CN105664888A - 一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法，先制备活化硅胶的甲醇匀浆备用，将D-葡萄糖酸内酯和N-（3-氨基丙基）咪唑溶解在乙醇后得到N-咪唑丙基葡糖酰胺，将其与3-异氰酸酯基丙基三甲氧基硅烷混合溶于乙醇后得到N-三甲基硅基丙基-N’-葡糖酰胺丙基咪唑+碘离子溶液；然后在该溶液中添加硅胶匀浆，加热后得到产物N，N’-三甲氧基丙基葡糖酰胺咪唑离子液体键合硅胶色谱固定相。糖基功能化咪唑型离子液体固定相色谱填料既有硅胶基质的优异物理结构又有功能化糖基的特殊色谱性能，对生物分子化合物有较强的分离性能，且分离效果稳定，该色谱填料具有耐有机溶剂，耐酸性，耐高温等，分离效率高的特点。

Description

一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法
技术领域
本发明涉及高效液相色谱固定相的技术领域，特别涉及一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法。
背景技术
目前大部分离子液体-功能化高效液相色谱固定相是基于咪唑类或吡啶阳离子，本发明通过葡萄糖基离子液体的合成受到启发，通过简单的糖基化键合反应，将糖基和咪唑型离子液体有机结合，产生基于糖基的新咪唑离子液体硅胶固定相，获得的糖基咪唑功能化固定相被用于HILIC模式下分析物的评价。有文献报道类似的葡萄糖基离子液键合体固定相，例如：葡萄糖基季胺型表面固载离子液体硅胶固定相、葡糖铵离子液体固定相，前者合成步骤复杂，工艺难度大；后者可分离分化合物很少，分离范围窄。本发明的这种新的糖基功能化离子液体除可以分离上述两种固定相提到的分析物，还对核苷、黄酮类化合物和人体多肽有很好的分离效果。
发明内容
综上所述，为了克服现有技术问题的不足，本发明提供了一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法，解决了功能化咪唑类离子液体高效液相色谱固定相在溶剂、缓冲液等条件下稳定性受限且目标分析物单一的问题，实现对同类生物分子化合物的高效率分离分析。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
步骤一：色谱用多孔球形硅胶经盐酸酸化处理后，水洗至中性，真空干燥后得到表面活化的硅胶，溶于甲醇，得到甲醇匀浆，备用；
步骤二：相等摩尔的D-葡萄糖酸内酯和N-(3-氨基丙基)咪唑溶解在乙醇里，加热回流，进行环氧开环反应，得到N-咪唑丙基葡糖酰胺；
步骤三：将相等摩尔的N-咪唑丙基葡糖酰胺和3-异氰酸酯基丙基三甲氧基硅烷混合溶于乙醇，继续回流，进行甲基化反应，得到N-三甲基硅基丙基-N’-葡糖酰胺丙基咪唑+碘离子；
步骤四：将步骤三中所得N-三甲基硅基丙基-N’-葡糖酰胺丙基咪唑+碘离子溶液进行机械搅拌，搅拌过程中添加步骤一中制备的硅胶的甲醇匀浆，所得悬浮液回流加热反应，得到的产物即为N，N’-三甲氧基丙基葡糖酰胺咪唑离子液体键合硅胶色谱固定相的乳白色悬浊液；
步骤五：将步骤四中所得的乳白色悬浊液过滤，真空干燥，避光保存，所得产物即为N，N’-三甲氧基丙基葡糖酰胺咪唑离子液体键合硅胶色谱固定相。
具体地，所述步骤一中，硅胶的酸化条件为用浓盐酸加热回流4～6h，用水洗至中性，在真空120℃，干燥6～8h，得到表面活化的硅胶，溶于甲醇，得到甲醇匀浆，备用。
具体地，所述步骤二中，将40～60mM的D-葡萄糖酸内酯和同等摩尔的N-(3-氨基丙基)咪唑同时溶解在200～300ml的乙醇里，加热至70～90℃，回流20～30h，得到N-咪唑丙基葡糖酰胺。
具体地，所述步骤三中，将5mM～8mM的N-咪唑丙基葡糖酰胺和同等摩尔的3-异氰酸酯基丙基三甲氧基硅烷混合溶于乙醇，回流2～4天，进行甲基化反应，得到N-三甲基硅基丙基-N’-葡糖酰胺丙基咪唑+碘离子。
具体地，所述步骤四中，将步骤三中得到的N-三甲基硅基丙基-N’-葡糖酰胺丙基咪唑+碘离子溶液加入磁子进行机械搅拌，并加入步骤一中制备的含有2.5～3.5g硅胶的甲醇匀浆15～25ml，搅拌均匀后，搅拌10～15h后，加热至65～75℃，回流24h，得到乳白色悬浊液。
具体地，所述步骤五中，将步骤四所得乳白色悬浊液过滤，并用体积比均为1：1的乙醇：水溶液和甲醇：水溶液进行清洗，过滤后所得的产物即为N，N’-三甲氧基丙基葡糖酰胺咪唑离子液体键合硅胶色谱固定相。将所得的产物放入真空干燥箱，在温度为70～100℃的情况下干燥8～12h，并且在进行表征之前存储在琥珀色的小瓶中。
N，N’-三甲氧基丙基葡糖酰胺咪唑离子液体键合硅胶色谱固定相，中文惯称为糖基功能化咪唑型离子液体固定相，英文简称为Sil-GLy-Imdzl，以下简称为糖基功能化咪唑型离子液体固定相或者Sil-GLy-Imdzl。
本发明采用的技术方案带来的有益效果是：
Sil-GLy-Imdzl色谱填料既具有硅胶基质的优异物理结构又具有功能化糖基的特殊色谱性能，由于硅胶表面键合的功能化糖基长链的结构使得Sil-GLy-Imdzl具有很强的亲水性能，因此对水溶性的生物大分子化合物具有较强的分离性能，不同流动相的选择可以减弱对核苷和核苷酸、人体多肽和黄酮苷类化合物的保留，并且通过将功能化糖基键合的方法修饰到硅胶表面上，实现分离的稳定性，耐高温，耐有机溶剂等优势，实现目标分离的高效性，从而获得具有优良的分离分析性能的糖基功能化咪唑型离子液体固定相。
采用本发明实施例提供的一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法所制得的固定相具有以下优点：
1)制备的Sil-GLy-Imdzl高效液相色谱填料既具有硅胶基质的优异物理结构又具有葡萄糖的特殊色谱性能；
2)Sil-GLy-Imdzl硅胶表面键合葡萄糖基长链的结构，说明该固定相具有很强的亲水性能，所以对生物分子化合物具有较强的分离性能；
3)并且通过将功能化糖基键合的方法修饰到硅胶表面上，实现分离的稳定性，耐有机溶剂，耐酸性，耐高温等优势，分离效率高，应用广泛。
附图说明
图1是本发明的制备过程图；
图2是本发明对实施例中制备的Sil-GLy-Imdzl抽样进行参数表征的红外光谱图；
图3是本发明对实施例中制备的Sil-GLy-Imdzl抽样进行参数表征的热重力分析图；
图4是本发明实施例2提供的对11种核苷和核苷酸的色谱分析图；
图5是本发明实施例2提供的对7种黄酮苷类化合物的色谱分析图；
图6是本发明实施例2提供的对6种人体多肽在7种不同流动相色谱条件下的色谱分析图。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得，下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1
如图1所示，一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法，按照如下步骤进行操作：
步骤一：将3g硅胶用浓盐酸加热回流4h，用水洗至中性，120℃下真空干燥6h，得到表面活化的硅胶；
步骤二：称重50mM的D-葡萄糖酸内酯和同等摩尔的N-(3-氨基丙基)咪唑，将二者同时溶解在250ml的乙醇里，加热至80℃，回流24h，冰箱里静置一天，得到N-咪唑丙基葡糖酰胺；
步骤三：将6mM的N-咪唑丙基葡糖酰胺和等摩尔的3-异氰酸酯基丙基三甲氧基硅烷混合溶于在50ml乙醇，回流2天，进行甲基化反应，生成N-三甲基硅基丙基-N’-葡糖酰胺丙基咪唑+碘离子；
步骤四，在步骤三中所得溶液里加入磁子进行机械搅拌12h，并加入含有3g硅胶的甲醇匀浆20ml，搅拌15min，均匀后，加热70℃，回流24h，得到糖基功能化咪唑型离子液体固定相的乳白色悬浊液；
步骤五，将步骤四中所得乳白色悬浊液过滤，并用体积比均为1：1的乙醇：水溶液和甲醇：水溶液进行清洗，最后过滤后的所得物即为Sil-GLy-Imdzl糖基功能化咪唑型离子液体固定相，将Sil-GLy-Imdzl放入真空干燥箱，70℃干燥12h，并且在进行表征之前存储在琥珀色的小瓶中。
实施例2
一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法，按照如下步骤进行操作：
步骤一：将3g硅胶用浓盐酸加热回流4h，用水洗至中性，120℃下真空干燥6h，得到表面活化的硅胶；
步骤二：称重50mM的D-葡萄糖酸内酯和同等摩尔的N-(3-氨基丙基)咪唑，将二者同时溶解在250ml的乙醇里，加热至80℃，回流24h，冰箱里静置一天，得到N-咪唑丙基葡糖酰胺；
步骤三：称重6mM的N-咪唑丙基葡糖酰胺和等摩尔的3-异氰酸酯基丙基三甲氧基硅烷混合溶于50ml乙醇中，回流3天，生成N-三甲基硅基丙基-N’-葡糖酰胺丙基咪唑+碘离子；
步骤四：在步骤三中所得的溶液中加入磁子进行机械搅拌，并加入含有3g硅胶的甲醇匀浆20ml，搅拌均匀后，搅拌12h后，加热至70℃，回流24h，得到悬浊液；
步骤五：将步骤四所得的乳白色悬浊液进行过滤，过滤后用体积比均为1：1的乙醇：水溶液和甲醇：水溶液进行清洗，最后过滤后的所得物即为糖基功能化咪唑型离子液体固定相Sil-GLy-Imdzl，将Sil-GLy-Imdzl放入真空干燥箱，干燥12h，温度为70℃，并且在进行表征之前存储在琥珀色的小瓶中。
实施例3
如图1所示，一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法，按照如下步骤进行操作：
步骤一：将2.5g硅胶用浓盐酸加热回流5h，用水洗至中性，120℃下真空干燥6h，得到表面活化的硅胶；
步骤二：称重40mM的D-葡萄糖酸内酯和同等摩尔的N-(3-氨基丙基)咪唑，将二者同时溶解在200ml的乙醇里，加热至75℃，回流24h，冰箱里静置一天，得到N-咪唑丙基葡糖酰胺；
步骤三：称重8mM的N-咪唑丙基葡糖酰胺和等摩尔的3-异氰酸酯基丙基三甲氧基硅烷混合溶于60ml乙醇中，回流2天，生成N-三甲基硅基丙基-N’-葡糖酰胺丙基咪唑+碘离子；
步骤四：在步骤三中所得的溶液加入磁子进行机械搅拌，并加入含有2.5g硅胶的甲醇匀浆25ml，搅拌均匀后，搅拌10h后，加热至70℃，回流24h，得到悬浊液；
步骤五：将步骤四所得的乳白色悬浊液进行过滤，过滤后用体积比均为1：1的乙醇：水溶液和甲醇：水溶液进行清洗，最后过滤后的所得物即为糖基功能化咪唑型离子液体固定相Sil-GLy-Imdzl，将Sil-GLy-Imdzl放入真空干燥箱，干燥24h，温度为80℃，并且在进行表征之前存储在琥珀色的小瓶中。
实施例4
一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法，按照如下步骤进行操作：
步骤一：将3g硅胶用浓盐酸加热回流6h，用水洗至中性，120℃下真空干燥8h，得到表面活化的硅胶；
步骤二：称重50mM的D-葡萄糖酸内酯和同等摩尔的N-(3-氨基丙基)咪唑，将二者同时溶解在250ml的乙醇里，加热至70℃，回流24h，冰箱里静置一天，得到N-咪唑丙基葡糖酰胺；
步骤三：称重7mM的N-咪唑丙基葡糖酰胺和等摩尔的3-异氰酸酯基丙基三甲氧基硅烷混合溶于40ml乙醇中，回流3天，生成N-三甲基硅基丙基-N’-葡糖酰胺丙基咪唑+碘离子；
步骤四在步骤三中所得的溶液加入磁子进行机械搅拌，并加入含有3g硅胶的甲醇匀浆20ml，搅拌均匀后，搅拌14h后，加热至75℃，回流24h，得到悬浊液；
步骤五：将步骤四所得乳白色悬浊液进行过滤，过滤后用体积比均为1：1的乙醇：水溶液和甲醇：水溶液进行清洗，最后过滤后的所得物即为糖基功能化咪唑型离子液体固定相Sil-GLy-Imdzl，将Sil-GLy-Imdzl放入真空干燥箱，干燥12h，温度为90℃，并且在进行表征之前存储在琥珀色的小瓶中。
实施例5
一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法，按照如下步骤进行操作：
步骤一：将3.5g硅胶用浓盐酸加热回流4h，用水洗至中性，120℃下真空干燥6h，得到表面活化的硅胶；
步骤二：称重60mM的D-葡萄糖酸内酯和同等摩尔的N-(3-氨基丙基)咪唑，将二者同时溶解在300ml的乙醇里，加热至90℃，回流24h，冰箱里静置一天，得到N-咪唑丙基葡糖酰胺；
步骤三：称重6mM的N-咪唑丙基葡糖酰胺和等摩尔的3-异氰酸酯基丙基三甲氧基硅烷混合溶于60ml乙醇中，回流3天，生成N-三甲基硅基丙基-N’-葡糖酰胺丙基咪唑+碘离子；
步骤四：在步骤三中所得的溶液加入磁子进行机械搅拌，并加入含有3g硅胶的甲醇匀浆20ml，搅拌均匀后，搅拌15h后，加热至70℃，回流24h，得到悬浊液；
步骤五：将步骤四所得乳白色悬浊液进行过滤，过滤后用体积比均为1：1的乙醇：水溶液和甲醇：水溶液进行清洗，最后过滤后的所得物即为糖基功能化咪唑型离子液体固定相Sil-GLy-Imdzl，将Sil-GLy-Imdzl放入真空干燥箱，干燥12h，温度为70℃，并且在进行表征之前存储在琥珀色的小瓶中。
实施例6
一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法，按照如下步骤进行操作：
步骤一：3.5g硅胶用浓盐酸加热回流4h，用水洗至中性，120℃下真空干燥6h，得到表面活化的硅胶；
步骤二：称重50mM的D-葡萄糖酸内酯和同等摩尔的N-(3-氨基丙基)咪唑，将二者同时溶解在250ml的乙醇里，加热至80℃，回流24h，冰箱里静置一天，得到N-咪唑丙基葡糖酰胺；
步骤三称重6mM的N-咪唑丙基葡糖酰胺和等摩尔的3-异氰酸酯基丙基三甲氧基硅烷混合溶于50ml乙醇中，回流3天，生成N-三甲基硅基丙基-N’-葡糖酰胺丙基咪唑+碘离子；
步骤四：在步骤三中所得的溶液加入磁子进行机械搅拌，并加入含有3.5g硅胶的甲醇匀浆25ml，搅拌均匀后，搅拌12h后，加热至70℃，回流24h，得到悬浊液；
步骤五：将步骤四所得乳白色悬浊液进行过滤，过滤后用体积比均为1：1的乙醇：水溶液和甲醇：水溶液进行清洗，最后过滤后的所得物即为糖基功能化咪唑型离子液体固定相Sil-GLy-Imdzl，将Sil-GLy-Imdzl放入真空干燥箱，干燥10h，温度为70℃，并且在进行表征之前存储在琥珀色的小瓶中。
实施例7
一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法，按照如下步骤进行操作：
步骤一：将3g硅胶用浓盐酸加热回流4h，用水洗至中性，120℃下真空干燥8h，得到表面活化的硅胶；
步骤二：称重50mM的D-葡萄糖酸内酯和同等摩尔的N-(3-氨基丙基)咪唑，将二者同时溶解在300ml的乙醇里，加热至80℃，回流24h，冰箱里静置一天，得到N-咪唑丙基葡糖酰胺；
步骤三：称重7mM的N-咪唑丙基葡糖酰胺和等摩尔的3-异氰酸酯基丙基三甲氧基硅烷混合溶于40ml乙醇中，回流3天，生成N-三甲基硅基丙基-N’-葡糖酰胺丙基咪唑+碘离子；
步骤四：在步骤三中所得溶液加入磁子进行机械搅拌，并加入含有3g硅胶的甲醇匀浆20ml，搅拌均匀后，搅拌12h后，加热至70℃，回流24h，得到悬浊液；
步骤五：将步骤四所得乳白色悬浊液进行过滤，过滤后用体积比均为1：1的乙醇：水溶液和甲醇：水溶液进行清洗，最后过滤后的所得物即为糖基功能化咪唑型离子液体固定相Sil-GLy-Imdzl。将Sil-GLy-Imdzl放入真空干燥箱，干燥12h，温度为90℃，并且在进行表征之前存储在琥珀色的小瓶中。
实施例8
一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法，按照如下步骤进行操作：
步骤一：将2.5g硅胶用浓盐酸加热回流5h，用水洗至中性，120℃下真空干燥6h，得到表面活化的硅胶；
步骤二：称重50mM的D-葡萄糖酸内酯和同等摩尔的N-(3-氨基丙基)咪唑，将二者同时溶解在200ml的乙醇里，加热至80℃，回流24h，冰箱里静置一天，得到N-咪唑丙基葡糖酰胺；
步骤三：称重6mM的N-咪唑丙基葡糖酰胺和等摩尔的3-异氰酸酯基丙基三甲氧基硅烷混合溶于60ml乙醇中，回流3天，生成N-三甲基硅基丙基-N’-葡糖酰胺丙基咪唑+碘离子；
步骤四：在步骤三中所得溶液加入磁子进行机械搅拌，并加入含有2.5g硅胶的甲醇匀浆20ml，搅拌均匀后，搅拌15h后，加热至70℃，回流24h，得到悬浊液；
步骤五：将步骤四所得乳白色悬浊液进行过滤，过滤后用体积比均为1：1的乙醇：水溶液和甲醇：水溶液进行清洗，最后过滤后的所得物即为糖基功能化咪唑型离子液体固定相Sil-GLy-Imdzl，将Sil-GLy-Imdzl放入真空干燥箱，干燥12h，温度80℃，并且在进行表征之前存储在琥珀色的小瓶中。
实施例9
一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法，按照如下步骤进行操作：
步骤一：将3g硅胶用浓盐酸加热回流4h，用水洗至中性，120℃下真空干燥6h，得到表面活化的硅胶；
步骤二称重50mM的D-葡萄糖酸内酯和同等摩尔的N-(3-氨基丙基)咪唑，将二者同时溶解在250ml的乙醇里，加热至80℃，回流24h，冰箱里静置一天，得到N-咪唑丙基葡糖酰胺；
步骤三称重6mM的N-咪唑丙基葡糖酰胺和等摩尔的3-异氰酸酯基丙基三甲氧基硅烷混合溶于50ml乙醇中，回流3天，生成N-三甲基硅基丙基-N’-葡糖酰胺丙基咪唑+碘离子；
步骤四：在步骤三中所得的溶液加入磁子进行机械搅拌，并加入含有3g硅胶的甲醇匀浆20ml，搅拌均匀后，搅拌12h后，加热至70℃，回流24h，得到悬浊液；
步骤五：将步骤四所得乳白色悬浊液进行过滤，过滤后用体积比均为1：1的乙醇：水溶液和甲醇：水溶液进行清洗，最后过滤后的所得物即为糖基功能化咪唑型离子液体固定相Sil-GLy-Imdzl，将Sil-GLy-Imdzl放入真空干燥箱，干燥12h，温度为75℃，并且在进行表征之前存储在琥珀色的小瓶中。
实施例10
如图1所示，一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法，按照如下步骤进行操作：
步骤一：将3g硅胶用浓盐酸加热回流5h，用水洗至中性，120℃下真空干燥8h，得到表面活化的硅胶；
步骤二：称重60mM的D-葡萄糖酸内酯和同等摩尔的N-(3-氨基丙基)咪唑，将二者同时溶解在300ml的乙醇里，加热至80℃，回流24h，冰箱里静置一天，得到N-咪唑丙基葡糖酰胺；
步骤三称重6.5mM的N-咪唑丙基葡糖酰胺和等摩尔的3-异氰酸酯基丙基三甲氧基硅烷混合溶于50ml乙醇中，回流2天，生成N-三甲基硅基丙基-N’-葡糖酰胺丙基咪唑+碘离子；
步骤四：在步骤三中所得溶液加入磁子进行机械搅拌，并加入含有3g硅胶的甲醇匀浆25ml，搅拌均匀后，搅拌12h后，加热至65℃，回流24h，得到悬浊液；
步骤五：将步骤四所得乳白色悬浊液进行过滤，过滤后用体积比均为1：1的乙醇：水溶液和甲醇：水溶液进行清洗，最后过滤后的所得物即为糖基功能化咪唑型离子液体固定相Sil-GLy-Imdzl，将Sil-GLy-Imdzl放入真空干燥箱，干燥10h，温度70℃，并且在进行表征之前存储在琥珀色的小瓶中。
本发明对制备的糖基功能化咪唑型离子液体固定相抽样进行参数表征，表征的方法和结果如下。
1)红外光谱表征：在红外光谱图中，如图2所示，由于糖基功能化咪唑型离子液体固定相的糖羟基和硅羟基的红外吸收峰重叠，3000-3400cm-1范围观察不到糖的羟基吸收。亚甲基和次甲基的特征峰出现在约2940cm-1和2890cm-1处，咪唑阳离子的特征峰出现在1560cm-1附近，可以确认糖基功能化咪唑型离子液体被成功键合至硅胶表面。
2)热重力分析表征：Sil-Gly-Imdzl的热重力分析图，如图3所示，热重分析在空气中进行，在空气中加热温度从0逐渐升至800℃；在质量剩余72％时出现裂解峰，表明有机体开始解体；800℃后质量趋于稳定，此时键合的有机基团已经完全裂解；由200℃的拐点可以观察到总的键合体约占固定相的质量的25％，这与元素分析相吻合。
3)元素分析表征：通过对糖基功能化咪唑型离子液体固定相Sil-Gly-Imdzl元素分析，表明，固定相的碳、氮、氢的含量分别为17.6％、1.39％和7.71％。用以下公式计算出Sil-Gly-Imdzl表面覆盖层的键合密度Bondingdensity:
B o n d i n g d e n s i t y ( μ m o l · m - 2 ) = N % × 10 6 M 1 × n × S × ( 1 - C % - N % - O % - H % - S i % )
其中C％,N％和H％分别表示制备的Sil-Gly-Imdzl里的碳、氮、氢含量；O％和Si％分别代表氧和硅的含量；M1是碳原子的摩尔质量；n是一个硅烷分子里的碳原子数目；S是硅胶的表面积。
接下来以实施例2为例，对制备的糖基功能化咪唑型离子液体固定相进行分离性能考察，考察的方法和结果如下：
制备的新型糖基离子液体键合硅胶固定相与高效液相色谱仪联用，实现对其性能的考察，以及对实际样品的分析。
11种核苷和核苷酸的分离影响：
糖基功能化咪唑型离子液体固定相(Sil-Gly-Imdzl)对核苷和核苷酸的分离是基于亲水作用保留机理，亲水保留是固定相表面的水富集层和含有高有机化合物的流动相之间的作用，高浓度的有机溶质在流动相中不只会导致亲水物质大幅离解流向水富集层，也可能诱发形成更丰富的富水层，从而导致更强的保留。
如图4所示，本发明检测了核苷和核苷酸在不同乙腈含量做流动相时的保留影响，核苷和核苷酸包括胸苷1、鸟嘌呤2、胸腺嘧啶3、尿嘧啶4、尿苷5、腺苷6、次黄嘌呤7、腺嘌呤8、肌苷9、鸟苷10和胞苷11。核苷和核苷酸的保留因子变化在不同的乙腈浓度的色谱条件下有很大的不同，如图4所示，其中曲线(a)流动相：乙腈：水＝92：8，曲线(b)流动相：100％乙腈，曲线(c)流动相：乙腈：水＝95：5，曲线(d)流动相：乙腈：水＝90：10；上述流动相中水相均含有50mM乙酸铵溶液。核苷和核苷酸类的保留因子与乙腈含量增加成正比，符合HILIC保留行为原理。当乙腈的浓度均可达92％时，11种被检测物均达到基线分离效果，实现完全分离，如图4(a)所示。
7种黄酮苷类化合物的分离影响:
黄酮类化合物包括杨梅苷、柚皮苷、熊果苷、苦杏仁苷、水杨苷、橙皮苷、黄芩苷，表1列出了待分析的7种黄酮苷的化学结构式，基于复杂的结构特点，可以推断黄酮苷在亲水作用下与糖基功能化咪唑型离子液体固定相的相互作用机理。
表17种黄酮苷的结构式
7种黄酮苷的分离结果，如图5所示，图中表明7种黄酮苷在三种色谱条件下表现出的不同分离效果，如图5中(a)曲线所示，黄酮苷的出峰顺序依次是杨梅苷1、柚皮苷2、熊果苷3、苦杏仁苷4、水杨苷5、橙皮苷6和黄芩苷7，由色谱图图4可知，分析物的保留强度和分析物的极性密切相关，与流动相的有机含量有密不可分的关系。从图5可以看出，黄酮苷的分离度很好，特别是苦杏仁苷4和水杨苷5。黄酮类化合物结构相异，但性质类似。Sil-Gly-Imdzl对黄酮苷的有效分离主要还是基于键合在硅胶表面的糖基侧链，同时其含有的酰胺基和咪唑环也提供了额外的相互作用效果，例如π-π作用和离子交换作用。由于黄酮苷类化合物的亲疏水性质不同，种类多样，结构各不相同，在反相色谱模式下很难实现有效分离。Sil-Gly-Imdz表面覆盖着糖单元基团和短烷基链，使得硅胶固定相表面上既有亲水极性基团，也有疏水部分，这样的双重作用结构可以增加样品的选择性，极性和疏水两种相互作用极大地促进了黄酮苷类化合物的分离。
6种人体多肽的分离影响
6种人体多肽包括人血管紧张素(ANG)、脱辅基肌红蛋白(APO)、去氨加压素(DesAc)、西曲瑞克(CET)、寡聚脱氧核糖核苷酸(Oligo-dt)和阿托西班(ATO)，HILIC是多肽分离分析中使用最为广泛使用的色谱技术之一，其超高分辨力、稳定性、通用性和简化的色谱条件都具有很强优势，而且与蒸发光散射检测器和质谱良好兼容。多肽类大多属于极性化合物，HILIC的分离机理可以为其提供很好的保留效果，更为灵敏。色谱作用过程中，盐的浓度可以改善肽类化合物的峰形，并发挥的离子交换作用。ELSD的通用检测方法消除了常见于传统HPLC检测方法中的难点，不同于紫外和荧光检测器，ELSD的响应不依赖于样品的光学特性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，不受其官能团的影响。ELSD的响应值与样品的质量成正比，因而能用于测定样品的纯度或者检测未知物。在ELSD上利用HILIC模式对多肽类化合物进行分离，也是一种全新的尝试。
表2分别列出6种肽类化合物的分子结构式，基于它们的结构式和结构特点，可以推断这几种人体多肽在亲水作用下与糖基功能化咪唑型离子液体固定相的相互作用机理。流动相添加剂选择甲酸铵和乙酸铵，是因为它们可以溶于高浓度乙腈溶液，且可以保持较强的离子强度，有效提高带电荷的被检测物的峰状。
表26种多肽的结构式
如图6所示，曲线(a)乙酸铵中流动相的配比为98％乙腈：50mM乙酸铵水溶液(v:v＝98:2)与其他六种流动相(曲线(b)甲酸铵、曲线(c)磷酸二氢钠、曲线(d)磷酸二氢钾、曲线(e)乙酸钠、曲线(f)三乙胺盐酸盐和曲线(g)三氟乙酸)配比的分离效果对比，可以观察到乙酸铵对应的保留信号明显较强。图6中分析物的出峰顺序分别为：人血管紧张素(ANG)1，脱辅基肌红蛋白(APO)2，去氨加压素(DesAc)3，西曲瑞克(CET)4，寡聚脱氧核糖核苷酸(Oligo-dt)5和阿托西班(ATO)6。这种明显差异可以理解为，流动相的选择除了要求在高有机溶质里的良好溶解性，还要在蒸发光散射检测器(ELSD)上具有强烈的响应信号。
上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
步骤一：色谱用多孔球形硅胶经盐酸酸化处理后，水洗至中性，真空干燥后得到表面活化的硅胶，溶于甲醇，得到甲醇匀浆，备用；
步骤二：相等摩尔的D-葡萄糖酸内酯和N-（3-氨基丙基）咪唑溶解在乙醇里，加热回流，进行环氧开环反应，得到N-咪唑丙基葡糖酰胺；
步骤三：将相等摩尔的N-咪唑丙基葡糖酰胺和3-异氰酸酯基丙基三甲氧基硅烷混合溶于乙醇，继续回流，进行甲基化反应，得到N-三甲基硅基丙基-N’-葡糖酰胺丙基咪唑+碘离子；
步骤四：将步骤三中所得N-三甲基硅基丙基-N’-葡糖酰胺丙基咪唑+碘离子溶液进行机械搅拌，搅拌过程中添加步骤一中制备的硅胶的甲醇匀浆，所得悬浮液回流加热反应，得到的产物即为N，N’-三甲氧基丙基葡糖酰胺咪唑离子液体键合硅胶色谱固定相的乳白色悬浊液；
步骤五：将步骤四中所得的乳白色悬浊液过滤，真空干燥，避光保存，所得产物即为N，N’-三甲氧基丙基葡糖酰胺咪唑离子液体键合硅胶色谱固定相。
2.根据权利要求1所述的一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，硅胶的酸化条件为用浓盐酸加热回流4～6h，用水洗至中性，在真空120℃，干燥6～8h，得到表面活化的硅胶，溶于甲醇，得到甲醇匀浆，备用。
3.根据权利要求1所述的一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，将40~60mM的D-葡萄糖酸内酯和同等摩尔的N-（3-氨基丙基）咪唑同时溶解在200~300ml的乙醇里，加热至70~90℃，回流20~30h，得到N-咪唑丙基葡糖酰胺。
4.根据权利要求1所述的一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，将5mM~8mM的N-咪唑丙基葡糖酰胺和同等摩尔的3-异氰酸酯基丙基三甲氧基硅烷混合溶于乙醇，回流2~4天，进行甲基化反应，得到N-三甲基硅基丙基-N’-葡糖酰胺丙基咪唑+碘离子。
5.根据权利要求1所述的一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，将步骤三中得到的N-三甲基硅基丙基-N’-葡糖酰胺丙基咪唑+碘离子溶液，加入磁子进行机械搅拌，并加入步骤一中制备的含有2.5~3.5g硅胶的甲醇匀浆15~25ml，搅拌均匀后，搅拌10~15h后，加热至65~75℃，回流24h，得到乳白色悬浊液。
6.根据权利要求1所述的一种糖基功能化咪唑型离子液体固定相的制备方法，其特征在于，所述步骤五中，将步骤四所得乳白色悬浊液过滤，并用体积比均为1：1的乙醇：水溶液和甲醇：水溶液进行清洗，过滤后所得的产物即为N，N’-三甲氧基丙基葡糖酰胺咪唑离子液体键合硅胶色谱固定相，将所得的产物放入真空干燥箱，在温度为70~100℃的情况下干燥8~12h。
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