CN104707991A - 磁性氧化石墨烯纳米银复合材料及制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种糖肽特异性富集的磁性氧化石墨烯纳米银复合材料制备。根据氧化石墨烯和氨基四氧化三铁之间共价反应，制备磁性氧化石墨烯。磁性氧化石墨烯作为载体，聚乙烯亚胺作为还原剂和稳定剂，在其表面原位生成和固定纳米银颗粒。磁性氧化石墨烯纳米银复合材料作为亲水固定相用于糖肽特异性富集。在该方法中，磁性氧化石墨烯纳米银复合材料成功用于糖肽亲水富集。该发明在蛋白质组学有较好的应用前景和实用价值。

Description

磁性氧化石墨烯纳米银复合材料及制备和应用

技术领域

本发明涉及一种磁性氧化石墨烯纳米银复合材料及其制备方法，用于亲水模式糖肽特异性富集。

背景技术

蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰，在很多生物过程中起重要作用。目前基于质谱技术的糖肽鉴定和解析是研究糖蛋白组学的重要手段，然而糖肽的低丰度和非糖肽的强烈离子抑制作用严重干扰糖肽鉴定。因此有必要在质谱分析前对低丰度的糖肽进行特异性富集。亲水作用色谱已经成功用于糖肽富集，相比于其他富集方法，亲水作用色谱具有重复性好，灵敏度高，与质谱兼容的优点。然而非糖肽的共洗脱是亲水富集过程中不可避免的。为解决这一问题，除了添加离子对试剂外，发展具有优异亲水性的富集材料是最实用的解决方案。目前有文献报道利用具有优异亲水性能的纳米银和糖肽糖苷羟基之间多相互反应来亲水富集糖肽（J.Mater.Chem.,2012,22,23981-23988）。但是目前基于聚合物基质纳米银复合材料银固载量小，而且不可避免存在非特异性吸附，因此有必要发展新型纳米银复合材料。

自2004年发现以来，石墨烯作为一种新型二维单原子厚度材料成为当今研究的热点。作为石墨烯的一种重要衍生物，氧化石墨烯由于其优异的物理化学性质，在生物分析领域受到越来越广泛的研究。氧化石墨烯不仅具有比表面积大，易于化学修饰的优点，而且具有良好的亲水性和生物兼容性。这些优点使氧化石墨烯成为金属和金属氧化物的理想载体。因此在本专利中，发展了纳米银修饰氧化石墨烯复合纳米材料，并用于亲水富集糖肽和糖苷。

发明内容

为制备磁性氧化石墨烯纳米银复合，本发明采用的技术方案为：

以氧化石墨烯和氨基四氧化三铁进行共价反应，制备磁性氧化石墨烯，其中，磁性氧化石墨烯作为载体，聚乙烯亚胺作为还原剂和稳定剂，在磁性氧化石墨烯表面原位生成和固定纳米银颗粒。

具体制备过程为：

1)磁性氧化石墨烯制备（GO/Fe₃O₄）：利用氧化石墨烯表面羧基与氨基四氧化三铁氨基之间缩合反应，共价制备磁性氧化石墨烯；具体为，配置1mg/mL氧化石墨烯吗啡乙磺酸溶液，超声1-3h使GO彻底剥离形成均匀分散液，然后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为活化试剂，超声活化羧基1-3h，活化反应完成后加入2-20倍氧化石墨烯质量的氨基四氧化三铁，超声反应60-120min，制备磁性氧化石墨烯。磁性吸附除去未反应的氧化石墨烯，三次去离子水和乙醇交替清洗，真空干燥待用。

2)PEI修饰磁性氧化石墨烯制备：

磁性氧化石墨烯表面原位生成和固定纳米银：聚乙烯亚胺作为还原和稳定剂用于在磁性氧化石墨烯表面原位生成和固定纳米银；具体为，取步骤(1)制备的磁性氧化石墨烯1份，加入2到200倍磁性氧化石墨烯质量的聚乙烯亚胺(PEI)，，强烈振荡1-10h，利用聚乙烯亚胺和磁性氧化石墨烯之间氢键相互作用，在磁性氧化石墨烯表面吸附聚乙烯亚胺。反应结束后，磁性吸附去除未反应PEI，然后分散于去离子水。

3)磁性氧化石墨烯表面原位生成和固定纳米银：在2)制备的PEI修饰磁性氧化石墨烯分散液中加入AgNO₃，硝酸银质量是磁性氧化石墨烯2到200倍，振荡均匀后，在60-120℃水浴中反应60-240min，反应结束后，制备得到磁性氧化石墨烯纳米银复合材料。磁性吸附，三次去离子水和乙醇交替清洗，空干燥待用。

4)磁性氧化石墨烯纳米银复合材料加入过氧化氢辣根酶酶解肽段溶液中(80%乙腈，0.1%甲酸，10mM碳酸氢铵)，吸附时间为1min，3次80%乙腈，0.1%甲酸，10mM碳酸氢铵清洗；60%乙腈，0.1%甲酸，10mM碳酸氢铵作为洗脱溶剂，洗脱时间为1min。洗脱液冷冻干燥后复溶于2,5-二羟基苯甲酸基质(60%乙腈,0.1%三氟乙酸)。

制备得到的磁性氧化石墨烯纳米银复合材料能够用于亲水模式糖肽特异性富集。

本发明具有如下优点：

1)磁性氧化石墨烯复合纳米材料用于纳米银颗粒固载，提高了纳米颗粒的固载量；

2)磁性氧化石墨烯纳米银复合材料用于亲水糖肽富集；开辟了亲水糖肽富集的新方法；

3)材料具备磁性，简化了糖肽富集的实验操作；

4)采用亲水富集的策略，能够快速吸附和洗脱糖肽。

附图说明

图1为磁性氧化石墨烯纳米银复合材料制备示意图。

图2为磁性氧化石墨烯纳米银复合材料透射电镜图。

图3为磁性氧化石墨烯纳米银复合材料X射线光电子能谱图

图4为0.1μg过氧化氢辣根酶酶解产物经过磁性氧化石墨烯纳米银复合材料富集前后基质辅助激光解析质谱图。

具体实施例1

1.磁性氧化石墨烯纳米银复合材料制备：按图1所示，利用氧化石墨烯与氨基四氧化三铁之间缩合反应制备磁性氧化石墨烯。称取10mg氧化石墨烯，加入40mL0.1M吗啡乙磺酸缓冲液（pH5.6），超声3h，使氧化石墨烯彻底剥离形成均匀分散液，然后加入192mg1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和115mg N-羟基琥珀酰亚胺，超声2h活化氧化石墨烯羧基，然后加入20mg氨基四氧化三铁，超声反应1h制备得到磁性氧化石墨烯复合材料。磁性吸附，三次去离子水和乙醇交替清洗，60℃真空干燥。

取1.5mg磁性氧化石墨烯分散于1mL去离子水中，加入30mg聚乙烯亚胺，然后强烈振荡1h，磁性吸附去除未反应聚乙烯亚胺，聚乙烯亚胺作为还原和固定试剂用于在磁性氧化石墨烯表面原位生成和固定纳米银。加入20mg硝酸银，振荡均匀后，在70℃水浴中反应1h。反应结束后，制备得到磁性氧化石墨烯纳米银复合材料，磁性吸附，三次去离子水和乙醇交替清洗，60℃真空干燥。

2.材料表征：图2为磁性氧化石墨烯纳米银复合材料透射电镜图，图3为磁性氧化石墨烯纳米银复合材料x-射线光电子能谱图（XPS）。

3.糖肽富集：20μg磁性氧化石墨烯纳米银复合材料加入50μL过氧化氢辣根酶酶解肽段溶液中(80%乙腈，0.1%甲酸，10mM碳酸氢铵)，吸附时间为1min，3次20μL80%乙腈，0.1%甲酸，10mM碳酸氢铵清洗；20μL50%乙腈，0.1%甲酸，10mM碳酸氢铵作为洗脱溶剂，洗脱时间为1min。洗脱液冷冻干燥后复溶于1μL2,5-二羟基苯甲酸基质(60%乙腈,0.1%三氟乙酸)，1μL进基质辅助激光解析质谱分析，富集前、后质谱图见图4，富集后9条糖肽被鉴定到，质荷比3000以下非糖肽得到很好的去除，富集到糖肽见表1。

具体实施例2

1.磁性氧化石墨烯纳米银复合材料制备：按图1所示，利用氧化石墨烯与氨基四氧化三铁之间缩合反应制备磁性氧化石墨烯。称取20mg氧化石墨烯，加入40mL0.1M吗啡乙磺酸缓冲液(pH5.6)，超声3h，使氧化石墨烯彻底剥离形成均匀分散液，然后加入192mg1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和115mg N-羟基琥珀酰亚胺，超声2h活化氧化石墨烯羧基，然后加入100mg氨基四氧化三铁，超声反应1h制备得到磁性氧化石墨烯复合材料。磁性吸附，三次去离子水和乙醇交替清洗，60℃真空干燥。

取3mg磁性氧化石墨烯分散于1mL去离子水中，加入30mg聚乙烯亚胺，然后强烈振荡1h，磁性吸附去除未反应聚乙烯亚胺，聚乙烯亚胺作为还原和固定试剂用于在磁性氧化石墨烯表面原位生成和固定纳米银。加入20mg硝酸银，振荡均匀后，在70℃水浴中反应1h。反应结束后，制备得到磁性氧化石墨烯纳米银复合材料，磁性吸附，三次去离子水和乙醇交替清洗，60℃真空干燥。

2.糖肽富集：20μg磁性氧化石墨烯纳米银复合材料加入50μL过氧化氢辣根酶酶解肽段溶液中(80%乙腈，0.1%甲酸，10mM碳酸氢铵)，吸附时间为1min，3次20μL80%乙腈，0.1%甲酸，10mM碳酸氢铵清洗；20μL60%乙腈，0.1%甲酸，10mM碳酸氢铵作为洗脱溶剂，洗脱时间为1min。洗脱液冷冻干燥后复溶于1μL2,5-二羟基苯甲酸基质(60%乙腈,0.1%三氟乙酸)，1μL进基质辅助激光解析质谱分析，富集到糖肽见表1。

表1：过氧化氢辣根酶酶解产物经过磁性氧化石墨烯纳米银复合材料富集后糖肽氨基酸序列和糖苷结构。

Claims (5)

1.一种磁性氧化石墨烯纳米银复合材料，其特征在于：以氧化石墨烯和氨基四氧化三铁进行共价反应，制备磁性氧化石墨烯，其中，磁性氧化石墨烯作为载体，聚乙烯亚胺作为还原剂和稳定剂，在磁性氧化石墨烯表面原位生成和固定纳米银颗粒。

2.一种磁性氧化石墨烯纳米银复合材料的制备方法，其特征在于：以氧化石墨烯和氨基四氧化三铁进行共价反应，制备磁性氧化石墨烯，其中，磁性氧化石墨烯作为载体，聚乙烯亚胺作为还原剂和稳定剂，在磁性氧化石墨烯表面原位生成和固定纳米银颗粒。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

其制备过程包括：

1)磁性氧化石墨烯制备(GO/Fe₃O₄)：利用氧化石墨烯表面羧基与氨基四氧化三铁氨基之间缩合反应，共价制备磁性氧化石墨烯；具体为，配置1mg/mL氧化石墨烯吗啡乙磺酸溶液，超声1-3h使GO彻底剥离形成均匀分散液，然后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为活化试剂，超声活化羧基1-3h，活化反应完成后加入2-20倍氧化石墨烯质量的氨基四氧化三铁，超声反应60-120min，制备磁性氧化石墨烯，磁性吸附除去未反应的氧化石墨烯，三次去离子水和乙醇交替清洗，真空干燥待用；

2)磁性氧化石墨烯表面原位生成和固定纳米银（GO/Fe₃O₄/Ag）：聚乙烯亚胺作为还原和稳定剂用于在磁性氧化石墨烯表面原位生成和固定纳米银。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：

步骤2）中具体为，取步骤(1)制备的磁性氧化石墨烯1份，加入2到200倍磁性氧化石墨烯质量的聚乙烯亚胺(PEI)，强烈振荡1-10h，利用聚乙烯亚胺和磁性氧化石墨烯之间氢键相互作用，在磁性氧化石墨烯表面吸附聚乙烯亚胺。反应结束后，磁性吸附去除未反应聚乙烯亚胺，然后分散于去离子水，然后加入2到200倍磁性氧化石墨烯质量的硝酸银，振荡均匀后，在60-120℃水浴中反应60-240min，反应结束后，制备得到磁性氧化石墨烯纳米银复合材料，磁性吸附，三次去离子水和乙醇交替清洗，空干燥，即可得到磁性氧化石墨烯纳米银复合材料。

5.一种权利要求1所述磁性氧化石墨烯纳米银复合材料的应用，其特征在于：用于亲水模式糖肽特异性富集。