CN108939087B - 一种纳米银复合物的制备方法及其应用 - Google Patents

一种纳米银复合物的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种纳米银复合物的制备方法及其应用，所述纳米银复合物的制备方法包括以下步骤：步骤S10、将纳米银与柠檬酸钠在HEPES缓冲液中反应，制得羧基化纳米银；步骤S20、将1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐与所述羧基化纳米银混合后加水溶解，形成混合溶液，向所述混合溶液中加入聚乙烯亚胺并使之溶解，然后在避光条件下反应制得纳米银‑聚乙烯亚胺复合材料；步骤S30、将活性叶酸酯与所述纳米银‑聚乙烯亚胺复合材料在避光条件下反应，制得纳米银‑叶酸酯复合物。本发明制备的纳米银复合物具有显著的抗肿瘤活性，可用于制备具有抗肿瘤功效的药物。

Description

一种纳米银复合物的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及药物合成技术领域，特别涉及一种纳米银复合物的制备方法及其应用。
背景技术
纳米技术是现今发展最快和最有前途的新技术之一，纳米材料的优异特性取决于材料本身具有的微观结构，具体来说大致可以分为量子尺寸效应、表面效应、小尺寸效应以及宏观量子隧道效应等，正因为有如此多的效应，故此类材料可显示出不同于一般材料的热光电磁催化与敏感等特性。
金属纳米材料由于其独特的性质而受到各界的关注与研究。金属纳米材料可以与生物靶向分子、荧光探针或者抗肿瘤药物等相结合实现金属纳米材料的多功能化，因此在癌症的靶向治疗、诊断、多模式成像等方面均有一定应用范围。金属纳米材料具有稳定的物理和化学性能，表面活性位点多、小尺寸、表面积大、催化效率、活性高以及吸附能力较强等优点，经过人工设计后对金属纳米材料进行靶向性和稳定化修饰后即可能制备出金属纳米复合材料，其在分子成像、特异性靶向药物输送、基因转染等生物医学领域中均得能得到应用。
纳米银(AgNPs)使指将粒径做到纳米级的金属银单质，其显示出不同于常规材料的多种特性，因其很稳定的物理和化学性能，表面积大、尺寸极小、表面活性位点多、活性高、催化效率高以及吸附能力强等优点，越来越被社会所关注。与普通银相比，AgNPs在电学、光学和催化等众多方面具有更优异的性能，现已广泛应用于陶瓷材料、环保材料和涂料等许多领域。
在癌症治疗方面，AgNPs同样有着良好的杀伤能力，其杀伤能力与粒径大小与表面功能有关，粒径越小，穿透性越强，杀伤能力也就越强。AgNPs粒子表面的原子数多，周围缺少相邻原子，存在许多空键，具有很强的吸附能力和很高的化学活性。由于其本身直径微小，有独特的量子效应、小尺寸效应和极大的比表面积能够透过生物膜上的孔隙进入癌细胞内，随后进入线粒体、细胞核等细胞器内，并且和蛋白质、脂类等生物大分子发生结合，影响癌细胞的正常生理功能。但是实际应用中，现有的AgNPs产品的抗肿瘤活性较低。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种纳米银复合物的制备方法及其应用，旨在提高所制备的纳米银复合物的抗肿瘤活性。
为实现上述目的，本发明提出一种纳米银复合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤S10、将纳米银与柠檬酸钠在HEPES缓冲液中反应，制得羧基化纳米银；
步骤S20、将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与所述羧基化纳米银混合后加水溶解，形成混合溶液，向所述混合溶液中加入聚乙烯亚胺并使之溶解，然后在避光条件下反应制得纳米银-聚乙烯亚胺复合材料；
步骤S30、将活性叶酸酯与所述纳米银-聚乙烯亚胺复合材料在避光条件下反应，制得纳米银-叶酸酯复合物。
优选地，在步骤S10中：
所述纳米银与柠檬酸钠的质量比为2：1；和/或，
所述HEPES缓冲液的浓度为0.02mol/L，所述HEPES缓冲液的温度为4℃，所述HEPES缓冲液pH值为7.0。
优选地，步骤S10具体包括：
步骤S11、将纳米银和柠檬酸钠加入HEPES缓冲液中，形成反应液，将所述反应液在超声环境中反应30～40min，得到生成有沉淀物的反应产物；
步骤S12、分离出所述反应产物中的沉淀物，并使用HEPES缓冲液洗涤，获得羧基化纳米银。
优选地，在步骤S20中：
所述羧基化纳米银与所述聚乙烯亚胺的质量比为1：4。
优选地，步骤S20具体包括：
步骤S21、将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与所述羧基化纳米银混合后加水溶解，形成混合溶液；
步骤S22、向所述混合溶液中加入聚乙烯亚胺后进行超声分散，然后在避光条件下，置于36～38℃、210～230rpm的恒温摇床上反应10～12h，得到生成有固体产物的混合液；
步骤S23、分离出所述混合液中的固体产物，并使用HEPES缓冲液洗涤，获得纳米银-聚乙烯亚胺复合材料。
优选地，在步骤S30中：
所述活性叶酸酯与所述纳米银-聚乙烯亚胺复合材料的质量比为2：1。
优选地，步骤S30具体包括：
步骤S31、将活性叶酸酯与所述纳米银-聚乙烯亚胺复合材料混合后，在避光条件下，置于36～38℃、210～230rpm的恒温摇床上反应10～12h，得到生成有固体沉淀的混合物；
步骤S32、分离出所述混合物中的固体沉淀，并洗涤所述固体沉淀，获得纳米银-叶酸酯复合物。
优选地，步骤S32中所说的洗涤所述固体沉淀的步骤包括：
先使用二甲基亚砜洗涤5～7次，然后使用HEPES缓冲液洗涤2～3次。
优选地，在步骤S31之前，还包括：
步骤S301、将叶酸溶解于二甲基亚砜后，再加入三乙胺混合，形成备用溶液；
步骤S302、将N-羟基琥珀酰亚胺溶解于二甲基亚砜后加入所述备用溶液中分散，然后在避光条件下，置于36～38℃、230～250rpm的恒温摇床上反应10～12h，制得活性叶酸酯。
本发明还提出如上所述的纳米银复合物的制备方法制得的纳米银复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明提供的技术方案中，先将纳米银通过羧基化反应制成羧基化纳米银，然后将羧基化纳米银与聚乙烯亚胺反应，制成纳米银-聚乙烯亚胺复合材料，再将纳米银-聚乙烯亚胺复合材料与活性叶酸酯反应，制得纳米银-叶酸酯复合物，所制得的纳米银-叶酸酯复合物能够抑制癌细胞增殖并诱导癌细胞凋亡，具有显著的抗肿瘤活性，可用于制备具有抗肿瘤功效的药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中AgNPs、AgNPs-PEI和AgNPs-PF的紫外扫描检测结果图；
图2为实施例1制备的AgNPs-PEI的FTIR检测结果图；
图3为实施例1制备的AgNPs-PF的FTIR检测结果图；
图4为实施例1制备的AgNPs-PF的SEM检测结果图；
图5为实施例1制备的AgNPs-PF的AFM检测结果图；
图6为应用实施例中MTT法的检测结果图；
图7为应用实施例中ROS法的检测结果图；
图8为图7中对应的平均荧光强度结果图；
图9为应用实施例中JC-1法的检测结果图；
图10为图9中对应的平均荧光强度结果图；
图11为应用实施例中细胞免疫荧光法观测到的Rad51蛋白的观测结果图；
图12为图11中对应的Rad51蛋白的平均荧光强度结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
纳米银(AgNPs)使指将粒径做到纳米级的金属银单质，可用于治疗癌症治疗，但是现有技术中的AgNPs产品的抗肿瘤活性不高，为解决上述问题，本发明提出一种纳米银复合物的制备方法，其是以AgNPs为原料，先通过羧基化反应制成羧基化AgNPs(AgNPs-COOH)，然后将AgNPs-COOH与聚乙烯亚胺(PEI)反应，制成AgNPs-PEI，再将AgNPs-PEI与活性叶酸酯(PF)反应，成功制得具有显著抗肿瘤活性的纳米银复合物AgNPs-PF。在本发明提供的纳米银复合物的制备方法的一实施例中，所述纳米银复合的制备方法包括以下步骤：
步骤S10、将AgNPs与柠檬酸钠在HEPES缓冲液中反应，制得AgNPs-COOH；
HEPES的中文全称是4-羟乙基哌嗪乙磺酸，HEPES缓冲液是指将HEPES溶解于蒸馏水中所配制的溶液，是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围，常用于细胞培养基中的添加成分，通常于4℃保存，在本实施例中，所选用的HEPES缓冲液的浓度为0.02mol/L，所述HEPES缓冲液的温度为4℃，所述HEPES缓冲液pH值为7.0，所述AgNPs与柠檬酸钠在此环境条件下反应可成功对应生成AgNPs-COOH。
进一步地，AgNPs与柠檬酸钠在HEPES缓冲液中反应时，所述AgNPs与柠檬酸钠的质量比为2：1，所述AgNPs与HEPES缓冲液的固液比为1mg：1mL，也即，每1mg所述AgNPs需对应加入HEPES缓冲液1mL。
在本实施例中，步骤S10中的所述AgNPs与柠檬酸钠在HEPES缓冲液中的反应优选为在震荡作用下进行，例如在超声震荡机中进行，有利于使反应充分进行，提高反应效率，在具体操作时包括以下步骤：
步骤S11、将AgNPs和柠檬酸钠加入HEPES缓冲液中，形成反应液，将所述反应液在超声机中反应30～40min，得到生成有沉淀物的反应产物；
步骤S12、分离出所述反应产物中的沉淀物，并使用HEPES缓冲液洗涤，获得羧基化AgNPs。
在步骤S11中，所述反应液在超声机中的反应在常温下进行即可，所述超声机的超声功率设置为300W(本实施例中其他用到超声机的步骤中，超声时的温度和频率设置均与此相同)。在步骤S12中，分离出所述沉淀物的方法可以采用本领域常规的固液分离手段，例如过滤或者离心等，优选为离心，具有固液分离率高、操作便捷的优点，以下将以本实施例中所有的使固液分离的方式均采用离心的方式进行为例进行说明。在离心获得所述沉淀物后，使用HEPES缓冲液进行洗涤，优选为洗涤多次，以彻底去除杂质，在本实施例中，洗涤3～5次即可，每次洗涤完毕后，使用精密移液器将上清液和少许杂质移除，然后再加入HEPES缓冲液进行下一次洗涤，其中，用来进行洗涤的所述HEPES缓冲液同样选用浓度为0.02mol/L、温度为4℃、pH值为7.0的HEPES缓冲液；在分离出所述沉淀物以及洗涤过程中的所有离心处理，离心速率可设置为10000rpm，每次离心5～7min。最终所得到的AgNPs-COOH保存于HEPES缓冲液中，然后用不透光的材料包裹起来，避光保存于温度设置为4℃的冰箱中。
步骤S20、将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与所述AgNPs-COOH混合后加水溶解，形成溶液，向所述溶液中加入PEI并使之溶解，然后在避光条件下反应制得AgNPs-PEI；
由于所述AgNPs-COOH保存于HEPES缓冲液中，在与所述EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)混合时，可以直接吸取一定体积的AgNPs-COOH储存液(AgNPs-COOH保存于HEPES缓冲液形成的溶液)，然后加入少量去离子水，摇匀以使所述EDC完全溶解，即形成步骤S20中的所述溶液；在向所述溶液中加入PEI时，以所述AgNPs-COOH储存液中的AgNPs-COOH质量为准，使所述AgNPs-COOH与所述PEI的质量比为1：4，然后用不透光的材料包裹以进行避光处理，然后置于预设条件下进行反应，反应后生成的固体产物即为AgNPs-PEI。
在本实施例中，步骤S20具体包括：
步骤S21、将EDC与所述AgNPs-COOH混合后加水溶解，形成混合溶液；
步骤S22、向所述混合溶液中加入PEI后进行超声分散，然后在避光条件下，置于36～38℃、210～230rpm的恒温摇床上反应10～12h，得到生成有固体产物的混合液；
步骤S23、分离出所述混合液中的固体产物，并使用HEPES缓冲液洗涤，获得AgNPs-PEI。
先量取一定体积的AgNPs-COOH储存液，然后向所述AgNPs-COOH储存液中加入EDC以及少量去离子水，摇匀后形成所述混合溶液备用；再向所述混合溶液中加入与AgNPs-COOH的质量比为4：1的PEI，在超声机中超声15～20min后，用不透光的材料包裹以进行避光处理，然后放入温度为36～38℃、转速为210～230rpm的恒温摇床中反应过夜；反应完毕后，通过离心收集固体产物，并使用HEPES缓冲液洗涤固体产物4～6次，每次洗涤完毕后，使用精密移液器将上清液和少许杂质移除，然后再加入HEPES缓冲液进行下一次洗涤，其中，用来进行洗涤的所述HEPES缓冲液同样选用浓度为0.02mol/L、温度为4℃、pH值为7.0的HEPES缓冲液；在分离出所述沉淀物以及洗涤过程中的所有离心处理，离心速率可设置为10000rpm，每次离心5～7min。最终所得到的AgNPs-PEI保存于HEPES缓冲液中，然后用不透光的材料包裹起来，避光保存于温度设置为4℃的冰箱中。
步骤S30、将活性PF与所述AgNPs-PEI在避光条件下反应，制得AgNPs-PF。
所述活性PF是指将叶酸(FA)活化制得的产物，通常是由DCC(二环己基碳二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)与FA反应所得，由于所述活性PF的稳定性不佳，在本实施例中，优选在步骤S20之后、步骤S30之前，即时制备所述活性PF，其制备方法包括以下步骤：
步骤S301、将FA溶解于二甲基亚砜后，再加入三乙胺(TEA)混合，形成备用溶液；
步骤S302、将NHS溶解于二甲基亚砜后加入所述备用溶液中分散，然后在避光条件下，置于36～38℃、230～250rpm的恒温摇床上反应10～12h，制得活性PF。
将FA加入适量二甲基亚砜(DMSO)中后摇匀以使所述叶酸充分溶解，然后向其中加入TEA，再次摇匀以使TEA充分溶解而形成所述备用溶液；将NHS加入适量DMSO中后，在超声机中超声5～7min，以使所述NHS完全溶解，随后加入到所述备用溶液中，在超声机中超声分散15～30min后，再使用不透光的材料包裹起来以实现避光处理，然后放入温度为36～38℃、转速为230～250rpm的恒温摇床中反应过夜，即制得所述活性PF，避光保存于温度设置为4℃的冰箱中。
在成功制得所述活性PF之后，再以所制得的活性PF为原料与AgNPs-PEI进行反应，以制备成AgNPs-PF。在本实施例中，在步骤S31中：所述活性PF与所述AgNPs-PEI的质量比为2：1。
进一步地，在本实施例中，步骤S30具体包括：
步骤S31、将活性PF与所述AgNPs-PEI混合后，在避光条件下，置于36～38℃、210～230rpm的恒温摇床上反应10～12h，得到生成有固体沉淀的混合物；
步骤S32、分离出所述混合物中的固体沉淀，并洗涤所述固体沉淀，获得AgNPs-PF。
将所述活性PF与所述AgNPs-PEI按照比例混合后，使用不透光的材料包裹起来以实现避光处理，然后放入温度为36～38℃、转速为210～230rpm的恒温摇床中反应过夜；反应完毕后，通过离心收集生成的固体沉淀，然后对所述固体沉淀进行洗涤，即可获得AgNPs-PF。所述AgNPs-PF在保存时，可先将获得的所述AgNPs-PF的产物干燥成为粉末状，然后放置在4℃的冰箱中避光保存，其干燥方式可以选用鼓风干燥、微波干燥或者是冷冻干燥等，优选为冷冻干燥，具有干燥效率高、不影响被干燥物质自身性质的优点。
在步骤S32中洗涤所述固体沉淀时，采用以下方式进行：先使用DMSO洗涤5～7次，其中，所述DMSO需用恒温水浴锅加热至36～38℃恒温后使用，其pH值为7.0，洗涤完毕后使用精密移液器将上清液和少许杂质移除；然后使用HEPES缓冲液洗涤2～3次，至上清液成无色即可，其中，所述HEPES缓冲液同样选用浓度为0.02mol/L、温度为4℃、pH值为7.0的HEPES缓冲液。
本发明提供的技术方案中，先将AgNPs通过羧基化反应制成AgNPs-COOH，然后将AgNPs-COOH与PEI反应，制成AgNPs-PEI，再将AgNPs-PEI与活性PF反应，制得纳米银复合物AgNPs-PF，所制得的纳米银复合物能够抑制癌细胞增殖并诱导癌细胞凋亡，具有显著的抗肿瘤活性，可用于制备具有抗肿瘤功效的药物。
本发明还提出如上所述的纳米银复合物的制备方法制得的纳米银复合物在制备抗肿瘤药物中的应用，本发明制备的纳米银复合物具有显著的抗肿瘤活性，可以通过抑制癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡，从而实现抗肿瘤的作用，应用前景广阔，尤其具有有效抑制卵巢癌细胞增殖、诱导卵巢癌细胞凋亡的生物活性。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
(1)AgNPs-COOH的制备
①称取10mg的AgNPs粉末和5mg的柠檬酸钠粉末，倒入10mL的浓度为0.02mol/L、温度为4℃、pH值为7.0的HEPES缓冲液(购自阿拉丁试剂(上海)有限公司)中，充分混合后在超声机中反应35min；
②待反应完毕后，在10000rpm下离心6min，收集反应生成的沉淀物，然后用HEPES缓冲液(0.02mol/L、4℃、pH 7.0)洗涤4次，制得AgNPs-COOH，避光保存于4℃的HEPES缓冲液中，形成AgNPs-COOH储备液，备用；其中，洗涤时每次使用5mL的HEPES缓冲液洗涤，洗涤完毕后利用精密移液器移除上清液，然后在10000rpm下离心6min后收集沉淀物进行下一次洗涤。
(2)AgNPs-PEI的制备
①取50mL的离心管(EP管)，采用精密移液器在EP管中加入5mL的AgNPs-COOH储备液(其中含有AgNPs-COOH共17.5mg)，再向EP管中加入40mg的EDC粉末和5mL的去离子水，摇匀备用；然后向EP管中加入70mg的PEI，在超声机中超声处理18min后，将EP管外部用不透光的薄膜包裹做避光处理，再将包裹好的EP管放入37℃、220rpm的恒温摇床中避光反应12h；
②待反应完毕后，在10000rpm下离心6min，收集反应生成的沉淀物，然后用HEPES缓冲液(0.02mol/L、4℃、pH 7.0)洗涤5次，制得AgNPs-PEI，避光保存于4℃的HEPES缓冲液中，备用；其中，洗涤时每次使用5～7mL的HEPES缓冲液洗涤，洗涤完毕后利用精密移液器移除上清液，然后在10000rpm下离心6min后收集沉淀物进行下一次洗涤。
(3)活性PF的制备
取50mL的EP管，称取250mg的FA加入到EP管中，然后用精密移液器移取5mL的DMSO加入到EP管中摇匀，再用精密移液器移取150μL的TEA加入到EP管中，摇匀备用；称取130mg的NHS加入1mL的DMSO中，在超声机中超声6min，然后加入到步骤①中备用的EP管中，在超声机中超声处理25min后，将EP管外部用不透光的薄膜包裹做避光处理，再将包裹好的EP管放入37℃、240rpm的恒温摇床中避光反应12h，制得活性PF，避光保存于4℃的冰箱中，备用；
(4)AgNPs-PF的制备
将步骤(3)制得的活性PF与步骤(2)制得的AgNPs-PEI按照2：1的质量比混合后，放入37℃、220rpm的恒温摇床中避光反应12h；待反应完毕后，先使用5～7mL的pH值为7.0、温度为37℃的DMSO洗涤6次，洗涤完毕后利用精密移液器移除上清液；然后使用5～7mL的HEPES缓冲液(0.02mol/L、4℃、pH 7.0)洗涤3次(至上清液呈无色即可)，即得AgNPs-PF(所制得的AgNPs-PF可利用冷冻干燥机干燥处理成粉末状，然后避光保存于4℃的冰箱中)。
采用X射线粉末衍射仪(XRD)、傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)、扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)和紫外光谱分析仪(UV-vis)检测实施例1中所制备的AgNPs-PEI以及AgNPs-PF的特性，检测结果如图1至图5所示。
其中，图1为AgNPs、AgNPs-PEI和AgNPs-PF的紫外扫描检测结果图，是在以AgNPs为原料在整个接枝反应过程中的UV-vis测量值。由图1可以看出，AgNPs、AgNPs-PEI和AgNPs-PF的紫外吸收光谱具有明显的区别，购买的AgNPs颗粒的最大吸收峰在244nm(颗粒粒径较小)，经过PEI修饰后其最大吸收峰在245nm，接枝叶酸FA后该物质最大吸收峰在246nm，均发生了一定程度的红移，最大吸收峰也随着接枝物的增加而相应变大；另外经过柠檬酸钠修饰与接枝聚乙烯亚胺PEI与叶酸FA后三类材料的吸收峰峰形并未发生明显宽展现象，说明材料的粒径在处理前后颗粒粒径有微量的增大，同时分散性良好并没有发生团聚现象。三类物质最大吸收峰均出现在几乎同一波长，由此可以推测，已成功构建纳米银复合材料AgNPs-PF。
图2为AgNPs-PEI的FTIR检测结果图，由图2可以看出，3420.00cm-1的波峰显示具有少量游离的-NH2，2851.97cm-1为亚甲基对称伸缩振动的特征吸收峰，1632.32cm-1的波峰是羰基的特征吸收峰νC＝O，即酰胺Ⅰ带的特征吸收峰(由于氮原子上未共用电子对与羰基的p-π共轭，使νC＝O伸缩振动频率降低出现在1690～1630cm-1)；1461cm-1处为亚甲基变形的特征吸收峰；1420.45cm-1与1399.97cm-1的波峰显示出νC-N谱带的特征(1420～1400cm-1范围有一个很强的碳氮键伸缩振动的吸收带)。1182.45cm-1和1119.96cm-1处吸收峰在阳离子化产物谱图中表现明显，该表现与C-N伸缩振动有关，上述FTIR检测结果说明该复合材料含阳离子酰胺类物质，也即，复合材料AgNPs-PEI已成功接枝上PEI。
图3为AgNPs-PF的FTIR检测结果图，由图3可以看出，3430.99cm-1的波峰显示具有少量游离的-NH2；2851.97cm-1的波峰为亚甲基对称伸缩振动的特征吸收峰；2925.79cm-1的波峰为甲基伸缩振动的特征吸收峰；1530.67cm-1和1510.39cm-1的两个波峰为δNH偶合形成的酰胺Ⅱ带特征吸收峰；1605.00cm-1的波峰为NH2的面内变形振动(在1655～1590cm-1)的特征吸收峰，靠近νC＝O；1150.93cm-1、750.81cm-1和620.80cm-1这三个波峰为NH2的摇摆振动吸收的特征吸收峰(伯酰胺在1150cm-1附近有一个弱吸收，在750～600cm-1有一个宽吸收)，上述FTIR光谱测量结果表明叶酸FA接枝成功，说明纳米银复合物AgNPs-PF构建成功。
图4为AgNPs-PF的SEM检测结果图(图4(a)是在1μm粒径下的观测结果，图4(b)为图4(a)中所示的虚线框区域的放大至500nm直径下的观测结果图)，由图4可以看出，本实施例制备的AgNPs-PF呈现出椭圆状鳄梨，且大小分布较为均匀，出现了一定的团聚现象。
图5为AgNPs-PF的AFM检测结果以及统计图。原子力显微镜(AFM)是一种检测AgNPs-PF形态学特征的重要技术，该技术可观测以及评估被测物质、材料表面的形态特征和性能。图5是典型利用的水分散后均匀涂在玻璃表面得到的AgNPs-PF图片，使用此图片可以测量AgNPs-PF的平均高度与宽度，得到的结果是A-B高度为6.52nm，C-D高度为5.16、7.82nm，E-F高度为7.82、7.49nm；宽度均在50-70nm之间。根据上述材料高度与宽度比较均匀的特征也进一步证实了本实施例制备的纳米银复合物AgNPs-PF为椭圆形颗粒，且该材料的大小具有一定的透过细胞膜进入细胞内的能力。
实施例2
(1)AgNPs-COOH的制备
①称取10mg的AgNPs粉末和5mg的柠檬酸钠粉末，倒入10mL的浓度为0.02mol/L、温度为4℃、pH值为7.0的HEPES缓冲液(购自阿拉丁试剂(上海)有限公司)中，充分混合后在超声机中反应30min；
②待反应完毕后，在10000rpm下离心5min，收集反应生成的沉淀物，然后用HEPES缓冲液(0.02mol/L、4℃、pH 7.0)洗涤3次，制得AgNPs-COOH，避光保存于4℃的HEPES缓冲液中，形成AgNPs-COOH储备液，备用；其中，洗涤时每次使用5mL的HEPES缓冲液洗涤，洗涤完毕后利用精密移液器移除上清液，然后在10000rpm下离心5min后收集沉淀物进行下一次洗涤。
(2)AgNPs-PEI的制备
①取50mL的离心管(EP管)，采用精密移液器在EP管中加入5mL的AgNPs-COOH储备液(其中含有AgNPs-COOH共17.5mg)，再向EP管中加入40mg的EDC粉末和5mL的去离子水，摇匀备用；然后向EP管中加入70mg的PEI，在超声机中超声处理15min后，将EP管外部用不透光的薄膜包裹做避光处理，再将包裹好的EP管放入38℃、230rpm的恒温摇床中避光反应10h；
②待反应完毕后，在10000rpm下离心5min，收集反应生成的沉淀物，然后用HEPES缓冲液(0.02mol/L、4℃、pH 7.0)洗涤4次，制得AgNPs-PEI，避光保存于4℃的HEPES缓冲液中，备用；其中，洗涤时每次使用5～7mL的HEPES缓冲液洗涤，洗涤完毕后利用精密移液器移除上清液，然后在10000rpm下离心5min后收集沉淀物进行下一次洗涤。
(3)活性PF的制备
取50mL的EP管，称取250mg的FA加入到EP管中，然后用精密移液器移取5mL的DMSO加入到EP管中摇匀，再用精密移液器移取150μL的TEA加入到EP管中，摇匀备用；称取130mg的NHS加入1mL的DMSO中，在超声机中超声5min，然后加入到步骤①中备用的EP管中，在超声机中超声处理15min后，将EP管外部用不透光的薄膜包裹做避光处理，再将包裹好的EP管放入38℃、250rpm的恒温摇床中避光反应10h，制得活性PF，避光保存于4℃的冰箱中，备用；
(4)AgNPs-PF的制备
将步骤(3)制得的活性PF与步骤(2)制得的AgNPs-PEI按照2：1的质量比混合后，放入38℃、230rpm的恒温摇床中避光反应10h；待反应完毕后，先使用5～7mL的pH值为7.0、温度为38℃的DMSO洗涤5次，洗涤完毕后利用精密移液器移除上清液；然后使用5～7mL的HEPES缓冲液(0.02mol/L、4℃、pH 7.0)洗涤2次(至上清液呈无色即可)，即得AgNPs-PF(所制得的AgNPs-PF可利用冷冻干燥机干燥处理成粉末状，然后避光保存于4℃的冰箱中)。
实施例3
(1)AgNPs-COOH的制备
①称取10mg的AgNPs粉末和5mg的柠檬酸钠粉末，倒入10mL的浓度为0.02mol/L、温度为4℃、pH值为7.0的HEPES缓冲液(购自阿拉丁试剂(上海)有限公司)中，充分混合后在超声机中反应40min；
②待反应完毕后，在10000rpm下离心7min，收集反应生成的沉淀物，然后用HEPES缓冲液(0.02mol/L、4℃、pH 7.0)洗涤5次，制得AgNPs-COOH，避光保存于4℃的HEPES缓冲液中，形成AgNPs-COOH储备液，备用；其中，洗涤时每次使用5mL的HEPES缓冲液洗涤，洗涤完毕后利用精密移液器移除上清液，然后在10000rpm下离心7min后收集沉淀物进行下一次洗涤。
(2)AgNPs-PEI的制备
①取50mL的离心管(EP管)，采用精密移液器在EP管中加入5mL的AgNPs-COOH储备液(其中含有AgNPs-COOH共17.5mg)，再向EP管中加入40mg的EDC粉末和5mL的去离子水，摇匀备用；然后向EP管中加入70mg的PEI，在超声机中超声处理20min后，将EP管外部用不透光的薄膜包裹做避光处理，再将包裹好的EP管放入36℃、210rpm的恒温摇床中避光反应11h；
②待反应完毕后，在10000rpm下离心7min，收集反应生成的沉淀物，然后用HEPES缓冲液(0.02mol/L、4℃、pH 7.0)洗涤6次，制得AgNPs-PEI，避光保存于4℃的HEPES缓冲液中，备用；其中，洗涤时每次使用5～7mL的HEPES缓冲液洗涤，洗涤完毕后利用精密移液器移除上清液，然后在10000rpm下离心7min后收集沉淀物进行下一次洗涤。
(3)活性PF的制备
取50mL的EP管，称取250mg的FA加入到EP管中，然后用精密移液器移取5mL的DMSO加入到EP管中摇匀，再用精密移液器移取150μL的TEA加入到EP管中，摇匀备用；称取130mg的NHS加入1mL的DMSO中，在超声机中超声7min，然后加入到步骤①中备用的EP管中，在超声机中超声处理30min后，将EP管外部用不透光的薄膜包裹做避光处理，再将包裹好的EP管放入36℃、230rpm的恒温摇床中避光反应11h，制得活性PF，避光保存于4℃的冰箱中，备用；
(4)AgNPs-PF的制备
将步骤(3)制得的活性PF与步骤(2)制得的AgNPs-PEI按照2：1的质量比混合后，放入36℃、210rpm的恒温摇床中避光反应11h；待反应完毕后，先使用5～7mL的pH值为7.0、温度为36℃的DMSO洗涤7次，洗涤完毕后利用精密移液器移除上清液；然后使用5～7mL的HEPES缓冲液(0.02mol/L、4℃、pH 7.0)洗涤3次(至上清液呈无色即可)，即得AgNPs-PF(所制得的AgNPs-PF可利用冷冻干燥机干燥处理成粉末状，然后避光保存于4℃的冰箱中)。
应用实施例纳米银复合物的生物活性试验
以实施例1制备的纳米银复合物AgNPs-PF为例，进行生物活性试验，试验方法及结果如下：
(1)细胞的培养：取人卵巢癌细胞(Skov3)细胞分别接种在96孔、24孔和6孔培养板中，接种后的细胞放入细胞培养箱中继续培养，12h后观察细胞，待细胞汇合度超过70％时，将细胞培养液换成含相同浓度为15μg/ml的AgNPs、AgNPs-PF、AgNPs-PF+AgNPs组合材料的细胞培养液，分组有空白对照组、AgNPs处理组、AgNPs-PF处理组、AgNPs-PF+AgNPs组合材料处理组，处理时间根据检测方式而定(MTT的检测细胞需要继续培养24h，活化氧(ROS)的检测细胞需要继续培养6h，JC-1检测和细胞免疫荧光(RAD51)衡量12h后)。
(2)采用MTT法评估癌细胞的活力，DCFH-DA荧光探针测量癌细胞活化氧(ROS)的生成、JC-1检测来评估癌细胞的凋亡程度和细胞免疫荧光(RAD51)衡量癌细胞核中DNA的损伤程度，检测结果如图6至图12所示。
其中，图6为MTT法的检测结果图(图6中，Control表示空白对照组，AgNPs表示AgNPs处理组，AgNPs-PF表示AgNPs-PF处理组，AgNPs-PF+AgNPs表示AgNPs-PF+AgNPs组合材料处理组，图7至图12中相同)。由图6可知，单质AgNPs、复合物AgNPs-PF和AgNPs+AgNPs-PF组合材料均对卵巢癌细胞Skov3的增殖具有抑制作用，抑制作用强弱变化依次为AgNPs+AgNPs-P组合材料＞AgNPs-PF＞AgNPs，即单质AgNPs、复合物AgNPs-PF以及AgNPs+AgNPs-PF组合材料对卵巢癌细胞Skov3增殖的抑制作用逐渐增强。
图7为ROS法的检测结果图，图8为ROS法检测中的平均DCFH-DA荧光强度结果图。胞内的ROS水平能被DCFH-DA荧光强度进行量化从而便于观察，结合图7所示的检测结果，从细胞的绿色荧光(图7中的白色亮点所示，由于绿色荧光的强度较弱，因此为了便于观察，将图7中观测到的绿色荧光标记为白色圆圈所示的亮点，需要说明的是，白色圆圈所示的亮点并不是实际观测结果)来看，我们可以发现AgNPs处理组、AgNPs-PF处理组、AgNPs+AgNPs-PF组合材料处理组的荧光强度依照从左到右呈现逐渐递进增加的结果，结合图8中DCFH-DA的结果表明，AgNPs、AgNPs-PF、AgNPs+AgNPs-PF组合材料均通过积累ROS导致Skov3卵巢癌细胞产生氧化应激过程，而氧化应激过程的产生、加剧会最终促进细胞凋亡、坏死。由上述ROS检测结果的对比可以清晰的发现三类材料对Skov3卵巢癌细胞胞内ROS水平的影响能力变化从高到低依次为AgNPs+AgNPs-PF组合材料＞AgNPs-PF＞AgNPs。
图9为JC-1法的检测结果图，图10为JC-1法检测的JC-1单体/JC-1聚集体的相对比值结果图。由图9和图10可知，当分别暴露在单质AgNPs、复合物AgNPs-PF、AgNPs+AgNPs-PF组合材料下，其JC-1染色的表达强度也表现出不同程度的强弱，综合三组情况在药物处理12h之后，组成JC-1的绿色(图9中第二排图片JC-1单体所示的亮点为绿色荧光)和红色荧光(图9第一排图片JC-1聚集体所示的亮点为红色荧光)照片后发现绝大多数的细胞呈现很强的绿色荧光(表现在图9第三排图片中的亮点主要表现为绿色荧光)，表明单质AgNPs、复合物AgNPs-PF、AgNPs+AgNPs-PF组合材料均可诱导卵巢癌细胞Skov3的凋亡，且致凋亡活性的能力强弱变化为AgNPs+AgNPs-PF＞AgNPs-PF＞AgNPs。
图11为DNA修复细胞RAD51的荧光检测结果图，图12为图11中对应的DNA修复细胞RAD51的相对荧光强度结果图。由图11可以看出，当Skov3卵巢癌细胞暴露在AgNPs、AgNPs-PF和AgNPs+AgNPs-PF组合材料下，其胞内RAD51的表达量表现出不同程度的增加；从图12中的分析统计来看RAD51表达量的强弱程度呈对照组＜AgNPs处理组＜AgNPs-PF处理组＜AgNPs+AgNPs-PF处理组，呈递增趋势。表明暴露在单质AgNPs、复合物AgNPs-PF和AgNPs+AgNPs-PF组合材料下，卵巢癌细胞Skov3会出现明显的DNA损伤。
综合上述图6至12的结果，表明本发明实施例合成的纳米银复合物AgNPs-PF可以抑制癌细胞增殖和诱导凋亡，具有抗肿瘤作用。
综上所述，本发明实施例制备的纳米银复合物AgNPs-PF可以通过抑制癌细胞的增殖、诱导癌细胞凋亡，具有显著的抗肿瘤活性，可用于制备具有抗肿瘤功效的药物，应用前景广阔。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种纳米银复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S10、将纳米银与柠檬酸钠在HEPES缓冲液中反应，制得羧基化纳米银；
步骤S20、将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与所述羧基化纳米银混合后加水溶解，形成混合溶液，向所述混合溶液中加入聚乙烯亚胺并使之溶解，然后在避光条件下反应制得纳米银-聚乙烯亚胺复合材料；
步骤S30、将活性叶酸酯与所述纳米银-聚乙烯亚胺复合材料在避光条件下反应，制得纳米银-叶酸酯复合物；
其中，所述活性叶酸酯的制备包括以下步骤：
步骤S301、将叶酸溶解于二甲基亚砜后，再加入三乙胺混合，形成备用溶液；
步骤S302、将N-羟基琥珀酰亚胺溶解于二甲基亚砜后加入所述备用溶液中分散，然后在避光条件下，置于36～38℃、230～250rpm的恒温摇床上反应10～12h，制得活性叶酸酯。
2.如权利要求1所述的纳米银复合物的制备方法，其特征在于，在步骤S10中：
所述纳米银与柠檬酸钠的质量比为2：1；和/或，
所述HEPES缓冲液的浓度为0.02mol/L，所述HEPES缓冲液的温度为4℃，所述HEPES缓冲液pH值为7.0。
3.如权利要求1所述的纳米银复合物的制备方法，其特征在于，步骤S10具体包括：
步骤S11、将纳米银和柠檬酸钠加入HEPES缓冲液中，形成反应液，将所述反应液在超声环境中反应30～40min，得到生成有沉淀物的反应产物；
步骤S12、分离出所述反应产物中的沉淀物，并使用HEPES缓冲液洗涤，获得羧基化纳米银。
4.如权利要求1所述的纳米银复合物的制备方法，其特征在于，在步骤S20中：
所述羧基化纳米银与所述聚乙烯亚胺的质量比为1：4。
5.如权利要求1所述的纳米银复合物的制备方法，其特征在于，步骤S20具体包括：
步骤S21、将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与所述羧基化纳米银混合后加水溶解，形成混合溶液；
步骤S22、向所述混合溶液中加入聚乙烯亚胺后进行超声分散，然后在避光条件下，置于36～38℃、210～230rpm的恒温摇床上反应10～12h，得到生成有固体产物的混合液；
步骤S23、分离出所述混合液中的固体产物，并使用HEPES缓冲液洗涤，获得纳米银-聚乙烯亚胺复合材料。
6.如权利要求1所述的纳米银复合物的制备方法，其特征在于，在步骤S30中：
所述活性叶酸酯与所述纳米银-聚乙烯亚胺复合材料的质量比为2：1。
7.如权利要求1所述的纳米银复合物的制备方法，其特征在于，步骤S30具体包括：
步骤S31、将活性叶酸酯与所述纳米银-聚乙烯亚胺复合材料混合后，在避光条件下，置于36～38℃、210～230rpm的恒温摇床上反应10～12h，得到生成有固体沉淀的混合物；
步骤S32、分离出所述混合物中的固体沉淀，并洗涤所述固体沉淀，获得纳米银-叶酸酯复合物。
8.如权利要求7所述的纳米银复合物的制备方法，其特征在于，步骤S32中所说的洗涤所述固体沉淀的步骤包括：
先使用二甲基亚砜洗涤5～7次，然后使用HEPES缓冲液洗涤2～3次。
9.如权利要求1至8任意一项所述的纳米银复合物的制备方法制得的纳米银复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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