WO2020218951A2 - Моноклональное антитело, которое специфически связывается с gitr - Google Patents

Моноклональное антитело, которое специфически связывается с gitr Download PDF

Info

Publication number
WO2020218951A2
WO2020218951A2 PCT/RU2020/050080 RU2020050080W WO2020218951A2 WO 2020218951 A2 WO2020218951 A2 WO 2020218951A2 RU 2020050080 W RU2020050080 W RU 2020050080W WO 2020218951 A2 WO2020218951 A2 WO 2020218951A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
antibody
monoclonal antibody
Prior art date
Application number
PCT/RU2020/050080
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2020218951A3 (ru
Inventor
Андрей Борисович УЛИТИН
Олеся Николаевна КОЗЛОВА
Александр Андреевич ГОРДЕЕВ
Ксения Михайловна БУРНЫШЕВА
Анастасия Николаевна ИШУТИНОВА
Александра Александровна СОЗОНОВА
Сергей Андреевич АГЕЕВ
Александр Николаевич ДОРОНИН
Владимир Сергеевич ЦЫМПИЛОВ
Иван Владимирович МИТРОШИН
Валерий Владимирович СОЛОВЬЕВ
Яков Юрьевич УСТЮГОВ
Роман Алексеевич ИВАНОВ
Дмитрий Валентинович МОРОЗОВ
Original Assignee
Закрытое Акционерное Общество "Биокад"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to BR112021021281A priority Critical patent/BR112021021281A2/pt
Priority to CA3137822A priority patent/CA3137822A1/en
Priority to JOP/2021/0286A priority patent/JOP20210286A1/ar
Priority to US17/605,933 priority patent/US20220213209A1/en
Priority to EA202192907A priority patent/EA202192907A1/ru
Priority to EP20794288.9A priority patent/EP3964525A4/en
Priority to PE2021001765A priority patent/PE20220144A1/es
Priority to KR1020217038209A priority patent/KR20220010501A/ko
Application filed by Закрытое Акционерное Общество "Биокад" filed Critical Закрытое Акционерное Общество "Биокад"
Priority to MX2021012962A priority patent/MX2021012962A/es
Priority to AU2020261207A priority patent/AU2020261207A1/en
Priority to JP2021563239A priority patent/JP2022532991A/ja
Priority to MA54969A priority patent/MA54969A1/fr
Publication of WO2020218951A2 publication Critical patent/WO2020218951A2/ru
Publication of WO2020218951A3 publication Critical patent/WO2020218951A3/ru
Priority to CONC2021/0014153A priority patent/CO2021014153A2/es
Priority to IL287531A priority patent/IL287531A/en
Priority to ZA2021/09374A priority patent/ZA202109374B/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Definitions

  • the present invention relates to the field of biotechnology, in particular to antibodies or antigen-binding fragments thereof, as well as their use. More specifically, the present invention relates to monoclonal antibodies that specifically bind to GITR (Glucocorticoid-induced TNFR-related protein) onyxone TNFRSF18 tumor necrosis factor receptor tumor necrosis). The invention also relates to a nucleic acid encoding a given antibody or antigen-binding fragment thereof, an expression vector, a method for producing the antibody, and the use of the antibody for the treatment of diseases or disorders associated with GITR.
  • GITR Glucocorticoid-induced TNFR-related protein
  • the invention also relates to a nucleic acid encoding a given antibody or antigen-binding fragment thereof, an expression vector, a method for producing the antibody, and the use of the antibody for the treatment of diseases or disorders associated with GITR.
  • TNFRSF18 GITR (English Glucocorticoid-induced TNFR-related protein / glucocorticoid-induced onyxone necrosis factor receptor ⁇ TNFRSF18 / tumor necrosis factor receptor superfamily) is a membrane protein, a receptor from the tumor necrosis factor receptor superfamily.
  • GITR is a type I transmembrane protein that consists of 216 amino acids and has a molecular weight of 26 kDa.
  • the N-terminal extracellular domain contains 3 TNFR-Cys repeats and an N-glycosylation site.
  • the 3 cysteine-rich domains and the cytoplasmic tail of GITR have significant homology to 4-1BB, 0X40 and CD27 (Nocentini, et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 6216-6221).
  • GITR Human GITR is expressed at low levels by immunoreactive T cells, with CD4 + cells showing higher expression compared to CD8 + cells. GITR expression is significantly increased for several days after T cell activation. GITR is constantly expressed at high levels in regulatory T cells (Tregs) such as CD4 + CD25 + or CD8 + CD25 + cells, and is further increased upon activation of these cells (Nocentini and Riccardi (2005) E. J. Immunol. 35: 1016)
  • GITR is not exclusively limited to T cells. Some studies have also indicated that GITR is expressed by NK cells, macrophages, B cells, dendritic cells, mast cells and monocytes (Nocentini and Riccardi (2005) E. J. Immunol. 35: 1016-1022). GITR is expressed in lymph nodes, peripheral blood leukocytes and, to a lesser extent, in the spleen; it is constitutively expressed in high amounts on Tregs, and in low amounts on naive T cells and memory cells.
  • GITR is expressed not only on immune cells, but also on tumor cells.
  • RNA-Seq analysis of data on GITR expression in 33 types of tumors was performed, high expression levels were found in NSCLC (head and neck squamous cell carcinoma), NSCLC (non-small cell lung cancer), BC (breast cancer), esophageal cancer, and bladder cancer (cancer Bladder) .
  • GITR is expressed not only on immune cells, but also on the membrane of tumor cells.
  • GITRL-Fc upregulated the expression of genes associated with T cells, CD8 T cells, cytotoxicity, Thl cells, IFN-gamma, NK, Teff, and T cell activation markers.
  • GITR and its ligand is not limited to hematopoietic cells. GITR is also expressed on keratinocytes, osteoclast precursors, GITRL on endothelial cells.
  • GITRL is a type II transmembrane protein that is typical of most members of the TNF ligand family. Research to date indicates that human GITRL generally exists as a trimer, although it can also exist as a monomer or form other multimeric forms (Chattopadhyay, et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. 104 : 19452-19457; Zhou, et al (2008) Proc Natl Acad Sci 105: 635-640). There is evidence to suggest that a soluble form of GITRL is also produced (Baltz, et al. (2008) Blood 112: 3735-3743; Mahesh, et al. (2006) Eur. J. Immunol. 36: 2128-2138).
  • GITRL is expressed primarily on antigen presenting cells (APCs), including macrophages, B cells, dendritic cells, and endothelial cells, which can function as APCs (Nocentini and Riccardi (2005) E. J. Immunol. 35: 1016-1022; Agostini. et al (2005) Infect Immun 73: 7502-7508; and Nocentini, et al (2007) EJ Immunol 37: 11651169).
  • APCs antigen presenting cells
  • GITR signaling serves as a coactivation signal for both CD4 + and CD8 + naive T cells, thereby inducing or enhancing proliferation and effector function, in particular when stimulation of T cell receptors (RTKs) is close to optimal (Schaer, et al. (2012 ) Curr. Opin. Immunol. 24: 217224).
  • GITR may have several effects on effector T cells and regulatory T cells, including: co-stimulation and activation of effector T cells so that they become more resistant to inhibition, inhibition of regulatory T cells, decreasing the sensitivity of effector T cells to suppression by regulatory T cells, and partial removal of regulatory T cells from circulation (Nocentini, et al. (2007) Eur. J. Immunol. 37: 1165-1169).
  • GITR The main functions of GITR, and hence the main effects of anti-GITR antibodies, are to enhance the proliferation and functioning of effector T cells, as well as an inhibitory effect on the suppressive effect of Tregs.
  • Teff cells are generated initially with an inability to resist the inhibitory tumor microenvironment and suppression of Treg cells. Stimulation of GITR at repeated stages of priming and expansion, via an anti-GITR agonist, soluble GITR ligand, or DC vaccine, modulates Teff and Treg tumor responses in favor of the former, which leads to tumor regression.
  • anti-GITR confers Teff resistance to Treg suppression.
  • GITR activation leads to an increase in the immune response. Such activation can potentially lead to the restoration of immune responses to infections and tumors. Accordingly, molecules capable of activating GITR would be of value as immunostimulatory agents under conditions where it is necessary to elicit an increased immune response.
  • the antibody should have GITR agonist properties, with effector, cytotoxic properties on Treg lymphocytes.
  • anti-GITR antibodies are known in the art (for example, WO2015187835, WO2015031667, WO2017068186, W02017096189, WO2017214548).
  • BCD-166 is an agonist monoclonal antibody that interacts with GITR, activates the receptor, suppresses the suppressor effect of T-regulatory lymphocytes, inhibits / depletes the T-suppressor (regulatory) link of immunity due to ADCC effector properties, thereby increasing the number of CD8 + and CD4 + effector cells and activating the T-effector link of immunity in the tumor microenvironment.
  • the present invention provides an isolated monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof, that specifically binds to GITR, comprising:
  • NYGMH (SEQ ID NO: 1) or YYWMY (SEQ ID NO: 12);
  • VIWFDGSNKFYTDSVKG (SEQ ID NO: 2) or AISWNGGRTYYAESMKG (SEQ ID NO: 13);
  • RASQSIGSWLA SEQ ID NO: 7
  • TGTSTDIGTYKYIS SEQ ID NO: 8
  • AASTLQR (SEQ ID NO: 8) or GVSHRPS (SEQ ID NO: 18);
  • QQSHSHPLT (SEQ ID NO: 9) or SSYTSSGTW (SEQ ID NO: 19).
  • the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that contains CDRs 1, 2, and 3 with the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, respectively.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that contains CDRs 1, 2, and 3 with the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 12, 13, and 14, respectively.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a variable domain of a light chain, which contains CDRs 1, 2 and 3 with the amino acid sequences represented by the sequences SEQ ID NO: 7, 8 and 9, respectively.
  • the monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof comprises a light chain variable domain that contains CDRs 1, 2, and 3 with the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 17, 18, and 19, respectively.
  • the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof comprises:
  • variable domain of the heavy chain which contains CDRs 1, 2 and 3 with amino acid sequences represented by the sequences of SEQ ID NO: 1, 2 and 3, respectively;
  • variable domain of the light chain which contains CDRs 1, 2 and 3 with the amino acid sequences represented by the sequences of SEQ ID NO: 7, 8 and 9, respectively.
  • the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof comprises:
  • variable domain of the heavy chain which contains CDRs 1, 2 and 3 with the amino acid sequences represented by the sequences of SEQ ID NO: 12, 13 and 14, respectively;
  • variable domain of the light chain which contains CDRs 1, 2 and 3 with the amino acid sequences represented by the sequences of SEQ ID NO: 17, 18 and 19, respectively.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that contains an amino acid sequence that is at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that contains an amino acid sequence that is at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15.
  • the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a light chain variable domain that contains an amino acid sequence at at least 90% homologous to the amino acid sequence
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a light chain variable domain that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof comprises a light chain variable domain that contains an amino acid sequence that is at least 90% homologous to an amino acid sequence
  • the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof comprises a light chain variable domain that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
  • the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof comprises:
  • variable domain of the heavy chain which contains an amino acid sequence at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
  • a light chain variable domain that contains an amino acid sequence that is at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof comprises:
  • variable domain of the heavy chain that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
  • the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof comprises:
  • variable domain of a heavy chain which contains an amino acid sequence at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15;
  • a light chain variable domain that contains an amino acid sequence that is at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
  • the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof comprises:
  • variable domain of the heavy chain that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15;
  • the monoclonal antibody that specifically binds to GITR is a full length IgG antibody.
  • the IgG monoclonal antibody is of the human IgGl, IgG2, IgG3, or IgG4 isotype.
  • the IgG monoclonal antibody is of the human IgG1 isotype.
  • the monoclonal antibody that specifically binds to GITR comprises an E345R mutation in the Fc fragment to increase agonistic properties, antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC), but not complement dependent cytotoxicity (CDC).
  • ADCC antibody dependent cellular cytotoxicity
  • CDC complement dependent cytotoxicity
  • the monoclonal antibody comprises a heavy chain having an amino acid sequence that is at least 90% homologous to SEQ ID NO: 5.
  • the monoclonal antibody comprises a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the monoclonal antibody comprises a heavy chain having an amino acid sequence that is at least 90% homologous to SEQ ID NO: b.
  • the monoclonal antibody comprises a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: b.
  • the monoclonal antibody comprises a light chain having an amino acid sequence that is at least 90% homologous to SEQ ID NO: 11.
  • the monoclonal antibody comprises a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the monoclonal antibody comprises:
  • the monoclonal antibody comprises:
  • the monoclonal antibody comprises:
  • the monoclonal antibody comprises: - a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;
  • the monoclonal antibody comprises a heavy chain having an amino acid sequence that is at least 90% homologous to SEQ ID NO: 16.
  • the monoclonal antibody comprises a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the monoclonal antibody comprises a light chain having an amino acid sequence that is at least 90% homologous to SEQ ID NO: 21.
  • the monoclonal antibody comprises a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21.
  • the monoclonal antibody comprises:
  • the monoclonal antibody comprises:
  • the present invention provides an isolated nucleic acid that encodes any of the aforementioned antibody or antigen binding fragment thereof.
  • the nucleic acid is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoe
  • the present invention relates to an expression vector comprising the aforementioned nucleic acid.
  • the present invention relates to a method for producing a host cell for producing said antibody or antigen-binding fragment thereof, which comprises transforming a cell with the above vector.
  • the present invention relates to a host cell for producing the above antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising the above nucleic acid.
  • the present invention relates to a method for producing the above antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising culturing the above cell host in a culture medium under conditions sufficient to obtain the specified antibody, if necessary, followed by isolation and purification of the resulting antibody.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of a disease or disorder mediated by GITR, comprising the above antibody or antigen-binding fragment thereof in a therapeutically effective amount, in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • the pharmaceutical composition is intended for the treatment of a disease or disorder mediated by GITR selected from the group of cervical cancer (cervical cancer), head and neck cancer, stomach cancer, BC (breast cancer), renal cell carcinoma, CRC (colorectal cancer ), OC (ovarian cancer), NSCLC (non-small cell lung cancer).
  • GITR selected from the group of cervical cancer (cervical cancer), head and neck cancer, stomach cancer, BC (breast cancer), renal cell carcinoma, CRC (colorectal cancer ), OC (ovarian cancer), NSCLC (non-small cell lung cancer).
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of a disease or disorder mediated by GITR, comprising the aforementioned antibody or antigen-binding fragment thereof in a therapeutically effective amount and at least one therapeutically active anticancer compound in a therapeutically effective amount.
  • the pharmaceutical composition is intended for the treatment of a disease or disorder mediated by GITR selected from the group of cervical cancer (cervical cancer), head and neck cancer, stomach cancer, BC (breast cancer), renal cell carcinoma, CRC (colorectal cancer) , OC (ovarian cancer), NSCLC (non-small cell lung cancer).
  • GITR selected from the group of cervical cancer (cervical cancer), head and neck cancer, stomach cancer, BC (breast cancer), renal cell carcinoma, CRC (colorectal cancer) , OC (ovarian cancer), NSCLC (non-small cell lung cancer).
  • the pharmaceutical composition comprises a therapeutically active anticancer compound selected from a chemotherapeutic agent, an antibody, or an anti-hormonal agent.
  • the pharmaceutical composition comprises a therapeutically active anticancer compound, an antibody selected from the group of anti-PD1 antibodies, anti-PD-L1 antibodies, anti-CTLA4 antibodies, anti-4-1BB antibodies, anti-OX40 antibodies, or combinations thereof.
  • the pharmaceutical composition comprises a therapeutically active anticancer compound that is a small molecule.
  • the pharmaceutical composition comprises a therapeutically active anticancer compound selected from the group of innate or acquired immunity activators. In some embodiments of the pharmaceutical composition, the above antibody and at least one therapeutically active anticancer compound are administered sequentially.
  • the above antibody and at least one therapeutically active anticancer compound are administered simultaneously.
  • the present invention relates to a method of inhibiting the biological activity of GITR in a subject in need of such inhibition, comprising administering to the subject an effective amount of the aforementioned antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides a method of treating a disease or disorder mediated by GITR, comprising administering to a subject the above antibody or antigen binding fragment thereof or the above pharmaceutical composition in need of such treatment in a therapeutically effective amount.
  • the method of treatment includes a disease or disorder that is selected from the group of cervical cancer (cervical cancer), head and neck cancer, stomach cancer, BC (breast cancer), renal cell carcinoma, CRC (colorectal cancer), OC ( ovarian cancer), NSCLC
  • non-small cell lung cancer non-small cell lung cancer
  • the present invention relates to the use of the aforementioned antibody or antigen binding fragment thereof or the aforementioned pharmaceutical composition for treating a GITR mediated disease or disorder in a subject in need of such treatment.
  • the use includes a disease or disorder selected from the group of cervical cancer (cervical cancer), head and neck cancer, stomach cancer, BC (breast cancer), renal cell carcinoma, CRC (colorectal cancer), OC (cancer ovary), NSCLC
  • non-small cell lung cancer non-small cell lung cancer
  • FIG. 1 Plasmid for protein production pEE-GITR-TEV-Fc lama.
  • FIG. 2 Plasmid for the production of pEE-GITR -Fc protein.
  • FIG. 3 Map of the plasmid pEE-humGITR-ligand-foldon-EPEA.
  • FIG. 4 SDS-gel electrophoresis in 4-20% PAGE
  • FIG. 5 SDS-gel electrophoresis
  • FIG. b Synthesis scheme for combinatorial naive human library
  • FIG. 8 Map of expression plasmid pLL for the production of secreted Fab.
  • FIG. 9 Map of the expression vector pEE-BCDl 66-01-001-VH- HC encoding the heavy chain of antibodies for the transient production of antibodies in mammalian cells
  • FIG. 10 Map of the expression vector pEE-BCD166-01-001-VK- CK encoding the light chain of antibodies for the transient production of antibodies in mammalian cells
  • FIG. 11 SDS-gel electrophoresis in 12% PAGE + b-ME
  • FIG. 12 SDS-gel electrophoresis in 12% PAGE + b-ME
  • FIG. 13 Graph showing the results of testing the specific agonist activity of anti-GITR monoclonal antibodies of lots 1161 (BCD166-01-01), 1210 BCD166-01-011) and 1213 BCD166-01-014) in a test on a reporter cell line.
  • FIG. 14 Graph showing the results of testing the specific binding of the antibody BCD166-01-01 to human GITR, mouse GITR, and cynomolgus monkey GITR.
  • FIG. 15 A graph showing the results of testing the specific binding of the BCD166-01-011 antibody to human GITR, mouse GITR and cynomolgus monkey GITR.
  • FIG. 16 Graph showing the results of testing the specific binding of the BCD166-01-014 antibody to human GITR, mouse GITR, and cynomolgus monkey GITR.
  • FIG. 17 Graph showing the results of the activation level in the cell agonist test of the subjects BCD166-01-01, BCD166-02-01, BCD166-01-014.
  • FIG. 18 Graph with the results of EC50 values in the cellular ADCC test of the investigated BCD166-02-01, BCD166-01-01, BCD166-01-014, BCD166-02-014.
  • FIG. 19 Graph with the results of the CDC level of the researched BCD166-01-01, BCD166-02-01, BCD166-01-014.
  • FIG. 20 Graph showing the effects of the studied anti-GITR candidates on immunoreactive cells (NK) versus negative controls.
  • FIG. 21 Graph showing the effects of the investigated anti-GITR candidates on immunoreactive cells (B) versus negative controls.
  • FIG. 22 Graph showing the effects of the investigated anti-GITR candidates on immunoreactive cells (CD3) versus negative controls.
  • FIG. 23 Graph showing the results of the effect of the investigated anti-GITR candidates on immunoreactive cells (CD8 + T cells) in comparison with the negative control.
  • FIG. 24 Graph showing the effect of the investigated anti-GITR candidates on immunoreactive cells (CD4 + T cells) versus negative controls.
  • FIG. 25 Analysis of antibody-dependent nTreg depletion under the action of the studied anti-GITR candidates for donor cell material 1.
  • FIG. 26 Analysis of antibody-dependent nTreg depletion under the action of the studied anti-GITR candidates for donor cell material 2.
  • FIG. 27 Analysis of antibody-dependent iTreg depletion under the action of the studied anti-GITR candidates for the cell material of donor 1 and donor 2
  • FIG. 28 Results of the analysis of the effect of anti-GITR antibodies on the level of secretion of proinflammatory cytokines IL-2 and IFN- ⁇ , which determine the anticancer effect.
  • FIG. 29 Data table of binding affinity constants of BCD166-02-01 candidate with gamma receptors.
  • FIG. 30 Stability plot of BCD166-02-01 with 72-hour incubation at 50 ° C.
  • FIG. 31 Stability plot of BCD166-01-014 at 72-hour incubation at 50 ° C.
  • FIG. 32 Average values of tumor volumes in groups during the experiment.
  • FIG. 33 Indicator of inhibition of tumor growth on the 33rd day.
  • GITR International Glucocorticoid-induced TNFR-related protein / glucocorticoid-induced onyxone necrosis factor receptor ⁇ TNFRSF18 / tumor necrosis factor receptor superfamily
  • GITR is a membrane protein, a receptor from the tumor necrosis factor receptor superfamily.
  • GITR is a type I transmembrane protein that consists of 216 amino acids and has a molecular weight of 26 kDa.
  • the N-terminal extracellular domain contains 3 TNFR-Cys repeats and an N-glycosylation site.
  • 3 cysteine-rich domains and the cytoplasmic tail of GITR have significant homology with 4-1BB, 0X40 and CD27 (Nocentini, et al. (1997) Proc.
  • GITR GITR
  • head and neck cancer GITR
  • stomach cancer GITR
  • BC breast cancer
  • OC ovarian cancer
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • binding molecule includes antibodies and immunoglobulins.
  • antibody or “immunoglobulin” (Ig), as used herein, includes whole antibodies and any antigen-binding fragment (ie, "antigen-binding portion") or individual chains thereof.
  • antibody refers to a glycoprotein containing at least two heavy (H) chains and two light (L) chains interconnected by disulfide bonds, or an antigen-binding portion thereof. Each heavy chain contains a heavy chain variable region (abbreviated herein as VH) and the constant region of the heavy chain.Five types of heavy chains of mammalian antibodies are known, which are denoted by Greek letters:, d, e, g and m.
  • the type of heavy chain present determines the class of the antibody; these chains are found in antibodies such as IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, respectively.
  • the various heavy chains differ in size and composition; and g contains about 450 amino acids and m and e have about 550 amino acids.
  • Each heavy chain contains two regions, ie a constant region and a variable region.
  • the heavy chains g, and d contain a constant region th, which consists of three constant domains CHI, CH2 and CH3 (lined up) and a hinge region, which gives flexibility (Woof J., Burton D., Nat Rev Immunol 4, 2004, cc.89-99); heavy chains m and e contain a constant region, which consists of four constant domains CHI, CH2, CH3 and CH4. In mammals, only two types of light chains are known, which are designated as lambda (l) and kappa (k). Each light chain consists of a light chain variable region (abbreviated herein as VL) and a light chain constant region. The approximate length of the light chain is 211-217 amino acids.
  • the light chain is a kappa (k) light chain and the CL constant domain is preferably C-kappa (k).
  • Antibodies can be antibodies of any class (eg, IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, preferably IgG) or subclass (eg, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl and IgA2, preferably IgGl).
  • class e.g, IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, preferably IgG
  • subclass eg, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl and IgA2, preferably IgGl.
  • VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability, called complementarity determining regions (CDRs), scattered between regions, which are more conservative, called framework regions (FR).
  • CDRs complementarity determining regions
  • FR framework regions
  • Each VH and VL consists of three CDRs and four FRs, located from the amino end to the carboxy end in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
  • the variable regions of the heavy and light chains contain a binding domain that interacts with antigen.
  • Antibody constant regions can mediate the binding of immunoglobulin to host tissues or factors, including various cells of the immune system (eg, effector cells) and the first component (Clq) of the classical complement system.
  • antigennegative portion of an antibody or "antigennegative fragment” refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind to an antigen. It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be performed by fragments of a full-length antibody.
  • binding fragments included in the term "antigen binding portion" of an antibody include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CH 1 domains; (ii) F (ab f ) 2 fragment, a bivalent fragment, containing two Fab fragments linked by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) an Fd fragment consisting of the VH and CH 1 domains; (iv) an Fv fragment consisting of the VL and VH domains in a single arm of an antibody, (v) dAb a fragment (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), which consists of a VH / VHH domain; and (vi) an isolated complementarity determining region (CDR).
  • a Fab fragment a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CH 1 domains
  • F (ab f ) 2 fragment a bivalent fragment, containing two Fab fragments linked by
  • two regions of the Fv fragment, VL and VH, encoded by different genes can be recombinantly linked using a synthetic linker that allows them to be produced as a single protein chain in which the VL and VH regions are paired to form monovalent molecules (known as single chain Fv (scFv); see, for example, Bird et al. (1988) Science 242 : 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883).
  • scFv single chain Fv
  • Such single-stranded molecules are also contemplated to be included in the term “antigen-binding portion.”
  • Such antibody fragments are prepared using conventional techniques known to those of skill in the art, and these fragments are screened in the same manner as intact antibodies.
  • the CDR of the antigen binding region, or all of the antigen binding region of the antibodies of the invention is of mouse, llama or human donor library origin, or is essentially human in origin with certain amino acid residues altered, for example substituted with different amino acid residues, in order to optimize specific antibody properties, for example KD , koff, IC50, EC50, ED50.
  • the antibody frameworks of the invention are of human origin or of substantially human origin (at least 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or 99% human).
  • the antigen binding portion of an antibody of the invention may be from other non-human species, including, but not limited to, a mouse, llama, rabbit, rat, or hamster.
  • the antigen binding site can be from human species.
  • variable refers to the fact that certain segments of the variable domains differ widely in sequence among antibodies.
  • the V domain mediates antigen binding and determines the specificity of a particular antibody for its particular antigen.
  • variability is unevenly distributed over the 110 amino acid variable domains.
  • V regions are composed of invariant fragments called framework regions (FRs) of 15-30 amino acids separated by shorter regions of extreme variability called “hypervariable regions” or CDRs.
  • FRs framework regions
  • Each variable domain of native heavy and light chains contains four FRs, generally adopting a beta sheet configuration, linked by three hypervariable regions that form binding loops, and in some cases are part of the beta sheet structure.
  • hypervariable regions in each chain are held together in close proximity by FRs and with the hypervariable regions of the other chain contribute to the formation of the antigen-binding site of antibodies.
  • Constant domains are not directly involved in the binding of an antibody to an antigen, but exhibit various effector functions, such as the involvement of an antibody in antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC).
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • hypervariable region refers to the amino acid residues of an antibody that are responsible for antigen binding.
  • the hypervariable region contains amino acid residues from the "complementarity determining region" or "CDR" and / or such residues from the "hypervariable loop".
  • affinity maturation it may also be preferable to alter one or more amino acid residues of the CDR regions in order to increase the binding affinity for the target epitope.
  • affinity maturation is known as "affinity maturation” and in some cases can be performed in connection with humanization, for example, in situations where the humanization of an antibody leads to a decrease in the specificity or affinity of binding, and it is not possible to sufficiently improve the specificity or affinity of binding by using only reverse mutations.
  • Various methods of affinity maturation are known in the art, for example, in vitro method scanning saturating mutagenesis described by Burks et al. , Proc Natl Acad Sci USA, 94: 412-417 (1997), and the stepwise in vitro affinity maturation method proposed by Wu et al. , Proc Natl Acad Sci USA 95: 6037 6042 (1998).
  • FR Framework regions
  • each variable domain has four FRs, designated FR1, FR2, FR3, and FR4.
  • FR1, FR2, FR3, and FR4 are variable domain residues other than the CDR residues.
  • each variable domain has four FRs, designated FR1, FR2, FR3, and FR4.
  • the FR residues of the light chain are located approximately in the region of residues 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) and 98-107 (LCFR4)
  • the FR residues of the heavy chain are located approximately in the region of residues 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) and 103-113 (HCFR4) in the heavy chain.
  • the FR residues of the light chain are located at approximately residues 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) and 97-107 (LCFR4) in the light chain and the FR residues of the heavy chain are located approximately at residues 1-25 (HCFRI), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) and 102-113 (HCFR4) in the residues of the heavy chain.
  • the FRs are adjusted accordingly. For example, when CDRH1 includes amino acids H26-H35, the FR1 residues of the heavy chain are at positions 1-25 and the FR2 residues are at positions 36-49.
  • a crystallizing fragment of immunoglobulin (English, fragment crystallizable region, Fc region, Fc) is the terminal part of an immunoglobulin molecule that interacts with the Fc receptor on the cell surface and with some proteins of the complement system. This property allows antibodies to activate the immune system.
  • the Fc region of IgG, IgA and IgD isotypes consists of two identical protein fragments, respectively, of the second and third constant domains of two heavy chains; in the case of IgM and IgE isotypes, Fc contains three heavy chain constant domains (CH 2-4 domains) in each polypeptide chain.
  • An antibody of the invention that “binds” a target antigen is an antibody that binds an antigen with sufficient affinity such that the antibody can be used as a diagnostic and / or therapeutic agent when targeting a protein or cell or tissue expressing the antigen, and slightly cross-reacts with other proteins.
  • analytical methods sorting of fluorescently activated cells (FACS), radioimmunoprecipitation (RIA) or ELISA (ELISA), in such variants of the invention the degree of binding of the antibody to a protein that is not a “target” (with a “non-target protein”) is less than 10 % of binding of an antibody to a specific target protein.
  • the term "specific binding "or the expressions” specifically binds to "or” specific to "a particular polypeptide or epitope on a particular target polypeptide means binding that is markedly (measurably) different from a non-specific interaction (for example, in the case of LH1-44 or LH1-81, a non-specific interaction is binds to bovine serum albumin, casein, fetal bovine serum or neutravidin).
  • Specific binding can be quantified, for example by determining binding of a molecule versus binding of a control molecule. For example, specific binding can be determined by competitive reaction with another molecule similar to the target, for example, with an excess of unlabeled target. In this case, specific binding is indicated if the binding of a labeled target to a probe is competitively inhibited by an excess of unlabeled target.
  • the term “specific binding” or the expression “specifically binds to” or “specific to” a particular polypeptide or epitope on a particular target polypeptide can be characterized by a molecule having a target Kd of at least about 200 nM, or at least at least about 150 nM, or at least about 100 nM, or at least about 60 nM, or at least about 50 nM, or at least about 40 nM, or at least about 30 nM, or at least about 20 nM, or at least about 10 nM, or at least about 8 nM, or at least about 6 nM, or at least about 4 nM, or at least about about 2 nM, or at least about 1 nM or higher.
  • the term “specific binding” refers to binding in which a molecule binds to a particular polypeptide or epitope on a particular polypeptide, without substantially binding to any other polypeptide or epitope on the polypeptide.
  • Ka refers to the rate of association of a particular antibody-antigen interaction.
  • Kd refers to the rate of dissociation of a particular antibody-antigen interaction.
  • Binding affinity generally refers to the strength of the cumulative non-covalent interactions between a single binding site of a molecule (eg, an antibody) and its binding partner (eg, an antigen). Unless otherwise indicated, "binding affinity” refers to an intrinsic (intrinsic, true) binding affinity that reflects a 1: 1 interaction between members of a binding pair (eg, antibody and antigen).
  • the affinity of a molecule X for its partner Y can usually be represented by a constant dissociation (Kd).
  • the Kd value is about 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, b nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM or less.
  • Affinity can be measured by conventional methods known in the art, including those described herein. Low affinity antibodies usually bind slowly to the antigen and tend to dissociate easily, while high affinity antibodies generally bind antigen faster and tend to remain bound longer. Various methods for measuring binding affinity are known in the art, any of these methods can be used for the purposes of the present invention.
  • KB or “KB value” according to this invention is measured by surface plasmon resonance methods on a BIAcore TM -2000 or BIAcore TM -3000 instrument (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) at 25 ° C using chips with immobilized antigen CM5 at ⁇ 10 relative units (response units, RU).
  • CM5 carboxymethyldextran biosensor chips
  • EDC N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the antigen is diluted with 10 mM sodium acetate, pH 4.8, to a concentration of 5 ⁇ g / ml ( ⁇ 0.2 ⁇ M), and then injected (injection) at a flow rate of 5 ⁇ l / minute until approximately 10 relative units (RU) of bound protein is reached.
  • 1 M ethanolamine solution is injected to block unreacted groups.
  • two-fold serial dilutions of Fab eg, 0.78 nM to 500 nM
  • PBST Tween 20
  • association rate (kop) and dissociation rate (koff) values are calculated using a simple Langmuir model for one-plus-one binding (BIAcore Evaluation Software version 3.2) by simultaneously obtaining a sensorgram of association and dissociation.
  • the equilibrium dissociation constant (Kb) is calculated as the koff / kon ratio. See, for example, Chen, Y., et al. , (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881.
  • a spectrometer such as a stopped flow spectrophotometer (Aviv Instruments) or an SLM spectrophotometer Aminco (ThermoSpectronie) Series 8000 with stirring cuvette.
  • Koff refers to the dissociation rate constant of a particular interaction between a binding molecule and an antigen.
  • the dissociation rate constant koff can be measured by biolayer interferometry, for example using the Octet TM system.
  • the "oh-rate" or "cop” of the present invention can also be determined by the same surface plasmon resonance method described above on a BIAcore TM -2000 or BIAcore TM -3000 instrument (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ ) at 25 ° C using chips with immobilized CM5 antigen at ⁇ 10 relative units (response units, RU).
  • CM5 antigen at ⁇ 10 relative units (response units, RU).
  • carboxymethyldextran biosensor chips CM5, BIAcore Inc.
  • EDC -ethyl- '- (3-dimethylamino propyl) - carbodiimide hydrochloride
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the antigen is diluted with 10 mM sodium acetate, pH 4.8, to a concentration of 5 ⁇ g / ml ( ⁇ 0.2 ⁇ M), and then injected (injection) at a flow rate of 5 ⁇ l / minute until approximately 10 relative units (RU) of bound protein is reached. After the introduction of the antigen, 1 M ethanolamine solution is injected to block unreacted groups.
  • biologically active and biological activity and “biological characteristics”, with respect to a polypeptide of this invention, mean having the ability to bind to a biological molecule.
  • biological molecule refers to a nucleic acid, protein, carbohydrate, lipid, and combinations thereof. In one embodiment of the invention, the biological molecule exists in nature.
  • Antibody regions such as Fab and F (ab ') 2 fragments can be obtained from whole antibodies using conventional methods such as papain or pepsin digestion of whole antibodies. Moreover, antibodies, antibody portions, and immunoadhesion molecules can be produced using standard recombinant DNA techniques, for example, as described herein.
  • recombinant antibody means an antibody that is expressed in a cell or cell line containing a nucleotide sequence (nucleotide sequences) that encodes antibodies, and the specified nucleotide sequence (nucleotide sequences) is not associated with the cell in nature.
  • variant antibody refers to an antibody having an amino acid sequence that differs from the amino acid sequence of its "parent” antibody by adding, removing and / or replacing one or more amino acid residues relative to the sequence of the parent antibody.
  • the variant antibody comprises at least one or more (e.g., from one to twelve, such as two, three, four, five, six, seven, eight or nine, ten, eleven, or twelve; and in some embodiments, one to about ten) amino acid additions, deletions and / or substitutions relative to the parent antibody.
  • additions, deletions and / or substitutions are made at the CDRs of the variant antibody.
  • Identity or homology to the sequence of a variant antibody is defined herein as the percentage of amino acid residues in the sequence of a variant antibody that are identical to those of the parent antibody, after sequence alignment and gaps, if necessary, to achieve the maximum percentage sequence identity.
  • the variant antibody retains the ability to bind to the same antigen, and preferably an epitope, to which the parent antibody binds, and in some embodiments, at least one property or biological activity is superior to that of the parent antibody.
  • a variant antibody can have, for example, a higher binding affinity, a longer half-life, a lower IC50 value, or an increased ability to suppress the biological activity of an antigen compared to the parent antibody.
  • a variant antibody showing a biological activity that is at least 2 times (preferably at least 5 times, 10 times, or 20 times) the biological activity of the parent antibody.
  • bispecific antibody means an antibody containing an antigen-binding domain or antigen-binding domains that are capable of specifically binding to two different epitopes on one biological molecule or capable of specific binding to epitopes on two different biological molecules.
  • a bispecific antibody is also referred to herein as being “dual specific” or as being “dual specific”.
  • chimeric antibody refers broadly to an antibody that contains one or more regions from one antibody and one or more regions from one or more other antibodies, typically an antibody of partially human origin and partially non-human origin, i.e., obtained in part from a non-human animal such as a mouse, rat or other rodent or camelids such as a llama or alpaca. Chimeric antibodies are preferred over non-human antibodies in order to reduce the risk of an immune response directed against antibodies in humans, such as a response against murine antibodies in humans in the case of a murine antibody.
  • An example of a typical chimeric antibody is one in which the variable region sequences are murine while the constant region sequences are human.
  • the non-human portions can be further altered to humanize the antibody.
  • humanization refers to the fact that when an antibody is wholly or partially non-human, for example, a mouse or llama antibody obtained by immunizing mice or llamas, respectively, with an antigen of interest, or is a chimeric antibody based on such a mouse or llama antibody , it is possible to replace some amino acids, for example, in the framework regions and constant domains of the heavy and light chains, in order to avoid or minimize the immune response in humans.
  • the specificity of the interaction of an antibody with a target antigen is mainly inherent in amino acid residues located in the six CDRs of the heavy and light chains. Therefore, amino acid sequences within CDRs are much more variable between individual antibodies than sequences outside of CDRs.
  • non-human antibodies can be "humanized” and the binding specificity and affinity of the parent antibody can be largely preserved.
  • non-human antibodies are generally more immunogenic than human antibodies.
  • Chimeric antibodies in which foreign (eg, rodent or camel) constant regions have been replaced with sequences of human origin have shown generally lower immunogenicity than antibodies of completely foreign origin, and there is a tendency to use humanized or fully human antibodies in therapeutic antibodies.
  • Chimeric antibodies, or other antibodies of non-human origin can thus be humanized to reduce the risk of an immune response directed against the antibody in humans.
  • humanization usually involves the modification of the framework regions of the variable plot.
  • Amino acid residues that are part of the complementarity determining regions (CDRs) will most often not change due to humanization, although in some cases it may be desirable to alter individual amino acid residues of the CDR region, for example, to remove a glycosylation site. a deamidation site, an aspartate isomerization site, or an unwanted cysteine or methionine residue.
  • N-linked glycosylation occurs by the attachment of an oligosaccharide chain to an asparagine residue in the tripeptide sequence Asn-X-Ser or Asn-X-Thr, where X can be any amino acid other than Pro.
  • Removal of the N-glycosylation site can be achieved by mutating the Asn or Ser / Thr residue with another residue, preferably by conservative substitution.
  • Deamidation of asparagine and glutamine residues can occur depending on factors such as pH and surface exposure.
  • Asparagine residues are particularly susceptible to deamidation, especially if they are present in the Asn-Gly sequence, and to a lesser extent in other dipeptide sequences such as Asn-Ala. In the presence of such a deamidated region, for example Asn-Gly in the sequence of the CDR region, it may be preferable to remove this region, usually by conservative substitution to remove one of the residues involved.
  • CDR transplantation Numerous methods of humanizing an antibody sequence are known in the art.
  • CDR transplantation may be based on Rabat CDR determinations, although a later publication (Magdelaine-Beuzelin et al., Crit Rev. Oncol Hematol. 64: 210 225 (2007)) suggests that no IMGT® definition (the international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org) can improve humanization outcomes (see Lefranc et al., Dev. Comp Immunol. 27: 55-77 (2003)).
  • CDR transplantation can reduce the specificity and binding affinity, and hence biological activity, in the CDR of the transplanted non-human antibody, compared to the parent antibody from which the CDRs are derived.
  • Reverse mutations (sometimes referred to as "framework repair") can be used at selected CDR positions of the grafted antibody, usually in the framework regions, in order to restore the specificity and binding affinity of the parent antibody. Determination of positions for possible reverse mutations can be performed using information available in the literature and in antibody databases. Amino acid residues that are candidates for reverse mutations are usually located on the surface of the antibody molecule, while residues that are deepened or have a low degree of surface exposure are usually not will be subject to change.
  • the humanization method is a surface alteration in which non-human residues unexposed on the surface are retained, while the residues exposed on the surface are transformed into human residues.
  • naive and immune libraries are constructed using naturally rearranged genes encoding the variable domains of immunoglobulins of healthy donors or those immune to any antigen, respectively. For this, mRNA of lymphoid cells producing antibodies is isolated. Most often these are peripheral blood lymphocytes, but in some cases splenocytes are used [Sheets MD, Amersdorfer P, Finnern R, Sargent P, Lindquist E, Schier R, et al.
  • One or more primers can be used at once, limiting the set of amplified genes to one or more gene families of variable domains or antibody isotypes already at the cDNA level [Marks JD, Hoogenboom HR, Bonnert TP, McCafferty J, Griffiths AD, Winter G. Bypassing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol 1991,222: 581-597].
  • Primers used for amplification genes encoding immunoglobulins are complementary to their most conserved regions. Their sequences are selected from gene collections that are organized into databases such as the Rabat database or V BASE. The primer design also provides for the presence of internal restriction sites in them, which allow cloning of PCR products into the composition of the corresponding vectors.
  • Phage display is the first and most widely used in vitro technology for antibody detection.
  • Smith discovered that foreign DNA sequences can be cloned into filamentous bacteriophage M13 in such a way that the cloned gene sequences are expressed on the surface of phage particles as fusion proteins (Smith GP: Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface Science 1985,228: 1315-1317.).
  • Smith GP Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface Science 1985,228: 1315-1317.
  • the repertoire of phage libraries reflects the repertoire of B-lymphocyte antibodies of each person or animal whose blood was used to create the library.
  • mice that expressed fully human antibodies whose repertoire could be matched with hybridoma technology obtained (Lonberg N, Taylor LD, Harding FA, Trounstine M, Higgins KM, Schramm SR, Kuo CC, Mashayekh R, Wymore K, McCabe JG et al .: Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 1994, 368: 856-859) These animals have been deliberately disrupted the genes of their own endogenous heavy and light chains of immunoglobulins and introduced transgenes, which are segments of genes of heavy and light chains of a person.
  • transgenic mice express B-cell receptors, which are essentially hybrid of mouse and human (human immunoglobulin, mouse Ig, Irb and other signaling molecules), their B-cells develop and mature normally. In some cases, it may also be preferable to alter one or more amino acid residues of the CDR regions in order to increase the binding affinity for the target epitope.
  • affinity maturation This is known as “affinity maturation” and in some cases can be performed in connection with humanization, for example, in situations where the humanization of an antibody leads to a decrease in the specificity or affinity of binding, and it is not possible to sufficiently improve the specificity or affinity of binding with only reverse mutations.
  • Various methods of affinity maturation are known in the art, for example, the in vitro scanning saturation mutagenesis method described by Burks et al. , Proc Natl Acad Sci USA, 94: 412-417 (1997), and the stepwise in vitro affinity maturation method proposed by Wu et al. , Proc Natl Acad Sci USA 95: 6037 6042 (1998).
  • the term "monoclonal antibody” or "tAb” refers to an antibody that is synthesized and isolated by a separate clonal population of cells.
  • the clonal population can be a clonal population of immortalized cells.
  • the immortalized cells in the clonal population are hybrid cells, hybridomas, which are usually obtained by fusion of individual B lymphocytes from immunized animals with individual lymphocytic tumor cells. Hybridomas are a type of engineered cell and do not occur in nature.
  • “Native antibodies” are usually heterotetrameric glycoproteins with a molecular weight of about 150,000 daltons, composed of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains. Each light chain is linked to the heavy chain by one covalent disulfide bond, while the number of disulfide bonds between the heavy chains varies in different immunoglobulin isotypes. Each heavy and light chain also has evenly spaced intrachain disulfide bridges. Each heavy chain has a variable domain (VH) at one end, followed by several constant domains. Each light chain has a variable domain at one end (VL) and a constant domain at the other end. The light chain constant domain is aligned with the first heavy chain constant domain, and the light chain variable domain is aligned with the heavy chain variable domain. It is believed that particular amino acid residues form an interface between the light chain and heavy chain variable domains.
  • isolated means an antibody identified and isolated and / or regenerated from the cell or cell culture in which it is expressed. Impurities (polluting components) from the natural environment are materials that typically interfere with diagnostic or therapeutic uses for the polypeptide, and may include enzymes, hormones, and other proteinaceous or non-proteinaceous solutes.
  • the antibody is purified (1) to an extent sufficient to obtain at least 15 residues of the N-terminal or internal amino acid sequence using a rotating glass cup sequencer (Edman sequencer), or (2) to homogeneity by SDS-PAGE under non-reducing or reducing conditions using Coomassie brilliant blue or preferably silver staining.
  • Isolated antibody comprises antibodies in situ within recombinant cells since at least one component of the polypeptide's natural environment is absent.
  • an isolated polypeptide is obtained from at least one purification step.
  • nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule that has been identified and separated from at least one contaminant nucleic acid molecule with which it is normally associated in a natural source of antibody nucleic acid.
  • An isolated nucleic acid molecule differs from the form or set in which it naturally occurs. Thus, the isolated nucleic acid molecule differs from the nucleic acid molecule that exists naturally in cells.
  • an isolated nucleic acid molecule includes a nucleic acid molecule found in cells in which the antibody is normally expressed, for example, if the nucleic acid molecule has a different localization in the chromosome from its localization in cells in natural conditions.
  • epitope refers to a portion (determinant) of an antigen that specifically binds to a binding molecule (eg, and an antibody or related molecule such as a bispecific binding molecule).
  • Epitope determinants usually consist of chemically active surface groups of molecules such as amino acids or carbohydrates, or sugar side chains, and usually have specific three-dimensional structural characteristics as well as specific charge characteristics.
  • the epitope can be “linear” or “conformational. »In a linear epitope, all interaction points between a protein (eg antigen) and an interacting molecule (such as an antibody) occur linearly along the primary amino acid sequence of the protein.
  • a conformational epitope interaction points occur through amino acid residues on a protein that are separated from each other in the primary amino acid sequence.
  • antibodies to this epitope can be generated with using techniques well known in the art.
  • the generation and characterization of antibodies or other binding molecules can shed light on desired epitopes. Based on this information, you can then competitively screen binding molecules to bind to the same or similar epitopes, for example, by conducting competition studies to find binding molecules that compete for antigen binding.
  • peptide linker in this document means any peptide with the ability to connect domains with a length depending on the domains that it links to each other, containing any amino acid sequence.
  • the peptide linker is more than 5 amino acids in length and consists of any set of amino acids selected from G, A, S, P, E, T, D, K.
  • in vitro refers to a biological object, biological process or biological response outside the body, simulated under artificial conditions.
  • in vitro cell growth should be understood as the growth of cells in an environment outside the body, for example, in a test tube, culture flask or microplate.
  • the term “1C 5 o” refers to concentrations of the drug at which the measured activity or response, for example, the growth or proliferation of cells, such as tumor cells, is inhibited by 50%.
  • the IC50 value can be estimated using appropriate log dose response curves using special statistical programs for curve processing.
  • GI50 50% growth inhibition refers to drug concentrations at which the proliferation of cells, such as tumor cells, is inhibited by 50%.
  • ED50 50% effective dose / concentration refers to the concentrations of a drug at which a measurable biological effect is achieved by 50% (may include cytotoxicity).
  • antiproliferative action means stopping or inhibiting the growth of proliferating cells, such as cancer cells.
  • effector function of an antibody refers to biological activities associated with the Fc region (native Fc region sequence or amino acid sequence variants of the Fc region) of an antibody, and varies depending on the isotype of the antibody.
  • Examples of antibody effector functions are: C1 q - binding; complement dependent cytotoxicity; Fc receptor binding; antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC); phagocytosis; downward regulation of cell surface receptors (eg, B-cell receptor, BCR) and B-cell activation.
  • Antibody-dependent cellular cytotoxicity refers to a cell-mediated response in which nonspecific cytotoxic cells that express Fc receptors (FcRs) (eg, natural killer (NK) cells, neutrophils and macrophages) recognize the bound antibody on the target cell and then induce lysis or phagocytosis of the target cell.
  • FcRs Fc receptors
  • FcR expression on hematopoietic cells is summarized in Table 3 on page 464 in Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991).
  • ADCC activity of a molecule of interest can be assessed in vitro, for example, in an animal model, such as that described in Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • NK natural killer cells
  • Human effector cells are leukocytes that express one or more FcRs and perform effector functions. Preferably, the cells express at least FcyRIII and exercise ADCC effector function. Examples of human leukocytes that mediate ADCC include peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), natural killer (NK) cells, monocytes, cytotoxic T cells, and neutrophils; with PBMC and NK cells being preferred.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • NK natural killer cells
  • monocytes monocytes
  • cytotoxic T cells cytotoxic T cells
  • neutrophils neutrophils
  • the effector cells can be isolated from their natural source, such as blood or PBMC, as described in this publication.
  • Fc receptor and “FcR” are used to describe a receptor that binds to the Fc region of an antibody.
  • a preferred FcR is a native sequence human FcR.
  • a preferred FcR is an FcR that binds an IgG antibody (gamma receptor), and preferred receptors include those of the FcyRI, FcyRII and FcyRIII subclasses, including allelic variants and alternatively spliced forms of these receptors.
  • FcyRII receptors include FcyRI IA ("activating receptor") and FcyRI IB ("inhibitory receptor”), which have similar amino acid sequences that differ mainly in their cytoplasmic domains.
  • the activating receptor FcyRI IA contains in its cytoplasmic domain a tyrosine-based immunoreceptor activation motif (ITAM).
  • the inhibitory receptor FcyRI IB contains in its cytoplasmic domain based on tyrosine immunoreceptor inhibition motif (ITIM) (for a review see Baron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)).
  • ITIM tyrosine immunoreceptor inhibition motif
  • FcR is included in the present description in the term "FcR”.
  • FcR also includes the neonatal receptor, FcRn, which is responsible for the transfer of maternal IgG to the fetus.
  • Complement-dependent cytotoxicity and “SBS” refer to the ability of a molecule to lyse a target in the presence of complement.
  • the complement activation pathway is initiated by the binding of the first component of the complement system (Clq) to a molecule (eg, an antibody) in a complex with its antigen.
  • a SBS assay can be performed, for example, as described in Gazzano-Santoro et al. , J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).
  • identity should be construed to mean the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical to the residues of the corresponding sequence to which it is compared, after sequence comparison and gaps, if a maximum percentage of identity for the entire sequence is to be achieved, and disregarding any conservative substitutions as part of sequence identity. Neither the N- or C-terminal extension nor the insertional segments should be construed as diminishing identity or homology. Comparison methods and computer programs are well known. Sequence identity can be determined using sequence analysis software (eg, Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave., Madison, WI 53705). This software is suitable for such sequences by determining the degree of homology for a variety of substitutions, deletions (elimination) and other modifications.
  • sequence analysis software eg, Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave., Madison, WI 53705
  • the phrase "homologous" with respect to the polypeptide sequence of an antibody is to be construed as an antibody exhibiting at least 70%, preferably 80%, more preferably 90% and most preferably 95% sequence identity relative to the polypeptide sequence.
  • the term in relation to a nucleic acid sequence is to be construed as a sequence of nucleotides exhibiting at least 85%, preferably 90%, more preferably 95% and most preferably 97% sequence identity with respect to the nucleic acid sequence.
  • Modification (s) of the amino acid sequences of the antibodies described in this publication are provided. For example, it may be desirable to improve the binding affinity and / or other biological properties of the antibody.
  • Amino acid sequence variants of an antibody are prepared by introducing appropriate nucleotide changes into the antibody nucleic acid or by peptide synthesis. Such modifications include, for example, deletions and / or insertions and / or substitutions of residues in the amino acid sequences of the antibody. Any combination of deletion, insertion and substitution is performed to obtain the final construct, provided that the final construct has the desired characteristics. Changes in amino acids can also alter post-translational processes in the antibody, such as altering the number or position of glycosylation sites.
  • a variant of modifying the amino acid sequences of antibodies using amino acid substitutions is the replacement of at least one amino acid residue in the antibody molecule with another residue.
  • Sites of greatest interest for mutagenesis by substitutions include hypervariable regions or CDRs, but changes in the FR or Fc region are also contemplated.
  • Conservative substitutions are shown in Table A under the heading “preferred substitutions”. If such substitutions result in a change in biological activity, then additional significant changes, referred to as "examples of substitutions" in Table A, or changes further described below in the description of amino acid classes, can be introduced, and products can be screened.
  • nucleic acid denotes a clear sequence of nucleotides, modified or not modified, defining a fragment or region of nucleic acid, containing or not containing unnatural nucleotides and being either double-stranded DNA or RNA, or single-stranded DNA or RNA, or transcription products of said DNA.
  • this invention does not relate to nucleotide sequences in their natural chromosomal environment, i.e. in a natural state.
  • the sequences of the present invention have been isolated and / or purified, i. E. were taken directly or indirectly, for example by copying, and their environment was at least partially modified.
  • isolated nucleic acids obtained by genetic recombination, for example, using host cells (host cells), or obtained by chemical synthesis.
  • nucleotide sequence covers its compliment, unless otherwise indicated.
  • reference to a nucleic acid having a defined sequence is to be understood as encompassing its complementary strand with its complementary sequence.
  • control sequences refers to DNA sequences necessary for the expression of an operably linked coding sequence in a particular host organism.
  • Suitable prokaryotic control sequences are, for example, a promoter, optionally an operator, and a ribosome binding site. It is known that eukaryotic cells contain promoters, polyadenylation signals, and enhancers.
  • a nucleic acid is “operably linked” if it is in a functional relationship with another nucleotide sequence.
  • DNA of a presequence or secretory leader is operably linked to DNA of a polypeptide if it is expressed as a preprotein that participates in the secretion of the polypeptide;
  • a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosome binding site is operably linked to a coding sequence if located so that it can facilitate translation.
  • "operably linked” means that the linked DNA sequences are contiguous, and in the case of a secretory leader sequence, are contiguous and in readout phase. However, enhancers do not have to be contiguous.
  • vector means a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it is linked.
  • the vector is a plasmid, i. e. a circular double-stranded portion of DNA into which additional DNA segments can be ligated.
  • the vector is a viral vector in which additional DNA segments can be ligated into the viral genome.
  • vectors are capable of autonomous replication in the host cell into which they are introduced (eg, bacterial vectors having a bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors).
  • vectors eg, non-episomal mammalian vectors
  • vectors can be integrated into the genome of a host cell upon introduction into a host cell, and thus replicate with the host genome.
  • some vectors are capable of directing the expression of genes to which they are operably linked. Such vectors are referred to herein as “recombinant expression vectors” (or simply “expression vectors”).
  • recombinant host cell means a cell into which a recombinant expression vector has been introduced.
  • the present invention relates to host cells, which may include, for example, a vector in accordance with the present invention described above.
  • the present invention also relates to host cells, which include, for example, a nucleotide sequence encoding a heavy chain or antigen-binding portions thereof, a nucleotide sequence encoding a light chain or antigen-binding portions thereof, or both of a first binding domain and / or a second binding domain binding molecule according to this invention.
  • excipient is used herein to describe any ingredient other than the compound (s) of this invention.
  • GITR disease or disorder mediated by GITR
  • diseases or disorders that are either directly or indirectly related to GITR, including the etiology, development, progression, persistence, or pathology of the disease or disorder.
  • Treatment refers to a method of alleviating or eliminating a biological disorder and / or at least one of its accompanying symptoms.
  • Alleviate a disease, disease or condition means reducing the severity and / or frequency of the symptoms of a disease, disorder or condition.
  • references herein to “treatment” include references to curative, palliative and prophylactic therapy.
  • the subject of treatment or patient is a mammal, preferably a human subject.
  • the aforementioned subject can be male or female of any age.
  • disorder means any condition that can be improved by the treatment of the present invention.
  • the definition of this term includes chronic and acute disorders or diseases, including pathological conditions that predispose a mammal to the occurrence of this disorder.
  • cancer refers to a physiological state or describe a physiological state in mammals that is typically characterized by unregulated cell growth / proliferation. This definition covers benign and malignant cancers. Examples of cancers include, but are not limited to, carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma, and leukemia.
  • cancers include squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, adenocarcinoma of the lung, squamous cell lung carcinoma, peritoneal cancer, hepatocellular carcinoma, stomach cancer including gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, glioma, cervical cancer, cancer ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, carcinoma of the endometrium and uterus, carcinoma of the salivary glands, kidney cancer (renal cell carcinoma), prostate cancer (prostate cancer), cancer of the external female genital organs, thyroid cancer, hepatic carcinoma, anal carcinoma, penile carcinoma, melanoma, and various types of head and neck cancer.
  • stomach cancer including gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, glioma, cervical cancer, cancer ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, carcinoma of the endometrium and uterus
  • immune response refers, for example, to the action of lymphocytes, antigen-presenting cells, phagocytic cells, granulocytes, and soluble macromolecules produced by said cells or liver cells (including antibodies, cytokines and complement, resulting from the selective damage, destruction or elimination from the human body of invasive pathogens, cells or tissues infected with pathogens, cancer cells or, in cases of autoimmunity or pathological inflammation, normal human cells or tissues).
  • a “therapeutically effective amount” is defined as the amount of therapeutic agent administered during treatment, which will relieve to a certain extent one or more symptoms of the disease for which treatment is being carried out.
  • chromenic use refers to the continuous (prolonged) use of the agent (s) as opposed to the acute (short-term) route of administration, so as to maintain the initial therapeutic effect (activity) over an extended period of time.
  • Intermittent use means a treatment that is not administered sequentially without interruptions, but which is rather intermittent in nature.
  • the present invention relates to a monoclonal antibody that specifically binds to GITR.
  • the present invention provides a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to GITR, comprising:
  • NYGMH (SEQ ID NO: 1) or YYWMY (SEQ ID NO: 12);
  • VIWFDGSNKFYTDSVKG (SEQ ID NO: 2) or AISWNGGRTYYAESMKG (SEQ ID NO: 13);
  • RASQSIGSWLA SEQ ID NO: 7
  • TGTSTDIGTYKYIS SEQ ID NO: 8
  • QQSHSHPLT (SEQ ID NO: 9) or SSYTSSGTW (SEQ ID NO: 19).
  • the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that contains CDRs 1, 2, and 3 with the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, respectively.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that contains CDRs 1, 2, and 3 with the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 12, 13, and 14, respectively.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a light chain variable domain that contains CDRs 1, 2, and 3 with the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 7, 8, and 9, respectively.
  • the monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof comprises a light chain variable domain that contains CDRs 1, 2, and 3 with the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 17, 18, and 19, respectively.
  • the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof comprises:
  • variable domain of the heavy chain which contains CDRs 1, 2 and 3 with amino acid sequences represented by the sequences of SEQ ID NO: 1, 2 and 3, respectively;
  • variable domain of the light chain which contains CDRs 1, 2 and 3 with the amino acid sequences represented by the sequences of SEQ ID NO: 7, 8 and 9, respectively.
  • the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof comprises:
  • variable domain of the heavy chain which contains CDRs 1, 2 and 3 with the amino acid sequences represented by the sequences of SEQ ID NO: 12, 13 and 14, respectively;
  • variable domain of the light chain which contains CDRs 1, 2 and 3 with the amino acid sequences represented by the sequences of SEQ ID NO: 17, 18 and 19, respectively.
  • the monoclonal antibody or antigen binding fragment includes a heavy chain variable domain which comprises an amino acid sequence at least 90% homologous to the amino acid sequence EVQLVQSGGGWQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSV KGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTV SS (SEQ ID NO: 4).
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that contains the amino acid sequence
  • the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that contains an amino acid sequence that is at least 90% homologous to an amino acid sequence
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that contains the amino acid sequence
  • the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof comprises a light chain variable domain that contains an amino acid sequence that is at least 90% homologous to an amino acid sequence
  • the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof comprises a light chain variable domain that contains the amino acid sequence DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQS IGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSG GGYGTEFTLTISSPLQFQGHSH
  • the monoclonal antibody, or antigen binding fragment thereof comprises a light chain variable domain that contains an amino acid sequence at least 90% homologous to the amino acid sequence QSALTQPASVSGSPGQS ITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLI IYGVSFLISGTSGVSDN
  • the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof comprises a light chain variable domain that contains the amino acid sequence QSALTQPASVSGSPGQS ITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLI IYGVSHRPSGVSDRF SGSKSDNTASLEDGTSGLL
  • the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof comprises:
  • variable domain of a heavy chain that contains an amino acid sequence that is at least 90% homologous to an amino acid sequence EVQLVQSGGGWQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSV KGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGTM NOVWG 4;
  • light chain variable domain that contains an amino acid sequence that is at least 90% homologous to an amino acid sequence
  • the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof comprises:
  • the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof comprises:
  • variable domain of a heavy chain that contains an amino acid sequence that is at least 90% homologous to an amino acid sequence
  • light chain variable domain that contains an amino acid sequence that is at least 90% homologous to an amino acid sequence
  • the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof comprises:
  • the GITR specific monoclonal antibody is a full length IgG antibody.
  • the IgG monoclonal antibody is of the human IgGl, IgG2, IgG3, or IgG4 isotype.
  • the IgG monoclonal antibody is of the human IgG1 isotype.
  • the monoclonal antibody specific for GITR comprises an E345R mutation in the Fc fragment to increase agonistic properties, antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC), but not complement dependent cytotoxicity (CDC).
  • ADCC antibody dependent cellular cytotoxicity
  • CDC complement dependent cytotoxicity
  • the monoclonal antibody comprises a heavy chain having an amino acid sequence that is at least 90% sequence homologous
  • the monoclonal antibody comprises a heavy chain comprising the amino acid sequence
  • the monoclonal antibody comprises a heavy chain having an amino acid sequence that is at least 90% sequence homologous
  • the monoclonal antibody comprises a heavy chain comprising the amino acid sequence
  • the monoclonal antibody comprises a light chain comprising an amino acid sequence that is at least 90% sequence homologous
  • the monoclonal antibody comprises a light chain comprising the amino acid sequence
  • the monoclonal antibody comprises:
  • the monoclonal antibody that specifically binds to GITR is BCD166-01-001.
  • Monoclonal antibody BCD166-01-001 includes:
  • a heavy chain comprising the amino acid sequence EVQLVQSGGGWQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSV KGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF
  • a light chain comprising the amino acid sequence DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSG GGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 11).
  • the monoclonal antibody comprises:
  • the monoclonal antibody that specifically binds to GITR is BCD166-02-001.
  • BCD166-02-001 differs from BCD166-01-001 by one mutation E345R in the Fc fragment to increase agonistic properties, antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC), but not complement dependent cytotoxicity (CDC).
  • ADCC antibody dependent cellular cytotoxicity
  • CDC complement dependent cytotoxicity
  • Monoclonal antibody BCD166-02-001 includes:
  • a heavy chain comprising the amino acid sequence EVQLVQSGGGWQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSV KGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRRPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF
  • the monoclonal antibody comprises a heavy chain containing an amino acid sequence that is at least 90% sequence homologous
  • the monoclonal antibody comprises a heavy chain comprising the amino acid sequence
  • the monoclonal antibody comprises a light chain comprising an amino acid sequence that is at least 90% sequence homologous
  • the monoclonal antibody comprises a light chain comprising the amino acid sequence
  • the monoclonal antibody comprises:
  • the monoclonal antibody that specifically binds to GITR is BCD166-01-014.
  • Monoclonal antibody BCD166-01-014 includes:
  • the present invention also relates to nucleic acid molecules, namely, sequences encoding a monoclonal antibody that specifically binds to GITR of this invention, as described herein, optionally including any peptide linker sequence connecting them.
  • nucleotide sequence covers its compliment unless otherwise indicated.
  • reference to a nucleic acid having a specific sequence is to be understood as encompassing its complementary strand with its complementary sequence.
  • polynucleotide means a polymeric form of nucleotides at least 10 bases in length, either ribonucleotides or deoxynucleotides, or a modified form of any type of nucleotide. The term includes single and double stranded forms.
  • the present invention relates to a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1-21.
  • a nucleic acid molecule can also contain any combination of the indicated nucleotide sequences.
  • the present invention provides a nucleic acid that contains a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to GITR, and includes:
  • NYGMH (SEQ ID NO: 1) or YYWMY (SEQ ID NO: 12);
  • VIWFDGSNKFYTDSVKG (SEQ ID NO: 2) or AISWNGGRTYYAESMKG (SEQ ID NO: 13);
  • RASQSIGSWLA SEQ ID NO: 7
  • TGTSTDIGTYKYIS SEQ ID NO: 8
  • AASTLQR (SEQ ID NO: 8) or GVSHRPS (SEQ ID NO: 18);
  • QQSHSHPLT (SEQ ID NO: 9) or SSYTSSGTW (SEQ ID NO: 19).
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof, which includes a heavy chain variable domain that contains CDRs 1, 2, and 3 with the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, respectively.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof, which includes a heavy chain variable domain that contains CDRs 1, 2, and 3 with amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 12, 13, and 14, respectively.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof, which includes a light chain variable domain that contains CDRs 1, 2, and 3 with the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 7, 8, and 9, respectively.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes variants of a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof, which includes a light chain variable domain that contains CDRs 1, 2, and 3 with amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 17, 18, and 19 , respectively.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof, which includes:
  • variable domain of the heavy chain which contains CDRs 1, 2 and 3 with amino acid sequences represented by the sequences of SEQ ID NO: 1, 2 and 3, respectively;
  • variable domain of the light chain which contains CDRs 1, 2 and 3 with the amino acid sequences represented by the sequences of SEQ ID NO: 7, 8 and 9, respectively.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof, which includes:
  • variable domain of the heavy chain which contains CDRs 1, 2 and 3 with the amino acid sequences represented by the sequences of SEQ ID NO: 12, 13 and 14, respectively;
  • variable domain of the light chain which contains CDRs 1, 2 and 3 with the amino acid sequences represented by the sequences of SEQ ID NO: 17, 18 and 19, respectively.
  • the nucleic acid molecule contains a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof, which includes a heavy chain variable domain that contains an amino acid sequence that is at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof, that includes a heavy chain variable domain that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof, that includes a heavy chain variable domain that contains an amino acid a sequence at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof, which includes a heavy chain variable domain that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15.
  • the nucleic acid molecule contains a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof, which includes a light chain variable domain that contains an amino acid sequence that is at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof, that includes a light chain variable domain that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof, that includes a light chain variable domain that contains an amino acid sequence that is at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that includes a light chain variable domain that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof, which includes:
  • variable domain of the heavy chain which contains an amino acid sequence at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
  • a light chain variable domain that contains an amino acid sequence that is at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof, which includes:
  • variable domain of the heavy chain that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof, which includes:
  • variable domain of a heavy chain which contains an amino acid sequence at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15;
  • a light chain variable domain that contains an amino acid sequence that is at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof, which includes:
  • variable domain of the heavy chain that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15;
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody that specifically binds to GITR, which is a full length IgG antibody.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes an IgG monoclonal antibody that is of the human IgGl, IgG2, IgG3, or IgG4 isotype.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes an IgG monoclonal antibody that is of the human IgGl isotype.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody that specifically binds to GITR, which includes an E345R mutation in the Fc fragment to increase agonistic properties, antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC), but not complement dependent cytotoxicity (CDC).
  • ADCC antibody dependent cellular cytotoxicity
  • CDC complement dependent cytotoxicity
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody that includes a heavy chain having an amino acid sequence that is at least 90% homologous to SEQ ID NO: 5.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody that includes a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody that includes a heavy chain containing an amino acid sequence at least 90% homologous to the sequence SEQ ID NO: b.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody that includes a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: b.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody that includes a light chain having an amino acid sequence that is at least 90% homologous to SEQ ID NO: 11.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody that includes a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody that includes:
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody that includes:
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody that includes:
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody that includes:
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody that includes a heavy chain having an amino acid sequence that is at least 90% homologous to SEQ ID NO: 16.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody that includes a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody that includes a light chain having an amino acid sequence that is at least 90% homologous to SEQ ID NO: 21.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody that includes a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody that includes:
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a monoclonal antibody that includes:
  • the nucleic acid is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoe
  • the nucleic acid molecules can be isolated.
  • nucleic acid molecule of this invention can be isolated from any source that produces a monoclonal antibody that specifically binds to GITR. In certain embodiments of the invention, the nucleic acid molecule of this invention can be synthesized rather than isolated. In one embodiment, nucleic acid molecules encoding VH (SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 15) or VL (SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 20) domains are converted to full length antibody genes by insertion into an expression vector already encoding heavy chain (CH) or light chain (CL) constant domains, respectively, such that the VH segment is operably linked to the CH segment (s) in the vector and / or the VL segment is operatively linked to the CL segment in the vector.
  • VH SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 15
  • VL SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 20 domains
  • nucleic acid molecules encoding VH and / or VL domains are converted to genes along the entire length of the antibody by linking, for example, ligating, a nucleic acid molecule encoding VH and / or VL domains to a nucleic acid molecule encoding CH and / or CL domains using standard molecular biology techniques. Nucleic acid molecules encoding the entire length of the heavy and / or light chain can then be expressed from the cell into which they were introduced.
  • Nucleic acid molecules can be used to express a large amount of recombinant monoclonal antibody that specifically binds to GITR.
  • the present invention provides a vector suitable for expressing any of the nucleotide sequences described herein.
  • the present invention relates to vectors containing nucleic acid molecules that encode any of the amino acid sequences of a monoclonal antibody that specifically binds to GITR, or parts thereof (e.g., heavy chain sequences of the first and / or heavy and / or light chain of the second binding domains) as described in this document.
  • the present invention further relates to vectors containing nucleic acid molecules encoding fusion proteins, modified antibodies, antibody fragments.
  • a monoclonal antibody that specifically binds to GITR of this invention is expressed by inserting DNA encoding part or all of the sequence of the first and second binding domain (e.g., heavy and light chain sequences, where the binding domain contains heavy and light sequences chains), obtained as described above, in expression vectors in such a way that the genes are operably linked to the necessary control sequences expression such as transcriptional and translational control sequences.
  • Expression vectors include plasmids, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses (AAV), plant viruses such as cauliflower mosaic virus, tobacco mosaic viruses, cosmids, YACs, EBV derived episomes, and the like.
  • DNA molecules can be ligated into a vector such that the sequences that control transcription and translation in the vector perform their intended function of regulating DNA transcription and translation.
  • the expression vector and expression control sequences can be selected to be compatible with the expression host cell used.
  • DNA molecules encoding part or all of the sequences of the first and second binding domains eg, heavy and light chain sequences, where the binding domain contains the sequence of the heavy and light chain
  • DNA molecules can be introduced into separate vectors. In one embodiment, any combination of the above DNA molecules is introduced into the same expression vector.
  • DNA molecules can be introduced into the expression vector by standard methods (for example, ligation of complementary restriction sites on the fragment of the antibody gene and the vector, or blunt-end ligation if there are no restriction sites).
  • a suitable vector is one that encodes functionally complete human immunoglobulin CH or CL sequences with appropriate restriction site construction such that any VH or VL sequence can be readily incorporated and expressed as described above.
  • HC- and LC-coding of genes in such vectors may contain intron sequences, which leads to an overall increase in antibody protein products by stabilizing the corresponding mRNA.
  • Intron sequences are surrounded by splice donor and splice acceptor sites that determine where RNA splicing will take place.
  • the location of intron sequences can be either in the variable or constant regions of the antibody chains, or in both variable and constant regions when multiple introns are used. Termination of polyadenylation and transcription can occur downstream of the native chromosome site of the encoded regions.
  • the recombinant expression vector can also encode a signal peptide that facilitates the production of an antibody chain by a host cell.
  • the antibody chain gene can be cloned into a vector such that the signal peptide is linked to the reading frame of the amino terminus of the immunoglobulin chain.
  • the signal peptide can be an immunoglobulin signal peptide or a heterologous signal peptide (ie, a signal peptide of a non-immunoglobulin protein).
  • the recombinant expression vectors of the invention may carry regulatory sequences that control the expression of the antibody chain genes in the host cell.
  • mammalian host cell expression control sequences include viral elements for high expression of proteins in mammalian cells, such as promoters and / or enhancers derived from retroviral LTR, cytomegalovirus (CMV) (e.g., CMV promoter / enhancer), simian virus 40 (SV40) (e.g.
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 simian virus 40
  • SV40 promoter / enhancer adenovirus (e.g., adenovirus large late promoter (AdMLP)), polyoma virus, and strong mammalian promoters such as the native immunoglobulin promoter or actin promoter.
  • AdMLP adenovirus large late promoter
  • strong mammalian promoters such as the native immunoglobulin promoter or actin promoter.
  • the recombinant expression vectors of the invention may carry additional sequences, such as sequences that regulate replication of the vector in host cells (eg, origin of replication) and selectable marker genes.
  • the selectable marker gene facilitates the selection of host cells into which the vector has been introduced (see, for example, US patents 4,399,216, 4,634,665 and 5,179,017).
  • typically a selectable marker gene confers resistance to drugs such as G418, hygromycin or methotrexate to the host cell into which the vector has been introduced.
  • selectable marker genes include a dihydrofolate reductase (DHFR) gene (for use in dhfr host cells for methotrexate selection / amplification), a neo gene (for G418 selection), and a glutamate synthetase gene.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • neo for G418 selection
  • glutamate synthetase gene glutamate synthetase gene
  • expression control sequence means polynucleotide sequences that are required to influence the expression and processing of the coding sequences to which they are ligated.
  • Expression Control Sequences include the corresponding sequences of transcription initiation, termination, promoter and enhancer; efficient RNA processing signals such as splicing and polyadenylation signals; sequences that stabilize cytoplasmic mRNA; sequences that enhance translation efficiency (i.e., Kozak consensus sequence); sequences that increase protein stability; and, if desired, sequences that enhance protein secretion.
  • control sequences differs depending on the host organism; in prokaryotes, such control sequences typically include a promoter, a ribosome binding site, and transcription termination sequences; in eukaryotes, such control sequences generally include promoters and transcription termination sequences.
  • control sequences includes at least all components that are essential for expression and processing, and may also include additional components whose presence is useful, for example, leader sequences and fusion cell sequences.
  • An additional aspect of the present invention relates to methods for producing a monoclonal antibody that specifically binds to GITR according to this invention.
  • One embodiment of the invention relates to a method for producing a monoclonal antibody that specifically binds to GITR as defined herein, comprising obtaining a recombinant host cell capable of expressing a monoclonal antibody that specifically binds to GITR, culturing said host cell under conditions suitable for expressing the production of a monoclonal antibody that specifically binds to GITR, and isolating the resulting monoclonal antibody that specifically binds to GITR.
  • a monoclonal antibody that specifically binds to GITR obtained by such expression in such recombinant host cells is referred to herein as a “recombinant monoclonal antibody that specifically binds to GITR”.
  • the invention also relates to the progeny of the cells of such host cells and a monoclonal antibody that specifically binds to GITR prepared in a similar manner.
  • Nucleic acid molecules encoding a monoclonal antibody that specifically binds to GITR according to the invention and vectors containing these nucleic acid molecules can be used to transfect a suitable mammal or its cell, plant or cell, bacterial or yeast host cells. Conversion can occur by any known method for introducing polynucleotides into a host cell. Methods for introducing heterologous polynucleotides into mammalian cells are well known in the art and include dextran-mediated transfection, nucleic acid-positively charged polymer complex transfection, nucleic acid calcium phosphate precipitate transfection, polybrene-mediated transfection, protoplast fusion, and lipid encapsulation transfection. direct microinjection of DNA into the nucleus.
  • nucleic acid molecules can be introduced into mammalian cells by viral vectors.
  • Methods for transfecting cells are well known in the art. See, for example, U.S. Patent Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, and 4,959,455.
  • Methods for transforming plant cells are well known in the art, including, for example, Agrobacterium-mediated transformation, biolistic transformation, direct injection, electroporation, and viral transformation. Methods for transforming bacterial and yeast cells are also well known in the art.
  • Mammalian cell lines used as hosts for transformation are well known in the art and include many immortalized cell lines available. These include, for example, Chinese hamster ovary (CHO) cells, NS0 cells, SP2 cells, HEK-293T cells, 293 Freestyle cells (Invitrogen), NIH-3T3 cells, HeLa cells, hamster kidney cells (BHK), African kidney cells green monkeys (COS), human hepatocellular carcinoma cells (eg, Hep G2), A549 cells and a number of other cell lines. Cell lines are selected by determining which cell lines have high levels of expression and provide the desired characteristics of the produced protein. Other cell lines that can be used are insect cell lines such as Sf9 or Sf21 cells.
  • the antibodies When recombinant expression vectors encoding a monoclonal antibody that specifically binds to GITR are introduced into mammalian host cells, the antibodies are produced by culturing the host cells for a time sufficient to express the antibodies in the host cells, or, more preferably, isolate the antibodies into a culture medium. in which host cells are grown.
  • a monoclonal antibody that specifically binds to GITR can be isolated from culture media using standard protein purification techniques.
  • Plant host cells for example, include Nicotiana, Arabidopsis, duckweed, corn, wheat, potatoes, etc.
  • Host bacterial cells include Escherichia and Streptomyces species.
  • Yeast host cells include Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, and Pichia pastoris.
  • the level of production of a monoclonal antibody that specifically binds to GITR of the present invention from a producing cell line can be enhanced by a number of known techniques.
  • the glutamine synthetase gene expression system (GS system) is widespread enough to enhance expression under certain conditions.
  • the GS system is discussed in whole or in part in connection with EP 0216846, 0256055, 0323997 and 0338841.
  • a monoclonal antibody that specifically binds to GITR from different cell lines or transgenic animals will differ in glycosylation profile.
  • a monoclonal antibody that specifically binds to GITR, encoded by the nucleic acid molecules described herein, or containing the amino acid sequences described herein are part of this invention, regardless of the glycosylation state of the binding molecules and in general, regardless of the presence or absence of post-translational modifications.
  • the invention also relates to methods and processes for producing a monoclonal antibody that specifically binds to GITR and antigen binding fragments thereof.
  • Monoclonal antibodies can be generated, for example, using the hybridoma-based method first described by Kohler et al. , Nature, 256, 1975, pp. 495, or using recombinant DNA techniques (US 4816567).
  • lymphocytes When using the hybridoma method, a mouse or other suitable host animal, such as a hamster, is immunized as described above in order to induce the formation of lymphocytes that produce, or can produce, antibodies capable of specifically binding to the protein used for immunization.
  • lymphocytes can be obtained by in vitro immunization. After immunization, lymphocytes are isolated and then fused with a myeloma cell line using a suitable binding agent such as polyethylene glycol to obtain a hybridoma cell.
  • the hybridoma cells thus obtained are seeded and grown in a suitable culture medium, which preferably contains one or more substances that inhibit the growth or survival of non-fused parental myeloma cells.
  • a suitable culture medium which preferably contains one or more substances that inhibit the growth or survival of non-fused parental myeloma cells.
  • the parental myeloma cells do not contain the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT or HPRT)
  • HGPRT or HPRT hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase
  • HGPRT hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase
  • HAT medium hypoxanthine, aminopterin and thymidine
  • Preferred myeloma cells as a fusion component are cells that readily fuse, maintain a stable high level of antibody production by the selected antibody-producing cells, and are sensitive to a selective environment in which unbound parental cells are selected.
  • Preferred myeloma cell lines are murine myeloma lines, such as those derived from the murine tumor cell lines MOPC-21 and MPC-11, available from the Salk Institite Cell Disrtibution Center, San Diego, NY. California, USA, and lines SP-2 or HBZ-Ad8-653, available from the American Type Culture Collection, Rockville, CA. Maryland, USA.
  • the use of human myeloma and mouse-human heteromyeloma cell lines for the production of monoclonal antibodies has also been described (Kozbor, J. Immunol., 133, 1984, p. 3001).
  • the binding specificity of monoclonal antibodies obtained using hybridoma cells is determined by immunoprecipitation or by an in vitro binding assay such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • an in vitro binding assay such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • the binding affinity of the monoclonal antibody can, for example, be determined using the Scatchard assay described by Munson et al. , Anal. Biochem., 107, 1980, p. 220.
  • the clones can be subcloned using the limiting dilution method and grown by standard methods. Suitable media for this purpose include, for example, DMEM or RPMI-1640 media.
  • hydriboma cells can be grown in vivo as ascites tumors in animals, for example, by intraperitoneal (i.p.) injection of cells into mice.
  • Monoclonal antibodies secreted by subclones can be separated from the culture medium, ascites fluid or serum using conventional antibody purification methods, for example, affinity chromatography (for example, using protein A or protein Q-sepharose), or ion exchange chromatography, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, etc.
  • affinity chromatography for example, using protein A or protein Q-sepharose
  • ion exchange chromatography for example, using protein A or protein Q-sepharose
  • hydroxylapatite chromatography hydroxylapatite chromatography
  • gel electrophoresis dialysis, etc.
  • DNA encoding monoclonal antibodies can be easily isolated and sequenced using conventional procedures (for example, using oligonucleotide probes that have the ability to specifically bind to genes encoding heavy and light chains of murine antibodies).
  • Hybridoma cells are a preferred source of such DNA.
  • the DNA can be incorporated into expression vectors, which are then transfected into host cells such as E. coli cells, monkey COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, or myeloma cells that do not produce antibody protein without transfection, resulting in synthesis of monoclonal antibodies in recombinant host cells.
  • monoclonal antibodies or antibody fragments can be isolated from phage antibody libraries created using the methods described by McCafferty et al. , Nature, 348, 1990, pp. 552-554. Clackson et al. , Nature, 352, 1991, pp. 624-628 and Marks et al. , J. Mol. Biol., 222, 1991, pp. 581-597 describe the isolation of murine and human antibodies, respectively, using phage libraries. Subsequent publications have described the production of high affinity (nM-range) human antibodies by chain shuffling (Marks et al., Bio / Technology, 10, 1992, pp.
  • the DNA encoding the antibody can also be modified, for example to produce chimeric or fusion antibody polypeptides, for example, by replacing the heavy and light chain constant region sequences (CH and CL) with homologous murine sequences (US Pat. No. 4,816,567 and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81, 1984, p. 6851) or by covalently linking an immunoglobulin coding sequence to all or part of the coding sequence of a non-immunoglobulin polypeptide (heterologous polypeptide).
  • CH and CL heavy and light chain constant region sequences
  • homologous murine sequences US Pat. No. 4,816,567 and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81, 1984, p. 6851
  • Non-immunoglobulin polypeptide sequences can be substituted for antibody constant regions or substituted for variable regions of an antibody antigen-binding site to create a chimeric bivalent antibody that contains one antigen-binding site with specificity for an antigen and another antigen-binding site with specificity for another.
  • transgenic animals for example, mice
  • transgenic animals for example, mice
  • DNA segment antibody heavy chain gene junction
  • transfer of a human immunoglobulin gene germline kit into such a mutant mouse germline results in the production of human antibodies after challenge with the antigen (US 5545806, 5569825, 5591669 (all in the name of GenPharm); 5545807; and WO 97/17852).
  • phage display technology can be used to obtain human antibodies and antibody fragments in vitro from the immunoglobulin variable region (V) genes spectrum from immunized donors (McCafferty et al., Nature, 348, 1990, pp. 552-553).
  • V region genes are cloned in frame with either the major or minor coat protein gene of a filamentous bacteriophage, such as M13 or fd, and presented as functional antibody fragments on the phage particle surface. Since the filamentous particle contains a copy of the single-stranded DNA of the phage genome, selection based on the functional properties of the antibody also leads to the selection of the gene encoding the antibody that has these properties.
  • the phage mimics some of the properties of the B cell.
  • Phage presentation can be done in a variety of formats.
  • Various sources of V gene segments can be used for phage presentation. Clackson and others. , Nature, 352, 1991, pp. 624-628 isolated various sets of anti-oxazolone antibodies from a small random combinatorial V-gene library obtained from the spleen of immunized mice.
  • a spectrum of V genes obtained from immunized human donors can be constructed, and antibodies to a different set of antigens (including autoantigens) can be isolated generally according to the methods described by Marks et al. , J. Mol. Biol., 222, 1991, pp. 581-597.
  • human antibodies can also be produced in vitro by activated B cells (see US Pat. No. 5,567,610 and 5,229,275).
  • fragments of antibodies rather than full antibodies.
  • the smaller size of the fragments facilitates their rapid clearance and may facilitate better penetration into solid tumors.
  • antibody fragments Traditionally, these fragments were obtained by proteolytic cleavage of intact antibodies. However, at present, these fragments can be obtained directly using recombinant host cells. Fab, Fv and scFv antibody fragments can be expressed and secreted from E. coli to facilitate the production of large quantities of these fragments. Antibody fragments can be isolated from the antibody phage libraries described above. In another embodiment, Fab 'SH fragments can be directly isolated from E. coli and chemically ligated to generate F (ab') 2 fragments (Carter et al., Bio / Technology, 10, 1992, pp. 163-167).
  • F (ab ') 2 fragments can be isolated directly from the culture of the recombinant host cells.
  • Fab and F (ab ') 2 fragments with increased in vivo half-lives, in which epitope-binding receptor residues are retained, are described in US Pat. No. 5,869,046.
  • Other techniques for preparing antibody fragments will be apparent to those skilled in the art.
  • the antibody of choice is a single chain Fv fragment (scFv) (see WO 93/16185; US 5571894 and US 5587458).
  • scFv single chain Fv fragment
  • Fv and scFv are the only species with intact binding sites devoid of constant regions; as a result, they can be used for reduced non-specific binding when used in vivo.
  • Fusion proteins carrying scFvs can be engineered to produce an effector protein fusion at either the N- or C-terminus of the scFv.
  • An antibody fragment can also be a "linear antibody", for example, as described in US Pat. No. 5,641,870. Such linear antibody fragments can be monospecific or bispecific.
  • Another aspect of the invention is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient (or as the only active ingredient), a monoclonal antibody that specifically binds to GITR.
  • the pharmaceutical composition may include at least one monoclonal antibody that specifically binds to GITR and at least one of the components selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable and pharmacologically compatible excipients.
  • the pharmaceutical composition may include at least one monoclonal antibody that specifically binds to GITR and one or more additional binding molecules (eg, antibodies) that target one or more corresponding surface receptors.
  • the compositions are designed to improve, prevent, or treat disorders that may be associated with GITR.
  • “Pharmaceutical composition” means a composition comprising a monoclonal antibody that specifically binds to GITR according to the invention and at least one of the components selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable and pharmacologically compatible excipients such as fillers, solvents, diluents , carriers, auxiliary, distribution, delivery vehicles, preservatives, stabilizers, emulsifiers, suspending agents, thickeners, slow-release regulators, the choice and ratio of which depends on the nature and method of administration and dosage.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention and methods of making them will be undeniably obvious to those skilled in the art.
  • the production of pharmaceutical compositions should preferably comply with GMP (Good Manufacturing Practice) requirements.
  • the composition may include a buffering composition, tonic agents, stabilizers, and solubilizers. Prolonged action of the composition can be provided by agents that delay absorption of the active pharmaceutical ingredient, for example, aluminum monostearate and gelatin.
  • suitable carriers, solvents, diluents and delivery vehicles are water, ethanol, polyalcohols, as well as mixtures thereof, oils, and injectable organic esters.
  • Drug (preparation) a substance or a mixture of substances in the form of a pharmaceutical composition in the form of tablets, capsules, powders, lyophilisates, injections, infusions, ointments, etc. ready-made forms, designed to restore, correct or change physiological functions in humans and animals, as well as for the treatment and prevention of diseases, diagnostics, anesthesia, contraception, cosmetology and others. Any method of administering peptides, proteins or antibodies accepted in the art can be suitably used for a monoclonal antibody that specifically binds to GITR of the present invention.
  • pharmaceutically acceptable means one or more compatible liquid or solid components that are suitable for administration to a mammal, preferably a human.
  • excipient or “excipient” is used herein to describe any component other than those previously described in this invention. These are substances of inorganic or organic origin used in the production process, the manufacture of drugs to give them the necessary physical and chemical properties.
  • buffer means a solution that is able to maintain the pH value due to the interaction of acidic and alkaline components that make up its composition, which enables the preparation of monoclonal antibodies that specifically bind to GITR exhibit resistance to pH changes.
  • the pH of the pharmaceutical composition is preferably from 4.0 to 8.0.
  • buffering agents for example, acetate, phosphate, citrate, histidine, succinate and the like can be used. buffer solutions, but not limited to them.
  • tonic agent refers to an excipient that can apply the osmotic pressure of a liquid antibody preparation.
  • An "isotonic” drug is a drug that has an osmotic pressure equivalent to that of human blood. Isotonic formulations typically have an osmotic pressure of about 250 to 350 mOsm / kg.
  • isotonic agents polyols, mono- and disaccharides, amino acids, metal salts, for example, sodium chloride, and the like, can be used, but are not limited to them.
  • stabilizer an auxiliary substance or a mixture of two or more auxiliary substances that provide the physical and / or chemical stability of the active agent.
  • Amino acids can be used as stabilizers, for example, but not limited to arginine, histidine, glycine, lysine, glutamine, proline; surfactants such as polysorbate 20 (trade name Tween 20), polysorbate 80 (trade name Tween 80), polyethylene-polypropylene glycol and copolymers (trade names Poloxaner, Pluronic), sodium dodecyl sulfate (SDS ), but not limited to them; antioxidants, for example, but not limited to methionine, acetylcysteine, ascorbic acid, monothioglycerol, sulfuric acid salts, and the like; chelating agents, for example, but not limited to ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), sodium citrate and the like.
  • a pharmaceutical composition is "stable" if the active agent maintains its physical stability and / or chemical stability and / or biological activity during the stated shelf life at a storage temperature, for example, at 2-8 ° C. It is preferred that the active agent retains both physical and chemical stability as well as biological activity.
  • the storage period is selected based on the results of stability studies with accelerated and natural storage.
  • the pharmaceutical composition of this invention can be manufactured, packaged or marketed as a unit dosage or a plurality of unit dosages in a finished dosage form.
  • unit dosage means a discrete amount of a pharmaceutical composition containing in advance a certain amount of the active ingredient.
  • the amount of active ingredient is usually equal to the dosage of the active ingredient to be administered to the subject, or a convenient portion of such dosage, for example, half or a third of such dosage.
  • compositions of the present invention are generally suitable for parenteral administration in the form of sterile drugs intended for administration to the human body in violation of the integrity of the skin or mucous membranes, bypassing the gastrointestinal tract by injection, infusion or implantation.
  • parenteral administration is contemplated to include, but is not limited to, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular, intravenous, intraarterial, intrathecal, intraventricular, intraurethral, intracranial, intra-articular, transdermal injection or infusion .; and renal dialysis infusion techniques.
  • Intratumoral delivery such as intratumoral injection, may also be useful.
  • Regional perfusion is also provided.
  • Preferred embodiments of the invention include intravenous and subcutaneous routes. Any method of administering peptides or proteins accepted in the art can be suitably used for a monoclonal antibody that specifically binds to GITR of the present invention.
  • Injectable drugs can be manufactured, packaged or sold in unit dosage form, for example, in ampoules, vials, polymer containers, pre-filled syringes, autoinjection devices, but not limited to them.
  • Medicines for parenteral administration include, but are not limited to, suspensions, solutions, emulsions in oily or aqueous bases, pastes, and the like.
  • Another embodiment of the invention is a medicament for parenteral administration, where the pharmaceutical composition is provided in dry form, that is, a powder or granules for dissolution in a suitable solvent (eg sterile pyrogen-free water) prior to administration.
  • a suitable solvent eg sterile pyrogen-free water
  • Such a drug can be obtained, for example, by lyophilization, i.e. a process known in the art as freeze drying, which includes freezing the preparation and then removing the solvent from the frozen contents.
  • the monoclonal antibody that specifically binds to GITR of this invention can also be administered intranasally or by inhalation, alone, as a mixture with a suitable pharmaceutically acceptable vehicle from an inhaler, such as a pressurized aerosol container, pump, spray, nebulizer) or nebulizer, in which a suitable propellant is used or not used, or in the form of nasal drops or spray.
  • a suitable pharmaceutically acceptable vehicle from an inhaler, such as a pressurized aerosol container, pump, spray, nebulizer) or nebulizer, in which a suitable propellant is used or not used, or in the form of nasal drops or spray.
  • the drug for parenteral administration can be immediate or modified release. Modified release drugs include delayed, sustained, pulsed, controlled, targeted and programmed release.
  • a monoclonal antibody that specifically binds to GITR of the present invention is used in the treatment of disorders that are associated (mediated) with GITR activity.
  • the subject of treatment or patient is a mammal, preferably a human subject.
  • the above subject can be male or female and of any age.
  • a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to GITR is used to treat a disease or disorder mediated by GITR, where the disease or disorder is selected from the group of cervical cancer (cervical cancer), head and neck cancer, stomach cancer, BC (breast cancer), renal cell carcinoma, CRC (colorectal cancer), OC (ovarian cancer), NSCLC (non-small cell lung cancer).
  • a therapeutically effective amount of an antibody or antibody fragment can reduce the number of cancer cells; reduce the initial tumor size; inhibit (i.e., slow down to some extent) and, preferably, stop) cancer cell infiltration of peripheral organs; inhibit (i.e. slow down to some extent and preferably stop) tumor metastasis; inhibit, to some extent, tumor growth; and / or facilitate, to some extent, one or more symptoms associated with the disorder
  • the antibody or antibody fragment may, to some extent, prevent the growth and / or kill existing cancer cells, it may cause a cytostatic and / or cytotoxic effect.
  • in vivo efficacy can be determined, for example, by assessing the duration life, time to disease progression (TTP), frequency from tumor response rate (RR), duration of response and / or quality of life.
  • co-administration refers to a monoclonal antibody that specifically binds to GITR, one or more other therapeutic agents, are intended to mean, refer to, or include: 1) the simultaneous administration of such a combination of a monoclonal antibody, which specifically binds to GITR, according to this invention and a therapeutic agent to a patient in need of treatment, when such components are formulated together in a single dosage form, from which said components are released substantially simultaneously to said patient,
  • a monoclonal antibody that specifically binds to GITR of the present invention can be administered without additional therapeutic treatment, i.e. as an independent therapy.
  • treatment with a monoclonal antibody that specifically binds to GITR according to this invention may include at least one additional therapeutic treatment (combination therapy).
  • a monoclonal antibody that specifically binds to GITR can be co-administered or formulated with another drug / cancer treatment.
  • cytotoxic agent refers to a substance that inhibits or prevents cell function and / or causes cell destruction.
  • the term is understood to include radioactive isotopes (for example, At 211 , I 131 , I 125 , Y 90 , Re 186 , Re 188 , Sm 153 , Bi 212 , P 32 and radioactive isotopes Lu), chemotherapeutic agents and toxins such as low molecular weight toxins or enzymatically active toxins having origin from bacteria, fungi, plants or animals, including fragments and / or variants thereof.
  • radioactive isotopes for example, At 211 , I 131 , I 125 , Y 90 , Re 186 , Re 188 , Sm 153 , Bi 212 , P 32 and radioactive isotopes Lu
  • chemotherapeutic agents and toxins such as low molecular weight toxins or enzymatically active toxins having origin from bacteria, fungi, plants or animals
  • chemotherapeutic agent is a chemical compound useful in the treatment of cancer.
  • examples of chemotherapeutic agents include alkylating agents such as thiotepa and cyclophosphamide (CYTOXAN ®); alkyl sulfonates such as busulfan, improsulfan, and piposulfan; aziridines such as benzodopa, carboquinone, meturedopa, and uredopa; ethyleneimines and methylmelamines including altretamine, triethylenemelamine, triethylenephosphoramide, triethylenethiophosphoramide, and trimethylmelamine; acetogenins (for example, bullatacin and bullatacinone); delta-9- tetrahydrocannabinol (dronabinol, MARINOL ®); beta lapachone; lapachol; colchicines; betulinic acid; a camptothecin (including the synthetic analogue topotecan (HYCAMTIN ®
  • dynemycin including dynemycin A; esperamycin; as well as the neocarcinostatin chromophore and related chromoprotein chromophores enediin antibiotics, aclacinomisins, actinomycin, autramycin, azaserin, bleomycins, cactinomycin, carbicin, carminomycin, carzinomycin-oxo-dycin, dyacinomycin-5 L-norleucine, doxorubicin (including ADRIAMICIN ®, morfolinodoksorubitsin, tsianomorfolinodoksorubitsin, 2- pyrrolino, doksorubitsinoNS1 in injectable liposomes (DOXOL ®), liposomal doxorubicin TLC D-99 (MYOCET ®), peg
  • topoisomerase 1 inhibitor e.g., LURTOTECAN ®
  • rmRH e.g., ABARELIX ®
  • BAY439006 sorafenib; Bayer
  • SU-11248 Pfizer
  • perifosin a COX-2 inhibitor (eg, celecoxib or etoricoxib), a proteosome inhibitor (eg, PS341); bortezomib (VELCADE ®); CCI-779; typifarnib (811577); orafenib, AVT510; Vs1-2 inhibitor such as oblimersen sodium (GENASENSE ®); pixantrone; EGFR inhibitors (see definition below); tyrosine kinase inhibitors (see definition below); and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above agents; as well as combinations of two or more of the above,
  • protivogormonalnye agents that act to regulate or inhibit hormone action on tumors such as anti-estrogens with mixed profile agonist / antagonist, including, tamoxifen (NOLVADEX ®), 4- hydroxytamoxifen, trioxifene, toremifene (FARESTON ®); idoxifene, droloxifene, raloxifene (EVISTA ®), trioxifene, keoxifene, and selective estrogen receptor modulators (SERM), such as SERM3; pure anti-estrogens without agonist properties, such as fulvestrant (FASLODEX ®), and EM800 (such agents may block estrogen receptor dimerization (ER), inhibit DNA binding, metabolism ER amplify and / or reduce the levels of ER); aromatase inhibitors, including steroidal aromatase inhibitors such as formestane and exemestane (AROMAS IN ®), and nonsteroidal aromat
  • therapeutic agents that can be used in combination with an antibody that specifically binds to GITR according to this invention can be inhibitors of growth factor function, for example, such inhibitors include growth factor antibodies and growth factor receptor antibodies (e.g. anti-erbB2 antibody trastuzumab [Herceptin], anti-EGFR antibody panitumumab, anti-erbB1 antibody cetuximab [Erbitux, C225] and any growth factor or growth factor receptor antibodies disclosed by Stern et al . Critical reviews in oncology / haematology, 2005, Vol.
  • growth factor antibodies and growth factor receptor antibodies e.g. anti-erbB2 antibody trastuzumab [Herceptin], anti-EGFR antibody panitumumab, anti-erbB1 antibody cetuximab [Erbitux, C225] and any growth factor or growth factor receptor antibodies disclosed by Stern et al . Critical reviews in oncology / haematology, 2005, Vol.
  • anti-angiogenic agents such as the inhibitory effects of vascular endothelial growth factor [eg, anti-vascular endothelial cell growth factor antibody bevacizumab (Avastin)], anti-vascular endothelial growth factor receptor antibodies such as anti-KDR antibodies and anti-fltl antibodies; antisense therapies, for example, directed to the above-listed targets such as ISIS 2503, anti-ras antisense agents, or G3139 (Genasense), anti-bc12 antisense agents; gene therapy approaches, including, for example, aberrant gene replacement approaches such as aberrant p53 or aberrant BRCA1 or BRCA2, GDEPT (gene directed enzyme prodrug therapy) approaches using cytosine deaminase, thymidine kinase or bacterial nitroreductase enzyme, targeting patient tolerance to chemotherapy or radiation therapy, such as multidrug resistance gene therapy; immunotherapeutic approaches, including, for example, treatment with Alemtuzumab (Avastin)], anti
  • Another therapeutic agent that can be used in combination with an antibody that specifically binds to GITR may be an antibody selected from the group: anti-PD1 antibodies, anti-PD-L1 antibodies, anti-CTLA4 antibodies, anti-4-1BB antibodies, anti-0X40 antibodies, or combinations thereof.
  • Another therapeutic agent that can be used in combination with an antibody that specifically binds to GITR according to this invention can be a therapeutically active anticancer compound selected from the group of innate or acquired immunity activators.
  • a monoclonal antibody that specifically binds to GITR of this invention can be used in methods of treatment as described above, can be used in treatment as described above, and / or can be used in the manufacture of a medicament for treatment as described above.
  • a monoclonal antibody that specifically binds to GITR of the present invention will be administered in an amount effective to treat the condition in question, i.e. in doses and for periods of time necessary to achieve the desired result.
  • the therapeutically effective amount can vary depending on factors such as the particular condition being treated, the age, sex, and weight of the patient, and whether administration of a monoclonal antibody that specifically binds to GITR is self-medication, or is given in combination with one or more additional drugs or treatments.
  • Dosing regimens can be adjusted to provide the optimal desired response. For example, a single bolus can be administered, several divided doses can be administered over time, or the dose can be proportionally reduced or increased depending on the severity of the therapeutic situation. It is particularly useful to formulate parenteral compositions in unit dosage form for ease of administration and uniformity of dosage.
  • Unit dosage form refers to physically discrete units suitable as dosage units for the patients / subjects to be treated; each unit contains a predetermined amount of active compound calculated to produce the desired therapeutic effect in combination with the required pharmaceutical carrier.
  • unit dosage forms of the present invention is generally dictated by and directly dependent on (a) the unique characteristics of the chemotherapeutic agent and the particular therapeutic or prophylactic effect to be to be achieved, and (b) the limitations inherent in the technique of compounding such an active compound for treating sensitivity in subjects.
  • dosages and dosage regimen are adjusted in accordance with methods well known in the therapeutic field. This means that the maximum tolerated dose can be readily established and the effective amount can also be determined to provide a detectable therapeutic effect for the patient, as well as the time requirements for administration of each agent to achieve a visible therapeutic effect for the patient.
  • dosages and regimens of administration are given as examples in this document, these examples do not in any way limit the dosages and regimes of administration that may be needed for a patient in the practice of using the present invention.
  • dosage values may vary depending on the type and severity of the condition to be alleviated, and may include one or more doses.
  • specific administration regimens should be adjusted over time according to the individual need and at the discretion of the healthcare professional who administers or controls the administration of the compositions, and that the concentration ranges given in this description are given only by way of example and are not intended to limit the scope or practice of the claimed compositions.
  • the dosage regimen with the compositions of this invention may be based on various factors, including the type of disease, age, weight, sex, health status of the patient, severity of the condition, route of administration, and the particular monoclonal antibody used that specifically binds to GITR.
  • the dosage regimen can vary widely, but can be determined regularly using standard methods. For example, doses can be adjusted based on pharmacokinetic and pharmacodynamic parameters, which can include clinical effects such as toxic effects or laboratory values.
  • the present invention encompasses individual dose escalation as determined by the skilled artisan. Determination of the required dose and regimens are well known in the relevant art and will be understood by the person skilled in the art upon reading the ideas disclosed herein.
  • a suitable dose of a monoclonal antibody that specifically binds to GITR according to this invention will be in the range of 0.1-200 mg / kg, preferably 0.1-100 mg / kg, including about 0.5-50 mg / kg, for example about 1-20 mg / kg.
  • a monoclonal antibody that specifically binds to GITR can be administered, for example, at a dose of at least 0.25 mg / kg, for example, at least 0.5 mg / kg, including at least 1 mg / kg, for example at least 1.5 mg / kg, for example, as well as at least 2 mg / kg, for example, at least 3 mg / kg, including at least 4 mg / kg, for example at least 5 mg / kg; and for example up to a maximum of 50 mg / kg, including up to a maximum of 30 mg / kg, for example up to a maximum of 20 mg / kg, including up to a maximum of 15 mg / kg.
  • the administration will be repeated, usually at appropriate intervals, for example, once a week, once every two weeks, once every three weeks, or once every four weeks, and as long as deemed appropriate by the responsible physician, who may in some cases increase or reduce dose if necessary.
  • a monoclonal antibody that specifically binds to GITR of the present invention is also used for diagnostic purposes (eg, in vitro, ex vivo).
  • a given monoclonal antibody that specifically binds to GITR of the present invention can be used to detect or measure the level of GITR in samples obtained from a patient, for example, a tissue sample or body fluid sample such as inflammatory exudate, blood, serum, fluid bowel, saliva, or urine.
  • Suitable detection and measurement methods include immunological methods such as flow cytometry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), chemiluminescence analysis, radioimmunoassay, and immunohistology.
  • the invention further includes kits, eg, diagnostic kits, containing a monoclonal antibody that specifically binds to GITR of the present invention as described herein.
  • the required gene segments were obtained from oligonucleotides created by chemical synthesis. Gene segments from 300 to 4000 kb in length, which are flanked by unique restriction sites, were collected by annealing and ligation of oligonucleotides, including PCR amplification and subsequent cloning through the indicated restriction sites. The DNA sequences of the subcloned gene fragments were confirmed by DNA sequencing.
  • DNA sequences were determined by Sanger sequencing.
  • variants of expression plasmids intended for expression in prokaryotic cells (E. coli) of short-term expression in eukaryotic cells (for example, in CHO cells) were used.
  • the vectors contained: a replication initiation site providing replication of the said plasmid in E. coli, genes that confer resistance in E. coli to various antibiotics (for example, ampicillin and kanamycin).
  • the fusion of genes containing the described antibody chains, as described below, was carried out by PCR and / or synthesis and assembly of genes using known recombination methods and procedures by linking the appropriate segments of nucleic acids, for example, using unique restriction sites in the corresponding vectors.
  • the subcloned nucleotide sequences were confirmed by DNA sequencing.
  • large numbers of plasmids were generated by obtaining plasmids from transformed E. coli cultures.
  • GITR gene sequence was cloned into a plasmid for protein production in mammalian cells with the Fc IgGl Lama glama tag (Fig. 1) at the Sall / Notl restriction sites.
  • the antigen sequence is separated from the Fc by the protease-labile site of the TEV protease, which was also used to cleave the Fc fragment by treatment with TEV protease and obtaining a tagless version of the antigen.
  • the sequence was also cloned into a plasmid containing the FLAG-EPEA-tag (C-tag GE Healthcare) at the C-terminus of the protein (Fig. 2) at the Sall / Notl restriction sites.
  • GITRL a similar cloning of the recombinant human GITR ligand
  • Plasmids were produced in the required quantities in E. coli cells and purified using the Maxiprep Qiagen kit.
  • Antibodies and antigens were produced in a permanent cell line derived from Chinese hamster ovary cells (CHO-K1 line) according to published protocols [Biotechnol Bioeng. 2005 Sep 20; 91 (6): 670-677, Liao Metal. 2004; Biotechnol Lett. 2006 Jun; 28 (11): 843-848; Biotechnol Bioeng. 2003 Nov 5; 84 (3): 332-342].
  • Cells constitutively expressing the EBNA1 protein gene (Epstein-Barrvirus nuclear antigen 1) were used. Suspension culture was performed in flasks on an orbital shaker using serum-free media from Life Technologies Corporation and according to the manufacturer's instructions.
  • Recombinant GITR and GITRL proteins containing EPEA-tag (glutamic acid-proline-glutamic acid-alanine) at the C-terminus of the protein were isolated and purified from the culture broth using the CaptureSelect C-tag Affinity Matrix sorbent.
  • the culture liquid was passed through a chromatographic column pre-filled with 5 ml of C-tag sorbent, then the column was washed with 25 ml of PBS to wash out nonspecifically binding components.
  • the bound antigen was eluted under mild conditions using 20mM Tris, 2M MgCl2 pH7.0-7.4. Then the protein was converted into PBS (pH 7.4) by dialysis using a semipermeable dialysis membrane, filtered (0.22 ⁇ m), transferred into tubes and stored at -70 ° C.
  • the recombinant GITR-TEV-Fc antigen was isolated from the culture broth and purified using a protein A affinity chromatography column.
  • the clarified culture broth was passed through a 5 ml HiTrap rProtein A Sepharose FF column (GE Healthcare) equilibrated with phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4).
  • PBS phosphate buffered saline
  • the column was then washed with 5 column volumes of PBS to wash out non-specific binding components.
  • the bound antigen was eluted using 0.1 M glycine buffer pH 3.
  • Main the protein peak elution was collected and its pH adjusted to neutrality with 1 M Tris buffer (pH 8). All stages were carried out at a flow rate of 110 cm / h.
  • the protein was converted into PBS (pH 7.4) by dialysis using SnakeSkin Dialysis Tubing technology, filtered (0.22 ⁇ m), transferred into tubes and stored at -70 ° C
  • RNA of B-lymphocytes from individual blood samples of more than a thousand human donors was isolated using the RNeasy Mini Kit according to the proposed protocol (from QIAGEN). RNA concentration was determined using the Nanovue kit (from GE Healthcare) and the quality of the isolated RNA was checked by electrophoresis in 1.5% agarose gel.
  • the reverse transcription reaction was performed using the MMLV RT kit (from Evrogen) according to the recommended protocol using MMuLV reverse transcriptase and random hexameric oligonucleotides as primer.
  • Reverse transcription products were used as a template in a two-step polymerase chain reaction to obtain genes of variable domains flanked by restriction sites using a set of oligonucleotides according to the authors' protocols [J Biol Chem. 1999 Jun 25; 274 (26): 18218-30].
  • the resulting DNA preparation VL-CK-VH (Fig. 6) was treated with restriction endonucleases NheI / Eco91I and ligated into the original phagemid pH5 (Fig. 7).
  • the ligation products were transformed into electrocompetent strain SS320 cells prepared according to the protocols [Methods Enzymol. 2000; 328: 333-63.].
  • the repertoire of the MeganLibTM combinatorial phage Fab display library consisted of 10 11 transformants. Phage Fab-library preparations were prepared according to the procedure described previously [J Mol Biol. 1991 Dec 5; 222 (3): 581-97].
  • RNA of B-lymphocytes from individual blood samples immunized with recombinant GITR antigens Lama Glama, which demonstrated the maximum specific titer sera were isolated using the RNeasy Mini Kit according to the proposed protocol (from QIAGEN). RNA concentration was determined using the Nanovue kit (from GE Healthcare) and the quality of the isolated RNA was checked by electrophoresis in 1.5% agarose gel.
  • the reverse transcription reaction was performed using the MMLV RT kit (from Evrogen) according to the recommended protocol using MMuLV reverse transcriptase and random hexameric oligonucleotides as primer.
  • Reverse transcription products were used as a template in a two-step polymerase chain reaction to obtain genes of variable domains flanked by restriction sites using a set of oligonucleotides according to the authors' protocols [J Biol Chem. 1999 Jun 25; 274 (26): 18218-30].
  • the selection of immune phage libraries was performed on an EIA / RIA Tube High Binding 5 ml immunotube.
  • the antigen (0.5 ml, 2 ⁇ g / ml) was sorbed in a carbonate buffer (0.1 M NaHCO3, pH 9.5) overnight at + 4C.
  • the tubes were washed with PBST (10 mM phosphate-buffered saline pH7.3-7.5, 137mM NaCl and 2.7 mM KC1, 0.1% Polysorbate 20) and added the total volume (5 ml) of 0.5% milk powder in PBST for driving.
  • PBST mM phosphate-buffered saline pH7.3-7.5, 137mM NaCl and 2.7 mM KC1, 0.1% Polysorbate 20
  • the hammering alternates from round to round, for example, if in the 1st round it was 0.5% milk on PBST, then on the 2nd - 1% BSA on PBST. Incubated for an hour at room temperature on a shaker. We washed PBST tubes and added 2 ml of driving buffer and phage libraries to a concentration of approximately 2 * 10 12 phage particles per ml. Incubated with phages for 1-2 hours at room temperature. In subsequent rounds, 4 ml of phage supernatant from the previous round, preliminarily clarified in a centrifuge at 1700 OD 10-15 minutes, was used. The tubes were washed 20 times with PBST.
  • Phages were eluted from the surface of the tubes with 0.5 ml of 0.1M glycine buffer pH 2.2: glycine buffer was added to the tubes and stirred slightly for 15 minutes at room temperature. Then the phage solution was transferred into clean non-sorbing tubes with 100 ⁇ l of 1M TrisHC1 pH 8.0 for neutralization. The tubes were kept on ice until the cells were infected. After selection, bacteriophage M13 is cultured using E. coli TG1 strain as a host. Amplification is carried out by infection of the host strain culture with phages and subsequent growth for 12-15 hours.
  • Helper phage K07 was added at the rate of 1 ⁇ l per 10 ml of culture (10 10 particles per ml) and incubated at 37C for 1.5 hours without rocking. Then, an equal volume of medium with a single ampicillin (100 ⁇ g / ml) and double kanamycin (40 ⁇ g / ml) and double IPTG (0.2 MM) was added to the cell culture. They were transferred to a rocking chair and the phage was accumulated for 4-5 hours at AIA. The cell culture was centrifuged for 25-30 minutes 17000 g and the supernatant was collected in test tubes. The resulting supernatant was then used in the next round of selection, or the phage was isolated by precipitation for subsequent storage.
  • Phages were isolated in the following way: 1/6 volume of a solution containing 20% polyethylene glycol and 2.5 M sodium chloride was added to the supernatant, and vigorously mixed. The solution was incubated on ice for at least 3 hours. Then the solution was centrifuged for 10 minutes at 8000g, the resulting precipitate containing phages was dissolved in 1 ml of TBS buffer (Tris - Borate Buffer).
  • TBS buffer Tris - Borate Buffer
  • Bacteriophages were isolated after two to three rounds and analysis of specific binding of polyclonal phage to human GITR and nonspecific antigens was performed.
  • PBST mM phosphate-buffered saline pH7.3-7.5, 137mM NaCl and 2.7 mM KC1, 0.1% Polysorbate 20
  • 300 ⁇ l / well of 0.5% dry milk in PBST for hammering Incubated for an hour at room temperature on a shaker.
  • the PBST plates were washed and 50 ⁇ l of phage solutions obtained after 2 and 3 rounds of selection, diluted with plugging buffer from 2 to 256 times, were added to them. Incubated for an hour at room temperature on a shaker. Washed plates with PBST and applied horseradish peroxidase-conjugated anti-M13 antibody in driving buffer. After incubation for an hour, the plates were washed and 50 ⁇ l of the reaction substrate (H2O2 - 0.02% and TMB) in acetate buffer pH 5.0 were added. They were incubated at room temperature in the dark until a slight background appeared in negative controls (but not more than 20 min). The reaction was stopped by adding 25 ⁇ l / well of 10% H2SO4, and the OD in the wells was measured at 450 nm.
  • the reaction substrate H2O2 - 0.02% and TMB
  • variable domains of antibodies from these libraries were recloned into the expression vector pLL-Fab (Fig. 8) to produce a secreted soluble form of Fab in E. coli cells.
  • ELISA was used to search for Fab secreted into the medium from monoclones of E. coli producers obtained from example 5, which specifically bind human GITR.
  • Fab with published sequence Fab-gitr3215 (patent pending) was used as a positive control.
  • wells of ELISA plates (medium binding from Greiner bio one) were coated with 50 ⁇ l of GITR (0.2 ⁇ g / ml in 1 * carbonate buffer), sealed and incubated overnight at 4 ° C. All subsequent steps were performed according to the standard ELISA protocol using a high-performance automated platform based on robotic systems Genetix Qpix2xt (from Molecular Device) and Tecan Freedom EVO 200 (from Tecan).
  • Blocking buffer BB (200 ⁇ l 0.5% nonfat milk in PBS) was added to block non-specific binding. The plates were incubated on a shaker for one hour at room temperature. After washing with PBS-Tween, 50 ⁇ l per well of the test cell supernatant containing the test Fab mixed with an equal volume of BB was added. The plates were again incubated with shaking for one hour at room temperature, after which each well of the plates was washed three times with PBS-Tween buffer. After washing, anti-human Fab HRP-conjugated secondary antibody (from Pierce-ThermoScientific) was added (50 ⁇ l / well) at a ratio of 1: 5000 in PBS-Tween.
  • the plates were shaken on a rotary shaker (50 min, room temperature) and washed three times with PBS-Tween buffer, as described above.
  • the colorimetric signal was developed by adding TMB (50 ⁇ l / well) until saturation (3-5 min on average), then further development was stopped by adding a stop solution (30 ⁇ l / well, 10% sulfuric acid).
  • the color signal was measured at 450 nm using a suitable Tesap-Sunrise plate reader (from Tesap). The degree of antibody binding was proportional to the production of a color signal. Clones in which the 5X color signal exceeded the background signal and was comparable to the signal of the control antibody Fab-gitr3215 were tested in ELISA for non-specific binding.
  • ELISA also used the analysis of nonspecific binding of the studied Fab-fragments with other antigens. The study was carried out as described above, but IL6R-Fc, INF 2b, PCSK9-VG-FE, PD-1-Fc (2.5 ⁇ g / ml in 1 c carbonate buffer) were used as antigens for immobilization. GITR-TEV-Fc (0.2 ⁇ g / ml in 1 c carbonate buffer) was used as a control for specific binding. All subsequent steps were carried out according to a standard ELISA protocol using a high-performance automated platform based on robotic systems Genetix Qpix2xt (from Molecular Device) and Tesap Freedom EVO 200 (from Tesap).
  • the cloning of the antibody variable domain genes from Example 7 was performed according to a standard procedure. For this, we have developed PCR products containing genes of variable domains of heavy and light chains of antibodies.
  • the variable domain of the heavy chain was cloned into the vector pEE-Hc IgGl at the Sall / Nhel restriction sites, a schematic map of which is shown in FIG. 9).
  • the variable domain of the light chain was ligated into the vector pEE-CK at the Sall / BsiWI restriction sites, a schematic map of which is shown in (Fig. 10).
  • Antibodies were produced in cells of a permanent cell line derived from Chinese hamster ovary cells (CHO-K1 line) according to published protocols [Biotechnol Bioeng.
  • CHO-K1-S cells were used for the production of antibodies in the transient expression system.
  • the cells were cultured in bumpers (125, 250, 500, 1000 and 3000 ml) in a mixture of CHO-S-SEM II and Freestyle CHO media (1: 1) with 4 mM glutamine, 0.05 mg / ml gentamicin and 10 ⁇ g / ml with ciprofloxacin in orbital shakers-incubators at + 37C in the presence of 5% CO2, at 110 or 150 rpm, depending on the size of the flask.
  • the cells were subcultured 3 times a week, the seeding density was 0.2 * 106 cells / ml.
  • the cells were seeded the day before with a density of 0.8 * 106 cells / ml, transfection was carried out every other day, in a cell culture with a density of 2 * 106 cells / ml.
  • To prepare the transfection mixture we used RPMI-1640 medium with 2 mM glutamine and 0.05 mg / ml gentamicin.
  • the vectors were diluted separately in the medium at the rate of 0.75 ⁇ g / ml, separately - the transfection agent polyethyleneimine (PEI), at the rate of PEI: DNA 7: 1 by weight. Dilutions of vectors and PEI were mixed and incubated for 10 minutes at room temperature, after which the transfection mixture was added to the cells and the cells were cultured under standard conditions.
  • PEI polyethyleneimine
  • the main protein elution peak was collected and adjusted to pH neutral with 1 M Tris buffer (pH 8). All stages were carried out at a flow rate of 110 cm / h.
  • the protein was transferred to PBS (pH 7.4) using dialysis, using the SnakeSkin Dialysis Tubing technology, filtered (0.22 ⁇ m), transferred to tubes and stored at - 70 ° C.
  • the binding constants of anti-GITR antibodies to human, rhesus, and cynomolgus GITR were obtained using an OctetRed 96 device according to ForteBio instructions.
  • Antigen 25 ⁇ g / ml was nonspecifically immobilized on the surface of second generation amino-reactive sensors (from AR2G) (ForteBio according to the standard protocol according to the manufacturer's instructions for preparation and immobilization of AR2G sensors).
  • anti-GITR antibodies Antibodies were added at concentration. The assay was performed at 30 ° C using PBS containing 0.1% Tween-20 and 0.1% BSA as a working buffer.
  • the test used the cell line HEK293-GITR-NFkB-Luc, created on the basis of the cell line Nek-293, stably expressing GITR on the surface and containing the gene encoding firefly luciferase under the control of the NFkB promoter.
  • the test was performed in a 96-well culture plate.
  • the suspension in each well contained HEK293-GITR-NFkB-Luc cells and the test antibody at the concentration indicated on the graph. All components of the suspension were prepared in a nutrient medium for cell culture. After the addition of all components, the plate was incubated at 37 ° C, 5% CO2, and then, using a kit for assessing luminescence and a plate reader, the intensity of luciferase in the wells was measured.
  • ELISA was used to measure the comparative affinity of antibodies to GITR-Fc of different organisms.
  • ELISA plate binding assay (medium binding from Greiner bio one) was coated with 50 ⁇ l of human, cynomolgus, mouse GITR-Fc (0.5 ⁇ g / ml in 1 c carbonate buffer), sealed and incubated overnight at 4 ° C. All subsequent steps were carried out according to the standard ELISA protocol described in example b.
  • Anti-GITR antibody BCD166-01-01 specifically bound to human and monkey cynomolgus GITR and did not bind to murine GITR (FIG. 14).
  • the BCD166-01-011 antibody specifically bound to human GITR, but did not bind to Cynomolgus monkey and mouse GITR (FIG. 15).
  • the BCD166-01-014 antibody specifically binds to human GITR, binding to the cynomolgus monkey GITR was much weaker and completely absent for mouse GITR (Fig. 16).
  • candidate BCD166-01-011 was excluded from further work due to the lack of apparent specificity for macaque GITR.
  • the candidates BCD166-01-01 and BCD166-01-014 have been finalized for further development.
  • the binding constants of anti-GITR antibodies to GITR from rhesus and cynomolgus monkeys were obtained using an OctetRed 96 device according to ForteBio instructions.
  • Antigen 25 ⁇ g / ml was nonspecifically immobilized on the surface of second generation amino-reactive sensors (from AR2G) (ForteBio according to the standard protocol according to the manufacturer's instructions for preparation and immobilization of AR2G sensors).
  • anti-GITR antibodies Antibodies were added at concentration. The assay was performed at 30 ° C using PBS containing 0.1% Tween-20 and 0.1% BSA as a working buffer.
  • the E345R mutation was selected and introduced into the IgGl Fc region of the antibody. It has been shown that such a mutation can lead to oligomerization of the antibody on the cell surface after binding to the antigen, and enhancement of various effector abilities of ADCC, ADCP, CDC, and also pharmacokinetics (PK).
  • BCD166-02-01 Two parental antibodies BCD166-01-01, BCD166-01-014 were also taken in the test.
  • Fig. 17 indicate a 5-fold increase in the level of activation in the cell agonist test of the studied BCD166-02-01 in comparison with the precursor BCD166-01-01, in which the E345R mutation was introduced, which is caused by antigen-dependent anti-GITR oligomerization BCD166-02-01 antibodies on the target cell. Moreover, not only the level of the upper activation plateau increased naturally, but also the EC50 value changed more than 20 times in the direction of increase.
  • ADCC antibody dependent cellular cytotoxicity
  • the test examined the ADCC activity for candidates BCD166-02-01. Two antibodies BCD166-01-01, BCD166-01-014 were also taken in the test. In addition, similar to candidate BCD166-01-01, the mutation E345R was introduced into candidate BCD166-01-014 (which was named BCD166-02-014) to increase ADCC activity compared to the wild form.
  • the test used the cell line Jurkat-NFAT-Luc-CDl 6, created on the basis of the Jurkat cell line, stably expressing CD16 on the surface and containing the gene encoding firefly luciferase under the control of the NFAT promoter; as well as the Hek-293-GITR cell line, created on the basis of the Nek-293 cell line, stably expressing GITR on the surface.
  • the test was performed in a 96-well culture plate.
  • Jurkat-NFAT-Luc-CDl 6 and Hek-293-GITR target cells as well as assay antibodies at the concentration shown in the graph. All components of the suspension were prepared in a nutrient medium for cell culture. After adding all the components, the plates were incubated at 37 ° C, 5% CO2, and then, using a kit for the assessment of Lucifer and a plate reader, the intensity of luminescence in the wells was measured.
  • Fig. 18 indicate a 40-fold increase in the EC50 value in the cellular ADCC test of the studied BCD166-02-01 in comparison with the precursor BCD166-01-01, in which the E345R mutation was introduced, which is caused by antigen-dependent anti-GITR oligomerization BCD166-02-01 antibodies on the target cell.
  • the cumulative data clearly indicate a significant positive effect of replacing the E345R in the Fc portion of IgGl antibodies on the various effector characteristics required to create a highly active GITR agonist.
  • the test was performed in a 96-well culture plate.
  • the suspension in each well contained HEK-293-GITR cells, as well as the analyzed antibodies at the indicated concentration and the complement of human blood serum.
  • the plate with the described suspension was incubated for 4 h at 37 ° C, 5% COg.
  • a solution of alamar blue was added to each well, and then incubated at 37 ° C, 5% CO2.
  • the fluorescence value was measured in the wells (excitation wavelength 544 nm, emission wavelength 590 nm),
  • Fig. 19 indicate an insignificant CDC activity, those not more than 10% up to a concentration of 1 ⁇ g / ml, which is the boundary for the estimated therapeutic dose expected for humans, for antibodies BCD166-01-01, BCD166-02-01 and the control antibody anti-GITR-3215.
  • candidate BCD166-01-14 the activity at a concentration of 1 ⁇ g / ml CDC was about 30% lysis, which indicates a visible effect, but possibly weakly manifested in vivo.
  • the cumulative data clearly indicate a negligible effect of substitution of E345R in the Fc portion of the IgGl of anti-GITR candidates.
  • PBMCs were isolated from whole blood of healthy donors by Ficoll density gradient centrifugation in a 96-well culture plate.
  • the suspension in each well contained PBMCs and the plotted antibody at 25, 1 and 0 ⁇ g / ml.
  • the plate was incubated for 16 hours at 37 ° C, 5% CO2.
  • the proportion of CD56 +, CD19 +, CD3 +, CD4 +, and CD8 + subpopulations of PBMCs in suspensions was assessed by direct staining of suspensions with fluorescently labeled antibodies against the corresponding CDs and subsequent analysis of cells on a flow cytometer.
  • the graphs show the proportion of all cells of the analyzed suspension, for CD4 +, CD8 + - the proportion of CD3 + cells.
  • results shown in FIG. 20-24 indicate an insignificant negative effect of the studied anti-GITR candidates, ie no more than 10% decrease in the number of immunoreactive cells in comparison with the negative control.
  • the control antibody anti-CD20 also showed an increase in the percentage of NK cells, but almost a natural complete depletion of the population of CD20 + B cells.
  • all the candidates under consideration do not exhibit nonspecific cytotoxicity in vitro on human blood cells.
  • ADCC-dependent depletion of GITR + cells in the nTreg population is assumed to be one of the main putative mechanisms of the therapeutic anti-oncogenic action of anti-GITR antibodies.
  • antibodies BCD166-01-01, BCD166-01-014, BCD166-02-01 and a control antibody anti-CTLA4 (ipilimumab) were tested.
  • PBMCs Peripheral blood mononuclear cells
  • NK cells were isolated from PBMCs using the NK Cell Isolation Kit, human (Miltenyi Biotec, Germany).
  • Antibody solutions, NK cell suspension, and nTreg suspension were added to the culture plate.
  • the plate was incubated at 37 ° C with 5% CO2 for 16 hours.
  • Samples of cell suspensions were stained using fluorescently labeled antibodies against CBZ, CB4, CB25, FoxP3 (Biolegend, USA). Samples of stained cell suspensions were analyzed using flow cytometry.
  • Fig. 25 results of the analysis of antibody-dependent nTreg depletion under the action of the studied antibodies are shown in Fig. 25 for the cell material of donor 1 and in FIG. 26 donor 2 indicate a significant 70-100% decrease in the cell population, i.e. depleting activity of the studied anti-GITR candidates, especially for donor material 2.
  • a comparative analysis with the control anti-CTLA4 antibody ipilimumab demonstrates greater activity in favor of anti-GITR antibodies, especially for the final candidate BCB166-02-01.
  • Antibodies BCD166-01-01, BCD166-01-014, BCD166-02-01 were tested in this test.
  • PBMCs were isolated from whole blood of healthy donors by Ficoll density gradient centrifugation. Monocytes were isolated from PBMCs as a population of cells that bind to culture plastic. To obtain dendritic cells, monocytes were incubated in the presence of 1000 U / ml GM-CSF (Peprotech, USA) and 500 U / ml IL-4 (Thermo Scientific, USA) at 37 ° C 5% CO2 for 120 hours. LPS solution (Sigma, USA) was added to the culture medium to a concentration of 0.5 ⁇ g / ml, the cells were incubated at 37 ° C with 5% CO2 for 48 hours. Antibody dilution solutions, dendritic cell suspension and PBMC were added to the culture plate. The plate was incubated at 37 ° C with 5% CO2 for 120 hours.
  • Samples of cell suspensions were stained using fluorescently labeled antibodies against CD3, CD4, CD25, FoxP3 (Biolegend, USA). Samples of stained cell suspensions were analyzed using flow cytometry. Anti-GITR antibodies BCD166-01-01, BCD166-01-14, and BCD166-02-01 cause iTreg depletion in vitro.
  • PBMCs were isolated from whole blood of healthy donors by Ficoll density gradient centrifugation.
  • AntiC 3 and aHTHGITR antibodies were immobilized in the wells of a 96-well plate. For this, 100 ⁇ l of a DPBS solution containing aHTHGITR antibody BCD166-02-01 in the concentration indicated on the graph and anti-SBZ antibody in a suboptimal concentration were added to the corresponding wells of the plate, the plate was incubated for 16 hours at room temperature.
  • the test was carried out in a 96-well plate with anti-CBZ and anti-GITR antibodies pre-immobilized in the wells.
  • the suspension in each well contained 40,000 PBMCs and anti-CB28 antibody at a suboptimal concentration. All suspension components were prepared in RPMI-1640 medium containing 10% FBS. After adding the cell suspension, the plate was incubated for 6 days at 37 ° C, 5% CO2. On the 4th day of incubation, aliquots of the culture liquid were taken from the wells. Next, the concentration of IL-2 and IFN-g in the culture fluid of the 4th and 6th days of incubation was determined using ELISA.
  • the binding affinity constants of the antibody BCD166-02-01 for FcRn, FcgRIIIal58V, FcgRIIIal58F, FcgRIIal31H, FcgRIIal31R, FcgRIIb and human FcgRIa were obtained using an OctetRed 96 instrument (from ForteBio). Biotinylated receptors were immobilized on the surface of streptavidin sensors (SA). Conducted and analyzed the association and dissociation of receptors and antibodies in a working buffer (PBS containing 0.1% Tween-20 and 0.1% BSA: with the FcRn receptor with pH6, with the rest of the receptors in buffer with pH7.4.) At 30 ° C. The resulting sensograms were analyzed according to 1: 1 or 2: 1 models and the affinity constants were calculated using Octet Data Analysis Software 8.0 User Guide Copyright 2011 ⁇ .
  • FIG. 29 The results of the affinity analysis of BCD166-02-01 for FcRn, FcgRIIIal58V, FcgRIIIal58F, FcgRIIal31H, FcgRIIal31R, FcgRIIb and human FcgRIa are shown in FIG. 29. They show values that are multiplied in comparison with the literature data and the data repeatedly measured in our company for antibodies of the IgGl isotype, which indicates a noticeable but not qualitative effect of the E345R mutation in the Fc fragment on the kinetics of monomeric antibodies adsorbed on these receptors from solution.
  • mice were subcutaneously transplanted with 3x10 6 A2058 cells mixed with Matrigel®. On day 7 after cell inoculation, the animals were assigned to groups as shown in Table 9.
  • the drugs were administered intraperitoneally at a dose of 20 mg / kg on days 1, 5, 8, 12 after the distribution of animals into groups.
  • the negative control group received histidine buffer.
  • the body weight of the mice and the linear dimensions of the tumor were measured.
  • the formula V LxWxHxn / 6 was used.
  • the indicator of tumor growth inhibition (TPO) was used as a criterion for the effectiveness of the study drug, which is calculated taking into account the average tumor volume in the negative control group (V c ) and the drug group (V t ) according to the formula:

Abstract

Реферат Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, а также их применению. Более конкретно, настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, которые специфически связываются с GITR. Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей данное антитело или его антигенсвязывающему фрагменту, вектору экспрессии, способу получения антитела и применению антитела для лечения заболеваний или нарушений, связанных с GITR.

Description

Моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR
Область техники
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, а также их применению. Более конкретно, настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, которые специфически связываются с GITR (Glucocorticoid-induced TNFR-related protein/индуцируемый глюкокортикоидами рецептор фактора некроза onyxone^TNFRSF18/tumor necrosis factor receptor superfamily, member 18/мембранный белок, рецептор из надсемейства рецепторов фактора некроза опухоли) . Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей данное антитело или его антигенсвязывающему фрагменту, вектору экспрессии, способу получения антитела и применению антитела для лечения заболеваний или нарушений, связанных с GITR.
Уровень техники
TNFRSF18, GITR (англ. Glucocorticoid-induced TNFR-related protein/индуцируемый глюкокортикоидами рецептор фактора некроза onyxone^TNFRSF18/tumor necrosis factor receptor superfamily) — мембранный белок, рецептор из надсемейства рецепторов фактора некроза опухоли.
GITR представляет собой трансмембранный белок типа I, который состоит из 216 аминокислот, молекулярная масса его составляет 26 кДа. N-концевой внеклеточный домен содержит 3 повтора TNFR-Cys и участок N-гликозилирования . 3 цистеин-богатых домена и цитоплазматический хвост GITR имеет значительную гомологию с 4- 1ВВ, 0X40 и CD27 (Nocentini, et al . (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94 : 6216-6221) .
Человеческий GITR экспрессируется на низких уровнях иммунореактивными Т-клетками, при этом клетки CD4+ демонстрируют более высокую экспрессию по сравнению с клетками CD8+. Экспрессия GITR значительно повышается на несколько дней после активации Т- клеток. GITR постоянно экспрессируется на высоких уровнях в регуляторных Т-клетках (Treg) , таких как клетки CD4+CD25+ или CD8+CD25+, и дополнительно повышается при активации этих клеток (Nocentini and Riccardi (2005) Е. J. Immunol. 35:1016)
При этом экспрессия GITR не ограничивается исключительно Т- клетками. В некоторых работах также указывалось, что GITR экспрессируется NK-клетками, макрофагами, В-клетками, дендритными клетками, тучными клетками и моноцитами (Nocentini and Riccardi (2005) Е. J. Immunol. 35:1016-1022) . GITR экспрессируется в лимфатических узлах, лейкоцитах периферической крови и в меньшей степени — в селезёнке, конституитивно экспрессируется в высоких количествах на Treg, в низких количествах - на наивных Т-клетках и клетках памяти.
Однако GITR экспрессируется не только на иммунных, но и на опухолевых клетках. Был проведен RNA-Seq анализ данных в отношении экспрессии GITR в 33 типах опухолей, высокий уровень экспрессии выявлен в ПРГШ (плоскоклеточный рак головы и шеи) , НМРЛ (немелкоклеточный рак легкого) , РМЖ (рак молочной железы) , раке пищевода и РМП (рак мочевого пузыря) .
Подобные результаты получены в ходе RNA-Seq анализа образцов 24 типов опухолей. Таким образом, GITR экспрессируется не только на иммунных клетках, но и на мембране опухолевых клеток. В образцах опухолей GITRL-Fc усиливал экспрессию генов, ассоциированных с Т- клетками, CD8 Т клетками, цитотоксичностью, Thl клетками, ИФН- гамма, NK, Teff, и Т-клеточными маркерами активации.
Экспрессия GITR и его лиганда не ограничивается гематопоэтическими клетками. GITR также экспрессируется на кератиноцитах, предшественниках остеокластов, GITRL - на эндотелиальных клетках.
GITRL представляет собой трансмембранный белок типа II, что типично для большинства представителей семейства лигандов TNF. Проводимые на данный момент исследования показывают, что человеческий GITRL, как правило, существует в виде тримера, хотя он также может находиться в виде мономера или образовывать другие мультимерные формы (Chattopadhyay, et al . (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. 104:19452-19457; Zhou, et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. 105:635-640) . Существуют данные, позволяющие предположить, что вырабатывается также и растворимая форма GITRL (Baltz, et al . (2008) Blood 112:3735-3743; Mahesh, et al . (2006) Eur . J. Immunol. 36: 2128-2138) . GITRL экспрессируется главным образом на антигенпрезентирующих клетках (АПК) , включая макрофаги, В-клетки, дендритные клетки и эндотелиальные клетки, которые могут функционировать как АПК (Nocentini and Riccardi (2005) Е. J. Immunol. 35:1016-1022; Agostini, et al . (2005) Infect. Immun. 73:7502-7508; и Nocentini, et al . (2007) E. J. Immunol. 37 : 11651169) .
Связывание GITRL на АПК c GITR на иммунореактивных Т-клетках запускает сигнализацию GITR, что костимулирует иммунореактивные Т- клетки и ингибирует супрессивную активность клеток регуляторных Т- клеток. Сигнализация GITR служит сигналом коактивации как для CD4+, так и CD8+ наивных Т-клеток, тем самым индуцируя или усиливая пролиферацию и эффекторную функцию, в частности, когда стимуляция рецепторов Т-клеток (РТК) близка к оптимальной (Schaer, et al . (2012) Curr. Opin. Immunol. 24:217224) . Более конкретно, GITR может оказывать несколько видов действия на эффекторные Т-клетки и регуляторные Т-клетки, включая: костимуляцию и активацию эффекторных Т-клеток так, что они становятся более устойчивыми к ингибированию, ингибирование регуляторных Т-клеток, снижение чувствительности эффекторных Т-клеток к супрессии регуляторными Т- клетками и частичное удаление регуляторных Т-клеток из циркуляции (Nocentini, et al . (2007) Eur . J. Immunol. 37:1165-1169) .
Основными функциями GITR, а значит и основными эффектами анти-GITR антитела, являются усиление пролиферации и функционирования эффекторных Т-клеток, а также ингибирующее влияние на супрессивное действие Tregs. Teff клетки генерируются изначально с неспособностью противостоять ингибиторному опухолевому микроокружению и супрессии Treg - клетками. Стимуляция GITR на повторных стадиях прайминга и экспансии, через анти-GITR агонист, растворимый GITR лиганд или DC вакцину, модулирует Teff и Treg опухолевый ответ в пользу первых, что приводит к регрессии опухоли. Таким образом, анти-GITR обеспечивает устойчивость Teff к супресссии Treg.
Вместе вышеуказанные функции, в частности, костимуляция иммунореактивных Т-клеток и нейтрализация супрессорной активности регуляторных Т-клеток, означают, что активация GITR приводит к повышению иммунного ответа. Такая активация потенциально может приводить к восстановлению иммунных ответов на инфекции и опухоли. Соответственно, молекулы, способные активировать GITR, имели бы ценность как иммуностимулирующие агенты в условиях, когда необходимо вызвать повышенный иммунный ответ.
Антитело должно обладать свойствами агониста рецептора GITR, с эффекторными, цитотоксическими свойствами в отношении Treg лимфоцитов .
Из уровня техники известны различные антитела к GITR (например, WO2015187835, WO2015031667, WO2017068186, W02017096189, WO2017214548 ) .
На данный момент на стадии доклинических и клинических исследований находится 23 агониста к GITR (антител/рекомбинантных GITRL) . Только 2 антитела находятся на 2 фазе КИ (TRX518, INCAGN1876), на 1 фазе КИ - AMG228, MEDI1873, МК-4166. Представлено очень мало клинических данных.
Однако, на данный момент, в мире нет ни одного антитела, которое специфически связывается с GITR, одобренного к терапевтическому использованию.
В связи с вышесказанным, актуальным является создание новых агонистических антител, которые взаимодействует с GITR, активирует рецептор, подавляет супрессорное действие Т-регуляторных лимфоцитов, ингибирует/деплетирует Т-супрессорное (регуляторное) звено иммунитета за счет ADCC эффекторных свойств.
BCD-166 представляет собой агонистическое моноклональное антитело, которое взаимодействует с GITR, активирует рецептор, подавляет супрессорное действие Т-регуляторных лимфоцитов, ингибирует/деплетирует Т-супрессорное (регуляторное) звено иммунитета за счет ADCC эффекторных свойств, тем самым увеличивая количество CD8+ и CD4+ эффекторных клеток и активируя Т- эффекторное звено иммунитета в микроокружении опухоли.
Краткое описание изобретения
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которое специфично связывается с GITR, включающему:
(a) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащему:
(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
NYGMH ( SEQ ID NO: 1) или YYWMY ( SEQ ID NO: 12);
(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
VIWFDGSNKFYTDSVKG ( SEQ ID NO: 2) или AISWNGGRTYYAESMKG (SEQ ID NO: 13) ;
(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
ELGGYYYDSSGFRPYYYGMDV (SEQ ID NO: 3) или NRYYSDPNYGMNL (SEQ ID NO: 14) , и
(b) вариабельный домен легкой цепи, содержащему:
(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
RASQSIGSWLA ( SEQ ID NO: 7) или TGTSTDIGTYKYIS (SEQ ID NO:
17) ;
(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
AASTLQR (SEQ ID NO: 8) или GVSHRPS (SEQ ID NO: 18);
(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
QQSHSHPLT (SEQ ID NO: 9) или SSYTSSGTW (SEQ ID NO: 19) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 1, 2 и 3, соответственно.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 12, 13 и 14, соответственно.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 7, 8 и 9, соответственно.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 17, 18 и 19, соответственно.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает:
- вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 1, 2 и 3, соответственно;
- вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 7, 8 и 9, соответственно.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает:
- вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 12, 13 и 14, соответственно;
- вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 17, 18 и 19, соответственно.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности
SEQ ID NO: 10.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO : 10.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности
SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO : 20.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает:
вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4;
вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает:
вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;
вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает:
вариабельный домен тяжелой цепи, которой содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15;
вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает:
вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15;
вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах моноклональное антитело, которое специфично связывается с GITR, представляет собой полноразмерное антитело IgG. В некоторых вариантах моноклональное антитело IgG относится к изотипу IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4 человека.
В некоторых вариантах моноклональное антитело IgG относится к изотипу IgGl человека.
В некоторых вариантах моноклональное антитело, которое специфично связывается с GITR, включает мутацию E345R в Fc фрагменте для увеличения агонистических свойств, антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) , но не комплементзависимой цитотоксичности (CDC) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 5.
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: б.
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: б .
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 11.
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает:
- тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 5;
- легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 11.
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает:
- тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5;
- легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает:
- тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: б;
- легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 11.
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает: - тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;
- легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 16.
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO : 16.
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает:
- тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 16;
- легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает:
- тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;
- легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, которая кодирует любое вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
В некоторых вариантах нуклеиновая кислота представляет собой
ДНК.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, содержащему вышеуказанную нуклеиновую кислоту .
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения клетки-хозяина для получения вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который включает трансформирование клетки вышеуказанным вектором.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к клетке- хозяину для получения вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащему вышеуказанную нуклеиновую кислоту.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, заключающемуся в культивировании вышеуказанной клетки- хозяина в культуральной среде в условиях, достаточных для получения указанного антитела, при необходимости, с последующим выделением и очисткой полученного антитела.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого GITR, содержащей вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в терапевтически эффективном количестве, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.
В некоторых вариантах фармацевтическая композиция предназначена для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого GITR, выбранного из группы: РШМ (рак шейки матки) , рак головы и шеи, рак желудка, РМЖ (рак молочной железы) , почечно-клеточный рак, КРР (колоректальный рак) , РЯ (рак яичника) , НМРЛ (немелкоклеточный рак легкого) .
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого GITR, содержащей вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в терапевтически эффективном количестве и по меньшей мере одно терапевтически активное противоопухолевое соединение в терапевтически эффективном количестве .
В некоторых вариантах фармацевтическая композиция предназначена для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого GITR, выбранного из группы РШМ (рак шейки матки) , рак головы и шеи, рак желудка, РМЖ (рак молочной железы) , почечно-клеточный рак, КРР (колоректальный рак) , РЯ (рак яичника) , НМРЛ (немелкоклеточный рак легкого) .
В некоторых вариантах фармацевтическая композиция включает терапевтически активное противоопухолевое соединение, которое выбирают из химиотерапевтического средства, антитела или противогормонального средства.
В некоторых вариантах фармацевтическая композиция включает терапевтически активное противоопухолевое соединение представляет антитело, которое выбирают из группы: антитела к PD1, антитела к PD-L1, антитела к CTLA4, антитела к анти 4-1ВВ, антитела к 0X40 или их комбинации .
В некоторых вариантах фармацевтическая композиция включает терапевтически активное противоопухолевое соединение, которое представляет собой малую молекулу.
В некоторых вариантах фармацевтическая композиция включает терапевтически активное противоопухолевое соединение, которое выбирают из группы активаторов врожденного или приобретенного иммунитета . В некоторых вариантах фармацевтической композиции вышеуказанное антитело и по меньшей мере одно терапевтически активное противоопухолевое соединение вводятся последовательно.
В некоторых вариантах фармацевтической композиции вышеуказанное антитело и по меньшей мере одно терапевтически активное противоопухолевое соединение вводятся одновременно.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу ингибирования биологической активности GITR у субъекта, нуждающемуся в таком ингибировании, включающему введение субъекту эффективного количества вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или нарушения, опосредованного GITR, включающему введение субъекту вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или вышеуказанной фармацевтической композиции, нуждающемуся в таком лечении, в терапевтически эффективном количестве.
В некоторых вариантах способ лечения включает заболевание или нарушение, которое выбрано из группы: РШМ (рак шейки матки) , рак головы и шеи, рак желудка, РМЖ (рак молочной железы) , почечно- клеточный рак, КРР (колоректальный рак) , РЯ (рак яичника) , НМРЛ
(немелкоклеточный рак легкого) .
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или вышеуказанной фармацевтической композиции для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, заболевания или нарушения, опосредуемого GITR.
В некоторых вариантах применение включает заболевание или нарушение, которое выбрано из группы: РШМ (рак шейки матки) , рак головы и шеи, рак желудка, РМЖ (рак молочной железы) , почечно- клеточный рак, КРР (колоректальный рак) , РЯ (рак яичника) , НМРЛ
(немелкоклеточный рак легкого) .
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Плазмида для наработки белка pEE-GITR-TEV-Fc lama.
Фиг. 2. Плазмида для наработки белка pEE-GITR -Fc.
Фиг. 3. Карта плазмиды pEE-humGITR-ligand-foldon-EPEA.
Фиг. 4. SDS-гель-электрофорез в 4-20% PAGE
1. Актемра 2,5 мг
2. маркер Fermentas unstained PW
3.
4. GITR-TEV-Fc-lama +b-ME 10 мл
5. Ангиопоетин 2-H6F + b-ME 10 мл
6.
7. GITR-TEV-Fc-lama -b -ME 10 мл 8. Ангиопоетин 2-H6F - b-ME 10 мл
Фиг. 5. SDS-гель-электрофорез
1. маркер Fermentas unstained PW
2.
3. hGITR лиганд -ЕРЕА среда до очистки 5 мл
4. hGITR лиганд -ЕРЕА среда после очистки 5 мл
5. hGITR лиганд -ЕРЕА
Фиг . б. Схема синтеза комбинаторной наивной библиотеки человека
Фиг 7. Карта фагмиды рН5 для клонирования Fab фаговых дисплейных библиотек.
Фиг. 8. Карта экспрессионной плазмиды pLL для наработки секретируемых Fab.
Фиг. 9. Карта экспрессионного вектора pEE-BCDl 66-01-001-VH- НС кодирующего тяжелую цепь антител для транзиентной продукции антител в клетках млекопитающих
Фиг. 10. Карта экспрессионного вектора pEE-BCD166-01-001-VK- СК кодирующего легкую цепь антител для транзиентной продукции антител в клетках млекопитающих
Фиг. 11. SDS-гель-электрофорез в 12% PAGE + b-ME
1. Актемра 5 мл
2. маркер Fermentas unstained PW
3.
4. анти-GITR антитело lot#1161 среда до очистки 5 мл
5. анти-GITR антитело lot#1161 среда после очистки 5 мл
6. анти-GITR антитело lot#1161 5 мл
7. анти-GITR антитело lot#1162 5 мл
8. анти-GITR антитело lot#1163 5 мл
9. анти-GITR антитело lot#1164 5 мл
10 анти-GITR антитело lot#1165 5 мл
11 анти-GITR антитело lot#1166 среда до очистки 5 мл 12 анти-GITR антитело lot#1166 среда после очистки 5 мл
13 анти-GITR антитело lot#1166 5 мл
14 анти-GITR антитело lot#1167 5 мл
Фиг. 12. SDS-гель-электрофорез в 12% PAGE + b-ME
1. маркер Fermentas unstained PW
2. анти-GITR антитело lot#1208 среда до очистки 10 мл
3. анти-GITR антитело lot#1208 среда после очистки 10 мл
4. анти-GITR антитело lot#1208 5 мл
5. анти-GITR антитело lot#1209 5 мл
6. анти-GITR антитело lot#1210 5 мл
7. анти-GITR антитело lot#1211 5 мл
8. анти-GITR антитело lot#1212 5 мл
9. анти-GITR антитело lot#1213 5 мл
10. анти-GITR антитело lot#1214 среда до очистки 10 мл
11. анти-GITR антитело lot#1214 среда после очистки 10 мл 12. анти-GITR антитело lot#1214 5 мл
Фиг. 13. График с результатами проверки специфической агонистической активности анти-GITR моноклональных антител лотов 1161 (BCD166-01-01 ) , 1210 BCD166- 01- 011 ) и 1213 BCD166-01-014 ) в тесте на репортерной клеточной линии.
Фиг. 14. График с результатами проверки специфического связывания антитела BCD166-01-01 с GITR человека, GITR мыши и GITR обезьяны циномолгус .
Фиг. 15. График с результатами проверки специфического связывания антитела BCD166-01-011 с GITR человека, GITR мыши и GITR обезьяны циномолгус.
Фиг. 16. График с результатами проверки специфического связывания антитела BCD166-01-014 с GITR человека, GITR мыши и GITR обезьяны циномолгус.
Фиг. 17. График с результатами уровня активации в клеточном агонистическом тесте исследуемых BCD166-01-01 , BCD166-02-01 , BCD166-01-014.
Фиг. 18. График с результатами величины ЕС50 в клеточном ADCC тесте исследуемого BCD166-02-01 , BCD166-01-01 , BCD166-01-014 , BCD166-02-014.
Фиг. 19. График с результатами уровня CDC исследуемого BCD166-01-01 , BCD166-02-01 , BCD166-01-014.
Фиг. 20. График с результатами влиянии исследуемых anti-GITR кандидатов на иммунореактивные клетки (NK) в сравнении с негативным контролем.
Фиг. 21. График с результатами влиянии исследуемых anti-GITR кандидатов на иммунореактивные клетки (В) в сравнении с негативным контролем.
Фиг. 22. График с результатами влиянии исследуемых anti-GITR кандидатов на иммунореактивные клетки (CD3) в сравнении с негативным контролем.
Фиг. 23. График с результатами влиянии исследуемых anti-GITR кандидатов на иммунореактивные клетки (CD8+ Т клетки) в сравнении с негативным контролем.
Фиг. 24. График с результатами влиянии исследуемых anti-GITR кандидатов на иммунореактивные клетки (CD4+ Т клетки) в сравнении с негативным контролем.
Фиг. 25. Анализ антитело-зависимой деплеции nTreg под действием изучаемых anti-GITR кандидатов для клеточного материала донора 1.
Фиг. 26. Анализ антитело-зависимой деплеции nTreg под действием изучаемых anti-GITR кандидатов для клеточного материала донора 2.
Фиг. 27. Анализ антитело-зависимой деплеции iTreg под действием изучаемых anti-GITR кандидатов для клеточного материала донора 1 и донора 2 Фиг. 28. Результаты анализа влияния анти-GITR антитела на уровень секреции провоспалительных цитокинов IL-2 и IFN- у, обуславливающих антираковых эффект.
Фиг. 29. Таблица данных констант аффиности связывания BCD166-02-01 кандидата с гамма рецепторами.
Фиг. 30. График по стабильности BCD166-02-01 при 72-часовой инкубации при 50 °С.
Фиг. 31. График по стабильности BCD166-01-014 при 72-часовой инкубации при 50 °С.
Фиг. 32. Средние значения объемов опухолей в группах в течение эксперимента .
Фиг. 33. Показатель торможения роста опухоли на 33 сутки.
Описание изобретения
Определения и общие методы
Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области.
Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.
Определения, связанные с антителом
TNFRSF18, GITR (англ. Glucocorticoid-induced TNFR-related protein/индуцируемый глюкокортикоидами рецептор фактора некроза onyxone^TNFRSF18/tumor necrosis factor receptor superfamily) — мембранный белок, рецептор из надсемейства рецепторов фактора некроза опухоли. GITR представляет собой трансмембранный белок типа I, который состоит из 216 аминокислот, молекулярная масса его составляет 26 кДа. N-концевой внеклеточный домен содержит 3 повтора TNFR-Cys и участок N-гликозилирования . 3 цистеин-богатых домена и цитоплазматический хвост GITR имеет значительную гомологию с 4-1ВВ, 0X40 и CD27 (Nocentini, et al . (1997) Proc.
Natl. Acad. Sci. 94:6216-6221) . Амплификация гена GITR и/или сверхэкспрессия его белка были обнаружены при многих раковых заболеваниях, в том числе при РШМ (раке шейки матки) , раке головы и шеи, раке желудка, РМЖ (раке молочной железы) , почечно-клеточном раке, КРР (колоректальном раке) , РЯ (раке яичника) , НМРЛ (немелкоклеточном раке легкого) .
Термин «связывающая молекула» включает в себя антитела и иммуноглобулины .
Термин «антитело» или «иммуноглобулин» (Ig), как использовано в данном описании, включает целые антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. «антигенсвязывающую часть») или его отдельные цепи. Термин "антитело» относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, взаимосвязанные дисульфидными связями, или его антигенсвязывающей части. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно называемую в данном описании как VH) и константную область тяжелой цепи. Известно пять типов тяжелых цепей антител млекопитающих, которые обозначают греческими буквами: , d, e, g и m. Присутствующий тип тяжелой цепи определяет класс антитела; указанные цепи обнаружены в антителах типа IgA, IgD, IgE, IgG и IgM соответственно. Различные тяжелые цепи отличаются по размеру и составу; и g содержат примерно 450 аминокислот, а m и e состоят примерно из 550 аминокислот. Каждая тяжелая цепь содержит две области, т.е. константную область и вариабельную область . Константная область является идентичной во всех антителах одного и того же изотипа, но отличается в антителах различного изотипа. Тяжелые цепи g, и d содержат константную область, которая состоит из трех константных доменов CHI, СН2 и СНЗ (выстроены в ряд) и шарнирной области, которая придает гибкость (Woof J., Burton D., Nat Rev Immunol 4, 2004, cc.89-99); тяжелые цепи m и e содержат константную область, которая состоит из четырех константных доменов CHI, СН2, СНЗ и СН4. У млекопитающих известно только два типа легких цепей, которые обозначают как лямбда (l) и каппа (к) . Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно называемой в данном описании как VL) и константной области легкой цепи. Примерная длина легкой цепи составляет 211-217 аминокислот. Предпочтительно легкая цепь представляет собой легкую каппа (к) - цепь, а константный домен CL предпочтительно представляет собой С- каппа (к) .
«Антитела» согласно изобретению могут представлять собой антитела любого класса (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, предпочтительно IgG) или подкласса (например, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl и IgA2, предпочтительно IgGl) .
Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR) , разбросанные между областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR) . Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2 , FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями хозяина или факторами, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторными клетками) , и первый компонент (Clq) классической системы комплемента .
Термин «антигенсвязывающая часть» антитела или «антигенсвязывающий фрагмент» (или просто «часть антитела» или «фрагмент антитела») , как использовано в данном описании, относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, включенных в термин "антигенсвязывающая часть» антитела включают (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН 1; (ii) F (abf ) 2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd- фрагмент, состоящий из доменов VH и СН 1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH в едином плече антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al . , (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH/VHH; и (vi) выделенная определяющая комплементарность область (CDR) . Кроме того, две области Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются разными генами, они могут быть соединены при помощи рекомбинантных способов с использованием синтетического линкера, который дает возможность получать их в виде единой белковой цепи, в которой области VL и VH спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al . (1988) Science 242:423-426; и Huston et al . (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883) . Предполагается, что такие одноцепочечные молекулы также включены в термин "антигенсвязывающая часть» антитела. Такие фрагменты антител получают с использованием общепринятых способов, известных специалистам в данной области, и эти фрагменты подвергают скринингу таким же образом, как и интактные антитела.
Предпочтительно CDR антигенсвязывающего участка или весь антигенсвязывающий участок антител по изобретению имеет происхождение из мыши, ламы или донорской человеческой библиотеки или по существу человеческое происхождение с определенными аминокислотными остатками, измененными, например, замещенными разными аминокислотными остатками с тем, чтобы оптимизировать конкретные свойства антитела, например KD, koff, IC50, ЕС50, ED50. Предпочтительно каркасные участки антитела по изобретению имеют человеческое происхождение или по существу человеческое происхождение (по крайней мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% человеческое происхождение) .
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий участок антитела по изобретению может происходить из других нечеловеческих видов, включая мыши, ламы, кролика, крысу или хомяка, но не ограничиваясь ими. Альтернативно, антигенсвязывающий участок может происходить из человеческих видов.
Термин «вариабельный» относится к тому факту, что определенные сегменты вариабельных доменов широко отличаются в последовательности среди антител. Домен V опосредует связывание антигена и определяет специфичность конкретного антитела к его конкретному антигену. Однако вариабельность неравномерно распределяется на участке вариабельных доменов из 110 аминокислот. Напротив, V области состоят из инвариантных фрагментов, называемых каркасными областями (FR) из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими участками чрезвычайной вариабельности, называемых «гипервариабельными областями» или CDR. Каждый вариабельный домен нативных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR, в основном принимающих конфигурацию бета-листов, связанных тремя гипервариабельными областями, которые образуют петли, связывающие, и в некоторых случаях являющиеся частью бета-складчатой структуры. Гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости с помощью FR и с гипервариабельными областями другой цепи вносят вклад в образование антигенсвязывающего сайта антител. Константные домены не принимают непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ, ADCC) .
Термин «гипервариабельная область» по данному описанию относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Обычно гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из «области, определяющей комплементарность» или «CDR», и/или такие остатки из «гипервариабельной петли».
В некоторых случаях может также быть предпочтительным изменение одного или более остатков аминокислот CDR-участков с целью повышения аффинности связывания с целевым эпитопом. Это известно, как «созревание аффиности» и в некоторых случаях может выполняться в связи с гуманизацией, например, в ситуациях, когда гуманизация антитела приводит к снижению специфичности или аффинности связывания, и не представляется возможным в достаточной степени улучшить специфичность или аффинность связывания с помощью только обратных мутаций. Различные методы созревания аффинности известны в данной области техники, например, способ in vitro сканирующего насыщающего мутагенеза, описанный Burks et al . , Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997), и способ пошагового in vitro созревания аффинности, предложенный Wu et al . , Proc Natl Acad Sci USA 95: 6037 6042 (1998) .
«Каркасные области» (FR) представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от CDR остатков. Обычно каждый вариабельный домен имеет четыре FR, определяемые как FR1, FR2, FR3 и FR4. Если CDR определяются согласно Rabat, FR остатки легкой цепи локализуются, приблизительно, в области остатков 1-23 ( LCFR1 ) , 35-49 ( LCFR2 ) , 57-88 ( LCFR3 ) и 98-107 ( LCFR4 ) , а остатки FR тяжелой цепи локализуются, приблизительно, в области остатков 1-30 (HCFR1 ) , 36-49 (HCFR2 ) , 66-94 (HCFR3 ) и 103- 113 (HCFR4 ) в тяжелой цепи. Если участки CDR содержат аминокислотные остатки из гипервариабельных петель, FR остатки легкой цепи локализуются, приблизительно, в остатках 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) и 97-107 (LCFR4) в легкой цепи, a FR остатки тяжелой цепи локализуются, примерно, в остатках 1-25 (HCFRI), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) и 102-113 (HCFR4) в остатках тяжелой цепи. В некоторых примерах, когда CDR содержит аминокислоты как из CDR по Rabat, так и аминокислоты из гипервариабельной петли, FR соответствующим образом корректируются. Например, когда CDRH1 включает аминокислоты Н26-Н35, остатки FR1 тяжелой цепи находятся в положениях 1-25, а остатки FR2 находятся в положениях 36-49.
Кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина (англ, fragment crystallizable region, Fc region, Fc) — это концевая часть молекулы иммуноглобулина, которая взаимодействует с Fc-рецептором на поверхности клетки и с некоторыми белками системы комплемента. Данное свойство позволяет антителам активировать иммунную систему. Fc-участок IgG, IgA и IgD изотипов состоит из двух одинаковых белковых фрагментов, соответственно, второго и третьего константных доменов двух тяжелых цепей; в случае изотипов IgM и IgE Fc содержит три константных домена тяжелых цепей (домены СН 2- 4 ) в каждой полипептидной цепочке .
Антитело по данному изобретению, «которое связывает» целевой антиген, представляет собой антитело, которое связывает антиген с достаточной аффинностью так, что антитело можно применять в качестве диагностического и/или терапевтического агента при нацеливании на белок или клетку, или ткань, экспрессирующую антиген, и в незначительной степени перекрестно реагирует с другими белками. По данным аналитических методов: сортинга флуоресцентно-активированных клеток (FACS), радиоиммунопреципитации (RIA) или ИФА (ELISA) , в таких вариантах изобретения степень связывания антитела с белком, не являющимся «мишенью» (с «нецелевым белком») , составляет менее 10% от связывания антитела с конкретным белком-мишенью. По отношению к связыванию антитела с молекулой-мишенью термин «специфическое связывание» или выражения «специфически связывается с» или «специфический к» конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном полипептиде-мишени означает связывание, которое заметно (измеримо) отличается от неспецифического взаимодействия (например, в случае ЬН1-44 или ЬН1-81 неспецифическое взаимодействие представляет собой связывание с бычьим сывороточным альбумином, казеином, фетальной бычьей сывороткой или нейтравидином) .
Специфическое связывание можно определять количественно, например, определяя связывание молекулы по сравнению со связыванием контрольной молекулы. Например, специфическое связывание можно определять конкурентной реакцией с другой молекулой, аналогичной мишени, например, с избытком немеченой мишени. В этом случае специфическое связывание указывается, если связывание меченой мишени с зондом конкурентно ингибируется избытком немеченой мишени. В данном описании термин «специфическое связывание» или выражения «специфически связывается с» или «специфический к» конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном полипептиде-мишени можно характеризовать на примере молекулы, имеющей Kd к мишени по меньшей мере около 200 нМ, или же по меньшей мере около 150 нМ, или же по меньшей мере около 100 нМ, или же по меньшей мере около 60 нМ, или же по меньшей мере около 50 нМ, или же по меньшей мере около 40 нМ, или же по меньшей мере около 30 нМ, или же по меньшей мере около 20 нМ, или же по меньшей мере около 10 нМ, или же по меньшей мере около 8 нМ, или же по меньшей мере около 6 нМ, или же по меньшей мере около 4 нМ, или же по меньшей мере около 2 нМ, или же по меньшей мере около 1 нМ или выше. В одном варианте изобретения термин «специфическое связывание» относится к связыванию, при котором молекула связывается с конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде, практически не связываясь с каким-либо другим полипептидом или эпитопом на полипептиде .
Термин «Ка», как использовано в данном описании, относится к скорости ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.
Термин «Kd», как использовано в данном описании, относится к скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.
«Аффинность связывания» обычно относится к силе совокупных нековалентных взаимодействий между единичным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном) . Если не указано иначе, «аффинность связывания» относится к внутренней (характерной, истинной) аффинности связывания, которая отражает 1:1 взаимодействие между членами пары связывания (например, антителом и антигеном) . Аффинность молекулы X к своему партнеру Y обычно можно представить константной диссоциации (Kd) . Желательно, чтобы величина Kd составляла, примерно, 200 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 60 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 8 нМ, б нМ, 4 нМ, 2 нМ, 1 нМ или менее. Аффинность можно измерять обычными методами, известными в уровне техники, включая методы по данному описанию. Низкоаффинные антитела обычно медленно связываются с антигеном и имеют тенденцию легко диссоциировать, тогда как высокоаффинные антитела обычно быстрее связывают антиген и имеют тенденцию дольше оставаться в связанном состоянии. В уровне техники известны различные методы измерения аффинности связывания, любой из этих методов можно использовать для целей настоящего изобретения.
В одном варианте изобретения «Кб» или «величину Кб» по данному изобретению измеряют методами поверхностного плазмонного резонанса на приборе В1Асоге™-2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C, используя чипы с иммобилизованным антигеном СМ5 при ~10 относительных единицах (единицах отклика, RU) . Коротко говоря, биосенсорные чипы с карбоксиметилдекстраном (СМ5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом Ы-этил-Ы' - ( 3- диметиламинопропил) -карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями производителя. Антиген разводят 10 мМ раствором ацетата натрия, pH 4.8, до концентрации 5 мкг/мл ( ~0.2 мкМ) , а затем вводят (инжекция) при скорости потока 5 мкл/минута до достижения, примерно, 10 относительных единиц (RU) связанного белка. После введения антигена вводят 1 М раствор этаноламина, чтобы блокировать непрореагировавшие группы. Для кинетических измерений двукратные серийные разведения Fab (например, от 0.78 нМ до 500 нМ) вводят в PBS с 0.05% Tween 20 (PBST) при 25°С при скорости потока, примерно, 25 мкл/мин. Величины скорости ассоциации (коп) и скорости диссоциации (koff) рассчитывают, применяя простую модель Ленгмюра для связывания один-плюс-один (BIAcore Evaluation Software версия 3.2), с помощью одновременного получения сенсограммы ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (Кб) рассчитывают как отношение koff/kon. См., например, Chen, Y., et al . , (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881. Если по данным вышеуказанного метода поверхностного плазмонного резонанса скорость ассоциации превышает 106 М-1 сек-1, тогда ее можно определять методом тушения флуоресценции, который измеряет увеличение или уменьшение интенсивности флуоресцентной эмиссии (возбуждение=295 нм; эмиссия (излучение ) =340 нм, полоса 16 нм) при 25 °С раствора антитела против антигена (Fab форма) с концентрацией 20 нМ в PBS, pH 7.2, в присутствии увеличивающихся концентраций антигена, измеряемых с помощью спектрометра, такого как спектрофотометр остановленного потока (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-Aminco ( ThermoSpectronie ) серии 8000 с кюветой с перемешиванием.
Термин «Koff» относится к константе скорости диссоциации конкретного взаимодействия связывающей молекулы и антигена. Константу скорости диссоциации koff можно измерить посредством биослойной интерферометрии, например, с помощью системы Octet™.
«Скорость ассоциации» («oh-rate») или «коп» по данному изобретению можно также определять тем же самым описанным выше методом поверхностного плазмонного резонанса на приборе BIAcore™- 2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C, используя чипы с иммобилизованным антигеном СМ5 при ~10 относительных единицах (единицах отклика, RU) . Коротко говоря, биосенсорные чипы с карбоксиметилдекстраном (СМ5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом -этил- ' - ( 3-диметиламино пропил) - карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями производителя. Антиген разводят 10 мМ раствором ацетата натрия, pH 4.8, до концентрации 5 мкг/мл (~0.2 мкМ) , а затем вводят (инжекция) при скорости потока 5 мкл/минута до достижения, примерно, 10 относительных единиц (RU) связанного белка. После введения антигена вводят 1 М раствор этаноламина, чтобы блокировать непрореагировавшие группы.
Если специально не указано иначе, выражения «биологически активный», и «биологическая активность», и «биологические характеристики», по отношению к полипептиду по данному изобретению, означают обладание способностью связываться с биологической молекулой.
Выражение «биологическая молекула» относится к нуклеиновой кислоте, белку, углеводу, липиду и их комбинации. В одном варианте изобретения биологическая молекула существует в природе .
Участки антител, такие как Fab- и F (ab ' ) 2-фрагменты, могут быть получены из целых антител с использованием традиционных методов, таких как папаиновый или пепсиновый гидролиз целых антител. Более того, антитела, части антител и молекулы иммуноадгезии могут быть получены с использованием стандартных методов рекомбинантной ДНК, например, как описано в настоящем документе .
Термин «рекомбинантное антитело» означает антитело, которое экспрессируется в клетке или клеточной линии, содержащей нуклеотидную последовательность (нуклеотидные последовательности) , которая кодирует антитела, при этом указанная нуклеотидная последовательность (нуклеотидные последовательности) не ассоциирована с клеткой в природе.
Термин «вариантное» антитело, используемый в данном документе, относится к антителу, имеющему аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности его «родительского» антитела путем добавления, удаления и/или замены одного или более аминокислотных остатков относительно последовательности родительского антитела. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вариантное антитело содержит по меньшей мере одно или более (например, от одного до двенадцати, например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять, десять, одиннадцать или двенадцать; и в некоторых вариантах осуществления изобретения от одного до примерно десяти) добавлений, делеций и/или замен аминокислот относительно родительского антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретение добавления, делеции и/или замены осуществляются на CDR-участках вариантного антитела. Идентичность или гомология по отношению к последовательности вариантного антитела определяется в настоящем документе как процент аминокислотных остатков в последовательности вариантного антитела, которые идентичны остаткам родительского антитела, после выравнивания последовательностей и введения гэпов, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательности. Вариантное антитело сохраняет способность связываться с тем же антигеном, и предпочтительно эпитопом, с которым связывается родительское антитело, и в некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одно свойство или биологическая активность превосходит аналогичные свойства родительского антитела. Например, вариантное антитело может иметь, например, более выраженную аффинность связывания, более длительный период полувыведения, более низкое значение ИК50 или повышенную способность подавлять биологическую активность антигена по сравнению с родительским антителом. Особый интерес в настоящем документе представляет вариантное антитело, показывающее биологическую активность, превышающую по меньшей мере в 2 раза (предпочтительно, по меньшей мере в 5 раз, 10 раз или 20 раз) биологическую активность родительского антитела.
Термин «биспецифическое антитело» означает антитело, содержащее антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающие домены, которые способны к специфическому связыванию с двумя различными эпитопами на одной биологической молекуле или способны к специфическому связыванию с эпитопами на двух различных биологических молекулах. Биспецифичное антитело также упоминается в настоящем документе, как обладающее «двойной специфичностью» или как являющееся антителом с «двойной специфичностью».
Термин «химерное антитело» относится в широком смысле к антителу, которое содержит одну или более областей из одного антитела, и одну или более областей из одного или нескольких других антител, как правило, антитело, частично человеческого происхождения и частично нечеловеческого происхождения, то есть полученное частично из не относящегося к человеку животного, например, мыши, крысы или другого грызуна или верблюдовых, таких как лама или альпака. Химерные антитела являются предпочтительными по сравнению с нечеловеческими антителами для того, чтобы снизить риск иммунного ответа, направленного против антител у человека, например, ответа, направленного против мышиных антител у человека в случае мышиного антитела. Примером типичного химерного антитела является то, в котором последовательности вариабельного участка являются мышиными, в то время как последовательности константного участка являются человеческими. В случае химерного антитела нечеловеческие части могут быть подвергнуты дальнейшему изменению с целью гуманизации антитела.
Термин «гуманизация» относится к факту, что когда антитело имеет полностью или частично нечеловеческое происхождение, например, антитело мыши или ламы, полученное при иммунизации мышей или лам, соответственно, с представляющим интерес антигеном, или является химерным антителом на основе такого антитела мыши или ламы, можно заменить некоторые аминокислоты, например, в каркасных областях и константных доменах тяжелой и легкой цепей, с тем чтобы избежать или свести к минимуму иммунный ответ у человека. Специфичность взаимодействия антитела с антигеном-мишенью присуща главным образом аминокислотным остаткам, расположенных в шести CDR-участках тяжелой и легкой цепи. Поэтому аминокислотные последовательности внутри CDR-участков, являются гораздо более вариабельными между отдельными антителами, по сравнению с последовательностями вне CDR-участков. Поскольку последовательности CDR участков отвечают за большинство антитело- антиген взаимодействий, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфического природного антитела, или в более общем плане какого-либо специфического антитела с данной аминокислотной последовательностью, например, путем конструирования экспрессионных векторов, которые экспрессируют последовательности CDR-участков из специфического антитела и каркасные последовательности другого антитела. В результате, можно «гуманизировать» нечеловеческое антитело и в значительной степени сохранить специфичность связывания и аффинность исходного антитела. Несмотря на то, что невозможно точно предсказать иммуногенность и тем самым иммунный ответ, направленный против антитела у человека на конкретное антитело, нечеловеческие антитела, как правило, более иммуногенны, чем человеческие антитела. Химерные антитела, у которых инородные (например, грызуна или верблюда) константные участки были заменены последовательностями человеческого происхождения, показали в целом более низкую иммуногенность, чем антитела полностью инородного происхождения, и существует тенденция использовать в терапевтических антителах гуманизированные или полностью человеческие антитела. Химерные антитела или другие антитела нечеловеческого происхождения, таким образом, могут быть гуманизированы, чтобы снизить риск иммунного ответа, направленного против антитела, у человека.
Для химерных антител, гуманизация обычно включает в себя модификацию каркасных участков последовательностей вариабельного участка. Аминокислотные остатки, которые являются частью участков, определяющих комплементарность (CDR участков) , чаще всего не будут изменяться в связи с гуманизацией, хотя в некоторых случаях это может быть желательным, чтобы изменить отдельные аминокислотные остатки CDR-участка, например, чтобы удалить участок гликозилирования, участок дезамидирования, участок изомеризации аспартата или нежелательный остаток цистеина или метионина. N- связанное гликозилирование происходит путем присоединения олигосахаридной цепи к остатку аспарагина в трипептидной последовательности Asn-X-Ser или Asn-X-Thr, где X может быть любой аминокислотой, кроме Pro. Удаление участка N-гликозилирования может быть достигнуто путем мутирования Asn или Ser/Thr остатка другим остатком, предпочтительно путем консервативной замены. Дезамидирование остатков аспарагина и глутамина может происходить в зависимости от таких факторов, как pH и обнажение поверхности. Остатки аспарагина особенно восприимчивы к дезамидированию, прежде всего, если они присутствуют в последовательности Asn-Gly, и в меньшей степени в других дипептидных последовательностях, таких как Asn-Ala. При наличии такого дезамидированного участка, например, Asn-Gly в последовательности CDR-участка, может быть предпочтительным удалить этот участок, как правило, путем консервативной замены для удаления одного из вовлеченных остатков.
В данной области техники известны многочисленные способы гуманизации последовательности антитела. Одним из наиболее часто используемых методов является трансплантация CDR-участков. Трансплантация CDR участка может быть основана на определениях CDR-участков по Rabat, хотя в более поздней публикации (Magdelaine-Beuzelin et al . , Crit Rev. Oncol Hematol. 64:210 225 (2007)) предполагается, что определение no IMGT® (the international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org) может улучшить результат гуманизации (см Lefranc et al . , Dev. Comp Immunol. 27:55-77 (2003)) . В некоторых случаях, трансплантация CDR-участкка может уменьшить специфичность и аффинность связывания, и, следовательно, биологическую активность, в CDR трансплантированном нечеловеческом антителе, по сравнению с родительским антителом, из которого получены CDR-участки. Обратные мутации (иногда именуемые «ремонт каркасного участка») , могут применяться в выбранных положениях CDR трансплантированного антитела, как правило, в каркасных участках, для того, чтобы восстановить специфичность и аффинность связывания родительского антитела. Определение позиций для возможных обратных мутаций может быть выполнено с использованием информации, имеющейся в литературе и в базах данных антител. Аминокислотные остатки, которые являются кандидатами для обратных мутаций, как правило, расположены на поверхности молекулы антитела, в то время как остатки, которые углублены или имеют низкую степень обнажения поверхности обычно не будут подвержены изменениям. Метод гуманизации, альтернативный трансплантации CDR-участка и обратной мутации, представляет собой изменение поверхности, при котором неэкспонированные на поверхности остатки нечеловеческого происхождения, сохраняются, в то время как экспонированные на поверхности остатки изменяются в человеческие остатки.
Существует две технологии получения полностью человеческих антител: с использованием in vitro собранных фаговых библиотек или in vivo иммунизацией гуманизированных животных (мышей, крыс и т.д. ) .
Конструирование комбинаторных фаговых библиотек антител начинается с выбора источника генного репертуара, в зависимости от которого можно выделить несколько видов библиотек антител: наивные, иммунные или синтетические. Наивные и иммунные библиотеки конструируют, используя естественным образом реорганизованные гены, кодирующие вариабельные домены иммуноглобулинов здоровых или иммунных к какому-либо антигену доноров, соответственно. Для этого выделяют мРНК клеток лимфоидного ряда, продуцирующих антитела. Чаще всего это лимфоциты периферической крови, но в некоторых случаях используют спленоциты [Sheets MD, Amersdorfer Р, Finnern R, Sargent P, Lindquist E, Schier R, et al . Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: the production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens. Proc Natl Acad Sci U S A 1998,95:6157-6162 и de Haard HJ, van Neer N, Reurs A, Hufton SE, Roovers RC, Henderikx P, et al . A large non-immunized human Fab fragment phage library that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodies. J Biol Chem 1999,274:18218-18230.], клетки миндалин или лимфоциты костного мозга [Vaughan TJ, Williams AJ, Pritchard К, Osbourn JK, Pope AR, Earnshaw JC, et al . Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library. Nat Biotechnol 1996,14:309-314.]. На основе мРНК синтезируют кДНК, при этом для праймирования реакции могут быть взяты олиго-dT праймеры и статистические гексаолигонуклеотиды, что позволяет получать кДНК копии всех возможных вариантов генов, кодирующих вариабельные домены антител [Улитин АБ, Капралова МВ, Даман АГ, Шепеляковсткая АО, Булгакова ЕВ, Фурсова КК, et al . Библиотека миниантител человека в формате фагового дисплея. Создание и апробация. ДАН: Изд-во «Наука»; 2005.].
Сразу могут использоваться один или несколько праймеров, ограничивающих набор амплифицируемых генов до одного или нескольких семейств генов вариабельных доменов или изотипов антител уже на уровне кДНК [Marks JD, Hoogenboom HR, Bonnert TP, McCafferty J, Griffiths AD, Winter G. Bypassing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol 1991,222:581-597]. Праймеры, используемые для амплификации генов, кодирующих иммуноглобулины, комплементарны их наиболее консервативным участкам. Их последовательности выбирают из коллекций генов, которые организованы в базы данных, такие как база данных Rabat или V BASE. Дизайн праймеров также предусматривает наличие в них внутренних сайтов рестрикции, позволяющих клонировать ПЦР продукты в состав соответствующих векторов .
Конструирование синтетических библиотек основано на замене природных CDR на набор случайных последовательностей, что позволяет создавать огромное разнообразие антигенсвязывающих сайтов .
Фаговый дисплей является первой и самой широко распространенной in vitro технологией для поиска антител. В 1985 году Смит обнаружил, что последовательности чужеродной ДНК могут быть клонированы в нитевидный бактериофаг М13 таким образом, что клонированные последовательности генов экспрессируются на поверхности фаговых частиц как слитые белки (Smith GP : Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 1985, 228:1315-1317.) . Таким образом, можно проводить селекцю интересующих нас слитых белков на основе их способности связывать другие белки. Это открытие было скомбинировано с методами ПЦР-амплификации, что позволило клонировать кДНК репертуар генов иммуноглобулинов для создания разнообразных фаговых библиотек, содержащих вариабельные домены, которые могут быть использованы для быстрого поиска мишень-специфичных моноклональных антител. Репертуар фаговых библиотек отражает репертуар антител В-лимфоцитов каждого человека или животного, кровь которого была использована при создании библиотеки. В 1995 году две статьи сообщили о создании генетически сконструированных мышей, которые экспрессировали полностью человеческие антитела, репертуар которых может быть соспоставим с полученных гибридомной технологией (Lonberg N, Taylor LD, Harding FA, Trounstine M, Higgins KM, Schramm SR, Kuo CC, Mashayekh R, Wymore K, McCabe JG et al . : Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 1994, 368:856-859) У этих животных были целенаправленно разрушены гены своих собственных эндогенных тяжелых и к легких цепей иммунноглобулинов и введены трансгены, представляющие собой сегменты генов тяжелых и к легких цепей человека . Оказалось , что репертуар генов человека может быть использован мышиной иммунной системой для создания высокоспецифичных и высокоаффинных антител ко большему разнообразию антигенов. Несмотря на то, что трансгенные мыши экспрессируют В-клеточные рецепторы, которые по существу являются гибридными мышиных и человеческих (человеческий иммуноглобулин, мышиные Ig , Irb и другие сигнальные молекулы) , их В-клетки нормально развиваются и созревают. В некоторых случаях может также быть предпочтительным изменение одного или более остатков аминокислот CDR-участков с целью повышения аффинности связывания с целевым эпитопом. Это известно, как «созревание аффинности» и в некоторых случаях может выполняться в связи с гуманизацией, например, в ситуациях, когда гуманизация антитела приводит к снижению специфичности или аффинности связывания, и не представляется возможным в достаточной степени улучшить специфичность или аффинность связывания с помощью только обратных мутаций. Различные методы созревания аффинности известны в данной области техники, например, способ in vitro сканирующего насыщающего мутагенеза, описанный Burks et al . , Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997), и способ пошагового in vitro созревания аффинности, предложенный Wu et al . , Proc Natl Acad Sci USA 95: 6037 6042 (1998) .
Термин «моноклональное антитело» или «тАЬ» относится к антителу, которое синтезировано и выделено отдельной клональной популяцией клеток. Клональная популяция может быть клональной популяцией иммортализованных клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммортализованные клетки в клональной популяции являются гибридными клетками, гибридомами, которые обычно получают путем слияния отдельных В-лимфоцитов от иммунизированных животных с отдельными клетками лимфоцитарной опухоли. Гибридомы представляют собой тип сконструированных клеток и не встречаются в природе.
«Нативные антитела» обычно являются гетеротетрамерными гликопротеидами с молекулярной массой примерно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как количество дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьирует в разных изотипах иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет равномерно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH) , за которым следует несколько константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (VL) и константный домен на другом конце. Константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Полагают, что конкретные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи.
Определение «выделенный» («изолированный») , применяемое для описания различных антител по данному описанию, означает антитело, идентифицированное и выделенное и/или регенерированное из клетки или клеточной культуры, в которой оно экспрессируется. Примеси (загрязняющие компоненты) из природной среды представляют собой материалы, которые, как правило, мешают диагностическому или терапевтическому применению полипептида, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах изобретения антитело очищают (1) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности, при использовании секвенатора с вращающейся стеклянной чашечкой (секвенатора Эдмана) , или (2) до гомогенности методом SDS-PAGE в невосстанавливающих или восстанавливающих условиях с применением окрашивания Кумасси бриллиантовым голубым или, предпочтительно, серебром. Выделенное антитело включает антитела in situ внутри рекомбинантных клеток, так как по меньшей мере один компонент природной среды полипептида отсутствует. Обычно выделенный полипептид получают в результате по меньшей мере одной стадии очистки.
«Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена от по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты-примеси, с которой она обычно связана в естественном источнике нуклеиновой кислоты антитела. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от той формы или набора, в которых она находится в естественных условиях. Таким образом, выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от молекулы нуклеиновой кислоты, существующей в клетках в естественных условиях. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, находящуюся в клетках, в которых в норме происходит экспрессия антитела, например, в случае, если молекула нуклеиновой кислоты имеет локализацию в хромосоме, отличную от ее локализации в клетках в естественных условиях.
Термин «эпитоп» при использовании в данном документе относится к части (детерминанте) антигена, который специфически связывается со связывающей молекулой (например, и антитело или родственная молекула, такие как биспецифичная связывающая молекула) . Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или углеводы, или боковые цепи сахаров, и, как правило, имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики зарядов. Эпитоп может быть «линейным» или «конформационным. » В линейном эпитопе, все точки взаимодействия между белком (например, антиген) и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) происходит линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка. В конформационном эпитопе, точки взаимодействия происходят через аминокислотные остатки на белке, отделенные друг от друга в первичной аминокислотной последовательности. Когда желаемый эпитоп антигена определен, можно генерировать антитела к этому эпитопу с использованием методик, хорошо известных в данной области техники. Кроме того, генерация и характеристика антител или других связывающих молекул могут пролить свет на информацию о желательных эпитопах. Основываясь на этой информации, можно затем конкурентно скринировать связывающие молекулы для связывания с теми же или аналогичными эпитопами, например, путем проведения исследований конкуренции, чтобы найти связывающие молекулы, которые конкурируют за связывание с антигеном.
Термин «пептидный линкер» в настоящем документе означает любой пептид с возможностью соединения доменов с длиной в зависимости от доменов, которые он связывает между собой, содержащий любую аминокислотную последовательность . Предпочтительно пептидный линкер имеет длину более 5 аминокислот и состоит из любого набора аминокислот, выбранного из G, A, S, Р, Е, Т, D, К.
Термин «in vitro» относится к биологическому объекту, биологическому процессу или биологической реакции вне организма, смоделированному в искусственных условиях. Например, рост клеток in vitro должен пониматься как рост клеток в среде вне организма, например, в пробирке, культуральном флаконе или микропланшете.
Термин «1С5о» (50% ингибирующая концентрация) относится к концентрациям препарата, при которых измеряемая активность или отклик, например, рост или пролиферация клеток, таких как опухолевые клетки, ингибируется на 50%. Значение IC50 может оцениваться с помощью соответствующих кривых зависимости ответа от логарифма дозы, с использованием специальных статистических программ для обработки кривых.
Термин GI50 (50% ингибирование роста) относится к концентрациям препарата, при которых пролиферация клеток, таких как опухолевые клетки, ингибируется на 50%.
Термин ED50 (ЕС50) (50% эффективная доза/концентрация) относится к концентрациям препарата, при которых измеряемый биологический эффект достигается на 50% (может включать цитотоксичность) .
Термин «антипролиферативное действие» подразумевает остановку или ингибирование роста пролиферирующих клеток, таких как раковые клетки.
Понятие «эффекторная функция» антитела относится к видам биологической активности, связанным с Fc-областью (нативной последовательностью Fc-области или с вариантами аминокислотной последовательности Fc-области) антитела, и варьируют в зависимости от изотипа антитела. Примерами эффекторных функций антитела являются: С1q— связывание; комплементзависимая цитотоксичность; связывание Fc-рецептора; антитело-зависимая клеточно- опосредованная цитотоксичность (ADCC) ; фагоцитоз; понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора, BCR) и В-клеточная активация.
«Антитело-зависимая клеточная цитотоксичность» или «А СС» относится к опосредованному клетками ответу, при котором неспецифичные цитотоксические клетки, которые экспрессируют рецепторы Fc (FcR) (например, природные клетки-киллеры (NK) , нейтрофилы и макрофаги) , узнают связанное антитело на клетке- мишени и затем вызывают лизис или фагоцитоз клетки-мишени. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcyRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcyRI, FcyRII и FcyRIII. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках суммирована в таблице 3 на странице 464 в публикации Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991) . Чтобы оценить активность в ADCC представляющей интерес молекулы можно осуществить анализы ADCC in vitro, такие как анализы, описанные в патентах США W 5500362 или 5821337. Применимые эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и природные клетки-киллеры (NK) . Альтернативно или дополнительно ADCC- активность представляющей интерес молекулы можно оценить in vivo, например, в животной модели, такой как модель, описанная в Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998) .
«Эффекторными клетками человека» являются лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcR и осуществляют эффекторные функции. Предпочтительно клетки экспрессируют, по меньшей мере, FcyRIII и осуществляют ADCC-эффекторную функцию. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) , природные клетки-киллеры (NK) , моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; при этом предпочтительны РВМС и NK-клетки. Эффекторные клетки могут быть выделены из их природного источника, например из крови или РВМС, как описано в настоящей публикации.
Термины «Fc-рецептор» и «FcR» используют для описания рецептора, который связывается с Fc-областью антитела. Предпочтительным FcR является FcR человека с нативной последовательностью. Кроме того, предпочтительным FcR является FcR, который связывает IgG-антитело (гамма-рецептор) , и к предпочтительным рецепторам относятся рецепторы подклассов FcyRI, FcyRII и FcyRIII, включая аллельные варианты и альтернативно сплайсируемые формы указанных рецепторов. Рецепторы FcyRII включают FcyRI IA («активирующий рецептор») и FcyRI IB («ингибирующий рецептор») , которые имеют сходные аминокислотные последовательности, которые отличаются главным образом своими цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор FcyRI IA содержит в своем цитоплазматическом домене основанный на тирозине мотив активации иммунорецептора (ITAM) . Ингибирующий рецептор FcyRI IB содержит в своем цитоплазматическом домене основанный на тирозине мотив ингибирования иммунорецептора (ITIM) (см. обзор в Ваёгоп, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)) . Обзор, посвященный FcR, представлен в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991) . Другие FcR, включая FcR, которые будут идентифицированы в будущем, включены в настоящем описании в термин «FcR». Термин также включает неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG в плод.
«Комплемент-зависимая цитотоксичность» и «СБС» относятся к способности молекулы лизировать мишень в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (Clq) с молекулой (например, антителом) в комплексе со своим антигеном. Чтобы оценить активацию комплемента можно осуществить анализ СБС, например, как описано в Gazzano-Santoro et al . , J. Immunol. Methods 202: 163 (1996) .
Термин «идентичность» или «гомологичность» следует толковать как означающее процентное содержание остатков аминокислот в кандидатной последовательности, которые идентичны остаткам соответствующей последовательности, с которой ее сравнивают, после сравнения последовательностей и введения «брешей», если необходимо достичь максимального процента идентичности для полной последовательности и не учитывая любые консервативные замещения как часть идентичности последовательности. Ни N- или С-концевой удлиняющей, ни инсерционные сегменты не следует толковать как уменьшающие идентичность или гомологичность . Методы и компьютерные программы для сравнения хорошо известны. Идентичность последовательности можно определить, используя программное обеспечение для анализа последовательности (например, Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave . , Madison, WI 53705) . Данное программное обеспечение подходит для подобных последовательностей путем определения степени гомологичности для разнообразных замещений, делеций (элиминирований) и других модификаций .
Фразу «гомологичный», что касается полипептидной последовательности антитела, следует толковать как антитело, проявляющее по крайней мере, 70%-ную, предпочтительно 80%-ную, более предпочтительно 90%-ную и наиболее предпочтительно 95%-ную идентичность последовательности относительно полипептидной последовательности. Термин в отношении последовательности нуклеиновой кислоты следует толковать как последовательность нуклеотидов, проявляющих, по крайней мере, 85%-ную, предпочтительно 90%-ную, более предпочтительно 95%-ную и наиболее предпочтительно 97%-ную идентичность последовательности относительно последовательности нуклеиновой кислоты.
Предлагается модификация (и) аминокислотных последовательностей антител, описанных в настоящей публикации. Например, может быть желательным улучшение аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела получают введением соответствующих изменений нуклеотидов в нуклеиновую кислоту антитела или пептидным синтезом. Такие модификации включают, например, делеции, и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Осуществляют любое сочетание делеции, инсерции и замены, чтобы получить конечную конструкцию, при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками. Изменения аминокислот также могут изменять посттрансляционные процессы в антителе, такие как изменение количества или положения сайтов гликозилирования .
Вариант модификации аминокислотных последовательностей антител с помощью аминокислотных замен. Такой вариант представляет собой замену, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка в молекуле антитела на другой остаток. Места, представляющие наибольший интерес для мутагенеза путем замен, включают гипервариабельные области или CDR, но также предполагаются изменения и в области FR или Fc . Консервативные замены показаны в таблице А под заголовком «предпочтительные замены». Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то могут быть введены дополнительные существенные изменения, названные «примерами заменам» в таблице А, или изменения, дополнительно описанные ниже при описании классов аминокислот, и может быть проведен скрининг продуктов.
Figure imgf000034_0001
Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность» или «нуклеиновокислотная последовательность», «полинуклеотид», «олигонуклеотид», «полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность», которые используются равнозначно в данном описании, обозначают четкую последовательность нуклеотидов, модифицированных или не модифицированных, определяющую фрагмент или участок нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую неприродные нуклеотиды и являющуюся либо двухцепочечной ДНК или РНК, либо одноцепочечной ДНК или РНК, либо продуктами транскрипции указанных ДНК.
Здесь также следует упомянуть, что данное изобретение не относится к нуклеотидным последовательностям в их природной хромосомной среде, т.е. в природном состоянии. Последовательности данного изобретения были выделены и/или очищены, т.е. были взяты прямо или косвенно, например, путем копирования, при этом их среда была по меньшей мере частично модифицирована. Таким образом, также здесь следует подразумевать изолированные нуклеиновые кислоты, полученные путем генетической рекомбинации, например, с помощью принимающих клеток (клеток-хозяев) , или полученные путем химического синтеза.
Ссылка на нуклеотидную последовательность охватывает его комплимент, если не указано иное. Таким образом, ссылка на нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью .
Выражение «контролирующие последовательности» относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в определенном организме- хозяине. Пригодные для прокариот контролирующие последовательности представляют собой, например, промотор, необязательно оператор и сайт связывания рибосомы. Как известно, в эукариотических клетках присутствуют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.
Нуклеиновая кислота «функционально связана», если она находится в функциональной связи с другой нуклеотидной последовательностью. Например, ДНК предпоследовательности или секреторной лидерной последовательности функционально связывают с ДНК полипептида, если он экспрессируется в виде предпротеина, который принимает участие в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связывают с кодирующей последовательностью, если он оказывает воздействие на транскрипцию последовательности; сайт связывания рибосомы функционально связывают с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что может облегчать трансляцию. Как правило, «функционально связан» обозначает, что связанные последовательности ДНК являются смежными, а в случае секреторной лидерной последовательности являются смежными и находятся в фазе считывания. Однако энхансеры не обязательно должны быть смежными.
Термин «вектор» при использовании в настоящем документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой плазмиду, т.е. кольцевую двухцепочечную часть ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. В некоторых вариантах осуществления изобретения векторы способны к автономной репликации в клетке- хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации и эписомные векторы млекопитающих) . В других вариантах осуществления изобретения векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и таким образом реплицируются вместе с геном хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально соединены. Такие векторы упоминаются в данном документе как «рекомбинантные экспрессирующие векторы» (или просто «экспрессирующие векторы») .
Термин «рекомбинантная клетка-хозяин» (или просто «клетка- хозяин») при использовании в данном документе означает клетку, в которую введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, которые могут включать, например, вектор в соответствии с настоящим изобретением, описанным выше. Настоящее изобретение относится также к клеткам- хозяевам, которые включают, например, нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь или ее антигенсвязывающие части, нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь или ее антигенсвязывающие части, или обе из них, первого связывающего домена и/или второго связывающего домена связывающей молекулы по данному изобретению. Следует понимать, что «рекомбинантная клетка-хозяин» и «клетка-хозяин» означают не только конкретную заявленную клетку, но также и потомство такой клетки. Поскольку модификации могут проходить в последующих поколениях вследствие мутации или воздействий окружающей среды, такое потомство не может, на самом деле, быть идентичным родительской клетке, но такие клетки по-прежнему включены в объем термина «клетка-хозяин» при использовании в настоящем документе.
Термин «эксципиент» используется в данном документе для описания любого ингредиента, отличающегося от соединения ( -ий) по данному изобретению.
Термин «заболевание или нарушение, опосредованное GITR» подразумевает все заболевания или нарушения, которые либо прямо, либо косвенно связаны с GITR, включая этиологию, развитие, прогресс, персистентность или патологию заболевания или нарушения.
«Лечить», «лечение» и «терапия» относятся к методу смягчения или устранения биологического расстройства и/или по меньшей мере одного из сопутствующих ему симптомов. Используемый в данном документе, термин «облегчить» болезнь, заболевание или состояние, означает уменьшение тяжести и/или частоты возникновения симптомов заболевания, расстройства или состояния. Кроме того, содержащиеся в данном документе ссылки на «лечение» включает ссылки на лечебную, паллиативную и профилактическую терапию.
В одном аспекте субъект лечения или пациент является млекопитающим, предпочтительно человеческим субъектом. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста.
Термин «нарушение» означает любое состояние, которое можно улучшить в результате лечения по настоящему изобретению. В определение данного термина входят хронические и острые нарушения или заболевания, включающие в себя патологические состояния, которые вызывают предрасположенность млекопитающего к возникновению данного нарушения.
Термины «рак» или «раковый» относятся к физиологическому состоянию или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым ( /-ой) ростом/пролиферацией клеток. Это определение охватывает доброкачественные и злокачественные раковые заболевания. Примеры раковых заболеваний включают, но без ограничения, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких раковых заболеваний включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшины, печеночноклеточный рак, рак желудка, включая рак ЖКТ, рак поджелудочной железы, глиобластому, глиому, цервикальный рак, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия и матки, карциному слюнных желез, рак почки (почечноклеточную карциному) , рак предстательной железы (рак простаты) , рак наружных женских половых органов, рак щитовидной железы, печеночную карциному, карциному анального канала, карциному пениса, меланому и различные типы рака головы и шеи.
Термины «иммунный ответ», «аутоиммунная реакция», «аутоиммунное воспаление» относятся, например, к действию лимфоцитов, антиген-представляющих клеток, фагоцитирующих клеток, гранулоцитов и растворимых макромолекул, вырабатываемых указанными клетками или клетками печени (включая антитела, цитокины и комплемент, образующиеся в результате селективного повреждения, разрушения или элиминации из человеческого организма инвазивных патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых клеток или, в случаях аутоиммунитета или патологического воспаления, нормальных человеческих клеток или тканей) .
«Терапевтически эффективным количеством» считается количество вводимого в процессе лечения терапевтического агента, которое избавит в определенной степени от одного или нескольких симптомов заболевания, по поводу которого проводится лечение.
Понятие «хроническое» применение относится к непрерывному (продолжительному) применению агента (ов) в противоположность острому (кратковременному) пути введения, так чтобы поддерживать первоначальное терапевтическое действие (активность) в течение длительного периода времени.
«Прерывистое» применение обозначает лечение, которое не осуществляют последовательно без перерывов, но которое скорее по своей природе является периодическим.
В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «иметь», «включать» и «содержать» или их вариации, такие как «имеет», «имеющий», «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.
Подробное описание изобретения
Антитело
Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, которое специфично связывается с GITR.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которое специфично связывается с GITR, включающему:
(a) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащему:
(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
NYGMH ( SEQ ID NO: 1) или YYWMY ( SEQ ID NO: 12);
(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
VIWFDGSNKFYTDSVKG ( SEQ ID NO: 2) или AISWNGGRTYYAESMKG (SEQ ID NO: 13) ;
(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
ELGGYYYDSSGFRPYYYGMDV (SEQ ID NO: 3) или NRYYSDPNYGMNL (SEQ ID NO: 14) , и
(b) вариабельный домен легкой цепи, содержащему:
(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
RASQSIGSWLA ( SEQ ID NO: 7) или TGTSTDIGTYKYIS (SEQ ID NO:
17) ;
(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
AASTLQR (SEQ ID NO: 8) или GVSHRPS (SEQ ID NO: 18); (iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы :
QQSHSHPLT ( SEQ ID NO: 9) или SSYTSSGTW (SEQ ID NO: 19) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 1, 2 и 3, соответственно.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 12, 13 и 14, соответственно.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 7, 8 и 9, соответственно.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 17, 18 и 19, соответственно.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает:
- вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 1, 2 и 3, соответственно;
- вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 7, 8 и 9, соответственно.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает:
- вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 12, 13 и 14, соответственно;
- вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 17, 18 и 19, соответственно.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности EVQLVQSGGGWQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSV KGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTV SS ( SEQ ID NO: 4) . В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность
EVQLVQSGGGWQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSV KGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTV SS ( SEQ ID NO: 4) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTY YAESMKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSS
( SEQ ID NO: 15) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTYYAESM KGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSS ( SEQ
ID NO: 15) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности
DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQS IGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVP SRFSGGGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIK ( SEQ ID NO: 10) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQS IGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSG GGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 10) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности QSALTQPASVSGSPGQS ITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLI IYGVSHRPSGVSDRF SGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTWFGGGTKVTVL ( SEQ ID NO: 20) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность QSALTQPASVSGSPGQS ITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLI IYGVSHRPSGVSDRF SGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTWFGGGTKVTVL (SEQ ID NO: 20) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает:
вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности EVQLVQSGGGWQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSV KGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTV SS (SEQ ID NO: 4) ;
вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности
DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSG GGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIK ( SEQ ID NO: 10) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает:
вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность
EVQLVQSGGGWQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSV KGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTV SS ( SEQ ID NO: 4) ;
вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность
DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSG GGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 10) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает:
вариабельный домен тяжелой цепи, которой содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTYYAESM KGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSS ( SEQ ID NO: 15) ;
вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLIIYGVSHRPSGVSDRF SGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTWFGGGTKVTVL ( SEQ ID NO: 20) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает:
вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTYYAESM KGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSS ( SEQ ID NO: 15) ;
вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLIIYGVSHRPSGVSDRF SGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTWFGGGTKVTVL (SEQ ID NO: 20) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело, специфичное к GITR, представляет собой полноразмерное антитело IgG. В некоторых вариантах моноклональное антитело IgG относится к изотипу IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4 человека.
В некоторых вариантах моноклональное антитело IgG относится к изотипу IgGl человека.
В некоторых вариантах моноклональное антитело, специфичное к GITR, включает мутацию E345R в Fc фрагменте для увеличения агонистических свойств, антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) , но не комплементзависимой цитотоксичности (CDC) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности
EVQLVQSGGGWQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSV KGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK ( SEQ ID NO: 5) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность
EVQLVQSGGGWQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSV KGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 5) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности
EVQLVQSGGGWQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSV KGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRRPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 6) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность
EVQLVQSGGGWQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSV KGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRRPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 6) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности
DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQS IGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSG GGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ( SEQ ID NO: 11) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность
DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQS IGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSG GGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 11) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает:
- тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности
EVQLVQSGGGWQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSV KGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 5) ;
- легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности
DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQS IGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSG GGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 11) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело, которое специфично связывается с GITR, представляет собой BCD166-01-001.
Моноклональное антитело BCD166-01-001 включает:
- тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность EVQLVQSGGGWQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSV KGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 5) ;
- легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSG GGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 11) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает:
- тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности
EVQLVQSGGGWQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSV KGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRRPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: б) ;
- легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности
DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSG GGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 11) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело, которое специфично связывается с GITR, представляет собой BCD166-02-001.
BCD166-02-001 отличается от BCD166-01-001 одной мутацией E345R в Fc фрагменте для увеличения агонистических свойств, антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) , но не комплементзависимой цитотоксичности (CDC) .
Моноклональное антитело BCD166-02-001 включает:
- тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность EVQLVQSGGGWQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGSNKFYTDSV KGRFTISRDNSKDTLSLQMNSLRAEDTAVYYCARELGGYYYDSSGFRPYYYGMDVWGQGTMVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRRPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: б) ;
- легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASTLQRGVPSRFSG GGYGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQSHSHPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 11) . В некоторых вариантах моноклональное антитело включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTYYAESM KGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK ( SEQ ID NO: 16) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTYYAESM KGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK (SEQ ID NO: 16) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности
QSALTQPASVSGSPGQS ITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLI IYGVSHRPSGVSDRF SGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTWFGGGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEE LQANKATLVCLISDFYРGAVTVAWKADSSРVKAGVEТТТРSKQSNNKYAASSYLSLТРЕQWKSН RSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS ( SEQ ID NO: 21) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность
QSALTQPASVSGSPGQS ITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLIIYGVSHRPSGVSDRF SGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTWFGGGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEE LQANKATLVCLISDFYРGAVTVAWKADSSРVKAGVEТТТРSKQSNNKYAASSYLSLТРЕQWKSН RSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 21) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает:
- тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTYYAESM KGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK (SEQ ID NO: 16) . - легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLIIYGVSHRPSGVSDRF SGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTWFGGGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEE LQANKATLVCLISDFYРGAVTVAWKADSSРVKAGVEТТТРSKQSNNKYAASSYLSLТРЕQWKSН RSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS ( SEQ ID NO: 21) .
В некоторых вариантах моноклональное антитело, которое специфично связывается с GITR, представляет собой BCD166-01-014.
Моноклональное антитело BCD166-01-014 включает:
- тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYWMYWVRQAPGKGLEWVSAISWNGGRTYYAESM KGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNRYYSDPNYGMNLWGKGTTVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK ( SEQ ID NO: 16) .
- легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSTDIGTYKYISWYQQHPGKAPKLIIYGVSHRPSGVSDRF SGSKSDNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSGTWFGGGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEE LQANKATLVCLISDFYРGAVTVAWKADSSРVKAGVEТТТРSKQSNNKYAASSYLSLТРЕQWKSН RSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 21) .
Молекулы нуклеиновых кислот
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновых кислот, а именно к последовательностям, кодирующим моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR, по данному изобретению, которые описаны в данном документе, необязательно включающим любую последовательность соединяющего их пептидного линкера .
Ссылка на нуклеотидную последовательность, охватывает его комплимент, если не указано иное. Таким образом, ссылка на нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать, как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью. Термин «полинуклеотид», упоминаемый в данном документе, означает полимерную форму нуклеотидов, по меньшей мере 10 оснований в длину, либо рибонуклеотидов, либо дезоксинуклеотидов или модифицированную форму любого типа нуклеотида. Термин включает в себя одно- и двухцепочечные формы. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-21. Молекула нуклеиновой кислоты может также содержать любую комбинацию указанных нуклеотидных последовательностей.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфично связывается с GITR, и включает:
(a) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащему:
(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
NYGMH ( SEQ ID NO: 1) или YYWMY (SEQ ID NO: 12);
(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
VIWFDGSNKFYTDSVKG (SEQ ID NO: 2) или AISWNGGRTYYAESMKG (SEQ ID NO: 13) ;
(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
ELGGYYYDSSGFRPYYYGMDV (SEQ ID NO: 3) или NRYYSDPNYGMNL (SEQ ID NO: 14) , и
(b) вариабельный домен легкой цепи, содержащему:
(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
RASQSIGSWLA ( SEQ ID NO: 7) или TGTSTDIGTYKYIS (SEQ ID NO:
17) ;
(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
AASTLQR (SEQ ID NO: 8) или GVSHRPS (SEQ ID NO: 18);
(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
QQSHSHPLT (SEQ ID NO: 9) или SSYTSSGTW (SEQ ID NO: 19) .
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 1, 2 и 3, соответственно.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 12, 13 и 14, соответственно. В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое включает вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 7, 8 и 9, соответственно.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое включает вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 17, 18 и 19, соответственно .
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое включает:
- вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 1, 2 и 3, соответственно;
- вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 7, 8 и 9, соответственно.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое включает:
- вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 12, 13 и 14, соответственно;
- вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 17, 18 и 19, соответственно.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое включает вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое включает вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое включает вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое включает вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое включает:
вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4;
вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое включает:
вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;
вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое включает:
вариабельный домен тяжелой цепи, которой содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15;
вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое включает:
вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15;
вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело, которое специфично связывается с GITR, которое представляет собой полноразмерное антитело IgG.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело IgG, которое относится к изотипу IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4 человека.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело IgG, которое относится к изотипу IgGl человека.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело, которое специфично связывается с GITR, которое включает мутацию E345R в Fc фрагменте для увеличения агонистических свойств, антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) , но не комплементзависимой цитотоксичности (CDC) .
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело, которое включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 5.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело, которое включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело, которое включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: б.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело, которое включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: б.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело, которое включает легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 11.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело, которое включает легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело, которое включает:
- тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO:
5;
- легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 11.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело, которое включает:
- тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5;
- легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело, которое включает:
- тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: б;
- легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 11.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело, которое включает:
- тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: б; - легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело, которое включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 16.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело, которое включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело, которое включает легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело, которое включает легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело, которое включает:
- тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 16;
- легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует моноклональное антитело, которое включает:
- тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;
- легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах нуклеиновая кислота представляет собой
ДНК.
В любом из указанных выше вариантах осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот могут быть выделенными.
Молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может быть выделена из любого источника, который продуцирует моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR. В определенных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты данному изобретению может быть синтезирована, а не выделена. В одном варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие домены VH (SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 15) или VL (SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 20) преобразуются в гены антитела по всей длине путем вставки в экспрессионный вектор, уже кодирующей константные домены тяжелой цепи (СН) или легкой цепи (CL) , соответственно, так что VH сегмент функционально соединен с СН сегментом ( -ами) в векторе и/или VL сегмент оперативно соединен с CL сегментом в векторе. В другом варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие VH и/или VL домены преобразуются в гены по всей длине антитела путем соединения, например, лигирования, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей VH и/или VL домены, к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей СН и/или CL домены с использованием стандартных молекулярно-биологических методов. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие по всей длине тяжелую и/или легкую цепи, могут затем экспрессироваться из клетки, в которую они были введены.
Молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться для экспрессии большого количества рекомбинантного моноклонального антитела, которое специфически связывается с GITR.
Вектор
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к вектору, подходящему для экспрессии любой из нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящем документе.
Настоящее изобретение относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют любую из аминокислотных последовательностей моноклонального антитела, которое специфически связывается с GITR, или их частей (например, последовательностей тяжелой цепи первого и/или тяжелой и/или легкой цепи второго связывающих доменов) как описано в настоящем документе. Настоящее изобретение далее относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих слитые белки, модифицированные антитела, фрагменты антител.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR, по данному изобретению экспрессируются путем вставки ДНК, кодирующей частично или полностью последовательность первого и второго связывающего домена (например, последовательности тяжелой и легкой цепи, где связывающий домен содержит последовательности тяжелой и легкой цепи) , полученный, как описано выше, в экспрессионных векторах таким образом, что гены функционально соединены с необходимыми последовательностями, контролирующими экспрессию, такими как транскрипционные и трансляционные контрольные последовательности. Экспрессионные векторы включают плазмиды, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (AAV) , вирусы растений, такие как вирус мозаики цветной капусты, вирусы табачной мозаики, космиды, YAC, EBV полученные эписомы и тому подобное. Молекулы ДНК могут быть лигированы в вектор таким образом, что последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию в векторе, выполняют предусмотренную функцию регуляции транскрипции и трансляции ДНК. Экспрессионный вектор и последовательности контроля экспрессии могут быть выбраны таким образом, чтобы быть совместимыми с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Молекулы ДНК, кодирующие частично или по всей длине последовательности первого и второго связывающих доменов (например, последовательности тяжелой и легкой цепи, где связывающий домен содержит последовательность тяжелой и легкой цепи) могут быть введены в отдельные векторы. В одном варианте осуществления изобретения любая комбинация указанных выше молекул ДНК вводится в тот же экспрессионный вектор. Молекулы ДНК могут быть введены в экспрессионный вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и вектора или лигированием тупых концов, если сайты рестрикции отсутствуют) .
Подходящим вектором является тот, который кодирует функционально законченные последовательности СН или CL человеческого иммуноглобулина с конструированием соответствующего места рестрикции так, что любая последовательность VH или VL может быть легко включена и экспрессирована, как описано выше. НС - и LC-кодирование генов в таких векторах может содержать интронные последовательности, что приводит к общему увеличению белковых продуктов антитела путем стабилизации соответствующей мРНК. Интронные последовательности находятся в окружении сплайс-донора и сплайс-акцептора сайтов, которые определяют, где будет происходить сплайсинг РНК. Расположение интронных последовательностей может быть либо в вариабельных или константных участках цепей антитела, или как в вариабельных, так и константных участках, когда используются несколько интронов. Прекращение полиаденилирования и транскрипции может произойти вниз по ходу сайта нативной хромосомы кодируемых участков. Рекомбинантный экспрессионный вектор также может кодировать сигнальный пептид, который облегчает выработку цепочки антитела клеткой-хозяином. Ген цепочки антитела может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид соединен с рамкой считывания аминоконца цепи иммуноглобулина. Сигнальным пептидом может быть сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (то есть, сигнальный пептид белка не иммуноглобулиновой природы) . Помимо цепочки генов антител, рекомбинантная экспрессия векторов по данному изобретению может нести регулирующие последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепи антител в клетке-хозяине . Специалистам в этой области будет понятно, что дизайн экспрессионного вектора, включая выбор регулирующих последовательностей, может зависеть от таких факторов, как селекция клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии желаемого белка, и т.д. Предпочтительные регулирующие последовательности для экспрессирующей клетки-хозяина млекопитающих включают вирусные элементы обеспечивающие высокий уровень экспрессии белков в клетках млекопитающих, таких как промоторы и/или энхансеры, полученные из ретровирусной LTR, цитомегаловируса (CMV) (например, CMV промотора/энхансера), обезьяньего вируса 40 (SV40) (например, SV40 промотора/энхансера), аденовируса, (например, большого позднего промотора аденовируса (AdMLP) ) , вирус полиомы, а также сильных промоторов млекопитающих, таких как промотор нативных иммуноглобулинов или промотор актина. Для дальнейшего описания вирусных регулирующих элементов и их последовательностей см., например, патенты США 5,168,062, 4,510,245 and 4,968,615. Способы экспрессии связывающих молекул, таких как антитела растений, в том числе описание промоторов и векторов, а также трансформация растений, известны в данной области техники. См., например, патент США 6,517,529. Методы экспрессии полипептидов в бактериальных клетках или клетках грибов, например, дрожжевых клетках, также хорошо известны в данной области техники.
В дополнение к генам цепи антитела и регулирующим последовательностям, рекомбинантные векторы экспрессии изобретения могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и гены селектируемого маркера. Ген селектируемого маркера облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые был введен вектор (см., например, патенты США 4,399,216, 4,634,665 и 5,179,017) . Например, обычно ген селектируемого маркера придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую вектор введен. Например, гены селектируемого маркера включают ген дигидрофолат редуктазы (DHFR) (для использования в dhfr-клетках-хозяевах при селекции/амплификации метотрексата), ген нео (для селекции G418) и ген синтетазы глутамата.
Термин «последовательность контроля экспрессии», используемый в данном описании, означает полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, к которым они лигированы. Контролирующие экспрессию последовательности включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации, промотора и энхансера; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сплайсинг и сигналы полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака) ; последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при желании, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Характер таких контролирующих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина; в прокариотах такие контролирующие последовательности, как правило, включают промотор, сайт связывания рибосомы, а также последовательности терминации транскрипции; в эукариотах, как правило, такие контролирующие последовательности включают промоторы и последовательности терминации транскрипции. Термин «контролирующие последовательности» включает, как минимум, все компоненты, наличие которых имеет важное значение для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, чье присутствие является полезным, например, лидирующие последовательности и последовательности слившихся клеток.
Клетки-хозяева
Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к способам получения моноклонального антитела, которое специфически связывается с GITR, по данному изобретению. Один вариант осуществления изобретения относится к способу получения моноклонального антитела, которое специфически связывается с GITR, как определено в настоящем документе, содержащему получение рекомбинантной клетки-хозяина, способной экспрессировать моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR, культивированию указанной клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии продукции моноклонального антитела, которое специфически связывается с GITR, и выделение полученного моноклонального антитела, которое специфически связывается с GITR. Моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR, полученное такой экспрессией в таких рекомбинантных клетках- хозяевах упоминается в данном документе как «рекомбинантные моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR». Изобретение также относится к потомству клеток таких клеток-хозяев и моноклональному антителу, которое специфически связывается с GITR, полученному аналогично.
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR, по изобретению и векторы, содержащие эти молекулы нуклеиновой кислоты, могут быть использованы для трансфекции подходящего млекопитающего или его клетки, растения или его клетки, бактериальной или дрожжевой клетки-хозяина. Преобразование может происходить любым известным способом для введения полинуклеотидов в клетку-хозяина . Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают декстран-опосредованную трансфекцию, трансфекцию комплексом нуклеиновой кислоты и позитивно заряженного полимера, трансфекцию преципитатом нуклеиновой кислоты и фосфата кальция, полибрен-опосредованную трансфекцию, слияние протопластов, трансфекцию инкапсулированными в липосомы полинуклеотидами и прямую микроинъекцию ДНК в ядра. В дополнение, молекулы нуклеиновых кислот могут быть введены в клетки млекопитающих вирусными векторами. Способы трансфекции клеток хорошо известны в данной области техники. См., например, патенты США, 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 и 4,959,455. Способы трансформации клеток растений хорошо известны в данной области, включая, например, Agrobacterium-опосредованную трансформацию, биолистическую трансформацию, прямую инъекцию, электропорацию и вирусную трансформацию. Методы трансформации клеток бактерий и дрожжей также хорошо известны в данной области.
Клеточные линии млекопитающих, используемые в качестве хозяев для трансформации, хорошо известны в данной области и включают множество иммортализованных доступных клеточных линий. К ним относятся, например, клетки яичников китайского хомячка (СНО) , NS0 клетки, клетки SP2, НЕК-293Т клетки, 293 Фристайл клетки ( Invitrogen) , NIH-3T3 клетки, клетки HeLa, клетки почек хомячка (ВНК) , клетки почек африканских зеленых мартышек (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), А549 клетки и ряд других клеточных линий. Клеточные линии выбираются путем определения, какие клеточные линии имеют высокие уровни экспрессии и обеспечивают необходимые характеристики продуцируемого белка. Другими клеточными линиями, которые могут быть использованы, являются клеточные линии насекомых, такие как Sf9 или Sf21 клетки. Когда векторы рекомбинантной экспрессии, кодирующие моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR вводятся в клетки-хозяева млекопитающих, антитела продуцируются путем культивирования клеток-хозяев в течение времени, достаточного для экспрессии антител в клетках- хозяевах или, предпочтительнее, выделения антител в питательную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. Моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR, может быть выделено из питательной среды с использованием стандартных методов очистки белка. Клетки-хозяева растений, например, включают Nicotiana, Arabidopsis, ряску, кукурузу, пшеницу, картофель и т.д. Клетки бактерий хозяина включают виды Escherichia и Streptomyces . Дрожжевые клетки-хозяева включают Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Кроме того, уровень продукции моноклонального антитела, которое специфически связывается с GITR, по данному изобретению из продуцирующей клеточной линии можно усилить с помощью ряда известных методов. Например, система экспрессии гена глутамин синтетазы (система GS) является достаточно распространенной для усиления экспрессии при определенных условиях. Система GS обсуждается в целом или частично в связи с патентами ЕР 0216846, 0256055, 0323997 и 0338841.
Вполне вероятно, что моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR, различных клеточных линий или трансгенные животные будут отличаться друг от друга профилем гликозилирования . Однако моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR, кодируемое молекулами нуклеиновой кислоты, описанными в данном документе, или содержащее аминокислотные последовательности, приведенные в настоящем документе, являются частью данного изобретения, независимо от состояния гликозилирования связывающих молекул и в целом, независимо от наличия или отсутствия пост-трансляционных модификаций .
Получение антител
Изобретение относится также к способам и процессам получения моноклонального антитела, которое специфически связывается с GITR, и их антигенсвязывающих фрагментов.
Моноклональные антитела
Моноклональные антитела можно создавать, например, с помощью метода на основе гибридом, который впервые описан Kohler и др . , Nature, 256, 1975, с. 495, или с помощью методов рекомбинантной ДНК (US 4816567) .
При использовании метода на основе гибридом мышь или другое пригодное животное-хозяин, такое как хомячок, иммунизируют согласно описанной выше методике, для того, чтобы вызывать образование лимфоцитов, которые продуцируют или могут продуцировать антитела, обладающие способностью специфически связываться с белком, применяемым для иммунизации. Согласно другому варианту лимфоциты можно получать в результате иммунизации in vitro. После иммунизации лимфоциты выделяют и затем сливают с клеточной линией миеломы с помощью приемлемого связывающего агента, такого как полиэтиленгликоль, с получением клетки гибридомы.
Полученные таким образом клетки гибридомы высевают и выращивают в пригодной культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, ингибирующих рост или выживание неслитых родительских клеток миеломы. Например, если родительские клетки миеломы не содержат фермента гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (HGPRT или HPRT) , то культуральная среда для гибридом, как правило, должна включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (НАТ-среда) , т.е. вещества, которые препятствуют росту клеток с дефицитом HGPRT .
Предпочтительными применяемые в качестве компонента для слияния клетками миеломы являются клетки, которые легко поддаются слиянию, поддерживают стабильный высокий уровень производства антител выбранными продуцирующими антитела клетками и чувствительны к избирательной среде, на которой происходит отбор несвязанных родительских клеток. Предпочтительными линиями клеток миелом являются линии мышиной миеломы, такие как созданные на основе мышиных линий опухолевых клеток линии МОРС-21 и МРС-11, которые можно получать из Salk Institite Cell Disrtibution Center, Сан-Диего, шт . Калифорния, США, и линии SP-2 или ХбЗ- Ад8-653, которые можно получать из Американской коллекции типовых культур, Роквилл, шт . Мэриленд, США. Описано также применение линий клеток человеческой миеломы и гетеромиеломы типа «мышь -человек» для производства моноклональных антител (Kozbor, J. Immunol., 133, 1984, с. 3001) .
Предпочтительно специфичность связывания моноклональных антител, полученных с использованием клеток гибридомы, определяют методом иммунопреципитации или с помощью анализа связывания in vitro, такого как радиоиммунный анализ (РИА) или твердофазный имммуноферментный анализ (ELISA) .
Аффинность связывания моноклонального антитела можно, например, определять с помощью Скэтчард-анализа, описанного у Munson и др . , Anal. Biochem., 107, 1980, с. 220.
После выявления клеток гибридомы, которые продуцируют антитела требуемой специфичности, аффинности и/или активности, клоны можно субклонировать с помощью метода лимитирующих разведений и выращивать стандартными методами. Пригодные для этой цели среды включают, например, среду DMEM или RPMI-1640. Кроме того, клетки гидрибомы можно выращивать in vivo в виде асцитных опухолей в организме животных, например, путем внутрибрюшинной (i.p.) инъекции клеток мышам.
Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, можно отделять от культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки с помощью обычных методов очистки антител, например, аффинной хроматографией (например, с использованием протеин А- или протеин Q-сефарозы) , или ионообменной хроматографии, хроматографии на гидроксилапатитах, гель-электрофореза, диализа и т.д.
ДНК, кодирующую моноклональные антитела, можно легко выделять и секвенировать с помощью общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые обладают способностью специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител) . В качестве предпочтительного источника такой ДНК служат клетки гибридомы. После выделения ДНК можно включать в экспрессионные векторы, которыми затем трансфектируют клетки-хозяева, такие как клетки Е. coli, обезьяньи COS- клетки, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые без трансфекции не продуцируют белок антитела, что приводит к синтезу моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах .
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения моноклональные антитела или фрагменты антител можно выделять из фаговых библиотек антител, созданных с помощью методов, описанных у McCafferty и др . , Nature, 348, 1990, сс. 552-554 . У Clackson и др . , Nature, 352, 1991, сс. 624- 628 и Marks и др . , J. Mol. Biol., 222, 1991, сс. 581-597 описано выделение мышиных и человеческих антител соответственно с помощью фаговых библиотек. В последующих публикациях было описано производство высокоаффинных (нМ-диапазон) человеческих антител с помощью перестановки цепи (Marks и др . , Bio/Technology, 10, 1992, сс. 779-783), а также комбинаторная инфекция и рекомбинация in vivo в качестве стратегии конструирования очень больших фаговых библиотек (Waterhouse и др . , Nucl . Acids. Res., 21, 1991, сс. 2265-2266) . Таким образом, эти методы представляют собой реальную альтернативу традиционным методам выделения моноклональных антител на основе гибридом моноклональных антител.
ДНК, кодирующую антитело, можно также модифицировать, например таким образом, чтобы получать химерные или слитые полипептиды антител, например, путем замены последовательностей константных областей тяжелой и легкой цепи (Сн и CL) на гомологичные мышиные последовательности (US 4816567 и Morrison и др . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81, 1984, с. 6851) или с помощью ковалентного связывания кодирующей последовательности иммуноглобулина со всей или с частью кодирующей последовательности полипептида, не относящегося к иммуноглобулинам (гетерологичного полипептида) . Не относящиеся к иммуноглобулинам полипептидные последовательности можно заменять на константные области антитела или заменять на вариабельные области антигенсвязывающего центра антитела, создавая химерное бивалентное антитело, которое содержит один антигенсвязывающий центр, обладающий специфичностью в отношении антигена, и другой антигенсвязывающий центр, обладающий специфичностью в отношении другого антигена.
Человеческие антитела и методика, основанная на применении фаговой дисплейной библиотеки
В настоящее время можно получать трансгенных животных (например, мышей) , которые после иммунизации могут продуцировать полный спектр человеческих антител без производства эндогенного иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготная делеция областей стыка гена тяжелой цепи антитела ( Дн-сегмента) в организме химерных мышей и мышей с мутацией в зародышевой линии приводит к полному ингибированию производства эндогенного антитела. Перенос набора зародышевой линии гена человеческого иммуноглобулина в такую мутантную зародышевую линию мышей приводит к производству человеческих антител после контрольного заражения антигеном (US 5545806, 5569825, 5591669 (все на имя фирмы GenPharm) ; 5545807; и WO 97/17852) .
В альтернативном варианте для получения человеческих антител и фрагментов антител in vitro из спектра генов вариабельной области (V) иммуноглобулина из организма иммунизированных доноров можно использовать фаговую дисплейную технологию (McCafferty и др . , Nature, 348, 1990, сс. 552-553) . Согласно этой методике гены V- области антитела клонируют в рамке считывания либо с основным, либо с минорным геном оболочечного белка нитчатого бактериофага, такого как М13 или fd, и презентируют в виде функциональных фрагментов антитела на поверхности фаговой частицы. Поскольку нитчатая частица содержит копию одноцепочечной ДНК фагового генома, селекции по признаку функциональных свойств антитела, также приводят к отбору гена, кодирующего антитело, которое обладает указанными свойствами. Таким образом, фаг имитирует некоторые свойства В-клетки. Фаговую презентацию можно осуществлять в различных форматах. Для фаговой презентации можно использовать различные источники сегментов V-генов. Clackson и др . , Nature, 352, 1991, сс. 624-628 выделили различные наборы антител к оксазолону из небольшой произвольной комбинаторной библиотеки V-генов, полученной из селезенки иммунизированных мышей. Можно конструировать спектр V-генов, полученных из организма иммунизированных людей-доноров, и антитела к различному набору антигенов (включая аутоантигены) можно выделять в целом согласно методам, описанным у Marks и др . , J. Mol. Biol., 222, 1991, сс. 581-597.
Как описано выше, человеческие антитела могут продуцироваться также in vitro активированными В-клетками (см. US 5567610 и 5229275) .
Фрагменты антител
В определенных обстоятельствах целесообразно применять фрагменты антител, а не полные антитела. Меньший размер фрагментов способствует их быстрому клиренсу и может способствовать лучшему проникновению в плотные опухоли.
Для получения фрагментов антител разработаны различные методы. Традиционно эти фрагменты получали путем протеолитического расщепления интактных антител. Однако в настоящее время эти фрагменты можно получать непосредственно с помощью рекомбинантных клеток-хозяев . Fab-, Fv- и scFv-фрагменты антител можно экспрессировать и секретировать из Е. coli, что позволяет облегчать производство больших количеств указанных фрагментов. Фрагменты антител можно выделять из описанных выше фаговых библиотек антител. Согласно другому варианту Fab ' -SH-фрагменты можно непосредственно выделять из Е. coli и химически сшивать с получением F ( ab ') 2-фрагментов (Carter и др . , Bio/Technology, 10, 1992, сс. 163-167) . Согласно другому подходу F(ab' ) 2 - фрагменты можно выделять непосредственно из культуры рекомбинантных клеток- хозяев. Fab- и F (ab ') 2-фрагмент с повышенным временем полужизни in vivo, в которых сохранены остатки эпитопсвязывающего рецептора, описаны в US 5869046. Специалистам в данной области должны быть очевидны другие методики получения фрагментов антител. В других вариантах осуществления изобретения выбранное антитело представляет собой одноцепочечный Fv- фрагмент (scFv) (см. WO 93/16185; US 5571894 и US США 5587458) . Fv и scFv представляют собой единственные виды с интактными связывающими сайтами, лишенные константных областей; в результате их можно применять для пониженного неспецифического связывания при применении in vivo. Слитые белки, несущие scFv, можно конструировать для получения слияния эффекторного белка либо на N-, либо на С-конце scFv. Фрагмент антитела может представлять собой также «линейное антитело», например, описанное в US 5641870. Такие фрагменты линейного антитела могут быть моноспецифическими или биспецифическими .
Фармацевтические композиции
Другим аспектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента (или в качестве единственного активного ингредиента) моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR.
Фармацевтическая композиция может включать по меньшей мере одно моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых эксипиентов .
Фармацевтическая композиция может включать по меньшей мере одно моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR, и одну или более дополнительных связывающих молекул (например, антител) , которые нацелены на один или более соответствующих поверхностных рецепторов. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции предназначены для улучшения, профилактики или лечения нарушений, которые могут быть связаны с GITR. «Фармацевтическая композиция» обозначает композицию включающую в себя моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR, согласно изобретению и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых эксипиентов, таких как наполнители, растворители, разбавители, носители, вспомогательные, распределяющие, средства доставки, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению и способы их изготовления будут бесспорно очевидными для специалистов в этой области. Производство фармацевтических композиций предпочтительно должно соответствовать требованиям GMP (надлежащей производственной практики) . Композиция может включать буферную композицию, тонические агенты, стабилизаторы и солюбилизаторы. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного фармацевтического ингредиента, например, моностеарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, масла и инъекционные органические сложные эфиры.
«Лекарственное средство (препарат)» - вещество или смесь веществ в виде фармацевтической композиции в виде таблеток, капсул, порошков, лиофилизатов, инъекций, инфузий, мазей и др . готовых форм, предназначенное для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилактики болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего. Любой способ введения пептидов, белков или антител, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для моноклонального антитела, которое специфически связывается с GITR, по данному изобретению .
Термин «фармацевтически приемлемый» означает один или несколько совместимых жидких или твердых компонентов, которые подходят для введения млекопитающему, предпочтительно человеку.
Термин «эксципиент» или «вспомогательное вещество» используется в данном документе для описания любого компонента, отличающегося от ранее описанных по данному изобретению. Это вещества неорганического или органического происхождения, используемые в процессе производства, изготовления лекарственных препаратов для придания им необходимых физико-химических свойств.
Под термином «буфер», «буферная композиция», «буферный агент» понимается раствор, способный сохранять значение pH, благодаря взаимодействию кислотных и щелочных компонентов, входящих в его состав, который дает возможность препарату моноклонального антитела, которое специфически связывается с GITR, проявлять устойчивость к изменениям pH. В общем случае, преимущественными являются значения pH фармацевтической композиции от 4,0 до 8,0. В качестве буферных агентов могут быть использованы, например, ацетатный, фосфатный, цитратный, гистидиновый, сукцинатный и т.п. буферные растворы, но, не ограничиваясь ими.
Термины «тонический агент», «осмолитик» или «осмотический агент» в том виде, как они здесь использованы, относятся к эксципиенту, который может подводить осмотическое давление жидкого препарата антитела. «Изотоничный» препарат представляет собой препарат, который имеет осмотическое давление, эквивалентное давлению человеческой крови. Изотоничные препараты обычно имеют осмотическое давление от примерно 250 до 350 мОсм/кг . В качестве изотоноческих агентов могут быть использованы полиолы, моно- и дисахара, аминокислоты, соли металлов, например, хлорид натрия, и т.п., но, не ограничиваясь ими.
Под «стабилизатором» понимается вспомогательное вещество или смесь двух и более вспомогательных веществ, которые обеспечивают физическую и/или химическую стабильность активного агента. В качестве стабилизаторов могут быть использованы аминокислоты, например, аргинин, гистидин, глицин, лизин, глутамин, пролин, но, не ограничиваясь ими; поверхностно-активные вещества, например , полисорбат 20 (торговое наименование Tween 20), полисорбат 80 (торговое наименование Tween 80), полиэтилен-полипропилен гликоль и его кополимеры (торговые наименования Полоксамер (Poloxaner) , Плуроник (Pluronic) ) , натрия додецилсульфат (SDS), но, не ограничиваясь ими; антиоксиданты, например, метионин, ацетилцистеин, аскорбиновая кислота, монотиоглицерол, соли серистых кислот, и т.п., но не ограничиваясь ими; хелатирующие агенты, например, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) , диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДТПА) , цитрат натрия и т.п., но не ограничиваясь ими.
Фармацевтическая композиция является «стабильной», если активный агент сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность в течение заявленного срока годности при температуре хранения, например, при 2-8 °С. Предпочтительно, чтобы активный агент сохранял и физическую, и химическую стабильность, а также биологическую активность. Период хранения выбирается на основании результатов исследования стабильности при ускоренном и естественном хранении.
Фармацевтическая композиция по данному изобретению может изготавливаться, упаковываться или широко продаваться в виде единичной стандартной дозы или множества единичных стандартных доз в виде готовой лекарственной формы. Используемый в данном документе термин «единичная стандартная доза» означает дискретное количество фармацевтической композиции, содержащей заранее определенное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозировке активного ингредиента, который будет вводиться субъекту, или удобной части такой дозировки, например, половине или трети такой дозировки.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению, как правило, пригодны для парентерального введения в виде стерильных лекарственных средств, предназначенных для введения в организм человека с нарушением целостности кожных покровов или слизистых оболочек, минуя желудочно-кишечный тракт путем инъекций, инфузий или имплантации. Например, предполагается, что парентеральное введение включает, помимо прочего, подкожную, внутрибрюшинную, внутримышечную, внутривенную, внутриартериальную, интратекальную, внутрижелудочковую, интрауретральную, внутричерепную, внутрисуставнную, трансдермальную инъекцию или инфузи.; и почечные диализные инфузионные методики. Внутриопухолевая доставка, например, внутриопухолевая инъекция, также может быть применима. Также предусмотрена региональная перфузия. Предпочтительные варианты осуществления изобретения включают внутривенный и подкожный пути. Любой способ введения пептидов или белков, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для моноклонального антитела, которое специфически связывается с GITR, по данному изобретению.
Инъекционные лекарственные средства могут быть изготовлены, упакованы или проданы в стандартной лекарственной форме, например, в ампулах, флаконах, полимерных контейнерах, преднаполненных шприцах, устройствах для автоинжекции, но, не ограничиваясь ими. Лекарственные средства для парентерального введения включают, помимо прочего, суспензии, растворы, эмульсии в масляных или водных основах, пасты и тому подобное.
Еще одним вариантом осуществления изобретения является лекарственное средство для парентерального введения, где фармацевтическая композиция предоставлена в сухой форме, то есть, порошка или гранул для растворения в подходящем растворителе (например, стерильной апирогенной воде) перед введением. Такое лекарственное средство может быть получено, например, с помощью лиофилизации, т.е. процесса, известного в данной области техники как сушка из замороженного состояния, включающая в себя замораживание препарата и последующее удаление растворителя из замороженного содержимого.
Моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR, по данному изобретению может также вводиться интраназально или ингаляционно, самостоятельно, в виде смеси с подходящим фармацевтически приемлемым наполнителем из ингалятора, такого как аэрозольный контейнер под давлением, помпа, спрей, распылитель) или небулайзер, в котором используется или не используется подходящий пропеллент, или в виде назальных капель или спрея. Лекарственное средство для парентерального введения может быть немедленного или модифицированного высвобождения. Лекарственные средства с модифицированным высвобождением включают отсроченное, замедленное, пульсирующее, контролируемое, нацеленное и программируемое высвобождение.
Терапевтическое применение моноклонального антитела, которое специфически связывается с GITR, по данному изобретению
В одном аспекте моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR, по данному изобретению применяется в лечении нарушений, которые связаны (опосредованы) с активностью GITR.
В одном аспекте субъект лечения или пациент является млекопитающим, предпочтительно человеческим субъектом. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола и любого возраста.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфично связывается с GITR, применяют для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого GITR, где заболевание или нарушение выбрано из группы: РШМ (рак шейки матки) , рак головы и шеи, рак желудка, РМЖ (рак молочной железы) , почечно-клеточный рак, КРР (колоректальный рак) , РЯ (рак яичника) , НМРЛ (немелкоклеточный рак легкого) .
В случае опухоли (например, раковой опухоли) терапевтически эффективное количество антитела или фрагмента антитела (например, антитела или фрагмента антитела, которое специфически связывает GITR, может уменьшать число раковых клеток; уменьшать начальный размер опухоли; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлять и, предпочтительно, прекращать) инфильтрацию раковыми клетками периферических органов; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлять и, предпочтительно, прекращать) метастазирование опухоли; ингибировать, до некоторой степени, рост опухоли; и/или облегчать, до некоторой степени, один или более симптомов, обусловленных расстройством. Антитело или фрагмент антитела может, до некоторой степени, предупреждать рост и/или убивать имеющиеся раковые клетки, оно может вызывать цитостатический и/или цитотоксический эффект. При терапии рака эффективность in vivo можно определять, например, оценивая продолжительность жизни, время до прогрессирования заболевания (ТТР) , частоту ответа опухоли на лечение (RR) , продолжительность ответа и/или качество жизни .
Используемые в данном документе термины «совместное назначение», «совместно назначенный» и «в сочетании с» относятся к моноклональному антителу, которое специфически связывается с GITR, с одним или более другими терапевтическими агентами, как предполагается, означают, сслылаются или включают: 1) одновременное введение такой комбинации моноклонального антитела, которое специфически связывается с GITR, по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в одной лекарственной форме, из которой указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,
2) одновременное введение такой комбинации моноклонального антитела, которое специфически связывается с GITR, по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно в разных лекарственных формах, введение которых происходит практически в одно и то же время указанному пациенту, после чего указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,
3) последовательное введение такой комбинации моноклонального антитела, которое специфически связывается с GITR, по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно друг от друга в отдельных лекарственных формах, которые принимаются в последовательно по времени указанным пациентом со значимым временным интервалом между каждым введением, после чего указанные компоненты высвобождаются в практически разное время указанному пациенту; а также
4) последовательное введение такой комбинации моноклонального антитела, которое специфически связывается с GITR, по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в единый лекарственной форме, из которой высвобождение указанных компонентов происходит контролируемым образом, после чего они одновременно, последовательно или совместно высвобождаются в одно и то же время и/или разное время указанному пациенту, где каждая часть может быть введена одним или разными путями.
Моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR, по данному изобретению могут назначаться без дополнительного терапевтического лечения, т.е. в качестве самостоятельной терапии. Кроме того, лечение моноклональным антителом, которое специфически связывается с GITR, по данному изобретению может включать по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое лечение (комбинированная терапия) . В некоторых вариантах осуществления изобретения, моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR, может вводиться совместно или быть сформулирована с другим медикаментом/препаратом для лечения рака.
Термин «цитотоксическое средство» в используемом в настоящем описании смысле относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает функционирование клеток и/или вызывает разрушение клеток. Подразумевается, что термин включает радиоактивные изотопы (например, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 и радиоактивные изотопы Lu) , химиотерапевтические средства и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины, имеющие происхождение из бактерий, грибов, растений или животных, включая их фрагменты и/или варианты.
«Химиотерапевтическим средством» является химическое соединение, применимое для лечения злокачественной опухоли. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN®) ; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбохинон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метилмеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилмеламин; ацетогенины (например, буллатацин и буллатацинон) ; дельта- 9- тетрагидроканнабинол (дронабинол, MARINOL®) ; бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновую кислоту; камптотецин (включая синтетический аналог топотекан (HYCAMTIN®) , СРТ-11 (иринотекан, CAMPTOSAR®) , ацетилкамптотецин, скополектин и 9-аминокамптотецин) ; бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин) ; подофиллотоксин; подофиллиновую кислоту; тенипозид; криптофицины (например, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, например, калихеамицин гамма II и калихеамицин омега II (см., например, Agnew, Chem. Inti. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин А; эсперамицин; а также хромофор неокарциностатина и родственные хромофоры хромопротеинов энедииновые антибиотики, аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-Ь-норлейцин, доксорубицин (включая ADRIAMICIN®, морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2- пирролинодоксорубицин, доксорубициноНС1 в инъецируемых липосомах (DOXOL®) , липосомный доксорубицин TLC D-99 (MYOCET®) , пегилированный липосомный доксорубицин (CAELYX®) и дезоксидоксорубицин) , эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат, гемцитабин (GEMZAR®) , тегафур (UFTORAL®) , капецитабин (XELODA®) , эпотилон и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат ; аналоги пурина, такие как флударабин, 6- меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; средства, подавляющие функции надпочечников, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; компенсатор фолиевой кислоты, такой как фолиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазихон; элфорнитин; ацетат эллиптиния; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2- этилгидразид ; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2>>- трихлортриэтиламин; трихотецены (например, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин) ; уретан; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («ага- С») ; тиотепа; таксоид, например паклитаксел (TAXOL®) , препарат паклитаксела на основе сконструированных связанных с альбумином наночастиц (ABRAXANETM) и доцетаксел (TAXOTERE®) ; хлорамбуцил; 6- тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; средства на основе платины, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин; алкалоиды барвинка, которые предотвращают полимеризацию тубулина из образующихся микротрубочек, включая винбластин (VELBAN®) , винкристин (ONCOVIN®) , виндезин (ELDISINE®, FILDESIN®) и винорелбин (NAVELBINE®) ; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; лейковорин; новантрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO) ; ретиноиды, такие как ретиноевая кислота, включая бексаротен (TARGRETIN®) ; бифосфонаты, такие как клодронат (например, BONEFOS® или OSTAC®) , этидронат ( DIDROCAL®) , NE-58095, золедроновую кислоту/золедронат (ZOMETA®), алендронат (FOSAMAX®), памидронат (AREDIA®) , тилудронат (SKELID®) или ризендронат (ACTONEL®) ; троксацитабин ( 1 , 3-диоксолановый нуклеозидный аналог цитозина); антисмысловые олигонуклеотиды, например олигонуклеотиды, которые ингибируют экспрессию генов в путях передачи сигналов, вовлеченных в пролиферацию аберрантных клеток, таких как, например, РКС-альфа, Raf, H-Ras и рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R) ; вакцины, такие как вакцина THERATOPE® и вакцины для генной терапии, например вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® и вакцина VAXID®; ингибитор топоизомеразы 1 (например, LURTOTECAN®) ; rmRH (например, ABARELIX®) ; BAY439006 (сорафениб; Bayer) ; SU-11248 (Pfizer) ; перифосин, ингибитор ЦОГ-2 (например, целекоксиб или эторикоксиб) , ингибитор протеосом (например, PS341); бортезомиб (VELCADE®) ; CCI- 779; типифарниб (811577); орафениб, АВТ510; ингибитор Вс1-2, такой как облимерсен натрия (GENASENSE®) ; пиксантрон; ингибиторы EGFR (см. определение ниже) ; ингибиторы тирозинкиназ (см. определение ниже) ; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше средств; а также сочетания двух или более указанных выше средств, такие как CHOP, сокращенное название комбинированной терапии циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизолоном, и FOLFOX, сокращенное название схемы лечения оксалиплатином (ELOXATINTM) в сочетании с 5-FU и лейковорином.
Также в указанное определение включены противогормональные средства, которые действуют, регулируя или ингибируя действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены со смешанным профилем агонист/антагонист, включая тамоксифен (NOLVADEX®), 4- гидрокситамоксифен, триоксифен, торемифен (FARESTON®); идоксифен, дролоксифен, ралоксифен (EVISTA®) , триоксифен, кеоксифен и избирательные модуляторы рецепторов эстрогена (SERM) , такие как SERM3; чистые антиэстрогены без агонистических свойств, такие как фулвестрант (FASLODEX®) и ЕМ800 (такие средства могут блокировать димеризацию рецепторов эстрогена (ER) , ингибировать связывание ДНК, усиливать метаболизм ER и/или снижать уровни ER) ; ингибиторы ароматазы, включая стероидные ингибиторы ароматазы, такие как форместан и эксеместан (AROMAS IN®) , и нестероидные ингибиторы ароматазы, такие как анастразол (ARIMIDEX®) , летрозол (FEMARA®) и аминоглутетимид и другие ингибиторы ароматазы, включая ворозол (RIVISOR®) , ацетат мегестрола (MEGASE®) , фадрозол, имидазол; агонисты рилизинг-гормона лютеинизирующего гормона, включая лейпролид (LUPRON® и ELIGARD®) , гозерелин, бузерелин и триптерелин; половые стероиды, включая прогестины, такие как ацетат мегестрола и ацетат медроксипрогестерона, эстрогены, такие как диэтилстилбестрол и премарин и андрогены/ретиноиды, такие как флуоксиместерон, полностью трансретиноевая кислота и фенретинид; онапристон; антипрогестероны; понижающие регуляторы рецепторов эстрогенов (ERD) ; антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид и бикалутамид; тестолактон; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше средств; а также сочетания двух или более указанных выше средств.
Другими терапевтическими средствами, которые могут применяться в комбинации с антителом, которое специфически связывается с GITR, по данному изобретению могут быть ингибиторы функции фактора роста, например, такие ингибиторы включают антитела фактора роста и антитела рецептора фактора роста (например, анти-егЬВ2 антитело трастузумаб [Herceptin] , анти-EGFR антитело панитумумаб, анти-erbBl антитело цетуксимаб [Erbitux, С225] и любые антитела факторов роста или рецепторов фактора роста, раскрытые Stern et al . Critical reviews in oncology/haematology, 2005, Vol. 54, ppll-29) ; антиангиогенные агенты, такие как ингибирующие эффекты сосудистого эндотелиального фактора роста, [например, антитело против фактора роста сосудистых эндотелиальных клеток бевацизумаб (Avastin) ] , антитела против рецепторов сосудистого эндотелиального фактора роста, такие как анти-KDR антитела и анти-fltl антитела; антисмысловые терапии, например, направленные на вышеперечисленные мишени, такие как ISIS 2503, анти-ras антисмысловые средства или G3139 (Genasense) , анти-Ьс12 антисмысловые средства; подходами генной терапии, включая, например, подходы с заменой аберрантных генов, таких как аберрантный р53 или аберрантный BRCA1 или BRCA2, GDEPT (ген- направленная ферментная пролекарственная терапия) подходы с использованием цитозиндеаминазы, тимидинкиназы или фермента бактериальной нитроредуктазы, и подходы, направленные на повышение толерантности пациента к химиотерапии или лучевой терапии, такие как генная терапия мультилекарственной резистентности; иммунотерапевтические подходы, включая, например, лечение Алемтузумабом (campath-lH) , моноклональным антителом, направленным на CD52, или лечение антителами, направленными на CD22, ex vivo и in vivo подходы по повышению иммуногенности опухолевых клеток пациента, трансфекцию цитокинами, такими как интерлейкин 2, интерлейкин 4 или гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор, подходы, направленные на снижение анергии Т-клеток, такие как лечение моноклональными антителами, ингибирующими функцию CTLA-4, подходы с использованием трансфицированных иммунных клеток, таких как цитокин- трансфицированные дендритные клетки, подходы с использованием цитокин-трансфицированных опухолевых клеточных линий и подходы, использующие анти-идиотипические антитела, адаптивный перенос Т- клеток с использованием Т-клеток, подвергнутых неспецифической активации или нацеленных на конкретный антиген, представляющий интерес, ex vivo; ингибиторы деградации белка, такие как ингибитор протеасом, такой как Велкаде ( бортезомид ) ; биотерапевтические терапевтические подходы, например, использующие пептиды или белки (такие как антитела или растворимые конструкты внешних рецепторных доменов) , которые секвестируют рецепторы лигандов, блокируют связывание лиганда с рецептором или ослабляют сигнализацию рецептора (например, вследствие повышенной деградации рецептора или сниженных уровней экспрессии) .
Другим терапевтическим средством, которое может применяться в комбинации с антителом, которое специфически связывается с GITR, по данному изобретению может быть антитело, которое выбирают из группы: антитела к PD1, антитела к PD-L1, антитела к CTLA4, антитела к анти 4-1ВВ, антитела к 0X40 или их комбинации.
Другим терапевтическим средством, которое могжет применяться в комбинации с антителом, которое специфически связывается с GITR, по данному изобретению может быть терапевтически активное противоопухолевое соединение, которое выбирают из группы активаторов врожденного или приобретенного иммунитета.
Подразумевается, что моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR, по данному изобретению могут использоваться в способах лечения, как описано выше, могут использоваться в лечении, как описано выше, и/или могут использоваться в производстве медикаментов для лечения, как описано выше .
Дозы и пути введения
Моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR, по данному изобретению будет вводиться в количестве, эффективном для лечения состояния, о котором идет речь, т.е. в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого результата. Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от таких факторов, как конкретное состояние, по поводу которого проводится лечение, возраста, пола и веса пациента, а также является ли введение моноклонального антитела, которое специфически связывается с GITR, самостоятельным лечением или оно проводится в комбинации с одним или более дополнительных препаратов или методов лечения.
Схемы приема лекарственных средств можно регулировать, чтобы обеспечить оптимальный желаемый ответ. Например, может быть введен один болюс, несколько разделенных доз могут быть введены в течение некоторого времени, или доза могут быть пропорционально уменьшена или увеличена в зависимости от остроты терапевтической ситуации. Особенно полезным является изготовление парентеральных композиций в стандартной лекарственной форме для простоты введения и однородности дозирования. Стандартная лекарственная форма при использовании в данном документе, относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для пациентов/субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для стандартных лекарственных форм по настоящему изобретению, как правило, диктуется и непосредственно зависит от (а) уникальных характеристик химиотерапевтического агента и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, которые должны быть достигнуты, и (Ь) ограничений, присущих в технике компаундирования такого активного соединения для лечения чувствительности у субъектов.
Таким образом, квалифицированным специалистам понятно, исходя из раскрытия, представленного в данном документе, что дозы и режим дозирования корректируются в соответствии со способами, хорошо известными в терапевтической области. Это означает, что может быть легко установлена максимально переносимая доза и может быть также определено эффективное количество, обеспечивающее обнаруживаемый терапевтический эффект для пациента, так же как и требования к времени введения каждого агента для достижения видимого терапевтического эффекта для пациента. Таким образом, хотя некоторые дозы и схемы режима введения приведены в качестве примеров в данном документе, эти примеры никоим образом не ограничивают дозы и режимы введения, которые могут понадобиться для пациента в практике применения настоящего изобретения.
Следует отметить, что значения дозировки могут изменяться, в зависимости от типа и тяжести состояния, которое следует облегчить, и может включать одну или более доз. Кроме того, необходимо понимать, что для любого конкретного пациента, конкретные схемы введения должны быть скорректированы через некоторое время согласно индивидуальной потребности и на усмотрение медицинского работника, который осуществляет введение или контролирует введение композиций, и что диапазоны концентрации, приведенные в данном описании, приведены только в качестве примера и не предназначены для ограничения объема или практики заявленных композиций. Кроме того, режим дозирования с композициями по данному изобретению может быть основан на различных факторах, включая тип заболевания, возраст, вес, пол, состояния здоровья пациента, тяжесть состояния, путь введения и конкретное используемое моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR. Таким образом, режим дозирования может широко варьироваться, но может определяться регулярно с помощью стандартных методов. Например, дозы могут быть скорректированы на основе фармакокинетических и фармакодинамических параметров, которые могут включать клинические эффекты, такие как токсические эффекты или лабораторные значения. Таким образом, настоящее изобретение охватывает индивидуальное повышение дозы, которое определяется квалифицированным специалистом. Определение необходимой дозы и режимы хорошо известны в соответствующей области техники и будут понятны специалисту в данной области после ознакомления с идеями, раскрытыми в данном документе.
Примеры подходящих способов введения предусмотрены выше.
Предполагается, что подходящая доза моноклонального антитела, которое специфически связывается с GITR, по данному изобретению будет в диапазоне от 0,1-200 мг/кг, предпочтительно 0,1-100 мг/кг, в том числе около 0,5-50 мг/кг, например, около 1-20 мг/кг. Моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR, может быть введено, например, в дозе по меньшей мере 0,25 мг/кг, например, по меньшей мере 0,5 мг/кг, в том числе не менее 1 мг/кг, например, по меньшей мере 1,5 мг/кг, например, также как не менее 2 мг/кг, например, по меньшей мере 3 мг/кг, в том числе по меньшей мере 4 мг/кг, например, по меньшей мере 5 мг/кг; и например вплоть до максимально 50 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 30 мг/кг, например, вплоть до максимально 20 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 15 мг/кг. Введение будет повторяться обычно в подходящие промежутки времени, например, раз в неделю, раз в две недели, один раз каждые три недели или один раз каждые четыре недели, и так долго, как будет сочтено целесообразным ответственным врачом, который может в некоторых случаях увеличить или уменьшить дозу при необходимости.
Диагностическое использование и композиции
Моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR, по настоящему изобретению также используются в диагностических целях (например, in vitro, ex vivo) . Например, данное моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR, по данному изобретению может использоваться для обнаружения или измерения уровня GITR в образцах, полученных от пациента, например, образец ткани или образец жидкости тела, такой как воспалительный экссудат, кровь, сыворотка крови, жидкость кишечника, слюна или моча. Подходящие методы обнаружения и измерения включают иммунологические методы, такие как проточная цитометрия, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) , хемилюминесцентный анализ, радиоиммуноанализ и иммуногистология. Изобретение далее включает наборы, например, диагностические наборы, содержащие моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR, по настоящему изобретению, описанное в данном документе .
Примеры
Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме .
Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения .
Материалы и общие методы
Общая информация, касающаяся нуклеотидных последовательностей легких и тяжелых цепей человеческого иммуноглобулина, представлена у: Rabat Е.А. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд. , изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Аминокислоты цепей антител пронумерованы согласно нумерации EU (Edelman G.M. и др . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63, 1969, ее. 78- 85; Rabat Е.А. и др . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) .
Методы рекомбинантной ДНК
Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др . , Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии использовали согласно инструкциям производителей.
Синтез генов
Требуемые сегменты генов получали из олигонуклеотидов, созданных путем химического синтеза. Генные сегменты длиной от 300 до 4000 т.п.н., которые фланкированы уникальными сайтами рестрикции, собирали путем отжига и лигирования олигонуклеотидов, включая ПЦР-амплификацию и последующее клонирование через указанные сайты рестрикции. Последовательности ДНК субклонированных генных фрагментов подтверждали путем секвенирования ДНК.
Определение последовательностей ДНК
Последовательности ДНК определяли путем секвенирования по Сенгеру .
Анализ последовательностей ДНК и белков и обработка данных о последовательностях Применяли пакет программ фирмы Infomax's Vector NT1 Advance suite, версия 8.0 для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрации последовательностей.
Экспрессионные векторы
Для экспрессии описанных антител и антигенов применяли варианты экспрессионных плазмид, предназначенных для экспрессии в клетках прокариот (E.coli) кратковременной экспрессии в клетках эукариот (например, в клетках СНО) . Помимо кассеты экспрессии антитела векторы содержали: сайт инициации репликации, обеспечивающий репликацию указанной плазмиды в E.coli, гены, придающие устойчивость в E.coli к различным антибиотикам (например, к ампициллину и канамицину) .
Слияние генов, содержащих описанные цепи антитела, как указано ниже, осуществляли с помощью ПЦР и/или синтеза и сборки генов с использованием известных методов и процедур рекомбинации путем соединения соответствующих сегментов нуклеиновых кислот, например, с использованием уникальных сайтов рестрикции в соответствующих векторах. Субклонированные нуклеотидные последовательности подтверждали секвенированием ДНК. Для кратковременных трансфекций создавали большие количества плазмид посредством получения плазмид из трансформированных культур Е. coli .
Пример 1
Продукция рекомбинантных антигенов и антител в суспензионной культуре клеток млекопитающих
Для приготовления рекомбинантных антигенов на основе последовательности экстраклеточной части GITR человека и ортологов был создан ряд конструкций, содержащих экстраклеточный домен антигена human GITR (https : / /www . uniprot . org/uniprot/Q9Y5U5 ) , mcyGITR Macaca mulatta (https : //www . uniprot .org/uniprot/Q1PBC4 ) и musGITR Mus musculus (https : //www . uniprot .org/uniprot/035714 ) .
Последовательности генов были синтезированы с помощью ПЦР с матрицы, кодирующий полноразмерный антигена GITR человека из плазмидного вектора RDC0359
(https : / /www. rndsystems . com/products/human-gitr-tnfrsf18- np 004186-versaclone-cdna rdc0359) и собраны из синтетических олигонуклеотидов для генов ортологов GITR. Последовательность гена GITR клонировали в плазмиду для наработки белка в клетках млекопитающих с тагом Fc IgGl Lama glama (фиг. 1) по сайтам рестрикции Sall/Notl. Кроме того, последовательность антигена отделена от Fc протеаз-лабильным сайтом TEV протеазы, который также использовался для отщепления Fc фрагмента обработкой с TEV протеазой и получении безтаговой версии антигена. Последовательность также клонировали в плазмиду, содержащую FLAG- EPEA-tag (C-tag GE Healthcare) на С-конце белка (фиг. 2) по сайтам рестрикции Sall/Notl. Кроме того, провели аналогичное клонирование рекомбинантного GITR-лиганда человека (GITRL) https : //www . uniprot . org/uniprot/Q9UNG2 ) в плазмиду, содержащую гомотримеризующий домен foldon [1] и EPEA-tag на C-terminus GITRL (фиг. 3) . Плазмиды нарабатывали в необходимых количествах в клетках E.Coli и очищали при помощи набора Maxiprep Qiagen.
Антитела и антигены продуцировали в клетках постоянной клеточной линии, полученной из клеток яичника китайского хомячка (линия СНО-К1), согласно опубликованным протоколам [Biotechnol Bioeng. 2005 Sep 20; 91(6) : 670-677, Liao Metal., 2004; Biotechnol Lett. 2006 Jun; 28 ( 11 ) : 843-848 ; Biotechnol Bioeng. 2003 Nov 5 ; 84 ( 3 ) : 332-342 ] . Использовали клетки, конститутивно экспрессирующие ген белка EBNA1 (Epstein-Barrvirus nuclear antigen 1) . Суспензионное культивирование осуществляли в колбах на орбитальном шейкере, с использованием бессывороточных сред производства компании Life Technologies Corporation и согласно инструкциям производителя. Для транзиентной экспрессии клетки в концентрации 2*106/мл трансфецировали с помощью линейного полиэтиленимина (ПЭИ «МАХ», компания «Polysciences») . Соотношение ДНК/ПЭИ составляло 1:3/1:10. Через 5-7 дней после трансфекции культуральную среду центрифугировали при 2000 g в течение 20 минут и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Целевые белки выделяли из культуральной жидкости с помощью аффинной хроматографии .
Рекомбинантные белки GITR и GITRL, содержащий EPEA-tag (glutamic acid-proline-glutamic acid-alanine) на С-конце белка, выделяли и очищали из культуральной жидкости, используя сорбент CaptureSelect C-tag Affinity Matrix. Культуральную жидкость пропускали через хроматографическую колонку, предварительно заполненную 5 мл C-tag сорбента, затем промывали колонку 25 мл ФСБ, чтобы вымыть неспецифически связывающиеся компоненты. Связанный антиген элюировали в мягких условиях, используя 20тМ Tris, 2М МдС12 рН7,0-7,4. Далее белок переводили в ФСБ (pH 7,4) с помощью диализа, используя полупроницаемую диализную мембрану, фильтровали (0,22 мкм), переносили в пробирки и хранили при -70°С.
Рекомбинантный антиген GITR-TEV-Fc из культуральной жидкости выделяли и очищали, используя колонку для аффинной хроматографии протеин А. Осветленную культуральную жидкость пропускали через колонку HiTrap rProtein A Sepharose FF объемом 5 мл (GE Healthcare) , уравновешенную фосфатно-солевым буфером (ФСБ, pH 7,4) . Затем колонку промывали 5 колоночными объемами ФСБ, чтобы вымыть неспецифически связывающие компоненты. Связанный антиген элюировали, используя 0,1 М глициновый буфер pH 3. Главный протеиновый пик элюции собирали и доводили его pH до нейтральности с помощью 1 М буфера Tris (pH 8) . Все стадии проводили при скорости потока 110 см/ч. Далее белок переводили в ФСБ (pH 7,4) с помощью диализа, используя технологию SnakeSkin Dialysis Tubing, фильтровали (0,22 мкм) , переносили в пробирки и хранили при -70°С.
Все рекомбинантные антитела IgG очищали на колонке Hi Trap rProteinA FF объемом 1 мл (GE Healthcare) согласно методике, описанной выше для антигенов. Чистоту полученного раствора белка оценивали с помощью SDS-гель-электрофореза (пример фиг. 4 и 5) .
Пример 2
Создание наивной Fab-библиотеки человеческих антител MeganLibTM
Суммарную РНК В-лимфоцитов из индивидуальных образцов крови более тысячи человеческих доноров выделяли с помощью набора RNeasy Mini Kit согласно предлагаемому протоколу (от QIAGEN) . Концентрацию РНК определяли с помощью набора Nanovue (от GE Healthcare) и проверяли качество выделенной РНК с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле.
Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора MMLV RT kit (от Evrogen) согласно рекомендуемому протоколу с использованием обратной транскриптазы MMuLV и рандом-гексамерных олигонуклеотидов в качестве затравки.
Продукты обратной транскрипции использовали в качестве матрицы в двухступенчатой полимеразной цепной реакции для получения генов вариабельных доменов, фланкированных сайтами рестрикции, с использованием набора олигонуклеотидов по протоколам авторов [J Biol Chem. 1999 Jun 25; 274(26) : 18218-30].
Полученный ДНК препарат VL-CK-VH (фиг. 6) обрабатывали эндонуклеазами рестрикции NheI/Eco91I и лигировали в оригинальную фагмиду рН5 (фиг. 7) . Продукты лигирования трансформировали в электрокомпетентные клетки штамма SS320, приготовленные согласно протоколам [Methods Enzymol. 2000;328: 333-63.]. Репертуар комбинаторной фаговой Fab-дисплейной библиотеки MeganLibTM составлял 1011 трансформантов. Препараты фага Fab-библиотек готовили согласно процедуре, описанной ранее [J Mol Biol. 1991 Dec 5 ; 222 (3) : 581-97] .
Пример 3
Создание иммуных Fab-библиотек гибридных лама-человеческих антител (CHARM) .
Суммарную РНК В-лимфоцитов из индивидуальных образцов крови иммунизированных рекомбинантными GITR антигенами Lama Glama, которые продемонстрировали максимальный специфический титр сыворотки, выделяли с помощью набора RNeasy Mini Kit согласно предлагаемому протоколу (от QIAGEN) . Концентрацию РНК определяли с помощью набора Nanovue (от GE Healthcare) и проверяли качество выделенной РНК с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле.
Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора MMLV RT kit (от Evrogen) согласно рекомендуемому протоколу с использованием обратной транскриптазы MMuLV и рандом-гексамерных олигонуклеотидов в качестве затравки.
Продукты обратной транскрипции использовали в качестве матрицы в двухступенчатой полимеразной цепной реакции для получения генов вариабельных доменов, фланкированных сайтами рестрикции, с использованием набора олигонуклеотидов по протоколам авторов [J Biol Chem. 1999 Jun 25; 274(26) : 18218-30].
Полученный ДНК препарат VL-CK-VH (фиг. 6) обрабатывали эндонуклеазами рестрикции NheI/Eco91I и лигировали в оригинальную фагмиду рН5 (фиг. 7) . Продукты лигирования трансформировали в электрокомпетентные клетки штамма SS320, приготовленные согласно протоколам [Methods Enzymol. 2000;328: 333-63.]. Репертуар комбинаторной фаговой Fab-дисплейной библиотеки MeganLibTM составлял 1011 трансформантов. Препараты фага Fab-библиотек готовили согласно процедуре, описанной ранее [J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3) : 581-97] . Суммарная таблица препаратов иммунных библиотек приведена в таблице 1.
Таблица 1.
Figure imgf000079_0001
Figure imgf000080_0001
Пример 4
Селекция Fab-библиотек фаговых антител
Специфичные фаговые Fab-антитела человека против GITR получали из комбинаторных фаговой Fab-дисплейной библиотеки MeganLibTM и иммунных CHARM библиотек, описанных в примерах 2 и 3. Селекцию проводили на рекомбинантных антигенах GITR человека методом фагового дисплея [Nat Biotechnol. 1996 Mar ; 14 ( 3 ) : 309-14 ; J Mol Biol.1991 Dec 5 ; 222 ( 3 ) : 581-97].
Селекция иммунных фаговых библиотек проводили на EIA/RIA Tube High Binding 5 ml immunotube . Антиген (0.5 мл 2 мкг\мл) сорбировали в карбонатном буфере (0.1 М NaHC03, pH 9.5) в течение ночи при+ 4С. Затем отмыли пробирки PBST (10 тМ фосфатно-солевой буфер рН7,3- 7,5, 137mM NaCl и 2,7 тМ КС1, 0,1% Polysorbate 20) и добавили полный объем (5 мл) 0,5% сухого молока в PBST для забивки. Забивка чередуется от раунда к раунду, например, если на 1 раунде это было 0,5% молоко на PBST, то на 2-ом - 1% BSA на PBST. Инкубировали в течение часа при комнатной температуре на качалке. Отмыли пробирки PBST и добавили в них по 2 мл забивочного буфера и фаговые библиотеки до концентрации примерно 2*1012 фаговых частиц на мл. Инкубировали с фагами в течение 1-2 часов на комнатной температуре. На последующих раундах использовали 4 мл фагового супернатанта с предыдущего раунда, предварительно осветленного на центрифуге при 17 00 Од 10-15 минут. Отмыли пробирки 20 раз PBST. Элюировали фаги с поверхности пробирок 0,5 мл 0, 1М глицинового буфера pH 2,2: добавили в пробирки глициновый буфер и несильно помешивали 15 минут при комнатной температуре. Затем перенесли раствор фагов в чистые не сорбирующие пробирки со 100 мкл 1М ТрисНС1 рН8,0 для нейтрализации. Держали пробирки во льду до заражения клеток. Бактериофаг M13 после селекции культивируют, используя штамм E.coli TG1 в качестве хозяина. Амплификацию проводят посредством заражения фагами культуры штамма-хозяина и последующим ростом в течение 12-15 часов.
0,5-1 мл фагов после селекции смешивали с культурой клеток (ОПбоо=0, 3-0, 4 ) и инкубировали 1.5 часа на 37С. Затем клетки осаждали на 3000-4000об\мин в течение 10-15 минут, ресуспендировали в 1 мл среды и растирали на чашки Петри с антибиотиком для селекции (ампициллин) . Наращивали колонии в термостате на ЗОС. Спустя 12-15 часов рассчитали количество колоний и смыли клетки с чашек 5-10 мл LB среды. 100 мкл клеточной суспензии добавили к 20 мл среды с антибиотиком (ампициллин) . Нарастили до ОПбоо=0, 35-0, 5 на 37. Добавили фаг-хэлпер К07 из расчета 1 мкл на 10 мл культуры ( 1010 частиц на мл) и инкубировали на 37С 1,5 часа без качания. Затем к клеточной культуре добавили равный объем среды с однократным ампициллином (100 мкг\мл) и двукратным канамицином (40 мкг/мл) и двукратным IPTG(0,2MM) . Переставили на качалку и нарабатывали фаг 4-5 часов при ЗОС. Культуру клеток центрифугировали 25-30 минут 17000д и отобрали супернатант в пробирки. Затем полученный супернатант использовали в следующем раунде селекции или выделяли фаг осаждением для последующего хранения.
Выделяли фаги следующим способом: добавляли к супернатанту 1/6 объёма раствора, содержащего 20% полиэтиленгликоля и 2,5М хлорида натрия, интенсивно перемешали. Инкубировали раствор во льду не менее 3 часов. Затем раствор центрифугировали 10 минут на 8000д, образовавшийся осадок, содержащий фаги растворили в 1 мл буфера TBS (Трис - Боратный Буфер) .
Бактериофаги после двух-трех раундов выделяли и проводили анализ специфического связывания поликлонального фага с GITR человека и неспецифических антигенов.
Пример 5
Анализ поликлонального фага, полученных после 2 и 3 раундов селекции .
После проведения 3 раундов селекции 2 наивных библиотек MeganLib и 6 иммунных библиотек на целевом антигене проверили специфическое и неспецифическое связывания поликлональных фагов полученных после 2 и 3 раундов с помощью ИФА.
На пластик планшета для ИФА сорбировали в течение ночи в карбонатном буфере (0.1 М ИаНСОЗ, pH 9.5) целевой антиген GITR для анализа наличия специфически связывающихся фагов (2 мкг\мл) или ГКСФ, hIL6R-Fc, интерферон альфа 2b, Rituximab (2 мкг\мл) для анализа неспецифически связывающихся фагов. Затем отмыли планшеты PBST (10 шМ фосфатно-солевой буфер рН7,3-7,5, 137mM NaCl и 2,7 шМ КС1, 0,1% Polysorbate 20) и добавили по 300 мкл\лунку 0,5% сухого молока в PBST для забивки. Инкубировали в течение часа при комнатной температуре на качалке. Отмыли планшеты PBST и добавили в них по 50 мкл растворов фагов, полученных после 2 и 3 раундов селекции, разведенные забивочным буфером от 2 до 256 раз. Инкубировали в течение часа при комнатной температуре на качалке. Отмыли планшеты PBST и нанесли анти-М13 антитело, конъюгированное пероксидазой хрена, в забивочном буфере. После инкубации в течение часа отмыли планшеты и добавили по 50 мкл субстрата реакции (Н202- 0,02% и ТМБ) в ацетатном буфере рН-5.0. Инкубировали при комнатной температуре в темноте до появления легкого фона в отрицательных контролях (но не более 20-ти мин) . Остановили реакцию добавлением 25 мкл на лунку 10% H2S04, и измерили ОД в лунках на 450 нм.
По результатам анализа было выявлено специфическое (5Х превышение над фоновым сигналом) связывание 1 наивной Fab человека, и 6 иммунных Fab CHARM библиотек после 3-его раунда селекции на целевом антигене и отсутствие значимого (менее 2Х превышение) неспецифического связывания.
Гены вариабельных доменов антител из данных библиотек были реклонированы в экспрессионный вектор pLL-Fab (Фиг. 8) для наработки секретирумой растворимой формы Fab в клетках E.coli.
Пример 6
Скрининг Fab, специфически связывающих GITR человека
ИФА (ELISA) использовали для поиска Fab, секретирующихся в среду из моноклонов продуцентов E.coli полученных из из примера 5, которые специфически связывают GITR человека. В качестве позитивного контроля использовали Fab с опубликованной последовательностью Fab-gitr3215 (заявка на патент) . Для анализа специфического связывания лунки планшетов ELISA (medium binding от Greiner bio one) покрывали 50 мкл GITR (0,2 мкг/мл в 1* карбонатном буфере) , герметично закрывали и инкубировали в течение ночи при 4°С. Все последующие этапы проводили по стандартному протоколу ИФА с использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы на базе роботизированных систем Genetix Qpix2xt (от Molecular Device) и Tecan Freedom EVO 200 (от Tecan) . Для блокирования неспецифического связывания добавляли блокирующий буфер ВВ (200 мкл 0,5% нежирного молока в ФСБ) . Планшеты инкубировали на шейкере в течение часа при комнатной температуре. После отмывок ФСБ-Твином добавляли по 50 мкл на лунку тестируемого клеточного супернатанта, содержащего исследуемый Fab, смешанного с равным объемом ВВ . Планшеты снова инкубировали, встряхивая, один час при комнатной температуре, после чего каждую лунку планшетов три раза промывали буфером ФСБ-Твин. После промывания добавляли (50 мкл/лунку) анти-человеческого Fab HRP-конъюгированного вторичного антитела (от Pierce-ThermoScientific) в соотношении 1:5000 в ФСБ-Твин. Планшеты встряхивали на ротационном шейкере (50 мин, комнатная температура) и промывали три раза буфером ФСБ-Твин, как описано выше. Колориметрический сигнал развивали добавлением ТМВ (50 мкл/лунку) до насыщения (в среднем 3-5 мин), затем дальнейшее развитие останавливали добавлением стопового раствора (30 мкл/лунку, 10% серная кислота) . Цветовой сигнал измеряли при длине волны 450 нм, используя подходящий планшет-ридер Тесап- Sunrise (от Тесап) . Степень связывания антитела была пропорциональна продуцированию цветового сигнала. Клоны, у которых цветовой сигнал 5Х превышал фоновый сигнал и был соизмерим с сигналом контрольного антитела Fab-gitr3215, проверяли в ИФА на неспецифическое связывание.
Пример 7
Анализ неспецифического связывания отобранных Fab с другими антигенами
ИФА (ELISA) использовали также анализа неспецифического связывания исследуемых Fab-фрагментов с другими антигенами. Исследование проводили, как описано выше, но в качестве антигенов для иммобилизации использовали IL6R-Fc, INF 2b, PCSK9-VG-FE, PD- 1-Fc (2,5 мкг/мл в 1c карбонатном буфере) . В качестве контроля специфического связывания использовали GITR-TEV-Fc (0,2 мкг/мл в 1c карбонатном буфере) . Все последующие этапы проводили по стандартному протоколу ИФА с использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы на базе роботизированных систем Genetix Qpix2xt (от Molecular Device) и Тесап Freedom EVO 200 (от Тесап) . Клоны, у которых цветовой сигнал неспецифического связывания не превышал фонового сигнала и составлял 5Х меньшие значения от специфического связывания считались позитивными и их гены были секвенированы для определения последовательности генов вариабельных доменов антител и определения уникальности. В результате секвенирования было отобрано 30 уникальных последовательностей для конверсии в полноразмерный формат IgGl антител .
Пример 8
Продукция рекомбинантных антител в суспензионной культуре клеток млекопитающих
Клонирование генов вариабельных доменов антител из примера 7 проводили по стандартной методике. Для этого, наработали ПЦР- продукты, содержащие гены вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антител. Вариабельный домен тяжелой цепи клонировали в вектор рЕЕ-Нс IgGl по сайтам рестрикции Sall/Nhel, схематичная карта которого приведена на фиг.9) . Вариабельный домен легкой цепи лигировали в вектор рЕЕ-СК по сайтам рестрикции Sall/BsiWI схематичная карта которого приведена на (фиг.10) . Антитела продуцировали в клетках постоянной клеточной линии, полученной из клеток яичника китайского хомячка (линия СН0-К1), согласно опубликованным протоколам [Biotechnol Bioeng. 2005 Sep 20; 91 ( б) : 670-677, Liao Metal., 2004; Biotechnol Lett. 2006 Jun; 28 ( 11 ) : 843-848 ; Biotechnol Bioeng. 2003 Nov 5;84 (3) :332— 342] . Использовали клетки, конститутивно экспрессирующие ген белка EBNA1 (Epstein-Barrvirus nuclear antigen 1) .
Для наработки антител в системе транзиентной экспрессии использовали клетки линии CHO-K1-S. Клетки культивировали в колбах с отбойниками (125, 250, 500, 1000 и 3000 мл) в смеси сред CHO-S- SEM II и Freestyle СНО (1:1) с 4 мМ глутамином, 0,05 мг/мл гентамицином и 10 мкг/мл ципрофлоксацином в орбитальных шейкерах- инкубаторах при +37С в присутствии 5%С02, при оборотах 110 или 150 rpm в зависимости от размера колбы. Клетки пересевали 3 раза в неделю, плотность засева 0,2*106 клеток /мл.
Для трансфекции клетки засевали накануне с плотностью 0,8*106 клеток /мл, трансфекцию проводили через сутки, на клеточной культуре с плотностью 2*106 клеток /мл. Для приготовления трансфекционной смеси использовали среду RPMI-1640 с 2 мМ глутамина и 0,05 мг/мл гентамицина. Отдельно в среде разводили вектора из расчета 0,75 мкг/мл, отдельно - трансфецирующий агент полиэтиленимин (ПЭИ) , из расчета ПЭИ:ДНК 7:1 по массе. Разведения векторов и ПЭИ смешивали и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего вносили трансфекционную смесь к клеткам и культивировали клетки при стандартных условиях.
На следующие сутки после трансфекции к клеткам вносили смесь сред CHO-S-SEM II и Freestyle СНО (1:1) с 0,05 мг/мл гентамицином и 10 мкг/мл ципрофлоксацином, 1 мМ вальпроата натрия и 10% фидинга F12.7 и культивировали клетки в орбитальных шейкерах-инкубаторах при +34С в присутствии 5%С02, при оборотах 110 или 150 rpm в зависимости от размера колбы. На 3-4 день после трансфекции к клеткам вносили 10% фидинга F12.7.
На 7 сутки после трансфекции отбирали образцы клеточной жидкости для измерения концентрации нарабатываемого белка на чипах Protein-A Biosense на приборе OctetRed 96 согласно инструкции компании ForteBio (таблица 2) . Рекомбинантные антитела из культуральной жидкости выделили и очистили, используя колонку для аффинной хроматографии протеин А. Осветленную культуральную жидкость пропускали через колонку Hi Trap rProteinA FF объемом 1 мл (GE Healthcare) , которая была уравновешена фосфатно-солевым буфером (ФСБ, pH 7,4) . Затем колонку промыли 5 колоночными объемами ФСБ, чтобы вымыть неспецифически связывающие компоненты. Связанный антитело элюировали, используя 0,1 М глициновый буфер pH 3. Главный протеиновый пик элюции собрали и довели его pH до нейтральности с помощью 1 М буфера Tris (pH 8) . Все стадии проводили при скорости потока 110 см/ч. Далее белок перевели в ФСБ (pH 7,4) с помощью диализа, используя технологию SnakeSkin Dialysis Tubing, профильтровали (0,22 мкм) , перенесли в пробирки и хранили при - 70 ° С .
Чистоту полученного раствора белка оценивали с помощью SDS- гель-электрофореза фиг.11 и фиг. 12. Все антитела удовлетворяют чистоте необходимой для исследования физико-химических свойств и активности для клеточных тестов.
Таблица2.
Figure imgf000085_0001
Пример 9
Кинетический анализ взаимодействия anti-GITR IgGl антител с GITR человека
Константы аффинности связывания анти-GITR антител с GITR человека, макаки резус и яванской макаки получили с помощью прибора OctetRed 96 согласно инструкциям компании ForteBio. Антиген 25 мкг/мл был неспецифически иммобилизован на поверхность аминореактивных сенсоров второго поколения (от AR2G) (ForteBio по стандартному протоколу согласно инструкции производителя для подготовки и иммобилизации AR2G сенсоров) . анти-GITR антител Антитела добавлялись с концентраицей Анализ был произведен при 30°С с использованием PBS, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% БСА в качестве рабочего буфера.
Полученные сенсограммы с вычетом базового сигнала анализировали с помощью программы Octet Data Analysis (версия 8.0) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 1:1. Полученные константы аффинности приведены в таблице 3. Все исследованные антитела является высокоаффинными и специфичными к GITR человека.
Таблица 3. Константы аффинности анти-GITR антител при взаимодействии с GITR human.
Figure imgf000086_0001
Пример 1 О
Тест на определение анти-GITR специфической агонистической активности .
Для теста использовали клеточную линию НЕК293-GITR-NFkB-Luc, созданную на основе клеточной линии Нек-293, стабильно экспрессирующую на поверхности GITR и содержащую ген, кодирующий люциферазы светляка, под контролем NFkB-промотора .
Тест проводили в культуральном 96-луночном планшете. Суспензия в каждой лунке содержала клетки НЕК293-GITR-NFkB-Luc и исследуемое антитело в указанной на графике концентрации. Все компоненты суспензии готовили в питательной среде для культивирования клеток. После добавления всех компонентов планшет инкубировали при 37 °С, 5% СОг и далее, с помощью набора для оценки люминесценции и планшетного ридера, измеряли интенсивность люциферазы в лунках .
Результаты проверки (фиг.13) специфической активности анти- GITR моноклональных антител обнаружил что антитела лотов 1161, 1210 и 1213 являются функционально активными и проявляют значительную агонистическую активность с уровнем верхнего плато соизмеримым как с контрольным антителом aHTM-GITR3215 антителом так и с GITRL. Эти антитела были переименованы согласно таблице 4.
Таблица 4.
Figure imgf000087_0001
Пример 11
Иммуноферментный анализ взаимодействий анти-GITR антител с GITR из разных организмов
ИФА (ELISA) использовали для измерения сравнительной аффинности антител к GITR-Fc разных организмов. Для анализа связывания лунки планшетов ELISA (medium binding от Greiner bio one) покрывали 50 мкл GITR-Fc человека, циномолгуса, мыши, (0,5 мкг/мл в 1c карбонатном буфере) , герметично закрывали и инкубировали в течение ночи при 4°С. Все последующие этапы проводили по стандартному ИФА протоколу, описанному в примере б. Анти-GITR антитело BCD166-01-01 специфически связывалось с GITR человека и обезьяны циномолгус и не связывалось с мышиным GITR (фиг. 14) . Антитело BCD166-01-011 специфически связывалось с GITR человека, но не показало связывания с GITR обезьяны циномолгус и мыши (фиг. 15) . Антитело BCD166-01-014 специфически связывалось с GITR человека, гораздо слабее было связывание с GITR обезьяны циномолгус и полностью отсуствовало для GITR мыши (фиг. 16) . Таким образом, кандидат BCD166-01-011 был исключен из дальнейшей работы из-за отсуствия видимой специфичности к GITR макаки. Кандидаты BCD166-01-01 и BCD166-01-014 были финализированы для последующей разработки .
Пример 12
Кинетический анализ взаимодействия anti-GITR IgGl антител с macaca mulatta GITR и тасаса Cynomolgus GITR
Константы аффинности связывания анти-GITR антител с GITR макаки резус и яванской макаки получили с помощью прибора OctetRed 96 согласно инструкциям компании ForteBio. Антиген 25 мкг/мл был неспецифически иммобилизован на поверхность аминореактивных сенсоров второго поколения (от AR2G) (ForteBio по стандартному протоколу согласно инструкции производителя для подготовки и иммобилизации AR2G сенсоров) . анти-GITR антител Антитела добавлялись с концентраицей Анализ был произведен при 30 °С с использованием PBS, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% БСА в качестве рабочего буфера.
Полученные сенсограммы с вычетом базового сигнала анализировали с помощью программы Octet Data Analysis (версия 8.0) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 1:1. Полученные константы аффинности приведены в таблице 5 и б. Все исследованные антитела является высокоаффинными и специфичными к GITR макаки, что является основанием для исследования в дальнейшем на этой релевантной in vivo животной модели .
Таблица 5.
Константы аффинности анти-GITR антител при взаимодействии с тасаса mulatta GITR.
Figure imgf000088_0001
Таблица 6.
Константы аффинности анти-GITR антител при взаимодействии с с macaca Cynomolgus GITR.
Figure imgf000089_0001
Пример 13
Клеточный in vitro тест на определение анти-GITR специфической агонистической активности диких и мутантного кандидата с усиленной агонистической активностью.
Для возможного усиления агонистической активности anti-GITR антитела BCD166-01-01 , производного человека, на основании работ по изучению таких замен приводящих в олигомеризации антитела в работах W02005047327 , W02006104989 (А2), W02007005612 (А2) и Science . 2014 Маг 14;343 (6176) :1260-3, была выбрана и введена мутация E345R в IgGl Fc регион антитела. Было показано что такая мутация может приводить к олигомеризации антитела на поверхности клеток после связывания с антигеном, и усилению различных эффекторных способностей тк ADCC, ADCP, CDC а также фармакокинетики (РК) . Целью было получить антитело с усиленной агонистической способностью, ADCC, но не CDC . Мутагенез производили согласно стандартным генно-инженерным протоколам и рекомбианнтное антитело синтезировали согласно примеру 8. Антитело было названо и используется далее как BCD166-02-01. В тест также были взяты и два родительских антитела BCD166-01-01 , BCD166-01- 014.
Тест провдили аналогично тесту в Примере 10.
Результаты приведены на фиг.17 свидетельствуют об 5-кратном увеличении уровня активации в клеточном агонистическом тесте исследуемого BCD166-02-01 в сравнении с предшественником BCD166- 01-01, в который была введена мутация E345R, что обуславливается антиген-зависимой олигомеризацией anti-GITR BCD166-02-01 антитела на клетке мишени. Причем закономерно увеличился не только уровень верхнего плато активации но и величина ЕС50 изменилась более чем в 20 раз в сторону усиления.
Пример 14
Клеточный in vitro тест на определение антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) для анти-GITR антител.
В тесте исследовали ADCC активность для кандидатов BCD166- 02-01. В тест также были взяты и два антитела BCD166-01-01 , BCD166- 01-014. Кроме того, по аналогии с кандидатом BCD166-01-01 , мутацию E345R ввели в кандидата BCD166-01-014 (который назвали BCD166-02- 014), чтобы повысить ADCC активность в сравнении с дикой формой.
В тесте использовали клеточную линию Jurkat-NFAT-Luc-CDl 6, созданную на основе клеточной линии Jurkat, стабильно экспрессирующую на поверхности CD16 и содержащую ген, кодирующий люциферазу светляка, под контролем NFAT-промотора; а также клеточную линию Hek-293-GITR, созданную на основе клеточной линии Нек-293, стабильно экспрессирующую на поверхности GITR.
Тест проводили в культуральном 96-луночном планшете.
Суспензия в каждой лунке содержала смесь клеток-эффекторов
Jurkat-NFAT-Luc-CDl 6 и клеток мишеней Hek-293-GITR, а также анализируемые антитела в указанной на графике концентрации. Все компоненты суспензии готовили в питательной среде для культивирования клеток. После добавления всех компонентов планшеты инкубировали при 37 °С, 5% СОг и далее, с помощью набора для оценки Люциферы и планшетного ридера, измеряли интенсивность люминесценции в лунках.
Результаты приведены на фиг.18 свидетельствуют об 40-кратном усилении величины ЕС50 в клеточном ADCC тесте исследуемого BCD166- 02-01 в сравнении с предшественником BCD166-01-01 , в который была введена мутация E345R, что обуславливается антиген-зависимой олигомеризацией anti-GITR BCD166-02-01 антитела на клетке мишени. Также было достоверно определено 5-кратное усиление величины ЕС50 в клеточном ADCC тесте исследуемого BCD166-02-14 в сравнении с предшественником BCD166-01-14 , в который была введена мутация E345R. Вместе совокупные данные явно свидетельствуют о значительном позитивном эффекте замены E345R в Fc части IgGl антител на разные эффекторные характеристики необходимые для создания высокоактивного агониста GITR.
Пример 15
Клеточный in vitro тест на определение комплемент зависимой цитотоксичности (CDC) для анти-GITR антител.
В данном тесте были исследованы антитела BCD166-01-01 , BCD166-01-014 , BCD166-02-01 и контрольное антитело anti-GITR-3215.
Тест проводили в культуральном 96-луночном планшете. Суспензия в каждой лунке содержала по клетки HEK-293-GITR, а также анализируемые антитела в указанной концентрации и комплемент сыворотки крови человека.. Планшет с описанной сусензией инкубировали в течение 4 ч при 37 °С, 5% СОг. Далее в каждую лунку вносили раствор аламара синего, и далее инкубировали при 37 °С, 5% СОг. Далее, с помощью планшетного ридера, измеряли в лунках величину флуоресценции (длина волны возбуждения 544 нм, длина волны испускания - 590 нм) ,
Результаты приведены на фиг.19 свидетельствуют об незначимой активности CDC , те не более 10% до концентрации 1 мкг/мл, которая является граничной для оценочной терапевтической дозы предполагаемой для человека, для антител BCD166-01-01 , BCD166-02- 01 и контрольного антитела anti-GITR-3215. Для кандидата BCD166- 01-14 активности при концентрации 1 мкг/мл CDC составила около 30% лизиса, что свидетельствует о видимом эффекте, но возможно слабо проявляющемся in vivo. Вместе совокупные данные явно свидетельствуют незначительном эффекте замены E345R в Fc части IgGl кандидатов anti-GITR.
Пример 16
Клеточный in vitro тест на определение цитотоксичности anti- GITR кандидатов.
Для оценки негативного или позитивного влияния изучаемых anti-GITR кандидатов на изменение количества различных популяций иммунореактивных клеток был проведен данный тест. В данном тесте были исследованы антитела BCD166-01-01, BCD166-01-014 , BCD166-02- 01 и контрольное антитело anti-CD20 (rituximab) .
Клетки PBMCs были изолированы из цельной крови здоровых доноров путём центрифугирования в градиенте плотности фиколла.Тест проводили в культуральном 96-луночном планшете. Суспензия в каждой лунке содержала клетки PBMCs и указанное на графике антитело в концентрации 25, 1 и 0 мкг/мл, .. После смешивание PBMCs и антител планшет инкубировали в течение 16 ч при 37 °С, 5% С02. Далее оценивали в суспензиях долю CD56+, CD19+, CD3+, CD4+ и CD8+ субпопуляций PBMCs с помощью прямого окрашивания суспензий флуоресцентно-меченными антителами против соответствующих CD и последующего анализа клеток на проточном цитофлуориметре . Для CD56+, CD19+, CD3+ клеток на графиках приведена доля от всех клеток анализируемой суспензии, для CD4+, CD8+ - доля от CD3+ клеток.
Результаты представленные на фиг. 20-24 свидетельствуют об незначимом негативном влиянии изученных anti-GITR кандидатов, те не более 10% уменьшения количества иммунореактивных клеток в сравнении с негативным контролем. В случае популяции NK клеток мы наблюдали приблизительно 30-70% увеличение количества клеток в зависимости от дозы. При этом контрольное антитело anti-CD20 показало также увеличение процента NK клеток, но практически закономерное полную деплецию популяции CD20+ В клеток. Таким образом, все рассматриваемые кандидаты не обладают неспецифической цитотоксичностью in vitro на клетках крови человека.
Пример 17
Клеточный in vitro тест на определение антитело-зависимой деплеции nTreg клеточной популяции человека.
ОДНИМ ИЗ ОСНОВНЫХ предполагаемых механизмов терапевтического анти-онкогенного действия anti-GITR антител предполагается ADCC зависимая деплеция GITR+ клеток nTreg популяции. В данном тесте были исследованы антитела BCD166-01-01, BCD166-01-014 , BCD166-02- 01 и контрольное антитело anti-CTLA4 (ipilimumab) .
Мононуклеарные клетки перифеческой крови (РВМС) были изолированы из цельной крови здоровых доноров центрифугированием в градиенте плотности фиколла. РВМС были обогащены nTreg с помощью «CD4+ CD25+ Regulatory Т Cell Isolation Kit, human» (Miltenyi Biotec, Германия) . Полученные клетки активировали с помощью магнитных частиц с иммобилизованными анти-С З и анти-СБ28 антителами .
NK клетки были изолированы из РВМС с помощью «NK Cell Isolation Kit, human» (Miltenyi Biotec, Германия) .
В культуральный планшет внесли растворы антител, сусензию NK клеток и суспензию nTreg. Планшет инкубировали при 37 °С 5% СОг в течение 16 часов.
Окрашивали образцы клеточных суспензий с помощью флуоресцентно меченных антител против СВЗ, СВ4, СВ25, FoxP3 (Biolegend, США) . Образцы окрашенных клеточных суспензий анализировали с помощью проточной цитофлюориметрии .
Результаты анализа антитело-зависимой деплеции nTreg под действием изучаемых антител представленные на фиг. 25 для клеточного материала донора 1 и на фиг. 26 донора 2 свидетельствуют о значимом 70-100% уменьшении популяции клеток, т.е. деплетирующей активности изученных anti-GITR кандидатов особенно для материала донора 2. Кроме того, сравнительный анализ с контрольным anti- CTLA4 антителом ipilimumab демонстрирует большую активность в пользу anti-GITR антител особенно для финального кандидата ВСВ166- 02-01.
Пример 18
Клеточный in vitro тест по анализу антитело-зависимой деплеции iTreg клеточной популяции человека.
Одним из основных предполагаемых механизмов терапевтического анти-онкогенного действия anti-GITR антител предполагается ADCC зависимая деплеция GITR+ клеток iTreg популяции. В данном тесте были исследованы антитела BCD166-01-01, BCD166-01-014 , BCD166-02- 01.
РВМС были изолированы из цельной крови здоровых доноров центрифугированием в градиенте плотности фиколла . Выделяли из РВМС моноциты, как популяцию клеток, связывающихся с культуральным пластиком. Для получения дендритных клеток моноциты инкубировали в присутствии 1000 Ед/мл GM-CSF (Peprotech, США) и 500 Ед/мл IL-4 (Thermo Scientific, США) при 37°С 5% СОг в течение 120 часов. Добавили в культуральную среду раствор LPS (Sigma, США) до концентрации 0,5 мкг/мл, инкубировали клетки при 37°С 5% СОг в течение 48 часов. В культуральный планшет внесли растворы разведений антител, сусензию дендритных клеток и РВМС . Планшет инкубировали при 37° С 5% СОг в течение 120 часов.
Окрашивали образцы клеточных суспензий с помощью флуоресцентно меченных антител против CD3, CD4, CD25, FoxP3 (Biolegend, США) . Образцы окрашенных клеточных суспензий анализировали с помощью проточной цитофлюориметрии . Антитела против GITR BCD166-01-01, BCD166-01-14 и BCD166-02-01 вызывают деплецию iTreg in vitro.
Результаты анализа антитело-зависимой деплеции iTreg под действием изучаемых антител представленные на фиг.27 для клеточного материала донора 1 и донора 2 свидетельствуют о значимой 2-5Х кратной деплетирующей активности изученных anti-GITR кандидатов особенно для материала донора 1. Финальный кандидат BCD166-02-01 демонстрирует достаточную iTreg деплетирующую активность .
Пример 19
Клеточный in vitro тест на определение секреции провоспалительных цитокинов IL-2 и IFN- g под действием анти-GITR антитела в клеточной популяции человека.
Клетки PBMCs были изолированы из цельной крови здоровых доноров путём центрифугирования в градиенте плотности фиколла .
Иммобилизовали в лунках 96-луночного планшета антиС З и aHTHGITR антитела. Для этого внесли в соответствующие лунки планшета по 100 мкл раствора DPBS, содержащего aHTHGITR антитело BCD166-02-01 в указанной на графике концентрации и антиСБЗ антитело в субоптимальной концкнтрации, инкубировали планшет 16 часов при комнатной температуре.
Тест проводили 96-луночном планшете с предварительно иммобилизованными в лунках анти-СВЗ и анти-GITR антителами. Суспензия в каждой лунке содержала 40 000 клеток PBMCs, а также анти-СБ28 антитело в субоптимальной концентрацииВсе компоненты суспензии готовили в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS . После добавления клеточной суспензии, планшет инкубировали в течение 6 дней при 37°С, 5% С02. На 4-ый день инкубации из лунок отбирали аликвоты культуральной жидкости. Далее определяли в культуральной жидкости 4-го и 6-го дня инкубации концентрацию IL-2 и IFN- g с помощью ИФА.
Результаты анализа влияния анти-GITR антитела на уровень секреции провоспалительных цитокинов IL-2 и IFN- g, обуславливающих антираковых эффект, представлены на фиг.28 демонстрируют значительное повышение концентрации этих веществ в культуральной жидкости. Таким образом, кандидат BCD166-02-01 демонстрирует высокую активность в активации цитокиновой секреции, что может свидетельствовать о значимом анти-онкогенном действии.
Пример 2О
Анализ связывания антитела BCD166-02-01 с FcRn, FcgRIIIal58V, FcgRIIIal58F, FcgRIIal31H, FcgRIIal31R, FcgRIIb и FcgRIa рецепторами человека.
Константы аффинности связывания антитела BCD166-02-01 к FcRn, FcgRIIIal58V, FcgRIIIal58F, FcgRIIal31H, FcgRIIal31R, FcgRIIb и FcgRIa человека получили с помощью прибора OctetRed 96 (от ForteBio) . Биотинилированные рецепторы иммобилизировали на поверхности стрептавидиновых сенсоров (SA) . Провели и проанализировали ассоциацию и диссоциацию рецепторов и антитела в рабочем буфере (PBS, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% БСА: с рецепором FcRn с рН6, с остальными рецепторами - в буфере с рН7,4.) при 30 °С. Полученные сенсограммы проанализировали в соответствии с моделями 1:1 или 2:1 и рассчитали константы аффинности, используя программное обеспечение Octet Data Analysis Software 8.0 User Guide Copyright 2011©.
Результаты анализа аффиности BCD166-02-01 к FcRn, FcgRIIIal58V, FcgRIIIal58F, FcgRIIal31H, FcgRIIal31R, FcgRIIb и FcgRIa человека представлены на Фиг. 29. Они демонстрируют значения кратно усилиненнные по сравнению с литературными данными и данными многократно измеренными в нашей компании для антител IgGl изотипа, что свидетельствует о заметном но не качественном влиянии мутации E345R в составе Fc фрагмента на кинетику мономерных антител адсорбирующихся на этих рецепторах из раствора.
Пример 21
Определение коллоидной и термической стабильности по точке агрегации белка методом динамического светорассеяния
Для определения температуры агрегации исследуемых образцов методом динамического светорассеяния получали зависимость размера частиц в среде от температуры с помощью прибора DynaPro® Plate Reader II (Wyatt Technology Corp.) при постепенном нагревании от 40 до 85°С. Результаты представлены в таблице 7.
Таблица 7. Точка агрегации BCD166-02-01
Figure imgf000094_0001
Можно заключить, что молекула BCD166-02-01 имеет высокую термоколлоидную стабильность (точка агрегации в 20mM Acetate, рН=5, 0 и 20мМ His, рН=5,5 буферных растворах составляет > 65°) .
Аналогичные данные были получены для BCD166-01-014.
Пример 22
Определение термической стабильности при термострессе 50 °С
Исследуемые образцы устанавливали в воздушный термостат и термостатировали при 50 °С в течение 72 часов. После окончания прогрева интактные и стрессировнные образцы передавали на анализ методом эксклюзионной ВЭЖХ (SEC HPLC) с УФ-детектором и методом капиллярного изоэлектрического фокусирования. Хроматографию проводили на системе ВЭЖХ Agilent 1100 на колонке Tosoh TSK-Gel G3000SWXL, детектирование проводили при длине волны 220 нм. Определение гетерогенности по заряду методом капиллярного изоэлектрического фокусирования проводился на приборе Labchip GX II, Caliper. Приготовление рабочих растворов и подготовку чипа проводили по стандартной методике с использованием наборов НТ Protein Charge Variant Labeling Kit и Protein Charge Variant Buffer Kit, PerkinElmer.
Результирующие данные стабильности BCD-166 (для BCD166-02-01 и BCD166-01-014 ) при инкубировании при 50 °С представлены в табл. 8 и на фиг. 30 (для BCD166-02-01 ) и 31 (для BCD166-01-014 ) представлены совмещённые хроматограммы при 72 -часовой инкубации при 50 °С.
Общий вывод: образец обладает высокой коллоидной и термической стабильностью.
Figure imgf000095_0001
* D - разница чистоты стрессированного образца и чистоты интактного образца (входного контроля), %.
Таблица 8. Зависимость содержания мономера по эксклюзивной ВЭЖХ и ЭФ для BCD-166.
Пример 23
Оценка противоопухолевой активности препаратов BCD-166 на модели подкожных ксенографтов
Для оценки противоопухолевой активности препаратов BCD-166 использовали модель подкожных опухолевых ксенографтов. Для этого гуманизированным мышам huNOG-EXL подкожно трансплантировали 3x106 клеток линии А2058 в смеси с Matrigel®. На 7 день после инокуляции клеток животных распределяли по группам, как представлено в таблице 9.
Таблица 9. Распределение животных по группам в эксперименте по определению противоопухолевой активности препаратов BCD-166
Figure imgf000096_0002
Введение препаратов проводили внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг на 1, 5, 8, 12 сутки после распределения животных по группам. Группе отрицательного контроля вводили гистидиновый буфер. В течение эксперимента измеряли массу тела мышей и линейные размеры опухоли. Для вычисления объема опухоли использовали формулу V=LxWxHxn/6. В качестве критерия эффективности исследуемого препарата использовали показатель торможения роста опухоли (ТРО) , который рассчитывается с учетом среднего объема опухоли в группе отрицательного контроля (Vc) и группе препарата (Vt) по формуле:
Figure imgf000096_0001
По результатам эксперимента препараты BCD-166-01-014 и BCD- 166-02-01 показали значимую противоопухолевую активность, препарат BCD-166-01-01 не показал значимой противоопухолевой активности. Результаты показаны на фигурах 32 и 33.

Claims

Формула изобретения
1. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфично связывается с GITR, включающее:
(a) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий:
(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
NYGMH ( SEQ ID NO: 1) или YYWMY ( SEQ ID NO: 12);
(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
VIWFDGSNKFYTDSVKG ( SEQ ID NO: 2) или AISWNGGRTYYAESMKG (SEQ ID NO: 13) ;
(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
ELGGYYYDSSGFRPYYYGMDV (SEQ ID NO: 3) или NRYYSDPNYGMNL (SEQ ID NO: 14) , и
(b) вариабельный домен легкой цепи, содержащий:
(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
RASQSIGSWLA ( SEQ ID NO: 7) или TGTSTDIGTYKYIS (SEQ ID NO : 17);
(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
AASTLQR (SEQ ID NO: 8) или GVSHRPS (SEQ ID NO: 18);
(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы:
QQSHSHPLT (SEQ ID NO: 9) или SSYTSSGTW (SEQ ID NO: 19) .
2. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит :
(i) CDR 1, CDR 2 и CDR 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, соответственно; или
(ii) CDR 1, CDR 2 и CDR 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14, соответственно.
3. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где вариабельный домен легкой цепи содержит :
(i)CDR 1, CDR 2 и CDR 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9, соответственно; или
(ii)CDR 1, CDR 2 и CDR 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19, соответственно.
4. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где
- вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR 1, CDR 2 и CDR 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, соответственно;
- вариабельный домен легкой цепи содержит CDR 1, CDR 2 и CDR 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9, соответственно.
5. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где
- вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR 1, CDR 2 и CDR 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14, соответственно;
- вариабельный домен легкой цепи содержит CDR 1, CDR 2 и CDR 3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19, соответственно.
6. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит :
(i) аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO : 4 ; или
(ii) аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15.
7. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где
(i) вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; или
(ii) вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.
8. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где вариабельный домен легкой цепи содержи :
(i) аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO : 10; или
(ii) аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO : 20.
9. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где
( i ) вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; или
(ii) вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.
10. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где
( i )
вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4;
вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO:
10 ; или
(ϋ)
вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO:
15;
вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO:
20.
11. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 10, где
вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;
вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.
12. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 10, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15;
вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.
13. Моноклональное антитело по п. 1, где антитело, которое специфично связывается с GITR, представляет собой полноразмерное антитело IgG.
14. Моноклональное антитело по п. 13, где полноразмерное антитело IgG относится к изотипу IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 человека .
15. Моноклональное антитело по п. 14, где полноразмерное антитело IgG относится к изотипу IgGl человека.
16. Моноклональное антитело по п. 1, где антитело, которое специфично связывается с GITR, включает мутацию E345R в Fc фрагменте для увеличения агонистических свойств, антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) , но не комплементзависимой цитотоксичности (CDC) .
17. Моноклональное антитело по п. 1, включающее тяжелую цепь, содержащую :
(i) аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 5; или
(ii) аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 6.
18. Моноклональное антитело по п. 1, включающее:
(i) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; или
(ii) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
19. Моноклональное антитело по п. 1, включающее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 11.
20. Моноклональное антитело по п. 1, включающее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.
21. Моноклональное антитело по п. 1, включающее: ( i )
тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 5;
легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 11; или
( ϋ )
тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 6;
легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 11.
22. Моноклональное антитело по п. 1, включающее:
тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5;
легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.
23. Моноклональное антитело по п. 1, включающее:
тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;
легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.
24. Моноклональное антитело по п. 1, включающее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 16.
25. Моноклональное антитело по п. 1, включающее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.
26. Моноклональное антитело по п. 1, включающее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 21.
27. Моноклональное антитело по п. 1, включающее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.
28. Моноклональное антитело по п. 1, включающее:
тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 16; легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 21.
29. Моноклональное антитело по п. 1, включающее:
тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;
легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.
30. Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-29.
31. Нуклеиновая кислота по п. 30, где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.
32. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп. 30-31.
33. Способ получения клетки-хозяина для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-29, включающий трансформирование клетки вектором по п. 32.
34. Клетка-хозяин для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-29, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп. 30-31.
35. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-29, заключающийся в культивировании клетки-хозяина по п. 34 в культуральной среде в условиях, достаточных для получения указанного антитела, при необходимости, с последующим выделением и очисткой полученного антитела.
36. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого GITR, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-29 в терапевтически эффективном количестве, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.
37. Фармацевтическая композиция по п. 36, предназначенная для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого GITR, выбранного из группы: РШМ (рак шейки матки) , рак головы и шеи, рак желудка, РМЖ (рак молочной железы) , почечно- клеточный рак, КРР (колоректальный рак) , РЯ (рак яичника) , НМРЛ (немелкоклеточный рак легкого) .
38. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого GITR, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-29 в терапевтически эффективном количестве и по меньшей мере одно терапевтически активное противоопухолевое соединение в терапевтически эффективном количестве.
39. Фармацевтическая композиция по п. 38, предназначенная для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого GITR, выбранного из группы РШМ (рак шейки матки) , рак головы и шеи, рак желудка, РМЖ (рак молочной железы) , почечно-клеточный рак, КРР (колоректальный рак) , РЯ (рак яичника) , НМРЛ (немелкоклеточный рак легкого) .
40. Фармацевтическая композиция по п. 38, где терапевтически активное противоопухолевое соединение выбирают из химиотерапевтического средства, антитела или противогормонального средства.
41. Фармацевтическая композиция по п. 40, где терапевтически активное противоопухолевое соединение:
(i) представляет собой антитело, которое выбирают из группы: антитела к PD1, антитела к PD-L1, антитела к CTLA4, антитела к анти 4-1ВВ, антитела к 0X40 или их комбинации, или
( ii ) представляет собой малую молекулу, или
(ill) выбирают из группы активаторов врожденного или приобретенного иммунитета.
42. Фармацевтическая композиция по п. 41, где антитело по пп. 1-29 и по меньшей мере одно терапевтически активное противоопухолевое соединение вводятся последовательно.
43. Фармацевтическая композиция по п. 41, где антитело по пп. 1-29 и по меньшей мере одно терапевтически активное противоопухолевое соединение вводятся одновременно.
44. Способ ингибирования биологической активности GITR у субъекта, нуждающемуся в таком ингибировании, включающий введение субъекту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-29.
45. Способ лечения заболевания или нарушения, опосредованного GITR, включающий введение субъекту антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-29 или фармацевтической композиции по 36 или 38, нуждающемуся в таком лечении, в терапевтически эффективном количестве.
46. Способ лечения заболевания или нарушения по п. 45, где заболевание или нарушение выбрано из группы: РШМ (рак шейки матки) , рак головы и шеи, рак желудка, РМЖ (рак молочной железы) , почечно-клеточный рак, КРР (колоректальный рак) , РЯ
(рак яичника) , НМРЛ (немелкоклеточный рак легкого) .
47. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-29 или фармацевтической композиции по пп. 36 или 38 для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, заболевания или нарушения, опосредуемого GITR.
48. Применение по п. 47, где заболевание или нарушение выбрано из группы: РШМ (рак шейки матки) , рак головы и шеи, рак желудка, РМЖ (рак молочной железы) , почечно-клеточный рак, КРР (колоректальный рак) , РЯ (рак яичника) , НМРЛ (немелкоклеточный рак легкого) .
PCT/RU2020/050080 2019-04-23 2020-04-23 Моноклональное антитело, которое специфически связывается с gitr WO2020218951A2 (ru)

Priority Applications (15)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MX2021012962A MX2021012962A (es) 2019-04-23 2020-04-23 Anticuerpo monoclonal que se une especificamente a gitr.
CA3137822A CA3137822A1 (en) 2019-04-23 2020-04-23 Monoclonal antibody that binds specifically to gitr
AU2020261207A AU2020261207A1 (en) 2019-04-23 2020-04-23 Monoclonal antibody that specifically binds to GITR
EA202192907A EA202192907A1 (ru) 2019-04-23 2020-04-23 Моноклональное антитело, которое специфически связывается с gitr
EP20794288.9A EP3964525A4 (en) 2019-04-23 2020-04-23 MONOCLONAL ANTIBODY THAT BINDS SPECIFICALLY TO GITR
PE2021001765A PE20220144A1 (es) 2019-04-23 2020-04-23 Anticuerpo monoclonal que se une especificamente a gitr
KR1020217038209A KR20220010501A (ko) 2019-04-23 2020-04-23 Gitr에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체
BR112021021281A BR112021021281A2 (pt) 2019-04-23 2020-04-23 Anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao gitr
JOP/2021/0286A JOP20210286A1 (ar) 2019-04-23 2020-04-23 جسم مضاد أحادي النسيلة يرتبط نوعياً مع gitr
US17/605,933 US20220213209A1 (en) 2019-04-23 2020-04-23 Monoclonal antibody that binds specifically to gitr
JP2021563239A JP2022532991A (ja) 2019-04-23 2020-04-23 Ｇｉｔｒに特異的に結合するモノクローナル抗体
MA54969A MA54969A1 (fr) 2019-04-23 2020-04-23 Anticorps monoclonal se liant spécifiquement à gitr
CONC2021/0014153A CO2021014153A2 (es) 2019-04-23 2021-10-22 Anticuerpo monoclonal que se une específicamente a gitr
IL287531A IL287531A (en) 2019-04-23 2021-10-24 A monoclonal antibody that uniquely binds to gitr
ZA2021/09374A ZA202109374B (en) 2019-04-23 2021-11-22 Monoclonal antibody that binds specifically to gitr

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019112296A RU2734432C1 (ru) 2019-04-23 2019-04-23 Моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR
RU2019112296 2019-04-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2020218951A2 true WO2020218951A2 (ru) 2020-10-29
WO2020218951A3 WO2020218951A3 (ru) 2020-12-24

Family

ID=69821666

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2020/050080 WO2020218951A2 (ru) 2019-04-23 2020-04-23 Моноклональное антитело, которое специфически связывается с gitr

Country Status (22)

Country Link
US (1) US20220213209A1 (ru)
EP (1) EP3964525A4 (ru)
JP (1) JP2022532991A (ru)
KR (1) KR20220010501A (ru)
CN (1) CN110903392B (ru)
AR (1) AR118763A1 (ru)
AU (1) AU2020261207A1 (ru)
BR (1) BR112021021281A2 (ru)
CA (1) CA3137822A1 (ru)
CL (1) CL2021002792A1 (ru)
CO (1) CO2021014153A2 (ru)
EA (1) EA202192907A1 (ru)
IL (1) IL287531A (ru)
JO (1) JOP20210286A1 (ru)
MA (2) MA54969A1 (ru)
MX (1) MX2021012962A (ru)
PE (1) PE20220144A1 (ru)
RU (1) RU2734432C1 (ru)
TW (1) TWI803718B (ru)
UY (1) UY38672A (ru)
WO (1) WO2020218951A2 (ru)
ZA (1) ZA202109374B (ru)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111732658B (zh) * 2020-06-28 2022-04-26 英诺湖医药(杭州)有限公司 一组gitr单克隆抗体及其医药用途
CN112540179B (zh) * 2020-08-06 2023-07-07 武汉天德生物科技有限公司 一种测试ApoE4蛋白含量的ELISA试剂盒
CN112362876B (zh) * 2020-08-06 2023-12-15 武汉天德生物科技有限公司 一种检测早期老年痴呆症的胶体金试纸条及其制备方法
CN111763257B (zh) * 2020-09-01 2020-12-15 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 抗gitr抗体及其用途
CN112646040B (zh) * 2020-12-31 2022-03-25 中元汇吉生物技术股份有限公司 特异性结合人IgG4的蛋白及其应用

Citations (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
EP0216846A1 (en) 1985-04-01 1987-04-08 Celltech Ltd TRANSFORMED MYELOMA CELL LINE AND METHOD FOR EXPRESSING A GENE ENCODING A EUKARYOTIC POLYPEPTIDE EMPLOYING THIS LINE.
EP0256055A1 (en) 1986-01-23 1988-02-24 Celltech Ltd RECOMBINANT DNA SEQUENCES, THESE VECTORS, AND METHODS OF USE THEREOF.
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0323997A1 (en) 1987-07-23 1989-07-19 Celltech Limited Recombinant dna expression vectors
EP0338841A1 (en) 1988-04-18 1989-10-25 Celltech Limited Recombinant DNA methods, vectors and host cells
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
WO1993016185A2 (en) 1992-02-06 1993-08-19 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5500362A (en) 1987-01-08 1996-03-19 Xoma Corporation Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US5569825A (en) 1990-08-29 1996-10-29 Genpharm International Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
US5591669A (en) 1988-12-05 1997-01-07 Genpharm International, Inc. Transgenic mice depleted in a mature lymphocytic cell-type
WO1997017852A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide mischungen
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5821337A (en) 1991-06-14 1998-10-13 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6517529B1 (en) 1999-11-24 2003-02-11 Radius International Limited Partnership Hemodialysis catheter
WO2005047327A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
WO2006104989A2 (en) 2005-03-29 2006-10-05 Verenium Corporation Altered antibody fc regions and uses thereof
WO2007005612A2 (en) 2005-07-01 2007-01-11 Medimmune, Inc. An integrated approach for generating multidomain protein therapeutics
WO2015031667A2 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Amgen Inc. Gitr antigen binding proteins
WO2015187835A2 (en) 2014-06-06 2015-12-10 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (gitr) and uses thereof
WO2017068186A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Ablynx Nv Gitr agonists
WO2017096189A1 (en) 2015-12-02 2017-06-08 Agenus Inc. Anti-gitr antibodies and methods of use thereof
WO2017214548A1 (en) 2016-06-10 2017-12-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-gitr antibodies and uses thereof

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060052681A (ko) * 2003-05-23 2006-05-19 와이어쓰 Ｇｉｔｒ 리간드, ｇｉｔｒ 리간드-연관 분자, 항체 및그의 용도
LT3023438T (lt) * 2009-09-03 2020-05-11 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-gitr antikūnai
US10155818B2 (en) * 2014-05-28 2018-12-18 Agenus Inc. Anti-GITR antibodies and methods of use thereof
SG10201906471PA (en) * 2015-01-14 2019-09-27 Brigham & Womens Hospital Inc Treatment of cancer with anti-lap monoclonal antibodies
CN109641967A (zh) * 2016-07-01 2019-04-16 戊瑞治疗有限公司 用GITR激动剂和CpG的组合的抗肿瘤疗法
JP7009448B2 (ja) * 2016-08-12 2022-02-10 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 強化されたアゴニスト活性を有する、Ｆｃが遺伝子操作を受けた抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体及びその使用方法
CA3042727A1 (en) * 2016-11-19 2018-05-24 Potenza Therapeutics, Inc. Anti-gitr antigen-binding proteins and methods of use thereof
EP3589657A1 (en) * 2017-03-03 2020-01-08 Rinat Neuroscience Corp. Anti-gitr antibodies and methods of use thereof
TWI788340B (zh) * 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途

Patent Citations (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
EP0216846A1 (en) 1985-04-01 1987-04-08 Celltech Ltd TRANSFORMED MYELOMA CELL LINE AND METHOD FOR EXPRESSING A GENE ENCODING A EUKARYOTIC POLYPEPTIDE EMPLOYING THIS LINE.
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
EP0256055A1 (en) 1986-01-23 1988-02-24 Celltech Ltd RECOMBINANT DNA SEQUENCES, THESE VECTORS, AND METHODS OF USE THEREOF.
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5500362A (en) 1987-01-08 1996-03-19 Xoma Corporation Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
EP0323997A1 (en) 1987-07-23 1989-07-19 Celltech Limited Recombinant dna expression vectors
EP0338841A1 (en) 1988-04-18 1989-10-25 Celltech Limited Recombinant DNA methods, vectors and host cells
US5591669A (en) 1988-12-05 1997-01-07 Genpharm International, Inc. Transgenic mice depleted in a mature lymphocytic cell-type
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5569825A (en) 1990-08-29 1996-10-29 Genpharm International Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US5821337A (en) 1991-06-14 1998-10-13 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993016185A2 (en) 1992-02-06 1993-08-19 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
WO1997017852A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide mischungen
US6517529B1 (en) 1999-11-24 2003-02-11 Radius International Limited Partnership Hemodialysis catheter
WO2005047327A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
WO2006104989A2 (en) 2005-03-29 2006-10-05 Verenium Corporation Altered antibody fc regions and uses thereof
WO2007005612A2 (en) 2005-07-01 2007-01-11 Medimmune, Inc. An integrated approach for generating multidomain protein therapeutics
WO2015031667A2 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Amgen Inc. Gitr antigen binding proteins
WO2015187835A2 (en) 2014-06-06 2015-12-10 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (gitr) and uses thereof
WO2017068186A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Ablynx Nv Gitr agonists
WO2017096189A1 (en) 2015-12-02 2017-06-08 Agenus Inc. Anti-gitr antibodies and methods of use thereof
WO2017214548A1 (en) 2016-06-10 2017-12-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-gitr antibodies and uses thereof

Non-Patent Citations (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Genetics Computer Group", UNIVERSITY AVE., article "Sequence Analysis Software Package"
AGNEW, CHEM. INTL. ED. ENGL., vol. 33, 1994, pages 183 - 186
AGOSTINI ET AL., INFECT. IMMUN., vol. 73, 2005, pages 7502 - 7508
BALTZ ET AL., BLOOD, vol. 112, 2008, pages 3735 - 3743
BIOTECHNOL BIOENG, vol. 84, no. 3, 5 November 2003 (2003-11-05), pages 332 - 342
BIOTECHNOL BIOENG, vol. 91, no. 6, 20 September 2005 (2005-09-20), pages 670 - 677
BIOTECHNOL BIOENG., vol. 91, no. 6, 20 September 2005 (2005-09-20), pages 670 - 677
BIRD ET AL., SCIENCE, vol. 242, 1988, pages 423 - 426
BURKS ET AL., PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 94, 1997, pages 412 - 417
CARTER ET AL., BIO/TECHNOLOGY, vol. 10, 1992, pages 163 - 167
CHATTOPADHYAY ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI., vol. 104, 2007, pages 19452 - 19457
CHEN, Y. ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 293, 1999, pages 865 - 881
CLACKSON ET AL., NATURE, vol. 352, 1991, pages 624 - 628
CLYNES ET AL., PNAS (USA, vol. 95, 1998, pages 652 - 656
DAERON, ANNU. REV. IMMUNOL., vol. 15, 1997, pages 203 - 234
EDELMAN, G.M. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 63, 1969, pages 78 - 85
GAZZANO-SANTORO ET AL., J. IMMUNOL. METHODS, vol. 202, 1996, pages 163
HAARD HJVAN NEER NREURS AHUFTON SEROOVERS RCHENDERIKX P ET AL.: "A large non-immunized human Fab fragment phage library that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodies", J BIOL CHEM, vol. 274, 1999, pages 18218 - 18230, XP002128301, DOI: 10.1074/jbc.274.26.18218
HUSTON ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 85, 1988, pages 5879 - 5883
J BIOL CHEM., vol. 274, no. 26, 25 June 1999 (1999-06-25), pages 18218 - 30
J MOL BIOL, vol. 222, 1991, pages 581 - 597
J MOL BIOL., vol. 222, no. 3, 5 December 1991 (1991-12-05), pages 581 - 97
KABAT, E.A. ET AL.: "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 1991, PUBLIC HEALTH SERVICE, NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH
KOHLER ET AL., NATURE, vol. 256, 1975, pages 495
KOZBOR, J. IMMUNOL., vol. 133, 1984, pages 3001
LEFRANC ET AL., DEV. COMP IMMUNOL., vol. 27, 2003, pages 55 - 77
LIAO METAL., BIOTECHNOL LETT, vol. 28, no. 11, 2004, pages 843 - 848
MAHESH ET AL., EUR. J. IMMUNOL., vol. 36, 2006, pages 2128 - 2138
MARKS ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 222, 1991, pages 581 - 597
MCCAFFERTY ET AL., NATURE, vol. 348, 1990, pages 552 - 553
METHODS ENZYMOL., vol. 328, 2000, pages 333 - 63
MORRISON ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 81, 1984, pages 6851
MUNSON ET AL., ANAL. BIOCHEM., vol. 107, 1980, pages 220
NAT BIOTECHNOL., vol. 14, no. 3, March 1996 (1996-03-01), pages 309 - 14
NOCENTINI ET AL., E. J. IMMUNOL., vol. 37, 2007, pages 11651169
NOCENTINI ET AL., EUR. J. IMMUNOL., vol. 37, 2007, pages 1165 - 1169
NOCENTINI ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI., vol. 94, 1997, pages 6216 - 6221
NOCENTINIRICCARDI, E. J. IMMUNOL., vol. 35, 2005, pages 1016 - 1022
RAVETCHKINET, ANNU. REV. IMMUNOL, vol. 9, 1991, pages 457 - 92
SAMBROOK, J. ET AL.: "Molecular cloning: A laboratory manual;", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
SCHAER ET AL., CURR. OPIN. IMMUNOL., vol. 24, 2012, pages 217224
SCIENCE, vol. 343, no. 6176, 14 March 2014 (2014-03-14), pages 1260 - 3
SHEETS MDAMERSDORFER PFINNERN RSARGENT PLINDQUIST ESCHIER R ET AL.: "Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: the production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens", PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 95, 1998, pages 6037 6042 - 6162
SMITH GP: "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface", SCIENCE, vol. 228, 1985, pages 1315 - 1317, XP002464311, DOI: 10.1126/science.4001944
STERN ET AL., CRITICAL REVIEWS IN ONCOLOGY/HAEMATOLOGY, vol. 54, 2005
VAUGHAN TJWILLIAMS AJPRITCHARD KOSBOURN JKPOPE AREARNSHAW JC ET AL.: "Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library", NAT BIOTECHNOL, vol. 14, 1996, pages 309 - 314, XP000196144, DOI: 10.1038/nbt0396-309
WARD ET AL., NATURE, vol. 341, 1989, pages 544 - 546
WATERHOUSE ET AL., NUCL. ACIDS. RES., vol. 21, 1993, pages 2265 - 2266
WOOF J.BURTON D., NAT REV IMMUNOL, vol. 4, 2004, pages 89 - 99
ZHOU ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI., vol. 105, 2008, pages 635 - 640

Also Published As

Publication number Publication date
CO2021014153A2 (es) 2021-10-29
US20220213209A1 (en) 2022-07-07
CA3137822A1 (en) 2020-10-29
KR20220010501A (ko) 2022-01-25
PE20220144A1 (es) 2022-01-27
AU2020261207A1 (en) 2021-12-23
IL287531A (en) 2021-12-01
MA55390A1 (fr) 2022-05-31
EA202192907A1 (ru) 2022-01-25
CN110903392A (zh) 2020-03-24
UY38672A (es) 2020-10-30
EP3964525A4 (en) 2022-12-28
TW202100554A (zh) 2021-01-01
MA55390B1 (fr) 2022-10-31
AR118763A1 (es) 2021-10-27
MA54969A1 (fr) 2022-08-31
TWI803718B (zh) 2023-06-01
CL2021002792A1 (es) 2022-06-24
EP3964525A2 (en) 2022-03-09
JP2022532991A (ja) 2022-07-21
JOP20210286A1 (ar) 2023-01-30
BR112021021281A2 (pt) 2022-03-08
ZA202109374B (en) 2022-12-21
CN110903392B (zh) 2024-02-13
MX2021012962A (es) 2021-12-15
RU2734432C1 (ru) 2020-10-16
WO2020218951A3 (ru) 2020-12-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11840567B2 (en) Bispecific antibodies with specific binding to CD47 and PD-L1
RU2734432C1 (ru) Моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR
US11236167B2 (en) Monoclonal antibody to PD-L1
RU2724469C2 (ru) Моноклональное антитело, которое специфически связывается с cd20
RU2779652C2 (ru) АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К CD47 и PD-L1
EA044786B1 (ru) Моноклональное антитело, которое специфически связывается с gitr
EA044757B1 (ru) Моноклональное антитело, которое специфически связывается с cd20
WO2019190359A1 (ru) Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с iv и ii субдоменами внеклеточного домена her2 человека
EA041915B1 (ru) Моноклональное антитело к pd-l1

Legal Events

Date Code Title Description
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3137822

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021563239

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112021021281

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020794288

Country of ref document: EP

Effective date: 20211123

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20794288

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01E

Ref document number: 112021021281

Country of ref document: BR

Free format text: COM BASE NA PORTARIA 405 DE 21/12/2020, SOLICITA-SE QUE SEJA APRESENTADO, EM ATE 60 (SESSENTA) DIAS, NOVO CONTEUDO DE LISTAGEM DE SEQUENCIA POIS O CONTEUDO APRESENTADO NA PETICAO NO 870210097928 DE 22/10/2021 NAO POSSUI TODOS OS CAMPOS OBRIGATORIOS INFORMADOS, NAO CONSTANDO OS CAMPOS 140 / 141 . ALEM DISSO, APRESENTE TRADUCAO DA FOLHA DE ROSTO DA PRIORIDADE.

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020261207

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20200423

Kind code of ref document: A

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01Y

Ref document number: 112021021281

Country of ref document: BR

Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 1.5 NA RPI NO 2658 DE 14/12/2021 PARA ADEQUACAO DO CONTEUDO EM NOVA EXIGENCIA.

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01E

Ref document number: 112021021281

Country of ref document: BR

Free format text: COM BASE NA PORTARIA 405 DE 21/12/2020, SOLICITA-SE QUE SEJA APRESENTADO, EM ATE 60 (SESSENTA) DIAS, NOVO CONTEUDO DE LISTAGEM DE SEQUENCIA POIS O CONTEUDO APRESENTADO NA PETICAO NO 870210103475 DE 09/11/2021 POSSUI INFORMACOES DIVERGENTES DO PEDIDO EM QUESTAO NO CAMPO 110 , FORMATO DE DATA ERRADO NO CAMPO 151 E AUSENCIA DO CAMPO OBRIGATORIO 140 / 141 UMA VEZ QUE O DEPOSITANTE JA POSSUIA O NUMERO DO PEDIDO NO BRASIL NO MOMENTO DO PETICIONAMENTO DA MESMA.

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112021021281

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20211022