CN103268797A

CN103268797A - 一种亲水磁性介孔微球及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN103268797A
Application number: CN2013101636611A
Authority: CN
Inventors: 林子俺; 郑江南; 张兰; 杨黄浩; 陈国南
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2013-05-07
Filing date: 2013-05-07
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2033-05-07
Also published as: CN103268797B

Abstract

本发明属于有机-无机复合材料和分析技术领域，具体涉及一种亲水磁性介孔微球及其制备方法与应用。亲水磁性介孔微球制备过程如下：（1）通过溶胶-凝胶反应，以表面活性剂作为结构导向剂，在磁性无机纳米粒表面包覆上一层具有有序介观结构的功能化二氧化硅/表面活性剂复合材料；（2）再通过溶剂萃取除去表面活性剂，得到表面功能化的磁性介孔微球；（3）与叠氮化钠反应，得到叠氮化磁性介孔微球；（4）利用点击化学反应将炔基化的糖类与叠氮化磁性介孔微球反应，得到亲水磁性介孔微球。本发明制得的亲水磁性介孔微球具有磁场感应性好、特异性强等优点，在蛋白质组学等领域有良好的使用价值和应用前景。

Description

一种亲水磁性介孔微球及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于有机-无机复合材料和分析技术领域，具体涉及一种亲水磁性介孔微球及其制备方法与应用。

背景技术

翻译后蛋白质的修饰是蛋白质组学研究的热点课题。糖基化修饰是一种最为常见的蛋白质翻译后修饰，它在生物发育、细胞分裂、炎症反应和重要的疾病中都扮演着关键角色。由于其丰度相对较低（2-4%），且每一个糖基化位点上都可能存在多种结构的糖链，从而使得研究存在较大困难。因此富集糖基化肽段就成为糖基化研究中至关重要的步骤。

目前已有的糖基化肽段富集方法主要有以下几种：凝集素亲和色谱法、亲水色谱法、肼腙反应法和硼酸富集法。其中，基于亲水相互作用的材料由于具有极好的重现性、高选择性等优点，呈现出良好的应用潜力，得到了广泛的关注（Xiong, Z.; Zhao, L.; Wang, F.; Zhu, J.; Qin, H.; Wu, R.; Zhang, W.; Zou, H. Chem. Commun. 2012, 48, 8138–8140; Yeh, C.-H.; Chen, S.-H.; Li, D.T.; Lin, H.P.; Huang, H. J.; Chang, C.I.; Shih, W.L.; Chern, C.L.; Shi, F.K.; Hsu, J.L. J. Chromatogr. A 2012, 1224, 70–78; Qu, Y.; Xia, S.; Yuan, H.; Wu, Q.; Li, M.; Zou, L.; Zhang, L.; Liang, Z.; Zhang, Y. Anal. Chem. 2011, 83, 7457–7463; ）

磁性介孔复合材料由于其良好的磁响应性、大的表面积、均一的介孔孔道以及特殊的排阻效应，可作为一种简便有效的分离方法应用于糖基化肽段富集研究中。目前亲水性的磁性介孔复合材料作为糖基化肽段的吸附剂尚未有报道。因此发明一种亲水磁性介孔微球及制备方法成为迫切的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种亲水磁性介孔微球及其制备方法与应用。本发明制得的亲水磁性介孔微球具有磁场感应性好、特异性强等优点，在蛋白质组学等领域有良好的使用价值和应用前景。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

在磁性无机微粒表面以表面活性剂辅助的溶胶-凝胶法包覆卤原子修饰的介孔二氧化硅，在去除表面活性剂后采用叠氮化钠修饰，最后利用点击化学将炔基化糖类固定在磁性介孔微球表面获得亲水磁性介孔微球。制备方法包括以下步骤：

（1）将磁性无机微粒分散在有机表面活性剂和催化剂的混合溶液中，然后向该溶液中添加硅烷前驱体的醇溶液，利用溶胶-凝胶反应在磁性无机微粒表面包覆上一层具有有序介观结构的功能化二氧化硅/表面活性剂复合材料，最后通过溶剂萃取除去有机表面活性剂，即得到表面功能化的磁性介孔复合微球；所合成的磁性介孔复合微球的大小为10 nm ~ 1μm，具体通过调节磁性无机微粒的大小、包覆的功能化介孔二氧化硅的厚度来实现；

（2）通过溶剂萃取，在回流条件下得到表面带有氯丙基或溴丙基的磁性介孔微球；

（3）将步骤（2）的磁性介孔微球分散在叠氮化钠的饱和溶液中，在加热条件下反应，得到叠氮化磁性介孔微球；

（4）炔基化糖类的制备：在四氢呋喃中加入醛糖、溴丙炔和金属盐类，在10~15℃冰浴和搅拌下分批加入锌粉，在室温下继续搅拌反应1~24h，向溶液中加入碳酸钠溶液，至溶液中的金属盐类完全沉淀，过滤后得到炔基化糖溶液；

（5）将叠氮化磁性介孔微球分散在水中，加入炔基化糖溶液与催化剂，利用点击化学反应，在室温下反应得到亲水磁性介孔微球。

步骤（1）中所述的磁性无机微粒可为纳米级也可为微米级，可参照文献（Deng, H.; Li, X.; Peng, Q.; Wang, X. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 2782–2785）合成，亦可使用商品化磁性微球；

所述的有机表面活性剂为非离子型表面活性剂或离子型表面活性剂；非离子型表面活性剂为含聚醚的小分子C_nH_2n+1EO_m，n=5-12、m=10-20中的一种或几种；离子型表面活性剂为烷基季铵盐类表面活性剂C_nTAB或C_nTAC，n=12-18中的一种或几种；

所述的硅烷前驱体为四甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷中的一种和氯丙基三甲氧基硅烷、氯丙基三乙氧基硅烷、溴丙基三甲氧基硅烷、溴丙基三乙氧基硅烷中的一种的混合物；

所述的催化剂为酸性催化剂或碱性催化剂；碱性催化剂为氢氧化钠、氢氧化钾或氨水中的一种或几种；酸性催化剂为醋酸、盐酸中的一种或几种；

所使用的溶剂为烷基醇与水的混合溶液，其中烷基醇为甲醇、乙醇、异丙醇的一种或几种；烷基醇与水的体积比为0~9：1。

步骤（2）中所使用的溶剂为甲醇、乙醇或丙酮的一种或几种。

步骤（4）中所述的醛糖为含醛基的单糖、二糖或多糖；所述的金属盐类为氯化铁、氯化锌、氯化铜或它们的水合物；醛糖、溴丙炔、金属盐类和锌粉的摩尔比为1~3：3：3：3。

步骤（5）中所述的催化剂为硫酸铜和抗坏血酸钠，所用的摩尔量分别为醛糖摩尔量的1~10%和2~40%。

本发明制得的亲水磁性介孔微球用于分离或富集糖基化肽段，其可直接放入含有糖基化肽段的复杂肽段混合物中，无需特殊处理；糖基化肽段吸附到材料上后，无需离心分离，采用简单磁性作用即可实现糖肽的特异性分离富集。

本发明的显著优点在于：本发明制得的亲水磁性介孔微球具有磁场感应性好、特异性强等优点，在蛋白质组学等领域有良好的使用价值和应用前景。

附图说明

图1为实施例1所合成的亲水磁性介孔微球的扫描电镜图。

图2为实施例1所合成的亲水磁性介孔微球的透射电镜图。

图3为实施例1所合成的含有CTAB的磁性介孔微球(a)、氯丙基修饰的磁性介孔微球(b)、叠氮化磁性介孔微球(c)和亲水磁性介孔微球(d)的红外谱图。

图4为实施例1所合成的磁性微球(a)和亲水磁性介孔微球(b)的磁滞回线图。

图5a为实施例1所合成的亲水磁性介孔微球富集40 μg/mL 辣根过氧化酶的胰蛋白酶酶解肽段前的ESI-Q-TOF 质谱图。（糖基化肽段用*表示，无标示的均为非糖基化肽段）。

图5b为实施例1所合成的亲水磁性介孔微球富集40 μg/mL 辣根过氧化酶的胰蛋白酶酶解肽段后的ESI-Q-TOF 质谱图。（糖基化肽段用*表示，无标示的均为非糖基化肽段）。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。本发明采用的原材料可在市场购得，或可用本领域已知的方法合成。

实施例1 亲水磁性介孔微球的合成

水热法合成磁性微球：采用6.8克FeCl₃·6H₂O，加入12.0克醋酸钠作为分散剂，在200mL乙二醇溶液中混匀，添加2.0克二水柠檬酸三钠，然后将该溶液移入密闭加热容器中，在200℃条件下进行溶剂热反应，加热时间7 h，得到四氧化三铁磁性微球。将产物洗涤干净后，在60℃下真空干燥12 h。

氯丙基修饰的磁性介孔微球的制备：取300 mg Fe₃O₄磁性微球，超声分散在580 mL二次水中，加入1.0 g CTAB、24 mg NaOH。在60℃水浴中，机械搅拌下滴加硅烷前驱体的乙醇溶液（四乙氧基硅烷、氯丙基三乙氧基硅烷和乙醇分别为8 mL、4 mL和8 mL）。滴加后继续搅拌12小时。

溶剂萃取法去除表面活性剂：将上述所得的复合磁球在60 mL乙醇中萃取2 h五次以除去表面活性剂。

叠氮化磁性介孔微球的制备：将上述磁性介孔微球分散在100 mL N, N-二甲基甲酰胺（DMF）中，加入2 g 叠氮化钠，在80 ℃下搅拌反应24 h，得到叠氮化磁性介孔微球。

炔基化葡萄糖的制备：在四氢呋喃中加入0.90 g葡萄糖、1.6 mL溴丙炔（80 wt%甲苯溶液）和2.43 g氯化铁，在10~15℃冰浴和搅拌下分批加入锌粉，在室温下继续搅拌反应12 h。向溶液中加入碳酸钠溶液，至溶液中的金属盐类完全沉淀，过滤后得到炔基化糖溶液。

亲水磁性介孔微球的制备：将叠氮化磁性介孔微球分散在水溶液中，加入上述炔基化葡萄糖、372 mg五水硫酸铜和892 mg抗坏血酸钠，利用点击化学反应，在室温下反应12 h得到亲水磁性介孔微球。将产物洗涤干净后，在60℃下真空干燥12 h。

实施例2性能测试

图1为实施例1中所合成的亲水磁性介孔微球的扫描电镜图中可以看出四氧化三铁纳米粒子的粒径在200 nm左右，分散性良好。

图2为实施例1得到的亲水磁性介孔微球的透射电镜图，可以看出其具有明显的核-壳结构且壳具有垂直有序介孔结构，说明磁性纳米粒子在溶胶-凝胶反应后成功地包覆上介孔SiO₂壳。

图3为实施例1所合成的含有CTAB的磁性介孔微球(a)、氯丙基修饰的磁性介孔微球(b)、叠氮化磁性介孔微球(c)和亲水磁性介孔微球(d)的红外谱图。在(a)中出现了明显的Si-O-Si的振动吸收峰（1090cm^-1），表明溶胶-凝胶反应顺利进行。同时，在(a)中出现了很强的甲基、亚甲基的振动吸收峰（2963 cm^-1、2921 cm^-1、2894 cm^-1），说明磁性介孔微球表面存在大量CTAB。而在(b)中甲基、亚甲基的振动吸收峰基本消失，说明CTAB在溶剂萃取过程中基本被除去。在(c)中出现了典型的叠氮基团吸收峰（2100 cm^-1），说明叠氮化磁性介孔微球的成功合成。在(d)中，叠氮基团吸收峰消失，而甲基、亚甲基的振动吸收峰增强，表明磁性介孔微球表面的叠氮基与炔基化葡萄糖完全反应，从而得到表面固定有葡萄糖的亲水磁性介孔微球。

图4为实施例1所合成的磁性微球(a)和亲水磁性介孔微球(b)的磁滞回线图。可见化学修饰前后磁球都具有很好的超顺磁性。

实施例3 亲水磁性介孔微球用于糖基化肽段的富集

取20 μL浓度为2 μg/μL 辣根过氧化酶（HRP）胰蛋白酶酶解的肽段混合物，配制为1 mL浓度为40 ng/μL的HRP溶液（80% 乙腈和0.2% (v/v)醋酸的水溶液），加入0.1 mg的亲水磁性介孔微球，在室温下振荡30分钟；在磁场作用下分离上清液和富集了糖基化肽段的微球。用80%乙腈水溶液（含0.2% (v/v)醋酸）清洗材料，再用40 μL 20%乙腈水溶液（含0.2% (v/v)醋酸）洗脱所富集的糖基化肽段。取10 μL洗出液，使用ESI-Q-TOF质谱检测。由图5所示，富集后检测到的糖基化肽段数量从4条增加到10条（对应的质谱峰数目分别为5个和14个），并且它们的质谱信号强度大大增强，说明实施例1所合成的亲水磁性介孔微球可对糖基化肽段进行选择性富集。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种亲水磁性介孔微球，其特征在于：在磁性无机微粒表面以表面活性剂辅助的溶胶-凝胶法包覆卤原子修饰的介孔二氧化硅，在去除表面活性剂后采用叠氮化钠修饰，最后利用点击化学将炔基化糖类固定在磁性介孔微球表面获得亲水磁性介孔微球。

2. 一种制备如权利要求1所述的亲水磁性介孔微球的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将磁性无机微粒分散在有机表面活性剂和催化剂的混合溶液中，然后向该溶液中添加硅烷前驱体的醇溶液，利用溶胶-凝胶反应在磁性无机微粒表面包覆上一层具有有序介观结构的功能化二氧化硅/表面活性剂复合材料，最后通过溶剂萃取除去有机表面活性剂，即得到表面功能化的磁性介孔复合微球；

3.根据权利要求2所述的亲水磁性介孔微球的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所合成的磁性介孔复合微球的大小为10 nm ~ 1μm，具体通过调节磁性无机微粒的大小、包覆的功能化介孔二氧化硅的厚度来实现。

4.根据权利要求2所述的亲水磁性介孔微球的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的有机表面活性剂为非离子型表面活性剂或离子型表面活性剂；非离子型表面活性剂为含聚醚的小分子C_nH_2n+1EO_m，n=5-12、m=10-20中的一种或几种；离子型表面活性剂为烷基季铵盐类表面活性剂C_nTAB或C_nTAC，n=12-18中的一种或几种；

5.根据权利要求2所述的亲水磁性介孔微球的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所使用的溶剂为甲醇、乙醇或丙酮的一种或几种。

6.根据权利要求2所述的亲水磁性介孔微球的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述的醛糖为含醛基的单糖、二糖或多糖；所述的金属盐类为氯化铁、氯化锌、氯化铜或它们的水合物；醛糖、溴丙炔、金属盐类和锌粉的摩尔比为1~3：3：3：3。

7.根据权利要求2所述的亲水磁性介孔微球的制备方法，其特征在于：步骤（5）中所述的催化剂为硫酸铜和抗坏血酸钠，所用的摩尔量分别为醛糖摩尔量的1~10%和2~40%。

8.一种如权利要求1所述的亲水磁性介孔微球的应用，其特征在于：亲水磁性介孔微球用于分离或富集糖基化肽段。