WO2019068302A1 - Антитела, специфичные к cd47 и pd-l1 - Google Patents

Антитела, специфичные к cd47 и pd-l1 Download PDF

Info

Publication number
WO2019068302A1
WO2019068302A1 PCT/EA2018/050001 EA2018050001W WO2019068302A1 WO 2019068302 A1 WO2019068302 A1 WO 2019068302A1 EA 2018050001 W EA2018050001 W EA 2018050001W WO 2019068302 A1 WO2019068302 A1 WO 2019068302A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
cancer
antibodies
seq
cell
Prior art date
Application number
PCT/EA2018/050001
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Кирилл Владимирович СОЛОВЬЕВ
Андрей Борисович УЛИТИН
Тимофей Александрович НЕМАНКИН
Валерий Владимирович СОЛОВЬЕВ
Дмитрий Валентинович МОРОЗОВ
Original Assignee
Закрытое Акционерное Общество "Биокад"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to CN201880078338.5A priority Critical patent/CN111801352A/zh
Priority to JOP/2020/0078A priority patent/JOP20200078A1/ar
Application filed by Закрытое Акционерное Общество "Биокад" filed Critical Закрытое Акционерное Общество "Биокад"
Priority to JP2020519341A priority patent/JP2020535839A/ja
Priority to PE2020000513A priority patent/PE20210460A1/es
Priority to MX2020004027A priority patent/MX2020004027A/es
Priority to BR112020006706-7A priority patent/BR112020006706A2/pt
Priority to AU2018345458A priority patent/AU2018345458A1/en
Priority to US16/753,587 priority patent/US11840567B2/en
Priority to MA49599A priority patent/MA49599B1/fr
Priority to EP18864490.0A priority patent/EP3693390A4/en
Priority to KR1020207012767A priority patent/KR20200058542A/ko
Priority to CA3078413A priority patent/CA3078413A1/en
Publication of WO2019068302A1 publication Critical patent/WO2019068302A1/ru
Priority to PH12020550214A priority patent/PH12020550214A1/en
Priority to CONC2020/0004199A priority patent/CO2020004199A2/es
Priority to RU2020115122A priority patent/RU2779652C2/ru
Priority to ZA2020/02047A priority patent/ZA202002047B/en
Priority to JP2023112302A priority patent/JP2023130455A/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001129—Molecules with a "CD" designation not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to the field of biotechnology, namely, antibodies or their antigen-binding fragments, as well as their use. More specifically, the present invention relates to antibodies that specifically bind to CD47 and PD-L1. The invention also relates to a nucleic acid encoding a given antibody or antigen-binding fragment thereof, an expression vector, a method for producing an antibody, and the use of said antibodies and compositions in cancer therapy.
  • T-cells Providing two separate signals to T-cells is a widespread model of lymphocytic activation of the remaining T-lymphocytes with antigen-presenting cells (APC). This model fully provides for recognition of one's own and others, and immune tolerance.
  • the primary signal or antigen-specific signal is transmitted through the T-cell receptor (TCR) after recognition of a foreign antigenic peptide presented in the context of the major histocompatibility complex (MHC).
  • MHC major histocompatibility complex
  • the second or co-stimulatory signal is delivered to T-cells using co-stimulatory molecules expressed on antigen-presenting cells (APC) and induces T-cells to stimulate clonal expansion, cytokine secretion and effector function.
  • APC antigen-presenting cells
  • T cells In the absence of co-stimulation, T cells can become immune to antigenic stimulation, they cause an effective immune response, and further it can lead to depletion or resistance to foreign antigens.
  • T cells receive both signals: both a positive and a negative secondary co-stimulatory signal.
  • the regulation of such positive and negative signals is critical for maximizing the protective immune response of the host, while maintaining immune stability and preventing autoimmunity.
  • Negative secondary signals appear to be necessary for the induction of T-cell resistance, while positive signals stimulate T-cell activation. While a simple two-signal model still provides a reliable explanation for naive lymphocytes, the immune response is a dynamic process, and co-stimulatory signals to antigen-expanded T cells can also be provided.
  • the mechanism of co-stimulation is of interest from a therapeutic point of view, since it has been shown that manipulating the co-stimulatory signals provides a means of either enhancing or terminating the immune response.
  • T-cell dysfunction or anergy has been found to occur simultaneously with the induced and persistent expression of the inhibitory receptor, polypeptide 1 programmed cell death (PD-1).
  • PD-1 polypeptide 1 programmed cell death
  • therapeutic targeting of PD-1 and other molecules that transmit a signal through interaction with PD-1 such as programmed death ligand 1 (PD-L1) and programmed death ligand 2 (PD-L2), is an area of intense interest.
  • PD-L1 is over-expressed in many malignant neoplasms and is often associated with a poor prognosis.
  • the majority of tumor infiltrating T-lymphocytes predominantly express PD-1, unlike T-lymphocytes in normal tissues and T-lymphocytes of peripheral blood, which reveals a positive regulation of PD-1 in relation to tumor-reactive T-cells and may contribute reduced immune response.
  • This may be due to the use of the PD-L1 signaling pathway mediated by tumor cells expressing PD-L1 and interacting with T-cells expressing PD-1, with a total weakening of T-cell activation and evasion of immune surveillance.
  • inhibition of PD-L1 / PD-1 can enhance CD8 + T-cell-mediated destruction of tumors.
  • the therapeutic focus of PD-1 and other molecules that transmit a signal through interaction with PD-1 is an area of intense interest. It was proposed to inhibit PD-L1 signals as a means to enhance T-cell immunity (for example, antitumor immunity) for the treatment of cancer and infection, including both acute and chronic infection.
  • Inhibitors that block the interaction of PD-L1 and PD-1 are known, among other sources, from documents W02001014557, W02002086083, W02007005874, W02010036959, W02010077634 and WO2011066389.
  • the optimal therapeutic agent aimed at the target along this path has not yet been commercialized, and this is a significant unmet need for medicine.
  • CD47 is a cell surface glycoprotein that binds to SIRPa (otherwise known as SHPS-1) and SIRPy on corresponding cells. This interaction leads to a negative regulation of the function of immune cells or may mediate cell adhesion and migration.
  • SIRPa also known as SHPS-1
  • SIRPy a cell surface glycoprotein that binds to SIRPa
  • This interaction leads to a negative regulation of the function of immune cells or may mediate cell adhesion and migration.
  • CD47 as a biological agent in the treatment of autoimmune disorders (WO 1999/040940) has been proposed.
  • CD47 ligands such as SIRPa
  • One explanation is that there is widespread expression of CD47, which may interfere with the use of CD47 binding polypeptides as potential drugs. Data published by Yu et al. (J Invest Dermatol, 126, 2006, pp.
  • a fusion protein consisting of the extracellular SIRPa domains fused to the Fc domain immunoglobulin, can prevent migration of the resulting dendritic cells (DC) from the skin to the draining lymph nodes in mice and thereby weaken (at least partially) the contact hypersensitivity reaction (response) in mice.
  • DC migration and function are important for immune or inflammatory responses. In a painful condition, these exacerbated DC responses can lead to the maintenance of the disease. Impacting the migration of pathogenic DCs from tissue to lymphoid organs may be an attractive opportunity to stop the vicious cycle of stimulating autoimmune or inflammatory diseases.
  • CD47 also known as integrin-associated protein (IAP), ovarian cancer OAS antigen, Rh-associated antigen and MER6, is a transmembrane receptor that penetrates the membrane several times and belongs to the immunoglobulin superfamily. Expression and / or activity of CD47 is observed in a number of diseases and disorders. Thus, there is a need for therapies that target CD47. In addition, because of the expression of CD47 on platelets, there is also a need for treatments that target CD47 (eg, antibodies) that do not cause significant levels of platelet depletion, hemagglutination, red cell depletion and / or anemia when administered to a subject.
  • target CD47 eg, antibodies
  • WO / 2014/087248 described a bispecific antibody that is specific for CD47 and CD19
  • WO2016023001 describes a bispecific antibody that is specific CD47 and PD1.
  • the possibility of creating and effectively using a multispecific antibody that specifically binds to CD47 and PD-L1 has not been previously described.
  • the present invention relates to binding molecules, for example, antibodies directed for binding to CD47 and PD-L1. Such antibodies can be used to treat a disease or disorder mediated by CD47 and PD-L1.
  • the present invention relates to a monoclonal antibody that specifically binds to CD47 and PD-L1 and includes one CD47 binding site, and at least one PD-L1 binding site.
  • an antibody of the present invention is a full-length antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • an antibody of the present invention includes one or two PD-L1 binding sites.
  • the saiga binding to the CD47 antibody of the present invention inhibits the interaction of the CD47 receptor and SIRPa ligand, and / or the binding site of PD-L1 inhibits the interaction of PD-L1 with the PD-1 receptor.
  • the CD47 binding site of an antibody of the present invention includes a heavy chain variable domain that contains the sequences CDR1, CDR2, CDR3, where CDR1 is the sequence is not less than 80% homologous to the sequence selected from the following group SEQ ID NO: 1-4, i.e., CDR1 is a sequence selected from the group SEQ ID NO: 1-4 or a sequence selected from the group SEQ ID NO: 1- 4 with 1 or 2 substitutions, where CDR2 is a sequence of not less than 80% homologous to the sequence selected from the following group SEQ ID NO: 6-15, i.e.
  • CDR2 represents a sequence selected from group SEQ ID NO: 6-15 or a sequence selected from the group of SEQ ID NO: 6 - 15 with 1, 2, 3, 4 or 5 substitutions
  • CDR3 is a sequence of not less than 80% homologous to the sequence selected from the following group SEQ ID NO: 17-20, i.e. CDR3 represents the sequence selected from SEQ ID NO: 17-20 or the sequence selected from the group of SEQ ID NO: 17 - 20 with 1, 2 or 3 substitutions.
  • the CD47 binding site of an antibody of the present invention comprises a heavy chain variable domain that contains the sequences CDR.1, CDR2, CDR3, where CDR1 is a sequence selected from the following group of SEQ ID NO: 1-4, where CDR2 is a sequence selected from the following group of SEQ ID NO: 6-15, where CDR3 is a sequence selected from the following group SEQ ID NO: 17-20.
  • the CD47 binding binding of an antibody of the present invention includes the heavy chain variable domain of claim 4, and the light chain variable domain that contains the sequences CDR1, CDR2, CDR3, where the CDR1 is a sequence of at least 80% homologous to the sequence selected from the following group of SEQ ID NO: 22-34, i.e.
  • CDR1 represents a sequence selected from the group SEQ ID NO: 22-34 or a sequence selected from the group SEQ ID NO: 22-34 from 1 or 2 substitution, where ( " DR2 is a sequence of not less than 80% homologous to the sequence selected from the following group SEQ ID NO: 36 - 48, that is, CDR2 represents a sequence selected from the group SEQ ID NO: 36 - 48 or the sequence selected from group SEQ ID NO: 36 - 48 with 1, 2 or 3 substitutions, where CDR3 is a sequence of not less than 80% homologous to the sequence selected from the following group SEQ ID NO: 50 - 64, that is, CDR3 represents the sequence SEQ ID NO: 50 - 64 or a sequence selected from group SEQ ID NO: 50 - 64 with 1 or 2 substitutions ..
  • the CD47 binding site of an antibody of the present invention includes a heavy chain variable domain of claim 4, and a light chain variable domain that contains CDRL sequences CDR2, CDR3, where CDR1 is a sequence selected from the following group SEQ ID NO: 22 - 34, CDR2 is a sequence selected from the following group SEQ ID NO: 36 - 48, CDR3 is a sequence selected from the following group SEQ ID NO: 50 - 64.
  • the CD47 binding site of an antibody of the present invention comprises a heavy chain variable domain that contains sequences homologous to at least 90% of sequences selected from the following group of SEQ ID NO: 66 - 88, and the light chain variable domain that contains sequences homologous to at least 90% of the sequences selected from the following group SEQ ID NO: 89 - 06.
  • the CD47 binding site of an antibody of the present invention comprises a heavy chain variable domain that contains sequences selected from the following group of SEQ ID NO: 66 - 88, and the variable domain of the light chain, which contains the sequence, you: Brasnnnye from the following group of SEQ ID NO: 89 - 106.
  • the binding site for a PD-L1 antibody of the present invention comprises a heavy chain variable domain that contains sequences that are homologous to at least 80% of the following: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 21, that is, it contains the amino acid sequences of SEQ ID NO: 5, 16 and 21 or SEQ ID NO: 5 with 1 substitution, SEQ ID NO: 16 with 1, 2 or 3 substitutions, SEQ ID NO: 21 with 1, 2 or 3 substitutions, and the light chain variable domain, which contains sequences homologous to at least 80% as follows: SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 49 and SEQ ID NO: 65, i.e., contains amino acid moieties edovatelnosti SEQ ID NO: 35, 49 and 65 or SEQ ID NO: 35 with 1, 2 or 3 substitutions, SEQ ID NO: 49, replacing 1, SEQ ID NO: 65 with 1 or 2 substitutions.
  • the saiga binding to the PD-L1 antibody of the present invention includes the heavy chain variable domain, which contains the following sequences: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 21, and the light chain variable domain, which contains the following sequences: SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 49 and SEQ ID NO: 65.
  • the CD47 binding site of an antibody of the present invention is Fab, scFv, scFab, or isolated VH or VI P. P mono domains.
  • the binding site for the PD-L1 antibody of the present invention is Fab, scFv, scFab, or isolated mono domains VI I or VI II I.
  • an antibody of the present invention is characterized in that it causes an antibody-dependent cellular cytotoxicity, macrophage-mediated phagocytosis and / or T-cell mediated cytotoxicity against cells bearing CD47 and / or PD-L1 antigens on the surface
  • an antibody of the present invention is characterized in that it contains an Fc fragment with at least one mutation or modification that enhances antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) compared with the same antibody without mutation or modification.
  • ADCC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • the antibody of the present invention is used as a medicine for treating cancer
  • the present invention relates to a nucleic acid that encodes any of the antibodies described above,
  • the nucleic acid of the present invention is a DNA.
  • the present invention relates to an expression vector that contains the nucleic acid described above,
  • the present invention relates to a method for producing a host cell for producing any of the antibodies described x above, which comprises transforming the cell with the vector of the present invention.
  • the present invention relates to a host cell for producing any of the antibodies described above, which contains the nucleic acid described above. In one aspect, the present invention relates to a method for producing any of the antibodies described above, which consists in culturing the host cell in a culture medium under conditions sufficient to obtain said antibody, if necessary, followed by isolating and purifying the resulting antibody
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease or disorder mediated by PD-L1 and CD47, which contains any of the antibodies described above, in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients and.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is intended for the prevention or treatment of a disease or disorder mediated by PD-L.1 and CD47 selected from the group: PSHR (squamous cell: head and neck cancer), cervical cancer, cancer without a primary source, glioblastoma , esophagus cancer, bladder cancer, TNMP (triple negative breast cancer), CRC (colorectal cancer), hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC (non-small cell lung cancer), kidney cancer, ovarian cancer, MSI CRC (high-risk colorectal cancer scrosal instability), leukemia (acute or myeloblastic), lymphoma, multiple myeloma, breast cancer, prostate cancer, sarcoma, Hodgkin's lymphoma, T-and B-cell acute lim: phoblastic leukemia, small cell lung cancer, acute m: iloblastic leukemia, refractory B-cell non-Hodgkin
  • PSHR
  • the present invention relates to a method for treating a disease or disorder mediated by PD-L1 and CD47, which includes the introduction of the subject of any antibodies of the above or pharmaceutical compositions according to this invention, in need of such treatment, in a therapeutically effective amount,
  • the disease or disorder is selected from the group: I I P! I ll (squamous ak of the head and neck), cervical cancer, cancer without identified primary source, glioblastoma, esophageal cancer, bladder cancer, TNBC (triple negative breast cancer), CRC (colorectal cancer), hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC ( Non-small cell lung cancer), kidney cancer, ovarian cancer, MSI CRC (colorectal cancer with high microsatellite instability), leukemia (acute or myeloblastic), lymphoma, multiple myeloma, breast cancer,, prostate cancer, bladder cancer, sarcoma, hepatocellularcarcinoma, glioblastoma, Hodgkin's lymphoma, T- and B-cell acute lymphoblastic leukemia, small cell lung cancer, acute myelogenous leukemia, B -kletochnaya refractory non-
  • the present invention relates to a method of inhibiting the biological activity of PD-L1 and / or CD47 in a subject in need of such inhibition, which comprises administering to the subject an effective amount of any of the above antibodies,
  • the present invention relates to the use of any of the above antibodies or the above pharmaceutical composition for treating a subject in need of such treatment for a disease or disorder mediated by PD-L1 and CD47.
  • the disease or disorder is selected from the group: PRGS (squamous cell carcinoma of the head and neck), cervical cancer, cancer without an identified primary source, gliomastoma, esophageal cancer, bladder cancer, ⁇ 3 ⁇ (triple negative breast cancer) , CRC (colorectal cancer), hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC (non-small cell lung cancer), kidney cancer, ovarian cancer, MSI CRC (colorectal cancer with high microsatellite instability), leukemia (acute or myeloblastic), lymphoma, mn cerebral myeloma, breast cancer, prostate cancer, bladder cancer, sarcoma, hepatocellular carcinoma, gliomastoma, Hodgkin
  • PRGS squamous cell carcinoma of the head and neck
  • FIG. 1 Plasmid map for transient production of human CD47-Fc in culture of CHO-K1 mammalian cells.
  • FIG. 2 SDS-gel electrophoresis in non-reducing conditions of the preparation of human CD47-Fc.
  • FIG. 3 SDS-gel electrophoresis in reducing conditions of the preparation of control anti-CD47 antibody B6H12
  • FIG. 4 SDS-gel electrophoresis in non-reducing conditions of the preparation of control anti-CD47 antibody B 6H12.
  • FIG. 5 Graph of ELISA of polyclonal phage that carry VHH antibody fragments that specifically interact with human CD47 antigen.
  • FIG. 6. Schematic representation of the domain structure of anti-PD-Ll / anti-CD47 bispecific antibodies, where A is based on anti-CD47 scFv fragments and B on anti-CD47 VHH fragments. At the same time, the PD-L1 binding part is represented by the Fab fragment.
  • FIG. 7 SDS-gel electrophoresis in non-reducing conditions of anti-PD-Ll / anti-CD47 preparations of bispecific antibodies based on anti-CD47 scFv fragments.
  • Fig.8 SDS-gel electrophoresis in reducing conditions of preparations of anti-PD-Ll / anti-CD47 bispecific antibodies based on anti-CD47 VHH fragments.
  • FIG. 10 Dependence of cytotoxic effect on the concentration of anti-PD-Ll / anti-CD47 bispecific antibodies studied.
  • FIG. 11 Efficiency of phagocytosis of MDA-MB-231 cell lines by human macrophages in the presence of anti-PD-Ll / anti-CD47 bispecific antibodies.
  • FIG. 12 Dependence of the level of fluorescence on the concentration of anti-PD-Ll / anti-CD47 bispecific antibodies.
  • FIG. 13 Dependence of the level of fluorescence on the concentration of anti-PD-Ll / anti-CD47 bispecific antibodies.
  • FIG. 14 Dependence of the level of fluorescence on the concentration of anti-PD-Ll / anti-CD47 bispecific antibodies.
  • FIG. 15. Dependence of the level of fluorescence on the concentration of anti-PD-Ll / anti-CD47 bispecific antibodies.
  • FIG. 16. Anti-PD-Ll activity of bispecific aHTH-PD-Ll / CD47 antibodies. The vertical axis shows the luminescence ratio of the wells with the aHTH-CD47 / PD-Ll antibodies tested against the luminescence of the wells without the addition of antibodies.
  • FIG. 17 Gel filtration profile for assessing the aggregation homogeneity of anti-PD-Ll / anti-CD47 bispecific antibodies.
  • PD-L1 programmed cell death receptor ligand 1
  • differentiation cluster 274 CD274
  • homologue 1 B7 B7- HI
  • Ig V and C-like domains 220
  • transmembrane 211
  • intracellular 3
  • CD47 a membrane membrane membrane transmembrane receptor belonging to the immunoglobulin superfamily, interacts with SIRPa (regulating protein a signals) on macrophages and thereby weakens phagocytosis. Cancer cells that work this way avoid phagocytosis. Therefore, a therapeutic effect on CD47 is widely used in various cancers.
  • Antibodies to CD47 may have the ability to block the interaction between CD47 and SIRPa, but they may not have this ability.
  • binding molecule includes antibodies and immunoglobulins.
  • antibody or “immunoglobulin” or “monoclonal antibody” or “bispecific antibody” or “multispecific antibody” (Ig), as used herein, includes the whole / full-length antibody or any antigen-binding fragment (i.e., "antigen-binding portion ").
  • antibody or “immunoglobulin” or “monoclonal antibody” include any combination of antigen-binding fragments, one or more valences and one or more specificities, and constant regions of immunoglobulins, and may be similar in meaning to the terms “bispecific antibody” or "multispecific antibody”.
  • antibody or “immunoglobulin” or “monoclonal antibody” include any combination of antigen-binding fragments and constant regions of immunoglobulins linked and covalently or non-covalently with any polypeptide of any nature.
  • antibody for example, refers to a glycoprotein containing at least two heavy (H) chains and two light (L) chains interconnected by disulfide bonds, or its antigen-binding portion. Each heavy chain contains the variable region of the heavy chain (abbreviated as VH in this description) and the constant region of the heavy chain.
  • heavy chains of antibodies There are five types of mammalian heavy chains of antibodies, which are designated by Greek letters: ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ and ⁇ .
  • the type of heavy chain present determines the class of antibody; These chains are found in antibodies of the type IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, respectively.
  • Different heavy chains vary in size and composition; a and ⁇ contain about 450 amino acids, and ⁇ and ⁇ consist of about 550 amino acids.
  • Each heavy chain contains two regions, i.e. constant region and variable region. The constant region is identical in all antibodies of the same isotype, but differs in antibodies of different isotype.
  • the ⁇ , a and ⁇ heavy chains contain a constant region, which consists of three constant domains CHI, CH2 and CH3 (lined up) and a hinge region that gives flexibility (Woof J., Burton D., Nat Rev Immunol 4, 2004, cc.89-99); the heavy chains ⁇ and ⁇ contain a constant region, which consists of four constant domains CHI, CH2, CH3 and CH4.
  • the heavy chains ⁇ and ⁇ contain a constant region, which consists of four constant domains CHI, CH2, CH3 and CH4.
  • lambda ( ⁇ ) and kappa (k) In mammals, only two types of light chains are known, which are designated as lambda ( ⁇ ) and kappa (k).
  • Each light chain consists of a light chain variable region (abbreviated as VL in this description) and constant region of the light chain.
  • the approximate length of the light chain is 211-217 amino acids.
  • the light chain is a light kappa (k) -chain
  • Antibodies can be antibodies of any class (for example, IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, preferably IgG) or a subclass (for example, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl and IgA2, preferably IgGl).
  • class for example, IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, preferably IgG
  • subclass for example, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl and IgA2, preferably IgGl.
  • the VH and VL regions can be further subdivided into hypervariability regions, called complementarity determining regions (CDRs), scattered between regions that are more conservative, called framework regions (FR).
  • CDRs complementarity determining regions
  • FR framework regions
  • Each VH and VL consists of three CDRs and four FRs located from the amino terminus to the carboxy terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
  • the variable regions of the heavy and light chains contain a binding domain that interacts with the antigen.
  • the constant regions of antibodies can mediate the binding of an immunoglobulin to host tissues or factors, including various cells of the immune system (for example, effector cells), and the first component (Clq) of the classical complement system.
  • antigen-binding portion of an antibody or “antigen-binding fragment” refers to one or more antibody fragments that retain the ability to specifically bind to an antigen. It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be performed by fragments of a full-length antibody.
  • binding fragments included in the term "antigen-binding portion" of an antibody include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CH1 domains; (ii) F (ab ') 2 fragment, a bivalent fragment containing two Fab fragments linked by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) a Fd fragment consisting of the VH and CH 1 domains; (iv) an Fv fragment consisting of the VL and VH domains in the single arm of an antibody, (v) a dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), which consists of the VH / VHH domain; and (vi) a dedicated complementarity determining region (CDR).
  • a Fab fragment a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CH1 domains
  • F (ab ') 2 fragment a bivalent fragment containing two Fab fragments linked by a dis
  • two regions of the Fv fragment, VL and VH are encoded by different genes, they can be connected using recombinant methods using a synthetic linker, which makes it possible to obtain them as a single protein chain, in which the VL and VH regions mate to form monovalent molecules (known as single-chain Fv (scFv); see, for example, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879 -5883). It is assumed that such single-stranded molecules are also included in the term “antigen-binding portion” of an antibody. Such antibody fragments are obtained using conventional methods known to those skilled in the art, and these fragments are screened in the same manner as intact antibodies.
  • the CDR of the antigen binding region or the entire antigen binding region of the antibodies of the invention is derived from a mouse, a llama or a human donor library, or is essentially human in origin with certain amino acid residues modified, for example, substituted with different amino acid residues, in order to optimize specific properties of the antibody, for example KD , koff, IC50, EC50, ED50.
  • the framework regions of an antibody of the invention are of human origin or substantially human (at least 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or 99% human origin).
  • the antigen binding portion of an antibody of the invention may be derived from other non-human species, including, but not limited to, a mouse, llama, rabbit, rat, or hamster.
  • the antigen binding region may occur from human species.
  • variable refers to the fact that certain segments of the variable domains differ widely in sequence among antibodies. Domain V mediates antigen binding and determines the specificity of a particular antibody for its specific antigen. However, the variability is unevenly distributed on the site of the variable domains of 110 amino acids. In contrast, the V regions consist of invariant fragments, called framework regions (FR) of 15–30 amino acids, separated by shorter sections of extreme variability, called “hypervariable regions” or CDRs.
  • FR framework regions
  • Each variable domain of native heavy and light chains contains four FRs, mainly taking the configuration of beta-sheets, connected by three hypervariable regions, which form loops connecting, and in some cases are part of the beta-folded structure.
  • the hypervariable regions in each chain are held together in close proximity with the help of FR and with the hypervariable regions of the other chain contribute to the formation of the antigen-binding site of the antibodies.
  • the constant domains are not directly involved in the binding of an antibody to an antigen, but exhibit various effector functions, such as the participation of an antibody in antibody-dependent cellular cytotoxicity (ACCC, ADCC).
  • hypervariable region refers to the amino acid residues of an antibody that are responsible for antigen binding.
  • the hypervariable region contains amino acid residues from the “complementarity determining region” or “CDR”, and / or such residues from the “hypervariable loop”.
  • affinity maturation it may also be preferable to alter one or more amino acid residues of the CDR regions in order to increase the binding affinity of the target epitope. This is known as “affinity maturation” and in some cases can be performed in connection with humanization, for example, in situations where humanization of an antibody leads to a decrease in the specificity or affinity of binding, and it is not possible to sufficiently improve the specificity or affinity of binding with only reverse mutations.
  • affinity maturation Various methods of affinity maturation are known in the art, for example, the in vitro scanning saturation mutagenesis method described by Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 412-417 (1997), and the step-by-step in vitro affinity maturation proposed by Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 95: 6037 6042 (1998).
  • FR Framework regions
  • FR light chain residues are localized approximately at residues 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) and 97-107 (LCFR4) in the light chain
  • FR is heavy chain residues localized at about 1-25 (HCFRI), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) and 102-113 (HCFR4) residues in the heavy chain residues.
  • HCFRI residues 1-25
  • HCFR2 residues from both Kabat CDRs and amino acids from the hypervariable loop
  • FR is adjusted accordingly. For example, when CDRH1 includes the amino acid H26-H35, the FR1 residues of the heavy chain are in positions 1-25, and the residues FR2 are in positions 36-49.
  • the antibody of this invention "which binds" the target antigen, is an antibody that binds the antigen with sufficient affinity so that the antibody can be used as a diagnostic and / or therapeutic agent when targeting a protein or cell, or tissue expressing an antigen, and slightly cross-reacts with other proteins.
  • analytical methods fluorescently-activated cell sorting (FACS), radioimmunoprecipitation (RIA) or ELISA (ELISA), in such embodiments of the invention, the degree of binding of an antibody to a non-target protein (with a "non-target protein") is less than 10 % of antibody binding to a specific target protein.
  • the term “specific binding” or the expression “specifically binds to” or “specific to” a particular polypeptide or epitope on a particular polypeptide of a target means binding that is noticeably (measurable) different from non-specific interaction (for example, in the case of LH1 -44 or LH1-81, the nonspecific interaction is the binding to bovine serum albumin, casein, fetal bovine serum or neutravidin).
  • Specific binding can be quantified, for example, by determining the binding of the molecule compared to the binding of the control molecule. For example, specific binding can be determined by competitive reaction with another molecule similar to the target, for example, with an excess of unlabeled target. In this case, the specific binding is indicated if the binding of the labeled target to the probe competitively inhibited by excess unlabeled target.
  • the term “specific binding” or the expression “specifically binds to” or “specific to” a particular polypeptide or epitope on a particular polypeptide target can be characterized by the example of a molecule having a Kd to target at least about 200 nM at least about 150 nM, or at least about 100 nM, or at least about 60 nM, or at least about 50 nM, or at least about 40 nM, or at least about 30 nM, or at least about 20 nM, or at least about 10 M, or at least about 8 nM, or at least about 6 nM, or at least about 4 nM, or at least about 2 nM, or at least about 1 nM or higher.
  • the term “specific binding” refers to binding, in which a molecule binds to a particular polypeptide or epitope on a particular polypeptide without actually binding to any other polypeptide or epitope on a polypeptide.
  • Ka refers to the rate of association of a particular antibody-antigen interaction
  • Kd refers to the rate of dissociation of a particular antibody-antigen interaction
  • Binding affinity generally refers to the strength of the cumulative non-covalent interactions between a single binding site of a molecule (eg, an antibody) and its binding partner (eg, an antigen). Unless otherwise indicated, “binding affinity” refers to intrinsic (characteristic, true) binding affinity, which reflects a 1: 1 interaction between members of a binding pair (for example, an antibody and an antigen). The affinity of the X molecule to its partner Y can usually be represented by constant dissociation (Kd).
  • the Kd value is approximately 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM or less.
  • Affinity can be measured by conventional methods known in the art, including those described herein. Low-affinity antibodies usually bind slowly to the antigen and tend to dissociate easily, whereas high-affinity antibodies usually bind the antigen faster and tend to stay longer in a bound state. Various techniques are known in the art for measuring binding affinity, any of these methods can be used for the purposes of the present invention.
  • the “Kd” or “Kd value” of the present invention is measured by surface plasmon resonance methods on a B1Asog TM -2000 or BIAcore TM -3000 device (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) at 25 ° C using immobilized chips CM5 antigen at ⁇ 10 relative units (response units, RU).
  • biosensor chips with carboxymethyldextran CM5, BIAcore Inc.
  • EDC epimethylaminopropyl
  • NHS ⁇ -hydroxysuccinimide
  • the antigen is diluted with 10 mM sodium acetate solution, pH 4.8, to a concentration of 5 ⁇ g / ml ( ⁇ 0.2 ⁇ M), and then injected (injection) at a flow rate of 5 ⁇ l / minute to achieve approximately 10 relative units (RU) of the bound protein.
  • a 1 M ethanolamine solution is injected to block unreacted groups.
  • double serial dilutions of Fab for example, from 0.78 nM to 500 nM
  • PBST Tween 20
  • Antibody antigen solution Fab form
  • Fab form Antibody antigen solution with a concentration of 20 nM in PBS, pH 7.2
  • a spectrometer such as a stopped flow spectrophotometer (Aviv Instr uments) or spectrometer SLM-Aminco (Thermo Spectronie) Series 8000 with a cuvette with stirring.
  • Koff refers to the dissociation rate constant of a particular interaction of a binding molecule and an antigen.
  • the koff dissociation rate constant can be measured by biolayer interferometry, for example, using the Octet TM system.
  • association rate (“ ⁇ -rate”) or “cop” of this invention can also be determined by the same surface plasmon resonance method described above on a B1Asog TM -2000 or BIAcore TM -3000 device (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ ) at 25 ° C, using chips with immobilized CM5 antigen at ⁇ 10 relative units (response units, RU).
  • biosensor chips with carboxymethyldextran are activated with N-ethyl-M '- (3-dimethylamino-propyl) -carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (HS) in accordance with the manufacturer's instructions.
  • EDC N-ethyl-M '- (3-dimethylamino-propyl) -carbodiimide hydrochloride
  • HS N-hydroxysuccinimide
  • the antigen is diluted with 10 mM sodium acetate solution, pH 4.8, to a concentration of 5 ⁇ g / ml ( ⁇ 0.2 ⁇ M), and then injected (injection) at a flow rate of 5 ⁇ l / minute to achieve approximately 10 relative units (RU) bound protein.
  • a 1 M ethanolamine solution is injected to block unreacted groups.
  • biologically active and “biological activity”, and “biological characteristics”, in relation to the polypeptide of the present invention, mean having the ability to bind to a biological molecule.
  • biological molecule refers to nucleic acid, protein, carbohydrate, lipid, and combinations thereof. In one embodiment of the invention, the biological molecule exists in nature.
  • Antibody sites such as Fab and F (ab ') 2 fragments, can be obtained from whole antibodies using conventional methods, such as papain or pepsin hydrolysis of whole antibodies. Moreover, antibodies, parts of antibodies and immunoadhesion molecules can be obtained using standard recombinant DNA methods, for example, as described herein.
  • recombinant antibody means an antibody that is expressed in a cell or cell line containing a nucleotide sequence (nucleotide sequence) that encodes an antibody, while the nucleotide sequence (nucleotide sequence) is not associated with the cell in nature.
  • variant antibody refers to an antibody having an amino acid sequence that differs from the amino acid sequence of its "parent” antibody by adding, removing and / or replacing one or more amino acid residues relative to the sequence of the parent antibody.
  • the variant antibody contains at least one or more (for example, from one to twelve, for example, two, three, four, five, six, seven, eight or nine, ten, eleven or twelve; and in some embodiments, from one to about ten) additions, deletions and / or substitutions of amino acids relative to the parent antibody.
  • additions, deletions, and / or substitutions are carried out on the CDR regions of a variant antibody.
  • Identity or homology with respect to the sequence of a variant antibody is defined herein as the percentage of amino acid residues in the sequence of a variant antibody that are identical to those of the parent antibody, after aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, to achieve the maximum percentage of sequence identity.
  • a variant antibody retains the ability to bind to the same antigen, and preferably the epitope, to which the parent antibody binds, and in some embodiments of the invention at least one property or biological activity is superior to those of the parent antibody.
  • a variant antibody may have, for example, a more pronounced binding affinity, a longer half-life, a lower IC 50 value, or an increased ability to inhibit the biological activity of the antigen compared to the parent antibody.
  • a variant antibody showing a biological activity greater than at least 2 times (preferably at least 5 times, 10 times or 20 times) the biological activity of the parent antibody.
  • bispecific antibody means an antibody containing an antigen-binding domain or antigen-binding domains that are capable of specific binding with two different epitopes on one biological molecule or capable of specific binding with epitopes on two different biological molecules. Bispecific the antibody is also referred to herein as having “dual specificity” or as being an antibody with “dual specificity”.
  • chimeric antibody refers broadly to an antibody that contains one or more areas of a single antibody, and one or more areas of one or more other antibodies, usually an antibody, partially of human origin and partially of non-human origin, that is, partly from a non-human animal, such as a mouse, rat, or other rodent, or camelids, such as a llama or alpaca. Chimeric antibodies are preferred over non-human antibodies in order to reduce the risk of an immune response directed against antibodies in humans, for example, a response directed against murine antibodies in humans in the case of a mouse antibody.
  • An example of a typical chimeric antibody is that in which the sequences of the variable region are murine, while the sequences of the constant region are human.
  • non-human parts may be further modified to humanize the antibody.
  • humanization refers to the fact that when an antibody is completely or partially nonhuman, for example, a mouse or llama antibody obtained by immunizing mice or llamas, respectively, with an antigen of interest, or is a chimeric antibody based on such mouse or llama antibody , it is possible to replace certain amino acids, for example, in the framework regions and the constant domains of the heavy and light chains, in order to avoid or minimize the immune response in humans.
  • the specificity of the interaction of the antibody with the target antigen is inherent mainly in amino acid residues located in the six CDR regions of the heavy and light chain. Therefore, the amino acid sequences inside the CDR regions are much more variable between individual antibodies, compared to sequences outside the CDR regions.
  • recombinant antibodies can be expressed that mimic the properties of a specific natural antibody, or more generally, a specific antibody with a given amino acid sequence, for example, by constructing expression vectors that express CDR sequences - plots of specific antibodies and framework sequences of another antibody.
  • expression vectors that express CDR sequences - plots of specific antibodies and framework sequences of another antibody.
  • Chimeric antibodies in which foreign (for example, rodent or camel) constant regions were replaced with sequences of human origin showed a generally lower immunogenicity than antibodies of completely foreign origin, and there is a tendency to use humanized or fully human antibodies in therapeutic antibodies.
  • Chimeric antibodies or other antibodies of non-human origin can thus be humanized to reduce the risk of an immune response directed against an antibody in humans.
  • humanization usually involves modification of the framework regions of the variable region sequences.
  • Amino acid residues that are part of the complementarity determining regions (CDRs of the regions) most often will not vary due to humanization, although in some cases it may be desirable to modify individual amino acid residues of the CDR region, for example, to remove a glycosylation site, a deamidation site, an aspartate isomerization site, or an unwanted cysteine or methionine residue.
  • CDRs of the regions amino acid residues that are part of the complementarity determining regions
  • ⁇ -linked glycosylation occurs by attaching an oligosaccharide chain to an asparagine residue in the tripeptide sequence Asn-X-Ser or Asn-X-Thr, where X can be any amino acid other than Pro.
  • Removal of the N-glycosylation site can be achieved by mutation of an Asn or Ser / Thr residue with another residue, preferably by conservative substitution.
  • Deamidation of asparagine and glutamine residues can occur depending on factors such as pH and surface exposure.
  • Asparagine residues are particularly susceptible to deamidation, especially if they are present in the Asn-Gly sequence, and to a lesser extent in other dipeptide sequences, such as Asn-Ala. In the presence of such a deamidated region, for example, Asn-Gly in the sequence of a CDR region, it may be preferable to remove this region, as a rule, by a conservative replacement to remove one of the residues involved.
  • CDR site transplantation Numerous methods for humanizing an antibody sequence are known in the art.
  • CDR plot transplantation may be based on Kabat CDR definitions, although a later publication (Magdelaine-Beuzelin et al., Crit Rev.Oncol Hematol. 64: 210 225 (2007)) assumes that the definition is no IMGT® (the The international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org) can improve the result of humanization (see Lefranc et al., Dev. Comp Immunol. 27: 55-77 (2003)).
  • transplanting a CDR region can reduce specificity and the binding affinity, and therefore the biological activity, in the CDR of the transplanted non-human antibody, compared with the parent antibody from which the CDR regions are obtained.
  • Reverse mutations (sometimes referred to as “frame repair”) can be used in selected CDR positions of the transplanted antibody, usually in the frame sections, in order to restore the specificity and binding affinity of the parent antibody. Determination of positions for possible reverse mutations can be performed using information available in the literature and in antibody databases. Amino acid residues that are candidates for reverse mutations are usually located on the surface of the antibody molecule, while residues that are deepened or have a low degree of surface exposure will usually not be affected.
  • the humanization method is a surface change in which non-exposed remains of non-human origin are preserved, while remains exposed on the surface change to human remains.
  • Phage display is the first and most widely used in vitro antibody search technology.
  • Smith discovered that foreign DNA sequences could be cloned into the filamentous bacteriophage M13 in such a way that the cloned gene sequences are expressed on the surface of phage particles as fusion proteins (Smith GP: Filamentous fusion: antigens on the virion surface. Science 1985, 228: 1315-1317.).
  • Smith GP Filamentous fusion: antigens on the virion surface. Science 1985, 228: 1315-1317.
  • the repertoire of phage libraries reflects the repertoire of B-lymphocyte antibodies of each person or animal whose blood was used to create the library.
  • transgenic mice express B cell receptors, which are essentially mouse and human hybrid (human immunoglobulin, mouse Iga, IgP and other signaling molecules), their B cells develop normally and mature.
  • affinity maturation is known as “affinity maturation” and in some cases can be performed in connection with humanization, for example, in situations where the humanization of an antibody results in to reduce the specificity or affinity of binding, and it is not possible to sufficiently improve the specificity or affinity of binding using only reverse mutations.
  • affinity maturation Various methods of affinity maturation are known in the art, for example, the in vitro scanning saturation mutagenesis method described by Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 412-417 (1997), and the step-by-step in vitro affinity maturation proposed by Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 95: 6037 6042 (1998).
  • the term "monoclonal antibody” or “mAb” refers to an antibody that is synthesized and isolated by a separate clonal population of cells.
  • a clonal population may be a clonal population of immortalized cells.
  • the immortalized cells in the clonal population are hybrid cells, hybridomas, which are usually obtained by merging individual B lymphocytes from immunized animals with individual cells of a lymphocytic tumor.
  • Hybridomas are a type of engineered cells and are not found in nature.
  • “Native antibodies” are typically heterotetrameric glycoproteins with a molecular weight of approximately 150,000 daltons, consisting of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains. Each light chain is linked to a heavy chain by one covalent disulfide bond, while the number of disulfide bonds between heavy chains varies in different isotypes of immunoglobulins. Each heavy and light chain also has a uniformly located intrachain point-shaped disulfide bridges. Each heavy chain has a variable domain (VH) at one end, followed by several constant domains. Each light chain has a variable domain at one end (VL) and a constant domain at the other end. The constant domain of the light chain is aligned with the first constant domain of the heavy chain, and the light chain variable domain is aligned with the heavy chain variable domain. Specific amino acid residues are believed to form the interface between the light chain and heavy chain variable domains.
  • isolated used to describe the various antibodies in this description, means an antibody identified and isolated and / or regenerated from the cell or cell culture in which it is expressed.
  • Impurities from the natural environment are materials that tend to interfere with diagnostic or therapeutic use of the polypeptide, and may include enzymes, hormones, and other proteinaceous or non-proteinaceous solutes.
  • the antibody is purified (1) to an extent sufficient to obtain at least 15 residues of the applicroft-terminal or internal amino acid sequence, using a rotating glass dish sequencer (Edman sequencer), or (2) to homogeneity by SDS-PAGE in non-reducing or reducing conditions using Kumassi staining with brilliant blue or, preferably, silver.
  • the selected antibody includes antibodies in situ within recombinant cells, since at least one component of the natural environment of the polypeptide is absent.
  • the isolated polypeptide is obtained by at least one purification step.
  • An “isolated” nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule that is identified and separated from at least one impurity nucleic acid molecule, with which it is usually associated in the natural nucleic acid source of an antibody.
  • An isolated nucleic acid molecule is different from the form or set in which it is in natural conditions. Thus, the isolated nucleic acid molecule is different from the nucleic acid that exists in cells in vivo.
  • an isolated nucleic acid molecule includes a nucleic acid molecule located in cells in which the antibody is normally expressed, for example, if the nucleic acid molecule has a localization on the chromosome that is different from its localization in cells in natural conditions.
  • epitope refers to a portion (determinant) of an antigen that specifically binds to a binding molecule (for example, and an antibody or a related molecule, such as a bispecific binding molecule).
  • Epitope determinants usually consist of chemically active surface groups of molecules, such as amino acids or carbohydrates, or sugar side chains, and, as a rule, have specific three-dimensional structural characteristics, as well as specific characteristics of charges.
  • An epitope can be "linear” or “conformational.” In a linear epitope, all points of interaction between a protein (for example, an antigen) and an interacting molecule (such as an antibody) occur linearly along the primary amino acid sequence of the protein.
  • peptide linker in this document means any peptide with the ability to connect domains with a length depending on the domains that it binds together, containing any amino acid sequence.
  • the peptide linker has a length of more than 5 amino acids and consists of any set of amino acids selected from G, A, S, P, E, T, D, K.
  • in vitro refers to a biological object, a biological process or a biological reaction outside the body, modeled in artificial conditions.
  • the growth of cells in vitro should be understood as the growth of cells in an environment outside the body, for example, in a test tube, culture flask or microplate.
  • IC50 50% inhibitory concentration refers to drug concentrations at which the measured activity or response, such as cell growth or proliferation, such as tumor cells, is inhibited by 50%.
  • the IC 50 value can be estimated using the appropriate response curves versus the logarithm of the dose, using special statistical programs for processing the curves.
  • GI50 50% growth inhibition refers to drug concentrations at which cell proliferation, such as tumor cells, is inhibited by 50%.
  • ED50 50% effective dose / concentration refers to the drug concentrations at which the measured biological effect is achieved by 50% (may include cytotoxicity).
  • effector function of an antibody refers to the types of biological activity associated with the Fc region (the native sequence of the Fc region or variants of amino acid Fc region sequences) of an antibody, and vary with the isotype of the antibody.
  • antibody effector functions are: Cl q - binding; complementability cytotoxicity; Fc receptor binding; antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC); phagocytosis; downregulation of cell surface receptors (for example, B-cell receptor, BCR) and B-cell activation.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • FcR Fc receptors
  • NK natural killer cells
  • macrophages cytotoxic cells that recognize the associated antibody target cell and then cause lysis of the target cell.
  • FcR expression on hematopoietic cells is summarized in Table 3 on page 464 in the publication Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991).
  • ADCC assays such as the assays described in US Pat. No. jN ° 5,500,362 or 5,821,337.
  • Applicable effector cells for such assays include peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and natural killer cells (NK ).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • NK natural killer cells
  • the ADCC activity of the molecule of interest can be assessed in vivo, for example, in an animal model, such as the model described in Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).
  • Human effector cells are white blood cells that express one or more FcRs and perform effector functions. Preferably, the cells express at least FcyRIII and perform the ADCC effector function. Examples of human leukocytes that mediate ADCC include mononuclear cells. peripheral blood (RVMS), natural killer cells (NK), monocytes, cytotoxic T-cells and neutrophils; with preferred RVMS and ⁇ -cells. Effector cells can be isolated from their natural source, for example, from blood or PBMC, as described in this publication.
  • Fc receptor and “FcR” are used to describe a receptor that binds to the Fc region of an antibody.
  • the preferred FcR is a native sequence human FcR.
  • a preferred FcR is an FcR that binds an IgG antibody (gamma receptor), and the preferred receptors include receptors of the FcyRI, FcyRII subclass (FcyRIIa and FcyRIIb), FcyRIII (FcyRIIIa and FcyRIIIb), including various alleles and alternatively splicing formulas receptors.
  • FcyRI exhibits high affinity for IgG
  • FcyRII and FcyRIII exhibit weaker affinity.
  • FcyRIIa and FcyRIIIa are activating FcyRs that are expressed on monocytes / macrophages and monocytes / macrophages / natural killer cells, respectively, and can trigger the cytotoxicity of human targets.
  • the activating receptor FcyRIIA contains in its cytoplasmic domain a tyrosine-based activation motif of the immunoreceptor (ITAM).
  • ITAM immunoreceptor
  • the FcyRIIB inhibitory receptor contains a tyrosine-based immunoreceptor inhibition motif (ITIM) in its cytoplasmic domain (see review in Daeron, Ach. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). The FcR review is presented in Ravetch and Kinet, Annu. Rev.
  • FcR FcR
  • FcRn neonatal receptor
  • “Complement-dependent cytotoxicity” or “CDC” refers to the ability of a molecule to lyse a target in the presence of complement. Way complement activation is initiated by binding the first component of the complement system (Clq) to a molecule (eg, an antibody) in complex with its antigen. To assess complement activation, a CDC analysis can be performed, for example, as described in Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).
  • identity or “homology” should be interpreted as meaning the percentage of amino acid residues in the candidate sequence, which are identical to the residues of the corresponding sequence with which it is compared, after sequence comparison and introduction of "gaps” if it is necessary to achieve the maximum percent identity for the full sequence and disregarding any conservative substitutions as part of sequence identity. Neither N- or C-terminal extension, nor insertion segments should be interpreted as reducing identity or homology. Methods and computer programs for comparison are well known. Sequence identity can be determined using sequence analysis software (eg, Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave., Madison, WI 53705). This software is suitable for similar sequences by determining the degree of homology for various substitutions, deletions (elimination) and other modifications.
  • sequence analysis software eg, Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave., Madison, WI 53705
  • the phrase “homologous,” with regard to the polypeptide sequence of an antibody, should be interpreted as an antibody exhibiting at least 70%, preferably 80%, more preferably 90% and most preferably 95% sequence identity relative to the polypeptide sequence .
  • Term in relation to nucleic acid sequence acids should be interpreted as a sequence of nucleotides that exhibit at least 85%, preferably 90%, more preferably 95% and most preferably 97% sequence identity with respect to the nucleic acid sequence.
  • the proposed modification (s) of the amino acid sequences of the antibodies described in this publication may be desirable to improve binding affinity and / or other biological properties of an antibody.
  • Variants of the amino acid sequence of an antibody are obtained by introducing the corresponding nucleotide changes into the antibody nucleic acid or peptide synthesis.
  • Such modifications include, for example, deletions and / or insertions and / or substitutions of residues in the amino acid sequences of an antibody. Any combination of deletion, insertion, and substitution is performed to obtain the final construct, provided that the final construct possesses the desired characteristics.
  • Amino acid changes can also alter post-translational processes in an antibody, such as changing the number or position of glycosylation sites.
  • a variant modification of the amino acid sequences of antibodies using amino acid substitutions is a substitution of at least one amino acid residue in the antibody molecule for another residue.
  • Locations of greatest interest for mutagenesis by substitutions include hypervariable regions or CDRs, but changes in the FR or Fc region are also contemplated.
  • Conservative substitutions are shown in Table A under the heading of “preferred substitutions”. If such substitutions lead to a change in biological activity, then additional significant changes may be introduced, called “examples substitution "in table A, or changes, further described below in describing classes of amino acids, and can be screened products.
  • nucleic acid denotes a clear sequence of nucleotides modified or not modified, defining a fragment or region of a nucleic acid, containing or not containing unnatural nucleotides and which is either double-stranded DNA or RNA, or single-stranded DNA or RNA, or transcription products of these
  • this invention does not relate to nucleotide sequences in their natural chromosomal environment, i.e. in a natural state.
  • the sequences of the present invention have been isolated and / or purified, i.e. were taken directly or indirectly, for example, by copying, while their environment was at least partially modified.
  • isolated nucleic acids obtained by genetic recombination for example, using host cells (host cells), or obtained by chemical synthesis, should also be implied.
  • nucleotide sequence covers its complement, unless otherwise indicated.
  • reference to a nucleic acid having a specific sequence should be understood as encompassing its complementary chain with its complementary sequence.
  • control sequences refers to DNA sequences necessary for the expression of a functionally related coding sequence in a particular host organism.
  • Control sequences suitable for prokaryotes are, for example, a promoter, optionally an operator and a ribosome binding site.
  • promoters, polyadenylation signals and enhancers are present in eukaryotic cells.
  • a nucleic acid is “functionally linked” if it is in functional connection with another nucleotide sequence.
  • the DNA of a pre-sequence or secretory leader sequence is functionally linked to the DNA of the polypeptide if it is expressed as a preprotein that is involved in the secretion of the polypeptide;
  • a promoter or enhancer is functionally linked to a coding sequence if it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosome binding site is functionally linked to the coding sequence, if it is located so that it can facilitate translation.
  • “functionally linked” means that the linked DNA sequences are contiguous, and in the case of a secretory leader sequence are contiguous and are in the reading phase. However, enhancers do not have to be contiguous.
  • vector means a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it is linked.
  • the vector is a plasmid, i.e. circular double-stranded part of DNA into which additional DNA segments can be ligated.
  • the vector is a viral vector in which additional DNA segments may be ligated into the viral genome.
  • the vectors are capable of autonomous replication in the host cell into which they have been introduced (for example, bacterial vectors having a bacterial replication initiation site and episomal mammalian vectors).
  • the vectors for example, non-episomal mammalian vectors
  • the vectors can be integrated into the genome of the host cell when introduced into the host cell, and thus replicated together with the host gene.
  • some vectors are able to direct the expression of genes with which they are functionally linked.
  • Such vectors referred to herein as “recombinant expression vectors” (or simply “expression vectors”).
  • recombinant host cell means a cell into which a recombinant expression vector has been introduced.
  • the present invention relates to host cells, which may include, for example, a vector in accordance with the present invention described above.
  • the present invention also relates to host cells that include, for example, a nucleotide sequence encoding a heavy chain or its antigen-binding portions, a nucleotide sequence encoding a light chain or its antigen-binding portions, or both of them, the first binding domain and / or the second binding domain binding molecules according to this invention.
  • excipient is used herein to describe any ingredient that is different from the compound (s) of this invention.
  • “Pharmaceutical composition” means a composition comprising an antibody according to the invention and at least one of the components selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable and pharmacologically compatible excipients, solvents, diluents, carriers, auxiliary, distributing and sensing agents, means delivery such as preservatives, stabilizers, fillers, grinders, moisturizers, emulsifiers, suspending agents, thickeners, sweeteners, fragrances, flavors, antibacterial agents, fungicides, lubricants, prolonged delivery regulators, the choice and ratio of which depends on the nature and method of administration and dosage.
  • suspending agents examples include ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene, sorbitol and sorbitol ether, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar-agar and tragacanth, and mixtures of these substances. Protection against the action of microorganisms can be provided with a variety of antibacterial and antifungal agents, such as parabens, chlorobutanol, sorbic acid, and similar compounds.
  • the composition may also include isotonic agents, for example, sugars, polyols, sodium chloride, and the like. Prolonged action of the composition can be provided with agents that slow down the absorption of the active principle, for example, aluminum monostearate and gelatin.
  • suitable carriers, solvents, diluents, and delivery vehicles are water, ethanol, polyalcohols, and mixtures thereof, vegetable oils (such as olive oil), and injectable organic esters (such as ethyl oleate).
  • suitable carriers are water, ethanol, polyalcohols, and mixtures thereof, vegetable oils (such as olive oil), and injectable organic esters (such as ethyl oleate).
  • fillers are lactose, milk sugar, sodium citrate, calcium carbonate, calcium phosphate, and the like.
  • shredders and dispensers are starch, alginic acid and its salts, silicates.
  • lubricants are magnesium stearate, sodium lauryl sulfate, talc, and high molecular weight polyethylene glycol.
  • a pharmaceutical composition for oral, sublingual, transdermal, intraocular, intramuscular, intravenous, subcutaneous, local or rectal administration of the active principle, alone or in combination with another active principle, can be administered to animals and humans in a standard form of administration as a mixture with traditional pharmaceutical carriers .
  • Suitable standard forms of administration include oral forms such as tablets, gelatin capsules, pills, powders, granules, chewing gums and oral solutions or suspensions, sublingual and transbukkalny forms of administration, aerosols, implants, local, transdermal, subcutaneous, intramuscular, intravenous, intranasal or intraglaze administration forms and rectal administration forms.
  • Drug (drug) a substance (or a mixture of substances in the form of a pharmaceutical composition) in the form of tablets, capsules, solutions, ointments and other ready-made forms, designed to restore, correct or change the physiological functions in humans and animals, as well as treatment and prevention of diseases, diagnosis, anesthesia, contraception, cosmetology and others.
  • disease or disorder mediated by CD47 and PD-L1 means all diseases or disorders that are either directly or indirectly associated with CD47 and PD-L1, including etiology, development, progress, persistence, or pathology of a disease or disorder.
  • Treatment refers to a method of alleviating or eliminating a biological disorder and / or at least one of its attendant symptoms.
  • Alleviate a disease, disease, or condition means reducing the severity and / or frequency of symptoms of a disease, disorder, or condition.
  • references to “treatment” in this document include references to curative, palliative and prophylactic therapy.
  • the treatment subject or patient is a mammal, preferably a human subject.
  • the above subject may be male or female of any age.
  • disorder means any condition that can be improved as a result of the treatment of the present invention.
  • the definition of this term includes chronic and acute disorders or diseases, including pathological conditions that cause the predisposition of a mammal to the occurrence of this violation.
  • the preferred disorder to be treated according to the invention is cancer.
  • cancer refers to the physiological state or describe the physiological state in mammals, which, as a rule, is characterized by unregulated (/ - oh) cell growth / proliferation. This definition encompasses benign and malignant cancers. Examples of cancers include, but are not limited to, carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma, and leukemia.
  • cancers include squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma, squamous cell lung carcinoma, peritoneal cancer, hepatocellular carcinoma, stomach cancer, including gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, glioma, cervical cancer, cancer ovary, liver cancer, bladder cancer, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrial and uterine carcinoma, salivary gland carcinoma, kidney cancer (renal cell carcinoma), cancer Yelnia prostate (prostate cancer), cancer, vulval cancer, thyroid cancer, hepatic carcinoma, anal carcinoma, penile, melanoma, and various types of head and neck cancer.
  • gastrointestinal cancer pancreatic cancer, glioblastoma, glioma, cervical cancer, cancer ovary, liver cancer, bladder cancer, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrial and uterine carcinoma, salivary gland carcinoma, kidney cancer (renal cell carcinoma),
  • immune response include, for example, the action of lymphocytes, antigen-presenting cells, phagocytic cells, granulocytes, and soluble macromolecules produced by these cells or liver cells (including antibodies, cytokines and complement, resulting from selective damage, destruction or elimination from the human body of invasive pathogens, cells or tissues infected with pathogens, cancer cells or, in cases of autoimmunity or pathological inflammation, normal human cells or tissues ).
  • a “therapeutically effective amount” is defined as the amount of therapeutic agent administered during treatment that will relieve to some extent one or more of the symptoms of the disease being treated.
  • chromenic use refers to the continuous (continuous) use of the agent (s) as opposed to the acute (short-term) route of administration, so as to maintain the initial therapeutic effect (activity) for a long period of time.
  • the present invention relates to antibodies that bind to CD47 H PD-L1.
  • the antibody is a full-length antibody or its antigen-binding fragment
  • the antibody includes one or two binding sites to PD-L1.
  • the CD47 binding site inhibits the interaction of the CD47 receptor and SIRPa ligand, and / or the binding site of PD-L1 inhibits the interaction of PD-L1 with the PD-1 receptor.
  • an antibody that binds CD47 and PD-L1 binds CD47 and PD-L1
  • the binding site with CD47 which includes the variable region of the heavy chain, containing:
  • CDR1 with an amino acid sequence of at least 80% or 90% homologous or identical sequence selected from the group of SEQ ID NO: 1-4, i.e., CDR1 is a sequence selected from the group SEQ ID NO: 1-4 or a sequence selected from the group of SEQ ID NO: 1 to 4 with 1 or 2 substitutions;
  • CDR2 with an amino acid sequence of at least 80%, 84%, 86%, 88%, 92% or 96% of a homologous or identical sequence selected from the group of SEQ ID NO: 6 to 15, i.e., CDR2 replicates the sequence SEQ ID NO: 6 - 15 or a sequence selected from the group of SEQ ID NO: 6 - 15 with 1, 2, 3, 4, or 5 substitutions;
  • CDR3 with an amino acid sequence of at least 80%, 85%, 86%, 90%, 93% or 95% of a homologous or identical sequence selected from the group of SEQ ID NO: 17-20, i.e., CDR3 represents a sequence, selected from the group of SEQ ID NO: 17-20 or a sequence selected from the group of SEQ ID NO: 17-20 with 1, 2 or 3 substitutions.
  • an antibody that binds CD47 and PD-L1 binds CD47 and PD-L1
  • the binding site with CD47 which includes the variable region of the heavy chain, containing:
  • an antibody that binds CD47 and PD-L1 binds CD47 and PD-L1, and includes a binding site for CD47 containing:
  • variable region of the heavy chain containing:
  • CDR1 with an amino acid sequence of at least 80% or 90% homologous or identical sequence selected from the group of SEQ ID NO: 1 4, i.e. CDR1 is a sequence selected from the group SEQ ID NO: 1-4 or selected from the group of SEQ ID NO: 1 to 4 with 1 or 2 substitutions;
  • a CDR2 with an amino acid sequence of at least 80%, 84%, 86%, 88%, 92% or 96% of a homologous or identical sequence selected from the group of SEQ ID NO: 6 to 15, i.e., CDR2 replicates the sequence SEQ ID NO: 6 - 15 or a sequence selected from the group of SEQ ID NO: 6 - 15 with 1, 2, 3, 4 or 5 substitutions,
  • CDR3 with an amino acid sequence of at least 80%, 85%, 86%, 90%, 93% or 95% of a homologous or identical sequence selected from the group of SEQ ID NO: 17-20, i.e., CDR3 represents the sequence selected from the group of SEQ ID NO: 17-20 or a sequence selected from the group SEQ ID NO: 17-20 with 1, 2 or 3 substitutions, and
  • CDR1 represents a sequence selected from the group SEQ ID NO: 22-34 or a sequence selected from the group of SEQ ID NO: 22 - 34 with 1 or 2 substitutions
  • CDR2 with an amino acid sequence of at least 80%, 87% or 94% of a homologous or identical sequence selected from the group of SEQ ID NO: 36–48, i.e. CDR2 replicates the sequence selected from the group of SEQ ID NO: 36 - 48 or a sequence selected from the group of SEQ ID NO: 36 - 48 with 1, 2 or 3 substitutions,
  • CDR3 with an amino acid sequence of at least 80% or 90% of a homologous or identical sequence selected from the group of SEQ ID NO: 50-64, i.e. a sequence selected from the group of SEQ ID NO: 50 - 64; or a sequence selected from the group of SEQ ID NO: 50 - 64 with 1 or 2 substitutions.
  • an antibody that binds CD47 and PD-L1 binds CD47 and PD-L1, and includes a binding site for CD47 containing:
  • variable region of the heavy chain containing:
  • variable region of the light chain containing:
  • an antibody that binds CD47 and PD-L1 binds CD47 and PD-L1, and includes a binding site for CD47 containing:
  • an antibody that binds CD47 and PD-L1 binds CD47 and PD-L1, and includes a binding site for CD47 containing:
  • an antibody that binds CD47 and PD-L1 and includes a binding site to PD-L1 containing:
  • variable region of the heavy chain containing:
  • CDR1 with an amino acid sequence of at least 80% homologous or identical to SEQ ID NO: 5, i.e. CDR1 is represented by the sequence SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 5 with 1 substitution;
  • CDR2 with an amino acid sequence of at least 80%, 86% or 92% of the homologous or identical sequence of SEQ ID NO: 16, i.e. CDR2 represents the sequence of SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 16 with 1, 2 or 3 substitutions;
  • CDR3 with an amino acid sequence of at least 80%, or 90% homologous or identical to SEQ ID NO: 21, i.e. CDR3 substitutes the sequence of SEQ ID NO: 21 or the sequence of SEQ ID NO: 21 with 1 or 2 substitutions, and
  • variable region of the light chain containing:
  • CDR1 represents the sequence of SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 35 with L 2 or 3 substitutions;
  • CDR2 with an amino acid sequence of at least 80 %% homologous or identical to SEQ ID NO: 49, i.e. CDR2 is represented by SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 49 with 1 substitution;
  • CDR3 with an amino acid sequence of at least 80% or 90% homologous or identical to SEQ ID NO: 65, i.e. CDR3 is the sequence of SEQ ID NO: 65 or SEQ ID NO: 65 with 1 or 2 substitutions.
  • an antibody that binds CD47 and PD-L1 and includes a binding site to PD-L1 containing:
  • variable region of the heavy chain containing:
  • variable region of the light chain containing:
  • the present invention relates to an antibody that binds CD47 and PD-L1, characterized in that the binding site for CD47 is Fab, scFv, scFab or isolated VH or VHH mono domains.
  • the present invention relates to an antibody that binds CD47 and PD-L1, characterized in that the binding site for PD-L1 is Fab, scFv, scFab or isolated VH or VHH mono domains.
  • the present invention relates to an antibody that binds CD47 and PD-L1, characterized in that it causes antibody-dependent cellular cytotoxicity, macrophage-mediated phagocytosis, complement-dependent cytotoxicity and / or T-cell mediated cytotoxicity against cells bearing on the surface antigens CD47 and / or PD-L1.
  • an antibody that binds CD47 and PD-L1 characterized in that it contains an Fc fragment with at least one mutation or modification that increases antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and / or complement dependent cytotoxicity (CDC) compared with the same antibody without mutation or modification.
  • ADCC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • CDC complement dependent cytotoxicity
  • the present invention also relates to nucleic acid molecules, and sequences encoding an antibody to CD47 and PD-L1 according to this invention, described in this document.
  • various nucleic acid molecules encode the first domain and the second domain of the amino acid sequence of an antibody to CD47 and PD-L1. Where the first domain and / or the second domain contains a heavy chain and a light chain, in some embodiments, various nucleic acids encode a heavy chain and amino acid sequences of the light chain. In other embodiments, the same nucleic acid molecule encodes a heavy chain and light chain sequence.
  • the nucleic acid molecule can encode any combination of amino acid sequences (eg, heavy and light chain sequences) of the first and second domain.
  • the nucleic acid molecule may encode the amino acid sequence of the first binding domain and the amino acid sequence of the light chain of the second binding domain, optionally including any sequence of the peptide linker connecting them.
  • the reference to the nucleotide sequence covers its complement, unless otherwise indicated. Thus, reference to a nucleic acid having a specific sequence should be understood as embracing its complementary chain with its complementary sequence.
  • polynucleotide referred to herein means a polymeric form of nucleotides, at least 10 bases in length, either ribonucleotides or deoxynucleotides, or a modified form of any type of nucleotide.
  • the term includes single and double stranded forms.
  • the nucleic acid molecules may be isolated.
  • the nucleic acid molecule of the invention can be isolated from any source that produces anti-CD47 and PD-L1 antibodies. In certain embodiments of the invention, the nucleic acid molecule of the invention can be synthesized, and not isolated. In some embodiments of the invention, the nucleic acid molecule of the invention may comprise a nucleotide sequence encoding a VH domain from the first or second domain of an antibody of the invention, linked in a reading to a nucleotide sequence encoding a constant domain of the heavy chain from any source.
  • a nucleic acid molecule of the invention may contain a nucleotide sequence encoding a VL domain from the first or second region of an antibody of the invention, combined within a reading with a nucleotide sequence encoding a constant domain of the light chain from any source.
  • nucleic acid molecules encoding the variable domain of a heavy (VH) and / or light (VL) chains of the first or second binding domain can be "transformed” along the entire length of the antibody genes.
  • nucleic acid molecules encoding the VH or VL domains are converted into antibody genes along the entire length by insertion into an expression vector that already encodes the constant domains of the heavy chain (CH) or light chain (CL), respectively, so that the VH segment is functionally connected to the CH segment (s) in the vector and / or the VL segment is operatively connected to the CL segment in the vector.
  • nucleic acid molecules encoding the VH and / or VL domains are converted into genes along the entire length of the antibody by connecting, for example, ligation, a nucleic acid molecule encoding the VH and / or VL domains to a nucleic acid molecule encoding CH and / or CL domains using standard molecular biological methods. Nucleic acid molecules that encode the heavy and / or light chain throughout their length can then be expressed in the cell into which they were inserted. Nucleic acid molecules can be used to express large amounts of recombinant antibodies to CD47 and PD-L1. Nucleic acid molecules can be used to produce human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, bispecific antibodies, single-chain antibodies, immunoadhesins, diabodies, mutated antibodies, and derivatives of antibodies, as described herein.
  • the present invention relates to a vector suitable for expressing any of the nucleotide sequences described herein.
  • the present invention relates to vectors containing nucleic acid molecules that encode any of the amino acid sequences of antibodies to CD47 and PD-L1 or parts thereof (for example, the heavy chain sequences of the first and / or heavy and / or light chain of the second binding domains) as described in this document.
  • the present invention further relates to vectors containing nucleic acid molecules encoding fusion proteins, modified antibodies, antibody fragments.
  • the nucleic acid molecules and vectors can be used to make mutated antibodies to CD47 and PD-L1.
  • Antibodies can mutate in the variable domains of the heavy and / or light chains of the first and / or heavy and / or light chains of the second binding domain, for example, to change the binding ability of antibodies.
  • a mutation can occur in one or more CDRs to increase or decrease Co antibodies, to increase or decrease k 0ff, or to change the binding specificity of an antibody for FcRn.
  • one or more mutations are subjected to an amino acid residue, which is known to be altered compared to the germ line in an antibody, corresponding to the first or second binding domain of the anti-CD47 and PD-L1 antibody of the invention. These mutations can be made in the CDR region or framework region of the variable domain, or in the constant domain. In a preferred embodiment of the invention, the mutations are produced in the variable domain. In another embodiment of the invention, one or more mutations are subjected to an amino acid residue that is known to be altered compared to the germline in the CDR region or framework region of the antibody variable domain of this invention.
  • antibodies to CD47 and PD-L1 according to this invention are expressed by inserting DNA that encodes part or all of the sequence of the first and second binding domain (for example, the sequence of the heavy and light chain, where the binding domain contains the sequence of the heavy and light chain) , obtained as described above, in expression vectors in such a way that the genes are functionally linked to the necessary expression control sequences, such as transcription nye and translational control sequences.
  • Expression vectors include plasmids, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses (AAV), plant viruses, such as cauliflower mosaic virus, tobacco mosaic viruses, cosmids, YAC, EBV, the resulting episomes and the like.
  • DNA molecules can be ligated into a vector in such a way that the sequences controlling transcription and translation in the vector fulfill the intended function of regulating transcription and translation of DNA.
  • the expression vector and expression control sequences can be selected to be compatible with the expression host cell used.
  • DNA molecules encoding in part or throughout the length of the sequence of the first and second binding domains (for example, the heavy and light chain sequences, where binding domain contains the sequence of the heavy and light chains) can be introduced into separate vectors. In one embodiment of the invention, any combination of the above DNA molecules is introduced into the same expression vector.
  • DNA molecules can be introduced into the expression vector by standard methods (for example, ligation of complementary restriction sites on the antibody and vector gene fragments or ligation of blunt ends if there are no restriction sites).
  • a suitable vector is one that encodes a functionally complete human immunoglobulin CH or CL sequence with constructing an appropriate restriction site so that any VH or VL sequence can be easily included and expressed, as described above.
  • NA - and LC-coding of genes in such vectors may contain intron sequences, which leads to an overall increase in antibody protein products by stabilization, the corresponding mRNA. Intron sequences are surrounded by splice donor and splice acceptor sites, which determine where RNA splicing will occur. The location of the intron sequences can be either in the variable or constant regions of the antibody chains, or in both the variable and constant regions when multiple introns are used. Termination of polyadenylation and transcription may occur downstream of the native chromosome site of the encoded regions.
  • the recombinant expression vector can also encode a signal peptide that facilitates the production of an antibody chain by a host cell.
  • the antibody chain gene can be cloned into a vector such that the signal peptide is connected to the reading frame of the amino-terminus of the immunoglobulin chain.
  • the signal peptide may be an immunoglobulin signal peptide or a heterologous signal peptide (i.e., a signal peptide of a protein of non-immunoglobulin nature).
  • the recombinant expression vector of the invention may carry regulatory sequences that control the expression of the antibody chain genes in the host cell.
  • regulatory sequences that control the expression of the antibody chain genes in the host cell.
  • Preferred regulatory sequences for a mammalian host cell include viral elements providing a high level of protein expression in mammalian cells, such as promoters and / or enhancers, derived from retroviral LTR, cytomegalovirus (CMV) (eg CMV promoter / enhancer), monkey virus 40 (SV40) (for example, SV40 promoter / enhancer), adenovirus (for example, the large late adenovirus promoter (AdMLP)), polyoma virus, as well as strong mammalian promoters, such as the native promoter immunoglobulin or actin promoter.
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 monkey virus 40
  • AdMLP adenovirus
  • AdMLP large late adenovirus promoter
  • polyoma virus as well as strong mammalian promoters, such as the native promoter immunoglobulin or actin promoter.
  • recombinant expression vectors of the invention may carry additional sequences, such as sequences that regulate vector replication in host cells (eg, replication start points) and selectable marker genes.
  • the selectable marker gene facilitates selection of host cells into which the vector has been introduced (see, for example, US patents 4,399,216, 4,634,665 and 5,179,017).
  • a selectable marker gene confers resistance to drugs, such as G418, hygromycin or methotrexate, to the host cell into which the vector is introduced.
  • the selectable marker genes include the dihydrofolate reductase gene (DHFR) (for use in host dhfr cells in the selection / amplification of methotrexate), the neo gene (for selection of G418) and the glutamate synthetase gene.
  • DHFR dihydrofolate reductase gene
  • expression control sequence means polynucleotide sequences that are necessary to influence the expression and processing of the coding sequences to which they are ligated.
  • Expression control sequences include the corresponding transcription initiation, termination, promoter and enhancer sequences; efficient RNA processing signals, such as splicing and polyadenylation signals; sequences that stabilize cytoplasmic mRNA; sequences that increase translation efficiency (i.e., Kozak consensus sequence); sequences that increase protein stability; and, if desired, sequences that enhance protein secretion.
  • control sequences vary depending on the host organism; in prokaryotes, such control sequences typically include a promoter, a ribosome binding site, and transcription termination sequences; in eukaryotes, such control sequences typically include promoters and transcription termination sequences.
  • control sequences includes, at a minimum, all components whose presence is important for expression and processing, and may also include additional components whose presence is beneficial, for example, the leading sequences and the sequence of fused cells.
  • An additional aspect of the present invention relates to methods for producing antibodies to CD47 and PD-L1 according to this invention.
  • One embodiment of the invention relates to a method for producing antibodies, as defined herein, comprising introducing the production of a recombinant host cell capable of expressing antibodies, culturing said host cell under conditions suitable for expressing antibody production, and isolating the resulting antibody.
  • Antibody to CD47 and PD-L1, obtained by such expression in such recombinant host cells is referred to herein as “recombinant antibodies”.
  • the invention also relates to progeny cells of such host cells and antibodies to CD47 and PD-L1, obtained similarly.
  • Nucleic acid molecules encoding anti-CD47 and PD-L1 antibodies of the invention and vectors containing these nucleic acid molecules can be used to transfect a suitable mammal or cell, plant or cell, bacterial or yeast host cell. Transformation can occur by any known method for introducing polynucleotides into a host cell. Methods for introducing heterologous polynucleotides into mammalian cells are well known in the art and include dextran-mediated transfection, transfection with a nucleic acid complex and a positively charged polymer, transfection with nucleic acid precipitate with calcium phosphate, polybrene-mediated transfection, protoplast fusion, transfection, transfection, transfection. direct microinjection of DNA into the nucleus.
  • nucleic acid molecules can be introduced into mammalian cells by viral vectors.
  • Methods for transfecting cells are well known in the art. Cm., for example, U.S. Patents 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, and 4,959,455.
  • Methods for transforming plant cells are well known in the art, including, for example, Agrobacterium-mediated transformation, biolistic transformation, direct injection, electroporation, and viral transformation. Methods for transforming bacteria and yeast cells are also well known in the art.
  • Mammalian cell lines used as hosts for transformation are well known in the art and include many immortalized cell lines available. These include, for example, Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, NS0 cells, SP2 cells, HEK-293T cells, 293 Freestyle cells (Invitrogen), NIH-3T3 cells, HeLa cells, African hamster kidney cells green monkeys (COS), human hepatocellular carcinoma cells (for example, Hep G2), A549 cells and a number of other cell lines. Cell lines are selected by determining which cell lines have high levels of expression and provide the necessary characteristics of the produced protein. Other cell lines that can be used are insect cell lines, such as Sf9 or Sf21 cells.
  • antibodies are produced by culturing host cells for a time sufficient to express the antibodies in the host cells or, preferably, isolating the antibodies into the culture medium, in which host cells are grown.
  • Antibodies to CD47 and PD-L1 can be isolated from the nutrient medium using standard protein purification methods.
  • Plant host cells include Nicotiana, Arabidopsis, duckweed, corn, wheat, potatoes, etc.
  • Host bacterial cells include E. coli and Streptomyces species.
  • Yeast host cells include Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris.
  • the level of production of antibodies to CD47 and PD-L1 according to this invention from a producing cell line can be enhanced using a number of known methods.
  • the glutamine synthetase gene expression system (GS system) is fairly common to enhance expression under certain conditions.
  • the GS system is discussed in whole or in part in connection with patents EP 0216846, 0256055, 0323997 and 0338841.
  • CD47 and PD-L1 from different cell lines or transgenic animals will differ from each other in their glycosylation profile.
  • all antibodies to CD47 and PD-L1 encoded by the nucleic acid molecules described herein, or containing the amino acid sequences given herein, are part of this invention, regardless of the glycosylation state of the binding molecules and, in general, regardless of the presence or absence of post-translational modifications.
  • the invention also relates to methods and processes for producing antibodies to CD47 and PD-L1 and their antigen-binding fragments.
  • Monoclonal antibodies can be created, for example, using a hybrid method based on CoYeg et al., Nature, 256, 1975, p. 495, or using recombinant DNA techniques (US 4816567).
  • lymphocytes When using a hybridoma-based method, a mouse or other suitable host animal, such as a hamster, is immunized according to the method described above, in order to cause the formation of lymphocytes that produce or can produce antibodies that are capable of specifically binding to the protein used for immunization.
  • lymphocytes can be obtained by in vitro immunization. After immunization, lymphocytes are isolated and then fused to the myeloma cell line with using an acceptable binding agent, such as polyethylene glycol, to obtain a hybridoma cell.
  • the hybridoma cells thus obtained are seeded and grown in a suitable culture medium, which preferably contains one or more substances that inhibit the growth or survival of unfused parent myeloma cells.
  • a suitable culture medium which preferably contains one or more substances that inhibit the growth or survival of unfused parent myeloma cells.
  • the culture medium for hybridomas should usually include hypoxanthine, aminopterin and thymidine (HAT medium), i.e. substances that inhibit the growth of cells deficient in HGPRT.
  • Preferred cells used for fusion of myeloma cells are cells that are easy to merge, maintain a stable high level of antibody production by selected antibody-producing cells, and are sensitive to the selective medium on which unbound parent cells are selected.
  • Preferred myeloma cell lines are mouse myeloma lines, such as those based on murine tumor cell lines MORS-21 and MPC-11, which can be obtained from the Salk Institite Cell Disrtibution Center, San Diego, pc. California, USA, and lines SP-2 or X63- Ag8-653, which can be obtained from the American Type Culture Collection, Rockville, ea. Maryland, USA.
  • the use of human mouse myeloma and mouse-human heteromyeloma cell lines for the production of monoclonal antibodies has also been described (Kozbor, J. Immunol, 133, 1984, p. 3001).
  • the binding specificity of monoclonal antibodies obtained using hybridoma cells is determined by immunoprecipitation or by using an in vitro binding assay, such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the binding affinity of a monoclonal antibody can, for example, be determined using the Scatchard analysis described in Munson et al., Anal. Biochem., 107, 1980, p. 220
  • the clones can be subcloned using the limiting dilution method and grown by standard methods. Suitable media include, for example, DMEM or RPMI-1640.
  • hydriboma cells can be grown in vivo as ascites tumors in animals, for example, by intraperitoneal (i.p.) cell injection in mice.
  • Monoclonal antibodies secreted by subclones can be separated from the culture medium, ascitic fluid, or serum using conventional antibody purification methods, for example, affinity chromatography (for example, using protein A or Q-sepharose protein), or ion-exchange chromatography, chromatography on hydroxyapatite, gel electrophoresis, dialysis, etc.
  • affinity chromatography for example, using protein A or Q-sepharose protein
  • ion-exchange chromatography chromatography on hydroxyapatite
  • gel electrophoresis dialysis, etc.
  • DNA encoding monoclonal antibodies can be easily isolated and sequenced using conventional procedures (for example, using oligonucleotide probes that have the ability to specifically bind to genes encoding the heavy and light chains of mouse antibodies).
  • Hybridoma cells serve as the preferred source of such DNA. After DNA isolation, you can include expression vectors, which then transfect host cells, such as E. coli cells, monkey COS cells, Chinese hamster ovary cells (CHO), or myeloma cells, which do not produce an antibody protein without transfection, which leads to synthesis of monoclonal antibodies in recombinant host cells.
  • monoclonal antibodies or antibody fragments can be isolated from antibody phage libraries created using the methods described in McCafferty et al., Nature, 348, 1990, cc. 552-554.
  • Clackson et al. Nature, 352, 1991, p. 624-628 and Marks et al. J. Mol. Biol, 222, 1991, p. 581 -597 described the selection of mouse and human antibodies, respectively, using phage libraries.
  • Subsequent publications have described the production of high-affinity (nM-range) human antibodies using chain permutation (Marks et al., Bio / Technology, 10, 1992, pp.
  • DNA encoding the antibody can also be modified, for example, so as to obtain chimeric or fusion antibody polypeptides, for example, by replacing the sequences of the constant regions of the heavy and light chains (CH and CL) with homologous murine sequences (US 4816567 and Morrison and others, Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81 (1984, p. 6851) or by covalently linking the immunoglobulin coding sequence to all or part of the coding sequence of a non-immunoglobulin polypeptide (heterologous polypeptide).
  • CH and CL constant regions of the heavy and light chains
  • homologous murine sequences US 4816567 and Morrison and others, Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81 (1984, p. 6851
  • Non-immunoglobulin polypeptide sequences can be replaced with constant regions of the antibody or replaced with variable regions of the antigen-binding center of the antibody, creating a chimeric bivalent antibody that contains one antigen-binding center with antigen specificity and another antigen-binding center with specificity for another antigen.
  • Humanized antibodies can be replaced with constant regions of the antibody or replaced with variable regions of the antigen-binding center of the antibody, creating a chimeric bivalent antibody that contains one antigen-binding center with antigen specificity and another antigen-binding center with specificity for another antigen.
  • the humanized antibody has one or more amino acid residues embedded in it, obtained from a source other than human. These derived from a source other than humans, amino acid residues are often referred to as “import” residues, since they are usually obtained from the “import” variable region.
  • humanization can be carried out according to the method of Winter et al. (Jones et al., Nature, 321, 1986, pp. 522-525) by replacing the hypervariable region sequences with the corresponding sequences of a human antibody.
  • humanized antibodies are chimeric antibodies (US 4816567), in which a region substantially smaller than the intact human variable region is replaced by the corresponding sequence derived from species other than humans.
  • humanized antibodies are, as a rule, human antibodies, in which part of the residues of the hypervariable region and possibly part of the FR residues are replaced by residues from analogous sites of rodent antibodies.
  • human light and heavy chain variable regions designed to produce humanized antibodies are very important in reducing antigenicity and the HAMA response (human anti-mouse antibody) when the antibody is intended to treat a person.
  • HAMA response human anti-mouse antibody
  • the sequence of the variable region of a rodent antibody is screened with respect to a complete library of known sequences of human variable regions.
  • the human sequence of the V region, which is closest to the sequence from the organism of rodents, is identified and a human framework is selected inside it.
  • plot (FR) suitable for use in humanized antibody (Sims and others, J. Immunol., 151, 1993, S. 2296).
  • a specific framework region is used, obtained from a consensus sequence of a certain subgroup of light or heavy chains of all human antibodies.
  • the same framework can be used for several different humanized antibodies (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 89, 1992, p. 4285).
  • humanized antibodies are obtained by analyzing the parental sequences and various humanized products using speculative three-dimensional models of the parental and humanized sequences. Three-dimensional models of immunoglobulins are widely available and well known to specialists in this field. Computer programs are known that illustrate and display possible three-dimensional conformational structures of selected promising immunoglobulin sequences. The study of these images allows the analysis of the possible role of residues in the function of a promising immunoglobulin sequence, i.e. analysis of residues that affect the ability of the perspective immunoglobulin to bind to the antigen.
  • a humanized antibody can be an antibody fragment, such as a Fab fragment, optionally conjugated with one or more cytotoxic agent (s) to create an immunoconjugate.
  • the humanized antibody may be a full-length antibody, for example, a full-length antibody in the form of IgGl.
  • humanization can be obtained human antibodies.
  • transgenic animals eg, mice
  • transgenic animals eg, mice
  • DNA segment the antibody heavy chain gene
  • homozygous deletion of the regions of the junction of the antibody heavy chain gene (DNA segment) in the organism of chimeric mice and mice with a mutation in the germ line leads to a complete inhibition of the production of endogenous antibodies.
  • the transfer of the human immunoglobulin germline kit to such mutant mouse germ line results in the production of human antibodies after challenge with an antigen (US 5545806, 5569825, 5591669 (all in the name of GenPharm); 5545807; and WO 97/17852).
  • phage display technology (McCafferty et al., Nature, 348, 1990, pp. 552-554) can be used to obtain human antibodies and antibody fragments in vitro from the spectrum of genes of the variable region (V) of immunoglobulin from the body of immunized donors.
  • the genes of the antibody V-region are cloned in reading frame with either the main or the minor gene of the envelope protein of the filamentous bacteriophage, such as M13 or fd, and presented as functional antibody fragments on the surface of the phage particle.
  • the filamentous particle contains a copy single-stranded DNA of the phage genome, selection on the basis of the functional properties of the antibody, also lead to the selection of the gene encoding the antibody, which has these properties.
  • the phage mimics some properties of the B-cell.
  • Phage presentation can be carried out in various formats. For phage presentation, you can use different sources of segments of V-genes. Clackson et al., Nature, 352, 1991, p. 624-628 isolated different sets of antibodies to oxazolone from a small random combinatorial library of V-genes obtained from the spleen of immunized mice.
  • V-genes derived from the body of immunized human donors, and antibodies to a different set of antigens (including autoantigens) can be isolated as a whole according to the methods described by Marks et al., J. Mol. Biol., 222, 1991, p. 581-597.
  • human antibodies can also be produced in vitro by activated B cells (see US 5,567,610 and 5,229,275).
  • antibody fragments rather than complete antibodies.
  • the smaller size of the fragments contributes to their rapid clearance and may contribute to better penetration into dense tumors.
  • Fab, Fv, and scFv fragments of antibodies can be expressed and secreted from E. coli, which can facilitate the production of large quantities of these fragments.
  • Antibody fragments can be isolated from the antibody phage libraries described above.
  • Fab'-SH fragments can be isolate directly from E. coli and crosslink chemically to produce P (ab ') 2 fragments (Carter et al., Bio / Technology, 10, 1992, pp. 163-167).
  • F (ab ') 2 - fragments can be isolated directly from a culture of recombinant host cells.
  • Fab- and F (ab ') 2 - a fragment with an increased in vivo half-life, in which epitope-binding receptor residues are stored, are described in US 5869046.
  • Other techniques for obtaining antibody fragments should be obvious to those skilled in the art.
  • the selected antibody is a single-chain Fv fragment (scFv) (see WO 93/16185; US 5571894 and US US 5587458).
  • Fv and scFv are the only species with intact binding sites that are devoid of constant regions; as a result, they can be used for reduced non-specific binding when applied in vivo.
  • Fusion proteins carrying scFv can be designed to produce fusion of the effector protein either at the ⁇ -or at the C-terminus of the scFv.
  • the antibody fragment may also be a “linear antibody”, for example, as described in US 5,641,870. Such linear antibody fragments may be monospecific or bispecific.
  • bispecific antibodies can bind to two different protein epitopes.
  • Other multispecific antibodies may carry a binding site to CD47 and PD-L1 in combination with the binding site of another protein.
  • Bespecifically antibodies can be obtained in the form of antibodies or fragments of antibodies (for example, F (ab ') 2 - fragments of bi-specific antibodies).
  • Bispecific antibodies are known in the art.
  • the generally accepted full-sized Bispecific antibodies are based on the co-expression of two pairs of immunoglobulin heavy and light chains, where both chains have different specificities. Due to the random collection of immunoglobulin heavy and light chains, these hybridomas (quadromas) can potentially produce a mixture of 10 different antibody molecules, of which only one has the correct bispecific structure. Purification of the correct molecule, which is usually carried out in several stages using affinity chromatography, is rather laborious, and the product yield is low. Similar processes are described in WO 93/08829.
  • the antibody variable regions with the desired binding specificity are fused to the immunoglobulin constant region sequences.
  • the fusion is preferably carried out with the constant region of the heavy chain Ig, which includes at least a part of the hinged CH2 and SN3 regions.
  • the first constant region of the heavy chain ( ⁇ 1) is present, containing the site necessary for light chain binding.
  • bispecific antibodies are an immunoglobulin heavy chain hybrid that provides the first binding specificity in the first shoulder and a heavy chain pair hybrid to the immunoglobulin light chain (which provides the second binding specificity) in the second shoulder.
  • a contact area between a pair of antibody molecules in order to increase to a maximum level the percentage of heterodimmers that are obtained from a culture of recombinant cells.
  • the preferred contact area includes at least a portion of the NNZ region.
  • one or several small amino acids with side chains from the contact area of the first antibody molecule are replaced with molecules with larger side chains (for example, tyrosine or tryptophan).
  • Balancing "cavities” that are identical or similar in size to the large side chain (s) (s) in the region of contact of the second antibody molecule create by replacing amino acids with large side chains with amino acids with smaller side chains (for example, alanine or threonine ). This provides a mechanism to increase the yield of the heterodimer relative to other unwanted end products.
  • Bespecifically antibodies include cross-linked antibodies or "heteroconjugates".
  • one of the antibodies in the heteroconjugate may be sewn with avidin and another with biotin.
  • Such antibodies can be used, for example, for the directed transfer of immune system cells to unwanted cells (US 4,676,980) and for the treatment of HIV infection (WO 91/00360, WO 92/200373 and EP 03089).
  • Heteroconjugate antibodies can be created using any of the usual methods of introducing cross-links. Acceptable cross-linkers are well known in the art and are described in US 4,676,980 along with various methods for introducing cross-links.
  • bispecific antibodies can be obtained by chemical binding.
  • Brennan et al., Science, 229, 1985, p. 81 described a technique in which intact antibodies are subjected to proteolytic cleavage, resulting in an E (ab ') 2 fragment.
  • E (ab ') 2 fragment These fragments are reduced in the presence of an agent forming complexes with dithiol, such as sodium arsenite, to stabilize neighboring dithiols and prevent the formation of intermolecular disulfide bonds.
  • the resulting Fab'-fragments are then converted to the thionitrobenzoate (TNB) derivative.
  • One of the Fab'-TNB derivatives is then re-converted to Fab'-thiol by reduction with mercaptoethylamine and mixed with an equimolar amount of the other Fab'-TNB derivative, to obtain a bispecific antibody.
  • the resulting bispecific antibodies can be used as agents for the selective immobilization of enzymes.
  • bispecific antibody possessed the ability to bind to cells characterized by overexpression of the EBb2 receptor and ordinary human T cells, as well as stimulate the lytic activity of human cytotoxic lymphocytes targeted by a human mammary tumor.
  • bispecific antibodies were obtained using leucine zippers (Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5), 1992, pp. 1547-1553).
  • Leucine zipper peptides from Fos and Jim proteins have been linked to Fab'-fragments of two different antibodies by gene fusion.
  • Homodimers of antibodies were restored in the hinge region to produce monomers, and then antibody heterodimers were obtained by reoxidation. This method can also be used to obtain homodimeric antibodies.
  • the “double antibody” technology described by Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • a polyvalent antibody can be internalized (and / or dissimilated) by a cell expressing the antigen with which the antibody binds, faster than a bivalent antibody.
  • the antibodies of the present invention may be multivalent antibodies (other than the IgM class) with three or more antigen binding sites (for example, tetravalent antibodies) that can be easily obtained by recombinant expression of a nucleic acid encoding an antibody polypeptide chains.
  • a polyvalent antibody may contain a dimerized domain and three or more antigen-binding centers. The preferred dimerized domain contains (or consists of) an Fc fragment or a hinge region.
  • a preferred multivalent antibody contains (or consists of) from 3 to about 8, but preferably 4, antigen binding sites.
  • a polyvalent antibody contains at least one polypeptide chain (and preferably two polypeptide chains), with the polypeptide chain (s) (s) containing (a) two or more variable regions.
  • polypeptide (s) chain (s) may (ut) contain VDl- (Xl) n-VD2- (X2) n-Fc, where VD1 denotes the first variable region, VD2 denotes the second variable region, Fc denotes one Fc polypeptide chain a fragment, XI and X2 denote an amino acid or polypeptide and n denotes 0 or 1.
  • the polypeptide chain (s) may (ut) contain the following chain: VH-CH1-flexible linker-VH-CH1 -Fc fragment; or VH-CH1-VH-CH1 -Fc fragment.
  • Polyvalent antibody proposed in the present invention preferably additionally contains at least 2 (and preferably 4) of the polypeptide of the variable region of the light chain.
  • Polyvalent antibody proposed in the present invention may, for example, contain from about 2 to about 8 polypeptides of the variable region of the light chain.
  • the polypeptides of the light chain variable region contain the variable region of the light chain and optionally further comprise a CL region.
  • compositions comprising, as an active ingredient (or as the only active ingredient), an antibody that is specific for CD47 and PD-L1.
  • the pharmaceutical composition may include at least one anti-CD47 and PD-L1 antibody and / or one or more additional binding molecules (eg, antibodies) that target one or more of the respective surface receptors, as described herein.
  • additional binding molecules eg, antibodies
  • the compositions are intended to improve, prevent, or treat disorders that are mediated by IgG.
  • “Pharmaceutical composition” means a composition comprising an anti-CD47 and PD-L1 antibody of the invention and at least one of the components selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable and pharmacologically compatible excipients, such as excipients, solvents, diluents carriers, auxiliary, distributing, delivery vehicles, preservatives, stabilizers, emulsifiers, suspending agents, thickeners, prolonged delivery regulators, the choice and ratio of which depends on the nature and method of administration and dosage.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention and methods for their manufacture will undoubtedly be obvious to those skilled in the art.
  • the manufacture of pharmaceutical compositions should preferably comply with GMP (Good Manufacturing Practice) requirements.
  • the composition may include a buffer composition, tonicity agents, stabilizers and solubilizers. Prolonged action of the composition can be achieved with agents that slow down the absorption of the active pharmaceutical ingredient, for example, aluminum monostearate and gelatin.
  • suitable carriers, solvents, diluents, and delivery vehicles are water, ethanol, polyalcohols, and mixtures thereof, oils, and injectable organic esters.
  • Drug (drug) a substance or mixture of substances in the form of a pharmaceutical composition in the form of tablets, capsules, powders, lyophilisates, injections, infusions, ointments and other ready-made forms, designed to restore, correct or change the physiological functions in humans and animals , as well as for the treatment and prevention of diseases, diagnosis, anesthesia, contraception, cosmetology and other things. Any method of administering peptides, proteins, or antibodies adopted in the art may appropriately be used for the anti-CD47 and PD-L1 antibody of the invention.
  • pharmaceutically acceptable means one or more compatible liquid or solid components that are suitable for administration to a mammal, preferably a human.
  • excipient or “excipient” is used in this document to describe any component that is different from the previously described in this invention. These are substances of inorganic or organic origin used in the production process, the manufacture of drugs to give them the necessary physico-chemical properties.
  • buffer means a solution capable of maintaining the pH value, due to the interaction of the acidic and alkaline components of its composition, which allows the preparation of antibodies to CD47 and PD-L1 to be resistant to changes pH
  • pH values of the pharmaceutical composition are from 4.0 to 8.0.
  • buffering agents for example, acetate, phosphate, citrate, histidine, succinate, etc. can be used. buffer solutions, but not limited to them.
  • tonic agent refers to an excipient that can bring the osmotic pressure of a liquid antibody preparation.
  • "Isotonic” drug is a drug that has an osmotic pressure equivalent to that of human blood. Isotonic preparations usually have an osmotic pressure of from about 250 to 350 mOsm / kg.
  • isotonic agents polyols, mono- and disahars, amino acids, metal salts, for example, sodium chloride, etc., can be used, but not limited to.
  • stabilizer an excipient or a mixture of two or more excipients that provide the physical and / or chemical stability of the active agent.
  • amino acids can be used, for example, arginine, histidine, glycine, lysine, glutamine, proline, but not limited to them; surfactants such as polysorbate 20 (trade name Tween 20), polysorbate 80 (trade name Tween 80), polyethylene-polypropylene glycol and its copolymers (trade names Poloxamer (Poloxaner), Pluronic (Pluronic)), sodium dodecyl sulfate (SDS ), but not limited to; antioxidants, for example, methionine, acetylcysteine, ascorbic acid, monothioglycerol, salts of sulfurous acids, etc., but not limited to; chelating agents, for example, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid
  • the pharmaceutical composition is “stable” if the active agent retains its physical stability and / or chemical stability and / or biological activity during the stated shelf life at storage temperature, for example, at 2-8 ° C.
  • the active agent maintains both physical and chemical stability, as well as biological activity.
  • the storage period is selected based on the results of stability studies for accelerated and natural storage.
  • the pharmaceutical composition according to this invention can be manufactured, packaged or widely sold in the form of a single unit dose or multiple unit unit doses in the form of a finished dosage form.
  • unit dosage unit means a discrete amount of a pharmaceutical composition containing a predetermined amount of active ingredient.
  • the amount of active ingredient is usually equal to the dosage of the active ingredient to be administered to the subject, or a convenient part of such a dosage, for example, half or one third of that dosage.
  • compositions of the present invention are generally suitable for parenteral administration in the form of sterile drugs intended for administration to the human body in violation of the integrity of the skin or mucous membranes, bypassing the gastrointestinal tract by injection, infusion or implantation.
  • parenteral administration includes, inter alia, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular, intravenous, intra-arterial, intrathecal, intraventricular, intraurethral, intracranial, intra-articular, transdermal injection or infusion and renal dialysis infusion techniques.
  • a regional perfusion is also provided.
  • Preferred embodiments of the invention include intravenous and subcutaneous routes. Any method of administering peptides or proteins adopted in the art may appropriately be used for the anti-CD47 and PD-L1 antibody of the invention.
  • Injection drugs can be manufactured, packaged or sold in standard dosage form, for example, in ampoules, vials, plastic containers, prefilled syringes, devices for autoinjection, but not limited to them.
  • Drugs for parenteral administration include, but are not limited to, suspensions, solutions, emulsions in oily or aqueous bases, pastes, and the like.
  • Another embodiment of the invention is a drug for parenteral administration, where the pharmaceutical composition is provided in a dry form, that is, a powder or granules to dissolve in a suitable solvent (for example, sterile, pyrogen-free water) before administration.
  • a suitable solvent for example, sterile, pyrogen-free water
  • Such a drug can be obtained, for example, by lyophilization, i.e. a process known in the art as drying from the frozen state, which includes freezing the preparation and then removing the solvent from the frozen contents.
  • Antibody to CD47 and PD-L1 according to this invention can also be administered intranasally or by inhalation, alone, as a mixture with a suitable pharmaceutically acceptable excipient from an inhaler, such as a pressurized aerosol container, pump, spray, spray or a nebulizer in which a suitable propellant is used or not, or in the form of nasal drops or spray.
  • an inhaler such as a pressurized aerosol container, pump, spray, spray or a nebulizer in which a suitable propellant is used or not, or in the form of nasal drops or spray.
  • Drug for parenteral administration may be immediate or modified release.
  • Modified release drugs include delayed, delayed, pulsating, controlled, targeted, and programmed release.
  • the anti-CD47 and PD-L1 antibody of the invention is used in the treatment of disorders that are mediated by CD47 and PD-L1, for example, a disease or disorder is selected from the group: HNS (squamous cell carcinoma of the head and neck), cervical cancer, cancer without identified primary source, glioblastoma, esophagus cancer, bladder cancer, TNRMZ (triple negative breast cancer), CRC (colorectal cancer), hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC (non-small cell lung cancer), kidney cancer, ovarian cancer, Hodgkin's lymphoma, MSI KR colorectal cancer with high mic osatellitnoy instability), leukemia (acute or chronic), non-Hodgkin's lymphoma, multiple myeloma, myelodysplastic syndrome.
  • HNS squamous cell carcinoma of the head and neck
  • cervical cancer cancer without identified primary source
  • glioblastoma eso
  • the treatment subject or patient is a mammal, preferably a human subject.
  • the above subject can be male or female and of any age.
  • a therapeutically effective amount of the antibody or antibody fragment may reduce the number of cancer cells; reduce initial size tumors; inhibit (i.e., slow down to some extent and, preferably, stop) the infiltration of peripheral organs by cancer cells; inhibit (ie, slow down to some extent and, preferably, stop) tumor metastasis; inhibit, to some extent, tumor growth; and / or relieve, to some extent, one or more of the symptoms associated with the disorder.
  • An antibody or antibody fragment may, to some extent, prevent growth and / or kill existing cancer cells, it may cause a cytostatic and / or cytotoxic effect.
  • in vivo efficacy can be determined, for example, by evaluating overall life expectancy (OS), time to disease progression (TTP), total tumor response rate to treatment (ORR), response time (DR) and / or quality of life.
  • co-administration refers to or include:
  • the anti-CD47 and PD-L1 antibody of the invention can be administered without additional therapeutic treatment, i.e. as an independent therapy.
  • treatment with an antibody of the invention may include at least one additional therapeutic treatment (combination therapy).
  • the anti-CD47 and PD-L1 antibody may be co-administered or formulated with another drug / drug for treating cancer.
  • cytotoxic agent refers to a substance that inhibits or prevents the functioning of cells and / or causes cell destruction.
  • the term is meant to include radioactive isotopes (for example, At 211 , 1 131 , 1 125 , Y 90 , Re 186 , Re 188 , Sm 153 , Bi 212 , P 32 and Lu radioactive isotopes), chemotherapeutic agents and toxins, such as low molecular weight toxins or enzymatically active toxins derived from bacteria, fungi, plants or animals, including fragments and / or variants thereof.
  • radioactive isotopes for example, At 211 , 1 131 , 1 125 , Y 90 , Re 186 , Re 188 , Sm 153 , Bi 212 , P 32 and Lu radioactive isotopes
  • chemotherapeutic agents and toxins such as low molecular weight toxins or enzymatically active toxins derived from bacteria, fungi,
  • chemotherapeutic agent is a chemical compound that is applicable to the treatment of a malignant tumor.
  • examples of chemotherapeutic agents include alkylating agents such as thiotepa and cyclophosphamide (CYTOXAN ®); alkyl sulfonates, such as busulfan, improsulfan and piposulfan; aziridines, such as benzodopa, carboquinone, meturedopa and uredope; ethyleneimines and methylmelamines, including altretamine, triethylenemelamine, triethylenephosphoramide, triethylenothiophosphoramide and trimethylmelamine; acetogenins (eg, bullatacin and bullatacinone); beta-lapachon; lapachol; colchicines; betulinic acid; camptothecin (including the synthetic analogue topotecan (HYCAMTIN ® ), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR ®
  • dinemicin including dinemycin A; esperacemic; and neocarcinostatin chromophore and related chromoprotein chromophores - enediyne antibiotics, aclacinomysins, actinomycin, authramycin, azaserine, bleomycins, cactinomycin, carabicin, carminomycin, carzinophilin, chromomycins, dactinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucine, doxorubicin (including ADRIAMICIN ®, morfolinodoksorubitsin, cyanomorpholinodoxor bicin, 2-pyrrolinodoxor bicin, doxorubicinONO in injectable lipysomes (DOXOL ® ), liposomal doxor
  • ALLOVECTIN ® vaccine, LEUVECTIN ® vaccine, and VAXID ® vaccine; topoisomerase 1 inhibitor for example, LURTOTECAN ® ); rmRH (for example, ABARELIX ® ); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-1 1248 (Pfizer); Perifosin, a COX-2 inhibitor (for example, celecoxib or etoricoxib), a proteosome inhibitor (for example, PS341); bortezomib (VELCADE ® ); CCI-779; tipifarnib (81 1577); Orafenib, ABT510; an inhibitor of Bc-2, such as oblimersen sodium (GENASENSE ® ); pixantron; EGFR inhibitors (see definition below); tyrosine kinase inhibitors (see definition below); and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above; and combinations of two or more of the above,
  • protivogormonalnye agents that act to regulate or inhibit hormone action on tumors such as anti-estrogens with mixed profile agonist / antagonist, including, tamoxifen (NOLVADEX ®), 4- hydroxytamoxifen, trioxifene, toremifene (FARESTON ®); idoxifene, droloxifene, raloxifene (EVISTA ® ), trioxifen, keoxifen, and selective estrogen receptor modulators (SERM), such as SERM3; pure anti-estrogens with no agonistic properties, such as fulvestrant (FASLODEX ® ) and EM800 (such agents can block estrogen receptor dimerization (ER), inhibit DNA binding, increase ER metabolism and / or reduce ER levels); aromatase inhibitors, including steroidal aromatase inhibitors such as formestane and exemestane (AROMASIN ®), and nonsteroidal aromatase
  • Other therapeutic agents that can be used in combination with antibodies against CD47 and PD-L1 according to the invention can be growth factor inhibitors, for example, such inhibitors include growth factor antibodies and growth factor receptor antibodies (for example, trastuzumab anti-EB2 antibody , anti-EGFR antibody panitumumab, anti-erbB l antibody cetuximab [Erbitux, C225] and any antibodies of growth factors or growth factor receptors disclosed by Stern et al., Critical reviews in oncology / haematology, 2005, Vol 54, ppl l -29 ); anti-angiogenic agents, such as the inhibitory effects of vascular endothelial growth factor, [eg, an antibody against growth factor vascular endothelial cells, Bevacizumab (Avastin)], antibodies against vascular endothelial growth factor receptors, such as anti-KDR antibodies and anti-fcl antibodies; antisense nucleotides, for example, directed to the above targets, such as ISIS 2503, anti-
  • immunotherapy approaches including, for example, treatment with Alemtuzumab (campath-lH), monoclonal antibody directed to CD52, or treatment with antibodies directed to CD22, ex vivo and in vivo approaches to increase the immunogenicity of the patient's tumor cells, transfection with cytokines, such as interleukin 2 , interleukin 4 or granulocyte macrophage colony-stimulating factor, approaches aimed at reducing T-cell anergy, such as treatment with monoclonal antibodies inhibiting CTLA-4 function, approaches using transfected immune cells x cells, such as cytokine-transfected dendritic cells, approaches using cytokine-transfected tumor cell lines and approaches using anti-idiotypic antibodies, adaptive transfer of T cells using T-cells subjected to nonspecific activation or targeted to a specific antigen representing interest, ex vivo; protein degradation inhibitors such as a proteasome inhibitor
  • the anti-CD47 and PD-L1 antibody of the invention will be administered in an amount effective to treat the condition in question, i.e. in doses and for periods of time necessary to achieve the desired result.
  • a therapeutically effective amount may vary in depending on factors such as the specific condition being treated, the age, sex and weight of the patient, and whether the administration of the antibody to CD47 and PD-L1 is a self-treatment or it is carried out in combination with one or more additional treatments.
  • Drug regimens can be adjusted to provide the optimum desired response. For example, a single bolus may be administered, several divided doses may be administered over time, or the dose may be proportionally reduced or increased, depending on the severity of the therapeutic situation. Particularly useful is the manufacture of parenteral compositions in a standard dosage form for ease of administration and uniformity of dosing.
  • the unit dosage form when used in this document, refers to physically discrete units suitable as unit doses for patients / subjects to be treated; each unit contains a given amount of active compound calculated to obtain the desired therapeutic effect in combination with the desired pharmaceutical carrier.
  • dosages and dosage regimens are adjusted in accordance with methods well known in the therapeutic field. This means that a maximum tolerated dose can be easily established and an effective amount can also be determined that provides a detectable therapeutic effect. effect for the patient, as well as the time requirements for the introduction of each agent to achieve a visible therapeutic effect for the patient.
  • a maximum tolerated dose can be easily established and an effective amount can also be determined that provides a detectable therapeutic effect. effect for the patient, as well as the time requirements for the introduction of each agent to achieve a visible therapeutic effect for the patient.
  • dosage values may vary, depending on the type and severity of the condition, which should be alleviated, and may include one or more doses.
  • the specific regimens should be adjusted over time according to the individual need and at the discretion of the medical professional who administers or controls the administration of the compositions, and that the concentration ranges given in this description are only as an example, and are not intended to limit the scope or practice of the claimed compositions.
  • the dosage regimen with the compositions of this invention may be based on various factors, including the type of disease, age, weight, sex, patient health status, severity of the condition, route of administration, and the specific antibody used for CD47 and PD-L1.
  • the dosing regimen can vary widely, but can be determined regularly using standard methods. For example, doses may be adjusted based on pharmacokinetic and pharmacodynamic parameters, which may include clinical effects, such as toxic effects or laboratory values. Thus, the present invention encompasses an individual dose increase, which is determined by a qualified technician. Determining the required dose and modes are well known in the relevant field of technology and will be clear to the person skilled in the art after becoming acquainted with the ideas disclosed in this document. Examples of suitable routes of administration are provided above.
  • a suitable dose of antibodies to CD47 and PD-L1 according to this invention will be in the range from 0.1-200 mg / kg, preferably 0.1-100 mg / kg, including about 0.5-50 mg / kg for example, about 1 to 20 mg / kg.
  • Antibody to CD47 and PD-L1 can be administered, for example, at a dose of at least 0.25 mg / kg, for example, at least 0.5 mg / kg, including at least 1 mg / kg, for example, at least 1.5 mg / kg, for example, as well as at least 2 mg / kg, for example, at least 3 mg / kg, including at least 4 mg / kg, for example, at least 5 mg / kg ; and for example, up to a maximum of 50 mg / kg, including up to a maximum of 30 mg / kg, for example, up to a maximum of 20 mg / kg, including up to a maximum of 15 mg / kg.
  • the introduction will usually be repeated at suitable intervals, for example, once a week, once every two weeks, once every three weeks or once every four weeks, and for as long as deemed appropriate by the responsible doctor, who may in some cases increase or reduce the dose if necessary.
  • the following embodiment of the invention is a product that contains products used to treat cancer, for example, PRGS, cervical cancer, cancer without an identified source, glioblastoma, esophageal cancer, bladder cancer, TNMP, CRC, hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC, cancer kidney, ovarian cancer, Hodgkin's lymphoma, MSI CRC, leukemia (acute or chronic), non-Hodgkin's lymphoma, multiple myeloma, myelodysplastic syndrome.
  • the product is a container and a label or leaflet insert in the package, which are placed on the container or enclosed in it. Suitable containers are, for example, cans, vials, syringes, etc.
  • Containers can be made from various materials, such as glass or plastic.
  • the container contains a composition that is effective for treatment of a particular condition, and may have a sterile inlet channel (for example, the container may be an intravenous solution bag or vial with a stopper that can be punctured with a hypodermic needle).
  • At least one active ingredient in the composition is an anti-PD-L1 antibody according to the invention.
  • the label or leaflet in the package indicates that the composition is used to treat a particular condition.
  • the label or package leaflet in the package should additionally contain instructions for administering the antibody composition to the patient.
  • the package leaflet contains the usual instructions that include commercially available packaging of therapeutic products, including approximate information about the indications, use, dose, route of administration, contraindications and / or precautions regarding the use of such therapeutic products.
  • the composition is used to treat cancer, for example, PRGS, cervical cancer, cancer without an identified source, glioblastoma, cancer of the esophagus, bladder cancer, TNMP, CRC, hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC, kidney cancer, ovarian cancer, Hodgkin's lymphoma, MSI CRC, leukemia (acute or chronic), non-Hodgkin's lymphoma, multiple myeloma, myelodysplastic syndrome.
  • cancer for example, PRGS, cervical cancer, cancer without an identified source, glioblastoma, cancer of the esophagus, bladder cancer, TNMP, CRC, hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC, kidney cancer, ovarian cancer
  • the product may further comprise a second container with a pharmaceutically acceptable buffer, such as bacteriostatic water for injection (BSVI), phosphate buffered saline, Ringer's solution and dextrose solution.
  • a pharmaceutically acceptable buffer such as bacteriostatic water for injection (BSVI), phosphate buffered saline, Ringer's solution and dextrose solution.
  • BSVI bacteriostatic water for injection
  • phosphate buffered saline such as phosphate buffered saline, Ringer's solution and dextrose solution.
  • it may include other products necessary from a commercial point of view and from a consumer point of view, for example, other buffers, diluents, filters, needles and syringes.
  • kits that can be used for various purposes, for example, for detecting PD-L1 in tissues, cells or body fluids of a mammal. Such a kit will be suitable for screening for PD-L1 associated diseases.
  • the kit includes a specific binding agent or antibody of the invention, and means indicating that the specific binding agent or antibody reacts with PD-L1, if present.
  • the antibody is a monoclonal antibody.
  • the antibody that binds PD-L1 is labeled.
  • the antibody is an unlabeled primary antibody, and the kit further includes means for detecting the primary antibody.
  • the detection means comprises a labeled second antibody, which is an anti-immunoglobulin.
  • kits may be a kit that contains antibodies for detecting and quantifying PD-L1 in vitro, for example, when performing an ELISA or Western blot.
  • the kit contains a container and a label or leaflet in the package located on the surface or inside the container.
  • the container contains a composition that includes at least one anti-PD-L1 antibody according to the invention. Additional containers may contain, for example, diluents and buffers, control antibodies.
  • the label or leaflet in the package may contain a description of the composition, as well as instructions for their use in vitro or for diagnostic purposes.
  • the CD47 and PD-L1 antibody of the present invention are also used in diagnostic processes (eg, in vitro, ex vivo).
  • anti-CD47 and PD-L1 antibody can be used to detect or measure the level of CD47 and / or PD-L1B samples obtained from a patient (for example, a tissue sample or a sample of body fluid, such as inflammatory exudate, blood, serum, intestinal fluid, saliva or urine).
  • a detection and measurement methods include immunological methods such as flow cytometry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), chemiluminescence analysis, radioimmunoassay and immunohistology.
  • the invention further includes kits (eg, diagnostic kits) containing antibodies to CD47 and PD-L1, as described herein.
  • Sequences of human extracellular domains of CD47 (Leul9-Vall34) and PD-L1 (Phel9-Arg238) (SEQ ID NO: 107-108) were cloned into a plasmid for producing protein in mammalian cells with the Fc tag (Fig. 1) at the Sall / restriction sites Notl. Plasmids were mined in necessary quantities in E.Coli cells and purified using the Qiagen kit. The sequences of the variable domains of antibodies to CD47 (B6H12, Stanford University, US20130142786) were cloned into plasmids for producing protein in the IgGl format in mammalian cells. Plasmids were mined in necessary quantities in E.Coli cells and purified using the Qiagen kit.
  • Antibodies and antigens were produced in cells of a permanent cell line derived from Chinese hamster ovary cells (CHO-T line). Suspension cultivation was carried out in flasks on an orbital shaker, using serum-free media manufactured by Life Technologies Corporation and according to the manufacturer's instructions. For transient expression, cells at a concentration of 2 * 10 6 / ml were transfected using linear polyethylenimine (for example, PEI MAX, Polysciences). The ratio of DNA / PAYS was 1: 3/1: 10. 5-7 days after transfection, the culture medium was centrifuged at 2000 g for 20 minutes and filtered through a 0.22 ⁇ m filter. Target proteins were isolated from the culture fluid using affinity chromatography.
  • linear polyethylenimine for example, PEI MAX, Polysciences
  • Fc recombinant proteins from the culture fluid were isolated and purified using Protein A affinity chromatography column.
  • the clarified culture fluid was passed through a 5 ml HiTrap rProtein A Sepharose FF column (GE Healthcare) balanced with phosphate-buffered saline (PBS, pH 7, four).
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the column was then washed with 5 column volumes of PBS to wash the non-specific binding components.
  • the bound antigen was eluted using 0.1 M glycine buffer pH 3.
  • the main protein elution peak was collected and its pH was adjusted to neutral with 1 M Tris buffer (pH 8). All stages were carried out at a flow rate of software cm / h.
  • the protein was converted to PBS (pH 7.4) using dialysis using Snake Skin Dialysis Tubing technology, filtered (0.22 ⁇ m), transferred to tubes and stored at -70 ° C.
  • the purity of the resulting protein solution was assessed by SDS-gel electrophoresis in 12% PAAG under non-reducing conditions of FIG. 2.
  • RNA of B-lymphocytes from individual blood samples of more than a thousand human donors were isolated using the RNeasy Mini Kit according to the proposed protocol (from QIAGEN). The RNA concentration was determined using a Nanovue kit (from GE Healthcare) and the quality of the isolated RNA was checked by electrophoresis on a 1.5% agarose gel.
  • the reverse transcription reaction was performed using the MMLV RT kit (from Evrogen) according to the recommended protocol using MMuLV reverse transcriptase and random hexameric oligonucleotides as a primer.
  • the products of reverse transcription were used as a template in a two-step polymerase chain reaction to obtain the variable domain genes flanked by restriction sites using a set of oligonucleotides according to the protocols of the authors [J Biol Chem. 1999 Jun 25; 274 (26): 18218-30].
  • the obtained DNA preparation VL-CK-VH (was treated with NheI / Eco91I restriction endonucleases and ligated into the original phagemid pH5.
  • the ligation products were transformed into electrocompetent cells of E.Coli strain SS320, prepared according to protocols [Methods Enzymol. 2000; 328: 333-63.]
  • the repertoire of the combinatorial phage Fab display library of MeganLibTM was 10 11 transformants.
  • Preparations of phage Fab libraries were prepared according to the procedure described previously [J Mol Biol. 1991 Dec 5; 222 (3): 581-97].
  • Lama immunization of CD47 with human antigen and the creation of a phage display library of fragments of llama antibodies Lama immunization of CD47 with human antigen and the creation of a phage display library of fragments of llama antibodies.
  • the animal Lama Glama was sequentially immunized 5 times by subcutaneous administration of antigenic material mixed with an equal volume of complete (with the first injection) or incomplete (with the remaining injections) Freund's adjuvant.
  • antigen recombinant human CD47 protein was used, described in Example 1, 1 mg per injection.
  • Antigen injections were performed on the following dates: 0, 2, 4, 5, 8 weeks.
  • Blood sampling 50 ml was performed 5 days after each injection, starting with the third.
  • As an anticoagulant 3.8% sodium citrate was used in a 1: 9 ratio.
  • the selected blood llamas were diluted 2 times with sterile saline.
  • Lymphoprep TM medium (Axis-Shield, Norway) with a density of 1,077 g / ml with a volume of 15 ml and centrifuged for 20 minutes at 800 g.
  • Mononuclear cells (lymphocytes and monocytes) were selected from interphase Lymphoprep plasma / medium zones, then washed with sterile PBS.
  • the obtained titer of serum immunoglobulin against CD47 evaluated according to the standard protocol, turned out to be at least 1/100000, which is sufficient for preparing a library of antibodies.
  • RNA of monomer llama cells was isolated using the RNeasy Mini Kit according to the proposed protocol (QIAGEN). The concentration of RNA was determined using Nanovue (GE Healthcare) and the quality of the isolated RNA was checked by electrophoresis on a 1.5% agarose gel.
  • the reverse transcription reaction was performed using the MMLV RT kit (from Evrogen) according to the recommended protocol using MMuLV reverse transcriptase and random hexameric oligonucleotides as primers.
  • Reverse transcription products were used as a template in a two-step polymerase chain reaction to produce VHH, scFv or Fab monodomain genes flanked by restriction sites, using a set of oligonucleotides and the protocols of the authors [FASEB J. 2007 Nov; 21 (13): 3490-8].
  • the obtained DNA preparation of the VHH genes was treated with Ncol / Notl restrictases and ligated into the original pscFv phagemid, similar in all the pHEN2 elements used in [FASEB J. 2007 Nov; 21 (13): 3490-8].
  • the ligation products were transformed into electrocompetent cells of strain SS320, obtained according to protocols [Methods Enzymol. 2000; 328: 333-63.].
  • the repertoires of libraries based on VHH were 0.5-2 * 10E + 8 independent transformants.
  • the repertoires of libraries based on scFv and Fab were 0.5-2 * 10E + 9 and 1, 2-2.5 * 10E + 9, respectively.
  • the library phage preparation was prepared according to the procedure previously described [J Mol Biol. 1991 Dec 5; 222 (3): 581-97].
  • phage antibodies against CD47 were obtained from phage Fab, VHH or scFv display libraries (Example 3, 4) by standard selection procedures described previously [EMBO J. 1994 Jul 15; 13 (14): 3245-60, Nat Biotechnol. 1996 Mar; 14 (3): 309-14; J Mol Biol.1991 Dec 5; 222 (3): 581-97], but using magnetic particles and the KingFisher Flex instrument, since the use of this technique allows to carry out up to 96 different schemes and variants in parallel.
  • Human biotinylated antigen PD-L1 and CD47 were directionally immobilized on the surface of streptavidin magnetic particles (streptavidin magnetic beads, NEB) at a concentration of 10 ⁇ g / ml for the first round, 2 ⁇ g / ml for the second, 0.4 and 0, 2 ⁇ g / ml for the third and fourth, respectively.
  • streptavidin magnetic particles streptavidin magnetic beads, NEB
  • the antigen was incubated with particles for 1 hour at room temperature on a rotator. Next, the particles were washed with PBS (pH 7.4) and blocked the surface of the particles with a solution of 2% skimmed milk or 1% BSA on PBS (pH 7.4) for 1 hour.
  • the human phage library MeganLibTM was diluted at a concentration of 2 * 10 13 phage particles per ml in PBS (pH 7.4) with 2% skimmed milk and a untargeted antigen with the target antigen tag and preselected with magnetic particles that do not contain antigen on the surface, to remove nonspecifically binding phages.
  • the 1B-5Ka-coated magnetic particles were then incubated with MeganLibTM for 1 -2 hours at room temperature.
  • Unbound phages were removed during several washes of magnetic particles with an FSB solution (pH 7.4) with 0.1% Tween 20. The number of washes was increased from round to round (in the 1st round, 3 washes, in the 2nd - 9 and 3rd - 12, on the 4th-15). The phages bound to the antigen on the surface of the magnetic particles were eluted from the particles with 100 mM Gly-HCl solution (pH 2.2) for 15 min while stirring, and the solution was neutralized with 1M TRIS-HCl (pH 7.6). Bacteria of E. coli TG1 strain were infected with phages and accumulated in culture, after which they were isolated and used in the next round of selection.
  • phagemid DNA was isolated from E. coli TGI culture according to the manufacturer’s standard protocol (Qiagen). Library enrichment for target antigens and assessment of the presence of non-specifically binding phage particles was performed using enzyme immunoassay of polyclonal phage (ELISA).
  • ELISA enzyme immunoassay of polyclonal phage
  • the target antigen CD47 and PD-L1
  • the untargeted with Fc-fusion protein
  • Protein was added at a concentration of 1 and 5 ⁇ g / ml, respectively, in 0.1 M NaHCC (pH 9.0) and titrated in increments of 2 to 7 dilutions, after which the hermetically sealed plates were incubated overnight at + 4 ° C. All subsequent steps were carried out according to the standard ELISA protocol using a high-performance automated platform based on the Tecan Freedom EVO 200 robotic system (from Tesap).
  • blocking buffer 2% skimmed milk or 1% BSA on PBS pH 7.4 was added to the wells of the plates. The plates were incubated for one hour at room temperature. After washing with phosphate-saline buffer containing tween-20 (PBS), 50 ⁇ l per well of the tested polyclonal phage was added. After washing, anti-M13 HRP-conjugated secondary antibody (from Pierce-ThermoScientific) was added (50 ⁇ l / well) in a ratio of 1: 7500 V FSTB. After incubation for 50 minutes at room temperature, the plates were washed with FSTB three times.
  • the colorimetric signal was developed by adding a substrate solution (H 2 O 2 -0.02% and TMB in CH5 CO 2 and pH 5.5) for 10 minutes, then the reaction was stopped by adding 1% sulfuric acid (20 ⁇ l). The color signal was measured at a wavelength of 450 nm using a suitable Tecan-Sunrise plate reader (from Tezap).
  • Reklonirovanie genes of the variable domains of antibodies in the expression plasmid from the phagemid vector after successful rounds of selection was carried out according to a standard protocol using the restriction ligase method.
  • the resulting pool of clones enriched with VHH monodomains or scFv specific against CD47 was recloned into the expression plasmid pET-22 (Novagen) under the control of the T7 promoter, which additionally contained myc-tag and His6 tag sequences at the C-terminus of VHH.
  • Fab fragment genes for libraries containing enriched sequences against the CD47 antigen were recloned into the pLL4 expression vector, under the control of the lac promoter, and additionally containing myc-tag and His6 tag sequences at the C-terminus of the CH1 domain of the heavy chain.
  • expression vectors containing antibody fragments were transformed into E. coli B121 (DE3) Gold (Stratagene) strain to produce antibody fragments by secretion into the culture medium and comparative analysis of the affinity of variable antibody fragments from display libraries to the antigen by ELISA using the Mabnext Flow Chart technology platform.
  • ELISA ELISA
  • ELISA ELISA
  • Nunc ImmimoMaxisorp 50 ⁇ l (0.5 ⁇ g / ml in IX carbonate buffer) of human CD47-Fc (Biocad), sealed and incubated overnight at 4 ° C. All subsequent steps were carried out using a standard ELISA protocol using a high-performance automated platform based on the GenetixQ-pix2xt robotic systems (from Molecular Device) and Tecan Freedom EVO 200 (from Tecan).
  • blocking buffer IV was added (200 ⁇ l of 0.5% non-fat milk in PBS).
  • the plates were incubated on a shaker for one hour at room temperature. After washing with PBS-Tween, 100 ⁇ l per well of the tested cell supernatant containing the antibody fragment under study was added. The plates were again incubated by shaking for one hour at room temperature, after which each well of the plates was washed five times with PBS-Tween buffer. After washing, mouse (50 ⁇ l / well) mouse anti-MYC IgG clone 9E10 (ThermoFisher Scientific) was added in a ratio of 1: 5000 in PBS-Tween. The plates were shaken on a rotary shaker (50 minutes, room temperature) and washed five times with PBS-Tween buffer, as described above.
  • an anti-mouse IgG conjugate (ThermoFisher Scientific) at a ratio of 1: 10,000 in PBS-Tween.
  • the plates were shaken on a rotary shaker (50 minutes, room temperature) and washed five times with PBS-Tween buffer, as described above.
  • the colorimetric signal was developed by adding TMB (50 ⁇ l / well) to saturation (10–12 min on average), then further development was stopped by adding a stop solution (25 ⁇ l / well, 1% sulfuric acid).
  • the color signal was measured at a wavelength of 450 nm using a suitable Tecan-Sunrise reader card (from Tesap). The degree of antibody binding was proportional to the color signal production.
  • VHH monodomain clones of different sequence more than 1 amino acid were obtained, but having more than 90% homology of each of the CDR regions with each other, which indicates their origin from one parent clone by in vivo maturation in an immunized llama ( Table!).
  • Table 1 Sequences of specific CD47 VHH-binding monodomains with human CD47.
  • Fab production was carried out according to a standard procedure: bacterial cells were transformed with expression vectors containing Fab genes, and the subsequent addition of an inducer that triggers transcription lac-operon, on Wednesday when cultivating the obtained transformants, causes expression of Fab.
  • B6H12 Fab was used with the published sequence (see Example 1).
  • wells of ELISA plates high binding from Greiner bio one
  • 50 ⁇ l of CD47 Fc lama 0.2 ⁇ g / ml in 1 carbonate buffer
  • All subsequent steps were carried out according to the standard ELISA protocol using a high-performance automated platform based on the Genetix Qpix2xt robotic systems (from Molecular Device) and Tecan Freedom EVO 200 (from Tecan).
  • blocking buffer IV was added (200 ⁇ L of 0.5% non-fat milk in PBS). The plates were incubated for one hour at room temperature.
  • the colorimetric signal was developed by adding TMB (50 ⁇ l / well) to saturation (15 min), then further development was stopped by adding a stop solution (25 ⁇ l / well, 1% sulfuric acid). The color signal was measured at a wavelength of 450 nm using a suitable tablet-Tecan-Sunrise reader (from Tecan). The degree of antibody binding was proportional to the color signal production. Clones whose color signal exceeded the signal from the control antibody were tested in ELISA for non-specific binding.
  • the purpose of secondary screening is to select Fab-producing clones that interact with the full-length CD47 antigen and do not interact with non-specific antigens, and also compete with the ligand (CD47) for binding to SIRPa.
  • ELISA was used to analyze the nonspecific binding of the studied Fab fragments with other antigens. The study was carried out as described above, but 3DHer3-H6E, INFa2b, PD-Ll-Fc-lama (2.5 ⁇ g / ml in 1 * carbonate buffer) was used as immobilization antigens. CD47 FE and CD47 Fc lama (0.2 ⁇ g / ml in 1 * carbonate buffer) were used as a control for specific binding. All subsequent steps were carried out according to the standard ELISA protocol using a high-performance automated platform based on the Genetix Qpix2xt robotic systems (from Molecular Device) and Tecan Freedom EVO 200 (from Tecan).
  • ELISA Competitive ELISA
  • SIRPa was immobilized in wells of ELISA plates (high binding from Greiner bio one) at 50 ⁇ l with a concentration of 0.5 ⁇ g / ml in 1 carbonate buffer and incubated overnight at 4 ° C. All subsequent steps were carried out using standard ELISA protocols using a high-performance automated platform based on the Genetix Qpix2xt robotic systems (from Molecular Device) and Tecan Freedom EVO 200 (from Tecan). To block non-specific binding, blocking buffer was added by BB (200 ⁇ l of 0.5% nonfat milk in PBS). The plates were incubated for one hour at room temperature.
  • non-sorbent plates were mixed in a 1: 1 ratio of cell supernatant containing test Fab and CD47 Fc lama (at a final concentration of 1 ⁇ g / ml in PBS-Tween), incubated for 45 minutes at room temperature.
  • the colorimetric signal was developed by adding TMB (50 ⁇ l / well) to saturation (average 15 min), then further development was stopped by adding a stop solution (25 ⁇ l / well, 1% sulfuric acid).
  • the color signal was measured at a wavelength of 450 nm using a suitable Tecan-Sunrise reader card (from Tesap).
  • Tesap Tecan-Sunrise reader card
  • the degree of Fab binding was inversely proportional to the color signal production.
  • the clones that showed blocking at the level of the control Fab antibody were noted as positive and used in further analyzes.
  • the genes of the variable domains of positive clones were sequenced according to standard protocols on an Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) and analyzed.
  • VHH antibody fragments As an example of analyzing the kinetic parameters of the interaction of antibody fragments that specifically bind to the CD47 receptor, measured the VHH antibody fragments.
  • a comparative screening of the dissociation constant (k d i S ) for VHH fragments was performed using an Octet Red 96 instrument and ARG2 amino-reactive biosensors (Pall-ForteBio). Affinity constants can be calculated by knowing the exact protein concentration in the analyzed solution and, since cell growth media and protein concentrations were not measured as a solution of proteins, the candidates were compared with each other by their dissociation constant. Biosensors were rehydrated in advance for an hour in water.
  • the long scFv genes have been developed from the VH and VL genes of two-step PCR synthesis from single-stranded DNA molecules. After PCR synthesis, fractionated on agarose gel DNA fragments were purified on QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) columns. The scFv and VHH genes were individually ligated into the pEE-Fc plasmid, while the variable heavy chain domain of the specific aPD-Ll antibody was pEE-Fc. (hole) plasmid.
  • pEE-Fc (knob) contains human IgGl Fc with mutations S354C + T366W and pEE-Fc (hole) contains human IgGl Fc with mutations Y349C + T366S + L368A, providing heterodimerization of these Fc parts with each other, with a minimal degree of homodimerization [ Nat Biotechnol. 1998 Jul; 16 (7): 677-81.] With co-transient expression in CHO-EBNA cells with the aPD-Ll light chain variable domain, similarly cloned into pEE-Clambda.
  • FIG. 7 shows examples of purified bispecific antibodies based on anti-CD47 scFv fragments.
  • FIG. 8 shows examples of purified anti-CD47 VHH based bispecific antibodies. fragments.
  • An antibody variant containing the VHH470pt3 sequence specified in Table 3 gave an extremely low antibody yield and was excluded from further analyzes.
  • Antibodies at a concentration of 30 ⁇ g / ml were immobilized on the surface of Anti-hlgG Fc Capture (ANS) sensors (Forte Bio). The analysis was carried out at 30 ° C using PBS containing 0.1% Tween-20 and 0.1% BSA as a working buffer. After the baseline was prescribed in the buffer solution, the sensors were immersed in the wells with a solution of non-specific antigens for 300 seconds, where the complex was associated. Then the dissociation of the complex in the buffer solution was detected for 600 seconds.
  • ANS Anti-hlgG Fc Capture
  • Biotinylated Fc-binding proteins FcyRIIIa-F158 and FcyRIIIa-VI 58 with Avi-tag at a concentration of 5 ⁇ g / ml in FSB kinetic buffer containing 0.1% Tween-20 and 0.1% BSA pH 7.4 were immobilized on the surface of streptavidin (SAX) sensors, with fixing tR eC Load - the time to reach the signal level of 0.4 nm. After the baseline was set in the buffer solution, the sensors were immersed in the wells with an antibody solution for 60 seconds, where the complex was associated. Then the dissociation of the complex in the buffer solution was detected for 150 seconds.
  • SAX streptavidin
  • binding curves with the reference signal subtraction were analyzed using Octet Data Analysis (version 9.0) using the standard procedure using the 2: 1 Global interaction model.
  • anti-PD-Ll / anti-CD47 bispecific antibodies specifically bind to the Fc-binding proteins FcyRIIIa-F158 and FcyRIIIa-V158.
  • Table 7 (- and Table 8.
  • Biotinylated FcRn with Avi-tag at a concentration of 5 ⁇ g / ml in FSB kinetic buffer containing 0.1% Tween-20 pH 6 were immobilized on the surface of streptavidin (SAX) sensors, with fixation tR eC Load - the time to reach a signal level equal to 0.4 nm. After the baseline was prescribed in the buffer solution, the sensors were immersed in wells with a solution of antibodies in FSB kinetic buffer containing 0.1% Tween-20 pH 6 for 60 seconds, where the complex was associated. Then, the dissociation of the complex was detected in FSB kinetic buffer containing 0.1% Tween-20 and 0.1% BSA pH 7.4 for 150 seconds.
  • SAX streptavidin
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity - antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • MDA-MB-231 cell line expressing PD-L1 and CD47 receptors on its surface and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were used.
  • PBMCs were obtained by fractionating venous blood cells of healthy donors in a density gradient. After isolation, cells were cultured in RPMI-1640 medium with 10% FBS at a concentration of 2-5 x 10 6 cells / ml for 18-24 hours at 37 ° C with 5% C0 2 .
  • MDA-MB-231 cells were cultured in DMEM with 10% FBS (fetal bovine serum) at 37 ° C with 5% C0 2 . Cells were removed from the surface of the plastic using trypsin, resuspendable in DMEM with 10% FBS. Calcein AM was added to a concentration of 5 ⁇ M. After 30 minutes, the cells were washed twice from excess Calcein AM with DMEM with 10% FBS. In DMEM with 10% FBS, a suspension of target cells with a concentration of 10 5 cells / ml was prepared. Preparation of dilutions of the studied antibodies
  • All tested antibodies were diluted with DMEM with 10% FBS to a concentration of 10 ⁇ g / ml. Prepared a series of serial dilutions in increments of 5. The concentrations of the antibodies tested were (ng / ml): 10,000; 2000; 400; 80; sixteen; 3.2; 0.64; 0.128; 0.0256; 0
  • Mononuclear lymphocytes were collected from vials. Centrifuged at 200 xg for 5 minutes. In DMEM with 10% FBS, a suspension of cells with a concentration of 5 x 10 6 cells / ml was prepared.
  • 50 ⁇ l / well of the test antibodies were added to the wells of a 96-well plate. 100 ⁇ l of the target cell suspension was added to the wells with antibodies. Incubated the plate at 37 ° C with 5% C0 2 for 15–20 minutes. Added to the wells with antibodies and target cells, 50 ⁇ l of the suspension RVMS. Three wells (control of maximum lysysis — KL) were poured in 50 ⁇ l of DMEM medium with 10% FBS, 100 ⁇ l of target cell suspension and 50 ⁇ l of PBMC suspension. Incubated the plate at 37 ° C with 5% C0 2 3.5-4 hours. 30 minutes before the end of the incubation, lysis buffer was added to the KL wells.
  • ADCP Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis - antibody-dependent cell phagocytosis
  • MDA-MB-231 cell line which has PD-L1 and CD47 receptors on its surface, and human macrophage cells were used.
  • PBMCs Peripheral blood mononuclear cells
  • PBMCs Peripheral blood mononuclear cells
  • the medium was changed to a new 700 ⁇ l RPMI-1640 with 10% FBS, 100 ng / ml GM-CSF (Peprotech), 50 ng / ml IFNy (Peprotech) and 10 ng / ml LPS (Sigma) per well, cells were cultured at 37 ° C with 5% C0 2 for another 3 days.
  • MDA-MB-231 cells were cultured in DMEM with 10% FBS (fetal bovine serum) at 37 ° C with 5% C0 2 . Cells were removed from the surface of the plastic using trypsin and suspended in DMEM with 10% FBS. Calcein AM was added to a concentration of 5 ⁇ M. After 30 minutes, the cells were washed twice from excess Calcein AM with DMEM with 10% FBS. In DMEM with 10% FBS, a suspension of target cells with a concentration of 10 5 cells / ml was prepared.
  • FBS fetal bovine serum
  • the medium was removed from the wells of the macrophages plate, 500 ⁇ l of RPMI-1640 medium with 10% FBS and 20 ⁇ g / ml of the studied antibodies were added to the wells. 500 ⁇ l of the target cell suspension was added to the wells. Incubated the plate at 37 ° C with 5% C0 2 for 3 hours. After the medium was taken, the cells were removed from the surface of the plastic using TrypLE Express reagent, the cells were stained with fluorescently labeled antibodies against CD14. The suspension of stained cells was analyzed on a flow cytometer.
  • Phagocytosis% x 100%
  • CD14 + - the number of all CD 14 -positive cells The results are presented in FIG. eleven.
  • a number of antibodies against CD47 / PD-L1 have the efficiency of stimulating the phagocytosis of human MDA-MB-231 cell lines by human macrophages, comparable to the effectiveness of the control reproduced B6H12 monospecific antibody against CD47.
  • Human erythrocytes were used to analyze the ability of antibodies to cause hemagglutination.
  • Blood was taken from a vein of a healthy donor to a vacuum tube with heparin. Transfer 9 ml of blood to a 50 ml centrifuge tube. Blood was diluted to 30 ml with a solution of DPBS without Ca2 + and Mg2 + at room temperature. The suspension was centrifuged at 800g for 10 minutes, the supernatant was decanted. The cell washing procedure was repeated twice with DPBS without Ca2 + and Mg2 + and centrifuged. Then, 300 ⁇ l of the cell pellet was resuspended in 30 ml of DPBS, resulting in a 1% erythrocyte suspension.
  • Test antibodies were diluted in DPBS to a concentration of 20 ⁇ g / ml. In a 96 well round bottom plate, 100 ⁇ l of antibody dilutions and erythrocyte suspensions were mixed. Incubated the plate in a C 02 incubator for 16 hours at 37 ° C. The results were recorded visually on a conventional scale of 4 crosses. Significantly positive is the result of 2 crosses and above. The results are presented in Table 10. Table 10. The reaction of hemagglutination in the presence of antibodies against CD47 / PD-L1. Symbol - indicates the absence of agglutination.
  • the MDA-MB-231 line which has PD-L1 and CD47 receptors on its surface, was used as target cells.
  • the MDA-MB-231 culture was cultured in DMEM culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS).
  • FBS fetal bovine serum
  • Cells were removed from the surface of the plastic using trypsin and suspended in DMEM with 0.1% BSA at a concentration of 10 6 cells / ml.
  • All aHTH-CD47 / PD-Ll antibodies tested were diluted with DMEM with 0.1% BSA to a concentration of 100 ⁇ g / ml. Prepared a series of serial dilutions in increments of 8. Concentrations of the antibodies tested were (ng / ml): 100,000; 12,500; 1562.5; 195.3; 24.4; 3.05; 0.38; 0.04; 0,005.
  • the human complement was thawed and diluted 1: 4 in DMEM with 0.1% BSA.
  • test antibodies 50 ⁇ l of each dilution of the test antibodies were added to the wells of a 96-well plate, 50 ⁇ l of medium supplemented with 0.1% BSA for each antibody sample — cell control, 150 ⁇ l of DMEM medium with 0.1% BSA — medium control.
  • the antibodies tested do not induce complement-mediated lysis (CDC) of the MDA-MB-231 cell line.
  • the MDA-MB-231 culture was cultured in DMEM culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). Cells were removed from the surface of the plastic using trypsin and suspended at a concentration of 1 * 10 5 cells / ml in DMEM with 10% FBS and 20 ng / ml of interferon gamma. Then it was added 200 l of cell suspension into wells of a white 96-well plate and incubated 48h in C0 2 incubator at 37 ° C, 5% C0 2.
  • FBS fetal bovine serum
  • All the tested aHTH-CD47 / PD-Ll antibodies were diluted with RPMI-1640 medium with 10% FBS to a concentration of 5 ⁇ g / ml. Prepared a series of serial dilutions in increments of 3. Concentrations of the tested antibodies were (ng / ml): 2500; 833.3; 277.7; 92.5; 30.8; 10.2; 3.4; 1.1.
  • Growth medium was removed from the MDA-MB-231 cell plate.
  • wells of the cells made 40 ⁇ l of antibody dilutions.
  • 40 ⁇ l of RPMI 1640 medium were added with 10% FBS. Incubated at room temperature for 30 minutes.
  • the anti-PD-Ll / anti-CD47 bispecific antibodies studied, as well as the control anti-PD-Ll monospecific antibody are antagonists of the PD-L1-dependent signaling pathway and, therefore, can stimulate T-cell dependent cytotoxicity with respect to cells bearing the PD-L1 receptor.
  • FIG. 17 shows the HPLC profile of the preparation BCD106-02-013, based on VHH470pt2 (see Example 12). According to the results of this test, we can conclude that the molecule BCD106-02-013 gives the drug a homogeneous 93% monomer in terms of aggregation composition and is applicable for subsequent tests in vitro and in vivo.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Реферат Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, а также их применению. Более конкретно, настоящее изобретение относится к антителам, которые специфически связываются с CD47 и PD-L1. Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей данное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вектору экспрессии, способу получения антитела и к применению указанных антител и композиций в терапии рака.

Description

АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К CD47 и PD-L1
Область техники
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, а также их применению. Более конкретно, настоящее изобретение относится к антителам, которые специфически связываются с CD47 и PD-L1. Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей данное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вектору экспрессии, способу получения антитела и к применению указанных антител и композиций в терапии рака.
Уровень техники
Обеспечение двух отдельных сигналов к Т-клеткам представляет собой широко распространенную модель лимфоцитарной активации оставшихся Т- лимфоцитов антиген-презентирующими клетками (АРС). Данная модель полностью обеспечивает распознование своих и чужих, и иммунную толерантность. Первичный сигнал или антиген-специфичный сигнал передается через Т-клеточный рецептор (TCR) после распознавания чужеродного антигенного пептида, презентированного в контексте главного комплекса гистосовместимости (МНС). Второй или ко-стимулирующий сигнал доставляется Т-клеткам с помощью ко-стимулирующих молекул, экспрессированных на антиген-презентирующих клетках (АРС), и индуцирует Т-клетки для стимулирования клональной экспансии, секреции цитокинов и эффекторной функции. При отсутствии ко-стимуляции Т-клетки могут стать невосприимчивыми к антигенной стимуляции, они вызывают эффективный иммуный ответ, и далее это может приводить к истощению или устойчивости к чужеродным антигенам. В двухсигнальной модели Т-клетки получают оба сигнала: как положительный, так и отрицательный вторичный ко-стимулирующий сигнал. Регуляция таких положительных и отрицательных сигналов явлется критической для максимизации защитной иммуной реакции хозяина, с поддержанием при этом иммуной устойчивости и предотвращением аутоиммунитета. Отрицательные вторичные сигналы, по-видимому, необходимы для индукции Т-клеточной устойчивости, в то время как положительные сигналы стимулируют Т-клеточную активацию. В то время как простая двухсигнальная модель всё ещё обеспечивает достоверное объяснение для наивных лимфоцитов, при этом иммунная реакция представляет собой динамичный процесс, и ко -стимулирующие сигналы к антиген-экспанированным Т-клеткам также могу обеспечиваться. Механизм ко-стимуляции представляет интерес с терапевтической точки зренрия, так как было показано, что манипуляции с ко-стимулирующими сигналами обеспечивают средства либо усиления, либо терминации иммуного ответа. Недавно было обнаружено, что Т-клеточная дисфункция или анергия проявляется одновременно с индуцированной и стойкой экспрессией ингибирующего рецептора, полипептида 1 программируемой клеточной смерти (PD-1). В результате терапевтическая направленность PD-1 и других молекул, которые передают сигнал через взаимодействие с PD-1, таких как лиганд 1 программируемой смерти (PD-L1) и лиганд 2 программируемой смерти (PD-L2), является областью интенсивного интереса.
PD-L1 сверхэкспрессируется при множестве злокачественных новообразований и часто ассоциирован с неблагоприятным прогнозом. Интересно, что большинство опухолевых инфильтрующих Т-лимфоцитов с преобладанием экпрессируют PD-1, в отличие от Т-лимфоцитов в нормальных тканях и Т-лимфоцитов переферической крови, что выявляет положительную регуляцию PD-1 в отношении опухоль -реактивных Т-клеток и может способствовать пониженному иммунному ответу. Это может быть связано с применением сигнального пути PD-L1, опосредованного опухолевыми клетками, экспрессирующими PD-L1, и взаимодействующими с Т-клетками, экспрессирующими PD-1, с итоговым ослаблением Т-клеточной активации и уклонением от иммунного надзора. Таким образом, ингибирование PD-L1/PD- 1 может усиливать CD8+ Т-клеточноопосредованное уничтожение опухолей.
Терапевтическая направленность PD-1 и других молекул, которые передают сигнал через взаимодействие с PD-1 , таких как PD-L1 и PD-L2, является областью интенсивного интереса. Ингибировать сигналы PD-L1 предлагалось в качестве средств для усиления Т -клеточного иммунитета (например, противоопухолевого иммунитета) для личения злокачественного новообразования и инфекции, включая как острую, так и хроническую инфекцию. Ингибиторы, блокирующие взаимодействие PD-L1 и PD-1, известны, помимо прочих источников, из документов W02001014557, W02002086083, W02007005874, W02010036959, W02010077634 и WO2011066389. Однако оптимального терапевтического средства, направленного на мишень по данному пути, ещё не коммерциализовали, и в этом заключается значительная нереализованная потребность медицины.
CD47 представляет собой гликопротеин клеточной поверхности, который связывается с SIRPa (иначе называемым как SHPS-1) и SIRPy на соответствующих клетках. Это взаимодействие приводит к негативной регуляции функции иммунных клеток или может опосредовать клеточную адгезию и миграцию. Было предложено применение CD47 в качестве биологического препарата при лечении аутоиммунных нарушений (WO 1999/040940). В отличие от этого, имеется очень мало данных о возможном применении лигандов CD47, таких как SIRPa для аналогичных терапевтических целей. Одно из объяснений заключается в том, что имеет место повсеместная экспрессия CD47, которая может препятствовать применению связывающих CD47 полипептидов в качестве потенциальных лекарственных средств. Данные, опубликованные Yu с соавторами (J Invest Dermatol, 126, 2006, сс. 797-807) позволяют предположить, что слитый белок, состоящий из внеклеточных доменов SIRPa, слитых с Fc-доменом иммуноглобулина, может препятствовать миграции образовавшихся дентритных клеток (DC) из кожи в дренирующие лимфатические узлы у мышей и тем самым ослаблять (по меньшей мере частично) контактную гиперчувствительную реакцию (ответ) у мышей. Миграция и функции DC являются важными для иммуных или воспалительных ответов. В болезненом состоянии эти обостренные ответы DC могут приводить к поддержанию заболевания. Воздействие на миграцию патогенных DC из ткани в лимфоидные органы может является привлекательной возможностью для прекращения порочного цикла стимуляци аутоиммуных или воспалительных заболеваний.
CD47, также известен как интегрин-ассоциированный белок (IAP), антиген ОАЗ рака яичников, Rh-ассоциированный антиген и MER6, представляет собой трансмембранный рецептор, несколько раз пронизывающий мембрану, и принадлежащий к суперсемейству иммуноглобулинов. Экспрессия и/или активность CD47 наблюдаются в ряде заболеваний и нарушений. Таким образом, существует потребность в терапиях, которые направленно воздействуют на CD47. Кроме того, по причине экспрессии CD47 на тромбоцитах, также существует потребность в терапиях, направленно воздействующих на CD47 (например, антителах), которые не вызывают значительных уровней истощения тромбоцитов, гемагглютинации, истощения красных телец и/или анемии при введении субъекту.
Известные антетела ингибирующие взаимодействие между CD47 и лигандом SIRPa описаны в следующих источниках: заявки WO2014123580, WO2013119714, WO2015191861, WO2011143624, WO/2014/093678, WO2017053423.
Также известны различные источники, описывающие мультиспецифические антитела, например, WO/2014/087248 описано биспецифическое антитело, которое специфично к CD47 и CD19, а в WO2016023001 описано биспецифическое антитело, которое специфично к CD47 и PD1. Однако ранее не было описано возможности создания и эффективного использования мультиспецифического антитела, которое специфически связвается с CD47 и PD-L1.
В связи с вышесказанным, актуальным является создание новых антител, которые эффективно связываются с CD47 и PD-L1.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к связывающим молекулам, например, антителам, направленным для связывания с CD47 и PD-L1. Такие антитела могут быть использованы для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого CD47 и PD-L1.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, которое специфически связывается с CD47 и PD- L1 и включает один сайт связывания с CD47, и по крайней мере один сайт связывания с PD-L1.
В некоторых вариантах антитело по настоящему изобретению представляет собой полноразмерное антитело или его антигенсвязьшающий фрагмент.
В некоторых вариантах антитело по настоящему изобретению включает один или два сайта связывания с PD-L1.
В некоторых вариантах сайг связывания с CD47 антитела по настоящему изобретению ингибирует взаимодействие CD47 рецептора и SIRPa лиганда, и/или сайт связывания с PD-L1 ингибирует взаимодействие PD-L1 с PD-1 рецептором.
В некоторых вариантах сайт связывания с CD47 антитела по настоящему изобретению включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит последовательности CDR1, CDR2, CDR3, где CDR1 представляет собой последовательность не менее чем на 80% гомологичную последовательности выбранной из следующей труппы SEQ ID NO: 1 - 4, то есть CDR1 передставляет собой последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 1-4 или последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 1-4 с 1 или 2 заменами, где CDR2 представляет собой последовательность не менее чем на 80% гомологичную последовательности выбранной из следующей группы SEQ ID NO: 6 - 15, то есть CDR2 передставляет собой последовательность, выбранную из группу SEQ ID NO: 6 - 15 или последовательность, выбранную из группу SEQ ID NO: 6 - 15 с 1 , 2, 3, 4 или 5 заменами, где CDR3 представляет собой последовательность не менее чем на 80% гомологичную последовательности выбранной из следующей группы SEQ ID NO: 17 -- 20, то есть CDR3 передставляет собой последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 17 - 20 или последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 17 - 20 с 1, 2 или 3 заменами.
В некоторых вариантах сайт связывания с CD47 антитела по настоящему изобретению включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит последовательности CDR.1, CDR2, CDR3, где CDR1 представляет собой последовательность, выбранную из следующей группы SEQ ID NO: 1 - 4, где CDR2 представляет собой последовательность, выбранную из следующей группы SEQ ID NO: 6 - 15, где CDR3 представляет собой последовательность, выбранную из следующей группы SEQ ID NO: 17 - 20.
В некоторых вариантах сайг связывания с CD47 антитела по настоящему изобретению включает вариабельный домен тяжелой цепи по п.4, и вариабельный домен легкой цепи, который содержит последовательности CDR1 , CDR2, CDR3, где CDR1 представляет собой последовательность не менее чем на 80% гомологичную последовательности выбранной из следующей группы SEQ ID NO: 22 - 34, то есть CDR1 передставляет собой последовательность, выбранную из группу SEQ ID NO: 22 - 34 или последовательность, выбранную из группу SEQ ID NO: 22 - 34 с 1 или 2 заменами, где ( "DR2 представляет собой последовательность не менее чем на 80% гомологичную последовательности выбранной из следующей группы SEQ ID NO: 36 - 48, то есть CDR2 передставляет собой последовательность, выбранную из группу SEQ ID NO: 36 - 48 или последовательность, выбранную из группу SEQ ID NO: 36 - 48 с 1, 2 или 3 заменами, где CDR3 представляет собой последовательность не менее чем на 80% гомологичную последовательности выбранной из следующей группы SEQ ID NO: 50 - 64, то есть CDR3 передставляет собой последовательность SEQ ID NO: 50 - 64 или последовательность, выбранную из группу SEQ ID NO: 50 - 64 с 1 или 2 заменами..
В некоторых вариантах сайт связывания с CD47 антитела по настоящему изобретению включает вариабельный домен тяжелой цепи по п.4, и вариабельный домен легкой цепи, который содержит последовательности CDRL CDR2, CDR3, где CDR1 представляет собой последовательность, выбранную из следующей группы SEQ ID NO: 22 - 34, CDR2 представляет собой последовательность, выбранную из следующей группы SEQ ID NO: 36 - 48, CDR3 представляет собой последовательность, выбранную из следующей группы SEQ ID NO: 50 - 64.
В некоторых вариантах сайт связывания с CD47 антитела по настоящему изобретению включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит последовательности гомологичные не менее чем на 90% последовательностям, выбранным из следующей группы SEQ ID NO: 66 - 88, и вариабельный домен легкой цепи, который содержит последовательности гомологичные не менее чем на 90% последовательностям, выбранным из следующей группы SEQ ID NO: 89 - 06.
В некоторых вариантах сайт связывания с CD47 антитела по настоящему изобретению включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит последовательности, выбранные из следующей группы SEQ ID NO: 66 - 88, и вариабельный домен легкой цепи, который содержит последовательности, вы:бра.нные из следующей группы SEQ ID NO: 89 - 106.
В некоторых вариантах сайт связывания с PD-L1 антитела по настоящему изобретению включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит последовательности гомологичные не менее чем: на 80% следующим: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 21 , то есть содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 5, 16 и 21 или SEQ ID NO: 5 с 1 заменой, SEQ ID NO: 16 с 1 , 2 или 3 заменами, SEQ ID NO: 21 с 1, 2 или 3 заменами, и вариабельный домен легкой цепи, который содержит последовательности гомологичные не менее чем на 80% следующим: SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 65, то есть содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 35, 49 и 65 или SEQ ID NO: 35 с 1, 2 или 3 заменами, SEQ ID NO: 49 с 1 заменой, SEQ ID NO: 65 с 1 или 2 заменами.
В некоторых вариантах сайг связывания с PD-L1 антитела по настоящему изобретению включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит следующие последовательности: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 21 , и вариабельный домен легкой цепи, который содержит следующие последовательности: SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 65.
В некоторых вариантах сайт связывания с CD47 антитела по настоящему изобретению представляет собой Fab, scFv, scFab или изолированные моно домены VH или VI I П.
В некоторых вариантах сайт связывания с PD-L1 антитела по настоящему изобретению представляет собой Fab, scFv, scFab или изолированные моно домены VI I или VI II I.
В некоторых вариантах антитело по настоящему изобретению характеризуется тем, что оно вызывает антитело-зависимую клеточную цитотоксичность, макрофаг-опосредованный фагоцитози/или опосредованную Т-клетками цитотоксичность в отношении клеток, несущих на поверхности антигены CD47 и/или PD-L1.
В некоторых вариантах антитело по настоящему изобретению характеризуется тем, что оно содержит Fc-фрагмент по меньшей мере с одной мутацией или модификацией, которая повышает антитело-зависимую клеточно-опосредованиую цитотоксичность (ADCC) по сравнению с тем же антителом без мутации или модификации.
В некоторых вариантах антитело по настоящему изобретению используется для применения в качестве лекарства для лечения рака,
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая кодирует любое из антител, описанных выше,
В некоторых вариантах нуклеиновая кислота по настоящему изобретению представляет собой ДНК.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, который содержит нуклеиновую кислоту, описанную выше,
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения клетки-хозяина для получения любого из антител описаны х выше, который включает трансформирование клетки вектором по настоящему изобретению.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к клетке-хозяину для получения любого антитела из описанных выше, которая содержит нуклеиновую кислоту, описанную выше. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения любого антитела из описанных выше, который заключается в культивировании клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, достаточных для получения указанного антитела, при необходимости, с последующим выделением и очисткой полученного антитела,
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиция для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого PD-L1 и CD47, которая содержит любое антитело из описанных выше, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлем ми эксципиента и .
В некоторых вариантах фармацевтическая композиция по настоящему изобретению предназначенна для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого PD-L.1 и CD47, выбранного из группы: ПРГШ (плоскоклеточный: рак головы и шеи), рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы), КРР (колоректальный рак), гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ (Немелкоклеточный рак легкого), рак почки, рак яичника, MSI КРР (колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью), лейкоз (острый или миелобластный), лимфома, множественная миелома, рак молочной железы, рак предстательной железы, саркома, лимфома Ходжкина, Т- и В-клеточном острый лим:фобластный лейкоз, мелкоклеточн й рак лёгкого, ост й м:иелобластный лейкоз, рефрактерная В -клеточная неходжкинская лимфома, фолликулярная лимфома, В-клеточная лимфома маргинальной зоны, крупноклеточная В- клеточной диффузная лимфома, , рак поджелудочной железы, рак яичника, и миелодиспластический синдром высокого риска,
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или нарушения, опосредованного PD-L1 и CD47, которое включает введение субъекту любого антитела из указанных выше или фармацевтической композиции по данному изобретению, нуждающемуся в таком лечении, в терапевтически эффективном количестве,
В некоторых вариантах способа лечения по настоящему изобретению заболевание или нарушение выбрано из группы: I I P! I l l (плоскоклеточный ак головы и шеи), рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы), КРР (колоректальный рак), гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ (Немелкоклеточный рак легкого), рак почки, рак яичника, MSI КРР (колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью), лейкоз (острый или миелобластный), лимфома, множественная миелома, рак молочной железы, , рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, саркома, гепатоцеллюлярная карцинома, глиобластома, лимфома Ходжкина, Т- и В-клеточном острый лимфобластный лейкоз, мелкоклеточный рак лёгкого, острый миелобластный лейкоз, рефрактерная В -клеточная неходжкинская лимфома, фолликулярная лимфома, В-клеточная лимфома маргинальной зоны, крупноклеточная В- клеточной диффузная лимфома, , рак поджелудочной железы, рак яичника, и миелодиеплаетический синдром высокого риска.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу ингибирования биологической активности PD-L1 и/или CD47 у субъекта, нуждающемуся в таком ингибировании, который включает введение субъекту эффективного количества любого антитела из указанных выше,
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению любого из указанных выше антител или указанной выше фармацевтической композиции для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении заболевания или нарушения, опосредуемого PD-L1 и CD47. В некоторых вариантах применения антитела по настоящему изобретению заболевание или нарушение выбрано из группы: ПРГШ (плоскоклеточный рак головы и шеи), рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиооластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ΊΉΡΜ3Κ (трижды негативный рак молочной железы), КРР (колоректальный рак), гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ (Немелкоклеточный рак легкого), рак почки, рак яичника, MSI КРР (колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью), лейкоз (острый или миелобластный), лимфома, множественная миелома, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, саркома, гепатоцеллюлярная карцинома, глиооластома, лимфома Ходжкина, Т- и В -клеточном острый лимфобластный лейкоз, мелкоклеточный рак лёгкого, острый миелобластный лейкоз, рефрактерная В-клеточна неходжкинская лимфома, фолликулярная лимфома, В-клеточная лимфома маргинальной зоны, крупноклеточная В- клеточной диффузная: лимфома, , рак поджелудочной: железы, рак яичника., и миелодиспластический синдром высокого риска.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Карта плазмиды для транзиентной продукции CD47-Fc человека в культуре СНО-К1 клеток млекопитающих.
Фиг. 2. SDS-гель-электрофорез в нередуцирующих условиях препарата CD47-Fc человека.
Фиг. 3. SDS-гель-электрофорез в редуцирующих условиях препарата контрольного anti-CD47 антитела В6Н12
Фиг. 4. SDS-гель-электрофорез в нередуцирующих условиях препарата контрольного anti-CD47 антитела В 6Н12.
Фиг. 5. График ИФА поликлонального фага, несущих VHH фрагменты антител, специфически взаимодействующих с CD47 антигеном человека. Фиг. 6. Схематичное представление доменной структуры anti-PD- Ll/anti-CD47 биспецифических антител, где А - на основе anti-CD47 scFv фрагментов и В - на anti-CD47 VHH фрагментов. При этом PD-L1 связывающая часть представлена ввиде Fab фрагмента.
Фиг. 7. SDS-гель-электрофорез в нередуцирующих условиях препаратов anti-PD-Ll/anti-CD47 биспецифических антител на основе anti-CD47 scFv фрагментов.
Фиг.8. SDS-гель-электрофорез в редуцирующих условиях препаратов anti-PD-Ll/anti-CD47 биспецифических антител на основе anti-CD47 VHH фрагментов.
Фиг.9. Зависимость цитотоксического эффекта от концентрации исследуемых anti-PD-Ll/anti-CD47 биспецифических антител.
Фиг. 10. Зависимость цитотоксического эффекта от концентрации исследуемых anti-PD-Ll/anti-CD47 биспецифических антител.
Фиг. 11. Эффективность фагоцитоза клеток линии MDA-MB-231 макрофагами человека в присутствии anti-PD-Ll/anti-CD47 биспецифических антител.
Фиг. 12. Зависимость уровня флуоресценции от концентрации anti-PD- Ll/anti-CD47 биспецифических антител.
Фиг. 13. Зависимость уровня флуоресценции от концентрации anti-PD- Ll/anti-CD47 биспецифических антител.
Фиг. 14. Зависимость уровня флуоресценции от концентрации anti-PD- Ll/anti-CD47 биспецифических антител.
Фиг. 15. Зависимость уровня флуоресценции от концентрации anti-PD- Ll/anti-CD47 биспецифических антител. Фиг. 16. Анти-PD-Ll активность биспецифических aHTH-PD-Ll/CD47 антител. По вертикальной оси показано отношение люминесценции лунок с исследуемыми aHTH-CD47/PD-Ll антителами к люминесценции лунок без добавления антител.
Фиг. 17. Гельфильтрационный профиль оценки агрегационной гомогенности anti-PD-Ll/anti-CD47 биспецифического антитела.
Описание изобретения
Определения и общие методы
Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области.
Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.
Определения, связанные с антителом
PD-L1 (лиганд 1 рецептора программируемой гибели клеток), также известный как кластер дифференцировки 274 (CD274) или гомолог 1 В7 (В7- HI), является трансмембранным белком 1 типа, массой 40кДа. Состоит из 3 доменов: внеклеточного, представленного Ig V и С-подобными доменами (220), трансмембранного (21) и внутриклеточного (31). Он играет важную роль в супрессии иммунной системы в период беременности, при пересадке чужеродной ткани, некоторых заболеваниях, например, при гепатите. В нормальных условиях, в ответ на собственные антигены, в лимфатических узлах и селезенке аккумулируется некоторое количество антиген- специфичных CD8+ Т-эффекторных клеток, с целью предотвращения аутоиммунного процесса, формируются PD-1/PD-L1 или B7-1/PD-L1 комплексы, это приводит к передаче ингибиторного сигнала, снижающего пролиферацию данных CD8+ Т - клеток в лимфоузлах. Таким образом PD- l/PD-L-взаимо действие является одним из ключевых в развитии иммунной толерантности .
CD47, многократно пронизывающий мембрану трансмембранный рецептор, принадлежащий к суперсемейству иммуноглобулинов, взаимодействует с SIRPa (регулирующий сигналы белок а) на макрофагах и тем самым ослабляет фагоцитоз. Раковые клетки, у которых работает этот путь, избегают фагоцитоза. Поэтому терапевтическое воздействие на CD47 имеет широкое применение при различных раковых заболеваниях. Антитела к CD47 могут обладать способностью блокировать взаимодействие между CD47 и SIRPa, а могут не обладать такой способностью.
Термин «связывающая молекула» включает в себя антитела и иммуноглобулины .
Термин «антитело» или «иммуноглобулин» или «моноклональное антитело» или «биспецифическое антитело» или «мультиспецифическое антитело» (Ig), как использовано в данном описании, включает целое/полноразмерное антитело или любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. «антигенсвязывающую часть»). Кроме того, например, термины «антитело» или «иммуноглобулин» или «моноклональное антитело» включают любую комбинацию антиген-связывающих фрагментов, одной или более валентности и одной или более специфичности, и константных областей иммуноглобулинов и могут быть аналогичны по смыслу терминам «биспецифическое антитело» или «мультиспецифическое антитело». Кроме того, например, термины «антитело» или «иммуноглобулин» или «моноклональное антитело» включают любую комбинацию антиген- связывающих фрагментов и константных областей иммуноглобулинов, связанных и ковалентно или нековалентно с любым полипептидом любой природы. Кроме того, термин «антитело», например, относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, взаимосвязанные дисульфидными связями, или его антигенсвязывающей частью. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно называемую в данном описании как VH) и константную область тяжелой цепи. Известно пять типов тяжелых цепей антител млекопитающих, которые обозначают греческими буквами: α, δ, ε, γ и μ. Присутствующий тип тяжелой цепи определяет класс антитела; указанные цепи обнаружены в антителах типа IgA, IgD, IgE, IgG и IgM соответственно. Различные тяжелые цепи отличаются по размеру и составу; а и γ содержат примерно 450 аминокислот, а μ и ε состоят примерно из 550 аминокислот. Каждая тяжелая цепь содержит две области, т.е. константную область и вариабельную область. Константная область является идентичной во всех антителах одного и того же изотипа, но отличается в антителах различного изотипа. Тяжелые цепи γ, а и δ содержат константную область, которая состоит из трех константных доменов CHI, СН2 и СНЗ (выстроены в ряд) и шарнирной области, которая придает гибкость (Woof J., Burton D., Nat Rev Immunol 4, 2004, cc.89-99); тяжелые цепи μ и ε содержат константную область, которая состоит из четырех константных доменов CHI, СН2, СНЗ и СН4. У млекопитающих известно только два типа легких цепей, которые обозначают как лямбда (λ) и каппа (к). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно называемой в данном описании как VL) и константной области легкой цепи. Примерная длина легкой цепи составляет 211-217 аминокислот. Предпочтительно легкая цепь представляет собой легкую каппа (к)-цепь, а константный домен CL предпочтительно представляет собой С-каппа (к).
«Антитела» согласно изобретению могут представлять собой антитела любого класса (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, предпочтительно IgG) или подкласса (например, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl и IgA2, предпочтительно IgGl).
Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), разбросанные между областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино -конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями хозяина или факторами, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторными клетками), и первый компонент (Clq) классической системы комплемента.
Термин «антигенсвязывающая часть» антитела или «антигенсвязывающий фрагмент» (или просто «часть антитела» или «фрагмент антитела»), как использовано в данном описании, относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, включенных в термин "антигенсвязывающая часть" антитела включают (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН 1 ; (ii) F(ab')2 -фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd- фрагмент, состоящий из доменов VH и СН 1 ; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH в едином плече антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341 :544-546), который состоит из домена VH/VHH; и (vi) выделенная определяющая комплементарность область (CDR). Кроме того, две области Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются разными генами, они могут быть соединены при помощи рекомбинантных способов с использованием синтетического линкера, который дает возможность получать их в виде единой белковой цепи, в которой области VL и VH спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Предполагается, что такие одноцепочечные молекулы также включены в термин «антигенсвязывающая часть» антитела. Такие фрагменты антител получают с использованием общепринятых способов, известных специалистам в данной области, и эти фрагменты подвергают скринингу таким же образом, как и интактные антитела.
Предпочтительно CDR антигенсвязывающего участка или весь антигенсвязывающий участок антител по изобретению имеет происхождение из мыши, ламы или донорской человеческой библиотеки или по существу человеческое происхождение с определенными аминокислотными остатками, измененными, например, замещенными разными аминокислотными остатками с тем, чтобы оптимизировать конкретные свойства антитела, например KD, koff, IC50, ЕС50, ED50. Предпочтительно каркасные участки антитела по изобретению имеют человеческое происхождение или по существу человеческое происхождение (по крайней мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% человеческое происхождение). В других вариантах осуществления антигенсвязывающий участок антитела по изобретению может происходить из других нечеловеческих видов, включая мышь, ламу, кролика, крысу или хомяка, но не ограничиваясь ими. Альтернативно, антигенсвязывающий участок может происходить из человеческих видов.
Термин «вариабельный» относится к тому факту, что определенные сегменты вариабельных доменов широко отличаются в последовательности среди антител. Домен V опосредует связывание антигена и определяет специфичность конкретного антитела к его конкретному антигену. Однако вариабельность неравномерно распределяется на участке вариабельных доменов из 110 аминокислот. Напротив, V области состоят из инвариантных фрагментов, называемых каркасными областями (FR) из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими участками чрезвычайной вариабельности, называемых «гипервариабельными областями» или CDR. Каждый вариабельный домен нативных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR, в основном принимающих конфигурацию бета-листов, связанных тремя гипервариабельными областями, которые образуют петли, связывающие, и в некоторых случаях являющиеся частью бета-складчатой структуры. Гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости с помощью FR и с гипервариабельными областями другой цепи вносят вклад в образование антигенсвязывающего сайта антител. Константные домены не принимают непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ, ADCC).
Термин «гипервариабельная область» по данному описанию относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Обычно гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из «области, определяющей комплементарность» или «CDR», и/или такие остатки из «гипервариабельной петли».
В некоторых случаях может также быть предпочтительным изменение одного или более остатков аминокислот CDR-участков с целью повышения аффинности связывания с целевым эпитопом. Это известно, как «созревание аффиности» и в некоторых случаях может выполняться в связи с гуманизацией, например, в ситуациях, когда гуманизация антитела приводит к снижению специфичности или аффинности связывания, и не представляется возможным в достаточной степени улучшить специфичность или аффинность связывания с помощью только обратных мутаций. Различные методы созревания аффинности известны в данной области техники, например, способ in vitro сканирующего насыщающего мутагенеза, описанный Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997), и способ пошагового in vitro созревания аффинности, предложенный Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042 (1998).
«Каркасные области» (FR) представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от CDR остатков. Обычно каждый вариабельный домен имеет четыре FR, определяемые как FR1, FR2, FR3 и FR4. Если CDR определяются согласно Kabat, FR остатки легкой цепи локализуются, приблизительно, в области остатков 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) и 98-107 (LCFR4), а остатки FR тяжелой цепи локализуются, приблизительно, в области остатков 1 -30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) и 103- 113 (HCFR4) в тяжелой цепи. Если участки CDR содержат аминокислотные остатки из гипервариабельных петель, FR остатки легкой цепи локализуются, приблизительно, в остатках 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) и 97-107 (LCFR4) в легкой цепи, a FR остатки тяжелой цепи локализуются, примерно, в остатках 1-25 (HCFRI), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) и 102-113 (HCFR4) в остатках тяжелой цепи. В некоторых примерах, когда CDR содержит аминокислоты как из CDR по Kabat, так и аминокислоты из гипервариабельной петли, FR соответствующим образом корректируются. Например, когда CDRH1 включает аминокислоты Н26-Н35, остатки FR1 тяжелой цепи находятся в положениях 1 -25, а остатки FR2 находятся в положениях 36-49.
Антитело по данному изобретению, «которое связывает» целевой антиген, представляет собой антитело, которое связывает антиген с достаточной аффинностью так, что антитело можно применять в качестве диагностического и/или терапевтического агента при нацеливании на белок или клетку, или ткань, экспрессирующую антиген, и в незначительной степени перекрестно реагирует с другими белками. По данным аналитических методов: сортинга флуоресцентно -активированных клеток (FACS), радиоиммунопреципитации (RIA) или ИФА (ELISA), в таких вариантах изобретения степень связывания антитела с белком, не являющимся «мишенью» (с «нецелевым белком»), составляет менее 10% от связывания антитела с конкретным белком-мишенью. По отношению к связыванию антитела с молекулой-мишенью термин «специфическое связывание» или выражения «специфически связывается с» или «специфический к» конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном полипептиде -мишени означает связывание, которое заметно (измеримо) отличается от неспецифического взаимодействия (например, в случае ЬН1 -44 или ЬН1-81 неспецифическое взаимодействие представляет собой связывание с бычьим сывороточным альбумином, казеином, фетальной бычьей сывороткой или нейтравидином) .
Специфическое связывание можно определять количественно, например, определяя связывание молекулы по сравнению со связыванием контрольной молекулы. Например, специфическое связывание можно определять конкурентной реакцией с другой молекулой, аналогичной мишени, например, с избытком немеченой мишени. В этом случае специфическое связывание указывается, если связывание меченой мишени с зондом конкурентно ингибируется избытком немеченой мишени. В данном описании термин «специфическое связывание» или выражения «специфически связывается с» или «специфический к» конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном полипептиде -мишени можно характеризовать на примере молекулы, имеющей Kd к мишени по меньшей мере около 200 нМ, или же по меньшей мере около 150 нМ, или же по меньшей мере около 100 нМ, или же по меньшей мере около 60 нМ, или же по меньшей мере около 50 нМ, или же по меньшей мере около 40 нМ, или же по меньшей мере около 30 нМ, или же по меньшей мере около 20 нМ, или же по меньшей мере около 10 нМ, или же по меньшей мере около 8 нМ, или же по меньшей мере около 6 нМ, или же по меньшей мере около 4 нМ, или же по меньшей мере около 2 нМ, или же по меньшей мере около 1 нМ или выше. В одном варианте изобретения термин «специфическое связывание» относится к связыванию, при котором молекула связывается с конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде, практически не связываясь с каким-либо другим полипептидом или эпитопом на полипептиде.
Термин «Ка», как использовано в данном описании, относится к скорости ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген, тогда как термин или «Kd» относится к скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.
«Аффинность связывания» обычно относится к силе совокупных нековалентных взаимодействий между единичным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иначе, «аффинность связывания» относится к внутренней (характерной, истинной) аффинности связывания, которая отражает 1 : 1 взаимодействие между членами пары связывания (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X к своему партнеру Y обычно можно представить константной диссоциации (Kd). Желательно, чтобы величина Kd составляла, примерно, 200 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 60 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 8 нМ, 6 нМ, 4 нМ, 2 нМ, 1 нМ или менее. Аффинность можно измерять обычными методами, известными в уровне техники, включая методы по данному описанию. Низкоаффинные антитела обычно медленно связываются с антигеном и имеют тенденцию легко диссоциировать, тогда как высокоаффинные антитела обычно быстрее связывают антиген и имеют тенденцию дольше оставаться в связанном состоянии. В уровне техники известны различные методы измерения аффинности связывания, любой из этих методов можно использовать для целей настоящего изобретения.
В одном варианте изобретения «Kd» или «величину Kd» по данному изобретению измеряют методами поверхностного плазмонного резонанса на приборе В1Асоге™-2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C, используя чипы с иммобилизованным антигеном СМ5 при ~10 относительных единицах (единицах отклика, RU). Коротко говоря, биосенсорные чипы с карбоксиметилдекстраном (СМ5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом М-этил-М'-(З-диметиламинопропил)- карбодиимида (EDC) и Ν-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями производителя. Антиген разводят 10 мМ раствором ацетата натрия, рН 4.8, до концентрации 5 мкг/мл (~0.2 мкМ), а затем вводят (инжекция) при скорости потока 5 мкл/минута до достижения, примерно, 10 относительных единиц (RU) связанного белка. После введения антигена вводят 1 М раствор этаноламина, чтобы блокировать непрореагировавшие группы. Для кинетических измерений двукратные серийные разведения Fab (например, от 0.78 нМ до 500 нМ) вводят в PBS с 0.05% Tween 20 (PBST) при 25°С при скорости потока, примерно, 25 мкл/мин. Величины скорости ассоциации (коп) и скорости диссоциации (koff) рассчитывают, применяя простую модель Ленгмюра для связывания один-плюс-один (BIAcore Evaluation Software версия 3.2), с помощью одновременного получения сенсограммы ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (Kd) рассчитывают, как отношение koff/kon. См., например, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881. Если по данным вышеуказанного метода поверхностного плазмонного резонанса скорость ассоциации превышает 106 М"1 сек"1, тогда ее можно определять методом тушения флуоресценции, который измеряет увеличение или уменьшение интенсивности флуоресцентной эмиссии (возбуждение=295 нм; эмиссия (излучение)=340 нм, полоса 16 нм) при 25°С раствора антитела против антигена (Fab форма) с концентрацией 20 нМ в PBS, рН 7.2, в присутствии увеличивающихся концентраций антигена, измеряемых с помощью спектрометра, такого как спектрофотометр остановленного потока (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-Aminco (Thermo Spectronie) серии 8000 с кюветой с перемешиванием.
Термин «Koff» относится к константе скорости диссоциации конкретного взаимодействия связывающей молекулы и антигена. Константу скорости диссоциации koff можно измерить посредством биослойной интерферометрии, например, с помощью системы Octet™.
«Скорость ассоциации» («οη-rate») или «коп» по данному изобретению можно также определять тем же самым описанным выше методом поверхностного плазмонного резонанса на приборе В1Асоге™-2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C, используя чипы с иммобилизованным антигеном СМ5 при ~10 относительных единицах (единицах отклика, RU). Коротко говоря, биосенсорные чипы с карбоксиметилдекстраном (СМ5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом N- этил-М'-(3-диметиламино пропил)-карбодиимида (EDC) и N- гидроксисукцинимидом ( HS) в соответствии с инструкциями производителя. Антиген разводят 10 мМ раствором ацетата натрия, рН 4.8, до концентрации 5 мкг/мл (~0.2 мкМ), а затем вводят (инжекция) при скорости потока 5 мкл/минута до достижения, примерно, 10 относительных единиц (RU) связанного белка. После введения антигена вводят 1 М раствор этаноламина, чтобы блокировать непрореагировавшие группы.
Если специально не указано иначе, выражения "биологически активный", и "биологическая активность", и "биологические характеристики", по отношению к полипептиду по данному изобретению, означают обладание способностью связываться с биологической молекулой.
Выражение «биологическая молекула» относится к нуклеиновой кислоте, белку, углеводу, липиду и их комбинации. В одном варианте изобретения биологическая молекула существует в природе.
Участки антител, такие как Fab- и F (ab ') 2-фрагменты, могут быть получены из целых антител с использованием традиционных методов, таких как папаиновый или пепсиновый гидролиз целых антител. Более того, антитела, части антител и молекулы иммуноадгезии могут быть получены с использованием стандартных методов рекомбинантной ДНК, например, как описано в настоящем документе.
Термин «рекомбинантное антитело» означает антитело, которое экспрессируется в клетке или клеточной линии, содержащей нуклеотидную последовательность (нуклеотидные последовательности), которая кодирует антитела, при этом указанная нуклеотидная последовательность (нуклеотидные последовательности) не ассоциирована с клеткой в природе.
Термин «вариантное» антитело, используемый в данном документе, относится к антителу, имеющему аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности его «родительского» антитела путем добавления, удаления и/или замены одного или более аминокислотных остатков относительно последовательности родительского антитела. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вариантное антитело содержит по меньшей мере одно или более (например, от одного до двенадцати, например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять, десять, одиннадцать или двенадцать; и в некоторых вариантах осуществления изобретения от одного до примерно десяти) добавлений, делеций и/или замен аминокислот относительно родительского антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретение добавления, делеций и/или замены осуществляются на CDR-участках вариантного антитела. Идентичность или гомология по отношению к последовательности вариантного антитела определяется в настоящем документе как процент аминокислотных остатков в последовательности вариантного антитела, которые идентичны остаткам родительского антитела, после выравнивания последовательностей и введения гэпов, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательности. Вариантное антитело сохраняет способность связываться с тем же антигеном, и предпочтительно эпитопом, с которым связывается родительское антитело, и в некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одно свойство или биологическая активность превосходит аналогичные свойства родительского антитела. Например, вариантное антитело может иметь, например, более выраженную аффинность связывания, более длительный период полувыведения, более низкое значение ИК50 или повышенную способность подавлять биологическую активность антигена по сравнению с родительским антителом. Особый интерес в настоящем документе представляет вариантное антитело, показывающее биологическую активность, превышающую по меньшей мере в 2 раза (предпочтительно, по меньшей мере в 5 раз, 10 раз или 20 раз) биологическую активность родительского антитела.
Термин «биспецифичное антитело» означает антитело, содержащее антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающие домены, которые способны к специфическому связыванию с двумя различными эпитопами на одной биологической молекуле или способны к специфическому связыванию с эпитопами на двух различных биологических молекулах. Биспецифичное антитело также упоминается в настоящем документе, как обладающее «двойной специфичностью» или как являющееся антителом с «двойной специфичностью» .
Термин «химерное антитело» относится в широком смысле к антителу, которое содержит одну или более областей из одного антитела, и одну или более областей из одного или нескольких других антител, как правило, антитело, частично человеческого происхождения и частично нечеловеческого происхождения, то есть полученное частично из не относящегося к человеку животного, например, мыши, крысы или другого грызуна, или верблюдовых, таких как лама или альпака. Химерные антитела являются предпочтительными по сравнению с нечеловеческими антителами для того, чтобы снизить риск иммунного ответа, направленного против антител у человека, например, ответа, направленного против мышиных антител у человека в случае мышиного антитела. Примером типичного химерного антитела является то, в котором последовательности вариабельного участка являются мышиными, в то время как последовательности константного участка являются человеческими. В случае химерного антитела нечеловеческие части могут быть подвергнуты дальнейшему изменению с целью гуманизации антитела.
Термин «гуманизация» относится к факту, что когда антитело имеет полностью или частично нечеловеческое происхождение, например, антитело мыши или ламы, полученное при иммунизации мышей или лам, соответственно, с представляющим интерес антигеном, или является химерным антителом на основе такого антитела мыши или ламы, можно заменить некоторые аминокислоты, например, в каркасных областях и константных доменах тяжелой и легкой цепей, с тем чтобы избежать или свести к минимуму иммунный ответ у человека. Специфичность взаимодействия антитела с антигеном-мишенью присуща главным образом аминокислотным остаткам, расположенных в шести CDR-участках тяжелой и легкой цепи. Поэтому аминокислотные последовательности внутри CDR- участков, являются гораздо более вариабельными между отдельными антителами, по сравнению с последовательностями вне CDR-участков. Поскольку последовательности CDR участков отвечают за большинство антитело-антиген взаимодействий, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфического природного антитела, или в более общем плане какого-либо специфического антитела с данной аминокислотной последовательностью, например, путем конструирования экспрессионных векторов, которые экспрессируют последовательности CDR- участков из специфического антитела и каркасные последовательности другого антитела. В результате, можно «гуманизировать» нечеловеческое антитело и в значительной степени сохранить специфичность связывания и аффинность исходного антитела. Несмотря на то, что невозможно точно предсказать иммуногенность и тем самым иммунный ответ, направленный против антитела у человека на конкретное антитело, нечеловеческие антитела, как правило, более иммуногенны, чем человеческие антитела. Химерные антитела, у которых инородные (например, грызуна или верблюда) константные участки были заменены последовательностями человеческого происхождения, показали в целом более низкую иммуногенность, чем антитела полностью инородного происхождения, и существует тенденция использовать в терапевтических антителах гуманизированные или полностью человеческие антитела. Химерные антитела или другие антитела нечеловеческого происхождения, таким образом, могут быть гуманизированы, чтобы снизить риск иммунного ответа, направленного против антитела, у человека.
Для химерных антител, гуманизация обычно включает в себя модификацию каркасных участков последовательностей вариабельного участка. Аминокислотные остатки, которые являются частью участков, определяющих комплементарность (CDR участков), чаще всего не будут изменяться в связи с гуманизацией, хотя в некоторых случаях это может быть желательным, чтобы изменить отдельные аминокислотные остатки CDR- участка, например, чтобы удалить участок гликозилирования, участок дезамидирования, участок изомеризации аспартата или нежелательный остаток цистеина или метионина. Ν-связанное гликозилирование происходит путем присоединения олигосахаридной цепи к остатку аспарагина в трипептидной последовательности Asn-X-Ser или Asn-X-Thr, где X может быть любой аминокислотой, кроме Pro. Удаление участка N- гликозилирования может быть достигнуто путем мутирования Asn или Ser/Thr остатка другим остатком, предпочтительно путем консервативной замены. Дезамидирование остатков аспарагина и глутамина может происходить в зависимости от таких факторов, как рН и обнажение поверхности. Остатки аспарагина особенно восприимчивы к дезамидированию, прежде всего, если они присутствуют в последовательности Asn-Gly, и в меньшей степени в других дипептидных последовательностях, таких как Asn-Ala. При наличии такого дезамидированного участка, например, Asn-Gly в последовательности CDR-участка, может быть предпочтительным удалить этот участок, как правило, путем консервативной замены для удаления одного из вовлеченных остатков.
В данной области техники известны многочисленные способы гуманизации последовательности антитела. Одним из наиболее часто используемых методов является трансплантация CDR -участков. Трансплантация CDR участка может быть основана на определениях CDR- участков по Kabat, хотя в более поздней публикации (Magdelaine-Beuzelin et al., Crit Rev.Oncol Hematol. 64:210 225 (2007)) предполагается, что определение no IMGT® (the international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org) может улучшить результат гуманизации (см Lefranc et al., Dev. Comp Immunol. 27:55-77 (2003)). В некоторых случаях, трансплантация CDR-участкка может уменьшить специфичность и аффинность связывания, и, следовательно, биологическую активность, в CDR трансплантированном нечеловеческом антителе, по сравнению с родительским антителом, из которого получены CDR-участки. Обратные мутации (иногда именуемые «ремонт каркасного участка»), могут применяться в выбранных положениях CDR трансплантированного антитела, как правило, в каркасных участках, для того, чтобы восстановить специфичность и аффинность связывания родительского антитела. Определение позиций для возможных обратных мутаций может быть выполнено с использованием информации, имеющейся в литературе и в базах данных антител. Аминокислотные остатки, которые являются кандидатами для обратных мутаций, как правило, расположены на поверхности молекулы антитела, в то время как остатки, которые углублены или имеют низкую степень обнажения поверхности обычно не будут подвержены изменениям. Метод гуманизации, альтернативный трансплантации CDR-участка и обратной мутации, представляет собой изменение поверхности, при котором неэкспонированные на поверхности остатки нечеловеческого происхождения, сохраняются, в то время как экспонированные на поверхности остатки изменяются в человеческие остатки.
Существует две технологии получения полностью человеческих антител: с использованием in vitro собранных фаговых библиотек или in vivo иммунизацией гуманизированных животных (мышей, крыс и т.д.).
Фаговый дисплей является первой и самой широко распространенной in vitro технологией для поиска антител. В 1985 году Смит обнаружил, что последовательности чужеродной ДНК могут быть клонированы в нитевидный бактериофаг М13 таким образом, что клонированные последовательности генов экспрессируются на поверхности фаговых частиц как слитые белки (Smith GP: Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 1985, 228: 1315-1317.). Таким образом, можно проводить селекцю интересующих нас слитых белков на основе их способности связывать другие белки. Это открытие было скомбинировано с методами ПЦР-амплификации, что позволило клонировать кДНК репертуар генов иммуноглобулинов для создания разнообразных фаговых библиотек, содержащих вариабельные домены, которые могут быть использованы для быстрого поиска мишень-специфичных моноклональных антител. Репертуар фаговых библиотек отражает репертуар антител В-лимфоцитов каждого человека или животного, кровь которого была использована при создании библиотеки. В 1995 году две статьи сообщили о создании генетически сконструированных мышей, которые экспрессировали полностью человеческие антитела, репертуар которых может быть соспоставим с полученным гибридомной технологией (Lonberg N, Taylor LD, Harding FA, Trounstine M, Higgins KM, Schramm SR, Kuo CC, Mashayekh R, Wymore K, McCabe JG et al.: Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 1994, 368:856-859). У этих животных были целенаправленно разрушены гены своих собственных эндогенных тяжелых и к легких цепей иммунноглобулинов и введены трансгены, представляющие собой сегменты генов тяжелых и к легких цепей человека. Оказалось, что репертуар генов человека может быть использован мышиной иммунной системой для создания высокоспецифичных и высокоаффинных антител к большему разнообразию антигенов. Несмотря на то, что трансгенные мыши экспрессируют В -клеточные рецепторы, которые по существу являются гибридными мышиных и человеческих (человеческий иммуноглобулин, мышиные Iga, IgP и другие сигнальные молекулы), их В-клетки нормально развиваются и созревают.
В некоторых случаях может также быть предпочтительным изменение одного или более остатков аминокислот CDR-участков с целью повышения аффинности связывания с целевым эпитопом. Это известно, как «созревание аффинности» и в некоторых случаях может выполняться в связи с гуманизацией, например, в ситуациях, когда гуманизация антитела приводит к снижению специфичности или аффинности связывания, и не представляется возможным в достаточной степени улучшить специфичность или аффинность связывания с помощью только обратных мутаций. Различные методы созревания аффинности известны в данной области техники, например, способ in vitro сканирующего насыщающего мутагенеза, описанный Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997), и способ пошагового in vitro созревания аффинности, предложенный Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042 (1998).
Термин «моноклональное антитело» или «mAb» относится к антителу, которое синтезировано и выделено отдельной клональной популяцией клеток. Клональная популяция может быть клональной популяцией иммортализованных клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммортализованные клетки в клональной популяции являются гибридными клетками, гибридомами, которые обычно получают путем слияния отдельных В -лимфоцитов от иммунизированных животных с отдельными клетками лимфоцитарной опухоли. Гибридомы представляют собой тип сконструированных клеток и не встречаются в природе.
«Нативные антитела» обычно являются гетеротетрамерными гликопротеидами с молекулярной массой примерно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как количество дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьирует в разных изотипах иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет равномерно расположенные внутрицеп очечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым следует несколько константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (VL) и константный домен на другом конце. Константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Полагают, что конкретные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи.
Определение «выделенный» («изолированный»), применяемое для описания различных антител по данному описанию, означает антитело, идентифицированное и выделенное и/или регенерированное из клетки или клеточной культуры, в которой оно экспрессируется. Примеси (загрязняющие компоненты) из природной среды представляют собой материалы, которые, как правило, мешают диагностическому или терапевтическому применению полипептида, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах изобретения антитело очищают (1) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков Ν-концевой или внутренней аминокислотной последовательности, при использовании секвенатора с вращающейся стеклянной чашечкой (секвенатора Эдмана), или (2) до гомогенности методом SDS-PAGE в невосстанавливающих или восстанавливающих условиях с применением окрашивания Кумасси бриллиантовым голубым или, предпочтительно, серебром. Выделенное антитело включает антитела in situ внутри рекомбинантных клеток, так как по меньшей мере один компонент природной среды полипептида отсутствует. Обычно выделенный полипептид получают в результате по меньшей мере одной стадии очистки.
«Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена от по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты-примеси, с которой она обычно связана в естественном источнике нуклеиновой кислоты антитела. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от той формы или набора, в которых она находится в естественных условиях. Таким образом, выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от молекулы нуклеиновой кислоты, существующей в клетках в естественных условиях. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, находящуюся в клетках, в которых в норме происходит экспрессия антитела, например, в случае, если молекула нуклеиновой кислоты имеет локализацию в хромосоме, отличную от ее локализации в клетках в естественных условиях.
Термин «эпитоп» при использовании в данном документе относится к части (детерминанте) антигена, который специфически связывается со связывающей молекулой (например, и антитело или родственная молекула, такие как биспецифичная связывающая молекула). Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или углеводы, или боковые цепи Сахаров, и, как правило, имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики зарядов. Эпитоп может быть «линейным» или «конформационным». В линейном эпитопе, все точки взаимодействия между белком (например, антиген) и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) происходит линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка. В конформационном эпитопе, точки взаимодействия происходят через аминокислотные остатки на белке, отделенные друг от друга в первичной аминокислотной последовательности. Когда желаемый эпитоп антигена определен, можно генерировать антитела к этому эпитопу с использованием методик, хорошо известных в данной области техники. Кроме того, генерация и характеристика антител или других связывающих молекул могут пролить свет на информацию о желательных эпитопах. Основываясь на этой информации, можно затем конкурентно скринировать связывающие молекулы для связывания с теми же или аналогичными эпитопами, например, путем проведения исследований конкуренции, чтобы найти связывающие молекулы, которые конкурируют за связывание с антигеном. Термин «пептидный линкер» в настоящем документе означает любой пептид с возможностью соединения доменов с длиной в зависимости от доменов, которые он связывает между собой, содержащий любую аминокислотную последовательность. Предпочтительно пептидный линкер имеет длину более 5 аминокислот и состоит из любого набора аминокислот, выбранного из G, A, S, Р, Е, Т, D, К.
Термин «in vitro» относится к биологическому объекту, биологическому процессу или биологической реакции вне организма, смоделированному в искусственных условиях. Например, рост клеток in vitro должен пониматься как рост клеток в среде вне организма, например, в пробирке, культуральном флаконе или микропланшете.
Термин «1С50» (50% ингибирующая концентрация) относится к концентрациям препарата, при которых измеряемая активность или отклик, например, рост или пролиферация клеток, таких как опухолевые клетки, ингибируется на 50%. Значение IC50 может оцениваться с помощью соответствующих кривых зависимости ответа от логарифма дозы, с использованием специальных статистических программ для обработки кривых.
Термин GI50 (50% ингибирование роста) относится к концентрациям препарата, при которых пролиферация клеток, таких как опухолевые клетки, ингибируется на 50%.
Термин ED50 (ЕС50) (50% эффективная доза/концентрация) относится к концентрациям препарата, при которых измеряемый биологический эффект достигается на 50% (может включать цитотоксичность).
Понятие «эффекторная функция» антитела относится к видам биологической активности, связанным с Fc-областью (нативной последовательностью Fc-области или с вариантами аминокислотной последовательности Fc-области) антитела, и варьируют в зависимости от изотипа антитела. Примерами эффекторных функций антитела являются: Clq- связывание; комплементзависимая цитотоксичность; связывание Fc- рецептора; антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора, BCR) и В-клеточная активация.
«Антитело-зависимая клеточная цитотоксичность» или «ADCC» относится к опосредованному клетками ответу, при котором неспецифичные цитотоксические клетки, которые экспрессируют рецепторы Fc (FcR) (например, природные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), узнают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки- мишени. Первичные клетки для опосредования ADCC, ΝΚ-клетки, экспрессируют только FcyRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcyRI, FcyRII и FcyRIII. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках суммирована в таблице 3 на странице 464 в публикации Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Чтобы оценить активность в ADCC представляющей интерес молекулы можно осуществить анализы ADCC in vitro, такие как анализы, описанные в патентах США jN° 5500362 или 5821337. Применимые эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и природные клетки-киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно ADCC-активность представляющей интерес молекулы можно оценить in vivo, например, в животной модели, такой как модель, описанная в Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).
«Эффекторными клетками человека» являются лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcR и осуществляют эффекторные функции. Предпочтительно клетки экспрессируют, по меньшей мере, FcyRIII и осуществляют ADCC-эффекторную функцию. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), природные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; при этом предпочтительны РВМС и ΝΚ-клетки. Эффекторные клетки могут быть выделены из их природного источника, например, из крови или РВМС, как описано в настоящей публикации.
Термины «Fc-рецептор» и «FcR» используют для описания рецептора, который связывается с Fc-областью антитела. Предпочтительным FcR является FcR человека с нативной последовательностью. Кроме того, предпочтительным FcR является FcR, который связывает IgG-антитело (гамма-рецептор), и к предпочтительным рецепторам относятся рецепторы подклассов FcyRI, FcyRII (FcyRIIa и FcyRIIb), FcyRIII (FcyRIIIa и FcyRIIIb), включая различные аллели и альтернативно сплайсируемые формы указанных рецепторов. FcyRI проявляет высокую аффинность к IgG, тогда как FcyRII и FcyRIII проявляют более слабую аффинность. FcyRIIa и FcyRIIIa представляют собой активирующие FcyR, которые экспрессированы на моноцитах/макрофагах и моноцитах/макрофагах/естественных киллерных клетках, соответственно, и могут запускать цитотоксичность мишеней человека. Активирующий рецептор FcyRIIA содержит в своем цитоплазматическом домене основанный на тирозине мотив активации иммунорецептора (ITAM). Ингибирующий рецептор FcyRIIB содержит в своем цитоплазматическом домене основанный на тирозине мотив ингибирования иммунорецептора (ITIM) (см. обзор в Daeron, Ашш. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). Обзор, посвященный FcR, представлен в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Другие FcR, включая FcR, которые будут идентифицированы в будущем, включены в настоящем описании в термин «FcR». Термин также включает неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG в плод.
«Комплемент-зависимая цитотоксичность» или «CDC» относится к способности молекулы лизировать мишень в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (Clq) с молекулой (например, антителом) в комплексе со своим антигеном. Чтобы оценить активацию комплемента можно осуществить анализ CDC, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).
Термин «идентичность» или «гомологичность» следует толковать как означающее процентное содержание остатков аминокислот в кандидатной последовательности, которые идентичны остаткам соответствующей последовательности, с которой ее сравнивают, после сравнения последовательностей и введения «брешей», если необходимо достичь максимального процента идентичности для полной последовательности и не учитывая любые консервативные замещения как часть идентичности последовательности. Ни N- или С-концевой удлиняющей, ни инсерционные сегменты не следует толковать как уменьшающие идентичность или гомологичность. Методы и компьютерные программы для сравнения хорошо известны. Идентичность последовательности можно определить, используя программное обеспечение для анализа последовательности (например, Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave., Madison, WI 53705). Данное программное обеспечение подходит для подобных последовательностей путем определения степени гомологичности для разнообразных замещений, делеций (элиминирований) и других модификаций.
Фразу «гомологичный», что касается полипептидной последовательности антитела, следует толковать как антитело, проявляющее по крайней мере, 70%-ную, предпочтительно 80%-ную, более предпочтительно 90%-ную и наиболее предпочтительно 95%-ную идентичность последовательности относительно полипептидной последовательности. Термин в отношении последовательности нуклеиновой кислоты следует толковать как последовательность нуклеотидов, проявляющих, по крайней мере, 85%-ную, предпочтительно 90%-ную, более предпочтительно 95%-ную и наиболее предпочтительно 97%-ную идентичность последовательности относительно последовательности нуклеиновой кислоты.
Предлагается модификация(и) аминокислотных последовательностей антител, описанных в настоящей публикации. Например, может быть желательным улучшение аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела получают введением соответствующих изменений нуклеотидов в нуклеиновую кислоту антитела или пептидным синтезом. Такие модификации включают, например, делеции, и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Осуществляют любое сочетание делеции, инсерции и замены, чтобы получить конечную конструкцию, при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками. Изменения аминокислот также могут изменять посттрансляционные процессы в антителе, такие как изменение количества или положения сайтов гликозилирования.
Вариант модификации аминокислотных последовательностей антител с помощью аминокислотных замен. Такой вариант представляет собой замену, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка в молекуле антитела на другой остаток. Места, представляющие наибольший интерес для мутагенеза путем замен, включают гипервариабельные области или CDR, но также предполагаются изменения и в области FR или Fc. Консервативные замены показаны в таблице А под заголовком «предпочтительные замены». Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то могут быть введены дополнительные существенные изменения, названные «примерами заменам» в таблице А, или изменения, дополнительно описанные ниже при описании классов аминокислот, и может быть проведен скрининг продуктов.
Figure imgf000042_0001
Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность» или «нуклеиновокислотная последовательность», «полинуклеотид», «олигонуклеотид», «полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность», которые используются равнозначно в данном описании, обозначают четкую последовательность нуклеотидов, модифицированных или не модифицированных, определяющую фрагмент или участок нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую неприродные нуклеотиды и являющуюся либо двухцепочечной ДНК или РНК, либо одноцепочечной ДНК или РНК, либо продуктами транскрипции указанных
ДНК.
Здесь также следует упомянуть, что данное изобретение не относится к нуклеотидным последовательностям в их природной хромосомной среде, т.е. в природном состоянии. Последовательности данного изобретения были выделены и/или очищены, т.е. были взяты прямо или косвенно, например, путем копирования, при этом их среда была по меньшей мере частично модифицирована. Таким образом, также здесь следует подразумевать изолированные нуклеиновые кислоты, полученные путем генетической рекомбинации, например, с помощью принимающих клеток (клеток-хозяев), или полученные путем химического синтеза.
Ссылка на нуклеотидную последовательность охватывает его комплемент, если не указано иное. Таким образом, ссылка на нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать, как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью .
Выражение «контролирующие последовательности» относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в определенном организме - хозяине. Пригодные для прокариот контролирующие последовательности представляют собой, например, промотор, необязательно оператор и сайт связывания рибосомы. Как известно, в эукариотических клетках присутствуют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.
Нуклеиновая кислота «функционально связана», если она находится в функциональной связи с другой нуклеотидной последовательностью. Например, ДНК предпоследовательности или секреторной лидерной последовательности функционально связывают с ДНК полипептида, если он экспрессируется в виде предпротеина, который принимает участие в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связывают с кодирующей последовательностью, если он оказывает воздействие на транскрипцию последовательности; сайт связывания рибосомы функционально связывают с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что может облегчать трансляцию. Как правило, «функционально связан» обозначает, что связанные последовательности ДНК являются смежными, а в случае секреторной лидерной последовательности являются смежными и находятся в фазе считывания. Однако энхансеры не обязательно должны быть смежными.
Термин «вектор» при использовании в настоящем документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой плазмиду, т.е. кольцевую двухцепочечную часть ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. В некоторых вариантах осуществления изобретения векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации и эписомные векторы млекопитающих). В других вариантах осуществления изобретения векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и таким образом реплицируются вместе с геном хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально соединены. Такие векторы упоминаются в данном документе как «рекомбинантные экспрессирующие векторы» (или просто «экспрессирующие векторы»).
Термин «рекомбинантная клетка-хозяин» (или просто «клетка-хозяин») при использовании в данном документе означает клетку, в которую введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, которые могут включать, например, вектор в соответствии с настоящим изобретением, описанным выше. Настоящее изобретение относится также к клеткам-хозяевам, которые включают, например, нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь или ее антигенсвязывающие части, нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь или ее антигенсвязывающие части, или обе из них, первого связывающего домена и/или второго связывающего домена связывающей молекулы по данному изобретению. Следует понимать, что «рекомбинантная клетка-хозяин» и «клетка-хозяин» означают не только конкретную заявленную клетку, но также и потомство такой клетки. Поскольку модификации могут проходить в последующих поколениях вследствие мутации или воздействий окружающей среды, такое потомство не может, на самом деле, быть идентичным родительской клетке, но такие клетки по- прежнему включены в объем термина «клетка-хозяин» при использовании в настоящем документе.
Термин «эксципиент» используется в данном документе для описания любого ингредиента, отличающегося от соединения(-ий) по данному изобретению.
«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя антитело согласно изобретению и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых наполнителей, растворителей, разбавителей, носителей, вспомогательных, распределяющих и воспринимающих средств, средств доставки, таких как консерванты, стабилизаторы, наполнители, измельчители, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, подсластители, отдушки, ароматизаторы, антибактериальные агенты, фунгициды, лубриканты, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Примерами суспендирующих агентов являются этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксиэтилен, сорбитол и сорбитовый эфир, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант, а также смеси этих веществ. Защита от действия микроорганизмов может быть обеспечена с помощью разнообразных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, таких как парабены, хлорбутанол, сорбиновая кислота и подобные им соединения. Композиция может включать также изотонические агенты, например, сахара, полиолы, хлористый натрий и им подобные. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного начала, например, моностеарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, растительные масла (такие, как оливковое масло) и инъекционные органические сложные эфиры (такие, как этилолеат). Примерами наполнителей являются лактоза, молочный сахар, цитрат натрия, карбонат кальция, фосфат кальция и им подобные. Примерами измельчителей и распределяющих средств являются крахмал, альгиновая кислота и ее соли, силикаты. Примерами лубрикантов являются стеарат магния, лаурилсульфат натрия, тальк, а также полиэтиленгликоль с высоким молекулярным весом. Фармацевтическая композиция для перорального, сублингвального, трансдермального, внутриглазного, внутримышечного, внутривенного, подкожного, местного или ректального введения активного начала, одного или в комбинации с другим активным началом, может быть введена животным и людям в стандартной форме введения в виде смеси с традиционными фармацевтическими носителями. Пригодные стандартные формы введения включают пероральные формы, такие как таблетки, желатиновые капсулы, пилюли, порошки, гранулы, жевательные резинки и пероральные растворы или суспензии, сублингвальные и трансбуккальные формы введения, аэрозоли, имплантаты, местные, трансдермальные, подкожные, внутримышечные, внутривенные, интраназальные или внутриглазные формы введения и ректальные формы введения.
«Лекарственное средство (препарат)» - вещество (или смесь веществ в виде фармацевтической композиции) в виде таблеток, капсул, растворов, мазей и др. готовых форм, предназначенное для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилактики болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего.
Термин «заболевание или нарушение, опосредованное CD47 и PD-L1», подразумевает все заболевания или нарушения, которые либо прямо, либо косвенно связаны с CD47 и PD-L1, включая этиологию, развитие, прогресс, персистентность или патологию заболевания или нарушения. «Лечить», «лечение» и «терапия» относятся к методу смягчения или устранения биологического расстройства и/или по меньшей мере одного из сопутствующих ему симптомов. Используемый в данном документе термин «облегчить» болезнь, заболевание или состояние, означает уменьшение тяжести и/или частоты возникновения симптомов заболевания, расстройства или состояния. Кроме того, содержащиеся в данном документе ссылки на «лечение» включает ссылки на лечебную, паллиативную и профилактическую терапию.
В одном аспекте субъект лечения или пациент является млекопитающим, предпочтительно человеческим субъектом. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста. Термин «нарушение» означает любое состояние, которое можно улучшить в результате лечения по настоящему изобретению. В определение данного термина входят хронические и острые нарушения или заболевания, включающие в себя патологические состояния, которые вызывают предрасположенность млекопитающего к возникновению данного нарушения. Предпочтительным подлежащим лечению нарушением согласно изобретению, является рак.
Термины "рак" или "раковый" относятся к физиологическому состоянию или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым(/-ой) ростом/пролиферацией клеток. Это определение охватывает доброкачественные и злокачественные раковые заболевания. Примеры раковых заболеваний включают, но без ограничения, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких раковых заболеваний включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшины, печеночноклеточный рак, рак желудка, включая рак ЖКТ, рак поджелудочной железы, глиобластому, глиому, цервикальный рак, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия и матки, карциному слюнных желез, рак почки (почечноклеточную карциному), рак предстательной железы (рак простаты), рак наружных женских половых органов, рак щитовидной железы, печеночную карциному, карциному анального канала, карциному пениса, меланому и различные типы рака головы и шеи.
Термины «иммунный ответ», «аутоиммунная реакция», «аутоиммунное воспаление» относятся, например, к действию лимфоцитов, антиген-представляющих клеток, фагоцитирующих клеток, гранулоцитов и растворимых макромолекул, вырабатываемых указанными клетками или клетками печени (включая антитела, цитокины и комплемент, образующиеся в результате селективного повреждения, разрушения или элиминации из человеческого организма инвазивных патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых клеток или, в случаях аутоиммунитета или патологического воспаления, нормальных человеческих клеток или тканей).
«Терапевтически эффективным количеством» считается количество вводимого в процессе лечения терапевтического агента, которое избавит в определенной степени от одного или нескольких симптомов заболевания, по поводу которого проводится лечение.
Понятие «хроническое» применение относится к непрерывному (продолжительному) применению агента(ов) в противоположность острому (кратковременному) пути введения, так чтобы поддерживать первоначальное терапевтическое действие (активность) в течение длительного периода времени.
«Прерывистое» применение обозначает лечение, которое не осуществляют последовательно без перерывов, но которое скорее по своей природе является периодическим.
В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «иметь», «включать» и «содержать» или их вариации, такие как «имеет», «имеющий», «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать, как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых. Подробное описание изобретения
Антитело
Настоящее изобретение относится к антителам, которые связывают с CD47 H PD-L1.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретения антитело представляет собой полноразмерное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретения антитело включает один или два сайта связывания с PD-L1.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение сайт связывания с CD47 ингибирует взаимодействие CD47 рецептор и SIRPa лиганда, и/или сайт связывания с PD-L1 ингибирует взаимодействие PD-L1 с PD-1 рецептором.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, которое связывает CD47 и PD-L1 , и сайт связывания с CD47 которого включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую:
(a) CDR1 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 80% или 90% гомологичной или идентичной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NO: 1 - 4, то есть CDR1 передставляет собой последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 1 - 4 или последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 1 - 4 с 1 или 2 заменами;
(b) CDR2 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 80%, 84%, 86%, 88%, 92% или 96% гомологичной или идентичной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NO: 6 - 15, то есть CDR2 передставляет собой последовательность SEQ ID NO: 6 - 15 или последовательность, выбранную из группу SEQ ID NO: 6 - 15 с 1 , 2, 3, 4 или 5 заменами;
(c) CDR3 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 80%, 85%, 86% 90%, 93% или 95%гомологичной или идентичной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NO: 17 - 20, то есть CDR3 передставляет собой последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 17 - 20 или последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 17 - 20 с 1, 2 или 3 заменами.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, которое связывает CD47 и PD-L1 , и сайт связывания с CD47 которого включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую:
(d) CDR1 с аминокислотной последовательностью идентичной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NO: 1 - 4;
(e) CDR2 с аминокислотной последовательностью идентичной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NO: 6 - 15;
(f) CDR3 с аминокислотной последовательностью идентичной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NO: 17 - 20.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, которое связывает CD47 и PD-L1, и включает сайт связывания с CD47 содержащий:
(а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую:
(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 80% или 90% гомологичной или идентичной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NO: 1 4, то есть CDR1 передставляет собой последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 1 - 4 или последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 1 - 4 с 1 или 2 заменами; (ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 80%, 84%, 86%, 88%, 92% или 96% гомологичной или идентичной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NO: 6 - 15, то есть CDR2 передставляет собой последовательность SEQ ID NO: 6 - 15 или последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 6 - 15 с 1, 2, 3, 4 или 5 заменами,
(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 80%, 85%, 86%, 90%, 93% или 95% гомологичной или идентичной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NO: 17 - 20, то есть CDR3 передставляет собой последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 17 - 20 или последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 17 - 20 с 1, 2 или 3 заменами, и
(Ь) вариабельную область легкой цепи, содержащую:
(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 80% или 90%гомологичной или идентичной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NO: 22 - 34, то есть CDR1 передставляет собой последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 22 - 34 или последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 22 - 34 с 1 или 2 заменами,
(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 80%, 87% или94%гомологичной или идентичной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NO: 36 - 48, то есть CDR2 передставляет собой последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 36 - 48 или последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 36 - 48 с 1, 2 или 3 заменами,
(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 80%или 90% гомологичной или идентичной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NO: 50 - 64, то есть CDR3 передставляет собой последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 50 - 64 или последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 50 - 64 с 1 или 2 заменами.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, которое связывает CD47 и PD-L1, и включает сайт связывания с CD47 содержащий:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую:
(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NO: 1 - 4,
(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NO: 6 - 15,
(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NO: 17 - 20, и
(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую:
(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NO: 22 - 34,
(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NO: 36 - 48,
(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NO: 50 - 64.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, которое связывает CD47 и PD-L1, и включает сайт связывания с CD47 содержащий:
(а) вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NO: 66 - 88, и
(b) вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NO: 89 - 106.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, которое связывает CD47 и PD-L1, и включает сайт связывания с CD47 содержащий:
(a) вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NO: 66 - 88, и
(b) вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NO: 89 - 106.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, которое связывает CD47 и PD-L1, и включает сайт связывания с PD-L1 содержащий:
(а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую:
(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 80%гомологичной или идентичной последовательности SEQ ID NO: 5, то есть CDR1 передставляет собой последовательность SEQ ID NO: 5 или последовательность SEQ ID NO: 5 с 1 заменой;
(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 80%, 86% или 92% гомологичной или идентичной последовательности SEQ ID NO: 16, то есть CDR2 передставляет собой последовательность SEQ ID NO: 16 или последовательность SEQ ID NO: 16 с 1 , 2 или 3 заменами; (iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 80%, или 90% гомологичной или идентичной последовательности SEQ ID NO: 21 , то есть CDR3 передставляет собой последовательность SEQ ID NO: 21 или последовательность SEQ ID NO: 21 с 1 или 2 заменами, и
(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую:
(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 80%, 86% или 83% гомологичной или идентичной последовательности SEQ ID NO: 35, то есть CDR1 передставляет собой последовательность SEQ ID NO: 35 или последовательность SEQ ID NO: 35 с L 2 или 3 заменами;
(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 80%% гомологичной или идентичной последовательности SEQ ID NO: 49, то есть CDR2 передставляет собой последовательность SEQ ID NO: 49 или последовательность SEQ ID NO: 49 с 1 заменой;(ш) CDR3 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 80% или 90% гомологичной или идентичной последовательности SEQ ID NO: 65, то есть CDR3 передставляет собой последовательность SEQ ID NO: 65 или последовательность SEQ ID NO: 65 с 1 или 2 заменами.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, которое связывает CD47 и PD-L1, и включает сайт связывания с PD-L1 содержащий:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую:
(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5,
(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 16,
(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 21, и
(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую:
(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 35,
(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 49,
(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 65. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, которое связывает CD47 и PD-L1, характеризуется тем, что сайт связывания с CD47 представляет собой Fab, scFv, scFab или изолированные моно домены VH или VHH.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, которое связывает CD47 и PD-L1, характеризуется тем, что сайт связывания с PD-L1 представляет собой Fab, scFv, scFab или изолированные моно домены VH или VHH.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, которое связывает CD47 и PD-L1, характеризуется тем, что оно вызывает антитело-зависимой клеточной цитотоксичностью, макрофаг- опосредованный фагоцитоз, комплемент-зависимую цитотоксичность и/или опосредованную Т-клетками цитотоксичность в отношении клеток, несущих на поверхности антигены CD47 и/или PD-L1.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, которое связывает CD47 и PD-L1, характеризуется тем, что оно содержит Fc-фрагмент по меньшей мере с одной мутацией или модификацией, которая повышает антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) по сравнению с той же антитело без мутации или модификации.
Молекулы нуклеиновых кислот
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновых кислот, и последовательностям, кодирующим антитело к CD47 и PD-L1 по данному изобретению, описанным в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения различные молекулы нуклеиновых кислот кодируют первый домен и второй домен аминокислотной последовательности антитела к CD47 и PD-L1. Там, где первый домен и/или второй домен содержит тяжелую цепь и легкую цепь, в некоторых вариантах осуществления изобретения различные нуклеиновые кислоты кодируют тяжелую цепь и аминокислотные последовательности легкой цепи. В других вариантах осуществления изобретения та же молекула нуклеиновой кислоты кодирует последовательность тяжелой цепи и легкой цепи. В определенных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты может кодировать любую комбинацию из аминокислотных последовательностей (например, последовательности тяжелой и легкой цепи) первого и второго домена. В конкретном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты может кодировать аминокислотную последовательность первого связывающего домена и аминокислотную последовательность легкой цепи второго связывающего домена, необязательно включающей любую последовательность соединяющего их пептидного линкера. Ссылка на нуклеотидную последовательность, охватывает его комплемент, если не указано иное. Таким образом, ссылка на нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать, как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью. Термин «полинуклеотид», упоминаемый в данном документе, означает полимерную форму нуклеотидов, по меньшей мере 10 оснований в длину, либо рибонуклеотидов, либо дезоксинуклеотидов или модифицированную форму любого типа нуклеотида. Термин включает в себя одно- и двухцепочечные формы.
В любом из указанных выше вариантах осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот могут быть выделенными.
Молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может быть выделена из любого источника, который продуцирует антитело к CD47 и PD- L1. В определенных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты данному изобретению может быть синтезирована, а не выделена. В некоторых вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую VH домен из первого или второго домена антитела по данному изобретению, соединенного в рамках считывания с нуклеотидной последовательности, кодирующей константный домен тяжелой цепи из любого источника. Аналогичным образом, молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую VL домен из первой или второй области антитела по данному изобретению, объединеной в рамках считывания с нуклеотидной последовательностью, кодирующей константный домен легкой цепи из любого источника.
В еще одном аспекте настоящего изобретения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельный домен тяжелой (VH) и/или легкой (VL) цепей первого или второго связывающего домена, могут «преобразовываться» по всей длине генов антитела. В одном варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие домены VH или VL преобразуются в гены антитела по всей длине путем вставки в экспрессионный вектор, уже кодирующей константные домены тяжелой цепи (СН) или легкой цепи (CL), соответственно, так что VH сегмент функционально соединен с СН сегментом(-ами) в векторе и/или VL сегмент оперативно соединен с CL сегментом в векторе. В другом варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие VH и/или VL домены преобразуются в гены по всей длине антитела путем соединения, например, лигирования, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей VH и/или VL домены, к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей СН и/или CL домены с использованием стандартных молекулярно-биологических методов. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие по всей длине тяжелую и/или легкую цепи, могут затем экспрессироваться в клетке, в которую они были введены. Молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться для экспрессии большого количества рекомбинантных антител к CD47 и PD-L1. Молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться для получения человеческих антител, гуманизированных антител, химерных антител, биспецифических антител, одноцепочечных антител, иммуноадгезинов, диател, мутировавших антител и производных антител, как описано в настоящем документе.
Вектор
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к вектору, подходящему для экспрессии любой из нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящем документе.
Настоящее изобретение относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют любую из аминокислотных последовательностей антител к CD47 и PD-L1 или их частей (например, последовательностей тяжелой цепи первого и/или тяжелой и/или легкой цепи второго связывающих доменов) как описано в настоящем документе. Настоящее изобретение далее относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих слитые белки, модифицированные антитела, фрагменты антител.
В другом варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот и векторы могут быть использованы для изготовления мутировавших антител к CD47 и PD-L1. Антитела могут мутировать в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей первого и/или тяжелой и/или легкой цепей второго связывающего домена, например, для изменения связывающей способности антител. Например, мутация может произойти в одном или нескольких CDR-участках, чтобы увеличить или уменьшить Ко антител, чтобы увеличить или уменьшить k0ff или изменить специфичность связывания антитела в отношении FcRn. В другом варианте осуществления изобретения одной или более мутациям подвергнут аминокислотный остаток, который, как известно, изменен по сравнению с зародышевой линией в антителе, соответствующем первому или второму связывающему домену антитела к CD47 и PD-L1 по данному изобретению. Эти мутации могут быть сделаны в CDR-участке или каркасном участке вариабельного домена, или в константном домене. В предпочтительном варианте осуществления изобретения мутации произведены в вариабельном домене. В другом варианте осуществления изобретения одной или нескольким мутациям подвергнут аминокислотный остаток, который, как известно, изменен по сравнению с зародышевой линией в CDR-участке или каркасном участке вариабельного домена антитела по данному изобретению.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитела к CD47 и PD-L1 по данному изобретению экспрессируются путем вставки ДНК, кодирующей частично или полностью последовательность первого и второго связывающего домена (например, последовательности тяжелой и легкой цепи, где связывающий домен содержит последовательности тяжелой и легкой цепи), полученный, как описано выше, в экспрессионных векторах таким образом, что гены функционально соединены с необходимыми последовательностями, контролирующими экспрессию, такими как транскрипционные и трансляционные контрольные последовательности. Экспрессионные векторы включают плазмиды, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (AAV), вирусы растений, такие как вирус мозаики цветной капусты, вирусы табачной мозаики, космиды, YAC, EBV полученные эписомы и тому подобное. Молекулы ДНК могут быть лигированы в вектор таким образом, что последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию в векторе, выполняют предусмотренную функцию регуляции транскрипции и трансляции ДНК. Экспрессионный вектор и последовательности контроля экспрессии могут быть выбраны таким образом, чтобы быть совместимыми с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Молекулы ДНК, кодирующие частично или по всей длине последовательности первого и второго связывающих доменов (например, последовательности тяжелой и легкой цепи, где связывающий домен содержит последовательность тяжелой и легкой цепи) могут быть введены в отдельные векторы. В одном варианте осуществления изобретения любая комбинация указанных выше молекул ДНК вводится в тот же экспрессионный вектор. Молекулы ДНК могут быть введены в экспрессионный вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и вектора или лигированием тупых концов, если сайты рестрикции отсутствуют).
Подходящим вектором является тот, который кодирует функционально законченные последовательности СН или CL человеческого иммуноглобулина с конструированием соответствующего места рестрикции так, что любая последовательность VH или VL может быть легко включена и экспрессирована, как описано выше. НС - и LC-кодирование генов в таких векторах может содержать интронные последовательности, что приводит к общему увеличению белковых продуктов антитела путем стабилизации, соответствующей мРНК. Интронные последовательности находятся в окружении сплайс-донора и сплайс-акцептора сайтов, которые определяют, где будет происходить сплайсинг РНК. Расположение интронных последовательностей может быть либо в вариабельных или константных участках цепей антитела, или как в вариабельных, так и константных участках, когда используются несколько интронов. Прекращение полиаденилирования и транскрипции может произойти вниз по ходу сайта нативной хромосомы кодируемых участков. Рекомбинантный экспрессионный вектор также может кодировать сигнальный пептид, который облегчает выработку цепочки антитела клеткой-хозяином. Ген цепочки антитела может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид соединен с рамкой считывания аминоконца цепи иммуноглобулина. Сигнальным пептидом может быть сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (то есть, сигнальный пептид белка не иммуноглобулиновой природы).
Помимо цепочки генов антител, рекомбинантный экспрессионный вектор по данному изобретению может нести регулирующие последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепи антител в клетке-хозяине. Специалистам в этой области будет понятно, что дизайн экспрессионного вектора, включая выбор регулирующих последовательностей, может зависеть от таких факторов, как селекция клетки- хозяина для трансформации, уровень экспрессии желаемого белка, и т.д. Предпочтительные регулирующие последовательности для экспрессирующей клетки-хозяина млекопитающих включают вирусные элементы обеспечивающие высокий уровень экспрессии белков в клетках млекопитающих, таких как промоторы и/или энхансеры, полученные из ретровирусной LTR, цитомегаловируса (CMV) (например, CMV промотора/энхансера), обезьяньего вируса 40 (SV40) (например, SV40 промотора/энхансера), аденовируса, (например, большого позднего промотора аденовируса (AdMLP)), вирус полиомы, а также сильных промоторов млекопитающих, таких как промотор нативных иммуноглобулинов или промотор актина. Для дальнейшего описания вирусных регулирующих элементов и их последовательностей см., например, патенты США 5,168,062, 4,510,245 and 4,968,615. Способы экспрессии связывающих молекул, таких как антитела растений, в том числе описание промоторов и векторов, а также трансформация растений, известны в данной области техники. См., например, патент США 6,517,529. Методы экспрессии полипептидов в бактериальных клетках или клетках грибов, например, дрожжевых клетках, также хорошо известны в данной области техники.
В дополнение к генам цепи антитела и регулирующим последовательностям, рекомбинантные векторы экспрессии изобретения могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках- хозяевах (например, точки начала репликации) и гены селектируемого маркера. Ген селектируемого маркера облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые был введен вектор (см., например, патенты США 4,399,216, 4,634,665 и 5,179,017). Например, обычно ген селектируемого маркера придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую вектор введен. Например, гены селектируемого маркера включают ген дигидрофолат редуктазы (DHFR) (для использования в dhfr-клетках -хозяевах при селекции/амплификации метотрексата), ген нео (для селекции G418) и ген синтетазы глутамата.
Термин «последовательность контроля экспрессии», используемый в данном описании, означает полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, к которым они лигированы. Контролирующие экспрессию последовательности включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации, промотора и энхансера; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сплайсинг и сигналы полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака); последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при желании, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Характер таких контролирующих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина; в прокариотах такие контролирующие последовательности, как правило, включают промотор, сайт связывания рибосомы, а также последовательности терминации транскрипции; в эукариотах, как правило, такие контролирующие последовательности включают промоторы и последовательности терминации транскрипции. Термин «контролирующие последовательности» включает, как минимум, все компоненты, наличие которых имеет важное значение для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, чье присутствие является полезным, например, лидирующие последовательности и последовательности слившихся клеток. Клетки-хозяева
Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к способам получения антител к CD47 и PD-L1 по данному изобретению. Один вариант осуществления изобретения относится к способу получения антител, как определено в настоящем документе, содержащему введение получение рекомбинантной клетки-хозяина, способной экспрессировать антитела, культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии продукции антитела, и выделение полученного антитела. Антитело к CD47 и PD-L1, полученное такой экспрессией в таких рекомбинантных клетках -хозяевах упоминается в данном документе как «рекомбинантные антитела». Изобретение также относится к потомству клеток таких клеток-хозяев и антителам к CD47 и PD-L1, получаемым аналогично.
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела к CD47 и PD- L1 по изобретению и векторы, содержащие эти молекулы нуклеиновой кислоты, могут быть использованы для трансфекции подходящего млекопитающего или его клетки, растения или его клетки, бактериальной или дрожжевой клетки-хозяина. Преобразование может происходить любым известным способом для введения полинуклеотидов в клетку-хозяина. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают декстран-опосредованную трансфекцию, трансфекцию комплексом нуклеиновой кислоты и позитивно заряженного полимера, трансфекцию преципитатом нуклеиновой кислоты и фосфата кальция, полибрен-опосредованную трансфекцию, слияние протопластов, трансфекцию инкапсулированными в липосомы полинуклеотидами и прямую микроинъекцию ДНК в ядра. В дополнение, молекулы нуклеиновых кислот могут быть введены в клетки млекопитающих вирусными векторами. Способы трансфекции клеток хорошо известны в данной области техники. См., например, патенты США, 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 и 4,959,455. Способы трансформации клеток растений хорошо известны в данной области, включая, например, Agrobacterium-опосредованную трансформацию, биолистическую трансформацию, прямую инъекцию, электропорацию и вирусную трансформацию. Методы трансформации клеток бактерий и дрожжей также хорошо известны в данной области.
Клеточные линии млекопитающих, используемые в качестве хозяев для трансформации, хорошо известны в данной области и включают множество иммортализованных доступных клеточных линий. К ним относятся, например, клетки яичников китайского хомячка (СНО), NS0 клетки, клетки SP2, НЕК- 293Т клетки, 293 Фристайл клетки (Invitrogen), NIH-3T3 клетки, клетки HeLa, клетки почек хомячка (ВНК), клетки почек африканских зеленых мартышек (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), А549 клетки и ряд других клеточных линий. Клеточные линии выбираются путем определения, какие клеточные линии имеют высокие уровни экспрессии и обеспечивают необходимые характеристики продуцируемого белка. Другими клеточными линиями, которые могут быть использованы, являются клеточные линии насекомых, такие как Sf9 или Sf21 клетки. Когда векторы рекомбинантной экспрессии, кодирующие антитела к CD47 и PD- L1, вводятся в клетки -хозяева млекопитающих, антитела продуцируются путем культивирования клеток-хозяев в течение времени, достаточного для экспрессии антител в клетках-хозяевах или, предпочтительнее, выделения антител в питательную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. Антитела к CD47 и PD-L1 могут быть выделены из питательной среды с использованием стандартных методов очистки белка. Клетки-хозяева растений, например, включают Nicotiana, Arabidopsis, ряску, кукурузу, пшеницу, картофель и т.д. Клетки бактерий хозяина включают виды Е. coli и Streptomyces . Дрожжевые клетки-хозяева включают Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Кроме того, уровень продукции антител к CD47 и PD-L1 по данному изобретению из продуцирующей клеточной линии можно усилить с помощью ряда известных методов. Например, система экспрессии гена глутамин синтетазы (система GS) является достаточно распространенной для усиления экспрессии при определенных условиях. Система GS обсуждается в целом или частично в связи с патентами ЕР 0216846, 0256055, 0323997 и 0338841.
Вполне вероятно, что антитела к CD47 и PD-L1 различных клеточных линий или трансгенные животные будут отличаться друг от друга профилем гликозилирования. Однако все антитела к CD47 и PD-L1, кодируемые молекулами нуклеиновой кислоты, описанными в данном документе, или содержащими аминокислотные последовательности, приведенные в настоящем документе, являются частью данного изобретения, независимо от состояния гликозилирования связывающих молекул и в целом, независимо от наличия или отсутствия пост-трансляционных модификаций.
Получение антител
Изобретение относится также к способам и процессам получения антител к CD47 и PD-L1 и их антигенсвязывающих фрагментов.
Моноклональные антитела
Моноклональные антитела можно создавать, например, с помощью метода на основе гибридом, который впервые описан КоЫег и др., Nature, 256, 1975, с. 495, или с помощью методов рекомбинантной ДНК (US 4816567).
При использовании метода на основе гибридом мышь или другое пригодное животное-хозяин, такое как хомячок, иммунизируют согласно описанной выше методике, для того, чтобы вызывать образование лимфоцитов, которые продуцируют или могут продуцировать антитела, обладающие способностью специфически связываться с белком, применяемым для иммунизации. Согласно другому варианту лимфоциты можно получать в результате иммунизации in vitro. После иммунизации лимфоциты выделяют и затем сливают с клеточной линией миеломы с помощью приемлемого связывающего агента, такого как полиэтиленгликоль, с получением клетки гибридомы.
Полученные таким образом клетки гибридомы высевают и выращивают в пригодной культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, ингибирующих рост или выживание неслитых родительских клеток миеломы. Например, если родительские клетки миеломы не содержат фермента гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (HGPRT или HPRT), то культуральная среда для гибридом, как правило, должна включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (НАТ-среда), т.е. вещества, которые препятствуют росту клеток с дефицитом HGPRT.
Предпочтительными применяемые в качестве компонента для слияния клетками миеломы являются клетки, которые легко поддаются слиянию, поддерживают стабильный высокий уровень производства антител выбранными продуцирующими антитела клетками и чувствительны к избирательной среде, на которой происходит отбор несвязанных родительских клеток. Предпочтительными линиями клеток миелом являются линии мышиной миеломы, такие как созданные на основе мышиных линий опухолевых клеток линии МОРС-21 и МРС-11, которые можно получать из Salk Institite Cell Disrtibution Center, Сан-Диего, шт. Калифорния, США, и линии SP-2 или Х63- Ag8-653, которые можно получать из Американской коллекции типовых культур, Роквилл, шт. Мэриленд, США. Описано также применение линий клеток человеческой миеломы и гетеромиеломы типа «мышь-человек» для производства моноклональных антител (Kozbor, J. Immunol, 133, 1984, с. 3001).
Предпочтительно специфичность связывания моноклональных антител, полученных с использованием клеток гибридомы, определяют методом иммунопреципитации или с помощью анализа связывания in vitro, такого как радиоиммунный анализ (РИА) или твердофазный имммуноферментный анализ (ELISA). Аффинность связывания моноклонального антитела можно, например, определять с помощью Скэтчард-анализа, описанного у Munson и др., Anal. Biochem., 107, 1980, с. 220.
После выявления клеток гибридомы, которые продуцируют антитела требуемой специфичности, аффинности и/или активности, клоны можно субклонировать с помощью метода лимитирующих разведений и выращивать стандартными методами. Пригодные для этой цели среды включают, например, среду DMEM или RPMI-1640. Кроме того, клетки гидрибомы можно выращивать in vivo в виде асцитных опухолей в организме животных, например, путем внутрибрюшинной (i.p.) инъекции клеток мышам.
Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, можно отделять от культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки с помощью обычных методов очистки антител, например, аффинной хроматографией (например, с использованием протеин А- или протеин Q-сефарозы), или ионообменной хроматографии, хроматографии на гидроксилапатитах, гель- электрофореза, диализа и т.д.
ДНК, кодирующую моноклональные антитела, можно легко выделять и секвенировать с помощью общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые обладают способностью специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). В качестве предпочтительного источника такой ДНК служат клетки гибридомы. После выделения ДНК можно включать в экспрессионные векторы, которыми затем трансфектируют клетки-хозяева, такие как клетки Е. coli, обезьяньи COS- клетки, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые без трансфекции не продуцируют белок антитела, что приводит к синтезу моноклональных антител в рекомбинантных клетках -хозяевах. Обзор статей о рекомбинантной экспрессии в бактериях ДНК, кодирующей антитело. Согласно еще одному варианту осуществления изобретения моноклональные антитела или фрагменты антител можно выделять из фаговых библиотек антител, созданных с помощью методов, описанных у McCafferty и др., Nature, 348, 1990, сс. 552-554. У Clackson и др., Nature, 352, 1991, сс. 624- 628 и Marks и др., J. Mol. Biol, 222, 1991, сс. 581 -597 описано выделение мышиных и человеческих антител соответственно с помощью фаговых библиотек. В последующих публикациях было описано производство высокоаффинных (нМ-диапазон) человеческих антител с помощью перестановки цепи (Marks и др., Bio/Technology, 10, 1992, сс. 779-783), а также комбинаторная инфекция и рекомбинация in vivo в качестве стратегии конструирования очень больших фаговых библиотек (Waterhouse и др., Nucl. Acids. Res., 21, 1991, сс. 2265-2266). Таким образом, эти методы представляют собой реальную альтернативу традиционным методам выделения моноклональных антител на основе гибридом моноклональных антител.
ДНК, кодирующую антитело, можно также модифицировать, например таким образом, чтобы получать химерные или слитые полипептиды антител, например, путем замены последовательностей константных областей тяжелой и легкой цепи (Сн и CL) на гомологичные мышиные последовательности (US 4816567 и Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81, 1984, с. 6851) или с помощью ковалентного связывания кодирующей последовательности иммуноглобулина со всей или с частью кодирующей последовательности полипептида, не относящегося к иммуноглобулинам (гетерологичного полипептида). Не относящиеся к иммуноглобулинам полипептидные последовательности можно заменять на константные области антитела или заменять на вариабельные области антигенсвязывающего центра антитела, создавая химерное бивалентное антитело, которое содержит один антигенсвязывающий центр, обладающий специфичностью в отношении антигена, и другой антигенсвязывающий центр, обладающий специфичностью в отношении другого антигена. Гуманизированные антитела
Методы создания «гуманизированных» антител животных, кроме человека, известны в данной области. Предпочтительно гуманизированное антитело имеет один или несколько встроенных в него аминокислотных остатков, полученных из источника, отличного от человека. Эти полученные из источника, отличного от человека, аминокислотные остатки часто называют «импортными» остатками, поскольку их обычно получают из «импортной» вариабельной области. Гуманизацию в целом можно осуществлять согласно методу Winter с соавторами (Jones и др., Nature, 321, 1986, сс. 522-525) путем замены последовательностей гипервариабельного участка на соответствующие последовательности человеческого антитела. Таким образом, «гуманизированные» антитела представляют собой химерные антитела (US 4816567), в которых участок, существенно меньший, чем интактная человеческая вариабельная область, заменен соответствующей последовательностью, полученной из видов кроме человека. На практике гуманизированные антитела представляют собой, как правило, человеческие антитела, в которых часть остатков гипервариабельного участка и возможно часть остатков FR заменены остатками из аналогичных участков антител грызунов.
Выбор человеческих вариабельных областей как легкой, так и тяжелой цепи, предназначенных для получения гуманизированных антител, очень важен для снижения антигенности и НАМА-ответа (человеческое антимышиное антитело), когда антитело предназначено для лечения человека. Согласно так называемому методу «наилучшего подбора» последовательность вариабельной области антитела грызунов подвергают скринингу относительно полной библиотеки известных последовательностей человеческих вариабельных областей. Человеческую последовательность V- области, которая наиболее близка к последовательности из организма грызунов, идентифицируют и внутри нее выбирают человеческий каркасный участок (FR), пригодный для применения в гуманизированном антителе (Sims и др., J. Immunol., 151, 1993, с. 2296). В другом методе используют определенный каркасный участок, полученный из консенсусной последовательности определенной подгруппы легких или тяжелых цепей всех человеческих антител. Один и тот же каркасный участок можно применять для нескольких различных гуманизированных антител (Carter и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 89, 1992, с. 4285).
Также важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокой связывающей способности к антигену и других важных биологических свойств. Для решения этой задачи согласно предпочтительному способу гуманизированные антитела получают с помощью анализа родительских последовательностей и различных гуманизированных продуктов с использованием умозрительных трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов общедоступны и хорошо известны специалистам в данной области. Известны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных перспективных последовательностей иммуноглобулинов. Изучение этих изображений позволяет осуществлять анализ возможной роли остатков в функции перспективной последовательности иммуноглобулина, т.е. анализ остатков, которые влияют на способность перспективного иммуноглобулина связываться с антигеном. Таким путем можно выбирать остатки в FR и объединять с реципиентными и импортными последовательностями для достижения требуемых характеристик антитела, таких как повышенная аффинность к антигену(ам)-мишени(ням). Как правило, остатки гипервариабельного участка оказывают непосредственное и наиболее существенное влияние на связывание антигена. Гуманизированное антитело может представлять собой фрагмент антитела, такой как Fab-фрагмент, необязательно конъюгированный с одним или несколькими цитотоксическим(ими) агентом(ами) для создания иммуноконъюгата. В альтернативном варианте гуманизированное антитело может представлять собой полноразмерное антитело, например, полноразмерное антитело в виде IgGl.
Человеческие антитела и методика, основанная на применении фаговой дисплейной библиотеки
В качестве альтернативы гуманизации можно получать человеческие антитела. Например, в настоящее время можно получать трансгенных животных (например, мышей), которые после иммунизации могут продуцировать полный спектр человеческих антител без производства эндогенного иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготная делеция областей стыка гена тяжелой цепи антитела (Дн-сегмента) в организме химерных мышей и мышей с мутацией в зародышевой линии приводит к полному ингибированию производства эндогенного антитела. Перенос набора зародышевой линии гена человеческого иммуноглобулина в такую мутантную зародышевую линию мышей приводит к производству человеческих антител после контрольного заражения антигеном (US 5545806, 5569825, 5591669 (все на имя фирмы GenPharm); 5545807; и WO 97/17852).
В альтернативном варианте для получения человеческих антител и фрагментов антител in vitro из спектра генов вариабельной области (V) иммуноглобулина из организма иммунизированных доноров можно использовать фаговую дисплейную технологию (McCafferty и др., Nature, 348, 1990, сс. 552-554). Согласно этой методике гены V-области антитела клонируют в рамке считывания либо с основным, либо с минорным геном оболочечного белка нитчатого бактериофага, такого как М13 или fd, и презентируют в виде функциональных фрагментов антитела на поверхности фаговой частицы. Поскольку нитчатая частица содержит копию одноцепочечной ДНК фагового генома, селекции по признаку функциональных свойств антитела, также приводят к отбору гена, кодирующего антитело, которое обладает указанными свойствами. Таким образом, фаг имитирует некоторые свойства В-клетки. Фаговую презентацию можно осуществлять в различных форматах. Для фаговой презентации можно использовать различные источники сегментов V-генов. Clackson и др., Nature, 352, 1991, сс. 624-628 выделили различные наборы антител к оксазолону из небольшой произвольной комбинаторной библиотеки V-генов, полученной из селезенки иммунизированных мышей. Можно конструировать спектр V- генов, полученных из организма иммунизированных людей-доноров, и антитела к различному набору антигенов (включая аутоантигены) можно выделять в целом согласно методам, описанным у Marks и др., J. Mol. Biol., 222, 1991, сс. 581-597.
Как описано выше, человеческие антитела могут продуцироваться также in vitro активированными В-клетками (см. US 5567610 и 5229275).
Фрагменты антител
В определенных обстоятельствах целесообразно применять фрагменты антител, а не полные антитела. Меньший размер фрагментов способствует их быстрому клиренсу и может способствовать лучшему проникновению в плотные опухоли.
Для получения фрагментов антител разработаны различные методы. Традиционно эти фрагменты получали путем протеолитического расщепления интактных антител. Однако в настоящее время эти фрагменты можно получать непосредственно с помощью рекомбинантных клеток-хозяев. Fab-, Fv- и scFv- фрагменты антител можно экспрессировать и секретировать из Е. coli, что позволяет облегчать производство больших количеств указанных фрагментов. Фрагменты антител можно выделять из описанных выше фаговых библиотек антител. Согласно другому варианту Fab'-SH-фрагменты можно непосредственно выделять из Е. coli и химически сшивать с получением Р(аЬ')2-фрагментов (Carter и др., Bio/Technology, 10, 1992, сс. 163-167). Согласно другому подходу F(ab')2 - фрагменты можно выделять непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Fab- и F(ab')2- фрагмент с повышенным временем полужизни in vivo, в которых сохранены остатки эпитопсвязывающего рецептора, описаны в US 5869046. Специалистам в данной области должны быть очевидны другие методики получения фрагментов антител. В других вариантах осуществления изобретения выбранное антитело представляет собой одноцепочечный Fv- фрагмент (scFv) (см. WO 93/16185; US 5571894 и US США 5587458). Fv и scFv представляют собой единственные виды с интактными связывающими сайтами, лишенные константных областей; в результате их можно применять для пониженного неспецифического связывания при применении in vivo. Слитые белки, несущие scFv, можно конструировать для получения слияния эффекторного белка либо на Ν-, либо на С-конце scFv. Фрагмент антитела может представлять собой также «линейное антитело», например, описанное в US 5641870. Такие фрагменты линейного антитела могут быть моноспецифическими или биспецифическими.
Мультиспецифические антитела
Мультицифические антитела представляют собой антитела, которые обладают специфичностью к связыванию с покрайней мере двумя различными эпитопами. Например, биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами белка. Другие мультиспецифические антитела могут нести сайт связывания с CD47 и PD-L1 в сочетании с сайтом связывания другого белка. Биспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, F(ab')2- фрагментов би специфических антител).
Методы создания мультиспецифических антител известны в данной области. Например, общепринятое получение полноразмерных биспецифических антител основано на совместной экспрессии двух пар тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, где обе цепи имеют различную специфичность. Из-за случайного набора тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, эти гибридомы (квадромы) потенциально могут продуцировать смесь из 10 различных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Очистка правильной молекулы, которую обычно осуществляют в несколько стадий с помощью аффинной хроматографии, является довольно трудоемкой, а выход продукта - низким. Аналогичные процессы описаны в WO 93/08829.
Согласно другому подходу вариабельные области антитела с требуемой специфичностью связывания (антигенсвязывающие центры антитела) сливают с последовательностями константной области иммуноглобулина. Слияние предпочтительно осуществляют с константной областью тяжелой цепи Ig, которая включает по меньшей мере часть шарнирных Сн2- и СнЗ- областей. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере в одном из слияний присутствовала первая константная область тяжелой цепи (Сн1), содержащая сайт, необходимый для связывания легкой цепи. ДНК, кодирующие слияния тяжелой цепи иммуноглобулина и при необходимости легкой цепи иммуноглобулина, встраивают в различные экспрессионные векторы и ими совместно трансфектируют приемлемый организм-хозяин. Это обеспечивает большую гибкость в подборе общих пропорций трех полипептидных фрагментов в вариантах, когда в конструкции используют неравные соотношения трех полипептидных цепей с целью оптимизации выходов. Однако можно также встраивать кодирующие последовательности в две или во все три полипептидные цепи в одном экспрессионном векторе, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных пропорциях обеспечивает высокие выходы или, когда соотношения не имеют решающего значения. В предпочтительном варианте осуществления указанного подхода биспецифические антитела представляют собой гибрид тяжелой цепи иммуноглобулина, обеспечивающий первую специфичность связывания в первом плече, и гибрид пары тяжелая цепь - легкая цепь иммуноглобулина (что обеспечивает вторую специфичность связывания) во втором плече. Было обнаружено, что эта асимметричная структура облегчает отделение требуемой биспецифической молекулы от нежелательных комбинаций цепей иммуноглобулинов, поскольку присутствие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы облегчает разделение. Этот подход описан в WO 94/04690. Дополнительное подробное описание получения биспецифических антител см., например, Suresh и др., Methods in Enzymology, 121, 1986, с. 210.
Согласно следующему подходу, описанному в патенте US 5731168, можно сконструировать область контакта между парой молекул антител с целью повышения до максимального уровня процентного содержания гетеро дим еров, которые получают из культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительная область контакта включает по меньшей мере часть СнЗ- области. Согласно этому методу одну или несколько небольших аминокислот с боковыми цепями из области контакта первой молекулы антитела заменяют на молекулы с более крупными боковыми цепями (например, на тирозин или триптофан). Уравновешивающие «полости», идентичные или близкие по размеру болыпой(им) боковой(ым) цепи(ям) создают в области контакта второй молекулы антитела путем замены аминокислот с крупными боковыми цепями на аминокислоты с более мелкими боковыми цепями (например, на аланин или треонин). Это обеспечивает механизм, способствующий повышению выхода гетеродимера относительно других нежелательных конечных продуктов.
Биспецифические антитела включают перекрестносшитые антитела или «гетероконъюгаты». Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть сшито с авидином, а другое с биотином. Такие антитела можно использовать, например, для направленного переноса клеток иммунной системы к нежелательным клеткам (US 4676980) и для лечения ВИЧ- инфекции (WO 91/00360, WO 92/200373 и ЕР 03089). Антитела- гетероконъюгаты можно создавать с помощью любого из обычных методов введения перекрестных сшивок. Приемлемые кросс-линкеры хорошо известны в данной области и описаны в US 4676980 наряду с различными методами введения перекрестных сшивок.
Методы получения биспецифических антител из фрагментов антител также описаны в литературе. Например, биспецифические антитела можно получать с помощью химического связывания. Brennan и др., Science, 229, 1985, с. 81 описали методику, согласно которой интактные антитела подвергают протеолитическому расщеплению, получая Е(аЬ')2-фрагменты. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии агента, образующего комплексы с дитиолом, такого как арсенит натрия, для стабилизации соседних дитиолов и предупреждения образования межмолекулярных дисульфидных связей. Полученные Fab'-фрагменты затем превращают в тионитробензоатное (TNB) производное. Одно из Fab'-TNB-производных затем повторно превращают в Fab'-тиол путем восстановления меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количеством другого Fab'-TNB-производного, получая биспецифическое антитело. Полученные биспецифические антитела можно применять в качестве агентов для избирательной иммобилизации ферментов.
Достигнутый в настоящее прогресс позволяет облегчать непосредственное выделение из Е. coli Fab'-SH-фрагментов, которые можно химически сшивать с образованием биспецифических антител. Shalaby и др., J. Exp. Med., 175, 1992, с. 217-225 описали получение Р(аЬ')2-фрагмента молекулы полностью гуманизированного биспецифического антитела. Каждый Fab'-фрагмент по отдельности секретировался из Е. coli и его подвергали непосредственному химическому связыванию in vitro с получением биспецифического антитела. Полученное таким образом биспецифическое антитело обладало способностью связываться с клетками, для которых характерна сверхэкспрессия рецептора ЕгЬВ2, и с обычными человеческими Т-клетками, а также стимулировать литическую активность человеческих цитотоксических лимфоцитов, мишенью которых является опухоль молочной железы человека.
Описаны также различные методы получения и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифические антитела получали с помощью лейциновых «застежек-молний» (Kostelny и др., J. Immunol., 148(5), 1992, сс. 1547-1553). Пептиды лейциновых «застежек-молний» из белков Fos и Jim связывали с Fab'-фрагментами двух различных антител путем генного слияния. Гомодимеры антител восстанавливали в шарнирной области с получением мономеров, а затем путем повторного окисления получали гетеродимеры антител. Этот метод можно применять также для получения гомодимеров антител. Технология на основе «двойных антител», описанная Hollinger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1993, с. 6444-6448, представляет собой другой механизм получения фрагментов биспецифических антител. Фрагменты содержат VH-область, связанную с VL- областью линкером, который является слишком коротким, для того чтобы позволить произойти спариванию двух доменов одной и той же цепи. Таким образом, VH- и VL- области одного фрагмента должны спариваться с комплементарными VL- и VH-областями другого фрагмента, образуя тем самым два антигенсвязывающих центра. Описана также другая стратегия получения фрагментов биспецифических антител, основанная на применении одноцепочечных (Fv)- (sFv) димеров (см. Gruber и др., J. Immunol, 152, 1994, с. 5368). Под объем изобретения подпадают также антитела, имеющие более двух валентностей. Например, можно получать триспецифические антитела.
Поливалентные антитела
Поливалентное антитело может интернализоваться (и/или диссимилироваться) клеткой, экспрессирующей антиген, с которым связывается антитело, быстрее, чем бивалентное антитело. Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, могут представлять собой поливалентные антитела (отличные от класса IgM) с тремя или большим количеством антигенсвяызвающих центров (например, тетравалентные антитела), которые можно легко получать путем рекомбинантной экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидные цепи антитела. Поливалентное антитело может содержать димеризованный домен и три или большее количество антигенсвязывающих центров. Предпочтительный димеризованный домен содержит (или состоит из) Fc-фрагмент или шарнирную область. В таком случае антитело должно содержать Fc-фрагмент и три или большее количество антигенсвязывающих центров, расположенных на Ν-конце относительно Fc- фрагмента. Согласно настоящему описанию предпочтительное поливалентное антитело содержит (или состоит из) от 3 до примерно 8, но предпочтительно 4, антигенсвязывающих центров. Поливалентное антитело содержит по меньшей мере одну полипептидную цепь (и предпочтительно две полипептидные цепи), при этом полипептидная(ые) цепь(и) содержит(ат) две или большее количество вариабельных областей. Например, полипептидная(ые) цепь(и) может(ут) содержать VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc, где VD1 обозначает первую вариабельную область, VD2 обозначает вторую вариабельную область, Fc обозначает одну полипептидную цепь Fc-фрагмента, XI и Х2 обозначают аминокислоту или полипептид и п обозначает 0 или 1. Например, полипептидная(ые) цепь(и) может(ут) содержать следующую цепь: VH-CH1- гибкий линкер- VH-CH1 -Fc-фрагмент; или VH-CH1-VH-CH1 -Fc-фрагмент. Поливалентное антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, предпочтительно дополнительно содержит по меньшей мере 2 (и предпочтительно 4) полипептида вариабельной области легкой цепи. Поливалентное антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, может, например, содержать от примерно 2 до примерно 8 полипептидов вариабельной области легкой цепи. В контексте настоящего описания подразумевается, что полипептиды вариабельной области легкой цепи содержат вариабельную область легкой цепи и необязательно дополнительно содержит CL-область.
Фармацевтические композиции
Другим аспектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента (или в качестве единственного активного ингредиента) антитело, которое специфично к CD47 и PD-L1. Фармацевтическая композиция может включать по меньшей мере одно антитело к CD47 и PD-L1 и/или одну или более дополнительных связывающих молекул (например, антител), которые нацелены на один или более соответствующих поверхностных рецепторов, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции предназначены для улучшения, профилактики или лечения нарушений, которые опосредованы IgG.
«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя антитело к CD47 и PD-L1 согласно изобретению и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых эксипиентов, таких как наполнители, растворители, разбавители, носители, вспомогательные, распределяющие, средства доставки, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению и способы их изготовления будут бесспорно очевидными для специалистов в этой области. Производство фармацевтических композиций предпочтительно должно соответствовать требованиям GMP (надлежащей производственной практики). Композиция может включать буферную композицию, тонические агенты, стабилизаторы и солюбилизаторы. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного фармацевтического ингредиента, например, моностеарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, масла и инъекционные органические сложные эфиры.
«Лекарственное средство (препарат)» - вещество или смесь веществ в виде фармацевтической композиции в виде таблеток, капсул, порошков, лиофилизатов, инъекций, инфузий, мазей и др. готовых форм, предназначенное для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилактики болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего. Любой способ введения пептидов, белков или антител, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для антитела к CD47 и PD-L1 по данному изобретению.
Термин «фармацевтически приемлемый» означает один или несколько совместимых жидких или твердых компонентов, которые подходят для введения млекопитающему, предпочтительно человеку.
Термин «эксципиент» или «вспомогательное вещество» используется в данном документе для описания любого компонента, отличающегося от ранее описанных по данному изобретению. Это вещества неорганического или органического происхождения, используемые в процессе производства, изготовления лекарственных препаратов для придания им необходимых физико-химических свойств.
Под термином «буфер», «буферная композиция», «буферный агент» понимается раствор, способный сохранять значение рН, благодаря взаимодействию кислотных и щелочных компонентов, входящих в его состав, который дает возможность препарату антитела к CD47 и PD-L1 проявлять устойчивость к изменениям рН. В общем случае, преимущественными являются значения рН фармацевтической композиции от 4,0 до 8,0. В качестве буферных агентов могут быть использованы, например, ацетатный, фосфатный, цитратный, гистидиновый, сукцинатный и т.п. буферные растворы, но, не ограничиваясь ими.
Термины «тонический агент», «осмолитик» или «осмотический агент» в том виде, как они здесь использованы, относятся к эксципиенту, который может подводить осмотическое давление жидкого препарата антитела. «Изотоничный» препарат представляет собой препарат, который имеет осмотическое давление, эквивалентное давлению человеческой крови. Изотоничные препараты обычно имеют осмотическое давление от примерно 250 до 350 мОсм/кг. В качестве изотоноческих агентов могут быть использованы полиолы, моно- и дисахара, аминокислоты, соли металлов, например, хлорид натрия, и т.п., но, не ограничиваясь ими.
Под «стабилизатором» понимается вспомогательное вещество или смесь двух и более вспомогательных веществ, которые обеспечивают физическую и/или химическую стабильность активного агента. В качестве стабилизаторов могут быть использованы аминокислоты, например, аргинин, гистидин, глицин, лизин, глутамин, пролин, но, не ограничиваясь ими; поверхностно- активные вещества, например , полисорбат 20 (торговое наименование Tween 20), полисорбат 80 (торговое наименование Tween 80), полиэтилен- полипропилен гликоль и его кополимеры (торговые наименования Полоксамер (Poloxaner), Плуроник (Pluronic)), натрия додецилсульфат (SDS), но, не ограничиваясь ими; антиоксиданты, например, метионин, ацетилцистеин, аскорбиновая кислота, монотиоглицерол, соли серистых кислот, и т.п., но не ограничиваясь ими; хелатирующие агенты, например, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДТПА), цитрат натрия и т.п., но не ограничиваясь ими.
Фармацевтическая композиция является «стабильной», если активный агент сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность в течение заявленного срока годности при температуре хранения, например, при 2-8 °С. Предпочтительно, чтобы активный агент сохранял и физическую, и химическую стабильность, а также биологическую активность. Период хранения выбирается на основании результатов исследования стабильности при ускоренном и естественном хранении.
Фармацевтическая композиция по данному изобретению может изготавливаться, упаковываться или широко продаваться в виде единичной стандартной дозы или множества единичных стандартных доз в виде готовой лекарственной формы. Используемый в данном документе термин «единичная стандартная доза» означает дискретное количество фармацевтической композиции, содержащей заранее определенное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозировке активного ингредиента, который будет вводиться субъекту, или удобной части такой дозировки, например, половине или трети такой дозировки.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению, как правило, пригодны для парентерального введения в виде стерильных лекарственных средств, предназначенных для введения в организм человека с нарушением целостности кожных покровов или слизистых оболочек, минуя желудочно-кишечный тракт путем инъекций, инфузий или имплантации. Например, предполагается, что парентеральное введение включает, помимо прочего, подкожную, внутрибрюшинную, внутримышечную, внутривенную, внутриартериальную, интратекальную, внутрижелудочковую, интрауретральную, внутричерепную, внутрисуставнную, трансдермальную инъекцию или инфузи и почечные диализные инфузионные методики. Также предусмотрена региональная перфузия. Предпочтительные варианты осуществления изобретения включают внутривенный и подкожный пути. Любой способ введения пептидов или белков, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для антитела к CD47 и PD- L1 по данному изобретению.
Инъекционные лекарственные средства могут быть изготовлены, упакованы или проданы в стандартной лекарственной форме, например, в ампулах, флаконах, полимерных контейнерах, преднаполненных шприцах, устройствах для автоинжекции, но не ограничиваясь ими. Лекарственные средства для парентерального введения включают, помимо прочего, суспензии, растворы, эмульсии в масляных или водных основах, пасты и тому подобное.
Еще одним вариантом осуществления изобретения является лекарственное средство для парентерального введения, где фармацевтическая композиция предоставлена в сухой форме, то есть, порошка или гранул для растворения в подходящем растворителе (например, стерильной апирогенной воде) перед введением. Такое лекарственное средство может быть получено, например, с помощью лиофилизации, т.е. процесса, известного в данной области техники как сушка из замороженного состояния, включающая в себя замораживание препарата и последующее удаление растворителя из замороженного содержимого.
Антитело к CD47 и PD-L1 по данному изобретению может также вводиться интраназально или ингаляционно, самостоятельно, в виде смеси с подходящим фармацевтически приемлемым наполнителем из ингалятора, такого как аэрозольный контейнер под давлением, помпа, спрей, распылитель) или небулайзер, в котором используется или не используется подходящий пропеллент, или в виде назальных капель или спрея.
Лекарственное средство для парентерального введения может быть немедленного или модифицированного высвобождения. Лекарственные средства с модифицированным высвобождением включают отсроченное, замедленное, пульсирующее, контролируемое, нацеленное и программируемое высвобождение.
Терапевтическое применение антитела к CD47 и PD-L1 по данному изобретению
В одном аспекте антитело к CD47 и PD-L1 по данному изобретению применяется в лечении нарушений, которые опосредованы CD47 и PD-L1, например заболевание или нарушение выбрано из группы: ПРГШ (плоскоклеточный рак головы и шеи), рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы), КРР (колоректальный рак), гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ (немелкоклеточный рак легкого), рак почки, рак яичника, лимфома Ходжкина, MSI КРР (колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью), лейкоз (острый или хронический), неходжкинская лимфома, множественная миелома, миелодиспластический синдром.
В одном аспекте субъект лечения или пациент является млекопитающим, предпочтительно человеческим субъектом. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола и любого возраста.
В случае опухоли (например, раковой опухоли) терапевтически эффективное количество антитела или фрагмента антитела (например, антитела или фрагмента антитела, которое специфически связывает к CD47 и PD-L1) может уменьшать число раковых клеток; уменьшать начальный размер опухоли; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлять и, предпочтительно, прекращать) инфильтрацию раковыми клетками периферических органов; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлять и, предпочтительно, прекращать) метастазирование опухоли; ингибировать, до некоторой степени, рост опухоли; и/или облегчать, до некоторой степени, один или более симптомов, обусловленных расстройством. Антитело или фрагмент антитела может, до некоторой степени, предупреждать рост и/или убивать имеющиеся раковые клетки, оно может вызывать цитостатический и/или цитотоксический эффект. При терапии рака эффективность in vivo можно определять, например, оценивая общую продолжительность жизни (OS), время до прогрессирования заболевания (ТТР), общую частоту ответа опухоли на лечение (ORR), продолжительность ответа (DR) и/или качество жизни.
Используемые в данном документе термины «совместное назначение», «совместно назначенный» и «в сочетании с» относящиеся к антителу к CD47 и PD-L1 с одним или более другими терапевтическими агентами, как предполагается, означают, сслылаются или включают:
1) одновременное введение такой комбинации антитела к CD47 и PD-L1 по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в одной лекарственной форме, из которой указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,
2) одновременное введение такой комбинации антитела к CD47 и PD-L1 по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно в разных лекарственных формах, введение которых происходит практически в одно и то же время указанному пациенту, после чего указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту, 3) последовательное введение такой комбинации антитела к CD47 и PD- L1 по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно друг от друга в отдельных лекарственных формах, которые принимаются последовательно по времени указанным пациентом со значимым временным интервалом между каждым введением, после чего указанные компоненты высвобождаются в практически разное время указанному пациенту; а также
4) последовательное введение такой комбинации антитела к CD47 и PD- L1 по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в единый лекарственной форме, из которой высвобождение указанных компонентов происходит контролируемым образом, после чего они одновременно, последовательно или совместно высвобождаются в одно и то же время и/или разное время указанному пациенту, где каждая часть может быть введена одним или разными путями.
Антитело к CD47 и PD-L1 по данному изобретению могут назначаться без дополнительного терапевтического лечения, т.е. в качестве самостоятельной терапии. Кроме того, лечение антителом по данному изобретению может включать по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое лечение (комбинированная терапия). В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело к CD47 и PD-L1 может вводиться совместно или быть сформулировано с другим медикаментом/препаратом для лечения рака.
Термин «цитотоксическое средство» в используемом в настоящем описании смысле относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает функционирование клеток и/или вызывает разрушение клеток. Подразумевается, что термин включает радиоактивные изотопы (например, At211, 1131, 1125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические средства и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины, имеющие происхождение из бактерий, грибов, растений или животных, включая их фрагменты и/или варианты.
"Химиотерапевтическим средством" является химическое соединение, применимое для лечения злокачественной опухоли. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN®); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбохинон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метилмеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилмеламин; ацетогенины (например, буллатацин и буллатацинон); бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновую кислоту; камптотецин (включая синтетический аналог топотекан (HYCAMTIN®), СРТ-11 (иринотекан, CAMPTOSAR®), ацетилкамптотецин, скополектин и 9- аминокамптотецин); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); подофиллотоксин; подофиллиновую кислоту; тенипозид; криптофицины (например, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и СВ 1 -ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, например, калихеамицин гамма II и калихеамицин омега II (см., например, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33 : 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин А; эсперамицин; а также хромофор неокарциностатина и родственные хромофоры хромопротеинов - энедииновые антибиотики, аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-Ь-норлейцин, доксорубицин (включая ADRIAMICIN®, морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксору бицин, 2 -пирролинодоксору бицин, доксорубициноНО в инъецируемых липосомах (DOXOL®), липосомный доксорубицин TLC D-99 (MYOCET®), пегилированный липосомный доксорубицин (CAELYX®) и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат, гемцитабин (GEMZAR®), тегафур (UFTORAL®), капецитабин (XELODA®), эпотилон и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; средства, подавляющие функции надпочечников, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; компенсатор фолиевой кислоты, такой как фолиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазихон; элфорнитин; ацетат эллиптиния; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2"-трихлортриэтиламин; трихотецены (например, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("ага-С"); тиотепа; таксоид, например паклитаксел (TAXOL®), препарат паклитаксела на основе сконструированных связанных с альбумином наночастиц (ABRAXANETM) и доцетаксел (TAXOTERE®); хлорамбуцил; 6- тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; средства на основе платины, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин; алкалоиды барвинка, которые предотвращают полимеризацию тубулина из образующихся микротрубочек, включая винбластин (VELBAN®), винкристин (ONCOVIN®), виндезин (ELDISINE®, FILDESIN®) и винорелбин (NAVELBINE®); этопозид (VP- 16); ифосфамид; митоксантрон; лейковорин; новантрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота, включая бексаротен (TARGRETIN®); бифосфонаты, такие как клодронат (например, BONEFOS® или OSTAC®), этидронат (DIDROCAL®), NE-58095, золедроновую кислоту/золе дронат (ZOMETA®), алендронат (FOSAMAX®), памидронат (AREDIA®), тилудронат (SKELID®) или ризендронат (ACTONEL®); троксацитабин (1 ,3-диоксолановый нуклеозидный аналог цитозина); антисмысловые олигонуклеотиды, например, олигонуклеотиды, которые ингибируют экспрессию генов в путях передачи сигналов, вовлеченных в пролиферацию аберрантных клеток, таких как, например, РКС-альфа, Raf, H-Ras и рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R); вакцины, такие как вакцина THERATOPE® и вакцины для генной терапии, например вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® и вакцина VAXID®; ингибитор топоизомеразы 1 (например, LURTOTECAN®); rmRH (например, ABARELIX®); BAY439006 (сорафениб; Bayer); SU-1 1248 (Pfizer); перифосин, ингибитор ЦОГ-2 (например, целекоксиб или эторикоксиб), ингибитор протеосом (например, PS341); бортезомиб (VELCADE®); CCI-779; типифарниб (81 1577); орафениб, АВТ510; ингибитор Вс1-2, такой как облимерсен натрия (GENASENSE®); пиксантрон; ингибиторы EGFR (см. определение ниже); ингибиторы тирозинкиназ (см. определение ниже); и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше средств; а также сочетания двух или более указанных выше средств, такие как CHOP, сокращенное название комбинированной терапии циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизолоном, и FOLFOX, сокращенное название схемы лечения оксалиплатином (ELOXATINTM) в сочетании с 5-FU и лейковорином.
Также в указанное определение включены противогормональные средства, которые действуют, регулируя или ингибируя действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены со смешанным профилем агонист/антагонист, включая тамоксифен (NOLVADEX®), 4- гидрокситамоксифен, триоксифен, торемифен (FARESTON®); идоксифен, дролоксифен, ралоксифен (EVISTA®), триоксифен, кеоксифен и избирательные модуляторы рецепторов эстрогена (SERM), такие как SERM3; чистые антиэстрогены без агонистических свойств, такие как фулвестрант (FASLODEX®) и ЕМ800 (такие средства могут блокировать димеризацию рецепторов эстрогена (ER), ингибировать связывание ДНК, усиливать метаболизм ER и/или снижать уровни ER); ингибиторы ароматазы, включая стероидные ингибиторы ароматазы, такие как форместан и эксеместан (AROMASIN®), и нестероидные ингибиторы ароматазы, такие как анастразол (ARIMIDEX®), летрозол (FEMARA®) и аминоглутетимид и другие ингибиторы ароматазы, включая ворозол (RIVISOR®), ацетат мегестрола (MEGASE®), фадрозол, имидазол; агонисты рилизинг-гормона лютеинизирующего гормона, включая лейпролид (LUPRON® и ELIGARD®), гозерелин, бузерелин и триптерелин; половые стероиды, включая прогестины, такие как ацетат мегестрола и ацетат медроксипрогестерона, эстрогены, такие как диэтилстилбестрол и премарин и андрогены/ретиноиды, такие как флуоксиместерон, полностью трансретиноевая кислота и фенретинид; онапристон; антипрогестероны; понижающие регуляторы рецепторов эстрогенов (ERD); антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид и бикалутамид; тестолактон; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше средств; а также сочетания двух или более указанных выше средств.
Другими терапевтическими средствами, которые могут применяться в комбинации с антителами против CD47 и PD-L1 согласно изобретению могут быть ингибиторы функции фактора роста, например, такие ингибиторы включают антитела фактора роста и антитела рецептора фактора роста (например, анти-егЬВ2 антитело трастузумаб [Herceptin], анти-EGFR антитело панитумумаб, анти-erbB l антитело цетуксимаб [Erbitux, С225] и любые антитела факторов роста или рецепторов фактора роста, раскрытые Stern et al. Critical reviews in oncology/haematology, 2005, Vol. 54, ppl l -29); антиангиогенные агенты, такие как ингибирующие эффекты сосудистого эндотелиального фактора роста, [например, антитело против фактора роста сосудистых эндотелиальных клеток бевацизумаб (Avastin)], антитела против рецепторов сосудистого эндотелиального фактора роста, такие как анти-KDR антитела и анти-f tl антитела; антисмысловые нуклеотиды, например, направленные на вышеперечисленные мишени, такие как ISIS 2503, анти-ras антисмысловые средства или G3139 (Genasense), анти-Ьс12 антисмысловые средства; подходами генной терапии, включая, например, подходы с заменой аберрантных генов, таких как аберрантный р53 или аберрантный BRCA1 или BRCA2, GDEPT (ген -направленная ферментная пролекарственная терапия) подходы с использованием цитозиндеаминазы, тимидинкиназы или фермента бактериальной нитроредуктазы, и подходы, направленные на повышение толерантности пациента к химиотерапии или лучевой терапии, такие как генная терапия мультилекарственной резистентности; иммунотерапевтические подходы, включая, например, лечение Алемтузумабом (campath-lH), моноклональным антителом, направленным на CD52, или лечение антителами, направленными на CD22, ex vivo и in vivo подходы по повышению иммуногенности опухолевых клеток пациента, трансфекцию цитокинами, такими как интерлейкин 2 , интерлейкин 4 или гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор, подходы, направленные на снижение анергии Т -клеток, такие как лечение моноклональными антителами, ингибирующими функцию CTLA-4, подходы с использованием трансфицированных иммунных клеток, таких как цитокин-трансфицированные дендритные клетки, подходы с использованием цитокин-трансфицированных опухолевых клеточных линий и подходы, использующие анти-идиотипические антитела, адаптивный перенос Т-клеток с использованием Т-клеток, подвергнутых неспецифической активации или нацеленных на конкретный антиген, представляющий интерес, ex vivo; ингибиторы деградации белка, такие как ингибитор протеасом, такой как Велкейд (бортезомиб); биотерапевтические терапевтические подходы, например, использующие пептиды или белки (такие как антитела или растворимые конструкты внешних рецепторных доменов), которые секвестируют рецепторы лигандов, блокируют связывание лиганда с рецептором или ослабляют сигнализацию рецептора (например, вследствие повышенной деградации рецептора или сниженных уровней экспрессии).
Дозы и пути введения
Антитело к CD47 и PD-L1 по данному изобретению будет вводиться в количестве, эффективном для лечения состояния, о котором идет речь, т.е. в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого результата. Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от таких факторов, как конкретное состояние, по поводу которого проводится лечение, возраста, пола и веса пациента, а также является ли введение антитела к CD47 и PD-L1 самостоятельным лечением или оно проводится в комбинации с одним или более дополнительных методов лечения.
Схемы приема лекарственных средств можно регулировать, чтобы обеспечить оптимальный желаемый ответ. Например, может быть введен один болюс, несколько разделенных доз могут быть введены в течение некоторого времени, или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена в зависимости от остроты терапевтической ситуации. Особенно полезным является изготовление парентеральных композиций в стандартной лекарственной форме для простоты введения и однородности дозирования. Стандартная лекарственная форма при использовании в данном документе, относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для пациентов/субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для стандартных лекарственных форм по настоящему изобретению, как правило, диктуется и непосредственно зависит от (а) уникальных характеристик химиотерапевтического агента и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, которые должны быть достигнуты, и (Ь) ограничений, присущих в технике составления такого активного соединения для лечения субъектов.
Таким образом, квалифицированным специалистам понятно, исходя из раскрытия, представленного в данном документе, что дозы и режим дозирования корректируются в соответствии со способами, хорошо известными в терапевтической области. Это означает, что может быть легко установлена максимально переносимая доза и может быть также определено эффективное количество, обеспечивающее обнаруживаемый терапевтический эффект для пациента, так же, как и требования к времени введения каждого агента для достижения видимого терапевтического эффекта для пациента. Таким образом, хотя некоторые дозы и схемы режима введения приведены в качестве примеров в данном документе, эти примеры никоим образом не ограничивают дозы и режимы введения, которые могут понадобиться для пациента в практике применения настоящего изобретения.
Следует отметить, что значения дозировки могут изменяться, в зависимости от типа и тяжести состояния, которое следует облегчить, и может включать одну или более доз. Кроме того, необходимо понимать, что для любого конкретного пациента, конкретные схемы введения должны быть скорректированы через некоторое время согласно индивидуальной потребности и на усмотрение медицинского работника, который осуществляет введение или контролирует введение композиций, и что диапазоны концентрации, приведенные в данном описании, приведены только в качестве примера и не предназначены для ограничения объема или практики заявленных композиций. Кроме того, режим дозирования с композициями по данному изобретению может быть основан на различных факторах, включая тип заболевания, возраст, вес, пол, состояние здоровья пациента, тяжесть состояния, путь введения и конкретное используемое антитело к CD47 и PD- L1. Таким образом, режим дозирования может широко варьироваться, но может определяться регулярно с помощью стандартных методов. Например, дозы могут быть скорректированы на основе фармакокинетических и фармакодинамических параметров, которые могут включать клинические эффекты, такие как токсические эффекты или лабораторные значения. Таким образом, настоящее изобретение охватывает индивидуальное повышение дозы, которое определяется квалифицированным специалистом. Определение необходимой дозы и режимы хорошо известны в соответствующей области техники и будут понятны специалисту в данной области после ознакомления с идеями, раскрытыми в данном документе. Примеры подходящих способов введения предусмотрены выше.
Предполагается, что подходящая доза антитела к CD47 и PD-L1 по данному изобретению будет в диапазоне от 0,1-200 мг/кг, предпочтительно 0,1-100 мг/кг, в том числе около 0,5-50 мг/кг, например, около 1 -20 мг/кг. Антитело к CD47 и PD-L1 может быть введена, например, в дозе по меньшей мере 0,25 мг/кг, например, по меньшей мере 0,5 мг/кг, в том числе не менее 1 мг/кг, например, по меньшей мере 1,5 мг/кг, например, также как не менее 2 мг/кг, например, по меньшей мере 3 мг/кг, в том числе по меньшей мере 4 мг/кг, например, по меньшей мере 5 мг/кг; и например вплоть до максимально 50 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 30 мг/кг, например, вплоть до максимально 20 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 15 мг/кг. Введение будет повторяться обычно в подходящие промежутки времени, например, раз в неделю, раз в две недели, один раз каждые три недели или один раз каждые четыре недели, и так долго, как будет сочтено целесообразным ответственным врачом, который может в некоторых случаях увеличить или уменьшить дозу при необходимости.
Изделие (продукты) и наборы
Следующим вариантом осуществления изобретения является изделие, которое содержит продукты, применяемые для лечения рака, например, ПРГШ, рака шейки матки, рака без выявленного первоисточника, глиобластомы, рака пищевода, рака мочевого пузыря, ТНРМЖ, КРР, гепатоцеллюлярной карциномы, меланомы, НМРЛ, рака почки, рака яичника, лимфомы Ходжкина, MSI КРР, лейкоз (острый или хронический), неходжкинская лимфома, множественная миелома, миелодиспластический синдром. Изделие представляет собой контейнер и этикетку или листовку- вкладыш в упаковке, которые размещены на контейнере или вложены в него. Приемлемыми контейнерами являются, например, банки, пузырьки, шприцы и т.д. Контейнеры можно изготавливать из различных материалов, таких как стекло или пластмасса. Контейнер содержит композицию, эффективную для лечения определенного состояния, и может иметь стерильный входной канал (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или пузырек, снабженный пробкой, которую можно прокалывать с помощью иглы для подкожных инъекций). По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет собой антитело к PD-L1, предлагаемое в изобретении. На этикетке или листовке-вкладыше в упаковке указано, что композицию применяют для лечения конкретного состояния. Этикетка или листовка-вкладыш в упаковке дополнительно должны содержать инструкции по введению композиции антитела пациенту.
Листовка-вкладыш в упаковке содержит обычные инструкции, которые включают в поступающие в продажу упаковки терапевтических продуктов, в том числе примерную информацию о показаниях, применении, дозе, пути введения, противопоказаниях и/или мерах предосторожности, касающихся применения таких терапевтических продуктов. В одном из вариантов осуществления изобретения на листовке-вкладыше в упаковке указано, что композицию применяют для лечения рака, например, ПРГШ, рака шейки матки, рака без выявленного первоисточника, глиобластомы, рака пищевода, рака мочевого пузыря, ТНРМЖ, КРР, гепатоцеллюлярной карциномы, меланомы, НМРЛ, рака почки, рака яичника, лимфомы Ходжкина, MSI КРР, лейкоз (острый или хронический), неходжкинская лимфома, множественная миелома, миелодиспластический синдром.
Кроме того, изделие может дополнительно содержать второй контейнер с фармацевтически приемлемым буфером, таким как бактериостатическая вода для инъекций (БСВИ), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, оно может включать другие продукты, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, например, другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Изобретение относится также к наборам, которые можно применять для различных целей, например, для детектирования PD-L1 в тканях, клетках или жидкостях организма млекопитающего. Такой набор будет пригодным для скрининга ассоциированных с PD-L1 болезней. Набор включает специфический связывающий агент или антитело по изобретению и средства, указывающие на протекание реакции специфического связывающего агента или антитела с PD-L1, в случае его присутствия. В одном варианте воплощения антитело представляет собой моноклональное антитело. В одном варианте воплощения антитело, связывающее PD-L1, является меченым. В другом варианте воплощения антитело представляет собой немеченое первичное антитело, и набор дополнительно включает средства детектирования первичного антитела. В одном варианте воплощения средства детектирования включают меченое второе антитело, представляющее собой анти-иммуноглобулин. Антитело может быть меченым с помощью маркера, выбранного из группы, состоящей из флуорохрома, фермента, радионуклида и радионепрозрачного материала. Набор может представлять собой набор, который содержит антитела для выявления и количественной оценки PD-L1 in vitro, например, при осуществлении ELISA или Вестерн-блоттинга. Также, как и в случае изделия, набор содержит контейнер и этикетку или листовку- вкладыш в упаковке, расположенные на поверхности или внутри контейнера. Контейнер содержит композицию, которая включает по меньшей мере одно антитело к PD-L1, предлагаемое в изобретении. Дополнительные контейнеры могут содержать, например, разбавители и буферы, контрольные антитела. Этикетка или листовка-вкладыш в упаковке могут содержать описание композиции, а также инструкции по их применению in vitro или для целей диагностики.
Диагностическое использование и композиции
Антитело к CD47 и PD-L1 по настоящему изобретению также используются в диагностических процессах (например, in vitro, ex vivo). Например, антитело к CD47 и PD-L1 может использоваться для обнаружения или измерения уровня CD47 и/или PD-L1B образцах, полученных от пациента (например, образец ткани или образец жидкости тела, такой как воспалительный экссудат, кровь, сыворотка крови, жидкость кишечника, слюна или моча). Подходящие методы обнаружения и измерения включают иммунологические методы, такие как проточная цитометрия, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), хемилюминесцентный анализ, радиоиммуноанализ и иммуногистология. Изобретение далее включает наборы (например, диагностические наборы), содержащие антитела к CD47 и PD-L1, описанные в данном документе.
Примеры
Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.
Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения.
Пример 1.
Продукция рекомбинантных антигенов и антител в суспензионной культуре клеток млекопитающих.
Последовательности экстраклеточных доменов человека CD47 (Leul9- Vall34) и PD-L1 (Phel9-Arg238) (SEQ ID NO: 107-108) клонировали в плазмиду для наработки белка в клетках млекопитающих с тагом Fc (фиг. 1) по сайтам рестрикции Sall/Notl. Плазмиды нарабатывали в необходимых количествах в клетках E.Coli и очищали при помощи набора Qiagen. Последовательности вариабельных доменов антитела к CD47 (В6Н12, Stanford University, US20130142786) клонировали в плазмиды для наработки белка в формате IgGl в клетках млекопитающих. Плазмиды нарабатывали в необходимых количествах в клетках E.Coli и очищали при помощи набора Qiagen.
Антитела и антигены продуцировали в клетках постоянной клеточной линии, полученной из клеток яичника китайского хомячка (линия СНО-Т). Суспензионное культивирование осуществляли в колбах на орбитальном шейкере, с использованием бессывороточных сред производства компании Life Technologies Corporation и согласно инструкциям производителя. Для транзиентной экспрессии клетки в концентрации 2* 106/мл трансфецировали с помощью линейного полиэтиленимина (например, ПЭИ «МАХ», компания «Polysciences»). Соотношение ДНК/ПЭИ составляло 1 :3/1 : 10. Через 5-7 дней после трансфекции культуральную среду центрифугировали при 2000 g в течение 20 минут и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Целевые белки выделяли из культуральной жидкости с помощью аффинной хроматографии.
Рекомбинантные белки с Fc из культуральной жидкости выделяли и очищали, используя колонку для аффинной хроматографии с протеином А. Осветленную культуральную жидкость пропускали через колонку HiTrap rProtein A Sepharose FF объемом 5 мл (GE Healthcare), уравновешенную фосфатно-солевым буфером (ФСБ, рН 7,4). Затем колонку промывали 5 колоночными объемами ФСБ, чтобы вымыть неспецифически связывающие компоненты. Связанный антиген элюировали, используя 0,1 М глициновый буфер рН 3. Главный протеиновый пик элюции собирали и доводили его рН до нейтральности с помощью 1 М буфера Tris (рН 8). Все стадии проводили при скорости потока ПО см/ч. Далее белок переводили в ФСБ (рН 7,4) с помощью диализа, используя технологию Snake Skin Dialysis Tubing, фильтровали (0,22 мкм), переносили в пробирки и хранили при -70°С. Чистоту полученного раствора белка оценивали с помощью SDS-гель- электрофореза в 12% ПААГ нередуцирующих условиях Фиг 2.
Пример 2.
Получение полноразмерных антител.
Клонирование проводили по стандартной методике. Нарабатывали ПЦР-продукты, содержащие гены вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антител с праймерами содержащими сайты рестрикции. Вариабельный домен тяжелой цепи клонировали в вектор рЕЕ-Нс IgGl по сайтам рестрикции Sall/Nhel . Вариабельный домен легкой цепи клонировали в вектор рЕЕ-СК по сайтам рестрикции Sall/BsiWl . Полученные генетические конструкции передали на транзиентную наработку белков в клеточной линии СНО-Т. Белки выделяли и очищали по стандартной методике путем аффинной хроматографии на бактериальном белке Protein А как описано в Примере 1. Электрофорез проводили в денатурирующем 12% ПААГ с добавлением меркаптоэтанола Фиг.З и денатурирующем 8% ПААГ без добавлением мер капто этанола Фиг.4
Пример 3.
Создание наивной фаговой Fab-библиоте и человеческих антител MeganLibTM.
Суммарную РНК В -лимфоцитов из индивидуальных образцов крови более тысячи человеческих доноров выделяли с помощью набора RNeasy Mini Kit согласно предлагаемому протоколу (от QIAGEN). Концентрацию РНК определяли с помощью набора Nanovue (от GE Healthcare) и проверяли качество выделенной РНК с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле.
Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора MMLV RT kit (от Evrogen) согласно рекомендуемому протоколу с использованием обратной транскриптазы MMuLV и рандом-гексамерных олигонуклеотидов в качестве затравки. Продукты обратной транскрипции использовали в качестве матрицы в двухступенчатой полимеразной цепной реакции для получения генов вариабельных доменов, фланкированных сайтами рестрикции, с использованием набора олигонуклеотидов по протоколам авторов [J Biol Chem. 1999 Jun 25; 274(26): 18218-30].
Полученный ДНК препарат VL-CK-VH (обрабатывали эндонуклеазами рестрикции NheI/Eco91I и лигировали в оригинальную фагмиду рН5. Продукты лигирования трансформировали в электрокомпетентные клетки штамма SS320 E.Coli, приготовленные согласно протоколам [Methods Enzymol. 2000;328: 333-63.]. Репертуар комбинаторной фаговой Fab- дисплейной библиотеки MeganLibTM составлял 1011 трансформантов. Препараты фага Fab-библиотек готовили согласно процедуре, описанной ранее [J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3): 581-97].
Пример 4.
Иммунизация ламы CD47 антигеном человека и создание фаговой дисплейной библиотеки фрагментов антител ламы.
Животное Lama Glama последовательно иммунизировали 5 раз путем подкожного введения антигенного материала, смешанного с равным объемом полного (при первой инъекции) или неполного (при остальных инъекциях) адъюванта Фрейнда. В качестве антигена использовали рекомбинантный белок CD47 человека, описанный в Примере 1 по 1 мг на 1 инъекцию. Инъекции антигенов проводили на следующих сроках: 0, 2, 4, 5, 8 недели. Взятие крови (50 мл) проводили через 5 дней после каждой инъекции, начиная с третьей. В качестве антикоагулянта применяли 3,8% цитрат натрия в соотношении 1 :9. Отобранную кровь ламы разводили в 2 раза стерильным физиологическим раствором. 30 мл разбавленного раствора крови наслаивали на среду Lymphoprep™ (Axis- Shield, Norway) с плотностью 1 ,077 г/мл объемом 15 мл и проводили центрифугирование в течение 20 мин при 800g. Мононуклеарные клетки (лимфоциты и моноциты) отбирали из интерфазной зоны плазма/среда Lymphoprep, после чего промывали стерильным раствором PBS.
Полученный титр сывороточного иммуноглобулина против CD47, оцененный согласно стандартному протоколу, оказался не менее 1/100000, что является достаточным для приготовления библиотеки антител.
Суммарную РНК мононуклеарных клеток ламы выделяли с помощью набора RNeasy Mini Kit согласно предлагаемому протоколу (QIAGEN). Концентрацию РНК определяли с помощью Nanovue (GE Healthcare) и проверяли качество выделенной РНК с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле.
Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора MMLV RT kit (от Evrogen) согласно рекомендованному протоколу с использованием обратной транскриптазы MMuLV и рандом-гексамерных олигонуклеотидов в качестве затравки.
Продукты обратной транскрипции использовали в качестве матрицы в двухступенчатой полимеразной цепной реакции для получения генов монодоменов VHH, scFv или Fab фланкированных сайтами рестрикции, с использованием набора олигонуклеотидов и протоколам авторов [FASEB J. 2007 Nov;21(13):3490-8]. Полученный ДНК препарат генов VHH обрабатывали рестриктазами Ncol /Notl и лигировали в оригинальную фагмиду pscFv, аналогичной по всем элементам pHEN2, использованной в работе [FASEB J. 2007 Nov;21(13):3490-8]. Продукты лигирования трансформировали в электрокомпетентные клетки штамма SS320, полученные согласно протоколам [Methods Enzymol. 2000;328: 333-63.]. Репертуары библиотек на основе VHH составили 0,5-2* 10Е+8 независимых трансформантов. Репертуары библиотек на основе scFv и Fab составили 0,5- 2* 10Е+9 и 1 ,2-2,5* 10Е+9 соответсвенно. Препарат фага библиотек был приготовлен согласно процедуре, описанной ранее [J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3): 581-97].
Пример 5
Селекция фаговых дисплейных-библиотек фрагментов антител
Специфичные фаговые антитела против CD47 были получены из фаговой Fab, VHH или scFv дисплейных библиотек (Примере 3, 4) путем стандартных селекционных процедур, описанных ранее [ЕМВО J. 1994 Jul 15;13(14):3245-60, Nat Biotechnol. 1996 Mar;14(3):309-14; J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3): 581-97], но с использованием магнитных частиц и прибора KingFisher Flex, так как использование данной методики позволяет проводить параллельно до 96 различных схем и вариантов.
Человеческий биотинилированный антиген PD-L1 и CD47 (Fc, ЕРЕА) направленно иммобилизовали на поверхность стрептавидиновых магнитных частиц (streptavidin magnetic beads, NEB) в концентрации 10 мкг/мл для первого раунда, 2 мкг/мл для второго, 0,4 и 0,2 мкг/мл для третьего и четвертого, соответственно. Антиген инкубировали с частицами в течение 1 часа при комнатной температуре на ротаторе. Далее частицы отмывали ФСБ (рН 7,4) и блокировали поверхность частиц раствором 2% обезжиренного молока или 1% БСА на ФСБ (рН 7,4) в течение 1 часа. Человеческую фаговую библиотеку MeganLibTM разводили в концентрации 2* 10 13 фаговых частиц на мл в ФСБ (рН 7,4) с 2% обезжиренным молоком и нецелевым антигеном с тагом целевого антигена и преселектировали с магнитными частицами, не содержащими антиген на поверхности, для удаления неспецифически связывающихся фагов. 1Ь-5Ка-покрытые магнитные частицы затем были инкубированы с MeganLibTM в течении 1 -2 часов при комнатной температуре.
Несвязавшиеся фаги удаляли в ходе нескольких отмывок магнитных частиц раствором ФСБ (рН 7,4) с 0,1% Твин 20. Количество отмывок увеличивали от раунда к раунду (на 1 -ом раунде 3 отмывок, на 2-ом - 9 и на 3-ем - 12, на 4-ом-15). Фаги, связавшиеся с антигеном на поверхности магнитных частиц, элюировали с частиц 100 мМ раствором Gly-HCl (рН 2,2) в течение 15 мин при перемешивании, после элюции нейтрализовали раствор 1М TRIS-HC1 (рН 7.6). Бактерии штамма Е. coli TG1 инфицировали фагами и нарабатывали в культуре, после чего выделяли их и использовали в следующем раунде селекции. После трех -четырех раундов из культуры Е. coli TGI выделяли фагмидную ДНК согласно стандартному протоколу производителя (Qiagen). Обогащение библиотеки на целевые антигены и оценку присутствия неспецифически связывающихся фаговых частиц проводили при помощи иммуноферментного анализа поликлонального фага (ИФА).
Пример 6.
Иммуноферментный анализ поликлонального фага на специфические и неспецифические антигены.
Для проведения ИФА на высоко-сорбционные плашки (Greiner-Bio) иммобилизовали целевой антиген (CD47 и PD-L1) и нецелевой (с Fc-фьюжн белком). Белок добавляли в концентрации 1 и 5 мкг/мл соответственно, в 0,1 М NaHCC (рН 9.0) и титровали с шагом 2 до 7 разведения, после чего, герметично закрытые плашки инкубировали в течение ночи при +4°С. Все последующие этапы проводили по стандартному ИФА протоколу с использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы на базе роботизированной системы Tecan Freedom EVO 200 (от Тесап). Для блокирования неспецифического связывания в лунки планшетов добавляли блокирующий буфер 2% обезжиренное молоко или 1% БСА на ФСБ (рН 7,4). Планшеты инкубировали в течение часа при комнатной температуре. После отмывок фосфатно-солевым буфером, содержащим Твин-20 (ФСБТ), добавляли по 50 мкл на лунку тестируемого поликлонального фага. После промывания добавляли (50 мкл/лунку) анти-М13 HRP-конъюгированного вторичного антитела (от Pierce-ThermoScientific) в соотношении 1 :7500 в ФСТБ. После инкубации 50 минут при комнатной температуре планшеты отмывали ФСТБ три раза. Колориметрический сигнал развивали добавлением субстратного раствора (Н2О2-0,02% и ТМБ в СНзСОС а рН5.5) на 10 минут, затем реакцию останавливали добавлением 1% серной кислоты (20 мкл). Цветовой сигнал измеряли при длине волны 450 нм, используя подходящий планшет-ридер Tecan-Sunrise (от Тесап).
После третьего и четвертого раунда селекции на целевом антигене проведенный ИФА анализ препарата поликлонального фага показал значительное обогащение Фиг. 5. Для реклонирования и дальнейшего скрининга отобрали библиотеки, у которых наблюдали превышение сигнала более чем в 5 раз на минимальном разведении фаговых библиотек на негомологичные контрольные антигены.
Пример 7.
Ре лонирование генов фрагментов антител в э спрессионную плазмиду.
Реклонирование генов вариабельных доменов антител в экспрессионную плазмиду из фагмидного вектора после успешных раундов селекции осуществляли по стандартному протоколу с применением рестриктазно лигазного метода.
Полученный пул клонов, обогащенных VHH монодоменами или scFv, специфичных против CD47, был реклонирован в экспрессионную плазмиду рЕТ-22 (Novagen) под контроль Т7 промотора, содержащую дополнительно myc-tag и His6 tag последоваетльности на С- конце VHH. Гены Fab фрагментов для библиотек, содержащих обогащенные последовательности против CD47 антигена, были реклонированы в pLL4 экспрессионный вектор, под контролем lac промотора, и содержащий дополнительно myc-tag и His6 tag последоваетльности на С- конце СН1 домена тяжелой цепи.
В последующем экспрессионные вектора содержащие фрагменты антител, трансформировали в штамм Е. coli B121(DE3)Gold (Stratagene) для наработки фрагментов антител путем секреции в культуральную среду и проведения сравнительного анализа аффинности вариабельных фрагментов антител из дисплейных библиотек к антигену методом ИФА с использованием технологической платформы Mabnext Flow Chart.
Пример 8.
Анализ специфического связывания scFv или VHH монодомена с CD47-Fc человека.
ИФА (ELISA) использовали для измерения связывания исследуемых специфических фрагментов антител, из Примера 4, с CD47-Fc человека. Для анализа специфического связывания лунки планшетов ELISA (от Nunc ImmimoMaxisorp) покрывали 50 мкл (0,5 мкг/мл в IX покрывающем карбонатном буфере) CD47-Fc человека (Биокад), герметично закрывали и инкубировали в течение ночи при 4°С. Все последующие этапы проводили по стандартному ИФА протоколу с использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы на базе роботизированных систем GenetixQ- pix2xt (от Molecular Device) и Tecan Freedom EVO 200 (от Tecan). Для блокирования неспецифического связывания добавляли блокирующий буфер ВВ (200 мкл 0,5% нежирного молока в PBS). Планшеты инкубировали на шейкере в течение часа при комнатной температуре. После отмывок PBS- Твином добавляли по 100 мкл на лунку тестируемого клеточного супернатанта, содержащего исследуемый фрагмент антитела. Планшеты снова инкубировали, встряхивая, один час при комнатной температуре, после чего каждую лунку планшетов пять раз промывали буфером PBS-Твин. После промывания добавляли (50 мкл/лунку) mouse анти-MYC IgG clone 9Е10 (ThermoFisher Scientific) в соотношении 1 :5000 в PBS-Твин. Планшеты встряхивали на ротационном шейкере (50 мин, комнатная температура) и промывали пять раз буфером PBS-Твин, как описано выше. После промывания добавляли (50 мкл/лунку) anti-mouse IgG HRP конъюгат (ThermoFisher Scientific) в соотношении 1 : 10000 в PBS-Твин. Планшеты встряхивали на ротационном шейкере (50 мин, комнатная температура) и промывали пять раз буфером PBS-Твин, как описано выше. Колориметрический сигнал развивали добавлением ТМВ (50 мкл/лунку) до насыщения (в среднем 10-12 мин), затем дальнейшее развитие останавливали добавлением стопового раствора (25 мкл/лунку, 1% серная кислота). Цветовой сигнал измеряли при длине волны 450 нм, используя подходящий планшет -ридер Tecan-Sunrise (от Тесап). Степень связывания антитела была пропорциональна продуцированию цветового сигнала. Клоны, у которых цветовой сигнал превышал фоновый более чем в 5 раз, были проверены в конкурентном ИФА анализе для выявления антагонистических специфических фрагментов антител, блокирующих взаимодействие SIRP-Fc лиганда (BIOCAD) и рецептора CD47- Fc человека в условиях аналогичных описываемым [WO2016048188 А8] и с пониженным в 4 раза сигналом относительно контроля, не содержащего анализируемые фрагменты антител.
В результате скрининга 2400 клонов было получено 265 клонов scFv и VHH с указанным 5-кратным превышением в сигнале над фоном. Из данной панели позитивных клонов было получено 27 антагонистических клонов способных блокировать взаимодействие SIRP-Fc лиганда (BIOCAD) и рецептора CD47-Fc человека. Нуклеотидная последовательность генов позитивных клонов была определена секвенированием по Сенгеру на приборе 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). В качестве примера, было получено шесть клонов VHH монодоменов различных по последовательности более чем на 1 аминокислоту, но имеющих более 90% гомологии каждого из CDR участка друг с другом, что указывает на их происхождение от одного родительского клона путем in vivo матурации в иммунизированной ламе (Таблица!). Таблица 1. Последовательности специфических CD47 связывающих VHH монодоменов с CD47 человека.
Опт. ед. Опт. ед. Опт. ед. первичный связывание конкурент
Название Аминокислотная
скрининг на на CD47 ный клона последовательность
CD47-Fc фирменный скрининг с SIRP-Fc
QVKLEESGGGLVQPGG 0,4 0,448 0,095 SLRLSCAASRSISSINA
BCD 106- MNWYRQAPGKRREW
02_L.Alecto. VAQITGEGITNYRD S V
VHHSel2_M KGRFTIT SDNAKNTM Y
Р1 Н10 78 LQMNSLKPEDTAVYYC
NAFVIHTTSEVYWGQG TLVTVSS
AVQLVDSGGGLVQPG 0,166 0,426 0,143
GSLRLSCAASRSIFSINA
BCD 106- MNWYRQAPG RREW
02_L.Alecto. VAQITDEGITNYVD S V
VHHSel2_M KGRFTITRDNAKNTMY
P1 G5 37 LQMNSLKPEDTAVYYC
NAFVITTTSEIYWGQGT
TVTVSS
QVKLEESGGGLVQPGG 0,319 0,498 0,088
SLTLSCAASGIISSINAM
BCD 106- NWYRQAPGKRREWVA
02_L.Alecto. QITGEGITNCRDSWKG
VHHSel2_M RFSITSDSANNTMYLQ
P1 G7 53 MNNLKPDDTDVYYCN
AFVIHTTSEIYWGLGTT
VTVSS
DVQLVESGGGLVQPGG 0,213 0,312 0,114
BCD 106-
SLRLSCAASRNIFSINA
02_L.Alecto.
MNWYRQAPGKRREW VHHSel2_M VAQITSEGITNYVDSVK
P1 F10 76 GRFTITRDNAKNTMYL
QMNSLKPEDTAVYYC NAF VITAS SEVYWGQG TTVTVSS
AVQLVDSGGGLVQPG 0,127 0,379 0,14
GSLRLSCAASRSIFSINA
BCD 106- MNWYRQAPG RREW
02_L.Alecto. VAQITDEGITNYVD S V
VHHSel2_M KGRFTITRDNAKNTMY
P1_C7_49 LQMNSLKPEDTAVYYC
NAFVITTTSEIYWGQGT
TVTVSS
DVQLVESGGGLVQPGG 0,129 0,24 0,188 SLTLSCAASRNTFRINA
BCD 106- MNWYRQAPGKRREW
02_L.Alecto. VAPIT SEGITNYVD S VK
VHHSel2_M GRFTITRDNAKNTMYL
P1 B9 64 QMNSLKPEDTAVYYC
NACLIT AS SEVYWGQG TLVTVSS
Отрицательн 0,021 0,024 0,481 ый контроль
- антиген +
конъюгат
Пример 9.
Анализ специфического связывания Fab фрагментов с CD47-Fc человека.
Наработку Fab проводили по стандартной методике: бактериальные клетки трансформировали экспрессионными векторами, содержащими гены Fab, а последующее добавление индуктора, который запускает транскрипцию lac-оперона, в среду при культивировании полученных трансформантов вызывает экспрессию Fab.
Далее проводили ИФА с целью поиска Fab, связывающих CD47 человека.
В качестве позитивного контроля использовали В6Н12 Fab с опубликованной последовательностью (см. пример 1). Для анализа специфического связывания лунки планшетов ELISA (high binding от Greiner bio one) покрывали 50 мкл CD47 Fc lama (0,2 мкг/мл в 1 карбонатном буфере), герметично закрывали и инкубировали в течение ночи при 4°С. Все последующие этапы проводили по стандартному протоколу ИФА с использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы на базе роботизированных систем Genetix Qpix2xt (от Molecular Device) и Tecan Freedom EVO 200 (от Tecan). Для блокирования неспецифического связывания добавляли блокирующий буфер ВВ (200 мкл 0,5% нежирного молока в ФСБ). Планшеты инкубировали в течение часа при комнатной температуре. После отмывок ФСБ-Твином добавляли по 60 мкл на лунку тестируемого клеточного супернатанта, содержащего исследуемый Fab. Планшеты снова инкубировали один час при комнатной температуре, после чего каждую лунку планшетов три раза промывали буфером ФСБ-Твин. После промывания добавляли (50 мкл/лунку) анти-человеческого Fab HRP-конъюгированного вторичного антитела (от Pierce-Thermo Scientific) в соотношении 1 :7500 в ФСБ-Твин. Планшеты инкубировали 1 час при комнатной температуре и промывали три раза буфером ФСБ-Твин, как описано выше. Колориметрический сигнал развивали добавлением ТМВ (50 мкл/лунку) до насыщения (15 мин), затем дальнейшее развитие останавливали добавлением стопового раствора (25 мкл/лунку, 1% серная кислота). Цветовой сигнал измеряли при длине волны 450 нм, используя подходящий планшет -ридер Tecan-Sunrise (от Tecan). Степень связывания антитела была пропорциональна продуцированию цветового сигнала. Клоны, у которых цветовой сигнал превышал сигнал от контрольного антитела, проверяли в ИФА на неспецифическое связывание. Пример 10.
Анализ неспецифического связывания Fab фрагментов с различными антигенами человека.
Целью вторичного скринига является отобор клонов, продуцирующих Fab, которые взаимодействуют с полноразмерным антигеном CD47 и не взаимодействуют с неспецифичными антигенами, а также конкурируют с лигандом (CD47) за связывание с SIRPa.
Для анализа неспецифического связывания исследуемых Fab- фрагментов с другими антигенами использовали ИФА (ELISA). Исследование проводили, как описано выше, но в качестве антигенов для иммобилизации использовали 3DHer3-H6E, INFa2b, PD-Ll-Fc-lama (2,5 мкг/мл в 1 * карбонатном буфере). В качестве контроля специфического связывания использовали CD47 FE и CD47 Fc lama (0,2 мкг/мл в 1 * карбонатном буфере). Все последующие этапы проводили по стандартному протоколу ИФА с использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы на базе роботизированных систем Genetix Qpix2xt (от Molecular Device) и Tecan Freedom EVO 200 (от Tecan).
Конкурентный ИФА (ELISA) использовали для проверки отобранных ранее специфичных Fab против CD47 человека на способность блокировать взаимодействие с рецептором SIRPa. В качестве позитивного контроля антагониста использовали Fab с опубликованной последовательностью (см. пример 1).
SIRPa иммобилизовали в лунках планшетов ELISA (high binding от Greiner bio one) no 50 мкл с концентрацией 0.5 мкг/мл в 1 карбонатном буфере и инкубировали в течение ночи при 4°С. Все последующие этапы проводили по стандартным ИФА протоколам с использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы на базе роботизированных систем Genetix Qpix2xt (от Molecular Device) и Tecan Freedom EVO 200 (от Tecan). Для блокирования неспецифического связывания добавляли блокирующий буфер по BB (200 мкл 0,5% нежирного молока в ФСБ). Планшеты инкубировали в течение часа при комнатной температуре.
Параллельно в несорбирующих планшетах смешивали в соотношении 1 : 1 клеточный супернатант, содержащий тестируемый Fab и CD47 Fc lama (в конечной концентрации 1 мкг/мл в ФСБ-Твин), инкубировали в течение 45 минут при комнатной температуре.
После отмывок от ВВ планшета, содержащего рецептор SIRPa, туда переносили смесь Fab и CD47 Fc lama, инкубировали в течение 45 минут при комнатной температуре. После чего каждую лунку планшетов три раза промывали буфером ФСБ-Твин, добавляли по 50 мкл/лунку анти- человеческого Fab HRP-конъюгированного вторичного антитела (от Pierce- Thermo Scientific) в соотношении 1 :7500 в ФСБ-Твин. Инкубировали 45 мин при комнатной температуре, после чего каждую лунку планшетов три раза промывали буфером ФСБ-Твин, как описано выше. Колориметрический сигнал развивали добавлением ТМВ (50 мкл/лунку) до насыщения (в среднем 15 мин), затем дальнейшее развитие останавливали добавлением стопового раствора (25 мкл/лунку, 1% серная кислота). Цветовой сигнал измеряли при длине волны 450 нм, используя подходящий планшет -ридер Tecan-Sunrise (от Тесап). Степень связывания Fab была обратно пропорциональна продуцированию цветового сигнала. Клоны, показавшие блокирование на уровне контрольного Fab антитела, отмечали как позитивные и использовали в дальнейших анализах. Гены вариабельных доменов позитивных клонов секвенировали, согласно стандартным протоколам на аппарате Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) и анализировали.
Пример 11.
Сравнительный скрининг анти-С047 фрагментов антителпо кинетической константе диссоциации koff (kdis).
В качестве примера анализа кинетических параметров взаимодействия фрагментов антител, специфически связывающихся с рецептором CD47, провели измерение VHH фрагментов антител. Сравнительный скрининг по константе диссоциации (kdiS) для VHH-фрагментов проводили с использованием прибора Octet Red 96 и аминореактивных биосенсоров ARG2 (Pall-ForteBio). Константы аффинности можно рассчитать, зная точную концентрацию белка в анализируемом растворе и, так как в качестве раствора белков были использованы среды роста клеток и концентрации белков не были измеряны, то кандидаты сравнивали друг с другом по их константе диссоциации. Биосенсоры заранее регидратировали в течение часа в воде. После активации биосенсеров CD47-Fc в концентрации 10 мкг\мл в ацетатном буфере рН4 был неспецифически (по NH2 -группам) иммобилизован на поверхности биосенсора. Затем сенсоры погружались в лунки с клеточной средой роста со специфическими VHH (ориентировочно от 1 мкг VHH в 1 мл среды), где происходила ассоциация комплекса. После этого сенсоры погружались в буферный раствор, в котором и проходила последующая стадия диссоциации комплекса. В исследуемые образцы среды роста клеток Е. Coli, содержащих анти-С047 VHH-фрагменты, добавляли 1/10 объема 10х- рабочего буфера и перемешали. Анализ полученных кривых проводили с помощью программного обеспечения OctetDataAnalysis (версия 7.0) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 1 : 1.
Результаты koff-скрининга анти-С047 VHH кандидатов представлены в Таблице 2. Продемонстрировано специфическое связывание всех VHH- фрагментов с CD47 человека, кандидат BCD 106- 02_L.Alecto.VHHSel2_MPl_C7_49 по преимущественному kdis был выбран для дальнейшей работы и реклонирования для получения биспецифических антител. Таблица 2. Кинетические константы диссоциации VHH с CD47-Fc
Figure imgf000115_0001
Пример 12.
Получение конструкций и наработки ассиметричных биспецифических против CD47 и PD-L1 антител.
Последовательности всех вариабельных доменов оптимизированных scFv-фрагментов, также как и последовательности генов для синтеза дикого и мутантных вариантов вариабельного домена VHH кандидата BCD 106-02- VHH_C7_49 (Таблица 3) и гены вариабельных доменов легких и тяжелых цепей anti-PD-Ll антитела (BCD135 -оригинальное антитело человека компании BIOCAD) получали de novo расчетом с использованием фирменных компьютерных алгоритмов и ПЦР-синтезом из олигонуклеотидов, полученных на на синтезаторах ASM-2000 (Новосибирск) оп стандартному протоколу [http://www.openwetware rg/wiki^NA_Synthesis_from_01igos]. Длинные гены scFv были наработаны из генов VH и VL двух этапной ПЦР- синтеза из одноцепочечных молекул ДНК. После ПЦР синтеза фракционированные на агарозном геле фрагменты ДНК были очищены на колонках QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) Гены scFv и VHH лигированы индивидуально в плазмиду pEE-Fc(knob), тогда как вариабельные домен тяжелой цепи специфичного aPD-Ll антитела в pEE-Fc(hole) плазмиду. При этом pEE-Fc(knob) содержит Fc IgGl человека с мутациями S354C+T366W и pEE-Fc(hole) содержит Fc IgGl человека с мутациями Y349C+T366S+L368A, обеспечивающими гетеродимеризацию этих Fc частей друг с другом, при минимальной степени гомодимеризации [Nat Biotechnol. 1998 Jul;16(7):677- 81.] при совместной транзиентной экспрессии в клетках CHO-EBNA с варибельным доменом легкой цепи aPD-Ll, аналогично клонированную в pEE-Clambda. После реакции безлигазного клонирования методом модифицированного LIC [Aslanidis С, de Jong PJ. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 1990;18:6069-6074]) ДНК трансформировали в E.coli. Корректные по последовательности конструкции pEE-Fc(knob)-scFv или pEE-Fc(knob)-VHH котрансфецировали с рЕЕ- BCD135-VH-299P-HC-hole и pEE-BCD135-01 4LG VL hzau CL для получения так называемых ассиметричных биспецифических антител (см. фиг. 6). На данном рисунке представлены схематично модели ассиметричных биспецифических антител, А- на основе связывающих фрагментов anti-CD47 scFv и anti-PD-Ll Fab, Б- на основе связывающих фрагментов anti-CD47 VHH и anti-PD-Ll Fab. Полученные генетические конструкции были использованы в наработку белков в клеточной линии СНО-Т, согласно Примеру 2. Антитела после очистки были высокогомогенны по составу, продукционные выходы биспецифических антител варьировали от 60 до 260 мг/мл культуральной среды. На фиг. 7 приведены примеры очищенных биспецифических антител на основе anti-CD47 scFv фрагментов. На фиг. 8 приведены примеры очищенных биспецифических антител на основе anti-CD47 VHH фрагментов .Вариант антитела содержащий указанную в таб.3 VHH470pt3 последовательность дал крайне низкий выход антитела и был исключен из дальнейших анализов.
Таблица 3. Аминокислотные последовательности дикого (wild) и мутантных вариантов anti-CD47 VHH из BCD 106-02- VHH C7 49 клона и вариабельных доменов anti-PD-Ll BCD135. Серым указаны позиции anti- CD47 VHH с мутациями отличными от дикого типа.
Figure imgf000117_0001
Пример 13.
Анализ взаимодействия anti-PD-Ll/anti-CD47 биспецифичес их антител PD-Llc антигенами PD-L1 и CD47 человека на приборе OctetRED96.
Анализ взаимодействия биспецифических антител PD-Llc антигенами PD-L1 и CD47 человека проводили на приборе OctetRed 96 (Pall-ForteBio). Биосенсоры AR2G заранее были регидратированы в течение часа в mQ. После активации биосенсеров PD-Ll-Fc или CD47-Fc в концентрации 25 мкг\мл в ацетатном буфере рН4 были неспецифически (по NH2 -группам) иммобилизованы на поверхности биосенсора. Затем сенсоры погружались в лунки с растворами anti-PD-Ll/anti-CD47 антитела (10 мкг\мл). В этом растворе происходила ассоциация комплекса антитела и антигена. После этого сенсоры погружались в буферный раствор для последующей стадии диссоциации. Кривые связывания с вычетом базового сигнала анализировали с помощью программы Octet Data Analysis (версия 8.2) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 1 : 1.
Результаты анализов приведены в таблице 4. Таким образом можно заключить что антитела высокоаффинны, при этом аффиность к PD-L1 антигену в антителах такого формата составила нМ значения, тогда как аффиность к CD47 антигену имеет субнМ значения. Такое связывание считается достаточным для взаимодействия антитела с рецепторами на клетках мишени, для последующей проверки как in vitro так in vivo терапевтической активности. Таблица 4. Кинетические константы диссоциации anti-CD47/anti-PD-Ll биспецифических антител.
Figure imgf000119_0001
Пример 14.
Анализ взаимодействий anti-PD-Ll/anti-CD47 биспецифичес их антител с рецепторами CD47 и PD-L1 макаки циномолгус на приборе Forte Bio Octet RED 384.
Эксперименты по исследованию аффинности связывания антител к антигеам CD47 и PD-L1 животных проводили на приборе Forte Bio Octert RED 384. Антитела в концентрации 20 мкг/мл иммобилизовали на поверхность AR2G сенсоров (Forte Bio) по стандартному протоколу согласно инструкции производителя. Анализ проводили при 30°С с использованием ФСБ, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1 % БСА в качестве рабочего буфера. После того как в буферном растворе прописывали базовую линию сенсоры погружали в лунки с раствором антигенов (CD47 животных и PD-L1) на 300 секунд, где происходила ассоциация комплекса. Затем детектировали диссоциацию комплекса в буферном растворе в течении 600 секунд.
Кривые связывания с вычетом базового сигнала анализировали с помощью программы Octet Data Analysis (версия 9.0) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 1 : 1 Global. AHTH-CD47 антитела специфически связываются с антигенами макаки CD47 и PD-L1. Таблица 5 и Таблица 6.
Таблица 5. Кинетические значения взаимодействия антител к антигену макаки (CD-47).
Figure imgf000120_0001
Таблица 6. Кинетические значения взаимодействия антител к антигену макаки (PD-L1).
Figure imgf000121_0001
Пример 15.
Анализ неспецифического связывания anti-PD-Ll/anti-CD47 биспецифических антител с панелью антигенов на приборе Forte Bio Octet RED 384.
Эксперименты по исследованию неспецифического связывания проводили на панели неспецифичных антигенов с ГИС-тагом. Для измерения использовались биосенсоры Anti-hlgG Fc Capture (АНС) заранее регедратированые в течение 10 минут в ФСБ, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% БСА в качестве рабочего буфера.
Антитела в концентрации 30 мкг/мл иммобилизовали на поверхность Anti-hlgG Fc Capture (АНС) сенсоров (Forte Bio). Анализ проводили при 30°С с использованием ФСБ, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% БСА в качестве рабочего буфера. После того как в буферном растворе прописывали базовую линию, сенсоры погружали в лунки с раствором неспецифичных антигенов на 300 секунд, где происходила ассоциация комплекса. Затем детектировали диссоциацию комплекса в буферном растворе в течение 600 секунд.
Кривые связывания с вычетом базового сигнала анализировали с помощью программы Octet Data Analysis (версия 9.0) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 1 : 1 Global. anti-PD- Ll/anti-CD47 биспецифических антител не связываются неспецифически с панелью антигенов. Пример 16.
Анализ взаимодействия anti-PD-Ll/anti-CD47 биспецифичес их антител с панелью FcyRIIIa на приборе Forte Bio Octet RED 384.
Эксперименты по исследованию аффинности антител к панели Fc- связывающих белков проводились на приборе Forte Bio Octert RED 384, с использованием стрептавидиновых (SAX) биосенсоров заранее гедратированых в течение 30 минут в ФСБ, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% БСА.
Биотинилированные Fc-связывающие белки FcyRIIIa-F158 и FcyRIIIa- VI 58 с Ави-тагом в концентрации 5 мкг/мл в кинетическом буфере ФСБ, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% БСА рН 7,4 иммобилизировали на поверхность стрептавидиновых (SAX) сенсоров, с фиксированием tReCLoad - время достижения сигнала уровня равного 0,4 нм. После того как в буферном растворе прописывали базовую линию сенсоры погружали в лунки с раствором антител на 60 секунд, где происходила ассоциация комплекса. Затем детектировали диссоциацию комплекса в буферном растворе в течение 150 секунд.
Кривые связывания с вычетом референсного сигнала анализировали с помощью программы Octet Data Analysis (версия 9.0) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 2: 1 Global. anti-PD- Ll/anti-CD47 биспецифических антител специфически связываются с Fc- связывающими белками FcyRIIIa-F158 и FcyRIIIa-V158. Таблица 7 (- и Таблица 8.
Таблица 7. Кинетические значения взаимодействия антител BCD- 106(02-001 , 03-006, 02-013) к FcyRIIIa-F158.
Figure imgf000122_0001
Таблица 8. Кинетические значения взаимодействия антител BCD- 106(02-001 , 03-006, 02-013) к FcyRIIIa-V158.
Figure imgf000123_0001
Пример 17.
Анализ взаимодействия anti-PD-Ll/anti-CD47 биспецифичес их антител с FcRn на приборе Forte Bio Octet RED 384.
Эксперименты по исследованию аффинности антител к панели Fc- связывающих белков проводились на приборе Forte Bio Octert RED 384, с использованием стрептавидиновых (SAX) биосенсоров заранее гедратированых в течение 30 минут в ФСБ, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% БСА.
Биотинилированный FcRn с Ави-тагом в концентрации 5 мкг/мл в кинетическом буфере ФСБ, содержащим 0,1% Твин-20 рН 6 иммобилизировали на поверхность стрептавидиновых (SAX) сенсоров, с фиксированием tReCLoad - время достижения сигнала уровня равного 0,4 нм. После того как в буферном растворе прописывали базовую линию сенсоры погружали в лунки с раствором антител в кинетическом буфере ФСБ, содержащим 0,1% Твин-20 рН 6 на 60 секунд, где происходила ассоциация комплекса. Затем детектировали диссоциацию комплекса в кинетическом буфере ФСБ, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% БСА рН 7,4 в течение 150 секунд.
Кривые связывания с вычетом референсного сигнала анализировали с помощью программы Octet Data Analysis (версия 9.0) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 2: 1 Global. anti-PD- Ll/anti-CD47 биспецифических антител специфически связываются с FcRn. Таблица 9. Таблица 9. Кинетические значения взаимодействия антител BCD- 106(02-001 , 03-006, 02-013) к FcRn.
Figure imgf000124_0001
Пример 18.
Анализ способности anti-PD-Ll/anti-CD47 биспецифичес их антител PD-L1 вызывать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность на PD-L1 и CD47 позитивных клетках.
Для анализа ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity - антитело- зависимая клеточная цитотоксичность) использовали клеточную линию MDA-MB -231 , экспрессирующую на своей поверхности рецепторы PD-L1 и CD47, и мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС).
Получение мононуклеарных клеток периферической крови
РВМС получали фракционированием клеток венозной крови здоровых доноров в градиенте плотности. После выделения клетки культивировали в среде RPMI-1640 с 10% FBS в концентрации 2-5 х 106 кл/мл 18-24 часов при 37°С 5% С02.
Подготовка клеток-мишеней
Клетки MDA-MB-231 культивировали в среде DMEM с 10% FBS (фетальной бычьей сывороткой) при 37°С 5% С02. Клетки снимали с поверхности пластика с помощью трипсина, ресуспендировали в DMEM с 10% FBS. Добавляли Кальцеин AM до концентрации 5 мкМ. Через 30 минут отмывали клетки дважды от избыточного Кальцеина AM с помощью DMEM с 10% FBS. В среде DMEM с 10% FBS готовили суспензию клеток-мишеней с концентрацией 105кл/мл. Подготовка разведений исследуемых антител
Все исследуемые антитела разводили средой DMEM с 10% FBS до концентрации 10 мкг/мл. Готовили ряд последовательных разведений с шагом 5. Концентрации исследуемых антител составили (нг/мл): 10000; 2000; 400; 80; 16; 3,2; 0,64; 0,128; 0,0256; 0.
Подготовка РВМС
Мононуклеарные лимфоциты собирали из флаконов. Центрифугировали при 200 xg 5 минут. В среде DMEM с 10% FBS готовили суспензию клеток с концентрацией 5 х 106 кл/мл.
Проведение ADCC теста
В лунки 96-луночного планшета вносили по 50 мкл/лунку исследуемых антител. Добавляли в лунки с антителами по 100 мкл суспензии клеток- мишеней. Инкубировали планшет при 37°С 5% С02 15-20 минут. Добавляли в лунки с антителами и клетками-мишенями по 50 мкл суспензии РВМС. В три лунки (контроль максимального лизиза - KL) вносили по 50 мкл среды DMEM с 10% FBS, 100 мкл суспензии клеток-мишеней и 50 мкл суспензии РВМС. Инкубировали планшет при 37°С 5% С02 3,5-4 часа. За 30 минут до окончания инкубации в лунки KL вносили лизирующий буфер.
По окончании инкубации, планшеты центрифугировали при 200 x g 10 минут. Надосад очную жидкость переносили в новые 96 -луночные планшеты. Измеряли показания флуоресценции в относительных единицах флуоресценции при длине волны возбуждения/излучения 485/538 нм, используя планшетный флуориметр. ективность ADCC рассчитывали по формуле
Значение люминесценции в лунке (RLU) - Среднее знач. К (RLU)
ADCC(%) • 100,
Среднее знач. KL (RLU) - Среднее знач. К (RLU)
где
К- контроль спонтанного лизиса клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток (50 мкл/лунку среды DMEM с 10% FBS + ЮОмкл/лунка клеток- мишеней + 50 мкл/лунка РВМС)
KL - контроль максимального лизиса клеток-мишеней (50 мкл/лунку среды DMEM с 10% FBS + ЮОмкл/лунка клеток-мишеней + 50 мкл/лунка PBMCs + лизирующий буфер)
Данные экспериментов представлены на фиг. 9 и 10.
Согласно полученным данным, все антитела против CD47/PD-L1 имеют значения ЕС50, сопоставимые или превосходящие значение ЕС50 для контрольного воспроизведенного В6Н12 моноспецифичяеского антитела против CD47.
Пример 19.
Сравнение активности anti-PD-Ll/anti-CD47 биспецифических антител против CD47/PD-L1 в тесте на стимуляцию фагоцитоза макрофагальными клетками человека
Для анализа ADCP (Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis - антитело- зависимый клеточный фагоцитоз) использовали клеточную линию MDA-MB- 231, имеющую на своей поверхности рецепторы PD-L1 и CD47, и макрофагальные клетки человека.
Получение макрофагов человека
Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из венозной крови здоровых доноров разделением в градиенте плотности. С помощью набора для выделения фракции С014-позитивных клеток человека (Miltenyi Biotec) выделили моноциты крови человека. В лунках 24 -луночного планшета культивировали по 350 ООО моноцитов на лунку в 700 мкл RPMI- 1640 с 10% FBS, 100 нг/мл GM-CSF (Peprotech) при 37°С 5% С02 3 суток. На 4 день культивирования сменили среду на новую по 700 мкл RPMI-1640 с 10% FBS, 100 нг/мл GM-CSF (Peprotech), 50 нг/мл IFNy (Peprotech) и 10 нг/мл LPS (Sigma) на лунку, культивировали клетки при 37°С 5% С02 еще 3 суток.
Подготовка клеток-мишеней
Клетки MDA-MB-231 культивировали в среде DMEM с 10% FBS (фетальной бычьей сывороткой) при 37°С 5% С02. Клетки снимали с поверхности пластика с помощью трипсина и суспендировали в DMEM с 10% FBS. Добавляли Кальцеин AM до концентрации 5 мкМ. Через 30 минут отмывали клетки дважды от избыточного Кальцеина AM с помощью DMEM с 10% FBS. В среде DMEM с 10% FBS готовили суспензию клеток-мишеней с концентрацией 105 кл/мл.
Проведение ADCP теста
Отобрали из лунок планшета с макрофагами среду, внесли в лунки по 500 мкл среды RPMI-1640 с 10% FBS и 20 мкг/мл исследуемых антител. Добавили в лунки по 500 мкл суспензии клеток-мишеней. Инкубировали планшет при 37°С 5% С02 3 часа. После отобрали среду, сняли клетки с поверхности пластика с помощью реагента TrypLE Express, окрасили клетки флуоресцентно-меченными антителами против CD14. Анализировали суспензию окрашенных клеток на проточном цитофлюориметре.
Эффективность ADCP рассчитывали по формуле:
^ п , Калъцеин+С01 + , ^ ^ ,
Фагоцитоз% = х 100% , где
4 О 4+
Кальцеин+С014+ - количество CD 14 -позитивных клеток, содержащих окраску кальцеином
CD14+ - количество всех CD 14 -позитивных клеток Результаты представлены на фиг. 11.
Согласно полученным данным, ряд антител против CD47/PD-L1 имеют эффективность стимуляции фагоцитоза клеток линии MDA-MB-231 макрофагами человека, сопоставимую с эффективностью контрольного воспроизведенного В6Н12 моноспецифического антитела против CD47.
Пример 20.
Сравнение влияния кандидатов anti-PD-Ll/anti-CD47 биспецифических антител на гемагглютинацию эритроцитов человека
Для анализа способности антител вызывать геммаглютинацию использовались эритроциты человека.
Приготовление суспензии эритроцитов
Произвели забор крови из вены здорового донора в вакуумную пробирку с гепарином. Перенесли 9мл крови в центрифужную пробирку на 50 мл. Кровь развели до 30 мл раствором DPBS без Са2+ и Mg2+ комнатной температуры. Центрифугировали суспензию при 800g по 10 минут, надосадочную жидкость слили. Дважды повторили процедуру отмывки клеток с помощью DPBS без Са2+ и Mg2+ и центрифугирования. Затем 300 мкл клеточного осадка ресуспендировали в 30 мл DPBS, в результате чего получили 1% суспензию эритроцитов.
Проведение теста на геммаглютинацию
Испытуемые антитела развели в DPBS до концентрации 20 мкг/мл. В 96 луночном кругло донном планшете смешали по 100 мкл разведений антител и суспензии эритроцитов. Инкубировали планшет в С 02 -инкубаторе 16 часов при 37 °С. Учет результатов производили визуально по условной шкале 4 крестов. Достоверно-положительным считается результат от 2 крестов и выше. Результаты представлены в Таблице 10. Таблица 10. Реакция геммаглютинации в присутствии антител против CD47/PD-L1. Символ - обозначает отсутствие агглютинации.
Figure imgf000129_0001
Согласно полученным данным, ни одно из антител против CD47/PD-L1 не вызывают геммаглютинацию, тогда как контрольное воспроизведенное антитела В6Н12 моноклонального против CD47 вызывает значительную агглютинацию из-за бивалентного характера антитела, и способности таким образом взаимодействовать с двумя CD47 молекулами, расположенными на разных эритроцитах. Пример 21.
Анализ комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) биспецифичных aHTH-CD47/PD-Ll антител.
Для анализа CDC (Complement-Dependent Cytotoxicity - комплемент- зависимая цитотоксичность) в качестве клеток-мишеней использовали линию MDA-MB-231, имеющую на своей поверхности рецепторы PD-L1 и CD47.
Подготовка клеток-мишеней
Культуру MDA-MB-231 культивировали в питательной среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS).
Клетки снимали с поверхности пластика с помощью трипсина и суспендировали в среде DMEM с 0,1% BSA в концентрации 1 106 клеток/мл.
Подготовка разведений исследуемых антител
Все исследуемые aHTH-CD47/PD-Ll антитела разводили средой DMEM с 0,1% BSA до концентрации 100 мкг/мл. Готовили ряд последовательных разведений с шагом 8. Концентрации исследуемых антител составили (нг/мл): 100000; 12500; 1562,5; 195,3; 24,4; 3,05; 0,38; 0,04; 0,005.
Проведение CDC теста
Разморозили комплемент человека и развели 1 :4 в среде DMEM с 0,1% BSA.
В лунки 96-луночного планшета внесли по 50 мкл каждого разведения исследуемых антител, по 50 мкл среды с добавлением 0,1% BSA для каждого образца антитела - контроль клеток, по 150 мкл среды DMEM с 0,1% BSA - контроль среды.
В каждую лунку с исследуемыми антителами и контролем клеток внесли по 50 мкл суспензии клеток MDA-MB-231. Во все лунки с исследуемыми антителами и контролем клеток внесли по 50 мкл разведенного комплемента. Планшет встряхивали в течение 2-4 мин на орбитальном шейкере при комнатной температуре, поместили в С02 инкубатор на 2-3 ч с температурой 37°С.
Добавили по 15 мкл реактива Аламар Синий в лунки анализируемого планшета. Встряхивали планшеты в течение 10-20 минут при комнатной температуре на орбитальном шейкере для перемешивания. Дополнительно инкубировали планшеты в С02 инкубаторе в течение 18-24 часов.
Встряхивали планшеты в течение 10-20 минут при комнатной температуре на орбитальном шейкере для перемешивания.
Оценили показания флуоресценции в относительных единицах флуоресценции при длине волны возбуждения/испускания 544/590 нм, используя планшетный флуориметр. Полученный сигнал флуоресценции пропорционален количеству жизнеспособных клеток. Результаты представлены на фиг.12-15.
Согласно полученным данным исследуемые антитела не вызывают опосредованный комплементом лизис (CDC) клеточной линии MDA-MB-231.
Пример 22.
Анализ антагонистической активности anti-PD-Ll/anti-CD47 биспецифических антител культуре клеток, несущих мембранный PD-L1 рецептор.
Для анализа антагонистической активности aHTH-PD-Ll/CD47 антител против PD-L1 рецептора оценивали способность этих антител реактивировать люциферазный сигнал в репортерной клеточной линии Jurkat-PDl-NFAT-Luc при ко-культивировании с клетками-продуцентами PD-L1.
Подготовка клеток-продуцентов PD-L1
Культуру MDA-MB-231 культивировали в питательной среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS). Клетки снимали с поверхности пластика с помощью трипсина и суспендировали в концентрации 1 * 105 клеток/мл в среде DMEM с 10% FBS и 20 нг/мл интерферона гамма. Затем вносили по 200 мкл клеточной суспензии в лунки белого 96-луночного планшета и инкубировали 48ч в С02 инкубаторе при температуре 37°С, 5% С02.
Подготовка разведений исследуемых антител
Все исследуемые aHTH-CD47/PD-Ll антитела разводили средой RPMI- 1640 с 10% FBS до концентрации 5 мкг/мл. Готовили ряд последовательных разведений с шагом 3. Концентрации исследуемых антител составили (нг/мл): 2500; 833,3; 277,7; 92,5; 30,8; 10,2; 3,4; 1,1.
Подготовка клеток Jurkat-PDl-NFAT-Luc
В день постановки эксперимента готовили суспензию клеток Jurkat- PDl-NFAT-Luc с концентрацией 2,5* 106 клеток/мл в среде RPMI-1640 с 10% FBS.
Приготовление раствора активирующих антител
В день постановки эксперимента готовили 10-кратную смесь активирующих антител (4 мкг/мл анти-СБЗ; 4 мкг/мл анти-С028; 16 мкг/мл анти-mouse в среде RPMI-1640 с 10% FBS).
Проведение теста
Из планшета с клетками MDA-MB-231 удалили среду роста. В лунки с клетками внесли по 40 мкл разведений антител. В контрольные лунки (клетки без исследуемых антител, клетки без исследуемых и активирующих антител) внесли по 40 мкл среды RPMI 1640 10% FBS. Инкубировали при комнатной температуре 30 минут.
Далее во все лунки внесли по 40 мкл суспензии клеток Jurkat-PDl-NFAT- Luc. Затем внесли во все лунки по 10 мкл 10-кратного раствора активирующих антител, кроме контрольных лунок «клетки без исследуемых и активирующих антител». Клетки инкубировали 6 ч в С02 инкубаторе при температуре 37°С, 5% С02.
Внесли во все лунки субстрат к люциферазе One-Glo Luciferase Assay System «Promega» из расчета 1 : 1 (90 мкл/лунку). Через 5-10 минут измерили уровень люминесценции на планшетном ридере.
Согласно полученным данным Фиг. 16, исследованные anti-PD-Ll/anti-CD47 биспецифические антитела, как и контрольное anti-PD-Ll моноспецифическое антитело, являются антагонистами PD-L1 -зависимого сигнального пути, и, следовательно, могут стимулировать Т-клеточную зависимую цитотоксичность по отношению к клеткам, несущим PD-L1 рецептор.
Пример 23.
Анализ гомогенности препаратов anti-PD-Ll/anti-CD47 биспецифичес их антител.
Анализ гомогенности препаратов биспецифических антител проводили методом эксклюзионной ВЭЖХ (SEC HPLC) с УФ-детектором. Хроматографию проводили на системе ВЭЖХ Agilent 1100 на колонке Tosoh TSK-Gel G3000SWXL, 7.8 мм х 30 см, кат. Ш 08541 с предколонкой Tosoh TSKgel Guard SWXL, 6.0 мм x 4.0 см, с диаметром частиц 7 мкм, кат. N° 08543. Детектирование проводилось на длинах волн 220 и 280 нм. В качестве примера на Фиг.17 приведен ВЭЖХ профиль препарата BCD106-02-013, на основе VHH470pt2 (см. пример 12). По результатам данного теста можно заключить, что молекула BCD106-02-013 дает препарат гомогенный 93% по мономеру по агрегационному составу и применим для последующих тестов in vitro и in vivo.

Claims

Формула изобретения
1. Моноклоналы-юе антитело, специфически связывающееся с CD47 и PD-L1 , включающее один сайт связывания с CD47, и по крайней мере один сайт связывания с PD-L1.
2. Антитело по п. 1, характеризующееся тем, что антитело представляет собой полноразмерное антитело или его антигенсвязьгаающий фрагмент,
3. Антитело по п. 1 , характеризующееся тем, что антитело включает один или два сайта связывания с PD-L 1 ,
4. Антитело по п.1 , отличающаяся тем, что сайт связывания с CD47 ингибирует взаимодействие CD47 рецептора и 8IRP лиганда, и/или сайт связывания с PD-L.1 ингибирует взаимодействие PD-L! с PD-1 рецептором:.
5. Антитело по п.1 , характеризующееся тем, что сайт связывания с CD47 включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит последовательности CDR1 , CDR2, CDR3, где CDR1 представляет собой последовательность не менее чем на 80% гомологичную последовательности выбранной из следующей группы SEQ ID NO: 1 - 4, где CDR2 представляет собой последовательность не менее чем на 80% гомологичную последовательности выбранной из следующей группы SEQ ID NO: 6 - 15, где CDR3 представляет собой последовательность не менее чем на 80% гомологичную последовательности выбранной из следующей группы SEQ ID NO: 17 - 20.
6. Антитело по п.1 , характеризующееся тем, что сайт связывания с CD47 включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит последовательности CDR1 , CDR2, CDR3, где CDR1 представляет собой последовательность, выбранную из следующей группы SEQ ID NO: 1 - 4, где CDR2 представляет собой последовательность, выбранную из следующей группы SEQ ID NO: 6 - 15, где CDR3 представляет собой последовательность, выбранную из следующей группы SEQ ID NO: 17 - 20,
7. Антитело по п.1, характеризующееся тем, что сайт связывания с CD47 включает вариабельный домен тяжелой цепи по п.4, и вариабельный домен легкой цепи, который содержит последовательности CDR1, CDR2, CDR3, где CDR1 представляет собой последовательность не менее чем на 80% гомологичную последовательности выбранной из следующей группы SEQ ID NO: 22 - 34, где CDR2 представляет собой последовательность не менее чем на 80% гомологичную последовательности выбранной из следующей группы SEQ ID NO: 36 - 48, где CDR3 представляет собой последовательность не менее чем на 80% гомологичную последовательности выбранной из следующей группы SEQ ID NO: 50 - 64.
8. Антитело по п.1 , характеризующееся тем, что сайт связывания с CD47 включает вариабельный домен тяжелой цепи по п.4, и вариабельный домен легкой цепи, который содержит последовательности CDR1, CDR2, CDR3, где CDR1 представляет собой последовательность, выбранную из следующей группы SEQ ID NO: 22 - 34, CDR2 представляет собой последовательность, выбранную из следующей группы SEQ ID NO: 36 - 48, CDR3 представляет собой последовательность, выбранную из следующей группы SEQ ID NO: 50 - 64.
9. Антитело по п.1, характеризующееся тем, что сайт связывания с CD47 включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит последовательности гомологичные не менее чем на 90% последовательностям, выбранным: из следующей группы SEQ ID NO: 66 - 88, и вариабельный домен легкой цепи, который содержит последовательности гомологичные не менее чем на 90% последовательностям, выбранным: из следующей группы SEQ ID NO: 89 ~ i06„
10. Антитело по п.1, характеризующееся тем, что сайт связывания с CD47 включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит последовательности, выбранные из следующей группы SEQ ID NO: 66
- 88, и вариабельный домен легкой цепи, который содержит последовательности, выбранные из следующей группы SEQ ID NO: 89
- 106.
11. Антитело по п .1 , характеризующееся тем, что сай г связывания с PD-L 1 включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит последовательности гомологичные не менее чем на 80% следующим: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 21 , и вариабельный домен легкой цепи, который содержит последовательности гомологичные не менее чем на 80% следующим: SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 65.
12. Антитело по п.1 , характеризующееся тем, что сайт связывания с PD-L1 включает вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит следующие последовательности: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 21 , и вариабельный домен легкой цепи, который содержит следующие последовательности: SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 65.
13. Антитело по п.1 , характеризующееся тем, что сайт связывания с CD47 представляет собой Fab, scFv, scFab или изолированные монодомены VH или VI Ш.
14. Антитело по п.1 , характеризующееся тем, что сайт связывания с PD-L1 представляет собой Fab, scFv, scFab или изолированные монодомены VII или Villi.
15. Антитело по п.1, характеризующееся тем, что оно вызывает антитело- зависимую клеточную цитотоксичность, макрофаг-опосредованный фагоцитоз, и/или опосредованную Т-клетками цитотоксичность в отношении клеток, несущих на поверхности антигены CD47 и/или PD- 1,1.
16. Антитело по п.1, характеризующееся тем, что оно содержит Fc~ фрагмент по меньшей мере с одной мутацией или модификацией, которая повышает антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) по сравнению с той же антитело без мутации или модификации .
17. Антитело по любому из и. 1 -16 для применения в качестве лекарства для лечения рака.
18. Нуклеиновая кислота, которая кодирует антитело по любому из пп. 1 - 16.
19. Нуклеиновая кислота по п. 18, где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.
20. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп. 18-19.
21. Способ получения клетки-хозяина для получения антитела по любому из пп. 1-16, включающий трансформирование клетки вектором по п. 20.
22. Клетка-хозяин для получения антитела по любому из пп. 1 -16, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп. 18-19.
23. Способ получения антитела по любому из пп. 1 -16, заключающийся в культивировании клетки-хозяина по п. 22 в культуральной среде в условиях, достаточных для получения указанного антитела, при необходимости, с последующим выделением и очисткой полученного антитела.
24. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого PD-L1 и CD47, содержащая антитело по любому из пп. 1-16, в сочетании с одни или несколькими фармацевтически приемлемы ми эксципиентам и .
25. Фармацевтическая композиция по п. 24, предназначенная для профилактики или лечения: заболевания: или нарушения, опосредуемого PD-L1 и CD47, выбранного из группы: Г1РГШ (плоскоклеточный рак головы и шеи), рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы), КРР (колоректальный рак), гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ (Немелкоклеточный рак легкого), рак почки, рак яичника, MSI КРР (колоректальный рак с высокой икросателлитной нестабильностью), лейкоз (острый или миелобластный), лимфома, множественная миелома, рак молочной железы, рак предстательной железы, саркома, гепатоцеллюлярная карцинома, лимфома Ходжкина, Т~ и В-клеточном острый лимфобластный лейкоз, мелкоклеточный рак лёгкого, острый миелобластный лейкоз, рефрактерная В -клеточная неходжкинска лимфома, фолликулярная лимфома, В-клеточная лимфома маргинальной зоны, крупноклеточная В -клеточной диффузная лимфома, , рак поджелудочной железы, , и миелодиспластический синдром высокого риска.
26. Способ лечения заболевания или нарушения, опосредованного PD-L1 и CD47, включающий введение субъекту антитела по любому из пп. 1 - 16 или фармацевтической композиции по п. 24, нуждающемуся в таком лечении, в терапевтически эффективном количестве.
27. Способ лечения по п.26, где заболевание или нарушение выбрано из группы: ГГРГШ (плоскоклеточный рак головы и шеи), рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы), КРР (колоректальный рак), гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ (Немелкоклето ный рак легкого), рак почки, рак яичника, MSI КРР (колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью), лейкоз (острый или миелобластный), лимфома, множественная миелома, рак молочной железы, колоректальный рак, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, саркома, гепатоцеллюлярная карцинома, глиобластома, лимфома Ходжкина, Т- и В -клеточном острый лимфобластный лейкоз, мелкоклеточный рак лёгкого, острый миелобластный лейкоз, рефрактерная В -клеточная неходжкинская лимфома, фолликулярная лимфома, В -клеточная лимфома маргинальной зоны, крупноклеточная В -клеточной диффузная лимфома, плоскоклеточный рак головы и шеи, рак поджелудочной железы, рак яичника., острый: миелобластный лейкоз и миелодиспластический синдром высокого риска.
28. Способ иигибирования биологической активности PD-L1 и/или CD47 у субъекта, нуждающемуся в таком ингибировании, включающий введение субъекту эффективного количества антитела по любому из пп. 1-16.
29. Применение антитела по любому из пп. 1 -16 или фармацевтической композиции по п. 24 для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении заболевания или нарушения, опосредуемого PD-L1 и CD47.
30. Применение антитела по п.29, где заболевание или нарушение выбрано из группы: ПРГШ (плоскоклеточный рак головы и шеи), рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы), КРР (колоректальный рак), гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ (Немелкоклеточный ра легкого), рак почки, рак яичника, MSI КРР (колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью), лейкоз (острый или миелобластный), лимфома, множественная миелома, рак молочной железы, колоректальный рак, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, саркома, гепатоцеллюлярная карцинома, глиобластома, лимфома Ходжкина, Т- и В-клеточном: острый лимфобластный лейкоз, мелкоклеточный рак лёгкого, острый миелобластный лейкоз, рефрактерная В-клеточная неходжкинская лимфома, фолликулярная лимфома, В-клеточная лимфома маргинальной зоны, крупноклеточная В -клеточной диффузная лимфома, плоскоклеточный рак головы и шеи, рак поджелудочной железы, рак яичника, острый миелобластный лейкоз и миелодиспластический синдром высокого риска.
PCT/EA2018/050001 2017-10-03 2018-10-03 Антитела, специфичные к cd47 и pd-l1 WO2019068302A1 (ru)

Priority Applications (17)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MA49599A MA49599B1 (fr) 2017-10-03 2018-10-03 Anticorps spécifiques à cd47 et pd-l1
US16/753,587 US11840567B2 (en) 2017-10-03 2018-10-03 Bispecific antibodies with specific binding to CD47 and PD-L1
JP2020519341A JP2020535839A (ja) 2017-10-03 2018-10-03 Ｃｄ４７およびｐｄ−ｌ１に特異的な抗体
PE2020000513A PE20210460A1 (es) 2017-10-03 2018-10-03 Anticuerpos especificos para cd47 y pdl1
MX2020004027A MX2020004027A (es) 2017-10-03 2018-10-03 Anticuerpos especificos cd47/pd-l1.
BR112020006706-7A BR112020006706A2 (pt) 2017-10-03 2018-10-03 anticorpos específicos para cd47 e pd-l1
AU2018345458A AU2018345458A1 (en) 2017-10-03 2018-10-03 Antibodies specific to CD47 and PD-L1
CN201880078338.5A CN111801352A (zh) 2017-10-03 2018-10-03 对cd47和pd-l1特异性的抗体
JOP/2020/0078A JOP20200078A1 (ar) 2017-10-03 2018-10-03 أجسام مضادة خاصة بـ cd47 وpd-l1
KR1020207012767A KR20200058542A (ko) 2017-10-03 2018-10-03 Cd47 및 pd-l1에 특이적인 항체
EP18864490.0A EP3693390A4 (en) 2017-10-03 2018-10-03 ANTIBODIES SPECIFIC TO CD47 AND PD-L1
CA3078413A CA3078413A1 (en) 2017-10-03 2018-10-03 Antibodies specific to cd47 and pd-l1
PH12020550214A PH12020550214A1 (en) 2017-10-03 2020-04-03 Antibodies specific to cd47 and pd-l1
CONC2020/0004199A CO2020004199A2 (es) 2017-10-03 2020-04-08 Anticuerpos específicos cd47/pd-l1
RU2020115122A RU2779652C2 (ru) 2017-10-03 2020-04-29 АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К CD47 и PD-L1
ZA2020/02047A ZA202002047B (en) 2017-10-03 2020-05-04 Antibodies specific to cd47 and pd-l1
JP2023112302A JP2023130455A (ja) 2017-10-03 2023-07-07 Ｃｄ４７およびｐｄ－ｌ１に特異的な抗体

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201791961A EA039662B1 (ru) 2017-10-03 2017-10-03 Антитела, специфичные к cd47 и pd-l1
EA201791961 2017-10-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019068302A1 true WO2019068302A1 (ru) 2019-04-11

Family

ID=65994976

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EA2018/050001 WO2019068302A1 (ru) 2017-10-03 2018-10-03 Антитела, специфичные к cd47 и pd-l1

Country Status (21)

Country Link
US (1) US11840567B2 (ru)
EP (1) EP3693390A4 (ru)
JP (2) JP2020535839A (ru)
KR (1) KR20200058542A (ru)
CN (1) CN111801352A (ru)
AR (1) AR113342A1 (ru)
AU (1) AU2018345458A1 (ru)
BR (1) BR112020006706A2 (ru)
CA (1) CA3078413A1 (ru)
CL (1) CL2020000919A1 (ru)
CO (1) CO2020004199A2 (ru)
EA (1) EA039662B1 (ru)
EC (1) ECSP20024555A (ru)
JO (1) JOP20200078A1 (ru)
MA (1) MA49599B1 (ru)
MX (1) MX2020004027A (ru)
PE (1) PE20210460A1 (ru)
PH (1) PH12020550214A1 (ru)
TW (1) TWI768129B (ru)
WO (1) WO2019068302A1 (ru)
ZA (1) ZA202002047B (ru)

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020233539A1 (en) * 2019-05-17 2020-11-26 Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. Anti-cd47/anti-pd-l1 multiple antigen binding proteins and methods of use thereof
WO2020259605A1 (zh) * 2019-06-25 2020-12-30 信达生物制药(苏州)有限公司 包含抗cd47/pd-l1双特异性抗体的制剂及其制备方法和用途
JP2021505195A (ja) * 2017-12-04 2021-02-18 北京韓美薬品有限公司Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｈａｎｍｉ Ｐｈａｒｍ． Ｃｏ．， Ｌｔｄ． 天然抗体様構造を有し、ヘテロ二量体形態の抗ｐｄ−ｌ１／抗ｃｄ４７二重特異性抗体、ならびにその製造方法
WO2021062361A3 (en) * 2019-09-27 2021-06-03 Beijing Starmab Biomed Technology Ltd Monospecific and multi-specific antibodies
WO2022057939A1 (en) * 2020-09-21 2022-03-24 I-Mab Biopharma Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising cd47 antibody and pd-1/pd-l1 inhibitor
US11319378B2 (en) 2016-11-18 2022-05-03 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-PD-1/anti-HER2 natural antibody structural heterodimeric bispecific antibody and method of preparing the same
US11498977B2 (en) 2016-09-29 2022-11-15 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Heterodimeric immunoglobulin constructs and preparation methods thereof
JP2022551345A (ja) * 2019-12-17 2022-12-08 ファイザー・インク Ｃｄ４７、ｐｄ－ｌ１に特異的な抗体、およびその使用
WO2022271053A1 (en) * 2021-06-21 2022-12-29 Joint Stock Company "Biocad" Isolated bispecific antibody that specifically binds to cd47 and pd-l1
US11753471B2 (en) 2018-02-08 2023-09-12 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-PD-1/anti-HER2 natural antibody structural heterodimeric bispecific antibody and method of preparing same
RU2815823C2 (ru) * 2021-06-21 2024-03-22 Акционерное общество "БИОКАД" Выделенное биспецифическое антитело, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1
EP4105234A4 (en) * 2020-02-12 2024-04-03 Shanghai Escugen Biotechnology Co., Ltd. SINGLE-DOMAIN ANTIBODY TARGETING HUMAN CD47 AND USE THEREOF

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109970860A (zh) * 2017-12-27 2019-07-05 信达生物制药(苏州)有限公司 三链抗体、其制备方法及其用途
TWI802633B (zh) 2018-01-15 2023-05-21 大陸商南京傳奇生物科技有限公司 針對pd-1之單域抗體及其變異體
EP3564263A1 (en) * 2018-05-03 2019-11-06 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Fusion proteins comprising a cell surface marker specific vhh
EP3998287A4 (en) * 2019-07-08 2023-08-09 Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. ANTI-CD47/ANTI-PD-1 BISPECIFIC ANTIBODY, METHOD FOR ITS PRODUCTION AND ITS USE
CN112745392B (zh) * 2019-10-30 2022-07-01 上海洛启生物医药技术有限公司 抗pd-l1/cd47双特异性抗体及其用途
US20240067728A1 (en) * 2020-11-06 2024-02-29 Bio-Thera Solutions, Ltd. Bispecific antibody and use thereof
US20230406921A1 (en) * 2020-11-12 2023-12-21 Mabwell (shanghai) Bioscience Co., Ltd. Antibody and preparation method therefor
BR112023016713A2 (pt) * 2021-02-19 2023-10-31 Seoul Nat Univ R&Db Foundation Anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, molécula de ácido nucleico, métodos para produzir um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e para detectar agrupamento de diferenciação 47 ou determinar uma quantidade de agrupamento de diferenciação 47 em uma amostra, e, uso do anticorpo ou de um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo
JP2024513643A (ja) * 2021-02-19 2024-03-27 シャペロン インク． Ｐｄ－ｌ１に対する単一ドメイン抗体及びその用途
WO2022177394A1 (ko) * 2021-02-19 2022-08-25 (주)샤페론 Pd-l1 및 cd47에 대한 이중특이적 단일 도메인 항체 및 이의 용도
EP4335872A1 (en) * 2021-05-07 2024-03-13 Immuneoncia Therapeutics, Inc. Bispecific antibody specifically binding to cd47 and pd-l1
CN115702931A (zh) * 2021-08-06 2023-02-17 百奥泰生物制药股份有限公司 抗pd-l1/cd47双特异抗体在治疗疾病中的应用
WO2023051680A1 (zh) * 2021-09-30 2023-04-06 正大天晴药业集团股份有限公司 针对免疫检查点的双特异性抗体
WO2023154730A2 (en) * 2022-02-09 2023-08-17 Exelixis, Inc. Multispecific binding agents and uses thereof
KR20230163305A (ko) * 2022-05-19 2023-11-30 (주)샤페론 Pd-l1 및 cd47에 대한 이중특이적 인간화 단일 도메인 항체 및 이의 용도
WO2024022384A1 (en) * 2022-07-28 2024-02-01 Shenzhen Enduring Biotech , Ltd. Peg based anti-cd47/anit-pd-l1 bispecific antibody-drug conjugate

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014087248A2 (en) * 2012-12-03 2014-06-12 Novimmune S.A. Anti-cd47 antibodies and methods of use thereof
US20160108123A1 (en) * 2014-10-14 2016-04-21 Novartis Ag Antibody molecules to pd-l1 and uses thereof

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
AU641673B2 (en) 1989-06-29 1993-09-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
JPH06500011A (ja) 1990-06-29 1994-01-06 ラージ　スケール　バイオロジー　コーポレイション 形質転換された微生物によるメラニンの製造
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
AU668423B2 (en) 1992-08-17 1996-05-02 Genentech Inc. Bispecific immunoadhesins
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
DE19544393A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide Mischungen
CA2226962A1 (en) 1998-02-16 1999-08-16 Marie Sarfati Use of binding agents to cd47 and its ligands in the treatment or the prophylaxis of various inflammatory, autoimmune and allergic diseases and in the treatment of graft rejection
MXPA02001877A (es) 1999-08-23 2002-08-20 Dana Farber Cancer Inst Inc Pd-1, un receptor para b7-4, y usos del mismo.
US6517529B1 (en) 1999-11-24 2003-02-11 Radius International Limited Partnership Hemodialysis catheter
CN1220026C (zh) 2000-08-18 2005-09-21 林德股份公司 用于制造空气分离设备的方法
US7794710B2 (en) 2001-04-20 2010-09-14 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods of enhancing T cell responsiveness
SI1907424T1 (sl) 2005-07-01 2015-12-31 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Humana monoklonska protitelesa proti programiranem smrtnem ligandu 1 (PD-L1)
US8168757B2 (en) * 2008-03-12 2012-05-01 Merck Sharp & Dohme Corp. PD-1 binding proteins
DK2342226T3 (en) 2008-09-26 2016-09-26 Dana Farber Cancer Inst Inc HUMAN ANTI-PD-1, PD-L1 AND PD-L2 ANTIBODIES AND APPLICATIONS THEREOF
CN108997498A (zh) 2008-12-09 2018-12-14 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗-pd-l1抗体及它们用于增强t细胞功能的用途
EP3279215B1 (en) 2009-11-24 2020-02-12 MedImmune Limited Targeted binding agents against b7-h1
DK3789038T3 (da) 2010-05-14 2022-10-17 Univ Leland Stanford Junior Humaniserede og kimære monoklonale antistoffer mod cd47
PT2812443T (pt) 2012-02-06 2019-09-05 Inhibrx Inc Anticorpos cd47 e métodos de utilização dos mesmos
JP6572131B2 (ja) 2012-12-12 2019-09-04 バスキュロックス インコーポレイテッド 治療用ｃｄ４７抗体
GB201300706D0 (en) 2013-01-15 2013-02-27 Cancer Rec Tech Ltd Antibody
EP4137518A1 (en) 2013-02-06 2023-02-22 Inhibrx, Inc. Non-platelet depleting and non-red blood cell depleting cd47 antibodies and methods of use thereof
WO2016023001A1 (en) * 2014-08-08 2016-02-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Multispecific high affinity pd-1 agents and methods of use
JP2018535692A (ja) 2015-09-21 2018-12-06 エラスムス ユニバーシティ メディカル センターＥｒａｓｍｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ 抗ｃｄ４７抗体及び使用方法
RU2665790C1 (ru) * 2017-04-17 2018-09-04 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Моноклональное антитело к pd-l1

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014087248A2 (en) * 2012-12-03 2014-06-12 Novimmune S.A. Anti-cd47 antibodies and methods of use thereof
US20160108123A1 (en) * 2014-10-14 2016-04-21 Novartis Ag Antibody molecules to pd-l1 and uses thereof

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11498977B2 (en) 2016-09-29 2022-11-15 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Heterodimeric immunoglobulin constructs and preparation methods thereof
US11319378B2 (en) 2016-11-18 2022-05-03 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-PD-1/anti-HER2 natural antibody structural heterodimeric bispecific antibody and method of preparing the same
EP3722322A4 (en) * 2017-12-04 2021-09-15 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. ANTI-PD-L1 / ANTI-CD47-BISPECIFIC ANTIBODY WITH A STRUCTURE LIKE A NATURAL ANTIBODY AND IN THE FORM OF A HETERODIMER AND PRODUCTION OF IT
US11739151B2 (en) 2017-12-04 2023-08-29 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-PD-L1/anti-CD47 bispecific antibody
JP2021505195A (ja) * 2017-12-04 2021-02-18 北京韓美薬品有限公司Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｈａｎｍｉ Ｐｈａｒｍ． Ｃｏ．， Ｌｔｄ． 天然抗体様構造を有し、ヘテロ二量体形態の抗ｐｄ−ｌ１／抗ｃｄ４７二重特異性抗体、ならびにその製造方法
JP7231641B2 (ja) 2017-12-04 2023-03-01 北京韓美薬品有限公司 天然抗体様構造を有し、ヘテロ二量体形態の抗ｐｄ－ｌ１／抗ｃｄ４７二重特異性抗体、ならびにその製造方法
US11753471B2 (en) 2018-02-08 2023-09-12 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-PD-1/anti-HER2 natural antibody structural heterodimeric bispecific antibody and method of preparing same
WO2020233539A1 (en) * 2019-05-17 2020-11-26 Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. Anti-cd47/anti-pd-l1 multiple antigen binding proteins and methods of use thereof
CN114040777A (zh) * 2019-06-25 2022-02-11 信达生物制药(苏州)有限公司 包含抗cd47/pd-l1双特异性抗体的制剂及其制备方法和用途
WO2020259605A1 (zh) * 2019-06-25 2020-12-30 信达生物制药(苏州)有限公司 包含抗cd47/pd-l1双特异性抗体的制剂及其制备方法和用途
EP4034549A4 (en) * 2019-09-27 2024-03-06 Beijing Starmab Biomed Technology Ltd MONO-SPECIFIC AND MULTI-SPECIFIC ANTIBODIES
WO2021062361A3 (en) * 2019-09-27 2021-06-03 Beijing Starmab Biomed Technology Ltd Monospecific and multi-specific antibodies
JP2022551345A (ja) * 2019-12-17 2022-12-08 ファイザー・インク Ｃｄ４７、ｐｄ－ｌ１に特異的な抗体、およびその使用
JP7369297B2 (ja) 2019-12-17 2023-10-25 ファイザー・インク Ｃｄ４７、ｐｄ－ｌ１に特異的な抗体、およびその使用
EP4105234A4 (en) * 2020-02-12 2024-04-03 Shanghai Escugen Biotechnology Co., Ltd. SINGLE-DOMAIN ANTIBODY TARGETING HUMAN CD47 AND USE THEREOF
WO2022057939A1 (en) * 2020-09-21 2022-03-24 I-Mab Biopharma Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising cd47 antibody and pd-1/pd-l1 inhibitor
WO2022271053A1 (en) * 2021-06-21 2022-12-29 Joint Stock Company "Biocad" Isolated bispecific antibody that specifically binds to cd47 and pd-l1
RU2815823C2 (ru) * 2021-06-21 2024-03-22 Акционерное общество "БИОКАД" Выделенное биспецифическое антитело, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1

Also Published As

Publication number Publication date
PH12020550214A1 (en) 2021-02-15
CL2020000919A1 (es) 2020-10-16
ZA202002047B (en) 2022-08-31
AU2018345458A1 (en) 2020-05-14
AR113342A1 (es) 2020-04-22
MA49599A1 (fr) 2021-01-29
TW201922781A (zh) 2019-06-16
AU2018345458A2 (en) 2020-05-21
PE20210460A1 (es) 2021-03-08
ECSP20024555A (es) 2020-06-30
EA201791961A1 (ru) 2019-04-30
EA039662B1 (ru) 2022-02-24
TWI768129B (zh) 2022-06-21
EP3693390A4 (en) 2021-11-03
US11840567B2 (en) 2023-12-12
RU2020115122A (ru) 2021-10-29
JP2023130455A (ja) 2023-09-20
CA3078413A1 (en) 2019-04-11
JP2020535839A (ja) 2020-12-10
MA49599B1 (fr) 2023-05-31
BR112020006706A2 (pt) 2020-10-06
US20200270345A1 (en) 2020-08-27
JOP20200078A1 (ar) 2020-04-30
MX2020004027A (es) 2020-08-13
KR20200058542A (ko) 2020-05-27
RU2020115122A3 (ru) 2021-10-29
CN111801352A (zh) 2020-10-20
EP3693390A1 (en) 2020-08-12
CO2020004199A2 (es) 2020-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11840567B2 (en) Bispecific antibodies with specific binding to CD47 and PD-L1
EP3575318A1 (en) Anti-pd-1 antibody and use thereof
RU2665790C1 (ru) Моноклональное антитело к pd-l1
RU2734432C1 (ru) Моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR
US20220002412A1 (en) Humanized Anti-PD-1 Antibody and The Use Thereof
EP4327823A1 (en) Anti-cldn4/anti-cd137 bispecific antibody
RU2779652C2 (ru) АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К CD47 и PD-L1
CN113272329A (zh) 与cd20特异性结合的单克隆抗体
KR102679554B1 (ko) Pd-l1에 대한 단일클론 항체
EA044786B1 (ru) Моноклональное антитело, которое специфически связывается с gitr
EA041915B1 (ru) Моноклональное антитело к pd-l1
WO2019190359A1 (ru) Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с iv и ii субдоменами внеклеточного домена her2 человека

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18864490

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3078413

Country of ref document: CA

Ref document number: 2020519341

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20207012767

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018864490

Country of ref document: EP

Effective date: 20200504

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018345458

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20181003

Kind code of ref document: A

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112020006706

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112020006706

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20200402