KR102582500B1 - Tnfaip6 -조작된 종양 세포 및 이의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조작된 종양 세포 및 이의 이용에 관한 것이다. 본 발명의 조작된 종양 세포는 TSG-6이 억제된 종양 세포에 관한 것으로, TSG-6의 억제는 TSG-6의 발현의 억제 또는 기능의 억제를 의미할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 조작된 종양 세포의 유전체가 조작된 TNFAIP6 유전자를 포함함으로 인하여 TSG-6이 억제된 것일 수 있다. 또한, 본 발명은 TNFAIP6 유전자를 조작하는 방법 및 이를 이용하여 조작된 종양 세포를 제작하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 조작된 종양 세포를 포함하는 항암용 치료용 조성물 및 이를 이용한 항암 방법에 관한 것이다.

Description

TNFAIP6 -조작된 종양 세포 및 이의 이용 {A TNFAIP6 - engineered tumor cell and Use thereof}

본 발명은 면역회피기능이 억제된 종양 세포를 이용한 항암 용도에 대한 기술이다.

암 세포는 신체의 면역 모니터링 시스템을 회피하고, 종양 미세 환경(tumor microenvironment, TME)에서 항암 면역(anticancer immunity)을 억제한다. 암 세포의 면역회피기능에 대한 메커니즘 중 하나는 PD-L1 또는 B7-H3과 같은 면역 체크포인트 단백질(immune checkpoint protein)의 발현과 관련이 있다. 또한, TME에는 면역 억제 세포로 알려진 종양 관련 대식세포(tumor-associated macrophages, TAMs) 및 조절 T 세포(regulatory Treg cells)도 포함되어 있다. 이와 반대로, TME의 면역 풀에는 CD8+ T세포 및 자연 살해 세포(natural killer cells)와 같은 항암 면역 세포(anticancer immune cells)도 포함되어 있다. 이러한 TME에 포함되는 세포들의 종류와 수는 항암치료효과를 예측하기 위한 바이오 마커로 제시되기도 한다.

항암 치료제의 개발을 위해서는 TME에서의 항종양 면역을 효과적으로 활성화하거나 암 세포의 면역회피기능을 억제할 수 있는 새로운 치료 표적이 필요하다. 이때, 치료 표적을 찾는 과정에서 상기 바이오 마커들을 지표로 사용할 수 있다.

대한민국 특허공개 제10-2021-0155534호 대한민국 특허공개 제10-2021-0138674호

본 발명의 일 목적은 TNFAIP6 -조작된 종양 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 세포를 이용하는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포를 이용하는 항암 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 TNFAIP6유전자 조작용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 TNFAIP6 -조작된 종양 세포를 제작하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 조작된 종양 세포를 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.

상기 조작된 종양 세포의 게놈 DNA는 인위적으로 조작된 TNFAIP6(tumor necrosis factor, alpha-induced protein 6) 유전자를 포함할 수 있다.

상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자의 핵산 서열은 야생형 TNFAIP6유전자의 핵산 서열과 다를 수 있다.

상기 조작된 종양 세포는 야생형 TSG-6(TNF-stimulated gene 6 protein) 단백질을 발현하지 않을 수 있다.

상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자의 핵산 서열은 야생형 TNFAIP6유전자의 핵산 서열에서 인델을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 인델은 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자의 엑손2 영역에 위치한 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 인델(indel)의 크기는 200bp이하인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 조작된 종양 세포는 야생형 종양 세포에 비하여, PD-L1(Programmed Death-Ligand 1) 또는 B7-H3(B7 homolog 3)의 발현 수준이 낮은 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 조작된 종양 세포는 고형암 환자의 고형암 세포로부터 유래된 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 고형암 세포는 유방암 세포인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 조작된 종양 세포는 세포사멸이 유도될 수 있도록 구성된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 TNFAIP6유전자 조작용 조성물을 제공한다.

상기 TNFAIP6유전자 조작용 조성물은 Cas9 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산; 및 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.

상기 가이드 RNA는 TNFAIP6유전자를 표적으로 하는 가이드 도메인을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질(SpCas9 단백질)인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 가이드 도메인이 표적으로 하는 서열은 TNFAIP6유전자의 엑손2영역에 위치한 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 TNFAIP6유전자 조작용 조성물은 상기 Cas9 단백질 및 상기 가이드RNA를 포함하고, 상기 Cas9단백질과 상기 가이드 RNA는 리보뉴클레오프로테인(ribonucleoprotein, RNP) 형태로 존재하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 TNFAIP6유전자 조작용 조성물은 상기 Cas9 단백질을 암호화하는 핵산 및/또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 핵산이 포함된 벡터를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 가이드 도메인은 서열번호 4와 적어도 적어도 80% 내지 100%의 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가지는 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 조작된 종양 세포 및 이를 제작하는 방법 등에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 기술을 통해, 항암용 약학적 조성물 및 항암 방법을 제공할 수 있다. 또한, TNFAIP6유전자 조작용 조성물을 제공할 수 있다.

도1은 유방암 세포에 siRNA(siTSG-6)를 형질감염시키고, siTSG-6그룹에서의 세포 증식, 이동 및 침습 능력을 분석한 결과를 보여준다.
도2는 siTSG-6 그룹에서 cadherins, 세포 신호 경로, 및 면역 관문 단백질 발현 분석한 결과를 보여준다.
도3은 간접 공동 배양한 DH82 세포의 마커(CD11c, iNOS, CD206, Arginase1, IL-6, PD-1)들의 발현을 확인한 결과를 보여준다.
도4는Naive 4T1 세포주, SC-4T1 세포주, 또는 KO-4T1 세포주를 면역적격(immunocompetent) 마우스에 피하 주입한 후, 종양의 전이 수준, 부피 등을 확인한 결과를 보여준다.
도5는 종양 침윤 림프구의 활성 수준, 사이토카인의 발현 수준, 및 CD8α+ 세포 중 활성화된 세포 집단 수준을 확인한 결과를 보여준다.
도6은 유방암 마우스 모델에 Irradiated 4T1 세포백신(SC-4T1 백신) 또는 Irradiated KO-4T1세포백신(KO-4T1 백신)을 접종한 후, 각 그룹의 마우스에 대한 몸무게, 종양의 크기, 종양의 부피 등의 데이터를 비교한 결과를 보여준다.
도7은 마우스의 비장 내 면역세포를 분리하여 유동세포계측법으로 면역세포군을 비교한 결과를 보여준다.
도8은 TSG-6 KO whole cell vaccine의 작용기전을 보여준다.
도9는 공동 배양한 DH82세포에서의 CD11c 및 CD206 발현수준을 측정한 결과를 보여준다.
도10은 공동 배양된 PMBC 중 세포독성 T 세포(CD3+/CD8α+)의 집단 및 활성을 분석한 결과를 보여준다.
도11은 실험예에서 제작한 sgRNA(sgTSG6_1 및 sgTSG6_2)의 서열을 보여준다.
도12는 sgRNA에 의한 mutation과 관련하여 16개의 단일 콜로니의 DNA를 분석한 결과를 보여준다.
도13은 TSG-6 KO 유방암 세포주로 확립된 KO-4T1세포의 특징을 확인하기 위하여, KO-4T1 세포를 Naive 및 scRNA 그룹과 비교한 결과를 보여준다.
도14는 CD11b+ 대식세포 및 CD3+ 림프구 모두에서, Naive 4T1 그룹 및 SC-4T1 그룹에 비하여, KO-4T1 그룹의 PD-1 발현이 유의하게 높은 것을 확인한 결과를 보여준다.
도15는 KO-4T1 그룹에서의 PD-1의 높은 발현 수준은 암 세포에서 TSG-6을 넉아웃하여 PD-L1 발현이 감소함으로 인한 것임을 확인한 결과를 보여준다.
도16은 세포의 비활성화 수준을 확인하기 위하여, 방사선을 조사하여 비활성화된 SC-4T1 세포(Irradiated 4T1), 방사선을 조사하여 비활성화된 KO-4T1 세포(Irradiated KO-4T1), 및 방사선을 조사하지 않은 Naive 4T1 세포(Naive 4T1)을 대상으로 세포 사멸 및 마커의 발현 수준을 관찰한 결과를 보여준다.
도17은 활성화된 면역 세포와 종양 항원 특이적 항체의 항종양 효과를 확인하기 위해, 입양 세포 전달 실험을 수행한 결과를 보여준다.
도18은 TME에서의 면역 활성화를 확인하기 위하여 조직 슬라이드를 분석한 결과를 보여준다.
도19는 TSG-6가 종양 세포에서 intrinsic role을 가지는지 확인하기 위하여, 세포의 OD value 및 세포의 수를 확인한 결과를 보여준다.
도20은 TSG-6이 세포주기의 어느 시점에 관여하는지를 알아보기 위해 세포주기 분석한 결과를 보여준다.
도21은 TSG-6가 종양 세포의 Migration 및 Invasion 능력에 영향을 미치는지 확인하기 위해 상처 치유 분석(Wound healing assay)을 수행한 결과를 보여준다.
도22는 TSG-6가 종양 세포의 Migration 및 Invasion 능력에 영향을 미치는지 확인하기 위해 상처 치유 분석(Wound healing assay)을 수행한 결과를 보여준다.
도23은 각 그룹에서 CIPp, CIPm, BT-20을 이용하여 CD44, PD-L1, STAT3, Nf-κB, Sox2 경로의 발현 수준을 확인한 결과를 보여준다.
도24는 각 그룹에서 CD44 및 PD-L1 발현을 면역형광으로 분석한 결과를 보여준다.
도25는 개 대식세포 세포주와 간접적으로 공동 배양된 암세포에서 TSG-6의 상대적 mRNA 발현수준을 확인한 결과를 보여준다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여, 발명의 내용을 특정한 구현예와 예시들을 통해 더욱 상세하게 설명한다. 상기 첨부된 도면은 발명의 일부 구현예를 포함하지만, 모든 구현예를 포함하고 있지는 않다는 점에 유의해야 한다. 본 명세서에 의해 개시되는 발명의 내용은 다양하게 구현될 수 있으며, 여기에 설명되는 특정 구현예로 제한되지 않는다. 이러한 구현예들은 본 명세서에 적용되는 법적 요건을 만족시키기 위해 제공되는 것으로 보아야 한다. 본 명세서에 개시된 발명이 속한 기술분야에 있어 통상의 기술자라면, 본 명세서에 개시된 발명의 내용에 대한 많은 변형 및 다른 구현예들을 떠올릴 수 있을 것이다. 따라서, 본 명세서에서 개시된 발명의 내용은 여기에 기재된 특정 구현예로 제한되지 않으며, 이에 대한 변형 및 다른 구현예들도 청구범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

용어의 정의

약

본 명세서에서 사용되는 "약"이라는 용어는 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

핵산 서열 표기

본 명세서에서 사용되는 A, T, C, G 및 U 기호는 당업계 통상의 기술자가 이해하는 의미로 해석된다. 문맥 및 기술에 따라 DNA 또는 RNA 상에서 염기, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드로 적절히 해석될 수 있다. 예를 들어, 염기를 의미하는 경우는 각각 아데닌(A), 티민(T), 시토신(C), 구아닌(G) 또는 우라실(U) 자체로 해석될 수 있고, 뉴클레오사이드를 의미하는 경우는 각각 아데노신(A), 티미딘(T), 시티딘(C), 구아노신(G) 또는 유리딘(U)으로 해석될 수 있으며, 서열에서 뉴클레오타이드를 의미하는 경우는 상기 각각의 뉴클레오사이드를 포함하는 뉴클레오타이드를 의미하는 것으로 해석되어야 한다.

본 명세서에서 N 기호는 문맥 및 기술에 따라 DNA 또는 RNA 상에서 염기, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드로 적절히 해석될 수 있다. 예를 들어, 염기를 의미하는 경우는 각각 아데닌(A), 티민(T), 시토신(C), 구아닌(G), 및 우라실(U) 중 어느 하나로 해석될 수 있고, 뉴클레오사이드를 의미하는 경우는 각각 아데노신(A), 티미딘(T), 시티딘(C), 구아노신(G), 및 유리딘(U) 중 어느 하나로 해석될 수 있으며, 서열에서 뉴클레오타이드를 의미하는 경우는 상기 각각의 뉴클레오사이드를 포함하는 뉴클레오타이드를 의미하는 것으로 해석되어야 한다.

작동 가능하게 연결된(operably linked)

본 명세서에서 사용되는 "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 유전자 발현 기술에 있어서, 특정 구성이 다른 구성과 연결되어, 상기 특정 구성이 의도된 방식대로 기능할 수 있도록 연결되어 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터 서열이 암호화 서열과 작동적으로 연결되었다고 할 때, 상기 프로모터가 상기 암호화 서열의 세포 내에서의 전사 및/또는 발현에 영향을 미칠 수 있도록 연결된 것을 의미한다. 또한, 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.

표적 유전자 또는 표적 핵산

본 명세서에서 사용되는 "표적 유전자" 또는 "표적 핵산"은 기본적으로, 유전자 편집의 대상이 되는 세포 내 유전자, 또는 핵산을 의미한다. 상기 표적 유전자 또는 표적 핵산은 혼용될 수 있으며, 서로 동일한 대상을 지칭할 수 있다. 상기 표적 유전자 또는 표적 핵산은 달리 기재되지 않은 한, 대상 세포가 가진 고유한 유전자 또는 핵산, 혹은 외부 유래의 유전자 또는 핵산 모두를 의미할 수 있으며, 유전자 편집의 대상이 될 수 있다면 특별히 제한되지 않는다. 상기 표적 유전자 또는 표적 핵산은 단일가닥 DNA, 이중가닥 DNA, 및/또는 RNA일 수 있다. 또한, 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.

표적 가닥(target strand), 비표적 가닥(non-target strand)

본 명세서에서 “표적 가닥”, 및 “비-표적 가닥”이라는 용어는, CRISPR/Cas9 복합체가 이중가닥 핵산을 표적 핵산으로 하여 작용하는 것을 서술할 때 각 가닥을 특정하기 위한 의미로 사용된다. 기본적으로, 표적 가닥과 비표적 가닥은 이중가닥 핵산의 각 가닥을 의미하며, 서로 상보적인 서열을 가진다. 여기서, 상기 비-표적 가닥은 Cas9 단백질이 인식하는 PAM(Protospacer Adjacent Motif)이 위치하는 가닥을 의미하고, 표적 가닥은 가이드 RNA 가 상보적으로 결합하게 되는 가닥을 의미한다. 달리 서술하면, CRISPR/Cas9 복합체가 표적 핵산을 절단할 때, 1) Cas9 단백질이 비-표적 가닥에 존재하는 PAM 서열을 인식하고, 2) 가이드 RNA 중 표적 서열을 표적화 하도록 설계된 부분(이른바, 가이드 도메인)이 표적 가닥과 상보적으로 결합하여 복합체(duplex)를 형성하여 CRISPR/Cas9 복합체의 핵산 절단 기능이 활성화되게 된다.

또한, 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.

표적 서열(target sequence), 비표적 서열(non-target sequence)

본 명세서에서 사용되는 "표적 서열"은 CRISPR/Cas 복합체가 표적 유전자 또는 표적 핵산을 절단하기 위해 인식하는 특정 서열을 의미한다. 상기 표적 서열은 그 목적에 따라 적절히 선택될 수 있다. 구체적으로, "표적 서열"은 표적 유전자 또는 표적 핵산 서열 내에 포함된 서열이며, 본 명세서에서 제공하는 가이드 RNA, 또는 엔지니어링 된 가이드 RNA에 포함된 가이드 도메인 서열과 상보성을 가지는 서열을 의미한다. 일반적으로, 상기 가이드 도메인 서열은 표적 유전자 또는 표적 핵산의 서열 및 CRISPR/Cas 시스템의 이펙터 단백질이 인식하는 PAM 서열을 고려하여 결정된다. 상기 표적 서열은 CRISPR/Cas 복합체의 가이드 RNA와 상보적으로 결합하는 표적 가닥에 포한 된 서열을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 "비표적 서열"은 상기 표적 서열과 상보성을 가지는 서열을 의미한다. 상기 비표적 서열은 비표적 가닥에 포함되는 서열로, 이중가닥으로 존재하는 경우, 표적 서열과 결합된 상태에 있는 것이 일반적이다. 또한, 상기 비표적 서열은 PAM 서열의 근처(adjacent)에 있다.

상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.

상동 재조합 수리(homology directed repairing, HDR)

본 명세서에서 사용되는 "상동 재조합 수리(homology directed repairing, HDR)"는 손상된 유전자 또는 핵산을 수선 또는 수복하기 위해 상동성을 가진 서열을 주형으로 이용하여 오류 없이 교정할 수 있는 방법으로, 일반적으로, 파손된 DNA을 수선 또는 수복하기 위해, 즉 세포가 가지고 있는 원래의 정보를 복원하기 위해, 변형이 이루어지지 않은 상보적인 염기서열의 정보를 이용하거나 자매 염색분체의 정보를 이용하여 파손된 DNA를 수선 또는 수복한다. HDR의 가장 일반적인 형태는 상동성 재조합(homologous recombination, HR)이다. HDR은 통상적으로 활발하게 분열하는 세포의 S나 G2/M 시기에 주로 발생하는 수선 또는 수복 방식이다.

HDR을 이용하여 손상된 DNA를 수선 또는 수복을 하기 위해, 세포가 본래 가지는 상보적인 염기서열 또는 자매 염색분체를 이용하는 대신에, 상보적인 염기서열 또는 상동성 염기서열 정보를 이용하여 인공적으로 합성한 DNA 주형을 이용할 수 있다. 즉, 상보적인 염기서열 또는 상동성 염기서열을 포함하는 핵산 주형을 세포에 제공하여 파손된 DNA를 수선 또는 수복할 수 있다. 이때, 상기 핵산 주형에 추가로 핵산 서열 또는 핵산 조각을 포함시켜 파손된 DNA를 수선 또는 수복할 때, 파손된 DNA에 추가로 포함시킨 핵산 서열 또는 핵산 조작을 삽입(Knock-In)할 수 있다. 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.

PAM (Protospacer Adjacent Motif)

CRISPR/Cas9 시스템은 표적-특이적인 핵산 절단 활성을 가지는데, 이러한

표적-특이적인 핵산 절단 활성을 나타내기 위해서는 두 가지 조건이 필요하다. 첫째로, 핵산 내에 Cas9 단백질이 인식할 수 있는 일정 길이의 염기 서열이

있어야 한다. 둘째로, 상기 일정 길이의 염기 서열 주변에 가이드 RNA에 포함된 가이드 도메인과 상보적으로 결합할 수 있는 서열이 있어야 한다. 위 두 가지 조건이 만족되어 1) Cas9 단백질이 상기 일정 길이의 염기 서열을 인식하고, 2) 상기 가이드 도메인이 상기 일정 길이의 염기 서열 주변 서열 부분과 상보적으로 결합하는 경우, 핵산 절단 활성이 나타난다. 이때, 상기 Cas9 단백질에 의해 인식되는 일정 길이의 염기 서열을 Protospacer Adjacent Motif(PAM) 서열이라 한다.

상기 PAM 서열은 상기 Cas9 단백질에 따라 정해지는 고유한 서열이다. 상기Cas9 단백질의 PAM 서열을 알고 있다면, 이를 사용하여 PAM 서열 주변의 미리 결정된 표적 서열의 핵산을 표적으로 하는 CRISPR/Cas9 시스템을 설계할 수 있다.

조작된

본 명세서에서 사용되는 "조작된" 이란 용어는 자연계에서 이미 존재하는 구성을 가진 물질, 분자 등과 구분하기 위해 사용하는 용어로, 상기 물질, 분자 등에 인위적인 변형이 가해진 것을 의미한다. 예를 들어, "조작된 유전자"의 경우, 자연계에 존재하는 유전자의 구성에 인위적인 변경이 가해진 유전자를 의미한다. 또한, 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.

억제된

본 명세서에서 사용되는 "억제된"이란 용어가 단백질과 함께 사용되는 경우, 억제된 대상이 되는 단백질의 발현 또는 기능이 억제된 것을 의미한다. 단백질의 발현이 억제된다는 것은 단백질이 발현되기 위한 전사과정 또는 번역과정이 억제되는 것을 의미한다. 구체적으로는, 단백질을 암호화하는 mRNA의 발현이 억제되거나 상기 mRNA로부터 단백질이 생성되는 과정이 억제되는 것을 의미한다. 단백질의 기능이 억제된다는 것은, 발현된 단백질이 야생형 단백질과 동일한 기능을 할 수 없거나 동일한 기능을 하더라도 비교적 낮은 수준의 기능을 하는 것을 의미할 수 있다. 일 예로, 발현된 단백질의 아미노산 서열이 야생형 단백질의 아미노산 서열과 차이가 있어서, 기능에 차이가 발생하는 경우가 있을 수 있다. 또한, 단백질의 기능이 억제된다는 것은, 단백질이 외부적인 요소에 의하여 본래의 기능을 할 수 없거나, 외부적인 요소가 없는 경우에 비하여 낮은 수준의 기능을 하는 것을 의미할 수 있다. 구체적으로는, 항체 또는 저분자 화합물 등 과 같은 외부적인 요소가 단백질에 반응을 하는 경우가 있을 수 있다. 또한, 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.

야생형

본 명세서에서 사용되는 "야생형"이란 용어는 자연적으로 발생하는 염기서열을 포함하는 유전자 및 그 유전자로부터 발현되는 단백질이 정상적인 기능적 특성을 지니는 것을 의미한다. 야생형 유전자는 집단에서 가장 빈번하게 관찰된다. 본 명세서에서 "야생형"이라는 용어가 조작된(또는 인위적으로 조작된) 유전자, 및/또는 세포와 대비해 사용된다면, 이는 인위적으로 조작된 유전자, 및/또는 세포와 상응하는 동종의 "인위적으로 조작되지 않은" 자연적으로 발생하는 염기서열을 포함하는 유전자 및 이를 가지는 세포를 의미하는 것으로 해석될 수 있다. 또한, 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.

발현 수준(expression level)

본 명세서에서 사용되는 "발현 수준"이라는 용어는, 특정 유전자로부터 발현된 산물, 예를 들어 mRNA 및/또는 단백질이 얼마나 잘 발현되는지를 의미한다. 일반적으로 세포 내 특정 유전자의 발현 수준이 높은 경우, 세포 내에 포함된 상기 특정 유전자로부터 발현된 mRNA 및/또는 특정 단백질의 양, 또는 세포질 내 상기 발현 산물의 농도가 높은 것으로 나타난다. 반대로 세포내 특정 유전자의 발현 수준이 낮은 경우, 세포 내에 포함된 상기 특정 유전자로부터 발현된 mRNA 및/또는 특정 단백질의 양, 또는 세포질 내 상기 발현 산물의 농도가 낮은 것으로 나타난다. 본 명세서에서 "발현 수준이 높다" 혹은 "발현 수준이 낮다"고 쓰는 경우, 비교 대상이 달리 명시되지 않는 한, 그 비교 대상은 동종의, 야생형의 세포라고 해석할 수 있다. 또한, 비교 기준이 되는 정량적인 지표는 문맥 상 가장 적합한 것으로 해석되어야 한다. 예를 들어, 각 세포의 절대량, 상대량, 및/또는 농도가 비교 기준이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 제1세포 내에서 a유전자의 발현 수준이, 제2세포 내에서 a유전자의 발현 수준보다 높다고 표현하는 경우, 제1세포 내의 a유전자의 발현 산물(mRNA, 단백질 등)이 제2세포 내의 a유전자의 발현 산물보다 절대량이 더 많거나, 상대량이 더 많거나, 및/또는 농도가 더 높을 수 있다. 또한, 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.

면역회피기능

본 명세서에서 사용하는 "면역회피기능"이라는 용어는, 암세포가 면역 시스템으로부터 벗어나기 위해 사용하는 메커니즘(mechanism)을 의미한다. 이러한 면역회피기능은 암세포가 자신들을 인식하고 파괴하는 면역 세포들의 공격을 회피하고 생존을 유지하는 역할을 하는 기능이다. 면역회피기능을 수행하는데 중요한 역할을 하는 단백질의 예시로 PD-L1 (Programmed Death-Ligand 1) 및 B7-H3 (B7 homolog 3)이 있다. PD-L1 및 B7-H3은 면역 세포와 상호 작용하여 암세포의 면역회피를 유도하는 역할을 한다. 구체적으로, PD-L1은 암세포의 표면에 발현되며, 면역 세포 중 T 세포의 PD-1 수용체와 상호 작용하여 T 세포의 기능을 억제한다. 이로 인해 T 세포는 암세포를 인식하고 공격하는 능력을 상실하게 된다. B7-H3도 마찬가지로 T 세포를 억제하여 암세포의 면역회피를 촉진하는 역할을 한다. 따라서, PD-L1 및/또는 B7-H3 등의 단백질을 억제하면, 암세포의 면역회피기능을 억제할 수 있다. 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.

종래 항암 치료의 문제점

암 세포는 면역회피기능이 있기 때문에, 체내의 면역시스템이 암에 정상적으로 작용될 수 없다. 구체적으로, 암 세포는 신체의 면역 모니터링 시스템을 회피하고, 면역 억제를 통해 종양 미세 환경(tumor microenvironment, TME)에서 항암 면역을 효과적으로 억제한다.

암 세포의 면역회피기능과 관련된 메커니즘 중 하나는 PD-L1 또는 B7-H3과 같은 면역 체크포인트 단백질의 발현과 관련이 있다. 암 세포는 표면에 존재하는 PD-L1 또는 B7-H3과 같은 면역 회피 시스템을 사용하여 생체 내 면역 감시를 회피한다.

위와 같은 면역회피기능으로 인하여 기존에 암을 치료하는 방법은 매우 제한적이다. 따라서 이러한 점을 극복하기 위하여, TSG-6를 억제함으로써 암의 면역회피기능을 억제하는 방법을 통해 암을 치료 또는 예방할 수 있는 기술로 본 발명을 제시한다.

조작된 종양 세포

본 발명의 일 태양으로 조작된 종양 세포가 있다.

상기 조작된 종양 세포는 TSG-6(TNF-stimulated gene 6 protein)이 억제된 종양 세포이다. 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 TSG-6의 발현이 억제된 종양 세포일 수 있다. 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 TSG-6의 작용(또는 기능)이 억제된 종양 세포일 수 있다. 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 TSG-6의 발현과 작용이 억제된 종양 세포일 수 있다. 구체적으로, 상기 조작된 종양 세포의 게놈은 조작된 TNFAIP6(tumor necrosis factor, alpha-induced protein 6) 유전자를 포함함으로 인하여 TSG-6가 억제된 종양 세포일 수 있다.

상기 조작된 종양 세포는 면역회피기능이 억제된 종양 세포일 수 있다. 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 PD-L1(Programmed Death-Ligand 1)이 억제된 종양 세포일 수 있다. 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 B7-H3(B7 homolog 3)이 억제된 종양 세포일 수 있다.

상기 조작된 종양 세포는 아폽토시스가 유도될 수 있도록 설계된 종양 세포일 수 있다. 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 아폽토시스가 예정된 종양 세포일 수 있다. 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 아폽토시스가 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 이내에 유도될 수 있도록 디자인된 종양 세포일 수 있다.

상기 조작된 종양 세포는 동물 세포로부터 유래된 것이다. 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 비인간 동물 세포로부터 유래된 것일 수 있다. 다른 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 인간 세포로부터 유래된 것일 수 있다. 이때, 상기 조작된 종양 세포는 환자의 세포로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 조작된 종양 세포는 환자의 고형암 세포로부터 유래된 것일 수 있다.

상기 조작된 종양 세포는 항암용으로 사용될 수 있다. 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 항암 기능을 가진다. 이때, 상기 항암 기능이란, 암세포에 대한 백신 및/또는 치료제의 역할을 하는 기능을 의미한다.

일 구체예로, 상기 항암 기능은, 체내의 면역 시스템을 활성화시켜 암세포를 인식하고 파괴할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 다른 일 구체예로, 상기 항암 기능은, 암세포의 면역회피기능을 억제하여 암세포에 대한 면역 세포의 기능을 활성화시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다. 또 다른 일 구체예로, 상기 항암 기능은, 체내의 면역 시스템이 종양특이적항원(Tumor specific antigen, TSA) 및/또는 종양관련항원(Tumor associated antigen, TAA)을 인식할 수 있도록 하는 것을 의미한다.

본 발명의 조작된 종양 세포는 암 백신(cancer vaccine)으로 이용될 수 있다. 암 백신(cancer vaccine)이란 암을 치료 또는 예방하기 위한 면역요법으로 암세포를 특이적으로 파괴하는 T세포의 활성을 인위적으로 조절할 수 있는 물질로서, 대부분 해당 암세포들을 직접 사용하는 방법을 이용하는 경우가 많다. 이때, 해당 암세포들을 직접 사용하는 경우, 암세포를 조작(또는 약화)시켜 사용할 수 있다. 본 발명의 조작된 종양 세포의 경우, 암세포의 TSG-6를 억제하여, 암 백신으로 이용할 수 있도록 조작된 세포이다.

본 출원의 조작된 종양 세포에 관한 상세한 내용을 아래에서 설명한다.

조작된 종양 세포의 특징1 - TSG-6이 억제됨

개괄

본 발명의 상기 조작된 종양 세포는 TSG-6이 억제된 종양 세포이다.

일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 TSG-6의 발현이 억제된 종양 세포일 수 있다. 구체적으로, 상기 조작된 종양 세포에서 TSG-6의 발현 수준이 낮을 수 있다. 일 구체예로, 야생형 종양 세포에 비하여, 상기 조작된 종양 세포에서 TSG-6의 발현 수준이 낮을 수 있다. 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포에서 TSG-6가 발현되지 않을 수 있다.

일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 TSG-6의 기능이 억제된 종양 세포일 수 있다. 구체적으로, TSG-6의 기능이 억제한다 함은 1) TSG-6 단백질 자체의 기능이 억제되거나, 2) TSG-6단백질이 다른 분자들과 상호작용하는 기능이 억제되거나, 3) 기타 직접, 간접적인 경로로 TSG-6의 기능이 억제된 것을 의미한다.

TSG-6 이 억제되는 경우1 - TSG-6 억제제

일 예로, 상기 조작된 종양 세포는 TSG-6 억제제에 의하여 TSG-6이 억제된 종양 세포일 수 있다. 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 TSG-6 억제제를 포함할 수 있다. 또 다른 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 TSG-6 억제제를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.

일 구현예로, 상기 TSG-6 억제제는 TSG-6 중화항체일 수 있다. 또 다른 구현예로, 상기 TSG-6 억제제는 TSG-6 유전자의 mRNA를 침묵시킬 수 있는 핵산 분자일 수 있다. 구체적으로, 상기 핵산 분자는 안티센스 올리고핵산(antisense oligonucleotide), RNAi, siRNA, 및/또는 shRNA일 수 있다. 또 다른 구현예로, 상기 TSG-6 억제제는 TSG-6의 기능을 억제하는 화합물 또는 small molecule일 수 있다.

TSG-6 이 억제되는 경우2 - 조작된 TNFAIP6유전자

일 예로, 상기 조작된 종양 세포는 조작된 TNFAIP6유전자에 의하여 TSG-6이 억제된 종양 세포일 수 있다. 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 TSG-6의 발현 및/또는 기능이 억제된 종양 세포일 수 있다. 다른 일 구체예로 상기 조작된 종양 세포는 조작된 TNFAIP6유전자를 포함할 수 있다. 또 다른 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포의 유전체(또는 게놈 DNA)는 조작된 TNFAIP6유전자를 포함할 수 있다. 또 다른 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 야생형 TNFAIP6유전자를 포함하지 않을 수 있다.

TSG-6이 억제되는 경우의 일 실시예로 조작된 TNFAIP6유전자에 관하여 아래에서 설명한다.

TSG-6억제의 예시 - 조작된 TNFAIP6유전자를 포함하는 경우

개괄

일 실시예로 본 발명의 조작된 종양 세포는 조작된 TNFAIP6유전자를 포함할 수 있다. 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포의 유전체(또는 게놈 DNA)는 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자를 포함할 수 있다. 상기 조작된 종양 세포는 야생형 TNFAIP6유전자를 포함하지 않을 수 있다.

일 구체예로, 상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자는, 서열 내에 인델(indel) 돌연변이을 포함하고, 야생형 TNFAIP6유전자 서열과 상이한 서열을 가진다. 상기 인델은 삽입(insertion) 및/또는 결실(deletion)을 의미한다.

또 다른 일 구체예로, 상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자는 큰 결실(large deletion)을 포함하고, 야생형 TNFAIP6유전자 서열과 상이한 서열을 가진다. 상기 큰 결실(large deletion)은 일정 크기 이상(예를 들어 200bp 이상)의 유전자 서열 부분이 제거된 돌연변이를 의미하며, 본 출원에서는 세포 내 NHEJ(Non-Homologous End Joining) 시스템에 의한 인델(indel) 돌연변이와 구별하기 위해 사용된 용어이다.

또 다른 일 구체예로, 상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자는 야생형 TNFAIP6유전자의 전체가 결실된 것을 의미할 수 있다.

또 다른 일 구체예로, 상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자는 서열 내에 외부 핵산 서열을 추가로 포함한 것일 수 있다. 이 때, 상기 외부 핵산 서열은 인위적으로 야생형 TNFAIP6유전자 서열 내에 삽입되어, 이 때, 상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자는 야생형 TNFAIP6유전자 서열과 상이한 서열을 가진다

인델을 포함하는, 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자

상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자의 핵산 서열은 야생형 TNFAIP6유전자의 핵산 서열과 동일하지 않다.

일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자는 야생형 TNFAIP6유전자와 비교하여, 서열 내에 인델을 포함한다. 일 구체예로, 상기 인델은 1bp, 2bp, 3bp, 4nt, 5bp, 6bp, 7bp, 8bp, 9bp, 10bp, 20bp, 30bp, 40bp, 50bp, 60bp, 70bp, 80bp, 90bp, 100bp, 110bp, 120bp, 130bp, 140bp, 150bp, 160bp, 170bp, 180bp, 190bp, 200bp, 또는 210bp 크기일 수 있다. 일 구체예로, 상기 인델은 바로 이전 문장에서 선택된 두 수치범위 사이의 크기 또는 이전 문장에서 선택된 수치 이하의 크기일 수 있다. 예를 들어, 상기 인델은 10 내지 100bp의 크기일 수 있다. 예를 들어, 상기 인델은 100bp 이하의 크기일 수 있다. 구체적으로, 상기 인델은 5bp 또는 13bp의 크기일 수 있다.

일 구체예로, 상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6 유전자의 서열은, 야생형 TNFAIP6유전자와 비교하여, 다음 서열을 포함하지 않을 수 있다: 5'-GCTCACCTACGCCGAAGCCA-3'(서열번호 1). 다른 일 구체예로, 상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6 유전자의 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 80%이상, 예를 들어, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95% 또는 95 내지 100%의 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가지는 핵산 서열을 포함하지 않을 수 있다. 또 다른 일 구체예로, 상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6 유전자의 서열은 야생형 TNFAIP6유전자와 비교하여 다음 서열을 포함하지 않을 수 있다: 5'- CCAAG-3'. 또 다른 일 구체예로, 상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6 유전자의 서열은 다음 서열을 포함하지 않을 수 있다: 5'-CGAAGCCAAGGCC -3'(서열번호 3).

일 예로, 상기 인델은 인위적으로 조작된 TNFAIP6 유전자의 엑손(exon)1, 엑손2, 엑손3, 엑손4, 엑손5, 엑손6, 인트론(intron)1, 인트론2, 인트론3, 인트론4, 인트론5, 인트론6, 및 인트론7 중 어느 하나 이상에 위치할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 인델은 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자의 엑손 2에 위치할 수 있다.

조작된 TNFAIP6유전자의 특징

본 발명의 조작된 종양 세포는 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자에 의하여 TSG-6이 억제된 종양 세포일 수 있다. 일 구체예로 상기 조작된 종양 세포의 유전체(또는 게놈 DNA)가 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자를 포함함으로 인하여, 상기 조작된 종양 세포는 TSG-6이 억제된 종양 세포일 수 있다.

상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자로 인하여 TSG-6이 발현되지 않을 수 있다. 일 구체예로, 상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자로부터 TSG-6을 암호화하는 mRNA가 발현되지 않을 수 있다. 다른 일 구체예로, 상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자로부터 발현된 단백질은 야생형 TSG-6단백질과 아미노산 서열이 다를 수 있다. 이때, 상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자로부터 발현된 단백질은 야생형 TSG-6단백질과 동일한 기능을 할 수 없다.

조작된 종양 세포의 특징2 - 면역회피기능이 억제됨

개괄

본 발명의 조작된 종양 세포는 면역회피기능이 억제된 것이다. 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 야생형 종양 세포에 비하여 면역회피기능이 억제된 것일 수 있다. 다른 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 야생형 종양 세포에 비하여 면역회피수준이 낮은 것일 수 있다. 또 다른 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 야생형 종양 세포에 비하여 면역회피능력이 낮은 것일 수 있다.

상기 조작된 종양 세포에서의 면역회피기능의 억제는 PD-L1 및/또는 B7-H3의 억제로 인한 것일 수 있다. 상기 조작된 종양세포에서의 PD-L1 및/또는 B7-H3의 억제는 TSG-6의 억제로 인한 것일 수 있다.

TSG-6가 억제됨에 따른 PD-L1 및/또는 B7-H3의 억제

상기 조작된 종양 세포는 PD-L1 및/또는 B7-H3이 억제된 종양 세포일 수 있다. 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 TSG-6가 억제됨으로 인하여 PD-L1 및/또는 B7-H3이 억제된 종양 세포일 수 있다.

일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 PD-L1 및/또는 B7-H3의 발현이 억제된 종양 세포일 수 있다. 구체적으로, 상기 조작된 종양 세포에서 PD-L1 및/또는 B7-H3의 발현 수준이 낮을 수 있다. 일 구체예로, 야생형 종양 세포에 비하여, 상기 조작된 종양 세포에서 PD-L1 및/또는 B7-H3의 발현 수준이 낮을 수 있다. 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포에서 PD-L1 및/또는 B7-H3이 발현되지 않을 수 있다.

일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 PD-L1 및/또는 B7-H3의 기능이 억제된 종양 세포일 수 있다. 구체적으로, PD-L1 및/또는 B7-H3의 기능이 억제한다 함은 1) PD-L1 및/또는 B7-H3 단백질 자체의 기능이 억제되거나, 2) PD-L1 및/또는 B7-H3단백질이 다른 분자들과 상호작용하는 기능이 억제되거나, 3) 기타 직접, 간접적인 경로로 PD-L1 및/또는 B7-H3의 기능이 억제된 것을 의미한다.

PD-L1 및/또는 B7-H3의 억제에 따른 면역회피기능의 억제

PD-L1 및/또는 B7-H3은 면역 세포의 종양 세포에 대한 면역반응을 억제하는 기능을 가진다. 따라서, PD-L1 및/또는 B7-H3의 억제로 인하여 종양 세포의 면역회피기능이 억제될 수 있다. 일 구체예로, PD-L1 및/또는 B7-H3이 억제되면, 면역 세포의 종양 세포에 대한 면역반응이 증가할 수 있다.

본 발명의 조작된 종양 세포의 PD-L1 및/또는 B7-H3이 억제됨으로 인하여, 상기 조작된 종양 세포의 면역회피기능이 억제될 수 있다. 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 면역회피기능이 억제된 종양 세포일 수 있다. 구체적으로, 상기 조작된 종양 세포는 면역회피수준이 낮을 수 있다. 일 구체예로, 야생형 종양 세포에 비하여, 상기 조작된 종양 세포에서 면역회피수준이 낮을 수 있다. 일 구체예로, 야생형 종양 세포에 비하여, 상기 조작된 종양 세포에서 면역회피기능이 억제될 수 있다.

상기 조작된 종양세포의 면역회피기능이 억제됨으로 인하여, 상기 조작된 종양세포에 대한 면역반응 수준이 증가될 수 있다. 일 구체예로, 상기 조작된 종양세포에 대한 면역세포의 반응 수준이 증가될 수 있다. 다른 일 구체예로, 상기 조작된 종양세포에 대한 신체의 면역 모니터링 시스템이 정상적으로 작동할 수 있다. 또 다른 일 구체예로, TSG-6이 억제되지 않은 종양세포에 비하여, 상기 조작된 종양세포에서의 항암 면역(anticancer immunity)의 억제 수준이 낮을 수 있다.

조작된 종양 세포의 특징3 - 세포사멸(apoptosis)이 예정됨

개괄

본 발명의 조작된 종양 세포는 세포사멸이 예정된 세포일 수 있다. 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 세포사멸이 유도될 수 있도록 구성된(설계된, 처리된) 종양 세포일 수 있다. 또 다른 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 체내에 투여된 후 세포 사멸이 유도될 수 있다. 또 다른 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 이내에 세포사멸이 유도될 수 있도록 구성된 종양 세포일 수 있다.

세포사멸의 원인

본 출원의 조작된 종양 세포는 세포사멸이 예정되도록 인위적으로 조작된 세포일 수 있다. 일 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 방사선 조사에 의하여 세포사멸이 예정된 세포일 수 있다. 다른 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 약물 처리에 의하여 세포사멸이 예정된 세포일 수 있다. 구체적으로, 상기 약물 처리는 cisplatin, doxorubicin, 및/또는 paclitaxel을 처리하는 것일 수 있다. 또 다른 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 항체에 의하여 세포사멸이 예정된 세포일 있다. 또 다른 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 열충격(Heat shock)에 의하여 세포사멸이 예정된 세포일 있다. 또 다른 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 유전자 조작에 의하여 세포사멸이 예정된 세포일 있다. 또 다른 구체예로, 상기 조작된 종양 세포는 저분자 화합물에 의하여 세포사멸이 예정된 세포일 있다.

세포사멸의 효과

본 출원의 조작된 종양 세포는 대상에게 투여 후 체내에서 세포사멸이 일어나도록 예정 수 있다. 상기 세포사멸로 인하여, 체내의 면역시스템을 활성화시킬 수 있다. 구체적으로는, 상기 조작된 종양 세포의 세포사멸로 인하여, 체내의 면역시스템에 종양세포가 포함하고 있던 TAA 및/또는 TSA가 제공되고, 그로 인하여 종양 세포에 대한 면역시스템이 활성화될 수 있다. 이에 따라 종양 세포에 대한 면역기능이 강화되어, 체내의 암세포를 제거하는 효과가 발생할 수 있다.

조작된 종양 세포를 포함하는 약학적 조성물

개괄

본 명세서에서는 상기 조작된 종양 세포를 포함하는 항암용 조성물을 개시한다. 상기 항암용 조성물은 치료적으로 유효한 양의 조작된 종양 세포; 약학적으로 허용되는 담체; 및/또는 어쥬번트를 포함할 수 있다. 여기서, 상기 약학적으로 허용되는 담체는 상기 항암용 조성물의 적절한 제제화를 위한 것일 수 있다.

대상 질병

상기 항암용 조성물은 종양 세포, 또는 종양 세포와 연관된 질병, 질환, 및/또는 증상을 치료 또는 예방하기 위한 것이다. 상기 종양 세포, 또는 종양 세포와 연관된 질병, 질환, 및/또는 증상은 통상의 기술자가 인식할 수 있는 것을 모두 포함한다. 일 구체예로, 상기 종양 세포, 또는 종양 세포와 연관된 질병, 질환, 및/또는 증상은 중피종, 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암 또는 자궁 암종, 피부암, 편평세포암(예를 들어, 상피 편평세포암), 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종을 포함하는 폐암, 복막암, 간세포암, 위장암을 포함하는 위암, 췌장암, 교모세포종, 간암, 방광암, 간종(hepatoma), 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 침샘 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 및/또는 두경부암일 수 있다. 구체적으로는 상기 고형종양은 간암세포, 폐암세포 또는 유방암세포일 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체

일 구체예로, 상기 약학적으로 허용되는 담체는 세포치료제에 적합한 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 및/또는 에탄올일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

조성물의 제제

세포치료제에 적합한 일 구체예로, 상기 항암용 조성물을 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 유효 성분인 세포를 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조할 수 있다. 더 나아가 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 일 구현예로, 상기 항암용 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

항암용 조성물의 용도

상기 조성물은 항암 용도로 사용될 수 있다. 이때, 항암 용도란, 암과 관련된 질병의 예방, 증상 완화, 및/또는 치료용 용도를 의미한다. 일 구체예로, 상기 항암용 조성물은 암 세포의 발생, 성장, 및/또는 전이를 억제하는 용도로 사용될 수 있다. 다른 일 구체예로, 상기 항암용 조성물은 암 세포의 사멸을 유도하기 위하여 사용될 수 있다. 본 출원의 조성물은 암 백신(cancer vaccine)의 용도를 포함한다.

조작된 종양 세포를 이용한 항암 방법

항암 방법 개괄

본 명세서에서는 상기 조작된 종양 세포를 포함하는 항암용 조성물을 이용한 항암 방법을 개시한다. 상기 항암 방법은 치료적으로 유효한 상기 항암용 조성물을 적절한 투여방법, 적절한 투여용법, 및 적절한 투여용량으로 대상에 투여하는 것을 포함한다.

투여대상

상기 항암 방법은 암 또는 암 세포와 관련된 질병을 앓고 있는 인간, 및/또는 비인간 동물을 투여 대상으로 한다. 일 구체예로, 상기 항암 방법은 상기 항암용 조성물을 인간 및/또는 동물에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 다른 일 구체예로, 상기 항암 방법은 상기 항암용 조성물을 인간에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 일 구체예로, 상기 항암 방법은 상기 항암용 조성물을 암에 걸린 인간(또는 암 환자)에 투여하는 것을 포함할 수 있다.

투여 부위 및 방법

상기 항암 방법은 상기 항암용 조성물을 정맥 내 주입, 근육 주입, 복강주입, 경피 투여, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 또는 암조직 내 주입하는 방법으로 대상에 투여하는 과정을 포함할 수 있다.

투여량

상기 항암용 조성물의 적절한 투여용량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

병용 치료 방법 예시

본 발명의 항암 방법은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료, 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법, 및/또는 항체 치료방법과 병용하여 사용될 수 있다.

조작된 종양 세포를 제작하는 방법

개괄

본 발명의 일 양태로 상기 설명한 인위적으로 조작된 종양 세포를 제작하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포에 TSG-6 억제용 조성물을 전달(delivered), 주입(injected), 및/또는 도입(introduced)하는 단계를 포함한다.

일 구체예로, 상기 방법은 종양 세포의 아폽토시스의 발생이 예정되도록 하는 방법을 추가로 더 포함할 수 있다.

TSG-6 억제용 조성물

본 명세세에서 개시하는 TSG-6 억제용 조성물은 TSG-6의 발현 또는 기능을 억제할 수 있는 것을 포함한다. TSG-6 억제용 조성물은 TNFAIP6유전자의 mRNA를 침묵시키는 핵산, TNFAIP6유전자를 넉아웃 또는 넉다운시키는 CRISPR/Cas 시스템, TSG-6 단백질 기능을 억제하는 화합물, 또는 TSG-6 단백질 기능을 억제하는 압타머 등을 포함할 수 있다.

일 구체예로, 상기 TSG-6억제용 조성물은 TSG-6중화항체 또는 상기 중화항체의 단편을 포함할 수 있다. 상기 TSG-6중화항체 또는 상기 중화항체의 단편은 종양 세포 내 발현된 TSG-6단백질과 결합하여, 상기 TSG-6단백질이 다른 분자와 상호작용하는 것을 방해하고, 결과적으로 TSG-6단백질의 기능을 억제할 수 있다. 다른 일 구체예로, 상기 TSG-6억제용 조성물은 TNFAIP6유전자로부터 전사된 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산으로, siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA), 및 안티센스 핵산 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 또 다른 일 구체예로, 상기 TSG-6억제용 조성물은 TSG-6단백질이 다른 분자와 상호작용하는 것을 막는 기능을 하는, 화합물 및/또는 small molecule을 포함할 수 있다. 또 다른 일 구체예로, 상기 TSG-6억제용 조성물은 TSG-6단백질이 다른 분자와 상호작용하는 것을 막는 기능을 하는, DNA 및/또는 RNA 압타머를 포함할 수 있다.

또한, 본 출원의 TSG-6 억제용 조성물의 일 실시예로 TNFAIP6유전자 조작용 조성물이 있고, 이는 별도로 후술한다.

TSG-6 억제용 조성물의 주입

상기 조작된 종양 세포를 제작하는 방법은 TSG-6 억제용 조성물을 전달(delivered), 주입(injected), 및/또는 도입(introduced)하는 단계를 포함한다.

상기 전달, 주입, 및/또는 도입 방법은, 세포 내로 TSG-6 억제용 조성물을 세포 내로 전달할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다.

일 구체예로, 상기 전달, 주입, 및/또는 도입 방법은 미세주입법, 전기천공법, 유전자총, 초음파천공법, 자기주입법(magnetofection), 및/또는 일시적인 세포 압축 또는 스퀴징일 수 있다.

일 구현예로, 상기 전달, 주입, 및/또는 도입 방법은 나노파티클을 이용하여 전달하는 것일 수 있다. 이때, 상기 전달 방법은 양이온성 리포좀법, 초산 리튬-DMSO, 지질-매개 형질감염(transfection), 인산칼슘 침전법(precipitation), lipofection, PEI(Polyethyleneimine)-매개 형질감염, DEAE-dextran 매개 형질감염, 및/또는 나노파티클-매개 핵산 전달(Panyam et. , al Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13.pii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023 참조)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구체예로, 상기 지질-매개 형질감염은 지질 나노입자(lipid nanoparticle, LNP) 및/또는 PEG를 이용한 것일 수 있다. 일 구체예로, 상기 LNP는 양성자화된 이온화 지질 및/또는 중성을 나타내는 이온화 지질을 포함할 수 있다.

다른 구체예로, 상기 미세주입법은 일정한 흐름 시스템(constant flow system 또는 continuous flow injection mode), 펄스 흐름 시스템(pulsed flow system), 및/또는 pronuclear injection을 이용한 것일 수 있다.

세포사멸이 예정되도록 하는 방법

본 출원의 인위적으로 조작된 종양 세포가 세포사멸이 예정되도록 하는 방법은, 방사선 조사, 약물 처리(cisplatin, doxorubicin, 및/또는 paclitaxel), 항체, 열충격(Heat shock), 유전자 조작, 및/또는 저분자 화합물을 이용하여 수행될 수 있다. .

전술한 바와 같이, 본 출원의 TSG-6 억제용 조성물의 일 실시예로 TNFAIP6유전자 조작용 조성물이 있다. 상기 TNFAIP6유전자 조작용 조성물은 인위적으로 게놈 상 TNFAIP6유전자의 서열에 인델(indel)을 발생시킬 수 있는 기술을 이용할 수 있다. . 예를 들어, 유전자 가위(engineered nuclease) 기술을 이용할 수 있다.

상기 유전자 가위 기술에서의 TNFAIP6유전자 조작용 조성물에 사용되는 단백질은 Cas 단백질, 징크핑거 뉴클레이즈(Zinc Finger Nuleases; ZFN) 또는 탈렌(TALEN; Tranion Activator-Like Effector Nucleases)일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.

상기 본 출원의 TNFAIP6유전자 조작용 조성물의 구체적인 예로써, CRISPR/Cas시스템을 들 수 있고, 이하, 이를 중심으로 기술한다.

CRISPR/Cas 시스템

개괄

CRISPR/Cas 시스템은 원핵생물 유기체에서 발견되는 면역 시스템의 일종이며, Cas 단백질, 및 가이드 RNA를 포함한다. Cas 단백질, 또는 가이드 RNA의 자세한 구성에 대해서는 공개문헌인 WO2018/231018(국제공개번호)에 자세히 설명되어 있다. 본 명세서에서 사용되는 "Cas 단백질" 이라는 용어는 CRISPR/Cas 시스템에서 이용되는 것으로 해석될 수 있는 뉴클레이즈(nuclease)를 총칭하는 용어이다. 다만, 설명의 편의를 위해, 이하에서는 가장 일반적으로 쓰이는 CRISPR/Cas 시스템의 DNA 절단 과정을 예를 들어 간략히 설명한다.

Cas 단백질

CRISPR/Cas 복합체에서, 핵산을 절단하는 뉴클레이즈(nuclase) 활성을 가지는 단백질을 Cas 단백질이라 한다. 상기 Cas 단백질 중에서, 대표적인 예로 Cas9 단백질을 들 수 있고, 상기 Cas9 단백질은 CRISPR/Cas 시스템 분류 상 Class 2, Type II에 해당하며, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 속 (Streptococcus sp.), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum) 유래 Cas9 단백질 등이 있다. 일 구체예에서, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질(spCAs9)일 수 있다. .

본 출원에서 사용할 수 있는 Cas 단백질은 CRISPR/Cas 시스템을 활용할 수 있는 것이라면, 그 종류에 제한이 없다. 일 실시예에서는 spCas9을 사용하였다.

가이드 RNA

CRISPR/Cas 복합체에서, 표적 핵산에 포함된 특정 서열을 인식하도록 CRISPR/Cas 복합체를 유도하는 기능을 가지는 RNA를 가이드 RNA라 한다. 상기 가이드 RNA의 구성을 기능적으로 나눈다면 크게, 1) 스캐폴드 서열 부분, 및 2) 가이드 서열 부분으로 나눌 수 있다. 상기 스캐폴드 서열 부분은 Cas 단백질과 상호작용하는 부분으로, Cas 단백질과 결합하여 복합체를 이룰 수 있도록 하는 부분이다.

일 예에서, 상기 스캐폴드 서열 부분은 tracrRNA, crRNA 반복 서열 부분을 포함하며, 상기 스캐폴드 서열은 Cas 단백질의 종류 및 유래에 따라서 결정된다. 상기 가이드 서열 부분은, 표적 핵산 내 일정 길이의 뉴클레오타이드 서열 부분과 상보적으로 결합할 수 있는 부분이다. 상기 가이드 서열 부분은 인위적으로 변형할 수 있는 염기 부분으로, 관심 있는 표적 뉴클레오타이드 서열에 의해 결정된다. 본 출원에서 사용할 수 있는 가이드 RNA는, 선택된 Cas 종류에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 가이드 RNA는 Cas의 종류에 따라 tracrRNA 및 crRNA로 구성되거나, crRNA로만 구성될 수 있다. 일 실시예에서는 spCas9 및; 이에 따른 tracrRNA 및 crRNA로 구성된 가이드 RNA를 사용하였다.

이하 CRISPR/Cas9 시스템을 중심으로 기술한다.

CRISPR/Cas9 복합체가 표적 핵산을 절단하는 과정

CRISPR/Cas9 복합체가 표적 핵산에 접촉하여 Cas9 단백질이 일정 길이의 뉴클레오타이드 서열을 인식하고, 가이드 RNA의 일부(상기 가이드 서열 부분)가 상기 PAM 서열과 인접한 부분과 상보적으로 결합하는 경우, CRISPR/Cas9 복합체에 의해 상기 표적 핵산이 절단된다.

이때, Cas9 단백질이 인식하는 일정 길이의 뉴클레오타이드 서열은 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer-adjacent motif, PAM) 서열이라 하며, 이는 Cas9 단백질의 종류나 기원에 따라 결정되는 서열이다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질은 표적 핵산 내 5'-NGG-3' 서열을 인식할 수 있다. 이때, 상기 N은 상기 N은 아데노신(A), 티미딘(T), 사이티딘(C), 구아노신(G)중 하나이다.

CRISPR/Cas9 복합체가 이중가닥 DNA를 절단할 때, 이중가닥 DNA에서, 가이드 도메인 부분과 결합하는 프로토스페이서(protospacer)가 있는 가닥을 표적 가닥(Target strand, TS)이라 한다. 상기 표적 가닥과는 상보적인 가닥으로, 상기 가이드 도메인 부분과 결합하지 않는 프로토스페이서(protospacer)가 있는 가닥을 비표적 가닥(Non-target strand, NTS)라 한다. 상기 설명한 PAM은 이러한 비표적 가닥에 존재한다.

상기 가이드 도메인 부분은 이중가닥 DNA의 표적 가닥(TS)에 포함된 프로토스페이서 서열 부분과 상보적으로 결합할 수 있다. 상기 가이드 도메인 부분 및 이중가닥 DNA의 비표적 가닥(NTS)에 포함된 프로토스페이서 서열은 동등한(equivalent) 서열이다. 구체적으로, 가이드 서열은 RNA 서열이고, 비표적 가닥(NTS)에 포함된 프로토스페이서 서열은 이에 대응되는 DNA 서열이라는 차이가 있을 뿐이다.

그러므로, CRISPR/Cas9 복합체가 표적 핵산을 절단하기 위해서는 가이드 RNA의 가이드 도메인 부분이 표적 가닥의 표적 서열(프로토스페이서)과 상보적으로 결합해야 하므로, 가이드 RNA의 기 가이드 도메인 부분을 설계 시, 비표적 가닥 중 "표적 서열과 상보적인 핵산 서열"에 상응하는 RNA 서열로 설계할 수 있다. , 구체적으로는 PAM 서열과 인접한 서열 부분의 DNA 서열에 상응하는 RNA 서열을 설계하여 사용된다(T를 U로 변경하여 디자인할 수 있음).

CRISPR/Cas9 복합체가 상기 표적 핵산을 절단할 때, 표적 핵산의 PAM 서열 부분 및/또는 상기 가이드 서열과 상보적으로 결합하는 서열 부분 내 임의의 위치가 절단되게 된다.

NHEJ(Non-Homologous End Joining)에 따른 인델(indel)형성

CRISPR/Cas9 복합체로 인하여 표적 유전자에서 이중 가닥 절단(Double-strand break, DSB)이 발생할 수 있다. 이때, DSB가 발생한 부분은 비-상동성 말단-결합(non-homologous end joining, NHEJ)의 메커니즘(mechanism)을 통하여 수선될 수 있다. 이때, NHEJ에 의하여 수선된 경우, 짧은 유전자 단편의 치환, 삽입 또는 결실(즉, 인델)을 야기하고, 표적 유전자의 넉아웃(Knock-out)이 일어날 수 있다.

TSG-6 억제용 조성물 예시 - CRISPR/Cas9 조성물

개괄

일 구현예로, TNFAIP6 유전자 조작용 조성물은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 TNFAIP6 유전자를 편집할 수 있는 구성을 가진다. 상기 유전자 조작용 조성물은 전술한 조작된 종양 세포의 유전자형, 및/또는 표현형을 나타낼 수 있도록, 적합한 세포 내 표적 서열을 인지하고 이를 편집할 수 있도록 설계된 것이다. 일 구현예로, 상기 유전자 조작용 조성물은 Cas9 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA, 및 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함할 수 있다.

TNFAIP6유전자 조작용 조성물 구성요소1 - Cas9 단백질

일 구현예로, 본 명세서에서 개시되는 TNFAIP6유전자 조작용 조성물은 Cas9 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함한다. 이때, 상기 Cas9 단백질은 자연계에 존재하는 Cas9 단백질이거나, 자연계에 존재하는 Cas9 단백질에서 하나 이상의 도메인이 인위적으로 변형된 Cas9 단백질일 수 있다. 일 구현예로, 상기 Cas9 단백질은 상기 Cas9 단백질에 포함된 일부 또는 전부 도메인의 기능이 불활성화된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질일 수 있다.

TNFAIP6 유전자 조작용 조성물 구성요소2 - 가이드 RNA

본 명세서에서 개시되는 TNFAIP6 유전자 조작용 조성물은 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함한다. 이때, 상기 가이드 RNA의 표적 유전자는 TNFAIP6 유전자이다.

상기 가이드 RNA는 스캐폴드 부분, 및 가이드 도메인 부분을 포함한다. 일반적으로, 상기 스캐폴드 부분은 tracrRNA, 및 반복 서열 부분(direct repeat)을 포함하며, 상기 가이드 도메인 부분 및 일부 반복 서열 부분은 crRNA에 포함된다. 일 구체예로, 상기 crRNA는 5'말단에서 3'말단 방향으로 가이드 도메인 부분 및 반복 서열 부분이 순차적으로 연결된 것일 수 있다.

상기 가이드 도메인은, 표적 핵산 내 일정 길이의 뉴클레오타이드 서열 부분과 상보적으로 결합할 수 있는 부분이다. 상기 가이드 도메인 부분은, 표적 핵산 내 일정 길이의 뉴클레오타이드 서열 부분과 상보적으로 결합할 수 있는 부분으로, 약 15 내지 30 nt의 길이를 가질 수 있다. 상기 가이드 도메인은 인위적으로 변형할 수 있는 서열로서, 관심 있는 표적 뉴클레오타이드 서열에 의해 결정된다. 상기 스캐폴드 부분은 Cas9 단백질과 상호작용하는 부분으로, Cas9 단백질과 상호작용하여 CRISPR/Cas9 복합체를 형성할 수 있다.

일 구체예로, 상기 가이드 RNA는 TNFAIP6유전자의 엑손(exon)1, 엑손2, 엑손3, 엑손4, 엑손5, 엑손6, 인트론(intron)1, 인트론2, 인트론3, 인트론4, 인트론5, 인트론6, 및 인트론7 중 어느 하나를 표적으로 할 수 있다. 구체적으로는 상기 가이드 RNA는 TNFAIP6유전자의 엑손 2를 표적으로 할 수 있다.

일 구체예로, 상기 가이드 RNA 중 가이드 도메인의 서열은 다음 서열을 포함할 수 있다: 5'-GCUCACCUACGCCGAAGCCA -3'(서열번호 4). 다른 일 구체예로, 상기 가이드 도메인의 서열은 서열번호 4의 서열과 적어도 80%이상, 예를 들어, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95% 또는 95 내지 100%의 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가지는 핵산 서열을 포함할 수 있다.

일 구체예로, 상기 가이드 도메인의 서열은 다음 서열을 포함할 수 있다: 5'-G UACGGCCUUGGCUUCGGCGU -3'(서열번호 5). 다른 일 구체예로, 상기 가이드 도메인의 서열은 서열번호 5의 서열과 적어도 80%이상, 예를 들어, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95% 또는 95 내지 100%의 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가지는 핵산 서열을 포함할 수 있다.

가이드 RNA의 스캐폴드 부분은 tracrRNA, 및 반복 서열 부분(direct repeat)을 포함하고, 상기 tracrRNA, 및 반복 서열 부분은 함께 사용하는 Cas단백질의 기원이나 종류에 따라 결정될 수 있다.

일 구체예로, spCas9과 함께 사용할 수 있는 상기 가이드 RNA의 스캐폴드 부분은 다음의 반복 서열을 포함할 수 있다: 5'-GTTTTAGAGCTAGAA -3'(서열번호 6). 다른 일 구체예로, 상기 스캐폴드 부분의 서열은 서열번호 6의 서열과 적어도 80%이상, 예를 들어, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95% 또는 95 내지 100%의 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가지는 핵산 서열을 포함할 수 있다.

일 구체예로, spCas9과 함께 사용할 수 있는 상기 가이드 RNA의 스캐폴드 부분은 다음의 반복 서열을 포함할 수 있다: 5'- GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT -3'(서열번호 82). 다른 일 구체예로, 상기 스캐폴드 부분의 서열은 서열번호 82의 서열과 적어도 80%이상, 예를 들어, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95% 또는 95 내지 100%의 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가지는 핵산 서열을 포함할 수 있다.

또한, spCas9과 함께 사용할 수 있는 tracrRNA 서열은 공지된 서열을 사용할 수 있다.

CRISPR/Cas9 시스템 구성요소의 포함 형태

상기 TNFAIP6유전자 조작용 조성물 내에 포함된 CRISPR/Cas 시스템의 각 구성요소의 형태는 상기 TNFAIP6유전자 조작용 조성물이 세포 내에 도입되는 경우, CRISPR/Cas 복합체가 형성되어 TNFAIP6유전자를 인위적으로 조작할 수 있도록 하는 형태라면 특별히 제한되지 않는다.

일 구체예로, 상기 TNFAIP6유전자 조작용 조성물은 상기 Cas9 단백질을 암호화하는 핵산 및/또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 핵산이 포함된 벡터를 가지고 있을 수 있다.

일 구체예로, 상기 벡터는 발현 조절 요소, 선별 요소 등을 더 포함할 수 있다. 상기 발현 조절 요소는 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통(Kozak consensus) 서열, ITR(inverted terminal repeat), LTR(long terminal repeat), 종결자(terminator), 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site, IRES), 2A 자가 절단 펩타이드(2A self-cleaving peptides) 또는 복제원점(replication origin) 등일 수 있다. 상기 선별 요소는 형광 단백질 유전자, 태그(tag), 리포터 유전자, 항생제 내성 유전자 등일 수 있다.

일 구체예로, 상기 벡터는 플라스미드 및/또는 바이러스 벡터일 수 있다. 일 구현예로, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 백시니아바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택된 하나일 수 있다. 일 구현예로, 상기 벡터는 비바이러스 벡터일 수 있다. 일 구체예로, 상기 비바이러스 벡터는 플라스미드, 파지, 네이키드 DNA, DNA 복합체, 및 mRNA로 구성된 군에서 선택되는 1 이상일 수 있다. 일 구현예로, 상기 플라스미드는 pcDNA 시리즈, pS456, p326, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, 및 pUC19으로 이뤄진 군에서 선택된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 파지는 λgt4λB, λ-Charon, λ△z1, 및 M13으로 이뤄진 군에서 선택된 것일 수 있다. 일 구체예로, 상기 암호화 핵산은 PCR 앰플리콘(amplicon)일 수 있다.

상기 TNFAIP6 유전자 조작용 조성물은 상기 Cas9 단백질 및 상기 가이드 RNA를 포함하고, 상기 Cas9 단백질과 상기 가이드 RNA는 리보뉴클레오프로테인(ribonucleoprotein, RNP) 형태로 존재할 수 있다. 일 구체예로, 상기 TNFAIP6유전자 조작용 조성물은 상기 Cas9 단백질 및 상기 가이드 RNA가 결합된 리보뉴클레오프로테인(RNP, ribonucleoprotein)을 포함할 수 있다.

일 구체예로, 상기 TNFAIP6유전자 조작용 조성물은 다음의 1) 내지 4)의 구성 중 어느 하나 이상의 구성을 포함할 수 있다: 1) Cas9 단백질 및 가이드 RNA; 2) Cas9 단백질를 암호화하는 핵산 및 가이드 RNA; 3) Cas9 단백질를 암호화하는 핵산 및 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 4) Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 암호화하는 핵산.

구체적으로는 상기 CRISPR/Cas9 조성물은 SpCas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함할 수 있다.

TNFAIP6 유전자 조작 결과 - 인델(indel) 발생

상기 TNFAIP6 유전자 조작용 조성물의 주입으로 인하여, 종양 세포 내 게놈의 TNFAIP6 유전자에서 이중 가닥 절단(Double-strand break, DSB)이 발생할 수 있다. 이때, DSB가 발생한 부분은 비-상동성 말단-결합(non-homologous end joining, NHEJ)의 메커니즘(mechanism)을 통하여 수선될 수 있다. 이때, NHEJ에 의하여 수선된 경우, 짧은 유전자 단편의 치환, 삽입 또는 결실을 야기하고, TNFAIP6유전자의 넉아웃(knock-out)이 일어날 수 있다.

일 구체예로, TNFAIP6 유전자에 인델이 발생할 수 있다. 이때, 상기 인델은 표적 서열 부분의 내부 및/또는 외부에서 일어날 수 있다. 상기 인델은, 유전자 편집 전 핵산의 뉴클레오타이드 배열에서 일부 뉴클레오타이드가 중간에 결실되거나, 임의의 뉴클레오타이드가 삽입되거나, 및/또는 상기 삽입과 결실이 혼입된 변이를 일컫는다.

상기 TNFAIP6유전자 내에 인델이 일어나면, TNFAIP6 유전자는 불활성화된다. 이러한 경우, 상기 TNFAIP6유전자가 코딩하는 TSG-6 단백질은 발현이 되지 않거나 손상된 단백질로 발현되어 기능적으로 결핍될 수 있다. 이러한 효과를 "TNFAIP6 유전자의 넉아웃(knock-out)"으로 지칭할 수 있다.

발명의 가능한 실시예

이하 본 명세서에서 제공하는 발명의 가능한 실시예들을 나열한다. 본 단락에서 제공하는 이하의 실시예들은 단지 발명의 일 예시에 해당될 뿐이다. 따라서, 본 명세서에서 제공하는 발명을 하기 실시예로 제한하여 해석할 수 없다. 실시예 번호와 함께 기재된 간략한 설명 또한, 각 실시예 간 구분의 편의를 위한 것일 뿐 본 명세서에서 개시하는 발명에 대한 제한으로 해석될 수 없다.

조작된 종양 세포

실시예1, 조작된 종양 세포

TSG-6이 억제된, 조작된 종양 세포.

실시예2, TSG-6 억제

실시예1에 있어서, 야생형 종양 세포(TSG-6이 억제되지 않은 종양 세포)에 비하여, TSG-6의 발현 수준이 낮거나 TSG-6의 기능이 억제된, 조작된 종양 세포.

실시예3, TSG-6의 억제 원인1

실시예1 내지 2에 있어서, 상기 조작된 종양 세포는 TSG-6에 대한 중화항체, TSG-6 유전자의 mRNA를 침묵시킬 수 있는 핵산 분자(안티센스 올리고핵산, RNAi, siRNA, 및/또는 shRNA), TSG-6의 기능을 억제하는 화합물 및/또는 small molecule에 의하여 TSG-6이 억제된 것을 특징으로 함.

실시예4, TSG-6의 억제 원인2

실시예1 내지 2에 있어서, 상기 조작된 종양 세포의 유전체(또는 genomic DNA)에 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자가 포함된 것을 특징으로 하는, 조작된 종양 세포.

실시예5, 조작된 TNFAIP6유전자의 구성1

실시예4에 있어서, 상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6 유전자는 인델을 포함하는 것을 특징으로 함.

실시예6, 조작된 TNFAIP6유전자의 구성2

실시예5에 있어서, 상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6 유전자는 야생형 TNFAIP6 유전자에 비하여 인델을 더 포함하는 것을 특징으로 함.

실시예7, 조작된 TNFAIP6유전자의 구성3

실시예5 내지 6에 있어서, 상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6 유전자는 야생형 TNFAIP6 유전자에서 인델을 더 포함하는 것을 특징으로 함.

실시예8, 조작된 TNFAIP6유전자의 구성4

실시예5 내지 7에 있어서, 상기 인델의 크기는 200bp이하인 것을 특징으로 함.

실시예9, 조작된 TNFAIP6유전자의 구성5

실시예5 내지 8에 있어서, 상기 인델은 상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6 유전자의 엑손(exon)1, 엑손2, 엑손3, 엑손4, 엑손5, 엑손6, 인트론(intron)1, 인트론2, 인트론3, 인트론4, 인트론5, 인트론6, 및 인트론7 중 어느 하나에 위치한 것을 특징으로 함.

실시예10, 조작된 TNFAIP6유전자의 구성6

실시예4에 있어서, 상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자는 야생형 TNFAIP6유전자에 비하여 큰 결실(large deletion) 및/또는 외부 유전자의 삽입(insertion)을 포함하는 것을 특징으로 함.

실시예11, 조작된 TNFAIP6유전자의 구성7

실시예4 내지 10에 있어서, 상기 조작된 종양 세포는 야생형 TNFAIP6유전자를 포함하지 않는 것을 특징으로 함.

실시예12, 조작된 TNFAIP6유전자의 특징1

실시예4 내지 11에 있어서, 상기 조작된 종양 세포는 유전체에 인위적으로 조작된 TNFAIP유전자를 포함함으로 인하여, TSG-6이 발현되지 않는 것을 특징으로 함.

실시예13, 조작된 TNFAIP6유전자의 특징2

실시예4 내지 12에 있어서, 상기 조작된 종양 세포는 유전체에 인위적으로 조작된 TNFAIP유전자를 포함함으로 인하여, 상기 조작된 종양 세포에서 발현된 TSG-6의 아미노산 서열이 야생형 TSG-6의 아미노산 서열과 다른 것을 특징으로 함.

실시예14, 조작된 TNFAIP6유전자의 특징3

실시예4 내지 13에 있어서, 상기 조작된 종양 세포는 유전체에 인위적으로 조작된 TNFAIP유전자를 포함함으로 인하여, 상기 조작된 종양 세포에서 발현된 TSG-6이 야생형 TSG-6과 동일한 또는 비슷한 수준의 기능을 하지 못하는 것을 특징으로 함.

실시예15, 면역회피기능1

실시예1 내지 14에 있어서, 상기 조작된 종양 세포의 면역회피기능이 억제된 것을 특징으로 함.

실시예16, 면역회피기능2

실시예1 내지 15에 있어서, 상기 조작된 종양 세포의 PD-L1 및/또는 B7-H3이 억제된 것을 특징으로 함.

실시예17, 면역회피기능3

실시예1 내지 16에 있어서, 상기 조작된 종양 세포는 TSG-6이 억제됨으로 인하여, 상기 조작된 종양 세포의 PD-L1 및/또는 B7-H3이 억제된 것을 특징으로 함.

실시예18, 면역회피기능4

실시예1 내지 17에 있어서, 상기 조작된 종양 세포는 PD-L1 및/또는 B7-H3의 발현 수준이 낮거나 기능이 저하된 것을 특징으로 함.

실시예19, 세포사멸1

실시예1 내지 18에 있어서, 상기 조작된 종양 세포는 세포사멸이 예정되어 있는 것을 특징으로 함.

실시예20, 세포사멸2

실시예1 내지 19에 있어서, 상기 조작된 종양 세포는 세포사멸이 유도될 수 있도록 구성된(또는 처리된) 것을 특징으로 함.

실시예21, 세포사멸3

실시예1 내지 20에 있어서, 상기 조작된 종양 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 이내에 세포사멸이 유도될 수 있도록 구성된(또는 처리된) 것을 특징으로 함.

실시예22, 세포사멸4

실시예1 내지 21에 있어서, 상기 조작된 종양 세포는 방사선 조사, 약물 처리(cisplatin, doxorubicin, 및/또는 paclitaxel), 항체, 열충격(Heat shock), 유전자 조작, 및/또는 저분자 화합물로 인하여 세포사멸이 유도될 수 있도록 구성된(또는 처리된) 것을 특징으로 함.

실시예23, 종양 세포1

실시예1내지 22에 있어서, 상기 조작된 종양 세포는 암세포인 것을 특징으로 함.

실시예24, 종양 세포2

실시예1내지 23에 있어서, 상기 조작된 종양 세포는 비인간 동물 또는 인간의 세포 유래인 것을 특징으로 함.

약학적 조성물

실시예25, 약학적 조성물

실시예1 내지 24 중 어느 하나의 조작된 종양 세포를 포함하는 항암용 조성물.

실시예26, 구성요소

실시예25에 있어서, 상기 항암용 조성물은 치료적으로 유효한 양의 조작된 종양 세포; 약학적으로 허용되는 담체; 및/또는 어쥬번트를 포함하는 것을 특징으로 함.

실시예27, 담체

실시예26에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 식염수, PBS(phosphate buffered saline) 및/또는 배지인 것을 특징으로 함.

실시예28, 제제화

실시예25 내지 27에 있어서, 상기 항암용 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유하며, 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화된 것을 특징으로 함.

실시예29, 용도

실시예25 내지 28에 있어서, 상기 항암용 조성물은 항암 용도(암과 관련된 질병의 예방, 증상 완화, 및/또는 치료용 용도) 또는 암 세포의 발생, 성장, 및/또는 전이를 억제하는 용도로 사용될 수 있는 것을 특징으로 함.

항암 방법

실시예30, 항암 방법

실시예25 내지 29 중 어느 하나의 항암용 조성물을 적절한 투여방법, 적절한 투여용법, 및 적절한 투여용량으로 대상에 투여하는 방법을 포함하는, 항암 방법.

실시예31, 투여대상

실시예30에 있어서, 상기 투여대상은 암 또는 암 세포와 관련된 질병을 앓고 있는 인간, 또는 비인간 동물인 것을 특징으로 함.

실시예32, 투여방법

실시예30 내지 31에 있어서, 상기 투여방법은 투여대상의 정맥 내 주입, 근육 주입, 복강주입, 경피 투여, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 또는 암조직 내 주입하는 방법인 것을 특징으로 함.

실시예33, 투여용량

실시예30 내지 32에 있어서, 상기 적절한 투여용량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인을 고려하여 결정된 것을 특징으로 함.

실시예34, 병용 치료

실시예30 내지 33에 있어서, 항암 방법은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료, 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법, 및/또는 항체 치료방법과 병용하여 사용되는 것을 특징으로 함.

TNFAIP6 유전자 조작용 조성물

실시예35, TNFAIP6 유전자 조작용 조성물

다음을 포함하는 TNFAIP6 유전자 조작용, 조성물:

Cas9 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산; 및

가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산.

실시예36, Cas9 단백질1

실시예35에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 속 (Streptococcus sp.), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 또는 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum) 유래 Cas9 단백질인 것을 특징으로 함.

실시예37, Cas9 단백질2

실시예35 내지 36에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질인 것을 특징으로 함.

실시예38, 가이드 RNA1

실시예35 내지 37에 있어서, 상기 가이드 RNA는 TNFAIP6 유전자를 표적으로 하는 것을 특징으로 함.

실시예39, 가이드 RNA2

실시예35 내지 38에 있어서, 상기 가이드 RNA는 TNFAIP6 유전자의 엑손(exon)1, 엑손2, 엑손3, 엑손4, 엑손5, 엑손6, 인트론(intron)1, 인트론2, 인트론3, 인트론4, 인트론5, 인트론6, 및 인트론7 중 어느 하나를 표적으로 함.

실시예40, 가이드 RNA3

실시예35 내지 39에 있어서, 상기 가이드 RNA는 TNFAIP6유전자의 엑손2를 표적으로 하는 것을 특징으로 함.

실시예41, 가이드 RNA4

실시예35 내지 40에 있어서, 상기 가이드RNA는 가이드 도메인을 포함하며, 상기 가이드 도메인의 서열은 서열번호 4 또는 서열번호5와 적어도 80%이상, 예를 들어, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95% 또는 95 내지 100%의 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가지는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 함.

실시예42, 가이드 RNA5

실시예35 내지 41에 있어서, 상기 가이드 RNA는 스케폴드 부분을 포함하며, 상기 스케폴드 부분의 서열은 서열번호 6과 서열과 적어도 80%이상, 예를 들어, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95% 또는 95 내지 100%의 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가지는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 함.

실시예43, 조성물의 형태1

실시예35 내지 42에 있어서, 상기 조성물은 상기 Cas9 단백질 및 상기 가이드 RNA가 결합된 리보뉴클레오프로테인(RNP, ribonucleoprotein)을 포함하는 것을 특징으로 함.

실시예44, 조성물의 형태2

실시예35 내지 43에 있어서, 상기 조성물은 상기 Cas9 단백질을 암호화하는 핵산 및/또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 핵산이 포함된 벡터를 포함하는 것을 특징으로 함.

실시예45, 벡터의 요소1

실시예44에 있어서, 상기 벡터는 발현 조절 요소 또는 선별 요소를 포함하는 것을 특징으로 함.

실시예46, 벡터의 요소2

실시예45에 있어서, 상기 발현 조절 요소는 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통(Kozak consensus) 서열, ITR(inverted terminal repeat), LTR(long terminal repeat), 종결자(terminator), 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site, IRES), 2A 자가 절단 펩타이드(2A self-cleaving peptides), 및 복제원점(replication origin) 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 함.

실시예47, 벡터의 요소3

실시예45에 있어서, 상기 선별 요소는 형광 단백질 유전자, 태그(tag), 리포터 유전자, 항생제 내성 유전자 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 함.

실시예48, 벡터의 종류

실시예 44 내지 47에 있어서, 상기 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 백시니아바이러스, 폭스바이러스, 단순포진 바이러스, 플라스미드, 파지, 네이키드 DNA, DNA 복합체, 및 mRNA로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 함.

조작된 종양 세포를 제작하는 방법

실시예49, 조성물 주입

실시예35 내지 48 중 어느 하나의 실시예의 조성물을 종양 세포에 전달(deliver), 주입(inject), 및/또는 도입(administer)하는 단계를 포함하는, 방법.

실시예50, 종양 세포의 종류1

실시예49에 있어서, 상기 종양 세포는 암세포인 것을 특징으로 함.

실시예51, 종양 세포의 종류2

실시예49 내지 50에 있어서, 상기 종양 세포는 인간 세포 또는 비인간 동물 세포 유래인 것을 특징으로 함.

실시예52, 주입 방법

실시예49 내지 51에 있어서, 상기 전달, 주입, 및/또는 도입 방법은 미세주입법, 전기천공법, 유전자총, 초음파천공법, 자기주입법(magnetofection), 및/또는 일시적인 세포 압축, 스퀴징, 나노파티클을 이용하여 전달하는 방법, 양이온성 리포좀법, 초산 리튬-DMSO, 지질-매개 형질감염(transfection), 인산칼슘 침전법(precipitation), lipofection, PEI(Polyethyleneimine)-매개 형질감염, DEAE-dextran 매개 형질감염, 나노파티클-매개 핵산 전달(Panyam et. , al Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13.pii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023 참조), 또는 지질 나노입자(lipid nanoparticle, LNP) 및/또는 PEG를 이용하는 방법인 것을 특징으로 함.

실시예53, 세포사멸1

실시예49 내지 52에 있어서, 상기 방법은 세포사멸이 예정되도록 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 함.

실시예54, 세포사멸2

실시예53에 있어서, 상기 세포사멸이 예정되도록 하는 단계는 종양 세포에의 방사선 조사, 약물 처리(cisplatin, doxorubicin, 및/또는 paclitaxel), 항체, 열충격(Heat shock), 유전자 조작, 및/또는 저분자 화합물을 처리하는 것을 특징으로 함.

이하, 실험예 및 실시예를 통해 본 명세서가 제공하는 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다. 이들 실험예는 오로지 본 명세서에 의해 개시되는 내용을 예시하기 위한 것으로, 본 명세서에 의해 개시되는 내용의 범위가 이들 실험예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험 방법 및 재료

세포 배양 (Cell culture)

개(Canine) 악성 유방암 세포(CIP)는 서울대학교(SNU) 수의임상병리과에서 입수하였다. 상기 CIP세포는 원발성 종양 CIP(primary tumor CIP, CIPp)과 전이성 종양 CIP(metastatic tumors CIP, CIPm)로 2종류를 사용하였다. 개(Canine) 대식세포-유사세포(DH82), 및 인간 유방암 세포(BT20)는 한국세포주은행(서울, 대한민국)에서 구입하였다. 마우스 유방암 세포(4T1)는 American Type Culture Collection (Manassas, VA)에서 구입하였다. CIPp, CIPm, BT-20, 및4T1 세포는 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(PS; PAN-Biotech)이 보충된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640 배지(Pan-Biotech, Aidenbach, Germay)에서 37℃, 5% CO₂조건의 가습 챔버에서 배양되었다.

DH82 세포는 10% FBS 및 1% PS가 보충된 Dulbecco's minimal essential medium (DMEM)에서 배양되었다. 본 명세서에서 개시하는 실험의 모든 세포주는 마이코플라스마 테스트 (Mycoplasma testing)에서 음성이였다.

개(canine)의 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) 및 비부착 세포의 분리

3마리의 건강한 개(IACUC 프로토콜 번호 SNU-200720-2)로부터 구연산염 포스페이트 덱스트로스 아데닌(citrate phosphate dextrose adenine) 함유 튜브를 사용하여 혈액 샘플(30mL)을 수집하였다. 혈액 샘플을 동일한 양의 PBS로 희석하고 PBMC를 원추형 튜브에서 Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)로 원심분리하여 분리하였다. Live PBMC는 10% FBS 및 1% PS(PAN-Biotech)가 보충된 RPMI에 재현탁하고, 밤새 배양하였다. 배양 24시간 후, 비부착 세포(Non-adherent cells)를 얻었다.

동물 (Animal)

유방암 마우스 모델을 제작하기 위하여, 건강한 면역적격(immune-competent) BALB/c 마우스(암컷; 생후 5주; 20 내지 25g)를 Central Lab Animal Inc.(서울, 대한민국)에서 구입하여 각 그룹에 무작위로 할당하였다. 모든 마우스는 온도(20-22℃), 습도(50% ± 5%) 및 명주기(12:12 시간의 명-암 주기)의 통제된 조건 하에 특정 병원균이 없는 표준실에 수용되었다. 동물을 대상으로 한 본 연구의 모든 실험 절차는 서울대학교 동물실험위원회의 승인을 받았으며(IACUC 프로토콜 번호 SNU-200810-2, SNU-210506-5), 동물 실험에 대한 지침에 따라 수행되었다.

유방암 마우스 모델

4T1 유방암 모델은 BALB/c 마우스에서 생착 및 성장이 잘 되었다.

4T1, SC-4T1, 또는 KO-4T1 세포(5×10^5/100 μL)를 마우스의 등 왼쪽의 피하 주입(inject)하였다. 대조군에는 유방암 세포 대신 PBS를 주입하였다. 유방암 세포 주입에 앞서 흡입용 이소플루란(2%, 1 L/min O2)을 사용하여 마우스를 마취하고, 등의 털을 제거하고, 피부를 멸균하였다.

종양의 크기는 다음과 같은 공식으로 계산이 되었다:

(부피) = 4/3 × (0.5 Х 작은 지름²(smaller diameter²⁾　Х 0.5 Х 큰 지름(larger diameter), 3일 간격으로 전자 캘리퍼를 통해 측정된 (as measured by an electronic caliper in 3-day intervals)).

실험은 과도한 종양 부하로 인해 안락사가 필요할 때까지, 4-6주 동안 계속되었다.

생체 내 입양 세포 전달 (Adoptive cell transfer in vivo)

마우스에 약화된 유방암 세포를 주입하여, 마우스를 유방암 세포에 대하여 면역화(immunization) 하고자 하였다. 이를 위하여, 방사선에 조사되어 약화된 4T1, SC-4T1, 또는 KO-4T1 세포(5Х10⁵ cells/100 μL)를 마우스의 등쪽 피하에 주입하였다. 이때, 처음 세포를 주입한 날을 기준으로 1일차, 14일차, 및 28일차에 세포를 주입을 하였다. 각 세포(4T1, SC-4T1, 또는 KO-4T1 세포)를 주입한 그룹은 10마리의 마우스로 구성하였다.

위의 면역화(immunization)로부터 7일차에 마우스의 혈청을 채취하였다. 채취된 혈청은 10일 동안 1일 1회 복강 내 주사하였다 (100 μL 혈청/마우스). 또한, 면역화 된 마우스에서 분리한 비장 면역세포를 주 2회, 2주간 복강 내 투여하였다 (5×10^5 cells/100 μL/mouse).

종양의 크기는 다음과 같은 공식으로 계산이 되었다:

(부피) = 4/3 × (0.5 Х 작은 지름²(smaller diameter²⁾　Х 0.5 Х 큰 지름(larger diameter), 3일 간격으로 전자 캘리퍼를 통해 측정된 (as measured by an electronic caliper in 3-day intervals)).

치료 면역 요법 (Therapeutic immunotherapy)

SC-4T1 또는 KO-4T1 세포(5×10^5 cells/100 μL)가 주입된 BALB/c 마우스에 4T1 BC 모델을 확립된 후, 방사선 조사된 SC-4T1 또는 KO-4T1 세포(5×10^5/100 μL)는 면역요법을 위해 보조제(마우스 GM-CSF)를 포함하는 PBS에 현탁된 세포 백신(whole-cell vaccine)으로 준비되었다. 예방접종은 유방암 세포 이식 후 7, 14, 및 21일차에 마우스의 등 오른쪽에 피하주사로 시행하였다.

종양의 크기는 다음과 같은 공식으로 계산이 되었다:

(부피) = 4/3 × (0.5 Х 작은 지름²(smaller diameter²⁾　Х 0.5 Х 큰 지름(larger diameter), 3일 간격으로 전자 캘리퍼를 통해 측정된 (as measured by an electronic caliper in 3-day intervals)).

실험은 과도한 종양 부하로 인해 안락사가 필요할 때까지, 4-6주 동안 계속되었다.

유방암 세포에 대한 siRNA 형질감염 (siRNA transfection on breast cancer cells)

CIPp, CIPm, BT-20 및 4T1 세포를 6-웰 플레이트에 2.5ⅹ10^5 세포/웰의 농도로 시딩하였다. 제조업체의 지침에 따라 Lipofectamine RNAiMAX 형질감염 시약(transfection Reagent)(ThermoFisher)를 사용하여 TSG-6를 표적으로 하는 siRNA(siTSG-6; Santa Cruz Biotechnology) 및 스크램블링된 siRNA(scRNA; Santa Cruz Biotechnology)로 세포를 형질감염(transfected)시켰다. 형질감염으로부터 48시간 후, 웨스턴 블롯 및 qRT-PCR로 TSG-6 단백질 및 TSG-6를 암호화하는 mRNA의 발현 수준을 측정하였다.

직접 및 간접 공동 배양 실험 (Direct and indirect co-culture experiments)

DH82 세포 또는 cPBMC를 6-웰 플레이트(2.5×10^5개 세포/웰)에 시딩하고 24시간 동안 배양하였다. 플레이트에 부착된 것을 확인한 후, LPS(200ng/mL; Sigma-Aldrich) 또는 대조군으로 24시간 동안 처리하였다. 이와 유사하게, 개 림프구를 6-웰 플레이트(1×10^6 세포/웰)에 시딩하고 Concanavalin A(Con A; 5 μg/ml; Sigma-Aldrich) 또는 대조군으로 24시간 동안 처리하였다. 배지는 각각 10% FBS 2ml를 포함하는 배지로 교체하였다.

위에서 배양된 DH82 세포 및 cPBMC의 단일 배양물을 양성 대조군으로 사용하였다. 직접 공동 배양 실험(direct co-culture experiment)를 위하여, 동일한 수의 CIPp 세포를 각 웰에서 공동 배양하였다. 간접 공동 배양 실험 (indirect co-culture experiment)를 위하여, CIPp 세포를 1:10 비율로 포함하는 트랜스웰 삽입물(공극 크기 0.4μm)을 각 웰에 삽입하였다. 실험은 항생제 없이 진행되었다.

TSG-6 녹아웃을 위한 단일 가이드 RNA(sgRNA) 디자인 (Single guide RNA (sgRNA) design for TSG-6 knock-out)

TSG-6 넉아웃 세포를 제작하기 위하여, TNFAIP6 유전자의 엑손2 부분을 표적으로 하는 sgRNA는 CHOPCHOP 소프트웨어(https://chopchop.cbu.uib.no/)를 이용하여 설계하였다. 설계된 sgRNA는 GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit(Invitrogen)를 사용하여 합성하였다. 네온 형질감염 시스템(Neon Transfection System)(Invitrogen; 1400 V, 20 ms, 2 pulses)을 사용하여, 합성된 sgRNA를 동일한 양의 Cas9 단백질과 함께 4T1 세포에 형질감염시켰다. 이때, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질(SpCas9 단백질)이다. 상기 합성된 sgRNA가 표적으로 하는 TNFAIP6 유전자의 비표적 서열 및 PAM 염기서열은 표1과 같다.

명칭	비표적 서열 및 PAM 염기서열(5' → 3')	서열번호
sgTSG6_1	GCTCACCTACGCCGAAGCCAAGG	서열번호 7
sgTSG6_2	TACGGCCTTGGCTTCGGCGTAGG	서열번호 8

형질감염으로부터 3일 후, 세포로부터 게놈 DNA(gDNA)를 추출하였다. 추출한 gDNA를 94℃에서 5분, 94℃에서 20초, 57℃에서 30초, 72℃에서 35초, 72℃에서 5분을 35-40주기로 PCR(polymerase chain reaction)하여, 표적 서열을 증폭하였다. 각 샘플에서의 TSG-6 유전자의 돌연변이(sgRNA 및 Cas9 단백질에 의하여 발생한 돌연변이)는 T7 endonuclease I (T7E1) assay (BioLabs, Seoul, South Korea)를 사용하여 확인되었다.

단일 세포 배양 및 TSG-6 넉아웃 세포주의 분리 (Single cell culture and isolation of TSG-6 knock-out cell line)

sgRNA 형질감염(transfection)이 확인된 각 웰(well)의 단일 세포(single cells)을 광학현미경을 사용하여 96-well plate에 분포(distribution)하였다. ㅂ부분포(distribution)으로부터 1주일간 단일 세포를 배양하여, 단일 콜로니의 형성을 확인하였다. 세포가 60-80% 컨플루언시(confluency)에 도달했을 때, 6-웰 플레이트로 cell passaging하였다. 세포 형태(morphology)를 확인한 후, 각 콜로니에서 gDNA를 추출하였다.

해당 실험에서 사용된 프라이머 서열은 표2에 기재되어 있다. 야생형 4T1세포의 gDNA를 혼합하거나 혼합하지 않은 각각의 시료에 대한 T7E1 분석을 선행 연구 방법(Gim GM et al., 2021)에 따라 수행하여, 돌연변이의 종류를 확인하였다. 선별된 콜로니의 TSG-6 유전자의 돌연변이를 DNA 시퀀싱(Cosmogenetech, Daejeon, South Korea)을 통해 확인하였다. 이후, TSG-6의 생산이 단백질 수준에서 저해되는지 여부를 웨스턴 블롯(western blot)을 통해 확인하였다.

표적	프라이머(Primer) (5'→3')	방향	표적 크기	결과물 밴드 사이즈
				sgTSG6_1	sgTSG6_2
TSG-6	CTATCCTGGAGCTAGCTCTG (서열번호 83)	Forward	648	465	459
	TCCCAAAGGGCTTGAGAG (서열번호 84)	Reverse		183	189

세포 백신의 제작 (Preparation of whole-cell vaccine)

세포 백신(whole-cell vaccine)을 제작하기 위하여, 4T1 세포와 KO-4T1 세포를 2×10^6 세포/mL 농도로 PBS에 현탁시켰다. GC 300 Elan(MDS Nordion, Canada)을 사용하여, 세포를 100Gy에서 조사하였다. 방사선 조사된 세포는 사용되기 전까지 -80℃에서 저장되거나, 인비트로 분석 (in vitro analysis) 또는 인비보 사용(in vivo use)를 위하여 배양되었다.

체외 세포 독성 분석 (In vitro cytotoxicity assay)

4T1 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하고(5×10^3 세포/웰), 조사된 SC-4T1 또는 KO-4T1 세포로 면역화된 마우스로부터 추출된 혈청 및 비장 면역 세포와 함께 직접 공동 배양(directly co-culture) 하였다. 이때, 직접 공동 배양(directly co-culture)는 10:1, 1:1 및 1:10의 이펙터 대 타겟 비율(effector-to-target ratio)로 진행되었다. 이펙터 세포 없이 배양된 암세포를 대조군으로 사용하였다.

플레이트를 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 부유 세포를 제거하기 위해 PBS로 2회 세척하였다. 100 μL 배지를 각 웰에 첨가한 후 제조사의 프로토콜에 따라 CCK assay를 이용하여 세포독성(cytotoxicity)을 측정하였다.

아넥신 V/PI 염색 (Annexin V/PI staining)

암세포(5×105 cells/well)를 6-well plate에 시딩하고, 감마선 조사 후 37℃, 5% CO2의 환경에서 1, 4, 및 7일간 배양하였다. 이들의 형태학적 변화(morphological changes)를 광학 현미경으로 매일 관찰하였다. FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여, 배양된 세포를 염색하였다. 염색한 세포들을 신선한 PBS로 세척하고 1X Annexin V 결합 버퍼에 재현탁하였다. Annexin V 및 PI를 세포에 첨가하고 암실에서 20℃에서 15분 동안 배양하였다. 샘플은 FACS Aria II(BD Biosciences)를 사용하여 1시간 이내에 분석하였다.

조직학적 검사 (Histological examination)

모든 1차(primary) 주사 부위 및 전이성 종양이 의심되는 기타 조직의 대표적인 조직 블록을 10% 포르말린 고정(10% formalin fixation), 파라핀 포매 (paraffin embedding) 및 트리밍 (trimming)의 순서대로 처리했다. 포르말린 고정 파라핀 포매 (formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE) 블록에서 4μm 연속 절편 (4 μm consecutive sections)을 얻고, 절편을 H&E 및 면역 세포 마커에 대해 염색하였다. H&E의 경우, Gill's Hematoxylin(Leica, UK)을 사용하여 Gemini H&E 염색기 (Thermo Fisher, UK)에서 섹션을 염색한 후, 탈수 (dehydrated), 세척(cleared), 및 DPX로 마운트(mounted)하였다. 면역 형광을 위해, 2100 Retriever(Electron Microscopy Sciences, Pennsylvania, USA)를 사용하는 에피토프 검색 프로세스(epitope retrieval process)에 따라, FFPE 절편을 탈파라핀 (deparaffinized) 처리하고, 알콜(graded alcohol)을 통해 재수화(rehydrated)하였다.

세포 증식 분석 (Cell proliferation assay)

세포에 siRNA를 형질감염시킨 후, 세포를 96-웰 플레이트(10^3 세포/웰)에 시딩하고, 37℃ 및 5% CO의 환경에서 배양하였다. 배양으로부터 24, 48 및 72시간 후, 각 웰에 CCK-8 시약(D-Plus™ CCK cell viability assay kit; Dong-in Biotech, Seoul, South Korea) 10 μL를 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 배양하였다. 이크로플레이트 판독기(Epoch Microplate spectrophotometer; BioTek Instruments, Winooski, VT, USA)를 사용하여 각 웰의 흡광도를 450 nm에서 측정하였다. 각 실험은 세 번씩 수행되었다.

세포 수 분석 (Cell count assay)

세포에 siRNA를 형질감염시킨 후, 세포를 96-웰 플레이트(10^3 세포/웰)에 시딩하고, 37℃ 및 5% CO의 환경에서 배양하였다. 배양으로부터 24, 48 및 72시간 후, 총 세포수를 아크리딘 오렌지(acridine orange)를 사용하여 측정하였다. 각 실험은 세 번씩 수행되었다.

상처 치유 분석 (Wound healing assay)

CytoSelect™ 24-well assay kit(Cell Biolabs, Inc.)를 사용하여, Wound healing assay에 대한 실험을 수행하였다. 세포에 siRNA를 형질감염시킨 후, 500 μL의 세포 현탁액(5×10^5 세포/mL)을 삽입물의 열린 끝(open end of the insert)을 통해 각 웰에 첨가하고, 세포를 밤새 배양하였다. 멸균 집게(forceps)를 사용하여 삽입물을 제거하였다. 세포를 무혈청 배지로 세척하고 새 배지로 리프레쉬(refresh)하였다.

상처 영역 표면 부분은 닫힐 때까지 광학 현미경으로 12시간마다 확인하였다.

침입 분석 (Invasion assay)

Matrigel을 4℃ 배지와 혼합하고, 24-웰 트랜스웰 인서트(8 μm 기공 크기)에 첨가하고, 37℃ 인큐베이터에서 30분 동안 고화(solidified)시켰다. 세포 용액(5×10^5 세포/mL, FBS가 없는 배지)을 매트리겔(Matrigel) 코팅 위에 추가하여 침윤(invasion)을 시뮬레이트(simulate)하였다. 10% FBS 함유 배지를 하단 챔버에 추가하였다. 48시간 후, 인서트 바닥면에 침윤된 세포를 3.7% 포름알데히드로 고정하고, 100% 메탄올로 투과화시킨 후 Geimsa로 염색하였다. 삽입물 내부의 비침윤(non-invasive) 세포를 코튼 어플리케이터(cotton-tipped applicator)로 제거하였다. 무작위로 선정한 6개에서, 광학 현미경으로 세포 수를 확인하였다. 각 실험은 세 번씩 수행되었다.

세포주기 분석 (Cell cycle assay)

암세포를 6-웰 플레이트(5×10^5 세포/웰)에 시딩하고 밤새 배양하였다. 세포를 siTSG-6 또는 scRNA로 형질감염시켰다. 배양 2일 후, 세포를 수확(harvest)하고, PBS로 세척하고, 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 세포를 -20℃에서 15분 동안 70% 메탄올로 고정시켰다. 고정 후, 세포를 FBS로 2회 세척하였다. 세척 후, 세포는 0.5 mL의 요오드화 프로피듐(propidium iodide, PI)/RNase 염색 완충액(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)으로 염색되었고, 암실에서 10분 동안 배양되었다. 유세포 분석기(BD FACSCalibur™; BD Bioscience, San Jose, CA, USA)를 사용하여 세포 주기 분포를 분석하였다.

역전사 정량 중합효소 연쇄 반응(Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction) (RT-qPCR)

Easy-BLUE Total RNA Extraction Kit(Intron Biotechnology)를 사용하여 전체 RNA를 분리하였다. 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여, 전체 RNA의 양과 순도를 260 nm 및 280 nm의 흡광도 파장에서 측정하였다. 권장 프로토콜(25 ℃ for 10 min, 42 ℃ for 50 min, and 85 ℃ for 5 min)에 따라 CellScript All-in-One 5× cDNA Synthesis Master Mix(CellSafe, Suwon, South Korea)를 사용하여, cDNA를 합성하였다. PCR 반응에 대한 음성 대조군으로서, RNA 샘플 대신 동일한 부피의 DPBS를 첨가하였다.

SYBR Green Dye(Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA) 및 QuantStudio 1(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)과 함께 AMPIGENE® qPCR Green Mix Hi-ROX를 사용하여, cDNA 샘플을 분석하였다. 2-△△CT 방법을 사용하여 관련 유전자 발현 값(relative gene expression value)를 얻고, 대조군으로 GAPDH를 사용하여 정규화하였다 (Livak KJ & Schimittgen TD, 2001). 이 실험에 사용된 프라이머 시퀀스는 표3에 기재되어 있다.

Genes	Forward (5'-3')	Reverse (5'-3')	Reference
cGAPDH	GGAGAAAGCTGCCAAATATG (서열번호 9)	ACCAGGAAATGAGCTTGACA(서열번호 10)	403755
hGAPDH	CCACTCCTCCACCTTTGACG(서열번호 11)	CCACCACCCTGTTGCTGTAG(서열번호 12)	(Tolouei S et al., 2013)
mGAPDH	GGTGCTGAGTATGTCGTGGA(서열번호 13)	AGTGAGTTGTCATATTTCTCGTGGT(서열번호 14)	GU214026.1
cTSG-6	TCCGTCTTAATAGGAGTGAAAGATG(서열번호 15)	AGATTTAAAAATTCGCTTTGGATCT(서열번호 16)	(Song WJ et al., 2018)
hTSG-6	GGTTGCTTGGCTGATTATG(서열번호 17)	GCTCATCTCCACAGTATCTT(서열번호 18)	(Wu HJ et al., 2014)
mTSG-6	TGTAGGAAGATACTGTGGTGATGAA(서열번호 19)	ACTGTGACGTATTTAATCTGGAAGC(서열번호 20)	NM_009398.2
cCD-44	GCCCTGAGCGTGGGCTTTGA(서열번호 21)	TCTGGCTGTAGCGGGTGCCA(서열번호 22)	(Lee KS et al., 2013)
hCD-44	CCTCTTGGCCTTGGCTTTG(서열번호 23)	CTCCATTGCCACTGTTGATCAC(서열번호 24)	(Zhang J et al., 2019)
mCD-44	TGGATCCGAATTAGCTGGAC(서열번호 25)	AGCTTTTTCTTCTGCCCACA(서열번호 26)	M27130.1
cPD-L1	CCGCCAGCAGGTCACTT(서열번호 27)	TCCATTGTCACATTGCCACC(서열번호 28)	NM_001291972.1
hPD-L1	GACCAGCACACTGAGAATCAACAC(서열번호 29)	TTGGAGGATGTGCCAGAGGTAG(서열번호 30)	(Horlad H et al., 2016)
mPD-L1	TGCTGCATAATCAGCTACGG(서열번호 31)	GCTGGTCACATTGAGAAGCA(서열번호 32)	NM_021893.3
cNF-κB	GACTCCCTGGTGCATCTAGT(서열번호 33)	GTTACAGTGCAGATCCCATC(서열번호 34)	NM_001003344.1
hNF-κB	TCAAGATCTGCCGACTGAAC(서열번호 35)	CCTCTTTCTGCACCTTGTCA(서열번호 36)	(Liu W et al., 2018)
mNF-κB	CTGACCTGAGCCTTCTGGAC(서열번호 37)	GCAGGCTATTGCTCATCACA(서열번호 38)	M57999.1
cSTAT3	GACCAAGTTCATCTGCGTGA(서열번호 39)	CATGTCGAAGGTCAGGGTCT(서열번호 40)	JX561100.1
hSTAT3	GAGAATCGTGGAGCTGT TTAG(서열번호 41)	GACCAGCAACCTGACTT TAG(서열번호 42)	(Li M et al., 2017)
mSTAT3	GACCCGCCAACAAATTAAGA(서열번호 43)	TCGTGGTAAACTGGACACCA(서열번호 44)	U06922.1
cSOX2	AACCCCAAGATGCACAACTC(서열번호 45)	CGGGGCCGGTATTTATAATC(서열번호 46)	(Lee KS et al., 2013)
hSOX2	AAAACAGCCCGGACCGCGTC(서열번호 47)	CTCGTCGATGAACGGCCGCT(서열번호 48)	(Chen S et al., 2012)
mSOX2	AAAGGGTTCTTGCTGGGTTT(서열번호 49)	AGACCACGAAAACGGTCTTG(서열번호 50)	NM_011443.4
cArginase1	AAATTATGTCCTGTCCCCTTTCTAC(서열번호 51)	TTTAAGTTGAATCTTTTTCCTGTGG(서열번호 52)	(Song WJ et al., 2018)
ciNOS	AAATTATGTCCTGTCCCCTTTCTAC(서열번호 53)	TTTAAGTTGAATCTTTTTCCTGTGG(서열번호 54)	(Song WJ et al., 2018)
cIL-6	ATGATCCACTTCAAATAGTCTACC(서열번호 55)	AGATGTAGGTTATTTTCTGCCAGTG(서열번호 56)	(Song WJ et al., 2018)
cPD-1	CTACTGCTGCTGCTGACCTG(서열번호 57)	GATGGTGGCATACTCGGTCT(서열번호 58)	AB898677.1
cIFN-γ	TTCAGCTTTGCGTGATTTTG(서열번호 59)	CTGCAGATCGTTCACAGGAA(서열번호 60)	AF126247.1
cCTLA-4	GCAAGGTTCAGGATCGATGAC(서열번호 61)	AGATGACTGAAGTCTGTGCC(서열번호 62)	(Miller J et al., 2015)
mB7-H3	GGAGCCCAACAAGGACCTAC(서열번호 63)	GTACCAGGCAGCTGTAGGTG(서열번호 64)	AY190318.1
mIL-12	AGGTGCGTTCCTCGTAGAGA(서열번호 65)	AAAGCCAACCAAGCAGAAGA(서열번호 66)	(Takanashi K et al., 2019)
mIL-10	TGGCCCAGAAATCAAGGAGC(서열번호 67)	CAGCAGACTCAATACACACT(서열번호 68)	(Yang XO et al, 2007)
mTNF-α	TCAAACCCTGGTATGAGCCC(서열번호 69)	ACCCATTCCCTTCACAGAGC(서열번호 70)	(Zhang Y et al., 2019)
mIL-6	AGGCTTAATTACACATGTTCTCTGG(서열번호 71)	TTATATCCAGTTTGGTAGCATCCAT(서열번호 72)	M24221.1
mIL-17	TCAGCGTGTCCAAACACTGAG(서열번호 73)	CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT(서열번호 74)	(Zhang Y et al., 2019)
mH2K1	AGA TTC CCC AAA GGC CCA TG(서열번호 75)	CAC CAC AGA TGC CCA CTT CT(서열번호 76)	NM_001001892.2
mGM-CSF	CGTTCCCCTGGTCAGTGTC(서열번호 77)	CCGCTGGCCTGGATCTTC(서열번호 78)	(Wright CR et al., 2015)
mHMGB1	GTT CTG AGT ACC GCC CCA AA(서열번호 79)	CCC TTT TTC GCT GCA TCA GG(서열번호 80)	NM_001313894.1
mTGF-β	AAA CTA AGG CTC GCC AGT CC(서열번호 81)	CAT AGA TGG CGT TGT TGC GG(서열번호 2)	NM_011577.2

항체 (Antibodies)

각 1차 항체(primary antibody)는 다음 표시된 공급자로부터 입수하였다: TSG-6 (sc-377277), CD206 (sc-376108) beta-actin (sc-47778) (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), STAT3 (LS-C352900), phospho-STAT3 (LS-C354108) (LSBio, Seattle, USA), SOX2 (GTX101507) (GeneTex Inc., Irvine, CA, USA), Cyclin D1 (NBP2-16054) (Novus Biologicals, USA), CD11b-FITC (11-0112-41), PD-L1 (ab205921), B7-H3 (ab134261), CTLA-4 (ab237712) (Abcam, MA, USA), CD11c-PE (117307) (BioLegend, San Diego, CA, USA), CD3-FITC (MCA1774F) (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA), CD44-FITC (11-5440-42), CD8α-PE (12-0081-82), IFN-γ-APC (17-7311-82), PD-1 (UM800091) Nf-κB (MA5-15160), phospho-Nf-κB (436700) (ThermoFisher Scientific, USA).

각 2차 항체(secondary antibody)는 다음 표시된 공급자로부터 입수하였다: m-IgGκBP-CFL 488 (sc-516176), mouse anti-rabbit IgG-PE (sc-3753) (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), goat anti-Rabbit IgG-HRP (SA002-500) (GenDEPOT, TX, USA), goat anti-Mouse IgG-HRP (A90-116P) (Bethyl Laboratories Inc., TX, USA).

웨스턴 블롯 분석 (Western blot analysis)

PRO-PREP Protein Extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Seongnam, South Korea)를 사용하여, 세포 및 조직으로부터 모든 단백질을 추출하였다. Bio-Rad DC Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여, 추출된 단백질을 측정하였다. 각 10ug 샘플의 단백질 컨텐트(protein content)는 SDS-PAGE 및 면역블롯팅에 적용되었다. 멤브레인은 5% 무지방 우유에서 차단되었고, 4℃에서 밤새 1차 항체로 표지(probe)되었다. 블롯을 실온에서 2시간 동안 HRP-컨쥬게이션된 2차 항체와 함께 배양하였다. ECL PLUS 시약(GE Healthcare, St.Giles, Bucks)을 사용하여, 결합(binding)을 검출하였다. ImageQuant LAS-400 mini(GE Healthcare Life Sciences, Chicago, IL, USA)를 사용하여, 면역반응성(Immunoreactive) 밴드를 검출하였다. GelGraph(Scinomics Co. Ltd., Daejeon, Korea)를 사용하여, 단백질 밴드를 정량하였다. 각 실험은 독립적으로 세 번씩 수행되었다.

면역형광 (Immunofluorescence)

세포 또는 조직 슬라이드를 실온에서 30분 동안 PBS 중 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정시켰다. 세척 후, 세포를 1% BSA를 포함하는 PBST(Tween 0.1%)로 30분 동안 투과시켰다. 세포를 블로킹 용액(1:100)에 희석된 1차 항체와 함께 암실에서 밤새 4℃에서 순차적으로 배양하였다. 1차 항체와 배양한 후, 세포를 세 번 세척하고, 세포에 희석된 2차 항체(1:200)를 처리하였다. 핵 시각화(nuclei visualization)를 위해 세포를 DAPI(LS-J1033-10, LSBio, Seattle, USA)를 포함하는 VECTASHIELD 안티페이드 마운팅 미디엄(Antifade Mounting Medium)으로 대조염색하였다. 이미지 제이(ImageJ)를 이용하여 세포 형광의 강도(intensity)를 측정하고, 염색되지 않은 대조군 세포와 비교하여 발현이 양성임을 확인하였다.

유세포분석 (Flow cytometry)

배양된 세포(1×10^6)를 100μL의 얼음처럼 차가운 Dulbecco 인산완충식염수(Dulbecco's phosphate-buffered saline, DPBS) 및 1μL의 1차 항체에 현탁하였다. 암실에서 1시간 동안 배양한 후 샘플을 DPBS로 두 번 세척하였다. 1차 항체가 형광 염료에 결합되지 않은 경우, 2차 항체(1:200)를 세포에 처리하고 저온에서 30분 동안 배양하였다. 마지막으로, 세포를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에 고정하고, 24시간 이내에 분석할 때까지 어두운 곳에서 4℃에서 보관하였다. 세포 형광을 유세포 분석기(flow cytometer)로 분석하였다.

정량화 및 통계 분석 (Quantification and statistical analysis)

GraphPad Prism 6(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)를 사용하여, 통계 분석을 수행하였다. 정량화(Normality)를 위해 샤피로 윌크(Shapiro-Wilk) 테스트를 수행하였다. 두 개 이상의 그룹 간의 차이는 정량화(normality)를 만족할 경우 본페로니(Bonferroni)의 다중 비교 사후 테스트(Bonferroni's multiple comparison post-test)에 의하여 분석하였으며, 정규 분포 (normal distribution)을 만족하지 못할 경우 Kruskal-Wallis 테스트와 Dunn의 다중 비교 사후 테스트(Dunn's multiple comparison post-test)를 사용한 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 의하여 분석되었다. 결과는 평균±표준편차(mean±SD)로 표현하였다. p<0.05인 경우, p-값을 통계적으로 유의한 차이로 간주하였다. 모든 분자 및 세포 분석은 최소 두 번 독립적으로 반복되었으며, 반복 결과는 유사한 경향을 보이는 것으로 나타났다. 실험 및 반복 횟수는 각 관련 도면 범례에 표시되어 있다.

실험 결과

실험예1. TSG-6와 암세포의 관계 확인

본 발명자는 암세포를 이용한 세포 백신을 제작하고자 하였다. 이때, 백신으로 사용될 암세포의 면역회피기능을 억제하고자 하였고, 면역회피기능을 억제하기 위한 방법으로 TSG-6의 발현을 억제하는 방법을 선택하였다. 이에 따라, 실험예1에서 TSG-6와 암세포의 면역회피기능과의 관계를 확인하고자 하였다.

이를 위하여, 유방암 세포주인 CIPp, CIPm, BT-20, 및 4T1 세포주에 TSG-6를 표적으로 하는 siRNA(siTSG-6)를 형질감염(transfection)시켰다. 대조군으로 스크램블링된 siRNA(scRNA)도 각 세포주에 형질감염시켰다.

본 실험에서 사용된 CIPp 및 CIPm 세포주는 개의 유방암 세포주이다. BT-20 세포주는 인간의 유방암 세포주이다. 4T1 세포주는 마우스의 세포주이다.

실험예1.1 siRNA에 의한 TSG-6의 억제 확인

본 발명자는 siRNA에 의하여 TSG-6가 억제되는지 확인하고자 하였다. 따라서, siRNA를 세포에 형질감염시킨 후, 세포의 TSG-6의 mRNA 발현양 및 TSG-6 단백질의 양을 확인하였다.

그 결과를 도1의a, 및 b에 도시하였다.

각 세포주별로, TSG-6의 mRNA 발현양은 형질감염시키지 않은 그룹(Naive 그룹)과 scRNA를 형질감염시킨 그룹(scRNA 그룹)에서 큰 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는, Lipofectamine을 이용한 도입과정은 세포에 큰 독성을 일으키지 않는 것을 보여준다. 이에 반하여, 각 세포주별로, TSG-6의 mRNA 발현양은 siTSG-6를 형질감염시킨 그룹(siTSG-6 그룹)에서 다른 그룹(Naive 및 scRNA)에 비하여 낮다 (도 1의 a). 또한, mRNA의 발현양에 대한 결과와 마찬가지로, TSG-6 단백질의 양은 siTSG-6를 형질감염시킨 그룹에서 다른 그룹(Naive, scRNA)에 비하여 낮다 (도1의 b).

이러한 결과는, siTSG-6에 의하여 TSG-6의 발현이 억제되는 것을 보여준다.

실험예1.2 TSG-6의 억제(down regulation)에 따른, 암세포의 증식(proliferation), 전이 (migration), 및 침윤능(invasion ability)의 손상

본 발명자는 TSG-6가 종양 세포에서 본질적 역할(intrinsic role)을 가지는지 확인하고자 하였다. 따라서, 형질감염시킨 후, 세포의 OD value 및 세포의 수를 확인하였다.

그 결과를 도1의 c 및 도19에 도시하였다.

다른 그룹(Naive 및 scRNA)와 비교하였을 때, siTSG-6그룹의 OD 값(OD value)이 유의하게 낮게 나왔다 (도19). 또한, 다른 그룹(Naive 및 scRNA)와 비교하였을 때, siTSG-6그룹의 세포 수가 유의하게 낮게 나왔다 (도1의 c).

TSG-6이 세포주기의 어느 시점에 관여하는지를 알아보기 위해 세포주기 분석을 수행하였다.

그 결과를 도20에 도시하였다.

다른 그룹(Naive 및 scRNA)와 비교하였을 때, siTSG-6그룹에서 G2-M 단계의 비율이 유의하게 높게 나왔다 (도20의 a). 또한, 다른 그룹(Naive 및 scRNA)와 비교하였을 때, siTSG-6그룹에서 Cyclin D1의 단백질 양이 유의하게 낮게 나왔다 (도20의 b 내지 c). 이러한 경향은 모든 유방암 세포주에서 동일하게 나왔다.

TSG-6가 종양 세포의 전이 (Migration) 및 침윤(Invasion) 능력에 영향을 미치는지 확인하기 위해 상처 치유 분석(Wound healing assay)을 수행하였다.

그 결과를 도1의 d 및 e, 도21, 및 도22에 도시하였다.

다른 그룹(Naive 및 scRNA)와 비교하였을 때, 4T1 세포의 siTSG-6그룹에서 Migration 능력이 낮은 것으로 확인되었다 (도 1의 d). 또한, 다른 그룹(Naive 또는 scRNA)와 비교하였을 때, 4T1 세포의 siTSG-6그룹에서 침윤(Invasion) 능력이 낮은 것으로 확인되었다 (도 1의 e). 이러한 경향은 다른 유방암 세포주에서도 유사하게 관찰되었다 (도 21, 및 도22).

침윤(Invasion) 능력의 차이에 대하여 설명하기 위해 상피-중간엽 전이(EMT)의 마커인 캐드헤린(cadherin)을 식별하기 위해 유동 세포 계측법을 사용하였다.

그 결과를 도2의 a에 도시하였다.

다른 그룹(Naive 및 scRNA)와 비교하였을 때, 4T1 세포의 siTSG-6그룹에서 E-캐드헤린 (E-cadherin) 양성 세포 수(population)가 높은 것으로 확인되었다. 다른 그룹(Naive 또는 scRNA)와 비교하였을 때, 4T1 세포의 siTSG-6그룹에서 N-캐드헤린(N-cadherin) 및 VE-캐드헤린(VE-cadherin) 양성 세포 population이 높은 것으로 확인되었다 (도 2의 a).

이러한 결과는, TSG-6를 억제하였을 때, 암세포의 증식(proliferation), 전이(migration), 및 침윤능(invasion ability)이 감소한다는 것을 보여준다. 즉, TSG-6를 억제하면, 암세포의 증식 또는 전이가 억제된다는 것을 보여준다.

실험예1.3 암세포에서의 TSG-6의 self-regulating mechanism

본 발명자는 암세포에서의 암세포의 TSG-6 유전자가 관여된 신호체계를 확인하고자, RT-qPCR과 웨스턴 블롯(western blot)을 이용하여 NF-κB, STAT3, SOX2 경로의 변화를 확인하였다.

그 결과를 도 2의 b 및 c에 도시하였다.

다른 그룹(Naive 및 scRNA)와 비교하였을 때, 4T1 세포의 siTSG-6그룹에서 NF-κB, STAT3 및 SOX2의 발현(단백질 및 mRNA)이 유의하게 낮은 것으로 확인되었다 (도 2의 b 및 c).

본 발명자는 암세포에서 TSG-6 조절이 면역 체크포인트 단백질의 발현에 영향을 미치는지 여부를 확인하고자 하였다. 따라서, CD44 및 PD-L1에 대한 항체를 사용하여 면역형광을 수행하였다.

그 결과를 도 2의 d 및 e에 도시하였다.

다른 그룹(Naive 및 scRNA)와 비교하였을 때, 4T1 세포의 siTSG-6그룹에서 CD44 및 PD-L1의 발현(단백질 및 mRNA)이 유의하게 낮은 것으로 확인되었다 (도 2의 d 및 e). 이러한 경향은 다른 유방암 세포주에서도 유사하게 관찰되었다 (도 23 및 24).

이러한 결과는, TSG-6를 억제(down-regulation)하면, 암세포의 성장 및 면역회피 기능에 대한 마커(NF-κB, STAT3 및 SOX2) 또는 면역회피 기능에 직접적인 역할을 하는 단백질(CD44 및 PD-L1)의 발현이 감소한다는 것을 보여준다. 즉, TSG-6를 억제(down-regulation)하, 암세포의 면역회피 기능이 억제된다는 것을 보여준다.

실험예1.4 암세포에서 TSG-6를 억제(down-regulation)함에 따른, 면역세포의 활성화

본 발명자는 암세포에서 TSG-6를 억제(down-regulation)하면, 암세포와 면역세포간의 상호 작용(예를 들어, 공동배양 되는 암세포가 면역세포에 미치는 작용)에 영향이 있는지 확인하고자 하였다. 이를 확인하기 위하여, 확장 도1의 a에서 도시하는 바와 같이, CIPp 세포주와 개 대식세포 세포주(DH82)를 간접 공동 배양(indirect co-culture) 또는 직접 공동 배양(direct co-culture) 하였다.

간접 공동 배양한 DH82 세포의 마커(CD11c, iNOS, CD206, Arginase1, IL-6, PD-1)들의 발현을 확인하였고, 그 결과를 도 3의 a, b, 및 c에 도시하였다.

다른 그룹(Naive 및 scRNA)와 비교하였을 때, CIPp 세포의 siTSG-6그룹과 공동 배양한 DH82 세포에서 종양 반응성 면역 세포 활성화의 마커(PD-1), 세포 표면 마커(CD11c), 및 M1 표현형에 해당하는 iNOS의 발현이 유의하게 높은 것으로 확인되었다. 다른 그룹(Naive 및및 scRNA)와 비교하였을 때, CIPp 세포의 siTSG-6그룹과 공동 배양한 DH82 세포에서 M2 표현형 마커 CD206, Arginase 1, 및 IL-6의 발현이 유의하게 낮은 것으로 확인되었다 (도 3의 a, b, 및 c).

대식세포 표현형 변환 효율을 보여주기 위해, 직접 및 간접 공동 배양 실험을 모두 사용하여 유동 세포 계측법을 수행하였고, 공동 배양한 DH82세포에서의 CD11c 및 CD206 발현수준을 측정하였다.

그 결과를 도9의 b 및 c에 도시하였다.

직접 공동 배양 실험과 간접 공동 배양 실험에서 공동배양 된 DH82세포에서의 CD11c 및 CD206 발현수준은 Naive, scRNA, 및 siTSG-6그룹에 대하여 유사한 경향을 보였다 (도9의 b 및 c). 다만, CD11c의 발현수준은 간접 공동 배양 실험에 비하여 직접 공동 배양 실험에서 2배 이상 높았다 (간접 공동배양: 1.67±0.14; 직접 공동배양: 3.86±0.22). CD11c의 발현수준의 차이를 통하여, M1 대식세포 개체수는 간접 공동 배양 실험에 비하여 직접 공동 배양 실험에서 유의미하게 높다는 것을 알 수 있다.

이러한 실험 결과는, 암세포에서 분비되는 TSG-6가 암세포의 면역조절 능력의 기전(mechanism) 중 하나인 것을 보여준다.

본 발명자는 암세포에서 TSG-6를 억제(down-regulation)하면, 암세포와 면역세포간의 상호 작용(예를 들어, 공동배양 되는 암세포가 면역세포에 미치는 작용)에 영향이 있는지 확인하고자 하였다. 이를 확인하기 위하여, 도9의 a에서 도시하는 바와 같이, CIPp 세포주와 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 간접 공동 배양(indirect co-culture) 또는 직접 공동 배양(direct co-culture) 하였다.

공동 배양된 PMBC 중 세포독성 T 세포(CD3+/CD8α+)의 집단 및 활성을 위의 개 대식세포 세포주(DH82)에서의 실험과 동일한 방식으로 분석하였고, 그 결과를 도10의 a, b, 및 c에 도시하였다.

Naive그룹 및 scRNA그룹에 비하여, siTSG-6 그룹과의 직접 및 간접 공동 배양 실험에서 공동배양 된 세포독성 T 세포의 수(population) 및 활동(activation) 수준은 유의미하게 높은 것으로 확인되었다 (도10의 a). Naive그룹 및 scRNA그룹에 비하여, siTSG-6 그룹과의 직접 및 간접 공동 배양 실험에서 공동배양 된 세포독성 T 세포에서의 IFN-γ 발현수준 및 PD-1 발현수준이 유의미하게 높은 것으로 확인되었다 (도10의 b 및 c). Naive그룹 및 scRNA그룹에 비하여, siTSG-6 그룹과의 직접 및 간접 공동 배양 실험에서 공동배양 된 세포독성 T 세포에서의 CTLA-4 발현수준이 유의미하게 낮은 것으로 확인되었다 (도10의 b).

이러한 실험 결과는, 암세포에서 분비되는 TSG-6가 암세포의 면역조절 능력의 기전(mechanism) 중 하나인 것을 보여준다.

실험예2. TSG-6의 넉아웃(Knock-out, KO)을 통한 암세포의 면역 억제 확인

실험예2.1 TSG-6 KO 유방암 마우스 모델 제작

본 발명자는 TSG-6가 넉아웃(Knock-out)된 유방암 세포주를 제작하고자 하였다. 이를 위하여, 마우스 TSG-6 유전자의 엑손2 부분을 표적으로 하는 single guide RNA(sgRNA)를 제작하였다. 제작된 sgRNA(sgTSG6_1 및 sgTSG6_2)의 서열은 도11의 a 및 b에서 도시하는 바와 같다.

4T1 세포에 상기 제작된 sgRNA를 형질감염시킨 후, 단일 세포 배양을 하여, 총 16개의 단일 콜로니를 얻었다. 총 sgRNA에 의한 mutation과 관련하여 16개의 단일 콜로니의 DNA를 분석하였고, 그 결과를 도12의 a, b, c, d, 및 e에 도시하였다. 16개의 단일 콜로니 중, 높은 넉아웃 효율을 보이는 Colony #4의 DNA 시퀀싱(DNA sequencing)을 통해 표적 서열 (target sequence)의 변화를 확인한 결과 한 allele의 5 bp와 다른 대립 유전자(allele)의 13 bp가 결손되어 이중 대립 형질 돌연변이(biallelic mutation)이 발생한 것을 확인하였다 (도13의 c). 이를 통해, 선정한 Colony #4의 세포를 TSG-6 KO 유방암 세포주(KO-4T1 세포)로 확립하였다.

TSG-6 KO 유방암 세포주로 확립된 KO-4T1세포의 특징을 확인하기 위하여, KO-4T1 세포를 Naive 및 scRNA 그룹과 비교하는 실험을 진행하였다. 그 결과를 도13의 a, b, d, 및 e에 도시하였다.

Naive그룹(Naive 4T1 세포) 및 scRNA 그룹(SC-4T1 세포)과 비교하여, KO-4T1 세포는 중간엽 세포의 신장(elongation)이 감소된 원형(round shape)으로 형태학적으로 차이가 있다 (도13의 a). SC-4T1 세포와 비교하여, KO-4T1 세포에서의 TSG-6의 단백질 발현 수준이 유의미하게 낮은 것이 확인되었다 (도13의 b). Naive 4T1 세포 및 SC-4T1 세포와 비교하여, KO-4T1 세포에서의 TSG-6, CD44, 및 PD-L1의 발현 수준(단백질 또는 mRNA)이 유의미하게 낮은 것이 확인되었다 (도13의 d 및 e). 또한, Naive 4T1 세포 및 SC-4T1 세포와 비교하여, KO-4T1 세포에서의 또 다른 면역 체크포인트 단백질인 B7-H3의 발현 수준(단백질 또는 mRNA)이 낮은 것이 확인되었다 (도13의 d 및 e).

이러한 실험 결과는, 암세포의 TSG-6를 넉아웃 하면 암세포의 면역회피기능과 관련이 있는 단백질의 발현이 억제된다는 것을 보여준다.

Naive 4T1 세포, SC-4T1 세포, 또는 KO-4T1세포를 주입한 유방암 마우스 모델을 대상으로 종양과 관련하여 실험예2.2 및 실험예2.3의 실험을 진행하였다.

실험예2.2 TSG-6 KO 유방암 마우스 모델에서의 종양의 부피 및 전이

본 발명자는 종양 미세 환경(tumor microenvironment, TME)에서 TSG-6의 생체 내(in vivo) 효과를 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 도 4의 a에 도시된 바와 같이, Naive 4T1 세포주, SC-4T1 세포주, 또는 KO-4T1 세포주를 면역적격(immunocompetent) 마우스에 피하 주입하였다.

세포주를 주입한 후, 마우스의 몸 무게를 측정하였고, 그 결과를 도4의 b에 도시하였다. Naive 4T1 그룹, SC-4T1 그룹, 및 KO-4T1 그룹의 평균 체중이 대조군에 비하여 유의하게 증가하였다.

세포주가 주입된 마우스를 희생하여 종양을 얻고, 종양의 부피를 측정하여, 그 결과를 도4의 c에 도시하였다. Naive 4T1 그룹, 및 SC-4T1 그룹에 비하여, KO-4T1 그룹의 종양 평균 부피가 유의하게 작은 것이 확인되었다.

이러한 실험 결과는, 암세포에서 TSG-6가 넉아웃되면 암세포의 성장이 억제된다는 것을 보여준다.

세포주가 주입된 마우스의 비장 및 폐로 암세포가 전이가 되었는지 확인하였고, 그 결과를 도4의 d 및 e에 도시하였다. 비장 지수를 통하여, Naive 4T1 그룹, 및 SC-4T1 그룹에 비하여, KO-4T1 그룹에서의 비장으로의 전이 수준이 낮은 것으로 확인되었다 (도4의 d). 폐로의 전이 수준은 거시적 결절(macroscopic nodules)의 수, 및 미세한 병변(microscopic lesion)의 예상 면적(H&E로 염색된 조직 슬라이드에서 결정된)을 통하여 평가되었다. 평가 결과, Naive 4T1 그룹, 및 SC-4T1 그룹에 비하여, KO-4T1 그룹에서 거시적 결절의 수 및 미세한 병변의 예상 면적이 낮고, 따라서 폐로의 전이 수준이 낮은 것으로 확인되었다 (도4의 e).

이러한 실험 결과는, 암세포에서 TSG-6가 넉아웃되면 암세포의 전이가 억제된다는 것을 보여준다.

세포주가 주입된 마우스의 TME에서 암세포와 관련된 마커 또는 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블롯을 통하여 확인하였고, 그 결과를 도4의 f에 도시하였다.

SC-4T1 그룹에 비하여, KO-4T1 그룹에서의 TSG-6, PD-L1, 및 B7-H3의 단백질 발현 수준이 낮은 것으로 확인되었다. 반면, SC-4T1 그룹에 비하여, KO-4T1 그룹에서의 PD-1의 단백질 발현 수준이 높은 것으로 확인되었다.

이러한 실험 결과는, 암세포에서 TSG-6가 넉아웃되면 암세포의 면역 회피 기능(PD-L1, 및 B7-H3이 관련된)이 억제되고, 그로 인하여 면역 세포가 활성화(PD-1이 관련된)되는 것을 보여준다.

실험예2.3 TSG-6 KO 유방암 마우스 모델에서의 항종양면역(Antitumor immunity)

본 발명자는 세포주가 주입된 마우스의 TME에서의 면역세포 침윤율(infiltration)을 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 덩어리 조직 슬라이드(mass tissue slide)를 제작하여 TME에 존재하는 면역세포 pool을 조사하였다.

덩어리 조직 슬라이드에 대하여 면역형광(Immunofluorescence)를 한 결과를 도5의 a, 도14 및 15에 도시하였다.

Naive 4T1 그룹 및 SC-4T1 그룹에 비하여, KO-4T1 그룹에서 CD11b+ 및 CD3+ 세포의 침습성(invasiveness)이 유의하게 높은 것으로 확인되었다. 또한, Naive 4T1 그룹 및 SC-4T1 그룹에 비하여, KO-4T1 그룹에서 M1 대식세포와 세포독성 T 세포가 유의하게 높은 비율로 관찰되는 것이 확인되었다 (도5의 a).

CD11b+ 대식세포 및 CD3+ 림프구 모두에서, Naive 4T1 그룹 및 SC-4T1 그룹에 비하여, KO-4T1 그룹의 PD-1 발현이 유의하게 높은 것이 확인되었다 (도14). 상기 KO-4T1 그룹에서의 PD-1의 높은 발현 수준은 암 세포에서 TSG-6을 넉아웃하여 PD-L1 발현이 감소함으로 인한 것으로 보인다 (도15).

이러한 실험 결과는, 도5a에서 확인된 종양 침윤 림프구(tumor-infiltrated lymphocytes, TIL)의 높은 활성 수준은 PD-1의 높은 발현 수준에 의한 것임을 보여준다.

본 발명자는 TME에서 항종양 면역 세포의 증가가 전신 면역 활성화와 관련이 있는지 확인하고자 하였다. 이를 위해, 마우스의 비장 면역 세포를 분리하여 면역활성화와 관련된 사이토카인의 발현 수준을 분석하였고, 그 결과를 도5b에 도시하였다. 또한, CD8α+ 세포 중 활성화된 세포 집단은 유세포분석법으로 확인하였고, 그 결과를 도5c에 도시하였다.

Naive 4T1 그룹 및 SC-4T1 그룹에 비하여, KO-4T1 그룹에서 IL-12의 발현 수준이 유의하게 높은 것으로 확인되었다. Naive 4T1 그룹 및 SC-4T1 그룹에 비하여, KO-4T1 그룹에서 L-10, TNF-α, 및 IL-17의 발현 수준이 유의하게 낮은 것으로 확인되었다 (도5의 b). Naive 4T1 그룹 및 SC-4T1 그룹에 비하여, KO-4T1 그룹에서 IFN-γ+ 세포의 비율이 유의하게 높은 것으로 확인되었다. 또한, Naive 4T1 그룹 및 SC-4T1 그룹에 비하여, KO-4T1 그룹에서 MHC 클래스 II를 발현하는 형질 세포(plasma cells expressing MHC class II)의 비율이 유의하게 높은 것으로 확인되었다 (도 5의 c).

이러한 실험 결과는, 암세포에서 TSG-6가 넉아웃되면 종양 항원을 인식하는 세포의 비율이 증가한다는 것을 보여준다.

실험예3. 셀 백신 제작 및 효과 확인

실험예1 및 실험예2의 결과를 바탕으로, whddid 세포에서 분비되는 TSG-6를 억제하면 종양의 면역원성(immunogenicity)이 증가하는 것으로 여겨졌다. 이에 따라, 본 발명자는 TSG-6 KO 세포 백신(TSG-6 KO whole cell vaccine)을 제작하고, 제작된 백신(vaccine)을 접종하면 종양 완화 및 치료에 유의미한 영향을 미치는지 여부를 실험예3을 통하여 확인하고자 하였다. TSG-6 KO 세포 백신(TSG-6 KO whole cell vaccine)의 작용기전은 도8에 도시하였다.

실험예3.1 TSG-6 KO whole cell vaccine 제작

최근 연구에 따르면, 세포에 방사선을 조사하면 DNA 붕괴를 통해 세포 비활성화가 발생하며, 비활성화된 세포를 세포 백신(whole cell vaccine)으로 사용할 수 있다. 이에 따라, 본 발명자는 실험예2에서 제작된 KO-4T1 세포에 방사선을 조사하여 비활성화시키는 방법을 통하여 TSG-6 KO 세포 백신(TSG-6 KO whole cell vaccine)을 제작하였다. 구체적으로는, 100 Gy의 감마선을 조사하여 SC-4T1 세포 및 KO-4T1 세포를 비활성화시켰다.

세포의 비활성화 수준을 확인하기 위하여, 방사선을 조사하여 비활성화된 SC-4T1 세포(Irradiated 4T1), 방사선을 조사하여 비활성화된 KO-4T1 세포(Irradiated KO-4T1), 및 방사선을 조사하지 않은 Naive 4T1 세포(Naive 4T1)을 대상으로 세포 사멸 및 마커의 발현 수준을 관찰하였고, 그 결과를 도16의 a, b, c, 및 d에 도시하였다.

Naive 4T1 그룹에 비하여, Irradiated 4T1그룹 및 Irradiated KO-4T1그룹에서 OD value값의 증가 폭이 유의하게 낮았으며, 72시간 후에는 증가하지 않았다 (도16의 a). 이러한 결과는, 방사선에 조사된 세포의 증식이 72시간 내에 중단되었다는 것을 보여준다.

방사선 조사 후, 세포 사멸로 인하여 세포 파편으로 분해되는 것을 현미경으로 관찰하였으며 (도16의 c), 7일 동안 80%이상의 세포가 사멸(apoptosis)된 것을 확인하였다 (도 16의 b).

Irradiated 4T1그룹에 비하여, Irradiated KO-4T1그룹에서 MHC 유전자 및 TNF-α의 발현 수준이 유의하게 높고, IL-6의 발현 수준은 유의하게 낮은 것을 확인하였다. GM-CSF, HMGB1, 및 TGF-β의 발현 수준에는 유의한 차이가 없었다 (도16의 d).

이러한 결과는, 다른 그룹에 비하여 Irradiated KO-4T1 vaccine이 싸이토카인 폭풍(cytokine storm)을 유도하는 부작용은 적으면서도 면역활성화 효과가 높은 것이라는 점을 시사한다.

실험예3.2 TSG-6 KO과 종양 면역원성(tumor immunogenicity) 및 입양 세포 이식(adoptive cell transfer, ACT)의 관계

본 발명자는 유방암에 대한 세포 백신 (whole cell vaccine)의 효능을 평가하고자 하였다. 따라서, Naive 4T1 세포, 실험예 3.1에서 제작된 Irradiated 4T1 세포 또는 Irradiated KO-4T1세포를 마우스에게 주입하여, 마우스를 면역화 하였다. 이때, Naive 4T1 세포를 주입한 마우스의 그룹을 Naive 4T1그룹으로, Irradiated 4T1 세포를 주입한 마우스의 그룹을 SC-ACT 그룹으로, Irradiated KO-4T1세포를 주입한 마우스의 그룹을 KO-ACT 그룹으로 기재한다. 아래는 SC-ACT 그룹과 KO-ACT 그룹에서의 종양 면역원성 및 ACT 수준을 비교한 실험의 내용이다.

활성화된 면역 세포와 종양 표적 항체의 세포 독성을 분석하기 위해, SC-ACT 그룹 또는 KO-ACT 그룹의 마우스로부터 분리된 비장 면역 세포를 4T1 세포와 공동배양을 하였다. 공동배양 된 4T1세포의 증식을 in vitro 세포 독성 분석법으로 분석하였고, 그 결과를 도17의 a에 도시하였다.

암세포의 증식은 KO-ACT그룹의 비장 면역 세포와 공동 배양된 4T1세포에서 유의하게 억제되었으며, 이는 모든 이펙터 대 표적 비율(effector-to-target ratios)에 걸쳐 일관된다.

활성화된 면역 세포와 종양 항원 특이적 항체의 항종양 효과를 확인하기 위해, 입양 세포 전달 실험을 수행하였다. 실험대상은, PBS를 접종한 마우스에서 분리한 혈청과 비장세포를 접종한 마우스(Naive 그룹; 대조군)와 SC-ACT그룹 또는 KO-ACT그룹의 마우스에서 분리한 혈청과 비장 면역 세포를 접종한 마우스(SC-ACT그룹 또는 KO-ACT그룹; 실험군)의 총 3군으로 구성하였다. 실험의 상세한 진행 방법을 도17의 b에 도시하였으며, 실험 결과는 도17의 c, d, e, 및 f에 도시하였다.

실험이 끝나는 28일차까지 모든 그룹에서 유의미한 체중 감소가 관찰되지 않았다 (도17의 c). Naive 그룹 및 SC-ACT 그룹에 비하여, KO-ACT 그룹에서 종양의 부피 및 무게가 유의미하게 낮은 것이 확인되었다 (도17의 d). 비장 지수는 그룹 간에 유의한 차이를 보이지 않았으며, 이러한 경향은 폐 전이 결과와 일치하였다 (도17의 e 및 f).

추가로, TME에서의 면역 활성화를 확인하기 위하여 조직 슬라이드를 분석하였고, 그 결과를 도18의 a 및 b에 도시하였다.

Naive 그룹 및 SC-ACT 그룹에 비하여, KO-ACT그룹의 TME에서 M1 타입 대식세포(M1 type macrophage)와 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)의 발현 수준이 유의하게 높은 것이 확인되었다 (도18의 a). Naive 그룹 및 SC-ACT 그룹에 비하여, KO-ACT그룹의 비장 면역 세포에서 M1 타입 대식세포(M1 type macrophage)및 조절 T세포(regulatory T cell, Treg)의 비율이 높은 것을 확인되었지만, 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)의 비율은 유의미한 차이가 없음이 확인되었다 (도18의 b).

이러한 실험 결과는, whole cell vaccine을 주입함으로 인하여, TME에서의 면역 반응이 활성화된 것에 비하여, 전신 면역 반응의 활성화가 불충분함을 시사한다.

실험예3.3 TSG-6 KO 세포 백신 (TSG-6 KO whole cell vaccine)의 효과 확인

본 발명자는 TSG-6 KO 세포 백신 (TSG-6 KO whole cell vaccine)의 항종양 효과를 확인하고자 하였다. 이를 위해, 도6의 a에 도시된 바와 같이, 유방암 마우스 모델에 Irradiated 4T1 세포백신(SC-4T1 백신) 또는 Irradiated KO-4T1세포백신(KO-4T1 백신)을 접종하였다.

실험 그룹은 총 6개로 구성되어 있다. 첫번째로, SC-4T1 세포주를 이식받은 유방암 마우스 모델에 DPBS를 처리한 대조군(SC+DPBS)이 있다. 두번째로, SC-4T1 세포주를 이식받은 유방암 마우스 모델에 면역자극제를 처리한 대조군(SC+Adjuvant)이 있다. 세번째로, SC-4T1 세포주를 이식받은 유방암 마우스 모델에 SC-4T1 백신을 처리한 실험군(SC+VaccineSC)이 있다. 네번째로, SC-4T1 세포주를 이식받은 유방암 마우스 모델에 KO-4T1 백신을 처리한 실험군(SC+VaccineKO)이 있다. 다섯 번째로, KO-4T1 세포주를 이식받은 유방암 마우스 모델에 SC-4T1 백신을 처리한 실험군(KO+ VaccineSC)이 있다. 여섯 번째로, KO-4T1 세포주를 이식받은 유방암 마우스 모델에 KO-4T1 백신을 처리한 실험군(KO+ VaccineKO)이 있다.

각 그룹의 마우스에 대한 몸무게, 종양의 크기, 종양의 부피 등의 데이터를 비교하였으며, 그 결과를 도6의 b, c, d, e, f에 도시하였다.

대조군과 비교하였을 때, 모든 실험군에서 마우스의 몸 무게는 실험 기간인 33일 동안 유의한 차이가 관찰되지 않았다 (도 6의 b).

마우스의 생존율은 Log-Rank 방법을 사용하여 평가하였다. 생존율에 있어서, SC+VaccineSC는 대조군과 유의한 차이를 보이지 않았으나, SC+VaccineKO, KO+VaccineSC, KO+VaccineKO는 대조군과 유의한 차이(실험군이 대조군보다 생존율이 높음)를 보였다(p<0.01). 대조군인 SC+DPBS 및 SC+Adjuvant의 평균 생존 기간은 각각 36일 및 38일인 반면, 실험군인 SC+VaccineSC 및 SC+VaccineKO의 평균 생존 기간은 각각 30일 및 52일이었다 (도6의 c).

SC+DPBS와 SC+Adjuvant 사이에 종양 크기에는 유의한 차이가 없었다. 대조군과 비교하여 SC+VaccineKO에서 종양 성장이 현저하게 억제된 것이 관찰되었지만(p<0.0001), SC+VaccineSC에서는 그렇지 않았다. 다른 대조군 및 실험군과 비교하여, KO+VaccineSC 및 KO+VaccineKO의 종양 부피가 현저하게 작은 것이 확인되었다(p<0.0001) (도6의 d).

비장 지수는 SC+VaccineSC, SC+VaccineKO, KO+VaccineSC, 및 KO+VaccineKO 순서로 평균값이 감소하는 경향을 보였다. 그리고 비장으로의 전이 수준은 SC+VaccineSC에 비해 KO+VaccineKO에서 유의하게 낮은 것이 확인되었다 (p<0.01) (도 6의 e).

자발성(spontaneous) 폐 전이의 수준은 육안적 결절 계수(macroscopic nodule counting) 및 현미경적 병변 면적 비교(microscopic lesion area comparison)의 두 가지 방법으로 결정되었다. 둘 다 SC+VaccineSC, SC+VaccineKO, KO+VaccineSC, 및 KO+VaccineKO 순서로 감소하는 경향을 보였다. KO+VaccineKO는 대조군과 비교하여 유의한 차이를 보였다 (도 6의 f).

실험예3.4 TSG-6 KO 세포 백신 (TSG-6 KO whole cell vaccine)의 인한 전신 면역 활성화(systemic immune activation) 유도

본 발명자는 백신에 의한 전신 면역 활성화 여부를 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 비장 내 면역세포를 분리하여 유동세포계측법으로 면역세포군을 비교하였고, 그 결과를 도7에 도시하였다.

활성화된 세포독성 T 세포 및 CD4+ T 세포의 개체군은 SC+VaccineSC, SC+VaccineKO, KO+VaccineSC, 및 KO+VaccineKO 순서로 증가하는 경향을 보였다. 이 중, KO+VaccineKO는 통계적 유의성을 보였다(p<0.01). 대조군에 비하여, SC+VaccineKO, KO+VaccineSC, KO+VaccineKO에서 M1형 대식세포의 비중이 유의하게 높은 것으로 확인되었다 (p<0.01). MHC II+ 형질세포는 SC+VaccineSC, SC+VaccineKO, KO+VaccineSC, 및 KO+VaccineKO 순서로 증가하는 경향을 보였다. 이중, KO+VaccineKO에서 통계적 유의성을 보였다 (도 7).

MHC 클래스 II 발현은 펩타이드 항원을 효율적으로 제시하기 위해 특화된 APC에서 발견된다. 그리고 MHC II 발현 기억 형질 세포는 백신 항원에 의해 유도된 오래 지속되는 체액성 면역에 기여힌다. 이러한 점과 실험 결과는, TSG-6 KO 세포 백신 (TSG-6 KO whole cell vaccine)에 의하여 전신 면역 활성화(systemic immune activation)가 유도된다는 것을 보여준다.

Claims (14)

1. 조작된 종양 세포를 포함하는, 유방암 치료를 위한 항암용 조성물로,
   상기 조작된 종양 세포의 게놈 DNA는 인위적으로 조작된 TNFAIP6(tumor necrosis factor, alpha-induced protein 6) 유전자를 포함하며,
   상기 조작된 TNFAIP6유전자의 핵산 서열은 야생형 TNFAIP6유전자의 핵산 서열과 다르며,
   상기 조작된 종양 세포는 야생형 TSG-6(TNF-stimulated gene 6 protein) 단백질을 발현하지 않고,
   상기 조작된 종양 세포는 유방암 환자의 유방암 세포로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 항암용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자의 핵산 서열은 야생형 TNFAIP6유전자의 핵산 서열에서 인델을 포함한 것을 특징으로 하는, 항암용 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 인델은 인위적으로 조작된 TNFAIP6유전자의 엑손2 영역에 위치한 것을 특징으로 하는, 항암용 조성물.
4. 제2항에 있어서,
   상기 인델(indel)의 크기는 200bp이하인 것을 특징으로 하는, 항암용 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 조작된 종양 세포는 야생형 종양 세포에 비하여, PD-L1(Programmed Death-Ligand 1) 또는 B7-H3(B7 homolog 3)의 발현 수준이 낮은 것을 특징으로 하는, 항암용 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 조작된 종양 세포는 세포사멸이 유도될 수 있도록 구성된 것을 특징으로 하는, 항암용 조성물.
   
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