CN100389189C - 一种以家蚕为宿主工厂化生产微孢子虫M-Px或M-Le的工艺 - Google Patents

一种以家蚕为宿主工厂化生产微孢子虫M-Px或M-Le的工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种以家蚕为宿主工厂化生产微孢子虫M-Px或M-Le的工艺，该工艺利用微孢子虫对昆虫寄生存在较宽松种特异性的特点，提出以饲养技术成熟、易养易繁、全年可多次饲养的家蚕为替代宿主，人为创造感染致病条件，大量增殖目标微孢子虫。宿主家蚕个体大、产量多、养蚕成本低，可规模化饲养，形成产业化生产，从而解决微孢子虫来源困难的问题。

Description

一种以家蚕为宿主工厂化生产微孢子虫M-Px或M-Le的工艺
技术领域
本发明涉及害虫生物防治的研究，尤其涉及一种利用家蚕为宿主工厂化生产微孢子虫M-Px或M-Le的工艺。
背景技术
微孢子虫是专性细胞内寄生虫，它不仅可引起宿主昆虫食下发病死亡，而且多数微孢子虫可经雌虫胚种传染子代导致子代虫体死亡，这种垂直传播既可保存病原物种又能继续扩大传播形成流行病，这是细菌、真菌等其他昆虫病原微生物所不具备的显著特点，从控制害虫种群数量的角度而言，具有特殊意义。因此，微孢子虫作为杀虫微生物农药应用，杀虫效力高，防治时间长，是一类极具潜力和应用前景的微生物农药资源。目前，利用微孢子虫防治作物害虫的研究不多。
影响微孢子虫生防实用化的一个重要原因是微孢子虫的大量繁殖问题。微孢子虫是一种专性细胞内寄生物，与昆虫病毒一样，不能在人工培养基上生长，必须采用活寄主繁殖或细胞培养繁殖。细胞培养的成本高，生产上不可取。目前国内外对微孢子虫的繁殖方法通常是利用原分离宿主来繁殖，但原分离宿主普遍存在饲养困难，成本高，难以实用化。利用微孢子虫对昆虫寄生存在较宽松寄主范围的特点，我们首次提出以饲养技术成熟、易养易繁、全年可多次饲养的家蚕为替代宿主，人为创造感染致病条件，大量增殖目标害虫强病原性微孢子虫的设想。家蚕个体大、产量高、成本低、可规模化生产微孢子虫，形成产业，解决微孢子虫来源困难的问题。这一方法将可解决微孢子虫在害虫生物防治实用化存在的关键问题。国内目前尚未见利用家蚕大量繁殖微孢子虫开展生防应用的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以家蚕为宿主工厂化生产微孢子虫M-Px或M-Le的工艺。
本发明提供的一种以家蚕为宿主工厂化生产微孢子虫M-Px或M-Le的工艺，包括以下步骤：
(1)选择无微孢子虫胚种传染的健康家蚕种作为繁殖宿主；
(2)家蚕幼虫在温度为25～30℃、湿度为70～85％及自然光照的条件下，用新鲜的正常桑叶饲养；
(3)将提纯的微孢子虫M-Px或M-Le孢子液配制成浓度1～5×106个/mL，涂于桑叶表面，在2～3龄起蚕连续添食4～8小时，然后换用新鲜正常桑叶进行正常饲养，饲养至化蛹、化蛾，收集病死虫尸和蛾体，0～5℃保存；
(4)将保存的病死虫和蛾体取出，用研磨器研磨，尼龙纱布过滤，差速离心多次，所得沉淀即为粗提纯微孢子虫液，分装于三角瓶于0～5℃保存。
微孢子虫是细胞内专性寄生物，不能在人工培养基上生长。通常采用活体繁殖，一般是通过饲养原宿主来繁殖，但原分离宿主普遍存在饲养困难，成本高，难以实用化，因此，要获得大量的微孢子虫比较困难。
过去认为原生动物的寄主范围窄，但通过人工接种感染试验发现，微孢子虫的寄主谱不象以前想象的那么严格，昆虫间存在交叉感染现象。日本学者广濑对102种昆虫共25000头进行调查，在65种昆虫中检出微孢子虫，其中12种对家蚕有病原性。国内报道从51种昆虫中镜检出54种微孢子虫，其中有18种可以感染家蚕。
利用微孢子虫对昆虫寄生存在较宽松种特异性的特点，本发明提出以饲养技术成熟、易养易繁、全年可多次饲养的家蚕为替代宿主，人为创造感染致病条件，大量增殖目标微孢子虫。宿主家蚕个体大、产量多、养蚕成本低，可规模化饲养，形成产业化生产，从而解决微孢子虫来源困难的问题。
下面通过具体实施方式对本发明作进一步的说明。
具体实施方式
下面以家蚕为宿主工厂化生产微孢子虫M-Px或M-Le的两个实施例用于阐述本发明，但本发明并不限于此。
微孢子虫M-Px(从小菜蛾分离的一种微孢子虫)和M-Le(从甜菜夜蛾分离的一种微孢子虫)对小菜蛾和甜菜夜蛾具有极强的致病力，是有应用潜力的2株微孢子虫，通过实验室研究发现，这两种微孢子虫均可以感染家蚕，且对家蚕的食下感染病原性较弱，M-Px主要寄生于家蚕脂肪体细胞，M-Le主要寄生于中肠后部气管丛，均不寄生家蚕丝腺，亦未发现有胚种传染现象，故对养蚕危害较轻微。这为利用家蚕为宿主繁殖这两种微孢子虫提供了实际可能。通过开展最佳接种剂量、接种时期、饲养条件、收获时期等研究，本发明提出了以家蚕为宿主的工厂化生产这2种微孢子虫的工艺流程。
实施例1 利用家蚕繁殖微孢子虫M-Px
蚕种选择：选择无微孢子虫胚种传染的健康蚕种作为繁殖宿主。
饲养条件：家蚕幼虫的饲养温度为25～30℃，湿度70～85％％，自然光照，新鲜的正常桑叶饲养。
接种剂量及时期：将提纯的M-Px孢子液配制成浓度2×106个/mL，涂于桑叶表面，在3龄起蚕连续添食8小时，然后换用新鲜正常桑叶进行正常饲养，饲养至化蛹、化蛾，收集病死虫尸和蛾体，冰箱5℃保存。
微孢子虫收集及提纯：将冰箱保存的病死虫和蛾体取出，用研磨器研磨，尼龙纱布过滤，差速离心多次，所得沉淀即为粗提纯微孢子虫液，分装于三角瓶于5℃保存。通常可保存1年以上。
实施例2 利用家蚕繁殖微孢子虫M-Le
蚕种选择：选择无微孢子虫胚种传染的健康蚕种作为繁殖宿主。
饲养条件：家蚕幼虫的饲养温度为25～30℃，湿度70～85％，自然光照，新鲜的正常桑叶饲养。
接种剂量及时期：将提纯的M-Le孢子液配制成浓度1×106个/mL，涂于桑叶表面，在3龄起蚕连续添食8小时，然后换用新鲜正常桑叶进行正常饲养，饲养至化蛹、化蛾，收集病死虫尸和蛾体，冰箱5℃保存。
微孢子虫收集及提纯：将冰箱保存的病死虫和蛾体取出，用研磨器研磨，尼龙纱布过滤，差速离心多次，所得沉淀即为粗提纯微孢子虫液，分装于三角瓶于5℃保存。通常可保存1年以上。

Claims (1)

1.一种以家蚕为宿主工厂化生产微孢子虫M-Px或M-Le的工艺，其特征在于包括以下步骤：
(1)选择无微孢子虫胚种传染的健康家蚕种作为繁殖宿主；
(2)家蚕幼虫在温度为25～30℃、湿度为70～85％及自然光照的条件下，用新鲜的正常桑叶饲养；
(3)将提纯的微孢子虫M-Px或M-Le孢子液配制成浓度1～5×106个/mL，涂于桑叶表面，在2～3龄起蚕连续添食4～8小时，然后换用新鲜正常桑叶进行正常饲养，饲养至化蛹、化蛾，收集病死虫尸和蛾体，0～5℃保存；
(4)将保存的病死虫和蛾体取出，用研磨器研磨，尼龙纱布过滤，差速离心多次，所得沉淀即为粗提纯微孢子虫液，分装于三角瓶于0～5℃保存。
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