CN112844258A - 一种半胱氨酸修饰的纳米核壳硅胶材料及制备与应用 - Google Patents

一种半胱氨酸修饰的纳米核壳硅胶材料及制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种半胱氨酸功能化的亲水纳米核壳硅胶材料的制备及其在糖肽富集中的应用。具体合成路线是首先采用四丙氧基硅烷(Tetrapropoxysilane，TPOS)，甲醛(Formaldehyde)和间苯二酚(Resorcinal)在碱性催化条件下生成实心硅胶微球，再经过高温煅烧得到纳米级的核壳硅胶微球，进行乙烯基修饰后，采用光引发巯基‑烯点击反应将半胱氨酸键合到微球表面得到亲水化的纳米硅胶微球材料，最后将该材料应用于生物样品中糖肽的高效富集。该亲水纳米材料的制备过程简单、反应条件温和、原料价格低廉，所制备的材料可成功应用于样品中糖肽的高效富集。

Description

一种半胱氨酸修饰的纳米核壳硅胶材料及制备与应用
技术领域
本发明涉及一种亲水相色谱固定相材料，具体是一种半胱氨酸修饰后的亲水性纳米核壳硅胶材料及其制备，以及其对生物样品中的糖肽的分离富集。
背景技术
核壳硅胶微球，也称为薄壳硅胶微球，顾名思义是由实心“核”与多孔“壳”两部分组装而成。内部的实心核，除了增加传质速率，还能在一定程度上增加基质的机械稳定性；外部的壳层结构可以提供一定的孔隙率，使核壳具备一定的载样能力。该种结构能够缩短溶质分子在多孔壳层内部的传质路径来加快固-液两相之间的传质速率，从而实现快速高效的色谱分离。这种材料作为色谱填料的另一个优势是背压较低，与高压液相色谱仪具有更好的兼容性，是传统全多孔硅胶微球的理想替代者，因此受到了科研工作者的青睐。目前已经发展出了多种策略来制备核壳硅胶微球，如多层自组装法(文献1Dong H,BrennanJ.D.Chem.Commun.,2011,47,1207-1209)、模板法(文献2、Kang Y,Shan W,Wu J,etc.Chem.mater.,2006,18,1861-1866)等，但是这些制备方法过程繁琐，需要多个制备步骤，制备周期较长。
蛋白质糖基化是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰。糖蛋白参与许多重要的生命进程，如免疫应答、信息传递、细胞迁移等。糖蛋白上糖链的异常改变会使其所修饰的蛋白质结构和功能发生变化，甚至会导致某些疾病的发生，因此糖基化的异常已经成为某些肿瘤发生和发展的重要标志之一(文献1Palaniappan,K.K.,Bertozzi,C.R.Chem.Rev.2016,116,14277-14306；文献2Ohtsubo K.,Marth J.D.Cell,2006,126,855-867；文献3梁阿新,汤波,孙立权等.化学进展.2019,31,996-1006)。蛋白质的糖基化分析对其生物学功能及阐明相关疾病的致病机理具有重要意义。目前，蛋白质的糖基化分析通常是通过高效液相色谱(high-performance liquid chromatography，HPLC)与质谱(Mass spectrometry，MS)联用技术来实现。但由于复杂样品中糖肽丰度很低，在质谱分析中非糖肽信号对糖肽信号有明显的抑制作用，因此在进行质谱分析之前需要对样品中的糖肽进行有效的富集(文献4LuH.,Zhang Y.,Yang P.Natl.Sci.Rev.2016,3,345-364；文献5Takegawa Y.,Deguchi K.,Ito H.,etc.J.Sep.Sci.2006,29,2533-2540)。经过科研工作者的不断努力，已经发展了一系列糖肽富集方法，主要包括肼化学反应法、硼酸化学反应法、凝集素亲和法和亲水作用色谱等。每种方法都有其自身的特点，其中亲水作用色谱(Hydrophilic interaction liquidchromatography，HILIC)由于对糖肽可以进行无差别式富集，糖基化鉴定覆盖率高，而且易于与HPLC-MS联用等优点，受到了越来越多的关注。但目前亲水相互作用色谱法依然存在对糖肽选择性低的缺点，非糖肽不能被有效去除，影响了糖肽的质谱响应。因此，寻找和制备新型糖肽富集材料依然是研究人员的重点(文献6Chen Z.,Huang J.,Li L.TrendsAnal.Chem.2019,118,880-892)。
本专利采用“一锅”合成法与高温煅烧相结合的方法制备出了核壳性的纳米硅胶材料，并用半胱氨酸进行修饰后用于复杂样品中的糖肽高效富集，合成步骤少，效率高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种半胱氨酸修饰的核壳硅胶微球材料的制备及其应用，其可用于亲水色谱的固定相高效地完成对生物样品中糖肽的分离富集。
为实现上述目的，可按如下步骤操作：
1)纳米核壳硅胶材料的制备：首先取2～4mL TPOS和2～4mL 20～30％(m％)的氨水放入烧瓶中，并加入50～70mL无水乙醇和20～30mL水，在室温下反应10～20min，再加入300～400mg间苯二酚和0.5～0.7mL甲醛，在室温下反应20～24h；将得到的材料用40～60％(v％)乙醇溶液洗涤2～4次，80～100℃真空干燥10～12h；将材料置于马弗炉中500～700℃下煅烧4～6h，得到纳米核壳硅胶材料。
2)活化核壳硅胶：首先称取100～200mg核壳硅胶于容器中，加入10％～20％(v％)盐酸溶液，在80～100℃反应6～8h，反应结束后用水洗至中性，置于烘箱中80～100℃干燥10～12h，得到盐酸酸化的核壳硅胶，即活化核壳硅胶。
3)乙烯基功能化的核壳硅胶材料的制备：将酸化的后的硅胶分散在30～50mL干燥甲苯中，再逐滴加入0.2～0.4mL二甲基乙烯基氯硅烷和0.2～0.4mL三乙胺，放入50～70℃的油浴中反应20～24h；反应结束后将产物用甲醇洗涤2～4次，60～80℃真空干燥10～12h，得到乙烯基功能化的核壳硅胶材料
4)亲水性核壳硅胶材料的制备：然后将100～200mg半胱氨酸和30～50mg的光引发剂DMPA溶解在30mL 40％～60％(v％)乙醇溶液中，配置成修饰液；将乙烯基功能化的核壳硅胶材料平铺于4～6cm表面皿中，加入10～20mL修饰液，使材料完全浸没于溶液之中；然后将表面皿置于紫外光照下曝光10～20min；取出后用移液枪将修饰液移除，用药勺轻轻搅动材料，然后继续添加10～20mL半胱氨酸修饰液。再次将表面皿置于紫外灯下(365nm)曝光10～20min；用40～60％(v％)乙醇溶液洗涤所得到的材料2～4次，80～100℃真空干燥10～12h，即可得到半胱氨酸修饰后的亲水核壳硅胶材料。
所述半胱氨酸修饰的亲水性核壳硅胶材料可用生物样品中糖肽的选择性富集。
本发明具有如下优点：
(1)制备方法反应条件温和，易于操作；
(2)原料成本低廉，适合于大尺度制备；
(3)所制备材料对于复杂样品中的糖肽具有很好的富集效果。
附图说明
图1为实施例1核壳硅胶材料的制备示意图和半胱氨酸修饰核壳硅胶材料的路线图。
图2为核壳硅胶材料的扫描电镜图和透射电镜图以及商品化的全多孔硅胶的扫描电镜图。
图3为实施例1核壳硅胶材料的氮气吸附/脱附曲线和孔径分布图。
图4为核壳硅胶材料和商品化的全多孔硅胶材料进行半胱氨酸修饰前后的接触角对比图。
图5为半胱氨酸功能化的核壳硅胶材料和全多孔硅胶对免疫球蛋白(IgG)酶解液富集前后的质谱对比图。
图6为实施例1中半胱氨酸功能化的核壳硅胶材料对人血清酶解液进行富集后的色谱分离图。
具体实施方式
实施例1半胱氨酸修饰亲水性核壳硅胶材料用于糖肽的分离富集。
半胱氨酸修饰亲水性核壳硅胶材料的制备：
1)纳米核壳硅胶微球的制备：首先将3.46mL四丙氧基硅烷、3mL 25％(m％)的氨水、60mL无水乙醇和20mL水加入到100mL圆底烧瓶中，在室温下搅拌反应15min。然后加入400mg间苯二酚和0.56mL甲醛，室温下继续反应24h，用50％(v％)乙醇洗涤产物三次，80℃真空干燥12h。将产物在高温600℃高温下煅烧5h，得到纳米核壳硅胶微球；
2)活化核壳硅胶：首先称取200mg核壳硅胶于容器中，加入15％(v％)盐酸溶液，在90℃反应6h，反应结束后用水洗至中性，置于烘箱中80℃干燥12h，得到盐酸酸化核壳硅胶微球，即活化核壳硅胶微球；
3)乙烯基核壳硅胶材料的制备：称取200mg活化核壳硅胶于100mL圆底烧瓶中，加入30mL无水甲苯，超声溶解形成均一溶液后，逐滴加入0.3mL的二甲基乙烯基氯硅烷，再放入60℃的油浴中反应24h；将产物用甲醇溶液洗涤三次，60℃真空干燥12h，得到乙烯基功能化的核壳硅胶材料；
4)亲水核壳硅胶材料的制备：首先将100mg半胱氨酸和50mg的光引发剂DMPA溶解在30mL 50％(v％)乙醇溶液中，配置成修饰液；其次将100mg乙烯基功能化的核壳硅胶材料缓慢移入20mL半胱氨酸修饰液于5cm表面皿中，使材料完全浸没于溶液之中。然后将表面皿置于紫外光照下曝光20min。取出后用药勺轻轻搅动材料，添加10mL半胱氨酸修饰液。再次将表面皿置于紫外灯下曝光20min。用50％(v％)乙醇溶液洗涤所得到的材料3次，80℃真空干燥12h，得到半胱氨酸修饰亲水核壳硅胶材料。
实施例2半胱氨酸修饰亲水性全多孔硅胶材料用于糖肽的分离富集。
半胱氨酸修饰亲水性全多孔硅胶材料的制备：
1)二甲基乙烯基氯硅烷功能化全多孔硅胶材料的制备：利用商品化的粒径为2μm全多孔硅胶进行修饰，采用与实施例1相同的步骤的方法，利用二甲基乙烯基氯硅烷在全多孔硅胶微球表面引入乙烯基；
2)半胱氨酸修饰全多孔硅胶材料的制备：用与实施例1相同的步骤，利用半胱氨酸对全多孔硅胶微球进行亲水性修饰，得到亲水性全多孔核壳硅胶固定相。
IgG酶解样品的制备：人血清免疫球蛋白(Human immunoglobulin G，IgG)1mg溶解在含8M尿素的100mM的碳酸氢铵溶液中(pH＝8.2)，加入80μmol二硫苏糖醇，在60℃恒温1h，再加入40μmol碘代乙酰胺，避光40min，用100mM的碳酸氢铵溶液将尿素浓度稀释成1M，按照与胰蛋白酶的质量比为1:40的加入胰蛋白酶，在37℃的水浴中反应时间16h，获得的酶解液除盐，冻干后保存在-20℃的冰箱中备用。
糖基化肽段的分离富集：首先将10μg IgG酶解液用200μL上样液(ACN/H2O/TFA，85:14.9:0.1，v/v/v)稀释，加入到10mg半胱氨酸修饰的核壳硅胶材料后，室温震荡15min。离心，除去上清液。然后用上样液(400μL×3次)淋洗，以除去非糖肽和其他杂质。离心弃去上清液，加入60μL洗脱液(ACN/H2O/TFA，30:69.9:0.1，v/v/v)，室温震荡10min后，离心，取上清液用Triple TOF 5600质谱进行MALDI-TOF/MS分析。另外，可将上清液冷冻干燥后，加入60μL含1000U PNGase F酶的10mmol/L NH4HCO3溶液(pH＝8.0)，40℃下孵育12h，以除去糖基片段。最后去糖基化肽段采用MALDI-TOF/MS或者nano-LC-MS/MS方法进行分析。
MALDI-TOF MS分析：所有MALDI-TOF MS分析实验均在5800飞行时间质谱仪(ABSCIEX,USA)上完成。该质谱仪配有脉冲Nd/YAG激光器，在正离子模式下的激发波长为355nm。样品制备采用DHB溶液(25g/L，H3PO4/H2O/ACN＝1/29/70，v/v/v)为基质，具体过程如下：取0.5μL样品点在MADLI靶上，待其完全干燥后，将0.5μL DHB溶液覆盖在样品点上，自然干燥后送入质谱仪进行分析。
cLC-MS/MS分析实验及数据库检索：所有的RPLC-MS/MS实验均在UltiMate3000RSLC nano systems(Thermo Scientific,USA)色谱-质谱联用仪上完成。该仪器配有四元纳升级别液相泵及LTQ Orbitrap Velos离子阱质谱检测系统(Thermo FisherScientific,San Jose,USA)。实验中使用含有0.1％FA(体积百分比)的水溶液为流动相A，含有0.1％FA(体积百分比)的乙腈溶液为流动相B。进样时，酶解液样品首先用流动相A以5μL/min的流速将酶解液样品注入一个实验室自制的C18硅胶微球(粒径为5μm，孔径12nm)填充的毛细管预柱中(3.0cm×200μm i.d)进行肽段捕捉，进样时间为5min。被捕捉到的肽段随后被流动相带入用C18硅胶微球(粒径3μm，孔径12nm)填充的分析柱(15.0cm×75μm i.d)中进行色谱分离。色谱分析梯度是：在2min内流动相B从0增加到5％(体积百分比)，接着在93min内流动相B从5％增加到35％，然后在8min内流动相B从35％增加到80％，最后100％流动相B保持10min。流速：550nL/min。数据采集软件为Xcalibur 2.1software(ThermoFisher Scientific)工作站。质谱参数：数据采集模式为数据依赖模式；一级质谱全扫描范围为400～2000(m/z)，分辨率为70,000；取前20个最强离子峰破碎解离进行二级质谱扫描，归一化碰撞能量为27％；电喷雾电压为2.0kV；离子传输毛细管温度为250℃。
质谱数据分析：将Xcalibur 2.1工作站得到的“*.raw”文件经过ProteomeDiscoverer(v1.2.0.208，Thermo,San Jose，CA)软件转化成“*.mgf”F格式，再使用MascotDaemon(version 2.5.1)蛋白鉴定软件工作站(Matrix Science，London，UK)进行搜索鉴定。所使用数据库是从网站http://www.uniprot.org/.下载的人库uniprot humandatabase。糖肽的鉴定使用ArMone v 2.0.软件工作站。母离子质量偏差容忍度设为20ppm，碎片离子质量偏差设为0.8Da。酶切设为胰蛋白酶全酶切，最多两个漏切位点。半胱氨酸的碘乙酰化修饰设为固定修饰，甲硫氨酸的氧化修饰设为可变修饰；检索结果导出时设置打分门槛值为20，假阳性率(FDR)低于1％。
产物表征
硅胶材料的扫描电镜和透射电镜如图2所示，可以清晰看到核壳硅胶材料呈球形状(图2a)，粒子分散均匀，核和壳层结构分明，微球平均粒径为300nm和壳层厚度为50nm(图2b)。商品化的全多孔硅胶(图2c)的平均粒径也为300nm左右。
氮气吸附脱/附曲线和孔径分布曲线如图3所示。核壳硅胶材料BET比表面积为154cm2/g，有明显的滞留环，而且介孔平均孔径为7.3nm。购买的商品化的全多孔硅胶微球的BET比表面积为185.6cm2/g，介孔平均孔径为16.6nm。
水接触角如图4a和b所示，核壳硅胶微球的接触角为16.2°，用半胱氨酸修饰后降为11.1°；商品化的全多孔硅胶的接触角为28.3°，用半胱氨酸修饰后降到16.8°(图4c和d)，说明半胱氨酸修饰可以提高微球表面的亲水性。
产物应用
标准蛋白IgG可以用来评价材料的糖肽富集能力。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行检测。图5a为IgG酶解液富集前后的效果对比图。富集前(图5a)，谱图中强度较高的信号峰绝大多数为非糖肽信号，糖肽的信号几乎都被抑制了，仅能观察到一条明显的糖肽信号峰。用实施案例1中半胱氨酸功能化的核壳硅胶材料富集后，如图5b所示，非糖肽信号明显降低，可以检测到25条典型的N-连接糖肽。为了验证所富集的肽段均为糖肽，将这些肽段采用PNGase F酶进行去糖基化处理，如图5d所示，在处理后的质谱图中仅能得到两条明显的质荷比在1158和1190的肽段，说明图5b得到的肽段均为糖肽。用实施例2中半胱氨酸修饰的全多孔硅胶材料富集后，如图5c所示，非糖肽干扰较严重，只可以检测到18条典型的N-连接糖肽，低于同等条件下亲水核壳材料的富集效果。
表1半胱氨酸功能化的核壳硅胶材料富集到的IgG酶解液中糖肽的分子量及糖型组成
Figure BDA0002291055570000071
Figure BDA0002291055570000081
N#表示糖基化位点；Hex:甘露糖；HexNAc:N-乙酰葡糖胺；Fuc:岩藻糖。
将材料进一步应用于更复杂的样品人血清酶解液中糖肽的深度富集用nano-LC-MS/MS方法进行分析鉴定。具体是采用20mg吸附剂对2μL的人血清酶解液按照上述方法进行富集，然后在C18硅胶分析柱上进行分析检测。色谱分离图如图6所示。总共鉴定到了来自108个糖蛋白的272条糖肽以及204个糖基化位点。这一结果，与文献报道的麦芽糖分步修饰的磁性纳米颗粒效果相当(Li J,Wang F,Wan H,et al.Magnetic nanoparticles coatedwith maltose-functionalized polyethyleneimine for highly efficient enrichmentof N-glycopeptides.[J].Journal of Chromatography A,2015,1425:213-220.)(在血清酶解液中鉴定到来自134个糖蛋白的219条糖肽以及187个糖基化位点)。但是本专利所采用的方法更加简单，成本也更加低廉，而且适合于大规模制备。

Claims (6)

1.一种半胱氨酸功能化的亲水性纳米核壳硅胶材料，于核壳硅胶微球表面通过巯基-烯反应修饰半胱氨酸。
2.按照权利要求1所述介孔核壳硅胶材料，其特征在于：其结构示意图如下：
Figure FDA0002291055560000011
3.一种权利要求1或2所述的亲水性纳米核壳硅胶材料的制备方法，其特征在于：是利用光引发巯基-烯点击反应将半胱氨酸接枝到乙烯基功能化的核壳硅胶微球表面；
首先，以TPOS、甲醛和间苯二酚为制备单体，以乙醇和水组成混合溶液为溶剂，在氨水的催化下发生水解和缩聚反应，生成纳米级别的双层实心硅胶微球，然后经过高温煅烧得到核壳硅胶微球；
接着利用盐酸酸化得到活化核壳硅胶，再利用二甲基乙烯基氯硅烷在微球表面引入乙烯基双键；最后采用光引发巯基-烯点击反应将半胱氨酸键合到硅胶表面上，以提高微球表面的亲水性，得到可用于糖肽富集的亲水性的核壳硅胶微球材料。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：可按如下步骤操作：
纳米核壳硅胶材料的制备：首先取2～4mL TPOS和2～4mL 20～30％的氨水放入烧瓶中，并加入50～70mL无水乙醇和20～30mL水，在室温下反应10～20min，再加入300～400mg间苯二酚和0.5～0.7mL甲醛，在室温下继续反应20～24h；将得到的材料用40～60％(v％)乙醇溶液洗涤2～4次，80～100℃真空干燥10～12h；最后将材料置于马弗炉中500～700℃下煅烧4～6h，得到纳米核壳硅胶材料；
材料的亲水性修饰：首先称取100～200mg核壳硅胶于容器中，加入10％～20％(m％)盐酸溶液，在80～100℃反应6～8h，过滤洗涤得到盐酸酸化的核壳硅胶；将酸化的后的硅胶分散在30～50mL干燥甲苯中，再逐滴加入0.2～0.4mL二甲基乙烯基氯硅烷和0.2～0.4mL三乙胺，放入50～70℃的油浴中反应20～24h；反应结束后将产物用甲醇洗涤2～4次，60～80℃真空干燥10～12h，得到乙烯基功能化的核壳硅胶材料；
称取100～200mg半胱氨酸和30～50mg的光引发剂DMPA溶解在30mL乙醇含量为40％～60％(v％)的水溶液中，配置成修饰液；将乙烯基功能化的核壳硅胶材料平铺于4～6cm表面皿中，加入10～20mL修饰液，使材料完全浸没于溶液之中；然后将表面皿置于紫外光照下曝光10～20min；取出后用移液枪将修饰液移除，用药勺轻轻搅动材料，然后添加10～20mL半胱氨酸修饰液。再次将表面皿置于紫外灯下(365nm)曝光10～20min；曝光结束用40～60％(v％)乙醇溶液洗涤所得到的材料2～4次，80～100℃真空干燥10～12h，即可得到半胱氨酸修饰后的亲水核壳硅胶材料。
5.一种权利要求3～4任一方法制备得到的半胱氨酸功能化的亲水性核壳硅胶材料。
6.一种权利要求1、2或5所述半胱氨酸修饰的亲水性核壳硅胶材料的应用，其特征在于：半胱氨酸修饰亲水性核壳硅胶材料作为富集材料应用于生物样品中糖肽的分离富集。
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