FR2908136A1 - Utilisation de peptides antimicrobiens comme marqueurs de resistance aux infections bacteriennes chez les crevettes peneides - Google Patents

Abstract

La présente invention est relative à l'utilisation de transcrits de gènes codant pour des peptides antimicrobiens pour évaluer la résistance de crevettes pénéides, en particulier de l'espèce Litopenaeus stylirostris, aux infections bactériennes, en particulier aux vibrioses.

Description

1 La présente invention est relative à l'utilisation de transcrits de

gènes codant pour des peptides antimicrobiens comme marqueurs de la résistance de crevettes pénéides aux infections bactériennes.

L'élevage des crevettes pénéides en aquaculture concerne de nombreux pays des zones tropicales, subtropicales, et tempérées. Neuf espèces de crevettes pénéides sont principalement exploitées : Litopenaeus vannamei (Pacifie White shrimp) qui est l'espèce la plus exploitée, L. styiirostris (Pacifie Blue shrimp), trois espèces d'origine atlantique dont L. setiferus (Atlantic White shrimp), L. schmitti (Southern White shrimp), et Farfanpenaeus paulensis (Sao Paulo shrimp), ainsi que Penaeus semisulcatus (Green Tiger prawn), P. monodon (Black Tiger prawn), Fenneropenaeus chinensis (Fleshy prawn) et Marsupenaeus japonicus (Kuruma prawn). Un problème majeur pour cette aquaculture est causé par les maladies infectieuses, majoritairement d'origine virale ou bactériennes. 2.0 En ce qui concerne les pathologies bactériennes, les principaux agents décrits appartiennent au genre des Vibrionaceae (VANDENBERGHE et al., Appl. Environ. Mic.robiol., 65 : 2592-7, 1999). Bien que les Vibrics soient généralement considérés comme des bactéries commensales ou symbiotes, de 25 nombreuses espèces peuvent devenir pathogènes pour les crevettes dans certaines conditions environnementales. Parmi les plus étudiées, on citera Vibrio penaeicida, qui est pathogène pour les larves, ainsi que pour les crevettes juvéniles et adultes, et qui est fréquemment utilisé comme 30 modèle de l'infection par les Vibrios chez les crevettes. Ce Vibrio pathogène est par ailleurs le principal agent étiologique associé à des mortalités cycliques nommées Syndrome 93 , apparues en 1993 et affectant les élevages néo-calédoniens en phase de grossissement (MERMOUD et al., 35 Aquaculture, 323-335, 1998). Les antibiotiques ont été très utilisés, comme agents préventifs et curatifs dans le traitement des animaux et des eaux des élevages. Leur utilisation est aujourd'hui 2908136 remise en question par L'apparition de bactéries résistantes, ainsi que pour les déséquilibres environnementaux qu'elle peut engendrer. De nouvelles méthodes prophylactiques ont été 5 proposées pour le contrôle des maladies, comme par exemple l'utilisation de bactéries probiotiques qui auraient des effets bénéfiques sur la survie et la croissance des animaux en élevage, ou celle d'immunostimulants, tels que des (3-glucanes ou des polysaccharides dérivés de levures ou de 10 bactéries. Les méthodes de vaccination utilisées chez les vertébrés ne sont pas envisageables chez les crustacés du fait de l'absence d'un système immunitaire à mémoire. Chez les crustacés, la défense contre les infections est basée sur une 15 réponse immunitaire innée, dont les acteurs principaux sont les hémocytes (cellules sanguines), producteurs notamment de différents peptides anti-microbiens. Chez les crevettes pénéides, les peptides antimicrobiens les mieux connus à ce jour appartiennent à la famille des pénaeidines (BACHERE et al., Immunol. Rev., 198 : 149--68, 2004). Les pénaeidines identifiées à l'heure actuelle ont été classées en 3 sous-groupes, respectivement dénommés PEN2, PEN3, et PEN4 (GUEGUEN et al., Dev. Comp. Immunol., 30 : 283-8, 2006), le sous-groupe PEN3 étant le plus représenté quantitativement. D'autres polypeptides antimicrobiens ont également été identifiés chez les crevettes. A titre d'exemples, on citera, des polypeptides homologues des antilipopolysaccharide factors (ALFs) de la limule identifiés à partir de banques d'ADNc d'hémocytes de P. monodon (SOMBOONWIWAT et al., Dev. Comp. Immunol., 29 : 841-51, 2005), ainsi que des homologues du lysozyme et d'une protéine antimicrobienne de 11.5 kDa, dénommée crustine, identifiés dans des ESTs de différentes espèces de pénéides (CROSS et al., Dev. Comp. Immunol., 25 : 565-77, 2001; SUPUNGUL et al., Mar. Biotechnol. (NY), 4 : 481-94, 2002). Chez les crevettes pénéides, l'étude de la population hémocytaire, et celle de l'expression des 2908136 s pénaeidines, en réponse à la stimulation par des agents non pathogènes, ou lors de l'infection par des bactéries pathogènes (MUNOZ et al., Pur. J. Eiochem., 269 : 2678-89, 2002; MUNOZ et al., Cc-11 Mol. Lite Sci., 61 : 961-72, 2004; DESTOUMIEUX et al., J. Cet]. Sci., 113(Pt 3) . 461-9, 2000), ont permis de mieux comprendre les mécanismes de la réponse immunitaire. La première phase de la réponse immunitaire des pénéides à une infection bactérienne, correspondant aux 6 ou 10 12 premières heures post-infection, est caractérisée par une diminution du nombre total d'hémocytes circulants, ainsi que par une diminution de l'expression relative des pénaeidines. Cette diminution traduit une migration des hémocytes vers les sites d'infection, ou ils sont lysés, et libèrent les 15 pénaeidines. Cette première phase est suivie d'un retour à un niveau de base 24 à 48 heures après ]'infection. Pendant la seconde phase de la réponse immunitaire, correspondant aux 48-72 heures post-infection, les pénaeidines 20 libérées sont observées à la fois dans les tissus et dans le plasma. Par ailleurs, on observe une augmentation importante des hémocytes exprimant des pénaeidines, à la fois dans la circulation sanguine et dans la plupart des tissus. Cette augmentation des hémocytes reflète un processus d'activation 25 de l'hématopoïèse, produisant une nouvelle population d'hémocytes granuleux caractérisée par une activité transcriptionnelle des pénaeidines plus importante que celle des hémocytes matures. La sélection genetique de lignées d'animaux 30 résistants aux infections constitue une approche potentiellement intéressante pour pérenniser les productions de crevettes. Pour mettre en œuvre cette approche, il est souhaitable de disposer de marqueurs permettant d'évaluer ou de prédire le niveau de résistance des animaux à l'infection. 35 Dans des travaux antérieurs (DE LORGERIL et al., Physiol. Genomics, 21 : 174-83, 2005) l'équipe des Inventeurs a étudié, par hybridation suppressive soustractive (SSH), l'expression de différents gènes avant et pendant une 2908136 9 infection expérimentale par V. penaeicida, chez des crevettes survivant à cette infection. Ils ont ainsi identifié différents gènes parmi lesquels figurent notamment des gènes codant pour des peptides 5 antimicrobiens, tels que les pénaeidines 2 (Litsty PEN2) et 3 (Litsty PEN3), le lysozyme, ainsi qu'un peptide riche en proline et cystéine apparenté à une cryptdine. En revanche, les gènes codant pour d'autres peptides antimicrobiens habituellement exprimés dans les hérnocytes de crevettes, à 10 savoir les crustines et le facteur anti-LPS (ALF) n'ont pas été identifiés dans cette banque SSH. Le niveau de transcription de ces gènes au cours de l'infection a également été étudié chez les crevettes survivant à l'infection, et chez celles n'y survivant pas. Le 15 niveau de transcription des gènes codant pour la pénaeidine-3, le lysozyme, et le peptide riche en proline et cystéine diminue en début d'infection chez tous les animaux, puis augmente ensuite uniquement chez les animaux qui survivent à l'infection. Il en est conclu que les profils d'expression 20 différentielle de ces 3 gènes au cours de l'infection peuvent ccnstituer de bons marqueurs pour évaluer la capacité des crevettes à survivre à l'infection. Les Inventeurs ont entrepris de rechercher d'autres marqueurs utilisables pour évaluer la réponse immunitaire et 25 la survie des crevettes aux infections. Ces études ont été effectuées sur deux lignées de crevettes de l'espèce Litopenaeus stylirostris : l'une, présentant une forte résistance aux vibrioses, est une lignée obtenue en troisième génération à partir de géniteurs ayant 30 survécu à des épisodes infectieux du Syndrome 93 , l'autre lignée dite contrôle ou non-sélectionnée est issue d'animaux élevés dans les conditions d'élevages communément utilisées en Nouvelle Calédonie. Ils ont ainsi mis en évidence d'autres gènes dont 35 le profil de transcription en réponse à l'infection par un V.ibrio est corrélé à la survie à cette infection, et ont en outre découvert que dans le cas de certains gènes, le niveau de transcription de base (c'est-à-dire le niveau d'expression 2908136 5 en l'absence d'infection par un pathogène) était également corrélé à la survie à l'infection. La présente invention concerne l'utilisation de ces différents gènes comme marqueurs de la résistance de crevettes 5 pénéides aux infections, notamment aux vibrioses. Les gènes pour lesquels les Inventeurs ont observé une corrélation du niveau de transcription de base avec la résistance à l'infection sont ceux du lysozyme, de la pénaeidine-3, et de ses isoformes PEN3-1 et PEN3-2. Le niveau 10 basal de transcription du lysozyme ainsi que celui de celui de l'isoforme PEN3-1 apparaissent corrélés positivement à la résistance à l'infection, alors que ceux de la pénaeidine-3, et de l'isoforme PEN3-2 apparaissent corrélés négativement à la résistance à l'infection. 15 La séquence d'ADNc du transcrit du lysozyme de L. styiirostris (SEQ ID NO : 1) . GCTTATTTATCALCCATTACAACGTCTGCACGTCAGCTGTGTTTTGCAATT CTGTTATTTGCATTTCAATGTTGTATAAATTCATACATCATGATATACAGGCAATCATTGTT TATTAACCCCLACTAATACTGGAATCCTGGCTTTAGCATTGCATTCGTATTATTTGCAGTAA 20 TAATGGTAACCCTGGTGCCAAGCCTGTAAATCTAGAACATAGAGCTCGAAG est disponible sur GenBank sous le numéro d'accès CV699332. Des homologues de la séquence SEQ ID NO : 1 chez d'autres espèces de crevettes sont disponibles sur GenBank 25 sous les numéros d'accès suivants : Litopenaeus vannamei (AF425673), Penaeus monodon (AF539466, Fenneropenaeus chinensis (AY661543), Penaeus semisulcatus (AY169675), et Marsupenaeus japonicus (AB080238). La séquence d'ADNc du transcrit PEN3-1 (SEQ ID NO : 30 2) : GGTTCCCTCCTCCGTCCGCCATGCGCCTCGTGGTCTGCCTGGTCTTCTTGG CC TCCTTCGCCCTGG'TCTGCCAAGGCCAAGGCTACAAGGGCGGTTACACAGGCCCGGTAGTC AGGCCCTTCGTGAGACCGATAGGCAGGCCCTTCGTGACACCGATAGGCAGGCCTGTTGTTTC GGGCAACGTGTGCCCTCTATCGTGCCGGGGCATTACCACCTTACAAGCGCGTTCTTGCTGCA 35 GCCGCTTGGGGCGCTGCTGTCGCGAGGCCAAGGGGTACTCCGGCTGATGGAGAAGAC correspond à celle retrouvée au niveau de l'ADN génomique (numéro d'accès GenBank AY351656 pour L. styiirostris). 2908136 6 La séquence d'ADNc du transcrit PEN3-2 (SEQ ID NO : GGTTCCCTCCTCCGTCCGCCATGCGCCTCGTGGTCTGCCTGGTCTTCTTGG CCTCCTTCGCCCTGGTCTGCCAAGGCCAAGGCTACAAGGGCGGTTACACAGGCCCGGTAGTC AGGCCCTTCGTGAGACCGATAGGCAGGCCTGTTGTTTCATACAACGTGTGCCCTCTATCGTG CCGGGGCATTACCACCTTACAAGCGCGTTCTTGCTGCAGCCGCTTGGGGCGCTGCTGTCGCG AGGCCAAGGGGTACTCCGGCTGATGGAGAAGAC dérive de modifications post-transcriptionnelles de PEN3-1, faisant intervenir une édition de l'ARN, ainsi que 1.0 l'élimination d'un motif de quelques acides aminés. La comparaison entre les séquences de ces deux isoformes est illustrée par la Figure 1. Les régions identiques sont indiquées par des astérisques ; les régions dissemblables par des points. Dans 15 les séquences nucléotidiques, les codons d'initiation et d'arrêt de la traduction sont soulignés. Dans les séquences polypeptidiques (SEQ ID NO : 38 et 39), les peptides signal sont soulignés, les régions riches en glycine et proline sont surlignées en gris clair, et les régions riches en cystéines 20 en gris foncé. La présente invention a en conséquence pour objet un procédé pour évaluer la capacité de résistance d'une lignée de crevettes pénéides à l'infection par une bactérie pathogène, caractérisé en ce qu'il comprend la quantification, 25 dans des hémocytes prélevés chez des animaux de la lignée à tester, non-infectés, d'au moins l'un des ARNs suivants . l'ARNm du lysozyme ; l'ARNm de la pénaeidine-3 ; l'ARNm de l'isoforme PEN3-lde la pénaeidine-3 ; 30 l'ARNm de l'isoforme PEN3-2 de la pénaeidine-3. On définit ici par : ARNm de la pénaeidine-3 , l'ensemble des transcrits des isoformes PEN3-1 et PEN3-2 de ce gène. Selon un mode de mise en ouvre préféré d'un procédé 35 conforme à l'invention, on détermine la quantité d'un ou plusieurs des ARNm définis ci-dessus, chez les animaux à tester et on la compare avec la quantité moyenne du même ARNm chez des animaux non-infectés d'une lignée contrôle (c'est-à- 2908136 7 dire non-sélectionnée pour sa résistance à une bactérie pathogène) de crevettes de la même espèce. Dans le cas du lysozyme, ou de l'isoforme PEN3-1, un niveau de transcrits supérieur à celui des crevettes 5 contrôle est prédictif d'une capacité élevée de résistance à l'infection. Dans le cas de la pénaeidine-3, ou de l'isoforme PEN3-2, un niveau de transcrits inférieur à celui des crevettes contrôle est prédictif d'une capacité élevée de résistance à l'infection. 10 Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré d'un procédé conforme à l'invention, il comprend la comparaison entre les quantités d'ARNm des deux membres d'au moins l'une des paires suivantes . - lysozyme/pénaeidine-3 ; 15 - lysozyme/isoforme PEN3-2 ; - isoforme PEN3-1/pénaeidine-3 ; - isoforme PEN3-1/isoforme PEN3-2. Un rapport lysozyme/pénaeidine-3 supérieur à 1,2, de préférence supérieur à 6,.34, de même qu'un rapport 20 lysozyme/isoforme PEN3-2 supérieur à 0,077, de préférence supérieur à 1,02, un rapport isoforme PEN3-1/pénaeidine-3 supérieur à 23,09, de préférence supérieur à 46,87, ou un rapport isoforme PEN3-1/isoforme PEN3-2 supérieur. à 1,48, de préférence supérieur à 7,7, sont prédictifs d'une capacité 25 élevée de résistance à l'infection. Les profils de transcription au cours de l'infection qui apparaissent corrélés à l'issue de l'infection sont, outre ceux de la pénaeidine-3, du lysozyme, et du peptide riche en proline et cystéine, identifiés précédemment 30 (DE LORGERIL et al., 2005, précité), ceux de la pénaeidine 2, de la crustine, et de l'isoforme PEN3-1. Dans tous les cas, lesdits profils de transcription sont observés 6 à 72 heures après l'infection, de préférence 24 heures après l'infection. 35 Après l'infection, on observe, dans le cas de la crustine et du peptide riche en praline et cystéine, un niveau de transcription plus élevé chez les animaux qui survivent à l'infection que chez ceux qui n'y survivent pas. Dans le cas 2908136 8 de la crustine, ce niveau est sensiblement égal au niveau basal de transcription (mesuré préalablement à l'infection) chez les animaux qui survivent, alors qu'il est significativement plus faible chez ceux qui ne survivent pas. 5 Dans le cas du peptide riche en proline et cystéine, ce niveau est un peu plus faible que le niveau basal de transcription chez les animaux qui survivent, alors qu'il est significativement plus faible chez ceux qui ne survivent pas. Pour les autres gènes, la corrélation entre le 10 profil d'expression du gène et la résistance de l'animal à l'infection dépend de la lignée dont est issu l'individu testé (lignée contrôle ou lignée sélectionnée pour sa résistance à l'infection). Dans le cas du lysozyme, de la pénaeidine 3, et de 15 l'isoforme PEN3-1 : pour la lignée contrôle, le niveau de transcription après l'infection est plus élevé chez les crevettes survivantes que chez les crevettes non-survivantes ; pour le lysozyme, il est égal ou supérieur au niveau basal de 20 transcription chez les animaux qui survivent, alors qu'il est significativement plus faible chez ceux qui ne survivent pas ; pour la pénaeidine 3, il un peu plus faible que le niveau basal de transcription chez les animaux qui survivent, alors qu'il est significativement plus faible chez ceux qui ne 25 survivent pas ; pour l'isoforme PEN3-1, il est égal ou supérieur au niveau basal de transcrits chez les animaux qui survivent, alors qu'il est significativement plus faible chez ceux qui ne survivent pas ; pour la lignée sélectionnée, le niveau de 30 transcription après l'infection ne diffère pas significativement entre les crevettes survivantes et les crevettes non-survivantes. Dans le cas de la pénaeidine-2 : pour la lignée contrôle, le niveau de 35 transcription après l'infection ne diffère pas significativement entre les crevettes survivantes et les crevettes non-survivantes ; 2908136 9 - pour la lignée sélectionnée, le niveau de transcription après l'infection est plus élevé chez les crevettes survivantes que chez les crevettes non-survivantes ; il n'est pas significativement différent du niveau de base de 5 transcription chez les animaux qui survivent, alors qu'il est significativement plus faible (au plus égal à 60 du niveau de base) chez ceux qui ne survivent pas. La présente invention a pour objet un procédé pour évaluer l'issue d'une infection par une bactérie pathogène 10 chez une crevette pénéide, caractérisé en ce qu'il comprend la quantification de l'ARNm de la crustine, dans des hémocytes prélevés chez l'animal à tester 6 à 72 heures, de préférence 24 heures, après l'infection. Selon un mode de mise en oeuvre préféré d'un procédé 15 conforme à l'invention, il comprend en outre la comparaison de la quantité d'ARNm de la crustine déterminée comme indiqué ci-dessus, avec la quantité du même ARNm dans des hémocytes prélevés chez l'animal à tester préalablement à l'infection. La séquence d'ADNc du transcrit de la crustine (SEQ 20 ID NO : 4) est la suivante : TCCCGGGGCGGTTTAGTGTAGGTGGTGGCGGTTTAGGTGTAGGTGGTGGCT TCCCGGGGCGGTGTAGGTGTAGGTGGCGGTCTTGGCGTGGGAGGAGGCCTTGGAGTTAGCGG TGGCTCAAGCAACTGCAGGTATTGGTGCAAGACTCCGGAGGGTCAAGCCTACTGCTGCGAGT CGGCCCACGAACCAGAGACACCTGTTGGCACCAAGCTACTCGACTGCCCCCAAGTCCGTCCC 25 ACATGCCCACGCTTCCATGGGCCCCCCACGACCTGTTCCAACGACTACAAGTGTGCTGGCCT CGACAAGTGTTGCTTCGACAGGTGTCTGGGAGAACACGTGTGCAAGCCTCCTTCGGCCTTCG GACAGCAAGTTTTCGGATGAAGAATAAACACAAAAGGATTTTAAAGGATGAAGAGAAAGACG AAAAGACCATCTGAAGGACGACCGATGTTTTGGAATTTGACTGAAAAAAGAAAGAAAAACTA ACAGGGAATTCTTTCTTTCTGTAGGATTTATCTGATTAACATGATTTTTGTTATATGTTAAT 30 TAGACTGTATTCTGTCAAAAGAAACTTATAGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTTG TA CACCTCGGCCGCGACCACGCT Des homologues de la séquence SEQ ID NO : 4 chez d'autres espèces de crevettes sont disponibles sur GenBank sous les numéros d'accès suivants : Litopenaeus vannamei 35 (AF430076), Penaeus monodon (DW042799), Marsupenaeus japonicus (AB121740), et Litopenaeus setiferus (AF430079). Un rapport ARNm de la crustine après infection/ARNm de la crustine avant infection compris entre 2908136 10 0,9 et 1,1 est prédictif de la survie à l'infection ; au ccntraire, un rapport ARNm de la crustine après infection/ARNm de la crustine avant infection inférieur ou égal à 0,6 est prédictif de la non-survie à l'infection. 5 Le cas échéant, ledit procédé comprend en outre la quantification de l'ARNm du peptide riche en proline et en cystéine, dans des hémocytes prélevés chez l'animal à tester 6 à 72 heures, de préférence 24 heures, après l'infection, et, avantageusement, la comparaison de la quantité d'ARNm ainsi 1.0 déterminée avec la quantité du même ARNm dans des hémocytes prélevés chez l'animal à tester préalablement à l'infection. La séquence d'ADNc du transcrit du peptide riche en proline et cystéine (SEQ ID NO : 5) . TCTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTCCAGAC 15 GCTGTTCTGCTCCTGTGTGGTGGCCGAACTCTGGACGCATCCCTGCTGCCATCATGAAGACC TACAGTCGGGTCTCCGTCTTTGTCTTATTGGTTGCGATCTTGCACACGTCACAAGGATCTTC CTTTTCACCTCCCAGAGGACCTCCGGGCTGGGGACCTCCATGCGTACAACAACCGTGCCCTA AGTGCCCATATGATGATTACAAGTGTCCGACGTGTGATAAATTCCCGGAGTGTGAGGAGTGC CCCCATATTAGTATAGGATGTGAATGCGGCTATTTTAGCTGCGAATGTCCGAAGCCTGTGTG 20 TGAACCGTGCGAGAGTCCCATCGCCGAGTTGATAAAAAAGGGAGGTTATAAAGGATAAAGAA GCGAGAACGAAGCCACAGCATTCTTTCACAAACCTCACTGAACTGAAAGAAGAGAGAGGGAG AGAGGGGGGAGGGAGAGGGAGAGAGAGAGAGAATAGAACGTGAGATGGGAGAAAGGAGAGAT GTTT Des homologues de la séquence SEQ ID NO : 5 chez 25 d'autres espèces de crevettes sont disponibles sur GenBank sous les numéros d'accès suivants : Litopenaeus vannamei (BE188497), et Penaeus monodon (DT366712). Un rapport ARNm du peptide riche en proline et cystéine après infection/ARNm du peptide riche en proline et 30 cystéine avant infection supérieur ou égal à 0,7 est prédictif de la survie à l'infection ; au contraire, un rapport ARNm du peptide riche en proline et cystéine après infection/ARNm du peptide riche en proline et cystéine avant infection inférieur ou égal à 0,3 est prédictif de la non- 35 survie à l'infection. Dans le cas où les animaux chez lesquels on souhaite évaluer l'issue de l'infection n'appartiennent pas à une lignée sélectionnée pour sa résistance à une bactérie 2908136 11 pathogène, on peut en outre quantifier un ou plusieurs des ARNm suivants . - l'ARNm du lysozyme ; -l'ARNm de la pénaeidine-3 ; 5 - l'ARNm de l'isoforme PEN3-1 de la pénaeidine-3. dans des hémocytes prélevés chez l'animal à tester 6 à 72 heures, de préférence 24 heures, après l'infection, et, avantageusement, comparer, pour chaque ARNm choisi, la quantité ainsi déterminée avec celle du même ARNm dans des 10 hémocytes prélevés chez l'animal à tester préalablement à l'infection. Un rapport ARNm du lysozyme après infection/ARNm du lysozyme avant infection supérieur ou égal à 1 est prédictif de la survie à l'infection ; au contraire, un 15 rapport ARNm du lysozyme après infection/ARNm du lysozyme avant infection inférieur à 0,2 est prédictif de la non-survie à l'infection. Un rapport ARNm de la pénaeidine 3 après infection/ARNm de la pénaeidine 3 avant infection supérieur 20 ou égal à 0,8 est prédictif de la survie à l'infection ; au contraire, un rapport ARNm de la pénaeidine 3 après infection/ARNm de la pénaeidine 3 avant infection inférieur ou égal à 0,5 est prédictif de la non-survie à l'infection. Un rapport ARNm de l'isoforme PEN3-1 après 25 infection/ARNm de l'isoforme PEN3-1 avant infection supérieur ou egal a 1 est prédictif de la survie à l'infection ; au contraire, un rapport ARNm de l'isoforme PEN3-1 après infection/ARNm de l'isoforme PEN3-1 avant infection inférieur ou égal à 0,2 est prédictif de la non- 30 survie à l'infection. Alternativement, dans le cas où les animaux chez lesquels on souhaite évaluer l'issue de l'infection appartiennent à une lignée sélectionnée pour sa résistance à une bactérie pathogène, on peut en outre quantifier l'ARNm de 35 la pénaeidine-2, dans des hémocytes prélevés chez l'animal à tester 6 à 72 heures, de préférence 24 heures, après l'infection, et, avantageusement, comparer la quantité ainsi 2908136 12 déterminée avec celle du même ARNm dans des hémocytes prélevés chez l'animal. à tester préalablement à l'infection. Un rapport ARNm de la pénaeidine 2 après infection/ARNm de la pénaeidine 2 avant infection supérieur 5 ou égal à 0,8 est prédictif de la survie à l'infection ; au contraire, un rapport ARNm de la pénaeidine 2 après infection/ARNm de la pénaeidine 2 avant infection inférieur ou égal à 0,6 est prédictif de la non-survie à l'infection. Les procédés conformes à l'invention peuvent en 10 particulier être mis en œuvre pour évaluer la résistance de crevette pénéides, et notamment de L. stylirostris à des vibrioses, et notamment à des infections par Vibrio penaeicida. Une grande variété de méthodes de quantification de 15 l'ARN, connues en elles-mêmes de l'homme du métier, sont utilisables pour la mise en œuvre de la présente invention (pour revue, cf. par exemple QUORE et al., J. Virol. Methods, 105(2) 189-196, 2002 ; Brevet FR 2 815 043 au nom de SKULD TECH ; HUGGETT et al., Genes Immun., 6(4) : 279-284, 2005 ; 20 EMR1CH et al., Methods Mol. Biol., 191 : 99-108, 2002; POWELL, Methods Mol. Biol., 99: 297-319, 2000 ; NESS, Methods Mol. Biol., 316 : 13-33, 2.006 ; SCHENA et al., Trends Biotechnol., 16(7): 301-306, 1998; RAMSAY, Nat. Biotechnol., 16(1) : 40-44, 1998). 25 A titre d'illustration, on citera les diverses méthodes basées sur la RT-PCR (transcription inverse suivie d'une amplification en chaîne par polymérase) quantitative. Le principe général de ces méthodes consiste à amplifier sélectivement par PCR le ou les gène(s) dont on veut mesurer 30 l'expression (gènes cible), à partir d'une préparation d'ADNc obtenue par transcription inverse des ARNm extraits de l'échantillon biologique à tester, et à quantifier le(s) produit(s) d'amplification obtenu(s). Les méthodes de RT-PCR quantitative les plus utilisées à l'heure actuelle mettent en 35 oeuvre les techniques de PCR en temps réel (pour revue, cf. par exemple VALASEK & REPA, Adv Physiol Educ, 29 : 151-9, 2005), où la quantification des produits d'amplification s'effectue, par mesure de leur fluorescence au fur et à mesure de leur 2908136 13 formation pendant la phase exponentielle de la réaction d'amplification. La présente invention a également pour objet des kits de réactifs pour la mise en œuvre d'un procédé conforme à 5 l'invention, dans lequel la quantification des transcrits s'effectue par RT-PCR quantitative. Des kits de réactifs conformes à l'invention comprennent outre les tampons et réactifs classiques nécessaires à la réaction d'amplification et à la détection 10 des produits d'amplification, au moins une paire d'amorces spécifiques de chacun des ARNm à doser. Selon un premier mode de réalisation, un kit de réactifs conforme à l'invention peut comprendre : une paire d'amorces spécifiques de l'ARNm du 15 lysozyme, une paire d'amorces spécifiques de l'ARNm de la pénaeidine-3 et/ou une paire d'amorces spécifiques de l'ARNm de l'isoforme PEN3-2 de la pénaeidine-3 ; ou - une paire d'amorces spécifiques de l'ARNm de l'isoforme PEN3-1 de la pénaeidine-3, une paire d'amorces 20 spécifiques de l'ARNm de la pénaeidine-3 et/ou une paire d'amorces spécifiques de l'ARNm de l'isoforme PEN3-2 de la pénaeidine-3 ; ou, avantageusement une paire d'amorces spécifiques de l'ARNm du lysozyme, une paire d'amorces spécifiques de l'ARNm de la 25 pénaeidine-3, une paire d'amorces spécifiques de l'ARNm de l'isoforme PEN3-1 de la pénaeidine-3, et une paire d'amorces spécifiques de l'ARNm de l'isoforme PEN3-2 de la pénaeidine-3. Selon un autre mode de réalisation, un kit de réactifs conforme à l'invention comprend une paire d'amorces 30 spécifiques de l'ARNm de la crustine, et avantageusement, une paire d'amorces spécifiques de l'ARNm du peptide riche en proline et cystéine. De préférence, ledit kit comprend en outre une paire d'amorces spécifiques de l'ARNm du lysozyme, et/ou une paire d'amorces spécifiques de l'ARNm de la 35 pénaeidine-3, et/ou une paire d'amorces spécifiques de l'ARNm de l'isoforme PEN3-1. Pour la mise en oeuvre de la présente invention, on peut également utiliser des puces à ADN - également dénommées 2908136 14 biopuces, microarrays, chips, etc... - (pour revue, cf. par exemple LOCKHART & WINZELER, Nature, 405 : 827-36, 2000). Le principe général des puces à ADN consiste à fixer à différents endroits de la surface d'un support solide 5 (par exemple une surface de verre, de plastique, ou de nylon) des sondes constituées par des polynucléotides complémentaires des différents gènes dont on veut mesurer l'expression (gènes cible). Les ARNm extraits de l'échantillon biologique à tester (et généralement convertis en ADNc par transcription inverse) 10 sont marqués et mis en contact avec les sondes fixées sur le support. La mesure des signaux d'hybridation permet d'évaluer la quantité des ARNm des gènes cible dans l'échantillon à tester. La présente invention a également pour objet des 15 puces à ADN permettant la mise en oeuvre d'un procédé conforme à l'invention. Selon un premier mode de réalisation, une puce à ADN conforme à l'invention peut par exemple comprendre : - une sonde spécifique de l'ARNm du lysozyme, une 20 scnde spécifique de l'ARNm de la pénaeidine-3 et/ou une sonde spécifique de l'ARNm de l'isoforme PEN3-2 de la pénaeidine-3 ; ou - une sonde spécifique de l'ARNm de l'isoforme PEN3-1 de la pénaeidine-3, une sonde spécifique de l'ARNm de 25 la pénaeidine-3 et/ou une sonde spécifique de l'ARNm de l'isoforme PEN3-2 de la pénaeidine-3 ; ou, avantageusement une sonde spécifique de l'ARNm dulysozyme, une sonde spécifique de l'ARNm de la pénaeidine-3, une sonde spécifique de l'ARNm de l'isoforme PEN3-1 de la pénaeidine-3, 30 et une sonde spécifique de l'ARNm de l'isoforme PEN3-2 de la pénaeidine-3. Selon un autre mode de réalisation, une puce à ADN conforme à l'invention comprend une sonde spécifique de l'ARNm de la crustine, et avantageusement, une sonde spécifique de 35 l'ARNm du peptide riche en prolne et cystéine. De préférence, ladite puce comprend en outre une sonde spécifique de l'ARNm du lysozyme, et/ou une sonde spécifique de l'ARNm de la 2908136 15 pénaeidine-3, et/ou une sonde spécifique de l'ARNm de l'isoforme PEN3-1. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui de réfère à 5 des exemples non-limitatifs, illustrant la corrélation entre le niveau de transcription de peptides anti-microbiens dans les hémocytes de crevettes pénéides, et la résistance desdites crevettes à l'infection par Vibrio penaeicida. EXEMPLES : 10 Materiels et méthodes Animaux :Des L. stylirostris juvéniles (20-30 g) issus de deux lignées de crevettes ont été obtenues auprès du laboratoire IFREMER de Nouvelle Calédonie (Ifremer, BP2059, 98896 Nouméa Cedex, Nouvelle Calédonie, France). 15 L'une de ces lignées, dénommée lignée sélectionnée résulte du croisement d'animaux ayant survécu au Syndrome 93 , élevés en bassins pendant les 6 premiers mois de leur vie, dans des conditions favorables à l'infection par Vibrio penaecicida (densité initiale : 20-25 PL/m2) ; les 20 animaux survivants sont alors élevés à des densités plus faibles (1-2 crevettes/m) pour se reproduire à l'âge de 12 mois. L'autre lignée, dénommée lignée de contrôle résulte du croisement d'animaux élevés en bassins en 25 conditions traditionnelles (densité initiale : 2 PL/m`), où l'occurrence du syndrôme 93 est très faible. Dans les deux lignées, la consanguinité a été contrôlée en marquant individuellement les animaux afin d'éviter l'accouplement de parents proches. 30 Les animaux utilisés dans les expériences décrites ci-après ont été prélevés dans la 3eme génération de la lignée sélectionnée (G3-sélection), et dans la 3eme génération de la lignée contrôle (G3-contrôle). Infections expérimentales : 35 Les infections ont été réalisées par immersion des crevettes pendant 2 heures dans des réservoirs d'eau de mer contenant Ix101 CFU/mi de la souche AM101 de V. penaeicida, ce qui correspond à 20% de la dose létale (LD20) (SAULNIER et 2908136 16 al., Dis. Aquatic Org., 40 : 109-115, 2000). Les animaux ont ensuite été rincés avec de l'eau de mer filtrée, et transférés dans des réservoirs de 100 L. Des animaux non-infectés ont été conservés dans un réservoir distinct de 100 L. 5 Pour le premier type d'infection expérimentale, utilisée pour les analyses globales, des animaux de chaque lignée de crevettes (contrôle et sélectionnée) ont été répartis en trois groupes (15 crevettes par groupe) placés dans des réservoirs distincts. Pour chacune des lignées de 10 crevettes, des échantillons de l'hémolymphe du premier groupe ont été collectés, 24 heures avant l'infection expérimentale (-24) pour constituer le contrôle non-infecté ; des échantillons de l'hémolymphe des deux autres groupes ont été collectés 12 heures après l'infection (+12) et 24 heures après 15 l'infection (+24). Le protocole du second type d'infection expérimentale, utilisée pour les analyses individuelles, est illustré par la Figure 2. Les crevettes sont marquées individuellement par 20 l'injection de silicone colorée sous le troisième segment abdominal de la cuticule. Un premier prélèvement d'hémolymphe est effectué 24 heures avant l'infection, et un second prélèvement 24 heures après l'infection. Les échantillons d'hémolymphe des animaux qui sont morts dans les 96 heures suivant l'infection (période de mortalité aiguë), et ceux des animaux ayant survécu à l'issue de cette période ont été individuellement distingués. Isolement d'ARN et analyse par PCR en temps réel : Les ARNs totaux ont été isolés des hémocytes des crevettes en utilisant le réactif Trizol (Gibco BRL) (1 ml/107 cellules), selon le protocole indiqué par le fabricant. Les ARNs totaux ont été traités par la Dnase (TURBO DNase, Ambion) pour éliminer l'ADN génomique contaminant, puis la Dnase a été éliminée par extraction au phénol-chloroforme. L'ADNc a été synthétisé à partir de 1 pg d'ARN total, en utilisant le kit de transcription inverse SuperScript II, 25 30 35 2908136 17 selon les instructions du fabricant (Invitrogen), dans un volume réactionnel de 20 pl. 0,5 pl de chaque réaction de transcription inverse ont servi de matrice pour la PCR en temps réel dans 10 pl de 5 volume réactionnel contenant IX SYBR GREEN MASTER MIX (Qiagen) et 0,5 pM de chaque amorce utilisée. Chaque réaction de PCR en temps réel a été réalisée avec une étape de dénaturation initiale de 900s à 95 C, suivie d'une amplification de l'ADNc cible (35 cycles de dénaturation 10 à 95 C pendant 15 secondes, d'une hybridation entre 54 C et 64 C (selon l'amorce utilisée) pendant 15 secondes, et d'une élongation à 72 C pendant 15 secondes), avec le LightCycler (Roche Molecular Biomedicals). Chaque réaction a été effectuée en trois exemplaires. 15 Pour déterminer l'efficacité de chaque paire d'amorces utilisée, des courbes standard ont été obtenues en utilisant des séries de 5 dilutions des plasmides contenant les séquences-cibles correspondantes (103 à 10' copies/pl). Les résultats de PCR en temps réel sont représentés 20 sous forme de variations de l'expression relative normalisée par rapport à un gène de référence, le facteur d'élongation la (EF--la, SEQ ID NO : 41), comme décrit par PFAFFL (Nucleic Acids Res., 29 : 45, 2001). Pour les gènes testés, l'efficacité de PCR en temps réel varie entre 1,87 et 1,98. 25 Cette efficacité n'étant pas exactement égale à 2,00 (représentant 100% d'efficacité d'amplification à chaque cycle), l'abondance relative a été calculée, comme indiqué par PFAFFL (précité, 2001), en utilisant l'équation corrigée pour les différences d'efficacité. 30 EXAMPLE 1 : ISOLEMENT D'UNE NOUVELLE SEQUENCE DE PENAEIDINE A PARTIR DU SOUS-GROUPE PEN3 DANS LES HEMATOCYTES DE L. STYLIROSTRIS Une première série de PCR en temps réel a été réalisée à partir des ADNc de pools d'hématocytes de 35 15 crevettes de chacune des deux lignées, pour comparer l'abondance du transcrit du peptide Litsty PEN3 (GenBank AY351656) entre ces deux lignées, en utilisant les amorces suivantes . 2908136 18 [5'-GGTTCCCTCCTCCGTCCGCC-3' (SEQ ID NO : 6) et 5'-GTCTTCTCCATCAGCCGGAG-3' (SEQ ID NO : 7), efficacité 1.94, température d'hybridation 60 C]. Les analyses des courbes de fusion des produits de 5 PCR sont présentées dans la Figure 3. Légende de la Figure 3 : lignée de crevettes sélectionnée lignée de crevettes contrôle La température de fusion correspondant à chaque pic est 10 indiquée au-dessus du pic. Les résultats montrent deux pics de fusion qui varient de près de 0,5 C. La température de fusion des produits de PCR apparaît plus élevée pour la lignée de crevettes sélectionnée que pour celle de la lignée contrôle (86.43 0.06 et 15 85.98_+0.02, respectivement, p<0.01, logiciel LightCyler 3.5). Les produits de PCR en temps réel présentant différentes températures de fusion ont été clonés et séquencés, ce qui a conduit à la caractérisation de deux séquences d'ADNc de 294 et 270 nucléotides (Figure 1A). La 20 séquence correspondant à la température de fusion la plus élevée, identifiée dans la lignée de crevettes sélectionnée, a été identifiée comme la séquence Litsty PEN3 précédemment caractérisée, et qui sera dénommée ci-après Litsty PEN3-l. La seconde séquence d'ADNc identifiée dans la lignée de crevettes 25 contrôle, diffère de Litsty PEN3-1 par une délétion de 24 nucléotides, et un changement de trois nucléotides dans une autre partie de la séquence (Figure 1A). Cette séquence sera dénommée ci-après Litsty PEN3-2. Au niveau de la séquence en acides aminés, Litsty 30 PEN3-2 diffère de Litsty PEN3-1 par l'absence dans le domaine N-terminal des 8 résidus PIGRPFVT, et par la substitution d'un résidu glycine par un résidu tyrosine (Figure 1B). Du fait de la proche similitude entre les séquences Litsty PEN3-1 et Litsty PEN3-2, il a été recherché si celles- 35 ci étaient exprimées par deux gènes distincts ou par un seul gène. Pour cela, les deux séquences de l'ADN génomique et de l'ADNc de l'hémocyte ont été amplifiées par PCR. 2908136 19 Des paires d'amorces permettant de distinguer ces deux séquences ont été construites : P3-1R et P3-1F: [5'--ACCGATAGGCAGGCCCTTCGTGAC-3' (SEQ ID NO : 8) et 5'-CGATAGAGGGCACACGTTGCCC-3' (SEQ ID NO : 9), efficacité 1.85, 5 température d'hybridation 64 C] pour Litsty PEN3-1 et P3-2R et P3-2F: [5'-GAGACCGATAGGCAGGCCTG-3' SEQ ID NO : 10 et 5'-CGATAGAGGGCACACGTTGTAT3' (SEQ ID NO : 11, efficacité 1.91, hybridation 64] pour Litsty PEN3-2. Les résultats d'électrophorèse en gel d'agarose des 10 produits de PCR obtenus avec ces amorces pour Litsty PEN3-1 et Litsty PEN3-2 sont présentés sur la Figure 4A et la Figure 4B, respectivement. Légende de la Figure 4 : gDNA = ADN génomique 15 cDNA = ADNc C- = contrôle négatif Les paires d'amorces utilisées sont indiquées au-dessus des représentations schématiques des deux transcrits par des flèches. 20 Les différences de nucléotides entre les deux transcrits sont représentés pour la délétion de 24 nucléotides par un rectangle hachuré sur Litsty PEN3-1 et par une ligne pointillée sur Litsty PEN3-2, et pour le changement de 3 nucléotides par un carré gris sur Litsty PEN3-1 et par un 2.5 carré blanc sur Litsty PEN3-2. Quelles que soient les paires d'amorces utilisées, Litsty PEN3-1 a pu être amplifié à partir de l'ADN génomique et de l'ADNc. Les fragments amplifiés sont de même taille dans les deux cas, indiquant l'absence d'intron (Figure 4A). Dans 30 le cas de Litsty PEN3-2 l'amplification est obtenue seulement à partir d'ADNc, mais pas à partir de l'ADN génomique (Figure 4B). EXEMPLE 2: PROFILS D'EXPRESSION DE GENES DE PEPTIDES ANTIMICROBIENS AU COURS D'UNE INFECTION PAR VIBRIO PENAEICIDA 35 Afin d'analyser l'expression des gènes de peptides antimicrobiens (AMPs) dans les hémocytes circulants de crevette, 6 séquences d'ADNc d'AMPs (ou d'AMPs putatifs) décrits dans des études récentes (MUNOZ et al., Cell. Mol. 2908136 20 Life Sci., 61 : 961-972, 2004 ; DE LORGERIL et al., 2005, précité) ont été choisies chez L. stylirostris. Les numéros d'accession GenBank des pénaeidines Litsty PEN2-1 et PEN3, sont respectivement AY351655 et AY351656. Les numéros 5 d'accession GenBank du lysozyme et du peptide riche en cystéine sont respectivement CV699332 et CV699287. La séquence d'ADNc de la crustine est indiquée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 4. La séquence d'ADNc de ALF est indiquée dans la liste de séquences en 10 annexe sous le numéro SEQ ID NO : 40. Les profils d'expression des gènes codant pour les AMPs, Litsty PEN2-1 et -3, ALF, crustine, lysozyme et peptide riche en cystéine, ont été analysés par PCR en temps réel pour examiner le schéma général d'expression pendant l'évolution de 15 l'infection par V. penaeicida, pour la lignée sélectionnée et pour la lignée contrôle. Les amorces PCR (sens et anti-sens) listées dans le Tableau 1 ci-dessous ont été utilisées. La température paire d'amorces est la PCR ; calculée par Nom du Amorce sens(5'? 3') Amorce anti-sens(5'? 3') Hybridation Efficacité Gène ( C) PCR ALF GCCACTCCTGCACCTACAA TTCACAACACCGGATTTGCTG 55 1.87 (SEQ ID NO : 12) SEQ ID NO : 13) Litsty CCATGCGCCTCGTGGTCTG GAACGCGCTTGTAAGGTGGTAA 64 1.98 PEN3 (SEQ ID NO : 14) (SEQ ID NO : 15) Litsty CCATGCGCCTCGTGGTCTG AGCAATTGCGGCATCTGGGAA 64 1.91 PEN2-1 SEQ ID NO : 16 (SEQ ID NO : 17) ( ) lysozyme CGTCTGCACGTCAGCTGTG GGCTTGGCACCAGGGTTACC 59 _ (SEQ ID NO : 18) (SEQ ID NO : 19) 1.93 crustine CCAAGTCCGTCCCACATGC CTGTCGAAGCAGCACTTGTC 55 1.91 (SEQ ID NO : 20) (SEO ID NO : 21) Peptide GCCCTAAGTGCCCATATGA GCCGCATTCACATCCTATA 54 1.89 riche en (SEQ ID NO : 22) (SEQ ID NO : 23) cystéine EF-1 u GGTGCTGGACAAGCTGAAGGC 1CGTTCCGGTGATCATGTTCTTGATG 60 1.96 _(SEQ ID NO : 24) (SEQ ID NO : 25) Les résultats sont présentés dans la Figure 5. Les expressions relatives ont été normalisées par rapport au 25 facteur d'élongation la, et chaque valeur a été calculée par d'hybridation spécifique de chaque 20 indiquée, de même que l'efficacité de l'équation E=10[-l/pente] (PFAFFL, 2001,

précité). Tableau 1 2908136 21 référence aux crevettes non infectées (expression relative = 1) selon la méthode 2-AACt corrigée pour les efficacités (PFAFFL, 2001, précité). Légende de la Figure 5 5 Lignée de crevettes sélectionnée -- Lignée de crevettes contrôle -24 = crevettes non infectées +12 = 12 heures après l'infection +24 = 24 heures après l'infection 10 Il apparaît que la quantité des ARNs d'ALF, du lysozyme, de la crustine et du peptide riche en cystéine varie pendant l'infection, et par rapport aux crevettes non infectées, dans les deux lignées de crevettes. Seul ALF présente un schéma d'expression au cours 15 de l'infection qui diffère entre les deux lignées de crevettes. En effet, la quantité de transcrit d'ALF augmente dès 12 heures après l'infection pour la lignée contrôle (augmentation relative de respectivement 3x et 2,1x, 12 et 24 heures après l'infection), alors que l'augmentation (d'un 20 facteur de 2,7x) est différée à 24 heures après l'infection pour la lignée de crevettes sélectionnée. Pour les autres AMPs la quantité de transcrits diminue dans les 12 premières heures suivant l'infection. Ceci est particulièrement évident pour le lysozyme, la crustine et 25 le peptide riche en cystéine, dans la lignée contrôle (diminution relative de 3,2x, 3,3x et 4,5x par rapport aux crevettes non infectées, respectivement) aussi bien que dans la lignée sélectionnée (diminution relative de 25x, 3,5x et 9,1x par rapport aux crevettes non infectées, respectivement).

30 La diminution des transcrits de la crustine et du peptide riche en cystéine est suivie, 24 heures après l'infection, d'une tendance à un retour aux niveaux observés dans les crevettes non infectées. Cette tendance est observée pour les deux lignées de crevettes, mais l'augmentation des transcrits 35 de la crustine et du peptide riche en cystéine entre 12 et 24 heures apparaît significativement plus importante dans la lignée sélectionnée (augmentation relative de 5,8x et 9,8x, 2908136 22 respectivement) que dans la lignée contrôle (augmentation relative de 2,5x et 2,6x, respectivement). La même diminution est observée pour le lysozyme 12 heures après l'infection pour les deux lignées ; cependant 5 les transcrits du lysozyme demeurent moins abondants 24 heures après l'infection pour la lignée de crevettes sélectionnée que pour la lignée de crevettes contrôle. En ce qui concerne les pénaeidines Litsty PEN2-1 et Litsty PEN3, leur expression ne varie que faiblement chez la 10 lignée contrôle, en particulier pour Litsty PEN3. Dans la lignée sélectionnée, la quantité des transcrits de Litsty PEN2-1 et Litsty PEN3 augmente (de respectivement 3,93x et 2,73x) entre 12 heures et 24 heures après l'infection. EXEMPLE 3 : MISE EN EVIDENCE DE LA RELATION ENTRE LE NIVEAU 15 BASAL D'EXPRESSION DE PEPTIDES ANTI-MICROBIENS ET LA RESISTANCE A L'INFECTION D'UNE L:IGNEE DE CREVETTES. Expression du lysozyme, et expression globale de la pénaeidine-3 Le niveau basal de transcription du lysozyme, de 20 Litsty PEN3, et des deux isoformes Litsty PEN3-1 et Litsty PEN3-2 a été comparé dans les deux lignées de crevettes (sélectionnée et contrôle). La quantité de transcrits 24 heures avant l'infection a été mesurée par PCR en temps réel, comme indiqué ci-dessus dans Matériel et Méthodes, à 25 partir de pools d'échantillons d'ARN d'hémocytes (pools de 15 crevettes) prélevés 24 heures avant l'infection. Pour quantifier la transcription du lysozyme et la transcription globale de Litsty PEN3 les amorces utilisées sont celles indiquées dans le tableau 1 ci-dessus. Pour 30 quantifier spécifiquement la transcription de Litsty PEN3-1 et de Litsty PEN3-2, les amorces P3-1R et P3-1F pour Litsty PEN3-1, et P3-2R et P3-2F pour Litsty PEN3-2, décrites dans l'Exemple 1, ont été utilisées. Les résultats obtenus pour le lysozyme sont 35 illustrés par la Figure 6A, et ceux obtenus pour Litsty PEN3 sont illustrés par la Figure 6P. Les résultats obtenus pour Litsty PEN3-1 et Litsty PEN3-2 sont présentés dans la Figure 7.

2908136 23 Les niveaux d'expression relative ont été normalisés par rapport au facteur d'élongation la. Dans le cas du lysozyme et de Litsty PEN3 (Figure 6), les résultats sont exprimés comme des valeurs moyennes SDV à partir de 5 ou 6 5 crevettes par lignée de crevettes. Chaque valeur est calculée en référence au groupe de la lignée contrôle (expression relative = 1) selon la méthode 2-,nACt corrigée pour l'efficacité (PFAFFL, 2001, précité). Dans le cas de Litsty PEN3-1 et Litsty PEN3-2 (Figure 7) les niveaux d'expression 10 relative ont été normalisés par rapport à EF-la, et chaque valeur a été calculée en référence à la première valeur de Litsty PEN3-2 à partir de la lignée contrôle (expression relative = 1) selon la méthode 2-GéCt corrigée pour l'efficacité. Les résultats sont exprimés comme des valeurs 15 moyennes SDV à partir de deux pools de crevettes réalisés en trois exemplaires. Légende de la Figure 6 ^ lignée de crevettes contrôle ^ lignée de crevettes sélectionnée 20 différence statistique entre les deux lignées de crevettes, p<0,05 (Student test). Légende de la Figure 7 transcrits de Litsty PEN3-1 ^ transcrits de Litsty PEN3-2 25 Ces résultats révèlent des différences significatives entre les crevettes de la lignée sélectionnée pour la survie et les crevettes de la lignée contrôle. En ce qui concerne le lysozyme, le niveau basal de transcription est moindre dans les hémocytes des crevettes de 30 la lignée contrôle, que dans ceux des crevettes de la lignée sélectionnée. Au contraire, en ce qui concerne la transcription globale de Litsty PEN3, son niveau basal est plus élevé dans les hémocytes des crevettes de la lignée contrôle que ceux des 35 crevettes de la lignée sélectionnée. En ce qui concerne Litsty PEN3-1 son niveau basal de transcription est beaucoup plus élevé dans les hémocytes 2908136 24 des crevettes de la lignée sélectionnée que dans ceux des crevettes de la lignée contrôle. Au contraire, le niveau basal de transcription de Litsty PEN3-2 est bien moindre dans les hémocytes des 5 crevettes de la lignée sélectionnée que dans ceux des crevettes de la lignée contrôle En outre, dans la lignée sélectionnée, le niveau basal de transcription de Litsty PEN3-1 est beaucoup plus élevé que celui de Litsty PEN3-2, alors qu'aucune différence 10 entre les niveaux de transcription de base de Litsty PEN3-1 et Litsty PEN3-2 n'est observable dans la lignée contrôle. EXEMPLE 4 : RELATION ENTRE LE PROFIL D'EXPRESSION DE GENES DE PEPTIDES ANTIMICROBIENS AU COURS DE L'INFECTION PAR VIBRIO PENAEICIDA ET LA CAPACITE INDIVIDUELLE DE SURVIE DES CREVETTES 15 Les quantités de transcrits de l'ALE, de Litsty PEN3 (PEN3) et de ses isoformes Litsty PEN3-1 et Litsty PEN3-2, de Litsty PEN2-1 (PEN2), du lysozyme, de la crustine et du peptide riche en cystéine, 24 heures avant l'infection, et 24 heures après l'infection ont été comparées entre les 20 individus ayant survécu à l'infection et ceux n'ayant pas survécu, dans la lignée de crevettes sélectionnée et dans la lignée contrôle. Les résultats sont présentés dans les Figures 8 et 9. La quantité de transcrits a été déterminée par PCR 25 en temps réel, comme décrit ci-dessus, à partir d'échantillons individuels (5 ou 6 crevettes par condition), et les résultats présentés représentent la moyenne de ces mesures. Les niveaux d'expression relative ont été normalisés par rapport à EF-la. Pour l'ALE, Litsty PEN3,3 Litsty PEN2-1, le 30 lysozyme, la crustine et le peptide riche en cystéine (Figure 8), les valeurs durant l'infection ont été calculées en référence au groupe non infecté (expression relative = 1) selon la méthode 2-ôôCt corrigée pour l'efficacité. Les conditions expérimentales associées par un crochet présentent 35 une différence statistique, p<0,05 (ANOVA-test LSD). Légende de la Figure 8 : ^ : quantité avant l'infection (-24) 2908136 25 ^ : quantité 24 heures après l'infection chez les crevettes ayant survécu (+24S) . quantité 24 heures après l'infection chez les crevettes n'ayant pas survécu (+24NS) 5 Pour ALF, on observe une augmentation des transcrits 24 heures après l'infection dans les deux lignées de crevettes. Dans la lignée contrôle, une différence significative du niveau de transcription par rapport aux crevettes non infectées est observée pour les crevettes ayant 10 survécu, mais pas pour celles n'ayant pas survécu. Au contraire, dans la lignée de crevettes sélectionnée, une différence significative du niveau de transcription par rapport aux crevettes non infectées est observée pour les crevettes n'ayant pas survécu, mais pas pour celles ayant 15 survécu. Aucune des deux lignées ne présente de différence significative entre les crevettes ayant survécu et celles n'ayant pas survécu. Pour la famille des pénaeidines, les transcrits de Litsty PEN2-1 et PEN3 diminuent 24 heures après l'infection. Pour Litsty PEN3, on n'observe de différences significatives des niveaux de transcription que chez la lignée contrôle, entre les crevettes n'ayant pas survécu et les aux crevettes non infectées, et également entre les crevettes n'ayant pas survécu et celles ayant survécu. Pour Litsty PEN2-1 des différences significatives sont observées dans les deux lignées. Dans la lignée contrôle, une diminution significative des transcrits par rapport aux crevettes non infectées est observée à la fois chez les crevettes ayant 30 survécu et chez celles n'ayant pas survécu. Dans la lignée sélectionnée, on observe des différences significatives entre les crevettes ayant survécu et celles n'ayant pas survécu, ainsi qu'entre les crevettes n'ayant pas survécu et celles non infectées. En revanche, 35 aucune différence significative n'est observée entre les crevettes non infectées et celles ayant survécu.

20 25 2908136 26 Les transcrits de la crustine et du peptide riche en cystéine présentent des schémas d'expression similaires dans les deux lignées de crevettes Chez les deux lignées on observe une diminution 5 significative des transcrits de la crustine et du peptide riche en cystéine chez les crevettes n'ayant pas survécu par rapport aux animaux non infectés, et une augmentation significative de ces transcrits chez les animaux ayant survécu par rapport à ceux n'ayant pas survécu.

10 Dans le cas du lysozyme, on observe dans la lignée contrôle, une diminution importante de la quantité de transcrits chez les crevettes n'ayant pas survécu par rapport aux crevettes non infectées, et par rapport aux crevettes ayant survécu. Dans la lignée sélectionnée, on observe une 15 diminution significative de la quantité de transcrits à la fois les crevettes ayant survécu et chez celles n'ayant pas survécu par rapport aux crevettes non infectées. Pour Litsty PEN3-1 et Litsty PEN3-2 (Figure 9), les valeurs durant l'infection ont été calculées en référence à la 20 moyenne de toutes les valeurs selon la méthode 2-êôCt corrigée pour l'efficacité. Légende de la Figure 9 : expression relative des transcripts Litsty PEN3-1 (P3-1) ^ expression relative des transcripts Litsty PEN3-2 (P3-2) 25 -24 = crevettes collectées avant l'infection +24S = crevettes collectées 24 heures après l'infection ayant survécu +24NS = crevettes collectées 24 heures après l'infection n'ayant pas survécu 30 Dans la lignée contrôle, on n'observe de différences significatives entre la quantité de transcrits de Litsty PEN3-1 et la quantité de transcrits de Litsty PEN3-2 que 24 heures après l'infection, et chez les crevettes ayant survécu. Pour les animaux qui n'ont pas survécu les quantités 35 des deux transcrits Litsty PEN3-1 et Litsty PEN3-2, sont extrêmement faibles par rapport à celles mesurées avant l'infection.

2908136 2 7 Dans la lignée sélectionnée, on observe des différences significatives entre les quantités de Litsty PEN3-1 et Litsty PEN3-2 quelque soit le moment de l'infection ccnsidérée.

5 Litsty PEN3--1 est beaucoup plus abondant que Litsty PEN3-2, que ce soit avant l'infection, à 24 heures dans les crevettes qui ont survécu, ou dans celles qui n'ont pas survécu. EXEMPLE 5 : ANALYSE DE L'EXPRESSION DES TRANSCRITS SUR PUCE 10 D'ADN Des membranes de miniarrays ont été préparées afin d'évaluer les abondances en transcrits de gènes codant pour six peptides antimicrobiens (ALF, crustine, peptide riche en glycine, Litsty PEN3-1, lysozyme, peptide riche en cystéine) 15 de la crevette L. styl_irostris. Les numéros d'accession peptide riche en cystéine sont CV699287. Les séquences d'ADNc de sont respectivement indiquées dans 20 annexe sous les numéros SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 4. La séquence d'ADNc de ALF est indiquée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 40. La séquence d'ADNc du peptide riche en glycine est indiquée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 42.

25 Préparation des ADNc sondes Des fragments d'ADNc (ADNc sonde) de chacun des gènes codant pour les six peptides antimicrobiens, sont amplifiés par PCR classique. Les amorces PCR (sens et anti-sens) listées dans le 30 Tableau 2 ci-dessous ont été utilisées. La température d'hybridation spécifique de chaque paire d'amorces est indiquée, de même que la taille des produits de PCR amplifiés attendue. GenBank du lysozyme et du respectivement CV699332 et PEN3-1 et de la crustine la liste de séquences en 2908136 28 Tableau 2 Nom de Tm Taille Nom du gène Séquence de l'amorce l'amorce ( C) (pb) Peptide riche CystF 5'-TGGTGGCCGAACTCTGGAC-3' (SEQ ID NO : 26) 62 475 en cystéine CystR ^ 5'-CTCCTTTCTCCCATCTCACG-3' (SEQ ID NO : 27) 62 Peptide riche GIyF 5'-TGCACCGAGCAAAACGTCAG-3' (SEQ ID NO : 28) 62 449 en glycine GIyR 5'-TCGAGGAATTCACACTGAAACA-3' (SEQ ID NO : 29) 62 CrusF 5'-GTGGTGGCGGTTTAGGTGTA-3' (SEQ ID NO :30) 62 Crustine 429 CrusR 5'-CATCGGTCGTCCTTCAGATG-3' (SEQ ID NO : 31) 62 LysoF 5'-TATCAACCATTACAACGTCTGC-3' (SEQ ID NO : 32) 62 Lysozyme 201 LysoR 5'-AGATTTACAGGCTTGGCACCA-3' (SEQ ID NO : 33) 62 PEN3-1 F 5'-CCTGGTCTTCTTGGCCTCC-3' (SEQ ID NO : 34) 62 Litsty PEN3-1 157 PEN3-1R 5'-TAGAGGGCACACGTTGCCC-3' (SEQ ID NO : 35) 62 ALFF 5'-GTGAACTCCGCTGTTAAAGAC-3' (SEQ ID NO : 36) 62 - ALF 507 ALFR 5'-TACACCACACTTGTATATTACAG-3' (SEQ ID NO : 37) 62 Les mélanges de PCR sont préparés selon les concentrations finales suivantes : 1 pM de mélange d'amorces, dNTP 1mM, MgC12 1,5 mM ; Tampon 10X à 1X ; Taq 0,5 pl pour 5 50 pl de volume final (QSP H2O) . Chaque réaction de PCR a été réalisée avec une étape de dénaturation initiale de 15 min. à 97 C, suivie d'une amplification de l'ADNc [dénaturation à 97 C pendant 1 min., hybridation à 62 C pendant 1 min., élongation à 72 C pendant 1 min. (le nombre de cycles varie 10 selon le gène amplifié)), une étape d'élongation finale à 72 C pendant 10 min., et un stockage à 4 C. Les produits de PCR pour chaque gène, précédemment amplifiés, sont purifiés en utilisant le kit QlAquick PCR Purification Kit Protocol (Qiagen) selon les recommandations 15 du fournisseur. Les produits de PCR amplifiés et purifiés sont dosés au spectrophotomètre (abs.. 260 et 280 nm, ratio proche de 1,8) afin de les quantifier, puis sont concentrés à 100 ng/pl pour le dépôt sur membrane.

20 Préparation des membranes Les produits de PCR purifiés et concentrés sont dénaturés à 98 C pendant 10 min.

2908136 29 Les produits de PCR (ADNcsonde) sont déposés sur deux membranes de nylon à raison de 100 ng/spot, selon le schéma de l'organisation montrée dans la Figure 10. Légende de la Figure 10 : 5 • _ ALF O = crustine 0 = glycine-riche Litsty PEN3-1 > = lysozyme 10 C)== cystéine-riche Les membranes sont séchées pendant 15 min. à température ambiante. Les produits PCR déposés sur les membranes sont à nouveau dénaturés à l'aide de NaOH 0,5 M pendant 15 min. (2 fois) par capillarité. Les membranes sont 15 neutralisées avec du Tris HC1 0,5 M, pH 7,4 ; pendant 10 min. (2 fois), puis séchées 10 min. à température ambiante. La fixation définitive des produits de PCR. est réalisée sous UV. Les membranes sont ensuite séchées en vue d'un 20 stockage à l'abri de la lumière à température ambiante. Préparation des ADNc cibles Une préparation d'ADNc a été obtenue à partir des ARN totaux isolés des hémocytes, soit d'une crevette non sélectionnée et non-survivante à l'infection, soit d'une 25 crevette sélectionnée et survivante à l'infection. Pour obtenir les ADNc de chacune des conditions expérimentales qui seront hybridés sur les membranes (ADNc cibles), les ADNc de chacun des gènes codant pour les six peptides antimicrobiens, ont été amplifiés avec les mêmes 30 ccuples d'amorces spécifiques et dans les mêmes conditions de PCR que pour la préparation des ADNc sondes. En revanche, des dUTP marqués à la digoxigénine (dUTP-DIG) ( PCR DIG labelling melange , Roche Diagnostics) ont été introduits. Hybridation et révélation des membranes 35 Dans un premier temps les membranes sur lesquelles les ADNc sondes sont fixés, ont été pré-hybridées avec un tampon de pré-hybridation composé de 6X SSC, 0,1% N- 2908136 30 lauroylsarcosine, 0,02% SDS, 1% lait écrémé, 1% Tween20 ; pendant 45 min. Dans un second temps, les ADNc cibles obtenus ont été dénaturés à 98 C pendant 10 min., puis plongés dans la 5 glace. Chaque ADNc cible a été déposé sur sa membrane respective, et incubé pendant 30 min. à température ambiante. Les membranes ont ensuite été lavées 2 fois avec du tampon de lavage Wl (0,1X SSC, 0,1% SDS) pendant 1 min. sous forte agitation.

10 Les membranes ont alors été incubées pendant 30 min. à température ambiante et sous faible agitation avec 450 pl de TBS 1X (10mM Tris HC1 pH 7,4 ; 150 mM NaCl ; 0,3% BSA), 1% lait écrémé, 2% sulfate Dextran, contenant une dilution au 1/5000 d'un anticorps anti-digoxigénine (Fab) 1.5 couplé à de la peroxydase. Les membranes ont ensuite été lavées 2 fois avec 0,5 ml de TBS 1X pendant. 1 min. sous forte agitation. Les membranes ont été incubées dans 300 pl de solution de révélation (TMB = 3,,3',5,5'-Tetramethylbenzidine : 20 substrat colorimétrique de la peroxydase) pendant 15 min. dans l'obscurité. Les membranes ont été lavées avec de l'eau stérile (dépourvue de Dnase et Rnase) pendant 5 min. Les résultats sont présentés dans la Figure 11. Légende de la Figure 11 : A = membrane hybridée avec l'ADNc cible provenant de la crevette non sélectionnée et non--survivante B= membrane hybridée avec l'ADNc cible provenant de la crevette sélectionnée et survivante Les résultats montrent que les signaux d'hybridation visualisables sur les membranes hybridées, soit avec l'ADNc cible d'une crevette non sélectionnée et non-survivante (Figure 11A), soit avec l'ADNc cible d'une crevette sélectionnée et survivante (Figure 11B), montrent des profils 35 différentiables sans appareillage particulier. En accord avec les résultats de PCR quantitative, cinq des peptides analysés (crustine, peptide riche en glycine, Litsy PEN3-1, peptide riche en cystéine, et lysozyme) 25 30 2908136 31 présentent des variations de signaux, avec une intensité plus importante sur la membrane hybridée avec la cible préparée à partir de la crevette sélectionnée et survivante à l'infection (Figure 11B) que sur celle hybridée avec la cible préparée à 5 partir de la crevette non sélectionnée et non-survivante à l'infection (Figure 11A). En revanche, les signaux d'hybridation de l'ALE ne présentent aucune différence entre les deux membranes, et constituent ainsi un contrôle positif de l'expérimentation.

Claims (10)

Revendications

1. Procédé pour évaluer l'issue d'une infection par une bactérie pathogène chez une crevette pénéide, caractérisé en ce qu'il comprend la quantification de l'ARNm de la crustine, dans des hémocytes prélevés chez l'animal à tester 6 à 72 heures après l'infection.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la comparaison de la quantité d'ARNm de la crustine avec la quantité du même ARNm dans des hémocytes prélevés chez l'animal à tester préalablement à l'infection.

3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la quantification de l'ARNm du peptide riche en proline 15 et en cystéine, dans des hémocytes prélevés chez l'animal à tester 6 à 72 heures après l'infection, et, avantageusement, la comparaison de la quantité d'ARNm ainsi déterminée avec la quantité du même ARNm dans des hémocytes prélevés chez l'animal à tester préalablement à l'infection.

4. Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la quantification d'un ou plusieurs des ARNm suivants : - l'ARNm du lysozyme ; l'ARNm de la pénaeidine-3 ; - l'ARNm de l'isoforme PEN3-1 de la pénaeidine-3 ; dans des hémocytes prélevés chez l'animal à tester 6 à 72 heures après l'infection, et, avantageusement, la comparaison, pour chaque ARNm choisi, de la quantité ainsi déterminée avec celle du même ARNm dans des hémocytes prélevés chez l'animal à 30 tester préalablement à l'infection.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la quantification de l'ARNm de la pénaeidine-2, dans des hémocytes prélevés chez l'animal à tester 6 à 72 heures après 35 l'infection, et, avantageusement, la comparaison de la quantité ainsi déterminée avec celle du même ARNm dans des hémocytes prélevés chez l'animal à tester préalablement à l'infection. 20 25 2908136 33

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les crevettes pénéides appartiennent à l'espèce L. stylirostris.

7 Procédé selon l'une quelconque des 5 revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'infection est une vibriose.

8. Kit de réactifs pour la mise en ouvre d'un procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel la quantification des 10 transcrits s'effectue par RT-PCR quantitative, et caractérisé en ce qu'il comprend outre les tampons et réactifs nécessaires à l'amplification de la réaction et à la détection des produits d'amplification, au moins une paire d'amorces spécifiques de chacun des ARNm à doser.

9. Kit de réactifs selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend une paire d'amorces spécifiques de l'ARNm de la crustine, et avantageusement, une paire d'amorces spécifiques de l'ARNm du peptide riche en proline et cystéine.

10. Kit de réactifs selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une paire d'amorces spécifiques de l'ARNm du lysozyme, et/ou une paire d'amorces spécifiques de l'ARNm de la pénaeidine-3, et/ou une paire d'amorces spécifiques de l'ARNm de l'isoforme PEN3-1. 25 1l. Puce à ADN permettant la mise en œuvre d'un procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en qu'elle comprend une sonde spécifique de l'ARNm de la crustine, et avantageusement, une sonde spécifique de l'ARNm du peptide riche en proline et 30 cystéine. 12. Puce à ADN selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une sonde spécifique de l'ARNm du lysozyme, et/ou une sonde spécifique de l'ARNm de la pénaeidine-3, et/ou une sonde spécifique de 35 l'ARNm de l'isoforme PEN3-1. 20