanja uporedivom sa 10D1. Humanizovana antitela 8D2H2L2 i 8D2H3L3 se vezuju za majmunski CTLA4 antigen sa efikasnošću vezivanja uporedivom sa 10D1. Antitela
1
8D2H2L15 i 8D2H2L17 se vezuju za humani CTLA4 antigen sa efikasnošću vezivanja boljom od kontrolnih antitela 10D1 i 11.2.1.
[0074] Antitela 8D2, 8D2(Re), i humanizovana antitela 8D2 - 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 i 8D2H2L17 mogu da kompetiraju sa B7 za vezivanje sa antigenom CTLA4. Među njima, 8D2, 8D2(Re), 8D2H1L1 i 8D2H2L2 su jača od 10D1 u kompeticiji sa B7-2 za vezivanje za CTLA4; a 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 i 8D2H2L17 su sva jača od antitela 10D1 i 11.2.1 u kompeticiji sa B7-1 i B7-2 za vezivanje za CTLA4.
[0075] Monoklonsko antitelo 8D2 i njegova humanizovana antitela predmetnog pronalaska mogu da blokiraju vezivanje CLTA4 za B7, specifično ublaže imunosupresivno dejstvo CTLA4 na organizam, i aktiviraju T limfocite veoma efikasno. Među njima, 8D2H2L2 i 8D2H2L15 imaju jače dejstvo od kontrolnih antitela 10D1 i 11.2.1 u aktiviranju T limfocita.
Kratak opis crteža
[0076]
Slika 1. Rezultati SDS-PAGE analize fuzionog proteina CTLA4ECD-mFc. Uzorci i količine u kojima su naneti u 4 kolone, sa leva na desno, bili su: M, Marker, 10 µL; fuzioni protein CTLA4ECD-mFc, 1 µg; fuzioni protein CTLA4ECD-mFc, 2 µg; fuzioni protein CTLA4ECD-mFc, 3 µg.
Slika 2. Rezultati SDS-PAGE analize antitela 8D2. Uzorci i količine u kojima su naneti u 4 kolone, sa leva na desno, bili su: M, marker, 10 µL; uzorak antitela u redukujućem puferu za nalivanje za elektroforezu proteina, 0.3 µg; neredukujući pufer za nalivanje za elektroforezu proteina, 2 µL; uzorak antitela u neredukujućem puferu za nalivanje za elektroforezu proteina, 0.3 µg.
Slika 3. Rezultati SDS-PAGE analize rekombinantnog antitela 8D2 (8D2(Re)). Uzorci i količine u kojima su naneti u 4 kolone, sa leva na desno, bili su: M, marker, 10 µL; uzorak antitela u redukujućem puferu za nalivanje za elektroforezu proteina, 1 µg; neredukujući pufer za nalivanje za elektroforezu proteina, 2 µL; uzorak antitela u neredukujućem puferu za nalivanje za elektroforezu proteina, 1 µg.
Slika 4. Rezultati SDS-PAGE analize humanizovanog antitela 8D2, 8D2H1L1. Uzorci i količine u kojima su naneti u 4 kolone, sa leva na desno, bili su: M, marker, 10 µL; uzorak antitela u redukujućem puferu za nalivanje za elektroforezu proteina, 1 µg; neredukujući pufer za nalivanje za elektroforezu proteina, 2 µL; uzorak antitela u neredukujućem puferu za nalivanje za elektroforezu proteina, 1 µg.
2
Slika 5. Rezultati SDS-PAGE analize humanizovanog antitela 8D2, 8D2H2L2. Uzorci i količine u kojima su naneti u 4 kolone, sa leva na desno, bili su: M, marker, 10 µL; uzorak antitela u redukujućem puferu za nalivanje za elektroforezu proteina, 1 µg; neredukujući pufer za nalivanje za elektroforezu proteina, 2 µL; uzorak antitela u neredukujućem puferu za nalivanje za elektroforezu proteina, 1 µg.
Slika 6. Rezultati SDS-PAGE analize humanizovanog antitela 8D2, 8D2H3L3. Uzorci i količine u kojima su naneti u 4 kolone, sa leva na desno, bili su: M, marker, 10 µL; uzorak antitela u redukujućem puferu za nalivanje za elektroforezu proteina, 1 µg; neredukujući pufer za nalivanje za elektroforezu proteina, 2 µL; uzorak antitela u neredukujućem puferu za nalivanje za elektroforezu proteina, 1 µg.
Slika 7. Rezultati SDS-PAGE analize humanizovanog antitela 8D2, 8D2H2L15. Uzorci i količine u kojima su naneti bili su: M, marker, 10 µL; uzorak antitela u neredukujućem puferu za nalivanje za elektroforezu proteina, 1 µg; uzorak antitela u redukujućem puferu za nalivanje za elektroforezu proteina, 1 µg.
Slika 8. Rezultati SDS-PAGE analize humanizovanog antitela 8D2, 8D2H2L17. Uzorci i količine u kojima su naneti bili su: M, marker, 10 µL; uzorak antitela u neredukujućem puferu za nalivanje za elektroforezu proteina, 1 µg; uzorak antitela u redukujućem puferu za nalivanje za elektroforezu proteina, 1 µg.
Slika 9. Rezultati određivanja dinamičkih karakteristika parametara mAb 8D2.
Slika 10. Rezultati određivanja dinamičkih karakteristika parametara 8D2H1L1.
Slika 11. Rezultati određivanja dinamičkih karakteristika parametara 8D2H2L2.
Slika 12. Rezultati određivanja dinamičkih karakteristika parametara 8D2H3L3.
Slika 13. Rezultati određivanja dinamičkih karakteristika parametara 8D2H2L15.
Slika 14. Rezultati određivanja dinamičkih karakteristika parametara 8D2H2L17.
Slika 15. Histogram koji prikazuje ekspresiju CTLA4 na neobeleženim ćelijama 293F, izotipska kontrola, i ćelijama 293FCTLA4 utvrđeno protočnom citometrijom (broj ćelija -fluorescencija (FITC)).
Slika 16. Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) ekspresije CTLA4 na neobeleženim ćelijama 293F, izotipska kontrola, i ćelijama 293F-CTLA4 utvrđeno protočnom citometrijom.
Slika 17. Rezultati EC50vezivanja mAb 8D2 za obeležene ćelije 293F-CTLA4.
Slika 18. Rezultati EC50vezivanja antitela 8D2(Re) za obeležene ćelije 293F-CTLA4.
Slika 19. Rezultati EC50vezivanja 8D2H1L1 za obeležene ćelije 293F-CTLA4.
Slika 20. Rezultati EC50vezivanja 8D2H2L2 za obeležene ćelije 293F-CTLA4.
Slika 21. Rezultati EC50vezivanja 8D2H3L3 za obeležene ćelije 293F-CTLA4.
Slika 22. Određivanje vezivanja antitela 8D2, 8D2H1L1 i 8D2(Re) za CTLA4 upotrebom ELISA testa.
Slika 23. Određivanje vezivanja rekombinantnih antitela 8D2H2L2 i 8D2H3L3 za humani CTLA4 upotrebom ELISA testa.
Slika 24. Određivanje vezivanja rekombinantnih antitela 8D2H2L2 i 8D2H3L3 za majmunski CTLA4 upotrebom ELISA testa.
Slika 25. Određivanje vezivanja rekombinantnih antitela 8D2H2L15 i 8D2H2L17 za majmunski CTLA4 upotrebom ELISA testa.
Slika 26. Rezultati ELISA testa za kompeticiju antitela 8D2, 8D2H1L1 i 8D2(Re) sa B7-1.
Slika 27. Rezultati ELISA testa za kompeticiju antitela 8D2, 8D2H1L1 i 8D2(Re) sa B7-2.
Slika 28. Rezultati ELISA testa za kompeticiju 8D2H2L2 i 8D2H3L3 antitela sa B7-1.
Slika 29. Rezultati ELISA testa za kompeticiju 8D2H2L2 i 8D2H3L3 antitela sa B7-2.
Slika 30. Rezultati ELISA testa za kompeticiju 8D2H2L15 i 8D2H2L17 antitela sa B7-1.
Slika 31. Rezultati ELISA testa za kompeticiju 8D2H2L15 i 8D2H2L17 antitela sa B7-2.
Slika 32. Dejstva na nivo sekrecije IL-2 T limfocita utvrđena ELISA testom posle kokultivacije tokom 72 časa sa mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC), Raji ćelijama i humanizovanim antitelima 8D2H1L1, 8D2H2L2 ili 8D2H3L3, redom. Rezultati pokazuju da humanizovana antitela mAb 8D2 povećavaju sekreciju IL-2 T limfocita blokiranjem receptora CTLA4.
Slika 33. Dejstva na nivo sekrecije IL-2 T limfocita utvrđena ELISA testom posle kokultivacije tokom 72 časa sa mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC), Raji ćelijama i humanizovanim antitelima 8D2H2L15 ili 8D2H2L17, redom. Rezultati pokazuju da humanizovana antitela mAb 8D2 povećavaju sekreciju IL-2 T limfocita blokiranjem receptora CTLA4.
Slika 34. Kriva rasta subkutano transplantiranog tumora u hu-SCID-raji modelu tretiranom sa 8D2H2L2.
Specifični primeri izvođenja
[0077] Primeri izvođenja prema pronalasku će u nastavku teksta biti detaljno opisani uz pozivanje na primere. Stručnjaci u oblasti će razumeti da su primeri koji slede dati kao ilustracija pronalaska. Primeri, kod kojih nisu opisane specifične tehnike ili uslovi, izvedeni su primenom tehnika ili uslova upisanih u literaturi stanja tehnike (npr., napisao J. Sambrook et al., preveo Peitang HUANG et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Science Press) ili prema instrukcijama koje prate proizvode. Reagensi i instrumenti, za koje dobavljač nije naznačen, su konvencionalni proizvodi koji su komercijalno dostupni.
[0078] U sledećim primerima prema pronalasku, miševi BALB/C su nabavljeni od Guangdong Medical Laboratory Animal Center.
[0079] U sledećim primerima prema pronalasku, korišćene T ćelije su dobijene od Akeso Biopharma Inc., Zhongshan.
[0080] Kontrolno antitelo, 10D1, pripremljeno je prema SAD patentu br. 6984720 B1; a 11.2.1 prema US 6682736 B1.
Primer 1. Generisanje CTLA4-8D2 ćelijske linije hibridoma LT001 i priprema monoklonskog antitela 8D2
[0081] Rekombinantni CTLA4 je eksprimiran u ekspresionom sistemu sisarskih ćelija za imunizaciju miševa kao antigen, i ćelije hibridoma su dobijene fuzionisanjem ćelija slezine miša sa ćelijama mijeloma. Ćelijska linija hibridoma (CTLA4-8D2 ćelijska linija hibridoma LT001) dobijena je nakon skrininga velikog broja uzoraka. Navedena ćelijska linija mogla je da sekretuje monoklonsko antitelo 8D2, koje se specifično vezuje za CTLA4. Specifični postupci su opisani u nastavku teksta.
1. Sinteza gena CTLA4ECD-mFc
[0082] Prema dizajnu (SEQ ID NO: 3), aminokiselinska sekvenca (SEQ ID NO: 2) koja odgovara regionu gena CTLA4 koji kodira ekstracelularni fragment (antigen 4 povezan sa citotoksičnim T-limfocitima, NCBI Gene ID: 1493, SEQ ID NO: 1) (CTLA4ECD) fuzionisana
2
je sa fragmentom Fc proteina mišjeg IgG (mFc), pri čemu se mFc odnosi na fragment Fc proteina mišjeg IgG sa aminokiselinskom sekvencom kao što je prikazano podvučenim delom sekvence SEQ ID NO: 3.
[0083] U cilju povećanja efikasnosti ekspresije gena od interesa u ekspresionom sistemu ćelija 293f, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira proteinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 optimizovana je u Genscript Co., uglavnom uzimajući u obzir faktore kao što su preferencija kodona, sadržaj GC, sekundarne strukture iRNK i ponovljene sekvence. Finalno optimizovani gen koji kodira fuzioni protein CTLA4ECD-mFc ima sledeću sekvencu (SEQ ID NO: 4), i sintetisan je u Genscript Co.
[0084] Sekvenca gena CTLA4ECD (375 bp):
[0085] Proteinska sekvenca koju kodira CTLA4ECD (125 ak):
[0086] Sekvenca fuzionog proteina CTLA4ECD-mFc (364 ak):
u kojoj je deo koji predstavlja CTLA4ECD podvučen talasastom linijom, a deo koji predstavlja mFc podvučen punom linijom.
[0087] Kodirajuća sekvenca gena koja odgovara fuzionom proteinu CTLA4ECD-mFc (1092 bp): u kojoj je deo CTLA4ECD podvučen talasastom linijom, a deo mFc deo je podvučen punom linijom.
2
2. Generisanje plazmida pUC57simple-CTLA4ECD-mFc
[0088] Sintetisani fuzioni gen CTLA4ECD-mFc (SEQ ID NO: 4) kloniran je u ekspresioni vektor pUC57simple (koji je obezbedila kompanija Genscript Co.) u Genscript Co., što je rezultovalo plazmidom pUC57simple-CTLA4ECD-mFc.
3. Konstruisanje rekombinantnog plazmida pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc
2
[0089] Plazmid pUC57simple-CTLA4ECD-mFc je digestiran endonukleazama Xba I i BamH I. Fragment fuzionog gena CTLA4ECD-mFc je izdvojen elektroforezom i ligiran u ekspresioni vektor pcDNA3.1 (nabavljen kod Invitrogen Co.). Rezultujući plazmid pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc je upotrebljen za transfekciju kompetentnih ćelija E. coli soja DH5a (nabavljen kod TIANGEN Co.). Transfekcija i kultivacija su obavljene prema uputstvima. Kolonije E. coli pozitivne na pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc su izdvojene skriningom i umnožavane uobičajenim postupcima. Zatim je rekombinantni plazmid pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc ekstrahovan upotrebom kompleta (nabavljen kod Tiangen Biotech (Beijing) Co. LTD, DP103-03) prema uputstvima iz kompleta.
[0090] 4. Ćelije 293F (nabavljene kod Invitrogen Co.) su transficirane rekombinantnim plazmidom pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc upotrebom kompleta za transfekciju Lipofectamin (nabavljen kod Invitrogen Co.).
[0091] 5. Sedam dana posle transfekcije ćelija 293F rekombinantnim plazmidom pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc, fuzioni protein CTLA4ECD-mFc je prečišćen iz tečnosti kulture centrifugiranjem na velikoj brzini, vakuumskom filtracijom kroz mikroporoznu membranu filtera, i HiTrap protein A HP hromatografijom na koloni. Posle prečišćavanja, uzeti su uzorci, dodati u redukujući pufer za nalivanje za elektroforezu proteina, i ispitani SDS-PAGE elektroforezom. Kao što je prikazano na slici 1, protein od interesa vidi se kao traka na oko 45 kD.
6. Generisanje CTLA4-8D2 ćelijske linije hibridoma LT001
[0092] Upotrebom fuzionog proteina CTLA4ECD-mFc kao antigena, ćelije hibridoma su dobijene fuzijom ćelija slezine imunizovanih miševa BALB/C (nabavljeni u Guangdong Medical Laboratory Animal Center) sa mišjim ćelijama mijeloma prema ustaljenom postupku (npr., Stewart, S. J., "Monoclonal Antibody Production", u Basic Methods in antibody Production and Characterization, Eds. G. C. Howard and D. R. Bethell, Boca Raton: CRC Press, 2000).
[0093] CTLA4 je upotrebljen kao antigen za oblaganje ELISA ploče, i ćelije hibridoma koje sekretuju nova antitela koja se specifično vezuju za CTLA4 dobijene su pomoću indirektnog ELISA skrininga. Ćelijske linije hibridoma koje sekretuju monoklonska antitela koja kompetiraju sa ligandom B7-1 (CD80, NCBI ID gena: 941) ili B7-2 (CD86, NCBI ID gena: 942) za vezivanje za CTLA4 dobijene su kompetetivnim ELISA skriningom iz ćelija hibridoma dobijenih indirektnim ELISA skriningom. Stabilna ćelijska linija hibridoma dobijena je metodom graničnog razblaženja. Ćelijska linija hibridoma označena je kao CTLA4-8D2 ćelijska linija hibridoma, a CTLA4-8D2 stabilna ćelijska linija dobijena je metodom graničnog
2
razblaženja (takođe označena kao LT001 u predmetnom pronalasku; monoklonsko antitelo koje ona sekretuje označeno je kao 8D2).
7. Priprema antitela 8G2
[0094] Ćelijska linija predmetnog pronalaska CTLA4-8D2 (LT001) kultivisana je u medijumu obogaćenom sa 10% fetalnog goveđeg seruma sa niskim IgG. Sedam dana kasnije, sakupljen je supernatant ćelijske kulture kako bi se prečistilo antitelo 8D2.
8. Detekcija antitela 8D2 metodom SDS-PAGE
[0095] Prečišćeni uzorci su dodati u redukujući pufer za nalivanje za elektroforezu proteina i neredukujući pufer za nalivanje za elektroforezu proteina. Posle kuvanja, sprovedena je detekcija. Rezultati pokazuju da se protein od interesa prikazuje kao dve trake na oko 50 kD i 25 kD za redukujući uzorak proteina, ili kao traka na oko 150 kD za neredukujući uzorak proteina (slika 2).
Primer 2. Određivanje sekvence lakog lanca i teškog lanca monoklonskog antitela 8D2
[0096] Prema uputstvima iz kompleta za ekstrakciju ukupne RNK iz kultivisanih ćelija/bakterija Cultured Cell/Bacteria Total RNA Extraction Kit (Tiangen, kat. br. DP430), ekstrahovana je iRNK iz ćelijske linije hibridoma CTLA4-8D2 (LT001 ćelija) dobijene u primeru 1.
[0097] Prema uputstvima iz kompleta za RT-PCR sistem za sintezu prvog lanca Invitrogen SuperScript® III, sintetisana je cDNK i amplifikovana pomoću PCR tehnike. Proizvod PCR amplifikacije je odmah podvrgnut TA-kloniranju, prema uputstvima iz kompleta pEASY-T1 Cloning Kit (TransGen, kat. br. CT101). Proizvod TA-kloniranja je odmah podvrgnut sekvenciranju, i rezultati sekvenciranja su dati u nastavku teksta.
[0098] Rezultati sekvenciranja DNK varijabilnog regiona teškog lanca (345 bp):
2
[0099] Proteinska sekvenca koju ona kodira (115 ak):
[0100] Rezultati sekvenciranja DNK varijabilnog regiona lakog lanca (318 bp):
[0101] Proteinska sekvenca koju ona kodira (106 ak):
Primer 3. Dizajn sekvenci lakog lanca i teškog lanca humanizovanih antitela 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 i 8D2H2L17
[0102] Na osnovu trodimenzionalne kristalne strukture proteina CTLA4 (Nat. Struct. Biol. (1997) 4, p.527) i sekvence antitela 8D2 dobijene u primeru 2, struktura antitela je kompjuterski modelovana. Sekvence varijabilnog regiona antitela 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 i 8D2H2L17 su dizajnirane na osnovu sekvence antitela i strukturnog modela (sekvence konstantnog regiona antitela poticale su iz baze podataka NCBI). Sekvence varijabilnog regiona date su u nastavku teksta.
1. Sekvence lakog lanca i teškog lanca monoklonskog antitela 8D2H1L1
[0103] DNK sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca (345 bp):
2
[0104] Proteinska sekvenca koju ona kodira (115 ak):
[0105] DNK sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca (321 bp):
[0106] Proteinska sekvenca koju ona kodira (107 ak):
2. Sekvence lakog lanca i teškog lanca humanizovanog monoklonskog antitela 8D2, 8D2H2L2
[0107] DNK sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca (345 bp):
[0108] Proteinska sekvenca koju ona kodira (115 ak):
[0109] DNK sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca (321 bp):
[0110] Proteinska sekvenca koju ona kodira (107 ak):
3. Sekvence lakog lanca i teškog lanca humanizovanog monoklonskog antitela 8D2, 8D2H3L3
[0111] DNK sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca (345 bp):
1
[0112] Proteinska sekvenca koju ona kodira (115 ak):
[0113] DNK sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca (321 bp):
[0114] Proteinska sekvenca koju ona kodira (107 ak):
4. Sekvence lakog lanca i teškog lanca humanizovanog monoklonskog antitela 8D2, 8D2H2L15
[0115] DNK sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca (345 bp):
2
[0116] Proteinska sekvenca koju ona kodira (115 ak):
[0117] DNK sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca (321 bp):
[0118] Proteinska sekvenca koju ona kodira (107 ak):
5. Sekvence lakog lanca i teškog lanca humanizovanog monoklonskog antitela 8D2, 8D2H2L17
[0119] DNK sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca (345 bp):
[0120] Proteinska sekvenca koju ona kodira (115 ak):
[0121] DNK sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca (321 bp):
[0122] Proteinska sekvenca koju ona kodira (107 ak):
4
Primer 4. Priprema rekombinantnog antitela 8D2, 8D2(Re) i humanizovanih antitela 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L3, 8D2H3L3, 8D2H2L15 i 8D2H2L17 i detekcija metodom SDS-PAGE
1. Priprema rekombinantnog antitela 8D2, 8D2(Re) i detekcija metodom SDS-PAGE
[0123] cDNK sekvenca teškog lanca (sekvenca njenog varijabilnog regiona prikazana je u SEQ ID NO: 5) i cDNK sekvenca lakog lanca (sekvenca njenog varijabilnog regiona prikazana je u SEQ ID NO: 7) 8D2 klonirane su u vektor pUC57simple (koji je obezbedio Genscript Co.), redom, čime su dobijeni plazmidi pUC57simple-8D2H i pUC57simple-8D2L.
[0124] Plazmidi pUC57simple-8D2H i pUC57simple-8D2L su podvrgnuti digestiji endonukleazama (Hind III, odnosno EcoR I). Fragmenti koji kodiraju teški lanac i laki lanac koji su izdvojeni elektroforezom odvojeno su subklonirani u vektor pcDNA3.1. Rekombinantni plazmidi su ekstrahovani i ko-transficirani u ćelije 293F. Posle 7 dana gajenja ćelija, tečnost kulture je podvrgnuta centrifugiranju na velikoj brzini, vakuumskoj filtraciji kroz mikroporoznu membranu filtera, i HiTrap protein A HP hromatografiji na koloni. Prečišćeni uzorci su dodati u redukujući pufer za nalivanje za elektroforezu proteina i neredukujući pufer za nalivanje za elektroforezu proteina. Posle kuvanja, detekcija je obavljena metodom SDS-PAGE. Kao što je prikazano na slici 3, protein od interesa se vidi kao dve trake na oko 50 kD i 25 kD za redukujući uzorak proteina, ili kao traka na oko 150 kD za neredukujući uzorak proteina.
2. Priprema humanizovanih antitela 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L2 i 8D2H3L3 i detekcija metodom SDS-PAGE
[0125] cDNK sekvence teškog lanca (sekvence njihovog varijabilnog regiona prikazane su u SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 13, redom), i cDNK sekvence lakog lanca (sekvence njihovog varijabilnog regiona prikazane su u SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, redom) 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 i 8D2H2L17 klonirane su u vektor pUC57simple vektor (koji je obezbedio Genscript Co.), redom, čime su dobijeni plazmidi pUC57simple-8D2H1L1, pUC57simple-8D2H2L2, pUC57simple-8D2H3L3, pUC57simple-8D2H2L15, i pUC57simple-8D2H2L17. Oni su odvojeno subklonirani u vektor pcDNA3.1 prema proceduri koja je gore opisana za 8D2(Re).
[0126] Rekombinantni plazmidi su transficirani u ćelije 293F. Tečnost kulture ćelija 293F podvrgnuta je detekciji posle prečišćavanja prema proceduri koja je gore opisana za 8D2(Re). Rezultati su prikazani na slici 4, slici 5, slici 6, slici 7 i slici 8. Redukujući uzorci proteina pokazali su proteine od interesa kao dve trake na oko 50 kD i 25 kD, a neredukujući uzorci proteina pokazali su proteine od interesa kao traku na oko 150 kD.
[0127] Rekombinantno antitelo 8D2, 8D2(Re), i humanizovana antitela 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L3, 8D2H3L3, 8D2H2L15 i 8D2H2L17 upotrebljena u sledećim primerima pripremljena su prema proceduri koja je opisana u ovom primeru.
Primer 5. Određivanje dinamičkih parametara antitela
[0128] Dinamički parametri vezivanja antitela 8D2 i humanizovanih 8D2H1L1, 8D2H2L2 i 8D2H3L3 za antigen CTLA4 (NCBI Gene ID: 1493, sa kodirajućom sekvencom nukleinske kiseline kao što je prikazano u SEQ ID NO: 25 i kodiranom aminokiselinskom sekvencom kao što je prikazano u SEQ ID NO: 26) određeni su upotrebom analizatora molekulskih interakcija Fortebio.
1. Protein CTLA4-mFc (CTLA4-mFc je generisan istim postupkom kao onaj koji je opisan u primeru 1 za sintezu CTLA4ECD-mFc) je podvrgnut cepanju proteazom TEV, i antigen CTLA4 je dobijen prečišćavanjem na koloni.
Sekvenca gena CTLA4 (636 bp):
Odgovarajuća kodirana aminokiselinska sekvenca (212 ak):
2. Antitelo 8D2 i njegova humanizovana antitela 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 i 8D2H2L17 su imobilizovana na površini senzora AR2G aminokuplovanjem i blokirana etanolaminom. Posle ekvilibracije u PBST, dodat je antigen CTLA4 za vezivanje. CTLA4 je serijski 2x razblažen u PBST, i dobijene su sledeće koncentracije: 300, 150, 75, 37.5, 18.75, 9.38, 4.69, 0 nM. Došlo je do disocijacije u PBST. Humanizovana antitela 8D2H1L1, H2L2, H3L3, H2L15 i H2L17 su detektovana istom metodom kao 8D2, i koncentracije antigena bile su 180, 90, 45, 22.5, 11.25, 5.625, 2.813, 0 nM.
[0129] Dinamički parametri antitela 8D2 i njegovih humanizovanih antitela 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 i 8D2H2L17 dati su u tabeli 1, a rezultati određivanja dinamičkih karakteristika parametara prikazani su na slikama 9 do 14, redom.
Tabela 1. Dinamički parametri antitela 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 i 8D2H2L17
[0130] Rezultati pokazuju da svih šest antitela imaju dobar afinitet za antigen, koji je uporediv ili čak bolji od kontrolnih antitela 10D1 i 11.2.1.
Primer 6. Određivanje aktivnosti antitela za vezivanje za antigen CTLA4 na površini ćelijske linije hibridoma protočnom citometrijom
[0131] Prvo, generisane su ćelije-domaćini 293F koje eksprimiraju CTLA4 antigen i obeležene monoklonskim antitelom 8D2 (primer 1) i 8D2(Re) i humanizovanim antitelima 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L2 i 8D2H3L3 (primer 4) pripremljenim u predmetnom pronalasku, redom. Zatim, protočnom citometrijom je potvrđena sposobnost antitela da se specifično vežu za antigen na površini ćelija koji ima nativnu konformaciju.
[0132] Specifični koraci dati su u nastavku teksta.
1. Generisanje ćelija-domaćina 293F koje eksprimiraju antigen CTLA4
[0133] Ćelije 293F su transficirane plazmidom pLenti6.3-CTLA4 za CTLA4 (vektor pLenti6.3 je nabavljen kod Invitrogen Co.) upotrebom kompleta za transfekciju Lipofectamin (nabavljen kod Invitrogen Co.). Posle skrininga, dobijena je klonalna populacija ćelija koje stabilno eksprimiraju CTLA4 (293F-CTLA4).
2. Obeležavanje antitelima i detekcija upotrebom protočnog citometra
[0134] Ćelije-domaćini 293F koje eksprimiraju antigen CTLA4 dobijene gore navedenim koracima podvrgnute su digestiji tripsinom prema uobičajenom postupku, i u svaku epruvetu za sakupljanje ćelija dodato je 2 x 10<5>ćelija. Pripremljeni su razblaženi rastvori antitela 8D2 u PBS koji sadrži 1% BSA da bi se postigle koncentracije od 20 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 0.1 nM, 0.01 nM, i 0 nM, redom. Posle inkubacije sa ćelijama 293F koje eksprimiraju CTLA4 na ledu tokom 2 časa, u svaku epruvetu dodato je 100 µL FITC-kozjeg-anti-mišjeg IgG (1:500), i epruvete su inkubirane na ledu 1 čas. Posle dodavanja 300 µL PBS, detektovan je fluorescentni signal upotrebom FITC kanala na protočnom citometru. Ostala antitela su detektovana na sličan način kao antitelo 8D2.
3. Rezultati
[0135] Rezultati koji potvrđuju ekspresiju CTLA4 na 293F-CTLA4 ćelijama prikazani su na slici 15 i slici 16, redom. Rezultati vezivanja antitela 8D2, 8D2(Re), i tri humanizovana antitela za ćelije 293F prikazani su na slikama 17 do 21, redom. Kao što je prikazano na slikama, antitelo 8D2 i njegova humanizovana antitela mogu efikasno da se vežu za ciljni protein CTLA4 na površini ćelija-domaćina 293F, i efikasnost njihovog vezivanja zavisi od doze. Intenziteti fluorescencije pri svakoj dozi dati su u tabeli 2.
[0136] Efikasnost vezivanja, EC50, antitela 8D2 i njegovih humanizovanih antitela je dobijena simulacijom krive u fluorescentnoj kvantitativnoj analizi vezanih antitela 8D2 i njegovih humanizovanih antitela, što je prikazano u tabeli 3.
Tabela 2. Analiza intenziteta fluorescencije koja određuje vezivanje 8D2, 8D2(Re) i humanizovanih antitela 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L2 i 8D2H3L3 za antigen CTLA4 na površini ćelija-domaćina 293F-CTLA4 protočnom citometrijom
Tabela 3. Efikasnost vezivanja, EC50, 8D2, 8D2(Re) i humanizovanih antitela 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L2 i 8D2H3L3 za antigen CTLA4 na površini ćelija-domaćina 293F-CTLA4 dobijen simulacijom krive u analizi protočnom citometrijom
[0137] Rezultati pokazuju da antitela 8D2, 8D2(Re) i humanizovana antitela 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L2 i 8D2H3L3 sva imaju vrlo jaku sposobnost vezivanja za antigen CTLA4 na površini ćelija-domaćina 293F-CTLA4.
Primer 7. Određivanje aktivnosti antitela u vezivanju za antigen CTLA4 pomoću ELISA testa
[0138] Ploča za ELISA test je obložena sa CTLA4 na 4 °C preko noći. Posle blokiranja sa 1% BSA na 37 °C tokom 2 h, dodata su anti-CTLA4 antitela 8D2, 8D2(Re) i humanizovana antitela 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 i 8D2H2L17, i kontrolna antitela 10D1 (Alan J. Korman, Edward L. Halk, et al., HUMAN CTLA-4 ANTIBODIES, SAD patent br. US 6984720 B1) i 11.2.1 (Douglas Charles Hanson, Mark Joseph Neveu, et al., Human monoclonal antibodies to CTLA-4, SAD patent br. US 682736 B1) za reakciju tokom 30 min. Dodato je sekundarno antitelo konjugovano sa enzimom za inkubaciju tokom 30 min. Zatim, određena je apsorbanca na 450 nm pomoću čitača ploča za ELISA test.
[0139] Rezultati detektovanja vezivanja antitela 8D2 i njegovih humanizovanih antitela za antigen CTLA4 prikazani su na slikama 22 do 25, redom. Kao što je prikazano na slikama, antitela 8D2, 8D2(Re) i humanizovana antitela 8D2, sva mogu efikasno da se vežu za protein CTLA4, i efikasnost njihovog vezivanja je dozno-zavisna. Intenziteti fluorescencije pri svakoj dozi dati su u tabelama 4 do 8. Efikasnost vezivanja, EC50, 8D2, 8D2(Re) i humanizovanih antitela je dobijena simulacijom krive u fluorescentnoj kvantitativnoj analizi vezanog antitela 8D2, 8D2(Re) i humanizovanih antitela (Tabela 9).
Tabela 4. Vezivanje 8D2 i 8D2(Re) za mišji CTLA4 (ELISA)
Tabela 5. Vezivanje 8D2, 8D2H1L1 i 8D2(Re) za humani CTLA4 (ELISA)
4
Tabela 6. Vezivanje 8D2H2L2 i 8D2H3L3 za humani CTLA4 (ELISA)
Tabela 7. Vezivanje 8D2H2L2 i 8D2H3L3 za majmunski CTLA4 (ELISA)
Tabela 8. Vezivanje 8D2H2L15 i 8D2H2L17 za humani CTLA4 (ELISA)
Tabela 9: Efikasnost vezivanja, EC50, 8D2, 8D2(Re) i humanizovanih antitela 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 i 8D2H2L17 za antigen CTLA4 dobijena simulacijom krive u analizi pomoću ELISA testa
[0140] Gore navedeni rezultati pokazuju da se antitela 8D2 i 8D2(Re) vezuju za mišji antigen CTLA4 sa efikasnošću boljom nego što je ona kod kontrolnih antitela 10D1 i 11.2.1.
Humanizovano antitelo 8D2H1L1 se vezuje za mišji antigen CTLA4 sa efikasnošću koja prevazilazi efikasnost kontrolnog antitela 10D1 i koja je uporediva sa efikasnošću antitela 11.2.1.
[0141] Humanizovano antitelo 8D2H2L2 se vezuje za humani antigen CTLA4 sa efikasnošću uporedivom sa onom kod 10D1. Humanizovana antitela 8D2H2L2 i 8D2H3L3 se vezuju za majmunski antigen CTLA4 sa efikasnošću uporedivom sa onom kod 10D1. Humanizovano antitelo 8D2H2L15 i 8D2H2L17 se vezuju za humani antigen CTLA4 sa efikasnošću koja značajno prevazilazi efikasnost kontrolnih antitela 10D1 i 11.2.1.
Primer 8. Detekcija aktivnosti antitela u kompeticiji sa B7-1/2 za vezivanje za antigen CTLA4 kompetetivnim ELISA testom
1. Detekcija aktivnosti antitela u kompeticiji sa B7-1 za vezivanje za antigen CTLA4 pomoću ELISA testa
[0142] Ploče za ELISA test su obložene sa B7-1 na 4 °C preko noći. Posle blokiranja sa 1% BSA na 37 °C tokom 2 h, dodata su anti-CTLA4 antitela, tj., monoklonska antitela 8D2 i 8D2(Re) i humanizovana antitela 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 i 8D2H2L17, kao i kontrolna antitela 10D1 i 11.2.1. Posle inkubacije od 10 minuta, dodat je CTLA4-mFc. Posle inkubacije na 37 °C tokom 40 minuta, dodato je sekundarno antitelo konjugovano sa enzimom. Posle inkubacije na 37 °C tokom 30 minuta, detektovana je apsorbanca na 450 nm na čitaču ploča za ELISA test.
2. Detekcija aktivnosti antitela u kompeticiji sa B7-2 za vezivanje za antigen CTLA4 pomoću ELISA testa
[0143] Ploče za ELISA test su obložene sa CTLA4-mFc na 4 °C preko noći. Posle blokiranja sa 1% BSA na 37 °C tokom 2 h, dodata su anti-CTLA4 antitela, tj., monoklonska antitela 8D2 i 8D2(Re) i humanizovana antitela 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 i 8D2H2L17, kao i kontrolna antitela 10D1 i 11.2.1. Posle inkubacije od 10 minuta, dodat je B7-2-his. Posle inkubacije na 37 °C tokom 40 minuta, dodato je sekundarno antitelo konjugovano sa enzimom. Posle inkubacije na 37 °C tokom 30 minuta, detektovana je apsorbanca na 450 nm na čitaču ploča za ELISA test. Rezultati detekcije vezivanja 8D2, 8D2(Re) i humanizovanih antitela za antigen CTLA4 prikazani su na slikama 26 do 31, redom. Kao što je prikazano na slikama, antitela 8D2, 8D2(Re) i humanizovana antitela 8D2, mogu efikasno da se vežu za protein CTLA, i efikasnost njihovog vezivanja je dozno-zavisna. Intenziteti fluorescencije pri svakoj dozi dati su u tabelama 10 do 16. Efikasnost vezivanja, EC50, 8D2, 8D2(Re) i humanizovanih antitela
4
dobijena je simulacijom krive u fluorescentnoj kvantitativnoj analizi vezanih antitela 8D2, 8D2(Re) i humanizovanih antitela (Tabela 17).
Tabela 10.8D2 i 8D2(Re) kompetiraju sa B7-1 u ELISA testu
Tabela 11.8D2, 8D2H1L1 i 8D2(Re) kompetiraju sa B7-1 u ELISA testu
Tabela 12.8D2, 8D2H1L1 i 8D2(Re) kompetiraju sa B7-2 u ELISA testu
Tabela 13. Antitela 8D2H2L2 i 8D2H3L3 kompetiraju sa B7-1 u ELISA testu
Tabela 14. Antitela 8D2H2L2 i 8D2H3L3 kompetiraju sa B7-2 za vezivanje za CTLA4 u ELISA testu
4
Tabela 15. Antitela 8D2H2L15 i 8D2H2L17 kompetiraju sa B7-1 za vezivanje za CTLA4 u ELISA testu
Tabela 16. Antitela 8D2H2L15 i 8D2H2L17 kompetiraju sa B7-2 za vezivanje za CTLA4 u ELISA testu
4
Tabela 17. Efikasnost vezivanja, EC50, 8D2, 8D2(Re) i humanizovanih antitela 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 i 8D2H2L17 za antigen CTLA4 u kompeticiji sa B7 dobijena simulacijom krive u analizi kompetetivnim ELISA testom
[0144] Gore navedeni rezultati pokazuju da antitela 8D2, 8D2 (Re) i humanizovana antitela 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 i 8D2H2L17 sva mogu da kompetiraju sa B7 za vezivanje za antigen CTLA4. Naročito, 8D2, 8D2(Re), 8D2H1L1 i 8D2H2L2 su jača od 10D1 u
4
kompeticiji sa B7-2 za vezivanje za CTLA4, dok je 8D2H2L17 jače od antitela 10D1 i 11.2.1 u kompeticiji sa B7-1 i B7-2 za vezivanje za CTLA4.
Primer 9. Analiza bioloških aktivnosti monoklonskog antitela 8D2 i humanizovanih antitela 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 i 8D2H2L17 u ćelijama
[0145] Za detekciju dejstva monoklonskog antitela 8D2 i humanizovanih antitela 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 i 8D2H2L17, i kontrolnih antitela 10D1 i 11.2.1 na ekspresiju IL-2 u mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC’s), sakupljena je periferna krv zdravih davalaca u epruvete koje sadrže natrijum heparin. PBMC’s su dobijene kao ćelijska suspenzija posle razblaživanja u PBS i centrifugiranja na medijumu za razdvajanje (na 2550 o/m tokom 20 min). Ćelijskoj suspenziji je dodat SEB (1 µg/mL) / PHA (30 µl/ml) i ona je stavljena za dalju kultivaciju u inkubator na 37 °C sa atmosferom zasićenom vlagom koja sadrži 5% CO2. Dodati su Raji limfociti i antitelo. Posle ko-inkubacije tokom 48 časova, PBMC’s su dva puta oprani PBS-om, i dodati u ploče sa 96 bunarčića u količini od 10 000 ćelija/bunarčiću. Zatim je dodat odgovarajući gradijent koncentracije antitela. Posle inkubacije od 20 minuta, dodate su Raji ćelije tretirane sa MMC tokom 1 časa u količini od 10 000 ćelija/ bunarčiću za ko-kultivaciju od 72 časa. Posle ko-inkubacije tokom 72 časa, sakupljen je supernatant ćelijske kulture i detektovan je profil ekspresije IL-2 u supernatantu ćelijske ko-kulture upotrebom kompleta za ELISA test prema uputstvima obezbeđenim sa kompletom (Dakewe Co., DKW12-1020-096).
[0146] Posle statističke analize, rezultati eksperimenata prikazani su na slikama 32 i 33. U poređenju sa grupom T ćelija i grupom Raji ćelija, u slučaju monoklonskog antitela 8D2, sva njegova humanizovana antitela 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15, i 8D2H2L17 mogu efikasno da blokiraju vezivanje CTLA4 za B7 i poboljšavaju ekspresiju IL-2 u T limfocitima (Slike 32 i 33). Naročito, pronalazač je iznenađujuće otkrio da su 8D2H2L2, 8D2H2L15 i 8D2H2L17 značajno bolja od kontrolnih antitela 10D1 i 11.2.1. U koncentraciji od 10 nM, ona su postigla nivo IL-2 koji je uporediv, ili čak bolji od onog koji se postiže sa 10D1 ili 11.2.1 u koncentraciji od 100 nM. Prema tome, antitela predmetnog pronalaska mogu da povećaju nivo IL-2 pri nižoj koncentraciji, npr., oko 10 nM.
Primer 10. In vivo antitumorska aktivnost monoklonskog antitela 8D2H2L2
[0147] In vivo antitumorska aktivnost 8D2H2L2 procenjivana je upotrebom životinjskog modela hu-SCID-raji. Humane mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC’s) izolovane su upotrebom Fikolovog reagensa, i aktivirane upotrebom SEB u koncentraciji od 1 µg/ml tokom 3 dana. Zatim je 1.25 x 106 aktiviranih PBMC’s pomešano sa 5 x 10<6>ćelija Raji Burkitovog limfoma i
4
8D2H2L2 (20 mg/kg), i subkutano ubrizgano u bok miševa SCID-beige. U isto vreme, uspostavljena je grupa za izotipsku kontrolu, 5 životinja po grupi. Zatim, doza od 20 mg/kg primenjivana je intravenskom injekcijom jednom nedeljno tokom tri uzastopne nedelje. Zapremina tumora je merena dva puta nedeljno do kraja eksperimenta ili dok zapremina tumora ne dostigne 1000 mm3.
[0148] Kao što je prikazano na slici 34, antitelo 8D2H2L2 je moglo primetno da inhibira rast tumora u modelu hu-SCID-raji. Ovaj rezultat je ukazao na to da ovo antitelo može da se primenjuje klinički za lečenje limfoma.
[0149] Iako su konkretni primeri izvođenja pronalaska detaljno opisani, stručnjaci u ovoj oblasti će, u svetlu učenja opisanog u specifikaciji, razumeti da se na prikazanim detaljima mogu izvršiti različite promene i modifikacije. Pun obim pronalaska dat je u priloženim patentnim zahtevima.
4
1
�
4
1
2
4
1
2

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se vezuje za humani CTLA4, izabran iz grupe koja se sastoji od:
(a) antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji sadrži varijabilni region teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 14 i varijabilni region lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 16; i
(b) antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji sadrži varijabilni region teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 14 i varijabilni region lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 16, pri čemu u sekvenci SEQ ID NO: 14 na poziciji 18, metionin može da bude supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koja se sastoji od: leucina, valina, izoleucina i alanina.
2. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je metionin na poziciji 18 u SEQ ID NO: 14 supstituisan leucinom, a varijabilni region lakog lanca ima sekvencu SEQ ID NO: 16.
3. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema patentnim zahtevima 1 ili 2, koje predstavlja humanizovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment.
4. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačeno time što se antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment vezuje za humani CTLA4 sa KDmanjom od oko 10-5 M, određeno rezonancijom površinskog plazmona.
5. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačeno time što antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment:
(a) blokira vezivanje humanog CTLA4 za humani B7;
(b) reguliše aktivnost humanog CTLA4;
(c) ublažava imunosupresivno dejstvo humanog CTLA4 na organizam;
(d) aktivira T limfocite, i/ili
(e) povećava ekspresiju IL-2 u T limfocitima.
6. Jedan ili više izolovanih molekula nukleinske kiseline koji kodiraju antitelo ili antigenvezujući fragment prema patentnom zahtevu 1.
7. Jedan ili više izolovanih molekula nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 6, naznačeni time što jedan ili više izolovanih molekula nukleinske kiseline imaju nukleotidnu sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO: 13 ili SEQ ID NO: 15.
8. Vektor koji sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 6.
9. Ćelija-domaćin koja sadrži vektor prema patentnom zahtevu 8.
10. Postupak za pripremu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, koji obuhvata korake kultivacije ćelije-domaćina prema patentnom zahtevu 8 pod pogodnim uslovima i izdvajanje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta iz ćelijske kulture.
11. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5 i farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili ekscipijens.
12. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 za upotrebu u postupku za lečenje kancera, kao što je melanom, tumor bubrega/renalni tumor, kancer prostate, kancer bešike, kolorektalni kancer, kancer gastrointestinalnog trakta, i/ili kancer jetre/hepatični kancer kod humanog subjekta.
13. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 za upotrebu u postupku za lečenje limfoma.
14. In vitro postupak koji obuhvata korake primene na ćelije efikasne količine antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačen time što je postupak odabran od sledećeg:
(a) postupka za detekciju nivoa CTLA4 u uzorku,
(b) postupka za blokiranje vezivanja humanog CTLA4 za humani B7,
(c) postupka za regulisanje aktivnosti humanog CTLA4 ili nivoa humanog CTLA4, (d) postupka za ublažavanje imunosupresivnog dejstva humanog CTLA4 na organizam, (e) postupka za aktivaciju T limfocita, ili
(f) postupka za povećanje ekspresije IL-2 u T limfocitima.
4
RS20210312A 2014-08-01 2015-07-31 Monoklonsko antitelo protiv ctla4 ili njegov antigen-vezujući fragment, medicinska kompozicija i upotreba RS61590B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410377352.9A CN105296433B (zh) 2014-08-01 2014-08-01 一种ctla4抗体、其药物组合物及其用途
PCT/CN2015/085721 WO2016015675A1 (zh) 2014-08-01 2015-07-31 抗ctla4的单克隆抗体或其抗原结合片段、药物组合物及用途
EP15827441.5A EP3176181B1 (en) 2014-08-01 2015-07-31 Anti-ctla4 monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof, medicinal composition and use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61590B1 true RS61590B1 (sr) 2021-04-29

Family

ID=55194268

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210312A RS61590B1 (sr) 2014-08-01 2015-07-31 Monoklonsko antitelo protiv ctla4 ili njegov antigen-vezujući fragment, medicinska kompozicija i upotreba

Country Status (39)

Country Link
US (3) US10449251B2 (sr)
EP (2) EP3858861A1 (sr)
JP (2) JP6514774B2 (sr)
KR (1) KR102017396B1 (sr)
CN (3) CN105296433B (sr)
AP (1) AP2017009762A0 (sr)
AU (2) AU2015295936C1 (sr)
CA (1) CA2956000C (sr)
CL (1) CL2017000250A1 (sr)
CO (1) CO2017000754A2 (sr)
CR (1) CR20170033A (sr)
CY (1) CY1124190T1 (sr)
DK (1) DK3176181T3 (sr)
DO (1) DOP2017000031A (sr)
EA (1) EA036396B1 (sr)
EC (1) ECSP17012781A (sr)
ES (1) ES2857509T3 (sr)
GE (2) GEAP202014437A (sr)
HR (1) HRP20210448T1 (sr)
HU (1) HUE053719T2 (sr)
IL (1) IL250321B (sr)
LT (1) LT3176181T (sr)
MA (2) MA40474B1 (sr)
MD (1) MD4795C1 (sr)
MX (2) MX387685B (sr)
MY (1) MY192822A (sr)
NI (1) NI201700008A (sr)
NZ (1) NZ729158A (sr)
PE (1) PE20170772A1 (sr)
PH (1) PH12017500190B1 (sr)
PL (1) PL3176181T3 (sr)
PT (1) PT3176181T (sr)
RS (1) RS61590B1 (sr)
SG (1) SG11201700819QA (sr)
SI (1) SI3176181T1 (sr)
TN (1) TN2017000010A1 (sr)
UA (1) UA119570C2 (sr)
WO (1) WO2016015675A1 (sr)
ZA (1) ZA201700528B (sr)

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA117466C2 (uk) 2012-12-13 2018-08-10 Мерк Шарп Енд Доме Корп. СТАБІЛЬНИЙ СКЛАД У ВИГЛЯДІ РОЗЧИНУ АНТИТІЛА ДО IL-23p19
CN105296433B (zh) 2014-08-01 2018-02-09 中山康方生物医药有限公司 一种ctla4抗体、其药物组合物及其用途
SI3303394T1 (sl) 2015-05-29 2020-10-30 Agenus Inc. Protitelesa proti-CTLA-4 in postopki njihove uporabe
CN114605548A (zh) 2015-09-01 2022-06-10 艾吉纳斯公司 抗-pd-1抗体及其使用方法
WO2017165742A1 (en) 2016-03-24 2017-09-28 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating gastrointestinal immune-related adverse events in anti-ctla4 anti-pd-1 combination treatments
US11760803B2 (en) 2016-03-24 2023-09-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods of treating gastrointestinal immune-related adverse events in immune oncology treatments
CN107400166A (zh) * 2016-05-19 2017-11-28 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 针对ctla4的单域抗体及其衍生蛋白
TWI640536B (zh) 2016-06-20 2018-11-11 克馬伯有限公司 抗體
CN106967172B (zh) 2016-08-23 2019-01-08 康方药业有限公司 抗ctla4-抗pd-1 双功能抗体、其药物组合物及其用途
WO2018035710A1 (en) * 2016-08-23 2018-03-01 Akeso Biopharma, Inc. Anti-ctla4 antibodies
CN106977602B (zh) 2016-08-23 2018-09-25 中山康方生物医药有限公司 一种抗pd1单克隆抗体、其药物组合物及其用途
JP6976322B2 (ja) 2016-10-10 2021-12-08 クラウン バイオサイエンス，インコーポレイテッド（タイツァン） 新規抗ｃｔｌａ４抗体
TW202436356A (zh) 2016-10-11 2024-09-16 美商艾吉納斯公司 抗ｌａｇ－３抗體及其使用方法
US11013802B2 (en) 2016-12-07 2021-05-25 Agenus Inc. Anti-CTLA-4 antibodies and methods of use thereof
US20220411506A1 (en) * 2017-03-15 2022-12-29 Suzhou Galaxy Biopharma Co., Ltd. Ctla4 antibody, pharmaceutical composition and use thereof
CN110505882A (zh) * 2017-03-31 2019-11-26 默沙东公司 用pd-1的拮抗剂和抗ctla4抗体的组合治疗癌症的组合物和方法
CA3060695A1 (en) * 2017-05-02 2018-11-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Stable formulations of anti-ctla4 antibodies alone and in combination with programmed death receptor 1 (pd-1) antibodies and methods of use thereof
JOP20190260A1 (ar) 2017-05-02 2019-10-31 Merck Sharp & Dohme صيغ ثابتة لأجسام مضادة لمستقبل الموت المبرمج 1 (pd-1) وطرق استخدامها
AU2018263868A1 (en) 2017-05-02 2019-12-12 Merck Sharp & Dohme Llc Formulations of anti-LAG3 antibodies and co-formulations of anti-LAG3 antibodies and anti-PD-1 antibodies
JP7173993B2 (ja) * 2017-05-19 2022-11-17 ウーシー バイオロジクス（シャンハイ）カンパニー リミテッド 細胞傷害性ｔリンパ球関連タンパク質４（ｃｔｌａ－４）に対する新規モノクローナル抗体
AR111760A1 (es) 2017-05-19 2019-08-14 Novartis Ag Compuestos y composiciones para el tratamiento de tumores sólidos mediante administración intratumoral
CN116478289A (zh) * 2017-05-19 2023-07-25 上海药明生物技术有限公司 一种新的ctla-4单克隆抗体
CN107325181A (zh) * 2017-07-05 2017-11-07 无锡傲锐东源生物科技有限公司 抗ctla4蛋白单克隆抗体及其用途
CN111511762B (zh) 2017-08-21 2025-05-06 天演药业公司 抗cd137分子及其用途
WO2019056281A1 (en) * 2017-09-21 2019-03-28 Eucure (Beijing) Biopharma Co., Ltd ANTI-CTLA4 ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
WO2019148444A1 (en) * 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
BR112020015915A8 (pt) * 2018-02-13 2023-01-31 Merck Sharp & Dohme Usos de um anticorpo anti-pd-1 e um anticorpo anti-ctla4 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, bem como kit para tratamento de um paciente com câncer
CN112218892B (zh) * 2018-03-19 2023-04-25 上海药明生物技术有限公司 新型抗ctla-4抗体多肽
CN109336975B (zh) * 2018-04-18 2022-05-13 中国科学院微生物研究所 一种靶向pd-1的肿瘤抑制性抗体及其应用
EP3802613A4 (en) 2018-06-05 2022-03-09 Jiangsu Alphamab Biopharmaceuticals Co., Ltd. DIMER AND ITS USE
KR20210035805A (ko) 2018-06-15 2021-04-01 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 세포후 신호전달 인자의 조절을 통한 면역 활성의 증가
CN110760002A (zh) * 2018-07-25 2020-02-07 南京金斯瑞生物科技有限公司 人源化抗人ctla4单克隆抗体及其制备方法和用途
JP7467438B2 (ja) 2018-10-18 2024-04-15 メルク・シャープ・アンド・ドーム・エルエルシー 抗ｒｓｖ抗体の製剤及びその使用方法
CN113015748B (zh) 2018-10-31 2025-12-12 默沙东有限责任公司 抗人pd-1抗体晶体及其使用方法
CN113316458B (zh) 2018-11-07 2024-08-02 默沙东有限责任公司 抗lag3抗体和抗pd-1抗体的共制剂
EP3898677A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 OSE Immunotherapeutics Bifunctional anti-pd-1/il-7 molecule
KR20210141447A (ko) 2018-12-26 2021-11-23 실리오 디벨럽먼트, 인크. 항-ctla4 항체 및 이의 사용 방법
WO2020165374A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecule comprising il-15ra
CN113631189A (zh) 2019-03-13 2021-11-09 默沙东公司 包含ctla-4和pd-1封闭剂的抗癌联合治疗
EP3962493A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity/level of irf or sting or of treating cancer, comprising the administration of a sting modulator and/or purinergic receptor modulator or postcellular signaling factor
TWI888925B (zh) * 2019-06-10 2025-07-01 英屬開曼群島商天演藥業有限公司 抗ctla4抗體及其製備及使用方法
CN110256561B (zh) * 2019-06-13 2021-04-16 东大生物技术(苏州)有限公司 一组ctla-4单克隆抗体及其医药用途
CN110256563A (zh) * 2019-07-05 2019-09-20 石河子大学 Ctla-4纳米抗体、制备方法及其应用
EP4076434A1 (en) 2019-12-17 2022-10-26 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
WO2021122866A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecules comprising an il-7 variant
KR20220149740A (ko) * 2020-03-05 2022-11-08 머크 샤프 앤드 돔 엘엘씨 Pd-1 길항제, ctla4 길항제 및 렌바티닙 또는 그의 제약상 허용되는 염의 조합물을 사용하여 암을 치료하는 방법
US20230092707A1 (en) * 2020-03-05 2023-03-23 Merck Sharp & Dohme Llc Methods for treating cancer or infection using a combination of an anti-pd-1 antibody, an anti-ctla4 antibody, and an anti-tigit antibody
CN115443291B (zh) * 2020-04-13 2025-08-05 博奥信生物技术（南京）有限公司 结合ctla4的抗体及其用途
JP7695272B2 (ja) * 2020-06-11 2025-06-18 ナントバイオ，インコーポレイテッド 抗ｃｔｌａ４モノクローナル抗体及びキメラ抗原受容体
US20230355804A1 (en) 2020-06-29 2023-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
CN113980130B (zh) * 2020-07-27 2023-07-21 湖南远泰生物技术有限公司 人源化cd37和双特异性cd19-人源化cd37 car-t细胞
CN112079926A (zh) * 2020-09-17 2020-12-15 北京华大蛋白质研发中心有限公司 抗人ctla4单克隆抗体及其应用
WO2022112198A1 (en) 2020-11-24 2022-06-02 Worldwide Innovative Network Method to select the optimal immune checkpoint therapies
CA3214085A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Darby Rye Schmidt Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
WO2022214652A1 (en) 2021-04-09 2022-10-13 Ose Immunotherapeutics Scaffold for bifunctioanl molecules comprising pd-1 or cd28 and sirp binding domains
CA3213917A1 (en) 2021-04-09 2022-10-13 Nicolas Poirier New scaffold for bifunctional molecules with improved properties
EP4363059A1 (en) 2021-06-29 2024-05-08 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
CN114316053B (zh) * 2021-12-20 2023-09-29 南京诺唯赞检测技术有限公司 一种vce的单克隆抗体及其制备方法
WO2023143597A1 (en) * 2022-01-30 2023-08-03 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Anti-ctla4/ox40 bispecific antibodies and uses thereof
WO2024003360A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Institut Curie Biomarkers and uses thereof for the treatment of neuroblastoma
JP2025525886A (ja) 2022-08-02 2025-08-07 オーエスイー・イミュノセラピューティクス Ｃｄ２８に対する多機能性分子
WO2024056049A1 (zh) * 2022-09-16 2024-03-21 同润生物医药(上海)有限公司 具有pH依赖性的抗CTLA4抗体或抗原结合片段
EP4598946A1 (en) 2022-10-05 2025-08-13 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer
WO2024151687A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Genetic switches and their use in treating cancer
WO2024200823A1 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Ose Immunotherapeutics Lipid-based nanoparticle targeted at activated immune cells for the expression of immune cell enhancing molecule and use thereof
EP4687990A1 (en) 2023-03-30 2026-02-11 Ose Immunotherapeutics Method of synthesis of targeted lipid nanoparticle and uses thereof
WO2025242835A1 (en) 2024-05-22 2025-11-27 Ose Immunotherapeutics Molecules comprising masking linkers and uses thereof for the treatment of cancer

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US682736A (en) 1900-08-02 1901-09-17 James C Owen Oil-can.
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5851795A (en) 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
US6719972B1 (en) * 1994-06-03 2004-04-13 Repligen Corporation Methods of inhibiting T cell proliferation or IL-2 accumulation with CTLA4- specific antibodies
AU703117B2 (en) 1995-04-27 1999-03-18 Advanced Tissue Sciences, Inc. Apparatus and method for sterilizing, seeding, culturing, storing, shipping and testing tissue, synthetic or native vascular grafts
US5811097A (en) 1995-07-25 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
US6051227A (en) 1995-07-25 2000-04-18 The Regents Of The University Of California, Office Of Technology Transfer Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
US5855887A (en) 1995-07-25 1999-01-05 The Regents Of The University Of California Blockade of lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
JP2001523958A (ja) 1997-03-21 2001-11-27 ブライハム アンド ウィミンズ ホスピタル，インコーポレイテッド 免疫療法のｃｔｌａ−４結合ペプチド
US7122615B1 (en) 1998-09-10 2006-10-17 Rutgers, The State University Of New Jersey Polyanhydrides with therapeutically useful degradation products
EE05627B1 (et) 1998-12-23 2013-02-15 Pfizer Inc. CTLA-4 vastased inimese monoklonaalsed antikehad
US7109003B2 (en) 1998-12-23 2006-09-19 Abgenix, Inc. Methods for expressing and recovering human monoclonal antibodies to CTLA-4
DK2112166T3 (en) * 1998-12-23 2019-02-04 Pfizer Human monoclonal antibodies to CTLA-4
NZ517202A (en) 1999-08-24 2004-05-28 Medarex Inc Human CTLA-4 antibodies and their uses
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
EP1261376A1 (en) 2000-01-27 2002-12-04 Genetics Institute, LLC Antibodies against ctla4(cd152), conjugates comprising same, and uses thereof
IL149701A0 (en) 2001-05-23 2002-11-10 Pfizer Prod Inc Use of anti-ctla-4 antibodies
JP4298498B2 (ja) * 2001-06-13 2009-07-22 ゲンマブ エー／エス 上皮成長因子受容体（ｅｇｆｒ）に対するヒトモノクローナル抗体
IL164287A0 (en) 2002-04-12 2005-12-18 Medarex Inc Methods of treatment using ctla-4 antibodies
BR0304876A (pt) 2002-05-24 2004-10-19 Castrol Ltd Produto de reação, composição de óleo lubrificante, monÈmero, copolìmero de enxerto e incrementador do ìndice de viscosidade de um dispersante e respectivos métodos de produção
EP2206517B1 (en) 2002-07-03 2023-08-02 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Immunopotentiating compositions comprising anti-PD-L1 antibodies
AU2003260871A1 (en) 2002-09-30 2004-04-19 Pfizer Products Inc. Hybridomas producing high levels of human sequence antibody
US8168170B2 (en) 2002-10-03 2012-05-01 The Procter And Gamble Company Compositions having an inner core and at least three surrounding layers
PL216630B1 (pl) * 2002-10-17 2014-04-30 Genmab As Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wiążące ludzki CD20, związane z tym przeciwciałem transfektoma, komórka gospodarza, transgeniczne zwierzę lub roślina, kompozycja, immunokoniugat, cząsteczka bispecyficzna, wektor ekspresyjny, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie medyczne, zestaw oraz przeciwciało antyidiotypowe i jego zastosowanie
US7465446B2 (en) 2003-05-30 2008-12-16 Medarex, Inc. Surrogate therapeutic endpoint for anti-CTLA4-based immunotherapy of disease
CA2560919A1 (en) 2004-03-26 2005-10-06 Pfizer Products Inc. Uses of anti-ctla-4 antibodies
DE102004063494A1 (de) * 2004-12-23 2006-07-13 Tegenero Ag Antikörper
WO2006096461A2 (en) * 2005-03-08 2006-09-14 Pharmacia & Upjohn Company Llc Composition comprising an antibody against macrophage colony-stimulating factor (m-csf) and a chelating agent
EP1869067A1 (en) 2005-04-11 2007-12-26 Medarex, Inc. Protein purification using hcic amd ion exchange chromatography
ES2720160T3 (es) 2005-05-09 2019-07-18 Ono Pharmaceutical Co Anticuerpos monoclonales humanos contra muerte programada 1(PD-1) y métodos para tratar el cáncer usando anticuerpos dirigidos contra PD-1 solos o junto con otras sustancias inmunoterapéuticas
CA2647282A1 (en) 2006-04-05 2007-10-11 Pfizer Products Inc. Ctla4 antibody combination therapy
CN101074264B (zh) * 2006-05-17 2011-08-17 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 一种重组抗ctla4单克隆抗体及其制备方法和用途
EP2240204A1 (en) 2008-02-04 2010-10-20 Medarex, Inc. Anti-clta-4 antibodies with reduced blocking of binding of ctla-4 to b7 and uses thereof
US9540426B2 (en) 2009-10-06 2017-01-10 Bristol-Myers Squibb Company Mammalian cell culture processes for protein production
US8435516B2 (en) 2009-10-12 2013-05-07 Pfizer Inc. Cancer treatment
SMT201700529T1 (it) 2009-11-17 2018-01-11 Squibb & Sons Llc Metodi per un'aumentata produzione di proteine
CN102134276A (zh) * 2010-01-22 2011-07-27 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 一种抗ctla-4嵌合抗体
WO2012038606A1 (en) 2010-09-24 2012-03-29 Oncos Therapeutics Oy Oncolytic adenoviral vectors coding for monoclonal anti - ctla - 4 antibodies
GB201103955D0 (en) * 2011-03-09 2011-04-20 Antitope Ltd Antibodies
CN107988156B (zh) 2011-06-30 2022-01-04 建新公司 T细胞活化的抑制剂
WO2013142796A2 (en) 2012-03-23 2013-09-26 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treatments using ctla4 antibodies
US9212224B2 (en) 2012-05-15 2015-12-15 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies that bind PD-L1 and uses thereof
US8844207B2 (en) 2012-06-04 2014-09-30 Mity-Lite, Inc. Portable dance floor panel with floating magnet retention system
CN102801616B (zh) 2012-08-02 2015-04-15 华为技术有限公司 报文发送和接收的方法、装置和系统
EP2759305A1 (en) 2013-01-24 2014-07-30 Thrombotargets Europe, S.L. Hemostatic compositions
US10570204B2 (en) 2013-09-26 2020-02-25 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Methods for treating hematologic cancers
EP3114144A1 (en) 2014-03-05 2017-01-11 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of renal cancer using a combination of an anti-pd-1 antibody and another anti-cancer agent
JP2017515859A (ja) 2014-05-15 2017-06-15 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 抗ｐｄ−１抗体と他の抗癌剤の組み合わせを使用する肺癌の処置
CN105296433B (zh) * 2014-08-01 2018-02-09 中山康方生物医药有限公司 一种ctla4抗体、其药物组合物及其用途
JP2018500332A (ja) 2014-12-16 2018-01-11 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 中枢神経系新生物における免疫チェックポイント阻害剤の使用
CN104479019B (zh) 2014-12-26 2020-07-21 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 一种抗ctla-4人源抗体
WO2016131769A2 (en) 2015-02-16 2016-08-25 Lonza Ltd Antibodies
WO2016183469A1 (en) 2015-05-13 2016-11-17 Robert Kirken Anti-ctla-4 blockade
KR20180101584A (ko) 2016-01-27 2018-09-12 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 항-pd-1 항체 및 또 다른 항암제의 조합을 사용하는 폐암의 치료

Also Published As

Publication number Publication date
EP3858861A1 (en) 2021-08-04
LT3176181T (lt) 2021-04-12
HUE053719T2 (hu) 2021-07-28
PL3176181T3 (pl) 2021-07-26
US12447208B2 (en) 2025-10-21
MD20170022A2 (ro) 2017-06-30
ZA201700528B (en) 2022-11-30
AU2015295936A1 (en) 2017-03-09
EA036396B1 (ru) 2020-11-05
EP3176181A1 (en) 2017-06-07
CA2956000A1 (en) 2016-02-04
US20170216433A1 (en) 2017-08-03
KR102017396B1 (ko) 2019-09-02
CO2017000754A2 (es) 2017-06-30
CR20170033A (es) 2017-09-29
CN106687479A (zh) 2017-05-17
MX387685B (es) 2025-03-18
CN106687479A8 (zh) 2017-07-07
MA40474A (fr) 2017-06-07
AU2018247270A1 (en) 2018-11-01
SG11201700819QA (en) 2017-03-30
PH12017500190A1 (en) 2017-06-28
DK3176181T3 (da) 2021-03-08
US20230064544A1 (en) 2023-03-02
PE20170772A1 (es) 2017-07-04
MA40474B1 (fr) 2021-02-26
AP2017009762A0 (en) 2017-02-28
MX2017001446A (es) 2017-12-15
SI3176181T1 (sl) 2021-07-30
DOP2017000031A (es) 2017-07-15
GEP20207166B (en) 2020-10-12
EP3176181B1 (en) 2020-12-23
GEAP202014437A (en) 2020-06-10
CY1124190T1 (el) 2022-05-27
US10449251B2 (en) 2019-10-22
MD4795C1 (ro) 2022-09-30
IL250321A0 (en) 2017-03-30
HRP20210448T1 (hr) 2021-05-28
ECSP17012781A (es) 2017-08-31
MX2021013586A (es) 2021-12-10
CN105296433A (zh) 2016-02-03
TN2017000010A1 (en) 2018-07-04
NI201700008A (es) 2017-03-08
PT3176181T (pt) 2021-03-04
CN106687479B (zh) 2022-10-25
AU2015295936B2 (en) 2018-11-08
IL250321B (en) 2021-06-30
MD4795B1 (ro) 2022-02-28
MA55868A (fr) 2022-04-06
BR112017002080A2 (pt) 2018-02-27
MY192822A (en) 2022-09-12
UA119570C2 (uk) 2019-07-10
US11291720B2 (en) 2022-04-05
CA2956000C (en) 2022-09-27
KR20170036092A (ko) 2017-03-31
EP3176181A4 (en) 2018-03-14
CN105296433B (zh) 2018-02-09
WO2016015675A1 (zh) 2016-02-04
JP2017523807A (ja) 2017-08-24
EA201790288A1 (ru) 2017-06-30
JP2019107018A (ja) 2019-07-04
CN115960232A (zh) 2023-04-14
PH12017500190B1 (en) 2022-07-20
JP6514774B2 (ja) 2019-05-15
NZ729158A (en) 2020-03-27
ES2857509T3 (es) 2021-09-29
JP6783886B2 (ja) 2020-11-11
AU2015295936C1 (en) 2019-08-01
US20200206346A1 (en) 2020-07-02
CL2017000250A1 (es) 2017-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12447208B2 (en) Anti-CTLA4 monoclonal antibody or its antigen binding fragments, pharmaceutical compositions and uses
KR102503084B1 (ko) 항-ctla4 및 항-pd-1 이작용성 항체, 이의 약제학적 조성물 및 이의 용도
KR102469286B1 (ko) 항-pd1 단일클론 항체, 이의 약제학적 조성물 및 이의 용도
HK40057046A (en) An anti-clta4 monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof, a pharmaceutical composition and use
HK1232893B (en) Anti-ctla4 monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof, medicinal composition and use
HK1232893A1 (en) Anti-ctla4 monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof, medicinal composition and use
HK40011027A (en) Anti-ctla4 and anti-pd-1 bifunctional antibody, pharmaceutical composition thereof and use thereof
EA042365B1 (ru) Бифункциональное антитело против ctla4 и против pd-1, его фармацевтическая композиция и их применение
BR112017002080B1 (pt) Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, molécula de ácido nucleico isolada, vetor, método para preparar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, composição farmacêutica, e, uso de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo