JP7473248B2 - ヒトcd47を標的化するシングルドメイン抗体及びその使用 - Google Patents
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Description
(1)SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3に示されるCDR1、CDR2、及びCDR3、又は
(2)SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8に示されるCDR1、CDR2、及びCDR3から選択されるCDRを含む、抗CD47重鎖シングルドメイン抗体(VHH)。
いくつかの実施形態では、前記抗CD47重鎖シングルドメイン抗体(VHH)は、
(1)SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3に示されるCDR1、CDR2、及びCDR3、又は
(2)SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8に示されるCDR1、CDR2、及びCDR3から選択されるCDRと少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
2. FR1、FR2、FR3、及びFR4を含む項1に記載のシングルドメイン抗体。いくつかの実施形態では、 FR1、FR2、FR3、及びFR4はヒト免疫グロブリンVH可変配列サブグループIIIのFR1、FR2、FR3、及びFR4コンセンサス配列である。
3. ヒト化したものである、項1又は2に記載のシングルドメイン抗体。
4. 前記FR1は、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.27又はSEQ ID NO.31から選択されるアミノ酸配列を含み、前記FR2は、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.28又はSEQ ID NO.32から選択されるアミノ酸配列を含み、前記FR3は、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.29又はSEQ ID NO.33から選択されるアミノ酸配列を含み、前記FR4は、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.30又はSEQ ID NO.34から選択されるアミノ酸配列を含む、項3に記載のシングルドメイン抗体。
5. SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:18から選択されるアミノ酸配列のいずれかを含む項1~4のいずれか1項に記載のシングルドメイン抗体。
いくつかの実施形態では、前記シングルドメイン抗体は、 SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:18から選択されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記シングルドメイン抗体は、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:18から選択されるいずれかのアミノ酸配列の保存的変異アミノ酸配列を含む。
6. 重鎖Fc領域として、ヒンジ領域、CH2、及びCH3から選択される領域をさらに含む項5に記載のシングルドメイン抗体。
7. 前記重鎖はIgG1又はIgG4である、項6に記載のシングルドメイン抗体。
いくつかの実施形態では、本願のシングルドメイン抗体は、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:18から選択されるいずれかのアミノ酸配列と、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 39から選択されるいずれかのアミノ酸配列とを含む。
いくつかの実施形態では、本願のシングルドメイン抗体は二価VHH-Fc融合抗体である。
8.項1~7のいずれか1項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片を含むコンジュゲート。
上記のいくつかの形態では、前記シングルドメイン抗体の抗原結合断片は、そのVHH領域を含むか、又はそのVHH領域からなる。
9.前記シングルドメイン抗体又はその抗原結合断片は薬物、毒素、細胞毒性剤、インターフェロン遺伝子刺激因子(STING)受容体アゴニスト、サイトカイン、放射性核種又は酵素に結合している、項8に記載のコンジュゲート。
10.項1~7のいずれか1項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片を含む融合タンパク質。
11.前記シングルドメイン抗体又はその抗原結合断片と診断・治療分子とが融合した項10に記載の融合タンパク質。
12.項1~7のいずれか1項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片をコードする、ポリヌクレオチド。
13.項12に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
14.ファージ、細菌又は酵母である、項13に記載のベクター。
15. 項12に記載のポリヌクレオチド又は項13~14のいずれか1項に記載のベクターを含む宿主細胞。
16. 原核又は真核生物宿主細胞である、項15に記載の宿主細胞、。
17. 大腸菌である、項16に記載の宿主細胞。
18. 項1~7のいずれか1項に記載の抗CD47重鎖シングルドメイン抗体の生産方法であって、項16に記載の宿主細胞(例えば大腸菌)を培養するステップ(a)と、培養物から抗CD47重鎖シングルドメイン抗体を単離するステップ(b)とを少なくとも含む、生産方法。
19. 項1~7のいずれか1項に記載のシングルドメイン抗体、項8~9のいずれか1項に記載のコンジュゲート、項10~11のいずれか1項に記載の融合タンパク質の、腫瘍治療薬の調製における使用。
20. 診断マーカー付き項1~7のいずれか1項に記載のCD47重鎖シングルドメイン抗体。
21. 前記診断マーカーは、同位体、コロイド金マーカー、着色マーカー又は蛍光マーカーから選択される、項20に記載のシングルドメイン抗体。
22. 項1~7のいずれか1項に記載のシングルドメイン抗体、項8~9のいずれか1項に記載のコンジュゲート、項10~11のいずれか1項に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
23. CD47タンパク質を検出する製品又はキットであって、項1~7、20~21のいずれか1項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片を含む、製品又はキット。
24. 項1~7、20~21のいずれか1項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片の、CD47タンパク質を検出する製品又はキットの調製における使用。
25. 項1~7のいずれか1項に記載のシングルドメイン抗体、項8~9のいずれか1項に記載のコンジュゲート、項10~11のいずれか1項に記載の融合タンパク質の有効量を被検者に投与することを含む、癌治療方法。
26. 前記シングルドメイン抗体、コンジュゲート又は融合タンパク質は他の1種又は複数種の抗体又は薬物と併用する、項25に記載の方法。
27. 前記他の1種又は複数種の抗体はチェックポイント抗体である、項26に記載の方法。
1. CD47に結合する構築体又は抗体ポリペプチドであって、重鎖シングルドメイン抗体(VHH)を含み、該重鎖シングルドメイン抗体(VHH)は、
(1)SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3に示されるCDR1、CDR2、及びCDR3、又は
(2)SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8に示されるCDR1、CDR2、及びCDR3から選択されるCDRを含む、構築体又は抗体ポリペプチド。
いくつかの実施形態では、前記CD47に結合する構築体又は抗体ポリペプチドは、
(1)SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3に示されるCDR1、CDR2、及びCDR3、又は
(2)SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8に示されるCDR1、CDR2、及びCDR3から選択されるCDRと少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
2. 抗体重鎖可変領域FR1、FR2、FR3、及びFR4アミノ酸配列を含む、項1に記載の構築体又は抗体ポリペプチド。
3. ヒト免疫グロブリンVH可変配列サブグループIIIのFR1、FR2、FR3、及びFR4コンセンサス配列を含む、項1又は2に記載の構築体又は抗体ポリペプチド。
4. 前記FR1は、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.27又はSEQ ID NO.31から選択されるアミノ酸配列を含み、前記FR2は、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.28又はSEQ ID NO.32から選択されるアミノ酸配列を含み、前記FR3は、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.25、 SEQ ID NO.29又はSEQ ID NO.33から選択されるアミノ酸配列を含み、前記FR4は、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.30又はSEQ ID NO.34から選択されるアミノ酸配列を含む、項3に記載の構築体又は抗体ポリペプチド。
5. SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:18から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含む、項1~4のいずれか1項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド。
いくつかの実施形態では、前記構築体又は抗体ポリペプチドは、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:18から選択されるいずれかのアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記シングルドメイン抗体は、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:18から選択されるいずれかのアミノ酸配列の保存的変異アミノ酸配列を含む。
6. 重鎖Fc領域として、ヒンジ領域、CH2、及びCH3から選択される領域をさらに含む、項5に記載の構築体又は抗体ポリペプチド。
7. 前記重鎖はIgG1又はIgG4である、項6に記載の構築体又は抗体ポリペプチド。
いくつかの実施形態では、前記構築体又は抗体ポリペプチドは、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:18から選択されるいずれかのアミノ酸配列と、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 39から選択されるいずれかのアミノ酸配列とを含む。
いくつかの実施形態では、前記構築体又は抗体ポリペプチドは二価VHH-Fc融合抗体である。
いくつかの実施形態では、前記構築体又は抗体ポリペプチドは、VHH-Fc融合構築体若しくは抗体ポリペプチド、又は二価VHH-Fc融合構築体若しくは抗体ポリペプチドである。
8. 項1~7のいずれか1項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド若しくはその抗原結合断片を含む、コンジュゲート。
上記のいくつかの形態では、前記構築体又は抗体ポリペプチドの抗原結合断片は、そのVHH領域を含むか、又はそのVHH領域からなる。
9. 前記構築体又は抗体ポリペプチド若しくはその抗原結合断片は、薬物、毒素、細胞毒性剤、インターフェロン遺伝子刺激因子(STING)受容体アゴニスト、サイトカイン、放射性核種又は酵素に結合する、項8に記載のコンジュゲート。
10. 項1~7のいずれか1項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド若しくはその抗原結合断片を含む融合タンパク質。
11. 前記構築体又は抗体ポリペプチド若しくはその抗原結合断片と診断・治療分子とが融合した項10に記載の融合タンパク質。
12. 項1~7のいずれか1項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド若しくはその抗原結合断片をコードする、ポリヌクレオチド。
13. 項12に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
14. ファージ、細菌又は酵母である、項13に記載のベクター。
15. 項12に記載のポリヌクレオチド又は項13~14のいずれか1項に記載のベクターを含む宿主細胞。
16. 原核又は真核生物宿主細胞である、項15に記載の宿主細胞。
17. 大腸菌である、項16に記載の宿主細胞。
18. 項1~7のいずれか1項に記載の抗CD47重鎖構築体又は抗体ポリペプチドの生産方法であって、項16に記載の宿主細胞(例えば大腸菌)を培養するステップ(a)と、培養物から抗CD47重鎖構築体又は抗体ポリペプチドを単離するステップ(b)とを少なくとも含む、生産方法。
19. 項1~7のいずれか1項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド、項8~9のいずれか1項に記載のコンジュゲート、項10~11のいずれか1項に記載の融合タンパク質の、腫瘍治療薬の調製における使用。
20. 診断マーカー付き項1~7のいずれか1項に記載のCD47重鎖構築体又は抗体ポリペプチド。
21. 前記診断マーカーは、同位体、コロイド金マーカー、着色マーカー又は蛍光マーカーから選択される、項20に記載の構築体又は抗体ポリペプチド。
22. 項1~7のいずれか1項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド、項8~9のいずれか1項に記載のコンジュゲート、項10~11のいずれか1項に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
23. CD47タンパク質を検出する製品又はキットであって、項1~7、20~21のいずれか1項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド若しくはその抗原結合断片を含む、製品又はキット。
24. 項1~7、20~21のいずれか1項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド若しくはその抗原結合断片の、CD47タンパク質を検出する製品又はキットの調製における使用。
25. 項1~7のいずれか1項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド、項8~9のいずれか1項に記載のコンジュゲート、項10~11のいずれか1項に記載の融合タンパク質の有効量を被検者に投与することを含む、癌治療方法。
26. 前記構築体又は抗体ポリペプチド、コンジュゲート又は融合タンパク質は、他の1種又は複数種の抗体又は薬物と併用する項25に記載の方法。
27. 前記他の1種又は複数種の抗体はチェックポイント抗体である、項26に記載の方法。
本願の一態様は、抗CD47のシングルドメイン重鎖抗体(VHH)、又は単にCD47シングルドメイン重鎖抗体(VHH)に関する。
1)SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3で示されるCDR1、CDR2、及びCDR3、又は
2)SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8で示されるCDR1、CDR2、及びCDR3以下から選択されるCDRを含む。
本明細書で使用される場合、「断片」、「誘導体」及び「アナログ」という用語は、本発明の抗体と実質的に同一の生物学的機能又は活性を維持するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチド断片、誘導体又はアナログは、(i)1つ又は複数の保存的又は非保存のアミノ酸残基(好ましくは保存のアミノ酸残基)が置換されたポリペプチドであって、このような置換アミノ酸残基は遺伝コードでコードされていても、コードされなくてもよいもの、又は(ii)1つ又は複数のアミノ酸残基に置換基を有するポリペプチド、又は(iii)成熟ポリペプチドと他の化合物(例えば、ポリペプチドの半減期を延長する化合物、例えば、ポリエチレングリコール)との融合によって形成されたポリペプチド、又は(iv)このポリペプチド配列に付加的なアミノ酸配列が融合して形成されたポリペプチド(例えば、リーダー配列若しくは分泌配列、このポリペプチドを精製するために使用された配列若しくはプロタンパク質配列、又は6Hisタグによって形成された融合タンパク質)であってもい。本明細書の教示によれば、これらの断片、誘導体及びアナログは、当業者に周知の範囲に属する。
1.免疫方法
通常、標準的な免疫プロセス(完全及び不完全フロイントアジュバントと免疫原を混合して動物を免疫する)を用いてラクダ科動物を免疫し、優れた力価を有する特異的シングルドメイン重鎖抗体を得る。例えば、1mlの免疫血清から約0.1mgのポリクローナルHCAbを得ることができる。黄色ブドウ球菌V8プロテアーゼを用いて可変領域とCH2の間の短いヒンジ領域からHCAbを切断し、ブドウ球菌プロテインAクロマトグラフィーによりFcセグメントを吸着し、流出した重鎖可変領域を収集すると、VHHを得る。
抗体ディスプレイのためのベクターとして大腸菌(E.coli)を用いることができる。抗体断片は、通常、大腸菌の内膜にディスプレイされ、抗体のFcセグメントを介して膜上のリポタンパク質に結合し、このディスプレイ及び発現の方式は固定化ペリプラズム発現(APEx:Anchored periplasmic expression)と呼ばれる。しかし、大腸菌の細胞壁と外膜が存在するため、抗原と結合するには、この細菌は原形質球の形態に透徹処理されなけばならない。外膜を用いた抗体ディスプレイ技術も報告されており、例えばSalemaらは、E.coli K-12細菌で発現・ディスプレイ可能な、大腸菌O157:H7(EHEC)細菌の外膜に由来する自己輸送タンパク質(EhaA autotransporter)又はインティミン(Intimin)上に抗体断片をディスプレイする。抗体ディスプレイには、グラム陽性菌のうち、ブドウ球菌カルノサスStaphylococcus carnosusが使用されてもよく、この方法は、ブドウ球菌カルノサスのタンパク質A上の細胞壁アンカー領域(Cell-wall anchoring domain)を介して抗体断片を細胞膜内から膜外に輸送し、細胞壁にアンカーするものである。
ファージ表面ディスプレイ技術の核心は、目的遺伝子を遺伝子工学的手法によりファージコートタンパク質遺伝子に融合発現させ、これをファージ表面にディスプレイさせ、特異的な濃縮スクリーニングにより標的タンパク質/ポリペプチドを担持したファージを得、クローニング及びシーケンシングを行い、最終的に標的タンパク質/ポリペプチドのDNAコード配列を得ることである。この技術は、ファージの高い増幅性により、遺伝子型と機能表現型(結合活性)とを組み合わせた、非常に効率的なスクリーニングシステムである。従来の抗体の軽重鎖マッチングの問題が存在しないため、シングルドメイン抗体はファージディスプレイライブラリ技術を用いてスクリーニングするのにより適している。
抗体ディスプレイ技術のスクリーニングは、サッカロミセス・セレビシエを用いて行ってもよい。サッカロミセス・セレビシエは約200nmの厚さの細胞壁を有し、出芽した酵母細胞壁の表面には、相対交配型の酵母上のAga2pタンパク質と結合し得るレクチンタンパク質が存在し、シングルドメイン抗体は融合タンパク質としてAga2pタンパク質と融合して発現し、酵母細胞表面にディスプレイしている。酵母ディスプレイ抗体ライブラリのスクリーニング方法は一般的に磁気ビーズによる細胞選別(MACS)及び蛍光活性化セルソーティング(FACS)を採用しており、MACSの主要な役割は非特異的結合を減少させるためであり、通常はMACSスクリーニングをした上で複数回のFACSスクリーニングを行う。ファージディスプレイ技術に比べて、酵母ディスプレイ技術には利点と欠点がある。一方、酵母は真核細胞に属し、抗体の翻訳後修飾は哺乳動物細胞と類似しており、グリコシル化後の抗体の安定性は高く、また、哺乳動物の発現系に存在し得る未知の状況を回避する。次に、酵母のディスプレイ技術は蛍光活性化セルソーティング方法を採用し、スクリーニング過程全体の制御性が高い。ただし、酵母抗体ライブラリのライブラリ容量は一般にファージ抗体ライブラリより小さい。さらに、酵母ディスプレイ技術はオリゴマーの抗原をスクリーニングする場合に効果が理想的ではない可能性があるため、一つの酵母細胞が同時に複数の抗原を共有結合する可能性があり、これによりスクリーニングされた抗体の親和性が期待に及ばない可能性がある。
本発明はまた、組成物を提供する。好ましくは、前記組成物は、上記の抗体又はその活性断片若しくはその融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。通常、これらの物質は、毒性のない、不活性で、薬学的に許容される水性担体媒体にて調製することができ、ここで、pHは、配合される物質の性質及び治療される病症にもよるが、通常、約5~8であり、好ましくは約6~8である。調製された医薬組成物は、腫瘍内、腹膜内、静脈内、又は局所投与を含む(ただし、これらに限定されるものではない)通常の経路を介して投与され得る。
本発明のCD47重鎖シングルドメイン抗体は、癌疾患の診断・治療、具体的には、CD47に対する臨床診断及び標的治療に有用である。
以下図面を参照して本発明の具体的な実施例について詳細に説明する。図面においては本発明の具体的な実施例が示されているが、本発明は、ここでの実施例により限制されることなく、さまざまな形態で実現されてもよいことが理解される。むしろ、これらの実施例は本発明をより完全に理解できるようにし、本発明の範囲を完全に当業者に伝えるために提供されるのである。
ヒトCD47組換えタンパク質(Human CD47His Tag、huCD47-His、ACRO Biosystemsから購入、カタログ番号CD7-H5227)及びサルCD47組換えタンパク質(Cynomolgus CD47 His Tag、cyCD47-His、ACROBiosystemsから購入、カタログ番号CD7-C52H1)を免疫原として、アルパカ2頭を選び、40日間の免疫プログラムにしたがって、毎週1回、計6回免疫した。1日目、8日目、15日目、22日目にそれぞれhuCD47-Hisで免疫し、29日目、36日目にhuCD47-His、cyCD47-Hisを混合して免疫した。
アルパカの免疫原に対する免疫応答を酵素結合免疫吸着法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay、ELISA)で検出した。免疫前(1日目)、免疫後(16日目、32日目)にそれぞれ動物の全血を採取し、通常の方法で血清を分離した。96ウェルマイクロタイタープレートに1ウェル当たりhuCD7-His又はcyCD47-His(5g/mL)抗原100μlを加え、4℃で一晩被覆し、PBST 250μlで4回洗浄した後、希釈したアルパカ血清(1:100~1:12,500希釈)100μlを加えて室温で1hインキュベートし、PBST 250μlを4回洗浄した後、1:5000希釈した検出抗体anti-llama(H+L)-HRP(Abcamから購入、カタログ番号ab112784)を加えて室温で1hインキュベートした。PBST 250μlで4回洗浄した後、TMB発色液(Cell Signalingから購入、カタログ番号7004)を加えて室温で10min遮光、発色し、2M H2SO4反応を停止し、マイクロプレートリーダーを用いてOD490の吸光値を測定した。
力価検出結果を図1に示す。免疫前の動物A及び動物Bの血清抗体力価は全て陰性(Pre-A、Pre-B)であり、免疫後の動物の血清抗体力価は陽性であり、32日目(post-A2、post-B2)に12,500倍希釈した血清抗体力価は陽性であった。6回目の免疫が終わった後(41日目)、アルパカA、アルパカBからそれぞれ末梢血300mLを採取して混合した。リンパ球分離液Ficoll-Hypaque(GEHealthcareから購入、カタログ番号45-001-751)の取扱説明書にしたがってPBMC(Peripheral blood mononuclear cell、末梢血単核球)を分離した。
上記分離により得られたPBMCを、TRIzolTM(Invitrogenから購入、カタログ番号15596018)使用ガイドラインにしたがって総RNAを抽出し、さらにPrimeScriptII cDNA合成キット(Takara、カタログ番号6210B)にしたがってoligodTプライマーとランダム6量体プライマーを用いて総RNAを逆転写してcDNAを合成した。ポリメラーゼ連鎖反応を用いてアルパカ重鎖抗体可変領域(VHH)断片を増幅し、PCR産物をアガロースゲル電気泳動により同定し、ゲルを回収して精製した後、ファージ粒子ベクターに連結し、TG1コンピテント大腸菌にエレクトロポレーションした。ライブラリ容量3×108CFU以上のファージライブラリから、26個のクローンを無作為に抽出してコロニーPCR及びシーケンシングを行い、コロニーPCRの結果から、ファージベクター中のVHH配列の挿入率が100%(26/26)であり、シーケンシングの結果は繰り返し配列がないことを示した。
huCD47を抗原としてディープウェルチューブに被覆し、ファージライブラリーを選別した(Biopanning)。1回目の選別時、マイクロプレートリーダーに2μg/mLのhuCD47-His組換えタンパク質を一晩被覆し、PBS+2%BSA(Bovine serum albumin、ウシ血清アルブミン)でブロッキングした後、ファージを加えて室温で2hインキュベートし、PBSTで10回洗浄した後、0.1M Triethylamineで結合したファージを溶出した。溶出したファージについて力価を測定した後、大腸菌TG1に感染し、次の選別に進んだ。選別は計3回行い、最終回の選別が終了した後、ELISAにより単位ファージと抗原との結合シグナル強度を測定した。各パンニングの結合シグナル(濃縮度)を図2に示す。
VHHファージと抗原との結合特異性をELISA法により検出した。2×YTプレートから大腸菌モノクローナルを選び、96ウェルプレートに入れて3h培養した後、ヘルパーファージを加えて菌体を分解した後、マイクロプレートリーダーにそれぞれ100μlのhuCD47、cyCD47、マウスCD47(moCD47)又はBSA(5μg/mL)を被覆し、5%脱脂粉乳を含むPBSでブロッキングした後、100μlの分解液上清を加え、室温で1hインキュベートした。PBSTでプレートを4回洗浄した後、anti-M13 antibody-HRP(1:1000希釈、Sino Biologicalsから購入、カタログ番号11973-MM05T-H)100μlを加えて1hインキュベートした。PBSTでプレーを4回洗浄し、TMBを加えて10min発色させ、2M H2S4Oで終了後、OD450吸光値をマイクロプレートリーダーで読み取った。
本研究では、744個のクローンの中から、huCD47に特異的に結合しないもの及びBSAに非特異的に結合するものを除去し、huCD47に特異的に結合するモノクローン93個をスクリーニングした。これらのクローンはcyCD47と種交差反応を示したが、マウスCD47と交差反応を示すクローンはスクリーニングされなかった。
上記スクリーニングにより得られたhuCD47に特異的に結合するVHHクローンを大腸菌で発現させた。VHHプラスミドを形質転換したTG1大腸菌クローンを2YT培地(クロラムフェニコール34μg/mL、ブドウ糖2%添加)にて25℃で一晩培養し、その後、2YT培地(クロラムフェニコール34μg/mL、ブドウ糖0.1%添加)にて37℃で1:100の割合で拡大培養した。培地にアラビノースを最終濃度0.2%まで添加し、25℃で5時間誘導した後、遠心分離して沈殿を収集した。菌体を細胞分解緩衝液(50mM Hepes、0.5mM EDTA、20%ショ糖、pH7.5)で分解した後、NiNTAカラム(Qiagenから購入、カタログ番号30210)で精製し、3.5kDa midi透析カラム(Milliporeから購入、カタログ番号71506)で透析した。精製産物についてNanodropで濃度を測定した後、SDS-PAGEによりタンパク質純度を検出し、精製して得られたVHHシングルドメイン抗体をその後の活性測定実験に用いた。
フローサイトメトリー(FACS)を用いてCD47陽性細胞に結合可能な抗体をスクリーニングした。ヒトBurkitt’sリンパ腫細胞Raji(中国科学院細胞バンクから購入、カタログ番号TCHu 44)を10%ウシ胎児血清FBS(Fetal Bovine Serum、Gibcoから購入、カタログ番号10099141)を含むRPMI-1640培地(Gibcoから購入、カタログ番号11875-093)を用い、37℃、5%CO2の条件下で培養した。
800rpmで3min遠心分離してRaji細胞を収集し、PBS+1%FBSで細胞を1回リンスし、再懸濁させてカウントした。96ウェルプレートに1ウェルあたり1×105個のRaji細胞を加え、その後、VHHの最終濃度がそれぞれ5、0.5、0.05μg/mLとなるまで、勾配希釈したVHH(精製後)サンプルを加え、均一に混合した後、室温でRaji細胞と1hインキュベートした。1400rpmで3min遠心分離してRaji細胞を収集し、PBS+1%FBSで2回洗浄した後、VHHサンプルウェルに1:500希釈したanti-c-myc抗体(Roche、カタログ番号11667149001)を加え、4℃で30minインキュベートした。細胞をFACS緩衝液で2回洗浄した後、1:300希釈した検出抗体であるアロフィコシアニンロバ抗マウスIgG(Jackson Immunoresearch、カタログ番号715-136-150)をそれぞれ加え、4℃、避光下で30minインキュベートした。細胞をPBS+1%FBSにより2回洗浄した後、iQuePlusフローサイトメーターで分析した。
蛍光二次抗体のみを加えた対照ウェルの平均蛍光強度(MFI:Mean fluorescence intensity)をバックグラウンド値平均蛍光強度とし、サンプル平均蛍光強度とバックグラウンド値平均蛍光強度の倍数でVHHシングルドメイン抗体とRaji細胞との結合強度を評価した。
平均蛍光強度の倍数=サンプルの平均蛍光強度÷バックグラウンド値-平均蛍光強度
本実験では、Raji細胞に結合可能なVHHシングルドメイン抗体43個をスクリーニングし、そのうち28個は、最低濃度(0.05μg/mL)でRaji細胞に結合する平均蛍光強度の倍数が5を超え、強い細胞結合活性を示した。具体的には、次の表1に示す。
Raji細胞に結合可能な上記のVHHシングルドメイン抗体についてCD47-SIRPα遮断活性をスクリーニングした。
96ウェルプレートに1μg/mLのhuCD47-His抗原(ACRO Biosystemsから購入、カタログ番号CD7-H5227)100μlを加え、4℃で一晩被覆し、PBST 250μlでプレートを3回洗浄した後、最終濃度がそれぞれ500、50、5、0.5nMとなるように1ウェルあたり精製されたVHH 100μlを加え、室温で1hインキュベートした。PBST 250μlでプレートを3回洗浄した後、5nM SIRPα-mIgG1(ACROBiosystemsから購入、カタログ番号SIA-H52A8)を加えて1hインキュベートした。PBSTでプレートを3回洗浄した後、1:5000希釈したヤギ抗マウスHRP-コンジュゲート(Invitrogenから購入、カタログ番号31430)を加えて45minインキュベートした。PBST 250μlでプレートを3回洗浄した後、TMB(Cell Signaling Technologyから購入、カタログ番号7004)発色基質を加えて10min発色させた。0.5M HClで反応を停止した後、マイクロプレートリーダーで値を読み取った。GraphPad Prism5の非線形回帰式を用いてIC50を計算し、結果を表2に示す。CD47-SIRPα遮断活性を有するVHHシングルドメイン抗体を計31個スクリーニングした。
CD47-SIRPα遮断活性を有する上記31個のVHHシングルドメイン抗体を用いて、Expi293F発現系により、Fc融合二価組換え抗体(VHH-Fc)を製造した。具体的には、シグナルペプチドアミノ酸配列(配列SEQ ID NO.13:MGWSCIILFLVATATGVHS)、VHH抗体アミノ酸配列、ヒトIgG1抗体(UniProtデータベースより、配列P01857)の重鎖ヒンジ領域からCH3ドメインまでのアミノ酸配列(SEQ ID NO.14(EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK))をN末端からC末端に向かって「シグナルペプチド-VHH-定常領域」の順にスプライシングした。アミノ酸配列をコドン最適化した後、全遺伝子合成方式(金唯智生物科技有限公司、蘇州)でDNAを合成し、XbaIとEcoRV酵素切断部位を通じてpcDNA3.4発現ベクター(Invitrogenから購入、カタログ番号A14697)に連結した。一般的な方法でコンピテント大腸菌(E.coli)を形質転換し、エンドトキシンフリープラスミドを調製した。
N末端からC末端に向かって「シグナルペプチド-可変領域-定常領域」の順に、シグナルペプチドアミノ酸配列、対照抗体5F9重鎖可変領域アミノ酸配列(PLoS ONE. 2015. 10(9): e0137345, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137345)即ちSEQ ID NO.35(QVQLQQPGAELVKPGASVMMSCKASGYTFTNYNMHWVKQTPGQGLEWIGTIYPGNDDTSYNQKFKDKATLTADKSSSAAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGYRAMDYWGQTSVTVSS)、及びヒトIgG4抗体(UniProtデータベースより、配列P1861、S228P突然変異含有)重鎖定常領域のアミノ酸配列(SEQ ID NO.36(ASTKGPSVFPLAPCSRSTSE STAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK))をスプライシングした。シグナルペプチド、5F9軽鎖可変領域のアミノ酸配列(PLoS ONE. 2015.10(9): e0137345,PLoS ONE. 2015. 10(9): e0137345, https://doi.org/10.1371/journal.pone. 0137345)、すなわちSEQ ID NO.37(DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVYSNGNTYLGWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYHCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK)と軽鎖定常領域(UniProtデータベース、配列P01834)のアミノ酸配列、すなわちSEQ ID NO.38(RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC)とをスプライシングした。上記配列をコドン最適化した後、DNAを全遺伝子合成し、XbaIとEcoRV酵素切断部位を通じてDNAをpcDNA3.4発現ベクターに連結した。一般的な方法でコンピテントE.coliを形質転換し、エンドトキシンフリープラスミドを製造した。
6×107個のExpi293F細胞(Gibcoから購入、カタログ番号A14527)をExpi293F発現培地30mL(Gibcoから購入、カタログ番号A14351-01)に接種し、37℃、8%CO2のシェーカーにて125rpmで24h培養した後、細胞密度及び活性を測定した。ExpiFectamineTM 293トランスフェクションキット(Gibcoから購入、カタログ番号A14524)の取扱説明書にしたがって、ExpiFectamine 293試薬80μlをOpti-MEM I培地1420μl(Gibcoから購入、カタログ番号31985062)と均一に混合し、室温で5min静置し、その後、pcDNA3.4発現プラスミド30μg、Opti-MEM I培地と均一に混合し、室温で20min静置した。上記トランスフェクション試薬をExpi293F細胞培養液に添加し、20h培養後、予め均一に混合したExpiFectamine 293トランスフェクションエンハンサーを加え、37℃、8%CO2シェーカーにて、125rpmで5~7日間培養した。
細胞培養液を1200rpmで3min遠心分離して細胞ペレットを除去し、上清を収集し、AmMagTM磁気ビーズ精製システム(ジェンスクリプト・バイオテクノロジー社から購入、カタログ番号L00695)の説明にしたがってVHH-Fc融合二価組換え抗体を精製し、マイクロプレートリーダーでOD280を測定してタンパク質定量を行い、組換え抗体3μgを還元SDS-PAGEで同定して、目標抗体の単量体分子量は37kD~39kDであった。上記31個のVHH-Fc融合二価組換え抗体のうち28個は発現に成功し、SDS-PAGEにおける大きさ及び純度の結果を図3に示す。
前述精製により得られた28個のVHH-Fc融合二価組換え抗体について赤血球凝集スクリーニングを行い、その中から赤血球凝集を起こさない分子を選別した。ヒト赤血球は賽笠生物科技有限公司(上海)に由来する。PBS 10mLでヒト赤血球を1回リンスし、1000rpmで3min遠心分離して細胞を収集し、リンスを2回繰り返した後、赤血球をPBSに再懸濁させ、血球カウントプレートでカウントし、細胞密度を4×107個/mLに調整した。96ウェルU字形プレートに1ウェルあたり100μl(4×106個)の赤血球を加え、次に、勾配希釈したVHH-Fc融合二価組換え抗体又は5F9対照抗体(抗体最終濃度はそれぞれ100、10、1、0.1μg/mL)を100μl加え、空白対照ウェルにPBSを100μl加えた。均一に混合した後、96ウェルU字形プレートを37℃、5%CO2のインキュベータに入れて2h静置した後、96ウェルプレートを取り出して白い背景プレートで撮影した。結果を図4に示す。
5F9抗体は1μg/mL~100μg/mLの濃度範囲で深刻な赤血球凝集反応を起こした。VHH-Fc融合二価組換え抗体はいずれの濃度でも赤血球凝集を起こさなかった。
フローサイトメトリー(FACS)を用いてVHH-Fc融合二価組換え抗体とヒト赤血球との結合を検出し、その中からヒト赤血球に結合しない又は弱結合の分子を選んだ。ヒト赤血球をPBSで3回リンスした後、血球カウントプレートでカウントし、PBS+1%FBSで再懸濁させ、細胞密度を1×107個/mLに調整し、96ウェルU字形プレートに1ウェルあたり100μl(1×106個)を加えた。VHH-Fc融合二価組換え抗体、5F9抗体をPBS+1%FBSで勾配希釈し、1ウェルあたり100μl(最終濃度はそれぞれ0.25、5、100μg/mL、又は0.018~300nM)を加え、4℃で1hインキュベートした。細胞を1000rpmで3min遠心分離した後、PBS+1%FBSで1回リンスし、1ウェル当たり1:1000希釈したヤギ抗ヒトIgG(H+L)-Alexa Fluor488(eBioscienceから購入、カタログ番号A11013)を100μl加え、4℃で45minインキュベートした。細胞を1000rpmで3min遠心分離した後、PBS+1%FBSで2回リンスし、PBS+1%FBSに200μl再懸濁させ、フローサイトメーターのフローチューブに移して装置にて検出した。データをFlowJo_V10ソフトウェアで処理し、GraphPadPrism5でプロットし、結果を図5に示す。
28個のVHH-Fc融合二価組換え抗体のうち、DX-36698及びDX-36699は赤血球との結合が極めて弱く、中でもDX-36699は赤血球との結合が最も弱かった。同じモル濃度では、DX-36699とヒト赤血球との結合は5F9よりもはるかに弱く、結果を図6に示す。
フローサイトメトリー(FACS)方法を用いてVHH-Fc融合二価組換え抗体DX-36699、対照抗体5F9とヒト血小板(ALLCELLS生物技術(上海)有限公司から購入)との結合を検出した。血小板を血球計でカウントした後、PBS+1%FBSで濃度を1.5×107個/mLに調整し、1ウェルあたり100μLで96ウェルU字形プレートに加えた。その後、勾配希釈したVHH-Fc融合二価組換え抗体又は5F9対照抗体(DX-36699の最終濃度0.0064~100μg/mL、5F9の最終濃度0.00064~10μg/mL、いずれも5倍勾配希釈)を100μl添加し、アイソタイプ対照抗体の最終濃度を100μg/mLとした。4℃で1hインキュベートした後、サンプルを1000rpmで3min遠心分離し、PBS+1%FBSで1回リンスした。1ウェル当たり1:1000希釈したヤギ抗ヒトIgG(H+L)-Alexa Fluor488(eBioscienceから購入、カタログ番号A11013)を100μl加え、4℃で45minインキュベートした。サンプルは1000rpmで3min遠心分離した後、PBS+1%FBSで2回リンスし、PBS+1%FBSに200μl再懸濁させ、フローチューブに移して装置にて検出した。データをFlowJo_V10ソフトウェアで処理し、GraphPadPrism5でプロットし、結果を図7に示す。
対照抗体5F9は0.08μg/mL及びこれ以上の濃度に亘って、ヒト血小板に結合する平均蛍光強度が600を超えた。一方、DX-36699(IgG1及びIgG4のサブタイプ)は、全ての濃度で、ヒト血小板に結合する平均蛍光強度が400未満であり、この抗体のヒト血小板への結合は5F9よりもはるかに弱いことを示している。
上記28個のVHH-Fc融合二価組換え抗体とヒトCD47組換えタンパク質との結合をELISA法により検出した。96ウェルマイクロタイタープレートに1ウェル当たり濃度1μg/mLのhuCD47-mFc(AcroBiosystemsから購入、カタログ番号CD7-H52A5)抗原100μlを加え、4℃で一晩被覆した。PBST 250μlで4回リンスした後、1%BSA含有PBSを200μl加え、室温で1hブロッキングした。PBST 250μlで4回リンスした後、勾配希釈したVHH-Fc融合二価組換え抗体(最終濃度0.1~50ng/mL)を加え、室温で1hインキュベートした。96ウェルプレートをPBST 250μlで4回リンスした後、1ウェル当たり1:10000希釈したヤギ抗ヒトFc-HRP(Jackson ImmunoResearchから購入、カタログ番号109-035-098)100μlを加え、室温で1hインキュベートした。PBST 250μlで4回リンスした後、1ウェル当たりTMB基質(Cell SignalingTechnologyから購入、カタログ番号7004)100μlを加えて発色させ、10min後、1ウェル当たり2M H2SO4 50μlを加えて発色を終了し、マイクロプレートリーダーで吸光値(OD450)を読み取った。データをGraphPadPrism5非線形回帰式で処理してプロットした結果、図8に示すように、28個のVHH-Fc融合二価組換え抗体はいずれもヒトCD47組換えタンパク質に濃度依存的に結合した。
フローサイトメトリーを用いてVHH-Fc融合二価組換え抗体とCD47陽性細胞との結合を検出した。胃癌細胞NUGC-4(南京科佰生物科学技術有限公司から購入、カタログ番号CBP60493)を10%FBS含有RPMI-1640培地で培養し、細胞をPBSでリンス、パンクレアチン(Gibcoから購入、カタログ番号12605-028)で消化した後、800rpmで3min遠心分離して細胞を収集し、RPMI-1640培地に再懸濁させた。細胞をカウントした後、密度を1.5×1061個/mLに調整し、96ウェルU字形プレートに1ウェルあたり1.5×10個5NUGC-4細胞とした。PBS+1%FBSでVHH-Fc融合二価組換え抗体、5F9抗体を勾配希釈し、1ウェル当たり抗体100μlを加えて、最終濃度をそれぞれ0.05、0.5、5nMとし、均一に混合した後、4℃で1hインキュベートした。1000rpmで遠心分離して細胞を収集した後、PBS+1%FBSで細胞を1回リンスした。1ウェル当たり1:1000希釈したヤギ抗ヒトIgG(H+L)-Alexa488(eBioscienceから購入、カタログ番号A11013)100μlを加え、4℃で1hインキュベートした。1000rpmで遠心分離して細胞を収集した後、PBS+1%FBSで2回リンスした。PBS+1%FBS 200μlで細胞を再懸濁させた後、フローチューブに移して装置にて検出した。データをGraphPadPrism5非線形回帰式で処理してプロットし、結果を図9に示す。図9は、0.5nM、5nMの抗体濃度では、上記28個のVHH-Fc融合二価組換え抗体が全てNUGC-4細胞に濃度依存的に結合できることを示している。
3種の実験方法を用いてCD47とSIRPα間の相互作用に対するVHH-Fc融合二価組換え抗体の中和活性を評価した。(1)ELISA方法を用いてCD47組換えタンパク質とSIRPα組換えタンパク質との相互作用に対する抗体の遮断活性を検出した。(2)フローサイトメトリーを用いて、CD47組換えタンパク質とHEK293-SIRPα細胞(膜型SIRPα発現)との相互作用に対する抗体の遮断活性を評価した。(3)フローサイトメトリーを用いてSIRPα組換えタンパク質とJurkat細胞(膜型CD47発現)との相互作用に対する抗体の遮断活性を評価した。
(1)CD47組換えタンパク質とSIRPα組換えタンパク質との相互作用のELISA検出
96ウェルプレートに1ウェルあたり1μg/mL SIRPα-His(Acro Biosystemsから購入、カタログ番号SIA-H5225)100μlを加え、4℃で一晩被覆した。PBSTで4回リンスした後、1ウェルあたりPBS+1%BSAを200μl加え、室温で1hブロッキングし、PBSTで4回リンスした。抗体を40ng/mL biotinylated-CD47(Acro Biosystems#CD7-H82E9)溶液で勾配希釈し、96ウェルプレートに1ウェル当たり希釈抗体100μlを加え、室温で1hインキュベートした。96ウェルプレートをPBSTで4回リンスし、1ウェルあたり1:2500希釈したSteptavidin-HRP(Invitrogen#434323)100μlを加え、室温で1hインキュベートした。96ウェルプレートをPBSTで4回リンスした後、1ウェル当たりTMB基質(Cell Signaling、カタログ番号7004)100μlを加え、室温で10min発色させた後、停止液50μlを加えて反応を停止した。マイクロプレートリーダーでデータを読み取り、GraphPad Prism5で解析し、結果を図10に示す。図10は、0.1~2500ng/mLの濃度範囲では、28個のVHH-Fc融合二価組換え抗体が全てCD47とSIRPαとの相互作用を濃度依存的に遮断できることを示している。
(2)CD47組換えタンパク質とSIRPα陽性細胞HEK293-SIRPとの相互作用のフローサイトメトリー検出
SIRPαを発現する遺伝子操作細胞HEK293-SIRPαを10%FBS、100μg/mLハイグロマイシンB(Thermo Fisher Scientificから購入、カタログ番号10687010)を含むDMEM培地(Gibcoから購入、カタログ番号10569044)で培養し、パンクレアチンで消化した後に細胞をカウントし、PBS+1%FBSに再懸濁させた。96ウェルU字形プレートに1ウェルあたり細胞(1.5×105個)100μlを加え、抗体を勾配希釈した後、50μlを96ウェルU字形プレートに加え、biotinylated-CD47(ACROBiosystemsから購入、CD7-H82E9)50μlを最終濃度60ng/mLまで加え、均一に混合した後、4℃で1hインキュベートした。1000rpmで3min遠心分離して細胞を収集した後、PBS+1%FBSで1回リンスし、その後1:100希釈したAnti-biotin PE(Thermo FisherScientificから購入、カタログ番号12-9895-82)100μlを加え、4℃で45minインキュベートした。1000rpmで3min遠心分離して細胞を収集した後、PBS+1%FBSで2回リンスし、細胞をPBS+1%FBS 200μlに再懸濁させ、フローチューブに移してPEの蛍光シグナルを検出した。平均蛍光強度MFIデータをGraphPad Prism5で解析し、結果を図11に示す。
(3)SIRPα組換えタンパク質とCD47陽性細胞Jurkatとの相互作用のフローサイトメトリー検出
ヒトTリンパ性白血病細胞Jurkat(中国科学院細胞バンクから購入、カタログ番号SCSP-513)をRPMI-1640培地で培養し、細胞をカウントした後、PBS+1%FBSで1回洗浄し、PBS+1%FBSに再懸濁させた。96ウェルU字形プレートに1ウェルあたりJurkat細胞(2×105個)100μlを加え、勾配希釈した抗体(最終濃度はそれぞれ8、2、0.5、0.125nM)50μlとSIRPα組換えタンパク質50μl(His-tag、最終濃度2μg/mL)を加え、4℃で1hインキュベートした。1000rpmで3min遠心分離して細胞を収集した後、PBS+1%FBS 200μlで細胞を1回洗浄し、1:20希釈した検出抗体PE anti-His Tag Antibody(Biolegendから購入、カタログ番号362603)を加え、4℃、避光下で1hインキュベートした。1000rpmで3min遠心分離して細胞を収集した後、PBS+1%FBSで2回リンスし、細胞をPBS+1%FBS 200μlに再懸濁させ、フローチューブに移して装置にて検出した。平均蛍光強度MFIデータをGraphPad Prism5で解析し、結果を図12に示す。
3種の試験方法の結果から、上記の28個のVHH-Fc融合二価組換え抗体は全てCD47組換えタンパク質とSIRPα組換えタンパク質との相互作用を遮断でき、CD47組換えタンパク質とSIRPα陽性細胞HEK293-SIRPとの相互作用を遮断でき、そして、SIRPα組換えタンパク質とCD47陽性細胞Jurkatとの相互作用を遮断できる。
上記28個のVHH-Fc融合二価組換え抗体の中から、赤血球に結合する分子、結合しない分子を2つずつ選び、抗体とhuCD47との親和性をBIAcore 8K(GEHealthcare)装置で検出した。アミノカップリング法によってAnti-humanIgGFcモノクローナル抗体(R&D systemsから購入、カタログ番号G-102-C)を捕獲分子としてCM5センサチップ(GEHealthcareから購入、カタログ番号BR―1005-30)に連結し、VHH-Fc融合二価組換え抗体又は5F9抗体を、抗体捕獲量250~500RUでCM5チップに捕獲した。注入緩衝液HBS-EP+(GEHealthcareから購入、カタログ番号BR100669)でHuCD47組換えタンパク質を勾配希釈し(濃度範囲1.56nM~100nM)、CM5チップ上の抗体に30μl/minの流速で流し、HuCD47と抗体の結合時間を180s、解離時間を900s、反応温度を25℃とした。BIAcore 8K Evaluationソフトウェア(GEHealthcare)を用いて1:1結合モデルに従い、FitGlobalを用いて結合定数ka、解離定数kd及び親和性KDを計算した。表3に示す結果のとおり、4つのVHH-Fc融合二価組換え抗体は、huCD47との結合の親和性がいずれも対照抗体5F9より高く、その中でも、DX-36699の親和性は5F9より遥かに高く、前者の親和性は後者の17倍であった。
ヒトPBMCからCD14+単球を単離し、インビトロで貪食機能を有するM1マクロファージに分化誘導し、CD47を発現するヒトTリンパ性白血病細胞Jurkatを標的細胞として抗体依存性細胞貪食効果(ADCP:Antibody-dependent cellular phagocytosis)を評価した。
妙通生物科技有限公司(上海)から購入したヒトPBMCを蘇生させた後、10%FBS含有RPMI-1640培地を用いて、37℃、5%CO2インキュベータで4~6h培養し、MagniSortヒトCD14陽性スクリーニングキット(Invitrogenから購入、カタログ番号8802-6834)の操作ガイドラインにしたがってCD14+単球を分離した。得られたCD14+単球を10%FBS含有RPMI-1640培地で培養し、最終濃度25ng/mLのM-CSF(R&D systemから購入、カタログ番号216-MC-100)を添加して6日間誘導し、その後、最終濃度50ng/mLのIFN-γ(R&D systemから購入、カタログ番号285-IF-100)を添加して24h誘導し、M1マクロファージを得た。M1マクロファージを96ウェルプレートに1ウェルあたり2000個接種し、37℃、5%CO2条件下で一晩培養した。
ヒトTリンパ性白血病細胞Jurkat(中国科学院細胞バンクから購入、カタログ番号SCSP-513)を10%FBS含有RPMI-1640培地で培養し、1000rpmで3min遠心分離して細胞を収集し、PBSで1回洗浄した。最終濃度1μMのCFSE(Carboxy Fluorescein diacetate Succinimidyl Ester、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル。eBioscienceから購入、カタログ番号65-0850-84)を用いてJurkat細胞を10min染色し、PBSで細胞を2回リンスし、PBSに再懸濁させた。CFSE標識Jurkat細胞とVHH-Fc融合二価組換え抗体とを混合した後、M1マクロファージを含む96ウェルプレートに加え、抗体最終濃度をそれぞれ0.4、2μg/mLとした。37℃、5%CO2条件下で2hインキュベートした後、PBSで細胞を2回洗浄し、培地に懸濁させたJurkat細胞を除去した。壁に付着したM1マクロファージの緑色蛍光シグナル、すなわち貪食されたJurkat細胞を蛍光顕微鏡で検出した。結果を図13に示す。
M-NSGマウス(メス、6週齢、上海南方模式生物科技股フェン有限公司)にRaji腫瘍細胞(右側に5×106個/匹皮下接種)を皮下移植し、Raji移植腫モデルを作成した。接種後8日目に、腫瘍の平均体積は約123mm3であり、ランダムブロック法を用いて担癌マウスを6群に分け、第1群 PBS、i.p、QD×11群;第2群 5F9、5mg/kg、i.p、QD×11群;第3群 DX-36699-IgG1、2.5mg/kg、i.p、QD×11群;第4群 DX-36699-IgG1、5mg/kg、i.p、QD×11群;第5群 DX-36699-IgG4、2.5mg/kg、i.p、QD×11群;および第6群 DX-36699-IgG4、5mg/kg、i.p、QD×11群を6匹ずつとした。各群は10mL/Kg投与した。
結果:初回投与17日後、対照群の平均腫瘍体積は1563.15±63.02mm3であった。受験サンプルとして第2群 5F9、5mg/kg、i.p、QD×11群;第3群 DX-36699-IgG1、2.5mg/kg、i.p、QD×11群;第4群 DX-36699-IgG1、5mg/kg、i.p、QD×11群;第5群 DX-36699-IgG4、2.5mg/kg、i.p、QD×11群;および第6群 DX-36699-IgG4、5mg/kg、i.p、QD×11群の腫瘍体積を対照群と比較した結果、極めて有意差があり(P<0.01)、結果を図14に示す。腫瘍阻害率(TGI)はそれぞれ59.77%、51.50%、65.34%、61.39%、及び67.72%であった。
試験終了時、動物を安楽死させ、腫瘍塊を剥がして重量を測定したところ、対照群の平均腫瘍重量は1.0612±0.0252gであり、受験サンプルとして第2群 5F9、5mg/kg、i.p、QD×11群;第3群 DX-36699-IgG1、2.5mg/kg、i.p、QD×11群;第4群 DX-36699-IgG1、5mg/kg、i.p、QD×11群;第5群 DX-36699-IgG4、2.5mg/kg、i.p、QD×11群;及び第6群 DX-36699-IgG4、5mg/kg、i.p、QD×11群の腫瘍重量と対照群の平均腫瘍重量では、極めて有意差があり(P<0.01)、腫重阻害率はそれぞれ59.57%、50.17%、59.76%、57.01%、及び64.56%であった。腫瘍重量の統計結果を図15に示す。
DX-36699抗体(VHH)の配列情報に基づき、まず、モデル作成によりこの抗体の相同モデルを取得し、CDRのコンホメーションや抗原結合活性に影響を及ぼす、CDRsから5A範囲にあるフレームワークアミノ酸及び希少アミノ酸をabysisソフトウェアと組み合わせて解析した。次に、IMGT解析によりヒト由来の生殖細胞系列(germline)を取得し、選択されたヒト由来の生殖細胞系列のフレームワークを抗体のCDRsとスプライシングした後、設計して得られたヒト化抗体と元の抗体のフレームワーク領域配列を比較し、両者のフレームワーク領域配列に差異が存在するアミノ酸部位を探し出し、親抗体の相同モデリング結果を分析することにより、差異が存在するこれらのアミノ酸部位がCDRのコンホメーションや抗原結合活性に影響するかどうかを判定した。抗体活性を維持し、異種性の減少を考慮した上で、ヒト抗体の表面残基と類似するアミノ酸と置換し、抗体のヒト化配列を設計した。4つのヒト化抗体配列を得て、これらの番号はそれぞれDX-36699-H7、DX-36699-H19、DX-36699-H20、及びDX-36699-H21であった。具体的な配列情報を表4に示す。
上記4つのヒト化VHHシングルドメイン抗体を用いて、293F発現系によりFc融合二価組換え抗体(VHH-Fc)を製造した。具体的には、N端からC端に向かって、「シグナルペプチド-可変領域-定常領域」の順に、シグナルペプチドアミノ酸配列(MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO.13))、DX-36699-H7、DX-36699-H19、DX-36699-H20、及びDX-36699-H21アミノ酸配列(表4)をコドン最適化した後、DNA(南京金斯瑞生物科技有限公司、南京)を全遺伝子合成し、次に、ヒトIgG4抗体(UniProtデータベースより、配列P1861、S228P突然変異含有)の重鎖ヒンジ領域~CH3ドメインのアミノ酸配列、すなわちSEQ ID NO.39(ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK)を含むpcDNA3.4ベクターにタンデムにサブクローンした。シーケンシングした結果、ベクターが正しい場合、一般的な方法でコンピテント大腸菌(E.coli)を形質転換し、Qiagenプラスミドマックスキット(カタログ番号:12362)を用いてエンドトキシンフリープラスミドを製造した。
LVTransmトランスフェクション試薬(iCarTabから購入、カタログ番号LVTran100)の取扱書にしたがって、冷蔵庫からLVTransmトランスフェクション試薬及び抗体発現ベクターを取り出し、室温で解凍した後、ピペットマンで上下にピペッティングして均一に混合した。PBS緩衝液を取り出し、室温まで加熱した。PBS 2mLを6ウェルプレートの1ウェルに取り、それぞれプラスミド130μgを加え、ピペットマンで上下にピペッティングして均一に混合した後、LVTransmを400μL加えた直後、ピペットで上下にピペッティングして均一に混合し、室温で10min静置した。上記のDNA/LVTransm複合体を293F細胞培養液120mLに加え、軽く振って十分に混合した。細胞を37℃、5%CO2インキュベーターに入れて、130rpmで6~8h培養した後、新しい培地50mLを加えて、さらに7日間培養した。
細胞培養液を1200rpmで3min遠心分離して細胞ペレットを除去し、上清を収集し、Protein A親和精製カラム(蘇州博進生物技術有限公司、カタログ番号:13-0010-02)を用いてVHH-Fc融合二価組換え抗体を精製し、マイクロプレートリーダでOD280を測定してタンパク質定量を行い、適量の組換え抗体を取って還元SDS-PAGEで同定し、目標抗体の単量体分子量は37kD~39kDであった。SDS-PAGEでは、そのサイズ及び純度の結果を図16に示す。
精製により得られた4つのヒト化分子を、元の抗体DX-36699IgG4(SEQ ID NO.9とSEQ ID NO.39のスプライシング)と5F9を対照として赤血球凝集検出を行った。ヒト赤血球はALLCELLS生物技術(上海)有限公司に由来する。具体的な実施方法は実施例9と同じであった。結果を図17に示す。
4つのヒト化分子は、元の抗体の特性と一致し、測定した各濃度では、赤血球凝集を起こさなかった。5F9抗体は0.096nMより高い濃度になると深刻な赤血球凝集反応を引き起こした。
FACSを用いてヒト化抗体とヒト赤血球との結合を検出し、元の抗体DX-36699-IgG4及び5F9を対照とした。ヒト赤血球はALLCELLS生物技術(上海)有限公司に由来する。具体的な実施方法は実施例10と同じであった。結果を図18に示す。
4つのヒト化分子は、元の抗体の特性と一致し、赤血球との結合が極めて弱く、同濃度では5F9よりはるかに弱かった。
FACS方法を用いてヒト化抗体とヒト血小板との結合を検出し、元の抗体DX-36699IgG4及び5F9を対照とした。具体的な実施方法は実施例11と同じであった。結果を図19に示す。
4つのヒト化分子は、元の抗体の特性と一致し、ヒト血小板との結合が極めて弱く、同濃度では5F9よりもはるかに弱かった。
FACS方法を用いてヒト化抗体と細胞表面CD47との結合を検出し、元の抗体DX36699-IgG4を対照とした。検出に用いた細胞はCD47陽性のJurkat細胞(中国科学院細胞バンク、カタログ番号SCSP-513)であった。具体的な実施方法は実施例12(NUGC-4細胞をJurkat細胞に変更した以外、残りの条件は変更しない)とした。結果を図20に示す。
4つのヒト化分子は細胞表面CD47に濃度依存的に結合し、その結合活性は元の抗体DX-36699-IgG4と一致した。
FACS方法を用いて、SIRPα組換えタンパク質とJurkat細胞(膜型CD47発現)との相互作用に対するヒト化抗体の遮断活性を検出し、元の抗体DX-36699IgG4を対照とした。具体的な実施方法は実施例13と同じであった。結果を図21に示す。
4つのヒト化分子は全てSIRPα組換えタンパク質とCD47陽性細胞Jurkatとの相互作用を濃度依存的に遮断でき、その遮断活性は元の抗体DX-36699-IgG4と一致した。
ヒト化抗体DX-36699-H20を選択し、Biacore T200(GE Healthcare)を用いてhuCD47との親和性を検出し、元の抗体DX-36699-IgG4と比較した。具体的な実施方法は、実施例14と同じであった。その結果、表5に示すように、ヒト化抗体DX-36699-H20の親和性は元の抗体DX-36699-IgG4と一致した。
FACSを用いてヒト化抗体DX-36699-H20とカニクイザルの赤血球との結合を検出し、5F9を対照とした。カニクイザルの赤血球は上海益諾思生物技術有限公司に由来し、4つの赤血球の番号はそれぞれ186#、188#、194#、及び567#である。具体的な実施方法は実施例10と同じであった。結果を図22に示す。
5F9は4つのカニクイザルの赤血球の全てに濃度依存的に結合し、強い結合活性を有し、最大結合50%に達したときの5F9抗体の濃度は0.01~0.03μg/mLであった。同じ実験条件では、DX-36699-H20はカニクイザルの赤血球と弱い結合しかなかった。
FACSを用いてヒト化抗体DX-36699-H20とカニクイザルの赤血球との結合を検出し、5F9を対照とした。カニクイザルの血小板は上海益諾思生物技術有限公司に由来し、4つの血小板の番号はそれぞれ186#、188#、194#、及び567#である。具体的な実施方法は実施例11と同じであった。結果を図23に示す。
5F9は、4つのカニクイザルの全ての血小板に濃度依存性に結合し、5F9濃度が0.1μg/mLより大きい場合には明らかな結合活性が測定された。同じ実験条件では、測定した濃度範囲(0.001~10μg/mL)では、DX-36699-H20とカニクイザルの血小板では、測定可能な結合シグナルは認められなかった。
CD47抗原は赤血球で高発現しており、CD47抗原に対して開発された第1世代抗体は5F9抗体を含むが、赤血球と結合し赤血球凝集、溶血及びマクロファージ貪食を誘導するため、重篤な貧血は主要な副作用の一つである。
カニクイザル4頭(雌2+雄2、番号はそれぞれ2#、3#、4#及び5#)を2群に分け、それぞれ5F9とDX-36699-H20を1回静脈点滴し、投与量はいずれも15mg/kgとした。投与前8日目、投与前2日目及び投与後3、5、9、13、21日目にカニクイザル非投与肢静脈から0.5mL採血し、血液サンプルをしゅう採取した後、サンプル番号が付けられたEDTA-K2抗凝固管に入れ、アイスボックスに入れ、採取後2h以内に血液ルーチンメータにより赤血球数、ヘモグロビン濃度、ヘマトクリット、網状赤血球の数と割合、赤血球体積分布幅、平均ヘモグロビン量と濃度、及び赤血球平均体積を検査した。その結果、図24に示すように、5F9静脈点滴後3日目から貧血が認められ、赤血球カウント、ヘマトクリッ及びとヘモグロビン濃度が低下し、低下傾向は9日目まで持続し、21日目には基本的に投薬前のレベルに回復し、末梢赤血球減少による貧血は骨髄の網状赤血球(未成熟赤血球)の代償性上昇による末梢赤血球レベル補充を伴い、網状赤血球は末梢赤血球減少性貧血の敏感な指標とすることができる。5F9静脈点滴後3日目から網状赤血球数及び割合では、明らかな代償性増加が現れ、13日目まで持続し、21日目には基本的に投薬前のレベルに回復し、DX-36699-H20の静脈点滴は測定した赤血球関連の各指標に影響がなく、動物では、貧血はなかった。
この結果は、インビトロでの5F9及びDX-36699-H20と赤血球との結合及び赤血球凝集実験の結果と一致しており、このことから、DX-36699-H20は赤血球凝集を起こさず、赤血球との結合が極めて弱いため、カニクイザルの体内に15mg/kgのDX-36699-H20を投与しても貧血の副作用は認められないことが示唆された。DX-36699-H20は、カニクイザルでは、5F9より安全性の優位性を示し、第1世代CD47抗体の臨床使用による貧血の副作用の問題を解決する潜在力を持っている。
Claims (22)
- 抗CD47重鎖シングルドメイン抗体(VHH)であって、
(1)SEQ ID NO: 1に示されるCDR1、SEQ ID NO: 2に示されるCDR2、及び、SEQ ID NO: 3に示されるCDR3、又は
(2)SEQ ID NO: 6に示されるCDR1、SEQ ID NO: 7に示されるCDR2、及び、SEQ ID NO: 8に示されるCDR3のCDRを含む、抗CD47重鎖シングルドメイン抗体。 - FR1、FR2、FR3、及びFR4を含み、
前記FR1は、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.27及びSEQ ID NO.31から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記FR2は、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.28及びSEQ ID NO.32から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記FR3は、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.29及びSEQ ID NO.33から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記FR4は、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.30及びSEQ ID NO.34から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の抗CD47重鎖シングルドメイン抗体。 - SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17及びSEQ ID NO:18のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の抗CD47重鎖シングルドメイン抗体。
- ヒト化したものである、請求項1に記載の抗CD47重鎖シングルドメイン抗体。
- 重鎖Fc領域に、ヒンジ領域、CH2、及びCH3からなる群から選択される領域をさらに含む、請求項2に記載の抗CD47重鎖シングルドメイン抗体。
- 前記重鎖はIgG1又はIgG4である、請求項5に記載の抗CD47重鎖シングルドメイン抗体。
- 請求項1~6のいずれか1項に記載の抗CD47重鎖シングルドメイン抗体又はその抗原結合断片を含む、コンジュゲート。
- 前記抗CD47重鎖シングルドメイン抗体又はその抗原結合断片は、薬物、毒素、細胞毒性剤、インターフェロン遺伝子刺激因子(STING)受容体アゴニスト、サイトカイン、放射性核種又は酵素に結合する、請求項7に記載のコンジュゲート。
- 請求項1~6のいずれか1項に記載の抗CD47重鎖シングルドメイン抗体又はその抗原結合断片を含む、融合タンパク質。
- 前記抗CD47重鎖シングルドメイン抗体又はその抗原結合断片と、診断分子又は治療分子とが融合した、請求項9に記載の融合タンパク質。
- 請求項1~6のいずれか1項に記載の抗CD47重鎖シングルドメイン抗体又はその抗原結合断片をコードする、ポリヌクレオチド。
- 請求項11に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項11に記載のポリヌクレオチド又は請求項12に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1~6のいずれか1項に記載の抗CD47重鎖シングルドメイン抗体の生産方法であって、
請求項13に記載の宿主細胞を培養するステップ(a)と、培養物から抗CD47重鎖シングルドメイン抗体を単離するステップ(b)とを少なくとも含む、生産方法。 - 診断マーカー付き請求項1~6のいずれか1項に記載の抗CD47重鎖シングルドメイン抗体。
- 前記診断マーカーは、同位体、コロイド金マーカー、着色マーカー又は蛍光マーカーから選択される、請求項15に記載の抗CD47重鎖シングルドメイン抗体。
- 請求項1~6のいずれか1項に記載の抗CD47重鎖シングルドメイン抗体、請求項7若しくは8に記載のコンジュゲート、又は請求項9若しくは10に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
- 請求項1~6、15及び16のいずれか1項に記載の抗CD47重鎖シングルドメイン抗体を含む、CD47タンパク質を検出する製品又はキット。
- CD47タンパク質の検出に使用するための、請求項1~6、15及び16のいずれか1項に記載の抗CD47重鎖シングルドメイン抗体又はその抗原結合断片。
- 請求項1~6のいずれか1項に記載の抗CD47重鎖シングルドメイン抗体、請求項7若しくは8に記載のコンジュゲート、又は請求項9若しくは10に記載の融合タンパク質の癌治療薬の調製における使用。
- 前記抗CD47重鎖シングルドメイン抗体、コンジュゲート又は融合タンパク質は、他の1種若しくは複数種の抗体又は薬物と併用される、請求項20に記載の使用。
- 前記他の1種又は複数種の抗体はチェックポイント抗体である、請求項21に記載の使用。
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