KR20210155534A - Tsg6 억제제를 포함하는 전이성 고형암 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 TSG6 shRNA의 전이성 고형암 치료제 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명은 TSG6 mRNA 발현을 억제하는 유전자 치료를 통해 전이성 암세포의 증식, 이동성 및 침습성을 감소시킴으로써 특히 암에서 과발현되는 것으로 알려진 PLK1과 그 활성형 또는 TGF-beta/Smad 신호전달에 의하여 전이가 일어나는 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

TSG6 억제제를 포함하는 전이성 고형암 치료용 조성물{Composition for treating metastatic solid cancer comprising TSG6 inhibitor}

본 발명은 TSG6 억제제를 포함하는 전이성 고형암 치료용 조성물에 관한 것이다.

항염증 반응은 암에서 면역반응을 억제하고 세포의 성장을 촉진, 전이를 유도하는 것으로 알려져 있다. 염증 반응의 사이토카인(Cytokine)로 알려진 TNF-α(Tumor necrosis factor-α)는 대식세포(Macrophage), T-세포(Helper T cell), NK세포(Natural killer cell)에 주로 분비되며, 정상적인 TNF-α의 분비는 세포 사멸(apoptosis)를 유도하고 종양생성을 억제한다. TSG6(Tumor necrosis factor-inducible gene 6 protein)는 이러한 TNF-α에 의하여 유도되는 항염증 단백질로서 TNF-α의 자극을 저해하여 서로의 신호 체계를 조절한다.

항염증 인자 TSG6는 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stromal cells, MSCs)에서 주로 발현되며, T-세포 기능을 억제하고 세포의 증식을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 또한 TSG6는 히알우론산과 결합하며 세포외 기질(Extracellular matrix) 안정화에 관여하고 세포의 이동을 유도한다. 뿐만 아니라 TSG6은 간엽세포 마커로 알려진 피브로넥틴(Fibronectin)과 같은 기질 연관 분자와 집적적으로도 결합하여 세포의 이동을 촉진하는 것으로 보고되었다. 최근 TSG6는 관절염에서의 연골 보호, 안구건조, 망막 이식술이나 신장, 간 등의 장기 이식에 있어서 면역 반응을 감소하여 이식한 장기가 안정화되도록 돕는 것으로 연구되고 있다.

Polo-like kinase 1(PLK1)은 최근 발암의 원인 및 전이의 원인이 되는 표적 분자로 연구되고 있으며, 이를 기반으로 PLK1에 대한 억제제 개발을 통한 항암제 개발 연구가 다방면으로 진행되고 있다. PLK1은 세린 트레오닌 인산화 효소로써, 활성화된 PLK1 형태가 기질과 폴로박스 도메인 결합에 의해 기질의 Ser/Thr 잔기에 인산화를 유도하는 효소이다.

기능적으로는 성장 및 분열하는 세포에서 발현이 증가되는데 특히 세포주기 중 세포분열기에서의 발현과 활성이 정점을 이루고 있다. 따라서 빠르게 성장하는 암세포에서 또한 그 발현율이 높은 것으로 알려져 있으며, TGF-β 신호전달을 활성화시켜 암의 전이를 촉진시키는 것을 본 발명팀에서 발견하였다.

암 전이는 암의 진행의 결과로 나타나는 현상이나, 실질적으로 원발소 암을 제거 또는 치료한다고 하더라도, 전이를 막을 수 없다면 암의 재발 등에 의해서 생존률이 매우 낮아진다. 암의 크기가 커질수록 주변 림프절 및 다른 조직으로 전이하는 비율이 높은 것으로 여겨지나, 암의 크기가 작음에도 불구하고 전이가 되는 경우가 있어, 아직까지 암의 전이와 증식의 관계는 여전히 명확하게 규명되어 있지 않다. 암의 치료에 있어, 암 세포의 증식 억제와 전이의 억제가 항상 같이 나타나는 효과가 아니고, 암의 전이를 억제할 수 있다면 많은 암의 치료 효율을 비약적으로 개선할 수 있다는 측면에서, 전이성 암의 치료를 위한 암의 전이 및 침윤을 효과적으로 억제하는 치료 표적 또는 치료제의 개발이 필요하다.

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본 발명의 목적은 TSG6 발현을 억제하는 유전자 치료를 기반으로 하여 전이성 고형암을 치료하는 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 2의 염기서열을 표적으로 하는 TSG6(Tumor necrosis factor-inducible gene 6 protein) 억제제를 포함하는 전이성 고형암 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 전이성 고형암 치료용 의약을 제조하기 위한 SEQ ID NO: 1 또는 2의 염기서열을 표적으로 하는 TSG6 억제제의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 치료적 유효량의 SEQ ID NO: 1 또는 2의 염기서열을 표적으로 하는 TSG6 억제제를 포함하는 전이성 고형암 치료용 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 전이성 고형암의 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 TSG6 발현을 억제하는 유전자 치료를 통해 전이성 암세포의 증식, 이동성 및 침습성을 감소시킴으로써 특히 암에서 과발현되는 것으로 알려진 PLK1과 그 활성형 또는 TGF-beta/Smad 신호전달에 의하여 전이가 일어나는 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 PLK1의 원형 또는 활성형을 발현하는 침습성 암세포에서 TSG6의 발현이 증가를 분석한 결과로,
A는 PLK1의 원형 또는 활성형을 발현하는 침습성 암세포를 이용한 마이크로어레이 분석 결과를 토대로 활성형 PLK1이 발현된 암세포에서 높아지는 유전자를 순서대로 나열한 그래프이고,
B는 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 이용하여 원형 또는 활성형 PLK1에서의 mRNA 분석결과 그래프이다. 양성대조군으로 상피간엽이행을 유도하는 것으로 알려진 TGF-β를 처리하여 진행하였다.
도 2는 폐암세포에 TSG6를 처리하였을 때 TSG6, PLK1 활성형(TD-PLK1), PLK1, 인산화된 Smad2, Smad2/3, 상피간엽이행 마커(E-cadherin, N-cadherin), CD44의 단백질 발현 변화 및 mRNA 발현 변화를 관찰한 결과이다. 더불어 PLK1의 활성형(TD-PLK1)을 발현시킨 암세포에 TSG6를 처리하였을 때의 암세포 이동성을 관찰하였고, 전이유도물질 TGF-β가 처리된 환경에서 TSG6를 처리하였을 때의 암세포 이동성 변화를 관찰한 결과이다.
A는 히트맵을 그릴 수 있는 Morpheus 프로그램(https://software. broadinstitute.org/morpheus/)을 이용하여 암환자의 일반 조직과 암 조직(Tumor stage 1), 전이 가능성이 있는 암 조직(Tumor stage 2-4)에서의 TNFAIP6 발현에 따른 유전자 발현 양상을 분석한 결과이고,
B는 폐암세포에 TSG6를 처리하였을 때 TSG6, PLK1 활성형(TD-PLK1), PLK1, 상피간엽이행 마커(E-cadherin, N-cadherin) 및 CD44 단백질의 발현 변화와 더불어 TGF-β 신호전달경로의 주된 단백질인 Smad2/3, 인산화되어 활성화된 Smad2의 발현 변화를 보여주는 결과이다.
C는 폐암세포에 TSG6를 처리하였을 때 상피간엽이행 마커(epithelial marker, CDH1; mesenchymal marker, CDH2), TGFB1, PLK1 mRNA 발현 양상을 보여주는 그래프이고,
D는 PLK1 활성형(TD-PLK1)에 의해 유도되는 암세포 이동성이 TSG6를 처리에 의해 더욱 증가되는 양상을 보여주는 그래프이다.
E는 전이유도물질 TGF-β 처리에 의해 유도되는 암세포 이동성이 TSG6를 처리에 의해 더욱 증가되는 양상을 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 활성형 PLK1 발현 암세포에서 TSG6 mRNA 발현 억제물질인 TSG6 shRNA 처리에 의한 암세포의 전이성 억제 효과를 확인한 결과로,
A는 표적 서열에 따른 TSG6 shRNA의 TSG6 발현 억제 정도를 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 이용하여 측정한 그래프이고,
B는 활성형 PLK1이 발현된 전이환경에서 TSG6의 shRNA 처리에 의한 암세포사멸을 cleaved caspase-3, cleaved PARP의 항체를 이용하여 면역블롯법으로 관찰한 결과이며,
C는 활성형 PLK1이 발현된 전이환경에서 TSG6의 shRNA 처리에 의한 상피간엽이행 마커와 TGF-β 신호전달경로의 주된 단백질인 Smad2/3, 활성화된 p-Smad2의 단백질 발현 변화를 면역블롯법으로 관찰한 결과이고,
D는 활성형 PLK1이 발현된 전이환경에서 TSG6의 shRNA 처리에 의한 mRNA수준의 상피간엽이행 마커 변화를 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 통해 관찰한 결과이며,
E는 인서트(Insert)를 이용한 세포 이동성 분석실험에서 대조군 벡터(pLKO-puro1.)에 바이러스를 감염시킨 세포의 이동 정도를 1 이라고 할 때, 실험군에서의 이동성 정도를 상대적 비율로 나타낸 그래프이고,
F는 마트리겔(Matrigel)을 이용한 침습성 실험에서 대조군 벡터에 pLKO-Puro 바이러스를 감염시킨 세포의 침습 정도를 1 이라고 할 때, 다른 실험군에의 침습 정도를 상대적 비율로 나타낸 그래프이다.
도 4는 전이를 유도하는 것으로 알려진 TGF-β를 처리한 환경에서 TSG6 mRNA 발현 억제 물질인 TSG6 shRNA 처리하였을 때의 상피간엽이행 마커 변화 및 암의 이동성, 침습성의 변화를 관찰한 결과로,
A는 TGF-β 처리에 의해 유도되는 암세포 전이를 TSG6 mRNA 발현 억제 물질인 TSG6 shRNA 처리하였을 때의 상피간엽이행 마커(CDH1, CDH2) 및 PLK1, TGF-β, CD44의 mRNA 발현 양상을 보여주는 그래프이고,
B는 TSG6 shRNA 처리에 의해 TGF-β 처리에 의해 유도한 암세포 이동성이 감소되는 양상을 보여주는 그래프이며,
C는 TSG6 shRNA 처리에 의해 TGF-β 처리에 의해 유도한 암세포 침습성이 감소되는 양상을 보여주는 그래프이다.
도 5는 TSG6(TNF-a stimulated gene 6, Human TSG6 mRNA [NM_007115.4])의 유전자 서열을 도시한다(SEQ ID NO: 7).

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 2의 염기서열을 표적으로 하는 TSG6 억제제를 포함하는 전이성 고형암 치료용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 전이성 고형암 치료용 의약을 제조하기 위한 SEQ ID NO: 1 또는 2의 염기서열을 표적으로 하는 TSG6 억제제의 용도를 제공한다.

상기 TSG6는 TNF-α 자극을 저해함으로써 T-세포 기능을 억제하고 세포의 증식을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 또한, 히알우론산과 결합하며 세포외 기질 안정화에 관여하고 세포의 이동을 유도하며, 간엽세포 마커로 알려진 피브로넥틴과 같은 기질 연관 분자와 집적적으로도 결합하여 세포의 이동을 촉진하는 것으로 보고되었다. 그러나, TSG6의 발현 억제가 암세포의 전이성을 감소시키는 용도에 대해서는 밝혀진 바 없다. 본 발명자들은 TSG6의 mRNA 및/또는 단백질의 발현을 억제하여 이에 따른 암세포의 전이, 이동 및 침습을 개선 또는 치료할 수 있음을 새롭게 밝혔다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, TSG6 mRNA의 발현을 억제하는 shRNA를 이용하여 상기 mRNA의 발현을 억제하는 경우, 암세포의 이동성과 침습성을 감소시키는 것을 확인함으로써 TSG6가 전이암 치료 표적으로 적합함을 확인하였다.

본 발명에서 "TSG6 억제제"는 TSG6 mRNA 또는 TSG6 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 모두 통칭하며, 구체적으로는 TSG6의 발현을 전사 수준에서 방해하여 TSG6의 발현을 감소시키는 모든 제제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 "TSG6"는 별도의 언급이 없는 한 TSG6 mRNA와 단백질을 모두 지칭하는 것으로 해석될 수 있다. 바람직하게는, SEQ ID NO: 7(Human TSG6 mRNA [NM_007115.4])의 530-550의 염기서열(SEQ ID NO: 1) 및 693-713의 염기서열(SEQ ID NO: 2)을 표적으로 하고, 상기 서열에 상보적으로 결합하여 TSG6 mRNA 발현을 억제하는 것일 수 있다.

상기 TSG6 mRNA의 발현을 억제하는 억제제는 상기 표적 서열에 특이적으로 결합하는 siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 앱타머 중 어느 하나일 수 있다.

본 발명에서 용어, "siRNA" 및 "shRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용된다. shRNA는 단일 가닥의 올리고 뉴클레오티드 내에서 상보적인 서열간의 결합에 의해 헤어핀(hairpin) 구조를 형성한 것이고, 생체 내에서 상기 shRNA는 다이서(dicer)에 의해 절단되면서 8 내지 30 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 이중 가닥의 올리고 뉴클레오티드인 siRNA가 되며, 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제할 수 있다. 따라서, shRNA 및 siRNA 중 어느 수단을 이용할지는 당업자의 선택에 의해 결정될 수 있으며 이들이 표적으로 하는 mRNA 서열이 동일한 경우라면 유사한 발현 감소 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 목적상 TSG6에 특이적으로 작용하여 TSG6 mRNA 분자를 절단하여 RNA 간섭(RNAi, RNA interference) 현상을 유도함으로써, 상기 TSG6을 억제할 수 있다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내(in vitro) 전사를 이용한 siRNA의 합성법, 시험관 내(in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중 가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법, shRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포 내 전달을 통한 발현법 및 PCR(polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트(cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

특히, 본 발명의 TSG6에 대한 siRNA, shRNA는 센스 뉴클레오티드와 이와 상보적인 서열의 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 상기 센스와 안티센스 뉴클레오티드 사이에 루프 서열을 포함하는 것 일 수 있다. 구체적인 예로, 본 발명의 TSG6에 대한 siRNA 또는 shRNA는 SEQ ID NO: 3 및 4의 센스 및 안티센스 뉴클레오티드를 포함하거나, SEQ ID NO: 5 및 6의 센스 및 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 이들 서열 사이에는 SEQ ID NO: 12의 루프 서열을 가질 수 있다.

본 발명에서 "miRNA(micro RNA)"는 세포 내에서 자연적으로 존재하는 물질로, RNAi 현상을 유도하여 특정한 유전자의 조절에 관여하는 물질을 의미한다. 본 발명의 TSG6의 발현 또는 작용을 억제할 수 있는 miRNA 라면 그 종류에 한정되지 않고 본 발명에 포함된다.

본 발명에서 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특성 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하고 있는 DNA, RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 2의 TSG6 표적 서열에 상보적이고, 상기 서열에 결합할 수 있는 DAN 또는 RNA 서열을 의미한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 5 내지 100 염기, 또는 8 내지 60 염기, 또는 10 내지 40 염기, 또는 10 내지 30 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여되거나, 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성된 형태로 투여될 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 본 발명의 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 생물/화학적인 방법에 의하여 합성될 수 있다. 또한, 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 하는 형태는 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 발현시키는 재조합벡터 등을 이용하여 실현할 수 있고, 이러한 방법은 본 발명의 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 디자인은 SEQ ID NO: 1 또는 2의 염기서열을 참조하여, 본 발명의 기술분야에서 공지된 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.

본 발명에서 "앱타머(aptamer)"는 단일가닥 올리고뉴클레오티드로, 20 내지 60 뉴클레오티드 정도의 크기이며, 소정의 표적에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가지며, 항원-항체 반응처럼 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적에 결합함으로써, 소정의 표적의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 또한 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 바람직하게 상기 앱타머는 TSG6 mRNA에 결합하여 TSG6의 발현 또는 활성을 저해하는 역할을 할 수 있다. 이와 같은 앱타머는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 TSG6 표적 서열로부터 당업자가 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역 글로불린 분자를 포함하는 단백질 분자로, 체내에 특정 항원이 침입한 경우 이를 특이적으로 인식하여 반응하는 항원 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 말한다. 하나의 항체 분자는 두 개의 중쇄(heavy chain) 및 두 개의 경쇄(light chain)로 구성되어 있으며, 이들 각각의 중쇄 및 경쇄는 가변 영역과 고정 영역을 포함한다. 상기 가변 영역은 3개의 상보성 결정 부위(Complementarity Cetermining Region: CDR) 및 4개의 구조 형성 부위(Framework Region; FR)를 포함하며, 상기 상보성 결정 부위들에 의해 항체와 항원 사이의 결합 부위가 형성되어 특정 항원에 대한 항체의 결합 특이성이 생성될 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 항체는 TSG6 단백질의 활성을 억제하는 항체라면 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들어, 다클론 항체, 단일클론 항체 또는 항체 단편 등을 모두 포함할 수 있다. 또한, 키메라성 항체 또는 이종 결합 항체 등과 같이 유전 공학적으로 제작된 항체들도 모두 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, TSG6 shRNA에 의한 암세포의 이동성 및 침습성 억제효과는 TSG6의 발현 또는 작용을 억제함으로써 전이 또는 침습을 억제하는 것을 확인하였는바, 본 발명의 TSG6 억제제가 항암제로 사용되는 경우 전이성 암에서 전이 및 침습을 억제하는 효과를 가짐을 알 수 있다.

본 발명에서 "암"은 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 세포 사멸 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 일컫는다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내의 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 되는데, 이러한 상태를 암이라고 한다. 일반적으로 종양(tumor)이라 하면 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자란 덩어리를 의미하며, 양성 종양(benign tumor)과 악성 종양(malignant tumor)으로 구분할 수 있다. 악성 종양은 양성 종양에 비해 성장속도가 매우 빠르고, 암의 진행에 1차 암과 주변 조직에 침윤하면서 전이(metastasis)가 일어나는 전이성(침습성) 암으로 구분할 수 있다. 이러한 악성 종양을 통상적으로 '암(cancer)'이라 한다.

본 발명의 조성물은 암의 증식을 억제할 뿐 아니라, 다른 조직으로 전이되는 전이성 암으로 발달된 경우에도 암세포의 전이성을 억제하는 효과를 가진다는 점에서, 본 발명은 전이성 암의 치료용 약학적 조성물일 수 있다. 또한, 본 발명의 유효성분은 TSG6의 발현 또는 작용을 억제함으로써 암의 증식, 전이 또는 침습을 억제한다는 점에서 TSG6 과발현이 나타나는 암, 또는 PLK1 과발현이 나타나는 고형암 또는 전이성 고형암의 치료용 조성물일 수 있다.

상기 암은 고형암일 수 있고, 구체적인 암의 종류로는 뇌종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 중프종, 식도암, 췌암, 대장암, 간암, 위암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 대장암, 림프종, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암을 포함하나, 상기 예들에 의해 본 발명의 암의 종류가 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 "대상체"는 암 질환을 보유하거나 또는 발병한, 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 전이성 고형암 치료용 조성물을 개체에 투여함으로써, 간암, 폐암 등을 비롯한 암을 완화 또는 치료할 수 있다. 상기 완화는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암 질환이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 용어, "치료"는 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 것을 지칭하고, 이는 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 바람직하게 본 발명에서는 TSG6을 억제하는 조성물의 투여로 암의 경과를 호전시키는 모든 행위를 포함한다.

본 발명의 전이성 고형암 치료용 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 치료를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

또한, 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 선택하는 것이 바람직하며, 본 발명의 전이성 고형암의 감소 효과를 나타내는 항암용 조성물은 성인의 체중 1㎏ 당 0.01 내지 100 ㎎, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎의 투여양으로 매일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구로 투여할 경우, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 비경구 투여용으로 제제화하기 위해서는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조할 수 있고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 투여용 약제학적 활성 화합물을 제형화할 경우에 유용하고 사용 조건하에 사실상 비독성 및 비민감성인 공지된 약제학적 부형제를 의미한다. 이러한 부형제의 정확한 비율은 유효성분의 용해도와 화학적 특성, 선택된 투여경로뿐만 아니라, 표준 약제학적 관행에 의해 결정된다.

약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다. 또한, 당해 기술분야의 적정한 방법 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 게재되어 있는 방법 등을 이용하여 각 질환 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명은 또한 치료적 유효량의 SEQ ID NO: 1 또는 2의 염기서열을 표적으로 하는 TSG6 억제제를 포함하는 전이성 고형암 치료용 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 전이성 고형암의 치료 방법을 제공한다.

상기 대상체는 인간 또는 인간 이외의 생물, 예를 들면 소, 원숭이, 새, 고양이, 마우스, 랫트, 햄스터, 돼지, 개, 토끼, 양, 말 등의 비인간 동물일 수 있다.

본 발명의 치료 방법에서, 상기 조성물의 제형, 투여 방식 등은 상술한 바와 같다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 전이능을 가진 PLK1 원형 및 활성형 발현 세포에서 TSG6 발현 분석

PLK1 원형 또는 활성형 단백질을 발현시키는 폐암세포 A549를 전이 능력의 하나인 침습성을 갖도록 마트리겔(matrigel)을 통과시켜 수취하고 비침습성 세포, 침습성 세포의 mRNA를 얻어 마이크로어레이 분석을 진행하였다.

구체적으로, 4℃에서 16~20시간동안 마트리겔을 완전히 녹인 후 마트리겔을 1 mg/mL이 되도록 차가운 무혈청 MEM(4℃)으로 희석하였다. 이를 8.0 mm 6-웰 인서트(insert)에 1 mL의 마트리겔 혼합물(1 mg/mL)을 넣고 37℃ 배양기에서 12-20시간 동안 굳혀주었다. 굳은 마트리겔 인서트에 PLK1 원형(WT), 활성형 PLK1(TD) 단백질을 발현시키는 폐암세포 A549들을 2X10⁵ cells/well의 세포수로 무혈청 MEM(36℃)에 희석하여 인서트에 분주하였다. 여기에 36℃의 따뜻한 MEM(10% FBS 포함)을 0.5 mL/well씩 분주하였다. 이 후 3일에 한 번씩 배지를 교환해주고 침습되는 정도를 관찰하였으며, 암세포의 침습이 충분히 일어난 것으로 관찰된 5일 차에 배지를 제거하고 1XPBS로 세척한 후, 인서트 안쪽의 세포들을 면봉으로 긁어내어 인서트 내부에 세포와 마트리겔의 잔여물이 남지 않도록 제거하였다. 인서트 바깥 면에 붙어있는 침습성 세포를 떼어 내기 위하여 6-웰 플레이트에 3 mL의 트립신을 분주하고 인서트를 넣은 상태에서 36℃ 인큐베이터에 5분간 두었다. 5분 후 인서트에 붙어있는 세포를 피펫으로 떼어 내어주고 6-웰 플레이트에 떨어진 침습성 세포까지 취하여 1000 rpm, 5분간 원심분리하여 세포를 취하였다. 수취한 세포에 트리졸(trizole)을 분주하여 세포를 충분히 녹여준 뒤, 클로로포름을 분주하고 상온에서 10분간 반응시켰다. 14000 rpm, 4℃, 10분간 원심분리하여 유기층을 제거하고 수층을 새로운 1.5 mL-튜브에 옮겨 담았다. 이소프로판올을 분주하고 14000 rpm, 4℃, 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음, DEPC에 녹여진 75% 에탄올을 이용하여 가라앉은 RNA를 세척하였다. 14000 rpm, 4℃, 10분간 원심분리하고 상층액 제거 후, 무균작업대에서 RNA를 말려주었다. 말려진 RNA는 멸균된 증류수에 녹여 보관하였다. 얻어진 RNA는 마이크로어레이 분석팀에 의뢰하였다.

마이크로어레이를 통하여 얻어진 유전자 발현 데이터를 이용하여 침습성을 가진 활성형 PLK1 발현 세포가 가장 많이 발현시키고 있는 상위 유전자 5개를 확인하였고 마이크로칩이 아닌 Real-time PCR을 이용하여 활성형 PLK1 발현 세포에서 TNFAIP6(TSG6 단백질의 유전자명)의 발현 증가를 관찰하였다.

도 1A의 마이크로어레이 결과에서, 침습성을 가진 PLK1 원형 또는 활성형 단백질을 발현시키는 폐암세포 A549에서 TNFAIP6의 유전자 발현이 증가되었고 특히, 활성형 PLK1이 발현되는 침습성 세포에서 대조군보다 6.6배 높은 발현으로 가장 높게 분석되었다. 도 1B의 Real-time PCR 결과에서도 PLK1 활성형 발현세포에서 TNFAIP6(TSG6)가 증가됨을 관찰하였고 상피간엽이행을 유도하는 TGF-β 처리군에서도 TNFAIP6(TSG6)가 증가되었다.

따라서, 전이를 유도하는 것으로 알려진 PLK1 활성형 발현과 TGF-β 처리 환경에서 항염증인자 TSG6가 증가하므로 TSG6가 전이암에서의 치료 표적이 될 수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 2> TSG6의 발현에 따른 전이 효과 평가

상기 결과를 통해 폐암세포에 TSG6를 처리하여 세포내의 TSG6, PLK1, 활성형 PLK1의 발현과 상피간엽이행 마커 및 암전이 관련 인자의 발현에 미치는 변화를 관찰하여 TSG6가 상피간엽이행에 미치는 효과를 분석하고자 하였다. 또한, 암의 이동성과 침습성에 미치는 영향을 관찰하기 위해서 세포 이동성 실험(migration assay)과 세포 침습성 실험(invasion assay)을 각각 진행하여 TSG6가 암전이에 미치는 효과를 분석하였다.

먼저, TNFAIP6의 발현이 폐암환자의 일반조직과 단계에 따른 암조직에서 전이에 관여하는 면역회피(Immune evasion), 암줄기세포(Cancer stem cell, CSC), 간엽마커(Mesenchymal marker)에 포함되는 유전자 발현 양상을 Morpheus 프로그램 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 구체적으로, Morpheus(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)을 가지고 있는 TCGA 빅데이터를 이용하여 폐암환자의 일반조직과 Stage 1 암 조직, 전이가 유도될 가능성이 있는 Stage 2-4 암 조직으로 구별하였다. 다음으로 면역회피(Immune evasion)에 포함되는 유전자; CD274, CD28, CD80, CD86, CD8A, CD8B, CTLA4, CXCR4, PDCD1, PDCD1LG2와 암줄기세포(Cancer stem cell, CSC)에 포함되는 유전자; CD44, THY1, PROM1, ALDH1A3, PLAUR, BMI1, CD33, ABCG2, 그리고 간엽마커(Mesenchymal marker)에 해당하는 유전자; VIM, CDH2, ZEB1, ZEB2, SNAI1, SNAI2, TWIST1, TWIST2, FN1, MMP2, MMP3, MMP9, PLK1를 검색하여 나열하고 TNFAIP6의 발현 순으로 정리한 다음 히트맵으로 표현하였다.

도 2A에 나타난 바와 같이, 전이가 유도될 가능성이 있는 Stage 2-4 암 조직은 일반 조직에 비하여 TNFAIP6의 발현이 높을수록 전이에 관여하는 면역회피(Immune evasion), 암줄기세포(Cancer stem cell, CSC), 간엽마커(Mesenchymal marker)에 포함되는 유전자 발현 양상 또한 높아져 있어 TNFAIP6 발현 증가에 따른 전이 가능성을 관찰할 수 있었다.

다음으로, 세포상 실험에서 TSG6 처리에 의한 상피간엽이행을 관찰하고자 폐암세포 A549를 5X10⁴ cells/mL으로 배양한 후, 다음 날 200 ng/mL TSG6를 2시간 동안 처리하고 세포를 수취하였다. 수취한 세포는 100 ㎕의 분쇄 용액(0.5% Triton X-100, 20 mM Tris, pH 7.5, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM beta-glycerophosphate, 25 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄, 2 ㎍/mL leupeptin, 2 ㎍/mL pepstatin A, 100 ㎍/mL PMSF, 1 ㎍/mL antipain)을 처리한 후 단백질 정량하였다. 정량한 단백질을 SDS-PAGE를 통해 전기영동시킨 후 각각의 상피간엽이행 마커 항체를 이용하여 면역블랏을 수행하여 단백질 발현 수준에서 상피간엽이행 과정의 관련 인자들의 발현을 확인하였다.

도 2B에 나타낸 바와 같이, TSG6 처리에 의해서 세포내의 TSG6 발현이 증가됨을 관찰하였고, 활성형 PLK1도 대조군에 비하여 발현이 증가되는 것을 관찰하였다. 또한, TSG6 처리에 의해서 간엽이행 마커인 N-cadherin 증가와 상피마커인 E-cadherin 감소를 관찰하였고, TGF-β 신호전달경로의 주된 단백질인 인산화된 Smad2(S465/467)의 발현 증가를 관찰하였다.

다음으로, TSG6의 처리에 따른 상피간엽이행 증가를 평가하기 위해 TSG6 처리 후 상피간엽이행 마커와 관련 인자를 mRNA 수준에서 관찰하였다. 구체적으로, A549 세포를 5X10⁴ cells/mL로 배양한 후, 다음 날 200 ng/mL TSG6를 2시간 동안 처리하고 세포를 수취하였다. 수취한 세포에서 mRNA를 분리하고 cDNA를 합성하여 Real-time PCR을 수행하였고, mRNA 수준에서의 상피간엽이행 마커 및 관련 인자들을 관찰함으로써 TSG6 처리가 상피간엽이행 과정을 증가시킨다는 것을 확인하였다.

도 2C에서 보여주는 바와 같이, TSG6가 처리된 세포는 대조군 세포보다 CDH2와 같은 간엽이행 마커가 증가하였으며, 상피 마커인 CDH1은 감소하였다. 또한, TGFB1과 PLK1의 발현도 TSG6 처리에 의해 증가하였음을 관찰하였다.

또한, TSG6가 활성형 PLK1이 발현되는 전이환경에서 세포 이동성 분석법을 이용하여 세포의 이동성을 억제하는 효과를 증명하였다. 구체적으로, 대조군 세포(Mock)와 활성형 PLK1을 발현하는 세포(PLK1-TD)를 24 칸용 인서트에 5X10⁴ cells/well의 세포수로 무혈청 MEM(36℃)에 희석하여 인서트에 분주하였다. 인서트 밖의 24칸 플레이트에는 혈청을 첨가한 MEM(10% FBS)을 0.5 mL/well씩 분주하였다. 200 ng/mL TSG6를 처리하는 실험군은 혈청이 포함된 MEM에 넣어서 세포에 TSG6를 처리하였다. TSG6 처리 48시간 후에 이동한 세포에 4% 파라포름알데히드(para-formaldehyde) 500 ㎕를 분주하여 고정시키고, 1XPBS로 3회 세척하여 0.05% crystal-violet 용액으로 5분간 염색하였다. 5분 후 1XPBS로 5회 세척하였고, 염색된 정도를 590 nm 파장에서 측정하였다. 대조군의 흡광도를 1이라고 할 때 각 실험군에서의 상대적 흡광도를 산출하여 그래프를 표시하였다.

도 2D에 나타난 바와 같이, TSG6를 처리한 세포는 대조군 세포(Mock)보다 세포의 이동성이 증가하였고, 활성형 PLK1가 발현되는 활성형 PLK1(PLK1-TD)는 TSG6 처리에 의해 세포의 이동성이 2배 이상 더 증가하였다.

다음으로, TGF-β 처리에 의해 유도된 전이환경에서 TSG6 처리가 세포의 이동성을 더욱 증가하는 효과를 세포 이동성 분석법을 이용하여 증명하였다. 구체적으로 폐암세포 A549를 무혈청 배지에 희석하여 5X10⁴ 개의 세포를 8.0 ㎛, 24 웰 인서트(BD Biosciences, NJ, USA)에 분주하고 24 칸 플레이트에 10% 혈청이 포함된 배지(MEM)를 분주한 뒤 인서트를 넣어 주었다. 2.5 ng/mL TGF-β 또는 200 ng/mL TSG6를 처리하는 각각의 실험군과 TGF-β나 TSG6 둘 다 혼합 처리하는 실험군은 혈청이 포함된 배지(MEM)에 넣어 세포에 처리하였다. TSG6 또는 TGF-β 처리 48시간 후에 4% 파라포름알데히드 500 ㎕를 분주하여 이동한 세포를 고정하고, 1XPBS로 3회 세척하여 0.05% crystal-violet 용액으로 5분간 염색하였다. 5분 후 1XPBS로 5회 세척하였고, 염색된 정도를 590 nm 파장에서 측정하였다. 대조군의 흡광도를 1이라고 할 때 각 실험군에서의 상대적 흡광도를 산출하여 그래프를 표시하였다.

도 2E에 나타난 바와 같이, TGF-β가 처리된 전이환경에서 TSG6를 처리한 세포는 TSG6 처리에 의해 세포의 이동성이 더욱더 증가하였음을 관찰하였다.

도 2의 결과를 종합하였을 때, TSG6 처리에 의한 세포내의 TSG6 증가가 세포의 상피간엽이행에 관여하는 인자들의 발현을 증가시켰음을 알 수 있었다. 또한, 활성형 PLK1가 발현된 전이환경과 TGF-β 처리에 의한 전이환경에서도 TSG6 처리는 세포의 이동성을 더욱 증가시켰음을 증명하였다.

<실시예 3> TSG6 shRNA의 암세포사멸 효과 평가 및 PLK1 활성형 발현에 의한 전이환경에서 TSG6 shRNA의 상피간엽이행 억제 효과 평가

TSG6의 mRNA 발현 억제 효과를 확인하기 위해서, shRNA 및 이를 포함하는 렌티바이러스를 제작하였다. 구체적으로, TSG6의 mRNA 발현을 억제하기 위하여 사람의 TSG6 mRNA(Human TNFAIP6 mRNA [NM_007115.4])서열 중 530-550 또는 693-713 위치의 뉴클레오티드 서열을 표적으로 하는 shRNA를 만들고자 프라이머를 제작하였다. 530-550 뉴클레오티드 표적 서열(SEQ ID NO: 1)의 센스 부위(sense region)로는 5'-CAAATGAGTACGAAGATAACC-3'(SEQ ID NO: 3)를, 안티센스 부위(antisense region)로는 5'-GGTTATCTTCGTACTCATTTG-3'(SEQ ID NO: 4) 부위를 이용하여 이를 기반으로 pLKO-puro.1 벡터를 이용한 pLKO-puro.1-TNFAIP6 플라스미드를 제작하였다. 정방향 프라이머로 5'-CCGGCAAATGAGTACGAAGATAACCCTCGAGGGTTATCTTCGTACTCATTTGTTTTTG-3'(SEQ ID NO: 8)를 사용하였고, 역방향 프라이머로 5'-AATTCAAAAACAAATGAGTACGAAGATAACCCTCGAGGGTTATCTTCGTACTC-ATTTG-3'(SEQ ID NO: 9)를 사용하였다.

693-713 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 2)을 표적으로 하는 shRNA의 센스 부위(sense region)로는 5'-GGGAAGATACTGTGGAGATGA-3'(SEQ ID NO: 5)를, 안티센스 부위(antisense region)로는 5'-TCATCTCCACAGTATCTTCCC-3'(SEQ ID NO: 6) 부위를 이용하여 이를 기반으로 pLKO-puro.1 벡터를 이용한 pLKO-puro.1-TNFAIP6 플라스미드를 제작하였다. 정방향 프라이머로 5'-CCGGGGGAAGATACTGTGGAGATGACTCGAGTCATCTCCACAGTATCTTCCCTTTTTG-3'(SEQ ID NO: 10)를 사용하였고, 역방향 프라이머로 5'-AATTCAAAAAGGGAAGATACTGTGGAGATGACTCGAGTCATCTCCACAGTATCTTCCC-3'(SEQ ID NO: 11)를 사용하였다.

루프 서열은 5'-CTCGAG-3'(SEQ ID NO: 12)이고, 프라이머에 포함된 형태로 shRNA를 제작하였다. 이를 pHR'-CMV-VSVG, pHR'-CMV-deltaR8.2와 함께 HEK293 세포 형질감염을 통해 발현시킨 후, 세포의 배양배지를 모아 렌티바이러스를 생산하였다. 원심분리기를 이용하여 상기 렌티바이러스를 농축시켰다. 바이러스 발현 확인을 위하여 A549 세포를 5X10⁴ cells/mL로 배양한 후, 다음 날 감염 버퍼(Infection Buffer; 10mM HEPES(Sigma-Aldrich, USA), 1 mg/mL 폴리브렌(Sigma-Aldrich, MO, USA))에 렌티바이러스를 20 mL/well로 첨가하여 암세포를 감염시켰다. 24시간이 지난 후 퓨로마이신(puromycin; Sigma-Aldrich, MO, USA)을 48시간 동안 처리하여 죽지 않고 살아있는 감염된 세포를 선별하였고, 선별한 세포의 RNA를 취하여 Real-time PCR을 통해 TSG6의 발현이 억제되었음을 관찰하였다.

도 3A에 나타난 바와 같이 shTNFAIP6에 감염된 폐암세포 A549는 대조군 shRNA(shCtrl)에 감염된 세포에 비하여 TNFAIP6의 mRNA의 발현이 감소하였고, 이는 TNFAIP6의 발현이 억제되었음을 보여준다.

다음으로, 암세포에서 TSG6의 발현을 억제하였을 때의 세포사멸을 평가하였다. 구체적으로, 대조군 세포(Mock)와 활성형 PLK1이 발현되는 세포(PLK1-TD)를 5X10⁴ cells/mL로 배양하고 대조군 바이러스(shCtrl) 또는 shTNFAIP6을 감염시킨 다음, 퓨로마이신을 48시간 동안 처리하여 죽지 않고 살아있는 세포를 선별하고 수취하였다. 수취한 세포는 100 ㎕의 분쇄 용액(0.5% Triton X-100, 20 mM Tris, pH 7.5, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM beta-glycerophosphate, 25 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄, 2 ㎍/mL leupeptin, 2 ㎍/mL pepstatin A, 100 ㎍/mL PMSF, 1 ㎍/mL antipain)을 처리한 후 단백질 정량 하였다. 정량한 단백질을 SDS-PAGE를 통해 전기영동시킨 후 세포사멸을 확인할 수 있는 Cleaved capase-3, Cleaved PARP 항체를 이용하여 세포사멸 여부를 확인하였다.

도 3B에서 보여준 바와 같이, 대조군 세포에 TSG6의 발현을 억제하였을 때, Cleaved capase-3, Cleaved PARP가 관찰되었고 이러한 결과는 TSG6의 발현억제는 암세포의 사멸을 유도할 수 있음을 보여준다. 또한, 전이를 유발하는 활성형 PLK1(PLK1-TD)발현 암세포에서도 TSG6의 발현을 억제하면 Cleaved capase-3, Cleaved PARP가 검출되고 세포사멸을 유도할 수 있음을 보여준다.

다음으로, TSG6의 발현 억제에 따른 상피간엽이행 감소 평가를 위하여 활성형 PLK1이 발현된 전이환경에서 TSG6 shRNA를 이용하여 TSG6의 발현을 억제하고 상피간엽이행 마커를 단백질 수준에서 관찰하였다.

구체적으로, 대조군 세포(Mock)와 활성형 PLK1이 발현되는 세포(PLK1-TD)를 5X10⁴ cells/mL로 배양하고 대조군 바이러스(shCtrl) 또는 shTNFAIP6을 감염시킨 다음, 퓨로마이신을 48시간 동안 처리하여 죽지 않고 살아있는 세포를 선별하고 수취하였다. 수취한 세포는 100 ㎕의 분쇄 용액(0.5% Triton X-100, 20 mM Tris, pH 7.5, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM beta-glycerophosphate, 25 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄, 2 ㎍/mL leupeptin, 2 ㎍/mL pepstatin A, 100 ㎍/mL PMSF, 1 ㎍/mL antipain)을 처리한 후 단백질 정량하였다. 정량한 단백질을 SDS-PAGE를 통해 전기영동시킨 후 상피간엽이행 마커 항체를 이용하여 면역블랏을 수행하여 상피간엽이행 과정의 감소를 확인하였다. 또한 수취한 세포에서 mRNA를 정제하고 cDNA를 합성하여 Real-time PCR을 수행하였고, mRNA 수준에서의 상피간엽이행 마커를 관찰함으로써 TSG6 shRNA가 활성형 PLK1에 의한 전이환경에서 상피간엽이행 과정을 감소시킨다는 것을 확인하였다.

도 3C에서 보여주는 바와 같이, 활성형 PLK1(PLK1-TD)가 발현되는 세포는 대조군 세포(Mock)보다 N-cadherin을 비롯한 Vimentin, Snail, Slug 등 간엽이행 마커들이 증가하였으며, 상피 마커인 E-cadherin은 감소하였다. 또한 암전이 과정에서 상피간엽이행의 주요 경로로 알려진, TGF-β 신호전달경로의 주된 단백질; Smad2/3, p-Smad2(S465/467)의 발현이 증가되었고, 본 결과는 활성형 PLK1(PLK1-TD)가 발현되는 세포는 TGF-β 신호전달경로를 통한 상피간엽이행 환경을 유도함을 의미한다. 이러한 환경에서 shTNFAIP6을 이용하여 TSG6의 발현을 억제시켰을 때, TGF-β 신호전달경로의 주된 단백질 p-Smad2(S465/467)의 발현이 감소되었고, N-cadherin을 비롯한 Vimentin, Snail, Slug 등 간엽이행 마커들이 감소한 것을 관찰하였다. 단백질 수준뿐만 아니라 도 3D에서 보여지는 mRNA 수준의 결과에서도 활성형 PLK1(PLK1-TD)가 발현되는 세포는 대조군 세포(Mock)보다 간엽이행 마커인 CDH2가 증가하였고, 상피 마커인 CDH1은 감소한 것을 관찰하였다. 따라서 본 발명은 TSG6의 발현 억제가 TGF-β 신호전달경로 활성에 의한 암전이에 있어서 활성형 p-Smad2(S465/467)를 감소시키고, 상피간엽이행을 저해함을 증명하였다.

또한, TSG6 shRNA가 활성형 PLK1이 발현되는 전이환경에서 인서트를 이용하여 세포의 이동성을 억제하는 효과를 증명하기 위해, 대조군 세포(Mock)와 활성형 PLK1을 발현하는 세포(PLK1-TD)를 24-웰 인서트에 5X10⁴ cells/well의 세포수로 혈청 프리 MEM(36℃)에 희석하여 인서트에 분주하였다. 인서트 밖의 24-웰에는 MEM(10% FBS 포함)을 0.5 mL/well씩 분주하고 24시간 뒤, 대조군 shRNA(shCtrl) 또는 TSG6 shRNA(shTNFAIP6) 바이러스를 감염시켰다. 다음날, 퓨로마이신을 48시간 동안 처리하고 바이러스 감염일로부터 4일 후 4% 파라포름알데히드 500 ㎕를 분주하고 1XPBS로 3회 세척하여 0.05% crystal-violet 용액으로 5분간 염색하였다. 5분 후 1XPBS로 5회 세척하였고, 염색된 정도를 590nm 파장에서 측정하였다. 대조군의 흡광도를 1이라고 할 때 각 실험군에서의 상대적 흡광도를 산출하여 그래프를 표시하였다.

도 3E에 나타난 바와 같이, 대조군 바이러스(shCtrl)을 처리한 활성형 PLK1(PLK1-TD)가 발현되는 세포는 대조군 세포(Mock)보다 세포의 이동성이 증가하였고, shTNFAIP6을 감염시켜 TSG6의 발현을 억제 시키자 활성형 PLK1가 발현되었음에도 불구하고 세포의 이동성이 감소하였다.

다음으로, TSG6 shRNA가 활성형 PLK1이 발현되는 전이환경에서 마트리겔을 이용하여 세포의 침습성을 억제하는 효과를 증명하였다. 이를 위해, 4℃에서 16~20시간 동안 마트리겔을 완전히 녹인 후 마트리겔을 1 mg/mL이 되도록 차가운 무혈청 MEM(4℃)으로 희석하였다. 이를 8.0 mm 24-웰 인서트에 1 mL의 마트리겔 혼합물(1 mg/mL)을 넣고 37℃ 배양기에서 12-20시간 동안 굳혀주었다. 굳은 마트리겔 인서트에 각각의 대조군 세포(Mock) 또는 활성형 PLK1 발현 세포(PLK1-TD)를 2X10⁵ cells/well의 세포수로 혈청프리 MEM(36℃)에 희석하여 인서트에 분주하였다. 여기에 36℃의 따뜻한 MEM(10% FBS 포함)을 0.5 mL/well씩 분주하였다. 이 후 3일에 한 번씩 배지를 교환해주고 침습되는 정도를 관찰하였으며, 암세포의 침습이 충분히 일어난 것으로 관찰된 5일 차에 배지를 제거하고 1XPBS로 세척한 후, 인서트 안쪽의 세포들을 면봉으로 긁어 내었고, 1XPBS로 세척하여 인서트 내부에 세포와 마트리겔의 잔여물이 남지 않도록 제거하였다. 인서트 바깥 면이 있는 24-웰에 4% 파라포름알데히드 500 ㎕를 분주하고 5분간 실온에서 인큐베이션한 후 5분에 1XPBS로 3회 세척하여, 0.05% crystal-violet 용액으로 5분간 염색하였다. 5분 후 1XPBS로 5회 세척하였고, 염색된 정도를 590nm 파장에서 측정하였다. 대조군의 흡광도를 1이라고 할 때 각 실험군에서의 상대적 흡광도를 산출하여 그래프를 표시하였다.

도 3F에 나타난 바와 같이, 대조군 바이러스(shCtrl)을 처리한 활성형 PLK1(PLK1-TD)가 발현되는 세포는 대조군 세포(Mock)보다 세포의 침습성이 증가하였고, shTNFAIP6을 감염시켜 TSG6의 발현을 억제시키자 활성형 PLK1가 발현되었음에도 불구하고 세포의 침습성이 감소하였다.

상기 결과들을 종합하였을 때, 활성형 PLK1이 발현되는 세포(PLK1-TD)는 상피간엽이행을 증가시킬 뿐만 아니라 세포의 이동성과 침습성을 증가시키는 전이환경을 가지며, 이러한 전이환경에서 TSG6 shRNA를 이용하여 TSG6의 발현을 억제하였을 때에 상피간엽이행이 감소되며, 세포의 이동성과 침습성 또한 감소하는 것을 증명하였다.

<실시예 4> TGF-β 처리에 의한 전이환경에서 TSG6 shRNA의 상피간엽이행 억제 효과 평가

TGF-β 처리에 의해 유도된 암전이 환경에서 TSG6 shRNA를 이용한 TSG6의 발현을 억제하였을 때, 상피간엽이행 마커 및 관련 인자들의 mRNA 발현 변화를 중합효소연쇄반응을 통해 관찰하였고, 암의 이동성과 침습성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 세포 이동성 실험 및 세포 침습성 실험을 각각 진행하였다.

구체적으로, 실시예 2에서 제작된 TSG6 shRNA(shTNFAIP6)를 pHR'-CMV-VSVG, pHR'-CMV-deltaR8.2와 함께 HEK293 세포 형질감염을 통해 발현시킨 후, 세포의 배양 배지를 모아 렌티바이러스를 생산하였다. 원심분리기를 이용하여 상기 렌티바이러스를 농축시켰다. 생산된 바이러스를 폐암세포인 A549 세포에 감염시킨 후 TGF-β 처리에 의해서 유도된 폐암세포의 전이성에 TSG6 shRNA가 미치는 영향에 대한 실험을 진행하였다. shRNA의 처리여부에 따라 shCtrl 대조군과 shTNFAIP6 실험군(TSG6 shRNA 처리군)으로 나누고, 폐암세포 A549에 TSG6 mRNA의 발현 억제를 위하여 제작한 pLKO-puro.1-TNFAIP6을 이용하여 발현시킨 바이러스성(viral) TSG6 shRNA를 20 ㎕ 취하여 감염 버퍼(Infection Buffer; 10mM HEPES, 1㎍/mL Polybrene)와 섞어 세포에 처리하였다. 24시간 후 2 ㎍/mL 퓨로마이신을 48시간 동안 처리하여 TSG6 shRNA에 감염된 세포만 선별하여 TSG6 발현을 억제하는 세포주를 구축하였다. 구축된 TSG6를 억제하는 세포주에 2.5 ng/mL TGF-β를 48시간 동안 처리하여 암전이를 유도한 조건에서 RNA를 분리한 후 Real-time PCR을 통해 TNIFAIP6 발현 및 상피간엽이행 관련 인자들인 CDH1, CDH2, PLK1, TGFB1, CD44 발현을 관찰하였다.

도 4A에 나타난 바와 같이, TSG6 shRNA(shTNFAIP6)에 감염된 폐암세포 A549는 대조군 shRNA(shCtrl)에 감염된 세포에 비하여 TNFAIP6의 mRNA의 발현이 감소하였고, 이는 TNFAIP6의 발현이 억제되었으며, 암전이 환경을 유도하는 TGF-β를 처리한 조건에서도 TNFAIP6의 발현이 억제되었음을 관찰하였다. TGF-β 처리에 의한 상피 마커인 CDH1 mRNA 발현의 감소가 shTNFAIP6 처리에 의한 TNFAIP6의 발현 억제로 CDH1 mRNA 발현의 감소가 억제되었으며, 또한, TGF-β 처리에 의한 간엽이행 마커인 CDH2을 비롯한 PLK1, TGF-β 및 CD44 발현의 증가도 TNFAIP6의 발현 억제를 의해 억제되었음을 관찰하였다.

다음으로, TSG6의 발현 억제가 TGF-β가 처리된 전이환경에서 세포 이동성 실험을 통해 세포의 이동성을 억제하는 효과를 확인하였다. 이를 위해, 폐암세포 A549를 무혈청 배지에 희석하여 5X10⁴ 개의 세포를 8.0 ㎛, 24 웰 인서트(BD Biosciences, NJ, USA)에 분주하고 24 칸 플레이트에 10% 혈청이 포함된 배지를 분주한 뒤 인서트를 넣어 주었다. 24시간 뒤, 대조군 shRNA(shCtrl) 또는 TSG6 shRNA(shTNFAIP6) 바이러스를 감염시켰다. 다음날, 2 ㎍/mL 퓨로마이신을 48시간 동안 처리 후 2.5 ng/mL TGF-β를 48시간 동안 처리하였다. TGF-β 처리 48시간 후 4% 파라포름알데히드 500 ㎕를 분주하여 이동한 세포를 고정시키고, 1XPBS로 3회 세척하여 0.05% crystal-violet 용액으로 5분간 염색하였다. 5분 후 1XPBS로 5회 세척하였고, 염색된 정도를 590nm 파장에서 측정하였다. 대조군의 흡광도를 1이라고 할 때 각 실험군에서의 상대적 흡광도를 산출하여 그래프를 표시하였다.

도 4B에 나타난 바와 같이, shTNFAIP6을 감염시켜 TSG6의 발현을 억제한 세포는 대조군 바이러스(shCtrl)을 처리한 세포보다 세포의 이동성을 억제하였고, TGF-β 처리에 의한 전이환경에서도 shTNFAIP6에 의한 TSG6 발현 억제가 세포의 이동성을 억제하는 것을 관찰하였다

다음으로, TSG6 shRNA가 TGF-β 처리에 의한 전이환경에서 세포 침습성 실험을 통해 세포의 침습성을 억제하는 효과를 확인하였다. 이를 위해, 4℃에서 16~20시간동안 마트리겔을 완전히 녹인 후 마트리겔을 1 mg/mL이 되도록 혈청이 포함되지 않은 차가운 MEM(4℃)으로 희석하였다. 이를 8.0 ㎛ 24 칸용 인서트에 150㎕ 마트리겔 혼합물을 분주하고 37℃ 배양기에서 12-20시간 동안 굳혀주었다. 굳은 마트리겔 위에 폐암세포 A549를 2X10⁵ cells/well의 세포수로 혈청이 없는 배지에 희석하여 분주하였다. 여기에 혈청이 포함된 36℃의 따뜻한 MEM(10% FBS)을 0.5 mL/well씩 분주하였다. 24시간 뒤, 대조군 shRNA(shCtrl) 또는 TSG6 shRNA(shTNFAIP6) 바이러스를 감염시켰다. 다음날, 2 ㎍/mL 퓨로마이신을 48시간동안 처리 후 2.5 ng/mL TGF-β를 처리하였다. 이 후 3일에 한 번씩 배지를 교환해주고 침습되는 정도를 관찰하였으며, 암세포의 침습이 충분히 일어난 것으로 관찰된 5일 차에 배지를 제거하고 1XPBS로 세척한 후, 인서트 안쪽의 세포들을 면봉으로 긁어 내었고, 1XPBS로 세척하여 인서트 내부에 세포와 마트리겔의 잔여물이 남지 않도록 제거하였다. 인서트 바깥 면이 있는 24 칸 플레이트에 4% 파라포름알데히드 500 ㎕를 분주하고 마트리겔을 침습한 세포를 5분간 실온에서 인큐베이션한 후 5분에 1XPBS로 3회 세척하여, 0.05% crystal-violet 용액으로 5분간 염색하였다. 5분 후 1XPBS로 5회 세척하였고, 염색된 정도를 590nm 파장에서 측정하였다. 대조군의 흡광도를 1이라고 할 때 각 실험군에서의 상대적 흡광도를 산출하여 그래프를 표시하였다.

도 4C에 나타난 바와 같이, shTNFAIP6을 감염시켜 TSG6의 발현을 억제한 세포는 대조군 바이러스(shCtrl)을 처리한 세포보다 세포의 침습성을 억제하였고, TGF-β 처리에 의한 전이환경에서도 shTNFAIP6에 의한 TSG6 발현 억제가 세포의 침습성을 억제하는 것을 관찰하였다

도 4의 결과를 종합하였을 때, shTNFAIP6에 의한 TSG6 발현 억제가 세포의 상피간엽이행에 관여하는 인자들의 발현을 억제시킬 뿐만 아니라 세포의 이동성과 침습성을 감소시키며, TGF-β 처리에 의한 전이환경에서도 shTNFAIP6에 의한 TSG6 발현 억제가 상피간엽이행 관련 인자들의 발현을 억제시키며, 세포의 이동성과 침습성도 감소하는 것을 증명하였다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus <120> Composition for treating metastatic solid cancer comprising TSG6 inhibitor <130> P20U22C0794 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSG6 530-550 nt <400> 1 caaatgagta cgaagataac c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSG6 693-713 nt <400> 2 gggaagatac tgtggagatg a 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSG6 shRNA sense nucleotide <400> 3 caaatgagta cgaagataac c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSG6 shRNA antisense nucleotide <400> 4 ggttatcttc gtactcattt g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSG6 shRNA sense nucleotide <400> 5 gggaagatac tgtggagatg a 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSG6 shRNA antisense nucleotide <400> 6 tcatctccac agtatcttcc c 21 <210> 7 <211> 1422 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 agtcacattt cagccactgc tctgagaatt tgtgagcagc ccctaacagg ctgttacttc 60 actacaactg acgatatgat catcttaatt tacttatttc tcttgctatg ggaagacact 120 caaggatggg gattcaagga tggaattttt cataactcca tatggcttga acgagcagcc 180 ggtgtgtacc acagagaagc acggtctggc aaatacaagc tcacctacgc agaagctaag 240 gcggtgtgtg aatttgaagg cggccatctc gcaacttaca agcagctaga ggcagccaga 300 aaaattggat ttcatgtctg tgctgctgga tggatggcta agggcagagt tggatacccc 360 attgtgaagc cagggcccaa ctgtggattt ggaaaaactg gcattattga ttatggaatc 420 cgtctcaata ggagtgaaag atgggatgcc tattgctaca acccacacgc aaaggagtgt 480 ggtggcgtct ttacagatcc aaagcaaatt tttaaatctc caggcttccc aaatgagtac 540 gaagataacc aaatctgcta ctggcacatt agactcaagt atggtcagcg tattcacctg 600 agttttttag attttgacct tgaagatgac ccaggttgct tggctgatta tgttgaaata 660 tatgacagtt acgatgatgt ccatggcttt gtgggaagat actgtggaga tgagcttcca 720 gatgacatca tcagtacagg aaatgtcatg accttgaagt ttctaagtga tgcttcagtg 780 acagctggag gtttccaaat caaatatgtt gcaatggatc ctgtatccaa atccagtcaa 840 ggaaaaaata caagtactac ttctactgga aataaaaact ttttagctgg aagatttagc 900 cacttataaa aaaaaaaaaa aggatgatca aaacacacag tgtttatgtt ggaatctttt 960 ggaactcctt tgatctcact gttattatta acatttattt attatttttc taaatgtgaa 1020 agcaatacat aatttaggga aaattggaaa atataggaaa ctttaaacga gaaaatgaaa 1080 cctctcataa tcccactgca tagaaataac aagcgttaac attttcatat ttttttcttt 1140 cagtcatttt tctatttgtg gtatatgtat atatgtacct atatgtattt gcatttgaaa 1200 ttttggaatc ctgctctatg tacagttttg tattatactt tttaaatctt gaactttata 1260 aacattttct gaaatcattg attattctac aaaaacatga ttttaaacag ctgtaaaata 1320 ttctatgata tgaatgtttt atgcattatt taagcctgtc tctattgttg gaatttcagg 1380 tcattttcat aaatattgtt gcaataaata tccttgaaca ca 1422 <210> 8 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 8 ccggcaaatg agtacgaaga taaccctcga gggttatctt cgtactcatt tgtttttg 58 <210> 9 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 9 aattcaaaaa caaatgagta cgaagataac cctcgagggt tatcttcgta ctcatttg 58 <210> 10 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 10 ccgggggaag atactgtgga gatgactcga gtcatctcca cagtatcttc cctttttg 58 <210> 11 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 11 aattcaaaaa gggaagatac tgtggagatg actcgagtca tctccacagt atcttccc 58 <210> 12 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Loop sequence <400> 12 ctcgag 6

Claims (5)

1. SEQ ID NO: 1 또는 2의 염기서열을 표적으로 하는 TSG6(Tumor necrosis factor-inducible gene 6 protein) 억제제를 포함하는 전이성 고형암 치료용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   TSG6 억제제는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 염기서열에 특이적으로 결합하는 siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 앱타머 중 어느 하나인, 전이성 고형암 치료용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   TSG6 억제제는 SEQ ID NO: 3 및 4의 염기서열을 포함하는 shRNA인, 전이성 고형암 치료용 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   TSG6 억제제는 SEQ ID NO: 5 및 6의 염기서열을 포함하는 shRNA인, 전이성 고형암 치료용 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   고형암은 shRNA는 뇌종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 중프종, 식도암, 췌암, 대장암, 간암, 위암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 대장암, 림프종, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암 중 어느 하나를 포함하는, 전이성 고형암 치료용 조성물.

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