CN114762818A - 表面富含磷酸基团并固定Ti4+碳球纳米材料的合成方法及其在磷酸化蛋白质组学的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于纳米技术范畴，利用G6PNa2作为碳源，通过水热碳化法一步制备出表面富含磷酸基团的碳球材料，接着通过螯合作用固定金属阳离子Ti4+(命名为CS‑Ti4+)。首先，将一定浓度的G6PNa2水溶液加入反应釜中，放入烘箱中180℃反应6小时，接着将反应产物用水和乙醇多次洗涤，在离心的条件下得到表面富含磷酸基团的碳球材料。然后将该材料分散到100mmol/L的Ti(SO4)2溶液中，室温下恒温震荡24小时，水系并离心并在50℃下干燥得到终产物。本发明制备过程简单，合成周期极短的材料制备流程，节省了大量时间和劳力；反应原料常见且没有使用任何有机试剂。

Description

表面富含磷酸基团并固定Ti4+碳球纳米材料的合成方法及其 在磷酸化蛋白质组学的应用
技术领域
本发明属于先进纳米材料与纳米技术范畴，具体涉及一种表面富含磷酸基团的碳球材料并固定Ti4+对磷酸化肽进行分离及利用高通量MALDI-TOFMS分析的一种技术。
背景技术
蛋白质的可逆磷酸化是最常见以及最重要的几种翻译后修饰之一。大量的报道表明，磷酸化在生物过程中起着不可替代的作用，例如细胞间的信号传导，神经活动等。经研究证明，一些生理异常和病理被认为和磷酸化异常有关，且目前某些磷酸化蛋白已成为一些疾病的生物标志物。因此，了解蛋白质磷酸化的反应机理及磷酸化位点对了解有机体的生命活动有着不可忽略的作用。质谱由于其高灵敏度和分辨率成为蛋白质组学/多肽组学分析中不可替代的工具之一。但碍于磷酸基团的影响，磷酸化肽的离子化效率较非磷酸化肽差很多，以及磷酸化肽的低丰度，所以不进行预处理而直接用质谱分析实际生物样本有很大的阻碍，这就要求我们开发出一种从复杂生物样品中分离出磷酸化肽的方法。
为了解决这些问题，很多材料和富集技术被用来富集磷酸化肽。其中金属离子吸附色谱得到了广泛应用。但传统的IMAC-Ti4+材料制备法费时费力，往往伴随着着繁杂的合成步骤，并且制备过程中使用大量有毒、有害的有机试剂，不符合绿色化学中减少或消除危险物质的使用和产生的化学品和过程的设计。
迄今为止，功能性碳质材料已在不同的科学领域得到了很大的发展。因此，发展一种流程简单的IMAC-Ti4+类纳米材料来富集磷酸化肽是一种新的需求。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种制备过程简单，合成周期极短的材料制备流程，节省了大量时间和劳力的表面富含磷酸基团并固定Ti4+碳球纳米材料的合成方法及其在磷酸化蛋白质组学的应用。
实现本发明目的的技术方案是：一种表面富含磷酸基团并固定Ti4+碳球纳米材料的合成方法，具体步骤如下：
(1)取3.04g的葡萄糖-6-磷酸二钠溶解至10ml的去离子水中配置成1mol/L浓度的溶液；
(2)取出容量为25mL的聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜，将步骤(1)所得的溶液倒入其中；
(3)将步骤(2)的反应釜放入烘箱中180℃温度反应6小时；
(4)将步骤(3)所得的产物用去离子水和乙醇充分洗涤，除去产物表面的杂质与原料单体，并在真空干燥器中50℃干燥过夜，得到表面富含磷酸基团的碳球材料；
(5)将步骤(4)中所得产物分散到浓度为100mmol/L的Ti(SO4)2溶液中，37℃震荡24小时；
(6)将步骤(5)所得的产物用去离子水和乙醇充分洗涤,并在真空干燥器中50℃干燥过夜，即得所述表面富含磷酸基团并固定Ti4+碳球纳米材料。
上述技术方案步骤(1)中所述葡萄糖-6-磷酸二钠的浓度为1mol/L。
上述技术方案步骤(3)中所述的反应温度为180℃，反应时间6小时。
一种采用上述合成方法得到的表面富含磷酸基团并固定Ti4+碳球纳米材料在磷酸化蛋白质组学的应用，具体步骤为：
首先，将纳米材料分散到200μL 0.1％体积比的三氟乙酸和50％体积比的乙腈的离心管中，再加入含有磷酸化肽的试样，37℃富集30min，其中三氟乙酸的体积比为0.1％，乙腈的体积比为50％；
然后，用0.1％体积比三氟乙酸、50％体积比乙腈，其余为水的缓冲液充分洗涤，并磁性分离；
最后，用10μL0.4M氨水洗脱10min，离心分离获取上清液。
上述技术方案中还具有质谱检测，具体为，取上述上清液点靶，进行质谱分析。
采用上述技术方案后，本发明具有以下积极的效果：
(1)本发明通过一步法HTC工艺，以D-葡萄糖-6-磷酸钠盐(G6PNa2)为唯一前体，以水为溶剂，制备了一种新型的富含碳的碳球(CS)。合成过程简便且环保；此外，功能化修改已集成到一个步骤的过程中，在室温下螯合Ti4+后，CS-Ti4+对磷酸肽表现出超高的特异性和选择性，这表明了其在磷酸化蛋白质组学研究中的巨大潜力。
(2)本发明利用G6PNa2作为碳源，通过水热碳化法一步制备出表面富含磷酸基团的碳球材料，接着通过螯合作用固定金属阳离子Ti4+(命名为CS-Ti4+)，制备过程简单，合成周期极短的材料制备流程，节省了大量时间和劳力。
(3)本发明的反应原料常见且没有使用任何有机试剂，符合绿色化学中减少或消除危险物质的使用和产生的化学品和过程的设计。
(4)本发明可以通过优化反应时间，温度，原料浓度不断调整材料的微观形貌和尺寸，从而获取性能最佳的材料，大大提高了磷酸化肽的富集能力。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1为本发明的一步法合成表面富含磷酸基团的碳球材料并固定Ti4+的扫描电子显微镜照片图；
图2为本发明的一步法合成表面富含磷酸基团的碳球材料并固定Ti4+的红外光谱图；
图3为本发明的一步法合成表面富含磷酸基团的碳球材料并固定Ti4+的元素分析图；
图4为本发明的固定Ti4+的碳球材料富集β-casein中的磷酸化肽的质谱图；
图5为本发明的固定Ti4+的碳球材料富集磷酸化肽段检测限(1fmol)的质谱图；
图6为本发明的固定Ti4+的碳球材料富集混合蛋白(非磷酸化蛋白BSA：磷酸化蛋白β-casein＝1000:1)中的磷酸化肽的质谱图；
图7为本发明的固定Ti4+的碳球材料富集标准磷酸化肽的回收率质谱图；
图8为本发明的固定Ti4+的碳球材料富集人血清中磷酸化肽段(▲代表磷酸化肽)示意图。
具体实施方式
实施例1
表面富含磷酸基团的碳球并在固定Ti4+的纳米材料的合成；
(1)将3.04g的葡萄糖-6-磷酸二钠(G6PNa2)溶解于10mL的去离子水中配置成1mol/L浓度的溶液；
(2)取出容量为25mL的聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜，将步骤(1)所得的溶液倒入其中；
(3)将步骤(2)的反应釜放入烘箱中在180℃下反应6小时；
(4)将步骤(3)所得的产物用去离子水和乙醇充分洗涤，除去产物表面的杂质与原料单体，放于真空干燥箱中50℃干燥过夜，得到表面富含磷酸基团的碳球材料；
(5)将步骤(4)中所得产物分散到10mL，100mmol/L的Ti(SO4)2溶液中，37℃恒温震荡24小时；
(6)将步骤(5)所得的产物用去离子水和乙醇充分洗涤,并在真空干燥器中50℃干燥过夜，即得所述表面富含磷酸基团并固定Ti4+碳球纳米材料。
所得的表面富含磷酸基团的碳球材料并固定Ti离子的纳米材料的扫描电子显微镜照片(20KV，飞利浦XL30电子显微镜，荷兰)如图1所示，傅里叶红外变换光谱图(赛默飞NIcolet iS 10，美国)如图2所示，元素分析图如图3所示。
实施例2
表面富含磷酸基团的碳球并固定Ti离子的纳米材料在富集β-酪蛋白中的磷酸化肽的应用：
(1)试样的准备：β-casein(β-酪蛋白)在25mmol/L NH4HCO3溶液中37℃酶解16h。
(2)富集：0.5mg纳米材料分散到200μL的0.1％体积比TFA 50％体积比ACN离心管中，再加入2μL步骤(1)制备的样品，在37℃富集30min；用0.1％体积比TFA和50％体积比ACN的缓冲液洗涤并离心分离3次；10μL 0.4M氨水洗脱10min，离心分离获取上清液。
(3)质谱分析：取0.5μL步骤(2)所得的上清液点靶，进行质谱分析，质谱图如图4所示，图5是表面富含磷酸基团的碳球材料并固定Ti离子的纳米材料富集β-casein中的磷酸化肽段检测限(1fmol)。
实施例3
表面富含磷酸基团的碳球并固定Ti离子的纳米材料在富集混合蛋白中的磷酸化肽的应用。
(1)试样的准备：牛血清白蛋白(BSA)先用二硫苏糖醇和碘乙酰胺还原烷基化，然后在37℃酶解16h。β-casein在25mM NH4HCO3溶液中37℃酶解16h。将牛血清白蛋白(BSA)和β-casein以1000：1摩尔比加到含有0.1％TFA 50％ACN离心管中。
(2)富集：0.5mg实施例1所得的纳米材料分散到200μL含有步骤(1)的磷酸化肽的0.1％体积比TFA 50％体积比ACN离心管中，37℃富集30min；用0.1％体积比TFA和50％体积比ACN的缓冲液洗涤并离心分离3次；10μL 0.4M氨水洗脱15min。
(3)质谱分析：取1μL步骤(2)所得的洗脱液点靶，用DHB作为基质进行质谱分析，碳球材料并在表面固定Ti4+纳米材料富集混合蛋白(非磷酸蛋白BSA：磷酸化蛋白β-casein＝1000:1)中的磷酸化肽的质谱图。
实施例4
表面富含磷酸基团的碳球并固定Ti离子的纳米材料在富集β-酪蛋白中的回收率分析。
(1)同位素标记标准蛋白：取等量的β-casein，分别在H2 16O和H2 18O中37℃酶解16小时；
(2)富集：0.5mg纳米材料分散到200μL的磷酸化肽的0.1％体积比TFA50％体积比ACN离心管中，加入2μL 16O标记的β-casein，37℃富集30min；用0.1％体积比TFA和50％体积比ACN的缓冲液洗涤并离心分离3次；10μL 0.4M氨水洗脱15min。
(3)另取0.5mg纳米材料分散到200μL的磷酸化肽的0.1％体积比TFA50％体积比ACN离心管中，将步骤(2)中脱附的洗脱液加入，再加入2μL步骤(1)中18O标记β-casein，37℃富集30min；用0.1％体积比TFA和50％体积比ACN的缓冲液洗涤并离心分离3次；10μL 0.4M氨水洗脱15min。
(4)质谱分析：取1μL步骤(2)所得的洗脱液点靶，用DHB作为基质进行质谱分析，质谱图如图7所示。
实施例5
表面富含磷酸基团的碳球并固定Ti离子的纳米材料在富集人唾液中的磷酸化肽的应用。
(1)试样的准备：获得的人唾液加入0.1％TFA在-5℃下离心取上清液。
(2)富集：0.5mg纳米材料分散到200μL含有步骤(1)的磷酸化肽的0.1％体积比TFA50％体积比ACN离心管中，37℃富集30min；用0.1％体积比TFA和50％体积比ACN的缓冲液洗涤并离心分离3次；10μL 0.4M氨水洗脱15min。
(3)质谱分析：取1μL步骤(2)所得的洗脱液点靶，用DHB作为基质进行质谱分析，质谱图如图8所示。
上述实施例1至5，均通过一步法HTC工艺，以D-葡萄糖-6-磷酸钠盐(G6PNa2)为唯一前体，以水为溶剂，制备了一种新型的富含碳的碳球(CS)。合成过程简便且环保。此外，功能化修改已集成到一个步骤的过程中。在室温下螯合Ti4+后，CS-Ti4+对磷酸肽表现出超高的特异性和选择性，这表明了其在磷酸化蛋白质组学研究中的巨大潜力。
水热碳化(HTC)是一种以生物质(蔗糖，葡萄糖和纤维素等)为碳源，以水为唯一溶剂将生物质转化为高含碳材料的过程。在HTC过程中，生物质会经历一系列复杂的反应，包括脱水，脱酸，水解和脱甲烷化。HTC制得的碳质材料表现出出色的亲水性表面，同时，功能组可以在HTC过程中直接合并，这大大简化了传统IMAC-Ti4+材料的制备流程。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种表面富含磷酸基团并固定Ti4+碳球纳米材料的合成方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)取3.04g的葡萄糖-6-磷酸二钠溶解至10ml的去离子水中配置成1mol/L浓度的溶液；
(2)取出容量为25mL的聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜，将步骤(1)所得的溶液倒入其中；
(3)将步骤(2)的反应釜放入烘箱中180℃温度反应6小时；
(4)将步骤(3)所得的产物用去离子水和乙醇充分洗涤，除去产物表面的杂质与原料单体，并在真空干燥器中50℃干燥过夜，得到表面富含磷酸基团的碳球材料；
(5)将步骤(4)中所得产物分散到浓度为100mmol/L的Ti(SO4)2溶液中，37℃震荡24小时；
(6)将步骤(5)所得的产物用去离子水和乙醇充分洗涤,并在真空干燥器中50℃干燥过夜，即得所述表面富含磷酸基团并固定Ti4+碳球纳米材料。
2.根据权利要求1所述的表面富含磷酸基团并固定Ti4+碳球纳米材料的合成方法，其特征在于：步骤(1)中所述葡萄糖-6-磷酸二钠的浓度为1mol/L。
3.根据权利要求1所述的表面富含磷酸基团并固定Ti4+碳球纳米材料的合成方法，其特征在于：步骤(3)中所述的反应温度为180℃，反应时间6小时。
4.一种如权利要求1所述合成方法得到的表面富含磷酸基团并固定Ti4+碳球纳米材料在磷酸化蛋白质组学的应用，其特征在于，具体步骤为：
首先，将纳米材料分散到200μL 0.1％体积比的三氟乙酸和50％体积比的乙腈的离心管中，再加入含有磷酸化肽的试样，37℃富集30min，其中三氟乙酸的体积比为0.1％，乙腈的体积比为50％；
然后，用0.1％体积比三氟乙酸、50％体积比乙腈，其余为水的缓冲液充分洗涤，并磁性分离；
最后，用10μL0.4M氨水洗脱10min，离心分离获取上清液。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：还包括质谱检测，具体为：取上清液点靶，进行质谱分析。
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