CN110903392B - 与gitr特异性结合的单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术，尤其涉及抗体或其抗原结合片段及其用途。更具体说，本发明涉及与GITR特异性结合的单克隆抗体。本发明还涉及一种编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸，一种表达载体，一种制备该抗体的方法，以及所述抗体在治疗GITR相关疾病或病症中的用途。

Description

与GITR特异性结合的单克隆抗体
技术领域
本发明涉及生物技术，尤其涉及抗体或其抗原结合片段，以及其用途。更具体而言，本发明涉及与GITR(糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白/TNFRSF18/肿瘤坏死因子受体超家族成员18)特异性结合的单克隆抗体。本发明还涉及一种编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸，一种表达载体，一种制备该抗体的方法，以及该抗体在治疗GITR相关疾病或病症中的用途。
背景技术
TNFRSF18，即GITR(糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白/TNFRSF18/肿瘤坏死因子受体超家族)为一种膜蛋白，而且是一种属于肿瘤坏死因子受体超家族的受体。
GITR为一种I型跨膜蛋白，由216个氨基酸组成，分子量为26kDa，其N端胞外区含三个TNFR-Cys重复区和N糖基化位点。这三个半胱氨酸富含区和GITR的胞质内尾区与4-1BB、OX40及CD27具有显著的同质性(Nocentini,etal.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94:6216-6221)。
人GITR在应答性T细胞中低水平表达，其中，在CD4+细胞中的表达水平高于在CD8+细胞中的表达水平。T细胞激活后，其GITR表达水平将在数天后显著上调。GITR在CD4+CD25+细胞或CD8+CD25+细胞等调节性T细胞中进行高水平的组成型表达，而且该表达水平在激活后的此类细胞中进一步上调(Nocentini and Riccardi(2005)Е.J.Immunol.35:1016)。
GITR的表达并不仅局限于T细胞。数项研究表明，NK细胞、巨噬细胞、B细胞、树突细胞、肥大细胞以及单核细胞上也存在GITR表达(Nocentini and Riccardi(2005)Е.J.Immunol.35:1016-1022)。GITR在淋巴结、外周血白细胞中有所表达，在脾脏中低程度表达，在调节性T细胞上进行大量组成型表达，在初始T细胞和记忆细胞上进行少量组成型表达。然而，除了免疫细胞之外，GITR还在肿瘤细胞上表达。与33种肿瘤中的GITR表达相关的RNA测序数据分析结果表明，GITR在头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、食道癌及膀胱癌中高度表达。24种肿瘤样本的RNA测序分析呈现类似的结果。由此可见，GITR不但在免疫细胞上表达，而且还在肿瘤细胞的细胞膜上表达。在肿瘤样本中，GITRL-Fc可促进与T细胞、CD8T细胞、细胞毒性、Th1细胞、干扰素-γ、NK细胞、效应性T细胞以及T细胞激活标志物相关的基因表达。
GITR及其配体的表达并不限于造血细胞。角质形成细胞、破骨细胞前体上也存在GITR表达，而GITR配体在内皮细胞上表达。
与大多数TNF配体家族成员的典型状况一致，GITR配体为一种II型跨膜蛋白。目前的研究结果表明，人GITR配体通常以三聚体的形式存在，但是也可以单体形式存在，或者组成其他多聚体形式(Chattopadhyay,et al.(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.104:19452-19457；Zhou,et al.(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.105:635-640)。某些证据表明，GITR配体还可生成为可溶解形式(Baltz,et al.(2008)Blood 112:3735-3743；Mahesh,et al.(2006)Eur.J.Immunol.36：2128-2138)。GITR配体主要在抗原呈递细胞(APC)上表达，此类抗原呈递细胞包括能够起到抗原呈递细胞作用的巨噬细胞、B细胞、树突细胞和内皮细胞(Nocentini and Riccardi(2005)Е.J.Immunol.35:1016-1022；Agostini,et al.(2005)Infect.Immun. 73:7502-7508；Nocentini,et al.(2007)E.J.Immunol.37:11651169)。
当抗原呈递细胞上的GITR配体与应答性T细胞上的GITR结合时，会触发GITR信号的生成，该信号对应答性T细胞形成共刺激，并遏制调节性T细胞的抑制活性。GITR信号用作CD4+和CD8+两种初始T细胞的共激活信号，以尤其在T细胞受体(TCR)刺激几近最佳状态时，诱导或增强增殖和效应功能(Schaer,et al.(2012)Curr.Opin.Immunol.24:217224)。更具体而言，GITR可对效应性T细胞和调节性T细胞产生数种作用，包括：对效应性T细胞进行共刺激和共激活，以增强其对抑制作用的抵抗力；抑制调节性T细胞；降低效应性T细胞对调节性T细胞抑制作用的敏感度；以及从循环中部分去除调节性T细胞(Nocentini,et al.(2007)Eur.J.Immunol.37:1165-1169)。
GITR的主要功能，亦即抗GITR抗体的主要作用在于，增强效应性T细胞的增殖和功能，以及遏制调节性T细胞的抑制作用。效应性T细胞在生成初期不具备抵抗抑制性肿瘤微环境和调节性T细胞抑制作用的能力。在后续的致敏和发育阶段，通过激动型抗GITR抗体、可溶性GITR配体或树突状细胞疫苗进行GITR刺激，可对效应性和调节性两种T细胞的肿瘤疗效进行有利于上述能力的调节，从而促进肿瘤消退。由此可见，抗GITR抗体可赋予效应性T细胞抵抗调节性T细胞抑制作用的能力。总体而言，上述功能，尤其应答性T细胞共刺激功能以及调节性T细胞抑制活性消除功能意味着，GITR的激活会导致免疫应答的增强。因此，GITR的激活具有恢复针对感染和肿瘤的免疫应答的潜力，而且具有GITR激活功能的分子具有在需要触发更强免疫应答的状况下作为免疫刺激剂的使用价值。此类抗体必须具有对调节性T淋巴细胞具有效应细胞毒性的GITR激动剂的特性。
本领域已存在多种针对GITR的已知抗体(如WO2015187835、WO2015031667、WO2017068186、WO2017096189、WO2017214548)。
目前，共有23种抗GITR激动剂(抗体/重组GITR配体)已投入临床前及临床试验阶段。其中，仅两种抗体(TRX518，INCAGN1876)处于2期临床试验阶段，三种抗体(AMG228，MEDI1873，MK-4166)处于1期临床试验阶段。目前，几乎尚未有任何临床数据。然而，在当前时间节点上，世界范围内尚无任何治疗用途已获批准的与GITR特异性结合的抗体。
综上所述，开发如下新的激动型抗体具有重要意义：与GITR相互作用；激活受体；消除调节性T细胞的抑制作用；通过ADCC效应物特性，抑制/消耗免疫系统的T抑制性(调节性)成分。
BCD-166为一种激动型单克隆抗体，其可与GITR相互作用，激活受体，消除调节性T细胞的抑制作用，利用ADCC效应物特性抑制/消耗免疫系统的T抑制物(调节性)成分，从而增加CD8+和CD4+效应性细胞的数量，并激活肿瘤微环境中免疫系统的T效应物成分。
发明内容
在一个方面中，本发明涉及一种与GITR特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，含：
(a)重链可变区，所述重链可变区含：
(i)CDR1，所述CDR1含选自下组的氨基酸序列：
NYGMH(SEQ ID NO.1)或YYWMY(SEQ ID NO.12)；
(ii)CDR2，所述CDR2含选自下组的氨基酸序列：
VIWFDGSNKFYTDSVKG(SEQ ID NO.2)或AISWNGGRTYYAESMKG(SEQ ID NO.13)；
(iii) CDR3，所述CDR3含选自下组的氨基酸序列：
ELGGYYYDSSGFRPYYYGMDV(SEQ ID NO.3)或NRYYSDPNYGMNL(SEQ ID NO.14)，以及
(b)轻链可变区，所述轻链可变区含：
(i)CDR1，所述CDR1含选自下组的氨基酸序列：
RASQSIGSWLA(SEQ ID NO.7)或TGTSTDIGTYKYIS(SEQ ID NO.17)；
(ii)CDR2，所述CDR2含选自下组的氨基酸序列：
AASTLQR(SEQ ID NO.8)或GVSHRPS(SEQ ID NO.18)；
(iii)CDR3，所述CDR3含选自下组的氨基酸序列：
QQSHSHPLT(SEQ ID NO.9)或SSYTSSGTVV(SEQ ID NO.19)。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含重链可变区，所述重链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ IDNO.2所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.3所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含重链可变区，所述重链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.12所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ IDNO.13所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.14所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含轻链可变区，所述轻链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.7所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ IDNO.8所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.9所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含轻链可变区，所述轻链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.17所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ IDNO.18所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.19所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含：
-重链可变区，所述重链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ ID NO.2所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.3所示氨基酸序列；
-轻链可变区，所述轻链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.7所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ ID NO.8所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.9所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含：
-重链可变区，所述重链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.12所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ ID NO.13所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.14所示氨基酸序列；
-轻链可变区，所述轻链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.17所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ ID NO.18所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.19所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含重链可变区，所示重链可变区含与SEQ ID NO.4所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含重链可变区，所述重链可变区含SEQ ID NO.4所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含重链可变区，所述重链可变区含与SEQ ID NO.15所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含重链可变区，所述重链可变区含SEQ ID NO.15所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含轻链可变区，所述轻链可变区含与SEQ ID NO.10所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含轻链可变区，所述轻链可变区含SEQ ID NO.10所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含轻链可变区，所述轻链可变区含与SEQ ID NO.20所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含轻链可变区，所述轻链可变区含SEQ ID NO.20所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含：
-重链可变区，所述重链可变区含与SEQ ID NO.4所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列；
-轻链可变区，所示轻链可变区含与SEQ ID NO.10所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含：
-重链可变区，所述重链可变区含SEQ ID NO.4所示氨基酸序列；
-轻链可变区，所述轻链可变区含SEQ ID NO.10所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含：
-重链可变区，所述重链可变区含与SEQ ID NO.15所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列；
-轻链可变区，所示轻链可变区含与SEQ ID NO.20所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含：
-重链可变区，所述重链可变区含SEQ ID NO.15所示氨基酸序列；
-轻链可变区，所述轻链可变区含SEQ ID NO.20所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种与GITR特异性结合的单克隆抗体为全长IgG抗体。
在一些实施方式中，所述全长IgG抗体属人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
在一些实施方式中，所述全长IgG抗体属人IgG1同种型。
在一些实施方式中，一种与GITR特异性结合的单克隆抗体，含有在其Fc片段中用于提高激动剂特性及抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、但不提高补体依赖性细胞毒性(CDC)的E345R突变。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含重链，所述重链含与SEQ ID NO.5所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含重链，所述重链含SEQ ID NO.5所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含重链，所述重链含与SEQ ID NO.6所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含重链，所述重链含SEQ ID NO.6所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含轻链，所述轻链含与SEQ ID NO.11所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含轻链，所述轻链含SEQ ID NO.11所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含：
-重链，所述重链含与SEQ ID NO.5所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列；
-轻链，所述轻链含与SEQ ID NO.11所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含：
-重链，所述重链含SEQ ID NO.5所示氨基酸序列；
-轻链，所述轻链含SEQ ID NO.11所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含：
-重链，所述重链含与SEQ ID NO.6所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列；
-轻链，所述轻链含与SEQ ID NO.11所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含：
-重链，所述重链含SEQ ID NO.6所示氨基酸序列；
-轻链，所述轻链含SEQ ID NO.11所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含重链，所述重链含与SEQ ID NO.16所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含重链，所述重链含SEQ ID NO.16所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含轻链，所述轻链含与SEQ ID NO.21所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含轻链，所述轻链含SEQ ID NO.21所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含：
-重链，所述重链含与SEQ ID NO.16所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列；
-轻链，所示轻链含与SEQ ID NO.21所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含：
-重链，所述重链含SEQ ID NO.16所示氨基酸序列；
-轻链，所述轻链含SEQ ID NO.21所示氨基酸序列。
在一个方面中，本发明涉及一种编码任何上述抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。
在一些实施方式中，所述核酸为DNA。
在一个方面中，本发明涉及一种含上述核酸的表达载体。
在一个方面中，本发明涉及一种获得用于生成上述抗体或其抗原结合片段的宿主细胞的方法，所述方法包括以上述载体进行细胞转化。
在一个方面中，本发明涉及一种用于制备含上述核酸的上述抗体或其抗原结合片段的宿主细胞。
在一个方面中，本发明涉及一种获得上述抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括以足以生成所述抗体的条件，在培养基中培养上述宿主细胞，以及必要时，随后对所得抗体进行分离和纯化。
在一个方面中，本发明涉及一种用于治疗GITR介导的疾病或病症的药物组合物，所述药物组合物含有与一种或多种药学上可接受的赋形剂相组合的治疗有效量的上述抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，一种药物组合物旨在用于治疗GITR介导的疾病或病症，所述疾病或病症选自含宫颈癌、头颈癌、胃癌、乳腺癌、肾细胞癌、结直肠癌(CRC)、卵巢癌(OC)、非小细胞肺癌(NSCLC)在内的组。
在一个方面中，本发明涉及一种治疗GITR介导的疾病或病症的药物组合物，所述药物组合物含治疗有效量的上述抗体或其抗原结合片段，以及至少一种治疗有效量的具有治疗活性的抗肿瘤化合物。
在一些实施方式中，一种药物组合物，旨在用于治疗GITR介导的疾病或病症，所述疾病或病症选自含宫颈癌、头颈癌、胃癌、乳腺癌、肾细胞癌、结直肠癌(CRC)、卵巢癌(OC)、非小细胞肺癌(NSCLC)在内的组。
在一些实施方式中，一种药物组合物，所述的具有治疗活性的抗肿瘤化合物选自化疗剂、抗体或抗激素剂。
在一些实施方式中，一种药物组合物，所述的具有治疗活性的抗肿瘤化合物选自含抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA4抗体、抗4-1BB抗体、抗OX40抗体及其组合在内的组。
在一些实施方式中，一种药物组合物，所述的具有治疗活性的抗肿瘤化合物为小分子化合物。
在一些实施方式中，一种药物组合物，所述的具有治疗活性的抗肿瘤化合物选自先天免疫激活剂或后天免疫激活剂。
在一种药物组合物的一些实施方式中，上述抗体与至少一种具有治疗活性的抗肿瘤化合物先后施用。
在一种药物组合物的一些实施方式中，上述抗体与至少一种具有治疗活性的抗肿瘤化合物同时施用。
在一个方面中，本发明涉及一种对具有抑制需求的对象体内的GITR生物活性进行抑制的方法，所述方法包括施用有效量的上述抗体或其抗原结合片段。
在一个方面中，本发明涉及一种治疗GITR介导的疾病或病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的上述抗体或其抗原结合片段或上述药物组合物施用至具有此类治疗需求的对象。
在一些实施方式中，所述疾病或病症选自含宫颈癌、头颈癌、胃癌、乳腺癌、肾细胞癌、结直肠癌(CRC)、卵巢癌(OC)、非小细胞肺癌(NSCLC)在内的组。
在一个方面中，本发明涉及上述抗体或其抗原结合片段或上述药物组合物治疗对GITR介导的疾病或病症具有相应治疗需求的对象的用途。
在一些实施方式中，所述疾病或病症选自含宫颈癌、头颈癌、胃癌、乳腺癌、肾细胞癌、结直肠癌(CRC)、卵巢癌(OC)、非小细胞肺癌(NSCLC)在内的组。
附图说明
图1、pEE-GITR-TEV-羊驼Fc蛋白生成质粒。
图2、pEE-GITR-Fc蛋白生成质粒。
图3、pEE-人GITR配体-折叠子-EPEA质粒图。
图4、SDS-PAGE(4～20％凝胶)
1.雅美罗(Actemra)(2.5mg)
2.未标记PW标记物(Fermentas)
3.-
4.GITR-TEV-羊驼Fc+β-巯基乙醇(10mL)
5.血管生成素2-H6F+β-巯基乙醇(10mL)
6.-
7.GITR-TEV-羊驼Fc-β-巯基乙醇(10mL)
8.血管生成素2-H6F-β-巯基乙醇(10mL)
图5、SDS凝胶电泳
1.未标记PW标记物(Fermentas)
2.-
3.hGITR配体-EPEA(培养基纯化前，5mL)
4.hGITR配体-EPEA(培养基纯化后，5mL)
5.hGITR配体–EPEA
图6、人天然组合库合成方案
图7、用于克隆Fab噬菌体展示库的噬菌粒pH5图。
图8、用于生成分泌Fab的表达质粒pLL图。
图9、编码抗体重链且用于在哺乳动物细胞内瞬时生成抗体的表达载体pEE-BCD166-01-001-VH-HC图。
图10、编码抗体轻链且用于在哺乳动物细胞内瞬时生成抗体的表达载体pEE-BCD166-01-001-VK-CK图。
图11、12％凝胶+β-巯基乙醇的SDS-PAGE
1.Actemra(5mL)
2.未标记PW标记物(Fermentas)
3.-
4.抗GITR抗体(批次号1161，培养基纯化前，5mL)
5.抗GITR抗体(批次号1161，培养基纯化后，5mL)
6.抗GITR抗体(批次号1161，5mL)
7.抗GITR抗体(批次号1162，5mL)
8.抗GITR抗体(批次号1163，5mL)
9.抗GITR抗体(批次号1164，5mL)
10.抗GITR抗体(批次号1165，5mL)
11.抗GITR抗体(批次号1166，培养基纯化前，5mL)
12.抗GITR抗体(批次号1166，培养基纯化后，5mL)
13.抗GITR抗体(批次号1166，5mL)
14.抗GITR抗体(批次号1167，5mL)
图12、12％凝胶+β-巯基乙醇的SDS-PAGE
1.未标记PW标记物(Fermentas)
2.抗GITR抗体(批次号1208，培养基纯化前，10mL)
3.抗GITR抗体(批次号1208，培养基纯化后，10mL)
4.抗GITR抗体(批次号1208，5mL)
5.抗GITR抗体(批次号1209，5mL)
6.抗GITR抗体(批次号1210，5mL)
7.抗GITR抗体(批次号1211，5mL)
8.抗GITR抗体(批次号1212，5mL)
9.抗GITR抗体(批次号1213，5mL)
10.抗GITR抗体(批次号1214，培养基纯化前，10mL)
11.抗GITR抗体(批次号1214，培养基纯化后，10mL)
12.抗GITR抗体(批次号1214，5mL)
图13、报告基因细胞系分析中批次号为1161(BCD166-01-01)、1210(BCD166-01-011)、1213(BCD166-01-014)的抗GITR单克隆抗体的特异性激动剂活性检验结果图。
图14、BCD166-01-01抗体与人GITR、小鼠GITR、食蟹猴GITR的特异性结合状况检验结果图。
图15、BCD166-01-011抗体与人GITR、小鼠GITR、食蟹猴GITR的特异性结合状况检验结果图。
图16、BCD166-01-014抗体与人GITR、小鼠GITR、食蟹猴GITR的特异性结合状况检验结果图。
图17、测试抗体BCD166-01-01、BCD166-02-01、BCD166-01-014细胞激动剂测定中的激活水平结果图。
图18、测试抗体BCD166-01-01、BCD166-02-01、BCD166-01-014的ADCC测定EC50值结果图。
图19、测试抗体BCD166-01-01、BCD166-02-01、BCD166-01-014的CDC水平结果图。
图20、候选抗GITR抗体与阴性对照对反应细胞(NK)的作用结果比较图。
图21、候选抗GITR抗体与阴性对照对反应细胞(B)的作用结果比较图。
图22、候选抗GITR抗体与阴性对照对反应细胞(CD3)的作用结果比较图。
图23、候选抗GITR抗体与阴性对照对反应细胞(CD8+T细胞)的作用结果比较图。
图24、候选抗GITR抗体与阴性对照对反应细胞(CD4+T细胞)的作用结果比较图。
图25、供体1细胞材料在候选抗GITR抗体作用下的抗体依赖性nTreg消耗状况分析。
图26、供体2细胞材料在候选抗GITR抗体作用下的抗体依赖性nTreg消耗状况分析。
图27、供体1和供体2细胞材料在候选抗GITR抗体作用下的抗体依赖性iTreg消耗状况分析。
图28、抗GITR抗体对可刺激抗癌效果的促炎性细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌水平的作用分析结果。
图29、候选抗体BCD166-02-01与γ受体的结合亲和力常数数据表。
图30、BCD166-02-01在72小时50℃温育条件下的稳定性。
图31、BCD166-01-014在72小时50℃温育条件下的稳定性。
图32、实验过程中各组的平均肿瘤体积值。
图33、第33天的肿瘤生长抑制指数。
具体实施方式
一、定义和通用方法
除非另外定义，否则本申请使用的所有科技术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。此外，除非上下文另有要求，否则单数词语应同时包括其复数含义，而且复数词语应同时包括其单数含义。一般而言，本申请所述的细胞培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、有机合成化学、医药化学以及蛋白质和核酸杂交及化学的分类和方法为本领域技术人员熟知且广为使用。酶反应及纯化方法均依照制造商的说明书进行，其或为本领域常见方法，或已载于本申请之中。
二、抗体相关定义
TNFRSF18，亦即GITR(糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白/TNFRSF18/肿瘤坏死因子受体超家族)为一种膜蛋白，而且是一种属于肿瘤坏死因子受体超家族的受体。GITR为一种I型跨膜蛋白，由216个氨基酸组成，分子量为26kDa，其N端胞外区含三个TNFR-Cys重复区和N糖基化位点。这三个半胱氨酸富含区和GITR的胞质内尾区与4-1BB、OX40及CD27具有显著的同质性(Nocentini,et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94:6216-6221)。
在包括宫颈癌、头颈癌、胃癌、乳腺癌、肾细胞癌、结直肠癌(CRC)、卵巢癌(OC)、非小细胞肺癌(NSCLC)在内的多种癌症疾病中均可见GITR基因的扩增以及/或者其蛋白质的过表达。
“结合分子”一词既包括抗体，也包括免疫球蛋白。
本说明书中使用的“抗体”或“免疫球蛋白”(Ig)两词既包括完整抗体，也包括其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”一词指含以二硫键互连的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白，或者指抗原结合部分。每一重链均包括重链可变区(本申请中缩写为VH)及重链恒定区。已知哺乳动物的Ig重链存在五种不同类型，分别以希腊字母α，δ，ε，γ和μ表示。抗体根据目前已知的重链类型分类，分别称IgA，IgD，IgE，IgG和IgM抗体。不同重链在大小和组成上有所不同：α重链和γ重链约含450个氨基酸，而μ重链和ε重链约有550个氨基酸。每一重链均具有恒定区和可变区两种区域。同种型的所有抗体的恒定区完全相同，非同种型的抗体具有不同恒定区。γ重链，α重链和δ重链的恒定区由CH1，СН2和CH3三个恒定区(连成一线)以及用于增加柔性的铰链区(Woof J.,Burton D.,Nat RevImmunol 4,2004,cc.89-99)组成。μ重链和ε重链的恒定区由CH1，СН2，CH3和CH4四个恒定区组成。在哺乳动物中，已知仅存在两种轻链，分别表示为λ和κ。每一轻链均由轻链可变区(本申请中缩写为VL)及轻链恒定区构成。轻链长度大约为211～217个氨基酸。上述轻链优选为κ轻链，而且恒定区CL优选为Cκ区。
本发明“抗体”可属于任何类别(如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，优选IgG)或子类别(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2，优选IgG1)。
VL区和VH区可进一步细分为所谓互补决定区(CDR)的超变区以及所谓骨架区(FR)的更为保守的区域，超变区散布于骨架区之间。每一VL区和VH区均由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端以如下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合区。抗体恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与免疫系统的各种细胞(如效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(Clq)的结合。
在本申请中，抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”一词(或简称“抗体部分”或“抗体片段”)是指抗体的具有与抗原特异性结合能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段实现。涵盖于抗体的“抗原结合部分”一词内的结合片段例如包括：(1)Fab片段，该片段为由VL区、VH区、CL区和CH1区构成的单价片段；(2)F(ab')2片段，该片段为含由位于铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(3)由VH区和CH1区构成的Fd片段；(4)由同一抗体臂的VL区和VH区构成的Fv片段；(5)由VH/VHH区构成的dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature341:544-546)；以及(6)提取获得的互补决定区(CDR)。此外，Fv片段的VL和VH两区由不同的基因编码，而且可通过采用合成接头的重组方法相互连接，该合成接头使得其可接收单个蛋白质链，在该链中所述VL和VH区相互配对，从而形成单价分子(称为单链Fv(scFv)，例如见：Bird et al.(1988)Science242:423-426；Huston etal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链分子也应涵盖于抗体的“抗原结合部分”一词内。此类抗体片段通过本领域技术人员已知的常规技术获得，而且其筛选方式与完整抗体的筛选方式相同。
优选地，本发明抗原结合部分或完整抗体抗原结合部分的CDR源自小鼠、羊驼或人供体库，或者基本上为人源CDR，即带有某些变更氨基酸残基的人源CDR。举例而言，可通过以不同氨基酸残基进行取代而优化相应抗体的特性，如优化其KD、koff、IC50、EC50、ED50。优选地，本发明抗体的骨架区为人源骨架区，或基本上为人源骨架区(至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％为人源)。
在其他实施方式中，本发明抗原结合部分可源自其他非人物种，包括但不限于小鼠、羊驼、兔、
大鼠或仓鼠。或者，所述抗原结合区可源自人类物种。
“可变”一词是指可变区的某些部分在不同抗体间存在较大的序列差异这一事实。V区介导抗原的结合，并决定每种特定抗体针对其特定抗原的特异性。然而，在可变区的由110个氨基酸组成的跨度上，可变性的分布并不均匀。相反，V区由所谓骨架区(FR)的不变片段及所谓“超变区”(CDR)的超高可变性区域组成，骨架区含15～30个氨基酸，并且被超变区相互隔开，超变区的氨基酸链更短。天然重链和轻链的每一可变区均含有很大程度上采用β-折叠构型的四个FR以及连接这些FR的三个超变区，这些超变区形成连接所述β-折叠结构的环，或者有时作为该β-折叠结构的一部分。每条链中的超变区均由相应FR紧密地保持在一起，而且与其他链中的超变区一道参与形成抗体的抗原结合位点。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但其具有各种效应功能，例如使抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
本申请中使用的“超变区”一词是指抗体中负责结合抗原的氨基酸残基。超变区通常含有“互补决定区”(CDR)氨基酸残基以及/或者“超变环”氨基酸残基。
在某些情况下，为了提高与靶表位的结合亲和力，还可能需要改变一个或多个CDR氨基酸残基。这一方法称为“亲和力成熟法”，并可选与人源化结合实施。举例而言，当抗体人源化导致结合特异性或结合亲和力下降，而且无法单纯通过回复突变改善结合特异性或结合亲和力时，可结合实施亲和力成熟法。本领域中已有各种人所熟知的亲和力成熟法，例如Burks et al.,Proc Natl Acad Sci USA,94:412-417(1997)描述的体外扫描饱和诱变法，以及Wu et al.,Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042(1998)描述的逐步体外亲和力成熟法。
“骨架区”(FR)为CDR残基之外的可变区残基。每一可变区一般具有四个FR，分别称为FR1，FR2，FR3和FR4。当按照Kabat方案定义CDR时，轻链FR残基大致为轻链中的1～23位残基(LCFR1)、35～49位残基(LCFR2)、57～88位残基(LCFR3)以及98～107位残基(LCFR4)，重链FR残基大致为重链中的1～30位残基(HCFR1)、36～49位残基(HCFR2)、66～94位残基(HCFR3)以及103～113位残基(HCFR4)。当CDR含超变环氨基酸残基时，轻链FR残基大致为轻链中的1～25位残基(LCFR1)、33～49位残基(LCFR2)、53～90位残基(LCFR3)以及97～107位残基(LCFR4)，重链FR残基大致为重链中的1～25位残基(HCFR1)、33～52位残基(HCFR2)、56～95位残基(HCFR3)以及102-113位残基(HCFR4)。在一些情况下，当CDR既含有按照Kabat定义的CDR氨基酸残基，也含有超变环氨基酸残基时，则对FR残基进行相应调整即可。例如，当CDRH1包括H26～H35氨基酸时，则重链FR1残基为1～25位残基，FR2残基为36～49位残基。
免疫球蛋白的片段可结晶区域(“Fc区”或“Fc”)为免疫球蛋白分子的“尾部”区域，该区域具有与细胞表面Fc受体以及补体系统的某些蛋白相互作用的特性，从而使得抗体能够激活免疫系统。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由分别源自两条重链的第二和第三恒定区的两个完全相同的蛋白片段组成。在IgM和IgE同种型中，Fc区的每一多肽链均含三个重链恒定区(CH区2～4)。
与靶抗原“结合”的本发明抗体是指能够以足够的亲和力与该抗原结合，从而使得该抗体可用作靶向表达所述抗原的蛋白质或细胞的诊断剂和/或治疗剂，并可与其他蛋白质发生轻微的交叉反应。根据荧光激活细胞分选(FACS)、放射免疫测定(RIA)或ELISA分析方法，在此类实施方式中，抗体与非靶蛋白的结合程度小于抗体与特异靶蛋白的结合程度的10％。就抗体与靶分子的结合而言，“特异性结合”、“特异性结合于”或针对特定多肽或特定多肽靶上的表位“具有特异性”一词是指与非特异性相互作用(例如，在bH1-44或bH1-81情况下，非特异性相互作用指与牛血清白蛋白、酪蛋白、胎牛血清或中性亲和素蛋白的结合)具有显著差异(可测程度的差异)的结合。
特异性结合可例如通过比较特定分子的结合情况与对照分子的结合情况的方式衡量。举例而言，可通过与类似于靶标的对照分子(如过量的未标记靶标)相竞争的方式，进行特异性结合的测定。在此情况下，如果标记靶标与探针的结合被过量的未标记靶标竞争性抑制，则表明存在特异性结合。在本申请中，“特异性结合”、“特异性结合于”或针对特定多肽或特定多肽靶上的表位“具有特异性”一词可描述为分子的靶标Kd至少为约200nM，或至少为约150nM，或至少为约100nM，或至少为约60nM，或至少为约50nM，或至少为约40nM，或至少为约30nM，或至少为约20nM，或至少为约10nM，或至少为约8nM，或至少为约6nM，或至少为约4nM，或至少为约2nM，或至少为约1nM，或更高。在一种实施方式中，“特异性结合”是指分子与特定多肽或特定多肽上的表位结合，而且基本上不与任何其他多肽或多肽表位结合。
本申请中使用的“Ka”一词旨在表示特定抗体抗原相互作用的结合(Kon)速率。
本申请中使用的“Kd”一词旨在表示特定抗体抗原相互作用的解离(Koff)速率。
“结合亲和力”一般指分子(如抗体)的各个单结合位点与其结合对象(如抗原)之间的非共价相互作用的总强度。除非另有说明，否则“结合亲和力”是指反映一对结合物(如抗体和抗原)当中两成份间的1：1相互作用的固有结合亲和力(特征结合亲和力、真实结合亲和力)。一般情况下，分子X针对其结合对象Y的亲和力可由解离常数(Kd)表示。优选Kd值为约200nM，150nM，100nM，60nM，50nM，40nM，30nM，20nM，10nM，8nM，6nM，4nM，2nM，1nM或更小。亲和力可通过包括本申请所描述方法在内的本领域已知常规方法测量。低亲和力抗体与抗原的结合一般较为缓慢且易于解离，而高亲和力抗体与抗原的结合一般较快且易于长时间保持结合。本领域存在多种已知的结合亲和力测量方法，所有这些方法均可用于本发明目的。
在一种实施方式中，“Kd”或“Kd值”通过表面等离子体共振测定法测量，该方法采用BIAcoreTM-2000或-3000(BIAcore Inc.公司：美国新泽西州皮斯卡特维镇)、25°С的温度、固定化抗原CM5芯片以及约10个共振单位(RU)。简单地说，根据制造商说明书，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)对羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.公司)进行活化。将抗原以10mM乙酸钠(pH＝4.8)稀释至5μg/mL(约0.2μM)后，以5μL/分钟的流速注入，以实现约10个共振单位(RU)的结合蛋白。抗原注入完成后，通过注入1M乙醇胺溶液，将未反应的基团封闭。为了进行动力学测量，在25℃下，将Fab的两倍连续稀释液(如0.78nM～500nM)以约25μL/min的流速注入含0.05％吐温20的PBS(PBST)中。采用简易一对一朗缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore评价软件3.2版)，并通过结合传感图和解离传感图的同时拟合，计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon之比，例如见Chen,Y.,et al.,(1999)J.Mol.Biol.293:865-881。如果通过上述表面等离子体共振测定法求得的结合速率超出106M-1s-1，则可通过荧光猝灭技术测定结合速率，该技术利用带停流功能分光光度计(AvivInstruments)或带搅拌比色杯的8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)等光谱仪，在逐渐增大抗原浓度的同时，于25℃下测定PBS(pH＝7.2)中20nM抗抗原抗体溶液(Fab形式)的荧光发射强度(激发波长＝295nM；发射波长＝340nM，16nM带通)的增减变化。
“koff”一词是指结合分子与抗原之间的特定相互作用的解离速率常数。解离速率常数koff可通过生物层干涉法测量，该方法例如采用OctetTM系统。
本发明中的“结合速率”或“kon”同样可通过使用上述表面等离子体共振测定法测量，该方法采用BIAcoreTM-2000或-3000(BIAcoreInc.：美国新泽西州皮斯卡特维镇)、25℃的温度、固定化抗原CM5芯片以及约10个相对单位(共振单位，RU)。简单地说，根据制造商说明书，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)对羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)进行活化。将抗原以10mM乙酸钠(pH＝4.8)稀释至5μg/mL(约0.2μM)后，以5μL/分钟的流速注入，以实现约10个共振单位(RU)的结合蛋白。抗原注入完成后，通过注入1M乙醇胺溶液，将未反应的基团封闭。
除非另有说明，否则与本发明多肽相关的“生物意义上的活性”、“生物活性”及“生物特性”三词是指具有结合生物分子的能力。
“生物分子”一词是指核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质及其组合。在一种实施方式中，所述生物分子是自然界存在的生物分子。
Fab和F(ab')2等抗体片段可利用现有技术从完整抗体中制得，例如通过以木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗体的方式制得。此外，可利用标准的重组DNA技术(如本申请所描述的技术)制备抗体、抗体部分以及免疫粘附分子。
“重组抗体”一词旨在表示表达于含抗体编码核苷酸序列的细胞或细胞系内的抗体，其中，该核苷酸序列并非天然结合于所述细胞上的核苷酸序列。
本申请中使用的“变体抗体”一词旨在表示通过在“亲本”抗体氨基酸序列的基础上增加、删除和/或取代一个或多个氨基酸残基而具有异于该亲本抗体的氨基酸序列的抗体。在一种优选实施方式中，变体抗体在亲本抗体的基础上增加、删除和/或取代至少一个或多个(如1～12个，进一步如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个；在一些实施方式中，为1～10个)氨基酸。在一些实施方式中，此类增加、删除和/或取代发生于变体抗体的CDR中。在本申请中，与变体抗体序列相关的同源性或同质性定义为变体抗体序列中与亲本抗体序列氨基酸残基完全相同的残基所占的百分比，为了计算序列同源性百分比最大值，必要时须进行序列对齐及引入空隙。变体抗体具有与亲本抗体结合相同抗原，优选结合相同表位的能力，而且在一些实施方式中，具有至少一项优于亲本抗体的特性或生物活性。举例而言，与亲本抗体相比，变体抗体可例如具有更强的亲和力，更长的半衰期，更低的IC50值，或更高的抗原生物活性抑制能力。本申请尤其关注的变体抗体为生物活性增强至亲本抗体的至少2倍(优选至少5倍、10倍或20倍)的变体抗体。
“双特异性抗体”一词是指抗原结合区能够与同一生物分子的两个不同表位特异性结合或者能够与两种不同生物分子的表位特异性结合的抗体。在本申请中，双特异性抗体也称为具有“双重特异性”的抗体或“双重特异性”抗体。
在广义上，“嵌合抗体”一词旨在表示含一种抗体的一个或多个区域及一种或多种其他抗体的一个或多个区域的抗体，一般情况下，部分为人抗体，部分为非人抗体，即部分来源于非人动物，如小鼠、大鼠等害兽或大羊驼和美洲驼等骆驼科动物。嵌合抗体一般优选非人抗体，以降低人的抗抗体免疫反应风险，例如，鼠抗体可降低人抗鼠抗体免疫反应。典型的嵌合抗体例如为可变区序列为鼠源序列，而恒定区序列为人源序列的嵌合抗体。在嵌合抗体的情况下，可对非人源部分进行进一步改变，以将该抗体人源化。
“人源化”一词旨在表示，对于完全或部分非人源的抗体，如通过以目标抗原使小鼠或大羊驼免疫而分别获得的小鼠或大羊驼抗体，或者对于基于小鼠或大羊驼的此类抗体的嵌合抗体，可通过取代某些氨基酸，尤其重链及轻链骨架区和恒定区内的氨基酸，避免或尽可能减小人体内的免疫反应。抗体与靶抗原的相互作用特异性主要在于重链和轻链中的六个CDR内的氨基酸残基。因此，CDR内的氨基酸序列在各种抗体之间的变异程度远大于CDR之外的氨基酸序列。由于CDR序列负责大部分抗体抗原相互作用，因此可例如通过构建表达特定抗体的CDR序列以及其他抗体的骨架序列的表达载体的方式，表达模拟特定天然抗体或更一般而言，带有所述氨基酸序列的任何特定抗体的特性的重组抗体。如此，可以在将非人抗体“人源化”的同时，很大程度地保留初始抗体的结合特异性和亲和力。虽然无法精确预测特定抗体的免疫原性，并因此无法精确预测其人抗抗体反应，但非人抗体通常比人抗体具有更高的免疫原性。已经表明，通过以人源序列取代外源(如害兽或骆驼科)恒定区而获得的嵌合抗体一般比全外源嵌合抗体具有更低的免疫原性，而且治疗性抗体的发展趋势为人源化抗体或全人源抗体。因此，可通过将嵌合抗体或其他非人抗体人源化的方式，降低人抗抗体反应风险。
嵌合抗体的人源化通常涉及对可变区序列骨架区的修饰。在绝大多数情况下，该人源化不对作为互补决定区(CDR)的一部分的氨基酸残基进行修饰，但是在某些情况下，为了通过修饰CDR中的个别氨基酸残基而例如删除糖基化位点、脱酰胺位点、天冬氨酸异构化位点或希望删除的半胱氨酸或甲硫氨酸残基，也可能需要上述氨基酸残基进行修饰。N-连接糖基化通过将寡糖链连接至三肽序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr的天冬酰胺残基上的方式实现，其中，X可以为除Pro之外的任何氨基酸。N-糖基化位点的去除可通过以其他残基令Asn或Ser/Thr残基突变的方式实现，而且，该突变方式优选为保守取代。天冬酰胺和谷氨酰胺残基的脱酰胺可取决于pH值和表面暴露程度等因素。天冬酰胺残基尤其容易发生脱酰胺，该易发性主要见于Asn-Gly序列，在Asn-Ala等其他二肽序列中的程度较低。如果CDR序列含有此类脱酰胺位点，尤其Asn-Gly时，则可能需要删除该位点，删除方式通常为通过保守取代删除其中的一个所涉残基。
本领域存在多种已知的抗体序列人源化方法。其中的一种常用方法为CDR移植。CDR移植可根据Kabat的CDR定义进行，但其最新版(Magdelaine-Beuzelin et al.,CritRev.Oncol Hematol.64:210 225(2007))表明，(国际免疫遗传学信息系统(International Immunogenetics Information)，www.imgt.org)定义可改善人源化结果(见Lefranc et al.,Dev.Comp Immunol.27:55-77(2003))。在某些情况下，与作为CDR来源的亲本抗体相比，CDR移植可使得CDR移植非人抗体的结合特异性和亲和力降低，并进而使得其生物活性降低。为了恢复亲本抗体的结合特异性和亲和力，可在CDR移植抗体的选定位置(通常在骨架区内)引入回复突变(有时称为“骨架修复”)。其中，可利用现有文献及抗体数据库中的信息，确定可能需要进行回复突变的位置。回复突变的候选氨基酸残基一般为位于抗体分子表面的氨基酸残基，而埋藏残基或表面暴露程度较低的残基一般不会被改变。CDR移植和回复突变之外的另一种人源化技术为表面重塑，其中，保留未暴露于表面上的非人源残基，而将表面残基改变为人源残基。
全人源抗体可通过两种技术生成，一种采用体外收集的噬菌体库，另一种采用对人源化动物(小鼠、大鼠等)的体内免疫。
在构建组合噬菌体抗体库时，首先选择全套基因的来源，并根据该来源区分以下数种抗体库类型：原始抗体库、免疫抗体库及合成抗体库。原始抗体库和免疫抗体库的构建分别通过以天然方式重组且编码健康供体免疫球蛋白可变区的基因的方式，以及以天然方式重组且编码以特定抗原免疫的供体的免疫球蛋白可变区的基因的方式实现。为此目的，需要从抗体生产性淋巴细胞系中分离mRNA。其中，主要使用外周血淋巴细胞，但有时也使用脾细胞(Sheets MD et al.,Proc Natl Acad Sci USA1998, 95:6157-6162以及de HaardHJ et al., J Biol Chem 1999,274:18218-18230.)，扁桃体细胞或骨髓淋巴细胞(Vaughan TJ et al.,Nat Biotechnol 1996,14:309-314.)。随后，根据mRNA合成cDNA，其中，可同时使用oligo-dT引物及按照统计学方式设计的六核苷酸，以生成抗体可变区编码基因的所有可能变体的cDNA拷贝(Ulitin AB etal.,Designing and testing DAN:Izd-vo"Nauka"；2005.)。
如今，可在cDNA层面上，通过同时使用一种或多种引物，将扩增基因的范围限制于一种或若干种可变区基因族或抗体同种型(Marks JD et al.,J Mol Biol 1991,222:581-597)。用于免疫球蛋白编码基因扩增的引物与这些基因的最保守区域互补，而且其序列选自组织为数据库的形式的基因集合，如Kabat或V BASE数据库。此外，引物设计还可实现用于将PCR产物克隆至相应载体内的限制性内切位点。
合成抗体库的构建通过以一组随机序列替换天然CDR的方式完成。通过这种方式，可生成种类繁多的抗原结合位点。
噬菌体展示为最有效的常用体外抗体筛选技术当中的一种。1985年，史密斯(Smith)发现外源DNA序列可克隆至丝状噬菌体M13内，而且所克隆的序列可在噬菌体颗粒表面表达为融合蛋白(Smith GP,Science 1985,228:1315-1317)。如此，可根据融合蛋白与其他蛋白质结合的能力，选择出目标融合蛋白。这一发现与PCR扩增法融合后，可通过克隆免疫球蛋白基因的全套cDNA而创建含可用于快速筛出靶特异性单克隆抗体可变区的各种噬菌体库。这一整套的噬菌体库反映了提供用于创建该库的血液的每个人或动物的全套B细胞抗体。1995年，两篇论文报道了通过基因工程制得的小鼠可表达与杂交瘤技术(Lonberg N et al.,Nature 1994,368:856-859)所获得的全人源抗体库类似的抗体库。其中，首先故意破坏这些小鼠自身体内的重链与k免疫球蛋白轻链基因，然后将人的重链和k轻链基因片段作为转基因引入。结果表明，小鼠免疫系统可利用人类基因库产生针对更多种抗原的高特异性和高亲和力抗体。虽然这些转基因小鼠所表达的B细胞受体基本上为小鼠成分和人类成分的杂合体(人免疫球蛋白，小鼠Igα、Igβ以及其他信号分子)，然而其B细胞仍正常发育和成熟。
在某些情况下，为了提高与目标表位的结合亲和力，可能还需要改变一个或多个CDR氨基酸残基。这一方法称为“亲和力成熟”，并可选与人源化结合实施。举例而言，当抗体人源化导致结合特异性或亲和力下降，而且无法单纯通过回复突变改善结合特异性或亲和力时，可结合实施所述亲和力成熟法。本领域中已有人所熟知的各种亲和力成熟方法，如Burks et al.,Proc Natl Acad Sci USA,94:412–417(1997)中描述的体外扫描饱和诱变法，以及Wuetal.,Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042(1998)中描述的逐步体外亲和力成熟法。
“单克隆抗体”和“mAb”两词是指由单克隆细胞群合成并自其分离所得的抗体。该克隆细胞群可以为永生化细胞的克隆群。在一些实施方式中，克隆群内的永生化细胞为杂交细胞(杂交瘤细胞)，一般为免疫动物的淋巴细胞分别与淋巴细胞肿瘤的细胞融合的产物。杂交瘤细胞为一种构建而成的细胞，并不存在于自然界中。
“天然抗体”通常为约150000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，重链之间的二硫键数目随免疫球蛋白同种型的不同而不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链的一端为可变区(VH)，下游为数个恒定区。每条轻链的一端为可变区(VL)，另一端为恒定区。轻链恒定区与重链的第一恒定区对齐，而且轻链可变区与重链可变区对齐。据信，轻链可变区和重链可变区之间有特定氨基酸残基形成的界面。
在本说明书中，当“分离的”一词用于描述各抗体时，其表示在表达抗体的细胞或细胞培养物中鉴定出该抗体，并将其分离和/或再生。存在于分离的抗体天然环境内的杂质(污染物组分)是指会干扰该多肽的诊断或治疗用途的物质，而且可包括酶、激素和其他蛋白性或非蛋白性溶质。在优选实施方式中，抗体纯化至：(1)足以通过转杯式测序仪(Edman测序仪)获得N端氨基酸序列或内部氨基酸序列的15个残基的程度；或者(2)采用考马斯亮蓝染色或优选银染色的非还原性或还原性SDS-PAGE可认定同质性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，这是因为该多肽缺少其天然环境内的至少一个成分。分离多肽通常通过至少一个纯化步骤制备。
“分离的”核酸分子是指将在抗体核酸天然来源物中与至少一个核酸分子杂质结合的核酸分子自该杂质鉴定且分离而出的该核酸分子。分离的核酸分子与天然条件下的该核酸分子在形式或姿态上有所不同。也就是说，分离的核酸分子与天然条件下细胞内的核酸分子不同。然而，分离的核酸分子包括位于如下细胞中的核酸分子：即使例如当该核酸分子的染色体定位与天然条件下细胞内的染色体定位不同，仍能正常表达抗体。
本申请中使用的“表位”一词旨在表示与结合分子(如抗体或双特异性结合分子等相关分子)特异性结合的抗原部分(决定簇)。表位决定簇通常由分子的氨基酸、碳水化合物、糖侧链等化学活性表面基团组成，并通常包括特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位可分为“线性表位”和“构象表位”。在线性表位中，蛋白质(如抗原)与作用对象分子(如抗体)之间的所有相互作用点沿蛋白质的一级氨基酸序列线性排列。在构象表位中，各相互作用点位于在一级氨基酸序列上相互分隔的蛋白质氨基酸残基上。一旦确定了所需的抗原表位，便可利用本领域的已知技术生成针对该表位的抗体。此外，在抗体或其他结合分子的生成或表征过程中，可以厘清所需表位的信息。根据该信息，可竞争性地筛选出与同一或相同表位结合的抗体。例如，可通过竞争性研究，找出相互间竞争性地与抗原结合的结合分子。
本申请中使用的“肽接头”一词旨在表示能够连接不同区的含任何氨基酸序列的任何肽，该肽的长度取决于其所要连接的各区。优选地，肽接头具有多于5个氨基酸的长度，并由选自G、A、S、P、E、T、D、K的任何一组氨基酸组成。
“体外”一词是指体外人工条件下的生物实体、生物过程或生物反应。例如，体外生长细胞应理解为在试管、培养瓶或微量滴定板等体外环境中生长的细胞。
本申请中使用的“IC50”(50％抑制浓度)一词是指对可测活性或反应(如肿瘤细胞等细胞的生长/增殖)具有50％抑制作用的药物浓度。IС50值可从专用曲线拟合统计软件制作的合适剂量响应曲线中计算求得。
“GI50”(50％生长抑制浓度)是指对肿瘤细胞等细胞的增殖具有50％抑制作用的药物浓度。
“ED50”(EC50)(50％有效剂量/浓度)一词是指产生50％生物效应(可包括细胞毒性)的药物浓度。
“抗增殖活性”一词旨在表示杜绝或抑制癌细胞等细胞的生长。
抗体的“效应功能”一词是指可归因于抗体Fc区(天然Fc区序列或Fc区的氨基酸变体)的生物活性，该抗体Fc区随抗体同种型的不同而不同。抗体效应功能例如包括：Clq结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合性；抗体依赖性细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(如B细胞受体(BCR))的下调和B细胞活化。
“抗体依赖性细胞毒性”或“ADCC”是指表达Fc受体(FcR)的非特异细胞毒性细胞(如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别出结合于靶细胞上的抗体并随后引起该靶细胞溶解的细胞介导反应。NK细胞为介导ADCC的主要细胞，其仅表达FcγRJII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的第464页表3总结了造血细胞的FcR表达。目标分子的ADCC活性评估可采用体外ADCC测定法，如专利号为5500362或5821337的美国专利所描述的方法。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。作为替代或补充措施，还可对目标分子的ADCC活性进行体内(如动物模型体内)评估，例如Clynes et al.PNAS(USA)95:652-656(1998)公开的方法。
“人效应细胞”为表达一种或多种FcR并执行效应功能的白细胞。优选地，此类细胞至少表达FcγRIII，并执行ADCC效应功能。介导ADCC的人白细胞例如包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞以及嗜中性粒细胞，优选为PBMC和NK细胞。效应细胞可从其天然来源分离而得，例如如本申请所述，从血液或PBMC分离而得。
“Fc受体”和“FcR”两词用于描述与抗体Fc区结合的受体。优选FcR为天然序列的人FcR。而且，优选FcR为与IgG抗体(γ受体)结合的FcR，包括FcγRI、FcγRII、及FcγRIII亚型的受体，并包括此类受体的等位基因变体及其他剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA受体(“活化受体”)和FcγRIIB受体(“抑制受体”)，此两类受体具有相似的氨基酸序列，而且该氨基酸序列的不同之处主要在胞浆区内。活化受体FcγRIIA的胞浆区含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB的胞浆区含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(见综述Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。关于FcR的综述，见Ravetch and Kinet, Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991)。本申请中的“FcR”一词还涵盖未来可能鉴定出的其他FcR。该词还包括负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿受体FcRn。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指分子在补体存在的条件下溶解靶标的能力。当补体系统(C1q)的第一成分结合于与相应抗原络合的分子(如抗体)上时，即引发补体激活途径。补体活化度可通过CDC测定法衡量，如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中描述的方法。
“同源性”或“同质性”一词旨在表示候选序列中与相应比较序列的氨基酸残基相同的残基占该候选序列氨基酸残基的百分比，其中，为了达到整个序列的同源性百分比最大值，在必要时须进行序列对齐及引入空隙，并且不将任何保守取代视为序列同源性的一部分。N末端或C末端的延伸以及插入均不视为会降低同源性或同质性的考虑因素。本领域已有各种人所熟知的序列对齐方法和计算机程序。序列同源性可由序列分析软件测定(如威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机小组：美国威斯康星州麦迪逊市大学街1710号(53705))的序列分析软件包)。该软件通过为各种取代部分、删除(消除)部分和其他修饰部分指定同质程度而对相似序列进行匹配。
当涉及抗体的多肽序列时，“同质”一词应理解为与多肽序列具有至少70％，优选80％，更优选90％，最优选95％的序列同源性的抗体。当涉及核酸序列时，该词应理解为与核酸序列具有至少85％，优选90％，更优选95％，最优选97％的序列同源性的核苷酸序列。
本申请中描述的抗体氨基酸序列修饰法为已有方法。例如，有时可能需要对抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性进行改善。通过在抗体核酸中引入合适的核苷酸变化，或者通过肽的合成，可制备抗体氨基酸序列的变体。此类修饰方法例如包括在抗体氨基酸序列中进行删除、和/或插入、和/或取代。通过删除、插入和取代的任意组合，可实现具有所需特征的最终构建体。抗体内的氨基酸变化还可能导致翻译后过程的变化，例如改变糖基化位点的数量或位置。
通过氨基酸取代，可得到抗体氨基酸序列的修饰变体。此类变体通过将抗体分子内的至少一个氨基酸残基以其他残基取代的方式获得。取代型诱变最关注的位点包括超变区或CDR，但FR或Fc也属于其考虑范围。表A中的“优选取代”一列列出了各保守取代方式。如果此类取代可产生生物活性的变化，则可进一步进行表A“例示取代”一列所示的深度变化，或进行下文氨基酸类别描述部分进一步详述的变化，并可进行产物筛选。
“核酸”、“核素序列”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“聚核苷酸序列”和“核苷酸序列”各词在本说明书中可互换使用，其表示修饰或未修饰的精确核苷酸序列，该核苷酸序列决定了含或不含非天然核苷酸的核酸片段或区域，并可以为双链DNA或双链RNA，单链DNA或单链RNA，或DNA的转录产物。
此处还应该说明的是，本发明不涉及天然染色体环境内的核苷酸序列，即不涉及天然状态的核苷酸序列。本发明序列为分离和/或纯化而得的序列，即其已被直接或间接取样(如通过拷贝)，而且其环境已经至少被部分改变。因此，此处还应点到通过重组遗传学(例如采用宿主细胞)或化学合成获得的分离核酸。
除非另有说明，当提及核苷酸序列时，还同时涵盖其互补体。因此，当提及具有特定序列的核酸时，应理解为同时涵盖具有其互补序列的互补链。
“控制序列”一词是指以可实现正常运作的方式连接的编码序列在特定宿主生物中表达时所需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子、操纵子序列(可选)及核糖体结合位点。目前已知，真核细胞采用启动子、多腺苷酸化信号及增强子。
当核酸设置为与另一核酸序列形成功能性关系时，则称其“以可实现正常运作的方式连接”。例如：如果前体序列或分泌前导序列的DNA以可实现正常运作的方式连接至多肽的DNA时，则其将表达为参与该多肽的分泌的前体蛋白；如果启动子或增强子以可实现正常运作的方式连接至编码序列时，则其将影响该序列的转录；如果核糖体结合位点以可实现正常运作的方式连接至编码序列时，则其位于便于翻译的位置。一般情况下，“以可实现正常运作的方式连接”是指所连接的DNA序列相邻，而且对于分泌前导序列而言，不但相邻，而且还处于阅读阶段。然而，增强子不一定非得相邻。
本申请中使用“载体”一词是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。在一些实施方式中，载体为质粒，即可将其他DNA片段连入其中的环状双链DNA片段。在一些实施方式中，载体为病毒载体，其中，其他DNA片段可连入该病毒的基因组。在一些实施方式中，载体可在其所进入的对象宿主细胞(如具有源于细菌的复制位点的细菌载体及附加型哺乳动物载体)内自主复制。在其他实施方式中，载体(如非附加型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞后，整合至宿主细胞的基因组内，从而随宿主基因一道复制。此外，某些载体在以可实现正常运作的方式连接至基因上后，能够指导该基因的表达。此类载体在本申请中称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。
本申请中使用的“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)一词旨在表示已引入重组表达载体的细胞。本发明涉及一种宿主细胞，该宿主细胞可例如含以上所述的本发明载体。本发明还涉及一种宿主细胞，该宿主细胞例如含编码本发明结合分子的第一结合区和/或第二结合区的重链或其抗原结合部分，或编码其轻链或其抗原结合部分，或同时编码该重链或其抗原结合部分及轻链或其抗原结合部分的核苷酸序列。应该理解的是，“重组宿主细胞”和“宿主细胞”不仅旨在表示特定对象细胞，还在于表示其子代。虽然子代可能因突变或环境影响所致的变化而与亲本细胞事实上并不完全相同，但是此类细胞仍然涵盖于本申请中使用的“宿主细胞”一词的范围内。
本申请中使用的“赋形剂”一词表示除本发明化合物之外的任何成分。
“GITR介导的疾病或病症”一词是指与GITR在包括病因、发展、进程、持续性或病理在内的各个方面直接或间接相关的任何疾病或病症。
“治疗”是指减轻或消除生物学病症及其/或其至少一种伴随症状的方法。本申请中使用的疾病、病症或病况的“减轻”一词是指降低疾病、病症或病况的症状严重性和/或发生频率。在申请中，提及“治疗”之处均涵盖治愈性、姑息性及预防性治疗在内。
在一个方面中，治疗对象(或称患者)为哺乳动物，优选为人类对象。该对象可以为任何年龄的雄性或雌性。
“病症”一词是指受益于以本发明化合物进行的治疗的任何病状。该病状包括慢性和急性病症或疾病，涵盖易于使所述哺乳动物罹患相关病症的病理性症状。
“癌症”和“癌性”两词用于指代或描述以不受控的细胞生长/繁殖为特征的哺乳动物体内生理状况。该定义既涵盖良性的癌性疾病，也包括恶性的癌性疾病。癌性疾病例如包括，但不限于，上皮细胞癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤及白血病。更具体而言，此类癌性疾病例如包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌(子宫癌)、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝上皮细胞癌、肛门癌、阴茎癌、黑色素瘤以及各种头颈癌。
“免疫反应”、“自身免疫反应”及“自身免疫炎症”各词例如指淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞及此类细胞或肝细胞产生的可溶性大分子(包括因侵入性病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或自身免疫或病理性炎症情形下的人体正常细胞或组织的选择性损伤、破坏或去除而产生的抗体、细胞因子和补体)的作用。
“治疗有效量”旨在表示可在一定程度上缓解被治疗病症的一种或多种症状的治疗剂施用量。
“慢性”用药一词是指，为了长时间地维持初期的治疗效果(活性)而持续(不间断)地用药，而非以急性(瞬时)途径施用。
“间歇”是指周期性治疗，而非无间断的连贯治疗。
本申请中使用的“包括”、“具有”、“包含”、“含有”或其“有”、“含”、“具”等变体及所有语法变化形式应理解为表示纳入所描述的一个或一组完整物，但不排除任何其他一个或一组完整物。
三、发明详述
1、抗体
本发明涉及一种与GITR特异性结合的单克隆抗体。
在一个方面中，本发明涉及一种与GITR特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，含：
(a)重链可变区，所述重链可变区含：
(i)CDR1，所述CDR1含选自下组的氨基酸序列：
NYGMH(SEQ ID NO.1)或YYWMY(SEQ ID NO.12)；
(ii)CDR2，所述CDR2含选自下组的氨基酸序列：
VIWFDGSNKFYTDSVKG(SEQ ID NO.2)或AISWNGGRTYYAESMKG(SEQ ID NO.13)；
(iii)CDR3，所述CDR3含选自下组的氨基酸序列：
ELGGYYYDSSGFRPYYYGMDV(SEQ ID NO.3)或NRYYSDPNYGMNL(SEQ ID NO.14)，以及
(b)轻链可变区，所述轻链可变区含：
(i)CDR1，所述CDR1含选自下组的氨基酸序列：
RASQSIGSWLA(SEQ ID NO.7)或TGTSTDIGTYKYIS(SEQ ID NO.17)；
(ii)CDR2，所述CDR2含选自下组的氨基酸序列：
AASTLQR(SEQ ID NO.8)或GVSHRPS(SEQ ID NO.18)；
(iii)CDR3，所述CDR3含选自下组的氨基酸序列：
QQSHSHPLT(SEQ ID NO.9)或SSYTSSGTVV(SEQ ID NO.19)。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含重链可变区，所述重链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ IDNO.2所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.3所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含重链可变区，所述重链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.12所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ IDNO.13所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.14所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含轻链可变区，所述轻链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.7所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ IDNO.8所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.9所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含轻链可变区，所述轻链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.17所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ IDNO.18所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.19所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含：
-重链可变区，所述重链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ ID NO.2所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.3所示氨基酸序列；
-轻链可变区，所述轻链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.7所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ ID NO.8所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.9所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含：
-重链可变区，所述重链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.12所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ ID NO.13所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.14所示氨基酸序列；
-轻链可变区，所述轻链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.17所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ ID NO.18所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.19所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含重链可变区，所述重链可变区含与SEQ ID NO.4所示氨基酸序列：
EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSS至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含重链可变区，所述重链可变区含SEQ ID NO.4所示氨基酸序列：
EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSS。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含重链可变区，所述重链可变区含与SEQ ID NO.15所示氨基酸序列：
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTYYAESMKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSS至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含重链可变区，所述重链可变区含SEQ ID NO.15所示氨基酸序列：
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTYYAESMKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSS。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含轻链可变区，所述轻链可变区含与SEQ ID NO.10所示氨基酸序列：
DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSGGGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIK至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含轻链可变区，所述轻链可变区含SEQ ID NO.10所示氨基酸序列：
DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSGGGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIK。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含轻链可变区，所述轻链可变区含与SEQ ID NO.20所示氨基酸序列：
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLIIYGVSHRPSGVSDRFSGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTVVFGGGTKVTVL至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含轻链可变区，所述轻链可变区含SEQ ID NO.20所示氨基酸序列：
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLIIYGVSHRPSGVSDRFSGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTVVFGGGTKVTVL。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含：
-重链可变区，所述重链可变区含与SEQ ID NO.4所示氨基酸序列：
EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSS至少90％同源的氨基酸序列；
-轻链可变区，所述轻链可变区含与SEQ ID NO.10所示氨基酸序列：
DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSGGGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIK至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含：
-重链可变区，所述重链可变区含SEQ ID NO.4所示氨基酸序列：
EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSS；
-轻链可变区，所述轻链可变区含SEQ ID NO.10所示氨基酸序列：
DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSGGGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIK。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含：
-重链可变区，所述重链可变区含与SEQ ID NO.15所示氨基酸序列：
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTYYAESMKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSS至少90％同源的氨基酸序列；
-轻链可变区，所述轻链可变区含与SEQ ID NO.20所示氨基酸序列：
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLIIYGVSHRPSGVSDRFSGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTVVFGGGTKVTVL至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体或其抗原结合片段，含：
-重链可变区，所述重链可变区含SEQ ID NO.15所示氨基酸序列：
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTYYAESMKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSS；
-轻链可变区，所述轻链可变区含SEQ ID NO.20所示氨基酸序列：
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLIIYGVSHRPSGVSDRFSGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTVVFGGGTKVTVL。
在一些实施方式中，一种GITR特异性单克隆抗体为全长IgG抗体。
在一些实施方式中，所述全长IgG抗体属人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
在一些实施方式中，所述全长IgG抗体属人IgG1同种型。
在一些实施方式中，一种GITR特异性单克隆抗体，含有在其Fc片段中用于提高激动剂特性及抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、但不提高补体依赖性细胞毒性(CDC)的E345R突变。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含重链，所述重链含与SEQ ID NO.5所示氨基酸序列：
EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含重链，所述重链含SEQ ID NO.5所示氨基酸序列：
EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含重链，所述重链含与SEQ ID NO.6所示氨基酸序列：
EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRRPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含重链，所述重链含SEQ ID NO.6所示氨基酸序列：
EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRRPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含轻链，所述轻链含与SEQ ID NO.11所示氨基酸序列：
DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSGGGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含轻链，所述轻链含SEQ ID NO.11所示氨基酸序列：
DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSGGGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含：
-重链，所述重链含与SEQ ID NO.5所示氨基酸序列：
EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK至少90％同源的氨基酸序列；
-轻链，所述轻链含与SEQ ID NO.11所示氨基酸序列：
DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSGGGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种与GITR特异性结合的单克隆抗体为BCD166-01-001。
该单克隆抗体BCD166-01-001含：
-重链，所述重链含SEQ ID NO.5所示氨基酸序列：
EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
-轻链，所述轻链含SEQ ID NO.11所示氨基酸序列：
DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSGGGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含：
-重链，所述重链含与SEQ ID NO.6所示氨基酸序列：
EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRRPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK至少90％同源的氨基酸序列；
-轻链，所述轻链含与SEQ ID NO.11所示氨基酸序列：
DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSGGGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种与GITR特异性结合的单克隆抗体为BCD166-02-001。
BCD166-02-001与BCD166-01-001之间的差别在于，Fc片段中含有用于提高激动剂特性及抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、但不提高补体依赖性细胞毒性(CDC)的E345R突变。
该单克隆抗体BCD166-02-001含：
-重链，所述重链含与SEQ ID NO.6所示氨基酸序列：
EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRRPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
-轻链，所述轻链含与SEQ ID NO.11所示氨基酸序列：
DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSGGGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含重链，所述重链含与SEQ ID NO.16所示氨基酸序列：
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTYYAESMKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含重链，所述重链含SEQ ID NO.16所示氨基酸序列：
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTYYAESMKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含轻链，所述轻链含与SEQ ID NO.21所示氨基酸序列：
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLIIYGVSHRPSGVSDRFSGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTVVFGGGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含轻链，所述轻链含SEQ ID NO.21所示氨基酸序列：
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLIIYGVSHRPSGVSDRFSGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTVVFGGGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS。
在一些实施方式中，一种单克隆抗体，含：
-重链，所述重链含与SEQ ID NO.16所示氨基酸序列：
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTYYAESMKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK至少90％同源的氨基酸序列；
-轻链，所述轻链含与SEQ ID NO.21所示氨基酸序列：
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLIIYGVSHRPSGVSDRFSGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTVVFGGGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种与GITR特异性结合的单克隆抗体为BCD166-01-014。
该单克隆抗体BCD166-01-014含：
-重链，所述重链含与SEQ ID NO.16所示氨基酸序列：
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTYYAESMKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
-轻链，所述轻链含与SEQ ID NO.21所示氨基酸序列：
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLIIYGVSHRPSGVSDRFSGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTVVFGGGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS。
2、核酸分子
本发明还涉及核酸分子，尤其涉及编码了本申请所述的本发明与GITR特异性结合的单克隆抗体的序列，该序列可选含与其相连的任何肽接头序列。除非另有说明，当提及核苷酸序列时，还同时涵盖其互补体。因此，当提及具有特定序列的核酸时，应理解为同时涵盖具有其互补序列的互补链。本申请中使用的“多核苷酸”一词是指长度至少为10个碱基的核苷酸聚合形式，或核糖核酸，或脱氧核糖核酸，或任一类型核苷酸的修饰形式。该词既包括单链形式，也包括双链形式。
在一个方面中，本发明涉及一种核酸分子，该核酸分子含编码了选自SEQ ID NO.1～21的氨基酸序列的核苷酸序列。一种核酸分子还含有上述核苷酸序列的任意组合。
在一个方面中，本发明涉及一种核酸，该核酸含编码了一种与GITR特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，该抗体或片段含：
(a)重链可变区，所述重链可变区含：
(i)CDR1，所述CDR1含选自下组的氨基酸序列：
NYGMH(SEQ ID NO.1)或YYWMY(SEQ ID NO.12)；
(ii)CDR2，所述CDR2含选自下组的氨基酸序列：
VIWFDGSNKFYTDSVKG(SEQ ID NO.2)或AISWNGGRTYYAESMKG(SEQ ID NO.13)；
(iii)CDR3，所述CDR3含选自下组的氨基酸序列：
ELGGYYYDSSGFRPYYYGMDV(SEQ ID NO.3)或NRYYSDPNYGMNL(SEQ ID NO.14)，以及
(b)轻链可变区，所述轻链可变区含：
(i)CDR1，含选自下组的氨基酸序列：
RASQSIGSWLA(SEQ ID NO.7)或TGTSTDIGTYKYIS(SEQ ID NO.17)；
(ii)CDR2，所述CDR2含选自下组的氨基酸序列：
AASTLQR(SEQ ID NO.8)或GVSHRPS(SEQ ID NO.18)；
(iii) CDR3，所述CDR3含选自下组的氨基酸序列：
QQSHSHPLT(SEQ ID NO.9)或SSYTSSGTVV(SEQ ID NO.19)。
在一些实施方式中，一种核酸分子含核苷酸序列，该核苷酸序列编码了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，该抗体或片段含重链可变区，所述重链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ ID NO.2所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.3所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子含核苷酸序列，该核苷酸序列编码了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，该抗体或片段含重链可变区，所述重链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.12所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ ID NO.13所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.14所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子含核苷酸序列，该核苷酸序列编码了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，该抗体或片段含轻链可变区，所述轻链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.7所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ ID NO.8所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.9所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子含核苷酸序列，该核苷酸序列编码了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，该抗体或片段含轻链可变区，所述轻链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.17所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ ID NO.18所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.19所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段含：
- 重链可变区，所述重链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ ID NO.2所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.3所示氨基酸序列；
-轻链可变区，所述轻链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.7所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ ID NO.8所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.9所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段含：
-重链可变区，所述重链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.12所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ ID NO.13所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.14所示氨基酸序列；
-轻链可变区，所述轻链可变区含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含SEQ ID NO.17所示氨基酸序列，所述CDR2含SEQ ID NO.18所示氨基酸序列，所述CDR3含SEQ ID NO.19所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段含重链可变区，所述重链可变区含与SEQ IDNO.4所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段含重链可变区，所述重链可变区含SEQ IDNO.4所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段含重链可变区，所述重链可变区含与SEQ IDNO.15所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段含重链可变区，所述重链可变区含SEQ IDNO.15所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段含轻链可变区，所述轻链可变区含与SEQ IDNO.10所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段含轻链可变区，所述轻链可变区含SEQ IDNO.10所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段含轻链可变区，所述轻链可变区含与SEQ IDNO.20所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段含轻链可变区，所述轻链可变区含SEQ IDNO.20所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段含：
-重链可变区，所述重链可变区含与SEQ ID NO.4所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列；
-轻链可变区，所述轻链可变区含与SEQ ID NO.10所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段含：
-重链可变区，所述重链可变区含含SEQ ID NO.4所示氨基酸序列；
-轻链可变区，所述轻链可变区含SEQ ID NO.10所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段含：
-重链可变区，所述重链可变区含与SEQ ID NO.15所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列；
-轻链可变区，所述轻链可变区含与SEQ ID NO.20所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段含：
-重链可变区，所述重链可变区含SEQ ID NO.15所示氨基酸序列；
-轻链可变区，所述轻链可变区含SEQ ID NO.20所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，上述核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种与GITR特异性结合的单克隆抗体，所述单克隆抗体为全长IgG抗体。
在一些实施方式中，全长IgG抗体属人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
在一些实施方式中，全长IgG抗体属人IgG1同种型。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种与GITR特异性结合的单克隆抗体，所述单克隆抗体的Fc片段含有用于提高激动剂特性及抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、但不提高补体依赖性细胞毒性(CDC)的E345R突变。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体含重链，所述重链含与SEQ ID NO.5所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体含重链，所述重链含SEQ ID NO.5所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体含重链，所述重链含与SEQ ID NO.6所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体含重链，所述重链含SEQ ID NO.6所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体含轻链，所述轻链含与SEQ ID NO.11所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体含轻链，所述轻链含SEQ ID NO.11所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体含：
-重链，所述重链含与SEQ ID NO.5所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列；
-轻链，所述轻链含与SEQ ID NO.11所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体含：
-重链，所述重链含SEQ ID NO.5所示氨基酸序列；
-轻链，所述轻链含SEQ ID NO.11所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体含：
-重链，所述重链含与SEQ ID NO.6所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列；
-轻链，所述轻链含与SEQ ID NO.11所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体含：
-重链，所述重链含SEQ ID NO.6所示氨基酸序列；
-轻链，所述轻链含SEQ ID NO.11所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体含重链，所述重链含与SEQ ID NO.16所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体含重链，所述重链含SEQ ID NO.16所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体含轻链，所述轻链含与SEQ ID NO.21所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体含轻链，所述轻链含SEQ ID NO.21所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体含：
-重链，所述重链含与SEQ ID NO.16所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列；
-轻链，所述轻链含与SEQ ID NO.21所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
在一些实施方式中，一种核酸分子，含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体含：
-重链，所述重链含SEQ ID NO.16所示氨基酸序列；
-轻链，所述轻链含SEQ ID NO.21所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述核酸为DNA。
在任何上述实施方式中，所述核酸分子可经分离获得。
本发明核酸分子可从与GITR特异性结合的单克隆抗体的任何产生来源中分离而得。在一些实施方式中，本发明核酸分子可合成而得，而非分离而得。
在本发明的一种实施方式中，通过将编码VH(SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.15)区或VL(SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.20)区的核酸分子插入已分别编码了重链恒定(CH)区或轻链恒定(CL)区的表达载体，并使得所述VH片段与载体内的CH片段以可实现正常运作的方式连接，而且/或者所述VL片段与载体内的CL片段以可实现正常运作的方式连接，可将该核酸分子沿整个抗体长度转入基因内。在本发明的另一实施方式中，通过以标准分子生物学技术将编码VH区和/或VL区的核酸分子与编码CH区和/或CL区的核酸分子连接(如配位连接)，将编码VH区和/或VL区的核酸分子沿整个抗体长度转入基因内。随后，编码整个重链和/或轻链长度的核酸分子可在其所引入的细胞内表达。
核酸分子可用于表达大量的与GITR特异性结合的重组单克隆抗体。
3、载体
在另一方面，本发明涉及一种适于表达本申请所述任一核苷酸序列的载体。
本发明涉及含编码了本申请所述与GITR特异性结合的单克隆抗体或其各部分的任一氨基酸序列(如第一结合区的重链序列以及/或者第二结合区的重链和/或轻链序列)的核酸分子的载体。本发明还涉及含编码了融合蛋白、修饰抗体、抗体片段的核酸分子的载体。
在一些实施方式中，通过将部分或完整编码了按上述方式获得的第一或第二结合区序列(如结合区含轻链和重链序列的轻链和重链序列)的DNA插入表达载体，以使得该基因以可实现正常运作的方式与转录和翻译控制序列等必要表达控制序列相连接的方式，表达本发明与GITR特异性结合的单克隆抗体。表达载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、花椰菜花叶病毒和烟草花叶病毒等植物病毒、粘粒、YAC、EBV衍生的附加体等。DNA分子可连入载体内，以使得该载体内的转录和翻译控制序列发挥其调控DNA转录和翻译的期望功能。表达载体和表达控制序列可选择为与所使用的表达宿主细胞相容的此类载体和序列。部分或完整编码第一和第二结合区序列(如结合区含轻链和重链序列的轻链和重链序列)的DNA分子可分别引入单独载体中。在一种实施方式中，在同一表达载体内引入所述DNA分子的任意组合。其中，DNA分子可通过标准方法(如与抗体基因片段和载体上的互补限制性酶切位点连接，或者当不存在限制性酶切位点时的平末端连接)引入表达载体。
合适的载体为不但编码了功能完整的人CH或CL免疫球蛋白序列，而且还具有允许上述任何VH或VL序列易于插入和表达的恰当改造限制性酶切位点的载体。此类载体内的HC和LC编码基因可含有通过将相应mRNA稳定化而提高抗体蛋白质总产量的内含子序列。该内含子序列的侧翼具有决定RNA剪接位置的剪接供体和剪接受体位点。内含子序列既可位于抗体链的可变区，也可位于其恒定区。当使用多个内含子时，其可同时分布于可变区和恒定区内。编码区下游的天然染色体位点上可发生多腺苷酸化和转录终止。重组表达载体还可编码促进宿主细胞分泌抗体链的信号肽。抗体链基因可以使得所述信号肽以符合读框的方式与免疫球蛋白链氨基末端连接的方式克隆至载体内。所述信号肽既可以为免疫球蛋白信号肽，也可以为异源信号肽(即源自非免疫球蛋白的蛋白质的信号肽)。
除了抗体链基因之外，本发明的重组表达载体还可携带对抗体链基因在宿主细胞内的表达进行调控的调控序列。本领域技术人员可理解的是，包括调控序列选择在内的表达载体设计可取决于对待转化宿主细胞的选择、目标蛋白质的表达水平等因素。对于哺乳动物体内的表达宿主细胞，优选控制序列包括源自逆转录病毒LTR的启动子和/或增强子、源自巨细胞病毒(CMV)的启动子和/或增强子(如CMV启动子/增强子)、源自猿猴病毒40(SV40)的启动子和/或增强子(如SV40启动子/增强子)、源自腺病毒的启动子和/或增强子(如腺病毒的主要晚期启动子(AdMLP))、源自多瘤病毒的启动子和/或增强子等确保哺乳动物细胞内的高蛋白质表达水平的病毒成分以及天然免疫球蛋白启动子或肌动蛋白启动子等强哺乳动物启动子。关于病毒控制成分及其序列的进一步描述，例如见专利号为5168062、4510245和4968615的美国专利。本领域中表达结合分子(如在植物体内表达抗体)的已知方法例如见专利号为6517529的美国专利，其中包括对启动子和载体以及植物转化方式的描述。此外，在细菌细胞或酵母细胞等真菌细胞表达多肽的方法也是本领域的已知方法。
除了抗体链基因和调控序列之外，本发明的重组表达载体还可携带其他序列，如对载体在宿主细胞内的复制进行调控的序列(如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因有助于已引入载体的宿主细胞的选择(例如见专利号为4399216、4634665和5179017的美国专利)。举例而言，选择标记基因通常赋予已引入载体的宿主细胞对G418、潮霉素或甲氨蝶呤等药剂的抗性。选择标记基因例如包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于甲氨蝶呤筛选/扩增期间的DHFR宿主细胞)、neo基因(用于G418筛选)以及谷氨酸合成酶基因。
本申请中使用的“表达控制序列”一词旨在表示与其连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括：合适的转录起始序列、终止序列、启动子序列和增强子序列；有效的RNA加工信号，如剪接信号和多腺苷酸化信号；使胞浆mRNA稳定化的序列；提高翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及必要时，增进蛋白质分泌的序列。此类控制序列本质上随宿主生物的不同而不同：在原核生物中，此类控制序列一般包括核糖体结合位点的启动子以及转录终止序列；在真核生物中，此类控制序列一般包括启动子和转录终止序列。“控制序列”一词旨在至少包括表达和加工所必需的所有成分，而且可进一步包括前导序列和融合对象序列等优选其他成分。
4、宿主细胞
本发明的另一方面涉及获得本发明与GITR特异性结合的单克隆抗体的方法。本发明的一种实施方式涉及一种获得本申请所述与GITR特异性结合的单克隆抗体的方法，包括：生成能够表达与GITR特异性结合的单克隆抗体的重组宿主细胞；在适于与GITR特异性结合的单克隆抗体的表达/生成的条件下培养所述宿主细胞；以及分离所获得的与GITR特异性结合的单克隆抗体。通过在所述重组宿主细胞内以所述方式表达而制得的与GITR特异性结合的单克隆抗体在本申请中称为“与GITR特异性结合的重组单克隆抗体”。本发明还涉及此类宿主细胞的细胞后代以及以类似方式制得的与GITR特异性结合的单克隆抗体。
编码本发明与GITR特异性结合的单克隆抗体的核酸分子以及含此类核酸分子的载体可用于转染合适的哺乳动物或其细胞、植物或其细胞、细菌或酵母宿主细胞。其中，可采用任何已知的转化技术将多核苷酸引入宿主细胞。本领域已有人所熟知的将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞内的方法，这些方法包括葡聚糖介导转染法、阳离子聚合物/核酸复合物转染法、磷酸钙沉淀法、聚凝胺介导转染法、原生质体融合法、脂质体包封多核苷酸法以及细胞核内DNA直接微注法。此外，核酸分子可通过病毒载体引入哺乳动物细胞内。本领域已有人所熟知的细胞转染方法，例如见专利号为4399216、4912040、4740461及4959455的美国专利。本领域已有人所熟知的植物细胞转化方法，这些方法例如包括农杆菌介导转化法、基因枪转化法、直接注入法、电穿孔法及病毒转化法。此外，本领域已有人所熟知的细菌和酵母细胞转化方法。
本领域已有人所熟知的用作转化宿主的哺乳动物细胞系，这些细胞系包括多种可为人所用的永生化细胞系。这些永生化细胞系例如包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、FreeStyle 293细胞(Invitrogen)、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)、A549细胞以及多种其他细胞系。细胞系选择为具有高表达水平且提供所产蛋白质必要特性的细胞系。可使用的其他细胞系为Sf9或Sf21细胞等昆虫细胞系。在编码与GITR特异性结合的单克隆抗体的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞后，通过将该宿主细胞培养一段时间而生成所述抗体，该段时间足以允许所述抗体在宿主细胞内表达，或者更为优选地，允许该抗体分泌于所述宿主细胞生长的培养基中。利用标准的蛋白质纯化技术，可以以所述培养基对与GITR特异性结合的单克隆抗体进行重构。植物宿主细胞例如包括烟草类植物、拟南芥类植物、浮萍、玉米、小麦、马铃薯等。细菌宿主细胞包括大肠杆菌及链霉菌。酵母宿主细胞包括裂殖酵母、酿酒酵母及巴斯德毕赤酵母。
此外，可使用多种已知技术提高生产细胞系生成本发明与GITR特异性结合的单克隆抗体的水平。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)为一种在特定条件下增进表达的常用方法。专利号为0216846、0256055、0323997及0338841的欧洲专利对GS系统进行了完整或部分描述。
由不同细胞系表达或在转基因动物中表达的与GITR特异性结合的单克隆抗体彼此间可能具有不同的糖基化状况。然而，由本申请所述核酸分子编码或包括本申请所提供的氨基酸序列的所有与GITR特异性结合的单克隆抗体，无论该结合分子的糖基化如何，而且总体上无论是否存在翻译后修饰，均为本发明的一部分。
5、抗体的制备
本发明还涉及获得与GITR特异性结合的单克隆抗体及其抗原结合片段的方法和工艺。
5.1、单克隆抗体
单克隆抗体可通过Kohler,et al.Nature256,1975,p.495中首次描述的杂交瘤法或制备，或者通过重组DNA法(US4816567)制备。
在杂交瘤法中，根据上述方法对小鼠或仓鼠等其他合适的宿主动物进行免疫，以诱发生成与免疫所用蛋白质特异性结合的抗体或具有生成该抗体的能力的淋巴细胞。根据另一实施方式，可通过体外免疫法产生淋巴细胞。免疫后，利用聚乙二醇等合适的融合剂，使所述淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合，以生成杂交瘤细胞。
以上述方式生成的杂交瘤细胞可培养于合适的培养基内，该培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。举例而言，如果该亲本骨髓瘤细胞具有次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)缺陷，则杂交瘤培养基一般含次黄嘌呤、氨基喋呤及胸苷(HAT培养基)，即阻止HGPRT缺陷细胞生长的物质。
用于骨髓瘤细胞融合成分的细胞优选为融合效率高，支持所选抗体生成细胞以稳定的高水平生成抗体，而且与用于选择未融合亲本细胞的培养基敏感的细胞。优选骨髓瘤细胞系为小鼠骨髓瘤细胞系，如源自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系(可得自索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center)：美国加利福尼亚州圣迭戈市)，以及SP-2或X63-Ag8-653细胞(可得自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)：美国马里兰州罗克维尔市)。此外，人骨髓瘤细胞系和小鼠/人杂合骨髓瘤细胞系在生成单克隆抗体中的用途已见诸描述(Kozbor, J.Immunol.,133,1984,p.3001)。
优选地，杂交瘤细胞所生成的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀法，或通过放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)等或体外结合测定法测定。
举例而言，可使用Munson et al.,Anal.Biochem.,107:220(1980)中描述的斯卡查德(Scatchard)分析测定单克隆抗体的结合亲和力。
在鉴定出可生成具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可通过有限稀释法对相应的克隆进行亚克隆，并通过标准方法使其生长。用于该目的的合适培养基例如包括D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，可例如通过将所述杂交瘤细胞腹腔注射(i.p.)至小鼠体内的方式，令其作为腹水瘤，在动物体内生长。
所述亚克隆分泌的单克隆抗体可通过亲和层析(如使用蛋白A琼脂糖凝胶或蛋白G琼脂糖凝胶)、离子交换色谱、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析等常规抗体纯化技术，从培养基、腹水或血清中分离而出。
利用常规方法(如通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，可容易地对编码所述单克隆抗体的DNA进行分离和测序。此类DNA优选来自上述杂交瘤细胞。分离之后，可将所述DNA置于表达载体之内，然后将该载体转染至大肠杆菌细胞、非洲绿猴肾细胞(COS)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞等在如非转染则不生成抗体蛋白质的宿主细胞内，以实现重组宿主细胞内的单克隆抗体合成。
在本发明的另一实施方式中，可从以McCafferty et al.,Nature,348:552-554(1990)中描述的技术生成的抗体噬菌体库中分离的单克隆抗体或抗体片段。Clackson etal.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中分别描述了利用噬菌体库分离鼠抗体和人抗体的技术。之后的文献还描述了通过链替换生成高亲和力(nM级)人抗体的技术(Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783(1992)，以及通过感染和体内重组的联合使用构建极大规模噬菌体库的技术(Waterhouse et al.,Nucl.Acids.Res.21:2265-2266(1993))。因此，这些技术在传统的单克隆抗体杂交瘤技术之外，提供了其他可行的单克隆抗体分离方案。
抗体编码DNA可例如通过以重链和轻链(CH和CL)恒定区序列取代同源鼠序列(US4816567及Morrison, et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA:81:6851(1984))或者通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的完整或部分编码序列共价融合的方式进行修饰，以例如生成嵌合或融合抗体多肽。所述非免疫球蛋白多肽序列可取代抗体恒定区或抗体的一个抗原结合中心的可变区，以生成含针对某一抗原具有特异性的一个抗原结合位点以及针对另一抗原具有特异性的另一抗原结合位点的嵌合二价抗体。
5.2、基于噬菌体展示库的人抗体和方法
目前，可制得在免疫后能够生成全部人抗体，而不生成内源性免疫球蛋白的转基因动物(如小鼠)。例如，根据已有文献描述，通过将嵌合和种系突变的小鼠的抗体重链连接区(JH)基因纯合删除，可完全抑制内源性抗体的生成。通过将人种系免疫球蛋白基因阵列导入此类种系突变小鼠体内，可在抗原攻击发生之后生成人抗体(US5545806、US5569825、US5591669(均为GenPharm公司专利)；US5545807；以及WO97/17852)。
或者，也可利用噬菌体展示技术(McCafferty et al.,Nature,348:552-554(1990))，通过从免疫供体获得的免疫球蛋白可变(V)区基因库在体外生成人抗体和抗体片段。在该技术中，通过M13或fd等丝状噬菌体的主要或次要衣壳蛋白基因，以符合读框的方式对抗体V区基因进行克隆，并将其作为功能性抗体片段展示于噬菌体颗粒表面。由于该丝状颗粒含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，因此根据抗体功能特性所做的筛选还可选出编码具有该特性的抗体的基因。因此，噬菌体在某些特性上类似于B细胞。噬菌体展示可以多种形式实施，而且可使用多种来源的V基因片段。Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)中描述了从源自免疫小鼠脾脏的小型随机V基因组合库分离出各种抗恶唑酮抗体阵列。通过基本上遵循Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)所描述的技术原则，可以构建未免疫人供体全套V基因，并分离出针对多种不同抗原(包括自身抗原)的抗体。
如上所述，人抗体还可通过体外活化的B细胞生成(见US5567610和US5229275)。
5.3、抗体片段
在某些情况下，使用抗体片段比使用完整抗体更加可取。抗体片段的较小尺寸有助于其快速清除，并可有助于更好地渗透至质地致密的肿瘤内。
目前，已开发出各种用于生成抗体片段的技术。传统上，通过完整抗体的蛋白水解获得抗体片段。然而，当前已可以通过重组宿主细胞直接生成抗体片段。通过以大肠杆菌表达和分泌Fab、Fv及ScFv抗体片段，可以促进此类片段的大量生成。此外，抗体片段可从上述抗体噬菌体库分离而得。根据另一实施方式，可直接从大肠杆菌分离Fab'-SH片段，并将其化学偶联，以形成F(ab')2片段(Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167(1992))。在另一方法中，可从重组宿主细胞培养物中直接分离获得F(ab')2片段。US5869046中描述了具有更长的体内半衰期以及表位结合受体残基的Fab和F(ab')2片段。对于本领域技术人员而言，用于生成抗体片段的其他技术也是显而易见的。在本发明的其他实施方式中，所选抗体为单链Fv片段(scFv)(见WO9316185、US5571894及US5587458)。Fv和scFv为仅有的具有完整结合位点，但无恒定区的片段，因此非常适用降低体内的非特异性结合。通过构建scFv融合蛋白，可实现效应蛋白在scFv的N末端或C末端的融合。如US5641870所述，所述抗体片段还可以为“线性抗体”。此类线性抗体片段既可以为单特异性片段，也可以为双特异性片段。
5.4、药物组合物
在另一方面，本发明提供一种将与GITR特异性结合的单克隆抗体作为活性成份(或作为唯一活性成分)含于其内的药物组合物。
一种药物组合物可含有至少一种与GITR特异性结合的单克隆抗体以及至少一种从药学上可接受且药理上兼容的赋形剂组成的组中选出的成分。
一种药物组合物可含有至少一种与GITR特异性结合的单克隆抗体以及靶向一种或多种相应表面受体的一种或多种其他结合分子(如抗体)。在本发明的一些实施方式中，组合物旨在改善、预防或治疗可与GITR相关的病症。
“药物组合物”是指含本发明与GITR特异性结合的单克隆抗体以及选自填充剂、溶剂、稀释剂、载体、辅助剂、分散剂、递送剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂、增稠剂、延迟递送控制剂等药学上可接受的且药理上相容的赋形剂所组成的组当中的至少一种成分，其中，是否选择某一成分以及所选成分的适当比例取决于施用类型和施用途径以及剂量。对于本领域技术人员而言，本发明药物组合物及其制备方法无疑是显而易见的。该药物组合物的生产优选符合GMP(良好生产规范)的要求。该组合物可含缓冲组合物、张力剂、稳定剂及增溶剂。通过能够减慢活性药物成分的吸收的试剂，可以延长组合物的作用，此类试剂例如为单硬脂酸铝和明胶。合适的载体、溶剂、稀释剂和递送剂例如包括水、乙醇、多元醇及多元醇混合物、油以及注射用有机酯。
“药物”是指旨在用于人和动物生理功能的恢复、改善或改变，疾病的治疗和预防以及诊断、麻醉、避孕、美容等目的的片剂、胶囊、粉末、冻干剂、注射剂、输注剂、软膏及其他现成形式的化合物或作为药物组合物的混合化合物。任何本领域公认的肽、蛋白质或抗体施用方法均可适用于本发明与GITR特异性结合的单克隆抗体。
“药学上可接受”一词是指适于施用于哺乳动物，优选适于施用于人的一种或多种相容液态或固态成分。
本申请中使用的“赋形剂”一词是指除上述本发明成分之外的任何成分。这些成分为制药中使药物产品具有必备物化特性的无机或有机物质。
本申请中使用的“缓冲液”、“缓冲组合物”、“缓冲剂”是指能够通过其酸碱共轭成分的作用抵抗pH值变化，并可使得上述与CD20特异性结合的单克隆抗体药物能够抵抗pH值变化的溶液。优选地，所述药物组合物的pH值一般处于4.0～8.0范围。所使用的缓冲液例如包括，但不限于，乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐等缓冲溶液。
本申请中使用的“张力剂”、“渗透剂”或“增渗剂”各词是指可提高液态抗体制剂渗透压的赋形剂。“等渗”药物是指渗透压与人体血液相仿的药物。等渗药物的渗透压一般为约250～350mOsm/kg。所使用的等渗剂但不限于多元醇、糖化物和蔗糖、氨基酸、氯化钠等金属盐。
“稳定剂”是指使所述活性成分具有物理和/或化学稳定性的赋形剂或两种或两种以上赋形剂的混合物。稳定剂包括：氨基酸，例如但不限于，精氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸；表面活性剂，例如但不限于，聚山梨醇酯20(商品名：吐温20)、聚山梨醇酯80(商品名：吐温80)、聚乙/丙二醇及其共聚物(商品名：Poloxamer、Pluronic)、十二烷基硫酸钠(SDS)；抗氧化剂，例如但不限于，甲硫氨酸、乙酰半胱氨酸、抗坏血酸、硫代甘油、亚硫酸盐等；螯合剂，例如但不限于，乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、柠檬酸钠等。
当药物组合物在指定的保质期内例如以2～8℃的储存温度储存时，如果其活性成分保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性，则称该药物组合物为“稳定”的药物组合物。优选地，所述活性成分同时保持其物理稳定性，化学稳定性及生物活性。储存时间根据加速或自然老化条件下的稳定性试验的结果调整。
本发明药物组合物可以现成制剂形式的单次单位剂量或多份单次单位剂量的形式制造、包装或广泛销售。本申请中使用的“单次单位剂量”一词是指含预定量活性成分的药物组合物独立量。活性成份的量一般等于待施用至施用对象的活性成份剂量，或者等于与该剂量的易计算分数，例如等于该剂量的一半或三分之一。
本发明药物组合物一般适于作为旨在通过注射、输注和植入的方式绕开胃肠道并经皮肤或粘膜屏障的破口施用于人体的无菌制剂进行肠胃外施用。举例而言，肠胃外施用尤其包括皮下、腹腔内、肌肉内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、颅内、滑膜内、经皮等注射或输注；以及肾透析输注技术。此外，还可采用肿瘤内注射等肿瘤内递送，以及区域灌注。本发明优选实施方式包括静脉内和皮下途径。任何本领域公认的肽或蛋白质施用方法均可适用于本发明与GITR特异性结合的单克隆抗体。
制造、包装或销售的形式可以为，但不限于，可注射制剂，其单位剂型如安瓿、小瓶、塑料容器、预填充注射器、自动注射装置等。肠胃外施用制剂尤其包括悬浮液、溶液、油性或水性基质乳液、糊剂等。
在另一实施方式中，本发明提供一种肠胃外施用组合物，该组合物包括以干燥形式(粉状或粒状)提供且在施用前以合适基质(如无菌无热原水)恢复的药物组合物。此类制剂可例如通过冷冻干燥方法(即本领域所谓的冻干法)制造，该方法包括先将产品冷冻，然后将溶剂从冷冻后的物质中去除。
本发明与GITR特异性结合的单克隆抗体可单独或与装入加压气溶胶容器、泵、喷雾器、雾化器或气雾器等吸入器内的合适的药学上可接受赋形剂混合后通过鼻内或吸入施用(其中，既可使用合适的喷射剂，也可不使用喷射剂)，或者用作滴鼻剂或喷雾剂。
肠胃外施用剂型既可以为速释剂型，也可以为调释剂型。调释制剂包括延迟释放、持久释放、脉冲释放、受控释放、靶向释放以及按程序释放。
本发明与GITR特异性结合的单克隆抗体的治疗用途
在一个方面中，本发明与GITR特异性结合的单克隆抗体可用于治疗与GITR活性相关(由GITR活性介导)的病症。
在一个方面中，治疗对象(或称患者)为哺乳动物，优选为人类对象。该对象可以为任何年龄的雄性或雌性。
在一些实施方式中，上述与GITR特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段用于治疗GITR介导的疾病或病症，其中，所述疾病或病症选自含宫颈癌、头颈癌、胃癌、乳腺癌、肾细胞癌、结直肠癌(CRC)、卵巢癌(OC)、非小细胞肺癌(NSCLC)在内的组。
在肿瘤(如癌症)的情况下，治疗有效量的所述抗体或其片段(如与GITR特异性结合的抗体或其片段)可：减少癌细胞数量；减少初始肿瘤大小；抑制(即一定程度减缓，优选阻止)癌细胞向周围器官的浸润；抑制(即一定程度减缓，优选阻止)肿瘤转移；一定程度抑制肿瘤生长；以及/或者一定程度上缓解与所述病症相关的一种或多种症状。所述抗体或其片段可一定程度阻止现有癌细胞的生长并且/或者将其杀死，而且其可具有细胞抑制和/或细胞毒性。对于癌症治疗，体内功效可例如通过评价生存期、肿瘤进展前时间(TTP)、肿瘤对治疗的应答率(ORR)、应答持续时间和/或生活质量进行衡量。
在本申请中，针对与GITR特异性结合的单克隆抗体与一种或多种不同治疗剂提及的“共同施用”、“联合施用”和“联用”等词旨在指或包括：
1)同时施用——本发明与GITR特异性结合的单克隆抗体与该联用治疗剂配制于同一剂型，以供其基本同时释放至需要治疗的患者体内；
2)基本同时施用——本发明与GITR特异性结合的单克隆抗体与该联用治疗剂分别配制于不同剂型，但此两剂型由需要治疗的患者基本同时服用，以供其基本同时释放至该患者体内；
3)先后施用——本发明与GITR特异性结合的单克隆抗体与该联用治疗剂分别配制于不同剂型，而且此两剂型由需要治疗的患者在相隔较长的时间点上先后服用，以供其基本上在不同时间点释放至该患者体内；
4)控释先后施用——本发明与GITR特异性结合的单克隆抗体与该联用治疗剂配制于同一剂型，以供其以受控方式在相同和/或不同时间点上，同时、相继或联合释放至需要治疗的患者体内，而且每一部分均可以相同或不同途径施用。
本发明与GITR特异性结合的单克隆抗体可以以无需其他疗法的方式施用，即作为一种独立疗法。
此外，本发明与GITR特异性结合的单克隆抗体所实施的治疗也可包括至少一种其他疗法(联合治疗)。在本发明的一些实施方式中，该与CD20特异性结合的单克隆抗体可与其他癌症治疗药物/制剂联合施用或配制。
本申请中使用的“细胞毒性剂”是指抑制或遏制细胞功能并/或导致细胞被破坏的物质。该词旨在涵盖放射性同位素(如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32及Lu的各放射性同位素)，化疗剂以及小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素(包括其片段和/或变体)等毒素。
“化疗剂”是指可用于治疗恶性肿瘤的化合物。化疗剂例如包括：烷化剂，如噻替派及环磷酰胺烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡及哌泊舒凡；氮丙啶，如苯佐替哌、卡波醌、美妥替哌及乌瑞替哌；乙烯亚胺及甲基三聚氰胺，包括六甲基三聚氰胺、三乙烯三聚氰胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺及三羟甲基三聚氰胺；乙酸原化合物(如布拉他辛和布拉他辛酮)；Δ9-四氢大麻酚(屈大麻酚)；β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙素；桦木酸；喜树碱(包括其合成类似物拓扑替康CPT-11(伊立替康，)、乙酰喜树碱、东莨菪素及9-氨基喜树碱)；苔藓虫素；海绵多聚乙酰；CC-1065(包括其合成类似物阿多来新、卡折来新、比折来新)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；念珠藻素(如念珠藻素1和念珠藻素8)；海兔毒素；倍癌霉素(包括其合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚素；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇；海绵抑制素；氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌二醇氮芥、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、二氯甲基二乙胺氧化物盐酸盐、苯丙氨酸氮芥、新氮芥、胆甾醇对苯乙酸氮芥、泼尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝脲，如氯化亚硝脲、葡糖氯乙亚硝脲、福莫司汀、环己亚硝脲、嘧啶亚硝脲及雷莫司汀；抗生素，如烯二炔类抗生素(如卡奇霉素，如卡奇霉素γII及卡奇霉素ωII(例如见Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994)))、达内霉素(包括达内霉素A、埃斯培拉霉素以及新制癌菌素发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡拉比星、洋红霉素、嗜癌素、东洋霉素、放线菌素D、正定霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉代阿霉素、氰基吗啉代阿霉素、2-吡咯啉代阿霉素、盐酸阿霉素脂质体注射液脂质体阿霉素TLC D-99聚乙二醇化脂质体阿霉素脱氧阿霉素)、表阿霉素、依索比星、艾达霉素、麻西罗霉素、丝裂霉素(如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、新制癌菌素、佐柔比星；抗代谢药物，如甲氨蝶呤、吉西他滨替加氟卡培他滨埃博霉素及5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硝咪硫鸟嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮杂脲嘧啶、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；抗肾上腺素药物，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；胺苯吖啶；倍曲布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙；地磷胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登醇，如美登素和安丝菌素；甲基乙二醛双脒基腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁；苯来美特(phenamet)；吡喃阿霉素；洛索蒽醌；2-乙基酰肼；甲基苄肼；多糖复合物(JHSNatural Products公司：美国俄勒冈州尤金市)；雷佐生；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(如T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素A及蛇形菌素)；乌拉坦；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；噻替派；紫杉类化合物，如紫杉醇白蛋白改造紫杉醇纳米颗粒制剂及多西他赛苯丁酸氮芥；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂剂，如顺铂、奥沙利铂及卡铂；阻止微管蛋白聚合形成微管的长春花类药物，包括长春碱长春新碱长春地辛及长春瑞滨依托泊苷(VP16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；瘤可维(leucovorin)；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙；正定霉素；氨基喋呤；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸等维甲类药物，包括贝沙罗汀双膦酸盐，如氯膦酸盐(如或)、依替膦酸盐NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐阿仑膦酸盐帕米膦酸盐替鲁膦酸盐或利塞膦酸盐曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，尤其抑制异常细胞增殖所涉信号传导途径内基因表达的反义寡核苷酸，如PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，如疫苗，以及疫苗、疫苗和疫苗等治疗疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(如)；rmRH(如)；BAY439006(索拉非尼，Bayer公司)；SU-11248(Pfizer公司)；哌立福新；COX-2抑制剂(如塞来昔布或依托考昔)；蛋白体抑制剂(如PS341)；硼替佐米CCI-779；替比法尼(Rl1577)；索拉非尼；ABT510；Bcl-2抑制剂，如奥利默森钠匹杉琼(pixantrone)；EGFR抑制剂(见下文定义)；酪氨酸激酶抑制剂(见下文定义)；上述任何一者的药学上可接受的酸或衍生物；以及上述任何两者或更多者的组合，如环磷酰胺、阿霉素、长春新碱及泼尼松龙的联合疗法(简称CHOP)以及奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-FU和瘤可维的联合治疗方案(简称FOLFOX)。
上述定义还包括：用于调控或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，如包括他莫昔芬4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬艾多昔芬、屈洛昔芬、雷洛昔芬曲沃昔芬、盐酸雷洛昔芬在内的具有激动剂/拮抗剂混合特性的抗雌激素剂，SERM3等选择性雌激素受体调节剂(SERM)，氟维司群及EM800(此类药物可阻断雌激素受体(ER)的二聚化，抑制DNA结合，促进ER周转，并且/或者抑制ER水平)等无激动剂特性的纯抗雌激素剂；芳香化酶抑制剂，包括福美司坦和依西美坦等甾体类芳香化酶抑制剂，阿那曲唑来曲唑及氨鲁米特等非甾体类芳香化酶抑制剂，以及包括伏氯唑醋酸甲地孕酮法倔唑、咪唑在内的其他芳香化酶抑制剂；促黄体激素释放激素激动剂，包括亮丙瑞林(及)、戈舍瑞林、布舍瑞林及曲普瑞林；性类固醇，包括醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮等孕激素，己烯雌酚和共轭雌激素等雌激素，以及氟羟甲酮、全反式维甲酸和维甲酰酚胺等雄激素/维甲类药物；奥那司酮；抗孕激素剂；雌激素受体下调因子(ERD)；抗雄激素剂，如氟他胺、尼鲁米特及比卡鲁胺；睾内酯；上述任何一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述任何两者或更多者的组合。
可与本发明与GITR特异性结合的抗体联用的其他治疗剂可以为生长因子功能抑制剂，此类抑制剂例如包括：生长因子抗体及生长因子受体抗体(如抗erbB2抗体——曲妥珠单抗(赫赛汀)、抗EGFR抗体——帕尼单抗、抗erbB1抗体——西妥昔单抗(爱必妥、C225))以及Stern et al.Critical reviews in oncology/haematology,2005,Vol.54,pp11-29公开的任何生长因子或生长因子受体抗体)；抗血管生成剂，如抑制血管内皮生长因子作用的抗血管生成剂(如抗血管内皮细胞生长因子抗体——贝伐珠单抗(安维汀))以及抗KDR抗体和抗flt1抗体等抗血管内皮生长因子受体抗体；反义核苷酸，例如ISIS2503、抗ras反义核苷酸(或称G3139(Genasense))、抗bcl2反义核苷酸等针对上述靶标的反义核苷酸；基因治疗方法，例如包括取代异常p53、异常BRCA1或异常BRCA2等异常基因的异常基因取代方法GDEPT(基因导向的酶解药物前体治疗)，采用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶等药物的方法，以及多药耐药基因治疗等提高患者对化疗或放疗耐受性的方法；免疫治疗方法，例如包括以阿仑单抗(campath-1H)(一种针对CD52的单克隆抗体)或针对CD22的抗体进行的治疗，提高患者肿瘤细胞免疫原性的体外和体内方法，以白介素2、白介素4或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等细胞因子进行转染，以抑制CTLA-4功能的单克隆抗体进行治疗等降低T细胞无反应性的方法，采用细胞因子转染的树突细胞等转染免疫细胞的方法，采用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法，采用抗独特型抗体的方法，使用已在体外非特异性激活或靶至特定目的抗原的T-细胞的过继性T细胞转移；蛋白降解抑制剂，如硼替佐米(万珂)等蛋白酶体抑制剂；生物治疗方法，如通过肽或蛋白质(如抗体或可溶性外部受体区构建体)隔离受体配体，阻断配体与受体的结合或减少受体信号传导(如通过提高受体降解水平或降低受体表达水平)的方法。
可与本发明与GITR特异性结合的抗体联用的其他治疗剂可以为选自包括抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA4抗体、抗4-1BB抗体、抗OX40抗体及其组合在内的组的抗体。
可与本发明与GITR特异性结合的抗体联用的其他治疗剂可以为选自由先天免疫激活剂和后天免疫激活剂组成的组中的治疗活性抗肿瘤化合物。
本发明与GITR特异性结合的单克隆抗体旨在可用于上述治疗方法，可用于上述治疗，而且/或者可用于制造用于上述治疗的药物。
5.5、施用剂量和途径
本发明与GITR特异性结合的单克隆抗体的施用量为相应病症的有效治疗量，即各施用剂量和施用时间段满足所需结果的要求。治疗有效量可根据所治疗的具体病症，患者的年龄、性别和体重，以及所述与GITR特异性结合的单克隆抗体是作为独立治疗施用还是以与一种或多种其他药物或治疗联用的方式施用等因素而异。
为了实现最佳响应，可以对剂量方案进行调整。举例而言，可作为单一剂量单次施用，或者划分为多个分剂量后在不同时间施用，或者根据治疗情况的紧急程度按比例减小或增大剂量。尤其优选的是，为了易于施用以及使剂量均匀化，将肠胃外组合物制成单位剂型。本申请中使用的“单位剂型”旨在表示适于作为患者/治疗对象单位用量的物理上独立的单位，每一单位均含有经计算可与所需药物载体一起产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。本发明单位剂型的规格通常由如下两因素决定或直接取决于此两因素：(1)化疗剂的独有特性及待实现的具体治疗或预防效果；以及(2)用于对治疗对象进行治疗的所述活性化合物的合成领域中的固有限制。
因此，根据本申请的公开内容，本领域技术人员可理解的是，剂量和用量方案根据治疗领域中众所周知的方法进行调整。也就是说，可容易地确立最大耐受剂量，向患者提供可检测治疗效果所需的有效量，以及为了向患者提供可检测治疗效果而对每一药剂进行施用的时间要求。因此，尽管本申请对特定剂量和施用方案进行了举例说明，但是这些示例对本发明实施方式具体实践中向患者提供的剂量和施用方案不构成任何限制。
需要注意的是，剂量值可随待缓解病状的类型和严重程度而变，而且可包括单次剂量和多次剂量。此外，可以理解的是，对于任何特定对象，应根据其个性化要求以及施用本发明组合物或对该施用进行监督的医学专业人员的判断，对具体剂量方案时时做出调整，而且本申请所示剂量范围仅在于例示，并不意在对所要求保护的组合物的范围或实际应用构成限制。另外，本发明组合物的剂量方案可基于各种因素，这些因素包括疾病类型，患者的年龄、体重、性别及身体状况，病情的严重程度，施用途径以及所使用的与GITR特异性结合的具体单克隆抗体。因此，剂量方案可广范围地变化，但是其可通过常规标准方法进行确定。举例而言，可根据药动学或药效学参数进行剂量调整，这些参数可包括毒性作用和/或实验室值等临床效果。因此，本发明涵盖由本领域技术人员所确立的患者体内剂量递增法。本领域已有人所熟知的用于确定合适剂量和方案的方法，如果公开于本申请中，其可为本领域技术人员理解。
合适的施用方法例如见上文描述。
本发明与GITR特异性结合的单克隆抗体的合适剂量可以为0.1～200mg/kg，优选0.1～100mg/kg，包括约0.5～50mg/kg，例如约1～20mg/kg。该与GITR特异性结合的单克隆抗体的施用剂量可以为至少0.25mg/kg，如至少0.5mg/kg，包括至少1mg/kg，如至少1.5mg/kg，如至少2mg/kg，如至少3mg/kg，包括至少4mg/kg，如至少5mg/kg，而且最大例如为50mg/kg，包括最大为30mg/kg，如最大为20mg/kg，包括最大为15mg/kg。所述施用一般为相隔合适时间间隔的重复施用，如每周一次，每两周一次，每三周一次，每四周一次，或主治医师认为合适的时间间隔，在某些情况下，该主治医师可在必要时增加或减少剂量。
5.6、诊断用途和组合物
本发明与GITR特异性结合的单克隆抗体还用于诊断过程(如体外、离体)。举例而言，该与GITR特异性结合的单克隆抗体可用于检测或测量从患者获得的样品(如组织样品或炎性渗出物、血液、血清、肠液唾液或尿液等体液样品)中的GITR水平。合适的检测和测量方法包括免疫测定法，如流式细胞术、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、化学发光测定法、放射免疫测定法及免疫组织学法。本发明还包括试剂盒，该试剂盒例如为含本申请所述与GITR特异性结合的单克隆抗体的诊断试剂盒。
6、实施例
以下实施例用于更好地理解本发明。这些实施例仅在于说明的目的，不应视为以任何方式对本发明范围构成了限制。
本说明书中引用的所有出版物、专利及专利申请均通过引用并入本文。虽然以上为了更加清楚地理解的目的，已经以说明和例示方式对本发明进行了一定程度的详细描述，但对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，根据本发明的内容，还可在不脱离下附实施例的精神或范围的前提下，对其进行某些修改和修饰。
6.1、材料和通用方法
与人免疫球蛋白轻链和重链核苷酸序列相关的一般信息见：Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。抗体链的氨基酸根据EU编号法(Edelman,G.M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.Natl.Acad.Sci.USA63(1969)78-85)及Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,(1991)编号和命名。
6.2、重组DNA技术
采用Sambrook,J.et al,Molecular cloning:A laboratory manual；ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中描述的标准方法对DNA进行处理。其中，根据制造商的说明内容，对分子生物学试剂进行运用。
6.3、基因合成
通过以化学合成法制得的寡核苷酸制备所需的基因区段。各基因区段的长度为300～4000kb，而且以单限制性位点为侧翼。这些基因区段首先通过包括PCR扩增法在内的寡核苷酸退火和连接法组装，然后通过上述限制性位点进行克隆。这些再次克隆的基因片段的DNA序列通过DNA测序法确定。
6.4、DNA序列的测定
DNA序列通过Sanger测序法测定。
DNA和蛋白质序列分析及序列数据管理
采用Infomax公司的8.0版Vector NT1 Advance套件进行序列的创建、匹配、分析、注释、图示。
6.5、表达载体
为了实现上述抗体和抗原的表达，采用旨在于原核细胞(大肠杆菌)内表达以及于真核细胞(如CHO细胞)内瞬时表达的不同形式的表达质粒。除了所述抗体表达框之外，各载体还包括：允许所述质粒在大肠杆菌中复制的复制起点；以及能够在大肠杆菌内产生针对各种抗生素(如氨苄青霉素和卡那霉素)的抗性的基因。
如下所述，含所述各抗体链的融合基因通过PCR法和/或基因合成法生成，并利用已知重组方法和技术通过连接相应核酸区段(如利用相应载体中的独特限制性位点)进行组装。再次克隆后的核酸序列通过DNA测序法进行验证。为了实现瞬时转染，还通过转化大肠杆菌培养物制得的质粒，进行更大量的质粒制备。
实施例1：在悬浮哺乳动物细胞培养物中生成重组抗原和抗体
为了根据人GITR和直系同源蛋白胞外部分的序列制备重组抗原，我们生成了含人GITR胞外区抗原(https://www.uniprot.org/uniprot/Q9Y5U5)、恒河猴mcyGITR(https://www.uniprot.org/uniprot/Q1PBC4)以及小家鼠musGITR(https://www.uniprot.org/uniprot/O35714)的多种构建体。其中，基因序列通过对质粒载体RDC0359(https://www.rndsystems.com/products/human-gitr-tnfrsf18-np_004186-versaclone-cdna_rdc0359)中编码全长人GITR抗原的基质进行PCR的方式合成，并利用针对GITR直系同源基因的合成寡核苷酸进行组装。GITR基因序列克隆至用于在SalI/NotI限制性位点设大羊驼Fc IgG1标签的哺乳动物细胞内生成蛋白的质粒内(图1)。此外，抗原序列通过TEV蛋白酶的蛋白酶不稳定位点从Fc分离，而且该位点还用于通过以TEV蛋白酶进行处理而断开Fc片段，并用于获得无标签形式的抗原。该序列还克隆至SalI/NotI限制性位点的蛋白C端设FLAG-EPEA标签(C标签，GE Healthcare)的质粒内(图2)。此外，重组人GITR配体(GITRL，https://www.uniprot.org/uniprot/Q9UNG2)以类似方式克隆至含同源三聚折叠子[1]区且GITRL C端设EPEA标签的质粒内(图3)。各质粒在大肠杆菌细胞内生成至所需量后，以MaxiprepQiagen试剂盒进行纯化。
抗体和抗原均按照已公开的方案(Biotechnol Bioeng.2005 Sep 20；91(6):670-677,Liao Metal.,2004；Biotechnol Lett.2006 Jun；28(11):843-848；BiotechnolBioeng.2003 Nov 5；84(3):332-342)，在得自中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)的成熟细胞系内生成。其中，采用对EB病毒核抗原1(EBNA1)蛋白基因进行组成型表达的细胞，并根据制造商说明书，以置于烧瓶中的无血清培养基(Life Technologies Corporation)在回旋振荡器上进行悬浮培养。为了实现瞬时表达，通过线性聚乙烯亚胺(PEI MAX，Polysciences)，以2×106个/mL的浓度进行细胞转染。DNA/PEI比为1:3/1:10。转染5～7天后，将细胞培养物在2000g下离心20分钟，并以0.22μm的过滤器进行过滤。目标蛋白通过亲和HPLC从培养液中分离。
蛋白C端含EPEA标签(谷氨酸-脯氨酸-谷氨酸-丙氨酸)的重组GITR蛋白和GITR配体蛋白通过吸附性CaptureSelect C-tag Affinity Matrix从培养液中分离和纯化。其中，使培养液通过预先填充有5mL的C标签吸附剂的色谱柱，然后以25mL的PBS对该柱进行洗涤，以除去非特异性结合成分。随后，在温和条件下，以20mM的Tris和2M的MgCl2(pH＝7.0～7.4)对结合的抗原进行洗脱。在通过以半透性透析膜将蛋白透析至PBS(pH＝7.4)中后，对其进行过滤(0.22μm)及转移入管，并且在-70°С下保存。
重组GITR-TEV-Fc抗原通过用于亲和HPLC的蛋白A柱从培养液中分离和纯化。其中，使澄清培养液通过以磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH＝7.4)平衡的5mL HiTrap rProteinASepharoseFF柱(GE Healthcare)，然后通过以5倍于柱体积的PBS洗柱而除去非特异性结合成分，并以0.1M甘氨酸缓冲液(pH＝3)洗脱结合抗原。其中，收集主要洗脱高峰期间的蛋白洗脱液后，以1M的Tris缓冲液(pH＝8)将其pH调至中性。所有阶段的流速均为110cm/h。在通过SnakeSkin透析管技术将蛋白透析至PBS(pH＝7.4)中后，对其进行过滤(0.22μm)及转移入管，并且在-70°С下保存。
所有重组IgG抗体均按照上述针对抗原的流程，以1mL HiTrap rProtein A FF柱(GE Healthcare)进行纯化。所得蛋白溶液的纯度通过SDS凝胶电泳评价(示例见图4和图5)。
实施例2：天然人抗体Fab库MeganLibTM的构建
利用RNeasy Mini Kit(Qiagen)，并按照推荐方案，从1000名以上不同人供体的血液样品中分离B淋巴细胞总RNA。通过Nanovue试剂盒(GE Healthcare)进行RNA浓度测定，并通过1.5％琼脂糖凝胶电泳测试所分离的RNA质量。
使用MMLV RT试剂盒(Evrogen)，并按照推荐方案，通过MMuLV逆转录酶进行逆转录反应，其中，以随机六聚体寡核苷酸作为引物。
通过将逆转录产物用作两阶段聚合酶链反应的基质，获得侧翼为限制性位点的可变区基因，该反应根据J Biol Chem.1999Jun 25；274(26):18218-30中的方案进行，并使用寡核苷酸试剂盒。
所得DNA产物VL-CK-VH(图6)以NheI/Eco91I限制性核酸内切酶处理后，连接至原始噬菌粒pH5内(图7)。连接产物转化至按照Methods Enzymol.2000；328:333-63方案制备的SS320大肠杆菌电转感受态细胞内。所得全套组合Fab噬菌体展示库MeganLibTM内的转化细胞数为1011。Fab噬菌体库产物根据在先文献描述的方法制备(J MolBiol.1991Dec 5；222(3):581-97)。
实施例3：大羊驼/人杂交抗体(CHARM)免疫Fab库的构建
利用RNeasy Mini Kit(Qiagen)，并按照推荐方案，从以具有最大血清比滴度的重组GITR抗原免疫的大羊驼各血液样品中分离B淋巴细胞总RNA。通过Nanovue试剂盒(GEHealthcare)进行RNA浓度测定，并通过1.5％琼脂糖凝胶电泳测试所分离的RNA质量。
使用MMLV RT试剂盒(Evrogen)，并按照推荐方案，通过MMuLV逆转录酶进行逆转录反应，其中，以随机六聚体寡核苷酸作为引物。
通过将逆转录产物用作两阶段聚合酶链反应的基质，获得侧翼为限制性位点的可变区基因，该反应根据J Biol Chem.1999 Jun 25；274(26):18218-30中的方案进行，并使用寡核苷酸试剂盒。
所得DNA产物VL-CK-VH(图6)以NheI/Eco91I限制性核酸内切酶处理后，连接至原始噬菌粒pH5内(图7)。连接产物转化至按照Methods Enzymol.2000；328:333-63方案制备的SS320大肠杆菌电转感受态细胞内。所得全套组合Fab噬菌体展示库MeganLibTM内的转化细胞数为1011。Fab噬菌体库产物根据在先文献描述的方法制备(J Mol Biol.1991 Dec 5；222(3):581-97)。表1为免疫库产物汇总表。
表1
实施例4：噬菌体抗体Fab库的筛选
从实施例2和实施例3中描述的组合噬菌体Fab展示库MeganLibTM和免疫CHARM库中获得特异性抗GITR人噬菌体Fab抗体。其中，通过噬菌体展示技术(Nat Biotechnol.1996Mar；14(3):309-14；J Mol Biol.1991 Dec 5；222(3):581-97)，以重组人GITR抗原进行筛选。
免疫噬菌体库的筛选采用5mL高结合力EIA/RIA-Tube免疫管。其中，抗原(0.5mL，2μg/mL)在+4℃的碳酸盐缓冲液(0.1M NaHCO3，pH＝9.5)中过夜吸附。各管以PBST(10mM磷酸盐缓冲盐水(pH＝7.3～7.5)，137mM NaCl，2.7mM KCl，0.1％聚山梨醇酯20)洗涤后，添加总体积为5mL且以0.5％浓度溶于PBST中的奶粉，以进行封闭。这一封闭操作隔轮进行：例如，如果前一轮使用0.5％的奶粉PBST溶液，则下一轮采用以1％的浓度溶于PBST中的BSA。各免疫管在振荡器上室温温育1小时后，以PBST洗涤，并在每管中加入2mL的封闭缓冲液和噬菌体库，最终浓度约为2×1012个噬菌体颗粒/mL。随后，加入噬菌体的各管在室温下温育1～2小时。在后续各轮中，每一轮均使用前一轮中经17000g下离心澄清10～15分钟后获取的4mL噬菌体上清液。各管以PBST洗涤20次后，以0.5mL的0.1M甘氨酸缓冲液(pH＝2.2)将管壁表面上的噬菌体洗脱：先将甘氨酸缓冲液加入各管，然后在室温下轻轻搅拌15分钟。随后，将噬菌体溶液移入盛有100μL用于中和的1M Tris-HCl(pH＝8.0)的干净无吸附力管中，并将各管置于冰上，直至细胞被感染。
筛选后，以大肠杆菌TG1菌株为宿主，培养M13噬菌体。其中，以噬菌体感染宿主菌株培养物后，通过令其生长12～15小时而进行扩增。
筛选后，将0.5～1mL的噬菌体与细胞培养物(OD600＝0.3～0.4)混合，并在37℃下温育1.5小时。随后，将细胞以3000～4000rpm的速度离心10～15分钟，并将其重新悬浮于1mL的培养基中，然后置于盛有用于筛选的抗生素(氨苄青霉素)的皮氏培养皿中。菌落在30℃的恒温器中生长12～15小时后，计算菌落数目，并以5～10mL的LB培养基将细胞从培养皿上洗下。将100μL细胞悬浮液加入20mL抗生素培养基(氨苄青霉素)中，将密度增大至OD600＝0.35～0.5乘以37。在将K07辅助噬菌体以1μL/10mL(1010个颗粒/mL)的量加入细胞培养物中，并在37℃下非振荡温育1.5小时后，在培养物中进一步加入相同体积的含单剂量氨苄青霉素(100μg/mL)，双剂量卡那霉素(40μg/mL)及双剂量IPTG(0.2mM)的培养基。随后，将细胞培养物装入振荡器中，并将噬菌体在30℃下培养4～5小时。细胞培养物在17000g下离心25～30分钟后，将上清液收集入管。所得上清液随后用于下一轮筛选，或者在沉淀分离噬菌体后，供进一步保存。
噬菌体通过如下方法分离：将1/6体积的含20％聚乙二醇和2.5M氯化钠的溶液加入上清液后，剧烈搅拌；将溶液在冰上温育至少3小时；将溶液在8000g下离心10分钟；将所得含噬菌体的沉淀物稀释于1mL的TBS缓冲液(Tris-硼酸盐缓冲液)中。
2～3轮后，分离噬菌体，并分析多克隆噬菌体与人GITR和非特异性抗原的特异性结合情况。
实施例5：第二轮和第三轮筛选所得多克隆噬菌体的分析
在以靶抗原对两个天然MeganLib库和六个免疫库进行三轮筛选后，通过ELISA对得自第二轮和第三轮的多克隆噬菌体的特异性和非特异性结合情形进行检验。
其中，通过使靶GITR抗原在碳酸盐缓冲液(0.1M NaHCO3，pH＝9.5)中过夜吸附于ELISA孔板的塑料表面而分析是否存在特异性结合噬菌体(2μg/mL)，或者通过使GCSF、hIL6R-Fc、干扰素α-2b、利妥昔单抗(2μg/mL)吸附而分析是否存在非特异性结合噬菌体。随后，以PBST(10mM磷酸盐缓冲盐水(pH＝7.3～7.5)，137mM NaCl，2.7mM KCl，0.1％聚山梨醇酯20)对孔板进行洗涤，并在每孔中加入300μL以0.5％浓度溶于PBST中的奶粉，以进行封闭。孔板在振荡器上室温温育1小时且以PBST洗涤后，以50μL/孔的量加入以封闭缓冲液稀释至1:2～1:256的第二轮和第三轮筛选所得噬菌体溶液。孔板进一步在振荡器上室温温育1小时且以PBST洗涤后，以含于封闭缓冲液内的与抗M13辣根过氧化物酶轭合的抗体包被。1小时温育后，对孔板进行洗涤，并以50μL/孔的量加入含于乙酸盐缓冲液(pH＝5.0)中的反应底物(Н2О2(0.02％)和TMB)。将孔板在暗光条件下室温温育至阴性对照中呈现轻微背景(但不超过20分钟)后，通过以25μL/孔的量加入10％ H2SO4而将反应淬灭，并在450nm下测量各板孔的OD。
该测定结果表明，以靶抗原进行第三轮筛选后，一个人天然Fab库和六个免疫FabCHARM库存在特异性(5倍于背景信号)结合，但无显著的(低于背景信号的2倍)非特异性结合。
这些库中的抗体可变区基因重新克隆至表达载体pLL-Fab中(图8)，以在大肠杆菌细胞内生成可分泌可溶解形式的Fab。
实施例6：特异性结合人GITR的Fab的筛选
利用ELISA，对实施例5中由大肠杆菌内生成的单克隆分泌至培养基中的特异性结合人GITR的Fab进行检测。其中，使用Fab-gitr3215(专利申请)这一序列已公开的Fab作为阳性对照。在特异性结合测定中，先以50μl/孔的GITR(以0.2μg/mL含于1倍碳酸盐缓冲液中)包被ELISA孔板(中等结合力，Greiner Bio-One)，然后密封并在4°С下温育过夜。所有其他步骤均按照标准ELISA方案，由基于GenetixQ-pix2xt(Molecular Devices)和TecanFreedom EVO 200(Tecan)等机器人系统的高性能自动化平台进行。其中，通过加入封闭缓冲液(BB)(200μl含0.5％无脂乳的PBS)，阻断非特异性结合。孔板在振荡器上室温温育1小时且以PBS-吐温洗涤后，以50μl的待测含Fab细胞上清液与相同体积的BB的混合物包被每一板孔。随后，将孔板在振荡器上室温温育1小时，并以PBS-吐温缓冲液将每一板孔洗涤3次。洗涤后，以含与抗人Fab HRP轭合的第二抗体(Pierce-ThermoScientific)的PBS-吐温(1:5000)包被每一板孔(50μl/孔)，并将孔板在旋转振荡器上振荡(室温下50分钟)后，按如上所述PBS-吐温缓冲液洗涤3次。随后，通过加入ТМВ(50μl/孔)，获取比色信号，直至达到饱和(平均3～5分钟)，并通过加入阻断溶液(30μl/孔，10％硫酸)，阻断进一步显色。其后，通过使用合适的Tecan-Sunrise读板器(Tecan)在450nM下测量颜色信号。其中，抗体结合水平与颜色信号的生成量成正比。此外，还通过ELISA对颜色信号超出背景信号5倍且与对照抗体Fab-gitr3215相当的克隆进行检验，以实现对非特异性结合状况的检测。
实施例7：所选Fab与其他抗原间相互作用的非特异性结合测定
ELISA还用于测定所关注的Fab片段与其他抗原的非特异性结合。该研究的实施方式如上文所述，但其中将IL6R-Fc、INFα2b、PCSK9-VG-FE、PD-1-Fc(以2.5μg/mL的浓度含于1倍碳酸盐缓冲液中)用作固定化抗原，并将GITR-TEV-Fc(以0.2μg/mL的浓度含于1倍碳酸盐缓冲液中)用作特异性结合对照物。所有其他步骤均按照标准ELISA方案，由基于GenetixQ-pix2xt(Molecular Devices)和Tecan Freedom EVO 200(Tecan)等机器人系统的高性能自动化平台进行。其中，将非特异性结合颜色信号不超出背景信号且其值5倍低于特异性结合颜色信号值的克隆视为阳性，并对其基因进行测序，以确定抗体可变区基因序列及独特唯一性。根据测试结果，我们选择30种独特唯一的序列，以供转化至全长IgG1抗体形式。
实施例8：重组抗体在哺乳动物细胞悬浮培养物中的生成
在本实施例中，按照标准方法，对实施例7的抗体可变区基因进行克隆。其中，首先生成含抗体重链和轻链可变区基因的PCR产物，然后将重链可变区克隆至pEE-Hc IgG1载体的SalI/NheI限制性位点(示意图见图9)，而轻链可变区连接于pEE-CK载体的SalI/BsiWI限制性位点(示意图见图10)。
抗体按照已公开的方案(Biotechnol Bioeng.2005Sep20；91(6):670-677,LiaoMetal.,2004；Biotechnol Lett.2006 Jun；28(11):843-848；Biotechnol Bioeng.2003Nov 5；84(3):332-342)，在得自中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)的成熟细胞系内生成。其中，采用对EB病毒核抗原1(EBNA1)蛋白基因进行组成型表达的细胞。
抗体通过CHO-K1-S细胞系细胞在瞬时表达体系内生成。其中，细胞在补充有4mM谷氨酰胺、0.05mg/mL庆大霉素和10μg/mL环丙沙星的CHO-S-SFM II/FreeStyle CHO混合(1:1)培养基中培养，该培养基盛于设置在回旋振荡器/温育箱内的带挡板烧瓶(125mL、250mL、500mL、1000mL及3000mL)中，培养条件如下：+37℃；5％СО2；110rpm或150rpm(取决于烧瓶大小)。细胞每周传代培养3次，接种密度为0.2×106个细胞/mL。
在转染过程中，转染前一天先以0.8×106个细胞/mL的密度进行细胞接种，一天后以密度为2×106个细胞/mL的细胞培养物进行转染。其中，以补充有2mM谷氨酰胺和0.05mg/mL庆大霉素的RPMI-1640培养基制备转染混合物。各载体以0.75μg/mL的浓度分别稀释于所述培养基中，而且聚乙烯亚胺(PEI)作为转染剂以PEI：DNA＝7：1的重量比另外稀释。载体和PEI的稀释液混合后，在室温下温育10分钟。随后，将转染混合物导入细胞中，并在标准条件下进行细胞培养。
转染后第二天，在细胞中添加补充有0.05mg/mL庆大霉素、10μg/mL环丙沙星、1mM丙戊酸钠及10％饲喂物F12.7的CHO-S-SFM II/FreeStyle CHO混合(1:1)培养基，并在回旋振荡器/温育箱中进行细胞培养，条件如下：+34℃；5％СО2；110rpm或150rpm(取决于烧瓶大小)。转染后第3～4天，在细胞中添加10％饲喂物F12.7。
转染后第7天，选择细胞液样品，并按照ForteBio方案且利用OctetRed 96，测量蛋白A传感器芯片上生成的蛋白浓度(表2)。重组抗体通过蛋白A亲和HPLC柱从培养液中分离和纯化。其中，使澄清培养液通过以磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH＝7.4)平衡的1mL HiTraprProtein AFF柱(GE Healthcare)，然后通过以5倍于柱体积的PBS洗柱而去除所有非特异性结合成分，并以0.1M甘氨酸缓冲液(pH＝3)洗脱结合抗原。收集主要洗脱高峰期间的蛋白洗脱液后，以1M的Tris缓冲液(pH＝8)将其pH调至中性。所有阶段的流速均为110cm/h。在通过SnakeSkin透析管技术将蛋白透析至PBS(pH＝7.4)中后，对其进行过滤(0.22μm)及转移入管，并且在-70°С下保存。
所得蛋白溶液的纯度通过SDS凝胶电泳评价(图11和图12)。所有抗体的纯度水平均符合细胞分析中理化性质检验和活性检验的要求。
表2
实施例9：抗GITR IgG1抗体与人GITR间相互作用的动力学测定
利用OctetRed 96，并根据制造商(ForteBio)方案，测定抗GITR抗体与人/恒河猴/食蟹猴GITR间相互作用的结合亲和力常数。其中，抗GITR抗体的抗原非特异性地固定至第二代胺反应性传感器(AR2G)(ForteBio，AR2G传感器的预备工作和抗原固定按照制造商说明书中的标准方案进行)表面，并加入25μg/mL浓度的抗体。该测定在30℃下实施，并将含0.1％吐温20和0.1％BSA的PBS用作工作缓冲液。
所得传感图在减去参考信号后，以Octet Data分析软件(8.0版)的标准方法和1:1相互作用模型进行分析，亲和力常数结果示于表3。所有测试抗体均呈现出针对人GITR的高亲和力和高特异性。
表3.抗GITR抗体与人GITR间相互作用的亲和力常数
实施例10：抗GITR特异性激动剂活性的测定
该测定使用基于Hek-293细胞系生成的HEK293-GITR-NFkB-Luc细胞系，该细胞系可在细胞表面稳定表达GITR，并含有受NFkB启动子控制的萤火虫荧光素酶编码基因。
该测定在96孔培养板中进行，各板孔内的悬浮液中含HEK293-GITR-NFkB-Luc细胞以及浓度如图所示的测试抗体。所有悬浮液成分均配制于营养细胞培养基中。在所有成分均加入后，在37℃和5％CO2下对孔板进行温育，然后通过荧光检测试剂盒和读板器测量各板孔的荧光素酶强度。
抗GITR单克隆抗体的特异性活性测定结果(图13)表明，批次号为1161、1210、1213的抗体具有功能活性，并表现出显著的激动剂活性，其顶部平台与作为对照抗体的抗GITR3215抗体和GITRL相当。这些抗体根据表4重新命名。
表4
实施例11：抗GITR抗体与不同生物GITR间相互作用的酶联免疫分析
通过ELISA法，测定抗体对不同生物GITR-Fc的相对亲和力。在结合测定中，先以50μl的人/食蟹猴/小鼠GITR-Fc(以0.5μg/mL含于1倍碳酸盐缓冲液中)包被ELISA板孔(中等结合力，Greiner Bio-One)，然后密封并在4°С下温育过夜。所有其他步骤均按照实施例6所述的标准ELISA方案进行。抗GITR抗体BCD166-01-01与人和食蟹猴GITR特异性结合，但不与小鼠GITR结合(图14)。抗体BCD166-01-011与人GITR特异性结合，但未表现出与食蟹猴和小鼠GITR的结合性(图15)。抗体BCD166-01-014与人GITR特异性结合，与食蟹猴GITR的结合性显著下降，而且根据观察结果，完全不与小鼠GITR结合(图16)。由于候选抗体BCD166-01-011缺乏针对猴GITR的明显特异性，因此将其从后续研究中剔除。同时，候选抗体BCD166-01-01和BCD166-01-014最终选定为供进一步开发的抗体。
实施例12：抗GITR IgG1抗体与恒河猴/食蟹猴GITR间相互作用的动力学测定
利用OctetRed 96，并根据制造商(ForteBio)方案，获得抗GITR抗体与恒河猴/食蟹猴GITR的结合亲和力常数。其中，抗GITR抗体的抗原非特异性地固定至第二代胺反应性传感器(AR2G)(ForteBio，AR2G传感器的预备工作和抗原固定按照制造商说明书中的标准方案进行)表面，并加入25μg/mL浓度的抗体。该测定在30℃下实施，并将含0.1％吐温20和0.1％BSA的PBS用作工作缓冲液。
所得传感图在减去参考信号后，以Octet Data分析软件(8.0版)的标准方法和1:1相互作用模型进行分析，亲和力常数结果示于表5和表6。所有测试抗体均呈现出针对猴GITR的高亲和力和高特异性，从而为针对该相关体内动物模型的进一步研究提供了基础。
表5抗GITR抗体与恒河猴GITR间相互作用的亲和力常数
表6抗GITR抗体与食蟹猴GITR间相互作用的亲和力常数
抗GITR抗体名称 批次号 KD(M)
1 BCD166-01-01 1285 5.42E-10
2 BCD166-01-014 1284 5.53E-08
实施例13：用于测定高激动剂活性野生型和突变型候选抗体的抗GITR特异性激动剂活性的体外细胞检测
为了确定是否可提高抗GITR抗体BCD166-01-01这一人衍生物的激动剂活性，根据WO2005047327、WO2006104989(A2)、WO2007005612(A2)及Science.2014 Mar 14；343(6176):1260-3中对可引起抗体寡聚的各种取代的研究，选择将E345R突变导入抗体的IgG1Fc区。据称，此类突变可使得抗体在与抗原结合后在细胞表面发生寡聚，从而不但提高ADCC、ADCP、CDC等各种效应功能，还可改善药代动力学(PK)。本发明的目的在于获得具有更高ADCC这一激动能力而非CDC的抗体。通过以标准基因工程方案实施诱变，根据实施例8合成重组抗体。该抗体命名为BCD166-02-01，并在下文中称为BCD166-02-01。同时，还对两个亲本抗体BCD166-01-01和BCD166-01-014进行测定。
测定方式与实施例10同。
如图17所示，测定结果表明，与引入E345R突变前的抗体BCD166-01-01相比，测试抗GITR抗体BCD166-02-01因在靶细胞上发生抗原依赖性寡聚而在细胞激动剂测定中呈现出5倍增高的激活水平。此外，不但激活曲线的顶部平台水平获得了自然增大，EC50值也增大了20倍以上。
实施例14：抗GITR抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)体外细胞检测
该检测用于测定候选抗体BCD166-02-01的ADCC活性。同时，还对BCD166-01-01和BCD166-01-014这两种抗体也进行了测定。此外，与候选抗体BCD166-01-01类似，为了增大相对于野生形式的ADCC活性，候选抗体BCD166-01-014中也引入了E345R突变(突变后称为BCD166-02-014)。该检测采用：基于Jurkat细胞系生成的Jurkat-NFAT-Luc-CD16细胞系，该细胞系可在细胞表面稳定表达CD16，并含有受NFAT启动子控制的萤火虫荧光素酶编码基因；以及基于Hek-293细胞系生成且可在细胞表面稳定表达GITR的Hek-293-GITR细胞系。
该检测在96孔培养板中进行，各板孔内的悬浮液中含Jurkat-NFAT-Luc-CD16效应性细胞和Hek-293-GITR靶细胞，以及浓度如图所示的测试抗体。所有悬浮液成分均配制于营养细胞培养基中。在所有成分均加入后，在37℃和5％CO2下对孔板进行温育，然后通过荧光检测试剂盒和读板器，测量各板孔的荧光素酶强度。
如图18所示，测定结果表明，与引入E345R突变前的抗体BCD166-01-01相比，测试抗GITR抗体BCD166-02-01因在靶细胞上发生抗原依赖性寡聚而在ADCC检测中呈现出40倍增大的EC50值。此外，与引入E345R突变前的抗体BCD166-01-14相比，测试抗体BCD166-02-14在ADCC检测中稳定呈现5倍增大的EC50值。所有这些数据清晰表明，IgG1抗体Fc部分的E345R取代对于高活性GITR激动剂生成所必需的效应功能具有显著的正效应。
实施例15：抗GITR抗体的补体依赖性细胞毒性(CDC)体外细胞检测
该检测以抗体BCD166-01-01、BCD166-01-014、BCD166-02-01为对象，并将抗GITR-3215抗体作为对照。该检测在96孔培养板中进行，各板孔内的悬浮液中含HEK-293-GITR细胞，以及浓度如图所示的测试抗体和人血清补体。含该悬浮液的孔板在37℃和5％CO2下温育4小时后，在每一板孔内加入阿尔玛蓝溶液，然后继续将孔板在37℃和5％CO2下温育。随后，通过读板器，测量各板孔的荧光强度(激发波长：544nm；发射波长590nm)。
如图19所示，测定结果表明，抗体BCD166-01-01、BCD166-02-01以及对照抗GITR-3215抗体的CDC活性并不显著，也就是说，并不比1μg/mL这一用于估算人体治疗用途剂量的极限浓度高10％。候选抗体BCD166-01-14的CDC活性在1μg/mL的浓度下约可实现30％的溶解率，这表明其具有显著的效果，但该效果在体内时可能趋于温和。所有这些数据清晰表明，候选抗GITR IgG1抗体Fc部分的E345R取代不具有显著作用。
实施例16：候选抗GITR抗体的体外细胞毒性检测
该检测用于评价候选抗GITR抗体对不同反应细胞群数变化的正负效应。该检测以抗体BCD166-01-01、BCD166-01-014、BCD166-02-01为对象，并以抗CD20抗体——利妥昔单抗为对照。
首先，通过Ficoll密度梯度离心法从健康供体的全血中分离PBMC，然后在96孔培养板中进行测定。各板孔内的悬浮液中含PBMC以及浓度如图所示为25μg/mL、1μg/mL、0μg/mL的抗体。PBMC和抗体混合后，将孔板在37℃和5％CO2下温育16小时。随后，以相应CD细胞的荧光标记抗体对悬浮液直接染色，并以流式荧光细胞仪进行细胞分析，以测量悬浮液中PBMC的CD56+、CD19+、CD3+、CD4+、CD8+亚群比例。在图示比例当中，CD56+、CD19+、CD3+细胞的比例为相对于被测悬浮液所有细胞的比例，而CD4+、CD8+细胞的比例为相对于CD3+细胞的比例。
如图20至图24所示，测定结果表明，候选抗GITR抗体不具有显著的负效应，即与阴性对照相比，反应细胞数的减少率小于10％。NK细胞群的细胞数随抗体浓度的不同，呈现约30～70％的增大。然而，对照抗CD20抗体同样呈现出NK细胞百分比的增大，但与此同时，CD20+B细胞群几乎完全自然耗尽。因此，所有候选抗体均不具有针对人血细胞的特异性体外细胞毒性。
实施例17：nTreg细胞群抗体依赖性消耗的体外细胞检测
GITR+nTreg细胞群的ADCC依赖性消耗被认为是抗GITR抗体治疗性抗癌作用的主要预期机制之一。该检测以抗体BCD166-01-01、BCD166-01-014、BCD166-02-01为对象，且以抗CTLA4抗体——伊匹单抗(ipilimumab)为对照。
首先，通过Ficoll密度梯度离心法从健康供体的全血中分离外周血单核细胞(PBMC)，然后以“人CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒”(德国Miltenyi Biotec)实现nTreg在PBMC中的富集。所得细胞通过附有固定化抗CD3抗体和抗CD28抗体的磁珠激活。
NK细胞通过“人NK细胞分离试剂盒”(德国Miltenyi Biotec)从PBMC中分离。
在将抗体溶液、NK细胞悬浮液以及nTreg悬浮液加入培养孔板中后，将孔板在37℃和5％CO2下温育16小时。将细胞悬浮液样品以针对CD3、CD4、CD25、FoxP3的荧光标记抗体(美国Biolegend)染色后，以流式荧光细胞仪分析染色后的细胞悬浮液样品。
供体1和供体2细胞材料在测试抗体作用下的抗体依赖性nTreg消耗检测结果分别示于图25和图26中。该结果表明，细胞群(尤其供体2材料的细胞群)发生70～100％的下降，也就是说，候选抗GITR抗体具有消耗活性。此外，与对照抗CTLA4抗体——伊匹单抗的比较结果表明，抗GITR抗体，尤其最终候选抗体BCD166-02-01的活性更高。
实施例18：人iTreg细胞群抗体依赖性消耗的体外细胞检测
GITR+iTreg细胞群的ADCC依赖性消耗被认为是抗GITR抗体治疗性抗癌作用的主要预期机制之一。该检测以抗体BCD166-01-01、BCD166-01-014、BCD166-02-01为对象。
首先，通过Ficoll密度梯度离心法从健康供体的全血中分离PBMC，然后从PBMC中分离单核细胞，以作为与用于培养的塑料材料结合的细胞群。这些单核细胞在1000单位/mL的GM-CSF(美国Peprotech)和500单位/mL的IL-4(美国Thermo Scientific)存在的条件下，在37℃和5％CO2下温育120小时，以获取树突细胞。在向培养基中以0.5μg/mL的浓度添加LPS溶液(美国Sigma)后，将细胞继续在37℃和5％CO2下温育48小时。
随后，将抗体稀释液、树突细胞悬浮液以及PBMC加至培养孔板中，并将孔板在37℃和5％CO2下温育120小时。
将细胞悬浮液样品以针对CD3、CD4、CD25、FoxP3的荧光标记抗体(美国Biolegend)染色后，以流式荧光细胞仪分析染色后的细胞悬浮液样品。抗GITR抗体BCD166-01-01、BCD166-01-14、BCD166-02-01可诱导iTreg的体外消耗。
供体1/供体2细胞材料在测试抗体作用下的抗体依赖性iTreg消耗检测结果示于图27。该结果显示，候选抗GITR抗体具有2～5倍的显著消耗活性(尤其对于供体1材料)。最终候选抗体BCD166-02-01呈现出足够高的iTreg消耗活性。
实施例19：抗GITR抗体作用下促炎性细胞因子IL-2和IFN-γ在人细胞群内分泌状况的体外细胞检测
首先，通过Ficoll密度梯度离心法从健康供体的全血中分离PBMC；然后将抗CD3和抗GITR抗体固定于96孔板的各板孔中。其中，先将含浓度如图所示的抗GITR抗体BCD166-02-01以及浓度低于最优浓度的抗CD3抗体的DPBS溶液以100μL/孔的量加入相应板孔中，然后将孔板在室温下温育16小时。该检测以板孔中预先固定有抗CD3和抗GITR抗体的96孔板实施。每一板孔的悬浮液含40000个PBMC以及浓度低于最优浓度的抗CD28抗体。所有悬浮液成分均配制于含10％FBS的RPMI-1640培养基中。添加细胞悬浮液后，将孔板在37℃和5％CO2下温育6天。在温育第4天时，从板孔中提取培养液的等分试样，然后以ELISA法测量温育第4天和温育6天时培养液中的IL-2和IFN-γ浓度。
抗GITR抗体对有助于抗癌效果的促炎性细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌水平的作用分析结果显示，此两物质在培养液中的浓度显著增大(结果见图28)。由此可见，候选抗体BCD166-02-01具有高细胞因子分泌激活活性，这表明其可能具有显著的抗癌作用。
实施例20：抗体BCD166-02-01与人FcRn、FcgRIIIa158V、FcgRIIIa158F、FcgRIIa131H、FcgRIIa131R、FcgRIIb、FcgRIa受体间相互作用的结合性分析
测定抗体BCD166-02-01与人FcRn、FcgRIIIa158V、FcgRIIIa158F、FcgRIIa131H、FcgRIIa131R、FcgRIIb、FcgRIa间相互作用的结合亲和力常数通过OctetRed 96(ForteBio)测定。其中，先将各生物素化受体固定于链霉亲和素传感器(SA)表面上，然后在30℃下分析受体与抗体在工作缓冲液(含0.1％吐温20和0.1％BSA的PBS，FcRn受体测定时的pH＝6，其他受体测定时的pH＝7.4)内的结合和解离状况。所得传感器图按照1:1或2:1模型分析，并利用Octet Data分析软件(8.0版，用户指南版权所有)计算亲和力常数。
抗体BCD166-02-01与人FcRn、FcgRIIIa158V、FcgRIIIa158F、FcgRIIa131H、FcgRIIa131R、FcgRIIb、FcgRIa间相互作用的亲和力测定结果示于图29。该结果表明，所得亲和力值为文献公布数据值及我公司针对IgG1同种型抗体反复测量的数据值的若干倍，这说明Fc片段的E345R突变对从溶液吸附至上述受体上的单体抗体的动力学具有明显但非定性的作用。
实施例21：通过以动态光散射法测定蛋白聚集点而测定胶体稳定性和热稳定性
为了以动态光散射法测定测试样品的聚集温度，使用Plate Reader II(Wyatt Technology Corp.)，获取温度从40℃渐升至85℃过程中介质粒度与温度之间的关系，结果如表7所示。
表7：BCD166-02-01聚集点
可以看出，BCD166-02-01分子具有高胶体热稳定性(在pH＝5.0的20mM醋酸盐缓冲溶液及pH＝5.5的20mM组氨酸缓冲溶液中的聚集点均>65°)。
BCD166-01-014数据与此类似。
实施例22：50°С热应力下热稳定性的测定
将测试样品置于恒温空气浴中，并在50℃下恒温放置72小时。加热后，以带紫外检测器的尺寸排阻HPLC(SEC HPLC)以及毛细管等电聚焦法，对已加热样品及未加热样品进行分析。其中，色谱采用Agilent 1100 HPLC系统和Tosoh TSK-Gel G3000SWXL色谱柱，检测波长为220nm；毛细管等电聚焦技术采用Labchip GX II(Caliper)，并用于测定电荷异质性。其中，根据HT蛋白电荷变体标记试剂盒和蛋白电荷变体缓冲试剂盒(PerkinElmer)的标准方法，进行工作溶液和芯片的预备。
BCD-166(BCD166-02-01和BCD166-01-014)在50℃下温育后的稳定性结果数据示于表8。图30(BCD166-02-01)和图31(BCD166-01-014)所示为50℃下72小时温育后的组合色谱图。
总结论：样品具有高胶体稳定性和高热稳定性。
表8：尺寸排阻HPLC和电泳所测BCD-166单体含量关系
*Δ表示热处理样品纯度与未处理样品(输入对照)纯度之差(％)
实施例23：以皮下移植模型评价BCD-166产品的抗肿瘤活性
采用皮下移植瘤模型，对BCD-166产品的抗肿瘤活性进行评价。其中，将与混合的3×106个A2058细胞系细胞皮下移植至人源化的huNOG-EXL小鼠体内。细胞接种后第7天，将实验动物分为表9所示各组。
表9：BCD-166产品抗肿瘤活性研究中的动物分组
组别 动物数 剂量
BCD-166-01-01 10 20mg/kg
BCD-166-02-01 10 20mg/kg
BCD-166-01-014 9 20mg/kg
阴性对照 10 -
分组后第1天、第5天、第8天、第12天，向将20mg/kg剂量的上述产品腹膜内施用至各产品组动物，并向阴性对照组施用组氨酸缓冲液。在整个实验过程中测量小鼠体重和肿瘤长宽高后，按照V＝L×W×H×π/6这一公式计算肿瘤体积，并根据肿瘤生长抑制指数(TGI)评价测试产品功效。TGI按照下式，根据阴性对照组的平均肿瘤体积(Vc)以及产品组的平均肿瘤体积(Vt)计算：
实验结果表明，BCD-166-01-014和BCD-166-02-01产品具有高抗肿瘤活性，而BCD-166-01-01产品未呈现任何显著的抗肿瘤活性。实验结果见图32和图33。

Claims (25)

1.一种与GITR特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，含：
(i)重链可变结构域，其包含分别由SEQ ID NOs：1、2和3的序列所示的氨基酸序列组成的CDRs1、2和3；
轻链可变结构域，其包含分别由SEQ ID NOs：7、8和9的序列所示的氨基酸序列组成的CDRs1、2和3；或
(ii)重链可变结构域，其包含分别由SEQ ID NOs：12、13和14的序列所示的氨基酸序列组成的CDRs1、2和3；
轻链可变结构域，其包含分别由SEQ ID NOs：17、18和19的序列所示的氨基酸序列组成的CDRs1、2和3。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：
重链可变结构域由SEQ ID NO.4所示氨基酸序列组成；
轻链可变结构域由SEQ ID NO.10所示氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：
重链可变结构域由SEQ ID NO.15所示氨基酸序列组成；
轻链可变结构域由SEQ ID NO.20所示氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中与GITR特异性结合的抗体为全长IgG抗体。
5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述的全长IgG抗体涉及人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
6.根据权利要求5所述的单克隆抗体，其中所述的全长IgG抗体涉及人IgG1同种型。
7.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中与GITR特异性结合的抗体含有在其Fc片段中用于提高激动剂特性、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)但不提高补体依赖性细胞毒性(CDC)的E345R突变。
8.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其包含：
重链，所述重链由SEQ ID NO.5所示氨基酸序列组成；
轻链，所述轻链由SEQ ID NO.11所示氨基酸序列组成。
9.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其包含：
重链，所述重链由SEQ ID NO.6所示氨基酸序列组成；
轻链，所述轻链由SEQ ID NO.11所示氨基酸序列组成。
10.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其包含：
重链，所述重链由SEQ ID NO.16所示氨基酸序列组成；
轻链，所述轻链由SEQ ID NO.21所示氨基酸序列组成。
11.一种编码权利要求1-10中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。
12.根据权利要求11所述的核酸，其中的核酸为DNA。
13.一种含权利要求11-12中任意一项所述核酸的表达载体。
14.一种获得用于获得权利要求1-10中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段的宿主细胞的方法，所述方法包括以权利要求13所述的载体进行细胞转化。
15.一种用于获得权利要求1-10中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段的宿主细胞，其包含权利要求11-12中任意一项所述的核酸。
16.一种获得权利要求1-10中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在足以获得所述抗体的条件，在培养基中培养权利要求15所述宿主细胞，以及必要时，随后对所得抗体进行分离和纯化。
17.一种用于治疗GITR介导的疾病或病症的药物组合物，所述药物组合物含有与一种或多种药学上可接受的赋形剂相组合的治疗有效量的权利要求1-10中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段。
18.一种治疗GITR介导的疾病或病症的药物组合物，所述药物组合物含治疗有效量的权利要求1-10中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及至少一种治疗有效量的具有治疗活性的抗肿瘤化合物。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中的具有治疗活性的抗肿瘤化合物选自化疗剂、抗体或抗激素剂。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中的具有治疗活性的抗肿瘤化合物是选自抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA4抗体、抗4-1BB抗体、抗OX40抗体及其组合在内的组的抗体。
21.根据权利要求19所述的药物组合物，其中的具有治疗活性的抗肿瘤化合物是小分子。
22.根据权利要求18所述的药物组合物，其中的具有治疗活性的抗肿瘤化合物选自先天免疫激活剂或后天免疫激活剂。
23.根据权利要求19-22中任意一项所述的药物组合物，其中的权利要求1-10中任意一项所述的抗体与至少一种具有治疗活性的抗肿瘤化合物先后或同时施用。
24.权利要求1-10中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求17或18所述的药物组合物用于制备用于治疗GITR介导的疾病或病症的药物的用途。
25.根据权利要求24所述的用途，其中的疾病或病症是选自含宫颈癌、头颈癌、胃癌、乳腺癌、肾细胞癌、结直肠癌(CRC)、卵巢癌(OC)、非小细胞肺癌(NSCLC)在内的组。
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