CN102787073B - 一种构建转基因家蚕微孢子虫的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种构建转基因家蚕微孢子虫的方法，在家蚕微孢子感染的家蚕体腔注射脂质体包裹的转基因载体，2～4天后取蚕血淋巴加入家蚕BmN培养细胞中培养；当微孢子虫呈绿色荧光时，用昆虫培养基极度稀释，加入到细胞培养板中，选择仅有一个培养细胞呈现绿色荧光的培养孔，添加正常培养细胞培养2～4天，获得感染培养细胞；重复至少3次，取获得的感染培养细胞，匀浆破碎细胞，差速离心，纯化微孢子，感染家蚕，家蚕发病后，从感染组织纯化获得转基因家蚕微孢子。运用本发明的技术方案可以将外源基因整合进家蚕微孢子虫基因组，实现了用基因工程技术改造家蚕微孢子虫，实现调节微孢子虫基因的表达水平，为微孢子虫基因功能研究提供了方法。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种构建转基因家蚕微孢子虫的方法。
背景技术
微孢子虫（microsporidia）是一种专性细胞内寄生的单细胞的真核生物，从线虫到人类，几乎所有动物身上，都发现了微孢子虫。微孢子虫是昆虫、鱼类、啮齿类动物、兔类、皮毛动物和灵长动物的病原，也是蝗虫的生物防治杀虫剂。目前已经发现的微孢子虫超过1200种，分布于144个属中。
家蚕微粒子病是由家蚕微孢子虫（Nosema bombycis，Nb）寄生蚕体引起的一种传染性病害，该病病原于1857年在法国首次被发现，因其具有胚胎传染性而被世界各养蚕国家和地区列为蚕种生产的惟一检疫对象。目前该病害仍然对养蚕业存在重大威胁。
目前，家蚕微孢子虫的基因组序列测定已近完成，但缺乏微孢子虫的基因功能研究平台，基因的敲入和敲除是研究基因功能最直接、有效的方法，因此，建立家蚕微孢子虫转基因研究体系对基因功能研究以及微孢子虫基因工程改造有重要作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种构建转基因家蚕微孢子虫的方法，以便于进行家蚕微孢子虫基因功能鉴定以及微孢子虫基因工程改造。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种构建转基因家蚕微孢子虫的方法，包括以下步骤：
(1) 用家蚕微孢子感染家蚕，感染后3～4天，体腔注射脂质体包裹的转基因载体，继续饲养；
(2) 2～4天后取家蚕的蚕血淋巴，用荧光显微镜进行观察，若观察到有部分血细胞呈绿色荧光，则取该家蚕的蚕血淋巴加入家蚕BmN培养细胞中，25～27℃培养；若没有观察到绿色荧光，则重复步骤(1)和(2)；
(3) 每隔2～3天，吸出一半旧培养液，补加新鲜培养基和正常家蚕BmN培养细胞，25～27℃培养；
(4) 每天采用荧光显微镜观察培养细胞，当发现感染培养BmN细胞内的微孢子虫呈现绿色荧光时，取出部分感染培养细胞，提取总DNA,用荧光蛋白基因的特异性引物进行PCR扩增，当扩增出荧光蛋白基因的特异性条带时，取未使用的部分感染培养细胞，进行步骤(5)，否则重复步骤(4)；
(5) 取部分感染培养细胞，用昆虫培养基极度稀释，加入到细胞培养板中，荧光显微镜观察，选择仅有一个培养细胞呈现绿色荧光的培养孔，添加新鲜正常培养细胞，25～27℃培养2～4天，获得感染培养细胞；
(6) 重复步骤(5)至少2次，每次采用上一次获得的感染培养细胞作为本次的初始感染培养细胞；
(7) 取经过上述处理的感染培养细胞，匀浆破碎细胞，差速离心，纯化微孢子；取部分微孢子虫提取微孢子虫DNA，用荧光蛋白基因的特异性引物进行PCR扩增，如果扩增出荧光蛋白基因的特异性条带，则用获得的微孢子虫感染家蚕，家蚕发病后，从感染组织纯化获得转基因家蚕微孢子。
上述技术方案中，所述转基因载体为非转座子转基因载体pIZT/V5-His或基于piggyBac转座子的转基因载体。
piggyBac因子又称IFP2，是目前应用比较广泛的转座子，已被证实在多种昆虫中可以发挥转座作用，可以通过转座而将外源基因重组整合到昆虫基因组中。到目前为止，尚无用此方法获得转基因家蚕微孢子虫的报道和专利。
pIZT/V5-His是Invitrogen公司开发的一种能在昆虫细胞中稳定表达外源基因的载体，属非转座子、非打靶类载体，可随机多拷贝将外源基因整合进昆虫细胞的基因组。但至今没有用pIZT/V5-His进行家蚕微孢子虫转基因的研究报道。
家蚕微孢子虫是Nosema属的代表种，通过转基因进行基因的敲入和敲除是研究基因功能最直接、有效的方法，但至今在包括家蚕微孢子虫在内的Nosema属微孢子虫中还没有基因敲入和敲除的报道。
步骤(5)中，所述用昆虫培养基极度稀释是指稀释后加入到细胞培养板中时，每个培养孔中仅分布1-2个感染培养细胞。
优选的技术方案，步骤(5)中，所述细胞培养板为96孔细胞培养板。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
1．现有的技术不能将外源基因导入家蚕微孢子虫基因组，本发明通过转基因将外源基因整合进家蚕微孢子虫基因组，实现了用基因工程技术改造家蚕微孢子虫，也可为其他微孢子虫的基因工程改造提供借鉴。
2. 现有的技术难以通过调节基因的表达水平研究微孢子虫基因功能，运用本发明的技术方案可以实现调节微孢子虫基因的表达水平，为微孢子虫基因功能研究提供了新技术。
附图说明
图1是实施例一中感染微孢子虫家蚕体腔注射转基因载体pIZT/V5-His后的呈绿色荧光的血细胞；
图2是实施例一中将能观察到绿色荧光的蚕血淋巴迅速加入至家蚕BmN培养细胞后，感染培养细胞中呈绿色荧光的家蚕微孢子虫；
图3 是实施例一中感染培养细胞的微孢子虫PCR鉴定，泳道1是感染微孢虫培养细胞总DNA为模板；泳道2是以pIZT/V5-His为模板；M为标准分子量DNA Marker；
图4 是实施例一中96孔细胞培养板中感染培养细胞内的微孢子虫呈现绿色荧光、且仅有一个培养细胞的培养孔，添加新鲜正常培养细胞。
图5是实施例二中将能观察到绿色荧光的蚕血淋巴迅速加入至家蚕BmN培养细胞后，感染培养细胞中呈绿色荧光的家蚕微孢子虫；
图6是实施例二中感染细胞内形成大量的孢子，部分培养细胞内呈绿色荧光的微孢子虫；
图7是实施例二中仅有一个培养细胞呈现绿色荧光培养孔；
图 8 是实施例二中纯化后的转基因家蚕微孢子虫。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：基于pIZT/V5-His介导的家蚕微孢子虫转基因
(1) 用106/mL的家蚕微孢子涂抹桑叶添食4龄起蚕6小时，饲养3～4天。
(2) 取2μg/μL的 pIZT/V5-His (Invitrogen公司)5μL与脂质体5μL混合，体腔注射步骤(1)的家蚕，继续饲养。
(3) 2～4天后取蚕血淋巴，用荧光显微镜进行观察，观察到有部分血细胞呈绿色荧光(图1)，取蚕血淋巴加入至家蚕BmN培养细胞中，26℃培养，每天进行荧光观察。
(4) 每隔2～3天，吸出一半旧培养液，补加相应的新鲜培养基和正常家蚕BmN培养细胞，26℃培养。
(5) 荧光显微镜观察培养细胞，当发现感染培养BmN细胞内的微孢子虫呈现绿色荧光时(图2)，取出部分感染培养细胞，提取总DNA,用荧光蛋白基因的特异性引物FGFP1（gcg tct aga gat ggc tag caa agg aga ag，下划线为XbaⅠ位点）和FGFP2（acg ccc ggg cat cca tgc cat gtg taa tcc，下划线为SmaⅠ位点）为引物进行PCR扩增，可扩增出荧光蛋白基因的特异性条带(图3)。
(6) 取部分感染培养细胞，用昆虫培养基极度稀释，加入到96孔细胞培养板中，荧光显微镜观察，选择仅有一个培养细胞呈现绿色荧光的培养孔，添加新鲜正常培养细胞(图4)，26℃培养2～4天。
(7) 取步骤(6)的感染培养细胞，按步骤(6)所述的方法重复。
(8) 取步骤(7)的感染培养细胞，按步骤(6)所述的方法重复。
(9) 取步骤(8)的感染培养细胞，匀浆破碎细胞，差速离心，纯化微孢子，提取微孢子虫DNA，用荧光蛋白基因的特异性引物进行PCR扩增，可扩增出荧光蛋白基因的特异性条带。
(10) 取步骤(8)的感染培养细胞、匀浆破碎细胞，差速离心，纯化微孢子，感染家蚕，发病后，从感染组织纯化获转基因家蚕微孢子。
实施例二：基于piggyBac转座子载体pigA3GFP介导的家蚕微孢子虫转基因
(1) 用106/mL的家蚕微孢子涂抹桑叶添食4龄起蚕6小时，饲养3～4天。
(2) 取4μg/μL的 pigA3GFP 2.5μL和 4μg/μL 辅助质粒2.5μL(（参见Tamura Toshiki. et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology, 2000,18:81-84）)与脂质体5μL混合，体腔注射步骤(1)的家蚕，继续饲养。
(3) 2～4天后取蚕血淋巴，用荧光显微镜进行观察，观察到有部分血细胞呈绿色荧光，取蚕血淋巴加入至家蚕BmN培养细胞中，26℃培养，每天进行荧光观察。
(4) 每隔2～3天，吸出一半旧培养液，补加相应的新鲜培养基和正常家蚕BmN培养细胞，26℃培养。
(5) 荧光显微镜观察培养细胞，当发现感染培养BmN细胞内的微孢子虫呈现绿色荧光时(图5)，取出部分感染培养细胞，提取总DNA,用荧光蛋白基因的特异性引物DEGFP1(5'-tgg aat tca tgg tga gca agg gcg ag-3'，下划线为EcoRⅠ位点)和DEGFP2(5'-ttg gat cct tac ttg tac agc tcg tcc atg-3'，下划线为BamHⅠ酶切位点)进行PCR扩增，可扩增出荧光蛋白基因的特异性条带。感染细胞继续培养，可观察到感染细胞内形成大量的微孢子，部分培养细胞内可观察到呈绿色荧光的微孢子虫(图6)。
(6) 取部分感染培养细胞，用昆虫培养基极度稀释，加入到96孔细胞培养板中，荧光显微镜观察，选择仅有一个培养细胞呈现绿色荧光的培养孔(图7)，添加新鲜正常培养细胞，26℃培养2～4天。
(7) 取步骤(6)的感染培养细胞，按步骤(6)所述的方法重复。
(8) 取步骤(7)的感染培养细胞，按步骤(6)所述的方法重复。
(9) 取步骤(8)的感染培养细胞，匀浆破碎细胞，差速离心，纯化微孢子，提取微孢子虫DNA，用荧光蛋白基因的特异性引物进行PCR扩增，可扩增出荧光蛋白基因的特异性条带。
(10) 取步骤(8)的感染培养细胞、匀浆破碎细胞，差速离心，纯化微孢子，感染家蚕，发病后，从感染组织纯化获转基因家蚕微孢子(图8)。
Claims (1)
1.一种构建转基因家蚕微孢子虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 用家蚕微孢子感染家蚕，感染后3～4天，体腔注射脂质体包裹的含有绿色荧光蛋白基因表达盒的转基因载体，继续饲养；所述转基因载体为非转座子转基因载体pIZT/V5-His或piggyBac转座子转基因载体pigA3GFP；
(2) 2～4天后取家蚕的蚕血淋巴，用荧光显微镜进行观察，若观察到有部分血细胞呈绿色荧光，则取该家蚕的蚕血淋巴加入家蚕BmN培养细胞中，25～27℃培养；若没有观察到绿色荧光，则重复步骤(1)和(2)；
(3) 每隔2～3天，吸出一半旧培养液，补加新鲜培养基和正常家蚕BmN培养细胞，25～27℃培养；
(4) 每天采用荧光显微镜观察培养细胞，当发现感染培养BmN细胞内的微孢子虫呈现绿色荧光时，取出部分感染培养细胞，提取总DNA,用荧光蛋白基因的特异性引物进行PCR扩增，当扩增出荧光蛋白基因的特异性条带时，取未使用的部分感染培养细胞，进行步骤(5)，否则重复步骤(4)；
(5) 取部分感染培养细胞，用昆虫培养基极度稀释，加入到细胞培养板中，荧光显微镜观察，选择仅有一个培养细胞呈现绿色荧光的培养孔，添加新鲜正常培养细胞，25～27℃培养2～4天，获得感染培养细胞；
(6) 重复步骤(5)至少2次，每次采用上一次获得的感染培养细胞作为本次的初始感染培养细胞；
(7) 取经过上述处理的感染培养细胞，匀浆破碎细胞，差速离心，纯化微孢子；取部分微孢子虫提取微孢子虫DNA，用荧光蛋白基因的特异性引物进行PCR扩增，如果扩增出荧光蛋白基因的特异性条带，则用获得的微孢子虫感染家蚕，家蚕发病后，从感染组织纯化获得转基因家蚕微孢子。
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