JP7275117B2 - 抗IL-5Rαモノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
本発明者らは、ベンラリズマブに匹敵する親和性においてヒトIL-5Rαに結合し、IL-5Rα媒介性活性化を阻害する、完全ヒト化モノクローナル抗体mAb(BCD-133)を開発した。ベンラリズマブの場合と同様に、BCD-133は、抗体依存性細胞傷害性を高め、したがって、IL-5受容体を有する細胞に対する免疫反応の活性化を可能にする。抗体BCD-133は、IL-5Rαに選択的に結合し、免疫コンピテント細胞および関連する特異性炎症のIL-5Rα媒介性活性化の効果的な阻害剤である。細胞試験は、ベンラリズマブの作用を超える抗体BCD-133の活性を示す。その上、BCD-133は、デノボにおいて得られた完全ヒト抗体であり;この事実は、免疫原性リスクを減らすことを可能にし、結合親和性の損失を引き起こし得るヒトタンパク質に対する親和性を増加させるように指示されたさらなる遺伝的形質転換を必要としない。
一態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
一態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号6~8の配列に対して少なくとも80%相同であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、すなわち、配列番号6~8の当該アミノ酸配列は、1つまたは2つのアミノ酸置換を含み得る。
一態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号1~3の配列に対して少なくとも80%相同であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号6~8の配列に対して少なくとも80%相同であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、すなわち、配列番号1~3および6~8の当該アミノ酸配列は、1つまたは2つのアミノ酸置換を含み得る。
一態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号9~10を含む群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%相同であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
一態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号4~5を含む群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%相同であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号9~10を含む群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%相同であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む。
一態様において、当該IL-5Rα特異的完全長IgGモノクローナル抗体は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4アイソタイプの抗体である。
一側面において、本発明は、上記抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸に関する。
一態様において、核酸は、抗体の重鎖をコードし、配列番号15~16を含む群から選択される配列に対して少なくとも90%相同であるヌクレオチド配列、および/または、抗体の軽鎖をコードし、配列番号17~18を含む群から選択される配列に対して少なくとも90%相同であるヌクレオチド配列を含む。
一側面において、本発明は、上記抗体またはその抗原結合性断片を産生するために使用される宿主細胞をする産生方法であって、上記ベクターによる細胞の形質転換を含む方法に関する。
一側面において、本発明は、上記抗体またはその抗原結合性断片を産生する方法であって、当該抗体を産生するのに十分な条件下において増殖培地にて上記宿主細胞を培養するステップと、必要であれば、その後に、得られた抗体を単離および精製するステップとを含む方法に関する。
喘息、例えば、好酸球性喘息(アトピー性喘息)、例えば、重篤な好酸球性喘息(アトピー性喘息);COPD(慢性閉塞性肺疾患);チャーグ・ストラウス症候群;好酸球性食道炎;好酸球性胃腸炎から選択される。
一側面において、本発明は、IL-5Rαの生物活性を阻害することを必要とする対象において当該生物活性を阻害する方法であって、上記抗体またはその抗原結合性断片の有効量を投与するステップを含む方法に関する。
定義および基本方法
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
用語IL-5Rまたは「インターロイキン5受容体」は、本明細書において使用される場合、インターロイキン5(IL-5)に結合するタンパク質である。インターロイキン5受容体(IL-5R)の発現は、主に、好酸球、好塩基球、および肥満細胞の表面においてのみ観測される。IL-5Rは、独特なα鎖(IL-5Ra/CD125、細胞外ドメイン)からなり、IL-3およびGM-CSF受容体β鎖(bc/CD131)と共有され、それらは、それ自体はリガンドに結合しないが、同名の受容体に対するIL-5の親和性を増加させ、シグナル伝達に直接的に関与する。
用語「抗体」または「免疫グロブリン」(Ig)は、本明細書において使用される場合、抗体全体ならびに任意の抗原結合性断片(すなわち、「抗原結合性部分」)または単鎖を包含する。用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された2つの重鎖(H)および2つの軽鎖(L)を少なくとも含む糖タンパク質、または抗原結合性部分を意味する。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書において、略してVHと称される)および重鎖定常領域を含む。ギリシャ文字:α、δ、ε、γ、およびμによって示される、哺乳動物Ig重鎖の5つのタイプが知られている。存在する重鎖のタイプは、抗体のクラスを定義し;これらの鎖は、それぞれ、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM抗体において見出される。異なる重鎖は、サイズおよび構成において異なっており;αおよびγは、およそ450のアミノ酸を含むが、μおよびεは、およそ550のアミノ酸を有する。各重鎖は、2つの領域、すなわち、定常領域および可変領域を有する。当該定常領域は、同じアイソタイプの全ての抗体において同一であるが、異なるアイソタイプの抗体では異なっている。重鎖γ、α、およびδは、3つの定常ドメインCH1、CH2、およびCH3(順番に)と、フレキシビリティを加えるためのヒンジ領域とで構成される定常領域を有し(Woof J., Burton D., Nat Rev Immunol 4, 2004, cc.89-99);重鎖μおよびεは、4つの定常ドメインCH1、CH2、CH3、およびCH4で構成される定常領域を有する。哺乳動物では、ラムダ(λ)およびカッパ(κ)で示される2つのタイプの軽鎖のみ知られている。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書では、略してVLと称される)および軽鎖定常領域からなる。軽鎖のおよその長さは、211から217のアミノ酸である。好ましくは、当該軽鎖はカッパ(κ)軽鎖であり、当該定常ドメインCLは、好ましくはCカッパ(κ)である。
抗体断片、例えば、FabおよびF(ab’)2断片などは、従来の技術、例えば、全抗体のパパインまたはペプシン消化などを用いて、全抗体から調製することができる。その上、抗体、その一部分、および免疫接着分子(immunoadhesion molecule)は、例えば、本明細書において説明されるような、標準的な組換えDNA技術を使用して調製することができる。
ファージディスプレイは、抗体の探求のための、最も強力で広く使用されているインビトロ技術の1つである。1985年、Smithは、外来DNA配列を、糸状性バクテリオファージM13中にクローニングすることができること、およびそのようなクローン配列を、融合タンパク質としてファージ粒子の表面に発現させることができることを見出した(Smith GP: Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 1985, 228:1315~1317.)。したがって、他のタンパク質に結合するそれらの能力に基づいて、目的の融合タンパク質を選択することが可能である。この発見は、PCR増幅法と組み合わされ、標的特異的モノクローナル抗体を迅速に探し出すために使用することができる可変ドメインを含む様々なファージライブラリーを作り出すために免疫グロブリン遺伝子のcDNAレパートリーをクローニングすることを可能にした。ファージライブラリーレパートリーは、ライブラリーを作製するためにその血液が使用されたそれぞれのヒトまたは動物のB細胞抗体のレパートリーを反映する。1995年、2つの論文によって、完全ヒト抗体を発現することができる遺伝子操作されたマウスの産生について報告され、当該抗体のレパートリーは、ハイブリドーマ技術によって得られるものに匹敵する(Lonberg N, Taylor LD, Harding FA, Trounstine M, Higgins KM, Schramm SR, Kuo CC, Mashayekh R, Wymore K, McCabe JGら: Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 1994, 368:856~859)。これらの動物において、それら自身の内因性免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖遺伝子が故意に破壊され、その後、ヒト重鎖およびκ軽鎖遺伝子のセグメントである導入遺伝子が導入された。ヒト遺伝子レパートリーは、より様々な抗原に対する高特異性および高親和性の抗体を産生するために、マウス免疫系によって使用することができるということが判明した。トランスジェニックマウスが、本質的に、マウスおよびヒト成分(ヒト免疫グロブリン、マウスIgα、Igβ、および他のシグナル伝達分子)のハイブリッドであるB細胞受容体を発現するという事実にもかかわらず、それらのB細胞は、正常に成長し成熟する。
抗体「エフェクター機能」なる用語は、抗体アイソタイプによって変わる抗体のFc領域(天然Fc領域配列またはFc領域アミノ酸バリアント)に起因する生物活性を意味する。抗体エフェクター機能の例としては、Clq結合および補体依存性細胞傷害;Fc受容体結合;抗体依存性細胞媒介型細胞傷害(ADCC);食作用;
細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体、BCR)の下方調節、およびB細胞活性化が挙げられる。
核酸配列に関連する用語は、核酸配列に対して少なくとも85%、好ましくは90%、より好ましくは95%、最も好ましくは97%の配列同一性を示すヌクレオチドの配列として解釈されるべきである。
「医薬組成物」は、本発明の抗体と、薬学的に許容される、および薬学的互換性の、充填剤、溶媒、希釈剤、担体、助剤、分配剤および検知剤、送達剤、例えば、防腐剤、安定化剤、充填剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、増粘剤、甘味料、風味剤、着香剤、抗菌剤、防カビ剤、潤滑剤、および持続的送達制御剤などを含む群から選択される成分のうちの少なくとも1つとを含む組成物を意味し、それらの選択および好適な比率は、投与のタイプおよび方法ならびに投与量に依存する。好適な懸濁剤の例は、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエテン、ソルビトールおよびソルビトールエーテル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、およびトラガカント、ならびにそれらの混合物である。微生物の作用に対する防御は、様々な抗菌剤および防カビ剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸、および同様の化合物などによって提供することができる。組成物は、等張剤、例えば、砂糖、ポリオール、塩化ナトリウムなども含有し得る。組成物の持続的作用は、有効成分の吸収を減速させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどによって達成され得る。好適な担体、溶媒、希釈剤、および送達剤の例としては、注射用の、水、エタノール、多価アルコール、およびそれらの混合物、天然油(例えば、オリーブ油)、および有機エステル(例えば、オレイン酸エチル)が挙げられる。充填剤の例は、ラクトース、乳糖、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムなどである。崩壊剤および分配剤の例は、デンプン、アルギン酸およびその塩、ケイ酸塩である。好適な潤滑剤の例は、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、および高分子量のポリエチレングリコールである。単独でのまたは別の活性化合物との組合せにおける有効成分の、経口、舌下、経皮、眼内、筋肉内、静脈内、皮下、局所、または直腸投与のための医薬組成物は、従来の医薬担体との混合物において、標準的投与形態でヒトまたは動物に投与され得る。好適な標準的投与形態としては、経口形態、例えば、錠剤、ゼラチンカプセル剤、丸剤、粉末剤、粒剤、チューイングガム、および経口用溶液剤もしくは懸濁剤など;舌下および経口腔投与形態;エアゾール剤;移植;局所、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、または眼内形態、および直腸投与形態が挙げられる。
用語「障害」は、本発明の化合物による治療から恩恵を受けるであろう任意の状態を意味する。これは、哺乳動物を関心対象の当該障害にする病的状態を含む、慢性および急性の障害または疾患を含む。本明細書における、治療されるのに好ましい障害は、自己免疫疾患である。
用語「慢性」使用は、長期間にわたって初期治療効果(活性)を持続するための、投与の急性(短期)経路とは対照的な、薬剤の継続的な(不断の)使用を意味する。
本明細書において使用される場合、語句「含む(comprise)」、「有する(have)」、「含む(include)」、または「含む(comprises)」、「含むこと(comprising)」、「有する(has)」、「有すること(having)」、「含む(includes)」、または「含むこと(including)」などの変形、ならびにそれらの文法的な全ての変形は、述べられる整数または整数の群を包含するが、任意の他の整数または整数の群を排除しないことを含意すると理解されるであろう。
発明の詳細な説明
抗体
本発明は、IL-5Rαに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片に関する。
(a)配列DYATNYGVPYFGS(配列番号3)に対して少なくとも80%、85%、または92%相同であるかまたは同一であるアミノ酸配列を含むCDR3(すなわち、CDR3は、配列DYATNYGVPYFGS(配列番号3)、または1つもしくは2つの置換を有する配列DYATNYGVPYFGS(配列番号3)である)を含む重鎖可変領域と、
(b)配列QSYDSSLSGHVV(配列番号8)に対して少なくとも80%、83%、または91%相同であるかまたは同一であるアミノ酸配列を含むCDR3(すなわち、CDR3は、配列QSYDSSLSGHVV(配列番号8)、または1つもしくは2つの置換を有する配列QSYDSSLSGHVV(配列番号8)である)を含む軽鎖可変領域と
を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片に関する。
(a)アミノ酸配列DYATNYGVPYFGS(配列番号3)を含むCDR3を含む重鎖可変領域と、
(b)アミノ酸配列QSYDSSLSGHVV(配列番号8)を含むCDR3を含む軽鎖可変領域と
を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片に関する。
(a)以下:
(i)配列NYAMS(配列番号1)に対して少なくとも80%相同であるかまたは同一であるアミノ酸配列を含むCDR1(すなわち、CDR1は、配列NYAMS(配列番号1)、または1つの置換を有する配列NYAMS(配列番号1)である)と、
(ii)配列AINSGGKSTNYADSVKG(配列番号2)に対して少なくとも80%、88%、または94%相同であるかまたは同一であるアミノ酸配列を含むCDR2(すなわち、CDR2は、配列AINSGGKSTNYADSVKG(配列番号2)、または1つもしくは2つの置換を有する配列AINSGGKSTNYADSVKG(配列番号2)である)と、
(iii)配列DYATNYGVPYFGS(配列番号3)に対して少なくとも80%、85%、または92%相同であるかまたは同一であるアミノ酸配列を含むCDR3(すなわち、CDR3は、配列DYATNYGVPYFGS(配列番号3)、または1つもしくは2つの置換を有する配列DYATNYGVPYFGS(配列番号3)である)と
を含む重鎖可変領域、
および/または
(b)以下:
(i)配列SGSRSNIGSGYDVH(配列番号6)に対して少なくとも80%、85%、または92%相同であるかまたは同一であるアミノ酸配列を含むCDR1(すなわち、CDR1は、配列SGSRSNIGSGYDVH(配列番号6)、または1つもしくは2つの置換を有する配列SGSRSNIGSGYDVH(配列番号6)である)と、
(ii)配列DDNNRPS(配列番号7)に対して少なくとも80%または85%相同であるかまたは同一であるアミノ酸配列を含むCDR2(すなわち、CDR2は、配列DDNNRPS(配列番号7)、または1つの置換を有する配列DDNNRPS(配列番号7)である)と、
(iii)配列QSYDSSLSGHVV(配列番号8)に対して少なくとも80%、83%、または91%相同であるかまたは同一であるアミノ酸配列を含むCDR3(すなわち、CDR3は、配列QSYDSSLSGHVV(配列番号8)、または1つもしくは2つの置換を有する配列QSYDSSLSGHVV(配列番号8)である)と
を含む軽鎖可変領域
を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片に関する。
(a)以下:
(i)アミノ酸配列NYAMS(配列番号1)を含むCDR1と、
(ii)アミノ酸配列AINSGGKSTNYADSVKG(配列番号2)を含むCDR2と、
(iii)アミノ酸配列DYATNYGVPYFGS(配列番号3)を含むCDR3と
を含む重鎖可変領域、および/または
(b)以下:
(i)アミノ酸配列SGSRSNIGSGYDVH(配列番号6)を含むCDR1と、
(ii)アミノ酸配列DDNNRPS(配列番号7)を含むCDR2と、
(iii)アミノ酸配列QSYDSSLSGHVV(配列番号8)を含むCDR3と
を含む軽鎖可変領域
を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片に関する。
(a)群:
(b)群:
を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片に関する。
(a)群:
(b)群:
を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片に関する。
一態様において、本発明は、IL-5Rαに特異的に結合し、
(a)群:
(b)配列
を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片に関する。
(a)群:
(b)アミノ酸配列
を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片に関する。
一態様において、IL-5Rαに特異的に結合する上記単離された抗体は、モノクローナル抗体である。
一態様において、IL-5Rαに特異的に結合する上記完全長IgG抗体は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4アイソタイプの抗体である。
一態様において、上記単離された抗体は、IL-5Rαに特異的に結合し、アミノ酸配列QVTLKESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTTVTVSSを含む重鎖可変断片と、アミノ酸配列QAGLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQVPGTAPKLLIFDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVLを含む軽鎖可変断片とを含む抗体BCD133-03-002である。
を含む軽鎖可変断片とを含む抗体BCD133-03-021である。
を含む抗体BCD133-03-002である。
一態様において、上記単離された抗体は、IL-5Rαに特異的に結合し、アミノ酸配列
一態様において、上記単離された抗体は、IL-5Rαに特異的に結合し、アミノ酸配列
核酸分子
本発明は、核酸分子、特に、本発明のIL-5Rα(インターロイキン5受容体α鎖)に対する抗体をコードする配列、またはその断片のいずれか、ならびに、本明細書において説明される、それらの様々な組合せであって、場合により、任意のペプチドリンカ配列を含み、それらによって結合される、組合せにも関する。
一側面において、本発明は、軽鎖をコードし、群:
一側面において、本発明は、上記の核酸配列の任意の組合せを含む核酸分子に関する。
上記の態様のいずれかにおいて、核酸分子は単離することができる。
別の側面において、本発明は、本明細書において説明されるヌクレオチド配列にいずれかの発現にとって好適なベクターに関する。
本発明のさらなる側面は、本発明の抗IL-5Rα抗体を製造する方法に関する。本発明の一態様は、本明細書において定義される抗体を産生する方法であって、抗体を発現することができる組換え宿主細胞を導入/調製するステップと、当該抗体の発現/産生にとって好適な条件下において当該宿主細胞を培養するステップと、得られた抗体を単離するステップとを含む方法に関する。そのような組換え宿主細胞におけるそのような発現によって産生される抗IL-5Rα抗体は、本明細書において、「組換え抗IL-5Rα抗体」と呼ばれる。本発明は、そのような宿主細胞由来の細胞の後代、および類似的に得られる抗IL-5Rα抗体にも関する。
本発明はさらに、抗IL-5Rα抗体およびその抗原結合性断片を産生する方法およびプロセスにも関する。
モノクローナル抗体は、Kohler,ら Nature 256,1975, 495頁によって最初に報告されたハイブリドーマ法を使用して調製され得るか、または、組換えDNA法(US4816567)を使用して調製され得る。
「ヒト化」された非ヒト動物抗体を製造する方法は、当技術分野において周知である。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された1つまたは複数の必須のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的に「移入(import)」可変領域から得られるため、多くの場合、「移入」残基と称される。ヒト化は、実質的に、Winterおよび共同研究者らの方法 (Jonesら, Nature, 321:522~525 (1986))に従って、ヒト抗体の対応する配列を超可変領域配列で置換することによって実施することができる。したがって、そのような「ヒト化」された抗体は、未処理のヒト可変領域より実質的に小さい領域が、非ヒト種由来の対応する配列で置換されている、キメラ抗体(US4816567)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの超可変領域残基およびおそらくいくつかのFR残基が、齧歯動物抗体における類似領域に由来する残基で置換された、ヒト抗体である。
ヒト化の代替手段として、ヒト抗体を作り出すことができる。例えば、免疫化の後に、内因性免疫グロブリンを産生することなくヒト抗体の全範囲を産生することができるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を産生することが可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子のホモ接合型欠失は、結果として、内因性抗体産生の完全な阻害を生じることが記載されている。そのような生殖細胞系変異体マウス中へのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子の移動は、結果として、抗原チャレンジの後のヒト抗体の産生を生じる(US5545806、US5569825、US5591669(GenPharmの全て);US5545807;およびWO97/17852)。
抗体断片
ある特定の状況において、抗体全体よりむしろ、抗体断片を使用することは賢明である。断片の小さいサイズは、それらの迅速なクリアランスに貢献し、密度の高い腫瘍中へのより良い浸透に貢献し得る。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例えば、二重特異性抗体は、抗IL-5Rα抗体タンパク質の2つの異なるエピトープに結合し得る。他の二重特異性抗体は、抗IL-5Rα抗体結合部位を、別のタンパク質に対する結合部位と一緒に、組み合わせてもよい。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片(例えば、二重特異性抗体のF(ab’)2)として調製することができる。
多価抗体
多価抗体は、二重特異性抗体よりも速く、当該抗体が結合する抗原を発現する細胞によって取り込まれ得る(および/または異化され得る)。本明細書において提案される抗体は、3つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体(IgMクラス以外の)であり得(例えば、四価抗体)、それらは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に産生することができる。当該多価抗体は、二量体化ドメインと3つ以上の抗原結合部位を含むことができる。好ましい二量体化ドメインは、Fc断片またはヒンジ領域を含む(または、それらからなる)。このシナリオにおいて、当該抗体は、Fc断片と、当該Fc断片に対するN末端における3つ以上の抗原結合部位とを含むであろう。本明細書における好ましい多価抗体は、3つから約8つ、好ましくは4つの抗原結合部位を含む(または、それらからなる)。当該多価抗体は、少なくとも1つのポリペプチド鎖(好ましくは2つのポリペプチド鎖)を含み、この場合、当該ポリペプチド鎖は、2つ以上の可変領域を含む。例えば、当該ポリペプチド鎖は、VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fcを含み得、この場合、VD1は、第一可変領域を意味し、VD2は、第二可変領域を意味し、Fcは、Fc断片の1つのポリペプチド鎖を意味し、X1およびX2は、アミノ酸またはポリペプチドを意味し、nは、0または1を意味する。例えば、当該ポリペプチド鎖は、以下の鎖:VH-CH1-フレキシブルリンカ-VH-CH1-Fc断片;またはVH-CH1-VH-CH1-Fc断片を含み得る。好ましくは、本明細書における当該多価抗体はさらに、少なくとも2つ(好ましくは4つ)の軽鎖可変領域ポリペプチドを含む。本明細書における当該多価抗体は、例えば、約2つから約8つの軽鎖可変領域ポリペプチドを含み得る。本発明との関連において、当該軽鎖可変領域ポリペプチドは、軽鎖可変領域を含み、場合により、さらにCL領域を含む。
別の側面において、本発明は、有効成分として(または、唯一の有効成分として)IL-5Rα-特異抗体を含む医薬組成物を提供する。当該医薬組成物は、本明細書において説明されるような、IL-5Rαに対して特異的な少なくとも1つの抗体、および/または対応する表面受容体の1つまたは複数を標的とする1つまたは複数の追加の結合性分子(例えば、抗体)を含み得る。いくつかの態様において、当該組成物は、IL-5とその細胞受容体との相互作用から結果として生じ得る障害を改善、予防、治療することを目的としている。
用語「賦形剤」は、本発明の上記の成分以外の任意の成分を説明するために、本明細書において使用される。これらは、必要な物理化学特性を薬物製品に与えるために医薬品製造において使用される無機または有機の性質の物質である。
一側面において、本発明の抗IL-5Rα抗体は、IL-5活性に関連する障害の治療において有用である。
本明細書において使用される場合、抗IL-5Rα抗体および1種または複数種の他の治療薬について言及する用語「共投与(co-administration)」、「共投与された」、および「との組合せにおいて」は、以下を、意味する、言及する、または含むことが予想される:
1)そのような成分が、当該成分を実質的に同じタイミングにおいて治療を必要とする患者に放出する単一投与剤形態へと一緒に製剤化される場合、当該患者への、本発明の抗IL-5Rα抗体および治療薬のそのような組合せの同時投与(simultaneous administration)、
2)そのような成分が、治療を必要とする患者によって同時に摂取され、それにより、当該成分が、当該患者へと実質的に同じタイミングで放出される別々の投与剤形態へと、お互いに別々に製剤化される場合、当該患者への、本発明の抗IL-5Rα抗体および治療薬のそのような組合せの実質的な同時投与、
3)そのような成分が、治療を必要とする患者によって、各投与の間に十分な時間間隔をおいて連続して摂取され、それにより、当該成分が、当該患者へと実質的に異なるタイミングで放出される別々の投与剤形態へと、お互いに別々に製剤化される場合、当該患者への、本発明の抗IL-5Rα抗体および治療薬のそのような組合せの逐次的投与、および
4)そのような成分が、制御された方式において当該成分を放出される単一投与剤形態へと一緒に製剤化され、それにより、当該成分が、治療を必要とする患者に対して同じタイミングおよび/または異なるタイミングで、同時に、連続して、または共同で放出され、各部分が、同じ経路または異なる経路のどちらかによって投与され得る場合、当該患者への、本発明の抗IL-5Rα抗体および治療薬のそのような組合せの逐次的投与。
本発明の抗IL-5Rα抗体は、関心対象の状態の治療において有効である量において、すなわち、所望の結果を達成するのに必要な用量および期間において、投与されるであろう。治療有効量は、治療すべき特定の状態、患者の年齢、性別、および体重、当該抗IL-5Rα抗体が、単独で投与されるかそれとも1種または複数種の追加の抗自己免疫または抗炎症治療技術と組み合わせて投与されるのかなどの要因によって変わり得る。
本発明の抗IL-5Rα抗体の好適な用量は、0.1~200mg/kg、好ましくは、0.1~100mg/kgの範囲、例えば、約0.5~50mg/kg、例えば、約1~20mg/kgなどであろうと考えられる。当該抗IL-5Rα抗体は、例えば、少なくとも0.25mg/kg、例えば、少なくとも0.5mg/kgなど、例えば、少なくとも1mg/kg、例えば、少なくとも1.5mg/kg、例えば、少なくとも2mg/kgなど、例えば、少なくとも3mg/kg、例えば、少なくとも4mg/kg、例えば、少なくとも5mg/kg;ならびに、例えば、最高でも最大50mg/kgまで、例えば、最高でも最大30mg/kgまで、例えば、最高でも最大20mg/kgまで、例えば、最高でも最大15mg/kgまでの用量において投与され得る。当該投与は、典型的には、責任ある医師によって適切であると考えられる限り、適切な時間間隔、例えば、1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、または4週間に1回などにおいて繰り返されるであろうし、場合により、必要であれば、用量を増加または減少され得る。
別の態様により、本発明は、自己免疫疾患または関連する状態、例えば、喘息、例えば、好酸球性喘息(アトピー性喘息)、例えば、重篤な好酸球性喘息(アトピー性喘息);COPD(慢性閉塞性肺疾患);チャーグ・ストラウス症候群;好酸球性食道炎、好酸球性胃腸炎、または好酸球増多症候群の治療のために使用されることが意図される製造物を含む製品を提供する。当該製造物は、ラベルおよび添付文書を伴う容器であり、それらは、ブリスタおよび/またはパッケージ内に存し得る。好適な容器としては、例えば、バイアル瓶、アンプル、シリンジなどが挙げられる。当該容器は、様々な材料、例えば、ガラス材料またはポリマー材料などによって作製され得る。当該容器は、ある特定の状態の治療に有効な組成物を含み、無菌アクセスポートを有し得る。当該組成物中の少なくとも1種の有効成分は、本発明による抗IL-5Rα抗体である。当該ラベルおよび添付文書は、当該薬物がある特定の状態を治療するために使用されることを意図されることを示す。当該ラベルおよび/または添付文書は、そのような治療薬のための、指示、頻度、容量、投与経路、禁忌症、および/または事前注意を追加的に含む、患者に当該抗体組成物を投与するための使用説明書を含む。一態様において、当該添付文書は、当該組成物が、喘息、例えば、好酸球性喘息(アトピー性喘息)、例えば、重篤な好酸球性喘息(アトピー性喘息);COPD(慢性閉塞性肺疾患);チャーグ・ストラウス症候群;好酸球性食道炎、好酸球性胃腸炎、または好酸球増多症候群の治療のために使用されることを意図されることを示す。
本発明は、例えば、細胞からIL-5Rαを精製または免疫沈降するため、IL-5Rα保有細胞を単離するためなど、様々な目的に使用することができるキットにも関する。抗IL-5Rα抗体またはIL-5Rα保有細胞の単離および精製のためのキット。キットは、顆粒(例えば、セファロース顆粒または磁性粒子)に結合された抗IL-5Rα抗体を含み得る。キットは、容器、ラベル、および添付文書を含む。
本発明の抗IL-5Rα抗体は、診断プロセス(例えば、インビトロ、エクスビボにおける)においても使用される。例えば、当該抗IL-5Rα抗体は、患者から得られた試料(例えば、組織試料、または体液、例えば、炎症性滲出液、血液、血清、腸液、唾液、または尿などの試料)中のIL-5Rαのレベルを検出または測定するために使用することができる。検出および測定のための好適な方法としては、イムノアッセイ、例えば、フローサイトメトリ、酵素連結免疫吸着測定法(ELISA)、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、および免疫組織学などが挙げられる。本発明はさらに、キット、例えば、本明細書において説明される抗IL-5Rα抗体を含む診断用キットを含む。
非限定的に、本発明は以下の態様を含む。
[態様1]
IL-5Rαに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であって、
1)配列番号3の配列に対して少なくとも80%相同であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと;
1)配列番号8の配列に対して少なくとも80%相同であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと
を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
[態様2]
重鎖可変ドメインが、配列番号3のアミノ酸配列を含む、態様1に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
[態様3]
軽鎖可変ドメインが、配列番号8のアミノ酸配列を含む、態様1に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
[態様4]
重鎖可変ドメインが、配列番号1~3の配列に対して少なくとも80%相同であるアミノ酸配列を含む、態様1に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
[態様5]
重鎖可変ドメインが、配列番号1~3によって表されるアミノ酸配列を含む、態様4に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
[態様6]
軽鎖可変ドメインが、配列番号6~8の配列に対して少なくとも80%相同であるアミノ酸配列を含む、態様1に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
[態様7]
軽鎖可変ドメインが、配列番号6~8によって表されるアミノ酸配列を含む、態様6に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
[態様8]
1)重鎖可変ドメインが、配列番号1~3の配列に対して少なくとも80%相同であるアミノ酸配列を含み;
2)軽鎖可変ドメインが、配列番号6~8の配列に対して少なくとも80%相同であるアミノ酸配列を含む、
態様1に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
[態様9]
1)重鎖可変ドメインが、配列番号1~3のアミノ酸配列を含み;
2)軽鎖可変ドメインが、配列番号6~8のアミノ酸配列を含む、
態様8に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
[態様10]
重鎖可変ドメインが、配列番号4~5を含む群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%相同であるアミノ酸配列を含む、態様1に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
[態様11]
重鎖可変ドメインが、配列番号4~5を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む、態様10に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
[態様12]
軽鎖可変ドメインが、配列番号9~10を含む群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%相同であるアミノ酸配列を含む、態様1に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
[態様13]
軽鎖可変ドメインが、配列番号9~10を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む、態様12に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
[態様14]
1)重鎖可変ドメインが、配列番号4~5を含む群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%相同であるアミノ酸配列を含み;
2)軽鎖可変ドメインが、配列番号9~10を含む群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%相同であるアミノ酸配列を含む、
態様1に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
[態様15]
1)重鎖可変ドメインが、配列番号4~5を含む群から選択されるアミノ酸配列を含み;
2)軽鎖可変ドメインが、配列番号9~10を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む、
態様14に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
[態様16]
1)配列番号11~12を含む群から選択される配列に対して少なくとも90%相同であるアミノ酸配列を含む重鎖と;
2)配列番号13~14を含む群から選択される配列に対して少なくとも90%相同であるアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む、態様1に記載のモノクローナル抗体。
[態様17]
1)配列番号11~12を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖と;
2)配列番号13~14を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む、態様16に記載のモノクローナル抗体。
[態様18]
IL-5Rα特異抗体が、完全長IgG抗体である、態様1に記載のモノクローナル抗体。
[態様19]
完全長IgG抗体が、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4アイソタイプの抗体である、態様18に記載のモノクローナル抗体。
[態様20]
完全長IgG抗体が、ヒトIgG1アイソタイプの抗体である、態様19に記載のモノクローナル抗体。
[態様21]
態様1~20のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸。
[態様22]
DNAである、態様21に記載の核酸。
[態様23]
a)態様1に記載の抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号15~16を含む群から選択される配列に対して少なくとも90%相同であるヌクレオチド配列、および/または、態様1に記載の抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号17~18を含む群から選択される配列に対して少なくとも90%相同であるヌクレオチド配列;あるいは、
b)配列番号15~16を含む群から選択されるヌクレオチド配列であって、態様1に記載の抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列、および/または、配列番号17~18を含む群から選択されるヌクレオチド配列であって、態様1に記載の抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列
を含む、態様21に記載の核酸。
[態様24]
態様21~23のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
[態様25]
態様1~20のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を調製するための宿主細胞を産生する方法であって、態様24に記載のベクターによる細胞の形質転換を含む方法。
[態様26]
態様1~20のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を調製するための宿主細胞であって、態様21~23のいずれか一項に記載の核酸を含む宿主細胞。
[態様27]
態様1~20のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を調製する方法であって、前記抗体を産生するのに十分な条件下において増殖培地にて、態様26に記載の宿主細胞を培養するステップと、必要であれば、その後に、該得られた抗体を単離および精製するステップとを含む方法。
[態様28]
IL-5Rαによって媒介される疾患または障害を予防または治療するために使用されることが意図される医薬組成物であって、1種または複数種の薬学的に許容される賦形剤との組合せにおいて、態様1~20のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物。
[態様29]
喘息、例えば、好酸球性喘息(アトピー性喘息)、例えば、重篤な好酸球性喘息(アトピー性喘息);COPD(慢性閉塞性肺疾患);チャーグ・ストラウス症候群;好酸球性食道炎、好酸球性胃腸炎を含む群から選択される、IL-5Rαによって媒介される疾患または障害を予防または治療するために使用されることが意図される態様28に記載の医薬組成物。
[態様30]
IL-5Rαによって媒介される疾患または障害を予防または治療するために使用されることが意図される医薬組合せであって、態様1~20のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と、少なくとも1種の異なる治療的活性化合物とを含む医薬組合せ。
[態様31]
IL-5Rαによって媒介される疾患または障害を予防または治療するために使用されることが意図される態様30に記載の医薬組合せであって、前記疾患または障害が、喘息、例えば、好酸球性喘息(アトピー性喘息)、例えば、重篤な好酸球性喘息(アトピー性喘息);COPD(慢性閉塞性肺疾患);チャーグ・ストラウス症候群;好酸球性食道炎、好酸球性胃腸炎を含む群から選択される、医薬組合せ。
[態様32]
異なる治療的活性化合物が、小分子、抗体、またはステロイドホルモン、例えば、コルチコステロイドなどから選択される、態様30~31のいずれか一項に記載の医薬組合せ。
[態様33]
IL-5Rαの生物活性を阻害することを必要とする対象においてそのような生物活性を阻害する方法であって、態様1~20のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片の有効量を投与するステップを含む方法。
[態様34]
IL-5Rαによって媒介される疾患または障害の治療のための方法であって、そのような治療を必要とする対象に、態様1~20のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片、または態様28に記載の医薬組成物を、治療有効量において投与するステップを含む方法。
[態様35]
疾患または障害が、喘息、例えば、好酸球性喘息(アトピー性喘息)、例えば、重篤な好酸球性喘息(アトピー性喘息);COPD(慢性閉塞性肺疾患);チャーグ・ストラウス症候群;好酸球性食道炎、好酸球性胃腸炎、または好酸球増多症候群を含む群から選択される、態様34に記載の、疾患または障害の治療のための方法。
[態様36]
そのような治療を必要とする対象の、IL-5Rαによって媒介される疾患または障害の治療のための、態様1~20のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または態様28に記載の医薬組成物の使用。
[態様37]
疾患または障害が、喘息、例えば、好酸球性喘息(アトピー性喘息)、例えば、重篤な好酸球性喘息(アトピー性喘息);COPD(慢性閉塞性肺疾患);チャーグ・ストラウス症候群;好酸球性食道炎、好酸球性胃腸炎を含む群から選択される、態様36に記載の使用。
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat, E.A.,ら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)において与えられる。抗体鎖のアミノ酸は、EU付番(Edelman, G.M.,ら, Proc. Natl. Acad. Sci. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78~85; Kabat, E.A.,ら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991))に従って付番され参照される。
Sambrook, J.ら, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載のようにDNAを操作するために、標準的方法を使用した。製造元の使用説明書に従って、分子生物学的試薬を使用した。
化学合成によって作製されたオリゴヌクレオチドから所望の遺伝子セグメントを調製した。単数の制限部位に隣接された300~4000kb長の遺伝子セグメントを、PCR増幅を含む、オリゴヌクレオチドのアニール処理およびライゲーションによって組み立て、その後に当該示された制限部位を介してクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定法によって確認した。
Sanger配列決定法により、DNA配列を決定した。
DNAおよびタンパク質の配列分析および配列データ管理
配列作製、マッピング、解析、アノテーション、および図示のために、InfomaxのVector NT1 Advanceスイート バージョン8.0を使用した。
説明した抗体および抗原の発現、原核細胞(大腸菌)における発現のための発現プラスミドのバリアント、真核細胞(例えば、CHO細胞)における一過性発現を適用した。抗体発現カセット以外に、当該ベクターは、大腸菌での当該プラスミドの複製を可能にする複製開始点、大腸菌での耐性を様々な抗生物質(例えば、アンピシリンおよびカナマイシン)に付与する遺伝子を含んだ。
懸濁哺乳動物細胞培養における組換え抗原および抗体の産生
SalI/NotI制限部位においてタンパク質を産生するために、ヒトおよび動物のIL-5Rαの細胞外ドメインをコードする配列を、EPEA、FC、およびH6Fタグと共にプラスミドpEE中へとクローニングした(図1、2、3)。当該プラスミドの必要量を大腸菌において産生し、Qiagenキットを使用して精製した。
実施例2
ナイーブヒトFabファージライブラリーMeganLibTMの工学技術
1千を超える個々のヒトドナーの血液試料由来のBリンパ球の全RNAを、推奨されたプロトコルに従い、RNeasy Mini Kit(QIAGEN)を使用して単離した。Nanovueキット(GE Healthcare)を使用して、RNA濃度アッセイを実施し、単離されたRNAの品質を、1.5%アガロースゲル電気泳動によって試験した。
ファージディスプレイによるヒト抗IL-5RαFabの産生
コンビナトリアルFabファージディスプレイライブラリーMeganLibTMから、特異的抗IL-5RαヒトファージFabを得た。ファージディスプレイにより[Nat Biotechnol. 1996 Mar;14(3):309-14; J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3): 581~97]、ただし、マグネットビーズおよびKingFisher Flex装置を使用して、ヒトIL-5Rαにおいてバイオパニングを実施したが、それは、この技術は、同時に最大96までの異なるスキームおよびバリアントを実施することを可能にすることによる。
特異的および非特異的抗原に対するポリクローナルファージのELISA
ELISAを実施するために、Fc融合タンパク質を伴う標的抗原IL-5Rα-Fcおよび非標的抗原を、高吸収プレート(Greiner-Bio)上に固定した。それぞれ、0.1MのNaHCO3(pH9.0)中における1μg/mlおよび5μg/mlの濃度においてタンパク質を加え、2から7希釈増分において滴定し、次いで、密封したプレートを4℃において一晩インキュベートした。全ての後続のステップを、高性能の自動化されたTecan Freedom EVO 200ベースのロボットプラットフォーム(Tecan)を使用して、標準ELISAプロトコルに従って実施した。非特異的結合をブロックするために、PBS(pH7.4)中における2%の無脂肪ミルクまたは1%のBSAを含むブロッキング緩衝液をプレートのウェルに加えた。プレートを室温で1時間インキュベートした。Tween20(PBST)を含むリン酸塩-塩水緩衝液による数回の洗浄サイクルの後、試験中の50μl/ウェルのポリクローナルファージを加えた。洗浄後、各ウェルを、PBST(1:7500)中における抗M13 HRPコンジュゲート二次抗体(Pierce-ThermoScientific)によってコーティング(50μl/ウェル)した。室温での50分間のインキュベーション後、プレートをPBSTで3回洗浄した。10分間かけて基質溶液(CH3COONa中におけるH2O2-0.02%およびTMB、pH5.5)を加えることによって、比色分析シグナルを得て、次いで、1%の硫酸(20μl)を加えることによって、発色を抑えた。好適なTecan-Sunriseプレート読み取り機(Tecan)を使用して、450nmにおいて発色シグナルを測定した。
発現プラスミド中への抗体可変ドメインの遺伝子の再クローニング
首尾よく成功した選択ラウンドの後のファージミドベクターからの発現プラスミド(図9)中への抗体可変ドメインの遺伝子の再クローニングを、制限ライゲーション技術を使用し、標準的プロトコルに従って実施した。それに続いて、Mabnext Flow Chartプラットフォームを使用したELISAによる、抗原に対するディスプレイライプラリからの可変抗体断片の親和性の比較分析のために、抗体断片を含む発現ベクターを、大腸菌BL21-Gold菌株中へと形質転換した。
ヒトIL-5Rαに特異的に結合する後選択ライブラリーからの高親和性クローンの選択
標準的技術に従って、Fabを産生した:Fab遺伝子を含む発現ベクターを用いて、大腸菌BL21-Gold細菌細胞を形質転換し、その後の誘発剤の添加により、ラックオペロンの転写を引き起こさせ、それにより、結果として得られた転換体を培養する場合、細胞膜周辺腔中へと移出されたFabの発現を生じさせた。次いで、基質に固定されたIL-5Rα-EPEA抗原へのFabの結合を確認するために、0.1MのNaHCO3(pH9.0)において、プレート(medium binding、Greiner bio one社製)上にて0.2μg/mlの濃度でELISAを実施した(抗原は、4℃において一晩かけて固定させた)。発現プラスミドpLLに挿入したFabベンラリズマブ(Medimmune)配列を、ポジティブコントロールとして使用した。全てのさらなるステップを、高性能の自動化されたプラットフォームをベースとするロボットシステムGenetix Qpix2xt(Molecular Devices)およびTecan Freedom EVO 200(Tecan)を使用して、標準的ELISAプロトコルに従って室温において実施した。各ステップの後に、300μl/ウェルの1×PBSTによって、3回の繰り返しにおいて洗浄を実施した。当該プレート上の非特異的結合部位を、1×PBS中における1%の無脂肪ミルクよってブロックし、洗浄後に、大腸菌上清によって代表される分析物(60μl/ウェルの大腸菌上清)を加えた。ペルオキダーゼコンジュゲートヤギ抗Fab抗体(Pierce-ThermoScientific)(1:7500)を使用して、免疫複合体を検出した。15分間かけて、50μlの基質溶液((CH3COONa中におけるH2O2-0.02%およびTMB(pH5.5))を加えることによって、基質-色原性混合物を染色した。反応を止めるために、25μlの1%のH2SO4を使用した。好適なTecan-Sunriseプレート読み取り機(Tecan)を使用して、450nmにおいて発色シグナルを測定した。抗体結合は、発生したシグナルに比例した。発色シグナルがコントロール抗体からのシグナルを超えたクローンを、非特異的結合に対して、ELISAによって試験した。
異なる抗原に対する選択されたFabの非特異的結合の分析
異なる抗原ELISAに対する、関心対象のFabの非特異的結合を分析するためにも、ELISAを用いた。分析は、上記において説明したように実施したが、0.1MのNaHCO3(pH9.0)中におけるIL6R-Fc、PCSK9-VG-FEを、固定化のための抗原として使用した(抗原は、4℃において一晩かけて固定した)。特異的結合コントロールとしてIL-5Rα-FE、IL-5Rα-Fcを使用した(抗原は、4℃において一晩かけて固定した)。全てのさらなる段階を、高性能の自動化されたプラットフォームをベースとするロボットシステム、例えば、Genetix Qpix2xt(Molecular Devices)およびTecan Freedom EVO 200(Tecan)などを用いて、標準的ELISAプロトコルに従って実施した。受容体-リガンド相互作用をブロックするFabを同定するために、発色シグナルがコントロールシグナルを超えなかったクローンを、競合ELISAによって試験した。
リガンドIL-5とのIL-5Rαの相互作用をブロックする高親和性Fabの選択
リガンドIL-5(Sino Biological)とのIL-5Rαの相互作用をブロックする能力に対して、前に選択した抗ヒト特異的Fabを試験するために、競合ELISAを使用した。公開された配列を有するFabのベンラリズマブ(Medimmune)を、ポジティブコントロールとして使用した。
解離速度による高親和性Fabの選択
Pall Forte Bio Octet Red 96を使用して、Koffスクリーニングを実施した。10mMのPBS(pH7.2~7.4)と0.1%のTween20と0.1%のBSAとを含むワーキング緩衝液において、Anti-FABCH1バイオセンサーを30分間再水和させた。大腸菌上清の試料を試験するために、最高10%最終濃度までワーキング緩衝液を加えた。次いで、候補の抗体のFabを含む大腸菌上清中に抗FABCH1バイオセンサーを浸し、4℃で12時間インキュベートした。表面に固定されたFabを有するセンサーを、ワーキング緩衝液の入ったウェルに移動させ、ベースラインを記録した(60秒)。次いで、抗原-抗体会合を達成するために、当該センサーを分析物溶液(IL-5Rα-Fc、30μg/ml)の入ったウェルに移動させた(300秒)。次いで、さらなる解離のために、当該センサーをワーキング緩衝液の入ったウェルに戻した(600秒)。各試験の後、使用したセンサーを再生させるため、それらを、再生緩衝液(10mMのGly-HCl、рH1.7)に3回入れ、次いで、さらなる実験に使用した。得られた曲線を、1:1局所相互作用モデルによる標準的手順に従ってOctet Data Analysis(バージョン9.0)を使用して解析した。
完全長抗体の調製
標準的技術によって、クローニングを実施した。Sal1/Nhe1制限部位において、ベクターpEE-HcIgG1中へと重鎖可変ドメイン配列をクローニングした。Sal1/BsiW1制限部位において、ベクターpEE-CK中へと軽鎖可変ドメインをクローニングした。CHO細胞株におけるタンパク質の一過性産生のために、得られた遺伝子構築物を移した。実施例1において説明したように、細菌性プロテインAにおける親和クロマトグラフィーによって、標準的方法に従ってタンパク質を単離し精製した。メルカプトエタノールおよび天然8%PAGEを補った変成12%PAGEにおいて、電気泳動を実施した(図6)。
Forte Bio Octert RED 384における完全長抗体の親和性の決定
Forte Bio Octert RED 384において、ヒトIL-5Rα抗原に対する抗体の結合親和性の実験研究を実施した。標準的プロトコルおよび製造元の使用説明書に従って、20μg/mlの濃度においてヒトIL-5RαをAR2Gセンサー(ForteBio)の表面上に固定した。ワーキング緩衝液として、0.1%のTween20および0.1%のBSAを含むPBSを使用して、30℃において分析を実施した。ベースラインを記録した後、抗体溶液の入ったウェルにセンサーを300秒間浸漬し、当該複合体を会合させた。次いで、緩衝溶液における複合体解離を600秒間検出した。
IL-5Rαを発現する安定細胞株の調製
CHO-K1細胞株を、5%のFBSを伴うDMEM/F12培地において培養した。製造元のプロトコルに従い、TurboFectを使用して、IL-5RαをコードするDNAを含む遺伝子構築物のトランスフェクションを実施した。
CHO-IL-5R細胞でのADCCアッセイにおけるコントロール再現可能アフコシル化抗体および候補抗IL-5Rα抗体の比較
IL-5Rαを安定して発現するCHO-IL-5R細胞株、および健康なドナーの球状血液単核細胞(PBMC)を、ADCCアッセイにおいて使用した。CHO-IL-5R細胞を、2mMのグルタミンと、5%のFBS(ウシ胎仔血清)と、0.05mg/mlのゲンタマイシンと、0.4mg/mlのハイグロマイシンBとを含むDMEM/F12培地において、5%のCO2を用いて、37℃において培養した。トリプシンによる処理によって当該表面から細胞を除去し、2mMのグルタミン、10%のFBSを伴うRPMI-1640において2回洗浄した。トリパンブルーによって染色した後、血球計を使用して生存率および細胞数を評価した。10%のFBSを伴うRPMI-1640培地において、4×105/mlの濃度の細胞の懸濁液を調製した。
Forte Bio Octet RED 384でのカニクイザル/ウサギ/マウスIL-5Ra受容体との相互作用の分析
Forte Bio Octert RED 384において、動物IL-5Rα抗原に対する抗体の結合親和性の実験研究を実施した。標準的プロトコルおよび製造元の使用説明書に従って、20μg/mlの濃度の抗体をAR2Gセンサー(Forte Bio)の表面上に固定した。ワーキング緩衝液として、0.1%のTween20および0.1%のBSAを含むPBSを使用して、30℃において分析を実施した。ベースラインを記録した後、抗原溶液(動物のIL-5Rα)の入ったウェルにセンサーを300秒間浸漬し、当該複合体を会合させた。次いで、緩衝溶液における複合体解離を600秒間検出した。
実施例15
安定細胞株の生成、抗IL-5Rα抗体の産生および精製
最適な比率の抗体軽鎖および重鎖を含んだベクター構築物を伴う親懸濁CHO-K1-S細胞株に、4D Nucleofector(Lonza)を使用して、エレクトロポレーションによってトランスフェクトすることによって、モノクローナル抗体BCD-133を産生する安定な細胞株を得た。ClonePixロボットプラットフォーム(Molecular Devices)と、異なる培養形式において抗生物質を使用する予備的ミニプール選択ステップを使用することにより、高水準のクローン系統(1000mg/l超)を得た。Octet QK System(Pall Life Sciences)分析システムを使用して、定量分析を実施した。自動化されたシステムであるTecan Genesis Workstation RSP 200/8 Automatic Liquid Handling System(Tecan)において、およびその後のMODDEソフトウェアにおける数学的処理により、基本培地および培養スキームを選択した。無血清培地および動物由来タンパク質を含まない栄養補給を用いて、生産株を培養した。HyCloneシングルユースバイオリアクタ(Thermo Fisher Scientific)50L発酵槽において、前臨床研究のためのBCD-133を調製した。
抗体BCD-133/ヒトIL-5Rα複合体のインシリコモデリング
IL-5Rαに対して特異的な変異体抗体BCD-133を作製するために、Schrodinger Suiteバージョン2017-1(Schrodinger)ソフトウェアを使用して、3D構造解析を行った。IDコード:3VA2の下においてProtein Data Bankに被着させた構造を、標的結晶構造として選択した。Schrodinger SuiteソフトウェアのPIPERツールを使用してドッキングを実施した。最適な位置の選択は、25ナノ秒分子動力学的間隔において、自由エネルギー評価(MM-GBSA法)を用いて行った(D.E. Shaw ResearchによるDesmondインストルメント)。得られた構造を、Maestro(Schrodinger)ツールを使用して視覚化した。図19、20は、BCD-133の可変ドメインを含むモデルを示す。
ヒトIL-5Rαに対して特異的な変異体抗体BCD-133のライブラリーの構築
IL-5Rαに対して特異的な変異体抗体BCD-133を作製するために、Schrodinger Suiteバージョン2017-1(Schrodinger)ソフトウェアおよびIL-5Rαモデル(PDB 3VA2)を使用して3D構造解析を実施した(実施例16も参照されたい)。コンピュータモデルに基づいて、抗体/IL-5Rα複合体の3D構造のセットを作製し、この場合、各3D構造は、抗体親和性および複合体安定性を変更するための6以下のアミノ酸置換を含んだ。次のステップにおいて、結果として得られる構造のセットは、ライブラリーを形成し、それは、当該置換が結果として複合体安定性の増加および抗体親和性の増加を生じるバリアントを含んだ。
動的光散乱を使用したタンパク質凝集点によるコロイド安定性の決定
動的光散乱による研究下での試料の凝集温度を決定するために、40℃から85℃の勾配加熱を用いて、DynaPro(登録商標) Plate Reader II (Wyatt Technology Corp.)を使用して、温度に対する培地での粒子サイズの依存性を得た。結果を表Eに示す。図21および図22は、20mMの酢酸緩衝溶液pH=5.0、および20mMのクエン酸緩衝溶液pH=5.0における研究下での抗体に対する凝集曲線のプロファイルを示す。
50℃での熱応力下での熱的安定性の決定
試験試料を、恒温空気槽に入れ、50℃で72時間恒温に維持した。
加熱後、未処理の圧力を加えた試料を、UV検出器を備えるサイズ排除HPLC(SEC HPLC)によって、および非還元条件下における電気泳動によって分析した。Tosoh TSK-Gel G3000SWXLカラムにおけるAgilent 1100 HPLCシステムにおいてクロマトグラフィーを行い、220nmの波長において検出を行った。Caliper Labchip GX IIにおいて電気泳動を行った。HT Protein Express Reagent Kitを使用して標準的手順に従って、検量線用溶液の調製およびチップの調製を行った。
Claims (27)
- IL-5Rαに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であって、
1)重鎖可変ドメインが、CDR1、CDR2及びCDR3として、それぞれ、配列番号1~3のアミノ酸配列を含み;
2)軽鎖可変ドメインが、CDR1、CDR2及びCDR3として、それぞれ、配列番号6~8のアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。 - 重鎖可変ドメインが、配列番号4~5を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- 軽鎖可変ドメインが、配列番号9~10を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- 1)重鎖可変ドメインが、配列番号4~5を含む群から選択されるアミノ酸配列を含み;そして
2)軽鎖可変ドメインが、配列番号9~10を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む、
請求項1に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。 - 1)配列番号11~12を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖と;
2)配列番号13~14を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む、請求項1に記載のモノクローナル抗体。 - IL-5Rα特異抗体が、完全長IgG抗体である、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- 完全長IgG抗体が、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4アイソタイプの抗体である、請求項6に記載のモノクローナル抗体。
- 完全長IgG抗体が、ヒトIgG1アイソタイプの抗体である、請求項7に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項1~8のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸。
- DNAである、請求項9に記載の核酸。
- 請求項9に記載の核酸であって、前記核酸が、
配列番号15~16を含む群から選択されるヌクレオチド配列であって、請求項1に記載の抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列、および、配列番号17~18を含む群から選択されるヌクレオチド配列であって、請求項1に記載の抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列
を含む、請求項9に記載の核酸。 - 請求項9~11のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項1~8のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を調製するための宿主細胞を産生する方法であって、請求項12に記載の発現ベクターによる細胞の形質転換を含む方法。
- 請求項1~8のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を調製するための宿主細胞であって、請求項9~11のいずれか一項に記載の核酸を含む宿主細胞。
- 請求項1~8のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を調製する方法であって、前記抗体を産生するのに十分な条件下において増殖培地にて、請求項14に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、方法。
- 請求項15に記載の方法であって、前記方法がさらに、得られた抗体を単離および精製するステップを含む、方法。
- 医薬組成物であって、1種または複数種の薬学的に許容される賦形剤との組合せにおいて、請求項1~8のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物。
- 請求項1~8に記載の抗体またはその抗原結合断片、または請求項17に記載の医薬組成物であって、IL-5Rαによって媒介される疾患または障害を予防または治療するために使用されることが意図される、抗体、その抗原結合断片、または医薬組成物。
- 喘息、;COPD(慢性閉塞性肺疾患);チャーグ・ストラウス症候群;好酸球性食道炎、好酸球性胃腸炎を含む群から選択される、IL-5Rαによって媒介される疾患または障害を予防または治療するために使用されることが意図される、請求項18に記載の医薬組成物。
- 請求項19に記載の医薬組成物であって、前記喘息が好酸球性喘息(アトピー性喘息)または重篤な好酸球性喘息(アトピー性喘息)である、医薬組成物。
- 医薬組合せであって、請求項1~8のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と、少なくとも1種の異なる治療的活性化合物とを含む医薬組合せ。
- 請求項21に記載の医薬組合せであって、IL-5Rαによって媒介される疾患または障害を予防または治療するために使用されることが意図される、医薬組合せ。
- IL-5Rαによって媒介される疾患または障害を予防または治療するために使用されることが意図される請求項21に記載の医薬組合せであって、前記疾患または障害が、喘息、;COPD(慢性閉塞性肺疾患);チャーグ・ストラウス症候群;好酸球性食道炎、好酸球性胃腸炎を含む群から選択される、医薬組合せ。
- 請求項23に記載の医薬組合せであって、前記喘息が好酸球性喘息(アトピー性喘息)または重篤な好酸球性喘息(アトピー性喘息)である、医薬組合せ。
- 異なる治療的活性化合物が、小分子、抗体、またはステロイドホルモンから選択される、請求項21に記載の医薬組合せ。
- 請求項25に記載の医薬組合せであって、前記ステロイドホルモンがコルチコステロイドである、医薬組合せ。
- IL-5Rαの生物活性を阻害することを必要とする対象においてそのような生物活性を阻害するために使用されることが意図される、請求項1~8のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、医薬組成物。
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