KR20220010501A - Gitr에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생물공학 분야, 구체적으로 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 그 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산, 발현 벡터, 상기한 항체의 제조 방법 및 GITR 관련 질환 또는 장애의 치료에 있어 상기한 항체의 용도에 관한 것이다.

Description

GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체
본 발명은 생물공학, 구체적으로 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 그 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 GITR (글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련 단백질/TNFRSF18/종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리, 멤버 18)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산, 발현 벡터, 상기한 항체의 제조 방법 및 GITR 관련 질환 또는 장애의 치료에 있어 상기한 항체의 용도에 관한 것이다.
TNFRSF18, GITR (글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련 단백질/TNFRSF18/종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리)는 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 수용체인 막 단백질이다.
GITR은 아미노산 216개로 구성되고 분자량이 26 kDa인 1형 막관통 단백질이다. N-말단 세포외 도메인은 TNFR-Cys 반복체 3개와 N-당화 부위를 포함한다. GITR의 시스테인-풍부 도메인 3개와 세포질 꼬리는 4-1BB, OX40 및 CD27과 현저한 상동성을 공유한다 (Nocentini, et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:6216-6221).
인간 GITR은 반응자 T 세포에서 낮은 수준으로 발현되며, CD4+ 세포에서는 CD8+ 세포와 비교해 높은 발현성을 보인다. GITR 발현은 T 세포 활성화 후 수일 동안 현저하게 상향 조절된다. GITR은 CD4+CD25+ 또는 CD8+CD25+ 세포와 같은 조절성 T 세포 (Treg)에서 높은 수준으로 구성적으로 발현되고, 이들 세포가 활성화되면 추가로 상향 조절된다 (Nocentini and Riccardi (2005) E. J. Immunol. 35:1016).
그러나, GITR 발현은 T 세포에서만 제한되지 않는다. 여러가지 연구들에서도, GITR이 NK 세포, 대식세포, B 세포, 수지상 세포, 비만 세포 및 단핵구 상에서 발현되는 것으로 확인되었다 (Nocentini 및 Riccardi (2005) E. J. Immunol. 35:1016-1022).
GITR은 림프절, 말초혈 백혈구 세포에서 발현되고, 비장에서 더 약하게, Treg 상에서는 높은 수준으로 구성적으로, 나이브 T 세포 및 기억 세포에서는 소량 발현된다.
그러나, GITR은 면역 세포뿐 아니라 종양 세포에서도 발현된다. 33종의 종양에서 GITR 발현에 대한 RNA-Seq 데이터 분석이 수행되었으며, HNSCC (두경부 편평 세포암), NSCLC (비-소 세포성 폐암), 유방암, 식도암 및 방광암에서 GITR이 높은 수준으로 발현되는 것으로 밝혀져 있다.
24종의 종양 샘플에 대한 RNA-Seq 분석에서도 비슷한 결과가 나타났다. 즉, GITR은 면역 세포뿐 아니라 종양 세포의 막에서도 발현된다. 종양 샘플에서, GITRL-Fc는 T 세포, CD8 T 세포, 세포독성, Th1 세포, 인터페론 γ, NK 세포, Teff 세포 및 T 세포 활성화 마커와 관련 있는 유전자 발현을 증가시켰다.
GITR 및 이의 리간드의 발현은 조혈 세포로 국한되지 않는다. GITR은 각질 형성 세포, 파골세포 전구체 상에서도 발현되는 반면, GITRL은 내피 세포 상에서 발현된다.
GITRL은 대부분의 TNF 리간드 패밀리 멤버에서 전형적인 타입 II의 막관통 단백질이다. 현재 연구에서, 인간 GITRL은 전형적으로 트리머로서 존재하지만, 모노머로 존재하거나 또는 다른 멀티머 형태로 조립될 수 있는 것으로 알려져 있다 (Chattopadhyay, et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. 104:19452-19457; Zhou, et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. 105:635-640). GITRL의 용해성 형태도 생성된다는 증거도 일부 존재한다 (Baltz, et al. (2008) Blood 112:3735-3743; Mahesh, et al. (2006) Eur. J. Immunol. 36: 2128-2138). GITRL은 APC로서 기능할 수 있는 대식세포, B 세포, 수지상 세포 및 내피 세포 등의 항원 제시 세포 (APC) 상에 주로 발현된다 (Nocentini 및 Riccardi (2005) E. J. Immunol. 35:1016-1022; Agostini, et al. (2005) Infect. Immun. 73:7502-7508; 및 Nocentini, et al. (2007) E. J. Immunol. 37:11651169).
APC 상의 GITRL에 반응자 T 세포 상의 GITR가 결합하면 GITR 신호전달이 촉발되어, 반응자 T 세포가 공동-자극되고, 조절성 T 세포의 억제 활성이 저해된다. GITR 신호전달은 CD4+ 및 CD8+ 나이브 T 세포에 대한 공동-활성화 신호로서 기능해, 증식 및 작동자 기능을, 특히 T 세포 수용체 (TCR) 자극이 최적 수준에 가까워지게 되면, 유도 또는 강화한다 (Schaer, et al. (2012) Curr. Opin. Immunol. 24:217224). 보다 구체적으로, GITR은 작동자 T 세포 및 조절성 T 세포에 대해 몇가지 효과를 나타낼 수 있다: 저해에 더 내성이 되도록 작동자 T 세포의 공동-자극 및 활성화, 조절성 T 세포의 저해, 조절성 T 세포에 의한 억제에 대한 작동자 T 세포의 민감성 감소, 및 순환계로부터 조절성 T 세포의 일부 제거 (Nocentini, et al. (2007) Eur. J. Immunol. 37:1165-1169).
GITR의 주요 기능들, 즉 항-GITR 항체의 주요 효과는 작동자 T 세포의 증식과 기능을 강화하고, Treg의 억제 효과를 저해하는 것이다. Teff 세포는 처음에는 저해성 종양 미세환경 및 Treg 세포에 의한 억제를 견디는 능력 없이 생성된다. 감작 및 증폭 2차 단계에서 작용제 항-GITR 항체, 용해성 GITR 리간드 또는 DC 백신을 통한 GITR의 자극이, Teff 및 Treg 종양 반응을 전자에 우호적으로 조절하여, 종양 퇴행을 촉진한다. 따라서, 항-GITR 항체는 Treg 억제에 대한 Teff 내성을 제공한다.
종합적으로, 전술한 기능들, 특히 반응자 T 세포의 공동-자극 및 조절성 T 세포의 억제자 활성의 파기는, GITR 활성화로 면역 반응이 강화되는 것을 의미한다. 이러한 활성화는 감염 및 종양에 대해 면역 반응을 회복시킬 수 있는 잠재성을 가지고 있다. 이에, GITR을 활성화할 수 있는 분자는, 강화된 면역 반응 촉발이 요망되는 상황에 면역자극제로서 유용할 것이다.
항체는 작동자, Treg 림프구에 대한 세포독성 특성을 가진, GITR 작용제 특성을 가지고 있어야 한다.
GITR에 대한 다양한 항체들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다 (예, WO2015187835, WO2015031667, WO2017068186, WO2017096189, WO2017214548).
현재 23종의 항-GITR 작용제 (항체/재조합 GITRL)들이 전임상 및 임상 실험 중에 있다. 항체 단 2종이 (TRX518, INCAGN1876) 2상 임상 실험 중이고, AMG228, MEDI1873, MK-4166은 1상 임상 실험 중에 있다. 임상 데이터는 거의 없다.
그러나, 현재, GITR에 특이적으로 결합하고 치료학적 용도로 허가된 항체는 전세계적으로 존재하지 않는다.
이와 관련하여, GITR과 상호작용하고, 조절성 T 세포의 억제자 효과를 무력화하고, 면역 시스템의 T-억제자 (조절성) 성분을 ADCC 작동자 특성을 통해 저해/고갈시키는, 새로운 작용제성 항체를 구축하는 것이 적절하다.
BCD-166은 GITR과 상호작용하며, 수용체를 활성화하고, 조절성 T 세포의 억제자 효과를 무력화하고, 면역 시스템의 T-억제자 (조절성) 성분을 ADCC 작용자 특성을 통해 저해/고갈시켜, CD8+ 및 CD4+ 작동자 세포의 수를 증가시키고 종양 미세환경에서 면역 시스템의 T-작동자 성분을 활성화하는, 작용제 단일클론 항체이다.
일 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는, GITR에 특이적으로 결합하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다:
(a) 하기를 포함하는 중쇄 가변성 도메인:
(i) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1:
NYGMH (서열번호 1) 또는 YYWMY (서열번호 12);
(ii) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2:
VIWFDGSNKFYTDSVKG (서열번호 2) 또는 AISWNGGRTYYAESMKG (서열번호 13);
(iii) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3:
ELGGYYYDSSGFRPYYYGMDV (서열번호 3) 또는 NRYYSDPNYGMNL (서열번호 14), 및
(b) 하기를 포함하는 경쇄 가변성 도메인:
(i) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1:
RASQSIGSWLA (서열번호 7) 또는 TGTSTDIGTYKYIS (서열번호 17);
(ii) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2:
AASTLQR (서열번호 8) 또는 GVSHRPS (서열번호 18);
(iii) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3:
QQSHSHPLT (서열번호 9) 또는 SSYTSSGTVV (서열번호 19).
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 1, 2 및 3의 서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 12, 13 및 14의 서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 7, 8 및 9의 서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 17, 18 및 19의 서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
- 서열번호 1, 2 및 3의 서열에 의해 각각 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변성 도메인;
- 서열번호 7, 8 및 9의 서열에 의해 각각 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
- 서열번호 12, 13 및 14의 서열에 의해 각각 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변성 도메인;
- 서열번호 17, 18 및 19의 서열에 의해 각각 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4의 아미노산에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 15의 아미노산에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 10의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 20의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
- 서열번호 4의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인;
- 서열번호 10의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
- 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인;
- 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
- 서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인;
- 서열번호 20의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
- 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인;
- 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 전장 IgG 항체이다.
일부 구현예에서, 단일클론 IgG 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형 형태이다.
일부 구현예에서, 단일클론 IgG 항체는 인간 IgG1 이소형 형태이다.
일부 구현예에서, GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 작용제 특성, 보체-의존적인 세포독성 (CDC)이 아닌 항체-의존적인 세포성 세포독성 (ADCC)을 높이기 위해, Fc 단편에 E345R 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 서열번호 5의 서열과 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 서열번호 6의 서열과 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 서열번호 11의 서열과 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기를 포함한다:
- 서열번호 5의 서열과 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
- 서열번호 11의 서열과 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기를 포함한다:
- 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
- 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기를 포함한다:
- 서열번호 6의 서열과 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
- 서열번호 11의 서열과 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기를 포함한다:
- 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
- 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 서열번호 16의 서열과 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 서열번호 21의 서열과 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기를 포함한다:
- 서열번호 16의 서열과 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
- 서열번호 21의 서열과 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기를 포함한다:
- 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
- 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일 측면에서, 본 발명은 상기한 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 핵산은 DNA이다.
일 측면에서, 본 발명은 상기한 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 세포에 상기 벡터를 형질전환하는 것을 포함하는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 숙주 세포를 구축하는 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하기 위한 숙주 세포에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 숙주 세포를 상기 항체를 생산하기에 충분한 조건 하에 배양 배지에서 배양한 다음 필요에 따라 수득한 항체를 단리 및 정제하는 것을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 수득 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 치료학적 유효량으로 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여 포함하는 GITR에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용되는 약학적 조성물에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 자궁경부암, 두경부암, 위암, 유방암, 신장 세포 암, CRC (결장직장암), (OC) 난소암, NSCLC (비-소 세포성 폐암)를 포함하는 군으로부터 선택되는 GITR에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 것으로 의도된다.
일 측면에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 치료학적 유효량의 하나 이상의 치료학적 활성 항종양 화합물을 포함하는 GITR에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 자궁경부암, 두경부암, 위암, 유방암, 신장 세포 암, CRC (결장직장암), (OC) 난소암, NSCLC (비-소 세포성 폐암)를 포함하는 군으로부터 선택되는 GITR에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 것으로 의도된다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 화학치료제, 항체 또는 항-호르몬제로부터 선택되는 치료학적 활성의 항종양 화합물을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 항-PD1 항체, 항체-PD-L1 항체, 항체-CTLA4 항체, 항체-4-1BB 항체, 항체-OX40 항체 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 항체인 치료학적 활성의 항종양 화합물을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 소분자로서 치료학적 활성의 항종양 화합물을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 선천 면역 또는 획득 면역의 활성자 (activators of innate or adaptive immunity) 군으로부터 선택되는 치료학적 활성의 항종양 화합물을 포함한다.
약학적 조성물에 대한 일부 구현예에서, 항체 및 하나 이상의 치료학적 활성의 항종양 화합물은 순차적으로 투여된다.
약학적 조성물에 대한 일부 구현예에서, 항체 및 하나 이상의 치료학적 활성의 항종양 화합물은 동시에 투여된다.
일 측면에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 저해가 필요한 개체에서 GITR의 생물학적 활성을 저해하는 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약학적 조성물을 치료학적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함하는 GITR에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 치료 방법은 자궁경부암, 두경부암, 위암, 유방암, 신장 세포 암, CRC (결장직장암), (OC) 난소암, NSCLC (비-소 세포성 폐암)을 포함하는 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애를 포괄한다.
일 측면에서, 본 발명은 GITR에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료가 필요한 개체에서 치료하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 용도는 자궁경부암, 두경부암, 위암, 유방암, 신장 세포 암, CRC (결장직장암), (OC) 난소암, NSCLC (비-소 세포성 폐암)을 포함하는 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애를 포괄한다.
도 1. 단백질 생산용 플라스미드 pEE-GITR-TEV-Fc lama.
도 2. 단백질 생산용 플라스미드 pEE-GITR-Fc.
도 3. 플라스미드 pEE-humGITR-ligand-foldon-EPEA의 지도.
도 4. SDS-PAGE (4-20% 겔)
1. Actemra 2.5 mg
2. Fermentas 비염색 PW 마커
3. -
4. GITR-TEV-Fc-lama +β-ME 10 ml
5. Angiopoetin 2-H6F + β-ME 10 ml
6. -
7. GITR-TEV-Fc-lama -β -ME 10 ml
8. Angiopoetin 2-H6F - β-ME 10 ml
도 5. SDS 겔 전기영동
1. Fermentas 비-염색 PW 마커
2. -
3. 정제하기 전 hGITR 리간드 -EPEA 배지 5 ml
4. 정제한 후 hGITR 리간드 -EPEA 배지 5 ml
5. hGITR 리간드 -EPEA
도 6. 인간 나이브 조합 라이브러리의 합성 계획.
도 7. Fab 파지 디스플레이 라이브러리 클로닝용 파지미드 pH5의 지도.
도 8. 분비형 Fab를 생산하기 위한 발현 플라스미드 pLL의 지도.
도 9. 포유류 세포에서 일시적으로 항체를 생산하기 위한 항체의 중쇄를 코딩하는 발현 벡터 pEE-BCD166-01-001-VH-HC의 지도.
도 10. 포유류 세포에서 일시적으로 항체를 생산하기 위한 항체의 경쇄를 코딩하는 발현 벡터 pEE-BCD166-01-001-VK-CK의 지도.
도 11. 12% 겔 + β-ME에서 SDS-PAGE.
1. Actemra 5 ml
2. Fermentas 비-염색 PW 마커
3. -
4. 정제하기 전 항-GITR 항체 lot#1161 배지 5 ml
5. 정제한 후 항-GITR 항체 lot#1161 배지 5 ml
6. 항-GITR 항체 lot#1161 5 ml
7. 항-GITR 항체 lot#1162 5 ml
8. 항-GITR 항체 lot#1163 5 ml
9. 항-GITR 항체 lot#1164 5 ml
10. 항-GITR 항체 lot#1165 5 ml
11. 정제하기 전 항-GITR 항체 lot#1166 배지 5 ml
12. 정제한 후 항-GITR 항체 lot#1166 배지 5 ml
13. 항-GITR 항체 lot#1166 5 ml
14. 항-GITR 항체 lot#1167 5 ml
도 12. SDS-PAGE in 12% GEL + β-ME
1. Fermentas 비-염색 PW 마커
2. 정제하기 전 항-GITR 항체 lot#1208 배지 10 ml
3. 정제한 후 항-GITR 항체 lot#1208 배지 10 ml
4. 항-GITR 항체 lot#1208 5 ml
5. 항-GITR 항체 lot#1209 5 ml
6. 항-GITR 항체 lot#1210 5 ml
7. 항-GITR 항체 lot#1211 5 ml
8. 항-GITR 항체 lot#1212 5 ml
9. 항-GITR 항체 lot#1213 5 ml
10. 정제하기 전 항-GITR 항체 lot#1214 배지 10 ml
11. 정제한 후 항-GITR 항체 lot#1214 배지 10 ml
12. 항-GITR 항체 lot#1214 5 ml
도 13. 리포터 세포주 분석에서 lot 1161 (BCD166-01-01), 1210 BCD166-01-011) 및 1213 BCD166-01-014)의 항-GITR 단일클론 항체의 특이적인 작용제 활성을 조사한 결과를 나타낸 그래프.
도 14. 인간 GITR, 마우스 GITR 및 시노몰구스 원숭이 GITR에 대한 BCD166-01-01 항체의 특이적인 결합성을 조사한 결과를 나타낸 그래프.
도 15. 인간 GITR, 마우스 GITR 및 시노몰구스 원숭이 GITR에 대한 BCD166-01-011 항체의 특이적인 결합성을 조사한 결과를 나타낸 그래프.
도 16. 인간 GITR, 마우스 GITR 및 시노몰구스 원숭이 GITR에 대한 BCD166-01-014 항체의 특이적인 결합성을 조사한 결과를 나타낸 그래프.
도 17. 대상 BCD166-01-01, BCD166-02-01, BCD166-01-014에 대한 세포 작용제 분석에서 활성화 수준 결과를 나타낸 그래프.
도 18. 대상 BCD166-02-01, BCD166-01-01, BCD166-01-014, BCD166-02-014에 대한 ADCC 분석에서 EC50 결과를 나타낸 그래프.
도 19. 대상 BCD166-01-01, BCD166-02-01, BCD166-01-014에 대한 CDC 수준 결과를 나타낸 그래프.
도 20. 반응자 세포 (NK)에 대한 대상 항-GITR 후보물질의 효과 결과를 음성 대조군과 비교 도시한 그래프.
도 21. 반응자 세포 (B)에 대한 대상 항-GITR 후보물질의 효과 결과를 음성 대조군과 비교 도시한 그래프.
도 22. 반응자 세포 (CD3)에 대한 대상 항-GITR 후보물질의 효과 결과를 음성 대조군과 비교 도시한 그래프.
도 23. 반응자 세포 (CD8+ T 세포)에 대한 대상 항-GITR 후보물질의 효과 결과를 음성 대조군과 비교 도시한 그래프.
도 24. 반응자 세포 (CD4+ T 세포)에 대한 대상 항-GITR 후보물질의 효과 결과를 음성 대조군과 비교 도시한 그래프.
도 25. 도너 1 세포 물질에 대한 대상 항-GITR 후보물질의 효과 하의 항체-의존적인 nTreg 고갈 분석.
도 26. 도너 2 세포 물질에 대한 대상 항-GITR 후보물질의 효과 하의 항체-의존적인 nTreg 고갈 분석.
도 27. 도너 1 및 도너 2 세포 물질에 대한 대상 항-GITR 후보물질의 효과 하의 iTreg의 항체-의존적인 고갈 분석
도 28. 항암 효과를 자극하는 전염증성 사이토카인 IL-2 및 IFN-γ의 분비 수준에 대한 항-GITR 항체 효과를 분석한 결과.
도 29. γ 수용체에 대한 BCD166-02-01 후보물질의 결합 친화성 계수 데이터 표.
도 30. 50℃에서 72시간 인큐베이션 하 BCD166-02-01의 안정성을 나타낸 그래프.
도 31. 50℃에서 72시간 인큐베이션 하 BCD166-01-014의 안정성을 나타낸 그래프.
도 32. 실험하는 동안 군들의 평균 종양 체적 값.
도 33. 33일에 종양 증식 저해 지수.
정의 및 일반적인 방법
달리 정의되지 않은 한, 본원에서 사용되는 모든 과학 용어 및 기술 용어는 당해 기술 분야의 당업자들에게 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가질 것이다.
나아가, 문맥상 달리 요구되지 않은 한, 단수형 용어들은 복수를 포함할 것이며, 복수형 용어들은 단수를 포함할 것이다. 전형적으로, 세포 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 분석화학, 유기 합성 화학, 의학 및 제약 화학의 분류 및 방법뿐 아니라 본원에 기술된 단백질 및 핵산의 혼성화 및 화학은 잘 알려져 있으며, 당해 기술 분야의 당업자에 의해 광범위하게 사용된다. 효소 반응 및 정제 방법들은 당해 기술 분야에 통상적이거나 또는 본원에 기술된 바와 같이, 제조사의 지침에 따라 수행된다.
항체 관련 정의
TNFRSF18, GITR (글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련 단백질/TNFRSF18/종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리)은 아미노산 216개로 구성되고 분자량이 26 kDa인 1형 막관통 단백질이다. N-말단 세포외 도메인은 TNFR-Cys 반복체 3개와 N-당화 부위를 포함한다. GITR의 시스테인-풍부 도메인 3개와 세포질 꼬리는 4-1BB, OX40 및 CD27과 현저한 상동성을 공유한다 (Nocentini, et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:6216-6221).
GITR 유전자의 증폭 및/또는 이의 단백질의 과다 발현은 자궁경부암, 두경부암, 위암, 유방암, 신장 세포 암, CRC (결장직장암), (OC) 난소암, NSCLC (비-소 세포성 폐암) 등의 다수의 암 질환들에서 발견되었다.
용어 "결합성 분자"는 항체 및 면역글로불린을 포함한다.
본 설명에서, 용어 "항체" 또는 "면역글로불린" (Ig)은 전체 항체 및 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 영역") 또는 이의 단쇄를 포함한다. 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 당단백질, 또는 항원-결합 영역을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변부 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변부를 포함한다. 그리스 문자 α, δ, ε, γ 및 μ로 표시되는 5가지 타입의 포유류 Ig 중쇄가 공지되어 있다. 존재하는 중쇄의 타입이 항체 클래스를 규정하고; 이들 쇄들은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 항체 각각에서 발견된다. 구별되는 중쇄들은 크기 및 구성 측면에서 다양하다; α 및 γ는 대략 450개의 아미노산을 포함하지만, μ 및 ε는 대략 550개의 아미노산을 포함한다. 각각의 중쇄는 2가지 영역, 즉 불변부 및 가변부를 포함한다. 불변부는 동일한 이소형의 항체들 모두에서 동일하지만, 서로 다른 이소형 항체들에서는 상이하다. 중쇄 γ, α 및 δ는 3개의 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3 (일렬로)로 구성된 불변부와, 유연성 (flexibility) 부가를 위한 힌지부를 포함하며 (Woof J., Burton D., Nat Rev Immunol 4, 2004, cc.89-99); 중쇄 μ 및 ε는 4개의 불변 도메인 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 구성된 불변부를 가진다. 포유류에서는, 람다 (λ) 및 κ (κ)로 언급되는 오직 2가지 타입의 경쇄만 공지되어 있다. 각 경쇄는 경쇄 가변부 (본원에서 VL로 약칭됨)와 경쇄 불변부로 구성된다. 경쇄의 대략적인 길이는 아미노산 211개 내지 217개이다. 바람직하게는, 경쇄는 카파 (κ) 경쇄이고, 불변 도메인 CL은 바람직하게는 C 카파 (κ)이다.
본 발명에서 "항체"는 임의 클래스 (예, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 바람직하게는 IgG) 또는 서브클래스 (예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2, 바람직하게는 IgG1)에 속하는 것일 수 있다.
VL 영역 및 VH 영역은 프래임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 보존성이 높은 영역들과 그 사이에 배치된 상보성 결정부 (CDR)로 지칭되는 과-가변성 영역으로 더욱 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 CDR 3개와 FR 4개로 구성되며, 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 다음과 같은 순서로 정렬된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 가변부와 경쇄 가변부는 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변부는 면역계의 다양한 세포 (예, 작동자 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분 (Clq) 등의, 숙주 조직 또는 인자에의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에서, 항체의 "항원-결합 영역" 또는 "항원 결합 단편" (또는 간단히 "항체 영역" 또는 "항체 단편")이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 가진, 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있는 것으로 입증된 바 있다. 항체의 "항원-결합 영역"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는, (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인들로 이루어진 1가 단편인, Fab 단편; (ii) 힌지부에서 이황화 결합에 의해 2개의 Fab 단편들이 연결된 2가 단편인, F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd-단편; (iv) 항체의 싱글 암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv-단편, (v) VH/VHH 도메인으로 구성된 dAb-단편 (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정부 (CDR) 등이 있다. 또한, Fv 단편의 2개의 영역, 즉 VL와 VH는 개별 유전자들에 의해 코딩되지만, VL 및 VH 영역들이 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성하는 싱글 단백질 쇄를 만들 수 있는 합성 링커에 의한 재조합 방법으로 연결될 수도 있다 (단쇄 Fv (scFv)로 알려져 있음; 예로, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883을 참조함). 이러한 단일-가닥 분자는 또한 항체의 "항원-결합 영역"이라는 용어에 포함되는 것으로 추정된다. 이러한 항체 단편은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 통상적인 기법을 이용해 수득되며, 이들 단편은 온전한 항체 (intact antibody)와 동일한 방식으로 스크리닝된다.
바람직하게는, 본 발명의 항원-결합 영역의 CDR 또는 전체 항체 항원 결합 영역은 마우스, 라마 또는 인간 도너 라이브러리로부터 유래되거나, 또는 일부 아미노산 잔기가 변형된, 예를 들어 특정 항체 특성, 예를 들어, KD, koff, IC50, EC50, ED50을 최적화하기 위해 다른 아미노산 잔기로 치환된, 실질적으로 인간 기원의 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체의 프래임워크 영역은 인간 기원의 것이거나 또는 실질적으로 인간 기원의 것이다 (인간 기원의 비율이 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%임).
다른 구현예들에서, 본 발명의 항원 결합 영역은, 비-제한적인 예로, 마우스, 라마, 토끼, 랫 또는 햄스터 등의, 인간을 제외한 다른 종으로부터 유래될 수 있다. 다른 예로, 항원-결합 영역은 인간 종으로부터 유래될 수 있다.
용어 "가변성"은 가변성 도메인의 일정 부분이 항체들에서 서열상 상당히 상이하다는 것을 의미한다. V 도메인은 각 특정 항체의 이의 특정 항원에 대한 항원 결합을 매개하고 특이성을 결정한다. 그러나, 가변성이 가변성 도메인의 110개의 아미노산 전체에 균등하게 분산되어 있지 않다. 대신, V 영역은 "과가변부" 또는 CDR로 지칭되는 극도의 가변성을 가진 더 짧은 가닥에 의해 이격된 아미노산 15-30개로 된 프래임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 불변성 단편들로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 각 가변성 도메인은 FR 4개를 포함하며, 연결성 루프, 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는, 과가변부 3개에 의해 연결된, β-시트 배열을 주로 취한다. 각 체인에서 과가변부들은 FR에 의해 서로 인접하게 유지되며, 다른 체인으로부터 유래된 과가변부와 함께 항체의 항원-결합부를 형성하는데 기여한다. 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는데 직접 참여하진 않지만, 항체-의존적인 세포성 세포독성 (ADCC)에 항체 참여 등의 여러가지 작동자 기능을 발휘한다.
본 설명에서, 용어 "과가변부"는 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 전형적으로, 과가변부는 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터 유래된 아미노산 잔기 및/또는 "과가변성 루프"로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 경우에, 타겟 에피토프에 대한 결합 친화성을 높이기 위해 하나 이상의 CDR 아미노산 잔기를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 "친화성 성숙화"라고 하며, 선택적으로, 예를 들어, 항체의 인간화에 의해 결합 특이성 또는 친화성의 저하가 발생하고 역 돌연변이 (inverse mutation) 단독에 의해 결합 특이성 또는 친화성을 충분히 개선하는 것이 가능하지 않을 경우, 인간화와 더불어 수행될 수 있다. 다양한 친화성 돌연변이 방법들, 예를 들어, Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997)에 언급된 시험관내 스캐닝 포화 돌연변이 유발 방법 및 Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042 (1998)에 제시된 단계별 시험관내 친화성 성숙화 방법이 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
"프래임워크 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변성 도메인 잔기이다. 각각의 가변성 도메인은 전형적으로 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 식별되는 FR 4개를 가지고 있다. CDR이 Kabat에 따라 정의되는 경우, 경쇄 FR 잔기들은 대략적으로 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) 및 98-107 (LCFR4)번 위치에 위치하고, 중쇄 FR 잔기들은 대략적으로 중쇄에서 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) 및 103-113 (HCFR4)번 위치에 위치한다. CDR이 과가변성 루프로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함하는 경우, 경쇄 FR 잔기는 대략적으로 경쇄에서 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) 및 97-107 (LCFR4)번 위치에 존재하며, 중쇄 FR 잔기는 대략적으로 중쇄 잔기에서 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) 및 102-113 (HCFR4)번 위치에 존재한다. CDR이 Kabat에 의해 정의되는 양쪽 CDR 및 과가변성 루프로부터 유래된 아미노산을 포함하는 일부 경우에, FR 잔기들은 그에 따라 조정될 것이다. 예를 들어, CDRH1이 아미노산 H26-H35를 포함할 경우, 중쇄 FR1 잔기는 1-25번 위치에 위치하고, FR2 잔기는 36-49번 위치에 위치한다.
면역글로불린의 단편 결정화가능한 영역 (fragment crystallizable region)("Fc 영역, Fc")은 세포 표면 Fc-수용체와 상호작용하는 면역글로불린 분자뿐 아니라 보체 시스템의 일부 단백질의 "꼬리" 영역이다. 이런 특성이 항체가 면역 시스템을 활성화하게 만든다. IgG, IgA 및 IgD 항체 이소형의 경우, Fc 영역은 중쇄 2개의 제2 및 제3 불변 도메인으로부터 유래된 각각의 동일한 단백질 단편 2개로 구성되고; IgM 및 IgE 이소형의 경우, Fc 영역은 각각의 폴리펩타이드 쇄에 중쇄 불변 도메인 3개 (CH 도메인 2-4)를 포함한다.
표적 항원에 "결합하는" 본 발명의 항체는, 항체가 단백질 또는 항원을 발현하는 세포를 표적화하는 치료학적 물질 및/또는 진단 물질로서 사용될 수 있도록 충분한 친화성으로 항원에 결합하며, 다른 단백질과는 일부 교차 반응하는 항체이다. 분석 방법에 따라: 형광-활성화된 세포 분류 (FACS), 방사성면역분석 (RIA) 또는 ELISA, 이러한 구현예에서, 비-표적 단백질에 항체가 결합하는 수준은 특이적인 표적 단백질에 결합하는 항체의 10% 미만이다. 항체가 표적 분자에 결합하는 것과 관련하여, 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 상의 에피토프에 "특이적인 결합" 또는 "에 특이적으로 결합한다" 또는 "에 특이적"이라는 용어는, 비-특이적인 상호작용과는 검출가능하게 (측정가능하게) 상이한 결합을 의미한다 (예, bH1-44 또는 bH1-81의 경우, 비-특이적인 상호작용은 소 혈청 알부민, 카세인, 소 태아 혈청 또는 뉴트라비딘에의 결합이다).
특이적인 결합은, 예를 들어, 분자의 결합을 대조군 분자의 결합과 비교 측정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적인 결합은 표적과 비슷한 다른 분자, 예를 들어 과량의 비-표지 표적을 이용한 경쟁적인 반응에 의해 결정할 수 있다. 이 경우, 표지된 표적과 프로브의 결합이 과량의 비-표지된 표적에 의해 경쟁적으로 저해된다면, 이는 특이적인 결합이다. 본원에서, 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 타겟 상의 에피토프에 "특이적인 결합" 또는 "에 특이적으로 결합한다" 또는 "에 특이적"이다라는 표현은, 표적에 대한 Kd가 적어도 약 200 nM 또는 적어도 약 150 nM 또는 적어도 약 100 nM 또는 적어도 약 60 nM 또는 적어도 약 50 nM 또는 적어도 약 40 nM 또는 적어도 약 30 nM 또는 적어도 약 20 nM 또는 적어도 약 10 nM 또는 적어도 약 8 nM 또는 적어도 약 6 nM 또는 적어도 약 4 nM 또는 적어도 약 2 nM 또는 적어도 약 1 nM 또는 그 이상인 분자로 설명될 수 있다. 일 구현예에서, 용어 "특이적인 결합"은 분자가 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 상의 에피토프에만 결합하고 임의의 다른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 상의 에피토프에는 실질적으로 결합하지 않는 것을 의미한다.
본원에서, 용어 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 (on) 속도를 의미한다.
본원에서, 용어 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 (off) 속도를 의미한다.
"결합 친화성"은 일반적으로 분자 (예, 항체)의 단일 결합부와 이의 결합 파트너 (예, 항원) 간의 비-공유성 상호작용들 전체의 세기를 의미한다. 달리 언급되지 않은 한, "결합 친화성"은 결합 쌍의 멤버들 (예, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 나타내는 고유한 (특징적인, 참된) 결합 친화성을 의미한다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화성은 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 바람직한 Kd 값은 약 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM 또는 그 미만이다. 친화성은 본원에 기술된 방법 등의 당해 기술 분야에 공지된 일반적인 방법으로 측정할 수 있다. 저-친화성 항체는 일반적으로 항원에 천천히 결합하고 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고-친화성 항체는 일반적으로 항원에 보다 빨리 결합하고 결합된 상태로 더 길게 머무르는 경향을 보인다. 결합 친화성을 측정하는 다양한 방법들은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 이중 임의의 방법을 본 발명의 목적에 따라 이용할 수 있다.
일 구현예에서, "Kd" 또는 "Kd 값"은 ~10 반응 단위 (RU)로 고정된 칩 CM5 항원을 사용해 25℃에서 BIAcore™-2000 또는 BIAcore®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)을 이용해 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정한다. 간략하게는, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore Inc.)을 제조사의 지침에 따라 N-에틸-N'-다이메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)를 사용해 활성화한다. 항원을 10 mM 소듐 아세테이트, pH 4.8을 사용해 5 ㎍/ml (~0.2 μM) 농도로 희석한 다음, 결합된 단백질 약 10 반응 단위 (RU)가 되도록 5 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 항원을 주입한 후, 1M 에탄올아민 용액을 주입해 비-반응성 기들을 차단한다. 카이네틱스를 측정하기 위해, Fab 2배 연속 희석물 (예, 0.78 nM 내지 500 nM)을 0.05% Tween 20 첨가된 PBS (PBST) 중에 25℃에서 약 25 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 결합 및 해리 센소그램을 동시적으로 피팅함으로써, 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 간단한 원 투 원 랭뮤어 결합 모델 (BIAcore 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용해 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon 비율로 계산한다. 예를 들어, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881을 참조한다. 이러한 표면 플라스몬 공명 분석에 따라 결합 속도가 106 M- 1 s-1을 초과한다면, 이는, 정지 흐름 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광광도계 (Thermo Spectronie)와 같은 분광기에서 큐벳을 교반하면서 측정한 바와 같이, 항원 농도 증가 조건에서, PBS, pH 7.2의 20 nM 항-항원 항체 용액을 25℃에서 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 (조사) = 340 nm, 16 nm 대역 (band))의 증가 또는 감소를 측정하는, 형광 퀀칭에 의해 결정할 수 있다.
용어 "koff"는 결합 분자와 항원 간의 특수한 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. koff 해리 속도 상수는 예를 들어 Octet™ 시스템을 사용해 바이오레이어 간섭계법 (biolayer interferometry)에 의해 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 "결합 속도" ("on-rate") 또는 "kon"은 또한 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)에서 ~10 상대적인 단위 (반응 단위, RU)로 고정된 항원 CM5 칩을 사용해, 25℃에서, 전술한 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정할 수 있다. 간략하게는, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore Inc.)을 제조사의 지침에 따라 N-에틸-N'-다이메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)를 사용해 활성화한다. 항원을 10 mM 소듐 아세테이트, pH 4.8을 사용해 5 ㎍/ml (~0.2 μM) 농도로 희석한 다음 결합된 단백질 약 10 반응 단위 (RU)가 되도록 5 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 항원을 주입한 후, 1M 에탄올아민 용액을 주입하여 미-반응성 기들을 차단한다.
달리 명시되지 않은 한, 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 "생물학적으로 활성인" 및" 생물학적 활성" 및 "생물학적 특징"은 생물학적 분자에 결합하는 능력을 가진 것을 의미한다.
용어 "생물학적 분자"는 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질 및 이들의 조합을 지칭한다. 일 구현예에서, 생물학적 분자는 자연계에 존재하는 것이다.
Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 단편은 전체 항체 (whole antibody)에 대한 펩신 또는 파파인 분해와 같은 통상적인 방법을 이용해 전체 항체로부터 수득할 수 있다. 또한, 항체, 항체의 일부 및 이뮤노어드헤신 (immunoadhesion) 분자는 본원에 기술된 바와 같이 표준적인 재조합 DNA 기법을 이용해 수득할 수 있다.
용어 "재조합 항체"는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 세포 또는 세포주에서 발현된 항체를 지칭하며, 이때 뉴클레오티드 서열(들)은 이들 세포에 천연적으로 조합되어 있지 않은 것이다.
본원에서, 용어 "변이체 항체"는, 부모 항체의 서열과 비교해, 하나 이상의 아미노산 잔기를 부가, 결손 및/또는 치환함으로써 이의 "부모" 항체의 아미노산 서열과 상이한, 아미노산 서열을 가진 항체를 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 변이체 항체는 부모 항체와 비교해 적어도 하나 이상의 (예, 1-12, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개, 일부 구현예에서, 변이체 항체는 1 내지 약 10개의) 아미노산의 부가, 결손 및/또는 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 부가, 결손 및/또는 치환은 변이체 항체의 CDR에서 이루어진다. 변이체 항체의 서열에 대한 동일성 또는 상동성은, 서열을 정렬하고, 필요에 따라 최대 서열 동일성 %를 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 변이체 항체 서열에서 부모 항체 잔기와 동일한 아미노산 잔기들의 %로서 본원에서 정의된다. 변이체 항체는, 부모 항체에 결합하는, 동일한 항원, 바람직하게는 에피토프에 결합하는 능력을 가지고 있으며, 일부 구현예에서 하나 이상의 특성 또는 생활성은 부모 항체보다 우수하다. 예를 들어, 변이체 항체는 부모 항체와 비교해 예를 들어 더 높은 결합 친화성을 가질 수 있거나, 반감기가 더 길 수 있거나, IC50 값이 더 낮거나 또는 항원의 생물학적 활성을 저해하는 능력이 강화될 수 있다. 본원에서는, 부모 항체와 비교해, 생물학적 활성이 적어도 2배 이상인 (바람직하게는 5배 이상, 10배 이상 또는 20배 이상) 변이체 항체에 특히 주목한다.
용어 "2중 특이성 항체"는 2개의 별개의 다른 생물학적 분자의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 하나의 생물학적 분자의 별개의 2개의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원-결합 도메인(들)을 가진 항체를 의미한다. 이중 특이성 항체는 또한 "듀얼 특이성"을 가진 것으로 또는 "듀얼 특이성" 항체인 것으로서 본원에서 지칭된다.
넓은 의미에서, 용어 "키메라 항체"는 하나의 항체의 하나 이상의 영역과, 하나 또는 수개의 다른 항체의 하나 이상의 영역, 전형적으로 부분적으로 인간 및 부분적으로 비-인간 항체, 즉 마우스, 랫 또는 유사 야생 동물과 같은 비-인간 동물 또는 라마 및 알파카 등의 낙타과로부터 일부 유래된 항체의 하나 이상의 영역을 포함하는, 항체를 지칭한다. 키메라 항체는 일반적으로 인간 항-항체 면역 반응, 예를 들어 뮤라인 항체의 경우 인간 항-마우스 항체 면역 반응의 위험성을 낮추기 위해, 비-인간 항체보다 선호된다. 전형적인 키메라 항체의 예는 가변성 영역의 서열이 뮤라인 서열이고 불변부 서열이 인간 서열인, 항체이다. 키메라 항체의 경우, 비-인간 영역은 항체를 인간화하기 위해 추가적으로 변형될 수 있다.
용어 "인간화 (humanization)"는, 항체가 완전 또는 부분적으로 비-인간 기원, 예를 들어, 대상 항원으로 마우스 또는 라마를 각각 면역화함으로써 수득한 마우스 또는 라마 항체이거나, 또는 이러한 마우스 또는 라마 항체에 기반한 키메라 항체일 경우, 인간에서 면역 반응을 회피하거나 또는 최소화하기 위해, 일부 아미노산, 특히 중쇄 및 경쇄의 프래임워크 영역 및 불변 도메인의 일부 아미노산을 치환할 수 있다는 것을 의미한다. 항체의 표적 항원과의 상호작용 특이성은 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역 6곳에 위치한 아미노산 잔기들에 내재되어 있다. 이러한 이유로, CDR 영역내 아미노산 서열은 CDR 영역 바깥쪽 서열에 비해 개별 항체들에서 훨씬 더 가변적이다. CDR 서열들이 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하므로, 특이적인 천연 생성 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키거나, 또는 보다 일반적으로는, 예를 들어, 특이 항체로부터 유래된 CDR 서열과 다른 항체로부터 유래된 프래임워크 서열을 발현하는 발현 벡터를 구축함으로써, 아미노산 서열을 가진 임의의 특이 항체를 발현시키는 것이 가능하다. 이로써, 비-인간 항체를 "인간화"하고, 초기 항체의 결합 특이성 및 친화성을 상당히 보존하는 것이 가능하다. 면역원성, 즉 특정 항체에 대한 인간 항-항체 반응을 정확하게 예측하기는 불가능하지만, 비-인간 항체는 전형적으로 인간 항체보다 면역원성이 더 높다. 외래 (예, 야생 동물 또는 낙타과) 불변부가 인간 기원의 서열로 치환된 키메라 항체는, 일반적으로, 완전 외래 기원의 항체보다 면역원성이 더 낮아, 치료 항체로 완전 인간 항체 또는 인간화된 항체를 사용하는 경향이다. 따라서, 키메라 항체 또는 비-인간 기원의 기타 항체는 따라서 인간 항-항체 반응의 위험성을 낮추기 위해 인간화될 수 있다.
키메라 항체의 경우, 인간화는 전형적으로 가변부 서열의 프래임워크 영역의 변형을 수반한다. 상보성 결정부 (CDR 영역)의 일부 아미노산 잔기는, 대부분 인간화에 의해 변형될 가능성이 거의 없지만, 일부 경우에는, 예를 들어, 당화 부위, 탈아미드화 부위, 아스파르테이트 이성질화 부위 또는 부적절한 시스테인 또는 메티오닌 잔기를 제거하기 위해, CDR의 개별 아미노산 잔기들을 변형하는 것이 바람직할 수 있다. N-연결된 당화는 트리펩타이드 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr에서 아스파라긴 잔기에 올리고당 쇄를 부착시켜 이루어지며, 서열에서 X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. N-당화 부위의 제거는 Asn 또는 Ser/Thr 잔기를 다른 잔기로 돌연변이함으로써, 바람직하게는 보존적인 치환에 의해 달성될 수 있다. 아스파라긴 및 글루타민 잔기의 탈아미드화는 pH 및 표면 노출과 같은 인자에 따라 이루어질 수 있다. 특히, 아스파라긴 잔기는, 주로 Asn-Gly 서열에 존재하는 경우에는 탈아미드화되기 쉬우며, Asn-Ala과 같은 다른 다이펩타이드 서열에서는 그 정도가 낮다. CDR이 이러한 탈아미드화 부위, 특히 Asn-Gly을 포함하는 한, 전형적으로 관련 잔기들 중 하나를 제거하기 위한 보존적인 치환에 의해 이 영역을 제거하는 것이 바람직할 수 있다.
항체 서열을 인간화하는 다수의 방법들이 당해 기술 분야에 알려져 있다. 가장 일반적으로 사용되는 방법들 중 한가지는 CDR 그래프팅 (CDR grafting)이다. CDR 그래프팅은 Kabat에 의한 CDR 정의를 기초로 할 수 있지만, 최종 편집판 (Magdelaine-Beuzelin et al, Crit Rev. Oncol Hematol. 64:210-225 (2007))에서는 IMGT® (the international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org) 정의가 인간화 결과를 개선할 수 있는 것으로 시사되어 있다 (Lefranc et al, Dev. Comp Immunol. 27:55-77 (2003)). 일부 경우에, CDR 그래프팅은 CDR이 입수된 부모 항체 CDR 영역과 비교해 결합 특이성과 친화성을 낮출 수 있으며, 따라서, CDR 그래프팅된 비-인간 항체의 생물학적 활성을 낮출 수 있다. 역 돌연변이 (때때로, "프래임워크 영역 수리 (framework region reparation)"라고도 함)를, CDR 그래프팅된 항체의 선택 위치에, 통상적으로 프래임워크 영역에 도입하여, 모 항체의 결합 친화성과 특이성을 회복시킬 수 있다. 잠재적인 역 돌연변이를 위한 위치 결정은 문헌 및 항체 데이터베이스에서 이용가능한 정보를 이용해 수행할 수 있다. 역 돌연변이하기 위한 후보 잔기 아미노산 잔기는 일반적으로 항체 분자의 표면 상에 위치하는데 반해, 표면 노출 정도가 낮거나 또는 묻히는 잔기는 일반적으로 변형하지 않을 것이다. CDR 그래프팅 및 역 돌연변이에 대한 대안적인 인간화 방법은, 비-인간 기원의 비-노출 잔기들은 유지하면서 표면 잔기는 인간 잔기로 바꾸는, 재표면화 (resurfacing)이다.
완전 인간 항체는 2가지 기법을 이용해 제조할 수 있다: 시험관내 구축된 파지 라이브러리 (in vitro collected phage libraries)를 이용한 기법, 또는 인간화된 동물 (마우스, 랫 등)의 생체내 면역화 기법.
파지 항체 조합 라이브러리의 구축은, 구분할 수 있는 수종의 항체 라이브러리 타입들: 나이브, 면역 및 합성에 따라, 유전자 레퍼토리의 소스 선택으로 시작한다. 나이브 라이브러리 및 면역 라이브러리는, 건강한 공여자 또는 특정 항원으로 면역화된 공여자 각각의 가변성 면역글로불린 도메인을 코딩하는, 천연 인지 유전자를 이용해 구축한다. 이러한 목적으로 항체-생산 림프구성 세포주로부터 mRNA를 단리한다. 말초혈 림프구가 주로 사용되지만, 일부 경우에 비장세포 [Sheets MD, Amersdorfer P, Finnern R, Sargent P, Lindquist E, Schier R, et al. Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: the production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens. Proc Natl Acad Sci U S A 1998,95:6157-6162 and de Haard HJ, van Neer N, Reurs A, Hufton SE, Roovers RC, Henderikx P, et al. A large non-immunized human Fab fragment phage library that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodies. J Biol Chem 1999,274:18218-18230], 편도세포 및 골수 림프구 [Vaughan TJ, Williams AJ, Pritchard K, Osbourn JK, Pope AR, Earnshaw JC, et al. Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library. Nat Biotechnol 1996,14:309-314.]도 물론 사용된 바 있다. 이후, mRNA를 기초로 cDNA를 합성하고, 올리고-dT 프라이머 및 통계학적으로 고안된 헥사뉴클레오티드를 사용해, 항체의 가변성 도메인을 코딩하는 가능한 모든 유전자 변이체의 cDNA 카피를 제작할 수 있다 [Ulitin AB, Kapralova MV, Laman AG, Shepelyakovskaya AO, Bulgakova EB, Fursova KK, et al. The library of human miniantibodies in the phage display format: Designing and testing DAN: Izd-vo "Nauka"; 2005].
cDNA 수준에서 하나 또는 수개의 가변성 도메인 유전자 패밀리 또는 항체 이소형에 대한 증폭된 유전자의 범위를 제한하기 위해 하나 또는 수개의 프라이머를 동시에 사용할 수 있다 [Marks JD, Hoogenboom HR, Bonnert TP, McCafferty J, Griffiths AD, Winter G. Bypassing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol 1991,222:581-597]. 면역글로불린을 코딩하는 유전자를 증폭하기 위해 사용되는 프라이머는 가장 보존적인 영역에 상보적이다. 이의 서열은 Kabat 또는 V BASE 데이터베이스와 같은 데이터베이스를 구성하는 유전자 콜렉션으로부터 선택한다. 또한, 프라이머 설계는 PCR-산물을 적절한 벡터에 클로닝하기 위한 내부 제한효소 부위를 제공한다.
합성 라이브러리 구축은 천연 CDR을 랜덤 서열 세트로 치환하는 것을 토대로 한다. 이 경우, 매우 다양한 항원-결합부를 제작할 수 있다.
파지 디스플레이는 가장 강력하고 널리 사용되는 시험관내 항체 검색 기법이다. 1985년에, 스미스는 외래 DNA 서열을 필라멘트형의 박테리오파지 M13에 클로닝하고, 클로닝한 서열을 융합 단백질로서 파지 입자의 표면에 발현시킬 수 있음을 알게 되었다 (Smith GP: Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 1985, 228:1315-1317). 따라서, 다른 단백질에 결합하는 능력을 토대로 대상 융합 단백질을 선별할 수 있다. 이러한 발견은 PCR 증폭 기법과 조합되었으며, 면역글로불린 유전자의 cDNA 레파토리를 클로닝하여, 타겟-특이적인 단일클론 항체를 신속하게 검색하기 위해 사용될 수 있는, 가변성 도메인을 포함하는 다양한 파지 라이브러리들을 구축할 수 있게 되었다. 파지 라이브러리 레파토리는, 라이브러리 구축에 사용된 혈액을 가진 임의 인간 또는 동물의 B-세포 항체의 레파토리를 반영한다. 1995년에, 2개의 논문에서 하이브리도마 기법에 의해 수득되는 것과 상응하는 레파토리로 완전 인간 항체를 발현할 수 있는 유전자 조작된 마우스의 구축을 발표하였다 (Lonberg N, Taylor LD, Harding FA, Trounstine M, Higgins KM, Schramm SR, Kuo CC, Mashayekh R, Wymore K, McCabe JG et al.: Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 1994, 368:856-859). 이들 동물에서, 자신의 내인성 면역글로불린 중쇄 및 κ 경쇄 유전자는 의도적으로 파괴한 다음, 인간 중쇄 및 κ 경쇄 유전자의 세그먼트인 전이유전자를 도입하였다. 인간 유전자 레파토리를 마우스 면역계에 사용하여, 매우 다양한 항원들에 대해 고 특이성 및 고 친화성의 항체가 생산되는 것으로 밝혀졌다. 형질전환 마우스는 기본적으로 마우스 및 인간 성분의 하이브리드 (인간 면역글로불린, 마우스 Igα, Igβ 및 기타 신호전달 분자들)인 B-세포 수용체를 발현함에도 불구하고, 이의 B-세포는 정상적으로 발생 및 성숙한다.
일부 경우에, 표적 에피토프에 대한 결합 친화성을 개선하기 위해 하나 이상의 CDR 아미노산 잔기를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 "친화성 성숙화"로 알려져 있으며, 선택적으로, 예를 들어 항체의 인간화로 결합 특이성 또는 친화성을 저하되고 역 돌연변이 단독으로 결합 특이성 또는 친화성을 충분히 개선할 수 없는 경우에 인간화와 함께 수행할 수 있다. 다양한 친화성 성숙화 방법들이 당해 기술 분야, 예를 들어 Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997)에 기술된 시험관내 포화 돌연변이 유발 방법 및 Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042 (1998)에 기술된 단계별 시험관내 친화성 성숙화 방법으로 알려져 있다.
용어 "단일클론 항체" 또는 "mAb"는 세포의 분리된 클론 집단에 의해 합성 및 단리된 항체를 지칭한다. 클론 집단은 불멸화 세포의 클론 집단일 수 있다. 일부 구현예에서, 클론 집단에서 불멸화 세포는 전형적으로 면역화된 동물 유래 개별 B 림프구를 림프성 종양 유래의 개별 세포와 융합하여 제조되는 하이브리드 세포, 즉 하이브리도마이다. 하이브리도마는 구축된 세포의 한가지 유형이며, 자연계에 존재하진 않는다.
"천연 항체"는 통상적으로 동일한 2개의 경(L) 쇄와 동일한 2개의 중(H) 쇄로 구성된 약 150,000 달톤 분자량의 헤테로테트라머 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 이황화 공유 결합에 의해 중쇄와 연결되고, 이황화 결합의 개수는 여러가지 면역글로불린 이소형의 중쇄들에서 다양하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 일정하게 이격된 체인내 이황화 결합을 가지고 있다. 각 중쇄는 한쪽 말단에 가변성 도메인 (VH)을 가지고 있으며, 그 뒤에 복수의 불변 도메인이 존재한다. 각 경쇄는 한쪽 말단에 가변성 도메인 (VL)을, 다른 말단에는 불변 도메인을 가지고 있다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변성 도메인은 중쇄의 가변성 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 가변성 도메인과 중쇄 가변성 도메인 사이에 계면(interface)을 형성하는 것으로 보인다.
본 설명에서 다양한 항체를 기술하기 위해 사용되는 용어 "단리된" ("isolated")은 항체가 발현되는 세포 또는 세포 배양물로부터 동정 및 분리 및/또는 재생된 항체를 지칭한다. 천연 환경으로부터의 불순물 (오염 물질)은 폴리펩타이드의 진단 또는 치료학적 용도를 방해하는 물질이며, 이는 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체는, (1) 스피닝 컵 서열 분석 장치 (spinning cup sequenator) (Edman sequenator)의 사용시 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (2) 코마시 브릴리언트 블루 또는 바람직하게는 은 염료를 이용한 환원성 또는 비-환원성 조건 하 SDS-PAGE에서의 동질성을 나타내는 수준으로 정제된다. 단리된 항체는, 폴리펩타이드의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않으므로, 재조합 세포 내부의 인 시추 항체를 포함한다. 전형적으로, 단리된 폴리펩타이드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조된다.
"단리된" 핵산 분자는 항체 핵산의 천연 소스에서 일반적으로 결합되어 있는 하나 이상의 핵산 분자-불순물로부터 동정 및 분리된 것이다. 단리된 핵산 분자는, 천연 환경에서 발견되는 형태 또는 세트와 구별된다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 환경에서 세포내 존재하는 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는, 예를 들어, 핵산 분자가 천연 환경에서 세포내 위치화가 아닌 염색체 위치에 존재하는 경우에, 항체가 정상적으로 발현되는 세포내 위치된 핵산 분자를 포함한다.
본원에서, 용어 "에피토프"는 결합 분자 (예, 이중 특이성 결합 분자와 같은, 항체 또는 관련 분자)에 특이적으로 결합하는 항원의 영역 (결정부)을 지칭하는 것으로 의도된다. 에피토프 결정부는 통상적으로 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹핑들로 이루어지며, 전형적으로 특이적인 3차원 구조 특징뿐 아니라 특이적인 전하 특징을 가진다. 에피토프는 "선형" 또는 "입체 구조 (conformational)"일 수 있다. 선형 에피토프의 경우, 단백질 (예, 항원)과 상호작용 분자 (예, 항체) 간의 상호작용 지점들 모두 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형적으로 이루어진다. 입체 에피토프의 경우, 상호작용 지점들은 1차 아미노산 서열에서 서로 이격되어 있는 단백질의 아미노산 잔기들을 가로질러 형성된다. 바람직한 항원 에피토프가 동정되면, 이 에피토프에 대한 항체를 당해 기술 분야에 널리 공지된 기법으로 제작할 수 있다. 또한, 항체 또는 기타 결합 분자의 구축 및 특정화로 바람직한 에피토프에 대한 정보를 해명할 수 있다. 이러한 정보를 기반으로, 예를 들어, 항원 결합에 대해 경쟁하는 결합 분자를 탐색하기 위한 경쟁적인 실험들을 수행함으로써, 같은 또는 상동적인 (identical) 에피토프에 결합하는 결합 분자를 경쟁적으로 스크리닝할 수 있다.
본원에서, 용어 "펩타이드 링커"는 도메인들을 조합할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 서로 결합하는 도메인에 따라 소정의 길이를 가지며, 임의의 아미노산 서열을 포함하는, 임의의 펩타이드를 의미하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 펩타이드 링커는 5개 이상의 아미노산 길이를 가지며, G, A, S, P, E, T, D, K로부터 선택되는 임의의 아미노산 세트로 구성된다.
용어 "시험관내"는 인공적인 조건에서 신체 외부에서의 생물학적 대상, 생물학적 공정 또는 생물학적 반응을 지칭한다. 예를 들어, 시험관내 배양된 세포는 신체 외부 환경, 예를 들어 시험관, 배양 바이얼 또는 마이크로타이터 플레이트에서 배양되는 세포로서 이해된다.
본원에서, 용어 "IC50" (50% 저해 농도)은 측정가능한 활성 또는 반응, 예를 들어 종양 세포와 같은 세포의 성장/증식을 50%까지 저해하는 약물의 농도를 의미한다. IC50은 곡선 피팅을 위한 특수 통계 소프트웨어를 사용해 적절한 농도-반응 곡선으로 계산할 수 있다.
용어 GI50 (50% 성장 저해)은 종양 세포와 같은 세포의 증식을 50%까지 저해하는 약물의 농도를 의미한다.
용어 "ED50" (EC50) (50% 유효 용량/농도)은 50%의 (세포독성을 포함할 수 있는) 생물학적 효과를 발휘하는 약물의 농도를 지칭한다.
용어 "항-증식 활성"은 암 세포와 같은 세포의 성장 중단 또는 저해를 의미하는 것으로 의도된다.
용어 항체 "작동자 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 Fc-영역 서열 또는 Fc-영역 아미노산 변이체)으로부터 기인한 생물학적 활성을 지칭하며, 이는 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 작동자 기능의 예로는 Clq 결합 및 보체 의존적인 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존적인 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예, B 세포 수용체, BCR)의 하향 조절, 및 B 세포 활성화 등이 있다.
"항체-의존적인 세포성 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비-특이적인 세포독성 세포 (예, 자연 살상 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인지한 후 표적 세포의 세포용해 또는 식세포작용을 유발하는, 세포-매개 반응을 의미한다. ADCC를 매개하는 일차 세포, 즉 NK 세포는 FcγRIII만 발현하지만, 단구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포의 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)의 464쪽 표 3에 요약 기술되어 있다. 대상 분자의 ADCC 활성을 분석하기 위해, 미국 특허 5,500,362 또는 5,821,337에 기술된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석에 사용가능한 작동자 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살상 (NK) 세포이다. 다른 예로 또는 부가적으로, 대상 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998)에 기술된 바와 같이 동물 모델에서 분석할 수 있다.
"인간 작동자 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하며 작동자 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 이 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하며, ADCC 작동자 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 자연 살상 (NK) 세포, 단구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 있으며; PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 작동자 세포는 이의 천연 소스로부터, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 혈액 또는 PBMC로부터 단리할 수 있다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 나타내기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 천연 인간 FcR 서열이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체에 결합하는 것 (수용체 γ)이며, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스를 포함하며, 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 얼터너티브 슬라이싱된 형태 (alternatively spliced form) 등을 포함한다. FcγRII 수용체는, 주로 세포질 도메인에 차이가 있는 비슷한 아미노산 서열을 가진, FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("저해 수용체")를 포함한다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프 (ITAM, immunoreceptor tyrosine-based activation motif)를 포함한다. 저해 수용체 FcγRIIB는 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반의 저해 모티프 (ITIM)를 포함한다 (Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). FcR에 대한 리뷰는 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)에 제공된다. 향후 동정되는 FcR 등의, 기타 FcR도 본원에서 용어 "FcR" 범위에 포함된다. 이 용어는 또한 모계 IgG를 태아에 전달하는 역할을 하는 신생아 (neonatal) 수용체 FcRn을 포함한다.
"보체-의존적인 세포독성" 및 "CDC"는 분자가 보체의 존재시 표적을 세포용해시킬 수 있는 능력을 의미한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템 (C1q)의 제1 성분이 동족 항원과 복합체를 형성한 분자 (예, 항체)에 결합함으로써, 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)에 기술된 바와 같이, CDC 분석을 수행할 수 있다.
용어 "동일성" 또는 "상동성"은, 서열들을 비교하고, 필요에 따라 전체 서열에 대해 최대 동일성%를 달성하기 위해 갭을 도입하고, 임의의 보존적인 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않은 후, 후보 서열의 아미노산 잔기가 이와 비교되는 대응되는 서열의 잔기와 동일한 %를 의미하는 것으로 해석된다. N-말단 또는 C-말단 연장도 삽입도 동일성 또는 상동성을 감소시키는 것으로 해석되진 않을 것이다. 정렬 방법 및 컴퓨터 프로그램들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 서열 동일성은 서열 분석 소프트웨어를 사용해 측정할 수 있다 (예, Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave., Madison, WI 53705). 이 소프트웨어는 다양한 치환, 결손 (소거) 및 기타 변형에 대한 상동성 정도를 지정함으로써 유사한 서열들을 매칭시킨다.
항체의 폴리펩타이드 서열과 관련하여 용어 "상동성"은 항체가 폴리펩타이드 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 더 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95%의 서열 동일성을 나타내는 것으로 해석되어야 한다. 이 용어는, 핵산 서열과 관련하여, 뉴클레오티드 서열이 핵산 서열에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 97%의 서열 동일성을 나타내는 것으로 해석되어야 한다.
본원에 기술된 항체의 아미노산 서열에 변형(들)이 제공된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 항체 핵산에 도입함으로써 또는 펩타이드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형으로는, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결손, 및/또는 삽입, 및/또는 치환 등이 있다. 최종 구조체가 바람직한 특징을 가지는 한, 최종 구조체에 도달하기 위한 결손, 삽입 및 치환의 임의 조합이 행해진다. 또한, 아미노산 변형은 당화 부위의 개수 또는 위치의 변동 등의, 항체에서 번역 후 프로세스를 변경시킬 수 있다.
아미노산 치환을 이용한 항체의 아미노산 서열의 변형 변이체. 이러한 변이체는 항체 분자의 하나 이상의 아미노산 잔기를 다른 잔기로 치환한 것이다. 치환 돌연변이를 유발하기 위한 가장 주목할만한 부위로는 과가변부 또는 CDR 등이 있지만, FR 또는 Fc 변형 역시 고려된다. 보존적인 치환은 표 1의 "바람직한 치환"에 나타낸다. 이러한 치환으로 생물학적 활성에 변화가 생긴다면, 표 A에서 "치환 예"로 또는 아미노산의 클래스를 기술하는 경우에 더 상세하게 후술된 변이로 언급되는 추가적인 실질적인 변화가 만들어질 수 있으며, 또한 산물 스크리닝을 수행할 수 있다.
표 A
원 잔기 치환 예 바람직한 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg(R) Lys; Gin; Asn Lys
Asn (N) Gin; His; Asp, Lys; Arg Gin
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln(Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gin Asp
Gly(G) Ala Ala
His (H) Asn; Gin; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르루신 Leu
Leu (L) 노르루신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gin; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe(F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp(W) Tyr; Phe Tyr
Tyr(Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르루신 Leu
용어 "핵산", "뉴클레익 서열 (nucleic sequence)", "핵산 서열", "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"은 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, 핵산의 단편 또는 영역을 결정하고, 비-천연 뉴클레오티드를 함유하거나 또는 비-함유하며, 이중 가닥 DNA 또는 RNA 또는 단일 가닥 DNA 또는 RNA 또는 이들 DNA의 전사 산물인, 변형된 또는 비-변형된 정확한 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본 발명은 천연 염색체 환경, 즉 천연 상태의 뉴클레오티드 서열과 무관한 것으로 본원에 포함되어야 한다. 본 발명의 서열은 단리 및/또는 정제된 것이며, 즉, 예를 들어, 복사 (copy)에 의해 직접 또는 간접적으로 수집된 것이며, 이의 환경은 적어도 부분적으로 변형된다. 이에, 예를 들어, 숙주 세포의 재조합 유전학에 의해 수득되거나 또는 화학 합성에 의해 수득된 단리된 핵산 역시 본 발명에 언급되어야 한다.
뉴클레오티드 서열은 달리 언급되지 않은 한 이의 상보체를 포괄한다. 즉, 특정 서열을 가진 핵산은 이의 상보적인 서열을 가진 이의 상보적인 가닥을 포괄하는 것으로서 이해되어야 한다.
"조절 서열"이라는 표현은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현시키는데 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 원핵생물에 적합한 조절 서열로는, 예를 들어, 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합부 등이 있다. 진핵생물 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은, 다른 핵산 서열과 기능적인 관계로 배치되었을 때, "작동가능하게 연결"된 것이다. 예를 들어, 프리-서열 (pre-sequence) 또는 분비형 리더 서열의 DNA는, 폴리펩타이드 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현된다면, 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결된 것이고; 프로모터 또는 인핸서가 서열 전사에 영향을 미친다면 이는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이고; 또는 리보솜 결합부가 번역을 용이하도록 배치된다면 이는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은, 연결된 DNA 서열들이 인접해 있으며, 분비형 리더의 경우에는 인접해 있으며 리딩 페이스 (in reading phase)인 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하게 위치되어야 하는 것은 아니다.
본원에서, 용어 "벡터"는 이에 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 일부 구현예에서, 벡터는 플라스미드이며, 즉 부가적인 DNA 세그먼트가 라이게이션될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 조각이다. 일부 구현예에서, 벡터는 부가적인 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 이것이 도입된 숙주 세포에서 자율적인 복제 (autonomous replication)를 수행할 수 있다 (예, 박테리아의 복제 오리진을 가진 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 추가적인 구현예들에서, 벡터 (예, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포에 도입시 숙주 세포 게놈에 병합될 수 있으며, 그래서 숙주 유전자와 함께 복제된다. 또한, 일부 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 단순히 "발현 벡터")로서 언급된다.
본원에서, 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단하게 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 본 발명은 전술한 본 발명에 따른 벡터를 포함할 수 있는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 예를 들어, 본 발명의 결합 분자의 제1 결합 도메인 및/또는 제2 결합 도메인의, 중쇄 또는 이의 항원-결합 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 경쇄-코딩 뉴클레오티드 서열 또는 이의 항원-결합 영역, 또는 이 둘다를 포함하는, 숙주 세포에 관한 것이다. "재조합 숙주 세포" 및 "숙주 세포"는 특정 대상 세포뿐 아니라 물론 이 세포의 자손을 지칭하는 것으로 의도된다. 변형이 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 연속 세대들에서 발생할 수 있으므로, 이들 자손은 실제 모 세포와 동일하지 않을 순 있지만, 이들 세포는 여전히 본 발명의 "숙주 세포"라는 용어의 범위에 포함된다.
본원에서, 용어 "부형제"는 본 발명의 화합물(들) 이외의 다른 임의의 성분을 표시하기 위해 사용된다.
용어 "GITR에 의해 매개되는 질환 또는 장애"는 질환 또는 장애의 병인, 발병, 진행, 지속 또는 병리를 포함하여, GITR과 직접 또는 간접적으로 연관된, 모든 질환 또는 장애를 의미한다.
"치료한다", "치료하는" 및 "치료"는 생물학적 장애 및/또는 하나 이상의 이와 관련된 증상을 완화 또는 제거하는 방법을 의미한다. 본원에서, 질환, 장애 또는 병태를 "완화한다"는 것은 질환, 장애 또는 병태의 증상의 중증도 및/또는 발병 빈도의 감소를 의미한다. 또한, 본원에서 "치료"는 것은 근치적 (curative), 고식적 (palliative) 및 예방적 치료를 포괄한다.
일 측면에서, 치료 대상 또는 환자는 포유류이며, 바람직하게는 인간 개체이다. 개체는 임의 연령의 남성 또는 여성일 수 있다.
용어 "장애"는 본 발명의 화합물을 이용한 치료가 유익한 임의 병태를 의미한다. 이 용어에 대한 정의는 포유류가 대상 장애에 취약하게 만드는 병리학적 병태를 비롯해, 만성 및 급성 장애 또는 질환을 의미한다.
용어 "암" 및 "암성"은, 전형적으로 세포의 규제되지 않은 성장/증식을 특징으로 하는, 포유류에서 생리학적 병태를 나타내거나 또는 병리학적 병태를 기술한다. 이 정의는 양성 및 악성 암성 질환을 망라한다. 암성 질환에 대한 예로는, 비-제한적으로, 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 등이 있다. 이러한 암성 질환에 대한 보다 구체적인 예로는 편평세포암, 소-세포 폐암, 비-소 세포성 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 상피암 (squamous carcinoma), 복막암, 간세포성 암, 위장암 등의 위암, 췌장암, 교모세포종, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 대장암, 결장직장암, 자궁내막암 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 흑색종 및 다양한 두경부암 등이 있다.
용어 "면역 반응", "자가면역 반응" 및 "자가면역 염증"은, 예를 들어, 림프구, 항원-제시 세포, 식세포, 과립구 및 이들 세포 또는 간 세포에 의해 생산되는 용해성 거대분자 (침습적인 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우에는 인간 신체로부터 유래된 정상 세포 또는 조직의 선택적인 손상, 파괴 또는 소거의 결과로서 만들어지는 항체, 사이토카인 및 보체)의 작용을 의미한다.
"치료학적 유효량"은 치료 중인 장애의 한가지 이상의 증상을 어느 정도 경감시키는 투여 중인 치료학적 물질의 양을 지칭하는 것으로 의도된다.
용어 "만성적인 (chronic)" 투여는, 장기간 동안 초기 치료학적 효과 (활성)를 유지하기 위해, 급성 (일시적) 투여 방식과 반대되는, 물질(들)의 연속적인 (지속적인) 사용을 의미한다.
"간헐적" 투여는 중단없이 계속적으로 수행되는 것이 아니라 사실상 주기적인 치료를 의미한다.
본원에서, 용어 "들을 포함한다", "들을 가진다, "들을 함유한다" 또는 "을 포함한다", "포함하는", "을 가진다", "가지는", "을 함유한다" 또는 "포함하여"와 같은 변형어, 그리고 이의 모든 문법상 변형어들은, 언급된 정수 (integer) 또는 정수군을 포함하는 의미로 이해될 뿐만 아니라, 임의의 다른 정수 또는 정수군을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.
본 발명에 대한 상세한 설명
항체
본 발명은 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다:
(a) 하기를 포함하는 중쇄 가변성 도메인:
(i) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1:
NYGMH (서열번호 1) 또는 YYWMY (서열번호 12);
(ii) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2:
VIWFDGSNKFYTDSVKG (서열번호 2) 또는 AISWNGGRTYYAESMKG (서열번호 13);
(iii) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3:
ELGGYYYDSSGFRPYYYGMDV (서열번호 3) 또는 NRYYSDPNYGMNL (서열번호 14), 및
(b) 하기를 포함하는 경쇄 가변성 도메인:
(i) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1:
RASQSIGSWLA (서열번호 7) 또는 TGTSTDIGTYKYIS (서열번호 17);
(ii) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2:
AASTLQR (서열번호 8) 또는 GVSHRPS (서열번호 18);
(iii) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3:
QQSHSHPLT (서열번호 9) 또는 SSYTSSGTVV (서열번호 19).
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 1, 2 및 3의 서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 12, 13 및 14의 서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 7, 8 및 9의 서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 17, 18 및 19의 서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
- 서열번호 1, 2 및 3의 서열에 의해 각각 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변성 도메인;
- 서열번호 7, 8 및 9의 서열에 의해 각각 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
- 서열번호 12, 13 및 14의 서열에 의해 각각 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변성 도메인;
- 서열번호 17, 18 및 19의 서열에 의해 각각 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함한다: EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDS VKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSS (서열번호 4).
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함한다: EVQLVQSGGGVVQPGKSLRL SCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSS (서열번호 4).
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함한다: QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTYYAE SMKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSS(서열번호 15)
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함한다: QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTYYAESMKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSS (서열번호 15).
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다: DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSG GGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIK (서열번호 10).
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다: DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQ SIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSGGGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIK (서열번호 10).
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다: QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLIIYGVSHRPSGVSDRF SGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTVVFGGGTKVTVL (서열번호 20).
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다: QSALTQPASVSGSPGQSITISC TGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLIIYGVSHRPSGVSDRFSGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTVVFGGGTKVTVL (서열번호 20).
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
- 다음의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인: EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWF DGSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSS (서열번호 4);
- 다음의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인: DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQR GVPSRFSGGGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIK (서열번호 10).
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
- 아미노산 서열 EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFD GSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSS(서열번호 4)을 포함하는 중쇄 가변성 도메인;
- 아미노산 서열 DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQ RGVPSRFSGGGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIK (서열번호 10)을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
- 하기 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인: QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNG GRTYYAE SMKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSS (서열번호 15);
- 하기 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인: QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLIIYGVSH RPSGVSDRFSGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTVVFGGGTKVTVL (서열번호 20).
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
- 하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인: QVQLVQSGGGLVQPGGS LRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTYYAESMKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSS (서열번호 15);
- 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인: QSALTQPASVSGSPGQSIT ISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLIIYGVSHRPSGVSDRFSGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTVVFGGGTKVTVL (서열번호 20).
일부 구현예에서, GITR-특이적인 단일클론 항체는 전장 IgG 항체이다.
일부 구현예에서, 단일클론 IgG 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형의 형태이다.
일부 구현예에서, 단일클론 IgG 항체는 인간 IgG1 이소형의 형태이다.
일부 구현예에서, GITR-특이적인 단일클론 항체는 작용제 특성, 보체-의존적인 세포독성 (CDC)이 아닌 항체-의존적인 세포성 세포독성 (ADCC)을 증가시키기 위해 Fc 단편에 E345R 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다: EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHW VRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 5).
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다: EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 5).
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다: EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVR QAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRRPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 6).
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다: EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSVKG RFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRRPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 6).
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다: DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQK PGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSGGGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 11).
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다: DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFS GGGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 11).
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기를 포함한다:
- 하기 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 5);
- 하기 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSGGGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 11).
일부 구현예에서, GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 BCD166-01-001이다.
단일클론 항체 BCD166-01-001은 하기 중쇄와 경쇄를 포함한다:
- 하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 5);
- 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSGGGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 11).
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기 중쇄 및 경쇄를 포함한다:
- 하기 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRRPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 6);
- 하기 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSGGGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 11).
일부 구현예에서, GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 BCD166-02-001이다.
BCD166-02-001과 BCD166-01-001 간의 차이는 작용제 특성, 보체-의존적인 세포독성 (CDC)이 아닌 항체-의존적인 세포성 세포독성 (ADCC)을 높이기 위해 Fc 단편에 존재하는 E345R 돌연변이이다.
단일클론 항체 BCD166-02-001은 하기 중쇄와 경쇄를 포함한다:
- 하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRRPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 6);
- 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSGGGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 11).
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다: QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTYYAESMKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 16).
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다: QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTYYAESMKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 16).
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다: QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLIIYGVSHRPSGVSDRFSGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTVVFGGGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (서열번호 21).
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다: QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLIIYGVSHRPSGVSDRFSGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTVVFGGGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (서열번호 21).
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기 중쇄와 경쇄를 포함한다:
- 하기 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTYYAESMKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 16).
- 하기 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLIIYGVSHRPSGVSDRFSGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTVVFGGGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (서열번호 21).
일부 구현예에서, GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 BCD166-01-014이다.
단일클론 항체 BCD166-01-014는 하기 중쇄와 경쇄를 포함한다:
- 하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTYYAESMKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 16).
- 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLIIYGVSHRPSGVSDRFSGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTVVFGGGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (서열번호 21).
핵산 분자
또한, 본 발명은, 선택적으로 서로 연결하는 임의의 펩타이드 링커 서열을 포함하는, 핵산 분자, 특히 본원에 기술된 바와 같이 본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 코딩하는 서열에 관한 것이다.
뉴클레오티드 서열은 달리 언급되지 않은 한 이의 상보체를 포괄한다. 따라서, 특이적인 서열을 가진 핵산은 이의 상보적인 서열을 가진 이의 상보적인 가닥을 포괄하는 것으로서 이해하여야 한다. 본원에서, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 염기 10개 이상의 길이의 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 임의 타입의 뉴클레오티드의 변형된 형태로 된 폴리머 형태를 의미한다. 이 용어는 이중 가닥 형태 및 단일 가닥 형태를 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 서열번호 1-21로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, 핵산 분자는 상기한 뉴클레오티드 서열들의 임의 조합을 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은, GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하며 하기를 포함하는, 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다:
(a) 하기를 포함하는 중쇄 가변성 도메인:
(i) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1:
NYGMH (서열번호 1) 또는 YYWMY (서열번호 12);
(ii) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2:
VIWFDGSNKFYTDSVKG (서열번호 2) 또는 AISWNGGRTYYAESMKG (서열번호 13);
(iii) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3:
ELGGYYYDSSGFRPYYYGMDV (서열번호 3) 또는 NRYYSDPNYGMNL (서열번호 14), 및
(b) 하기를 포함하는 경쇄 가변성 도메인:
(i) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1:
RASQSIGSWLA (서열번호 7) 또는 TGTSTDIGTYKYIS (서열번호 17);
(ii) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2:
AASTLQR (서열번호 8) 또는 GVSHRPS (서열번호 18);
(iii) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3:
QQSHSHPLT (서열번호 9) 또는 SSYTSSGTVV (서열번호 19).
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 1, 2 및 3의 서열 각각에 의해 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3를 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 12, 13 및 14의 서열 각각에 의해 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3를 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 7, 8 및 9의 서열 각각에 의해 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3를 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 17, 18 및 19의 서열 각각에 의해 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3를 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
- 서열번호 1, 2 및 3의 서열에 의해 각각 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변성 도메인;
- 서열번호 7, 8 및 9의 서열에 의해 각각 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
- 서열번호 12, 13 및 14의 서열에 의해 각각 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변성 도메인;
- 서열번호 17, 18 및 19의 서열에 의해 각각 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 4의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 10의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 20의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
- 서열번호 4의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인;
- 서열번호 10의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
- 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인;
- 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
- 서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인;
- 서열번호 20의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
- 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인;
- 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 전장 IgG 항체로서 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형 형태인 단일클론 IgG 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 인간 IgG1 이소형 형태인 단일클론 IgG 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 작용자 특성, 보체-의존적인 세포독성 (CDC)이 아닌 항체-의존적인 세포성 세포독성 (ADCC)을 높이기 위해 Fc 단편에 E345R 돌연변이를 포함하는, GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 5의 서열과 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 단일클론 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 단일클론 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 6의 서열과 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 단일클론 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 단일클론 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 11의 서열과 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단일클론 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단일클론 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함하는 단일클론 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
- 서열번호 5의 서열과 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
- 서열번호 11의 서열과 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함하는 단일클론 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
- 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
- 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함하는 단일클론 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
- 서열번호 6의 서열과 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
- 서열번호 11의 서열과 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함하는 단일클론 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
- 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
- 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 16의 서열과 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 단일클론 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 단일클론 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 21의 서열과 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단일클론 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단일클론 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함하는 단일클론 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
- 서열번호 16의 서열과 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
- 서열번호 21의 서열과 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함하는 단일클론 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
- 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
- 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 구현예에서, 핵산은 DNA이다.
상기한 임의의 구현예에서, 핵산 분자는 단리될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 임의의 원료로부터 단리할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 단리되기 보다는 합성할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, VH (서열번호 4 또는 서열번호 15) 또는 VL (서열번호 10 또는 서열번호 20)를 코딩하는 핵산 분자는, VH 세그먼트가 벡터 내 CH 세그먼트(들)에 작동가능하게 연결되거나, 및/또는 VL이 벡터내 CL에 작동가능하게 연결되도록, 중쇄 불변 (CH) 또는 경쇄 불변 (CL) 도메인을 각각 이미 코딩하고 있는 발현 벡터에 삽입함으로써, 전체 길이를 따라 항체 유전자들로 변환된다. 본 발명의 다른 구현예에서, VH 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산 분자는, CH 및/또는 CL 도메인을 코딩하는 핵산 분자에 VH 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 표준 분자 생물 기법을 이용해 연결, 예를 들어 라이게이션함으로써, 항체의 전체 길이로 유전자들이 변환된다. 전체 길이의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산 분자는 이후 이것이 도입된 세포에서 발현될 수 있다.
핵산 분자를 이용해 GITR에 특이적으로 결합하는 재조합 단일클론 항체를 대량 발현시킬 수 있다.
벡터
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 뉴클레오티드 서열을 발현시키는데 적합한 벡터에 관한 것이다.
본 발명은, 본원에 기술된 바와 같이, GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 일부의 임의 아미노산 서열 (예, 제1 결합 도메인의 중쇄 서열 및/또는 제2 결합 도메인의 중쇄 및/또는 경쇄 서열)을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 추가적으로 융합 단백질, 변형된 항체, 항체 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는, 유전자들이 전사 조절 서열 및 번역 조절 서열과 같은 필수 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록, 발현 벡터에서, 전술한 바와 같이 수득되는, 제1 또는 제2 결합 도메인의 서열 (예, 결합 도메인이 경쇄 및 중쇄 서열을 포함하는 경우 중쇄 및 경쇄 서열)을 일부 또는 전체 코딩하는 DNA를 삽입함으로써 발현된다. 발현 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스 (AAV), 식물 바이러스, 예를 들어 콜리플라워 모자익 바이러스, 토바코 모자익 바이러스, 코스미드, YAC, EBV 유래 에피좀 등을 포함한다. DNA 분자는 벡터내 전사 및 번역 조절 서열이 DNA의 전사 및 번역을 조절하는 의도한 기능을 제공하도록, 벡터에 라이게이션될 수 있다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용되는 발현 숙주 세포에 적합하도록 선택될 수 있다. 제1 및 제2 결합 도메인의 서열 (예, 결합 도메인이 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 경우 중쇄 및 경쇄 서열)을 일부 또는 전체 코딩하는 DNA 서열이 각 벡터에 도입될 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 DNA 분자들의 임의 조합이 동일한 발현 벡터에 도입된다. DNA 분자는 표준 방법 (예, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적인 제한효소 부위의 라이게이션, 또는 제한효소 부위가 존재하지 않는다면 블런트 엔드 라이게이션)에 의해 발현 벡터에 도입될 수 있다.
적절한 벡터는, 임의의 VH 또는 VL 서열이 전술한 바와 같이 용이하게 삽입 및 발현될 수 있도록 적절한 제한효소 부위 조작을 가진, 기능적으로 완전한 (complete) 인간 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 코딩하는 것이다. 이러한 벡터에서 HC- 및 LC-코딩 유전자는, 대응되는 mRNA를 안정화함으로써 항체 단백질의 전체 수율을 높이는, 인트론 서열을 함유할 수 있다. 인트론 서열의 측면에는, RNA 스플라이싱이 발생할 위치를 결정하는 스플라이스 도너 부위와 스플라이스 어셉터 부위가 배치된다. 인트론 서열의 위치는 항체 쇄의 가변부 또는 불변부 중 어느 하나이거나, 또는 복수의 인트론이 사용된 경우에는 가변부 및 불변부 양쪽일 수 있다. 폴리아데닐화 및 전사 종결은 코딩 영역의 하류 천연 염색체 부위에서 이루어질 수 있다. 재조합 발현 벡터는 또한 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 용이하게 하는 신호 펩타이드를 코딩한다. 항체 쇄 유전자는, 신호 펩타이드가 면역글로불린 쇄의 아미노 말단에 인-프래임으로 연결되도록, 벡터에 클로닝될 수 있다. 신호 펩타이드는 면역글로불린 신호 펩타이드 또는 이종의 (heterologous) 신호 펩타이드 (즉, 비-면역글로불린 단백질 유래 신호 펩타이드)일 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는, 항체 쇄 유전자 외에도, 숙주 세포에서 항체 쇄 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 운반할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 조절 서열의 선택 등의 발현 벡터의 설계가 형질전환할 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자들에 따라 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 포유류에서 발현 숙주 세포에 대해 바람직한 조절 서열로는, 레트로바이러스 LTR, 사이토메갈로바이러스 (CMV) (예, CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스 40 (SV40) (예, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스 (예, 주요 후기 프로모터 아데노바이러스 (AdMLP)), 폴리오마 바이러스로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서 및 천연 면역글로불린 프로모터 또는 액틴 프로모터와 같은 강한 포유류 프로모터 등의, 포유류 세포에서 단백질의 높은 수준의 발현을 보장하는 바이러스 인자 등이 있다. 바이러스 조절 인자 및 이의 서열에 대한 추가적인 설명은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,168,062, 4,510,245 및 4,968,615를 참조한다. 프로모터 및 벡터뿐 아니라 식물의 형질전환에 대한 설명을 포함하여, 식물에서 항체와 같은 결합 분자를 발현시키는 방법들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 6,517,529를 참조한다. 박테리아 세포 또는 진균 세포, 예를 들어 효모 세포에서 폴리펩타이드를 발현하는 방법들 역시 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는, 항체 쇄 유전자 및 조절 서열 외에도, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 규제하는 서열 (예, 복제 오리진) 및 선별가능한 마커 유전자 등의, 부가적인 서열을 함유할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선별할 수 있도록 해준다 (예, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017). 예를 들어, 전형적으로, 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약제 물질에 대한 내성을 부여한다. 예를 들어, 선별가능한 마커 유전자로는 다이하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭에 dhfr-숙주 세포를 사용하는 경우), neo 유전자 (G418 선별하는 경우), 및 글루타메이트 신테타제 유전자 등이 있다.
본원에서, 용어 "발현 조절 서열"은 이것이 라이게이션된 코딩 서열의 발현 및 프로세싱에 작용하는데 필수적인 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭하는 것으로 의도된다. 발현 조절 서열로는 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호 등의 효율적인 RNA 프로세싱 신호; 세포질 mRNA 안정화 서열; 번역 효율을 강화하는 서열 (즉, Kozak 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 강화하는 서열; 및 적절한 경우, 단백질 분비를 강화하는 서열 등이 있다. 이러한 조절 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 다르며; 원핵생물의 경우, 이러한 조절 서열은 일반적으로 리보솜 결합부의 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하며; 진핵생물의 경우, 이러한 조절 서열은 전형적으로 프로모터 서열 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열"은 발현 및 프로세싱에 필수적인 모든 구성 성분들을 적어도 포함하며, 존재할 경우 유익한 부가적인 구성성분, 예를 들어 리딩 서열 및 융합 파트너 서열을 또한 포함할 수 있다.
숙주 세포
본 발명의 다른 측면은 본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 수득하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예는, GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 발현할 수 있는 재조합 숙주 세포를 수득하고, 이 숙주 세포를 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 발현/생산에 적합한 조건 하에 배양하고, GITR에 특이적으로 결합하는 수득된 단일클론 항체를 단리하는 것을 포함하는, 본원에 정의된 바와 같이, GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 이러한 재조합 숙주 세포에서 이러한 발현에 의해 제조되는 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 본원에서 "GITR에 특이적으로 결합하는 재조합 단일클론 항체"로 언급된다. 본 발명은 또한 이러한 숙주 세포로부터 유래된 세포의 자손, 및 유사하게 제조된 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 코딩하는 핵산 분자 및 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터는 적절한 포유류 또는 이의 세포, 식물 또는 이의 세포, 박테리아 또는 효모 숙주 세포를 형질전환하는데 사용할 수 있다. 형질전환은 숙주 세포에 폴리뉴클레오티드를 도입하는 임의의 공지된 기법일 수 있다. 이종의 폴리뉴클레오티드를 포유류 세포에 도입하는 방법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 덱스트란-매개 형질감염, 양이온성 폴리머-핵산 복합체 형질감염, 칼슘 포스페이트 침강, 폴리브렌-매개 형질감염, 프로토플라스트 융합, 리포좀내 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화 및 DNA의 핵내 직접 미세주입법 등이 있다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유류에 도입될 수 있다. 세포의 형질감염 방법들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 및 4,959,455를 참조한다. 식물 세포의 형질전환 방법도 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 아그로박테리움-매개 형질전환 (Agrobacterium-mediated transformation), 바이올리스틱 형질전환 (biolistic transformation), 직접 주입 (direct injection), 전기천공 (electroporation) 및 바이러스 형질전환 등이 있다. 박테리아 및 효모 세포의 형질전환 방법들 역시 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
형질전환의 숙주로 사용되는 포유류 세포주는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 이용가능한 복수의 불멸화 세포주들을 포함한다. 이러한 것으로는, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 세포, SP2 세포, HEK-293T 세포, FreeStyle 293 세포 (Invitrogen), NIH-3T3 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 아프리카 그린 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포암 세포 (예, Hep G2), A549 세포, 및 복수의 기타 세포주 등이 있다. 발현 수준이 높고 생산되는 단백질의 필요한 특징을 제공하는 세포주를 확인함으로써, 세포주를 선정한다. 사용될 수 있는 기타 세포주는 Sf9 또는 Sf21 세포 등의 곤충 세포주이다. GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포에 도입되는 경우, 숙주 세포에서 항체의 발현 또는 더 바람직하게는 숙주 세포를 배양한 배양 배지로의 항체의 방출을 허용하기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체를 제조한다. GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 표준 단백질 정제 기법을 이용하여 배양 배지로부터 단리할 수 있다. 식물 숙주 세포로는, 예를 들어, 니코티아나 (Nicotiana), 아라비돕시스 (Arabidopsis), 개구리밥 (duckweed), 옥수수, 밀, 감자 등이 있다. 박테리아 숙주 세포로는 E. coli 및 스트렙토마이세스 종 등이 있다. 효모 숙주 세포로는 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 등이 있다.
아울러, 생산 세포주로부터 본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 생산 수준은 다수의 공지된 기법을 이용해 강화할 수 있다. 예를 들어, 글루타민 신테타제 유전자 발현 시스템 (GS 시스템)은 특정 조건에서 발현을 강화하기 위한 일반적인 방법이다. GS 시스템은 EP 0216846, 0256055, 0323997 및 0338841과 연계하여 전체 또는 일부 논의되어 있다.
여러가지 세포주 또는 형질전환 동물의 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체가 서로 다른 당화 프로파일을 가질 것임은 틀림없다. 그러나, 본원에 기술된 핵산 분자에 의해 코딩되거나 또는 본원에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는, 결합 분자의 당화와 무관하게, 일반적으로 번역 후 수정 여부와 무관하게, 본 발명의 일부이다.
항체 제조
본 발명은 또한 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 및 이의 항원 결합 단편를 수득하는 방법 및 공정에 관한 것이다.
단일클론 항체
단일클론 항체는 Kohler, et al. Nature 256,1975, p. 495에 최초로 언급된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조하거나 또는 재조합 DNA 방법 (US 4816567)을 이용해 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법의 경우, 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터를, 면역화에 사용되는 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 유발하기 위해, 전술한 방법에 따라 면역화한다. 다른 구현예에서, 림프구는 시험관내 면역화의 결과로서 수득할 수 있다. 면역화 후, 림프구를 골수종 세포주와 적절한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용해 융합시켜, 하이브리도마 세포를 제조한다.
전술한 방식으로 수득되는 하이브리도마 세포는, 바람직하게는 비-융합된 모 골수종 세포의 증식 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 포함하는, 적절한 배양 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍되어 있다면, 하이브리도마의 배양 배지는 전형적으로 하이토크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지), 즉 HGPRT-결핍 세포의 증식을 저해하는 물질을 함유할 것이다.
골수종 세포 융합의 구성 성분으로서 사용되는, 바람직한 골수종 세포는, 효율적으로 융합하며, 선택된 항체-생산 세포에 의한 안정적인 높은 수준의 항체 생산을 뒷받침하며, 비-융합된 모 세포를 선별하는 배지에 민감한 세포이다. 바람직한 골수종 세포주는 미국 캘리포니아 샌디에고 Salk Institite Cell Disrtibution Center에서 입수할 수 있는 뮤라인 종양 MORS-21 및 MPC-11, 그리고 미국 메릴랜드 록빌 American Type Culture Collection에서 입수할 수 있는 SP-2 또는 X63-Ag8-653 등의 뮤라인 골수종 세포주이다. 단일클론 항체를 제조하기 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주의 사용 역시 개시되어 있다 (Kozbor, J. Immunol, 133, 1984, p. 3001).
바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침강 또는 시험관내 결합 분석에 의해, 예를 들어 방사성면역분석 (RIA) 또는 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 측정한다.
단일클론 항체의 결합 친화성은, 예를 들어, Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)에 기술된 스캐차드 분석 (Scatchard analysis)에 의해 측정할 수 있다.
원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성을 가진 항체를 생산하는 하이브리도마를 동정한 후, 제한 희석 공정을 이용해 클론을 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 배양할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 예를 들어 마우스에 세포의 복막내 (i.p.) 주사에 의해 동물에서 복수 종양으로서 생체내 배양할 수 있다.
서브클론에 의해 방출되는 단일클론 항체는 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 통례적인 항체 정제 기법, 예를 들어 친화성 크로마토그래피 (예, 단백질 A- 또는 단백질 G-세파로스 이용) 또는 이온-교환 크로마토그래피, 하이드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등에 의해 분리할 수 있다.
단일클론 항체를 코딩하는 DNA는 통례적인 공정 (예, 뮤라인 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써)을 이용해 쉽게 단리 및 서열분석한다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 소스로서 사용된다. DNA는, 단리 후, 발현 벡터에 배치할 수 있으며, 이후 E. coli 세포, 시미안 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 형질감염되지 않은 항체 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체의 합성을 달성한다.
본 발명의 추가적인 구현예에서, 단일클론 항체 또는 항체 단편은 McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)에 기술된 기법을 이용해 구축한 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)에는 파지 라이브러리를 이용해 뮤라인 및 인간 항체를 각각 단리하는 방법이 기술되어 있다. 후속 간행물들은 매우 거대한 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 체인 셔플링 (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992))뿐 아니라 조합 감염 및 생체내 재조합 (combinatorial infection and in vivo recombination)에 의한 고 친화성 (nM 범위) 인간 항체의 제조 방법을 개시하였다 (Waterhouse et al., Nucl. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). 즉, 이러한 기법들은 단일클론 항체를 단리하기 위한 전통적인 단일클론 항체 하이브리도마 기법에 대한 실행가능한 대안이다.
항체를 코딩하는 DNA는, 예를 들어, 키메라 또는 융합 항체 폴리펩타이드를 제조하기 위해, 예를 들어, 중쇄 및 경쇄 (CH 및 CL) 불변부의 서열을 상동적인 뮤라인 서열로 치환함으로써 (US 4,816,567 및 Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81: 6851 (1984)), 또는 면역글로불린 코딩 서열을 비-면역글로불린 폴리펩타이드 (이종의 폴리펩타이드)의 코딩 서열 전체 또는 일부에 공유적으로 융합으로써, 변형할 수 있다. 비-면역글로불린 폴리펩타이드 서열로 항체의 불변부를 치환하거나, 또는 항체의 항원-결합 센터의 가변성 도메인을 치환하여, 항원에 대한 특이성을 가진 항원-결합부와 다른 항원에 대한 특이성을 가진 다른 항원-결합부를 포함하는 키메라 2가 항체를 구축할 수 있다.
인간 항체 및 파지 디스플레이 라이브러리에 기반한 기법
현재, 면역화 후, 내인성 면역글로불린 생산 없이 전 범위 (full spectrum)의 인간 항체를 생산할 수 있는, 형질전환 동물 (예, 마우스)을 생산하는 것이 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동형접합성 결손 (homozygous deletion)시, 내인성 항체 생산이 완전히 저해된다는 사실이 개시된 바 있다. 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이를 이러한 생식계열 돌연변이 마우스에 전이하면, 항원 챌린지시 인간 항체가 만들어진다 (US 5,545,806; 5,569,825; 5,591,669 (모두 GenPharm); 5,545,807; 및 WO 97/17852).
다른 예로, 면역화된 공여체 유래 면역글로불린 가변 (V) 영역 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내에서 수득하기 위해, 파지 디스플레이 기법을 이용할 수 있다 (McCafferty et al., Nature, 348:552-553 (1990)). 이 기법에 따라, 항체 V-영역 유전자를 M13 또는 fd와 같은 필라멘트형 박테리오파지의 메이저 또는 마이너 외막 단백질 유전자와 인-프래임으로 클로닝하여, 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편으로서 제시한다. 필라멘트형 입자는 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 1 카피를 포함하므로, 항체의 기능적 특성에 기반한 선택으로 상기한 특성을 가진 항체를 코딩하는 유전자를 선별한다. 즉, 파지는 B-세포의 일부 특성을 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행할 수 있다. 파지 디스플레이를 위해 여러가지 소스의 V-유전자 세그먼트를 사용할 수 있다. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)에서는, 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V-유전자의 소규모 랜덤 조합 라이브러리로부터 다양한 항-옥사졸론 항체 세트를 단리하였다. 다양한 항원 세트 (자기-항원 포함)에 대해 비-면역화된 인간 공여체 유래의 V 유전자 레퍼토리를 기본적으로 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)에 기술된 기법에 따라 단리할 수 있다.
전술한 바와 같이, 인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 구축할 수 있다 (US 5,567,610 및 US 5,229,275).
항체 단편
특정 경우에, 전체 항체보다 항체 단편을 사용하는 것이 추천된다. 더 작은 크기의 단편이 이를 신속하게 회수하여, 밀집 종양 (dense tumor)에 더 잘 침투시킬 수 있다.
항체 단편을 제조하기 위한 다양한 기법들이 개발되어 있다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백질분해성 분해 (proteolytic digestion)로부터 파생된다. 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 수득할 수도 있다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 E. coli로부터 발현 및 분비시켜, 이들 단편의 다량 생산을 용이하게 할 수 있다. 항체 단편은 전술한 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 다른 구현예에서, Fab'-SH-단편을 E. coli에서 직접 단리하고, 화학적으로 커플링하여 F(ab')2-단편을 제조할 수 있다 (Carter et al, Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). 다른 접근법에 따르면, F(ab')2-단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리할 수 있다. 에피토프 결합성 수용체 잔기를 보유한 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2가 US 5,869,046에 기술되어 있다. 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 기법들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 자명할 것이다. 본 발명의 다른 구현예들에서, 선택 항체는 단쇄 Fv 단편 (scFv)이다 (WO 93/16185, US 5,571,894 및 US 5,587,458 참조). Fv 및 sFcv는 불변부가 결핍된 온전한 결합 부위를 가진 유일한 종이며; 그래서, 생체내 사용시 비-특이적인 결합을 줄이는데 적합하다. scFv 융합 단백질은 scFv의 N- 또는 C-말단에 작동자 단백질이 융합되게 설계될 수 있다. 또한, 항체 단편은, 예를 들어, US 5,641,870에 기술된 바와 같이 "선형 항체 (linear antibody)"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일 특이성 또는 2중 특이성일 수 있다.
약학적 조성물
다른 측면에서, 본 발명은 활성 성분으로서 (또는 유일한 활성 성분으로서) GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
약학적 조성물은 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 하나 이상과, 약제학적으로 허용가능하고 약리학적으로 적합한 부형제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 구성성분을 포함할 수 있다.
약학적 조성물은 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 하나 이상과, 대응되는 하나 이상의 표면 수용체 하나 이상을 표적화하는 하나 이상의 부가적인 결합 분자 (예, 항체)를 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 조성물은 GITR과 관련될 수 있는 장애를 개선, 예방 또는 치료하기 위한 것이다.
"약학적 조성물"은 본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체, 및 충전제, 용매, 희석제, 담체, 보조제, 분배제, 전달제, 보존제, 안정화제, 유화제, 현탁화제, 증점제, 장기 전달 조절제와 같은, 약제학적으로 허용가능하며 약리학적으로 적절한 부형제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하는 조성물을 의미하며, 이들 물질의 선택과 비율은 투여 타입과 경로 및 투여량에 따라 결정된다. 본 발명의 약학적 조성물 및 이의 제조 방법은 당해 기술 분야의 당업자에게 의심의 여지없이 자명할 것이다. 약학적 조성물은 바람직하게는 GMP (우수 의약품제조 관리 기준) 요건을 준수하여 제조되어야 한다. 조성물은 완충제 조성물, 긴장성 물질 (tonicity agent), 안정화제 및 용해제를 포함할 수 있다. 조성물의 장기 작용은 약학적 활성 성분의 흡수를 서행시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴에 의해 달성될 수 있다. 적합한 담체, 용매, 희석제 및 전달제의 예로는 물, 에탄올, 폴리알코올 및 이들의 혼합물, 오일, 및 주사용 유기 에스테르 등이 있다.
"약제 (약물)"는, 인간 및 동물에서 생리학적 기능을 복구, 개선 또는 수정하고 질환을 치료 및 예방하고, 진단, 마취, 피임, 미용 (cosmetology) 및 기타 용도로 의도된, 정제, 캡슐제, 산제, 동결건조제, 주사제, 주입제, 연고 및 기타 레디 형태 (ready form)의 물질 또는 약학적 조성물로서 물질들의 혼합물이다. 당해 기술 분야에서 허용되는 펩타이드, 단백질 또는 항체를 투여하는 임의 방법이 본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체에 적절하게 적용될 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용가능한"은 포유류, 바람직하게는 인간에 투여하기 적합한 하나 이상의 혼용가능한 (compatible) 액체 또는 고체 성분을 지칭한다.
본원에서, 용어 "부형제"는 본 발명의 전술한 성분 이외의 임의 성분을 나타내기 위해 사용된다. 이러한 성분은 약물 제품에 필요한 물리화학적 특성을 부여하기 위해 약제 제조에 사용되는 무기 또는 유기 성질의 물질이다.
용어 "완충제", "완충제 조성물", "완충화제 (buffering agent)"는 산-염기 공액 구성성분들의 작용에 의해 pH 변화를 견딜 수 있으며, GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 약물이 pH 변화를 견딜 수 있게 하는, 용액을 지칭한다. 일반적으로, 약학적 조성물은 바람직하게는 4.0 내지 8.0 범위의 pH를 가진다. 사용되는 완충제의 예로는, 비-제한적으로, 아세테이트, 포스페이트, 사이트레이트, 히스티딘, 숙시네이트 등이 있다. 완충제 용액.
본원에서, 용어 "긴장성 물질", "삼투용질 (osmolyte)" 또는 "삼투압제 (osmotic agent)"는 액체 항체 제형의 삼투압을 높일 수 있는 부형제를 지칭한다. "등장성" 약물은 인간 혈액과 동일한 삼투압을 가진 약물이다. 등장성 약물은 전형적으로 약 250 내지 350 mOsm/kg의 삼투압을 가진다. 사용되는 등장제 (isotonic agent)로는, 비-제한적으로, 폴리올, 사카라이드 및 슈크로스, 아미노산, 금속염, 예를 들어, 소듐 클로라이드 등이 있다.
"안정화제"는 활성 물질의 물리적 및/또는 화학적 안정성을 제공하는 부형제 또는 2 이상의 부형제들의 혼합물을 의미한다. 안정화제로는, 아미노산, 비-제한적인 예로, 아르기닌, 히스티딘, 글리신, 라이신, 글루타민, 프롤린; 계면활성제, 비-제한적인 예로, 폴리소르베이트 20 (상품명 Tween 20), 폴리소르베이트 80 (상품명 Tween 80), 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜 및 이의 코폴리머 (상품명 Poloxamer), Pluronic, 소듐 도데실 설페이트 (SDS); 항산화제, 비-제한적인 예로, 메티오닌, 아세틸시스테인, 아스코르브산, 모노티오글리세롤, 아황산 염 등; 킬레이트제, 비-제한적인 예로, 에틸렌다이아민테트라아세트산 (EDTA), 다이에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 소듐 사이트레이트 등이 있다.
약학적 조성물은, 활성 물질이 보관 온도, 예를 들어 2-8℃의 보관 온도에서 지정된 유통 기한 (shelf life) 동안 물리적인 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 유지한다면, "안정적"이다. 바람직하게는, 활성 물질은 물리적 및 화학적 안정성뿐 아니라 생물학적 활성을 유지한다. 보관 기간은 가속 또는 자연 노화 조건에서의 안정성 검사 결과를 토대로 조율된다.
본 발명의 약학적 조성물은 레디 제형 (ready formulation) 형태의 단일 단위 용량 (single unit dose) 또는 복수개의 단일 단위 용량들로 제조, 포장 또는 널리 시판될 수 있다. 본원에서, 용어 "단일 단위 용량"은 활성 물질을 미리 정해진 양으로 포함하는 개별 약학적 조성물의 양을 의미한다. 활성 물질의 양은 일반적으로 환자에게 투여할 활성 물질의 투여량 또는 투여량의 편리한 일부 (convenient part), 예를 들어 그 투여량의 절반 또는 1/3과 같다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 전형적으로, 주사, 주입 및 이식 (implantation)에 의해 위장관을 우회하여, 피부 또는 점막 장벽에서의 브리치 (breach)를 통해 인체에 투여하기 위한 것으로 의도된 무균성 (sterile) 제형으로서 비경구 투여에 적합하다. 예를 들어, 비경구 투여로는, 특히 피하, 복막내, 근육내, 흉골내, 정맥내, 동맥내, 척추강내, 뇌실내, 요도내, 두개강내, 활액내, 경피 주사 또는 주입; 및 신장 투석 주입 기법 등이 있다. 종양내 전달, 예를 들어 종양내 주사도 이용할 수 있다. 또한, 국소 관류 (regional perfusion)도 제공된다. 본 발명의 바람직한 구현예는 정맥내 경로 및 피하 경로를 포함한다. 당해 기술 분야에서 허용되는, 펩타이드 또는 단백질의 임의 투여 방법은, 본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체에 적절히 적용될 수 있다.
주사가능한 제형은, 비-제한적으로, 예를 들어, 앰플, 바이얼, 플라스틱 용기, 사전 충진된 주사기, 자동주사 기구내 단위 투약 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여용 제형은 특히 현탁제, 용액제, 오일성 또는 수성 베이스 중의 에멀젼, 파스타제 (pastes) 등을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 투여하기 전에 적절한 베이스 (예, 무균성 발열원 제거 수)를 사용해 재구성하기 위한 건조된 형태 (즉, 분말 또는 과립)로 제공되는 약학적 조성물을 포함하는 비경구 투여용 조성물을 제공한다. 이러한 제형은, 예를 들어, 냉동 건조로서 당해 기술 분야에 공지되어 있으며 산물을 냉동시킨 다음 냉동된 물질로부터 용매를 제거하는 것을 수반하는, 동결건조 공정에 의해 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 또한 적절한 추진제가 사용되거나 또는 사용되지 않는, 가압 에어로졸 용기 (aerosol pressurized container), 펌프, 스프레이, 분무기 (atomizer) 또는 네블라이저와 같은 흡입기로부터 단독으로 또는 적절한 약제학적으로 허용가능한 부형제와의 혼합물로서 흡입에 의해 또는 비강내로, 또는 점비제로서 또는 스프레이제로서 투여할 수 있다.
비경구 투여를 위한 투여 형태는 즉시 방출형으로 및/또는 변형된 방출형으로 제형화될 수 있다. 변형된 방출형 제형은 지연성, 지속성, 펄스형, 조절된, 표적화된 및 프로그래밍된 방출을 포함한다.
본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 치료학적 용도
일 측면에서, 본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 GITR 활성 (에 의해 매개되는)과 관련된 장애를 치료하는데 유용하다.
일 측면에서, 치료 개체 또는 환자는 포유류, 바람직하게는 인간 개체이다. 개체는 임의 연령의 남성 또는 여성일 수 있다.
일부 구현예에서, GITR에 특이적으로 결합하는 상기한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 자궁경부암, 두경부암, 위암, 유방암, 신장 세포 암, CRC (결장직장암), (OC) 난소암, NSCLC (비-소 세포성 폐암)를 포함하는 군으로부터 선택되는 GITR에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용된다.
종양 (예, 암)의 경우에, 항체 또는 이의 단편 (예, GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편)의 치료학적 유효량은 암 세포의 개수를 감소시키거나; 처음 종양 크기를 줄이거나; 암 세포의 말초 장기로의 침윤을 저해 (즉, 어느 정도 서행, 바람직하게는 정지)하거나; 종양 전이를 저해 (즉, 어느 정도 서행, 바람직하게는 정지)하거나; 종양 증식을 어느 정도 저해하거나; 및/또는 장애와 관련있는 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화할 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 암 세포의 성장을 어느 정도 방지할 수 있거나, 및/또는 기존 암 세포를 사멸시킬 수 있으며, 이는 세포분열억제 (cytostatic) 및/또는 세포독성을 나타낼 수 있다. 암 요법의 경우, 생체내 효과는, 예를 들어, 종양 진행 시간 (TTP), 치료에 대한 종양 반응률 (RR), 수명 기간 및/또는 질을 평가함으로써 측정할 수 있다.
본원에서, GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 및 하나 이상의 다른 치료학적 물질과 관련하여 용어 "공동-투여 (co-administration)", "공동-투여된다" 및 "와 조합하여 (in combination with)"는,
1) 환자에게 구성 성분들을 실질적으로 동시에 방출하는 단일한 투약 형태로 구성 성분들이 제형화되는, 본 발명의 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체와 치료학적 물질의 조합을 치료가 필요한 환자에게 동시 투여하는 방식,
2) 구성 성분들이 서로 다른 투약 형태로 분리되어 제형화되고, 환자에게 실질적으로 동시에 섭취되어 이들 구성 성분들이 환자에서 실질적으로 동시에 방출되는 경우에, 본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 및 치료학적 물질의 조합을 치료가 필요한 환자에게 동시에 투여하는 방식,
3) 구성 성분들이 별개의 투약 형태로 서로 분리되어 제형화되고, 투약 형태들이 충분한 투여 간격으로 환자에게 연속적인 횟수로 섭취되어, 구성 성분들이 환자에서 실질적으로 다른 시기에 방출되는, 본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 및 치료학적 물질의 조합을 치료가 필요한 환자에게 순차적으로 투여하는 방식; 및
4) 환자에게 동시에, 연속적으로 또는 동일 시점에 및/또는 서로 다른 시점에 합동적으로 (jointly) 방출되는 조절된 방식으로 구성 성분들을 방출하는 단일한 투약 형태로 구성 성분들이 함께 제형화되고, 각각의 부분이 동일 경로에 의해 또는 서로 다른 경로에 의해 투여될 수 있는, 본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 및 치료학적 물질의 조합을 치료가 필요한 환자에게 순차적으로 투여하는 방식을 의미, 언급 또는 포함하는 것으로 간주된다.
본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 추가적인 치료학적 처치없이, 즉 독립적인 테라피 (independent therapy)로서 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체에 의한 치료는 하나 이상의 부가적인 치료학적 처치를 포함할 수 있다 (병용 요법). 본 발명의 일부 구현예에서, GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 암을 치료하기 위한 다른 약물/제제와 합동 방식으로 투여하거나 또는 이와 함께 제형화할 수 있다.
본원에서, 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 저해 또는 방지하거나 및/또는 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학치료제 및 소분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 식물 기원의 효소학적 활성 독소와 같은 독소를 이의 단편 및/또는 변이체를 비롯하여 포함하는 것으로 의도된다.
"화학치료제"는 악성 종양을 치료하기 위해 사용되는 화학적 화합물이다. 화학치료제에 대한 예로는 알킬화제, 예로 티오테파 (thiotepa) 및 사이클로스포스파미드 (CYTOXAN®); 알킬 설포네이트, 예를 들어 부설판 (busulfan), 임프로설판 (improsulfan) 및 피포설판 (piposulfan) 아지리딘 (aziridine), 예를 들어 벤조도파 (benzodopa), 카르보쿠온(carboquone), 메투레도파 (meturedopa), 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민 (methylamelamine), 예로 알트레타민 (altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라민 (trimethylolomelamine); 아세토게닌 (acetogenin) (예를 들어, 불라탁신 (bullatacin) 및 불라탁시논 (bullatacinone)); δ-9-테트라하이드로카나비놀 (드로나비놀 MARINOL®); β-라파콘 (lapachone); 라파콜 (lapachol); 콜히친; 베툴린산 (betulinic acid); 캄프토테신 (camptothecin) (예, 합성 유사체 토포테칸 (topotecan) (HYCAMTIN®), CPT-11 (이리노테칸 (irinotecan), CAMPTOSAR®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 (scopolectin) 및 9-아미노캄프토테신); 브리오스타틴 (bryostatin); 칼리스타틴 (callystatin); CC-1065 (이의 아도젤레신 (adozelesin), 카르젤레신 (carzelesin) 및 바이젤레신 (bizelesin) 합성 유사체 포함); 포도필로톡신 (podophyllotoxin); 포도필린산 (podophyllinic acid); 테니포시드 (teniposide); 크립토피신 (cryptophycin) (예를 들어, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴 (dolastatin); 두오카르마이신 (duocarmycin) (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘루테로빈 (eleutherobin); 판크라티스타틴 (pancratistatin); 사르코딕틴 (sarcodictyin); 스폰기스타틴 (spongistatin); 니트로겐 머스타드, 예로 클로람부실 (chlorambucil), 클로르나파진 (chlornaphazine), 콜로포스파미드 (cholophosphamide), 에스트라무스틴 (estramustine), 이포스파미드 (ifosfamide), 메클로르에타민 (mechlorethamine), 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란 (melphalan), 모벰비신 (novembichin), 펜에스테린 (phenesterine), 프레드무스틴 (prednimustine), 트로포스파미드 (trofosfamide), 우라실 머스타드 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴 (carmustine), 클로로조톡신 (chlorozotocin), 포테무스틴 (fotemustine), 로무스틴 (lomustine), 니무스틴 (nimustine) 및 라님누스틴 (ranimnustine); 항생제, 예를 들어 엔다이인 항생제 (enediyne antibiotic) (예, 칼리케아미신 (calicheamicin), 예를 들어, 칼리케아미신 gamma II 및 칼리케아미신 omega II (예, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)를 참조함); 디네미신 (dynemicin), 예를 들어 디네미신 (dynemicin) A; 에스페라미신 (esperamicin) 및 네오카르지노스타틴 크로모포어 (neocarzinostatin chromophore) 및 관련된 크로모프로테인 엔다이인 항생제 크로모포어), 아클라시노마이신 (aclacinomysin), 액티노마이신 (actinomycin), 오트라마이신 (authramycin), 아자세린 (azaserine), 블레오마이신 (bleomycin), 칵티노마이신 (cactinomycin), 카라비신 (carabicin), 카르미노마이신 (carminomycin), 카르지노필린 (carzinophilin), 크로모마이신 (chromomycin), 닥티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 데토루비신 (detorubicin), 6-다이아조-5-옥소-L-노르루신, 독소루비신 (예로, ADRIAMYCIN®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포좀 주사제 (DOXOL®), 리포솜 독소루비신 TLC D-99 (MYOCET®), 페길화된 리포솜 독소루비신 (CAELYX®) 및 데옥시독소루비신), 에피루비신 (epirubicin), 에소루비신 (esorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 마르셀로마이신 (marcellomycin), 미토마이신 (mitomycin), 예를 들어 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신 (nogalamycin), 올리보마이신 (olivomycin), 페플로마이신 (peplomycin), 포트피로마이신 (potfiromycin), 푸로마이신 (puromycin), ??라마이신 (quelamycin), 로도루비신 (rodorubicin), 스트렙토니그린 (streptonigrin), 스트렙토족신 (streptozocin), 투베르시딘 (tubercidin), 우베니멕스 (ubenimex), 지노스타틴 (zinostatin), 조루비신 (zorubicin) 항-대사산물제, 예를 들어 메토트렉세이트 (methotrexate), 겜시타빈 (gemcitabine) (GEMZAR®), 테가푸르 (tegafur) (UFTORAL®), 카페시타빈 (capecitabine) (XELODA®), 에포틸론 (epothilone) 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어, 데노프테린 (denopterin), 메토트렉세이트 (methotrexate), 프테로프테린 (pteropterin), 트리메트렉세이트 (trimetrexate); 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈 (fludarabine), 6-머캅토퓨린, 티아미프린 (thiamiprine), 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈 (ancitabine), 아자시티딘 (azacitidine), 6-아자우리딘, 카르모푸르 (carmofur), 시타라빈 (cytarabine), 다이데옥시우리딘, 독시플루리딘 (doxifluridine), 에노시타빈 (enocitabine), 플록스우리딘 (floxuridine); 항-아드레날린제, 예를 들어 아미노글루테티미드 (aminoglutethimide), 미토탄 (mitotane), 트릴로스탄 (trilostane); 엽산 보충제 (folic acid replenisher), 예를 들어 프롤린산 (frolinic acid); 아세글라톤 (aceglatone); 알도포스파미드글리코시드 (aldophosphamideglycoside); 아미노레불린산 (aminolevulinic acid); 에닐우라실 (eniluracil); 암사크린 (amsacrine); 베스트라부실 (bestrabucil); 비스안트렌 (bisantrene); 에다트렉세이트 (edatraxate); 데포파민 (defofamine); 데메콜신 (demecolcine); 다이아지쿠온 (diaziquone); 엘포르니틴 (elfornithine); 엘립티늄 아세테이트 (elliptinium acetate); 에토글루시드 (etoglucid); 갈륨 나이트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난 (lentinan); 로니다이닌 (lonidainine); 메이탄시노이드 (maytansinoid), 예를 들어 메이탄신 (maytansine) 및 안사미톡신 (ansamitocin); 미토구아존 (mitoguazone); 미톡산트론 (mitoxantrone); 모피단몰 (mopidanmol); 니트라에린 (nitraerine); 펜토스타틴 (pentostatin); 페나메트 (phenamet); 피라루비신 (pirarubicin); 로속산트론 (losoxantrone); 2-에틸하이드라지드 (2-ethylhydrazide); 프로카바진 (procarbazine); PSK® 다당류 복합체 (JHS Natural product, Eugene, OR); 라족산 (razoxane); 리족신 (rhizoxin); 시조피란 (sizofiran); 스피로게르마늄 (spirogermanium); 테누아존산 (tenuazonic acid); 트리아지쿠온 (triaziquone); 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (trichothecene) (예, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘 (anguidine)); 우레탄; 다카르바진 (dacarbazine); 만노무스틴 (mannomustine); 미토브로니톨 (mitobronitol); 미토락톨 (mitolactol); 피포브로만 (pipobroman); 가시토신 (gacytosine); 아라비노사이드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드 (taxoid), 예를 들어, 파클리탁셀 (TAXOL®), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형 (ABRAXANETM) 및 도세탁셀 (docetaxel) (TAXOTERE®); 클로람부실 (chlorambucil); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트 (methotrexate); 플라티늄 제제, 예를 들어, 시스플라틴 (cisplatin), 옥살리플라틴 (oxaliplatin) 및 카보플라틴 (carboplatin); 미소관 형성으로부터 튜불린 중합을 방해하는 빈카 (vincas), 예를 들어, 빈블라스틴 (vinblastine) (VELBAN®), 빈크리스틴 (vincristine)(ONCOVIN®),빈데신 (vindesine) (ELDISINE®), FILDESIN®), 및 비노렐빈 (vinorelbine) (NAVELBINE®); 에토포시드 (etoposide) (VP16); 이포스파미드; 미톡산트론 (mitoxantrone); 루코보린 (leucovorin); 노반트론 (novantrone); 에다트렉세이트 (edatrexate); 다우노마이신 (daunomycin); 아미노프테린 (aminopterin); 이반드로네이트 (ibandronate); 토포이소머라제 저해제 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어 레티노익산, 예로 벡사로텐 (bexarotene) (TARGRETIN®); 비스포스포네이트, 예로 클로드로네이트 (clodronate) (예를 들어, BONEFOS® 또는 OSTAC®), 에티드로네이트 (etidronate) (DIDROCAL®), NE- 58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (zoledronate) (ZOMETA®), 알렌드로네이트 (alendronate) (FOSAMAJX®), 파미드로네이트 (pamidronate)(AREDIA®), 틸루드로네이트 (tiludronate) (SKELID®) 또는 리세드로네이트 (risedronate) (ACTONEL®); 트록사시타빈 (1,3-다이옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상적인 세포 증식에 연루된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 저해하는 것, 예를 들어, PKC-alpha, Raf, H-Ras, 및 상피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예를 들어 THERATOPE® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어, ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신 및 VAXID® 백신; 토포이소머라제 1 저해제 (예를 들어, LURTOTECAN®); rmRH (예를 들어, ABARELIX®); BAY439006 (소라페닙 (sorafenib) Bayer); SU-11248 (Pfizer); 페리포신 (perifosine), COX-2 저해제 (예를 들어, 셀레콕십 (celecoxib) 또는 에토리콕십 (etoricoxib)), 프로테오좀 저해제 (예를 들어, PS341); 보르테조밉 (bortezomib) (VELCADE®); CCI-779; 티피파르닙 (tipifarnib) (Rl 1577); 오라페닙 (orafenib), ABT510; Bcl-2저해제, 예를 들어, 오블리메르센 소듐 (oblimersen sodium) (GENASENSE®); 피산트론 (pixantrone); EGFR 저해제 (하기 정의 참조); 티로신 키나제 저해제 (하기 정의 참조); 및 전술한 임의의 물질의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체, 아울러 상기한 물질들의 2 이상의 조합, 예를 들어 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론으로 이루어진 조합 요법의 약칭인 CHOP, 및 옥살리플라틴 (ELOXATINTM)을 5-FU 및 루코보빈과 조합하여 치료 요법의 약칭인 FOLFOX를 포함한다.
또한, 이 정의에는, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 저해하도록 작용하는 항-호르몬제, 예를 들어, 혼합형 작용제/길합제 프로파일을 가진 항-에스테로겐, 예컨대, 타목시펜 (tamoxifen) (NOLVADEX®), 4-하이드록시타목시펜 (tamoxifen), 토레미펜 (toremifene) (FARESTON®), 이독시펜 (idoxifene), 드롤록시펜, 랄록시펜 (raloxifene) (EVTSTA®), 트리옥시펜 (trioxifene), 케옥시펜 (keoxifene), 및 선택적인 에스트로겐 수용체 모듈레이터 (SERM), 예를 들어 SERM3; 작용제 특성이 없는 순수한 항-에스트로겐, 예컨대 풀베스트란트 (fulvestrant) (FASLODEX®), 및 EM800 (이러한 제제는 에스트로겐 수용체 (ER) 이량화를 차단하고, DNA 결합을 저해하며, ER 반감기를 연장하고 및/또는 ER 수준을 억제할 수 있음); 아로마타제 저해제, 예로, 스테로이드계 아로마타제 저해제, 예컨대 포르메스탄 (formestane) 및 엑세메스탄 (exemestane) (AROMASIN®), 및 비스테로이드계 아로마타제 저해제, 예를 들어 아나스트라졸 (anastrazole) (AREVIIDEX®), 레트로졸 (letrozole) (FEMARA®) 및 아미노글루테티미드, 및 기타 아로마타제 저해제, 예로, 보로졸 (vorozole) (RIVISOR®), 메게스트롤 (megestrol) 아세테이트 (MEGASE®), 파드로졸 (fadrozole), 이미다졸; 황체화 호르몬-방출 호르몬 작용제, 예로, 루프롤라이드 (LUPRON® 및 ELIGARD®), 고세렐린 (goserelin), 부세렐린 (buserelin) 및 트리프테렐린 (tripterelin); 성 스테로이드, 예를 들어, 프로게스틴 (progestine), 예컨대 메게스트롤 아세테이트 (megestrol acetate) 및 메드록시프로게스테론 아세테이트 (medroxyprogesterone acetate), 에스트로겐, 예를 들어, 다이에틸스틸베스트롤 (diethylstilbestrol) 및 프레마린 (premarin), 및 안드로겐/레티노이드, 예를 들어 플루옥시메스테론 (fluoxymesterone), 모든 트란스레티온 산 (transretionic acid) 및 펜레티니드 (fenretinide); 오나프리스톤 (onapristone); 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절인자 (ERD); 항-안드로겐, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드 및 바이칼루타미드 테스토락톤 및 전술한 물질의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체 및 전술한 물질 2종 이상의 조합도 포함된다.
본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 항체와 조합하여 이용할 수 있는 기타 치료학적 물질은 성장인자 기능의 저해제일 수 있으며, 예를 들어, 이러한 저해제로는 성장인자 항체 및 성장인자 수용체 항체 (예를 들어, 항-erbB2 항체 트라스투주맵 (trastuzumab) [헤르셉틴 (herceptin)], 항-EGFR 항체 파니투무맵 (panitumumab), 항-erbB1 항체 세투시맵 (cetuximab) [Erbitux, C225] 및 Stern et al. Critical reviews in oncology/haematology, 2005, Vol. 54, pp11-29에 의해 개시된 임의의 성장인자 또는 성장인자 수용체 항체); 항-혈관신생제, 예를 들어 혈관 내피 성장인자의 작용을 저해하는 물질, [예를 들어, 항-혈관 내피 세포 성장인자 항체 베박시주맵 (bevacizumab) (아바스틴 (avastin))], 항-혈관 내피 성장인자 수용체 항체, 예컨대 항-KDR 항체 및 항-flt1 항체 안티센스 요법, 예를 들어 상기 열거된 표적에 대한 요법, 예컨대 ISIS 2503, 항-ras 안티센스 또는 G3139 (Genasense), 항-bcl2 안티센스 유전자 요법 방식, 예를 들어, 비정상적인 p53 또는 비정상적인 BRCA1 또는 BRCA2와 같이 비정상적인 유전자를 대체하기 위한 방식, GDEPT (gene-directed enzyme pro-drug therapy), 시토신 데아미나제, 티미딘 키나제 또는 박테리아 니트로리독타제 효소를 이용하는 방식 등의 방식, 및 화학요법 또는 방사선요법에 대한 환자 내성을 높이기 위한 방식, 예컨대 다약제 내성 유전자 요법; 면역요법 방식, 예를 들어, CD52에 대한 단일클론 항체인 알렘투주맵 (Alemtuzumab) (campath-1H)을 이용한 치료, 또는 CD22에 대한 항체를 이용한 치료, 환자의 종양 세포의 면역원성을 높이기 위한 생체외 및 생체내 방식, 인터루킨 2, 인터루킨 4 또는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자와 같은 사이토카인을 이용한 형질감염, T 세포 아네르기를 낮추고자 하는 방식, 예를 들어, CTLA-4 기능을 저해하는 단일클론 항체를 이용한 치료, 사이토카인-형질감염된 수지상 세포와 같은 형질감염된 면역 세포를 이용한 방식, 사이토카인-형질감염된 종양 세포주를 이용한 방식 및 항-이디오타입 항체를 이용한 방식, 생체외에서 비-특이적으로 활성화되거나 또는 대상 특정 항원을 타겟팅하는 T 세포를 이용한 T 세포의 입양 T 세포 전달; 벨카드 (Velcade) (보르테조미드)와 같은 프로테아좀 저해제 등의 단백질 변성 저해제; 예를 들어 수용체 리간드를 격리시키거나, 수용체에 대한 리간드 결합을 차단하거나 또는 (예, 수용체 변성 증가 또는 발현 수준 감소로 인해) 수용체 신호전달을 약화시키는 펩타이드 또는 단백질 (예, 항체 또는 외부 수용체 도메인 구조체)를 이용한, 바이오테라퓨틱 치료학적 방식 (biotherapeutic therapeutic approach) 등이 있다.
본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 항체와 조합하여 이용할 수 있는 다른 치료학적 물질은 항-PD1 항체, 항체-PD-L1 항체, 항체-CTLA4 항체, 항체-4-1BB 항체, 항체-OX40 항체 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 항체일 수 있다.
본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 항체와 조합하여 이용할 수 있는 다른 치료학적 물질은 선천 면역 또는 적응 면역의 활성자 군으로부터 선택되는 치료학적 활성의 항종양 화합물일 수 있다.
본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 전술한 치료 방법에 사용할 수 있거나, 전술한 치료에 사용할 수 있거나, 및/또는 전술한 치료용 약제의 제조에 사용할 수 있는 것을 의미한다.
투여량 및 투여 경로
본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 대상 병태를 치료하는데 효과적인 양으로, 즉 바람직한 결과를 달성하는데 필요한 용량 및 시간 동안 투여될 것이다. 치료학적 유효량은 치료 중인 구체적인 병태, 환자의 나이, 성별 및 체중뿐 아니라 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체가 단독으로 또는 하나 이상의 부가적인 약물 치료와 조합하여 투여되는 지의 여부와 같은 인자들에 따라 달라질 수 있다.
투약 용법은 최적의 바람직한 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스를 투여하거나, 분할된 수회의 용량을 일정 기간 동안 투여하거나, 또는 용량을 치료학적 상황의 긴급성에 의해 지정되는 바와 같이 비례적으로 줄이거나 높일 수 있다. 투여 용이성 및 용량 단일성을 위해 단위 투약 형태로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유익하다. 본원에서 단위 투약 형태는 치료할 환자/개체에게 단일한 용량 (unitary dosages)으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하는 것으로 의도되며; 각 단위는 바람직한 약제학적 담체와 조합하여 바람직한 치료학적 효과를 발휘하도록 계산된 기-결정된 함량으로 활성 화합물을 포함한다. 전형적으로, 본 발명의 단위 투약 형태에 대한 사양 (specification)은, (a) 화학요법제의 고유한 특징 및 달성할 구체적인 치료학적 또는 예방학적 효과, 및 (b) 개체에서 민감도 치료를 위한 활성 화합물의 컴파운딩 기술 분야에서 고유한 한계에 의해 기술되며, 이에 의해 직접 결정된다.
따라서, 당해 기술 분야의 당업자는, 본원에 제공된 내용을 기초로, 용량 및 투여 용법이 치료 분야에서 잘 공지된 방법에 따라 조정됨을 알 것이다. 즉, 최대 허용량은 쉽게 확립할 수 있으며, 환자에게 검출가능한 치료학적 이점을 제공하는 유효량 역시 환자에게 검출가능한 치료학적 효과를 제공하기 위해 각 물질을 투여하는 시간적 요건처럼 결정할 수 있다. 따라서, 일부 용량 및 투여 용법이 본원에 예시되지만, 이들 예는 본 발명의 구현예 수행시 환자에게 제공될 수 있는 용량 및 투여 용법을 어떠한 방식으로도 제한하는 것은 아니다.
용량 값은 완화할 병태의 유형과 중증도에 따라 달라질 수 있으며, 1회 투여 또는 다회 투여를 포함할 수 있음에 유념하여야 한다. 또한, 임의 특정 환자의 경우, 구체적인 투여 용법은 개체 필요성에 따라, 그리고 조성물의 투여를 수행 또는 감독하는 의료 전문가의 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 하며, 본원에 기술된 용량 범위는 단순 예이며 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하고자 하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 조성물을 이용한 투여 용법은 질환의 유형, 환자의 연령, 체중, 성별, 의학적인 상태, 병태의 중증도, 투여 경로 및 사용되는 구체적인 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 등의, 여러가지 인자들에 기초할 수 있다. 즉, 투여 용법은 광범위하게 달라질 수 있지만, 표준 방법을 이용해 일상적으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 용량은 독성 효과 또는 실험 값과 같은 임상적인 효과를 포함할 수 있는 약동학 및 약력학 파라미터를 기반으로 조정될 수 있다. 이에, 본 발명은 당해 기술 분야의 당업자에 의해 결정되는 환자별 용량-증가 (dose-escalation)를 포함한다. 적정 용량 및 용법을 결정하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 본원에 기술된 아이디어가 제공된다면 당해 기술 분야의 당업자라면 이해할 것이다.
적합한 투여 방법의 예는 상기에 제공된다.
본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 적정 용량은 0.1-200 mg/kg, 바람직하게는 0.1-100 mg/kg, 예로, 약 0.5-50 mg/kg, 예를 들어, 약 1-20 mg/kg의 범위일 것으로 간주된다. GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는, 예를 들어, 적어도 0.25 mg/kg, 예를 들어, 적어도 0.5 mg/kg, 예로, 적어도 1 mg/kg, 예를 들어, 적어도 1.5 mg/kg, 예를 들어, 적어도 2 mg/kg, 예를 들어, 적어도 3 mg/kg, 예로, 적어도 4 mg/kg, 예를 들어 적어도 5 mg/kg; 예를 들어, 최대 50 mg/kg, 예로, 최대 30 mg/kg, 예를 들어, 20 mg/kg, 예로, 최대 15 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있다. 투여는 전형적으로 적절한 시간 간격으로, 예를 들어 주당 1회, 2주당 1회, 3주당 1회 또는 4주당 1회로, 그리고 주치의가 적절하다고 생각하는 동안 반복될 것이며, 일부 경우에 필요에 따라 용량을 늘리거나 또는 줄일 수 있다.
진단학적 용도 및 조성물
본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 또한 진단 절차 (예, 시험관내, 생체외)에 사용된다. 예를 들어, 본 발명에 따른 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 환자로부터 수득한 샘플 (예, 염증성 삼출액, 혈액, 혈청, 장액, 타액 또는 뇨와 같은 조직 샘플 또는 체액 샘플)에서 GITR의 농도를 검출 또는 측정하기 위해 이용할 수 있다. 적합한 검출 및 측정 방법으로는 유세포 측정, 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA), 화학발광 분석, 방사성 면역분석 및 면역조직학과 같은 면역분석 등이 있다. 본 발명은 본원에 기술된 GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 포함하는 키트, 예를 들어 진단 키트를 더 포함한다.
실시예
아래 실시예들은 본 발명은 본 발명을 더 잘 이해하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 단지 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 전술한 본 발명은 명확한 이해를 목적으로 설명 및 예를 들어 일부 상세하게 기술되었지만, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 교시 내용에 비추어, 첨부된 구현예의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 본 발명에 대한 일부 변화 및 수정이 행해질 수 있음은 매우 자명할 것이다.
재료 및 일반적인 방법
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적인 정보는 Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에 제공된다. 항체 쇄의 아미노산은 EU 넘버링에 따라 번호가 지정된다 (Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991).
재조합 DNA 기법
Sambrook, J. et al, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989에 기술된 바와 같이 표준 방법을 이용해 DNA를 조작하였다. 분자 생물 시약들은 제조사의 지침에 따라 사용하였다.
유전자 합성
원하는 유전자 세그먼트를 화학 합성에 의해 제조한 올리고뉴클레오티드로부터 제조하였다. 단일 제한효소 부위가 측면에 위치한 300-4000 kb 길이의 유전자 세그먼트를 PCR 증폭 등의 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 라이게이션에 의해 조립한 다음 지정된 제한효소 부위를 통해 클로닝하였다. 서브클로닝한 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 검증하였다.
DNA 서열 결정
DNA 서열을 생거 서열분석에 의해 결정하였다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리
Infomax's Vector NT1 Advance suite version 8.0을 서열 구축, 맵핑, 분석, 주석 (annotation) 및 예시에 사용하였다.
발현 벡터
언급된 항체 및 항원을 발현시키기 위해, 원핵생물 세포 (E. coli)에서의 발현, 진핵생물 세포 (예, CHO 세포)에서의 일시적인 발현용으로 고안된 발현 플라스미드 변이체를 이용하였다. 벡터에는, 항체 발현 카세트 외에도, E. coli에서 플라스미드의 복제를 허용하는 복제 오리진, E. coli에 다양한 항생제 (예, 암피실린 및 카나마이신)에 대한 내성을 부여하는 유전자를 포함한다.
후술한 바와 같이 언급된 항체 쇄를 포함하는 융합 유전자를 PCR 및/또는 유전자 합성에 의해 제작하고, 핵산 세그먼트를, 예를 들어, 해당 벡터내 고유한 제한효소 부위를 이용해 연결함으로써 공지된 재조합 방법 및 기법으로 조립하였다. 서브클로닝한 핵산 서열을 DNA 서열분석에 의해 검증하였다. 일시적인 형질감염을 위해, 다량의 플라스미드를 E. coli 형질전환된 배양물로부터 플라스미드 제조에 의해 입수하였다.
실시예 1
포유류 세포의 현탁 배양에서 재조합 항원 및 항체 생산
인간 GITR 및 오솔로그 (ortholog)의 세포외 영역의 서열을 토대로 재조합 항원들을 제조하기 위해, 항원 세포외 도메인 인간 GITR (https://www.uniprot.org/uniprot/Q9Y5U5), mcyGITR Macaca mulatta (https://www.uniprot.org/uniprot/Q1PBC4) 및 musGITR Mus musculus (https://www.uniprot.org/uniprot/O35714)을 포함하는 여러개의 구조체를 구축하였다. 유전자 서열은 플라스미드 벡터 RDC0359 (https://www.rndsystems.com/products/human-gitr-tnfrsf18-np_004186-versaclone-cdna_rdc0359)로부터 전장 인간 GITR 항원을 코딩하는, 매트릭스로부터 PCR에 의해 합성하고, GITR 오솔로그 유전자에 대한 합성 올리고뉴클레오티드로부터 조립하였다. GITR 유전자 서열은 Fc IgG1 Lama glama-태깅된 포유류 세포에서 단백질 생산하기 위해 플라스미드 (도 1)에 SalI/NotI 제한효소 부위 위치로 클로닝하였다. 또한, 항원 서열은 TEV 프로테아제의 프로테아제 취약 부위에 의해 Fc로부터 이격되어 있으며, 이 부위는 TEV 프로테아제 처리에 의해 Fc 단편을 절단하여 항원의 비-태깅된 버전을 수득하는데 이용하였다. 이 서열 역시 FLAG-EPEA-tag (C-tag GE Healthcare)를 함유한 플라스미드에 단백질의 C-말단에 SalI/NotI 제한효소 부위에 클로닝하였다 (도 2). 아울러, 재조합 인간 GITR-ligand (GITRL) https://www.uniprot.org/uniprot/Q9UNG2)도 비슷한 방식으로 호모트리머 폴돈 [1] 도메인과 EPEA-태그를 함유한 플라스미드에 GITRL의 C-말단에서 클로닝하였다 (도 3). 플라스미드의 필요한 양을 E. Coli 세포에서 생산하여, Maxiprep Qiagen 키트를 사용해 정제하였다.
중국 햄스터 난소 세포 (CHO-K1)로부터 확립된 세포주에서 공개된 프로토콜에 따라 항체 및 항원을 구축하였다 [Biotechnol Bioeng. 2005 Sep 20; 91(6):670-677, Liao Metal., 2004; Biotechnol Lett. 2006 Jun;28(11):843-848; Biotechnol Bioeng. 2003 Nov 5;84(3):332-342]. EBNA1 (엡스타인 바 바이러스 핵 항원 1) 단백질 유전자를 구성적으로 발현하는 세포를 이용하였다. 현탁 배양을 Life Technologies Corporation 사의 무혈청성 배지를 사용해 플라스크 또는 오르비탈 셰이커에서 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 일시적으로 발현시키기 위해, 세포를 2*106/ml 농도로 선형 폴리에틸렌이민 (PEI MAX, Polysciences)을 이용해 형질감염시켰다. DNA/PEI 비율은 1:3-1:10이었다. 형질감염 후 5-7일에, 세포 배양물을 2000 g에서 20분간 원심분리하고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 표적 단백질을 어파인 HPLC에 의해 배양물로부터 단리하였다.
단백질 C-말단에 EPEA-tag (글루탐산-프롤린-글루탐산-알라닌)를 함유한 재조합 GITR 및 GITRL 단백질을 CaptureSelect C-tag 친화성 매트릭스 흡착제를 사용해 배양액으로부터 단리 및 정제하였다. 배양액을 C-태그 흡착제 5 ml이 미리 충진된 크로마토그래피 컬럼을 통과시킨 다음, 컬럼을 PBS 25 ml로 헹궈 비-특이적으로 결합된 성분을 제거하였다. 결합된 항원은 20mM Tris, 2M MgCl2 pH7.0-7.4를 이용한 온화한 조건에서 용출시켰다. 그 후, 단백질은 반투과성 투석 막에서 PBS (pH 7.4)로 투석한 다음 여과 (0.22 ㎛)하여 시험관에 넣어 -70℃에서 보관하였다.
재조합 GITR-TEV-Fc 항원은 어핀 HPLC를 위해 단백질 A 컬럼에서 배양액으로부터 단리 및 정제하였다. 청징된 배양액을, 포스페이트 완충화된 염수 (PBS, pH 7.4)로 평형화된 5 ml HiTrap rProtein A 세파로스 FF 컬럼 (GE Healthcare)을 통과시켰다. 그런 후, 컬럼은 PBS를 5배 컬럼 부피로 사용해 헹궈 비-특이적으로 결합된 성분들을 제거하였다. 결합된 항원은 0.1 M 글리신 완충제 (pH 3)를 사용해 용출시켰다. 단백질 용출 주 피크를 수집하고, 1 M Tris 완충제 (pH 8)를 사용해 중성 pH로 만들었다. 모든 단계들은 유속 110 cm/h로 수행하였다. 그 후, 단백질을 SnakeSkin 투석 튜빙 기법을 이용해 PBS (pH 7.4)로 투석하고, 여과 (0.22 ㎛)한 다음 시험관에 넣어 -70℃에서 보관하였다.
모든 재조합 IgG 항체는 1 ml Hi Trap rProtein A FF 컬럼 (GE Healthcare)에서 항원에 대해 미리 언급된 공정에 따라 사용해 정제하였다. 수득되는 단백질 용액의 순도를 SDS 겔 전기영동에 의해 평가하였다 (예는 도 4 및 5에 도시).
실시예 2
나이브 인간 항체 Fab-라이브러리 MeganLibTM의 구축
인간 공여자 천명 이상의 혈액 샘플로부터 수득한 B 림프구의 전체 RNA를 RNeasy Mini Kit를 제안된 프로토콜 (QIAGEN)에 따라 사용해 단리하였다. RNA 농도 분석은 Nanovue 키트 (GE Healthcare)를 사용해 수행하고, 단리된 RNA의 품질은 1.5% 아가로스겔 전기영동을 이용해 검사하였다.
역전사 반응은 프라이머로서 랜덤 헥사머 올리고뉴클레오티드와 MMuLV 역전사효소를 사용해 제안된 프로토콜에 따라 MMLV RT 키트 (Evrogen)에서 수행하였다.
역전사 산물은 2-단계 중합효소 연쇄 반응에서 매트릭스로 사용해 제한효소 부위가 양측에 위치한 가변성 도메인 유전자를 구축하고; 반응은 올리고뉴클레오티드 키트를 프로토콜에 따라 사용해 수행하였다 [J Biol Chem. 1999 Jun 25; 274(26): 18218-30].
수득되는 DNA 제조물 VL-CK-VH (도 6)에 NheI/Eco91I 제한 엔도뉴클레아제를 처리하여, 오리지널 파지미드 pH5에 연결하였다 (도 7). 라이게이션 산물은 프로토콜에 따라 준비된 SS320 균주 일렉트로컴피턴트 세포에 형질전환하였다 [Methods Enzymol. 2000;328: 333-63]. 조합 파지 Fab 디스플레이 라이브러리 MeganLibTM의 레퍼토리는 형질전환체 1011개였다. Fab 라이브러리 파지 산물을 이전에 개시된 공정에 따라 준비하였다 [J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3): 581-97].
실시예 3
하이브리드 라마-인간 항체의 면역 Fab 라이브러리 구축 (CHARM).
재조합 GITR 항원으로 면역화된, 특이 혈청 역가가 가장 높은, 라마 (Lama Glama)의 개별 혈액 샘플로부터 수득한 B 림프구의 전체 RNA를, RNeasy Mini Kit를 제안된 프로토콜 (QIAGEN)에 따라 사용해 단리하였다. RNA 농도 분석은 Nanovue 키트 (GE Healthcare)를 사용해 수행하고, 단리된 RNA의 품질은 1.5% 아가로스겔 전기영동을 이용해 검사하였다.
역전사 반응은 프라이머로서 랜덤 헥사머 올리고뉴클레오티드와 MMuLV 역전사효소를 사용해 제안된 프로토콜에 따라 MMLV RT 키트 (Evrogen)에서 수행하였다.
역전사 산물은 2-단계 중합효소 연쇄 반응에서 매트릭스로 사용해 제한효소 부위가 양측에 위치한 가변성 도메인 유전자를 구축하고; 반응은 올리고뉴클레오티드 키트를 프로토콜에 따라 사용해 수행하였다 [J Biol Chem. 1999 Jun 25; 274(26): 18218-30].
수득되는 DNA 제조물 VL-CK-VH (도 6)에 NheI/Eco91I 제한 엔도뉴클레아제를 처리하고, 오리지널 파지미드 pH5에 연결하였다 (도 7). 라이게이션 산물은 프로토콜에 따라 준비된 SS320 균주 일렉트로컴피턴트 세포에 형질전환하였다 [Methods Enzymol. 2000;328: 333-63]. 조합 파지 Fab 디스플레이 라이브러리 MeganLibTM의 레퍼토리는 형질전환체 1011개였다. Fab 라이브러리 파지 산물을 이전에 개시된 공정에 따라 준비하였다 [J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3): 581-97]. 표 1은 면역 라이브러리 산물을 요약한 표이다.
항목 번호 코드 명칭 라이브러리 변이체/종 레퍼토리, CFU 농도, unit/ml
1 Lib1-60 BCD166_ILKalifVHH.bph 칼리프 라마 면역 모노도메인 라이브러리, GITR 프로젝트 (플라스미드 pSCK) 5x10E8 2x10E13
2 Lib1-61 BCD166_ILBlackVHH.bph 블랙 라마 면역 모노도메인 라이브러리, GITR 프로젝트 (플라스미드 pSCK) 5x10E8 2x10E13
3 Lib1-62 BCD166_Ch_L_VH_ILBlack.bph 블랙 라마 λ-Fab Charm Lib, GITR 프로젝트 (플라스미드 pH6) 5x10E7 4x10E13
4 Lib1-63 BCD166_Ch_К_VH_ILBlack.bph 블랙 라마 κ-Fab Charm Lib, GITR 프로젝트 (플라스미드 pH6) 5x10E7 4x10E13
5 Lib1-64 BCD166_Ch_L_VH_ILKalif.bph 칼리프 라마 λ-Fab Charm Lib, GITR 프로젝트 (플라스미드 pH6) 5x10E7 3x10E13
6 Lib1-65 BCD166_Ch_К_VH_I LKalif.bph 칼리프 라마 κ-Fab Charm Lib, GITR 프로젝트 (플라스미드 pH6) 5x10E7 4.7x10E13
실시예 4
파지 항체 Fab-라이브러리의 선별
특이적인 항-GITR 인간 파지 Fab 항체를, 실시예 2 및 실시예 3에 기술된 조합 파지 Fab 디스플레이 라이브러리 MeganLibTM 및 면역 CHARM 라이브러리로부터 획득하였다. 파지 디스플레이에 의해 재조합 인간 GITR 항원에 대해 선별을 수행하였다 [Nat Biotechnol. 1996 Mar;14(3):309-14; J Mol Biol. 1991 Dec 5; 222(3): 581-97].
면역 파지 라이브러리의 선별은 EIA/RIA 튜브 고 결합성 5 ml 이뮤노튜브 상에서 수행하였다. 항원 (0.5 ml 2 ㎍/ml)을 카보네이트 완충제 (0.1 M NaHCO3, pH 9.5) 중에 밤새 +4℃에서 흡착시켰다. 그런 후, 튜브를 PBST (10 mM 포스페이트 완충화된 염수 pH 7.3-7.5, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, 0.1% 폴리소르베이트20)으로 헹구고, PBST 중의 0.5% 우유 분말로 된 용액을 전체 부피 (5 ml)로 첨가하여 차단 처리하였다. 차단제는 라운드에 따라 교체하였으며; 예를 들어. PBST 중의 0.5% 우유 분말 용액을 1차 라운드에 사용한 다음, 2차 라운드에서는 PBST 중의 1% BSA를 사용하였다. 튜브들은 교반기 위에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 튜브를 PBST로 헹구고, 차단 완충제 2 ml/튜브 및 파지 라이브러리를 파지 입자 약 2*1012/ml의 농도로 첨가하였다. 이를 실온에서 1-2시간 동안 파지와 함께 인큐베이션하였다. 추가의 라운드에서는, 이전 라운드에서 수득한 파지 상층액 4 ml을 사용하였으며, 이는 17,000 g에서 10-15분간 원심분리하여 사전 청징 처리하였다. 튜브를 PBST로 20회 헹구었다. 0.1 M 글리신 완충제 0.5 ml을 사용해 튜브 표면으로부터 파지를 용출시키고; 튜브에 글리신 완충제를 첨가한 다음 용액은 가볍게 실온에서 15분간 교반하였다. 그런 후, 파지 용액을 깨끗한 비-흡착성 튜브로 옮기고, 중화를 위해 1M TrisHCl pH8.0 100 ㎕를 첨가하였다. 튜브는 세포가 감염될 때까지 얼음에서 보관하였다.
선별 후, M13 박테리오파지를 숙주로서 E.coli TG1 균주를 사용해 배양하였다. 숙주 균주 배양물에 파지를 감염시킨 다음 12-15시간 증식시켜, 증폭을 수행하였다.
선별 후, 파지 0.5-1 ml을 세포 배양물 (OD600=0.3-0.4)과 혼합하여, 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 3,000-4,000 rpm에서 10-15분간 스핀 다운시키고, 이를 배지 1 ml에 재현탁해 선별을 위한 항생제 (암피실린)가 함유된 페트리 디쉬에 도말하였다. 콜로니를 온도 조절 장치에서 30℃에서 증식시켰다. 12-15시간 후, 콜로니의 개수를 계산하고, 세포를 LB 배지 5-10 ml로 세척하였다. 세포 현탁물 100 ㎕를 항생제 (암피실린) 배지 20 ml에 첨가하였다. OD600=0.35-0.5로 37로 밀도를 증가시켰다. K07 파지 헬퍼를 배양물에 대해 1 ㎕/ 10 ml (1010 입자/ml)로 첨가하여, 교반하지 않고 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 동일 부피의 배지를 1회분 암피실린 (100 ㎍/ml)과 2회분 카나마이신 (40 ㎍/ml) 및 2회분 IPTG (0.2 mM)와 함께 세포 배양물에 첨가하였다. 세포 배양물을 셰이커에 탑재한 다음, 파지를 30℃에서 4-5시간 동안 배양하였다. 세포 배양물을 17,000 g에서 25-30분간 원심분리한 다음, 상층액을 튜브에 수집하였다. 주득한 상층액을 다음 선별 라운드에 사용하거나, 또는 추가적인 보관을 위해 침전시켜 파지를 단리하였다.
파지를 다음 방법으로 단리하였다: 20% 폴리에틸렌글리콜 및 2.5 M 소듐 클로라이드를 함유한 용액의 1/6 부피를 상층액에 첨가하고, 강하게 교반하였다. 용액을 얼음에서 적어도 3시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 후, 용액을 10분간 8,000 g에서 원심분리하고, 수득되는 파지를 함유한 침전물을 TBS 완충제 (Tris-보레이트 완충제) 1 ml에 희석하였다.
라운드 2-3회 후, 박테리오파지를 단리하였으며, 인간 GITR 및 비-특이 항원에 대한 다클론 파지의 특이적인 결합성을 분석하였다.
실시예 5
2차 및 3차 선별 라운드에서 수득한 다클론 파지에 대한 분석.
나이브 MeganLib 라이브러리 2종과 면역 라이브러리 6종에서 표적 항원에 대한 3차 선별 라운드 후, 2차 및 3차 라운드에서 수득한 다클론 파지의 특이 및 비-특이 결합성을 ELISA를 이용해 조사하였다.
특이적으로 결합하는 파지 (2 ㎍/ml)의 존재를 분석하기 위해 표적 GITR 항원을, 또는 비-특이 결합성 파지를 분석하기 위해 GCSF, hIL6R-Fc, 인터페론 alfa-2b, 리툭시맵 (2 ㎍/ml)을, ELISA 플레이트의 플라스틱 표면 상에 카보네이트 완충제(0.1 M NaHCO3, pH 9.5) 하에 밤새 흡착시켰다. 그런 후, 플레이트를 PBST (10 mM 포스페이트 완충화된 염수 pH 7.3-7.5, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, 0.1% Poly소르베이트 20)으로 헹구고, PBST 중의 0.5% 우유 분말 용액을 웰당 300 ㎕씩 차단 처리를 위해 웰에 첨가하였다. 플레이트를 셰이커 위에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 헹구고, 2차 및 3차 선별 라운드에서 수득한 파지 용액을 차단 완충제로 1:2 내지 1:256으로 희석하여, 50 ㎕/웰로 플레이트에 투입하였다. 플레이트를 셰이커 위에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PVST로 헹구고, 차단 완충제 중의 항-M13 호스래디시 퍼옥시다제 접합된 항체로 코팅하였다. 1시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 헹구고, 아세테이트 완충제 pH 5.0 중의 반응 기질 (H2O2-0.02% 및 TMB)을 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 음성 대조군에서 약간의 백그라운드가 나타날 때까지 (단 20분을 초과하지 않음) 암 조건 하에 실온에서 인큐베이션하였다. 여기에 10% H2SO4를 25 ㎕/웰로 첨가하여 반응을 퀀칭한 다음 450 nm에서 OD를 측정하였다.
분석 결과, 표적 항원에 대한 3차 선별 라운드 후 인간 나이브 Fab 라이브러리 1종과 면역 Fab CHARM 라이브러리 6종에서 특이적인 (백그라운드 신호의 5X) 결합성이 드러났으며, 유의한 (백그라운드 신호의 2X 미만) 비-특이적인 결합은 관찰되지 않았다.
이들 라이브러리에서 수득한 항체 가변성 도메인 유전자는, E. coli에서 분비가능한 용해성 형태의 Fab를 생산하도록, 발현 벡터 pLL-Fab (도 8)에 다시 클로닝하였다.
실시예 6
인간 GITR에 특이적으로 결합하는 Fab 스크리닝
ELISA를 사용해, 실시예 5에 따라 E. coli에서 생산된 모노클론으로부터 배지로 분비되는 인간 GITR에 특이적으로 결합하는 Fab를 검출하였다. 공개된 서열을 가진 Fab, Fab-gitr3215 (특허 출원)를 양성 대조군으로 이용하였다. 특이적인 결합성 분석을 위해, ELISA 웰 플레이트 (배지 결합성, Greiner bio one)를 GITR 50 ㎕/웰 (1X 카보네이트 완충제 중의 0.2 ㎍/ml)로 코팅하고, 밀봉한 다음 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 모든 추가적인 단계들은 표준 ELISA 프로토콜에 따라 Genetix Qpix2xt (Molecular Devices) 및 Tecan Freedom EVO 200 (Tecan)과 같은 로보트 시스템에 기반한 고-성증 자동 플랫폼을 사용해 수행하엿다. 비-특이 결합은 차단 완충제 BB (PBS 중의 0.5% 탈지 우유 용액 200 ㎕)를 첨가하여 차단시켰다. 플레이트를 셰이커에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 PBS-Tween으로 헹군 다음, 동일 부피의 BB가 혼합된 검사 Fab-함유 세포 상층액 50 ㎕로 코팅하였다. 플레이트를 셰이커에서 1시간 동안 실온에서 추가로 인큐베이션하였으며, 각 플레이트의 웰을 PBS-Tween 완충제로 3번 헹구었다. 세척 후, 각 웰을 항-인간 Fab HRP-접합된 2차 항체 (Pierce-ThermoScientific)로 PBS-Tween (1:5000) 중에서 코팅하였다. 플레이트를 회전 셰이커에서 (실온에서 50분간) 교반시킨 다음 상기와 같이 PBS-Tween 완충제로 3번 헹구었다. TMB (50 ㎕/웰)를 포화될 때까지 (평균 3-5분) 첨가하여 비색 신호를 발생시켰으며; 정지 용액 (30 ㎕/웰 10% 황산)을 첨가하여 추가적인 발생을 차단하였다. 색 신호는 Tecan-Sunrise 플레이트 리더 (Tecan)를 사용해 450 nm에서 측정하였다. 항체 결합 수준은 발색 신호 형성에 비례하였다. 색 신호가 백그라운드 신호의 5배를 초과하고 대조군 항체 Fab-gitr3215와 비슷한 클론은, 비-특이 결합을 검출하기 위해 ELISA에 의해 조사하였다.
실시예 7
선택된 Fab-기타 항원 상호작용에 대한 비-특이 결합 분석
다른 항원에 대한 대상 Fab 단편의 비-특이 결합성을 분석하기 위해 ELISA를 이용하였다. 본 실험은 전술한 바와 같이 수행하였으며, 단 IL6R-Fc, INFα2b, PCSK9-VG-FE, PD-1-Fc (1x 카보네이트 완충제 중의 2.5 ㎍/ml)를 고정 항원으로 사용하였다. GITR-TEV-Fc (1x 카보네이트 완충제 중의 0.2 ㎍/ml)를 특이 결합의 대조군으로 사용하였다. 모든 추가적인 단계들은 표준 ELISA 프로토콜에 따라 Genetix Qpix2xt (Molecular Devices) 및 Tecan Freedom EVO 200 (Tecan)과 같은 로보트 시스템에 기반한 고-성능 자동 플랫폼을 사용해 수행하였다. 비-특이 결합의 색 신호가 백그라운드 신호를 초과하지 않고 특이 결합과 비교해 5배 이상 낮은 클론은 양성으로 간주하였으며, 항체 가변성 도메인 유전자 서열의 결정 및 독특성 (uniqueness) 확인을 위해 이의 유전자를 서열분석하였다. 서열 분석 결과, 본 발명자들은 전장 IgG1 항체 포맷으로 전환하기 위한 고유한 서열 30종을 선별하였다.
실시예 8
포유류 세포의 현탁 배양으로 재조합 항체 생산
실시예 1의 항체 가변성 도메인 유전자를 표준 방법에 따라 클로닝하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 항체 중쇄 및 경쇄 가변성 도메인을 함유한 PCR 산물을 제조하였다. 중쇄 가변성 도메인은 벡터 pEE-Hc IgG1에 SalI/NheI 제한효소 부위로 클로닝하였으며, 대략적인 지도는 도 9에 도시한다. 경쇄 가변성 도메인은 벡터pEE-CK에 SalI/BsiWI 제한효소 부위에서 라이게이션하였으며, 대략적인 지도는 도 10에 도시한다.
중국 햄스터 난소 세포 (CHO-K1)로부터 수득된 확립된 세포주에서 공개된 프로토콜에 따라 항체를 구축하였다 [Biotechnol Bioeng. 2005 Sep 20; 91(6):670-677, Liao Metal., 2004; Biotechnol Lett. 2006 Jun;28(11):843-848; Biotechnol Bioeng. 2003 Nov 5;84(3):332-342]. EBNA1 (엡스타인 바 바이러스 핵 항원 1) 단백질 유전자를 구성적으로 발현하는 세포를 이용하였다.
CHO-K1-S 세포주를 사용해, 일시적인 발현 시스템에서 항체를 구축하였다. 세포를 배플형 플라스크 (125, 250, 500, 1000 및 3000 ml)에서 4 mM 글루타민, 0.05 mg/ml 겐타마이신 및 10 ㎍/ml 시프로플록사신 (ciprofloxacin)이 첨가된 CHO-S-SFM II 및 FreeStyle CHO (1:1) 배지 혼합 하에, 오르비탈 셰이커-인큐베이터에 넣어, +37℃, 5% CO2, 및 플라스크 크기에 따라 110 또는 150 rpm 하에 배양하였다. 세포를 주당 3회 서브 배양하였으며, 밀도 0.2*106 세포/ml로 접종하였다.
형질감염을 위해, 세포를 0.8*106 세포/ml의 밀도로 접종하였으며, 1일 후 2*106 세포/ml 밀도의 세포 배양물로 형질감염을 수행하였다. 2 mM 글루타민 및 0.05 mg/ml 겐타마이신이 첨가된 RPMI-1640 배지를 사용해 형질감염 혼합물을 준비하였다. 벡터를 0.75 ㎍/ml로 배지에서 각각 희석하고, 형질감염제 폴리에틸렌이민 (PEI)을 PEI:DNA 7:1 중량비로 각각 희석하였다. 벡터 및 PEI 희석물을 혼합하여, 실온에서 10분간 인큐베이션한 다음, 형질감염 혼합물을 세포에 투입하여 세포를 표준 조건 하에 배양하였다.
형질감염 다음날, 0.05 mg/ml 겐타마이신 및 10 ㎍/ml 시프로플록사신이 첨가된 CHO-S-SFM II 및 FreeStyle CHO (1:1) 배지 혼합물, 1 mM 소듐 발프로에이트 및 10% 피딩 F12.7을 세포에 첨가하고, 세포를 오르비탈 셰이커-인큐베이터에서 +34℃, 5% CO2 및 플라스크 크기에 따라 110 또는 150 rpm에서 배양하였다. 형질감염 후 3-4일에, 10% 피딩 F12.7을 세포에 첨가하였다.
형질감염 후 7일에, 세포 유체 샘플을 선별해, OctetRed 96을 ForteBio 프로토콜에 따라 사용해 단백질-A 바이오센스 칩 상에서 생성된 단백질 농도를 측정하였다 (표 2). 단백질 A 어핀 HPLC 컬럼을 사용해 배양액으로부터 재조합 항체를 단리 및 정제하였다. 청징 처리된 배양액을, 포스페이트 완충화된 염수(PBS, pH 7.4)로 평형화된 1 ml HiTrap rProtein A FF 컬럼 (GE Healthcare)으로 통과시켰다. 그런 후, 컬럼을 PBS 5배 컬럼 부피로 헹궈 비-특이 결합 물질을 제거하였다. 결합된 항체는 0.1 M 글리신 완충제 (pH 3)로 용출시켰다. 단백질의 주 용출 피크를 수집하고, 1 M Tris 완충제 (pH 8)를 사용해 중성 pH로 만들었다. 모든 단계들은 유속 110 cm/h로 수행하였다. 그런 후, 단백질을 SnakeSkin 투석 튜빙 기법을 이용해 PBS (pH 7.4)로 투석하고, 여과 (0.22 ㎛)한 다음 시험관에 넣어 -70℃에서 보관하였다.
수득되는 단백질 용액의 순도를 SDS 겔 전기영동에 의해 평가하였다 (도 11 및 12). 항체들 모두 세포 분석에서 물리-화학적 특성 및 활성 검사에서 요구되는 순도에 부합하였다.
Lot # 단백질 명 OCTETRED96에 의한 항체 측정 농도 (mg/l)
1161 BCD166-NHVKITSel3-5-H3-25 147.0
1162 BCD166-NHVKSel3-1-C1-9 127.9
1163 BCD166-NHVKSe13-1-A1-1 119.5
1164 BCD166-SPF2Se13-4-F1-38 148.0
1165 BCD166-SPF2Se13-4-G8-43 188.0
1208 BCD166-0l_VH_ChLVHILBSe12_MP1_A9_3-HC(DEL)_VL_ChLVHILBSel2_MPl_A9_3-CL 145.4
1209 BCD166-01_VH_ChLVHILBSe12_MP1_B11_20-HC(DEL)_VL_ChLVHILBSe12_MP1_B11_20-CL 163.0
1210 BCD166-01_VH_ChLVHILBSe12_MP1_F10_16-HC(DEL)_VL_ChLVHILBSe12_MP1_F10_16-CL 52.0
1211 BCD166-01_VH_ChKVHILKSe13_MP2_B9_57-HC(DEL)_VK_ChKVHILKSe13_MP2_B9_57-CK 125.2
1212 BCD166-01_VH_ChKVHILKS e13_MP2_D2_5-HC(DEL)_VL_ChKVHILKSe13_MP2_D2_5-CL 136.0
1213 BCD166-01_VH_ChLVHILKSe12_MP2_G15-HC(DEL)_VL_ChLVHILKSel2_MP2_Gl_5-CL 109.0
1214 BCD166-01_VH_ChKVHILKSe13_MP2_H8_55-HC(DEL)_VK_ChKVHILKSe13_MP2_H8_55-CK 187.4
실시예 9
항-GITR IgG1 항체-인간 GITR 상호작용에 대한 카이네틱 분석
항-GITR 항체-인간/레수스 마카큐/시노몰구스 원숭이 GITR 상호작용에 대한 결합 친화성 상수를 OctetRed 96에서 제조사 (ForteBio) 프로토콜에 따라 결정하였다. 항원 25 ㎍/ml을 2세대 (AR2G) (ForteBio, ARG2 센서의 준비 및 고정화에 대한 제조사의 지침에 따른 표준 프로토콜 적용)의 아민-반응성 센서의 표면에 비-특이적으로 고정시켰다. 항-GITR 항체 중 항체를 소정의 농도로 첨가하였다. 분석은 0.1% Tween-20 및 0.1% BSA를 포함하는 PBS를 작동 완충제로 사용해 30℃에서 수행하였다.
수득되는 센소그램은, 기준 신호를 제한 후, Octet 데이터 분석 소프트웨어 (Version 8.0)를 표준 공정으로 1:1 상호작용 모델을 이용해 분석하였다. 수득된 친화성 상수는 표 3에 나타낸다. 검사 항체 모두 인간 GITR에 대해 높은 친화성과 특이성을 나타내었다.
표 3. 항-GITR 항체 - 인간 GITR 상호작용에 대한 친화성 상수.
번호 명칭 Lot # KD (M)
1 BCD166-NHVKITSe13-5-H3-25 1161 6.38E-11
2 BCD166-NHVKSel3-1-C1-9 1162 6.81E-10
3 BCD166-NHVKSel3-1-A1-1 1163 1.96E-10
4 BCD166-SPF2Sel3-4-F1-38 1164 5.7 6E-10
5 BCD166-SPF2Sel3-4-G8-43 1165 3.30E-11
7 BCD166-01_VH_ChLVHILBSel2_MP1_A9_3-HC(DEL)_VL_ChLVHILBSel2_MPl_A9_3-CL 1208 7.37E-11
8 BCD166-01_VH_ChLVHILBSel2_MP1_B11_20-HC(DEL)_VL_ChLVHILBSel2_MP1_B11_20-CL 1209 6.54E-10
9 BCD166-0l_VH_ChLVHILBSel2_MP1_F10_l6-HC(DEL)_VL_ChLVHILBSel2_MP1_F10_16-CL 1210 1.84E-11
10 BCD166-0l_VH_ChKVHILΚSel3_MP2_B9_57-HC(DEL)_VK_ChKVHILKSel3_MP 2_B9_57-CK 1211 3.13E-10
11 BCD166-0l_VH_ChKVHILΚSel3_MP2_D2_5-HC(DEL)_VL_ChKVHILKSel3_MP2_D2_5-CL 1212 <1.0E-12
12 BCD166-01_VH_ChLVHILΚSel2_MP2_G1_5-HC(DEL)_VL_ChLVHILKSel2_MP2_G1_5-CL 1213 8.50E-09
13 BCD166-0l_VH_ChKVHILKSel3_MP2_H8_55-HC(DEL)_VK_ChKVHILKSel3_MP2_H8_55-CK 1214 1.98E-10
실시예 10
항-GITR 특이적인 작용제 활성 결정.
분석을 위해, Hek-293 세포주에 기반하여 구축된, 표면에 GITR을 안정적으로 발현하고, NFkB 프로모터 하에 반딧불이 루시퍼라제 코딩 유전자를 함유한 HEK293-GITR-NFkB-Luc 세포주를 구축하였다.
분석은 96웰 배양 플레이트에서 수행하였다. 각 웰내 현탁물에는 HEK293-GITR-NFkB-Luc 세포 및 검사 항체를 그래프에 지정된 농도로 함유하였다. 모든 현탁물 성분들은 영양 세포 배양 배지 중에 준비하였다. 모든 성분들을 첨가한 다음, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션한 다음 발광 분석 키트와 플레이트 리더를 사용해 웰의 루시퍼라제 강도를 측정하였다.
항-GITR 단일클론 항체의 비활성 평가 결과 (도 13), lot 1161, 1210 및 1213의 항체들은 기능적으로 활성이고 현저한 작용제 활성을 나타내는 것으로 드러났으며, 대조군 항체 항-GITR3215 항체 및 GITRL 둘다와 비슷한 상위 안정기 (upper plateau)를 보였다. 이들 항체는 표 4에 따라 명명하였다.
번호 기존 명칭 Lot # 새로운 명칭
1 BCD166-NHVKITSel3-5-H3-25 1161 BCD166-01-01
3 BCD166-01_VH_ChLVHILBSel2_MP1_F10_16-HC(DEL)_VL_ChLVHILBSel2_MP1_F10_16-CL 1210 BCD166-01-011
2 BCD16601_VH_ChLVHILKSel2_MP2_G1_5-HC(DEL)_VL_ChLVHILKSel2_MP2_G1_5-CL 1213 BCD166-01-014
실시예 11
항-GITR 항체와 여러가지 유기체로부터 유래된 GITR 간의 상호작용에 대한 효소-연계된 면역분석
ELISA를 이용해 여러가지 유기체로부터 유래된 GITR-Fc에 대한 항체의 상대적인 친화성을 측정하였다. 결합 분석을 위해, ELISA 플레이트 웰 (Greiner bio one 사의 배지 결합)을 인간/시노몰구스/뮤라인 GITR-Fc (1x 카보네이트 완충제 중의 0.5 ㎍/ml) 50 ㎕로 코팅하고, 밀봉한 다음 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 모든 추가적인 단계들은 실시예 6에 기술된 표준 ELISA 프로토콜에 따라 수행하였다. 항-GITR 항체 BCD166-01-01은 인간 및 시노몰구스 원숭이 GITR에 특이적으로 결합하고, 뮤라인 GITR에는 결합하지 않았다 (도 14). 항체 BCD166-01-011은 인간 GITR에 특이적으로 결합하였지만 시노몰구스 원숭이 및 뮤라인 GITR에는 결합하지 않았다 (도 15). 항체 BCD166-01-014는 인간 GITR에 특이적으로 결합하였으며 시노몰구스 원숭이 GITR에 대한 결합성은 훨씬 약하였고, 뮤라인 GITR에 대한 결합성은 전혀 관찰되지 않았다 (도 16). 이에, 원숭이 GITR에 대한 명확한 특이성이 없는 후보물질 BCD166-01-011은 향후 실험에서 제외하였다. 후보물질 BCD166-01-01과 BCD166-01-014는 추가로 개발하는 것으로 확정하였다.
실시예 12
항-GITR IgG1 항체에 대한 카이네틱 분석 - 마카카 물라타 (macaca mulatta) GITR/마카카 시노몰구스 (macaca Cynomolgus) GITR 상호작용
항-GITR 항체 및 레수스 마카큐/시노몰구스 원숭이 GITR에 대한 결합 친화성 상수를 OctetRed 96을 제조사 (ForteBio)의 프로토콜에 따라 사용해 입수하였다. 항원 25 ㎍/ml을 2세대 (AR2G) (ForteBio, ARG2 센서의 준비 및 고정화에 대한 제조사의 지침에 따른 표준 프로토콜 적용)의 아민-반응성 센서의 표면에 비-특이적으로 고정시켰다. 항-GITR 항체 중 항체를 소정의 농도로 첨가하였다. 분석은 0.1% Tween-20 및 0.1% BSA를 포함하는 PBS를 작동 완충제로 사용해 30℃에서 수행하였다.
수득되는 센소그램은, 기준 신호를 제한 후, Octet 데이터 분석 소프트웨어 (Version 8.0)를 표준 공정으로 1:1 상호작용 모델을 이용해 분석하였다. 수득된 친화성 상수는 표 5 및 6에 나타낸다. 검사 항체 모두 원숭이 GITR에 대해 높은 친화성과 특이성을 나타내어, 이의 관련 생체내 동물 모델에서 추가로 연구하기 위한 기반으로 제공된다.
표 5. 항-GITR 항체의 친화성 상수 - 마카카 물라타 GITR 상호작용.
항-GITR 항체 명 Lot# KD (M)
1 BCD166-01-01 1285 9.34E-11
2 BCD166-01-014 1284 1.92E-10
표 6. 항-GITR 항체의 친화성 상수 - 마카카 시노몰구스 GITR 상호작용.
항-GITR 항체 명 Lot# KD (M)
1 BCD166-01-01 1285 5.42E-10
2 BCD166-01-014 1284 5.53E-08
실시예 13
야생형 및 작용제 활성이 강화된 돌연변이 후보물질의 항-GITR 특이 작용제 활성을 결정하기 위한 시험관내 세포 분석.
WO2005047327 , WO2006104989 (A2), WO2007005612 (A2) 및 Science.2014 Mar 14;343(6176):1260-3에서 항체 올리고머화에서 수득된 치환물질에 대한 실험을 토대로, 항-GITR 항체 BCD166-01-01 즉 인간 유도체의 작용제 활성의 강화 가능성을 위해, E345R 돌연변이를 선택하여, 항체의 IgG1 Fc 영역에 도입하였다. 이러한 돌연변이는 항원에 결합된 후 세포 표면 상에서 항체의 올리고머화를 유도하고, ADCC, ADCP, CDC와 같은 다양한 작동자 기능 뿐 아니라 약동학 (PK)을 강화하는 것으로 확인되었다. 목표는, CDC가 아닌 ADCC, 작용제 능력이 강화된 항체를 수득하는 것이었다. 돌연변이 유발은 표준 유전자 조작 프로토콜에 따라 수행하였으며, 실시예 8에 따라 재조합 항체를 합성하였다. 항체를 명명하고, 이하 BCD166-02-01으로 지칭하였다. 2가지 부모 항체 BCD166-01-01, BCD166-01-014 역시 분석하였다.
분석은 실시예 10에서와 동일한 방식으로 수행하였다.
도 17에 나타낸 결과는, 세포 작용자 분석에서, 표적 세포에서 항원-의존적인 항-GITR 항체 BCD166-02-01의 올리고머화로부터 생성된, E345R 돌연변이가 도입된 검사 BCD166-02-01의 활성화 수준이, 전구체 BCD166-01-01과 비교해 5배 증가함을 보여준다. 아울러, 활성화의 상위 안정기 수준이 자연적으로 증가하였으며, EC50값도 증가 방식 (direction of gain)으로 20배 이상 증가하였다.
실시예 14
항-GITR 항체의 항체-의존적인 세포-매개 세포독성 (ADCC)에 대한 시험관내 세포 분석.
본 분석에서는, 후보물질 BCD166-02-01의 ADCC 활성을 조사하였다. 항체 2종 BCD166-01-01, BCD166-01-014도 분석하였다. 또한, 후보물질 BCD166-01-01과 마찬가지로, E345R 돌연변이를 후보물질 BCD166-01-014 (BCD166-02-014로 지칭됨)에 도입하여, 야생형 대비 ADCC 활성을 증가시켰다.
본 분석에서, 본 발명자들은 표면에 CD16을 안정적으로 발현하며 반딧불이 루시퍼라제 코딩 서열을 NFAT 프로모터 하에 함유한 NFAT 프로모터 세포주를 기반으로 구축된 Jurkat-NFAT-Luc-CD16 세포주와 GITR을 표면에 안정적으로 발현하는 Hek-293 세포주에 기반하여 구축된 Hek-293-GITR 세포주를 이용하였다.
분석은 96웰 배양 플레이트에서 수행하였다. 각 웰의 현탁물은 Jurkat-NFAT-Luc-CD16 작동자 세포 및 Hek-293-GITR 표적 세포뿐 아니라 그래프에 표시된 농도로 검사 항체를 함유하였다. 모든 현탁물 구성성분들은 영양 세포 배양 배지 중에 준비하였다. 구성성분들을 모두 첨가한 다음, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션한 다음 루시퍼라제 분석 키트와 플레이트 리더를 사용해 웰의 방광 강도를 측정하였다.
도 18에 나타낸 결과는, ADCD 분석에서 E345R 돌연변이가 도입된 검사 물질 BCD166-02-01의 EC50 값이 전구체 BCD166-01-01과 비교해 40배 증가함을 보여주며, 이는 표적 세포 상에서 항-GITR 항체 BCD166-02-01의 항원-의존적인 올리고머화로 인한 것이다. ADCC 분석에서 전구체 BCD166-01-14 대비 E345R 돌연변이가 도입된 검사 물질 BCD166-02-14에서 EC50 값이 5배 증가하였다. 응집 데이터는 고 활성의 GITR 작용체 생산에 필수적인 여러가지 작동자 특징에 있어 IgG1 항체의 Fc 영역내 E345R 치환이 현저하게 긍정적으로 작용함을 명확하게 보여준다.
실시예 15
항-GITR 항체의 보체-의존적인 세포독성 (CDC)에 대한 시험관내 세포 분석.
본 분석에서, 본 발명자들은 항체 BCD166-01-01, BCD166-01-014, BCD166-02-01 및 대조군 항-GITR-3215 항체를 조사하였다.
분석은 96웰 배양 플레이트에서 수행하였다. 각 웰 내 현탁물은 HEK-293-GITR 세포, 뿐 아니라 지정된 농도의 검사 항체 및 인간 혈청 보체를 포함하였다. 언급된 현탁물이 수용된 플레이트를 4시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 나아가, 알라마르 블루 용액을 각 웰에 첨가한 다음 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 또한, 플레이트 리더를 사용해, 웰에서 형광 강도를 측정하였다 (여기 파장 544 nm, 방출 파장 590 nm).
도 19에 나타낸 결과는, CDC 활성이 미미함을, 즉 항체 BCD166-01-01, BCD166-02-01 및 대조군 항-GITR-3215 항체는, 인간에 사용하기 위한 치료학적 용량을 추정하기 위한 한계 농도인 1 ㎍/ml까지 10%를 초과하지 않는 것으로 나타났다. 후보물질 BCD166-01-14의 경우, 1 ㎍/ml 농도에서 CDC 활성은 세포용해율 약 30%였으며, 즉 효과가 명확함을 의미하며, 생체내 보통 수준일 수 있음을 의미한다. 응집 데이터는 항-GITR IgG1 항체 후보물질의 FC 영역내 E345R 치환 효과가 미미하다는 것을 명확하게 보여준다.
실시예 16
항-GITR 후보물질의 시험관내 세포성 세포독성 분석.
본 분석은 여러가지 반응자 세포 집단들의 수적 변화에 대한 항-GITR 검사 후보물질의 부정적인 또는 긍정적인 효과를 평가하기 위해 수행하였다. 분석에서, 본 발명자들은 항체 BCD166-01-01, BCD166-01-014, BCD166-02-01 및 대조군 항-CD20 항체 (리툭시맵)를 사용하였다.
건강한 공여자의 전혈로부터 Ficoll 밀도 구배 원심분리에 의해 PBMC를 분리하였다. 분석은 96웰 배양 플레이트에서 수행하였다. 각 웰의 현탁물에는 PBMC와 그래프에 나타낸 25, 1 및 0 ㎍/ml 농도의 항체가 포함되었다. PBMC를 항체와 혼합한 후, 플레이트를 16시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 그런 후, 현탁물에서 PBMC의 CD56+, CD19+, CD3+, CD4+ 및 CD8+ 아집단의 비율을 현탁물을 해당 CD에 대한 형광-표지된 항체를 이용한 직접 표지 및 유세포 측정기를 이용한 후속적인 세포 분석에 의해 측정하였다. CD56+, CD19+, CD3+ 세포의 경우, 그래프는 검사 현탁액의 전체 세포에 대한 비율을 나타내고, CD4+, CD8+의 경우에는, 그래프는 CD3+ 세포에 대한 이의 비율을 나타낸다.
도 20-24에 나타낸 결과는, 검사 항-GITR 후보물질이 유의하지 않은 부정적인 효과를 나타냄을, 즉 반응자 세포의 수가 음성 대조군과 비교해 10%를 초과하지 않는다는 것을 보여준다. NK 세포 집단의 경우에는, 용량에 따라 약 30-70%의 세포 수 증가가 관찰되었다. 그러나, 대조군 항-CD20 항체는 NK 세포 집단의 증가를 보였지만, CD20+ B 세포 집단은 실제 자연적으로 완전히 제거되었다. 따라서, 모든 대상 후보물질들은 인간 혈액 세포에 대해 비-특이적인 시험관내 세포독성을 나타내지 않았다.
실시예 17
인간 nTreg 세포 집단의 항원-의존적인 고갈에 대한 시험관내 세포 분석.
ADCC-의존적인 GITR+ nTreg 세포 집단의 고갈은 항-GITR 항체의 치료학적 항-종양 효과의 주요 고려 기작들 중 하나로 간주된다. 분석에서, 본 발명자들은 항체 BCD166-01-01, BCD166-01-014, BCD166-02-01 및 대조군 항-CTLA4 항체 (이필리무맵)를 이용하였다.
말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 건강한 공여자의 전혈에서부터 Ficoll 밀도 원심분리에 의해 단리하였다. PBMC를 "CD4+ CD25+ 조절성 T 세포 단리 키트, 인간" (Miltenyi Biotec, Germany)를 사용해 nTreg에 대해 농화시켰다. 수득한 세포는 고정된 항-CD3 및 항-CD28 항체를 이용한 자기 비드로 활성화하였다.
"NK 세포 단리 키트, 인간" (Miltenyi Biotec, Germany)를 사용해 PMBC로부터 NK 세포를 단리하였다.
항체 용액, NK 세포 현탁물 및 nTreg 현탁물을 배양 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 16시간 동안 인큐베이션하였다.
세포 현탁물 샘플을 CD3, CD4, CD25, FoxP3 (Biolegend, USA)에 대한 형광-표지된 항체로 염색하였다. 염색한 세포 현탁물 샘플을 유세포 형광 측정기로 분석하였다.
도너 1 세포 물질에 대해 도 25에, 그리고 도너 2에 대해 도 26에 나타낸 검사 항체에 작용 하 항체-의존적인 nTreg 고갈에 대한 분석 결과, 세포 집단에서 70-100%의 현저한 감소, 즉 특히 도너 2 물질에서 검사 항-GITR 후보물질의 활성 고갈이 관찰되었다. 아울러, 대조군 항-CTLA4 항체 이필리무맵을 이용한 비교 분석에서는 항-GITR 항체 특히 최종 후보물질 BCD166-02-01이 더 높은 활성을 나타내는 것으로 관찰되었다.
실시예 18
인간 iTreg 세포 집단의 항체-의존적인 고갈에 대한 시험관내 세포 분석.
GITR+ iTreg 세포 집단의 ADCC-의존적인 고갈은 항-GITR 항체의 치료학적 항-종양 효과에 대해 고려되는 주요 기전들 중 하나로 보인다. 본 분석에서, 본 발명자들은 항체 BCD166-01-01, BCD166-01-014, BCD166-02-01을 연구하였다.
PBMC를 건강한 공여자의 전혈에서부터 Ficoll 밀도 원심분리에 의해 단리하였다. 배양 플라스틱-결합성 세포의 집단으로서 단핵구를 PMBC에서 단리하였다. 수지상 세포를 입수하기 위해, 단핵구를 1000 unit/ml GM-CSF (Peprotech, USA) 및 500 unit/ml IL-4 (Thermo Scientific, USA)의 존재 하에 37℃ 및 5% CO2에서 120시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 배지에 LPS 용액 (Sigma, USA)을 0.5 ㎍/ml의 농도로 첨가하고, 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 48시간 인큐베이션하였다.
항체 희석 용액, 수지상 세포 현탁물 및 PBMC를 배양 플레이트에 투입하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 120분간 인큐베이션하였다.
세포 현탁물 샘플을 CD3, CD4, CD25, FoxP3 (Biolegend, USA)에 대한 형광-표지된 항체로 염색하였다. 염색된 세포 현탁물 샘플을 유세포 형광 측정기로 분석하였다. 항-GITR 항체 BCD166-01-01, BCD166-01-14 및 BCD166-02-01은 시험관내에서 iTreg 고갈을 유도한다.
도너 1/도너 2 세포 물질의 경우, 도 27에 나타낸 검사 항체의 작용 하에 항체-의존적인 iTreg 고갈을 분석한 결과, 특히 도너 1 물질의 경우 검사 항-GITR 후보물질의 고갈 활성이 2-5배 유의하게 높은 것으로 관찰되었다. 최종 후보물질 BCD166-02-01은 충분한 iTreg 고갈 활성을 나타내었다.
실시예 19
인간 세포 집단에서 항-GITR 항체의 작용 하에 전염증성 사이토카인 IL-2 및 IFN-γ의 분비에 대한 시험관내 세포 분석.
건강한 공여자의 전혈로부터 Ficoll 밀도 구배 원심분리에 의해 PBMC를 분리하였다.
항-CD3 및 항-GITR 항체를 96웰 플레이트의 웰에 고정하였다. 이를 위해, 항-GITR 항체 BCD166-02-01을 그래프에 표시된 농도로 함유한 DPBS 용액을 100 ㎕/웰로, 그리고 항-CD3 항체를 준최적 농도로 해당 플레이트 웰에 투입하고, 플레이트를 실온에서 16시간 동안 인큐베이션하였다.
분석은 항-CD3 및 항-GITR 항체가 웰에 사전 고정된 96웰 플레이트를 사용해 수행하였다. 각 웰의 현탁물은 40,000 PBMC 및 준최적 농도의 항-CD28 항체를 포함하였다. 현탁물의 모든 성분들은 10% FBS가 함유된 RPMI-1640 배지 중에 준비하였다. 세포 현탁물을 첨가한 다음, 플레이트를 6일 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 배양 4일에, 배양액 분액을 웰에서 취하였다. 그런 후, IL-2 및 IFN-γ 농도를 배양 4일 및 6일차 배양액에서 ELISA에 의해 측정하였다.
항암 효과에 기여하는 전염증성 사이토카인 IL-2 및 IFN-γ의 분비 수준에 대한 항-GITR 항체 효과를 분석한 결과, 배양액에서 이들 물질의 농도가 현저하게 증가되는 것으로 관찰되었다 (결과는 도 28에 도시). 즉, 후보물질 BCD166-02-01은 사이토카인 분비 활성화에 우수한 활성을 나타내었으며, 이는 유의한 항-종양 효과를 의미할 수 있다.
실시예 20
항체 BCD166-02-01의 인간 FcRn, FcgRIIIa158V, FcgRIIIa158F, FcgRIIa131H, FcgRIIa131R, FcgRIIb 및 FcgRIa 수용체 상호작용에 대한 결합성 분석.
항체 BCD166-02-01의 인간 FcRn, FcgRIIIa158V, FcgRIIIa158F, FcgRIIa131H, FcgRIIa131R, FcgRIIb 및 FcgRIa 상호작용에 대한 결합 친화성 상수를 OctetRed 96 (ForteBio)을 사용해 결정하였다. 바이오틴화된 수용체를 스트렙타비딘 센서 (SA)의 표면에 고정하였다. 본 발명자들은, 작동 완충제 (0.1% Tween-20 및 0.1% BSA를 함유한 PBS: FcRn 수용체의 경우 pH6 완충제를, 기타 수용체의 경우에는 pH 7.4 완충제를 사용함) 하에 수용체와 항체 간의 결합 및 해리를 30℃에서 수행 및 분석하였다. 수득한 센소그램을 1:1 또는 1:2 모델에 따라 분석하였으며, 친화성 상수를 Octet Data Analysis Software 8.0 User Guide Copyright 2011ⓒ로 계산하였다.
BCD166-02-01의 인간 FcRn, FcgRIIIa158V, FcgRIIIa158F, FcgRIIa131H, FcgRIIa131R, FcgRIIb 및 FcgRIa 상호작용에 대한 친화성 분석 결과는 도 29에 나타낸다. 이는 IgG1 이소형 항체에 대해 문헌 데이터와 본 회사에서 반복 측정한 데이터 대비 다중 배수 증폭 값들을 보였으며, 이는 Fc 단편 내 E345R 돌연변이가 용액으로부터 이들 수용체에 흡착된 모노머 항체의 카이네틱스에 대해 인지가능하지만 정성적이지 않은 효과를 발휘함을 의미한다.
실시예 21
동적 광 산란을 이용한 단백질 응집점에 의한 콜로이드 및 열 안정성 측정.
동적 광 산란 실험에서 검사 샘플의 응집 온도를 결정하기 위해, 소정의 온도에서 배지 중의 입자 크기의 의존성을 DynaPro® Plate Reader II (Wyatt Technology Corp.)에서 40℃에서 85℃까지 점차적으로 승온시키면서 확인하였다. 그 결과는 표 7에 나타낸다.
검사 샘플 응집점
BCD166-02-01 20 mM 아세테이트 pH=5.0 73.9℃ ±0.1℃
20 mM His, pH=5.5 73.9℃ ±0.1℃
표 7. BCD166-02-01 응집점
분자 BCD166-02-01은 우수한 열-콜로이드 안정성을 가지는 것으로 결론 내릴 수 있다 (20mM 아세테이트에서 응집점, pH = 5.0 및 20mM His에서 응집점, pH = 5.5, 완충제 용액은 > 65℃임).
BCD166-01-014에서 비슷한 데이터가 수득되었다.
실시예 22
50℃ 열 스트레스 하의 열 안정성 결정
검사 샘플을 온도 조절되는 에어 조에 넣고, 72시간 동안 50℃에서 온도 제어하였다. 가열한 후, 온전한 샘플 및 열 스트레스 노출 샘플을 크기 배지 HPLC (SEC HPLC) 및 UV 검출기를 사용해, 그리고 캐필러리 등전점 포커싱 방법에 의해 분석하였다. 크로마토그래피는 Agilent 1100 HPLC 시스템에서 Tosoh TSK-Gel G3000SWXL 컬럼을 사용해 수행하였으며, 검출은 220 nm의 파장에서 수행하였다. 전하 이질성 (charge heterogeneity)은 Labchip GX II, Caliper를 사용해 캐필러리 등전점 포커싱 기법으로 확인하였다. 작용 용액 및 칩 준비는 HT Protein Charge Variant Labeling Kit 및 Protein Charge Variant Buffer Kit, PerkinElmer를 사용해 표준 방법에 따라 수행하였다.
50℃ 인큐베이션 조건에서 BCD-166 (BCD166-02-01 및 D166-01-014)에 대한 안정성 수득 데이터는 표 8에 나타내며; 도 30 (BCD166-02-01) 및 31 (BCD166-01-014)은 50℃에서 72시간 인큐베이션하였을 때의 크로마토그램을 조합하여 도시한다.
일반적인 결론: 샘플은 높은 콜로이드 및 열 안정성을 가진다.
완충제 용액 검사 샘플의 조건 SEC 이소형 프로파일
응집물 함량, % 모노머 함량, % 단편 함량, % 알칼리 분획, % 염기성 분획, % 산성 분획%
20 mM 아세테이트 pH=5.0 온전한 상태 0.396 98.332 1.272 4.57 64.43 31.00
72시간, 50℃ 0.432 98.664 0.905 4.01 58.90 37.09
Δ* 0.036 0.332 -0.367 -0.56 -5.53 6.09
20 mM His, pH=5.5 온전한 상태 0.416 99.110 0.474 4.48 66.93 28.59
72시간, 50℃ 0.393 99.198 0.410 4.39 60.93 34.69
Δ* -0.023 0.088 -0.064 -0.09 -6.00 6.10
* Δ은 스트레스 노출 샘플과 온전한 샘플 (인풋 대조군) 간의 순도 차이, %.
표 8. BCD-166에 대한 크기-배제 HPLC 및 전기영동에 의한 모노머 함량 의존성
실시예 23
피하 이종이식 모델을 이용한 BCD-166 산물의 항-종양 활성 평가
BCD-166 산물의 항종양 활성을 피하 종양 이종이식 모델을 사용해 평가하였다. 이를 위해, A2058 세포주 3x106개를 Matrigel®과 혼합하여, 인간화된 huNOG-EXL 마우스에 피하 이식하였다. 세포 접종 후 7일에, 동물을 표 9에 나타낸 바와 같이 군으로 분할하였다.
표 9. BCD-166 산물의 항-종양 활성 실험에서 동물 군
군 동물 수 용량
BCD-166-01-01 10 20 mg/kg
BCD-166-02-01 10 20 mg/kg
BCD-166-01-014 9 20 mg/kg
음성 대조군 10 -
동물을 군으로 나눈 후 1, 5, 8 및 12일 후에 산물을 20 mg/kg 투여량으로 복막내 투여하였다. 히스티딘 완충제를 음성 대조군으로 투여하였다. 마우스의 체중과 종양의 길이 치수를 실험 내내 측정하였다. 종양의 부피를 식 V = L x W x H x π/6으로 계산하였다. 검사 제품의 효능은 음성 대조군에서 평균 종양의 부피 (Vc)와 산물 군에서의 평균 종양 부피 (Vt)를 하기 식으로 계산한 종양 증식 저해 지표 (TGI)로 분석하였다:
Figure pct00001
실험 결과, BCD-166-01-014 및 BCD-166-02-01 산물의 경우 항-종양 활성이 확인되었으며, 반면 BCD-166-01-01 산물은 임의의 유의한 항-종양 활성을 나타내지 않았다. 그 결과는 도 32 및 33에 나타낸다.
<110> JSC "BIOCAD" <120> Monoclonal antibody that specifically binds to GITR <150> RU2019112296 <151> 2019-04-23 <160> 21 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence HCDR1 BCD166-01/02-001 <400> 1 Asn Tyr Gly Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence HCDR2 BCD166-01/02-001 <400> 2 Val Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Thr Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence HCDR3 BCD166-01/02-001 <400> 3 Glu Leu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Phe Arg Pro Tyr Tyr 1 5 10 15 Tyr Gly Met Asp Val 20 <210> 4 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence BCD166-01/02-001_VH <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Ser 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Phe Arg Pro 100 105 110 Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 5 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence BCD166-01-001_HC <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Ser 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Phe Arg Pro 100 105 110 Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 130 135 140 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 145 150 155 160 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 165 170 175 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 195 200 205 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 210 215 220 Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 225 230 235 240 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 245 250 255 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 260 265 270 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 275 280 285 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 290 295 300 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 305 310 315 320 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 325 330 335 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 340 345 350 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 355 360 365 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 370 375 380 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 385 390 395 400 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 405 410 415 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 420 425 430 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 435 440 445 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 6 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence BCD166-02-001_HC <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Ser 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Phe Arg Pro 100 105 110 Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 130 135 140 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 145 150 155 160 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 165 170 175 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 195 200 205 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 210 215 220 Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 225 230 235 240 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 245 250 255 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 260 265 270 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 275 280 285 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 290 295 300 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 305 310 315 320 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 325 330 335 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 340 345 350 Lys Gly Gln Pro Arg Arg Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 355 360 365 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 370 375 380 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 385 390 395 400 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 405 410 415 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 420 425 430 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 435 440 445 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence LCDR1 BCD166-01/02-001 <400> 7 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence LCDR2 BCD166-01/02-001 <400> 8 Ala Ala Ser Thr Leu Gln Arg 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence LCDR3 BCD166-01/02-001 <400> 9 Gln Gln Ser His Ser His Pro Leu Thr 1 5 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence BCD166-01/02-001_VL <400> 10 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser His Ser His Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 11 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence BCD166-01/02-001_LC <400> 11 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser His Ser His Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence HCDR1 BCD166-01-014 <400> 12 Tyr Tyr Trp Met Tyr 1 5 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence HCDR2 BCD166-01-014 <400> 13 Ala Ile Ser Trp Asn Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Met Lys 1 5 10 15 Gly <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence HCDR3 BCD166-01-014 <400> 14 Asn Arg Tyr Tyr Ser Asp Pro Asn Tyr Gly Met Asn Leu 1 5 10 <210> 15 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence BCD166-01-014_VH <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr 20 25 30 Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Met 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Arg Tyr Tyr Ser Asp Pro Asn Tyr Gly Met Asn Leu Trp 100 105 110 Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence BCD166-01-014_HC <400> 16 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr 20 25 30 Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Met 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Arg Tyr Tyr Ser Asp Pro Asn Tyr Gly Met Asn Leu Trp 100 105 110 Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys 450 <210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence LCDR1 BCD166-01-014 <400> 17 Thr Gly Thr Ser Thr Asp Ile Gly Thr Tyr Lys Tyr Ile Ser 1 5 10 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence LCDR2 BCD166-01-014 <400> 18 Gly Val Ser His Arg Pro Ser 1 5 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence LCDR3 BCD166-01-014 <400> 19 Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Gly Thr Val Val 1 5 10 <210> 20 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence BCD166-01-014_VL <400> 20 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Thr Asp Ile Gly Thr Tyr 20 25 30 Lys Tyr Ile Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Ile Ile Tyr Gly Val Ser His Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Asp Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Gly Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 21 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence BCD166-01-014_LC <400> 21 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Thr Asp Ile Gly Thr Tyr 20 25 30 Lys Tyr Ile Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Ile Ile Tyr Gly Val Ser His Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Asp Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Gly Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215

Claims (48)

  1. 하기 중쇄 가변성 도메인과 경쇄 가변성 도메인을 포함하는, GITR에 특이적으로 결합하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (a) 하기를 포함하는 중쇄 가변성 도메인:
    (i) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1:
    NYGMH (서열번호 1) 또는 YYWMY (서열번호 12);
    (ii) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2:
    VIWFDGSNKFYTDSVKG (서열번호 2) 또는 AISWNGGRTYYAESMKG (서열번호 13);
    (iii) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3:
    ELGGYYYDSSGFRPYYYGMDV (서열번호 3) 또는 NRYYSDPNYGMNL (서열번호 14), 및
    (b) 하기를 포함하는 경쇄 가변성 도메인:
    (i) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1:
    RASQSIGSWLA (서열번호 7) 또는 TGTSTDIGTYKYIS (서열번호 17);
    (ii) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2:
    AASTLQR (서열번호 8) 또는 GVSHRPS (서열번호 18);
    (iii) 하기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3:
    QQSHSHPLT (서열번호 9) 또는 SSYTSSGTVV (서열번호 19).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 가변성 도메인이 하기를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (i) 각각 서열번호 1, 2 및 3의 서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3;
    (ii) 각각 서열번호 12, 13 및 14의 서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 경쇄 가변성 도메인이 하기를 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (i) 각각 서열번호 7, 8 및 9의 서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3;
    (ii) 각각 서열번호 17, 18 및 19의 서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3.
  4. 제1항에 있어서,
    - 상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 서열 각각으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하고;
    - 상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 서열 각각으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서,
    - 상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14의 서열 각각으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하고;
    - 상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19의 서열 각각으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 가변성 도메인이 하기를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (i) 서열번호 4의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열; 또는
    (ii) 서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열.
  7. 제1항에 있어서,
    (i) 상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나,
    (ii) 상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 경쇄 가변성 도메인이 하기를 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (i) 서열번호 10의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열; 또는
    (ii) 서열번호 20의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열.
  9. 제1항에 있어서,
    (i) 상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (ii) 상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항에 있어서,
    (i)
    - 상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 4의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하고;
    - 상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 10의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (ii)
    - 상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하고;
    - 상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 20의 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제10항에 있어서,
    - 상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고;
    - 상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제10항에 있어서,
    - 상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하고;
    - 상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 GITR에 특이적으로 결합하는 항체가 전장 IgG 항체인, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 전장 IgG 항체가 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 이소형 형태인, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 전장 IgG 항체가 인간 IgG1 이소형 형태인, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 GITR에 특이적으로 결합하는 항체가 작동자 특성, 보체-의존적인 세포독성 (CDC)이 아닌 항체-의존적인 세포성 세포독성 (ADCC)을 높이기 위해 Fc 단편에 E345R 돌연변이를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 제1항에 있어서,
    (i) 서열번호 5의 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열; 또는
    (ii) 서열번호 6의 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열
    을 포함하는 중쇄를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. 제1항에 있어서,
    (i) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 또는
    (ii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄
    를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  19. 제1항에 있어서,
    서열번호 11의 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  20. 제1항에 있어서,
    서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  21. 제1항에 있어서,
    (i)
    - 서열번호 5의 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
    - 서열번호 11의 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하거나; 또는
    (ii)　　
    - 서열번호 6의 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
    - 서열번호 11의 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  22. 제1항에 있어서,
    - 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
    - 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  23. 제1항에 있어서,
    - 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
    - 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  24. 제1항에 있어서,
    서열번호 16의 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  25. 제1항에 있어서,
    서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  26. 제1항에 있어서,
    서열번호 21의 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  27. 제1항에 있어서,
    서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  28. 제1항에 있어서,
    - 서열번호 16의 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
    - 서열번호 21의 서열에 대해 90% 이상 상동한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  29. 제1항에 있어서,
    - 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
    - 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 핵산이 DNA인, 단리된 핵산.
  32. 제30항 또는 제31항에 따른 핵산을 포함하는, 발현 벡터.
  33. 세포를 제32항에 따른 벡터로 형질전환하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 수득하기 위한 숙주 세포의 구축 방법.
  34. 제30항 또는 제31항에 따른 핵산을 포함하는, 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 수득하기 위한 숙주 세포.
  35. 제34항에 따른 숙주 세포를, 항체를 수득하기에 충분한 조건 하에 배양 배지에서 배양하고, 필요에 따라 수득되는 항체를 단리 및 정제하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 수득하는 방법.
  36. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 치료학적 유효량으로 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여 포함하는, GITR에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약학적 조성물.
  37. 제36항에 있어서,
    자궁경부암, 두경부암, 위암, 유방암, 신장 세포 암, CRC (결장직장암), (OC) 난소암, NSCLC (비-소 세포성 폐암)를 포함하는 군으로부터 선택되는 GITR에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 것인, 약학적 조성물.
  38. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 치료학적 유효량으로 포함하고, 하나 이상의 치료학적 활성의 항종양 화합물을 치료학적 유효량으로 포함하는, GITR에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약학적 조성물.
  39. 제38항에 있어서,
    자궁경부암, 두경부암, 위암, 유방암, 신장 세포 암, CRC (결장직장암), (OC) 난소암, NSCLC (비-소 세포성 폐암)를 포함하는 군으로부터 선택되는 GITR에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 것인, 약학적 조성물.
  40. 제38항에 있어서,
    상기 치료학적 활성의 항종양 화합물이 화학치료제, 항체 또는 항-호르몬제로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 치료학적 활성의 항종양 화합물이
    (i) 항-PD1 항체, 항체-PD-L1 항체, 항체-CTLA4 항체, 항체-4-1BB 항체, 항체-OX40 항체 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 항체,
    (ii) 소분자, 또는
    (iii) 선천 면역 또는 획득 면역의 활성자 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  42. 제41항에 있어서,
    제29항에 따른 항체 및 하나 이상의 치료학적 활성의 항종양 화합물이 순차적으로 투여되는, 약학적 조성물.
  43. 제41항에 있어서,
    제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 하나 이상의 치료학적 활성의 항종양 화합물이 동시에 투여되는, 약학적 조성물.
  44. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 저해가 필요한 개체에서 GITR의 생물학적 활성을 저해하는 방법.
  45. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제36항 또는 제38항에 따른 약학적 조성물을 치료학적 유효량으로 치료가 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함하는, GITR에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료 방법.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 질환 또는 장애가 자궁경부암, 두경부암, 위암, 유방암, 신장 세포 암, CRC (결장직장암), (OC) 난소암, NSCLC (비-소 세포성 폐암)을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  47. GITR에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료가 필요한 개체에서 치료하기 위한, 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제36항 또는 제38항에 따른 약학적 조성물의 용도.
  48. 제47항에 있어서,
    상기 질환 또는 장애가 자궁경부암, 두경부암, 위암, 유방암, 신장 세포 암, CRC (결장직장암), (OC) 난소암, NSCLC (비-소 세포성 폐암)을 포함하는 군으로부터 선택되는, 용도.
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