JPH0987300A - 雑種蛋白質およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】有効で安全なＨＩＶ感染予防およびエイズ発症
予防ワクチンを開発する。 【解決手段】ヒト免疫不全ウイルスＧａｇＰ２４抗原と
インターロイキン２類とからなる雑種蛋白質および該雑
種蛋白質を含有するワクチン。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト免疫不全ウイ
ルス（Human Immunodeficiency Virus: ＨＩＶ）感染予
防ワクチン、及び後天性免疫不全症候群（acquired imm
unodeficiency syndrome: AIDS: エイズ）の発症予防ワ
クチンに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ウイルスに対するワクチンは、ウイルス
を不活化したものを用いる不活化ワクチンやウイルスを
弱毒化したものを用いる生ワクチンが一般的である。し
かし、エイズの原因ウイルスであるＨＩＶに対するワク
チンの開発には、ＨＩＶの抗原性が変異しやすいこと
や、感染したＨＩＶはｃＤＮＡとなってヒト染色体に組
み込まれて潜伏感染する過程を持っていることなどのた
めに問題点が多い。すなわち、ＨＩＶの弱毒生ワクチン
については、ワクチン候補株の弱毒化やその安全性の証
明のために、その開発期間の極めて長期化が予想され
る。また、弱毒株ができたとしても、ＨＩＶは変異が起
こりやすいために毒性が復帰することも懸念される。ま
た、ＨＩＶのゲノムＲＮＡにはそれ自身で感染性ウイル
スを生成させる能力があるため、不活性化ワクチンも危
険性が大きい。そのため、ウイルスの適当な抗原、また
は抗原の一部のペプチドを免疫原とする成分ワクチンの
開発が期待される。現在開発中のＨＩＶワクチンの免疫
原として、外被糖蛋白質（Ｅｎｖ抗原）が最も多く使用
されているが、Ｅｎｖ抗原は変異が起こり易い（T. F.
W. Wolfs et. al. : ウィロロジー（Virology）185: 19
5-205, 1991）。また、エイズ感染者では、体内に高力
価の抗ＨＩＶ抗体が産生されているにもかかわらず、感
染性のＨＩＶそのものが血液中に存在していることが知
られている（D. D. Ho et. al. : ニュー・イングラン
ド・ジャーナル・オブ・メディシン（N. Engl. J. Me
d.） 321: 1621-1625, 1989）ことから、ワクチンで抗
体産生を誘導させても、ＨＩＶ感染を予防し、体内のＨ
ＩＶを排除することは難しいことがあることが判る。さ
らに、ＨＩＶの感染は、遊離のＨＩＶによることより
も、感染細胞が経粘膜的に侵入することによることの方
が多い（C. J. Miller et. al. : ラボラトリー・イン
ベスティゲイション（Lab. Invest.） 68: 129-145, 19
93）。

【０００３】また本発明者等はワクチン用の抗原とリン
ホカインとの融合蛋白を提案しており（特開平04-11739
9号公報）、ここでは単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ−
１）の表面抗原たるｇＤ、ｇＢとリンホカインとの融合
蛋白、あるいは該抗原とリンホカインの各々の精製標品
を別個に調製しそれらを化学的に結合した雑種蛋白を記
載している他、ＨＩＶ抗原とリンホカインとの融合蛋白
についても記載している。この単純ヘルペスウイルス
（HSV-1）の糖蛋白質Ｄ（gD）とヒトのインターロイキ
ン２（IL-２）とを融合させたサイトカイン融合抗原（g
D-IL-２）が抗ヘルペス剤として有効であることは、マ
ウス（M. Hazama et. al. : ワクチン（Vaccine ）11:
629-636, 1993）およびモルモットの性器ヘルペスモデ
ル （M. Nakao et. al. : ジャーナル・オブ・インフェ
クシャス・ディジーズ（J. Infect.Dis.） 169: 787-79
1, 1994）を用いた動物実験において証明されている。
該融合蛋白質ｇＤ−ＩＬ−２は、ＨＳＶ−１由来のｇＤ
遺伝子の下流にヒトＩＬ−２遺伝子を結合させた融合遺
伝子をマウス・ミエローマ細胞（Sp2/0）に導入して発
現させたものである。ｇＤ−ＩＬ−２は、ＩＬ−２レセ
プターを発現している樹状細胞などの抗原提示細胞へ効
率的にターゲッティングされ、ｇＤ特異的Ｔ細胞の活性
化を誘導するために、強力な免疫原性を発揮すると考え
られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】有効で安全なＨＩＶ感
染予防およびエイズ発症予防ワクチンを開発することが
本発明の課題であり、このワクチンは上記のように、抗
体産生を主とする体液性免疫を誘導するだけではなく、
感染細胞を傷害するキラーＴ細胞を主とする細胞性免疫
をも同時に誘導し得るようなものが望まれる。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、有効で安
全なエイズワクチンを開発するためには、まず、変異が
比較的少なく、Ｔ細胞エピトープを含む適当な抗原を選
び、次に、該抗原の免疫原性を高める工夫を施す必要が
あると考え、更に上記のように、ＨＩＶに対するワクチ
ンは、抗体産生を主とする体液性免疫を誘導するだけで
はなく、感染細胞を傷害するキラーＴ細胞を主とする細
胞性免疫をも同時に誘導し得るようなものが望まれるこ
とを考慮に入れ、鋭意研究を行った結果、以下のように
して本発明を完成したものである。一般に、ウイルスに
対する中和抗体のエピトープやキラーＴ細胞の認識部位
は有用なワクチン免疫原の候補と考えられる。しかしな
がら、ＨＩＶの場合にはこれらの部位のほとんどは変異
し得ることが明らかになっているため（P. L. Naraet.
al. : フィデレーション・オブ・アメリカン・ソサイア
ティーズ・フォー・エキスペリメンタル・バイオロジー
・ジャーナル（FASEB J.） 5: 2437-2455,1991）、ワク
チンの免疫原として不適当な場合がある。そこで本発明
者等はＨＩＶ-１のＧａｇ抗原中のＰ２４抗原が、Ｅｎ
ｖ抗原ほどには変異しない安定な抗原であり、また、Ｐ
２４抗原中にサル免疫不全ウイルスＳＩＶａｇｍとＳＩ
Ｖｍａｃ、およびネコ免疫不全ウイルスＦＩＶとの間で
も高い相同性を示す領域が同定され（K. Matsuo et. a
l. :ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウィロロジー（
J. Gen. Virol.） 73: 2445-2450, 1992）、さらにこの
領域にキラーＴ細胞誘導能があることが知られている
（Y. Nishino et. al.: ワクチン（Vaccine） 12: 485-
491, 1994）ことに注目し、このＧａｇＰ２４抗原を本
発明のワクチンに用いることを考えた。また、Ｇａｇ抗
原に対する抗体はエイズ発症前に低下することが知られ
ており、Ｇａｇに対する免疫応答はエイズ発症を抑制す
る可能性がある（J. B. Spear et. al. : J. Infect. D
is. 158:1132-1133, 1988）。一方、先に述べた単純ヘ
ルペスウイルス（HSV-1）の糖蛋白質Ｄ（gD）とヒトの
インターロイキン２（IL-２）とを融合させたサイトカ
イン融合抗原（gD-IL-２）が抗ヘルペス剤として有効で
あること、ｇＤ−ＩＬ−２は、ｇＤ精製標品とＩＬ−２
精製標品とを別々に調製し、化学的に両者を結合させる
ことによっても作製することができること、ｇＤ−ＩＬ
−２は、ＩＬ−２レセプターを発現している樹状細胞な
どの抗原提示細胞へ効率的にターゲッティングされ、ｇ
Ｄ特異的Ｔ細胞の活性化を誘導するために、強力な免疫
原性を発揮すると考えられていることを考慮して研究を
進めた結果、本発明者等は、ＨＩＶ抗原として上記の比
較的安定なＧａｇＰ２４抗原を用いると共に、ヘルペス
ウイルスのワクチンにおけるアジュバントとして用いら
れたインターロイキンを用いた新規な雑種蛋白質がＨＩ
Ｖ感染予防および後天性免疫不全症候群のワクチンとし
て安全かつ有用であることを見出し、本発明に到達した
ものである。

【０００６】すなわち、本発明は、ＨＩＶのＧａｇＰ２
４抗原とインターロイキン２類とからなる雑種蛋白質、
およびそれを含有するＨＩＶ感染予防ワクチンと後天性
免疫不全症候群（acquired immunodeficiency syndrom
e: AIDS: エイズ）の発症予防ワクチンを提供するもの
である。更に詳しくは、本発明は、（１）ヒト免疫不全
ウイルスＧａｇＰ２４抗原とインターロイキン２類とか
らなる雑種蛋白質、（２）上記（１）記載の雑種蛋白質
を含有するワクチン、（３）ヒト免疫不全ウイルス感染
による後天性免疫不全症候群の発症予防用である上記
（２）記載のワクチン、および（４）ヒト免疫不全ウイ
ルスの感染予防用である上記（２）記載のワクチンに関
する。

【０００７】

【発明の実施の形態】ヒト免疫不全ウイルスとしては、
１型、２型などが挙げられるが、好ましくは、１型が挙
げられる。本発明で用いられるヒト免疫不全ウイルスＧ
ａｇＰ２４抗原は、前駆体ＧａｇＰ５５からプロセシン
グによって生まれるコア蛋白質成分であり、ＧａｇＰ２
４抗原としては、A. Adachi et al. : ジャーナル・オブ
・ウィロロジー（J. Virol）59 : 284-291（1986）、F.
Buseyne et al. : ジャーナル・オブ・ウィロロジー（J.
Virol）67 : 694-702（1993）などに記載のものが挙げ
られる。ＧａｇＰ２４抗原としては遺伝子工学的に製造
されるものが好ましく、例えば、ＧｅｎＢａｎｋに登録
されている配列（Ｔ． Ｔｈｅｏｄｏｒｅ ｅｔ ａｌ．
１９８８，ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃Ｍ３
８４３１， １１８６−１８７８（塩基配列）、Ｐｒｏ1
33−Ｌｅｕ363）を基に通常の遺伝子工学的方法によっ
て製造されるものが挙げられる。例えば、ＧａｇＰ２４
抗原は、ＨＩＶのＧａｇＰ２４遺伝子を大腸菌Ｔ７プロ
モーター系（A. Rosenberg et. al. : ジーン（Gene）5
6: 125-135, 1987）を利用して発現させ、調製すること
ができる。また、ＧａｇＰ２４遺伝子を真核細胞、例え
ばマウス・ミエローマ細胞株（Ｓｐ２／０）、サル腎細
胞株（ＣＯＳ−７）、チャイニーズハムスター卵巣細胞
株（ＣＨＯ）、昆虫培養細胞株（Ｓｆ９）などを宿主に
用いて発現させ、調製することができる。

【０００８】インターロイキン２（ＩＬ−２）類とは、
ＩＬ−２活性を有する物質であり、すなわち、Ｔ細胞を
継代維持し得る作用を有する物質であればいずれでもよ
い。例えば、動物体内や動物細胞で産生される天然のＩ
Ｌ−２や遺伝子組換え技術で生産される組換え型ＩＬ−
２などが挙げられるが、なかでもヒトＩＬ−２が好まし
く、とりわけヒト組換え型ＩＬ−２が好ましい。上記Ｉ
Ｌ−２は、糖鎖を有していてもよく、また有さなくても
よい。具体的には、例えば遺伝子工学技術により製造さ
れる図１（配列番号：１）で示されるアミノ酸配列を有
するポリペプチド（Ａ）（特開昭６１−７８７９９号公
報、特開平４−１１７３９９号公報参照）、その生物学
的もしくは免疫学的活性に必要な一部のアミノ酸配列か
らなるフラグメントでもよい。上記フラグメントとして
は、例えばポリペプチド（Ａ）のアミノ末端から１個の
アミノ酸（ＥＰＣ公開９１５３９号公報参照）または４
個のアミノ酸を欠くフラグメント（特開昭６０−１２６
０８８号公報）やカルボキシル末端部の数個のアミノ酸
を欠くフラグメントなどが挙げられる。さらに上記ポリ
ペプチド（Ａ）の構成アミノ酸の一部が欠損しているか
他のアミノ酸に置換されたもの、例えば１２５位のシス
ティン残基がセリン残基に置換されたもの（特開昭５９
−９３０９３号公報参照）でもよい。上記遺伝子工学技
術で製造される組換え型ＩＬ−２は、ポリペプチド
（Ａ）のアミノ末端にさらにＭｅｔを有してもよく（特
開昭６１−７８７９９号公報参照）、またポリペプチド
（Ａ）とそのアミノ末端にさらにＭｅｔを有するポリペ
プチド（Ａ）との混合物でもよい（特開昭６０−１５５
２８号公報参照）。

【０００９】ＩＬ−２類は、例えば、特開昭６０−１１
５５２８号公報または特開昭６１−７８７９９号公報に
記載の方法に従って、ＩＬ−２類遺伝子を大腸菌で発現
させて調製することができる。この調製方法としては例
えば、ヒト末梢白血球の培養液からヒトＩＬ−２をコー
ドするｍＲＮＡを分離し、逆転写酵素などを用いて単鎖
のｃＤＮＡを合成した後、二重鎖ＤＮＡを合成する。つ
いで、プラスミドに導入して、例えば大腸菌や枯草菌な
どを形質転換させ、これよりｃＤＮＡ含有プラスミドを
単離することによりヒトＩＬ−２をコードする二重鎖Ｄ
ＮＡを製造することができる。このＤＮＡを、例えばｄ
Ｇ−ｄＣホモポリマー結合法によりたとえばプラスミド
ｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ開裂エンドヌクレアーゼ切断部
位に組み込ませる。さらに、例えばヒトＩＬ−２の一部
のアミノ酸配列に対応する塩基配列をもつオリゴヌクレ
オタイドを化学合成した後、³²Ｐでラベルしてプローブ
となし自体公知の方法でコロニーハイブリダイゼイショ
ン法により、テトラサイクリン耐性あるいはアンピシリ
ン感受性のトランスフォーマントの中から求めるクロー
ンを選出する。上記ハイブリダイゼイション法で陽性を
示したクローンのＤＮＡの塩基配列をＭａｘａｍ−Ｇｉ
ｌｂｅｒｔ法あるいはファージＭ１３を用いたジヌクレ
オチド合成鎖停止法により決定し、ヒトＩＬ−２遺伝子
の存在を確認する。次に、得られたクローンからヒトＩ
Ｌ−２遺伝子の全部あるいは一部を切り出し、プラスミ
ド中の適当なプロモーター、ＳＤ（シャイン・アンド・
ダルガーノ）塩基配列の下流につないで適当な宿主に導
入することができる。プロモーターとしてはｔｒｐプロ
モーターなどが、宿主としては大腸菌（２９４株、ＤＨ
１株など）などが有利に用いられる。ＤＮＡによる宿
主の形質転換は公知の方法（Cohen, S. N. ら、プロシ
ーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス・ＵＳＡ、第69巻、2110頁(1972年)）により実
施することができる。このようにして得られた宿主はそ
れ自体公知の培地、例えばグルコース、カザミノ酸を含
むＭ９培地中で培養される。

【００１０】培養後、公知の方法で菌体を集め、菌体を
塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤を含む緩衝液に懸濁
し、冷所で撹拌した後、遠心分離によりＩＬ−２を含む
上澄液を得る方法、あるいは緩衝液に懸濁し、超音波処
理、リゾチームおよび／または凍結融解によって菌体を
破壊した後、遠心分離によりＩＬ−２を含む上澄液を得
る方法などが適宜用い得る。上記上澄液からＩＬ−２を
分離、精製するには、自体公知の分離・精製法を適宜に
組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離・
精製法としては塩析や溶媒沈殿法などの溶解度を利用す
る方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法およびＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分
子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィ
ーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティクロマ
トグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相
クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、
等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法など
が挙げられる。

【００１１】上記ＩＬ−２の分離・精製の一例について
更に詳しく述べると、ヒトＩＬ−２をコードする遺伝子
を含有する大腸菌を培養して得られる菌体を塩酸グアニ
ジン（好ましくは２Ｍ〜８Ｍの濃度で用いる）などの蛋
白変性剤に懸濁させ、撹拌後遠心分離により上澄液を集
める。上澄液をそのままあるいは限外濾過装置などによ
り濃縮して透析し、生じた沈殿を遠心分離により除き、
得られる上澄液を、たとえばジエチルアミノエチルセル
ロース〔ＤＥ５２セルロース（ワットマン社製、アメリ
カ）カラムなど〕を用いて陰イオン交換クロマトグラフ
ィーを行い活性画分を集める。次いで、活性画分を限外
濾過装置を用いて濃縮したあと、たとえばＮ，Ｎ’−メ
チレンビスアクリルアミド架橋アリルデキストランたと
えばセファクリルＳ−２００（ファルマシア社製，スエ
ーデン）カラム等を用いるゲル濾過を行う。活性画分を
集め、次いで前記した高速液体クロマトグラフィーを行
う。このような方法により、非グリコシル化ヒトＩＬ−
２を取得することができる。なお、ここで高速液体クロ
マトグラフィーに用いる逆相系カラムとしては、例えば
アルキル化（Ｃ_1-18程度）ケイ素のものが挙げられる。
溶出溶媒としては、Ｃ_1-6程度の低級アルカノール（エ
タノール，プロパノールなど）やアセトニトリルが有利
に使用でき、ｐＨは１．５〜４が好ましい。溶出速度は
０．１〜１００ｍｌ／ｍｉｎが好ましい。ここで得られ
るヒトＩＬ−２蛋白質溶液は必要によりこれを凍結乾燥
により粉末とすることができる。凍結乾燥に際しては、
ソルビトール，マンニトール，デキストロース，マルト
ース，グリセロール，ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）な
どの安定剤を加えることができる。

【００１２】等電点の差を利用する方法では、たとえば
アンホラインを利用する密度勾配等電点電気泳動法、ゲ
ル等電点電気泳動法、等速度電気泳動法などの電場の中
で蛋白質を泳動させる方法やクロマトホーカシング法、
ＦＰＬＣ法（Fast Protein Liquid Chromatography）、
ＤＥＡＥ(Diethylaminoethyl)イオン交換カラムクロマ
トグラフ法、CM(carboxymethyl)イオン交換カラムクロ
マトグラフ法またはSP(sulphopropyl)イオン交換カラム
クロマトグラフ法などの、溶出カラム等の荷電担体に付
加した蛋白質を、ｐＨ勾配または塩濃度勾配を作成して
等電点の差異をもたらす荷電の相異に従って担体から蛋
白質を順に脱離して溶出させる方法などを用いることが
できる。

【００１３】ＨＩＶのＧａｇＰ２４抗原とＩＬ−２類と
を結合させるためには、蛋白質分子中に存在している置
換基を利用して化学的に結合させることができる。すな
わち、ＧａｇＰ２４抗原とＩＬ−２類とを化学的に結合
させるために、これらの蛋白分子中に存在している置換
基、例えばアミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基
またはスルフヒドリル基などを利用することができる。
例えば、（１）一方の蛋白の反応性アミノ基をＮ−ヒド
ロキシスクシミドの活性エステル〔例、ｐ−マレイミド
メチルシクロヘキサン−１−カルボキシル−Ｎ−ヒドロ
キシスクシミドエステル、Ｎ−（ε−マレイミドカプロ
イロキシ）スクシミドエステルなど〕と反応させてマレ
イミド化したのち、ｉ）他方の蛋白をジチオスレイト−
ル（ＤＴＴ）で還元した蛋白、あるいはii）他方の蛋白
にＮ-スクシミジル-３-（２-ピリジルジチオ）プロピオ
ネート（ＳＰＤＰ）でスルフヒドリル基を導入した蛋白
のスルフヒドリル基とチオエーテル結合させる、（２）
一方の蛋白の反応性アミノ基と他方の反応性カルボキシ
ル基とを水溶性カルボジイミド試薬〔例、１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミ
ド、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチ
ル）−カルボジイミド−ｐ−トルエンスルホネートな
ど〕を用いて水溶溶媒中で脱水縮合させる、（３）２種
の蛋白双方の反応性アミノ基をスクシンジアルデヒドや
グルタルアルデヒドなどのジアルデヒド試薬を用いて結
合させる、（４）２種の蛋白をＤＴＴで還元あるいはＳ
ＰＤＰでスルフヒドリル基を導入し、再酸化によりヘテ
ロダイマーを作製する、などの方法がある。またこれら
の方法を種々組合せて、２種の蛋白活性をできるだけ損
なわずに効率良く目的のヘテロダイメリックな蛋白を作
製することもできる。以上のような結合反応終了後、得
られた雑種蛋白はセファデックスＧ１００もしくはＧ２
００、セファロース６Ｂもしくは４Ｂ、ウルトラゲルＡ
ｃＡ４４もしくは３４、セファクリルＳ２００などのゲ
ルろ過クロマトグラフィーにより精製・分取できる。あ
るいは抗体結合カラムを用いるアフィニティークロマト
グラフィーを組合せることにより選択的な分取も可能で
ある。本発明で得られる雑種蛋白質は、ＨＩＶの感染予
防のためのワクチンとして、またＨＩＶ感染によるＡＩ
ＤＳの発症予防のためのワクチンとして、有利に用いる
ことができる。

【００１４】本発明で得られる雑種蛋白質は、ウイルス
の感染予防のために用いられる各種ワクチンの投与方法
に準じて投与（筋肉内、皮下、皮内、鼻内、膣内）する
ことができる他、さらに静脈内に投与することもでき
る。該雑種蛋白質はそれ自体あるいは薬理学的に許容さ
れうる担体などとの組成物やリポソーム化製剤として用
いることができる。

【００１５】

【実施例】以下の実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
以下の実施例において用いられたいくつかのプラスミド
類、制限酵素などの酵素類、試薬は、製造業者の指示に
従って使用した。また、ＤＮＡの操作、大腸菌組換え体
の培養および産生物の回収、および化学反応は、当業者
既知の方法、あるいは文献記載の方法［モレキュラー・
クローニング（Molecular Cloning） ALaboratory Mann
ual. 2nd Edition.: T. Maniatis et. al. : CSH Labor
atory,1989］に準じて行った。また、本明細書におい
て、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-
IUB Commision on Biochemical Nomenclature による略
号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を次に挙げる。また、アミノ酸に関して光学
異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ−体を
示すものとする。 DNA : デオキシリボ核酸 RNA : リボ核酸 A : アデニン T : チミン G : グアニン C : シトシン CBB : クーマシーブリリアントブルー SDS : ドデシル硫酸ナトリウム Gly : グリシン（Ｇ） Ala : アラニン（Ａ） Val : バリン（Ｖ） Leu : ロイシン（Ｌ） Ile : イソロイシン（Ｉ） Ser : セリン（Ｓ） Thr : スレオニン（Ｔ） Cys : システイン（Ｃ） Met : メチオニン（Ｍ） Glu : グルタミン酸（Ｅ） Asp : アスパラギン酸（Ｄ） Lys : リジン（Ｋ） Arg : アルギニン（Ｒ） His : ヒスチジン（Ｈ） Phe : フェニルアラニン（Ｆ） Tyr : チロシン（Ｙ） Trp : トリプトファン（Ｗ） Pro : プロリン（Ｐ） Asn : アスパラギン（Ｎ） Gln : グルタミン（Ｑ） Apr : アンピシリン耐性遺伝子

【００１６】なお、実験例または実施例で用いたＩＬ−
２は、図１に示すアミノ酸配列を有するヒトＩＬ−２す
なわちアミノ末端がアラニンで始まるＩＬ−２である。
該ＩＬ−２は、形質転換体エシェリヒア・コリ（Escher
ichia coli) Ｎ４８３０／ｐＴＢ２８５を用い、参考例
１および２に記載したような方法で培養し、高度に精製
され、等電点分画により分離されたものであり、その比
活性は約３.５×１０⁴単位／ｍｇである（培養、分離に
ついては特開昭６１−７８７９９号公報、精製について
は特開昭６０−１１５５２８号公報を参照されたい）。

【００１７】前記形質転換体エシェリヒア・コリＮ４８
３０／ｐＴＢ２８５は、昭和６０年４月２５日から財団
法人発酵研究所（ＩＦＯ）に、受託番号ＩＦＯ１４４３
７として寄託され、また昭和６０年４月３０日から通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）
に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−８１９９として寄託され、
該寄託はブダペスト条約に基づく寄託に切換えられて、
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８５２として同研究所（ＮＩ
ＢＨ）に保管されている。また、実験例または実施例で
用いたＧａｇＰ２４抗原は参考例３、４の方法で製造し
たものを用いた。

【００１８】〔参考例１〕非グリコシル化ヒトインター
ロイキン−２の製造 （ｉ）発現用プラスミドの構築 ヒトＩＬ−２遺伝子を有するプラスミドｐＩＬＯＴ１３
５−８（特開昭６０−１１５５２８号公報、実施例１
（vii）参照）を制限酵素ＨｇｉＡＩで切断した。得ら
れた１２９４ｂｐＤＮＡ断面をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
で平滑末端とし、Ｔ４ＤＮＡリカーゼを用いて、Ｅｃｏ
ＲＩリンカーｄＴＧＣＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡ
を結合させた。得られたＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、
翻訳開始コドンＡＴＧおよびヒトＩＬ−２遺伝子を有す
るＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を、あらかじめＥ
ｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位を消化したｐｔｒｐ７８１〔ヌ
クレイック・アシズ・リサーチ、第１１巻、３０７７頁
（１９８３）〕にＴ４ＤＮＡリカーゼを用いて挿入し
た。かくして得られた発現用プラスミドｐＴＦＩはｔｒ
ｐプロモーターの下流に翻訳開示コドンとヒトＩＬ−２
遺伝子を有する。プラスミドｐＴＦＩを制限酵素Ｓｔｕ
Ｉで切断し、ＢａｍＨＩリンカーと結合させた。このプ
ラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ
で処理し、ついでＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位にλＰＬ
プロモーターを有するプラスミドｐＴＢ２８１に挿入し
た。かくして得た発現用プラスミドをｐＴＢ２８５と命
名した。 （ii）形質転換体の製造 上記で得たプラスミドｐＴＢ２８５でエシェリヒア・コ
リＮ４８３０をコーエンらの方法〔プロシージングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐ
ｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第６９
巻、２１１０頁（１９７２）〕に従い形質転換し、上記
プラスミドを含有する形質転換体エシェリヒア・コリＮ
４８３０／ｐＴＢ２８５を得た。 （iii）形質転換体の培養 形質転換体エシェリヒア・コリＮ４８３０／ｐＴＢ２８
５を２５０ｍｌ容フラスコ内のバクト・トリプトン（デ
ィフコ・ラボラトリーズ、アメリカ）１％、バクト・イ
ーストエキス（ディフコ・ラボラトリーズ、アメリカ）
０．５％、食塩０．５％およびアンピシリン５０μｇ／
ｍｌを含む液体培地（ｐＨ７．０）５０ｍｌに接種して
３７℃で一晩回転振動培養した。この培養液をカザミノ
酸０．５％、グルコース０．５％およびアンピシリン５
０μｇ／ｍｌを含むＭ９培地２．５リットルの入った５
リットル容ジャーファーメンターに移し３５℃で６時
間、ついで４２℃でさらに３時間通気撹拌培養して培養
液２．５リットルを得た。この培養液を遠心分離し、菌
体を集め、−８０℃で凍結して保存した。

【００１９】（iv）抽出 凍結菌体２０ｇを７Ｍ塩酸グアニジン０．１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌを含む抽出（ｐＨ７．０）１００ｍｌに均一
に懸濁し、４℃で１時間撹拌した後、２８，０００×ｇ
で２０分間遠心分離し上清を得た。 （ｖ）インターロイキン−２蛋白質の部分精製 得られた上清を０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ８．５）に対して透析後１９，０００×ｇで１０
分間遠心分離して得た上清を０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＤＥ５２（ＤＥ
ＡＥ−セルロース、ワットマン社製、イギリス）カラム
（５０ｍｌ容）に通して蛋白を吸着後、ＮａＣｌ濃度直
線勾配（０〜０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１リットル）を作
成して、ＩＬ−２を溶出させ、活性画分を得た。 (vi)インターロイキン−２蛋白質の精製 上記で得られた活性画分をＹＭ−５メンブラン（アミコ
ン社製、アメリカ）を用いて、５ｍｌに濃縮し、０．１
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）−１ＭＮａＣｌ緩
衝液で平衡化したセファクリルＳ−２００（ファルマシ
ア製、スウェーデン）カラム（５００ｍｌ容）を用いて
ゲルろ過を行った。活性画分４０ｍｌをＹＭ−５メンブ
ランで３ｍｌに濃縮した。得られた濃縮液を、ウルトラ
ポアＲＰＳＣ（アルテックス社製、アメリカ）カラムに
吸着させ、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出
溶媒とする高速液体クロマトグラフィーを行った。［カ
ラム、ウルトラポアＲＰＳＣ（４．６×７５ｍｍ）：カ
ラム温度、３０℃：溶出溶媒Ａ、０．１％トリフルオロ
酢酸−９９．９％水：溶出溶媒Ｂ、０．１％トリフルオ
ロ酢酸−９９．９％アセトニトリル：溶出プログラム、
０分（６８％Ａ＋３２％Ｂ）−２５分（５５％Ａ＋４５
％Ｂ）−３５分（４５％Ａ＋５５％Ｂ）−４５分（３０
％Ａ＋７０％Ｂ）−４８分（１００％Ｂ）：溶出速度、
０．８ｍｌ／ｍｉｎ：検出波長、２３０ｎｍ。］ 本条件下で保持時間約３９分の活性画分、ＩＬ−２およ
びＭｅｔ−ＩＬ−２の混合物１０ｍｌを集めた。

【００２０】〔参考例２〕ＳＰ−５ＰＷカラムによるＩ
Ｌ−２とＭｅｔ−ＩＬ−２との分離 参考例１で得られたＩＬ−２およびＭｅｔ−ＩＬ−２の
混合物である非グリコシル化ヒトインターロイキン−２
を含む０．００５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．
０，蛋白質濃度１．０３ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを０．
０２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した高速
液体クロマトグラフィー用ＳＰ−５ ＰＷカラム(０．７
５×７．５ｃｍ；東洋曹達社製）にのせ、０．０２５Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて蛋白質を溶出し
た。カラム温度は３５℃に、緩衝液の流速は０．５ｍｌ
／ｍｉｎに設定した。クロマトグラフシステムはバリア
ン社製５５００型液体クロマトグラフを用いた。その結
果、非グリコシル化インターロイキン−２は２つのピー
ク（ピークＡおよびピークＢ）として溶出された。それ
ぞれのピークを分取しアミノ末端アミノ酸の分析を行っ
た結果、ピークＡはＭｅｔ−ＩＬ−２を、ピークＢはＩ
Ｌ−２をそれぞれ９９．５％以上の純度で含んでいるこ
とが確認された。

【００２１】〔参考例３〕ＨＩＶ−１のＧａｇＰ２４遺
伝子を含む発現プラスミドの構築 （１）プラスミドｐＢＳ₍₊₎ｇａｇ２４の構築 GenBank（compiled by National Institutes of Healt
h; distributed by Hitachi Software Engineering C
o., Ltd.）に登録［Accession #: M38431； Author: T.
Theodore et. al.；Journal: 未発表（1988年）］され
ているＨＩＶ−１ＮＹ５株の塩基配列をもとに、Ｇａｇ
抗原中のＰ２４抗原（Ｐｒｏ１３３〜Ｌｅｕ３６３）を
コードする塩基配列とその５’末端に開始コドン（ＡＴ
Ｇ）、３’末端に終止コドン（ＴＡＧ）、およびそれら
の両端にＮｄｅＩ認識配列を有する約７３０ｂｐのＤＮ
Ａ断片を合成した。このＤＮＡ断片の末端をリン酸化
し、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片で末端平滑化した
後、制限酵素ＳｍａＩで開裂したプラスミドｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ₍₊₎（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）と
結合させた。反応混合液を用いて大腸菌ＪＭ１０９［宝
酒造（株）］を形質転換し、得られたクローンから目的
のプラスミドｐＢＳ₍₊₎ｇａｇ２４を得た。 （２）プラスミドｐＥＴｇａｇ２４の構築および組換え
大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＥＴｇａｇ２４の作製 プラスミドｐＢＳ₍₊₎ｇａｇ２４をＮｄｅＩで切断し、
前記のＰ２４抗原（Ｐｒｏ１３３〜Ｌｅｕ３６３）のコ
ード領域を含む約７３０ｂｐのＤＮＡ断片を回収して、
ＮｄｅＩで開裂したプラスミドｐＥＴ−３ｃ ［メソッ
ズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology
）(ed. by D. V. Goeddel; Academic Press）, 185，6
0-88 (1990)］と結合後、反応混合液を用いて大腸菌JM1
09を形質転換した。得られたクローンからプラスミドを
調製し、Ｐ２４抗原のコード領域がプラスミドｐＥＴ−
３ｃ中のＴ７プロモーターと順方向に挿入されたプラス
ミドｐＥＴｇａｇ２４を持つクローンを選択し、プラス
ミドｐＥＴｇａｇ２４を回収して、エレクトロポレーシ
ョンによって大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）を形質転換
し、組換え大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＥＴｇａｇ
２４を得た。

【００２２】〔参考例４〕ＧａｇＰ２４遺伝子の発現お
よびＰ２４抗原の精製 （１）ＧａｇＰ２４遺伝子の発現 大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＥＴｇａｇ２４を１０
０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地で一夜培養し
た。この培養液を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有
ＬＢ培地に１／１００量植え継ぎ、６００ｎｍでの吸光
度が０．４〜０．６に達した時点でイソプロピルチオガ
ラクトシドを終濃度０．４ｍＭになるように加えて、さ
らに３〜４時間培養した後、遠心分離によって菌体を回
収した。菌体の溶解液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で展開後、ＣＢＢ染色と抗Ｐ２４抗体（AALT
O BIO REAGENTS社; アフィニティ精製ヒツジ抗ＨＩＶ−
１−Ｐ２４ Ｇａｇ）を用いたウェスタンブロッティン
グでＰ２４抗原が大量に発現されていることを確認し
た。 （２）Ｐ２４抗原の抽出 回収した菌体に培養液の１／２０容量の水を加えて懸濁
し、超音波処理後に遠心して上清と沈殿とに分けた。Ｃ
ＢＢ染色と抗Ｐ２４抗体を用いたウェスタンブロッティ
ングによって、Ｐ２４抗原は上清画分に存在し、凝集体
を形成していないことが分かった。 （３）Ｐ２４抗原の精製 上記の大腸菌破砕液を１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）に溶解し、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．
０）で平衡化したＳＰ−セファロース（Pharmacia Biot
ech社）カラムに負荷し、Ｐ２４抗原をカラムに吸着さ
せた。カラムを同緩衝液で洗浄した後、０．３Ｍ 塩化
ナトリウムを含む１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．
０）によってＰ２４抗原を溶出した。その結果、２リッ
トルの大腸菌培養液から純度９０％以上（ＣＢＢ 染色
により判断）のＰ２４抗原標品が１００ｍｇ以上得られ
た。

【００２３】〔実施例１〕 Ｐ２４抗原とヒトＩＬ−２との化学的結合（１） （１）ヒトＩＬ−２のマレイミド化 組換えヒトＩＬ−２［１ ｍｇ／ｍｌ、 ５ｍＭ 酢酸ア
ンモニウム（ｐＨ５．０）溶液中］１ ｍｇを、透析に
よって１０ｍＭ リン酸緩衝液 （ｐＨ７．０）に置換し
た後、２倍モル（４２．８μｇ）の４−（マレイミドメ
チル）−１−シクロヘキサンカルボキシル酸 Ｎ−ヒド
ロキシスクシニミドエステル（Aldrich Chem. Co.）の
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液１００μｌを添加
し、３０℃で３０分間反応させた。反応後、総量２．５
ｍｌになるように１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）を加え、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で
平衡化したＰＤ１０カラム（Pharmacia Biotech社）に
供して過剰の結合試薬を除去し、マレイミド化ＩＬ−２
溶液、３．５ｍｌを得た。 （２）Ｐ２４抗原のスルフヒドリル化 参考例４で作製したＰ２４抗原の１ｍｇを０．５ｍｌの
１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、２
倍モル（２４．０μｇ）のＮ−スクシミジル−３−（２
−ピリジルチオ）プロピオネート［ＳＰＤＰ；和光純薬
工業（株）］を含むメタノ−ル溶液２５μｌを添加し
た。３０℃で３０分間反応後、総量２．５ｍｌになるよ
うに１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、
０．１Ｍ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）水溶液６２．
５μｌを添加して還元した後、１０ｍＭ リン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で平衡化したＰＤ１０カラムに供して試
薬を除去し、スルフヒドリル化Ｐ２４抗原溶液、３．５
ｍｌを得た。

【００２４】（３）Ｐ２４抗原とヒトＩＬ−２との化学
的結合 上記の（１）で得られたマレイミド化ＩＬ−２溶液のう
ちの半量（１．７５ｍｌ）と（２）で得られたスルフヒ
ドリル化Ｐ２４抗原溶液の半量（１．７５ｍｌ）とを混
合し、４℃で２４時間以上静置して反応させた。反応混
液に塩化ナトリウムを終濃度０．１５Ｍになるように加
え、それを０．１５Ｍ 塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセファクリ
ル Ｓ−２００（Pharmacia Biotech社）カラムに供して
未反応のＰ２４抗原とＩＬ−２とを分離除去し、約１２
０μｇの化学的に結合した雑種蛋白質Ｐ２４−ＩＬ−２
を得た。なお、本標品には除去しきれなかったＰ２４が
約２４０μｇ混入していた。また、上記の方法と同様
に、マレイミド化したＰ２４抗原とスルフヒドリル化し
たＩＬ−２とを反応させた場合にも、Ｐ２４抗原とＩＬ
−２とが化学的に結合した雑種蛋白質が得られた。

【００２５】〔実施例２〕 雑種蛋白質Ｐ２４−ＩＬ−２におけるＩＬ−２の生物活
性 ＩＬ−２依存性の細胞株ＮＫＣ−３（R. Suzuki et. a
l. :ジャーナル・オブ・イムノロジー（J. Immunol. ）
139: 981-987, 1983 ; 東北大学・熊谷教授から分与さ
れたマウス・ナチュラルキラー細胞系列株）にＰ２４−
ＩＬ−２を加え、その細胞死抑制効果、すなわち ＩＬ
−２活性をＭＴＴ試薬（３−[４,５−ジメチル−２−チ
アゾリル]−２,５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム
ブロミド;（株）同仁化学研究所）によって判定したと
ころ（H. Tada et. al. : ジャーナル・オブ・イムノロ
ジカル・メソッズ（J. Immunol. Methods ）9: 157-16
5,1986）、対照のＩＬ−２が０．９７２×１０⁷ＪＲＵ
／ｍｇの比活性を示したのに対し、Ｐ２４−ＩＬ−２の
ＩＬ−２活性は０．３２４×１０⁷ＪＲＵ／ｍｇであっ
た。なお、マレイミド化したＰ２４抗原とスルフヒドリ
ル化したＩＬ−２とを化学反応させて調製した雑種蛋白
質Ｐ２４−ＩＬ−２にもＩＬ−２活性が検出された。

【００２６】〔実施例３〕 雑種蛋白質Ｐ２４−ＩＬ−２の抗Ｐ２４抗体産生誘導能 （１）雑種蛋白質Ｐ２４−ＩＬ−２によるマウスの免疫 メスの６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを以下の４群（ｎ＝
６）に分け、各抗原を２００μｌのリン酸緩衝食塩水
（ＰＢＳ）に溶解し、皮下に接種した。初回接種の３週
間後に２回目の接種を行い、初回接種後５週目に採血し
て抗体価を測定した。第１群には、完全フロインドアジ
ュバント、０．１ｍｌ（ＦＣＡ；ネガティブコントロー
ル）のみを接種し（この群のみ１回接種）、対照群とし
た。第２群には、Ｐ２４抗原、２．６μｇを２回接種し
た。第３群には、Ｐ２４抗原、２．６μｇとＩＬ−２、
１．４μｇとを混合したものを２回接種した。第４群に
は、雑種蛋白質Ｐ２４−ＩＬ−２、１μｇを２回接種し
た。

【００２７】（２）抗Ｐ２４抗体価のエンザイムイムノ
アッセイ（ＥＩＡ） 参考例４で調製したＰ２４抗原をコーティング溶液（Ki
rkegaard & Perry Laboratories, Inc.）に溶解し、イ
ムノプレート（Nunc社）の１穴あたり１μｇになるよう
に分注し、４℃で一夜静置した。ＰＢＳでプレートを１
回洗浄し、２０％ ブロックエース［大日本製薬
（株）］を含むＰＢＳを分注し、４℃で一夜静置した。
プレートを洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む
ＰＢＳ）で３回洗浄した後、（１）で調製したマウス血
清を希釈液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０と２０％ ブ
ロックエースを含むＰＢＳ）で１／６４０に希釈してプ
レートに分注し、室温で２時間静置した。洗浄液でプレ
ートを６回洗浄した後、二次抗体ＨＲＰ−ウサギ抗マウ
スＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ZYMED社）を希釈液で１／３００
０に希釈して分注し、室温で１時間静置した。洗浄液で
プレートを６回洗浄した後、ＴＭＢマイクロウェルペル
オキシダーゼサブストレートシステム（Microwell Pero
xidase Substrate System； Kirkegaard & Perry Labor
atories, Inc.）で発色反応を行い２倍量の１ＮＨ₂ＳＯ
₄を加えて反応を止め、４５０ｎｍの吸光度を測定し
た。結果を表１に示す。雑種蛋白質Ｐ２４−ＩＬ−２投
与群では、対照群と比較し、有意な抗Ｐ２４抗体産生の
誘導が証明された。また、Ｐ２４抗原とＩＬ−２の混合
投与群との比較では、有意ではないが、高力価を示す傾
向が見られた。一方、Ｐ２４抗原とＩＬ−２の混合投与
群では、抗体価が僅かに上昇したものの対照群と比べて
有意ではなかった。以上のことから、雑種蛋白質はアジ
ュバントを添加しなくても優れた免疫原性を発揮するこ
とが予想された。

【００２８】

【表１】

【００２９】〔実施例４〕 Ｐ２４抗原とヒトＩＬ−２との化学的結合（２） （１）ヒトＩＬ−２のマレイミド化 実施例１に示した組換えヒトＩＬ−２、 ２．５ｍｇを
透析によって １０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）に
置換した後、２倍モル（１０７．２μｇ）の４−（マレ
イミドメチル）−１−シクロヘキサンカルボキシル酸
Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルのＤＭＦ溶液２５
０μｌを添加し、反応後、ＰＤ１０カラムに供してマレ
イミド化ＩＬ−２溶液３．５ｍｌを得た。 （２）Ｐ２４抗原のスルフヒドリル化 参考例４で作製したＰ２４抗原の４ｍｇを２ｍｌの１０
ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）に溶解して２倍モル
（９７．２μｇ）のＳＰＤＰのメタノール溶液１００μ
ｌを添加し、反応させた。反応後、総量２．５ｍｌにな
るように１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）を加
え、０．１Ｍ ＤＴＴ水溶液６２．５μｌを添加して還
元した後、ＰＤ１０カラムに供してスルフヒドリル化Ｐ
２４溶液３．５ｍｌを得た。 （３）Ｐ２４抗原とヒトＩＬ−２との化学的結合 上記の（１）で得られたマレイミド化ＩＬ−２溶液３．
５ｍｌと（２）で得られたスルフヒドリル化Ｐ２４抗原
溶液３．５ｍｌとを混合し、４℃で２４時間以上静置し
て反応させ雑種蛋白質Ｐ２４−ＩＬ−２を得た。 （４）雑種蛋白質Ｐ２４−ＩＬ−２の精製 上記の（３）の反応混液１．７５ｍｌ（Ｐ２４抗原１ｍ
ｇ分とＩＬ−２、６２５μｇ分との反応液）を３回に分
けて１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ８．０）で平衡化し
たハイトラップヘパリンカラム（Pharmacia Biotech
社）に供して０〜１Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配によ
り溶出した。得られたＰ２４−ＩＬ−２溶出画分を５回
に分けて１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）／０．
１５Ｍ 塩化ナトリウムで平衡化したプロテインパック
３００カラム（Waters Corporation）に供して分画化
し、純度９０％程度の雑種蛋白質Ｐ２４−ＩＬ−２の画
分を得た。定量の結果、Ｐ２４−ＩＬ−２画分には２
３．７μｇの蛋白質が含まれていることがわかった。つ
まり、１ｍｇのＰ２４抗原と６２５μｇのＩＬ−２とか
ら純度約９０％のＰ２４−ＩＬ−２が２３．７μｇ得ら
れた。

【００３０】〔実施例５〕 実施例４で作製した雑種蛋白質Ｐ２４−ＩＬ−２におけ
るＩＬ−２の生物活性 実施例２と同様、ＮＫＣ−３細胞の細胞死抑制効果から
ＩＬ−２活性を測定した。判定試薬にはＭＴＴの代わり
にアラマーブルー（Alamar Biosciences, Inc.）を用い
た。対照のＩＬ−２が０．９７２×１０⁷ＪＲＵ／ｍｇ
の比活性を示したのに対し、Ｐ２４−ＩＬ−２のＩＬ−
２活性は０．５０８×１０⁷ＪＲＵ／ｍｇであった。

【００３１】〔実施例６〕 実施例４で作製した雑種蛋白質Ｐ２４−ＩＬ−２の抗Ｐ
２４抗体産生誘導能 （１）雑種蛋白質Ｐ２４−ＩＬ−２によるマウスの免疫 メスの７週齢のＣ３Ｈ／Ｈｅマウスを以下の４群（ｎ＝
６）に分け、各抗原を２００μｌのＰＢＳに溶解し皮下
に接種した。初回免疫の３週間後に２回目の接種を行
い、初回免疫後５週目に採血して抗体価を測定した。第
１群にはＰＢＳのみ（ネガティブコントロール）を、第
２群にはＰ２４抗原１μｇを、第３群にはＰ２４抗原１
μｇとＩＬ−２、０．６μｇを、第４群にはＰ２４−Ｉ
Ｌ−２、１μｇをそれぞれ２回接種した。 （２）抗Ｐ２４抗体価のＥＩＡ 実施例３と同様のＥＩＡを行った。ただし、マウス血清
の濃度は１／４０に変更した。結果を表２に示す。雑種
蛋白質Ｐ２４−ＩＬ−２投与群では、対照群およびＰ２
４抗原とＩＬ−２の混合投与群と比較し、有意な抗Ｐ２
４抗体産生の誘導が証明された。一方、Ｐ２４抗原とＩ
Ｌ−２の混合投与群では、抗体価が僅かに上昇したもの
の対照群と比べて有意ではなかった。以上のことから、
雑種蛋白質はアジュバントを添加しなくても優れた免疫
原性を発揮することが明らかになった。

【００３２】

【表２】

【００３３】

【発明の効果】本発明によるＨＩＶ・ＧａｇＰ２４抗原
とインターロイキン２類とからなる雑種蛋白質（ＨＩＶ
・ＧａｇＰ２４)-(ＩＬ２)）は、インターロイキン２非
結合の抗原に比べてはるかに高い免疫原性を示し、ＨＩ
Ｖの感染予防および感染による免疫不全症候群の発症を
抑制するワクチンの安定な免疫原として有用である。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：133 配列の型: アミノ酸 トポロジー: 直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明で用いたインターロイキン２のアミノ酸
配列を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｋ Ｃ１２Ｐ 21/02 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 松尾 久仁子 京都府京都市西京区下津林六反田１番地の 74

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト免疫不全ウイルスＧａｇＰ２４抗原と
   インターロイキン２類とからなる雑種蛋白質。
2. 【請求項２】ヒト免疫不全ウイルスがヒト免疫不全ウイ
   ルス−１である請求項１記載の雑種蛋白質。
3. 【請求項３】請求項１又は２記載の雑種蛋白質を含有す
   るワクチン。
4. 【請求項４】ヒト免疫不全ウイルス感染による後天性免
   疫不全症候群の発症予防用である請求項３記載のワクチ
   ン。
5. 【請求項５】ヒト免疫不全ウイルスの感染予防用である
   請求項３記載のワクチン。