JP2010521460A - 癌免疫療法におけるIi−RNAi関与Ii抑制 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒトの癌細胞でのIi発現を有効に阻害するヒトIi−RNAi構築物を作製した。Ii mRNAの異なる位置を標的化する異なるIi−RNAi構築物の組合せは、Ii阻害に対して相乗効果を有する。さらに、Ii−RNAi発現を駆動するための特異的プロモーターは、種々の細胞型におけるIi−RNAiの活性に不可欠である。
【選択図】なし
Description
特異的抗原に対する免疫応答は、Tリンパ球による該抗原のペプチド断片の認識によって調節される。抗原提示細胞内では、プロセシングされた抗原のペプチド断片が、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子の抗原ペプチド結合部位内に結合された状態になる。このようなペプチド−MHC複合体は、次いで、細胞表面に輸送され、ヘルパーまたは細胞傷害性Tリンパ球上のT細胞受容体によって(外来ペプチドと、提示しているMHC分子の隣接表面の両方が)認識される。ペプチドを送達するMHC分子には2つのクラス、すなわちMHCクラスIとMHCクラスIIがある。
本発明は、抗原提示経路の改変を目的とした細胞におけるIi発現の阻害に関連する組成物および方法に関する。
Ii発現の抑制は、抗原提示経路を改変することが意図される。より詳しくは、Ii発現の阻害は、MHCクラスII分子に、通常この状況では提示され得ない抗原エピトープが負荷されるのを促進することが意図される。主題の発明は、抗原提示経路の改変を目的とした細胞におけるIi発現の阻害に関連する組成物および方法に関する。
レトロウイルスは、脳腫瘍を処置するために使用されており、この場合、レトロウイルスが分裂細胞(腫瘍細胞)のみに感染する能力が、特に好都合であり得る。
10種類のIi−siRNA構築物を作製した。これらは米国特許出願第10/999,208号に記載されている。これらの単独のsiRNA構築物を、非癌性ヒト胚性腎臓(HEK)293細胞株においてIi発現の阻害について試験した。
10種類のsiRNA(Ii)構築物を設計した。これらの構築に使用したオリゴヌクレオチドを表1に示す。構築物は、siRNAのクローニングのために特別に設計されたpSuppressorAdenoプラスミド(Imgenex.サンディエゴ、カリフォルニア州)を用いて作製した。このプラスミドは、siRNA発現に対して最適化されたCMVプロモーターを含み、siRNA配列の挿入のための簡便なクローニング部位を提供し、さまざまな細胞への送達を可能にする。さらに、このプラスミドはまた、siRNA発現構築物を含む組換えアデノウイルスの構築に対しても使用され得る。これらのsiRNA(Ii)構築物の設計では、2つのアプローチに従った。まず、Imgenexコンピュータプログラムを用いて5種類の構築物(表1の構築物11〜15)を予測した。このプログラムにより、Ii RNAにハイブリダイズしそうな基本組成(すなわち、適切なG−C含量など)を有するRNA配列が特定される。得られた5種類のsiRNA(Ii)構築物は、実際にIi mRNAとハイブリダイズするならば、強力なインヒビターであることが予測される。しかしながら、任意の所与のmRNAの3次構造を予測することは困難なため、かかるコンピュータ設計siRNA(Ii)構築物は、実験によってIi mRNAに到達可能でないとされる場合がみられ得る。したがって、さらに5種類の構築物(表1の構築物16〜20)の設計において、第2のアプローチもまた使用した。Iiタンパク質の発現を阻害するためのIi−RGCの使用に関する先のデータにおいて、一部のIiアンチセンスオリゴヌクレオチド(Qiu Cancer Imm Immunother. 48: 499-506 (1999)(Xu 米国特許第6,368,855号)およびIi逆遺伝子構築物(RGC;Lu Cancer Immunol Immunother. 52: 592-598 (2003))(米国特許第10/127,347号)は、ヒトIi mRNAの最初の400bpにハイブリダイズすること、およびその結果としての強力なIiタンパク質発現の阻害が示されていた。このデータから、ヒトIi mRNAのこの領域は、siRNA構築物に到達する可能性が高いはずであることが推測され得る。さらに、この提案は、翻訳を開始させるAUG部位を含むmRNA領域が、一般に、mRNAに結合するアンチセンス構築物に対して感受性の領域であるという文献のデータと整合する。したがって、検討により、さらに5種類のsiRNA構築物を設計してヒトIi mRNAの最初の400bp以内のAUG開始部位近傍のIi mRNAの部分にハイブリダイズさせた。ヒトIi mRNAの最初には2つのAUGが存在し、これらはともに機能性の翻訳開始部位であると思われるため、siRNA配列は、これらの両方の部位を標的化するように設計した。具体的には、最初のAUGの近傍に2つのオーバーラップ配列を設計し、第2のAUGの近傍に3つのオーバーラップsiRNA配列を設計した。これらの5種類のsiRNA(Ii)配列は、最適なアニーリングパラメータを有するものでない可能性はあるが、Ii RNAとハイブリダイズすることが予測され得る。配列はすべて、発現されたsiRNA配列のヘアピン形成を可能にする短鎖ループ配列を用いて設計した。ヘアピンの形成により、機能性の二本鎖siRNAが生じる。標的mRNAと相互作用し、これを切断するRNA誘導型サイレンシング複合体(RISC)の形成における二本鎖RNAの必要性が、明白に示された(Nature Reviews Genetics 2: 110-119, 2001)。
10種類のsiRNA(Ii)構築物を、標準的な分子生物学的手法に従い、Sal1およびXba1酵素部位を用いて、上記の配列をpSuppressorAdenoプラスミド(Imgenex、サンディエゴ、カリフォルニア州)内にクローニングすることにより作製した。293ヒト腎臓細胞株(ATCC番号CRL−1573)の細胞を、これらの各Ii siRNA構築物(0.82μg)を有するヒトIi cDNA遺伝子プラスミド(0.18μg)とともにコトランスフェクトした。いくつかの活性なIi siRNA構築物を規定した。
本発明では、上記の表1に示した10種類のIi−siRNA構築物を使用し、ヒトリンパ腫細胞株Raji細胞をトランスフェクトした。Raji細胞内へのIi−siRNA構築物のトランスフェクションには、遺伝子銃送達法を使用した。Ii−siRNA配列を、CMVプロモーターによって駆動されるpSuppressorAdenoベクター(Imgenex、サンディエゴ)内にクローニングした(CMV/Ii−siRNAと称する)。このプラスミドDNAを、金微粒子上に沈降させた。金マイクロキャリア(カートリッジ1つに対して0.5mgの1μm金微粒子)を、超音波処理によって100μlの0.1Mスペルミジン中に懸濁させた。表示した量のプラスミドDNA(カートリッジの所望数による)を、内毒素無含有水中1mg/mlの濃度で添加し、超音波処理し、200μlの1M CaCl2を滴下した。この金−DNA混合物を10分間放置した後、1mlの100%エタノールで3回洗浄した。最後の洗浄後、ペレットを適切な容量(金微粒子の所望量による)の0.02mg/mlのポリビニルピロリドン(PVP)含有100%エタノール中に再懸濁させ、15ml容チューブに移した。すると、カートリッジ1つあたり0.5mgの金のマイクロキャリア負荷量(MLQ)および可変DNA負荷比(DLR)であった。1mlのDNA/マイクロキャリア懸濁液で、17個のコーティングされた0.5インチカートリッジが作製され、これらを使用前に、乾燥剤を用いて4℃で一晩保存した。Raji細胞のトランスフェクションには、106Raji細胞を含む20μlの媒体を組織培養皿上の直径約0.8cmの領域に塗布し、次いで、0.5インチカートリッジによる遺伝子銃射撃に供した(350〜400psiのヘリウム圧を使用)。トランスフェクション後、細胞をさらに36〜48時間培養した。次いで、細胞を収集し、洗浄し、抗HLA−DRおよび抗ヒトIiモノクローナル抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析し、HLA−DR+/Ii−細胞の割合を求めた。Raji細胞におけるIi阻害を表2に示す。表2から、Ii−siRNA配列番号14、番号16および番号17は、Raji細胞におけるIi発現の阻害において活性であることがわかる。この阻害は、MHCクラスII分子提示が、これらのIi−siRNA構築物によって明らかには影響されていないため、Ii特異的である。
別の実験において、活性なCMV/Ii−siRNA構築物(表2の配列番号14、番号16および番号17を含む)を、さらに、別々に(1μg/トランスフェクション)または組合せて(0.5μg+0.5μg/トランスフェクション)使用し、Raji細胞においてIi発現を阻害した。金微粒子上へのプラスミドDNAコーティングおよびトランスフェクションの手順は、表2の実験のものと同じとした。Raji細胞をトランスフェクションの36〜48時間後に収集し、洗浄し、抗HLA−DRおよび抗ヒトIi抗体で染色した。結果を表3に示す。表3から、配列番号14と番号17を含むプラスミドの組合せの使用で、Raji細胞における最も著しいIi阻害が得られたことがわかり、これは、Ii遺伝子の異なる部位に標的化されるIi−siRNA配列の組合せの使用によって、単独のIi−siRNA構築物の使用よりも有効なIi阻害がもたらされることを示す。配列番号14と番号16または配列番号16と番号17を含むプラスミドの組合せの使用では、配列番号14と番号17を含むプラスミドの組合せの使用と比べて低いIi阻害がもたらされ、これは、後者の組合せが最良の組合せであることを示す。
2つの最も活性な(Raji細胞において)Ii−siRNA配列番号14と番号17(表2参照)を、EF−1αプロモーターによって駆動されるpBudCE4.1プラスミド(Invitrogen、CA)内にさらにクローニングした(EF−1α/Ii−siRNAと称する)。これを行なうため、2種類のオリゴヌクレオチド対をまずアニーリングさせてオーバーヘッドBgl IIおよびNot Iクローニング部位を有する番号14および番号17(表2)のDNA配列に対応する2つの二本鎖DNA配列とした。Ii−siRNA配列は、EF−1αプロモーターによって駆動させた。得られたプラスミドを配列決定によって確認した。KG−1細胞(ヒト急性骨髄性白血病(AML)細胞株)を使用し、CMVまたはEF−1αいずれかのプロモーターによって駆動される2種類の活性なIi−siRNAプラスミドの活性を調べた。金微粒子上へのプラスミドコーティングの手順および遺伝子銃関与トランスフェクションの手順は、Raji細胞のトランスフェクションと同じとした。トランスフェクション後、KG−1細胞を36〜48時間さらに培養し、細胞を収集し、洗浄し、抗ヒトIiモノクローナル抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析し、Ii陰性細胞の割合を求めた。表4に示されるように、CMV/Ii−siRNAおよびEF−1α/Ii−siRNA構築物は、KG−1細胞においてほぼ同程度に活性であった。違いは、コーティングおよびトランスフェクションの差異の反映であり得る。CMV駆動プラスミドは、pSuppressorAdenoベクターであり、一方、EF−1α駆動プラスミドは、PBudCE4.1ベクターであった。
CMV/Ii−siRNAおよびEF−1α/Ii−siRNA構築物の活性を、前立腺癌細胞においてさらに試験した。PC−3前立腺癌細胞をCMV/p7(p7=配列番号17)およびEF−1α/P7プラスミドで、Lipofectamine(登録商標)2000(Invitrogen、CA)法により、製造業者の使用説明書に従ってトランスフェクトした。結果(表5)は、PC−3細胞において、CMVプロモーターがEF−1αプロモーターよりもずっと活性であることを示す(CMV/p7とEF−1α/p7を比較)。この結果は、プロモーターの活性が細胞型特異的であることを示す。この試験のデータ全般は、CMVプロモーターが、試験したすべての型の細胞において活性なプロモーターであることを示す。また、EF−1αプロモーターも、試験したすべての型の細胞において活性であるが、前立腺癌細胞でのEF−1αプロモーターの活性は、CMVプロモーターよりもずっと低い。
Claims (28)
- 配列番号:14、16および17からなる群より選択される任意の2種類の異なるsiRNAを投与する工程を含む、細胞内でIiを抑制する方法。
- 請求項1において、選択される2種類の異なるsiRNAが、配列番号:14および17である方法。
- 配列番号:14、16および17からなる群より選択される2種類の異なるsiRNAをコードするDNA配列(1つまたは複数)を含む発現可能な構築物を投与する工程を含む、細胞内でIiを抑制する方法。
- 請求項3において、該siRNAをコードするDNA配列(1つまたは複数)が、RNAポリメラーゼプロモーターに作動可能に連結されている方法。
- 請求項4において、RNAポリメラーゼプロモーターが、CMVまたはEF−1αである方法。
- 請求項1または3において、細胞が癌細胞である方法。
- 請求項5において、細胞が癌細胞であり、プロモーターがCMVであり、癌がAML、前立腺癌またはB細胞リンパ腫である方法。
- 請求項5において、細胞が癌細胞であり、プロモーターがEF−1αであり、癌がAMLまたは前立腺癌である方法。
- 配列番号:14、16および17からなる群より選択される任意の2種類の異なるsiRNAを投与する工程を含む、癌の処置方法。
- 配列番号:14、16および17からなる群より選択される2種類の異なるsiRNAをコードするDNA配列(1つまたは複数)を含む発現可能な構築物を投与する工程を含む、癌の処置方法。
- 請求項3または10において、該siRNAをコードするDNA配列(1つまたは複数)が、カチオン性デンドリマー、脂質、リポソーム、金粒子、ポリラクチドコグリコリド粒子、およびポリアルキルオキシドコポリマーからなる群より選択される媒介物質を用いる方法によって細胞内に導入される方法。
- Ii発現を阻害するのに有効なsiRNAの組合せを含む組成物であって、前記組合せが、配列番号:14、16および17からなる群より選択される任意の2種類の異なるsiRNAで構成されたものである組成物。
- 請求項12において、該2種類の異なるsiRNAが、配列番号:14および17である組成物。
- 配列番号:14、16および17からなる群より選択される2種類の異なるsiRNAをコードするDNA配列(1つまたは複数)を含む組成物であって、該siRNAがIi発現を阻害するのに有効である組成物。
- 請求項14において、該siRNAをコードするDNA配列(1つまたは複数)が、RNAポリメラーゼIIIプロモーターに作動可能に連結されている組成物。
- 請求項15において、該プロモーターが、CMVまたはEF−1αプロモーターである組成物。
- 配列番号:14、16および17からなる群より選択される任意の2種類の異なるsiRNAを含む哺乳動物細胞。
- 配列番号:14、16および17からなる群より選択される2種類の異なるsiRNAをコードするDNA配列(1つまたは複数)を含む発現可能な構築物を含む哺乳動物細胞。
- 請求項17または18において、癌細胞である哺乳動物細胞。
- 免疫応答のために個体の細胞型を標的化するための方法であって、該細胞型が1種類以上の確認済または未知の抗原の発現を特徴とし、
a) 培養物中に、抗原提示細胞を含む個体の末梢血単核細胞を準備する工程;ならびに
b) 工程a)の培養物の抗原提示細胞内に、配列番号:14、16および17からなる群より選択される2種類の異なるsiRNAを導入し、該siRNAは直接または間接的に該細胞内に導入されることによりIiの発現が阻害される工程、
を含む方法。 - 請求項20において、さらに、治療効果のために個体に工程b)の細胞を再導入することを含む方法。
- 請求項20または21において、標的化される細胞型が、癌細胞である方法。
- 請求項14において、該DNA配列(1つまたは複数)が、プラスミドベクター内に存在する組成物。
- 請求項14において、該DNA配列(1つまたは複数)が、ウイルスベクター内に存在する組成物。
- 請求項18において、該DNA配列(1つまたは複数)が、プラスミドベクター内に存在する哺乳動物細胞。
- 請求項18において、該DNA配列(1つまたは複数)が、ウイルスベクター内に存在する哺乳動物細胞。
- 請求項24において、ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザ、およびレトロウイルスからなる群より選択される組成物。
- 請求項26において、ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザ、およびレトロウイルスからなる群より選択される哺乳動物細胞。
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