CN109479899A - 鞘翅目金龟类昆虫rna干扰的方法 - Google Patents

鞘翅目金龟类昆虫rna干扰的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109479899A
CN109479899A CN201811161028.8A CN201811161028A CN109479899A CN 109479899 A CN109479899 A CN 109479899A CN 201811161028 A CN201811161028 A CN 201811161028A CN 109479899 A CN109479899 A CN 109479899A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dsrna
gene
cockchafer
injection
class insect
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811161028.8A
Other languages
English (en)
Inventor
尹姣
李克斌
张帅
王超群
李而涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201811161028.8A priority Critical patent/CN109479899A/zh
Publication of CN109479899A publication Critical patent/CN109479899A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
    • A01N57/10—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds
    • A01N57/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds containing heterocyclic radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供鞘翅目金龟类昆虫RNA干扰的方法，其是将特异dsRNA通过注射法导入金龟类昆虫成虫体内，所述dsRNA注射的部位为头胸连接处、胸腹连接处或腹部。其中，所述特异dsRNA靶向金龟类昆虫功能基因和/或生长发育相关基因。本发明首次建立了用于鞘翅目金龟类昆虫基因功能研究的RNAi平台，通过对金龟类昆虫不同部位和不同剂量注射dsRNA进行研究，建立了一套金龟类昆虫的高效RNA干扰方法，实践表明，开发转基因抗虫作物能有效地控制害虫危害，本发明为开发抗金龟类昆虫转基因作物提供了理论依据。

Description

鞘翅目金龟类昆虫RNA干扰的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及鞘翅目金龟类昆虫RNA干扰的方法。
背景技术
金龟子属于昆虫纲鞘翅目金龟科，幼虫统称为蛴螬，为土栖性害虫中分布最广、为害最严重的一大类群，其食性复杂，主要以三龄幼虫取食植物的幼苗、根、茎、种子及块根、块茎等，对玉米、薯类、豆类、棉花、花生、甜菜及小麦等农作物和蔬菜、果树、林木幼苗等造成危害，降低产量，影响品质，严重地块可造成绝收，据调查统计，植物地下受害部分的86％是由蛴螬危害造成的。因而，开展金龟类昆虫的研究是目前生产上的当务之急，其中，RNA干扰技术是开展相关昆虫功能研究的一个重要工具。
RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)是指通过利用短片段的双链RNA促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断特定基因的表达，诱使细胞表现出特定基因沉默的表型，是生物界普遍存在的一种在转录后调节基因表达的有效方式。由于RNAi技术具有特殊的生物学功能作用，因此越来越受到有关科学工作者的关注。目前，已经在线虫、果蝇、小鼠、大鼠以及多种昆虫体内实现了多种基因的表达抑制，显示了RNAi在功能基因组学和基因治疗等领域的广阔应用前景，但是，在金龟类昆虫尚未见利用RNAi进行功能研究的相关报道。目前对昆虫进行RNAi的操作技术主要是注射法和饲喂法，饲喂法较为简便，但需要成熟的人工饲料技术，且作用较慢、效率较低的特点，同时已有研究表明，饲喂法对于中肠之外的蛋白作用效果较差甚至无效。因此，研究利用注射法对金龟类昆虫进行有效RNA干扰的技术对于进一步研究相关昆虫基因功能具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供鞘翅目金龟类昆虫RNA干扰的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的鞘翅目金龟类昆虫RNA干扰的方法，其是将特异dsRNA通过注射法导入金龟类昆虫成虫体内，所述dsRNA注射的部位为头胸连接处、胸腹连接处或腹部。其中，所述特异dsRNA靶向金龟类昆虫功能基因和/或生长发育相关基因。
优选地，所述特异dsRNA靶向金龟类昆虫的气味结合蛋白编码基因。
优选地，所述dsRNA注射的部位为头胸连接处。
更优选地，用于注射的dsRNA浓度为1μg/μL，注射体积不少于2μL。
本发明中，所述金龟类昆虫包括但不限于华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟、铜绿丽金龟等金龟科的昆虫。
在本发明的一个具体实施方式中，所述特异dsRNA作用的靶向华北大黑鳃金龟HoblOBP1基因或靶向铜绿丽金龟AcorOBP1基因。华北大黑鳃金龟HoblOBP1基因及铜绿丽金龟AcorOBP1基因的开放阅读框(ORF)序列分别见SEQ ID NO:3和4。
其一，靶向华北大黑鳃金龟HoblOBP1基因的dsRNA所作用的位点为华北大黑鳃金龟寄主植物识别过程中的重要嗅觉蛋白—气味结合蛋白1(HoblOBP1)(Genbank ID：GQ856258)基因自起始密码子开始的第76位碱基到第426位碱基。
以绿色荧光蛋白GFP为对照进行RNA干扰，所用引物如下：
dsHoblOBP1-F：5’-ATGTCAGAAGAAATGGAAGC-3’
dsHoblOBP1-R：5’-CTATACGATCATATACGAC-3’
dsGFP-F:5’-AAGTTCAGCGTGTCCG-3’
dsGFP-R:5’-CACCTTGATGCCGTTC-3’
靶向华北大黑鳃金龟HoblOBP1基因的特异dsRNA的核苷酸序列为ATGTCAGAAGAAATGGAAGCATTAGCCAAACAGCTGCACGACGATTGCGTTGCTCAAACTGGAGTTGACGAAGCGCACATAAGCACAGTGAAAGACCAGAAGGGATTCCCGGACGATGAAAAGTTCAAGTGCTACTTAAAATGTTTAATGACCGAAATGGCCATTGTGGGAGATGATGGTGTGGTGGACGTTGAAGCGGCCGTAGGTGTTCTGCCAGACGAATACAAGGATAAAGCAGAACCGATAATGCGAAAATGCGGAGTAATACCTGGTGCCAATCCATGTGACAATGTTTACCAGACACACAAATGCTACTACGATACGGACGCCAAGTCGTATATGATCGTATAG(SEQ ID NO:1)。可以根据Promega公司T7RiboMAXTMExpress RNAi System试剂盒说明书进行dsHoblOBP1的合成。
前述的方法，成虫经dsRNA注射后，持续饲养成虫，并利用荧光定量PCR检测成虫体内HoblOBP1基因的表达量。
以β-actin作为内参进行荧光定量PCR检测，所用引物序列如下(SEQ ID NO:5-8)：
其二，靶向铜绿丽金龟AcorOBP1基因的dsRNA所作用的位点为铜绿丽金龟寄主植物识别过程中的重要嗅觉蛋白—气味结合蛋白1(AcorOBP1)(Genbank ID：KF445134)基因自起始密码子开始的第60位碱基到第391位碱基。
以绿色荧光蛋白GFP为对照进行RNA干扰，所用引物如下：
dsAcorOBP1-F：5’-GTCAGAAGAAATGGAAGA-3’
dsAcorOBP1-R：5’-ACTGGGGATCAGTGTC-3’
dsGFP-F：5’-AAGTTCAGCGTGTCCG-3’
dsGFP-R：5’-CACCTTGATGCCGTTC-3’
靶向铜绿丽金龟AcorOBP1基因的特异dsRNA的核苷酸序列为GTCAGAAGAAATGGAAGAATTAGCCAAACAATTACACAATGACTGTGTTGCTCAAACAGGAGTTGATGAAGCTCATATTACAACTGTCAAGGATCAAAAAGGATTTCCGGATGATGAAAAATTCAAATGCTACTTGAAATGTTTGATGACTGAAATGGCGATCGTTGGCGATGATGGTGTAGTAGACGTAGAAGCTGCTGTGGGAGTCCTACCAGATGAATATAAAGCGAAAGCAGAACCAGTAATAAGAAAATGTGGAGTCAAACCTGGAGCGAATCCCTGTGATAATGTTTATCAAACCCATAAATGTTATTACGACACTGATCCCCAGT(SEQ ID NO:2)。可以根据Promega公司T7RiboMAXTMExpress RNAi System试剂盒说明书进行dsAcroOBP1的合成。
前述的方法，成虫经dsRNA注射后，持续饲养成虫，并利用荧光定量PCR检测成虫体内AcorOBP1基因的表达量。
以GAPDH作为内参进行荧光定量PCR检测，所用引物序列如下(SEQ ID NO:9-12)：
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明通过不同部位和不同剂量的干扰实验发现，进行RNA干扰时金龟子头胸连接处是最佳的注射部位。此外，注射2μg的dsRNA即可达到良好的RNA干扰效果。
(二)本发明通过对金龟类昆虫不同部位和不同剂量注射dsRNA的方法，建立一种金龟类昆虫RNA干扰的有效方法。该方法高效、简单，可操作性强，干扰效果明显，为研究金龟类昆虫基因的功能提供技术支持。
(三)本发明首次建立了用于鞘翅目金龟类昆虫基因功能研究的RNAi平台，通过对金龟类昆虫不同部位和不同剂量注射dsRNA进行研究，建立了一套金龟类昆虫的高效RNA干扰方法，实践表明，开发转基因抗虫作物能有效地控制害虫危害，本发明为开发抗金龟类昆虫转基因作物提供了理论依据。
附图说明
图1为本发明实施例1中注射不同部位相同剂量无菌水后华北大黑鳃金龟的死亡率。
图2为本发明实施例2中注射相同部位不同体积无菌水后华北大黑鳃金龟的死亡率。
图3为本发明实施例3中利用荧光定量PCR检测RNA干扰沉默华北大黑鳃金龟HoblOBP1基因的表达的结果；其中，ddH2O代表注射水的金龟子，dsHoblOBP1代表注射HoblOBP1基因dsRNA的金龟子，dsGFP代表注射GFP基因dsRNA的金龟子。
图4为本发明实施例4中利用荧光定量PCR检测RNA干扰沉默铜绿丽金龟AcorOBP1基因的表达的结果；其中，ddH2O代表注射水的金龟子，dsAcorOBP1代表注射AcorOBP1基因dsRNA的金龟子，dsGFP代表注射GFP基因dsRNA的金龟子。
图5显示了华北大黑鳃金龟成虫的形态结构。其中，Ⅰ表示头胸连接处，Ⅱ表示胸腹连接处，Ⅲ表示腹部。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中使用的dsRNA可通过人工合成方式获得。实施例1-3中靶向华北大黑鳃金龟HoblOBP1基因的特异dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。根据Promega公司T7RiboMAXTMExpress RNAi System试剂盒说明书进行dsHoblOBP1的合成。具体步骤如下：
1、触角RNA的提取
(1)将研钵清洗后倒入无水乙醇点燃灭菌，冷却到室温后倒入从-80℃取出的华北大黑鳃金龟触角，倒入液氮迅速研磨至粉末。加入1mL Trizol继续研磨至液态，倒入无RNA酶的1.5mL离心管中，冰上静置5min。4℃离心，12000rpm、10min。
(2)加入200-250μL氯仿，上下剧烈晃动离心管10次，室温静置10min。4℃离心，12000rpm、15min。离心后可见分为三层，自上而下依次为RNA、DNA和蛋白质。
(3)吸取上层RNA至新的无RNA酶的离心管中，加入等体积的异丙醇，室温静置10min，4℃离心，12000rpm、15min，弃上清，沉淀为RNA。
(4)洗涤：用1mL 75％乙醇(DEPC水配制)，吹吸混匀。4℃离心，12000rpm、10min。
(5)用枪头吸净上清，在超净台中最大风速干燥10s。
(6)加入适量的DEPC水溶解RNA。置于-80℃保存。
(7)经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。
(8)Nanodrop-1000检测RNA浓度和纯度。
2、cDNA的合成
(1)根据Fast King RT Kit(With gDNase)试剂盒说明书进行反转录合成cDNA。配制去除基因组DNA的混合体系10μL，包括2μL 5x gDNA Buffer，2μg RNA，补RNase-FreeWater至10μL，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上。
(2)配制反转录反应体系10μL，包括2μL 10x King RT Buffer，1μL Fast King RTEnzyme Mix，2μL RQ-RT Primer Mix，补RNase-Free Water至10μL，彻底混匀并离心。
(3)将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀
(4)42℃，孵育15min。
(5)95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存。
3、目的片段的扩增
扩增体系为20μL，包括cDNA模板1μL，2x PCR Mix 10μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，其余用蒸馏水补足。PCR反应条件：预变性95℃、10min，30个热循环：95℃、30s，60℃、30s，72℃、1min，终延伸72℃、10min。扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并回收。
以dsGFP作为对照基因，所用引物序列如下：
dsHoblOBP1-F：5’-ATGTCAGAAGAAATGGAAGC-3’
dsHoblOBP1-R：5’-CTATACGATCATATACGAC-3’
dsGFP-F:5’-AAGTTCAGCGTGTCCG-3’
dsGFP-R:5’-CACCTTGATGCCGTTC-3’
4、PCR产物回收
根据Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒说明进行以下操作：
(1)加入与PCR扩增体系等体积的Membrane Solution，室温溶解混匀。
(2)将上述液体转移至吸附柱内，室温孵育1min。4℃离心12000g、1min。
(3)弃收集管中的废液，加入700μL Membrane Wash Solution至吸附柱内，4℃离心12000g、1min。
(4)重复上一步。
(5)空柱离心12000g、5min。
(6)将吸附柱置于超净台中，最大风速干燥1min，去除酒精。
(7)将吸附柱置于新的Eppendorf管中，加入50μL的DNase-Free Water，4℃离心12000g、1min，获得回收产物。
5、dsRNA的合成
(1)配置dsRNA合成体系20μL，包括RiboMAXTMExpress T7 2×Buffer 10μL，EnzymeMix T7Express 2μL，PCR回收产物5μL，其余用蒸馏水补足。混匀后，37℃放置30min，扩增条件：42℃、1h；72℃、10min。缓慢降至室温。
(2)将RNAase稀释200倍，在上述Eppendorf管(Ep管)中加入1μL稀释好的RNAase，混匀。
(3)加入1μL DNAase，混匀。37℃孵育30min。
(4)加入2.2μL乙酸钠(3.0M，pH 5.2)和24.2μL异丙醇，用枪小心地水平混匀，冰上放置5min。4℃离心16000g、10min，弃上清。
(5)加入500μL预冷的70％乙醇洗涤，4℃离心16000g 5min，弃上清。
(6)将Ep管至于超净台中以最大风速干燥，加入40-100μL Nuclease-Free Water溶解dsRNA。
(7)1.0％琼脂糖凝胶电泳检测大小；Nanodrop-1000检测dsRNA浓度和纯度，并定量到1μg/μL。
实施例4中靶向铜绿丽金龟AcorOBP1基因的特异dsRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。dsAcorOBP1制备方法参照dsHoblOBP1的制备。所用引物序列如下：
dsAcorOBP1-F：5’-GTCAGAAGAAATGGAAGA-3’
dsAcorOBP1-R：5’-ACTGGGGATCAGTGTC-3’
dsGFP-F:5’-AAGTTCAGCGTGTCCG-3’
dsGFP-R:5’-CACCTTGATGCCGTTC-3’
实施例1最佳注射部位的确定
本实施例研究了不同部位注射无RNA酶的水对华北大黑鳃金龟死亡率的影响。
1、实验对象：羽化2-3天的华北大黑鳃金龟成虫，270头，分3次重复。
2、实验方法：利用显微注射仪Nanoliter2010通过毛细管分别注射3μL无RNA酶的水至华北大黑鳃金龟成虫相应部位(图5)，随后放入预先放有榆树叶片的昆虫饲养箱中，温度为25±1℃，光周期为16L：8D，环境相对湿度为70％±10％，土壤含水量为15％±3％，分别在注射1、2、3、4天后检查华北大黑鳃金龟的死亡率，明确华北大黑鳃金龟进行RNA干扰的最佳注射部位。
注射不同部位相同剂量dsRNA后华北大黑鳃金龟的死亡率见图1。其中，头胸连接处存活率最高，注射后第4天仍有90％以上的存活率，注射胸、腹部，死亡率非常高，第4天时几乎全部死亡，结果表明华北大黑鳃金龟进行RNA干扰时头胸连接处注射是对成虫影响最小的一种方式。
实施例2最佳注射体积的确定
1、实验对象：羽化2-3天的华北大黑鳃金龟成虫，360头，分3次重复。
2、实验方法：在确定最佳注射位置为头胸连接处后，未确定最佳注射体积，本发明使用三种剂量(2μL，5μL，10μL，15μL)的无RNA酶的水注射华北大黑鳃金龟3日龄成虫的位置I，自注射后连续4天统计生存率，结果如图2所示，通过死亡率统计可以看出，向华北大黑鳃金龟位置I注射10-15μL的无RNA酶的水后72h死亡率达到50％以上，远高于2-5μL注射量的死亡率。比较2μL和5μL在不同时间的死亡率发现，两组数据间并无显著差异(P<0.05，LSD)，单纯从死亡率作为参考，两者均可作为注射参考。但是，考虑到成本问题，同时，避免操作过程中由于操作不当或其他不可预知的原因造成注射过量而导致死亡率增高的结果，我们决定采用小剂量2μL的剂量进行注射。
实施例3注射特异dsRNA对华北大黑鳃金龟HoblOBP1基因表达量的影响
1、实验对象：羽化2-3天的华北大黑鳃金龟成虫，300头，分3次重复。
2、实验方法：采用上述注射法分别将HoblOBP1基因的dsRNA(dsHoblOBP1)和对照GFP基因的dsRNA(dsGFP)注射进华北大黑鳃金龟成虫，注射参数如下：注射浓度为1.0μg/μL的溶液，注射体积2μL，注射部位为华北大黑鳃金龟成虫的头胸连接处(位置标记I)。分别在注射24h、48h和96h后取样。提取华北大黑鳃金龟触角总RNA，反转录成cDNA，用荧光定量PCR检测基因表达量的差异。同时以位置I注射无RNA酶的水为对照进行处理。
以β-actin作为内参基因，引物和探针设计序列见表1；
表1 qPCR引物和探针序列(5′-3′)
HoblOBP1-F： ATTGTGGGAGATGATGGTG
HoblOBP1-R： CGGTTCTGCTTTATCCTTGT
β-actin-F： CTACCAGCCAAATCTAAACG
β-actin-R： GCTAACCGAGAAAAGATGAC
qPCR反应体系及反应条件如下：
qPCR反应体系：
反应程序为：95℃60s；95℃5s，60℃15s，40个循环。
根据荧光定量PCR结果(图3)，注射dsGFP与注射水的对照相比，华北大黑鳃金龟HoblOBP1的表达量无显著差异，但是注射dsHoblOBP1后，华北大黑鳃金龟HoblOBP1基因的基因相比注射水和dsGFP的对照，其表达量显著降低，在48h后表达量已经下降了70％以上。而且本方法3次生物学重复试验稳定，误差小，且干扰效率明显提高。
实施例4注射特异dsRNA对铜绿丽金龟AcorOBP1基因表达量的影响
1、实验对象：羽化2-3天的铜绿丽金龟成虫，300头，分3次重复。
2、实验方法：采用上述注射法分别将AcorOBP1基因的dsRNA(dsAcorOBP1)和对照GFP基因的dsRNA(dsGFP)注射进铜绿丽金龟成虫，注射参数如下：注射浓度为1.0μg/μL的溶液，注射体积2uL，注射部位为铜绿丽金龟成虫的头胸连接处(位置标记I)。分别在注射24h、48h和96h后取样。提取铜绿丽金龟触角总RNA，反转录成cDNA，用荧光定量PCR检测基因表达量的差异。同时以位置I注射无RNA酶的水为对照进行处理。
以GAPDH作为内参基因，引物和探针设计序列见表2；
表2 qPCR引物和探针序列(5′-3′)
AcorOBP1-F： TCGTTGGCGATGATGGTG
AcorOBP1-R： ACAGGGATTCGCTCCAGGT
GAPDH-F： GTGGTGCTGCCCAGAACATC
GAPDH-R： TTGGAACTGGTACACGGAATG
qPCR反应体系及反应条件如下：
qPCR反应体系：
反应程序为：94℃2min；94℃30s,60℃1min,40个循环。
根据荧光定量PCR结果(图4)，注射dsGFP与注射水的对照相比，AcorOBP1的表达量无显著差异，但是注射dsAcorOBP1后，铜绿丽金龟金龟AcorOBP1基因的基因表达量显著降低，在48h后表达量下降了65％以上。而且本方法3次生物学重复试验稳定，误差小，且干扰效率明显提高。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 鞘翅目金龟类昆虫RNA干扰的方法
<130> KHP181112009.3
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtcagaag aaatggaagc attagccaaa cagctgcacg acgattgcgt tgctcaaact 60
ggagttgacg aagcgcacat aagcacagtg aaagaccaga agggattccc ggacgatgaa 120
aagttcaagt gctacttaaa atgtttaatg accgaaatgg ccattgtggg agatgatggt 180
gtggtggacg ttgaagcggc cgtaggtgtt ctgccagacg aatacaagga taaagcagaa 240
ccgataatgc gaaaatgcgg agtaatacct ggtgccaatc catgtgacaa tgtttaccag 300
acacacaaat gctactacga tacggacgcc aagtcgtata tgatcgtata g 351
<210> 2
<211> 332
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcagaagaa atggaagaat tagccaaaca attacacaat gactgtgttg ctcaaacagg 60
agttgatgaa gctcatatta caactgtcaa ggatcaaaaa ggatttccgg atgatgaaaa 120
attcaaatgc tacttgaaat gtttgatgac tgaaatggcg atcgttggcg atgatggtgt 180
agtagacgta gaagctgctg tgggagtcct accagatgaa tataaagcga aagcagaacc 240
agtaataaga aaatgtggag tcaaacctgg agcgaatccc tgtgataatg tttatcaaac 300
ccataaatgt tattacgaca ctgatcccca gt 332
<210> 3
<211> 426
<212> DNA
<213> 华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)
<400> 3
atgagaagta acatcaaaat gtttaaaaac agtgcgttgt ttatattggg aataattctt 60
cctagcgtat tgtgtatgtc agaagaaatg gaagcattag ccaaacagct gcacgacgat 120
tgcgttgctc aaactggagt tgacgaagcg cacataagca cagtgaaaga ccagaaggga 180
ttcccggacg atgaaaagtt caagtgctac ttaaaatgtt taatgaccga aatggccatt 240
gtgggagatg atggtgtggt ggacgttgaa gcggccgtag gtgttctgcc agacgaatac 300
aaggataaag cagaaccgat aatgcgaaaa tgcggagtaa tacctggtgc caatccatgt 360
gacaatgttt accagacaca caaatgctac tacgatacgg acgccaagtc gtatatgatc 420
gtatag 426
<210> 4
<211> 405
<212> DNA
<213> 铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)
<400> 4
atgttaaaac tagttgtgtt gttaactttg ggaatatacg ttcctactgt tatgtgtatg 60
tcagaagaaa tggaagaatt agccaaacaa ttacacaatg actgtgttgc tcaaacagga 120
gttgatgaag ctcatattac aactgtcaag gatcaaaaag gatttccgga tgatgaaaaa 180
ttcaaatgct acttgaaatg tttgatgact gaaatggcga tcgttggcga tgatggtgta 240
gtagacgtag aagctgctgt gggagtccta ccagatgaat ataaagcgaa agcagaacca 300
gtaataagaa aatgtggagt caaacctgga gcgaatccct gtgataatgt ttatcaaacc 360
cataaatgtt attacgacac tgatccccag tcttacatga tagtg 405
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
attgtgggag atgatggtg 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cggttctgct ttatccttgt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctaccagcca aatctaaacg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctaaccgag aaaagatgac 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcgttggcga tgatggtg 18
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acagggattc gctccaggt 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtggtgctgc ccagaacatc 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttggaactgg tacacggaat g 21

Claims (10)

1.鞘翅目金龟类昆虫RNA干扰的方法，其特征在于，将特异dsRNA通过注射法导入金龟类昆虫成虫体内，所述dsRNA注射的部位为头胸连接处、胸腹连接处或腹部；其中，所述特异dsRNA靶向金龟类昆虫功能基因和/或生长发育相关基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特异dsRNA靶向金龟类昆虫的气味结合蛋白编码基因。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述dsRNA注射的部位为头胸连接处。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于注射的dsRNA浓度为1μg/μL，注射体积不少于2μL。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述金龟类昆虫包括华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟、铜绿丽金龟。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述特异dsRNA作用的靶向华北大黑鳃金龟HoblOBP1基因或靶向铜绿丽金龟AcorOBP1基因。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，靶向华北大黑鳃金龟HoblOBP1基因的特异dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，靶向铜绿丽金龟AcorOBP1基因的特异dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，注射后，持续饲养成虫，并利用荧光定量PCR分别检测华北大黑鳃金龟或铜绿丽金龟成虫体内HoblOBP1或AcorOBP1基因的表达量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，分别以β-actin和GADPH作为内参进行荧光定量PCR检测，所用引物序列如下：
CN201811161028.8A 2018-09-30 2018-09-30 鞘翅目金龟类昆虫rna干扰的方法 Pending CN109479899A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811161028.8A CN109479899A (zh) 2018-09-30 2018-09-30 鞘翅目金龟类昆虫rna干扰的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811161028.8A CN109479899A (zh) 2018-09-30 2018-09-30 鞘翅目金龟类昆虫rna干扰的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109479899A true CN109479899A (zh) 2019-03-19

Family

ID=65689436

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811161028.8A Pending CN109479899A (zh) 2018-09-30 2018-09-30 鞘翅目金龟类昆虫rna干扰的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109479899A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005005613A2 (en) * 2003-07-02 2005-01-20 Medical University Of South Carolina Dsrna induced specific and non-specific immunity in crustaceans and other invertebrates and biodelivery vehicles for use therein
CN102550594A (zh) * 2011-09-15 2012-07-11 华中农业大学 用RNAi有效防治昆虫及蜘蛛类有害生物的方法
CN103993079A (zh) * 2014-05-13 2014-08-20 中国农业科学院植物保护研究所 对绿盲蝽进行rna干扰的注射方法及其在基因筛选上的应用
CN104561006A (zh) * 2015-02-03 2015-04-29 东北林业大学 舞毒蛾CYP6AN15v1基因dsRNA及其在无公害防治中的应用
CN106350529A (zh) * 2016-08-31 2017-01-25 中国农业科学院植物保护研究所 绿盲蝽V‑ATPaseE基因及其在RNAi介导的害虫防治方面的应用
CN106636363A (zh) * 2016-11-16 2017-05-10 中国农业科学院植物保护研究所 利用特异性挥发物筛选昆虫相关嗅觉蛋白的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005005613A2 (en) * 2003-07-02 2005-01-20 Medical University Of South Carolina Dsrna induced specific and non-specific immunity in crustaceans and other invertebrates and biodelivery vehicles for use therein
CN102550594A (zh) * 2011-09-15 2012-07-11 华中农业大学 用RNAi有效防治昆虫及蜘蛛类有害生物的方法
CN103993079A (zh) * 2014-05-13 2014-08-20 中国农业科学院植物保护研究所 对绿盲蝽进行rna干扰的注射方法及其在基因筛选上的应用
CN104561006A (zh) * 2015-02-03 2015-04-29 东北林业大学 舞毒蛾CYP6AN15v1基因dsRNA及其在无公害防治中的应用
CN106350529A (zh) * 2016-08-31 2017-01-25 中国农业科学院植物保护研究所 绿盲蝽V‑ATPaseE基因及其在RNAi介导的害虫防治方面的应用
CN106636363A (zh) * 2016-11-16 2017-05-10 中国农业科学院植物保护研究所 利用特异性挥发物筛选昆虫相关嗅觉蛋白的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
蒋艳冬: "白背飞虱气味结合蛋白SfOBP11与寄主选择行为的相关性研究", 《应用昆虫学报》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Steeves et al. Transgenic soybeans expressing siRNAs specific to a major sperm protein gene suppress Heterodera glycines reproduction
CN103201385A (zh) 下调昆虫害虫中的基因表达
CN104610440B (zh) ABC转运蛋白基因ABCH1及其特异性dsRNA在小菜蛾防治和Bt抗性治理中的应用
CN103993079B (zh) 对绿盲蝽进行rna干扰的注射方法及其在基因筛选上的应用
CN104178490A (zh) 用于生物防控的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列及其载体和应用
CN106399483A (zh) 对绿盲蝽进行rna干扰的饲喂方法及其在基因筛选上的应用
CN104561006A (zh) 舞毒蛾CYP6AN15v1基因dsRNA及其在无公害防治中的应用
WO2015070765A1 (zh) 一种通过灌溉防治害虫的RNAi技术及其应用
CN113774065A (zh) 美国白蛾不同性别成虫荧光定量内参基因及其引物和应用
CN105543224A (zh) 用于控制昆虫侵袭的核苷酸序列及其方法
CN104561055B (zh) 一种朱砂叶螨细胞色素p450基因及其应用
CN109479899A (zh) 鞘翅目金龟类昆虫rna干扰的方法
CN115806996A (zh) 番茄潜叶蛾蜕皮素激素受体EcR基因及其在防控番茄潜叶蛾中的应用
CN110373417A (zh) 棉花GhMADS41-A04基因在促进植物开花中的应用
CN106367428A (zh) 一种绿盲蝽V‑ATPase‑D基因cDNA及其应用
CN110295169A (zh) 一种miRNA及其用于杀灭褐飞虱的应用
CN110951730B (zh) 青翅蚁形隐翅甲V-ATPase-A基因的dsRNA及其人工饲料和应用
CN104293809B (zh) 一种羧酸酯酶基因dsRNA及其在防治麦长管蚜中的应用
CN105838727A (zh) 用于控制昆虫侵袭的核苷酸序列及其方法
CN106318956A (zh) 一种绿盲蝽V‑ATPase‑A基因cDNA及其应用
CN108753791A (zh) 绿盲蝽decapentaplegic基因及其RNAi在害虫防控中的应用
CN104263731A (zh) 一种蚜虫共生菌基因的dsRNA及其在降低蚜虫存活率中的应用
CN110511936A (zh) 茄二十八星瓢虫生长发育相关基因chs1及其应用
CN110511937A (zh) Snf7基因及其防治瓢虫的应用
CN110669768B (zh) 一种防治酸浆瓢虫的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190319