CN107273711B - 一种对虾健康状况指示菌群的筛选方法 - Google Patents
一种对虾健康状况指示菌群的筛选方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107273711B CN107273711B CN201710483476.9A CN201710483476A CN107273711B CN 107273711 B CN107273711 B CN 107273711B CN 201710483476 A CN201710483476 A CN 201710483476A CN 107273711 B CN107273711 B CN 107273711B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- prawn
- health condition
- samples
- flora
- phyla
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 title claims abstract description 119
- 230000036541 health Effects 0.000 title claims abstract description 80
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 49
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 49
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 48
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims abstract description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 18
- 241000425347 Phyla <beetle> Species 0.000 claims description 30
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 29
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 15
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 12
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 12
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 claims description 9
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 claims description 7
- 241001135761 Deltaproteobacteria Species 0.000 claims description 7
- 241000192128 Gammaproteobacteria Species 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000007637 random forest analysis Methods 0.000 claims description 6
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 claims description 5
- 238000002790 cross-validation Methods 0.000 claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 2
- 241001446247 uncultured actinomycete Species 0.000 claims 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 abstract description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 2
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 abstract description 2
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 abstract description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 abstract 1
- 241000192142 Proteobacteria Species 0.000 description 14
- 238000003066 decision tree Methods 0.000 description 14
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 4
- 241001142109 Chloroflexi Species 0.000 description 4
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 4
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 4
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 description 3
- 241000605059 Bacteroidetes Species 0.000 description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 3
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 2
- 241001185363 Chlamydiae Species 0.000 description 2
- 241001180199 Planctomycetes Species 0.000 description 2
- 241001180364 Spirochaetes Species 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001135756 Alphaproteobacteria Species 0.000 description 1
- 241001626906 Blastomonas Species 0.000 description 1
- 241000192733 Chloroflexus Species 0.000 description 1
- 241000033356 Hymenobacter Species 0.000 description 1
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 1
- 241000238553 Litopenaeus vannamei Species 0.000 description 1
- 241001261005 Verrucomicrobia Species 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000003181 biological factor Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 1
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012203 high throughput assay Methods 0.000 description 1
- 238000013090 high-throughput technology Methods 0.000 description 1
- 230000007236 host immunity Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229940088592 immunologic factor Drugs 0.000 description 1
- 239000000367 immunologic factor Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
- G06Q—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR ADMINISTRATIVE, COMMERCIAL, FINANCIAL, MANAGERIAL OR SUPERVISORY PURPOSES; SYSTEMS OR METHODS SPECIALLY ADAPTED FOR ADMINISTRATIVE, COMMERCIAL, FINANCIAL, MANAGERIAL OR SUPERVISORY PURPOSES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- G06Q50/00—Information and communication technology [ICT] specially adapted for implementation of business processes of specific business sectors, e.g. utilities or tourism
- G06Q50/02—Agriculture; Fishing; Forestry; Mining
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B5/00—ICT specially adapted for modelling or simulations in systems biology, e.g. gene-regulatory networks, protein interaction networks or metabolic networks
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Business, Economics & Management (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Economics (AREA)
- Marketing (AREA)
- General Business, Economics & Management (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Strategic Management (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Primary Health Care (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tourism & Hospitality (AREA)
- Human Resources & Organizations (AREA)
- Mining & Mineral Resources (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于肠道指示细菌的对虾病害定量预测方法，特点是基于生物信息学筛选对虾健康状况指示细菌门，并基于对虾肠道菌群组成特征设计特异性引物；采用实时定量PCR检测健康指示细菌门相对丰度，以健康指示细菌门相对丰度及其指示权重为自变量自建预测模型实现对虾养殖病害定量预测，优点是区分了不同生长阶段和病害对肠道菌群的影响，提高了预测的准确率，同时建立了廉价的定量预测病害方法，具有很高的实际应用价值，能够为制定应对干预措施提供依据，如设计益生菌群，对于降低对虾养殖风险起到良好推动作用。
Description
技术领域
本发明涉及水产养殖病害预测方法，尤其是涉及一种基于肠道指示细菌的对虾病害定量预测方法。
背景技术
对虾养殖模式从土塘养殖转变为集约化、高密度的温棚和循环水养殖，这种转变导致应激原增多、对虾免疫力下降, 致使对虾养殖病害频发。对虾病害具有发病快、死亡率高等特点，而目前缺乏特别有效的治疗方法。在对虾病害发生情况未见明显好转，部分地区有加重趋势的背景下，2016年农业部为对虾重大病害防治工作专门制定了方案，其中核心环节是在疾病诊断和环境监测的指导下安全合理用药。因此，亟需明确对虾病害的病因学机理，并建立定量预测对虾发病风险的技术，为采取针对措施防控病害提供依据和指导。
现有研究表明，肠道微生物通过拮抗病原菌定殖和促进宿主免疫力等，在维持宿主健康方面起到重要作用。对虾缺乏获得性免疫系统，主要依靠非特异性免疫因子抵抗环境胁迫和各种病原菌感染，因此正常和稳定的肠道菌群组成和功能在对虾健康中的作用可能更加突出。微生物能够对外界环境扰动(如水质恶化、病原菌侵染)做出线性(变异幅度与扰动强度在一定范围正相关)的响应，能够综合地反映环境和生物因素干扰的协同或拮抗效应。现有研究利用高通量技术发现健康和发病对虾的肠道细菌群落组成差异显著，并能够筛选出与病害严重程度线性相关的指示种群。然而，高通量测序技术存在周期长，费用昂贵和专业技术要求高等特点，难以应用于养殖过程中对对虾病害进行常规评估和预警。因此，急需建立一种廉价、快速、准确和定量的方法来克服现有技术的限制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种低成本、快速、定量预测对虾发病风险的基于肠道指示细菌的对虾病害定量预测方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于肠道指示细菌的对虾病害定量预测方法，包括以下步骤：前期采用Illumina高通量测序方法分别获得不同生长阶段健康对虾在和发病对虾的肠道细菌群落组成和丰度信息，先以虾龄为主因子利用随机森林模型筛选出健康对虾在不同生长阶段的特征细菌种群，定义为虾龄指示菌群；在肠道细菌群落组成中删除虾龄指示菌群后，以健康状况为主因子筛选出对虾健康状况指示菌群；针对对虾肠道菌群的组成特点，设计健康状况指示菌群的特异性引物，通过定量PCR检测获得健康状况指示菌群的相对丰度，以健康状况指示细菌群的相对丰度及其指示权重为为自变量，建立预测模型，利用预测模型定量预测对虾发病概率。
所述的对虾健康状况指示菌群的筛选方法具体步骤如下：
(1) 设共有N个样品，其中有a个健康和b个病害样品，前期所有样品通过Illumina高通量测序获得准确完整的细菌门组成，共得到m种细菌门，计算每个细菌门的相对丰度；
(2) 选取a个健康样品的细菌门群落，以每一个细菌门的相对丰度与所对应样品的虾龄进行随机森林计算，结合10倍交叉验证鉴定出与健康对虾虾龄显著相关的菌群，从而确定虾龄指示菌门的组合；
(3) 在m种细菌门中去掉步骤(2)中筛选到的虾龄指示菌门，且仅保留与b个病害样品相同虾龄的健康对虾样品的细菌门群落，以对虾健康状况为主变量，利用随机森林模型结合10倍交叉验证筛选出对虾健康状况指示菌群。
所述的对虾健康状况指示菌群的组成如下：浮霉状菌门(Planctomycetes)；变形菌门/γ变形菌纲(Proteobacteria/Gammaproteobacteria)；衣原体门(Chlamydiae)；绿屈挠菌门(Chloroflexi)；蓝细菌门(Cyanobacteria)；放线菌门(Actinobacteria)；变形菌门/δ变形菌纲(Proteobacteria/Deltaproteobacteria)；拟杆菌门(Bacteroidetes)；螺旋体门(Spirochaetes)。
所述的对虾健康状况指示菌群的特异性引物序列如下：
通过定量PCR检测获得健康状况指示菌群相对丰度的方法具体步骤如下：随机挑取健康和病害对虾肠道微生物DNA样品，以总细菌16S基因为参比，利用各健康状况指示菌特异性引物进行定量PCR检测，采用2-△△t法计算各健康状况指示菌相对丰度。
所述的定量 PCR检测反应体系20 μL组成如下：2× FastStart SYBR green mix10 μL，50× ROX Reference Dye 0.4μL，浓度为50ng/μL的上下游引物各0.8 μL，模板8 μL；反应参数为40个循环，95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s。
所述的对虾发病概率预测模型数学公式如下：
式中F表示待检测对虾发病概率；
A为健康状况指示菌群的相对丰度向量，即A=[T1，T2，T3，…，Tn]，其中Ti（i=1，2，…，n）为各健康状况指示细菌门的相对丰度；
magvatA表示检测样品以定量PCR检测的各健康状况指示细菌门丰度分布特征与前期高通量检测的各健康状况指示细菌门丰度的拟合相关性；
tr为决策树数目，为常数2，健康或病害；
Q为示性函数，分别为健康或病害指示种；
nt，c为决策树t对预测健康状况的分类结果，健康记为1，病害记为2；
nt是决策树t的结点数，默认值为N/3，N为指示细菌门个数，N= 9；
W为各健康状况指示菌的指示权重。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一种基于肠道指示细菌的对虾病害定量预测方法，其通过筛选虾龄指示种群后再筛选对虾健康状况指示种群，消除了因对虾不同生长阶段肠道菌群的差异对筛选健康状况指示种群的影响，极大地提高了指示种群的准确性；针对对虾肠道菌群的组成特点，设计健康状况指示种群的特异性引物，具有较高的特异性能够有效检测各指示菌的含量；后期利用定量PCR技术检测指示种群相对丰度，以指示细菌门相对丰度及其指示权重为自变量建立预测模型定量评估病害发生的风险，是一种低成本、快速和定量的预测对虾发病风险的技术，提高经济效益、降低对虾养殖的风险。弥补了目前缺乏生产实际中的应用。定量预测对虾发病风险，并且为设计和及时添加益生菌组合防控病害提供依据和指导，也可以借鉴到其它养殖物种的病害定量预测。
附图说明
图1为本发明的对虾病害预测方法流程示意图；
图2为定量PCR与高通量测序检测肠道微生物的拟合相关性示意图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施案例
时间2016年4月—7月，从2016年4月8日开始，分别在凡纳滨对虾放苗7，14，21，28，35，42，49，56，63，70，77，84，87和93天后从6个养殖塘中采集样品。放苗84天后，在监测的6个养殖塘中有3个养殖塘对虾发病，并且随着时间的推移疾病的严重程度增加，死亡率线性增加。我们同时采集了健康和病害对虾样品，共计103个样品。样本经DNA提取、PCR扩增细菌16S rRNA基因，Illumina双末端测序得到各样本肠道细菌群落组成，并转换为相对丰度；抽取对虾血液测超氧化物歧化酶(SOD)浓度，结合病症和死亡率判断病害严重程度。我们用各时间点共85个健康对虾样品作为筛选虾龄指示类群的样本；在去掉虾龄指示种群后，以采集的健康和病害(发病过程中87和93天的样品)对虾样本作为筛选健康状况指示类群的样本，筛选到健康状况指示菌群，针对对虾肠道菌群的组成特点，设计健康状况指示种群的特异性引物，通过定量PCR检测健康状况指示种群的相对丰度，以检测到的相对丰度为自变量建立预测模型并通过模型预测养殖塘发病概率。实施流程参照图1。
以下数据说明具体流程与方法：
1、测定对虾超氧化物歧化酶(SOD)水平，结合对虾病症和死亡率划分对虾疾病严重程度。
2、筛选虾龄指示种群
(1) 用于筛选虾龄指示种群的样本共有85个，通过Illumina高通量测序得到41种细菌门，计算每个细菌门的相对丰度。
(2) 以每一个细菌门的相对丰度与所对应样品的虾龄(7，14，21，28，35，42，49，56，63，70，77，84，87和93天)进行随机森林分析，结合10倍交叉验证鉴定出与健康对虾虾龄显著相关的菌群，定义为虾龄指示菌，共筛选到2个具有强指示性能的虾龄指示菌，分别为疣微菌门(Verrucomicrobia)和变形菌门中的α变形菌(Alphaproteobacteria)。
3、筛选对虾健康状况指示种群
在检测到的41个细菌门中，去掉2个虾龄指示菌门；然后仅保留87和93天的病害和对应时间健康样品。以健康状况为主因子，同上分析筛选健康状况指示菌群；共筛选到9个健康状况指示菌，分别为：
浮霉状菌门(Planctomycetes)；
变形菌门/γ变形菌纲(Proteobacteria/Gammaproteobacteria)；
衣原体门(Chlamydiae)；
绿屈挠菌门(Chloroflexi)；
蓝细菌门(Cyanobacteria)；
放线菌门(Actinobacteria)；
变形菌门/δ变形菌纲(Proteobacteria/Deltaproteobacteria)；
拟杆菌门(Bacteroidetes)；
螺旋体门(Spirochaetes)。
上述9个指示菌门的相对丰度与病害严重程度显著相关，且不受虾龄影响。以上述9个健康状况指示菌的相对丰度及其指示权重W为自变量，利用自建预测模型
(1)，计算出各对虾样本健康和发病概率（表1），与已知的健康状况对比，总预测的准确率高达93.2% (表2)。
表1 各样品基于高通量检测的相对丰度为自变量的预测结果
注：前3位数字为采样日期，H为健康对虾样品，D为病害对虾样品，后1位数为平行样品间编号，如422H1为4月22日1号养殖塘的健康对虾样品。健康概率由
计算；患病概率= 1-概率健康。
式中F表示待检测对虾发病概率；A为健康状况指示菌群的相对丰度向量，即A=[T1，T2，T3，…，Tn]，其中Ti（i=1，2，…，n）为各健康状况指示细菌门的相对丰度；magvatA表示检测样品以定量PCR检测的各健康状况指示细菌门丰度分布特征与前期高通量检测的各健康状况指示细菌门丰度的拟合相关性；tr为决策树数目，为常数2，健康或病害；Q为示性函数，分别为健康或病害指示种；nt，c为决策树t对预测健康状况的分类结果，健康记为1，病害记为2；nt是决策树t的结点数，默认值为N/3, N为用于预测的自变量个数（本发明中N =9，指示细菌门个数）；W为各健康状况指示菌的指示权重。
例如，以422H1样品为例：健康概率 F = 0.899 ×1/2×[1/3 ×(35.8×17.5% +13.4×13.2% + 8.4×8.1% + 8.1×8.6% + 4.6×4.5% + 4.5×4.5% + 2.2 × 4.8%－2/3×(17×7.4% + 6.1×7.0%)] =0.984=98.4%；病害概率=1-健康概率=1-98.4% =1.6%。
表2以对虾健康状况指示菌丰度为自变量预测虾健康状况的准确率
4、设计对虾健康状况指示菌群特异性引物
(1) 针对对虾肠道菌群的组成特点(肠道菌群组成具有宿主特异性)，从前期高通量测序数据库中，基于各对虾健康状况指示细菌门分别挑选50条代表性序列；
(2) 从RDP网站(http://rdp.cme.msu.edu/seqmatch/seqmatch_intro.jsp)中找出各条代表序列的对应16S rRNA基因全长序列；
(3) 通过clustalX进行序列比对，并找出保守区；
(4) 根据对虾肠道菌群特征选取简并碱基，利用Primer Premier 5设计特异性引物；
(5) 利用NCBI里面的primer-BLAST进行引物特异性的验证，交由生物公司合成。
9种对虾健康状况指示菌门特异性引物见表3
表3 对虾健康状况指示菌特异性引物
注：R=A / G；Y=C / T；N= G / A / T / C； M=A / C； K=T / G；S=C / G；B=C / G/ T；上述9个对虾健康状况指示菌中1-5指示菌的特异性引物为本专利发明人设计验证获得，6-9指示菌的特异性引物为参考现有的文献报道。
5、定量PCR检测各指示细菌门
(1) 指示细菌门相对丰度检测：随机挑取健康和病害对虾肠道微生物DNA样品，以总细菌16S基因为参比，定量PCR检测，采用2-△△t法计算各指示菌相对丰度。其中采用20 μL定量 PCR反应体系：2× FastStart SYBR green mix 10 μL，50× ROX Reference Dye0.4μL (SYBR Premix Ex TaqTM, Takara)，上下游引物各0.8 μL（浓度为50ng/μL），模板8 μL。反应参数为40个循环，95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s。所用仪器为7500实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystem）。
(2) 检测结果可靠性评价：将定量PCR检测的相对丰度与前期高通量测序的结果相比较，发现两种方法测得的肠道微生物群落相对丰度具有很高的一致性，如图2所示，特别是在高相对丰度的变形菌门。虽然有些细菌门存在偏差，如拟杆菌门、芽单胞菌门，但变化趋势是一致的(表4)。同时，以定量PCR检测的指示细菌门相对丰度为自变量获得如表2一致的预测结果。因此，我们设计的指示细菌门引物具有很高的可靠性，能够以定量PCR替代高通量测序，实现廉价、快速检测指示菌群相对丰度的目的。
表4 不同健康状况对虾肠道菌群结构分析
注：*表示健康与患病样品存在显著差异(P < 0.05)。
(3) 建立预测模型
①取健康对虾肠道微生物DNA样品(84，87和93天健康对虾样品)，用上述9种特异性引物进行特异性扩增从而绘制标准曲线；取患病对虾DNA样品(87和93天患病对虾样品)采用定量PCR检测各指示菌的相对丰度，并与标准曲线比较得到定量结果。
②随机挑取健康和病害对虾肠道微生物DNA样品共N个，定量PCR检测9种指示菌相对丰度，将健康状况指示菌门的相对丰度定义为特征向量A，即A=[T1，T2，T3，T4，T5，T6，T7，T8，T9]。其中Ti（i =1，2，3……9）为9种（表4）指示细菌门的相对丰度。
将指示菌相对丰度向量A及其指示权重W作为决策树分类的自变量，通过在决策树中的聚类概率对对虾健康状况进行诊断，即发病概率。
③构建预测模型
1)以随机挑取的N个健康和病害对虾肠道微生物获得的各健康状况指示菌相对丰度及其指示权重作为自变量，按照决策树的生成步骤建立对虾健康状况诊断决策树。
2)将N个样品随机分为10组，每组建立相应对虾健康状况诊断决策树，采用多数投票法，利用自建预测模型即可计算出对虾发病概率。所用数学公式如下：
式中F表示待检测对虾发病概率；
magvatA表示检测样品以定量PCR检测的各指示细菌门丰度分布特征与前期高通量检测的各指示细菌门丰度的拟合相关性；
tr为决策树数目，为常数2，健康或病害；
Q为示性函数，分别为健康或病害指示种；
nt，c为决策树t对预测健康状况的分类结果，健康记为1，病害记为2；
nt是决策树t的结点数，默认值为N/3, N 为预测变量个数；
W为各健康状况指示菌的指示权重。
3) 挑选M个(M不包含在N中)已知健康状况的对虾肠道微生物DNA样品，同样检测指示菌相对丰度，带入模型中检验模型的准确性。总预测准确率所用数学公式如下：
式中PT表示正确分类的个数（F >50%预测准确），PF表示错误分类的个数（F<50%预测错误）。其中随机挑选部分已知健康状况的对虾肠道微生物DNA样品(健康20个，患病18个)，同样检测指示菌相对丰度，带入模型中检验模型的准确性，准确率达86.2%。
(4) 利用模型预测养殖塘发病概率
将待检测的对虾样品，提取肠道微生物DNA，采用定量PCR检测各健康状况指示细菌门的相对丰度，以检测到的相对丰度及其指示权重为自变量，通过自建预测模型(1)计算出待检样本健康和发病概率，从而实现定量预测病害发生概率。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序 列 表
<110> 宁波大学
<120> 一种基于肠道指示细菌的对虾病害定量预测方法
<130>
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 浮霉状菌门特异性上游引物
<400> 1
GAGCGGTGAAATGYGTTGA 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 浮霉状菌门特异性下游引物
<400> 2
TGTGTGAGCCCCCGTCAA 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 变形菌门/ γ变形菌纲特异性上游引物
<400> 3
GCTCGTGTTGTGAAATGTTGG 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 变形菌门/ γ变形菌纲特异性下游引物
<400> 4
CGTAAGGGCCATGATGACTTG 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衣原体门特异性上游引物
<400> 5
CCAACACTGGGACTGAGACACT 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衣原体门特异性下游引物
<400> 6
AGCTGCTGGCACGGAGTTAG 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 绿屈挠菌门特异性上游引物
<400> 7
GCTAACTACGTGCCAGCAGC 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 绿屈挠菌门特异性下游引物
<400> 8
TACGCATTRCACCACTACACC 21
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 蓝细菌门特异性上游引物
<400> 9
CGGTAAKACGGAGGAKGCA 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 蓝细菌门特异性下游引物
<400> 10
TCGCCACTGGTGTTCTTCC 19
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 放线菌门特异性上游引物
<400> 11
TGTAGCGGTGGAATGCGC 18
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 放线菌门特异性下游引物
<400> 12
AATTAAGCCACATGCTCCGCT 21
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 变形菌门/ δ变形菌纲特异性上游引物
<400> 13
GTGCNARCGTTGYTCGGA 18
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 变形菌门/ δ变形菌纲特异性下游引物
<400> 14
CCGTCAATTCMTTTRAGTTT 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 拟杆菌门特异性上游引物
<400> 15
GTTTAATTCGATGATACGCGAG 22
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 拟杆菌门特异性下游引物
<400> 16
TTAASCCGACACCTCACGG 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 螺旋体门特异性上游引物
<400> 17
CTGCTGCCTCCCGTAGGAGT 20
<210> 18
<211> 202
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 螺旋体门特异性下游引物
<400> 18
CATGCAAGTCGAACGGTAGG 20
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌 16S rRNA特异性上游引物
<400> 19
CCTAYGGGRBGCASCAG 17
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌 16S rRNA特异性下游引物
<400> 20
GGACTACNNGGGTATCTAAT 20
Claims (3)
1.一种对虾健康状况指示菌群的筛选方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)设共有N个样品，其中有a个健康和b个病害样品，前期所有样品通过Illumina高通量测序获得准确完整的细菌门组成，共得到m种细菌门，计算每个细菌门的相对丰度；
(2)选取a个健康样品的细菌门群落，以每一个细菌门的相对丰度与所对应样品的虾龄进行随机森林计算，结合10倍交叉验证鉴定出与健康对虾虾龄显著相关的菌群，从而确定虾龄指示菌门的组合；
(3)在m种细菌门中去掉步骤(2)中筛选到的虾龄指示菌门，且仅保留与b个病害样品相同虾龄的健康对虾样品的细菌门群落，以对虾健康状况为主变量，利用随机森林模型结合10倍交叉验证筛选出对虾健康状况指示菌群，所述的对虾健康状况指示菌群的组成如下：由浮霉状菌门；γ变形菌纲；衣原体门；绿屈挠菌门；蓝细菌门；放线菌门；δ变形菌纲；拟杆菌门和螺旋体门组成，所述的对虾健康状况指示菌群的特异性引物序列如下：
2.根据权利要求1所述的一种对虾健康状况指示菌群的筛选方法，其特征在于通过定量PCR检测获得健康状况指示菌群相对丰度的方法具体步骤如下：随机挑取健康和病害对虾肠道微生物DNA样品，以总细菌16S基因为参比，利用各健康状况指示菌特异性引物进行定量PCR检测，采用2-△△t法计算各健康状况指示菌相对丰度。
3.根据权利要求2所述的一种对虾健康状况指示菌群的筛选方法，其特征在于所述的定量PCR检测反应体系20μL组成如下：2×FastStart SYBR green mix 10μL，50×ROXReference Dye 0.4μL，浓度为50ng/μL的上下游引物各0.8μL，模板8μL；反应参数为40个循环，95℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸30s。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710483476.9A CN107273711B (zh) | 2017-06-22 | 2017-06-22 | 一种对虾健康状况指示菌群的筛选方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710483476.9A CN107273711B (zh) | 2017-06-22 | 2017-06-22 | 一种对虾健康状况指示菌群的筛选方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107273711A CN107273711A (zh) | 2017-10-20 |
| CN107273711B true CN107273711B (zh) | 2021-03-23 |
Family
ID=60069088
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710483476.9A Active CN107273711B (zh) | 2017-06-22 | 2017-06-22 | 一种对虾健康状况指示菌群的筛选方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107273711B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110308255B (zh) * | 2019-05-08 | 2021-11-02 | 宁波大学 | 一种基于污染指示菌群对近海水体污染程度定量预测方法 |
| CN110504005A (zh) * | 2019-08-27 | 2019-11-26 | 上海其明信息技术有限公司 | 数据处理方法 |
| CN110894527B (zh) * | 2019-11-22 | 2023-09-19 | 东莞市林业科学研究所(广东省林业区域性试验东莞中心、东莞市林业科技推广站) | 一种树木根腐病的评价方法 |
| CN111091872B (zh) * | 2019-12-06 | 2023-05-16 | 宁波大学 | 一种基于对虾病害多病源菌筛选益生菌组合的方法 |
| CN111398539A (zh) * | 2020-03-09 | 2020-07-10 | 上海交通大学 | 一种基于大数据和分子生物技术的水质微生物指示方法 |
| CN114511157B (zh) * | 2022-04-18 | 2022-07-05 | 广东省农业科学院植物保护研究所 | 一种基于蔬菜青枯病防治的微生态调控方法及系统 |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101553580A (zh) * | 2006-11-07 | 2009-10-07 | 法国海洋开发研究院（Ifremer） | 抗微生物肽作为对虾中细菌感染抗性标志物的用途 |
| CN101709332A (zh) * | 2009-10-30 | 2010-05-19 | 中国科学院海洋研究所 | 一种对虾性别探针及其获取方法 |
| CN102743420A (zh) * | 2012-06-06 | 2012-10-24 | 上海交通大学 | 改善肠道菌群结构的方法及应用 |
| CN103222439A (zh) * | 2013-05-15 | 2013-07-31 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种凡纳滨对虾无特定病原种虾分级养殖方法 |
| CN105296617A (zh) * | 2015-10-10 | 2016-02-03 | 宁波大学 | 用于检测哈维弧菌群的基因芯片及其使用方法 |
| WO2016151489A1 (en) * | 2015-03-25 | 2016-09-29 | Nestec Sa | Methods for predicting overweight risk for pets and adult percent body fat |
| CN106202846A (zh) * | 2015-04-30 | 2016-12-07 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 口腔微生物群落检测模型的构建方法及其应用 |
| CN106202989A (zh) * | 2015-04-30 | 2016-12-07 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种基于口腔微生物群落获得儿童个体生物年龄的方法 |
| CN106446599A (zh) * | 2015-08-11 | 2017-02-22 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种筛选婴幼儿龋病的口腔致病性生物标记物的方法 |
-
2017
- 2017-06-22 CN CN201710483476.9A patent/CN107273711B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101553580A (zh) * | 2006-11-07 | 2009-10-07 | 法国海洋开发研究院（Ifremer） | 抗微生物肽作为对虾中细菌感染抗性标志物的用途 |
| CN101709332A (zh) * | 2009-10-30 | 2010-05-19 | 中国科学院海洋研究所 | 一种对虾性别探针及其获取方法 |
| CN102743420A (zh) * | 2012-06-06 | 2012-10-24 | 上海交通大学 | 改善肠道菌群结构的方法及应用 |
| CN103222439A (zh) * | 2013-05-15 | 2013-07-31 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种凡纳滨对虾无特定病原种虾分级养殖方法 |
| WO2016151489A1 (en) * | 2015-03-25 | 2016-09-29 | Nestec Sa | Methods for predicting overweight risk for pets and adult percent body fat |
| CN106202846A (zh) * | 2015-04-30 | 2016-12-07 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 口腔微生物群落检测模型的构建方法及其应用 |
| CN106202989A (zh) * | 2015-04-30 | 2016-12-07 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种基于口腔微生物群落获得儿童个体生物年龄的方法 |
| CN106446599A (zh) * | 2015-08-11 | 2017-02-22 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种筛选婴幼儿龋病的口腔致病性生物标记物的方法 |
| CN105296617A (zh) * | 2015-10-10 | 2016-02-03 | 宁波大学 | 用于检测哈维弧菌群的基因芯片及其使用方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 4 株对虾肠道益生菌的筛选及鉴定;李海兵 等;《海洋与湖沼》;20080731;第39卷(第4期);第374-380页 * |
| Regulation of Life Span by the Gut Microbiota in the Short-Lived African Turquoise Killifish;Patrick Smith 等;《bioRxiv》;20170406;第1-55页 * |
| 健康和患病凡纳滨对虾幼虾消化道菌群结构的比较;杨坤杰 等;《水产学报》;20161130;第40卷(第11期);第1765-1773页 * |
| 定量PCR方法与流式成像技术在亚历山大藻藻华研究中的应用;高岩;《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20160415;第2016年卷(第04期);第A006-58页 * |
| 肠道菌群对凡纳滨对虾健康的指示作用;吴金凤 等;《应用生态学报》;20160228;第27卷(第2期);第611-621页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107273711A (zh) | 2017-10-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107273711B (zh) | 一种对虾健康状况指示菌群的筛选方法 | |
| Hiergeist et al. | Multicenter quality assessment of 16S ribosomal DNA-sequencing for microbiome analyses reveals high inter-center variability | |
| CN105368944B (zh) | 可检测疾病的生物标志物及其用途 | |
| Lin et al. | Distinct distal gut microbiome diversity and composition in healthy children from Bangladesh and the United States | |
| Han et al. | Multicenter assessment of microbial community profiling using 16S rRNA gene sequencing and shotgun metagenomic sequencing | |
| Tsuji et al. | Environmental DNA analysis shows high potential as a tool for estimating intraspecific genetic diversity in a wild fish population | |
| Fackelmann et al. | Current levels of microplastic pollution impact wild seabird gut microbiomes | |
| Weber et al. | Age at which dairy cattle become Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis faecal culture positive | |
| Ashraf et al. | A novel multiplex PCR assay for simultaneous detection of nine clinically significant bacterial pathogens associated with bovine mastitis | |
| Suttner et al. | Metagenomics as a public health risk assessment tool in a study of natural creek sediments influenced by agricultural and livestock runoff: Potential and limitations | |
| Di Giannatale et al. | Tracing back clinical Campylobacter jejuni in the Northwest of Italy and assessing their potential source | |
| US20220073996A1 (en) | Model for predicting treatment responsiveness based on intestinal microbial information | |
| Mughini-Gras et al. | Critical orientation in the jungle of currently available methods and types of data for source attribution of foodborne diseases | |
| CN110283903A (zh) | 用于诊断胰腺炎的肠道微生物菌群 | |
| Kretzschmar et al. | Development of a quantitative PCR assay for the detection and enumeration of a potentially ciguatoxin-producing dinoflagellate, Gambierdiscus lapillus (Gonyaulacales, Dinophyceae) | |
| US20200357485A1 (en) | System and method for nucleotide analysis | |
| Krol et al. | How does eDNA compare to traditional trapping? Detecting mosquito communities in South-African freshwater ponds | |
| Chamorro et al. | Landscapes and bacterial signatures of mucosa-associated intestinal microbiota in Chilean and Spanish patients with inflammatory bowel disease | |
| Sadoughi et al. | Aging gut microbiota of wild macaques are equally diverse, less stable, but progressively personalized | |
| Zhang et al. | Postmortem submersion interval estimation of cadavers recovered from freshwater based on gut microbial community succession | |
| Xin et al. | Rapid detection and differentiating of the predominant Salmonella serovars in chicken farm by TaqMan multiplex real-time PCR assay | |
| Combrink et al. | Best practice for wildlife gut microbiome research: A comprehensive review of methodology for 16S rRNA gene investigations | |
| Ma et al. | Molecular epidemiology of Brucella abortus strains from cattle in Inner Mongolia, China | |
| Anslan et al. | Compatibility of diatom valve records with sedimentary ancient DNA amplicon data: A case study in a brackish, alkaline Tibetan lake | |
| Liu et al. | Temporal variability of microbial communities during the past 600 years in a Tibetan lake sediment core |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |