CN103969325A - 一种聚多巴胺修饰的maldi靶板的合成方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于先进纳米富集材料与纳米技术领域，涉及一种表面由聚多巴胺修饰的MALDI靶板的合成和应用。本方法首先将MALDI靶板浸泡在含多巴胺的Tris缓冲溶液中反应24小时，水洗后将多巴胺修饰好的靶板浸泡在硫酸钛溶液中2小时固定钛离子。经过修饰的靶板具有极好的亲水性及生物相容性，固定其上的钛离子对磷酸化肽段有富集效果。该方法合成简单，反应条件温和，免洗脱，可在高通量MALDI-TOFMS下富集复杂样品中的磷酸化肽段。

Description

一种聚多巴胺修饰的MALDI靶板的合成方法及其应用

技术领域

本发明属于先进纳米材料与纳米技术领域，具体涉及一种用于富集磷酸化肽段的聚多巴胺修饰的MALDI靶板的合成方法及其应用。

背景技术

蛋白质磷酸化是最重要也是最普遍的一种蛋白质翻译后修饰之一，几乎参与了细胞生命的所有阶段，比如细胞生长、分裂、迁移和分化。因此，为了研究这些生物过程，发展出对磷酸化肽段进行系统的鉴定和表征的方法技术是至关重要的。而质谱（MS）分析技术由于其具有快速和高通量的特点，已成为检测和表征磷酸化肽段的重要手段，比如基质辅助激光电离飞行时间质谱（MAIDL-TOF-MS）分析。然而，复杂生物样品中含有的大量非磷酸化肽会阻碍磷酸化肽的检测，因此，在MALDI-TOF-MS分析之前对生物样品中的磷酸化肽段进行选择性富集是十分必要的。

很多传统的脱靶方法，比如固相金属离子亲和色谱（IMAC），金属氧化物亲和色谱（MOAC）以及功能化纳米材料等，都已经被应用于MALDI-TOF-MS分析前的磷酸化肽选择性富集。然而，这些方法都存在不可避免的样品损失，材料的浪费以及样品可能的污染等问题。为了避免这些问题，近年来，对MALDI-TOF-MS分析之前的靶上富集技术的研究获得了大量的关注，包括利用靶上MOAC技术对磷酸化肽的选择性富集。如卢晋等人合成了空心氧化铝微球用于靶上选择性富集磷酸化肽等。然而，由于纳米粒子和激光的相互作用，基于靶上MOAC技术的选择性富集会导致质谱离子源的污染使之受损。因此，发展新的靶上富集技术用于磷酸化肽的选择性富集是至关重要的。

大量研究已经证明，多巴胺（DOPA）可以在温和的条件下在各种物质表面自聚。并且，金属离子，比如Ti⁴⁺等，通过与多巴胺的邻苯二酚基团结合，可以在温和的条件下被直接固定在聚多巴胺表面。本发明即是基于此发展了一种创新的靶上IMAC技术，即固定钛离子的聚多巴胺层修饰的MALDI靶板，应用于磷酸化肽的高选择性富集并用于直接MALDI-TOF质谱分析。

本发明中所涉及的固定钛离子的聚多巴胺修饰的MALDI靶板，富集磷酸化肽时不会造成样品损失，避免了洗脱的步骤，并且具有很高的选择性和灵敏度。

发明内容

本发明目的在于提供一种表面由聚多巴胺修饰的MALDI靶板的合成方法及其在高通量MALDI-TOF MS下富集复杂样品中的磷酸化肽段的应用。

本发明提出的表面由聚多巴胺修饰的MALDI靶板的合成方法，包括以下步骤：

（1）将MALDI靶板浸泡在含有多巴胺的Tris缓冲溶液中，使其静止其中6-20小时；

（2）将步骤（1）所获得的靶板用去离子水冲洗几遍；一般为3-5遍；

（3）将步骤（2）所得的靶板浸泡在含有硫酸钛的水溶液中2-5小时；

（4）将步骤（3）所得的靶板用水冲洗几次；一般为3-5次；

（5）最终将修饰好的靶板在真空干燥器中干燥。

本发明中，多巴胺与硫酸钛的质量比为1：12.

本发明提出的表面由聚多巴胺修饰的MALDI靶板在富集磷酸化钛中的应用，包括以下步骤：

（1）将修饰好的MALDI靶板用含有乙腈及TFA的缓冲溶液冲洗几次；一般为3-5次；

（2）将步骤（1）所得的靶板置于室温下干燥；

（3）将酶解好的β-casein酶解液用含有乙腈及TFA的缓冲溶液稀释后点于步骤（2）所得的靶板上；

（4）将步骤（3）所得靶板置于湿盒中进行富集，时间半小时；

（5）将步骤（4）所得靶板用含有乙腈及TFA的缓冲溶液冲洗多次，将非特异性吸附的非磷酸化肽洗脱；

（6）将步骤（5）所得靶板室温干燥，点DHB基质，用MALDI分析。

本发明的有益效果在于：所提供的表面由聚多巴胺修饰的MALDI靶板的合成方法简单，处理后的材料具有良好的生物相容性和亲水性，在富集后的步骤中，避免了洗脱的繁琐，可以直接对富集到的肽段在高通量MALDI-TOF MS下进行高灵敏度、高选择性的分析。

附图说明

图1为经过聚多巴胺修饰的MALDI靶板表面的扫描电子显微镜照片；

图2为用修饰聚多巴胺的MALDI靶板富集β-casein和BSA的混合酶解液（摩尔比1:500）前的质谱信号峰图；

图3为用修饰聚多巴胺的MALDI靶板富集β-casein和BSA的混合酶解液（摩尔比1:500）后的质谱信号峰图（磷酸化肽段的信号峰用“*”标注）；

图4为用聚多巴胺修饰的MALDI靶板富集血清样品中的磷酸化肽段前的质谱信号峰图；

图5为用聚多巴胺修饰的MALDI靶板富集血清样品中的磷酸化肽段后的质谱信号峰图（磷酸化肽段的信号峰用“*”标注）。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。

实施例1.

聚多巴胺修饰的MALDI靶板的合成

（1） 将400mg多巴胺盐酸盐分散于200mLTris缓冲液（10mM, pH=8.5）中。

（2） 将MALDI靶板分别用蒸馏水和乙醇洗涤数次，室温干燥。

（3） 将洗净的MALDI靶板浸没在（1）中的多巴胺溶液中室温反应24小时。

（4） 将（3）中获得的聚多巴胺修饰的靶板用蒸馏水冲洗3次，并浸没在Ti(SO₄)₂ (100 mM)水溶液中室温反应2小时。

（5） 用（4）中获得的靶板用蒸馏水冲洗3次，室温干燥。

图1为经过聚多巴胺修饰的MALDI靶板表面的扫描电子显微镜照片。多巴胺在聚合反应初期呈现出小球状，而在聚合反应后期，趋向于形成聚多巴胺膜。膜的厚度与多巴胺溶液的浓度以及反应时间有关。

实施例2：聚多巴胺修饰的MALDI靶板选择性富集磷酸化肽，并进行高通量MALDI-TOF MS分析

（1）试样的准备：将BSA或β-casein蛋白溶解于NH₄HCO₃ 缓冲液(25mM, pH 8.3)中，并用trypsin (2%, w/w) 在37℃下酶解16小时。酶解后的产物0℃以下保存。血清样品离心后，取上清液0℃以下保存。

（2）点靶：将修饰过的靶板用50%乙腈和0.1%TFA水溶液（v/v）冲洗三次，分别将β-casein酶解液，β-casein与BSA酶解液的混合液及处理过的血清用50%乙腈和0.1%TFA水溶液(v/v)稀释至不同浓度；吸取1μL稀释后的酶解液点于修饰后的MALDI靶板上，室温下置于湿盒中富集30分钟；用50%乙腈和0.1%TFA水溶液（v/v）冲洗上样的靶板点以除去非特异性吸附的非磷酸化肽段；取1μL的基质DHB（20mg/mL,50%乙腈及1% H₃PO₄）点于上样层上并在室温下置于空气中自然风干。

（3）质谱分析：通过富集前后的对比图可以看到，富集前，由于各样品中的磷酸化肽受到非磷酸化肽的抑制，使得磷酸化肽无法被成功检测到。经过聚多巴胺修饰的MALDI靶板富集后，磷酸化肽可以成功地被质谱检测到，且非磷酸化肽的峰几乎看不到，磷酸化肽的峰占据主导地位。该结果成功地说明了聚多巴胺修饰的靶板可以应用与复杂生物样品的磷酸化肽的富集中。

图2，图3分别为用修饰聚多巴胺的MALDI靶板富集β-casein和BSA的混合酶解液（摩尔比1:500）前后的质谱信号峰图（磷酸化肽段的信号峰用“*”标注）。通过图中的对比可以看到，富集前，由于混合酶解液中的磷酸化肽受到非磷酸化肽的抑制，使得磷酸化肽无法被成功检测到。经过聚多巴胺修饰的MALDI靶板富集后，6条磷酸化肽可以成功地被质谱检测到，并以高信噪比占据主导地位。

图4，图5分别为用聚多巴胺修饰的MALDI靶板富集血清样品中的磷酸化肽段前的质谱信号峰图（磷酸化肽段的信号峰用“*”标注）。通过图中的对比可以看到，富集前，由于血清样品中的磷酸化肽受到非磷酸化肽以及无机盐的抑制，使得磷酸化肽无法被成功检测到。经过聚多巴胺修饰的MALDI靶板富集后，4条磷酸化肽可以被成功地检测到，并以高信噪比占据主导地位。

Claims (3)

1.表面由聚多巴胺修饰的MALDI靶板的合成方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将MALDI靶板浸泡在含有多巴胺的Tris缓冲溶液中，使其静止其中6-20小时；

（2）将步骤（1）所获得的靶板用去离子水冲洗几遍；

（3）将步骤（2）所得的靶板浸泡在含有硫酸钛的水溶液中2-5小时；

（4）将步骤（3）所得的靶板用水冲洗几次；

（5）最终将修饰好的靶板在真空干燥器中干燥。

2.根据权利要求1所述的表面由聚多巴胺修饰的MALDI靶板的合成方法，其特征在于多巴胺与硫酸钛的质量比为1：12。

3.一种如权利要求1所述的表面由聚多巴胺修饰的MALDI靶板在富集磷酸化肽中的应用，其特征在于包括以下步骤：

（1）将修饰好的MALDI靶板用含有乙腈及TFA的缓冲溶液冲洗几次；

（2）将步骤（1）所得的靶板置于室温下干燥；

（3）将酶解好的β-casein酶解液用含有乙腈及TFA的缓冲溶液稀释后点于步骤（2）所得的靶板上；

（4）将步骤（3）所得靶板置于湿盒中进行富集，时间半小时；

（5）将步骤（4）所得靶板用含有乙腈及TFA的缓冲溶液冲洗多次，将非特异性吸附的非磷酸化肽洗脱；

（6）将步骤（5）所得靶板室温干燥，点DHB基质，用MALDI分析。