CN1428437A - 一种家蚕微粒子病的核酸分子杂交检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种家蚕微粒子病的核酸分子杂交检测方法。该方法采用核酸分子杂交技术，提取家蚕微孢子虫的DNA，通过PCR，将PCR产物克隆到重组载体质粒中，用N.B.PCR产物经DIG标记制成分子探针，采用DNA Dot blot检测家蚕微粒子病病原孢子。本发明所提取的各种微孢子虫基因组质量好、含量高，所设计的引物为N.B.孢子所特有，引物与模板DNA特异性高度吻合，检测准确率＞98％，可在家蚕微粒子原孢子的早期，快速、定性、定量地进行检测，是一种方便、高效、准确的检测方法。
Description
技术领域：
本发明涉及生物病害的检测方法，尤其涉及昆虫病害的检测方法，更具体涉及一种家蚕微粒子病的核酸分子杂交检测方法。
背景技术：
家蚕微粒子病(Pebrine disease)是微粒子孢子(Nosema bombycis，简称N.B.)寄生而引起的蚕病，是一种带毁灭性的家蚕慢性传染病，对蚕桑生产危害严重且长期得不到根治。该病流行范围广泛，诊断治疗困难，历史上曾给欧洲、日本、中国等世界主要养蚕国的蚕业生产以毁灭性的打击。法国、意大利等国家因家蚕微粒子的病爆发流行，而一蹶不振，因此对微粒子病的防治是一个世界性难题。
近年来，我国家蚕微粒子病发病趋势渐趋严重。如四川省因其优越的地理环境和适宜的气候条件，曾经大面积栽桑养蚕，养蚕量最多的1994年(含重庆)发种量达800多万张，产茧量近400万担，居全国之首，仅蚕农茧款收入就达到20亿元。现四川省(除重庆)年养蚕也有300多万张，产茧160万担以上，仅次于江、浙，居全国第三位。但因多年来受到微粒子病的严重困扰，蚕茧的单产低、质量差，每年直接经济损失在千万元以上。据估算每年因蚕病造成的损失几占30％以上。而在蚕种制种过程中因蚕种微粒子超毒被烧毁的损失还未计算在内。这种连年的低产低收，已大大打击了蚕农的养殖热情，毁桑事件屡见不鲜。这对如此优越的地理、气候资源不能不说是一种巨大的浪费。因此，加强对家蚕微粒子病的防治已成为稳定蚕桑生产的当务之急。
家蚕微粒子病的传染途径主要有两条——食下传染和胚种传染。卵壳、桑叶、昆虫、蚕沙等都可能带有微粒子孢子，成为食下传染的来源。蚕座混育感染是引起微粒子病传染的重要因素，混育时间越早危害越大，饲育环境的干燥清洁程度及其中微粒子孢子数量的多少，是影响感染率高低的重要因子。而4至5龄家蚕感染微粒子孢子后，雌蚕虽能正常发育，但会产下被微粒子孢子污染的蚕卵，从而、造成胚种传染。经配种传染的蚕卵经孵化培养，又为蚕期食下传染提供了病原，从而酿成恶性循环，危害严重。微粒子孢子对环境有较强的抵抗力。如在干燥的母蛾体内保护3年仍有感染致病能力；在水中浸5个月仍有活力；被鸡、猪等食下，从其粪便中排出的孢子仍有很强的感染力。当微粒子病蚕和携带者的尸体或其排泄物等未经严格的灭微孢子处理时，微粒子孢子除将直接传染给共育的健康蚕体外，也可以经由空气、飞尘、流水、昆虫等媒介污染桑叶、蚕蔟、以及蚕具、蚕室等养蚕环境。此外，微粒子孢子对多种物理化学因素的抵抗力也比较强，这就为蚕室、蚕具等养蚕环境以及病蚕尸体、排泄物的灭微工作增大了难度。所以对蚕种、幼蚕、桑叶以及养蚕环境等进行微粒子孢子的检测，对家蚕微粒子病的预防和治疗均具有举足轻重的作用。
对微粒子病的检测目前主要有三种方法：肉眼观察法、显微镜检测法和血清学诊断法。这三种方法均存在如下缺点：耗时长、灵敏度低、准确性差、无法实现早期检测。同时，多种变异的致病性原孢子虫的存在也为传统的微粒子病及微粒子孢子虫的检测方法增大了难度，进一步降低了检测的准确性。因此建立一种高效、快速、准确、灵敏的检测方法迫在眉睫。
发明内容：
本发明的目的是，提供一种家蚕微粒子病的核酸分子杂交检测方法。该方法采用核酸分子杂交技术，可在家蚕微粒子原孢子的早期，快速、定性、定量地进行检测，是一种方便、高效、准确的家蚕微粒子病原孢子虫检测方法。可实现对家蚕微粒子病早发现、早预防、早治疗的目的。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
用核酸分子杂交技术，即利用核苷酸碱基互补的原理，采用蛋白酶K苯酚氯仿抽提法提取家蚕微孢子虫的DNA，测定其特异DNA片断，通过PCR反应，将PCR产物微孢子虫特异DNA序列克隆到带有SP6噬菌体的启动子pGEN-3Z重组载体质粒中，经过重组质粒序列分析，用家蚕微孢子虫孢子(Nosema bombycis，简称N.B.)PCR产物(217bp)经异羟基洋地黄毒苷(即地高辛，Digoxigenin，简称DIG)标记制成分子探针，合成相应的引物，制备尼龙杂交膜，采用点杂交法(DNA Dot blot)检测家蚕微粒子病病原孢子。
本发明与现有技术相比，具有下列优点：
1)按照本发明所提取的各种微孢子虫基因组质量好、含量高；
2)所设计的引物为N.B.孢子所特有，因此引物与模板DNA特异性高度吻合，检测准确率＞98％，无无效杂交
3)DIG标记探针检测N.B.微孢子虫DNA，快速、灵敏、准确。
附图说明：
图1为样品DNA琼脂糖凝胶电泳图谱。其中1为病蚕幼虫，2为健蚕幼虫(5龄)，3为健棉铃虫蛹，4为健蚕蛹，5为带毒玉米螟蛹，6为带毒蚕蛾，7为玉米螟卵。
图2为PCR产物克隆、重组质粒酶切图谱。
图3为核酸探针点杂交鉴别家蚕微孢子虫。其中2，25，26为N.B.孢子DNA；3，4为山东微孢子虫DNA；5，6为广西南宁地区银纹夜蛾微粒子孢子DNA；7，8，9为广西甜菜夜蛾微粒子孢子DNA；10，11，12为广东广州地区微孢子虫DNA；13，14，15，16为北京地区玉米螟微粒子孢子DNA；17，18为菜粉蝶孢子DNA；19，20为四川大孢子DNA；21，22为柞蚕孢子DNA；23，24为家蚕幼虫DNA。
具体实施方式：
本发明的具体操作步骤如下：
家蚕微孢子虫DNA的提取→聚合酶联反应(PCR)→PCR产物克隆及重组质粒鉴定→重组质粒序列分析→DIG标记探针对N.B.孢子特异性鉴定→DIG标记探针对N.B.孢子DNA检测灵敏度鉴定→DIG标记探针在蚕业生产上的应用。
1、家蚕微孢子虫DNA的提取：用蛋白酶K苯酚氯仿抽提法进行提取。将添食微孢子虫进行普通喂养的家蚕碾碎提纯，按如下过程进行操作：
取400微升稍离心后去上清+等体积0.2摩尔/升K2CO3
↓30℃，1小时，除去杂质
转移到磷酸缓冲液(PBS buffer)中(pH7.8)
↓30℃，2小时，刺激孢子发芽
6000转/分钟，5分钟，去上清，加入40微升孢子裂解液
↓
54℃，水浴3-5小时
等体积饱和酚抽提一次
↓4000转/分钟，5分钟
取上清液，加等体积酚/氯仿/异戊醇
↓6000转/分钟，5分钟
取上清液，加2.5倍无水乙醇，1/30体积的10摩尔NH4AC
↓-20℃，12小时，12000转/分钟，10分钟
弃上清，沉淀用70％的冷乙醇、无水乙醇各洗一次，真空抽干10分钟
↓
溶于30微升TE缓冲液中，-20℃保存备用
用该方法所抽提的微孢子虫基因组DNA(图1)含量可达7～18微克。
2、聚合酶联反应(Polymerase Chain reaction，简称PCR)：根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank Sequence数据库，获得所有已经报道的微粒子属16SrRNA基因的核苷酸序列，根据16SrRNA小亚基基因的一段240bp(即240碱基对)特异性序列设计合成PCR扩增引物。经以下步骤操作检测，所合成的PCR产物约为217bp。
5’端引物：5’CACGAACCACGGTAATACTTGT 3’
3’端引物：3’GGCAATGGTATCTAATCATCTTC 5’
2.1引物的PCR扩增，按以下步骤操作：
2.1.1先在0.5毫升离心管中依次加入以下物质至总体积50毫升。
dd H2O(双蒸水)30微升，10×Taq DNA Polymerase buffer(耐热脱氧核糖核酸聚合物缓冲液)5.0微升，d NTPs(脱氧核糖核酸混合物)5.0微升，5’端引物2.0微升，3’端引物2.0微升，Template DNA(模板脱氧核糖核酸)2.0微升，DMSO(二甲基亚砜)3.5微升，Taq DNAPolymerase(耐热脱氧核糖核酸聚合物)1.0微升。之后，再加30微升无菌石蜡油，离心10秒。
2.1.2 95℃变性5分钟；按每个循环95℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共30个循环；72℃延伸10分钟。扩增完毕后，取5微升PCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳检测。
2.2 PCR产物回收：将PCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，90伏，30～40分钟，在紫外灯下用手术刀将含有扩增产物的凝胶切下，放入1.5毫升的离心管中，加6摩尔/升NaI 400微升，55～60℃水浴5分钟，待凝胶完全融化，放在冰中冰浴降至30℃，加入Wizard DNA Clean-upSystem树脂1毫升，倒转几次使溶液混合均匀，室温放置2分钟，加到过滤栓中，抽干，再加入2毫升80％的异丙醇，抽滤洗脱树脂上的杂质，将载有树脂的过滤器放入一Eppendorf管(小塑料管)中，10000转/分钟甩干残余的异丙醇(大约2分钟)，再将其转移到另一个新的Fppendorf管中，加入65℃热水30微升至过滤器中，保留1分钟，12000转/分钟离心20秒，收集管中液体于-20℃保存备用。
3、PCR产物克隆及重组质粒鉴定
对PCR产物按以下操作进行连接转化，并进行鉴定，确定217bp的PCR产物是否克隆到质粒载体之中(图2)，筛选结果表明，其克隆效率非常高。
3.1 PCR产物连接：首先在一个0.5毫升离心管中加入dd H2O 7微升、PCR扩增产物8微升、pGEM-T Easy Vector 2.0微升、10×T4 DNA ligasebuffer(甲状腺素脱氧核糖核酸连接酶缓冲液)2.0微升，T4 DNA ligase(甲状腺素脱氧核糖核酸连接酶)1微升(3微克/微升SABC)混合后离心20秒，置入4℃冰箱中联接50小时。
3.2感受态细胞的制备：在新鲜的大肠杆菌(E.coli)DH5a的LB(牛肉高蛋白冻培养基)平板上挑取一单菌落，接种于20毫升LB液体培养基上，37℃，300转/分钟剧烈振荡4小时，当OD600＝0.3～0.4时，在无菌条件下将细菌转移到预冷的1.5毫升0.1M CaCl2重悬，冰上放置15分钟，4℃，5000转/分钟离心10分钟，吸去上层液体，再用冰预冷的200微升0.1摩尔CaCl2重悬细菌，即为感受态细胞，在4℃条件下保存一周。
3.3感受态细胞的转化：在预冷的离心管中加入10微升连接反应液，100微升感受态细胞混匀后在冰上放置30分钟，42℃水浴90秒。向管中加400微升LB液体培养基，37℃，45分钟。在一个小离心管中加入4微升IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，200毫克/毫升)和16微升X-Gal(X-半乳糖，20毫克/毫升)，混匀后均匀涂在含LB平板(含100微升/毫升氨卞青霉素)表面，室温晾干，然后将转化液均匀涂布在LB平板上。
3.4蓝白菌落筛选和DNA的小量制备：在转化平板上挑取5个白色菌落，取名为pGEMN.B.1-5，分别接种于4毫升LB培养基(含氨卞青霉素100微升/毫升)的试管中，37℃，300转/分钟振荡培养8～12小时。采用《分子克隆实验指南》中的碱裂解法少量制备质粒DNA。
3.5重组质粒的酶切鉴定：在5个0.5毫升的Eppendorf管中分别加入质粒DNA 2微升，EcoR I(限制性内切酶)10×buffer 5微升，EcoRI 2微升，双蒸水4微升，离心20秒，混匀，37℃水浴2小时，酶切完毕各取8微升反应液在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测，用未进行酶切的质粒DNA和PCR产物做对照，PCR Marker做分子量标记。
3.6重组质粒DNA点杂交鉴定
3.6.1 DIG DNA探针制备：按照西德柏林格尔曼海姆公司出产的“DIG标记和检测试剂盒”说明书操作步骤，用N.B.PCR产物(217bp)做DIG标记制成探针。
取N.B.PCR产物10微升到0.5毫升离心管中，95-100℃变性10分钟，迅速置入冰上保持4-7分钟；然后，依次加入随机引物2微升、dNTPs(脱氧核苷三磷酸)2微升、ddH2O 15微升、Klenow 1微升，6000转/分钟离心20秒，37℃水浴反应过夜，反应完毕加入2微升0.2MEDTA(乙二胺四乙酸)终止反应，-20℃保存。
3.6.2杂交膜制备：将用SDS-蛋白酶K方法提取的N.B.孢子基因组DNA用TE稀释成100纳克/微升、10纳克/微升、1纳克/微升、100皮克/微升四种浓度梯度，每种浓度各取5微升、3微升、2微升、1微升，依次在一张5厘米×5厘米的尼龙膜上点样，再用120℃烘干30分钟。
3.6.3杂交膜预杂交、杂交。
将烘干的杂交膜至于预杂交液中，在40-45℃水浴摇床上预杂交1小时，倒去预杂交液，加入杂交液(含DIG标记探针)，40-45℃杂交10-20小时。
3.6.4洗膜：在室温条件下，用2×SSC和0.1％(重量/体积)SDS100毫升洗膜2次，每次5分钟；在68℃条件下，0.1×SSC和0.1％(重量/体积)SDS(十二烷基磺酸钠)100毫升洗膜2次，每次5分钟。
3.6.5抗原抗体反应及显色：
3.6.5.1将严格漂洗过的杂交膜，放入40毫升Maleic acid buffer(马来酸缓冲液)中，加0.3％(体积/体积)Tween-20(吐温-20)，放在摇摆平台上洗膜5分钟。
3.6.5.2将杂交膜转入50毫升Maleic acid buffer+10％(重量/体积)blocking reagent(封阻试剂)10×conc封闭溶液中，在摇摆平台上反应30分钟，再用封闭溶液稀释anti-DIG-AP抗体至1∶5000(体积/体积)即配成抗体溶液，将杂交膜至于20毫升抗体溶液中，在摇摆平台上反应30分钟。
3.6.5.3用60毫升加有0.3％Tween-20的Maleic acid buffer溶液放在摇摆平台上洗膜2次，每次15分钟，以除去未结合的抗体，再将杂交膜在不含Tween-20的Maleic acid buffer中洗5分钟，倒掉漂洗液，加60毫升Detection Solution(显色液)(0.1％摩尔Tris-HCL，0.1摩尔NaCL，50毫摩尔Mgcl2，pH9.5)，平衡2分钟。
3.6.5.4将Detection Solution倒掉，加10毫升显色液(10毫升Detection Solution加45微升NBT和35微升X-phospate)在室温黑暗静置条件下显色反应过夜(15-20小时)，当斑点已充分显示时，加50毫升TE buffer洗膜5分钟，终止反应，分析杂交结果。
4、重组质粒pGEMN.B.序列分析
将PEG纯化的重组质粒DNA稀释成0.2微克/微升，取两个0.5毫升的离心管，在其中一个中加入重组质粒DNA、双蒸水、PCR单引物，总体积达到12微升，质粒含量为400纳克，引物含量为3.2皮摩尔；另一离心管中加入重组质粒DNA、ddH2O、pGEM载体通用引物，总体积达到8微升，质粒DNA含量为400纳克，经PCR反应后在PERKIN ELMER公司ABI-377DNA自动测序仪上进行分析(如表1)，与240bp序列进行比较，同源性达到95％以上。
家蚕微孢子虫DNA PCR产物序列NB01 GCCAAACCGA GTCCCACCAC CCCCGGTAAT ACTTGTCCCG ATATTTTGTT -51NB02 GCCAAACCGA GTCCCACCAC CCCCGGTAAT ACTTGTCCCG ATATTTTGTT -51NB01 TGTTGATTGA TCCAGTTAAA AAGCCTGTAG TTTATTTATA ATAAGCATTG -101NB02 TGTTGATTGA TCCAGTTAAA AAGCCTGTAG TTTATTTATA ATAAGCATTG -101NB01 TAAGGTATAC TGTATGGTTA GGAGAGAGAT GAAATGTGAT AACCCTAACT -151NB02 TAAGGTATAC TGTATGGTTA GGAGAGAGAT GAAATGTGAT AACCCTAACT -151NB01 GGATGAACAG AAGCGAAAGC TGTATACTTA AATGTATTAT TAGAACAAGG -201NB02 GGATGAACAG AAGCGAAAGC TGTATACTTA AATGTATTAT TAGAACAAGG -201NB01 ACGTAAGCTA GAGGATCGAA GATGATTAGA TACCATTGTA -240NB02 ACGTAAGCTA GAGGATCGAA GATGATTAGA TACCATTGTA -240
其中NB01为N.B.16SrRNA小亚基基因特异性保守序列，NB02为本发明PCR产物的序列。
5、DIG标记探针对N.B.孢子特异性鉴定：
5.1点杂交(Dot Blot)：将以上经过标记的DIG DNA标记探针进行预杂交、杂交、洗膜、抗原抗体反应、显色反应等(方法3.6.2、3.6.3、3.6.4、3.6.5所述)。其N.B.等10种微孢子虫基因组DNA的杂交结果显示，在所取的10种微孢子虫DNA中，DIG标记的217bp的DNA探针只对N.B.孢子有较强的杂交信号，说明用来标记探针的217bp DNA片断为N.B.孢子基因组DNA所特有(图3)。
5.2 DNA印迹杂交(Southern Blot)：为排除点杂交的假阳性，采用DNA Southern Blot对用来标记的217bp DNA片断进行鉴定。选用7种微孢子虫基因组DNA进行HindIII酶切，结果只有N.B.孢子虫DNA与探针产生杂交信号，进一步说明217bp DNA片断是N.B.孢子基因组DNA所特有。其操作步骤如下：
5.2.1基因组DNA酶切：在0.5毫升的离心管中依次加入N.B.孢子、山东微孢子虫、银纹夜蛾微粒子孢子、甜菜夜蛾微粒子孢子、广州地区微孢子虫、玉米螟微粒子孢子、菜粉蝶孢子、四川大孢子、柞蚕孢子、家蚕幼虫等基因组DNA各10微升，HindIII×buffer 5微升，HindIII 2微升，双蒸水33微升。用5000转/分钟离心20秒，37℃水浴2小时。
5.2.2制备杂交膜：
5.2.2.1取以上反应液各20微升，在1％琼脂糖凝胶上电泳，90伏，30分钟。取出后再放入一瓷盘中，加200毫升变性液，不断轻摇30分钟，倒掉变性液，加少量蒸馏水洗凝胶一次，倒掉蒸馏水，再加200毫升中和液，不断轻摇30分钟。
5.2.2.2在一大瓷盘中加入800毫升10×SSC转移液，用一块海绵做平台，转移液液面要略第于平面。依凝胶大小将一干净塑料薄膜剪成一个“窗口”，放到平台上，然后在窗口下放两张经10×SSC湿润过的沃特曼(Whatman)3毫米滤纸，用玻璃棒滚动赶走上面的气泡。
5.2.2.3剪取与凝胶大小一致的尼龙膜，用蒸馏水浸泡5分钟，剪掉一角做标记。再将凝胶从中和液中取出，反过来放在平台的沃特曼3毫米滤纸上，再将浸湿的尼龙膜放在凝胶上。
5.2.2.4将两张用10×SSC浸湿的沃特曼3毫米滤纸，放在尼龙膜上(中间不能有气泡)，再将一叠(10-12厘米厚)尺寸约小于沃特曼3毫米滤纸的吸水纸放在沃特曼3毫米滤纸上，在其上放一块玻璃板，用约500克的重物压实。使DNA转移16-22小时。
5.2.2.5转移完毕，用2×SSC浸泡尼龙膜2分钟，再将尼龙膜出，室温晾干30分钟，120℃烘烤30分钟。
5.2.3尼龙膜的预杂交、杂交：按3.6.3操作步骤进行。
5.2.4洗膜：按3.6.4操作步骤进行。
5.2.5抗原抗体反应、显色反应：按3.6.4操作步骤进行。
6、DIG标记探针对N.B.孢子DNA检测灵敏度鉴定
如5.1-5.2各操作，用不同浓度或含量的N.B.基因组与DIG标记探针进行杂交，其结果显示，当N.B.孢子DNA在500～10纳克之间时，DIG探针可明显地检测N.B.孢子DNA的存在和其含量，但当N.B.孢子DNA含量低于1纳克时，探针只能定性的说明DNA的存在，不能做定量分析。因此，如果是对家蚕微粒子病作定性检测，则本发明的DIG标记探针可以检测N.B.基因组DNA的灵敏度达到1纳克DNA水平。
7、DIG标记探针在蚕业生产上的应用。
7.1 DIG标记探针对病蛾的检测应用
生产中家蚕微粒子病病蛾发病情况分为三个等级，即较轻(N.B.含量105～106个孢子/毫升)、中等(N.B.含量107个孢子/毫升)、严重(N.B.含量108个孢子/毫升)。
取无病正常蚕蛾60头，加100毫升蒸馏水，在研钵中研碎，用经一层纱布过滤后的研磨液稀释发病严重的蚕蛾研磨液中沉淀下来的家蚕微孢子虫，配成1×109个孢子/毫升、1×108个孢子/毫升、1×107个孢子/毫升、1×106个孢子/毫升、1×105个孢子/毫升、5×105个孢子/毫升六个浓度梯度，各取500微升稀释液，按操作步骤1的方法，用SDS和蛋白酶K法抽提DNA。
将抽提得到的DNA(含蚕蛾DNA和N.B.孢子DNA)与DIG标记探针(含217bp DNA特异片断)进行DNA Dot Blot杂交，操作如3.1所述。每个梯度重复2次，以重组质粒DNA为正对照，正常蛾DNA为负对照。结果六个浓度的病蛾研磨液抽提得到的DNA都有杂交信号，灵敏度可达1纳克DNA水平。
7.2 DIG标记探针对家蚕病卵的检测应用
取家蚕健蛾产下的蚕卵约5克，加40毫升蒸馏水，研磨后用一层纱布过滤，用该研磨液稀释微粒子病蚕卵研磨液沉淀下来的家蚕微孢子虫，配制成1×109个孢子/毫升、1×108个孢子/毫升、1×107个孢子/毫升、1×106个孢子/毫升、1×105个孢子/毫升、5×105个孢子/毫升六个浓度梯度，各取500微升稀释液，按实施方法“1、家蚕微孢子虫DNA的提取的方法”，用SDS和蛋白酶K法抽提DNA。
将抽提得到的DNA(含蚕卵DNA和N.B.孢子DNA)与DIG标记探针(含217bp DNA特异片断)进行DNA Dot Blot杂交，操作如3.1所述。每个梯度重复2次，以重组质粒DNA为正对照，正常卵DNA为负对照。结果六个浓度的病蛾研磨液抽提得到的DNA都有杂交信号，灵敏度可达1纳克DNA水平。
Claims (5)
1、一种家蚕微粒子病的核酸分子杂交检测方法，其特征在于，该方法采用蛋白酶K苯酚氯仿抽提法提取家蚕微孢子虫的DNA，测定其特异DNA片断，合成引物，通过聚合酶联反应(Polymerase Chain reaction，简称PCR)扩增得到PCR产物，将PCR产物微孢子虫特异DNA序列克隆到带有SP6噬菌体的启动子pGEN-3Z重组载体质粒中，经过重组质粒序列分析，用家蚕微孢子虫孢子(Nosema bombycis，简称N.B.)PCR产物(217bp，即217个碱基对)经异羟基洋地黄毒苷(即地高辛，Digoxigenin，简称DIG)标记制成分子探针，采用点杂交法(DNA Dot blot)检测家蚕微粒子病病原孢子。
2、根据权利要求1所述的一种家蚕微粒子病的核酸分子杂交检测方法，其特征在于，所述的蛋白酶K苯酚氯仿抽提法提取家蚕微孢子虫的DNA是按下列步骤进行的：
a、将添食微孢子虫进行普通喂养的家蚕研碎提纯；
b、取400微升离心后去上清+等体积0.2摩尔/升K2CO3，30℃，1小时，除去杂质；
c、转移到磷酸缓冲液(PBS buffer)中(Ph7.8)，30℃，2小时，刺激孢子发芽；
d、6000转/分钟，5分钟，去上清，加入40微升孢子裂解液，54℃，水浴3～5小时；
e、等体积饱和酚抽提一次，4000转/分钟，5分钟；
f、取上清液，加等体积酚/氯仿/异戊醇，6000转/分钟，5分钟；
g、取上清液，加2.5倍无水乙醇，1/30体积的10摩尔NH4AC，-20℃，12小时，12000转/分钟，10分钟；
h、弃上清，沉淀用70％的冷乙醇、无水乙醇各洗一次，真空抽干10分钟，溶于30微升TE缓冲液中，-20℃保存。
3、根据权利要求1所述的一种家蚕微粒子病的核酸分子杂交检测方法，其特征在于，所述的聚合酶联反应(PCR)按下列步骤进行：
A、根据16SrRNA小亚基基因的一段240bp(即240碱基对)特异性序列设计以下引物。
5’端引物：5’CACGAACCACGGTAATACTTGT 3，
3’端引物：3’GGCAATGGTATCTAATCATCTTC 5，
B、引物的PCR扩增：
·先在0.5毫升离心管中依次加入以下物质至总体积50毫升：
dd H2O(双蒸水)30微升，10×Taq DNA Polymerase buffer(耐热脱氧核糖核酸聚合物缓冲液)5.0微升，d NTPs(脱氧核糖核酸混合物)5.0微升，5’端引物2.0微升，3’端引物2.0微升，Template DNA(模板脱氧核糖核酸)2.0微升，DMSO(二甲基亚砜)3.5微升，Taq DNAPolymerase(耐热脱氧核糖核酸聚合物)1.0微升，无菌石蜡油30微升，离心10秒；
·95℃变性5分钟；按每个循环95℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共30个循环；72℃延伸10分钟；
·取5微升PCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳检测；
C、PCR产物回收：
·PCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，90伏，30～40分钟；
·在紫外灯下用手术刀将含有扩增产物的凝胶切下，放入1.5毫升的离心管中，加6摩尔/升NaI 400微升，55～60℃水浴5分钟，待凝胶完全融化，放在冰中冰浴降至30℃，加入Wizard DNA Clean-up System树脂1毫升，倒转几次使溶液混合均匀，室温放置2分钟，加到过滤栓中，抽干；
·加入2毫升80％的异丙醇，抽滤洗脱树脂上的杂质，将载有树脂的过滤器放入一Eppendorf管(小塑料管)中，10000转/分钟甩干残余的异丙醇(大约2分钟)；
·再将其转移到另一个新的Eppendorf管中，加入65℃热水30微升至过滤器中，保留1分钟，12000转/分钟离心20秒，收集管中液体于-20℃保存备用。
4、根据权利要求1所述的一种家蚕微粒子病的核酸分子杂交检测方法，其特征在于，所述的将PCR产物微孢子虫特异DNA序列克隆到带有SP6噬菌体的启动子pGEN-3Z重组载体质粒中是按下列步骤进行的：
A、PCR产物连接：
0.5毫升离心管中加入dd H2O 7微升、PCR扩增产物8微升、pGEM-TEasy Vector 2.0微升、10×T4 DNA ligase buffer(甲状腺素脱氧核糖核酸连接酶缓冲液) 2.0微升，T4 DNA ligase(甲状腺素脱氧核糖核酸连接酶)1微升混合后离心20秒，置入4℃冰箱中联接50小时；
B、感受态细胞制备：
大肠杆菌(E.coli)DH5a的LB(牛肉高蛋白冻培养基)平板单菌落
↓接种
20毫升LB液体培养基
｜ 37℃，300转/分钟剧烈振荡4小时
↓ 当OD600＝0.3～0.4，无菌
细菌转移到预冷的1.5毫升0.1摩尔CaCl2重悬
↓
吸去上层液体，再用冰预冷的200微升0.1摩尔CaCl2重悬
↓
4在℃条件下保存一周
C、感受态细胞的转化：
·在预冷的离心管中加入10微升连接反应液，100微升感受态细胞混匀后在冰上放置30分钟，42℃水浴90秒；
·向管中加400微升LB液体培养基，37℃，45分钟；
·在一个小离心管中加入4微升IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，200毫克/毫升)和16微升X-Gal(X-半乳糖，20毫克/毫升)，混匀后均匀涂在含LB平板(含100微升/毫升氨卞青霉素)表面，室温晾干，然后将转化液均匀涂布在LB平板上；
D、蓝白菌落筛选和DNA的小量制备：在转化平板上挑取5个白色菌落，命名为pGEMN.B.1-5，分别接种于4毫升LB培养基(含氨卞青霉素100微升/毫升)的试管中，37℃，300转/分钟振荡培养8～12小时。采用《分子克隆实验指南》中的碱裂解法少量制备质粒DNA；
E、重组质粒的酶切鉴定：在5个0.5毫升的Eppendorf管(小塑料管)中分别加入质粒DNA2微升，EcoR I(一种限制性内切酶)10×buffer5微升，Ec0R I 2微升，双蒸水4微升，离心20秒，混匀，37℃水浴2小时，酶切完毕各取8微升反应液在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测，用未进行酶切的质粒DNA和PCR产物做对照，PCR Marker做分子量标记；
F、重组质粒DNA点杂交鉴定
①DIG DNA探针制备：
用N.B.PCR产物(217bp)做DIG标记制成探针；
取N.B.PCR产物10微升到0.5毫升离心管中，95-100℃变性10分钟，迅速置入冰上保持4-7分钟；再依次加入随机引物2微升、dNTPs(脱氧核苷三磷酸)2微升、ddH2O 15微升、Klenow(克列诺片断)1微升，6000转/分钟离心20秒，37℃水浴反应过夜，反应完毕加入2微升0.2摩尔EDTA(乙二胺四乙酸)终止反应，-20℃保存；
②杂交膜制备：将提取的N.B.孢子基因组DNA用TE缓冲液稀释成100纳克/微升、10纳克/微升、1纳克/微升、100皮克/微升四种浓度梯度，每种浓度各取5微升、3微升、2微升、1微升，依次在一张5厘米×5厘米的尼龙膜上点样，再用120℃烘干30分钟；
③杂交膜预杂交、杂交：将烘干的杂交膜至于预杂交液中，在40-45℃水浴摇床上预杂交1小时，倒去预杂交液，加入杂交液(含DIG标记探针)，40-45℃杂交10-20小时；
④洗膜：在室温条件下，用2×SSC(缓冲液)和0.1％(重量/体积)SDS100毫升洗膜2次，每次5分钟；在68℃条件下，0.1×SSC和0.1％(重量/体积)SDS(十二烷基磺酸钠)100毫升洗膜2次，每次5分钟；
⑤抗原抗体反应及显色：将严格漂洗过的杂交膜，放入40毫升马来酸缓冲液中，加0.3％(体积/体积)吐温-20，放在摇摆平台上洗膜5分钟；将杂交膜转入50毫升马来酸缓冲液+10％(重量/体积)封阻试剂+10×conc封闭溶液中，在摇摆平台上反应30分钟，再用封闭溶液稀释anti-DIG-AP抗体至1∶5000(体积/体积)即配成抗体溶液，将杂交膜至于20毫升抗体溶液中，在摇摆平台上反应30分钟；用60毫升加有0.3％吐温-20的马来酸缓冲溶液放在摇摆平台上洗膜2次，每次15分钟，以除去未结合的抗体，再将杂交膜在不含吐温-20的马来酸缓冲溶液中洗5分钟，倒掉漂洗液，加60毫升显色液(0.1％摩尔Tris-HCL，0.1摩尔NaCL，50毫摩尔Mgcl2，pH9.5)，平衡2分钟；将显色液倒掉，加10毫升显色液(10毫升Detection Solution加45微升NBT和35微升X-phospate)在室温黑暗静置条件下显色反应过夜(15-20小时)，当斑点已充分显示时，加50毫升TE buffer洗膜5分钟，终止反应，分析杂交结果。
5、根据权利要求1所述的一种家蚕微粒子病的核酸分子杂交检测方法，其特征在于，所述的重组质粒序列分析是指：
将PEG纯化的重组质粒DNA稀释成0.2微克/微升，取两个0.5毫升的离心管，在其中一个中加入重组质粒DNA、双蒸水、PCR单引物，总体积达到12微升，质粒含量为400纳克，引物含量为3.2皮摩尔；另一离心管中加入重组质粒DNA、ddH2O、pGEM载体通用引物，总体积达到8微升，质粒DNA含量为400纳克，经PCR反应后在PERKIN ELMER公司ABI-377DNA自动测序仪上进行分析，结果与240bp序列进行比较，同源性达到95％以上。
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