JP2024020399A - 遺伝子操作された免疫刺激性細菌菌株およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
2017年7月11日に出願され、Christopher D. ThanosおよびLaura Hix Glickmanの「ENGINEERED IMMUNOSTIMULATORY BACTERIAL STRAINS AND USES THEREOF」と題された米国特許仮出願第62/531,327号に対する優先権の利益を主張する。2018年3月26日に出願され、Christopher D. Thanos、Laura Hix GlickmanおよびJustin Skobleの「ENGINEERED IMMUNOSTIMULATORY BACTERIAL STRAINS AND USES THEREOF」と題された米国特許仮出願第62/648,380号に対する優先権の利益も主張する。
配列リストの電子バージョンは、本願と共に出願され、その内容は、その全体が参照により組み込まれるものとする。電子出願は、2018年7月11日に作製されており、サイズは410キロバイトであり、表題は1701SEQPC001.txtである。
rfaL、rfaG、rfaH、rfaD、rfaP、rFb、rfa、msbB、htrB、firA、pagL、pagP、lpxR、arnT、eptA、およびlpxTのうちの1つまたは複数の中から選択される、リポポリサッカライドの生合成を変更する、遺伝子の突然変異のうちの1つまたは複数;および/または
自殺遺伝子を導入し、sacB、nuk、hok、gef、kilまたはphlAのうちの1つまたは複数の中から選択される突然変異のうちの1つまたは複数;および/または
溶菌遺伝子を導入し、hlyおよびclyのうちの1つまたは両方から選択される突然変異のうちの1つまたは複数;および/または
IsyA、pag、prg、iscA、virG、plcおよびactの中から選択される、1つまたは複数のビルレンス因子(複数可)の突然変異;および/または
recA、htrA、htpR、hspおよびgroELの中から選択される、ストレス応答を改変する1つまたは複数の突然変異;および/または
細胞周期を破壊するminの突然変異;および/または
cya、crp、phoP/phoQ、およびompRの中から選択される、調節性機能を破壊または不活性化する1つまたは複数の突然変異、のうちのいずれかである。
A.定義
B.免疫刺激性細菌の概説
C.がん免疫療法
1.免疫療法
2.養子免疫療法
3.がんワクチンおよび腫瘍崩壊性ウイルス
D.細菌によるがん免疫療法
1.細菌による治療法
2.細菌およびウイルスに対する免疫応答の比較
3.サルモネラ属による治療法
a.腫瘍指向性細菌。
b.サルモネラエンテリカセロバーティフィムリウム
c.細菌の弱毒化
i.msbB-突然変異体
ii.purI-突然変異体
iii.弱毒突然変異の組合せ
iv.VNP20009および他の弱毒化S.ティフィムリウム菌株
v.高分子をデリバリーするように遺伝子操作された弱毒化S.ティフィムリウム
4.治療指数を増加させるための免疫刺激性細菌の強化
a.asd遺伝子欠失
b.アデノシン栄養要求性
c.フラジェリン欠損菌株
d.サルモネラ属含有液胞(SCV)を逃避するように遺伝子操作されたサルモネラ属
e.バイオフィルム形成に必要なサルモネラ属遺伝子における欠失
f.LPS生合成経路中の遺伝子における欠失
g.SPI-1遺伝子の欠失
h.プラスミドデリバリーを増加させるためのエンドヌクレアーゼ(endA)突然変異
i.RIG-I阻害
j.DNASE II阻害
k.RNase H2阻害
l.スタビリン-1/CLEVER-1阻害
m.細菌培養条件
E.例示的プラスミドの構築
1.干渉RNA(RNAi)
a.shRNA
b.マイクロRNA
2.複製起点およびプラスミドコピー数
3.CpGモチーフおよびCpGアイランド
4.プラスミドの維持/構成成分の選択
5.DNA核標的化配列
F.腫瘍標的化免疫刺激性細菌は、抗腫瘍免疫を刺激するための例示的免疫標的遺伝子に対するRNAiを含む
1.TREX1
2.PD-L1
3.VISTA
4.SIRPα
5.β-カテニン
6.TGF-β
7.VEGF
8.追加の例示的なチェックポイント標的
G.単回療法モダリティおよび組合せ療法内での複数の免疫標的に対するRNAI shRNAの組合せ
1.TREX1および他の標的
2.TREX1および照射療法
3.TREX1および免疫原性化学療法
4.抗チェックポイント抗体を用いた組合せ療法
H.医薬産生、組成物、および製剤
1.製造
a.細胞バンクの製造
b.原薬の製造
c.薬物産物の製造
2.組成物
3.製剤
a.液体剤、注射剤、乳剤
b.熱安定性乾燥製剤
4.他の投与経路のための組成物
5.投薬量および投与
6.包装および製造物品
I.処置および使用の方法
1.がんおよび腫瘍
2.投与
3.モニタリング
J.実施例
別段の定義がない限り、本明細書において使用する全ての技術および科学用語は、本発明(複数可)が属する技術分野における当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書における開示全体にわたって言及される全ての特許、特許出願、出願公開および文献、GenBank配列、データベース、ウェブサイトおよび他の刊行物は、特に注釈がない限り、その全体が参照により組み込まれるものとする。本明細書における用語に関して複数の定義が存在する場合には、この項におけるものが優先される。URLまたは他のそのような識別子またはアドレスを参照する場合、そのような識別子は変更されている場合があり、インターネット上の特定の情報が押し寄せてくる場合があるが、インターネット検索によって等価の情報を見出すことができることを理解されたい。その参照は、そのような情報の利用可能性および一般的な普及の証拠となる。
本明細書において免疫刺激性細菌と称され、腫瘍において蓄積しおよび/または複製し、処置される対象においてRNAが発現すると同時に、その阻害、抑制またはサイレンシングが腫瘍療法をもたらす遺伝子を標的とする設計shRNAおよび設計マイクロRNA等の阻害性RNAをコードする改変細菌が提供される。改変のための細菌の菌株は、治療的使用にいずれも好適である。本明細書において提供される改変された免疫刺激性細菌は、がんを処置するための使用のためのものおよび方法のためのものである。細菌は、そのような使用および方法のために改変される。
腫瘍微小環境(TME)内で認められる免疫抑制性環境は、腫瘍を発症し、進行させるドライバーである。がんは、免疫系が腫瘍の制御および封じ込めを失敗した後に出現する。複数の腫瘍特異的な機序が腫瘍環境を作り出し、免疫系は、それらを除去する代わりに腫瘍およびそれらの細胞の許容を示さざるを得ない。がん免疫療法の目標は、腫瘍を削除する免疫系の自然の能力を助けることである。微生物感染と関連する急性の炎症は、何世紀にもわたる観察に基づいた腫瘍の自然消失に関連している。
いくつかの臨床的ながん免疫療法は、抗腫瘍免疫に対する免疫抑制のバランスを混乱させることが求められている。IL-2およびIFN-α等のサイトカインを直接投与することを介して免疫を刺激するための戦略では、少数の患者において中程度の臨床応答が認められ、同時に重篤な全身性炎症関連毒性が誘導されてきた(Sharma et al. (2011) Nat Rev Cancer 11:805-812)。免疫系は、T細胞上のプログラム細胞死タンパク質1(PD-1)の上方調節、および抗原提示細胞(APC)上と腫瘍細胞上の両方で発現されるその同族リガンドであるプログラム死リガンド1(PD-L1)に対するその結合等の自己免疫を制限するためにいくつかのチェックおよびバランスを進化させてきた。PD-L1がPD-1へ結合すると、CD8+T細胞シグナル伝達経路に干渉し、CD8+T細胞の増殖およびエフェクター機能を損なわせ、T細胞寛容を誘導する。PD-1およびPD-L1は、多数の阻害性「免疫チェックポイント」のうちの2つの例であり、これらは免疫応答を下方調節することによって機能する。他の阻害性免疫チェックポイントとしては、細胞毒性T-リンパ球関連タンパク質4(CTLA-4)、シグナル調節タンパク質α(SIRPα)、T細胞活性化のV-ドメインIgサプレッサー(VISTA)、プログラム死リガンド2(PD-L2)、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)1および2、リンパ球活性化遺伝子3(LAG3)、ガレクチン-9、IgおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体(TIGIT)、T細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有3(TIM-3、A型肝炎ウイルス細胞受容体2(HAVCR2)としても公知である)、ヘルペスウイルス侵入メディエーター(HVEM)、CD39、CD73、B7-H3(CD276としても公知である)、B7-H4、CD47、CD48、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD155、CD160、CD244(2B4)、B-およびT-リンパ球アテニュエーター(BTLA、またはCD272)およびがん胎児性抗原関連細胞接着分子1(CEACAM1、またはCD66a)がある。
冷たい腫瘍を再活性化し、より免疫原性になるようにするための試みにおいては、養子細胞療法(ACT)として公知であるある種の免疫療法は、免疫細胞を利用し、抗腫瘍活性を有するようにそれらを再プログラムする様々な戦略を包含する(Hinrichs et al. (2011) Immunol. Rev. 240:40-51)。樹状細胞ベースの治療法は、更なる免疫刺激特性を有する遺伝子操作された樹状細胞(DC)を導入する。これらの治療法は、がんに対する免疫寛容を破壊することができないために成功していない(例えば、Rosenberg et al. (2004) Nat. Med. 12:1279を参照のこと)。DCリクルートメントを刺激するために、内因性腫瘍抗原および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を含む全体が照射された腫瘍細胞を使用する、GVAXとして公知の方法は、腫瘍寛容を破壊するための能力が無いために同様に臨床においてできない(Copier et al. (2010) Curr. Opin. Mol. Ther. 12:647-653)。個別の自家細胞ベース療法であるシプロイセル-T(Provenge)は、去勢抵抗性前立腺がんに対して2010年にFDA承認された。それは、患者から採取されたAPCを利用し、前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)抗原を発現するように再武装し、T細胞応答を刺激し、次いでリンパ切除後に再導入される。残念ながら、その広範な採用は、観察される客観的奏効率が低く、かつコストが高いことによって制限されており、その使用は、前立腺がんの初期段階のみに限定される(Anassi et al. (2011) P T. 36(4):197-202)。同様に、自家T細胞療法(ATC)は、患者自身のT細胞を採取し、それらをエクスビボで再活性化し、腫瘍寛容を克服し、次いでそれらをリンパ切除後に患者へ再導入する。ATCの臨床的成功は限定され、黒色腫においてのみであり、同時に重大な安全性および実行可能性の問題が生じ、これらがその有用性を限定する(Yee et al. (2013) Clin. Cancer Res. 19:1-3)。
冷たい腫瘍は、T細胞および樹状細胞(DC)の浸潤が無く、T細胞非炎症性である(Sharma et al. (2017) Cell 9; 168(4):707-723)。冷たい腫瘍を再活性化し、より免疫原性にするための試みにおいては、別の種類の免疫療法で、腫瘍において自然にまたは工学に基づき蓄積することができる微生物が利用される。これらは、免疫系を刺激し、腫瘍抗原を発現し、その結果、免疫系を活性化および再プログラミングし、腫瘍を拒絶するように設計されたウイルスを含む。ウイルスベースのがんワクチンは、ウイルス性ベクター自体に対する既存のまたは後天的な免疫、ならびに腫瘍抗原を提示するのに十分な免疫原性の欠如を含むいくつかの因子のために臨床的に大きく失敗している(Larocca et al. (2011) Cancer J. 17(5):359-371)。APCの適正なアジュバント活性化が無いことも、DNAワクチン等の他の非ウイルス性ベクターがんワクチンの妨げになる。対照的に、腫瘍崩壊性ウイルスは、健常組織よりも分裂腫瘍細胞において優先的に複製しようとし、するとその後の腫瘍細胞溶解が、免疫原性の腫瘍細胞死および更なるウイルス性播種をもたらす。腫瘍崩壊性ウイルスのタリモジェンラヘルパレプベク(T-VEC)は、改変単純ヘルペスウイルスをDCリクルーティングサイトカインGM-CSFと組み合わせて使用しており、転移性の黒色腫に関してFDA承認されている(Bastin et al. (2016) Biomedicines 4(3):21)。一部の黒色腫患者における臨床的利点と、他の免疫療法よりも免疫毒性が少ないことが実証されたが、腫瘍内投与経路および製造条件が制限され、ならびに遠位腫瘍有効性および他の腫瘍タイプに対する幅広い適用が欠如している。とりわけ、パラミクソウイルス、レオウイルスおよびピコナウイルスを利用したもの等の他の腫瘍崩壊性ウイルス(OV)ベースのワクチンでは、全身性抗腫瘍免疫の誘導において類似の制限が認められる(Chiocca et al. (2014) Cancer Immunol. Res. 2(4):295-300)。腫瘍崩壊性ウイルスの全身投与は、ユニークな課題を示す。IV投与の場合、ウイルスは急速に希釈され、したがって高力価が必要とされ、それが肝毒性をもたらすことがある。更に、既存の免疫が存在する場合、ウイルスは血液中で急速に中和され、そして後天的な免疫が反復投薬を制限する(Maroun et al. (2017) Future Virol. 12(4):193-213)。
1.細菌療法
細菌が抗がん活性を有するという認識は、何名かの医師が、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)に感染した患者において腫瘍の退行を観察したときの1800年代にさかのぼる。William Coleyは、末期のがんの処置に対して細菌を利用して研究を最初に開始し、S.ピオゲネス(S.pyogenes)およびセラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)から構成されるワクチンを開発し、肉腫、がん腫、リンパ腫および黒色腫を含む様々ながんの処置に使用するのに成功した。その後、クロストリジウム属(Clostridium)、マイコバクテリウム属、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)、L.モノサイトゲネス等のリステリア属、およびエシェリキア属(Escherichia)の菌種を含むいくつかの細菌が、抗がんワクチンの原料として研究されている(例えば、国際公開第1999/013053号;国際公開第2001/025399号;Bermudes et al. (2002) Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 5:194-199;Patyar et al. (2010) Journal of Biomedical Science 17:21;Pawelek et al. (2003) Lancet Oncol.4:548-556を参照のこと)。
細菌は、ウイルスと同様、自然免疫刺激性であるという利点を有する。細菌およびウイルスは、宿主細胞パターン認識受容体(PRR)によって感知される病原体関連分子パターン(PAMP)として公知の保存構造を含むことは公知である。PRRによるPAMPの認識は、サイトカインおよびケモカインの誘導をもたらす下流シグナル伝達カスケード、および病原体クリアランスをもたらす免疫応答の開始を誘導する(Iwasaki and Medzhitov (2010) Science 327(5963):291-295)。自然免疫系にPAMPが関与する様式、および何のタイプの感染因子からかが、侵入病原体を阻止するための適切な適応免疫応答を決定する。
サルモネラ属は、がん治療剤として使用することができる細菌属の例示的なものである。本明細書において例示されるサルモネラ属は、弱毒化菌種、またはがん治療剤として使用するための改変が毒性を減少させることに基づいたものである。
いくつかの細菌菌種が、遠位部位から注射したときに、固形腫瘍内で優先的に複製することは実証されている。これらの細菌としては、これらに限定されるものではないが、サルモネラ属、ビフィドバクテリウム属、クロストリジウム属、およびエシェリキア属の菌種がある。細菌性感染に対する宿主の自然免疫応答と組み合わせた細菌の天然の腫瘍ホーミング特性は、抗腫瘍応答を媒介すると考えられている。この腫瘍組織指向性は、腫瘍のサイズを様々な程度に減少させることが示されている。これらの細菌菌種の腫瘍指向性に対する1つの要因は、無酸素または低酸素環境中で複製するための能力である。いくつかのこれらの天然の腫瘍指向性細菌が、抗腫瘍応答の潜在力を高めるように更に遺伝子操作されている(reviewed in Zu et al. (2014) Crit Rev Microbiol. 40(3):225-235;およびFelgner et al. (2017) Microbial Biotechnology 10(5):1074-1078)。
サルモネラエンテリカセロバーティフィムリウム(S.ティフィムリウム)は、抗がん治療剤として使用するための細菌菌種の例示的なものである。がんに対する宿主免疫を刺激するために細菌を使用するための1つのアプローチは、グラム陰性通性嫌気性菌S.ティフィムリウムを介しており、この菌は、腫瘍微小環境を含む低酸素部分および身体の壊死部分において優先的に蓄積する。S.ティフィムリウムは、組織壊死から栄養素を利用することができ、腫瘍血管系が漏出性であり、かつそれらが免疫系回避腫瘍微小環境において生き残る可能性が高いために、これらの環境において蓄積する(Baban et al. (2010) Bioengineered Bugs 1(6):385-294)。S.ティフィムリウムは、好気性と嫌気性の両方の条件下で成長することができ;したがって低酸素の程度が低い小さい腫瘍および低酸素の程度が高い大きい腫瘍に定着することができる。
がんの処置として投与するための治療用細菌は、弱毒化されるべきである。細菌性病原体を弱毒化するための様々な方法が、当技術分野において公知である。例えば、栄養要求性突然変異によって、細菌は必須栄養素を合成することができなくなり、aro、pur、gua、thy、nadおよびasd等の遺伝子における欠失/突然変異(米国特許出願公開第2012/0009153号)が広範囲に使用される。これらの遺伝子に関与する生合成経路によって産生される栄養素は、宿主細胞において利用できないことが多く、したがって、細菌の生存が課題である。例えば、サルモネラ属および他の菌種の弱毒化は、シキミ酸経路の一部であり、芳香族化合物アミノ酸生合成のための解糖に関連するaroA遺伝子の欠失によって達成することができる(Felgner et al. (2016) MBio 7(5):e01220-16)。したがって、aroAの欠失は、細菌の芳香族化合物アミノ酸栄養要求性、およびその後の弱毒化をもたらす(米国特許出願公開第2003/0170276号、同第2003/0175297号、同第2012/0009153号、同第2016/0369282号、国際公開第2015/032165号、および国際公開第2016/025582号)。同様に、aroCおよびaroDを含む、芳香族化合物アミノ酸のための生合成経路に関与する他の酵素は、欠失され、弱毒化が達成されている(米国特許出願公開第2016/0369282;国際公開第2016/025582号)。例えば、S.ティフィムリウム菌株SL7207は、芳香族化合物アミノ酸栄養要求株(aroA-突然変異体)であり;菌株A1およびA1-Rはロイシン-アルギニン栄養要求株である。VNP20009はプリン栄養要求株(purI-突然変異体)である。本明細書において示すように、免疫抑制性ヌクレオシドアデノシン栄養要求性でもある。
S.ティフィムリウムにおけるmsbB遺伝子によってコードされる酵素脂質A生合成ミリストイル転写酵素は、末端ミリスチル基がリポポリサッカライド(LPS)の脂質Aドメインへ追加されることを触媒する(Low et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(1):37-41)。したがってmsbBの欠失は、グラム陰性細菌の外膜の主要な構成成分であるLPSの脂質Aドメインのアシル組成を変更する。この改変は、敗血症ショックを誘導するLPSの能力を顕著に減少させ、細菌菌株を弱毒化し、TNFαの潜在的に有害な産生を減少させ、したがって、全身毒性を低下させる。S.ティフィムリウム msbB突然変異体は、マウスにおける他の組織にわたる腫瘍に優先的に定着するそれらの能力を維持し、抗腫瘍活性を保持し、したがってサルモネラ属ベースの免疫療法の治療インデックスを増加させる(米国特許出願公開第2003/0170276号、同第2003/0109026号、同第2004/0229338号、同第2005/0225088号、同第2007/0298012号)。
プリン(例えばアデニン)、ヌクレオシド(例えばアデノシン)またはアミノ酸(例えば、アルギニンおよびロイシン)等の1つまたは複数の必須栄養素に対する栄養要求性にすることによって弱毒化することができる免疫刺激性細菌が用いられる。特に、S.ティフィムリウム等の本明細書において提供される免疫刺激性細菌の実施形態では、細菌は、腫瘍微小環境において優先的に蓄積するアデノシンに対する栄養要求性が付与される。したがって、本明細書において記載する免疫刺激性細菌の菌株は、成長するためにアデノシンを必要とし、以下で検討されるようなアデノシンを豊富に有するTMEで優先的に定着するため、弱毒化される。
染色体の異なる領域における遺伝子欠失を用いて複数の遺伝子的弱毒化を有する細菌は、弱毒化を増加し、同時に野生型遺伝的材料との相同的組換えによる遺伝子の獲得によってビルレント表現型への復帰の可能性を減少させることができるため、細菌免疫療法に望ましい。相同的組換えによってビルレンスが回復すると、同じ有機体内で起こるように2つの個別の組換え事象を必要とすることになる。理想的には、免疫療法薬剤において使用するために選択される弱毒突然変異の組合せは、有効性を低下させることなく忍容性を増加させ、その結果、治療インデックスが増加する。例えば、S.ティフィムリウム菌株VNP20009におけるmsbBおよびpurI遺伝子の破壊は、腫瘍を標的とし、成長を抑制するために使用されており、動物モデルにおいて低毒性を誘導する(Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002;Bermudes et al. (2000) Cancer Gene Therapy: Past Achievements and Future Challenges, edited by Habib Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, pp. 57-63;Low et al. (2003) Methods in Molecular Medicine, Vol. 90, Suicide Gene Therapy:47-59;Lee et al. (2000) International Journal of Toxicology 19:19-25;Rosenberg et al. (2002) J. Immunotherapy 25(3):218-225;Broadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178;Loeffler et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104(31):12879-12883;Luo et al. (2002) Oncology Research 12:501-508)。VNP20009(msbB-/purI-)を同系またはヒト異種移植腫瘍を有するマウスに投与した場合、細菌は、300~1000対1を超える比で腫瘍の細胞外構成成分内に優先的に蓄積し、TNFα誘導を減少させ、腫瘍が退行し、制御マウスと比較して生存率が延長することが実証された(Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002)。しかし、ヒトにおける第1相臨床試験からの結果、VNP20009は比較的安全であり、優れた耐容性を示すことが示されたが、不十分な蓄積がヒト黒色腫腫瘍において観察され、抗腫瘍活性は非常にわずかであることが実証された(Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152)。任意の抗腫瘍活性を示すために必須の高用量は、毒性のために不可能であった。
本明細書において記載する改変することができる治療用細菌の例示的なものは、VNP20009(ATCC#202165、YS1646)と称される菌株である。臨床的候補のVNP20009(ATCC#202165、YS1646)は、安全性のためにmsbBとpurlの両方の遺伝子の欠失によって少なくとも50,000倍弱毒化された(Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002;Low et al. (2003) Methods in Molecular Medicine, Vol. 90, Suicide Gene Therapy:47-59;Lee et al. (2000) International Journal of Toxicology 19:19-25)。弱毒化された同様のサルモネラ属の菌株も検討される。上述のように、msbBの欠失は、グラム陰性細菌性外膜の主要な構成成分であるリポポリサッカライドの脂質Aドメインの組成を変更する(Low et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(1):37-41)。これは、リポポリサッカライド誘導性敗血症ショックを阻止し、細菌菌株を弱毒化し、全身毒性を低下させ、同時にTNFαの潜在的に有害な産生を減少させる(Dinarello、C.A. (1997) Chest 112(6 Suppl):321S-329S;Low et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(1):37-41)。purI遺伝子の欠失は、細菌をプリン栄養要求性にし、細菌を更に弱毒化し、腫瘍微小環境においてそれを富化する(Pawelek et al.(1997) Cancer Res. 57:4537-4544;Broadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178)。
細菌菌株は、治療用分子をデリバリーするように遺伝子操作される。本明細書における菌株は、免疫チェックポイント、また他のそのような標的を標的とし、それに対して阻害性であるRNAiをデリバリーする。
毒性を低下させ、抗腫瘍活性を改善する免疫刺激性細菌に対する強化が本明細書において提供される。そのような強化の例示的なものは、以下のものである。これらはサルモネラ属、特にS.ティフィムリウムに関して記載しており;当業者であれば、他の細菌菌種および他のサルモネラ属菌株において同様の強化を与えることができる点を理解されたい。
細菌におけるasd遺伝子は、アスパルテート-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする。S.ティフィムリウムのasd-突然変異体は、細胞壁合成に必須のジアミノピメリン酸(DAP)に対して偏性の必須要件を有し、DAPに恵まれない環境において溶解されることになる。asd遺伝子がプラスミド上で、トランス型で相補される場合に、このDAP栄養要求性は、プラスミドを選択し、抗生物質を使用せずにプラスミドの安定性を維持するために、インビボで使用することができる。抗生物質不含ベースのプラスミド選択系は有利であり、1)有害事象の症状における急速なクリアランス機序として投与された抗生物質の使用、および2)そのような使用は通常回避される場合、抗生物質を使用しない生産のスケールアップを可能にする。asd遺伝子相補系はそのような選択を提供する(Galan et al. (1990) Gene 28:29-35)。腫瘍微小環境においてプラスミドを維持するためにasd遺伝子相補系を使用すると、遺伝子または干渉RNAをコードするプラスミドをデリバリーするように遺伝子操作されたS.ティフィムリウムの潜在力を高めることが期待される。
トリプトファンおよびATP/アデノシン経路由来の代謝産物は、腫瘍内の免疫抑制性環境形成において主要なドライバーである。細胞の内部および外部に遊離形態で存在するアデノシンは、免疫機能のエフェクターである。アデノシンは、NF-κBのT細胞受容体誘導性活性化を低下させ、IL-2、IL-4、およびIFN-γを阻害する。アデノシンは、T細胞細胞毒性を減少させ、T細胞アネルギーを増加させ、Foxp3+またはLag-3+調節性(T-reg)T細胞へのT細胞分化を増加させる。NK細胞に関しては、アデノシンはIFN-γ産生を減少させ、NK細胞の細胞毒性を抑制する。アデノシンは、好中球接着血管外漏出をブロックし、食作用を減少させ、スーパーオキシドおよび一酸化窒素のレベルを弱毒化する。アデノシンは、マクロファージ上でTNF-α、IL-12、およびMIP-1αの発現も減少させ、MHCクラスII発現を弱毒化し、IL-10およびIL-6のレベルを増加させる。アデノシン免疫調節活性は、腫瘍の細胞外空間へのその放出および標的免疫細胞、がん細胞または内皮細胞表面上のアデノシン受容体(ADR)の活性化後に起こる。腫瘍微小環境においてアデノシンレベルが高いと、局在的な免疫抑制をもたらし、それが、がん細胞を削除するための免疫系の能力を制限する。
鞭毛は、細菌の表面上にある小器官であり、フックを介して回転モーターへ結合された長いフィラメントから構成され、そのモーターは、時計回りまたは反時計回りの様式で回転し、移動するための手段を提供することができる。S.ティフィムリウムにおける鞭毛は、胃腸管内の粘膜層全体での運動性を媒介するための能力に起因して、走化性のため、かつ経口経路を介した感染を確立するために重要である。鞭毛は、インビトロでの円柱腫瘍への走化性およびそこへの定着に必須であることが実証され(Kasinskas and Forbes (2007) Cancer Res. 67(7):3201-3209)、運動性は、腫瘍貫通のために重要であることが示されているが(Toley and Forbes (2012) Integr Biol (Camb). 4(2):165-176)、鞭毛は、細菌が静脈内で投与された場合に、動物における腫瘍定着に必須ではない(Stritzker et al. (2010) International Journal of Medical Microbiology 300:449-456)。各鞭毛フィラメントは、何万ものフラジェリンサブユニットからなる。S.ティフィムリウム染色体は、2つの遺伝子、fliCおよびfljBを含み、これらは抗原的に異なるフラジェリンモノマーをコードする。fliCとfljBの両方が欠陥している突然変異体は、感染の経口経路を介して投与したときに非運動性およびビルレントであるが、非経口で投与したときにビルレンスを維持する。
S.ティフィムリウム等のサルモネラ属は、サルモネラ属含有液胞(SCV)と称される膜結合性コンパートメントにおいて主に複製する細胞内病原体である。一部の上皮細胞株においてかつ低頻度で、S.ティフィムリウムは細胞質ゾルへ逃避し、複製できることが示されてきた。SCVの脂質二重層が潜在的な障壁であるため、高い効率でSCVを逃避するように遺伝子操作されたサルモネラ属は、プラスミド等の高分子のデリバリーにおいてより効率的であろう。SCVからの逃避の頻度が強化されたサルモネラ属および方法が本明細書において提供される。これは、フィラメント(SIF)形成を誘導されるサルモネラ属に必須の遺伝子を欠失することによって達成される。これらの突然変異体は、SCVからの逃避の頻度が増加され、細胞質ゾルにおいて複製することができる。
細菌および真菌は、バイオフィルムと称される多細胞構造体を形成することができる。細菌性バイオフィルムは、分泌された細胞壁関連のポリサッカライド、糖タンパク質、および糖脂質、ならびに、細胞外高分子物質と総称される細胞外DNAの混合物に内包される。これらの細胞外高分子物質は、細菌を、洗浄剤、抗生物質、および抗菌ペプチド等の複数の傷害から保護する。細菌性バイオフィルムは、表面に定着し、インジェクションポートおよびカテーテル等の人工器官の顕著な感染の原因である。バイオフィルムは、感染の進行中の組織において形成し、細菌存続およびシェディングの持続を増加させ、抗生物質療法の有効性を制限する場合もある。バイオフィルムにおける細菌の慢性的な存続は、例えば胆嚢のS.ティフィ(S.typhi)感染における腫瘍形成の増加と関連する(Di Domenico et al. (2017) Int. J. Mol. Sci. 18:1887)。
グラム陰性細菌のLPSは、細菌膜の外葉の主要な構成成分である。それは、3つの主要な部分である脂質A、非反復コアオリゴサッカライド、およびO抗原(またはOポリサッカライド)からなる。O抗原は、LPS上の最も外側の部分であり、細菌透過性に対する防御層としての役割を果たすが、O抗原の糖組成は、菌株間で広範囲に異なる。脂質Aおよびコアオリゴサッカライドは非常に少なく、より典型的には、同じ菌種の菌株内に保存される。脂質Aは、エンドトキシン活性を含むLPSの一部である。それは、典型的には、複数の脂肪酸で修飾されるジサッカライドである。これらの疎水性脂肪酸鎖は、LPSを細菌膜へ固定し、残りのLPSは細胞表面から突出する。脂質Aドメインは、グラム陰性細菌の毒性の多くの原因となる。典型的には、血液中のLPSは、深刻な病原体関連分子パターン(PAMP)として認識され、重度の炎症促進性応答を誘導する。LPSは、CD14、MD2およびTLR4を含む膜結合受容体複合体のためのリガンドである。TLR4は、輸送膜タンパク質NFκB経路を刺激するためのMyD88およびTRIF経路を介してシグナルを送ることができ、TNF-αおよびIL-1β等の炎症促進性サイトカインの産生をもたらし、内毒素性ショックとなることがある結果、命にかかわる場合がある。哺乳動物細胞の細胞質ゾル中のLPSは、カスパーゼ4、5、および11のCARDドメインに直接結合し、自己活性化およびパイロトーシス細胞死を引き起こすことがある(Hagar et al. (2015) Cell Research 25:149-150)。脂質Aの組成および脂質A変異体の毒素産生性は十分に立証されている。例えば、モノリン酸化された脂質Aは、複数のホスフェート基を有する脂質Aよりも炎症性が低い。脂質A上のアシル鎖の数および長さも、毒性の程度に深刻な影響を与える場合がある。E.コリからの標準的な脂質Aは、6個のアシル鎖を有し、このヘキサアシル化は、強力な毒性である。S.ティフィムリウム脂質Aは、E.コリのものと同様であり;それは4つの第一級および2つの第二級ヒドロキシアシル鎖を保有するグルコサミンジサッカライドである(Raetz and Whitfield (2002) Annu Rev Biochem. 71:635-700)。上述のようなS.ティフィムリウムのmsbB突然変異体は、そのLPSに末端ミリストイル化を受けることができず、ヘキサアシル化脂質Aよりも顕著に毒性が低いペンタアシル化LPSを主に生成する。パルミテートを用いた脂質Aの改変は、パルミトイル転写酵素(PagP)によって触媒される。pagP遺伝子の転写は、例えば、SCV内部で低濃度のマグネシウムによって活性されるPhoP/PhoQ系の制御下である。したがって、S.ティフィムリウムのアシル含有量は可変であり、野生型細菌の場合、ヘキサまたはペンタアシル化とすることができる。その脂質AをパルミテートするためのS.ティフィムリウムの能力は、ファゴリソソームへ分泌される抗菌ペプチドに対する抵抗性を増加させる。
上述のように、S.ティフィムリウム等のサルモネラ属菌種では、病態形成は、サルモネラ属病原性アイランド(SPI)と称される遺伝子のクラスターに関与する。SPI-1は、上皮細胞の侵入を介在する。SPI-1は、宿主細胞の細胞質ゾル中へエフェクタータンパク質がトランスロケーションすることに寄与する3型分泌装置(T3SS)をコードし、サルモネラ属の取り込みをもたらすアクチンをもたらす場合がある。SPI-1T3SSは、消化管上皮層を横断するのに必須であるが、細菌が非経口で注射された場合は、感染に重要ではない。一部のタンパク質の注入およびニードル複合体自体も、インフラマソーム活性化および食細胞のパイロトーシスを誘導することができる。この炎症促進性細胞死は、抗原-提示細胞(APC)死を直接誘導することによって頑強な適応免疫応答の開始を制限し、ならびにサイトカイン環境を改変し、メモリーT細胞の生成を阻止することができる。SPI-1遺伝子は、いくつかのオペロンを含み、それらとしてはsitABCD、sprB、avrA、hilC、orgABC、prgKJIH、hilD、hilA、iagB、sptP、sicC、iacP、sipADCB、sicA、spaOPQRS、invFGEABCIJ、およびinvHがある。
endA遺伝子(例えば、配列番号250)は、グラム陰性細菌のペリプラズムにおける二本鎖DNAの分解を介在するエンドヌクレアーゼ(例えば、配列番号251)をコードする。endA遺伝子の突然変異は、高収率のプラスミドDNAを可能にするため、実験用E.コリの最も一般的な菌株はendA-である。この遺伝子は菌種と一緒に保存される。無傷プラスミドDNAデリバリーを促進するために、遺伝子操作された免疫刺激性細菌のendA遺伝子を欠失または突然変異させ、そのエンドヌクレアーゼ活性を阻止する。そのような突然変異の例示的なものは、E208Kアミノ酸置換(Durfee、et al. (2008) J. Bacteriol. 190(7):2597-2606)または目的の菌種に対応する突然変異である。E208を含むendAは、サルモネラ属を含む細菌菌種と一緒に保存される。したがって、E208K突然変異を使用し、サルモネラ属菌種を含む他の菌種においてエンドヌクレアーゼ活性を削除することができる。当業者であれば、endA活性を削除するために、他の突然変異または欠失を導入することができる。サルモネラ属等、本明細書における免疫刺激性細菌においてendAの活性を削除するために、遺伝子にこの突然変異または欠失または破壊を行うと、無傷プラスミドDNAデリバリーの効率を増加させ、その結果、shRNAおよび/またはmiRNA等のRNAの発現を増加させ、プラスミドにおいてコードされる免疫チェックポイントのうちのいずれかまたは2つ以上を標的とし、その結果、チェックポイント遺伝子のRNAi-介在性ノックダウンを増加させ、抗腫瘍有効性を強化する。
TLR非依存性I型IFN経路のうちの1つは、細胞質ゾルにおける一本鎖ストランド(ss)および二本鎖ストランド(ds)RNAの宿主認識によって介在される。これらは、RNAヘリカーゼによって感知され、これらとしては、レチノイン酸誘導性遺伝子I(RIG-I)、黒色腫分化関連遺伝子5(MDA-5)があり、IRF-3転写因子のIFN-βプロモーター刺激因子1(IPS-1)アダプタータンパク質介在性リン酸化を介して、I型IFNの誘導を引き起こす(Ireton and Gale (2011) Viruses 3(6):906-919)。RIG-Iは、5’-トリホスフェートを有するdsRNAおよびssRNAを認識する。この部分は、RIG-Iに直接結合するか、またはポリDNA依存性RNAポリメラーゼIII(Pol III)によってポリ(dA-dT)鋳型から合成することができる(Chiu, Y. H. et al. (2009) Cell 138(3):576-91)。2つのAAジヌクレオチド配列を含むポリ(dA-dT)鋳型は、一般的なレンチウイルスshRNAクローニングベクター中のU6プロモーター転写開始部位において生じる。その後のプラスミドにおけるその欠失は、I型IFN活性化を阻止する(Pebernard et al. (2004) Differentiation. 72:103-111)。RIG-I結合配列は、本明細書において提供されるプラスミドに含むことができ;含有していると、本明細書における免疫刺激性細菌の抗腫瘍活性を増加させる免疫刺激を増加することができる。
外来および自己DNA分解の原因となる別のヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼであるDNase IIであり、これはエンドソームのコンパートメント中に常在し、アポトーシス後のDNAを分解する。DNase II(マウスにおけるDnase2a)が無いと、細胞質ゾルへ逃避し、cGAS/STINGシグナル伝達を活性化するエンドソームDNAの蓄積をもたらす(Lan YY et al. (2014) Cell Rep. 9(1):180-192)。TREX1と同様に、ヒトにおけるDNase II-欠乏は、自己免疫I型インターフェロン症を示す。がんでは、腫瘍常在性マクロファージによって取り込まれた死滅腫瘍細胞は、cGAS/STING活性化およびエンドソームコンパートメント内のDNAのDNase II消化を介した潜在的な自己免疫を阻止する(Ahn et al. (2018) Cancer Cell 33:862-873)。したがって、本明細書において提供する免疫刺激性細菌菌株の実施形態は、DNase IIの発現を阻害するか、抑制するか、または遮断し、腫瘍微小環境においてDNase IIを阻害することができるshRNAまたはmiRNA等のRNAiをコードし、その結果、細胞質ゾルにおいてエンドサイトーシスされたアポトーシス腫瘍DNAの蓄積をもたらし、強力なcGAS/STINGアゴニストとして作用することができる。
TREX1およびDNase IIは、異常なDNA蓄積を除去するために機能するが、RNase H2は、細胞質ゾルにおいてRNA:DNAハイブリッドの病原性の蓄積を削除するために同様に機能する。TREX1と同様に、RNase H2の不足は、エカルディグティエール症候群の自己免疫表現型の一因にもなる(Rabe、B. (2013) J Mol Med. 91:1235-1240)。特に、RNase H2の損失およびRNA:DNAハイブリッドまたはゲノム埋込リボヌクレオチド基質のその後の蓄積は、cGAS/STINGシグナル伝達を活性化することを示している(MacKenzie et al. (2016) EMBO J. Apr15;35(8):831-44)。したがって、本明細書において提供する免疫刺激性細菌菌株の実施形態は、RNAse H2の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するshRNAまたはmiRNA等のRNAiをコードし、その結果RNase H2を阻害し、腫瘍由来RNA:DNAハイブリッドおよびこれらの誘導体をもたらし、cGAS/STINGシグナル伝達および抗腫瘍免疫を活性化する。
最初に単球上で発現され、免疫調節することに関与する別の分子は、スタビリン-1(遺伝子名STAB1、CLEVER-1、FEEL-1としても公知である)である。スタビリン-1は、炎症後に内皮細胞およびマクロファージ上で、特に腫瘍関連マクロファージ上で上方調節されるI型輸送膜タンパク質である(Kzhyshkowska et al. (2006) J. cell. Mol. Med. 10(3):635-649)。炎症が活性化した場合に、スタビリン-1はスカベンジャーとして作用し、創傷治癒およびアポトーシス小体クリアランスを助け、肝線維症等の組織損傷を阻止することができる(Rantakari et al. (2016) PNAS 113(33):9298-9303)。スタビリン-1の上方調節は、抗原特異的T細胞応答を直接阻害し、単球におけるsiRNAによるノックダウンは、それらの炎症促進性機能を強化することが示された(Palani、S. et al. (2016) J Immunol.196:115-123)。したがって、本明細書において提供する免疫刺激性細菌菌株の実施形態は、腫瘍微小環境においてスタビリン-1/CLEVER-1の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するshRNAまたはmiRNA等のRNAiをコードし、その結果腫瘍常在性マクロファージの炎症促進性機能を強化する。
細菌のための培養条件は、それらの遺伝子発現に影響を与える場合がある。S.ティフィムリウムは、SPI-1およびその関連するT3SS-1を含む機序により、感染して30~60分以内にマクロファージの急速な炎症促進性カスパーゼ依存性細胞死を誘導することができるが、上皮細胞は誘導しないことが報告されている(Lundberg et. al (1999) Journal of Bacteriology 181(11):3433-3437)。この細胞死は、その後、IL-1βおよびIL-18の成熟および放出を促進し、パイロトーシスと称される細胞死の新規な形態を開始する、カスパーゼ-1を活性化するインフラマソームの活性化によって介在されることは、現在公知である(Broz and Monack (2011) Immunol Rev. 243(1):174-190)。このパイロトーシス活性は、対数期細菌を使用することによって誘導することができ、一方、静止期細菌は、マクロファージにおいてこの急速な細胞死を誘導しない。SPI-1遺伝子は、対数期成長中に誘導される。したがって、静止期において治療上使用することになるS.ティフィムリウムを採取することによって、マクロファージの急速なパイロトーシスを阻止することができる。マクロファージは、自然免疫系の重要なメディエーターであり、これらは適切な抗腫瘍応答を確立するのに重要であるサイトカインを分泌するように作用することができる。更に、IL-1βおよびIL-18等の炎症促進性サイトカイン分泌を制限すると、投与されたS.ティフィムリウム療法の忍容性が改善するであろう。本明細書において提供する、静止期において採取される免疫刺激性S.ティフィムリウムは、抗腫瘍応答を誘導するために使用されるであろう。
本明細書において提供される免疫刺激性細菌は改変されている。それらは、細菌性ゲノムおよび細菌性遺伝子を発現するような改変を含み、また、細菌性プロモーターを含むことによって細菌中に、または適切な真核生物プロモーターおよび必要に応じて他の調節性領域を含むことによって宿主内に発現される産物をコードするプラスミドを含む。
本明細書におけるプラスミドは、チェックポイントおよび上述のような他の目的の標的を標的とするRNAi核酸をコードする。RNAiとしては、shRNA、siRNA、およびマイクロRNAがある。RNA干渉(RNAi)は、標的遺伝子と相同の配列を有する短い合成dsRNA分子である低分子干渉RNA(siRNA)を使用して真核細胞における遺伝子発現の配列選択的抑制を可能にする。RNAi技術は、疾患関連転写を枯渇するための強力なツールを提供する。
典型的には、約19~29塩基対長であるsiRNAは、特異的な宿主mRNA配列を分解し、それらの各タンパク質産物への翻訳を不可能にし、標的とする遺伝子の発現を効果的にサイレンシングすることによって機能する。タイトなヘアピンループを含むショートヘアピン型RNA(shRNA)は、RNAiにおいて広範囲に使用される。shRNAは、4~15ヌクレオチドのループスペーサーによって連結された各19~29bps長の2つの相補的RNA配列を含む。標的遺伝子配列相補的である(したがってmRNA配列と同一である)RNA配列は、「センス」ストランドとして公知であり、同時にmRNAに相補的である(および標的遺伝子配列と同一である)ストランドは、「アンチセンス」または「ガイド」ストランドとして公知である。shRNA転写は、siRNA二本鎖へのダイサーとして公知のRNase III酵素によってプロセシングされる。次いで産物は、アルゴノート(Ago)タンパク質および他のRNA-結合タンパク質を有するRNA誘導性サイレンシング複合体(RISC)へ積み込まれる。次いでRISCは、アンチセンスまたは「ガイド」ストランドをその相補的mRNA配列へ局在化させ、その後、それがAgoによって開裂される(米国特許第9,624,494号)。shRNAの使用は、より費用効果が高く、細胞内高濃度のsiRNAはオフターゲット効果と関連するため、かつsiRNAの濃度は細胞分裂時に希釈されるようになるためにsiRNAよりも好ましい。一方、shRNAの使用は、安定で長期の遺伝子ノックダウンをもたらし、複数の一連のトランスフェクションの必要がない(Moore et al. (2010) Methods Mol. Bio. 629:141-158)。
マイクロRNA(miRNA)は、約20~24または20~24ヌクレオチド長の短い非コード一本鎖ストランドのRNA分子である。天然発生miRNAは、遺伝子発現の転写後調節に関与し;miRNAは、遺伝子をコードしない。miRNAは、細胞増殖および生存、ならびに細胞分化を調節することが示されている。miRNAは、配列相補性を共有する標的となるmRNAへ結合することによって翻訳を阻害するかまたはRNA分解を促進する。これらはmRNAの安定性および翻訳に作用し;miRNAは、配列相補性を共有する標的となるmRNAへ結合することによって、翻訳を阻害しおよび/またはRNA分解を促進する。真核生物中に存在するmiRNAは、RNA Pol IIによって一次miRNA、またはpri-miRNAとして公知の、キャップされ、ポリアデニル化されたヘアピン含有一次転写産物へ転写される。これらのpri-miRNAは、酵素ドローシャリボヌクレアーゼIIIおよびその補助因子Pasha/DGCR8によって、前駆体miRNAまたはプレ-miRNAとして公知の約70ヌクレオチド長の前駆体miRNAヘアピンへ開裂され、次いでこれらは核から細胞質へ輸送され、ダイサーリボヌクレアーゼIIIによって、およそ22ヌクレオチド長のセンスおよびアンチセンスストランド産物を有するmiRNA:miRNA*二本鎖へ開裂される。成熟miRNAは、RNA誘導性サイレンシング複合体(RISC)中に組み込まれ、それが標的mRNAを認識し、通常、miRNAと対を成す不完全な塩基を介して3’非翻訳領域(UTR)においてそこに結合し、翻訳の阻害または標的mRNAの不安定化/分解をもたらす(例えば、Auyeung et al. (2013) Cell 152(4):844-85を参照のこと)。
5’-CCGGATC AACGCCCTAG GTTTATGTTT GGATGAACTG ACATACGCGT ATCCGTC NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTAG TGAAATATAT ATTAAAC NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN TACGGTAACGCG GAATTCGCAA CTATTTTATC AATTTTTTGC GTCGAC-3’(配列番号249)
であり、Nは、相補的な、一般的に18~26、例えば19~24、19~22、19~20塩基対長のアンチセンスおよびセンスヌクレオチド配列であって、サイレンシングされることになる遺伝子を標的とし、マイクロRNAループの前後に挿入される配列を表す。ARI-205(配列番号214)およびARI-206(配列番号215)等のRNAは、配列番号249のマイクロRNA骨格をベースとする例示的なコンストラクトであり、21および22個の塩基対相同配列をそれぞれコードする。ARI-207(配列番号216)およびARI-208(配列番号217)は、配列番号249のマイクロRNA骨格ベースの例示的コンストラクトであり、19個の塩基対相同配列をコードする。別の例は、ARI-201と称されるコンストラクトであり、これはマイクロRNAコンストラクトARI-205であり、Nは、マウスPD-L1を標的とするヌクレオチドの配列で置き換えられる。ARI-202と称されるコンストラクトは、マイクロRNAコンストラクトARI-206を表し、Nは、マウスPD-L1を標的とする配列で置き換えられる。当業者であれば、miR-16-2骨格、または当業者であれば公知の他の好適な骨格を使用して、本明細書において記載され、例示されるようなプラスミド中に含ませるためのマイクロRNAを容易に構成することができる。
プラスミドは、複製起点を用いて細菌内に維持される自律複製染色体外環状二本鎖DNA分子である。コピー数は、プラスミドの安定性に影響を与える。コピー数が高いと、細胞分裂時にランダムな分割が生じた場合に、プラスミドに優れた安定性を一般的にもたらす。プラスミド数が高いと、成長速度が一般的に低下し、したがって場合により、プラスミドが少ない細胞が、成長が早いために培養を支配することを可能にする。複製起点も、プラスミドの相互性、すなわち同じ細菌性細胞内の別のプラスミドと共に複製するためのその能力を決定する。同じ複製系を利用するプラスミドは、同じ細菌性細胞中で共存できない。これらは同じ相互性グループに属すると言われている。同じ相互性グループから第2のプラスミドの形態で新規の起点を導入すると、常在性プラスミドを複製するという結果を模倣する。したがって、任意の更なる複製は、2つのプラスミドが異なる細胞に分離され、正しい複製前コピー数の生成を済ませるまで阻止される。
非メチル化シチジン-ホスフェート-グアノシン(CpG)モチーフは、細菌においてよく認められるが、脊椎動物のゲノムDNAでは認められない。CpGモチーフを含む病原性DNAおよび合成オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)は、宿主防御機序を活性化し、先天的および後天的な免疫応答を引き起こす。非メチル化CpGモチーフは、中心非メチル化CGジヌクレオチドとフランキング領域を含む。ヒトにおける、CpG ODNの4つの個別のクラスは、誘導する免疫応答の構造および性質における相違に基づいて同定されている。K-タイプODN(B-タイプとも称される)は、典型的には、1から5個のCpGモチーフをホスホロチオエート骨格上に含む。D-タイプODN(A-タイプとも称される)は、混合ホスホジエステル/ホスホロチオエート骨格を有し、ステム-ループ構造の形成を可能にするパリンドローム配列に隣接する単一のCpGモチーフ、ならびにポリGモチーフを3’および5’終端において有する。C-タイプODNは、ホスホロチオエート骨格を有し、ステムループ構造またはダイマーを形成することができる複数のパリンドロームCpGモチーフを含む。P-クラスCpG ODNは、ホスホロチオエート骨格を有し、複数のCpGモチーフを含み、二重パリンドロームを伴い、それらのGCが豊富な3’終端においてヘアピンを形成することができる(Scheiermann and Klinman (2014) Vaccine 32(48):6377-6389)。本明細書における目的に関しては、CpGは、プラスミドDNAにおいてコードされ;モチーフとしてまたは遺伝子中に導入することができる。
実験室背景におけるプラスミドの維持は、抗生物質抵抗性遺伝子をプラスミド上に含ませ、成長培地中に抗生物質を使用することによって常に確実にする。上述のような、プラスミド上の機能asd遺伝子を補完されるasd欠失突然変異体を使用すると、抗生物質を使用することなくインビトロでプラスミドを選択することが可能になり、かつインビボでプラスミドを選択することが可能になる。asd遺伝子相補系は、そのような選択を提供する(Galaen et al. (1990) Gene 28:29-35)。腫瘍微小環境においてプラスミドを維持するためにasd遺伝子相補系を使用すると、遺伝子または干渉RNAをコードするプラスミドをデリバリーするように遺伝子操作されたS.ティフィムリウムの潜在力が高められる。
本明細書において提供されるプラスミドは、上述のような免疫学的チェックポイントを標的とする干渉RNAをコードするように設計される。RNA発現カセットは、H1プロモーター、またはU6プロモーター、またはCMVプロモーター等のヒト細胞において転写するためのプロモーターを含む。U6およびH1はRNAポリメラーゼIII(RNAP III)プロモーターであり、これらは、小分子RNAを産生およびプロセシングするためのものである。CMVプロモーターは、RNAポリメラーゼIIによって認識され、RNAP IIIよりも長いRNA伸展を発現することを可能にする。プロモーターは、上述のようなshRNA、siRNAまたはmiRNA等の干渉RNAに先行する。
SV40DTS等のDNA核標的化配列(DTS)は、核膜孔複合体を介してDNA配列のトランスロケーションを媒介する。この輸送の機序は、核局在配列を含むDNA結合タンパク質の結合に依存することが報告されている。プラスミド上にDTSが含まれると、核輸送および発現が増加することが実証されており(Dean、D.A. et al. (1999) Exp. Cell Res.253(2):713-722)、その含まれる点を使用し、S.ティフィムリウムによってデリバリーされるプラスミドから遺伝子発現を増加させる(Kong et al. (2012) PNAS 109(47):19414-19419)。
任意の免疫標的に対するRNAiは、プラスミドにおいてコードすることができる。これらとしては、これらに限定されるものではないが、本明細書における開示において検討される任意のもの、および当業者であれば公知の任意のものがある。以下の議論では、例示的な標的を記載する。プラスミドは、そのような標的に対する任意のRNAiを含むことができ、それらとしては、これらに限定されないが、shRNA、siRNAおよびマイクロRNAがある。
本明細書において提供されるある特定の実施形態では、免疫刺激性細菌は、TREX1発現を阻害するかまたは遮断するかまたは抑制するshRNA等の阻害性RNAをコードする。TREX1によってコードされ、cGASから上流に位置する酵素産物は、I型インターフェロン経路のメディエーターである。TREX1は、哺乳動物細胞において主要な3’DNAエキソヌクレアーゼ(DRNase IIIとも称される)をコードする。ヒトTREX1タンパク質は、細菌性エキソヌクレアーゼと同じように触媒的に効率的である(Mazur and Perrino (2001) J. Biol. Chem. 276:17022-17029)。RNAサイレンシング以外のプロセスによってTREX1発現を阻害する免疫刺激性細菌も本明細書において検討される。
プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)は、免疫応答の負の調節に関与する免疫阻害受容体である。その同族リガンドであるプログラム死リガンド1(PD-L1)は、APC上に発現され、T細胞上のPD-1に結合したときにCD8+T細胞エフェクター機能の損失をもたらし、T細胞耐性を誘導する。PD-L1の発現は、ある特定のヒトがんにおける腫瘍攻撃性および生存率の低下と関連することが多い(Gao et al. (2009) Clin. Cancer Res. 15(3):971-979)。
免疫活性化における他の非冗長なチェックポイントは、T細胞活性化のV-ドメイン免疫グロブリン(Ig)サプレッサー(VISTA)等のPD-1/PD-L1およびCTLA-4と共に相乗効果を与えることができる。VISTAは、APC上に、特に腫瘍浸潤骨髄細胞および骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)上に、かつ少ない程度ではあるが調節性T細胞(CD4+Foxp3+Tregs)上に最初に発現される(Wang et al. (2011) J. Exp. Med. 208(3):577-592)。PD-L1と同様に、VISTAの上方調節は、T細胞増殖および細胞毒性機能を直接抑制する(Liu et al. (2015) PNAS 112(21):6682-6687)。VISTAを標的とするモノクローナル抗体は、マウスにおける腫瘍微小環境を再モデル化し、APC活性化を高め、抗腫瘍免疫を強化することが示された(LeMercier et al. (2014) Cancer Res. 74(7):1933-1944)。臨床的には、VISTAの発現は、前立腺がんにおける抗CTLA-4療法処置後に、腫瘍常在性マクロファージ上で上方調節されることが示されており、免疫チェックポイントの代償性調節が実証された(Gao et al. (2017) Nat. Med. 23(5):551-555)。VISTAの発現の大部分は、骨髄細胞の表面上ではなく細胞内コンパートメントに位置するとされており、これはモノクローナル抗体アプローチの有効性を制限する場合がある(Deng et al. (2016) J.Immunother. Cancer 4:86)。本明細書において提供するVISTAに対するshRNAを含む腫瘍標化細菌を使用して、APC内からVISTAを阻害するための能力は、より効率的であり、VISTAのT細胞抑制機能を完全に阻害し、T細胞介在性抗腫瘍免疫の活性化および腫瘍退行をもたらすであろう。
腫瘍細胞が除去を回避することによる1つの機序は、自然免疫細胞によってそれらの食作用を阻止することである。食作用は、造血および非造血細胞上に広範囲に発現するCD47の表面発現によって阻害される(Liu et al. (2015) PLoS ONE 10(9):e0137345)。CD47が、その受容体のシグナル調節タンパク質アルファ(SIRPα)に結合すると、食作用に関する阻害性シグナルが開始される。SIRPαは、マクロファージ、顆粒球およびDCを含む食細胞上に豊富に発現する。したがって、CD47とSIRPαとの間のタンパク質-タンパク質相互作用は、APCに特有の別のクラスの免疫チェックポイント、特に腫瘍常在性マクロファージを提示する。食作用の阻止におけるCD47の有効性は、様々な腫瘍において上方調節されることが多く、これは腫瘍微小環境においてAPCによる貪食を回避することを可能にするという事実によって証明されている(Liu et al. (2015) Nat. Med. 21(10):1209-1215)。抗CD47もしくは抗SIRPα抗体または抗体フラグメントの開発、いずれかのタンパク質に結合する小ペプチドの使用、またはCD47発現のノックダウンを含む、CD47/SIRPα相互作用をブロックするためのいくつかの方法が検討されている(米国特許出願公開第2013/0142786号、同第2014/0242095号;国際公開第2015/191861号;McCracken et al. (2015) Clin. Cancer Res. 21(16):3597-3601)。このため、抗体依存性細胞食作用(ADCP)として公知のプロセスにおいて、SIRPαを直接標的とするいくつかのモノクローナル抗体が、単独で、または抗体オプソニン化腫瘍細胞の食作用を強化することができる腫瘍標的化抗体(例えばリツキシマブ、ダラツムマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ)と組み合わせて臨床的に開発されている(McCracken et al. (2015) Clin. Cancer Res. 21(16):3597-3601;Yanagita et al. (2017) JCI Insight 2(1):e89140)。
免疫チェックポイント経路は、免疫の過剰活性化および自己免疫を阻止するために存在する複数の層の調節、抗腫瘍免疫を促進するためのこれらの経路の破壊における困難を例示する。腫瘍がチェックポイント治療法に対して難治性に進化した1つの機序は、T細胞非炎症性または「冷たい腫瘍」として記載されるT細胞および樹状細胞(DC)浸潤の欠如を介している(Sharma et al. (2017) Cell 9;168(4):707-723)。いくつかの腫瘍の内因性機序は同定されており、抗腫瘍T細胞の排除および免疫療法に対する抵抗性につながっている。黒色腫では、特に、チェックポイント治療法-難治性腫瘍の分子プロファイリングによって、腫瘍浸潤性リンパ球の欠如と相関するβ-カテニンおよびその下流標的遺伝子のシグネチャーの上昇が明らかにされた(Gajewski et al. (2011) Curr. Opin. Immunol. 23(2):286-292)。
形質転換成長因子ベータ(TGF-β)は、胚形成、創傷治癒、血管新生および免疫調節において多くの役割を有する多面的なサイトカインである。哺乳動物細胞では、3つのアイソフォーム、TGF-β1、TGF-β2およびTGF-β3が存在し;TGF-β1は、免疫細胞中で最も優勢である(Esebanmen et al. (2017) Immunol Res. 65:987-994)。免疫抑制剤としてのTGF-βの役割は、おそらく、その最も優勢な機能である。腫瘍微小環境における潜在的形態からのその活性化は、特に、DCに対して広範囲の免疫抑制性効果、および抗原特異的T細胞に対して耐性化するためのそれらの能力を有する。TGF-βは、Th1 CD4+T細胞を免疫抑制性Tregに直接変換し、腫瘍寛容の促進を更に拡大することもできる(Travis et al. (2014) Annu Rev Immunol. 32: 51-82)。その腫瘍特異的な免疫抑制性機能に基づいて、かつその公知のがん細胞成長および転移促進特性に関係なく、TGF-βの阻害が、がん療法の標的である。高TGF-βシグナル伝達は、CRC、HCC、PDACおよびNSCLCを含むいくつかのヒト腫瘍タイプにおいて実証されている(Colak et al. (2017) Trends in Cancer 3:1)。TGF-βの全身性の阻害は、許容できない自己免疫毒性をもたらすことがあり、その阻害は、腫瘍微小環境に対して局在的とするべきである。したがって、本明細書において提供されるTGF-βに対するshRNAまたはTGF-βRIIに対するshRNA等のRNAiを有する腫瘍標的化免疫刺激性細菌は、腫瘍免疫寛容を破壊し、抗腫瘍免疫を刺激する。
血管新生または新規の血管の発達は、任意の腫瘍微小環境が確立されるようになるために必須の工程である。血管内皮成長因子(VEGF)は、内皮増殖および血管新生に重要なマイトジェンであり、腫瘍微小環境におけるVEGFが阻害されると、腫瘍血管分布が顕著に減少し、その結果、腫瘍への血液供給が枯渇する(Kim et al. (1993) Nature 362(6423):841-4)。この初期研究は、VEGFのモノクローナル抗体阻害剤、ベバシズマブ(アバスチン;Genentech)の開発へつながっており、化学療法と組み合わせて、転移性のCRCに関する標準治療となっている。ベバシズマブの全身投与も、NSCLCの第II相トライアルにおいて複数の死亡を含む顕著な毒性が実証され、大部分は出血によるものであった。したがって、抗VEGF受容体2抗体ラムシルマブ(Cyramza、Imclone)等のいくつかの次世代の抗血管新生剤および抗血管新生チロシンキナーゼ阻害剤のアキシチニブ(Inlyta、Pfizer)が評価されてきたが、全身毒性を克服することも、無増悪生存を顕著に改善することもできなかった(Alshangiti et al. (2018) Curr Oncol. 25(Suppl 1):S45-S58)。抗VEGF治療法の抗腫瘍活性は、一部の有望性を示すが、全身毒性は、明らかに制限されている。したがって、本明細書において提供されるVEGFに対するshRNAを有する免疫刺激性腫瘍標的化細菌等の腫瘍微小環境のみを標的とする治療法は、局在性の抗血管新生療法をデリバリーし、同時に全身毒性を阻止する。この治療モダリティは、腫瘍微小環境においてVEGFを主に産生する骨髄細胞へ取り込まれるという追加の利点を有し、これは、腫瘍の進行に最大限の影響を与えるであろう(Osterberg et al. (2016) Neuro-Oncology. 18(7):939-949)。
マイクロRNAおよびshRNA等のRNAiを調製することができるか、または本明細書において例示する例示的なチェックポイント標的は、これらに限定されるものではないが以下のものがある。
他の例示的標的としては、これらに限定されるものではないが以下のものがある。
1つの細菌において異なる標的を阻害するshRNAまたはマイクロRNA等のRNAiの組合せが検討される。そのような標的の組合せ、相乗的に作用するように選択することができる。任意の2つの免疫チェックポイントを標的とするRNAiを組合せは、本明細書において記載するように改変された免疫刺激性細菌性宿主中にまたは他の治療用細菌性宿主中に導入することができる。
STING活性化時に上方調節され、抗腫瘍免疫を強化することができる代償性免疫チェックポイント経路の誘導を軽減するため、本明細書において提供される改変された免疫刺激性細菌は、他の免疫標的に対するshRNAと組合せてTREX1に対するショートヘアピン型(sh)-RNA配列を含み、それらとしては、これらに限定されないが、PD-L1、VISTAおよびSIRPαがある。腫瘍常在性食細胞においてTREX1およびSIRPαをノックダウンすると、腫瘍細胞上のCD47との「私を食べないで(don’t eat me)」相互作用をブロックすること、ならびにS.ティフィムリウム感染に対する腫瘍微小環境の感受性を更に強化することが可能になり(Li et al.(2012) J Immunol 189(5):2537-2544)、本明細書において提供される。SIRPαの阻害によって可能になる強化された食作用とTREX1の同時ノックダウンとの組合せは、cGAS/STINGシグナル伝達をより強力に活性化することができる、細胞質ゾルのより優れたデリバリーおよび腫瘍DNAの安定化を促進する。特に、CD47/SIRPαブロックの抗腫瘍効果は、無傷STINGシグナル伝達を必要とすることが示され、TREX1介在性STING活性化とSIRPα阻害との組合せの潜在的な相乗効果が実証された(Liu et al. (2015) Nat. Med. 21(10):1209-1215)。本明細書において提供されるPD-L1に対するshRNAと組み合わせてTREX1をノックダウンすると、改変されたS.ティフィムリウムの病態形成および免疫刺激特性が強化され(Lee et al. (2010) J.Immunol. 185(4):2442-2449)、その結果、より炎症性のかつ免疫原性の腫瘍微小環境がもたらさせる。β-カテニンおよびTGF-βに対するshRNAの標的化も、よりT細胞炎症性の腫瘍微小環境をもたらし、PD-L1に対するshRNAと共により相乗効果を与え、本明細書において提供される。マクロファージ/骨髄性コンパートメント内での局在性のチェックポイントブロックと免疫活性化とを組み合わせると、特に、例えば本明細書において提供されるTREX1およびVISTAに対するshRNAの組合せを介して、S.ティフィムリウム感染APCによる腫瘍新抗原の提示の促進と、腫瘍特異的T細胞の活性化の促進の両方によって免疫応答が強化される。
抗がん照射療法の成功は、I型インターフェロン依存性自然および適応免疫の誘導によって決まる。TREX1は、損傷されたがん細胞において産生される細胞質DNAを分解することによって、高レベルのGy照射後の抗腫瘍免疫を弱毒化し、その結果、cGASおよびSTINGが介在するI型インターフェロン経路を阻止することが示されている(Vanpouille-Box et al. (2017) Nature Communications 8:15618)。したがって、IFN-I経路の活性化を阻止するTREX1の過剰発現またはcGAS/STINGのノックアウトは、照射時にアブスコパル腫瘍応答を弱毒化する。CD8+T細胞のSTING介在性Batf3-DCプライミングを活性化し、最大限のアブスコパル抗腫瘍免疫を達成するために、TREX1を誘導することがないであろう低用量の放射線が必要とされた(Vanpouille-Box et al. (2017) Nature Communications 8:15618)。TREX1を下方調節すると、電離放射線に対する腫瘍細胞の感受性が回復することが示されている。例えば、高用量を照射すると、TREX1発現が誘導され、dsDNAの細胞質蓄積が阻止され、その結果、アブスコパル腫瘍退行が阻害された(Vanpouille-Box et al. (2017) Nature Communications 8:15618)。TREX1発現をブロックするまたは阻害する本明細書において提供される免疫刺激性菌株は、高用量照射処置時にTREX1の発現を減少させるかまたは削除するかまたは鈍化し、治療域を顕著に拡大することができる。
TREX1の誘導は、マウスおよびヒト線維芽細胞のDNAに傷害を与えるUV照射、ならびにDNAアルキル化剤のニムスチン、カルムスチンおよびホテムスチン、ならびにトポイソメラーゼI阻害剤のトポテカンを用いた神経膠腫および悪性黒色腫細胞の処置後に観察された。これらの腫瘍細胞は、TREX1をsiRNAでノックダウンした後に、これらの抗がん療法に対して再感作された(Tomicic et al. (2013) Biochimica et Biophysica Acta 1833:1832-1843)。TREX1は、AP-1を効率的に誘導する薬剤を損傷することによってのみ誘導されるが、メチル化薬剤のテモゾロマイドおよびトポイソメラーゼII阻害剤のエトポシド等のFos/Jun/AP-1の弱いインデューサーである薬剤は、TREX1を誘導しない。
本明細書において提供される免疫刺激性細菌を用いた治療法は、チェックポイント阻害剤療法および上記で検討された他のがん処置および化学療法を含む任意の他の抗がん療法と組み合わせることができる。
本明細書において提供される免疫刺激性細菌のうちのいずれか、および薬学的に許容される賦形剤または添加物を含む、医薬組成物および製剤を製造する方法が本明細書において提供される。医薬組成物は、腫瘍またはがん等の過剰増殖性疾患または状態等の疾患の処置において使用することができる。免疫刺激性細菌は、単一の薬剤療法として投与することができるか、または更なる薬剤または処置を用いた組合せ療法として投与することができる。組成物は、単回投薬量投与用にまたは多回投薬量投与用に製剤化することができる。薬剤は、直接投与するために製剤化することができる。組成物は、液体または乾燥製剤として提供されることもある。
a.細胞バンクの製造
本明細書において記載する免疫療法の活性成分は、遺伝子操作された自己複製細菌からなるため、選択される組成物は、長期貯蔵のためにかつ原薬を製造するための出発材料として維持されるであろう一連の細胞バンクへ拡大することになる。細胞バンクは、連邦規則集(Code of Federal Regulations)(CFR)21 part211または他の関連規制当局に従って、適切な製造施設において、現行の製造管理および品質管理に関する基準(current Good Manufacturing Practice)(cGMP)の下で作製される。免疫療法剤の活性薬剤は生存細菌であるため、本明細書において記載する製品は、定義によれば非滅菌であり、最終的に滅菌することはできない。無菌手順が、汚染を阻止するために、製造プロセスにわたって使用されることが確実になるように注意するべきである。したがって、全ての原材料および溶液は、製造プロセスにおいて使用する前に滅菌されていなくてはならない。
原薬は、上述のようなcGMPの下で滅菌プロセスを使用して製造される。ワーキング細胞バンク材料は、典型的には、cGMPの下で原薬を製造するための出発材料として使用されるが、他の細胞バンク(例えば、MCBまたはMWCB)を使用することができる。滅菌プロセシングは、細菌性細胞ベース療法剤を含む全ての細胞療法剤を製造するために使用される。細胞バンクからの細菌は発酵によって膨張され、これは、プレ培養物を製造することによって(例えば、振とうフラスコ中で)または発酵槽へ直接接種することによって達成することができる。発酵は、滅菌バイオリアクター、または使い捨てであっても、再使用可能であってもよいフラスコ中で達成される。細菌は、濃縮することによって(例えば、遠心分離、連続遠心分離、または接線流ろ過によって)採取される。濃縮された細菌は、培地を緩衝液と交換することによって(例えば、ダイアフィルトレーション)培地構成成分および細菌性代謝産物から精製される。バルク薬物製品は、中間体として製剤化され、保存されるか(例えば、凍結または乾燥によって)、または薬物製品へと直接プロセシングされる。原薬は、同一性、強度、純度、潜在力、および品質に関して試験される。
薬物製品は、その最終容器中に含まれる活性物質の最終製剤として定義される。薬物製品は、cGMPの下で滅菌プロセスを使用して製造される。薬物製品は、原薬から製造される。原薬は、必要に応じて解凍されるかまたは復元され、次いで適切な標的の強度に製剤化される。薬物製品の活性構成成分は生存している遺伝子操作された細菌であるため、強度は、懸濁液内に含まれるCFUの数によって判定される。バルク製品は、以下に記載するような貯蔵および使用に適した最終製剤で希釈される。容器へ充填し、容器閉鎖系を用いて密閉し、薬物製品にラベル付けする。薬物製品は、適切な温度で貯蔵され、安定性を維持し、同一性、強度、純度、潜在力、および品質に関して試験を行い、特定の承認基準を満たす場合はヒトに使用するために発売される。
薬学的に許容される組成物は、規制当局または他の当局の承認を考慮して調製され、動物およびヒトにおいて使用するための一般的に認識されている薬局方に従って調製される。組成物は、溶液剤、懸濁剤、粉末剤、または持続放出製剤として調製することができる。典型的には、化合物は、当技術分野において周知の技術および手順を使用して医薬組成物へ製剤化される(例えば、Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126を参照のこと)。製剤は、投与様式に適合する必要がある。
a.液体剤、注射剤、乳剤
製剤は、投与経路に適合するように概して作製される。概して、皮下、筋肉内、腫瘍内、静脈内または皮内のいずれかでの注射または点滴によって特徴付けられる非経口投与が本明細書において検討される。非経口投与のための細菌の調製物としては、調製済み懸濁注射剤(直接投与)または凍結乾燥粉末剤等の使用前に解凍される凍結懸濁液、可溶性乾燥産物、使用直前に再懸濁溶液を組み合わせる調製済み製剤(ready to be combined with a resuspension solution just prior to use)、およびエマルションがある。凍結乾燥された製剤等の乾燥された熱安定製剤は、後で使用するための単位用量を貯蔵するために使用することができる。
細菌は乾燥することができる。凍結乾燥または噴霧乾燥粉末およびガラス化ガラス(vitrified glass)等の乾燥された熱安定製剤は、溶液、エマルションおよび他の混合物として投与するために復元することができる。乾燥された熱安定製剤を、上述の懸濁剤等の液体製剤のうちのいずれかから調製することができる。医薬製剤は、使用前に水または他の好適な媒体を用いて復元するための凍結乾燥またはガラス化形態として提供することができる。
処置される状態によって、局所適用、経皮パッチ等の非経口、経口および直腸投与に加えて他の投与経路も本明細書において検討される。上述の懸濁剤および散剤は、経口で投与することができるか、または経口投与のために復元することができる。直腸投与のための医薬投薬形態は、全身的な効果のための直腸坐剤、カプセル剤および錠剤およびゲルカプセル剤である。直腸坐剤は、体温で融解または軟化する直腸へ挿入するための固形物を含み、1つまたは複数の薬理学的または治療上活性成分を放出する。直腸坐剤中の薬学的に許容される物質は、融点を上げるための基剤または媒体および薬剤である。基剤の例としては、ココアバター(テオブロマ油)、グリセリンゼラチン、カーボワックス(ポリオキシエチレングリコール)および脂肪酸モノ-、ジ-およびトリグリセリドの適切な混合物がある。様々な基剤の組合せを使用することができる。坐剤の融点を上げるための薬剤としては、鯨ろうおよびワックスがある。直腸坐剤は、圧縮法によってまたは成形によって調製することができる。直腸坐剤の典型的な重量は、約2~3gmである。直腸投与のための錠剤およびカプセル剤は、同じ薬学的に許容される物質を使用して、かつ経口投与のための製剤と同じ方法によって製造される。直腸投与に好適な製剤は、単位用量坐剤として提供されることもある。これらは、原薬を、1つまたは複数の従来の固形担体、例えば、ココアバターと混合し、次いで得られた混合物を成形することによって調製することができる。
組成物は、単回投薬量または多回投薬量投与のために医薬組成物として製剤化することができる。免疫刺激性細菌は、処置された患者に対する不所望の副作用が無い場合は、治療有用効果に影響を与えるのに十分な量で含むことができる。例えば、薬学的活性化合物の濃度は、注射が、所望の薬理学的効果を生成するために有効量を提供できるように調整される。治療上有効な濃度は、本明細書において記載するまたは当技術分野において公知のアッセイを使用することによって等の、公知のインビトロおよびインビボ系において免疫刺激性細菌を試験することによって経験的に判定することができる。例えば、標準的な臨床的技術を用いることができる。インビトロアッセイおよび動物モデルは、最適な投薬量範囲の同定の助けとなるように用いることができる。経験的に判定することができる正確な用量は、患者または動物の年齢、重量、体表面積、および状態、投与される特定の免疫刺激性細菌、投与経路、処置されることになる疾患のタイプおよび疾患の重症度によって決まり得る。
包装材料、本明細書において提供される任意の医薬組成物、および組成物が、本明細書において記載する疾患または状態を処置するために使用されることを示すラベルを含む製造物品も提供される。例えばラベルは、処置が、腫瘍またはがんのためのものであることを示す場合もある。
本明細書で提供される方法は、がん等の疾患または状態を有する対象を処置するための免疫刺激性細菌を投与または使用する方法を含み、対象の症状はそのような細菌の投与によって改善または緩和され得る。特定の例では、疾患または状態は腫瘍またはがんである。更に、抗がん剤または抗ヒアルロナン剤等の処置用の1つまたは複数の追加の薬剤との併用療法の方法もまた提供される。細菌は、非経口、全身、腫瘍内等の局所および局部、静脈内、直腸、経口、筋肉内、粘膜ならびに他の経路を含むがこれらに限定されない任意の適切な経路によって投与することができる。各々に適した製剤が提供される。当業者は、適切なレジメンおよび用量を確立し、経路を選択することができる。
本明細書で提供される免疫刺激性細菌、組合せ、使用および方法は、がん、特に、肺がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、胃がん、頭頸部がん、卵巣がん、肝臓がん、膵臓がん、腎臓がん、乳がん、結腸直腸がん、および前立腺がんを含む固形腫瘍を含む、全てのタイプの腫瘍の処置に適用可能である。方法はまた、血液がんに使用することもできる。
本明細書の使用および方法の実施において、本明細書で提供される免疫刺激性細菌は、腫瘍を有するか、もしくは新生物細胞を有する対象、または免疫化される対象を含む対象に投与され得る。対象への免疫刺激性細菌の投与の前、同時または後に、免疫刺激性細菌の投与に適した状態を有する対象の診断、対象の免疫力の決定、対象の免疫化、化学療法剤による対象の処置、放射線による対象の処置、または対象の外科的処置を含むがこれらに限定されない1つまたは複数のステップが行われ得る。
本明細書で提供される方法は、対象をモニタリングする、腫瘍をモニタリングする、および/または対象に投与される免疫刺激性細菌をモニタリングする1つまたは複数のステップを更に含んでもよい。腫瘍サイズのモニタリング、転移の存在および/またはサイズのモニタリング、対象のリンパ節のモニタリング、対象の体重または血液もしくは尿マーカーを含む他の健康指標のモニタリング、抗細菌抗体力価のモニタリング、検出可能な遺伝子産物の細菌発現のモニタリング、ならびに対象の腫瘍、組織または臓器における細菌力価の直接モニタリングを含むがこれらに限定されない任意の様々なモニタリングステップが、本明細書で提供される方法に含まれ得る。
以下の例は例示目的のみで含まれ、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
株AST-101を調製した。株AST-101は、asd-(asd遺伝子ノックアウト)になるように遺伝子改変されているYS1646(ATCCから購入することができる、カタログ# 202165)に由来する弱毒化サルモネラ・ティフィムリウムである。この例では、サルモネラ・ティフィムリウム株YS1646 asd-遺伝子欠失は、図1に概説され、以下に記載されるように、DatsenkoおよびWanner[Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645(2000)]の方法の変更形態を使用して遺伝子改変した。
YS1646株は、以前に記載されているように[Sambrook J., (1998), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory]、培養物をLBで成長させ、100倍濃縮し、氷冷10%グリセロールで3回洗浄してエレクトロコンピテントになるように調製した。エレクトロコンピテントな株に、0.2cmギャップキュベットを使用して以下の設定:2.5kV、186ohm、50μFでラムダレッドヘルパープラスミドpKD46(配列番号218)を電気穿孔した。pKD46を担持する形質転換体を、アンピシリンおよび1mM L-アラビノースを含む5mL SOC培地、30℃で成長させ、アンピシリンを含有するLB寒天プレートで選択した。ラムダレッドヘルパープラスミドpKD46を含有するYS1646クローンを、次いで、上記に記載したようにYS1646用にエレクトロコンピテントにした。
YS1646のゲノム由来のasd遺伝子[Broadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178]を、asd遺伝子ノックアウトカセットの設計に使用した。asd遺伝子の左側および右側領域に相同な204および203bpをそれぞれ含有するプラスミドを、DH5-アルファコンピテント細胞に形質転換した。lox P部位と隣接するカナマイシン遺伝子カセットを、このプラスミドにクローニングした。asd遺伝子ノックアウトカセットを、次いで、プライマーasd-1およびasd-2(表1)を使用してPCR増幅し、ゲル精製した。
プラスミドpKD46を担持するYS1646株に、ゲル精製した直鎖状asd遺伝子ノックアウトカセットを電気穿孔した。電気穿孔細胞をSOC培地に回収し、カナマイシン(20μg/mL)およびジアミノピメリン酸(DAP、50μg/ml)を補充したLB寒天プレートにプレーティングした。このステップ中、ラムダレッドリコンビナーゼは、染色体asd遺伝子とkanカセットとの相同組換えを誘導し(染色体asd遺伝子の上流および下流の相同な隣接配列の存在のため)、asd遺伝子の染色体コピーのノックアウトが起こる。選択したカナマイシン耐性クローンにおける破壊されたasd遺伝子の存在を、破壊部位に隣接するYS1646ゲノム由来のプライマー(プライマーasd-3)およびマルチクローニング部位由来のプライマー(プライマーscFv-3)を用いたPCR増幅によって確認した(表1)。また、DAP栄養要求性を証明するために、補充DAPを含むおよび含まないLBプレートにコロニーをレプリカプレーティングした。asd遺伝子欠失を有する全てのクローンは補充DAPの非存在下では成長できず、DAP栄養要求性を証明した。
kan選択マーカーは、Cre/loxP部位特異的組換え系を使用して除去した。YS1646 asd-遺伝子KanR突然変異体を、pJW168(creリコンビナーゼを発現する温度感受性プラスミド、配列番号224)で形質転換した。AmpRコロニーを30℃で選択し、pJW168はその後、42℃での成長によって排除した。選択されたクローン(AST-101)を、次いで、カナマイシンを含むおよび含まないLB寒天プレートにレプリカプレーティングしてkanの喪失についてテストし、破壊部位に隣接するYS1646ゲノム由来のプライマー(プライマーasd-3およびasd-4、プライマー配列については、表1を参照のこと)を使用したPCR検証によって確認した。
asd突然変異体AST-101はLB寒天プレート、37℃で成長することができなかったが、50μg/mLジアミノピメリン酸(DAP)を含有するLBプレートでは成長することができた。asd突然変異体成長率をLB液体培地で評価した。asd突然変異体は液体LBで成長することができなかったが、600nMで吸光度を測定して決定した場合、50μg/mL DAPを補充したLBでは成長することができた。
AST-101 asd遺伝子欠失株を、プライマーasd-3およびasd-4を使用したDNA配列決定によって検証した。asd座に隣接する領域の配列決定を行い、該配列により、asd遺伝子がYS1646染色体から欠失されたことを確認した。
所望の標的遺伝子に対するshRNAをコードするプラスミドで形質転換された組換えサルモネラ・ティフィムリウムを生成するために、ヒトPD-L1、SIRPアルファ、ベータカテニン、VISTA、TREX1、およびVEGFの各々に対する6つのshRNAのセットを設計した。ヒトTGF-ベータアイソフォーム1に対しては合計9つのshRNAを設計した。合計45個のshRNAについて、shRNAをpEQU6ベクター(配列番号41)にサブクローニングした。
同じプラスミドから発現された別個のshRNAによる2つの別個の遺伝子標的の組合せRNAiノックダウンを、U6およびH1プロモーターの両方を担持する遺伝子改変プラスミド(配列番号42)を使用してテストした。それぞれPD-L1(ARI-123、配列番号2)およびTREX1(ARI-114、配列番号24)を標的にする個々のshRNAをサブクローニングして、組合せRNAi ARI-134(配列番号210)を生成した。次いで、それぞれの標的(PD-L1およびTREX1)の発現をそれぞれ個別にノックダウンすることができる2つの別個のshRNAをインサイチュ(in situ)で同時に発現する能力について、ARI-134をテストした。対照として、HEK293細胞でのARI-134によるヒトPD-L1発現のノックダウンを、ARI-123[PD-L1のみを標的にする単一RNAi(配列番号2)]と比較し、HEK293細胞でのARI-134によるヒトTREX1のノックダウンを、ARI-114[TREX1のみを標的にする単一RNAi(配列番号24)]と比較した。ARI-123ノックダウンが野生型ヒトPD-L1遺伝子発現の27.6%であったのに対し、ARI-134(組合せベクター)によるヒトPD-L1のノックダウンは、野生型ヒトPD-L1遺伝子発現の11.8%と改善した(図9A)。同じく、ARI-114を用いたヒトTREX1ノックダウンが野生型TREX1発現の16%であったのに対し、ARI-134を用いたヒトTREX1のノックダウンは100%であった(図9B)。PD-L1およびTREX1に対するARI-134によるノックダウンをウエスタンブロットによって分析した場合、それぞれの陽性対照(RNAiを全く欠いた個々のヒトPD-L1およびヒトTREX1発現反応物)と対比して、ヒトPD-L1もヒトTREX1も検出可能な発現はなかった。したがって、組合せRNAi ARI-134は、PD-L1およびTREX1の発現をノックダウンすることができる。
マイクロRNAコンストラクト、ARI-205(配列番号214)を使用して、マウスPD-L1を標的にするRNAiを配列番号249のマイクロRNA骨格に挿入することによりマウスPD-L1標的化マイクロRNA、ARI-201を生成し、上記に記載したように、qPCRおよびウエスタンブロット分析によってPD-L1標的化shRNAコンストラクトARI-115(配列番号75)と比較した。ARI-115ノックダウンが野生型PD-L1発現の26.6%であったのに対し、ARI-201によるノックダウンは、PD-L1発現の14.6%と改善した(図19A)。ウエスタンブロットで、ARI-115は野生型PD-L1発現の15.8%までPD-L1をノックダウンすることができ、ARI-201によるノックダウンは、PD-L1発現の10.5%と改善した(図19B)。
TREX1
全身投与された弱毒化サルモネラ菌の腫瘍微小環境取り込み後、shRNAのTREX1へのデリバリーにより、STING介在性抗腫瘍免疫および腫瘍成長阻害が活性化する。マウス結腸癌モデルにおいて腫瘍成長阻害を誘導するAST-104(pEQU6-shTREX1で形質転換された株YS1646)の能力を評価するために、6~8週齢のメスのBALB/cマウス(1群当たり8匹)に、CT26マウス結腸癌(100μL PBS中2×105細胞)を右側腹部へ皮下(SC)接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、1×107CFUのAST-104、またはAST-102(pEQU6プラスミド対照で形質転換された株YS1646)を4日空けて2回静脈内(IV)注射し、PBS対照と比較した。初回IV投与の6時間後、マウスを採血し、血漿を回収し、Mouse Inflammation Cytometric Bead Arrayキットを使用して炎症促進性サイトカインについて評価し、FACS(BD Biosciences)によって分析した。
TREX1
IV注射後6時間での全身性血清サイトカインのレベルを評価した。AST-104(プラスミド中にasd相補を含むshTREX1プラスミドを含有する;asdはCpGエレメントを含有する)によって誘発された免疫活性化サイトカインTNF-アルファ、IL-12、およびインターフェロン-ガンマは、AST-102プラスミド対照(同様にasd由来のCpGを含有する)およびPBS群と比べて有意に高かった(図24A)。免疫を抑制することが知られているサイトカインであるIL-10[例えば、Wang et al. (2012) Scand J Immunol. 3:273-281を参照のこと]は、プラスミド対照と比べてshTREX1群でより低い傾向を示した(図24B)。これらのデータは、TREX1の阻害が、結腸癌のマウスモデルにおいて抗腫瘍免疫および強力な腫瘍成長阻害を促進する既知のSTING経路誘導サイトカインを活性化することを示している。
免疫系は、自己免疫を制限するためにいくつかのチェック・アンド・バランスを発達させた。プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)およびプログラム死リガンド1(PD-L1)は、免疫応答を下方調節することにより機能する数多くの阻害性「免疫チェックポイント」の2つの例である。PD-L1のPD-1への結合は、CD8+T細胞シグナル伝達経路を妨げ、CD8+T細胞の増殖およびエフェクター機能を損ない、T細胞寛容を誘導する[Topalian et al. (2012) N Engl J Med 366:3443-3447]。
腫瘍に対する適応免疫を誘導する特徴は、遠位の未処置腫瘍の退縮を誘導する能力である。pEQU6 shRNAプラスミドを含有するYS1646株の、両側腹部マウス結腸癌モデルにおいて原発および遠位腫瘍成長阻害を誘導する能力を評価するために、6~8週齢のメスのBALB/cマウス(1群当たり10匹のマウス)に、CT26マウス結腸癌(100μL PBS中2×105細胞)を右側腹部および左側腹部へSC接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、5×106CFUのAST-104(YS1646でのpEQU6 shTREX1)、AST-105(YS1646でのpEQU6 shPD-L1)またはAST-102(YS1646でのプラスミド対照)を4日空けて2回、右側腹部腫瘍へ腫瘍内(IT)注射し、PBS対照と比較した。
Toll様受容体(TLR)は、病原体関連分子パターン(PAMP)を感知し、病原体に対する自然免疫を活性化するための重要な受容体である[Akira et al. (2001) Nat Immunol. 2(8):675-680]。これらのうち、TLR9は、哺乳動物DNAには天然に存在しない病原体DNAの低メチル化CpGモチーフを認識することに関与している[McKelvey et al. (2011) J Autoimmunity 36:76]。免疫細胞サブセットにおけるエンドソームへの病原体の食作用時のCpGモチーフの認識により、IFR7依存性I型インターフェロンシグナル伝達が誘導され、自然および適応免疫が活性化される。CpGモチーフを含有する改変サルモネラ・ティフィムリウムプラスミドを担持するS.ティフィムリウム株YS1646(YS1646 pEQU6スクランブル)は、プラスミドを含まないYS1646株と比べて、TLR9を同様に活性化し、I型IFN介在性自然および適応免疫を誘導することが本明細書に示されている。
優れたTREX1遺伝子ノックダウンは、マイクロRNA ARI-203によりインビトロで達成された(実施例2、図20を参照のこと)。マイクロRNA株AST-106を、TREX1に対するマイクロRNA(miRNA)をコードするARI-203、pEQU6プラスミドでYS1646を形質転換して生成した。AST-106を、shRNA株、AST-104(pEQU6 shTREX1で形質転換されたYS1646)と比較した。マウス結腸癌モデルにおけるインビボ効力をテストした。この実験のために、6~8週齢のメスのBALB/cマウス(1群当たり10匹のマウス)に、CT26(100μL PBS中、2×105細胞)を右側腹部へSC接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、5×106CFUのAST-104またはAST-106を、8日目、15日目および23日目に毎週IV注射し、PBS対照と比較した。
プラスミドからのasd発現によるasd欠失の相補
プラスミド(pATIU6)を化学的に合成し、アセンブルした(配列番号225)。プラスミドは、以下の特徴を含有した:高コピー(pUC19)複製起点、ショートヘアピンの発現を駆動するためのU6プロモーター、その後の除去のためのHindIII制限部位と隣接するアンピシリン耐性遺伝子、および開始コドンの上流に85塩基対の配列を含有するasd遺伝子(配列番号246)。このベクターに、マウスTREX1を標的にするshRNAまたはスクランブル非同族shRNA配列をSpeIおよびXhoIによる制限消化およびライゲーションによって導入し、E.コリDH5-アルファにクローニングした。それぞれ、pATI-shTREX1およびpATI-shSCRと名付けられた得られたプラスミドをE.コリで増幅し、電気穿孔によるasdノックアウト株AST-101への形質転換、ならびにそれぞれ株AST-108およびAST-107を産生する、LB ampプレートでのクローン選択のために精製した。pATIU6由来プラスミドで相補したasd突然変異体は、DAPの非存在下のLB寒天および液体培地で成長することができた。
以下の特徴を含有するプラスミドを設計し、合成した:pBR322複製起点、SV40 DNA核標的化配列(DTS)、rrnBターミネーター、shRNAの発現を駆動するためのU6プロモーターと、これに続く、プロモーターおよびshRNAまたはマイクロRNAをクローニングするための隣接制限部位、asd遺伝子、rrnGターミネーター、ならびに除去のためのHindIII部位およびマルチクローニング部位と隣接するカナマイシン耐性遺伝子(配列番号247)。更に、2つの別個のshRNAまたはマイクロRNAの発現用のプラスミドを設計し、合成した。このプラスミドは、以下の特徴を含有した:pBR322複製起点、SV40 DNA核標的化配列(DTS)、rrnBターミネーター、shRNAの発現を駆動するためのU6プロモーターと、これに続く、プロモーターおよびshRNAまたはマイクロRNAをクローニングするための隣接制限部位、第2のshRNAまたはマイクロRNAの発現を駆動するためのH1プロモーター、H1とU6プロモーターの間に置かれる450bpのランダムに生成されたスタッファー配列、asd遺伝子、rrnGターミネーター、ならびに除去のためのHindIII部位およびマルチクローニング部位と隣接するカナマイシン耐性遺伝子(配列番号245)。
本明細書の例では、S.ティフィムリウム株を、炎症促進性シグナル伝達を低減するためにフラジェリンサブユニットfliCおよびfljBの両方を欠くように遺伝子改変した。fliCおよびfljBの欠失は、YS1646のasd遺伝子欠失株(AST-101)の染色体へ連続的に遺伝子改変させた。
この例では、実施例1に詳細に記載され、図34に図式的に示されるDatsenkoおよびWannerの方法[Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645 (2000)]の修正を使用して、AST-101株の染色体からfliCを欠失させた。fliC遺伝子に隣接する224および245塩基の相同な配列を含有する合成fliC遺伝子相同性アーム配列を注文し、pSL0147と呼ばれるプラスミドにクローニングした(配列番号230)。cre/lox p部位と隣接するカナマイシン遺伝子カセットを、次いでpSL0147にクローニングし、fliC遺伝子ノックアウトカセットを、次いで、プライマーflic-1(配列番号232)およびflic-2(配列番号233)を用いてPCR増幅し、ゲル精製し、温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドpKD46を担持するAST-101株に電気穿孔によって導入した。電気穿孔細胞をSOC+DAP培地に回収し、カナマイシン(20μg/mL)およびジアミノピメリン酸(DAP、50μg/ml)を補充したLB寒天プレートにプレーティングした。コロニーを選択し、ノックアウト断片の挿入について、プライマーflic-3(配列番号234)およびflic-4(配列番号235)を使用するPCRによってスクリーニングした。pKD46を、次いで、選択したカナマイシン耐性株を42℃で培養して除去し、アンピシリン耐性の喪失についてスクリーニングした。カナマイシン耐性マーカーを、次いで、Creリコンビナーゼ(pJW1680)を発現する温度感受性プラスミドの電気穿孔によって除去し、AmpRコロニーを30℃で選択した;pJW168はその後、培養物を42℃で成長させて排除した。選択したfliCノックアウトクローンを、次いで、破壊部位に隣接するプライマー(flic-3およびflic-4)を使用するPCR、およびアガロースゲルでの電気泳動移動度の評価によって、カナマイシンマーカーの喪失についてテストした。
fljBを、次いで、上記に記載した方法の修正を使用してasd/fliC欠失YS1646株で欠失させた。fliC遺伝子に隣接する、それぞれ249および213塩基の左側および右側配列を含有する合成fljB遺伝子相同性アーム配列を合成し、pSL0148と呼ばれるプラスミドにクローニングした(配列番号231)。cre/loxP部位と隣接するカナマイシン遺伝子カセットを、次いでpSL0148にクローニングし、fljB遺伝子ノックアウトカセットを、次いで、プライマーfljb-1(配列番号236)およびfljb-2(配列番号237)を用いてPCR増幅し、ゲル精製し、温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドpKD46を担持するAST-101に電気穿孔によって導入した。カナマイシン耐性遺伝子を、次いで、上記に記載したようにcre介在性組換えによって除去し、温度感受性プラスミドは非許容温度での成長によって除去した。fliCおよびfljB遺伝子ノックアウト配列を、プライマーflic-3およびflic-4またはfljb-3(配列番号238)およびfljb-4(配列番号239)を使用するPCRによって増幅し、DNA配列決定によって検証した。YS1646のこのasd-/fliC-/fljB-突然変異体誘導体をAST-111と名付けた。
本明細書でAST-111またはASD/FLGと呼ばれる、fliCおよびfljBの両方の欠失を有するYS1646由来asd突然変異体株を、10マイクロリットルの一晩培養物をスイミングプレート(0.3%寒天および50mg/mL DAPを含有するLB)にスポットして、遊泳運動性について評価した。運動性はYS1646およびasd欠失株AST-101で観察されたが、asd/fliC/fljB欠失株AST-111では運動性が明白ではなかった。AST-111株に、次いで、pATIshTREX1(asd遺伝子およびTREX1を標的にするshRNAを含有するプラスミド)を電気穿孔してAST-112を作製し、DAPの非存在下でのその成長率を評価した。図35に示すようにASD/FLG(pATI-shTREX1)株AST-112は、補充DAPの非存在下、LBで複製することができ、pATIshTREX1を含有するasd株(AST-108)と同等の速度で成長した。これらのデータは、フラジェリンの排除は、S.ティフィムリウムのインビトロでの適応度を低下させないことを示している。
結腸癌のマウスモデルで投与されたフラジェリンノックアウト株の影響を評価するために、6~8週齢のメスのBALB/cマウス(1群当たり10匹のマウス)に、CT26(100μL PBS中、2×105細胞)を右側腹部へSC接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、pATIKan-shTREX1プラスミドを含有するASD/FLG株(AST-113)または同じpATIKan-shTREX1プラスミドを有するASD株(AST-110)5×106CFUの週3回投与をIV注射し、PBS対照と比較した。初回IV投与の6時間後、マウスを採血し、血漿を回収し、Mouse Inflammation Cytometric Bead Arrayキットを使用して炎症促進性サイトカインについて評価し、FACS(BD Biosciences)によって分析した。
この例では、実施例1に記載されたYS1646のasd欠失株(AST-101)を更に改変して、サルモネラ属菌株の細胞質に蓄積するシグナル配列を欠くリステリオリシンO(LLO)タンパク質(本明細書ではcytoLLOと呼ばれる)を発現させた。LLOは、リステリア・モノサイトゲネスから分泌され、細菌のファゴソームエスケープ(phagosomal escape)を介在するコレステロール依存性の膜孔形成細胞溶解素である。コドン2~24個を欠失したLLOをコードする遺伝子を、サルモネラ菌での発現に最適化されたコドンにより合成した。cytoLLOのオープンリーディングフレームの配列は、配列番号240にある。cytoLLO遺伝子を、S.ティフィムリウムにおける転写を誘導するプロモーター(以下に再現された配列番号241)の制御下に置いた。実施例1に記載されているDatsenkoおよびWanner[Proc Natl Acad Sci USA (2000) 97:6640-6645]の方法の修正を使用して、cytoLLO発現カセットをasd欠失株AST-101のノックアウトasd座に単一コピーで挿入した。
cytoLLO遺伝子ノックインが抗腫瘍効果をもたらしたかどうかを決定するために、ASD/LLO(pATI-shTREX1)株AST-115を結腸癌のマウスモデルで評価した。この試験のために、6~8週齢のメスのBALB/cマウス(1群当たり8匹のマウス)に、CT26(100μL PBS中、2×105細胞)を右側腹部へSC接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、5×106CFUのAST-115の単回投与をIV注射し、PBS対照と比較した。
本明細書で提供される株は、アデノシンに対して栄養要求性であるように遺伝子改変される。その結果、株はインビボで弱毒化される。その理由は、正常組織の低アデノシン濃度では株は複製することができず、したがって定着は主に、アデノシンレベルが高い固形腫瘍微小環境で生じるためである。サルモネラ属菌株YS1646(AST-100)は野生型株ATCC14028の誘導体であり、purI遺伝子の破壊のためにプリンに対して栄養要求性であるように遺伝子改変された[Low et al., (2004) Methods Mol. Med 90:47-60]。YS1646の全ゲノムのその後の分析は、purI遺伝子(purMと同義)は実際に欠失されないが、代わりに染色体逆位によって破壊されること[Broadway et al. (2014) J.Biotechnol. 20:177-178]、および遺伝子全体は、挿入配列と隣接するYS1646染色体の2つの部分内に依然として含有されること(そのうち1つは、活性トランスポザーゼを有する)を示した。染色体再結合(chromosomal reengagement)によって破壊されたpurI遺伝子の完全な遺伝子配列の存在は、野生型遺伝子の復帰可能性を残す。YS1646のプリン栄養要求性がインビトロでの連続継代後に安定であることは以前に示されているが、復帰率がどれほどであるかは明らかでなかった[Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002]。
プラスミドを含有する細菌株の適応度を評価するために、37℃でSpectramaxプレートリーダーを使用し、15分ごとにOD600を読み取ってLB液体培地で成長曲線を行った。図43に示すように、低コピープラスミドpEQU6-shTREX1を含有するYS1646(AST-104)は、プラスミドを含有しないYS1646(AST-100)と同等に成長した。asd栄養要求性を相補し得るasd遺伝子を含む高コピーshTREX1プラスミドを有するasd突然変異体株(AST-110)は、DAPの非存在下のLBで複製することができたが、YS1646より遅く成長した。低コピー数の複製起点およびasd栄養要求性を相補し得るasd遺伝子を含むshTREX-1発現プラスミド(pATIlow-shTREX1)を含有するasd欠失株、株AST-117は、AST-110より速い速度で成長した。これらのデータは、asd遺伝子栄養要求性を相補する低コピー数プラスミドは、S.ティフィムリウムのインビトロでのより迅速な複製速度を可能にすることから、高コピー数プラスミドより優れていることを示している。
高および低コピープラスミド上のasdを相補したasd突然変異体の適応度を測定するために、マウス腫瘍細胞株において細胞内で複製する細菌株の能力を、ゲンタマイシン保護アッセイを使用して評価した。このアッセイでは、マウスメラノーマB16.F10細胞またはマウス結腸がんCT26細胞を、相補的asd遺伝子を含有し、および高コピー複製起点、AST-110(ASD pATI-shTREX1)または低コピー複製起点、AST-117(ASD pATI低コピー-shTREX1)のどちらかを有するプラスミドを含有するasd突然変異体サルモネラ属菌株に感染させた。細胞を、1細胞当たり約5個の細菌の多重度で30分間感染させ、次いで細胞をPBSで洗浄し、ゲンタマイシンを含有する培地を添加して細胞外細菌を死滅させた。細胞内細菌は細胞膜を通過することができないことから、ゲンタマイシンによって死滅されない。感染後の様々な時点で、細胞単層を水による浸透圧ショックによって溶解し、細胞溶解物を希釈し、LB寒天にプレーティングして生存コロニー形成単位(CFU)を数えた。
この例では、CT26腫瘍担持マウスを、TREX1を標的にするshRNAを発現するプラスミド(pEQU6-TREX1)を含有するYS1646、株AST-104、または機能性asd遺伝子およびTREX1を標的にするshRNAを有するプラスミド(pATI-shTREX1)を含有するYS1646のasd欠失株、株AST-110で処置した。最後のサルモネラ注射後12日目に、腫瘍をホモジナイズし、ホモジネートを連続希釈し、LB寒天プレートにプレーティングして存在するCFUの総数を数えるか、またはカナマイシンを含有するLBプレートにプレーティングしてカナマイシン耐性コロニーの数を数えた。
asd相補系を、プラスミド喪失を防ぎ、S.ティフィムリウム株によるインビボでの阻害性RNAデリバリーの抗腫瘍効果を増強するように設計する。これをテストするために、shTREX1プラスミドを含有するasd欠失株(AST-110)、または機能性asd遺伝子カセットを含有するスクランブル対照(AST-109)を、pEQU6-shTREX1を含有するYS1646(AST-104、asd遺伝子カセットを欠き、したがってプラスミド維持のための機構を有さないプラスミド)とマウス結腸癌モデルにおける抗腫瘍効果について比較した。この実験のために、6~8週齢のメスのBALB/cマウス(1群当たり8匹のマウス)に、CT26(100μL PBS中、2×105細胞)を右側腹部へSC接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、5×106CFUのAST-109(pATI-shスクランブルで形質転換されたASD)、AST-110(pATI-shTREX1で形質転換されたASD)、またはAST-104(pEQU6-shTREX1で形質転換されたYS1646)を8日目および18日目に2回IV注射し、PBS対照と比較した。
高コピーshTREX1プラスミドに対して、asd相補系を有する低コピーshTREX1プラスミドの抗腫瘍効果を結腸癌のマウスモデルで比較するために、6~8週齢のメスのBALB/cマウス(1群当たり10匹のマウス)に、CT26(100μL PBS中、2×105細胞)を右側腹部へSC接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、5×106CFUのAST-117[ASD(pATI Low-shTREX1)]またはAST-110[ASD(pATI-shTREX1)]の週2回投与をIV注射し、陰性対照としてのPBS注射と比較した。図47に示すように、低コピープラスミドを有する株、AST-117は、高コピープラスミドを有する株AST-110と比べて優れた抗腫瘍効果を示した(高TGI 59%、低TGI 79%、p=0.042、25日目)。
log vs定常注射ストックの作製
サルモネラ・ティフィムリウムのサルモネラ病原性アイランド-1(SPI-1)遺伝子は、対数成長中に誘導されることが示されている[Lundberg et al. (1999) Journal Of Bacteriology 181:3433-3437]。この病原性アイランドは、上皮細胞等の非食細胞、または固形腫瘍に由来する細胞における取り込みに不可欠である。後期log中のSPI-1遺伝子の誘導はまた、マクロファージの迅速なピロトーシス(カスパーゼ-1依存性の炎症促進性プログラム細胞死)をもたらすことも示されている[Fink et al. (2007) Cell Microbiol. 9(11): 2562-2570]。
採取時の培養期がインビボ活性に与える影響を決定するために、改変サルモネラ・ティフィムリウム株の対数期vs定常期培養物を結腸癌のマウスモデルで評価した。6~8週齢のメスのBALB/cマウス(1群当たり10匹のマウス)に、CT26(100μL PBS中、2×105細胞)を右側腹部へSC接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、対数期または定常期に採取した5×106CFUのAST-104(pEQU6-shTREX1で形質転換されたYS1646)株の週3回投与をIV注射し、PBS対照と比較した。初回IV投与の6時間後、マウスを採血し、血漿を回収し、Mouse Inflammation Cytometric Bead Arrayキットを使用して炎症促進性サイトカインについて評価し、FACS(BD Biosciences)によって分析した。
上記に記載したように、S.ティフィムリウムのasd遺伝子は、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする。この遺伝子の欠失により、細菌は、インビトロまたはインビボで成長するときジアミノピメリン酸(DAP)に対して栄養要求性となる。この例は、asd欠失株(実施例1に記載)を使用する。該株は、DAPに対して栄養要求性であり、該株がインビボでの複製を欠損するようにasd相補遺伝子を含有しないRNAiのデリバリーに適したプラスミドを含有する。この株は、DAPの存在下、インビトロで増殖され、正常に成長し、次いで、DAPが存在しない哺乳動物宿主に免疫療法剤として投与され、細菌の自己溶解をもたらす。自己溶解株は、宿主細胞に侵入することができるが、哺乳動物組織におけるDAPの欠如のため複製することができない。特質のこの組合せにより、RNAi介在性遺伝子ノックダウンおよび複製する株と比べた安全性の増加が可能になる。
cytoLLOおよびTREX1を標的にするマイクロRNAをデリバリーするように遺伝子改変された自己溶解株AST-120が、ビルレンスを弱毒化されたかどうかを決定するために、半致死量(LD50)試験を行った。1×106~5×107CFUにわたるAST-120の漸増用量を、C57BL/6マウス(LPSに高度に感受性であるマウス株)にIV投与した。IV投与後、AST-120は、全ての用量で十分に忍容性であり、単回投与後に一過性の体重減少が観察された。2回目の投与は、初回投与7日後に投与し、最も高い用量レベル(5×107CFU)の4匹中1匹のマウスが瀕死で見出され、安楽死を必要とした。AST-120を投与された全ての他のマウスが一過性の体重減少を経験したが、回復した。これらのデータは、TREX1を標的にするマイクロRNAをデリバリーするS.ティフィムリウム(typhimurim)の自己溶解株(AST-120)のLD50が、5×107CFUより大きいことを示唆している。VNP20009株のLD50は、C57BL/6マウスで約5×106であることが知られている[Lee et al. (2000) International Journal of Toxicology 19:19-25]。これは、AST-120がVNP20009と比べて少なくとも10倍弱毒化されることを示している。
cytoLLOおよびTREX1を標的にするマイクロRNAをデリバリーするように遺伝子改変された自己溶解株AST-120が、抗腫瘍応答をもたらすことができるかどうかを決定するために、6~8週齢のメスのBALB/cマウス(1群当たり10匹)に、CT26(100μL PBS中、2×106細胞)を右側腹部へSC接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、5×106CFUの自己溶解株AST-120[ASD/LLO(pEQU6-miTREX1)]の単回投与をIV注射し、対照としてPBSで処置したマウスと比較した。図51に示すように、PBS単独で処置した動物と比べて、抗腫瘍応答がわずか1回の投与後に検出された(TGI 52.4%、p=0.02、17日目)。まとめると、これらのデータは、DAP栄養要求性によって自己溶解性であるように遺伝子改変され、およびTREX1を標的にするRNAiのデリバリー用のプラスミドを含有するように遺伝子改変されたS.ティフィムリウムが見事に弱毒化され、抗腫瘍応答を誘発できることを示している。
adrAまたはcsgD欠失
この例では、purI欠失、msbB欠失、asd遺伝子欠失を含有し、および干渉RNAをコードするプラスミドをデリバリーするように遺伝子改変されたサルモネラ・ティフィムリウムの生弱毒化株が、サルモネラ・ティフィムリウムのバイオフィルム形成に必要な遺伝子、adrAを欠失させるために更に改変される。バイオフィルムを形成することができないサルモネラは、宿主食細胞によってより迅速に吸収され、より迅速に排除される。細胞内局在化におけるこの増加により、プラスミドデリバリーおよびRNA干渉による遺伝子ノックダウンの有効性は強化される。腫瘍/組織からのクリアランス速度の増加は、療法の忍容性を向上させ、バイオフィルム形成の欠如は、患者における人工器官および胆嚢への定着を妨げる。別の例では、purI欠失、msbB欠失、asd遺伝子欠失を含有し、および干渉RNAをコードするプラスミドをデリバリーするように遺伝子改変されたサルモネラ・ティフィムリウムの生弱毒化株が、csgDを欠失させるために更に改変される。この遺伝子はadrAの活性化に関与し、またTLR2アゴニストであるcurli線毛の発現も誘導する。csgDの喪失もまたバイオフィルム形成を防ぎ、TLR2活性化の阻害という追加の利点があり、それによって細菌のビルレンスを更に低減し、RNAiのデリバリーを強化する。
この例では、purI欠失、msbB欠失、asd遺伝子欠失を含有し、および干渉RNAをコードするプラスミドをデリバリーするように遺伝子改変されたS.ティフィムリウムの生弱毒化株が、pagPを欠失させるために更に改変される。pagP遺伝子は、S.ティフィムリウムの感染ライフサイクル中に誘導され、リピドAをパルミトイル化(palmitylate)する酵素をコードする。野生型S.ティフィムリウムでは、pagPの発現は、ヘプタアシル化されたリピドAをもたらす。リピドAの末端アシル鎖を付加することができないmsbB突然変異体では、pagPの発現はヘキサアシル化LPSをもたらす。ヘキサアシル化LPSは、最も炎症促進性であることが示されている。この例では、pagPおよびmsbBを欠失した株は、ペンタアシル化LPSしか産生できず、細菌が干渉RNAをデリバリーするように遺伝子改変される場合、炎症促進性サイトカインの低下、忍容性の強化、および適応免疫の増加を可能にする。
この例では、purI欠失、msbB欠失、asd遺伝子欠失を含有し、および干渉RNAをコードするプラスミドをデリバリーするように遺伝子改変されたサルモネラ・ティフィムリウムの生弱毒化株が、hilAを欠失させるために更に改変される。hilAは、サルモネラ病原性アイランド-1(SPI-1)関連3型分泌装置(T3SS)の発現に必要とされる調節遺伝子である。この分泌装置は、改変S.ティフィムリウムの取り込みを引き起こす上皮細胞等の非食宿主細胞のサイトゾルへのエフェクタータンパク質の注入に関与している。SPI-1 T3SSは、腸上皮層の通過に不可欠であることが示されているが、細菌が非経口的に注射される場合、感染には必ずしも必要でない。いくつかのタンパク質およびニードル複合体の注入自体も、インフラマソーム活性化および食細胞のピロトーシスを誘導し得る。この炎症促進性細胞死は、抗原提示細胞(APC)死を直接誘導すること、およびサイトカイン環境を改変してメモリーT細胞の生成を妨げることによって、頑強な適応免疫応答の開始を制限する可能性がある。この例では、静脈内または腫瘍内のどちらかに投与される治療的サルモネラ・ティフィムリウム株からのhilA遺伝子の追加の欠失が、取り込みにSPI-1 T3SSを必要としない食細胞に対してサルモネラ・ティフィムリウム感染を集中させ、次いでこれらの食細胞の寿命を延長させる。hilA突然変異は炎症促進性サイトカインの量を低減し、療法の忍容性、および適応免疫応答の質を向上させる。
TREX1が、正常ヒト組織と比べて腫瘍組織で上方調節されて見出されるかどうかを評価するために、cancer genome atlas(TCGA)データベースを使用してTREX1遺伝子の相対的遺伝子発現を評価するための分析を行った。図52に示すように、乳がん、前立腺がん、子宮がん、膀胱がんおよび子宮頸がんを含む広範な腫瘍タイプが、正常組織と比べてTREX1の有意な上方調節を示した(p値:BRCA:7.7e-16;PRAD:9.4e-12;UCEC:2.5e-05;BLCA:3.7e-03;CESC:7.7e-03)。更に、TREX1は、腎臓がんの複数の形態で上方調節されて見出された(p値:KIPAN:8.9e-39;KIRC:9.6e-35;KIRP:5.8e-14;KICH:4.9e-08)。これらのデータは、腫瘍進行と広く相関するTREX1上方調節の現象を立証し、本明細書で提供されるような有望ながん治療戦略として、この標的化を支持するものである。
マウス結腸腫瘍側腹部モデルにおける一連のshRNA免疫標的の有効性を比較するために、6~8週齢のメスのBALB/cマウス(1群当たり10匹のマウス)に、CT26(100μL PBS中、2×105細胞)を右側腹部および左側腹部にSC接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、各々5×106CFUのYS1646、YS1646(pEQU6-shVISTA)、YS1646(pEQU6-shベータカテニン)、またはYS1646(pEQU6-shTGF-ベータ)を右側腹部腫瘍に4日空けて2回、腫瘍移植後10日目および14日目に腫瘍内(IT)注射し、PBS対照と比較した。
放射線療法は、S.ティフィムリウムと相乗作用して腫瘍成長阻害を促進することが示されている。以前の試験は、マウスB16.F10メラノーマ側腹部モデルにおける5×105CFUのS.ティフィムリウム(YS1646)の単回IV投与と、これに続く15Gy放射線との組合せによる腫瘍成長阻害の強化を示した(Bermudes et al. (2001) Biotechnol Genet Eng Rev. 18:1)。
抗PD-1チェックポイント療法の追加がAST-106(TREX1に対するマイクロRNAをコードするプラスミドを担持するYS1646)の有効性を強化し得ることを示すために、6~8週齢のメスのBALB/cマウス(1群当たり10匹のマウス)に、CT26(100μL PBS中、2×105細胞)を右側腹部および左側腹部へ皮下接種(SC)して腫瘍を確立した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、5×106CFUのAST-106(pEQU6-miTREX1、ARI-203で形質転換されたYS1646)、またはAST-103(pEQU6-スクランブルshRNAで形質転換されたYS1646)を、単独でまたは抗PD-1(4mg/kg、クローンRMP1-14、BioXCell)の毎週IP注射との組合せのどちらかで、腫瘍移植後10日目および14日目に右側腹部腫瘍へ腫瘍内(IT)注射し、PBS対照と比較した。原発腫瘍および遠位腫瘍有効性がCD8α+T細胞およびDCに依存性であったかどうかを決定するために、IT注射前、5および7日目、次いで10、14および17日目に抗CD8α除去抗体を群にIP投与した(4mg/kg、クローン2.43、BioXCell)。
以下の表は、第1列にRNAの標的を記載し;第2列は、プラスミド中のRNAによってコードされる標的の組合せを記載し;第3列は、プラスミド中のコードされたRNAのタイプ(フォーマット)を記載し;および第4列は、表または本明細書の免疫刺激性細菌との併用療法で使用され得る例示的な追加の治療剤を記載する。次の列は、細菌株のゲノムに対する改変を列挙し、最終列は、使用され得るプラスミドの特徴を記載する。列に列挙された要素はそれぞれ、表に列挙された、および本明細書の開示全体を通して提供される任意の他の要素/特徴と適合し得る。細菌は、任意の治療的細菌、特に本明細書の開示全体を通して列挙されたいずれか、例えば、ただし以下に限定されるものではないが、サルモネラ属、シゲラ属、E.コリ、ビフィドバクテリウム属、リケッチア属、ビブリオ属、リステリア属、クレブシエラ属、ボルデテラ属、ナイセリア属、アエロモナス属、フランシセラ属(Franciesella)、コレラ属、コリネバクテリウム属、シトロバクター属、クラミジア属、ヘモフィルス属、ブルセラ属、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、レジオネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、ヘリコバクター属、バチルス属、およびエリジペロスリックス属であってもよい。そのような細菌の例は、S.ティフィムリウム等のサルモネラ属菌株である。サルモネラ・ティフィムリウム属菌株のうち、VNP20009(ATCC #202165)、RE88、SL7207、χ8429、χ8431、およびχ8468と名付けられた株はよく知られている株である。
Claims (226)
- RNAをコードするヌクレオチドの配列を含む免疫刺激性細菌であって、
RNAが、免疫チェックポイントまたは他の標的の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断し、その阻害、抑制または遮断が、対象における抗腫瘍免疫応答を増加させ;
RNAが、前記細菌中のプラスミド上にコードされ;
免疫刺激性細菌が、アスパルテート-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ-(asd-)である、免疫刺激性細菌。 - プラスミドが、低から中コピー数で存在する、請求項1に記載の免疫刺激性細菌。
- RNAをコードするヌクレオチドの配列を含む免疫刺激性細菌であって、
RNAが、免疫チェックポイントの発現を阻害するか、抑制するか、または遮断し;
RNAが、前記細菌中のプラスミド上にコードされ;
プラスミドが、シグナル配列が無いリステリオリジンO(LLO)タンパク質(cytoLLO)をコードする核酸(複数可)の配列、CpGモチーフ、DNA核標的化配列(DTS)、フラジェリンサブユニット(複数可)をコードする遺伝子の欠失、およびレチノイン酸誘導性遺伝子-I(RIG-I)結合エレメントのうちの1つまたは複数を含む、免疫刺激性細菌。 - アスパルテート-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ-(asd-)である、請求項3に記載の免疫刺激性細菌。
- アスパルテート-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(asd)をコードする内因性遺伝子のうちの全てまたは一部が破壊または欠失しており、そのために内因性asdが発現されないことから、asd-である、請求項1から4のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- プラスミドが、中から低コピー数の複製起点を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- プラスミドが、低コピー数の複製起点を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- プラスミドが低コピー数で存在する、請求項1から7のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 中コピー数が、150未満もしくは約150未満かつ20超もしくは約20超であるか、または20もしくは25から150の間である、請求項1から6のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 低コピー数が、25未満または20未満または約25未満または約20未満コピーである、請求項1から9のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- アデノシン栄養要求性である、請求項1から10のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- アデノシンおよびアデニン栄養要求性である、請求項1から11のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 前記細菌において発現するためにasdをコードするプラスミドを含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 細菌プロモーターによって発現されるasdをコードするプラスミドを含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- CpGモチーフを含む核酸を含み、モチーフが、トル様受容体9(TLR9)によって認識される、請求項1から14のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- CpGモチーフを含む核酸が、プラスミド上にコードされる、請求項15に記載の免疫刺激性細菌。
- CpGモチーフをコードする核酸を含み、CpGモチーフをコードする核酸が、プラスミドにおいてコードされる細菌性遺伝子中に含まれるか、またはその一部である、請求項1から16のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- CpGを含む遺伝子がasdである、請求項17に記載の免疫刺激性細菌。
- フラジェリン欠損であり、野生型細菌が鞭毛を含む、請求項1から18のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 鞭毛をコードする遺伝子(複数可)の欠失を有する、請求項19に記載の免疫刺激性細菌。
- フラジェリンサブユニットfliCとfljBのうちの1つまたは両方をコードする遺伝子の欠失を含み、そのために細菌が鞭毛欠損であり、野生型細菌が鞭毛を発現する、請求項1から20のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- シグナル配列が無いリステリオリジンO(LLO)タンパク質であるcytoLLOをコードする核酸を含む、請求項1から21のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- RNAが、TREX1およびPD-L1のうちの1つもしくは両方、またはTREX1およびPD-1のうちの1つもしくは両方の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断する、請求項22に記載の免疫刺激性細菌。
- プラスミド上にコードされるDNA核標的化配列(DTS)を含む、請求項1から23のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- DTSがSV40 DTSである、請求項24に記載の免疫刺激性細菌。
- エンドヌクレアーゼA(endA)をコードする遺伝子の欠失または改変を有し、そのためにendA活性が阻害されるかまたは削除される、請求項1から25のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- CpGモチーフ、プラスミドを維持するためのasd遺伝子選択マーカー、およびDNA核標的化配列のうちの1つまたは複数を含む、請求項1から26のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 免疫チェックポイントの発現を阻害するか、抑制するか、もしくは遮断する2つ以上の異なるRNA分子、または免疫抑制性であるかもしくは免疫抑制性経路にある代謝産物の阻害剤をコードするRNA分子をコードする核酸をプラスミド上に含む、請求項1から27のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- プラスミドが、RNAをコードする核酸の下流に転写ターミネーターを含む、請求項28に記載の免疫刺激性細菌。
- RNAが、ショートヘアピン型RNA(shRNA)またはマイクロRNA(miRNA)である、請求項1から29のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- RNAが、3’修復エキソヌクレアーゼ1(TREX1)、PD-1、PD-L1(B7-H1)、VEGF、TGF-ベータアイソフォーム1、ベータ-カテニン、CTLA-4、PD-L2、PD-2、IDO1、IDO2、SIRPα、CD47、VISTA(B7-H5)、LIGHT、HVEM、CD28、LAG3、TIM3、TIGIT、ガレクチン-9、CEACAM1、CD155、CD112、CD226、CD244(2B4)、B7-H2、B7-H3、ICOS、GITR、B7-H4、B7-H6、CD27、CD40/CD40L、CD48、CD70、CD80、CD86、CD137(4-1BB)、CD200、CD272(BTLA)、CD160、CD39、CD73、A2a受容体、A2b受容体、HHLA2、ILT-2、ILT-4、gp49B、PIR-B、HLA-G、ILT-2/4、OX40/OX-40L、KIR、TIM1、TIM4、STAT3、スタビリン-1(CLEVER-1)、DNASE IIおよびRNASE H2のうちの1つまたは複数の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断する、請求項1から30のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- RNAが、TREX1、PD-L1、VISTA、TGF-ベータアイソフォーム1、ベータ-カテニン、SIRP-アルファ、VEGF、RNASE H2、DNASE II、およびCLEVER-1/スタビリン-1のうちの1つまたは組合せの発現を阻害するか、抑制するか、または遮断する、請求項1から30のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- プラスミドが、少なくとも2つの標的の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードするヌクレオチドの配列を含み;
各RNAが、異なるプロモーターから発現される、請求項1から32のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。 - 阻害、抑制または遮断のための標的が、TREX1およびPD-L1、TREX1およびPD-1、TREX1およびVISTA、TREX1およびSIRP-アルファ、PD-L1およびTGF-ベータアイソフォーム1、PD-L1およびベータ-カテニン、PD-L1およびVISTA、TGF-ベータアイソフォーム1およびVISTA、SIRP-アルファおよびVISTA、ならびにTREX1およびRNASE H2の中から選択される少なくとも2つの組合せを含む、請求項33に記載の免疫刺激性細菌。
- プラスミドが、TGF-ベータアイソフォーム1の発現を特異的に阻害するか、抑制するか、または遮断するが、TGF-ベータアイソフォーム2またはTGF-ベータアイソフォーム3ではしないshRNAまたはマイクロRNAをコードするか;または
プラスミドが、TGF-ベータアイソフォーム1および3の発現を特異的に阻害するか、抑制するか、または遮断するが、アイソフォーム2にはしないshRNAまたはマイクロRNAをコードする、請求項1から34のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。 - プラスミドが、レチノイン酸誘導性遺伝子I(RIG-I)のアゴニストであるヌクレオチドの配列をコードする、請求項1から35のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- msbB-である、請求項1から36のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- purI-(purM-)、msbB- 、purD- 、フラジェリン-(fliC-/fljB-)、pagP-、adrA-、CsgD-およびhilA-のうちの1つまたは複数である、請求項1から37のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- purI欠失、msbB欠失、asd欠失、およびadrA欠失を含む、請求項1から38のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- rfaL、rfaG、rfaH、rfaD、rfaP、rFb、rfa、msbB、htrB、firA、pagL、pagP、lpxR、arnT、eptA、およびlpxTのうちの1つまたは複数の中から選択される、リポポリサッカライドの生合成を変更する、遺伝子の突然変異のうちの1つまたは複数;および/または
自殺遺伝子を導入し、sacB、nuk、hok、gef、kilおよびphlAのうちの1つまたは複数から選択される突然変異のうちの1つまたは複数;および/または
溶菌遺伝子を導入し、hlyおよびclyのうちの1つまたは両方から選択される、突然変異のうちの1つまたは複数;および/または
IsyA、pag、prg、iscA、virG、plcおよびactの中から選択される、1つまたは複数のビルレンス因子(複数可)の突然変異;および/または
recA、htrA、htpR、hspおよびgroELの中から選択される、ストレス応答を改変する1つまたは複数の突然変異;および/または
細胞周期を破壊するminの突然変異;および/または
cya、crp、phoP/phoQおよびompRの中から選択される、調節性機能を破壊または不活性化する1つまたは複数の突然変異
を含む、請求項1から39のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。 - RNAが、ショートヘアピン型RNA(shRNA)またはマイクロRNA(miRNA)である、請求項1から40のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- RNAがmiRNAであり;
標的またはその相補体をコードするRNAのmiRNA骨格が、miR-16-2(配列番号248)と表されるか、または配列番号249のmiRNA骨格である、請求項41に記載の免疫刺激性細菌。 - RNAが、RNAポリメラーゼIII(RNAP III)またはRNAポリメラーゼII(RNAP II)プロモーターの制御下で発現される、請求項1から42のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- RNAがshRNAである、請求項41または43に記載の免疫刺激性細菌。
- RNAがmiRNAである、請求項41から43のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- プロモーターがRNAP IIIであり、RNAがshRNAである、請求項41、43および44のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- プロモーターがRNAP IIであり、RNAがmiRNAである、請求項41から43および45のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- RNAが、U3、H1、U6、7SKおよび7SLの中から選択されるRNAP IIIプロモーターの制御下で発現される、請求項41から46のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- RNAが、ウイルス性プロモーターであるRNAP IIプロモーターの制御下で発現される、請求項41から45および47のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- ウイルス性プロモーターが、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、SV40プロモーター、およびアデノウイルスプロモーターの中から選択される、請求項49に記載の免疫刺激性細菌。
- 細菌が、サルモネラ属、シゲラ属、E.コリ、ビフィドバクテリウム属、リケッチア属、ビブリオ属、リステリア属、クレブシエラ属、ボルデテラ属、ナイセリア属、アエロモナス属、フランシセラ属、コレラ属、コリネバクテリウム属、シトロバクター属、クラミジア属、ヘモフィルス属、ブルセラ属、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、レジオネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、ヘリコバクター属、バチルス属、およびエリジペロスリックス属の菌株、または細菌菌株の先行する列挙のうちのいずれかのこれらの弱毒化菌株もしくはこれらの改変菌株である、請求項1から50のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 弱毒化細菌である、請求項1から51のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- サルモネラ属の菌株である、請求項1から52のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- サルモネラ・ティフィムリウム菌株である、請求項53に記載の免疫刺激性細菌。
- 菌株AST-104、AST-105、AST-106、AST-108、AST-110、AST-112、AST-113、AST-115、AST-117、AST-118、AST-119、AST-120、AST-121、AST-122、およびAST-123の中から選択されるサルモネラ・ティフィムリウム菌株である、免疫刺激性細菌。
- 3’修復エキソヌクレアーゼ1(TREX1)の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードするヌクレオチドの配列を含み、アデノシン栄養要求性である、免疫刺激性細菌。
- VISTAの発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードするヌクレオチドの配列を含み、アデノシン栄養要求性である、免疫刺激性細菌。
- プログラム死リガンド1(PD-L1)の発現を阻害する、抑制する、遮断するRNAをコードするヌクレオチドの配列を含む、免疫刺激性細菌。
- 3’修復エキソヌクレアーゼ1(TREX1)の発現を阻害するか、抑制するか、遮断するかまたはサイレンシングするRNAをコードする核酸を含む、免疫刺激性サルモネラ属細菌。
- VISTAの発現を阻害するか、抑制するか、遮断するかまたはサイレンシングするRNAをコードする核酸を含む、免疫刺激性サルモネラ属細菌。
- 3’修復エキソヌクレアーゼ1(TREX1)の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードするヌクレオチドの配列、およびPD-L1の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードするヌクレオチドの配列を含む、免疫刺激性細菌。
- VISTAの発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードするヌクレオチドの配列、およびPD-L1の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードするヌクレオチドの配列を含む、免疫刺激性細菌。
- TREX1、PD-L1、VISTA、TGF-ベータアイソフォーム1、ベータ-カテニン、SIRP-アルファ、VEGF、RNASE H2、DNASE II、およびCLEVER-1/スタビリン-1のうちの1つまたは組合せの発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードするヌクレオチドの配列を含む、請求項1から62のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 阻害、抑制または遮断のための標的が、TREX1およびPD-L1、TREX1およびPD-1、TREX1およびVISTA、TREX1およびSIRP-アルファ、PD-L1およびTGF-ベータアイソフォーム1、PD-L1およびベータ-カテニン、PD-L1およびVISTA、TGF-ベータアイソフォーム1およびVISTA、SIRP-アルファおよびVISTA、TREX1およびRNASE H2、VISTAおよびRNASE H2、ならびにVISTAおよびDNASE IIの中から選択される少なくとも2つの組合せである、請求項63に記載の免疫刺激性細菌。
- TREX1およびSIRPα、またはTREX1およびVISTA、またはTREX1およびVEGF、またはPD-L1およびβ-カテニン、またはPD-L1およびTGF-ベータアイソフォーム1、またはPD-L1およびVEGF、またはTREXおよびPD-1の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードするヌクレオチドの配列を含む、免疫刺激性細菌。
- 細菌が、CTLA-4、PD-L1(B7-H1)、PD-L2、PD-1、PD-2、IDO1、IDO2、SIRPα、CD47、VISTA(B7-H5)、LIGHT、HVEM、CD28、LAG3、TIM3、TIGIT、ガレクチン-9、CEACAM1、CD155、CD112、CD226、CD244(2B4)、B7-H2、B7-H3、ICOS、GITR、B7-H4、B7-H6、CD27、CD40/CD40L、CD48、CD70、CD80、CD86、CD137(4-1BB)、CD200、CD272(BTLA)、CD160、CD39、CD73、A2a受容体、A2b受容体、HHLA2、ILT-2、ILT-4、gp49B、PIR-B、HLA-G、ILT-2/4、OX40/OX-40L、KIR、TIM1、TIM4、STAT3、CLEVER-1、DNASE IIおよびRNASE-H2のうちのいずれかの中から選択される、阻害、抑制、または遮断されることになる別の異なる免疫チェックポイントまたは標的の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードする核酸を更に含む、請求項1から65のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 阻害、抑制、または遮断されることになる別の異なる免疫チェックポイントが、ヒトPD-L1(配列番号31)、ヒトベータ-カテニン(配列番号32)、ヒトSIRPα(配列番号33)、ヒトTREX1(配列番号34)、ヒトVISTA(配列番号35)、ヒトTGF-ベータアイソフォーム1(配列番号193)およびヒトVEGF(配列番号194)の中から選択される、請求項66に記載の免疫刺激性細菌。
- RNAが、配列番号1~30、36~40、および195~209のうちのいずれかに示す免疫チェックポイント核酸における配列を標的とする、請求項1から67のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードする核酸が、shRNAまたはマイクロRNA(miRNA)をコードする、請求項1から68のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- RNAが、miR-103であるmiRNAであり、成熟miR-103が配列:5’-AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA-3’を含む、請求項1から69のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- RNAが、前記細菌中のプラスミド上にコードされ;
プラスミドが、RNAをコードする核酸の下流に転写ターミネーターを含む、請求項1から70のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。 - プラスミドが、シグナル配列が無いリステリオリジンO(LLO)タンパク質(cytoLLO)をコードする核酸の配列、CpGモチーフ、DNA核標的化配列(DTS)、フラジェリンサブユニット(複数可)をコードする遺伝子の欠失、およびレチノイン酸誘導性遺伝子-I(RIG-I)結合エレメントのうちの1つまたは複数を含む、請求項1から71または56から71のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- CpGモチーフを含む核酸を含み、モチーフが、トル様受容体9(TLR9)によって認識される、請求項1から72または56から72のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- purI欠失、msbB欠失、asd欠失、およびadrA欠失を含む、請求項1から73のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 免疫刺激性細菌が、アスパルテート-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ-(asd-)である、請求項1から74のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- purI-(purM-)、msbB- 、purD- 、フラジェリン-(fliC-/FljB-)、pagP-、adrA-、およびhilA-のうちの1つまたは複数である、請求項1から75または56から75のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- エンドヌクレアーゼ-1(endA)をコードする遺伝子の改変を有し、そのためにendA活性が阻害されているかまたは削除されており、改変が、挿入または欠失である、請求項1から76または56から76のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- rfaL、rfaG、rfaH、rfaD、rfaP、rFb、rfa、msbB、htrB、firA、pagL、pagP、lpxR、arnT、eptA、およびlpxTのうちの1つまたは複数の中から選択される、リポポリサッカライドの生合成を変更する、遺伝子の突然変異のうちの1つまたは複数;および/または
自殺遺伝子を導入し、sacB、nuk、hok、gef、kilまたはphlAのうちの1つまたは複数から選択される突然変異のうちの1つまたは複数;および/または
溶菌遺伝子を導入し、hlyおよびclyのうちの1つまたは両方から選択される突然変異のうちの1つまたは複数;および/または
IsyA、pag、prg、iscA、virG、plcおよびactの中から選択される、1つまたは複数のビルレンス因子(複数可)の突然変異;および/または
recA、htrA、htpR、hspおよびgroELの中から選択される、ストレス応答を改変する1つまたは複数の突然変異;および/または
細胞周期を破壊するminの突然変異;および/または
cya、crp、phoP/phoQ、およびompRの中から選択される、調節性機能を破壊または不活性化する1つまたは複数の突然変異
を含む、請求項56から77のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。 - RNAが、前記細菌中のプラスミド上にコードされ;
プラスミドが、RNAをコードする核酸の下流に転写ターミネーターを含む、請求項56から78のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。 - プラスミドが、中から低コピー数の複製起点を含む、請求項56から79のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- プラスミドが、低コピー数の複製起点を含む、請求項56から80のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- プラスミドが低コピー数で存在する、請求項56から81のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 中コピー数のプラスミドを含み、中コピー数が、150未満もしくは約150未満かつ20超もしくは約20超であるか、または20もしくは25から150の間である、請求項56から80のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 低コピー数のプラスミドを含み、低コピー数が25未満または20未満または約25未満または約20未満コピーである、請求項56から82のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 複製起点が、pBR322、p15A、pSC101、pMB1、colE1、colE2、pPS10、R6K、R1、RK2、およびpUC由来の起源の中から選択される、請求項1から84のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードする核酸が、細菌が投与されるか、またはそれを投与することになる対象によって認識される真核生物プロモーターの制御下にある、請求項1から85のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- プロモーターが、U3、H1、U6、7SKおよび7SLの中から選択される、請求項86に記載の免疫刺激性細菌。
- 対象がヒトである、請求項86または87に記載の免疫刺激性細菌。
- 発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードする核酸が、前記細菌中のプラスミド上にコードされる、請求項56から88のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードする各核酸が、異なるプロモーターの制御下にあるshRNAをコードし、プロモーターが真核生物プロモーターである、請求項1から89のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードする核酸がそれぞれ、少なくとも約75個のヌクレオチド、または少なくとも75個のヌクレオチド分、離れている、請求項1から90のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードする1個超の核酸が存在する場合、それぞれが、少なくとも約75個のヌクレオチド、または少なくとも75個のヌクレオチド、最大約もしくは少なくとも100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500個のヌクレオチド(または塩基対)、最大約1600もしくは1600個のヌクレオチド(または塩基対)、または75~1500もしくは1600個の間のヌクレオチド(または塩基対)分、離れている、請求項1から91のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- プロモーターがRNAポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項86から92のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- プロモーターが、U3、H1、U6、7SKおよび7SLの中から選択される、請求項86から93のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードする核酸が、細菌においてプラスミド上に含まれる、請求項1から94のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 細菌菌株がアスパルテート-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ-(asd-)である、請求項56から95のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 細菌菌株がプラスミド上でasdを発現し;その発現が、腫瘍微小環境(TME)において発現されるプロモーターの制御下にある、請求項1から96のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- プロモーターが、低酸素条件において、またはpHが7未満である条件において発現される、請求項97に記載の免疫刺激性細菌。
- サルモネラ属、シゲラ属、E.コリ、ビフィドバクテリウム属、リケッチア属、ビブリオ属、リステリア属、クレブシエラ属、ボルデテラ属、ナイセリア属、アエロモナス属、フランシセラ属、コレラ属、コリネバクテリウム属、シトロバクター属、クラミジア属、ヘモフィルス属、ブルセラ属、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、レジオネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、ヘリコバクター属、バチルス属、およびエリジペロスリックス属の菌株、または細菌菌株の先行する列挙のうちのいずれかのこれらの弱毒化菌株もしくはこれらの改変菌株である、請求項56から98のいずれか一項に記載の細菌。
- 弱毒化される、請求項56から99のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- AST100(VNP20009またはYS1646)由来である、請求項1から100のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 真核生物対象においてインビボにある場合に弱毒化される、請求項1から101のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 対象においてインビボで弱毒化され、腫瘍微小環境(TME)条件において複製する、請求項1から102のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- アデノシン栄養要求性であり、
鞭毛をコードするその核酸における欠失;
endAにおける欠失;および
CytoLLOをコードし、核局在配列、asdプラスミド相補系を含み、免疫チェックポイントまたは他の標的の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断し、その阻害、抑制または遮断が、対象における抗腫瘍免疫応答を高めるRNAをコードするプラスミド
を含む免疫刺激性細菌。 - 細菌がサルモネラ属の菌株である、請求項1から104のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- サルモネラ・ティフィムリウム菌株である、請求項1から105のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- AST100、VNP20009と称される菌株、または菌株YS1646(ATCC#202165)、RE88、SL7207、χ8429、χ8431、およびχ8468の中から選択される弱毒化サルモネラ・ティフィムリウム菌株である、請求項1から105または56から106のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- TREX1を標的とするshRNAをコードし、PD-L1を標的とするshRNAをコードするプラスミドを含む、請求項1から107のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- アデノシン栄養要求性である、請求項1から108のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 細菌が、shRNAをコードするプラスミドを含み、shRNAが、配列番号36~40および75~78のうちのいずれかに示すヌクレオチドの配列によってコードされる、請求項1から109のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 細菌が、miRNAをコードするプラスミドを含み、miRNAが、配列番号214~217のうちのいずれかに示すヌクレオチドの配列によってコードされる、請求項1から110または56から110のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 静止期において採取される、請求項1から111のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- RNAをコードするプラスミドが、アスパルテート-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(asd)をコードするヌクレオチドの配列を含んでおらず、得られた菌株がasd-であり、得られた菌株の複製がインビボで制限される、請求項1から111のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
- 請求項1から113のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌を、薬学的に許容される媒体中に含む、医薬組成物。
- 酵素3’修復エキソヌクレアーゼ1(TREX1)をコードする遺伝子の発現を阻害するか、または遮断するか、または抑制するRNAをコードするヌクレオチドの配列を含む免疫刺激性細菌を、薬学的に許容される媒体中に含む、医薬組成物。
- アデノシン栄養要求性であるが、アデニン栄養要求性ではない免疫刺激性細菌を、薬学的に許容される媒体中に含む、医薬組成物。
- アデノシン栄養要求性であり、3’修復エキソヌクレアーゼ1(TREX1)の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードする免疫刺激性細菌を、薬学的に許容される媒体中に含む、医薬組成物。
- アデノシン栄養要求性であり、purI-ではない免疫刺激性細菌を、薬学的に許容される媒体中に含む、医薬組成物。
- 請求項1、59および61のいずれか一項に記載の細菌を、薬学的に許容される媒体中に含む、医薬組成物。
- がんの処置に使用するための、請求項1から113のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌または請求項114から119のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- がんを処置するための、請求項1から113のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌または請求項114から119のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
- がんが、固形腫瘍または血液悪性腫瘍である、請求項120に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または請求項121に記載の使用。
- がんが、乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、肝臓、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、頸部または肝臓のがんの中から選択される、請求項120から122のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- 細菌が、サルモネラ属、シゲラ属、E.コリ、ビフィドバクテリウム属、リケッチア属、ビブリオ属、リステリア属、クレブシエラ属、ボルデテラ属、ナイセリア属、アエロモナス属、フランシセラ属、コレラ属、コリネバクテリウム属、シトロバクター属、クラミジア属、ヘモフィルス属、ブルセラ属、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、レジオネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、ヘリコバクター属、バチルス属、およびエリジペロスリックス属の菌種、または細菌菌株の先行する列挙のうちのいずれかのこれらの弱毒化菌株もしくはこれらの改変菌株である、請求項1から123のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- 細菌が、TREX1、ならびにCTLA-4、PD-L1(B7-H1)、PD-L2、PD-1、PD-2、IDO1、IDO2、SIRPα、CD47、VISTA(B7-H5)、LIGHT、HVEM、CD28、LAG3、TIM3、TIGIT、ガレクチン-9、CEACAM1、CD155、CD112、CD226、CD244(2B4)、B7-H2、B7-H3、ICOS、GITR、B7-H4、B7-H6、CD27、CD40/CD40L、CD48、CD70、CD80、CD86、CD137(4-1BB)、CD200、CD272(BTLA)、CD160、CD39、CD73、A2a受容体、A2b受容体、HHLA2、ILT-2、ILT-4、gp49B、PIR-B、HLA-G、ILT-2/4、OX40/OX-40L、KIR、TIM1、TIM4、STAT3、CLEVER-1、DNASE IIおよびRNASE-H2のうちのいずれかの中から選択される別の異なる免疫チェックポイントの発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードする核酸を含む、請求項1から124のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- 阻害されることになる免疫チェックポイントが、ヒトPD-L1、SIRPα、TREX1、VISTA、およびCLEVER-1のうちの1つまたは複数の中から選択される、請求項1から124のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- 阻害されることになる免疫チェックポイントが、ヒトPD-L1(配列番号31)、ヒトベータ-カテニン(配列番号32)、ヒトSIRPα(配列番号33)、ヒトTREX1(配列番号34)、ヒトVISTA(配列番号35)、ヒトTGF-ベータアイソフォーム1(配列番号193)およびヒトVEGF(配列番号194)の中から選択される、請求項125または126に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- RNAが、配列番号1~30、36~40および195~209のうちのいずれかに示す核酸をコードする免疫チェックポイントにおける配列を標的とする、請求項114から127のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- 発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードする核酸が、shRNAをコードする、請求項1から41、43、44、46、48から69、71から110および112から127のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- 発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードする核酸が、細菌または組成物が目的とする対象によって認識される真核生物プロモーターの制御下にある、請求項1から129のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- プロモーターが、対象に対してオルソロガスな菌種からのものである、請求項130に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- 発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードする核酸が、前記細菌中のプラスミド上にコードされる、請求項130または131に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- 発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードする各核酸が、異なるプロモーターの制御下にあるshRNAまたはマイクロRNAをコードし、プロモーターが真核生物プロモーターである、請求項1から132のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- RNAが、前記細菌中のプラスミド上にコードされ;
プラスミドが、標的の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断する2つ以上のRNA分子をコードし;
各RNAをコードする核酸の各配列が、少なくとも約75個のヌクレオチド、または少なくとも75個のヌクレオチド分、離れている、請求項1から133のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌、医薬組成物または使用。 - RNAが、前記細菌中のプラスミド上にコードされ;
プラスミドが、標的の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断する2つ以上のRNA分子をコードし;
発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードする核酸のそれぞれが、少なくとも約75個のヌクレオチド、または少なくとも75個のヌクレオチド、最大約もしくは少なくとも100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500個のヌクレオチド(または塩基対)、最大約1600もしくは1600個のヌクレオチド(または塩基対)、または75~1500もしくは1600個のヌクレオチド(または塩基対)分、離れている、請求項1から133のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。 - プロモーターがRNAポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項133から135のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- プロモーターが、U3、H1、U6、7SKおよび7SLの中から選択される、請求項133から136のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- 細菌菌株がアスパルテート-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ-(asd-)である、請求項1から137のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- 細菌菌株が、腫瘍微小環境(TME)において発現されるプロモーターの制御下でasdを発現する、請求項1から138のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- プロモーターが、低酸素条件において、またはpHが7未満である条件において発現される、請求項139に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- 細菌が、サルモネラ属、シゲラ属、E.コリ、ビフィドバクテリウム属、リケッチア属、ビブリオ属、リステリア属、クレブシエラ属、ボルデテラ属、ナイセリア属、アエロモナス属、フランシセラ属、コレラ属、コリネバクテリウム属、シトロバクター属、クラミジア属、ヘモフィルス属、ブルセラ属、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、レジオネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、ヘリコバクター属、バチルス属、およびエリジペロスリックス属の菌株、または細菌菌株の先行する列挙のうちのいずれかのこれらの弱毒化菌株もしくはこれらの改変菌株である、請求項1から140のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- 細菌が、真核生物対象においてインビボにある場合に弱毒化される、請求項1から141のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- 細菌が、対象においてインビボで弱毒化され、腫瘍微小環境(TME)条件において複製する、請求項1から142のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- 対象がヒトである、請求項120から143のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- 細菌がサルモネラ属の菌株である、請求項1から144のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- 細菌がサルモネラ・ティフィムリウム菌株である、請求項1から144のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- 細菌が、VNP20009(ATCC#202165)、RE88、SL7207、χ8429、χ8431、およびχ8468と称される菌株の中から選択される弱毒化サルモネラ・ティフィムリウム菌株である、請求項1から146のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- 細菌が、TREX1を標的とするshRNAまたはmiRNAをコードし、PD-L1を標的とするshRNAをコードするプラスミドを含む、請求項145から147のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌または医薬組成物。
- 細菌がアデノシン栄養要求性であり、および/またはプラスミドが、低コピー数の複製起点を有し、および/または菌株がasd-である、請求項1から148のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- 細菌が、shRNAまたはmiRNAをコードするプラスミドを含み、
shRNAが、配列番号1~30、36~40および75~78のうちのいずれかに示すヌクレオチドの配列によってコードされ;
miRNAが、配列番号214~217のうちのいずれかに示すヌクレオチドの配列によってコードされる、請求項1から149のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。 - がんを有する対象を処置する方法であって、
請求項1から113のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌または請求項114から119のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。 - がんを有する対象を処置する方法であって、
請求項1から113のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌を投与することを含み、がんが固形腫瘍である、方法。 - 処置が、第2の抗がん剤または処置が投与される組合せ療法を含む、請求項151または152に記載の方法。
- 第2の抗がん剤または処置が、免疫刺激性細菌の前に、それと同時に、その後に、またはそれと間欠的に投与される、請求項153に記載の方法。
- 第2の抗がん剤が、細胞質DNAをもたらす化学療法剤であるか、または放射線療法である、請求項153または154に記載の方法。
- 免疫刺激性細菌が、TREX1の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードする核酸を含む、請求項154または155に記載の方法。
- RNAが、shRNAまたはmiRNAである、請求項156に記載の方法。
- 免疫刺激性細菌の投与が、全身または局在または局所である、請求項151から157のいずれか一項に記載の方法。
- 免疫刺激性細菌の投与が非経口である、請求項151から157のいずれか一項に記載の方法。
- 免疫刺激性細菌の投与が、経口または直腸であるか、または肺へのエアゾールによるものか、または腫瘍内である、請求項151から157のいずれか一項に記載の方法。
- 免疫刺激性細菌の投与が、静脈内、筋肉内、または皮下である、請求項151から157のいずれか一項に記載の方法。
- がんが、固形腫瘍または血液悪性腫瘍である、請求項151から161のいずれか一項に記載の方法。
- がんが、乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、肝臓、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、頸部および肝臓のがんの中から選択される、請求項151から162のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体である免疫チェックポイント阻害剤である第2の治療剤を投与することを含む、請求項151から162のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体が、抗PD-1、または抗PD-L1もしくは抗CTLA4抗体である、請求項164に記載の方法。
- 腫瘍または転移または血液悪性腫瘍を処置する方法であって、
cd73+である腫瘍を有する対象を同定することと;
アデノシン栄養要求性である免疫刺激性細菌を投与することと
を含む、方法。 - 腫瘍がcd73+/cd39+である、請求項166に記載の方法。
- 免疫刺激性細菌が、サルモネラ属、シゲラ属、リステリア属、またはE.コリ菌種である、請求項166または167に記載の方法。
- 細菌がサルモネラ属菌種である、請求項166から168のいずれか一項に記載の方法。
- 細菌がサルモネラ・ティフィムリウム菌株である、請求項166から168のいずれか一項に記載の方法。
- 免疫刺激性細菌の投与が、腹腔内または腫瘍内投与によるものである、請求項151から170のいずれか一項に記載の方法。
- 対象がヒトである、請求項151から171のいずれか一項に記載の方法。
- 対象が、がんまたは腫瘍または転移または血液悪性腫瘍を有する、請求項151から172のいずれか一項に記載の方法。
- 腫瘍またはがんが固形腫瘍を含む、請求項151から173のいずれか一項に記載の方法。
- 腫瘍が、肺がん、頭頸部がん、胃がん、肝臓がん、腎臓がん、乳房がん、直腸結腸がん、前立腺がん、および慢性リンパ芽球性白血病の中から選択される、請求項151から174のいずれか一項に記載の方法。
- 腫瘍が、膀胱、肝臓、前立腺、胃、膵臓または直腸結腸がんである、請求項151から175のいずれか一項に記載の方法。
- 免疫刺激性細菌が、請求項1から113のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌である、請求項151から176のいずれか一項に記載の方法。
- cd73+である腫瘍を有する対象の処置に使用するための免疫刺激性細菌であって、
アデノシン栄養要求性であり;
対象が、腫瘍生検または他の身体組織もしくは体液試料を試験することによって、cd73+である腫瘍を有すると同定されている、免疫刺激性細菌。 - 対象において免疫刺激性細菌の定着を増加させる方法であって、
免疫刺激性細菌を対象に投与することと;
対象においてTREX1の発現および/またはTREX1のコード化産物の活性を阻害するか、または抑制することと
を含む、方法。 - 免疫刺激性細菌が、対象においてTREX1の発現を阻害するか、遮断するか、またはサイレンシングする阻害性RNAをコードする、請求項179に記載の方法。
- 免疫刺激性細菌が、対象においてTREX1の発現を阻害するか、遮断するか、または抑制するshRNAをコードする、請求項179または180に記載の方法。
- 免疫刺激性細菌がサルモネラ属菌種である、請求項179から181のいずれか一項に記載の方法。
- 免疫刺激性細菌がS.ティフィムリウムである、請求項179から181のいずれか一項に記載の方法。
- 未改変S.ティフィムリウムが、AST-100または菌株YS1646(ATCC#202165)である、請求項183に記載の方法。
- 未改変S.ティフィムリウムがVNP20009(AST-100)である、請求項1から178のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用または方法。
- 対象において腫瘍、転移または血液悪性腫瘍を処置するための、放射線療法、または化学療法剤を用いた処置を改善する方法であって、
放射線療法、または細胞質DNAをもたらすか、もしくはDNAを遮断し、その結果TREX1の発現を増加させる抗がん剤を用いて対象を処置することと;
請求項1から113のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌、またはTREX1の発現および/もしくはTREX1のコード化産物の活性を阻害するか、もしくは抑制する産物をコードする免疫刺激性細菌を投与することによって、対象におけるTREX1の発現および/またはTREX1のコード化産物の活性を阻害するか、または抑制することと
を含む、方法。 - 免疫刺激性細菌を投与し、TREX1の発現および/またはTREX1のコード化産物の活性を阻害するか、または抑制する、請求項186に記載の方法。
- 免疫刺激性細菌と放射線療法または抗がん剤とが、同時に投与されるか、もしくは間欠的に投与されるか、または細菌が、放射線療法もしくは抗がん剤の後に投与されるか、または細菌が、放射線療法もしくは抗がん剤の前に投与される、請求項186または187に記載の方法。
- 免疫刺激性細菌が、対象においてTREX1の発現を阻害するか、遮断するか、またはサイレンシングする阻害性RNAをコードする、請求項186から188のいずれか一項に記載の方法。
- 免疫刺激性細菌が、対象においてTREX1の発現を阻害するか、遮断するか、または抑制するshRNAをコードする、請求項186から189のいずれか一項に記載の方法。
- 細菌がサルモネラ属菌種である、請求項186から190のいずれか一項に記載の方法。
- 免疫刺激性細菌がS.ティフィムリウムである、請求項186から191のいずれか一項に記載の方法。
- 未改変細菌が、VNP20009であるS.ティフィムリウム菌株である、請求項192に記載の方法。
- 免疫刺激性細菌が弱毒化される、請求項151から193のいずれか一項に記載の方法。
- 未改変細菌が、VNP20009またはVNP20009の誘導体である、請求項193に記載の方法。
- 細菌が、チェックポイント阻害剤もしくはそのような阻害剤をコードする遺伝子、または免疫抑制性であるか、もしくは免疫抑制性経路にある代謝産物の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するsiRNAまたはshRNAまたはmiRNAをコードする、請求項151から193のいずれか一項に記載の方法または請求項1から113のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌または請求項114から150のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは組成物または使用。
- 腫瘍または悪性腫瘍を処置する方法であって、
細胞質DNAをもたらす抗腫瘍療法を投与することと;
TREX1の発現の阻害剤を投与することであり、TREX1の発現の阻害剤が、請求項1から113のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌である、投与することと
を含む、方法。 - それを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、
対象において内因性インターフェロン-ベータ(IFN-β)産生を調節することと;
請求項1から113のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌を投与することであり、細菌が、TREX1の発現を阻害するか、または減少させるか、または遮断する産物をコードする、投与することと;
治療有効量の電離放射線または化学療法剤を投与することと
を含む、方法。 - がんを処置する方法であって、TREX1の発現を阻害するかまたは発現を遮断する産物をコードする請求項1から113のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌を投与することによって、対象において電離放射線、化学療法感作、および/または免疫原性細胞死を誘導する薬剤に対する感作を維持するために、対象においてI型インターフェロンの活性化を維持することを含む、方法。
- 放射線療法によってがんを処置する方法であって、請求項1から113のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌を投与することを含み、細菌が、TREX1の発現を阻害するか、または減少させるか、または遮断し、低放射線用量でのアブスコパル効果を回復させる産物をコードする、方法。
- 免疫刺激性細菌が、チェックポイント阻害剤もしくはそのような阻害剤をコードする遺伝子、または免疫抑制性であるか、もしくは免疫抑制性経路にある代謝産物の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するshRNAまたはmiRNAをコードするサルモネラ属菌株である、請求項197から200のいずれか一項に記載の方法。
- 抗VEGF薬剤または抗CTLA-4薬剤である第2の抗がん剤を投与することを含む、請求項151から177および179から199のいずれか一項に記載の方法。
- 抗VEGF薬剤が、VEGFに結合する抗体またはVEGF受容体である、請求項202に記載の方法。
- 免疫刺激性細菌が、TREX1および/またはPD-L1の発現を、阻害するか、抑制するか、または遮断するRNAをコードするヌクレオチドの配列を含む、請求項202または203に記載の方法。
- 免疫刺激性細菌がサルモネラ属菌種である、請求項202から204のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の抗がん剤が抗CTLA-4薬剤である、請求項202に記載の方法。
- 抗CTLA-4薬剤が、CTLA-4を阻害するか、またはそれに結合する抗体である、請求項206に記載の方法。
- がんを処置するための、TREX1の発現を阻害するか、または発現を遮断する産物をコードする、請求項1から113のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌の使用。
- がんを処置するための、TREX1の発現を阻害するか、または発現を遮断し、インターフェロンI型活性化またはインターフェロンI型レベルに対する照射療法の影響を阻止するか、または低下させる産物をコードする、請求項1から113のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌の使用。
- 対象におけるがんまたは腫瘍または転移の処置に使用するための、請求項1から119のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌または医薬組成物。
- 処置が、第2の抗がん剤または処置を用いた組合せ療法を含む、請求項210に記載の免疫刺激性細菌または医薬組成物。
- 第2の薬剤または処置が、放射線療法、または細胞質DNAをもたらす化学療法剤である、請求項211に記載の免疫刺激性細菌または医薬組成物。
- 対象がヒトである、請求項208から212のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または使用。
- 細菌または細菌を含む組成物が、全身または局在または局所投与のために製剤化される、請求項1から213のいずれか一項に記載の使用または免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または方法。
- 投与が、非経口、経口、静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内である、請求項1から207のいずれか一項に記載の使用または免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物または方法。
- shRNAをコードする核酸を含む免疫刺激性細菌の定着を増加させるための、対象においてTREX1の発現またはTREX1のコード化産物の活性を阻害するか、遮断するか、またはサイレンシングするshRNAまたはmiRNAの使用。
- RNAをコードする核酸を含む免疫刺激性細菌の定着を増加させるために使用するための、対象においてTREX1の発現またはTREX1のコード化産物の活性を阻害するか、遮断するか、またはサイレンシングするRNAを含む組成物。
- 配列番号1~30、36~40、75~78および195~217のうちのいずれかに示す核酸の配列を含む、DNA分子。
- 請求項218に記載のDNA分子を含む、プラスミド。
- サルモネラ属菌種において複製する、請求項219に記載のプラスミド。
- サルモネラ属がS.ティフィムリウムである、請求項220に記載のプラスミド。
- サルモネラ属がVNP20009である、請求項220に記載のプラスミド。
- 配列番号41、42、43、44、45、46、47、79、80、218、224、225、230、231、244、245、または247に示すヌクレオチドの配列を含む、請求項219から222のいずれか一項に記載のプラスミド。
- 請求項219から223のいずれか一項に記載のプラスミドを含む、サルモネラ属菌株。
- 請求項1から113のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌を生成するための方法であって、
細菌を培養することと;
静止期において細菌を採取することと
を含む、方法。 - 免疫刺激性細菌を生成するための方法であって、
免疫刺激性細菌を培養することであり、細菌が、免疫チェックポイントまたは他の標的の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断し、その阻害、抑制または遮断が、対象における抗腫瘍免疫応答を高めるRNAをコードするプラスミドを含む、培養することと;
静止期において細菌を採取することと
を含む、方法。
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