RS60141B1 - Konjugati antitela specifičnog za axl i lekova za lečenje kancera - Google Patents

Konjugati antitela specifičnog za axl i lekova za lečenje kancera

Info

Publication number
RS60141B1
RS60141B1 RS20200419A RSP20200419A RS60141B1 RS 60141 B1 RS60141 B1 RS 60141B1 RS 20200419 A RS20200419 A RS 20200419A RS P20200419 A RSP20200419 A RS P20200419A RS 60141 B1 RS60141 B1 RS 60141B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
region
axl
seq
antibody
adc
Prior art date
Application number
RS20200419A
Other languages
English (en)
Inventor
Julia Boshuizen
Kirstine Jacobsen
Esther Breij
Louise Koopman
David Satijn
Den Brink Edward Van
Dennis Verzijl
Jong Rob De
Dijkhuizen Radersma Riemke Van
Daniel Peeper
Henrik Jørn Ditzel
Paul Parren
Original Assignee
Genmab As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/EP2015/065900 external-priority patent/WO2016005593A1/en
Application filed by Genmab As filed Critical Genmab As
Publication of RS60141B1 publication Critical patent/RS60141B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis pronalaska
OBLAST TEHNIKE
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na konjugate antitela i leka (ADC) koji se vezuju za humani AXL za terapijsku upotrebu, posebno za lečenje rezistentnih ili refraktornih kancera.
STANJE TEHNIKE PRONALASKA
[0002] AXL je transmembranski protein od 104-140 kDa koji pripada TAM potfamiliji sisarskih tirozin kinaznih receptora (RTK) i koga karakterišu transformišuće sposobnosti (Paccez i saradnici, 2014). Vanćelijski domen AXL je sastavlјen od kombinacije dva N-terminalna domena slična imunoglobulinskim (Ig) domenima (Ig1 i Ig2 domenima) koji su postavljeni distalno u odnosu na membranu, kao i dva ponovka fibronektinskog tipa III (FNIII) postavljena proksimalno u odnosu na membranu (FN1- i FN2-domeni) (Paccez i saradnici, 2014). Pojačana ili de novo eksresija AXL je prijavljena u raznim kancerima, uključujući kancer želuca, prostate, jajnika i pluća (Paccez i saradnici, 2014). Potrebno je napomenuti da je utvrđeno da više vrsta kancera sa rezistencijom na inhibitore tirozin kinaze, inhibitore serin/treonin kinaze i/ili hemoterapiju karakteriše pojačana ili de novo ekspresija AXL proteina. Preciznije, tumorske ćelije sa rezistencijom na ciljanu terapiju za receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR) (Wilson i saradnici, 2014; Brand i saradnici, 2015; Zhang i saradnici, 2012; Blakely i saradnici, 2012) ili na inhibitore B-raf (BRAF) puta (Müller i saradnici, 2014) karakteriše pojačana ili de novo ekpresija AXL. Dodatno, pojačana ili de novo ekspresija AXL je prijavljena kod ćelija kancera glave i vrata (SCCHN) rezistentnih na PI3K inhibitor BYL719 (Elkabets i saradnici, 2015), kod kancera dojke rezistentnog na lapatinib, agens koji ciljano deluje na HER2 (Liu i saradnici, 2009), kod gastrointestnalnih stromalnih tumora (GIST) rezistentnih na imatinib (Mahadevan i saradnici, 2015), kod kancera bubrega rezistentnog na sunitinib (Zhou i saradnici, 2015), u ćelijama neuroblastoma i kod nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC) rezistentnih na ALK inhibitor krizotinib (Debruyne i saradnici, 2015; Kim i saradnici, 2013), kod kancera jednjaka rezistentnog na cisplatin (Hong i saradnici, 2013), kod rabdomiosarkoma rezistentnog na IGF-IR antitelo MAB391 (Huang i saradnici, 2010), u akutnoj mijeloidnoj leukemiji (AML) rezistentnoj na FLT3 inhibitore poput midostaurina (PKC412) ili kvizartiniba (AC220) (Park i saradnici, 2015), u AML rezistentnom na lekove (Hong i saradnici, 2008) i kod hronične mijeloidne leukemije rezistentne na imatinib (Dufies i saradnici, 2011). Ekspresija AXL je takođe indukovana u ćelijama kancera prostate sa stečenom rezistencijom na metformin (Bansal i saradnici, 2015).
[0003] AXL može biti aktiviran po vezivanju njegovog liganda, faktora specifičnog za zaustavljanje rasta tipa 6 koji je zavisan od vitamina K (Gas6). Vezanje Gas6 za AXL dovodi do AXL dimerizacije, autofosforilacije i naknadne aktivacije unutarćelijskih signalnih puteva, kao što su PI3K/AKT, mitogenom aktivirane protein kinazne (MAPK), STAT i NF-κB kaskade (Leconet i saradnici, 2013). U kancerskim ćelijama, ekspresija AXL-a je povezana sa pokretlјivošću, invazijom, migracijom tumorskih ćelija, a uključena je i u prelazak epitela u mezenhim (EMT) (Linger i saradnici, 2010).
[0004] Cilјana inhibicija AXL i/ili njegovog liganda Gas6 može biti efektivna kao anti-tumorska terapija upotrebom, npr. malih molekula ili anti-AXL antitela (Linger i saradnici, 2010). Opisana su anti-AXL antitela koja ublažavaju NSCLC i rast ksenografta kancera dojke in vivo, negativnom regulacijom ekspresije receptora, smanjenjem proliferacije tumorskih ćelija i indukovanjem apoptoze (Li i saradnici, 2009; Ye i saradnici, 2010; WO 2011/159980, Genentech). Prijavljena su i razna druga anti-AXL antitela (Leconet i saradnici, 2013; lida i saradnici, 2014; WO 2012/175691, INSERM; WO 2012/175692, INSERM; WO 2013/064685, Pierre Fabré Medicaments; WO 2013/090776, INSERM; WO 2009/063965, Chugai Pharmaceuticals i WO 2010/131733), uklјučujući ADC zasnovan na anti-AXL antitelu i pirolobenzo-diazepinskom (PBD) dimeru (WO 2014/174111, Pierre Fabré Medicament i Spirogen Sari).
[0005] Breij i saradnici, "Novel antibody-drug conjgates targeting Axl show anti-tumor activity in solid cancer xenograft models", American Association of Cancer Research, 19. april 2015, str. 1-2 (XP055296816), opisuju upotrebu konjugata lekova i anti-AXL antitela (ADC) za lečenje kancera pluća i epidermoidnih karcinoma. Anti-AXL antitela su bila konjugovana sa MMAE.
[0006] Breij i saradnici, Journal of Clinical Oncology, vol. 33, 29. maj 2015, str. 1-2 (XP055297040) opisuju upotrebu AXL antitela konjugovanog sa MMAE za ubiijanje ćelija kancera pluća in vivo.
[0007] WO 2014/068139 opisuje anti-AXL antitela, 1003A2 i 1024G11 i njihovih konjugata sa saporinom za ubijanje raznih tumorskih ćelijskih linija.
[0008] WO 2016/005593 opisuje inhibitorna anti-AXL antitela koja inhibiraju rast tumora i nisu u kompeticiji sa GAS6 ligandom u vezivanju za AXL, kao i njihovu upotrebu kao ADC sa MMAE za ubiijanje raznih tipova kancera in vivo, kao što su kancer dojke, kancer pluća, karcinom grlića materice, kancer jednjaka, epidermoidni karcinom i kancer pankreasa.
[0009] Ipak, i dalje postoji potreba za pobolјšanim postupcima lečenja kancera koji jesu, ili su sa visokom tendencijom da postanu, rezistentni na inhibitore tirozin kinaze, inhibitore serin/treonin kinaze i/ili hemoterapiju, naročito upotrebom AXL-ADC.
KRATKO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0010] Predmetni pronalazač(i) su utvrdili da ADC zasnovani na anti-AXL antitelima mogu biti upotrebljeni za efikasno lečenje kancera koji su rezistentni, ili su sa velikom tendencijom da postanu rezistentni, na određene terapijske agense.
[0011] Tako, prema jednom aspektu, pronalazak se odnosi na ADC koji sadrži antitelo koje se vezuje za humani AXL za upotrebu u lečenju kancera rezistentnog na najmanje jedan terapijski agens izabran iz grupe koja se sastoji od inhibitora tirozin kinaze, inhibitora serin/treonin kinaze i hemoterapijskog agensa, pri čemu ADC sadrži najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 36, 37, i 38, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom.
[0012] Ovaj aspekt i primeri izvođenja i opisi, uklјučujući upotrebu AXL-ADC zasnovanih na anti-AXL antitelima koja karakterišu njihove osobine vezivanja antigena ili sekvenci antigena, terapijski ostaci pogodni za takve ACD, kombinacije takvih ACD sa određenim terapijskim agensima, kao i postupci lečenja rezistentnih neoplazija, detalјnije su opisani u tekstu koji sledi.
LEGENDE SLIKA NACRTA
[0013]
Slika 1: Krive vezivanja anti-AXL antitela za HEK293 ćelije transfektovane sa (A) humanim AXL-ECD, (B) AXL-ECD cinomolgus majmuna ili (C) mišjim AXL-ECD. Prikazani podaci su srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) jednog reprezentativnog eksperimenta, kao što je opisano u Primeru 2.
Slika 2: Vezivanje anti-AXL antitela za AXL himere miša i čoveka je urađeno kao što je opisano u Primeru 3. Ispitivani su sledeći himerni proteini Homo sapiens AXL (hsAXL) i Mus musculus AXL-a (mmAXL): (A) hsAXL i mock, (B) hsAXL-mmECD, (C) hsAXL-mmIg1, (D) hsAXL-mmIg2, (E) hsAXL-mmFN1, (F) hsAXL-mmFN2.
Slika 3: Citotoksičnost posredovana ćelijama i zavisna od anti-AXL antitela u A431 ćelijama. Citotoksičnost posredovana ćelijama i zavisna od anti-AXL antitela u A431 ćelijama je određena kao što je opisano u Primeru 4.
Slika 4: Karakteristike vezivanja konjugata AXL antitela i leka (AXL-ADC). Vezivanje AXL-ADC za HEK293T ćelije tranzientno transfektovane sa humanim AXL je određeno kao što je opisano u Primeru 5. Prikazani podaci su srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) iz jednog reprezentativnog eksperimenta.
Slika 5: In vitro citotoksičnost indukovana konjugatima AXL antitela i leka. Indukcija citotoksičnosti konjugatima AXL antitela i leka je određena kao što je objašnjeno u Primeru 6.
Slika 6: Varijante VH i VL antitela koje omogućavaju vezivanje za AXL. Antitela sa identičnim VL ili VH regionima su poravnata i identifikovane su i na slikama uokvirene razlike u VH (Slike A-D) ili VL (Slika E) sekvencama, tim redom. CDR regioni su podvučeni.
Slika 7: Indukcija citotoksičnosti sa ADC u LCLC-103H ćelijama je određena kao što je opisano u Primeru 8.
Figura 8: Anti-tumorska aktivnost AXL antitela konjugovanih sa MMAE u terapijskom LCLC-103H modelu ksenografta, određena je kao što je opisano u Primeru 9.
Slika 9: Imunohistohemijsko bojenje preseka zamrznutih PAXF1657 tumora (PDX model kancera pankreasa) upotrebom više objedinjenih AXL monoklonskih antitela, kao što je opisano u Primeru 10.
Slika 10: (A) Prosečna veličina tumora nakon terapijskog tretmana PAXF1657 modela sa AXL-ADC. Nekonjugovani AXL Humab (C) i ADC koji nije sa ciljanim dejstvom (D) ne pokazuju anti-tumorsku aktivnost, što ukazuje da je terapijski kapacitet AXL-ADC zavisio od citotoksične aktivnosti MMAE i od cilјanog vezivanja, pri čemu grafičke vrednosti greške predstavlјaju S.E.M..
Slika 11: Vezivanje anti-AXL antitela za AXL himere miša i čoveka urađeno je kao što je opisano u Primeru 11. Ispitivani su sledeći himerni proteini Homo sapiens AXL-a (hsAXL) i Mus musculus AXL-a (mmAXL): (A) hsAXL i mock, (B) hsAXL-mmECD, (C) hsAXL-mmIg1, (D) hsAXL-mmIg2, (E) hsAXL-mmFN1, (F) hsAXL-mmFN2.
Slika 12: Vezivanje humanog Gas6 (hGas6) na A431 ćelije koje su prethodno inkubirane sa antitelom koje se vezuje za Ig1 domen AXL-a. Prikazani podaci su srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI) iz jednog reprezentativnog eksperimenta.
Slika 13: Anti-tumorska aktivnost AXL antitela konjugovanih sa MMAE u terapijskom A431 modelu ksenografta koji proizvodi visok nivo endogenog Gas6, kao što je opisano u Primeru 13. Paneli A i B pokazuju rezultate iz dva nezavisna eksperimenta.
Slika 14: Anti-tumorska aktivnost AXL antitela konjugovanih sa MMAE u terapijskom LCLC-103H modelu ksenografta koji eksprimira niske nivoe endogenog Gas6, kao što je opisano u Primeru 13. Paneli A i B pokazuju rezultate iz 2 nezavisna eksperimenta.
Slika 15: Indukcija citotoksičnosti sa AXL-ADC u A431 ćelijama (A) i MDA-MB231 ćelijama (B) je određena kao što je opisano u Primeru 8.
Slika 16. Bojenje AXL u kanceru štitne žlezde, jednjaka, jajnika, dojke, pluća, pankreasa, grlića materice i endometrijuma. Prosečan intenzitet AXL bojenja (OD) ćelija pozitivnih na AXL je unet shodno X-osi grafika, dok je procenat tumorskih ćelija pozitivnih na AXL unet u odnosu na Y-osu. Svaka tačka predstavlјa vrednost za centralni region tumora, izdvojen iz pojedinačnog pacijenta.
Slika 17. Reprezentativni primeri centralnih regiona tumora nakon imunobojenja na AXL kod različitih tumorskih indikacija.
Slika 18. AXL antitela se specifično vezuju za AXL, ali ne i za ostale članove familije TAM receptora. Vezanje HuMab-AXL antitela za HEK293 ćelije transfektovane sa humanim AXL (A), humanim MER (B), humanim TYRO3 (C) ili HEK293 ćelije koje nisu transfektovane (D). Da bi se potvrdila pravilna ekspresija transfektovanih ćelija, netransfektovane HEK293F ćelije i ćelije koje su transfektovane sa AXL (E), MER (F) ili TYRO3 (G) su obojene antitelima specifičnim za MER i TYRO3. Prikazani podaci su srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) iz jednog reprezentativnog eksperimenta, kao što je opisano u Primeru 15.
Slika 19. Detekcija AXL antitela na plazma membrani tumorskih ćelijskih linija koje su bile inkubirane sa AXL antitelom tokom 1 sata na 4°C, nakon čega je sledila inkubacija preko noći na 4°C ili 37°C. I u MDA-MB-231 (A i B) i u Calu-1 ćelijama (C i D), više antitela je detektovano na plazma membrani ćelija koje su bile inkubirane na 4°C nego na ćelijama koje su inkubirane na 37°C, što je ukazalo na internalizaciju antitela vezanog za membranu na 37°C.
Slika 20. Geometrijska sredina intenziteta fluorescencije LCLC-103H ćelija nakon inkubacije sa AXL antitelima koja su bila u kompleksu sa Fab-TAMRA/QSY7. Kao negativne kontrole su bili uključeni samostalni tretmani sa IgG1-b12 i Fab-TAMRA/QSY7.
Slika 21. (A) Prosečna veličina tumora nakon terapijskog tretmana sa IgG1-AXL-107-vcMMAE u PDX modelu ES0195 kancera jednjaka. IgG1-b12 i IgG1-b12-MMAE su bili uklјučeni kao izotipsko kontrolno antitelo i izotipski kontrolni ADC, tim redom. (B) Veličina tumora kod pojedinačnih miševa 32. dana nakon injeciranja MDA-MB-231-luc D3H2LN tumorskih ćelija u masne naslage dojki kod ženki SCID miševa. *p<0,05; **p<0,0001
Slika 22. Terapijski efekat AXL-ADC u modelu ksenografta kancera grlića materice dobijenom iz pacijenta. (A) Prosečna veličina tumora nakon terapijskog tretmana sa IgG1-AXL-183-vcMMAE ili IgG1-AXL-726-vcMMAE u PDX modelu CEXF 773 kancera grlića materice. IgG1-b12 i IgG1-b12-MMAE su bili uklјučeni kao izotipsko kontrolno antitelo i izotipski kontrolni ADC, tim redom. (B) Veličina tumora u pojedinačnim miševima 28. dana nakon započinjanja lečenja u PDX modelu CEXF 773 kancera grlića materice. *p<0,001.
Slika 23. Terapijska aktivnost AXL-ADC u ortotopskom modelu ksenografta kancera dojke. (A) Prosečna veličina tumora nakon terapijskog tretmana sa IgG1-AXL-183-vcMMAE ili IgG1-AXL-726-vcMMAE u MDA-MB-231-luc D3H2LN ortotopskom modelu ksenografta. IgG1-b12 i IgG1-b12-MMAE su bili uklјučeni kao izotipsko kontrolno antitelo i izotipski kontrolni ADC, tim redom. (B) Veličina tumora kod pojedinačnih miševa 32. dana nakon injeciranja MDA-MB-231-luc D3H2LN tumorskih ćelija u masne naslage dojki kod ženki SCID miševa. *<0,001.
Slika 24. Citotoksičnost IgG1-AXL-107-vcMMAE u humanim tumorskim ćelijskim linijama sa različitim nivoima AXL ekspresije na plazma membrani. Ekspresija AXL u plazma membrani humanih tumorskih ćelijskih linija je ispitivana upotrebom Qifikit analize, dok je citotoksičnost IgG1-AXL-107-vcMMAE izražena kao procenat vijabilnih tumorskih ćelija koje su ostale u ćelijskim kulturama nakon izlaganja 1 µg/mL IgG1-AXL-107-vcMMAE.
Slika 25. Pobolјšana anti-tumorska efikasnost IgG1-AXL-107-vcMMAE u modelu ksenografta izvedenom iz pacijenata (PDX) koji je bio rezistentan na erlotinibom u kombinaciji sa erlotinibom. Prosečna veličina tumora nakon terapijskog tretmana sa IgG1-AXL-107-vcMMAE, erlotinibom ili erlotinibom u kombinaciji sa IgG1-AXL-107-vcMMAE u NSCLC LU2511 PDX modelu. IgG1-b12 i IgG1-b12-MMAE su bili uklјučeni kao izotipsko kontrolno antitelo i izotipski kontrolni ADC, tim redom. *, p<0,05; **, p<0,01; ns, nije značajno (jednofaktorski ANOVA test).
Slika 26. Pojačana ekspresija Axl proteina u NSCLC ćelijskim linijama sa stečenom rezistencijom na EGFR-TKI. Ekspresija Axl proteina je određena imunoblot postupkom. Bojenje aktina je upotrebljeno kao kontrola za jednako nanošenje proteina. Ekspresija Axl je procenjena u ćelijama koje su bile gajene u prisustvu (+) ili odsustvu (-) erlotiniba.
Slika 27. Senzitivnost parentalnih (divlјeg tipa) i HCC827 i PC9 ćelija rezistentnih na erlotinib, na IgG1-AXL-107-vcMMAE (A, B, F, G, H, J, K) ili EGFR-TKI (C, D, E, i I) je procenjena u analizama vijabilnosti. Matične (divlјeg tipa) i ćelijske linije rezistentne na erlotinib su bile izložene rastućim koncentracijama IgG1-b12-vcMMAE, IgG1-AXL-107-vcMMAE, erlotiniba, gefitiniba ili afatiniba tokom 4 ili 5 dana nakon čega je određena ćelijska vijabilnost kao što je opisano u Primeru 22.
Slika 28. Ekspresija AXL u uspostavlјenim ćelijskim linijama melanoma i primarnim linijama melanoma izvedenim iz pacijenata sa niskom stopom pasaža (PDX). (A) Varijabilni nivoi AXL ekspresije su uočeni kod uspostavljenih ćelijskih linija melanoma. Pojačana ili de novo AXL ekspresija je primećena u ćelijskim linijama rezistentnim na PLX4720 (A375-R, SKMEL28R, SKMEL147). (B) Ekspresija AXL je utvrđena kod 8/15 primarnih linija melanoma koje su dobijene iz pacijenata. I u uspostavlјenim ćelijskim linijama melanoma i PDX kulturama sa niskom stopom pasaže, AXL ekspresija je bila u obrnutoj korelaciji sa MITF ekspresijom.
Slika 29. Ekspresija AXL proteina na ćelijskoj površini. Primeri AXL ekspresije određeni kvantitativnom protočnom citometrijom u ćelijskoj liniji melanoma negativnoj na Axl i pozitivnoj na Axl. Svetlo sive površina predstavljaju bojenje sa antitelima specifičnim za AXL, dok tamno sive površine predstavljaju boljene sa izotipskim kontrolnim antitelom.
Slika 30. Senzitivnost uspostavlјenih ćelijskih linija melanoma na IgG1-AXL-107-vcMMAE. Melanomske ćelijske linije (A-F; CDX) su tretirane sa IgG1-AXL-107-vcMMAE ili izotipskim kontrolnim ADC IgG1-b12-vcMMAE tokom 5 dana, u triplikatu. Vijabilnost ćelija je analizirana upotrebom CellTiter-Glo testa i grafički je prikazana u odnosu na ADC koncentraciju.
Slika 31. Senzitivnost kultura primarnih melanomskih ćelija na IgG1-AXL-107-vcMMAE. Primarne melanomske ćelijske linije niskog stepena pasaža (A-C; PDX) su tretirane sa IgG1-AXL-107-vcMMAE ili izotipskim ADC IgG1-b12-vcMMAE tokom 8 dana, u triplikatu. Vijabilnost ćelija je analizirana upotrebom CellTiter-Glo testa i grafički je prikazana u odnosu na ADC koncentraciju.
Slika 32. Anti-tumorska efikasnost IgG1-AXL-107-vcMMAE u LU0858 NSCLC modelu ksenografta izvedenom iz pacijenata (PDX) i rezistentnom na erlotinib. Prikazana je prosečna veličina tumora nakon terapijskog tretmana sa IgG1-AXL-107-vcMMAE, erlotinibom ili erlotinibom u kombinaciji sa IgG1-AXL-107-vcMMAE (A). IgG1-b12 i IgG1-b12-MMAE su bili uklјučeni kao izotipsko kontrolno antitelo i izotipski kontrolni ADC, tim redom. Prikazane su srednje veličine tumora i SEM svake grupe po vremenskoj tački, kao i veličina tumora za svakog pojedinačnog miša po grupi 11. dana (B) i 21. dana (C). *, p<0,05; **, p<0,01; ns, nije značajno (Mann-Whitney test).
Slika 33. Anti-tumorska efikasnost IgG1-AXL-107-vcMMAE u LU1868 NSCLC modelu ksenografta izvedenom iz pacijenata (PDX) i rezistentnom na erlotinib. Prikazana je prosečna veličina tumora nakon terapijskog tretmana sa IgG1-AXL-107-vcMMAE, erlotinibom ili erlotinibom u kombinaciji sa IgG1-AXL-107-vcMMAE (A). IgG1-b12 i IgG1-b12-MMAE su bili uklјučeni kao izotipsko kontrolno antitelo i izotipski kontrolni ADC, tim redom. Prikazane su srednje veličine tumora i SEM svake grupe po vremenskoj tački, kao i veličina tumora za svakog pojedinačnog miša po grupi 21. dana (B), 28. dana (C) i 31.dana (D). *, p<0,05; **, p<0,01; ns, nije značajno (Mann-Whitney test).
Slika 34. Anti-tumorska efikasnost IgG1-AXL-107-vcMMAE u LXFA 526 NSCLC modelu ksenografta izvedenom iz pacijenata (PDX) i rezistentnom na erlotinib. (A) Prikazana je prosečna veličina tumora nakon terapijskog tretmana sa IgG1-AXL-107-vcMMAE, erlotinibom ili erlotinibom u kombinaciji sa IgG1-AXL-107-vcMMAE. (B) Srednja veličina tumora i SEM svake grupe po vremenskoj tački, kao i veličina tumora za svakog pojedinačnog miša po grupi 23. dana. *, p<0,05; **, p<0,01; ns, nije značajno (Mann-Whitney test).
Slika 35. Anti-tumorska efikasnost IgG1-AXL-107-vcMMAE u NSCLC modelu ksenografta izvedenom iz pacijenta (PDX), LXFA 677 (A) i LXFA 677_3 (C), koji je sa stečenom rezistencijom na erlotinib. Prikazana je prosečna veličina tumora nakon terapijskog tretmana sa IgG1-AXL-107-vcMMAE, erlotinibom ili erlotinibom u kombinaciji sa IgG1-AXL-107-vcMMAE. (B, D) Srednja veličina tumora i SEM svake grupe po vremenskoj tački, kao i veličina tumora za svakog pojedinačnog miša po grupi 21. dana kod LXFA 677 modela (B) ili 37. dana kod LXFA 677_3 modela (D). *, p<0,05; **, p<0,01; ns, nije značajno (Mann-Whitney test).
Slika 36. Anti-tumorska efikasnost IgG1-AXL-107-vcMMAE u SKMEL147 modelu melanoma. Prikazana je prosečna veličina tumora nakon terapijskog tretmana sa IgG1-b12, IgG1-b12-vcMMAE, IgG1-AXL-107 ili IgG1-AXL-107-vcMMAE (A). Veličina tumora u IgG1-AXL-107-vcMMAE miševima kod kojih su ponovo uočeni tumori (n = 2) ili su ponovo tretirani sa IgG1-AXL-107-vcMMAE (n = 4) je prikazana na (B).
Slika 37. SKMEL28 ćelije divlјeg tipa (crvene) i SKMEL28-R ćelije rezistentne na PLX4720 (zelene) su pomešane u odnosu 1:1 i tretirane sa IgG1-AXL-107-vcMMAE (AXL-ADC), IgG1-b12-MMAE (b12-ADC), PLX4720 (PLX), dabrafenibom (dabr), trametinibom (tram) ili kombinacijama kao što je navedeno. (A) Ukupni broj ćelija u odnosu na netretirane ćelije. (B) Odnos GFP/mCherry koji odgovara proporciji SKMEL28-R/SKMEL28 ćelija.
Slika 38. Anti-tumorska efikasnost IgG1-AXL-107-vcMMAE u PDX modelu CV1664 kancera raka grlića materice. (A) Prikazana je prosečna veličina tumora nakon terapijskog tretmana sa IgG1-b12, IgG1-b12-vcMMAE, IgG1-AXL-107, IgG1-AXL-107-vcMMAE ili paklitakselom. (B) Prikazana je srednja veličina tumora i SEM svake grupe po vremenskoj tački, kao i veličina tumora za svakog pojedinačnog miša po grupi 46. dana (C, D) Prikazana je prosečna veličina tumora kod miševa tretiranih sa IgG1-AXL-107-vcMMAE (C) ili paklitakselom (D) koji su ponovo tretirani sa IgG1-AXL-107-vcMMAE. *, p<0,05; **, p<0,01; ns, nije značajno (Mann-Whitney test).
Slika 39. Primeri Axl ekspresije utvrđene imunohistohemijom u uzorcima primarnih melanoma. (A) Primer melanoma sa ++ pozitivnim intenzitetom bojenja Axl (B) Primer melanoma sa pozitivnim intenzitetom bojenja Axl između i + (C) Primer Axl ekspresije u tkivima melanoma iz istog pacijenta pre i nakon tretmana sa vemurafenibom; levo = pre tretmana vemurafenibom, slab intenzitet Axl bojenja ; desno = nakon tretmana vemurafenibom, Axl intenzitet bojenja od slabog do + (D) Primer heterogene Axl ekspresije sa + intenzitetom unutar tkiva primarnog melanoma.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Terapijske primene
[0014] Pronalazak se odnosi na ADC specifične za AXL (ovde takođe označene kao "AXL-ADC") koji su kao što je ovde definisano prema bilo kom aspektu ili primeru izvođenja, a za upotrebu u lečenju kancera ili tumora koji su rezistentni na određene hemoterapeutike, inhibitore tirozin kinaze (npr. EGFR inhibitore), inhibitore serin/treonin kinaze (npr. BRAF inhibitore), kao što je ovde opisano.
[0015] Predmetni pronalazak se zasniva, barem delimično, na otkriću da su AXL-ADC efektivni kako in vitro tako i in vivo u indukovanju citotoksičnosti u tumorskim ćelijama koje su rezistentne na cilјanu terapiju EGFR-a, cilјanu terapiju BRAF/MEK ili agense koji ciljano deluju na mikrotubule. Na primer, NSCLC ćelije sa stečenom rezistencijom na EGFR inhibitore erlotinib, gefitinib i afatinib su ispoljile smanjenu vijabilnost nakon tretmana sa AXL-ADC (Primer 21), a modeli rezistentni na erlotinib sa različitim statusom EGFR gena su pokazali senzitivnost na AXL-ADC (Primer 22; Tabela 17). Preciznije, u nekoliko tumorskih modela u kojima lečenje EGFR inhibitorom erlotinibom nije indukovalo antitumorsku aktivnost, lečenje sa AXL-ADC, ili kombinacijom AXL-ADC i erlotiniba, indukovalo je snažnu anti-tumorsku aktivnost (Primer 22). Na primer, ćelijska linija rezistentna na erlotinib koja je izvedena iz ćelijske linije senzitivne na erlotinib je bila posebno senzitivna na AXL-ADC - dobijena je snažnija antitumorska aktivnost pri nižoj dozi (Primer 22). Pored toga, ćelijske linije melanoma rezistentne na BRAF-inhibitore PLX4720 (analog vemurafeniba) ili dabrafenib karakterisala je pojačana AXL ekspresija, kao i senzitivnost na tretman sa AXL-ADC, dok je AXL-ADC ispoljio snažnu anti-tumorsku aktivnost u in vivo modelu melanoma rezistentnog na PLX4720 (Primer 23). Štaviše, AXL-ADC je indukovao potpunu ili delimičnu regresiju tumora u tumorskom modelu kancera grlića materice, gde su tumori napredovali nakon lečenja paklitakselom (Primer 24).
[0016] Tako, predmetni opis obezbeđuje AXL-ADC, npr. HuMax-AXL-ADC, za upotrebu u lečenju kancera rezistentnog na najmanje jedan terapijski agens izabran iz grupe koja se sastoji od inhibitora tirozin kinaze, inhibitora PI3K, antagonističkog antitela na tirozin kinazni receptor, kao i inhibitora serin/treonin kinaze i hemoterapijskog agensa. U jednom primeru izvođenja, terapijski agens je izabran od inhibitora tirozin kinaze, inhibitora serin/treonin kinaze i hemoterapijskog agensa, pri čemu ADC sadrži najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom. U posebnom primeru izvođenja, terapijski agens je izabran od inhibitora tirozin kinaze, inhibitora serin/treonin kinaze i hemoterapijskog agensa.
[0017] Predmetni opis takođe obezbeđuje AXL-ADC, npr. HuMax-AXL-ADC, za upotrebu u lečenju kancera u kombinaciji sa terapijskim agensom izabranim od hemoterapijskog agensa, inhibitora tirozin kinaze, inhibitora PI3K, antagonističkog antitela za tirozin kinazni receptor i inhibitora serin/treonin kinaze, pri čemu se ADC i terapijski agens primenjuju istovremeno, odvojeno ili sekvencijalno. Kancer može biti rezistentan na terapijski agens i/ili može biti sa visokom tendencijom da postane rezistentan na terapijski agens. Terapijski agens može naročito biti izabran od inhibitora tirozin kinaze, inhibitora serin/treonin kinaze i hemoterapijskog agensa.
[0018] Kao što se ovde upotrebljava, "rezistentan", "rezistentan na lečenje" ili "refraktorni" kancer, tumor ili slično, označava kancer ili tumor kod subjekta, pri čemu kancer ili tumor nisu reagovali na lečenje sa terapijskim agensom od početka tretmana (ovde označeno kao „urođena rezistencija“) ili su prvobitno reagovali na tretman terapijskim agensom, ali su nakon određenog perioda lečenja postali nereaktivi ili manje reaktivni na terapijski agens (ovde označeno kao „stečena rezistencija“), što je rezultovalo progresijom oboljenja. Za solidne tumore, početna stabilizacija oboljenja takođe predstavlјa početni odgovor. Ostali pokazatelјi rezistencije obuhvataju ponovnu pojavu kancera, povećanje opterećenja tumorom, novootkrivene metastaze ili slično, uprkos lečenju terapijskim agensom. Da li tumor ili kancer jeste, ili je sa velikom tendencijom da postane, rezistentan na terapijski agens, stručna osoba može lako odrediti. Na primer, Nacionalna sveobuhvatna mreža za kancer (NCCN, www.nccn.org) i Evropsko društvo za medicinsku onkologiju (ESMO, www.esmo.org/Guidelines) obezbeđuju smernice za procenu da li određeni kancer odgovara na lečenje. Kao što je opisano u Tabeli 1 ispod, kao i na drugim mestima u tekstu, utvrđeno je da AXL eksprimiraju kanceri ili tumori koji razvijaju rezistenciju na određene hemoterapeutike (npr. agense koji ciljano deluju na mikrotubule („MTA“) poput taksana), kao i na inhibitore tirozin kinaze (npr. EGFR inhibitore), inhibitore serin/treonin kinaze (npr. inhibitor BRAF ili MEKe), PI3K inhibitore i antagonistička antitela.
[0019] Kao što se ovde upotrebljava, termin "subjekat" je obično čovek kome se primenjuje AXL-ADC, uklјučujući na primer humane pacijente kojima je dijagnostikovan kancer koji može biti lečen ubjanjem ćelija koje eksprimiraju AXL, direktno ili indirektno.
[0020] Kao što se ovde upotrebljava, kancer koji "je sa visokom tendencijom" za rezistenciju na specifičan terapijski agens, je kancer za koga je poznato da je povezan sa visokom tendencijom da bude ili postane rezistentan ili refraktoran na lečenje sa određenom klasom lekova. Na primer, pacijent sa kancerom koji je bio lečen ili za koga je utvrđeno da ispunjava uslove za lečenje terapijskim agensom kao što je ovde opisano i za koga postoji povezanost između rezistencije i pojačane ili de novo AXL ekspresije, boluje od kancera koga karakteriše visoka tendencija rezistencije. Neograničavajući primeri kancera i terapijskih agenasa za koje je poznato da su udruženi sa pojačanom ili de novo AXL ekspresijom, a koji stoga mogu biti sa visokom tendencijom da postanu rezistentni na terapijski agens, prikazani su ispod, u Tabeli 1. Štaviše, kao što je prikazano u Primeru 24, AXL-ADC je indukovao potpunu ili delimičnu regresiju tumora u tumorskom modelu kancera grlića materice, gde su tumori napredovali nakon lečenja paklitakselom. Ostali kanceri i tipovi tumora sa urođenom ili stečenom rezistencijom na terapijski agens, a koji su senzitivni na lečenje sa AXL-ADC, takođe su ovde opisani na drugim mestima.
Tabela 1 - Primeri terapijskih agenasa koja indukuju pojačanu ili de novo ekspresiju AXL
1
[0021] "Inhibitor tirozin inaze" ili "TKI", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na jedinjenje, obično farmaceutik, koje inhibira tirozin kinaze ili signalizaciju nishodno od tirozin kinaza. Tirozin kinaze su enzimi odgovorni za dodavanje fosfatne grupe na tirozin proteina (fosforilaciju), korak koji TKI inhibiraju, bilo direktno ili indirektno. Rezultat fosforilacija tirozina je aktivacija unutarćelijskih signalnih transdukcionih kaskada. Mnoge TKI su korisne za terapiju kancera. Neograničavajući primeri takvih TKI i njihovih cilјnih molekula su prikazani prethodno, u Tabeli 1, i uklјučuju, npr. EGFR inhibitore poput erlotiniba. U jednom primeru izvođenja, termin inhibitor tirozin kinaze, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na jedinjenja koja specifično inhibiraju aktivnost tirozin kinaze da fosforiliše proteine, npr. tirozin kinaznu aktiivnost EGFR-a.
[0022] Iako mnogi TKI koji su u kliničkoj upotrebi predstavljaju farmaceutike tipa malih molekula, postoje i "inhibitori tirozin kinaznog receptora" (rTKI) poput antagonističkih antitela koja se vezuju za vanćelijski deo tirozin kinaznog receptora (ovde označeni kao mAb/rTKI", čime se inhibira signalizacija posredovana receptorima. Primeri takvih antitela su cetuksimab i MAB391.
[0023] "Inhibitor fosfoinozitid 3-kinaze" ili "PI3KI", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na jedinjenje, obično farmaceutski agens, koje inhibira enzim u PI3K/AKT putu. Primeri PI3KI uklјučuju Alpelisib (BYL791).
[0024] "Inhibitor serin/treonin kinaze" ili "S/Th KI", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na jedinjenje, obično farmaceutski agens, koje inhibira serin/treonin kinaze poput BRAF ili MEK ili signalne puteve nishodno od ovih serina/treonin kinaza kao što su BRAF/MEK signalni putevi. Serin/treonin kinaze su enzimi odgovorni za fosforilaciju hidroksilne grupe serinskog ili treoninskog ostatka, korak koji S/Th KI inhibiraju, bilo direktno ili indirektno. Rezultat fosforilacija serina ili treonina je aktivacija unutarćelijskih signalnih transdukcionih kaskada. Primeri S/Th KI korisnih za terapiju kancera, kao i njihovi cilјni molekuli su prikazani prethodno, u Tabeli 1, i uklјučuju BRAF inhibitore kao što su vemurafenib i njihovi analozi ili derivati. U jednom primeru izvođenja, termin inhibitor serin/treonin kinaze, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na jedinjenja koja specifično inhibiraju aktivnost serin/treonin kinaza da fosforilišu proteine, npr. kao što je serin/treonin kinazna aktivnost mutiranog BRAF ili MEK.
[0025] Vemurafenib (PLX4032) je oralno bioraspoloživ, ATP-kompetitivni inhibitor tipa malog molekula, mutirane BRAF kinaze, koji se selektivno vezuje i inhibira BRAF koji sadrži određene mutacije, rezultat čega je inhibicija prekomerno aktiviranog nishodnog MAPK signalnog puta u tumorskim ćelijama koje eksprimiraju mutiranu BRAF kinazu. Mutacije BRAF koje su identifikovane u humanim kancerima su obično lokalizovane u P petljama bogatim glicinom N režnja, kao i segmentu aktivacije i uokvirujućim regionima unutar kinaznog domena. Vemurafenib se vezuje i inhibira BRAF kinazu koja sadrži određene od ovih mutacija, kao što su, ali bez ograničavanja samo na, aminokiselinske supstitucije ostatka V600 (npr. V600E), ostatka L597 (npr. L597R; Bahadoran i saradnici, 2013); i ostatka K601 (Dahlman i saradnici, 2012).
[0026] Kao što se ovde upotrebljava, „derivat“ leka je jedinjenje koje je izvedeno ili se može izvesti direktnom hemijskom reakcijom iz leka. Kako se ovde upotrebljava, "analog" ili "strukturni analog" leka je jedinjenje koje slične strukture i/ili mehanizma delovanja kao lek, ali se razlikuje u najmanje jednom strukturnom elementu. "Terapijski aktivni" analozi ili derivati leka kao što su, na primer, vemurafenib ili erlotinib, imaju sličnu ili pobolјšanu terapijsku efikasnost u poređenju sa osnovnim lekom, ali se mogu razlikovati u, npr. jednom ili više od stabilnosti, cilјne specifičnosti, rastvorlјivosti, toksičnosti i sličnog.
[0027] Tabele 2 i 3 ispod prikazuju inhibitore BRAF i EGFR koje karakteriše sličan mehanizam delovanja (inhibicija BRAF ili EGFR, tim redom) kao kod vemurafeniba i erlotiniba, tim redom.
Tabela 2 - BRAF inhibitori
Tabela 3 - EGFR inhibitori
[0028] Shodno navedenom, kao što je ovde prikazano, rezistencija melanoma na vemurafenib, dabrafenib, trametinib ili kombinacije bilo koja dva ili više njih; i NSCLC rezistencija na erlotinib, gefitinib ili afatinib ili kombinacije bilo koja dva ili više njih, može biti povezana sa de novo ili pojačanom AXL ekspresijom od strane tumorskih ćelija. Stoga, takvi tumori mogu biti pogodni za lečenje sa ADC specifičnim za AXL.
[0029] Predmetni opis obezbeđuje postupak lečenja kancera kod subjekta, pri čemu je kancer rezistentan na najmanje jedan terapijski agens izabran od inhibitora tirozin kinaze, inhibitora serin/treonin kinaze i hemoterapijskog agensa, postupak koji obuhvata primenu AXL-ADC. Kancer može, na primer, biti sa stečenom rezistencijom tokom prethodnog ili lečenja sa terapijskim agensom koje je još u toku. Alternativno, kancer je bio rezistentan od početka lečenja sa terapijskim agensom. U jednom primeru izvođenja, kancer je kancer koji eksprimira AXL. Terapijski agens može biti inhibitor PI3K ili mAb/rTKI.
[0030] Predmetni opis obezbeđuje postupak lečenja kancera kod subjekta, postupak koji obuhvata primenu AXL-ADC u kombinaciji sa najmanje jednim terapijskim agensom izabranim od hemoterapijskog agensa, inhibitora tirozin kinaze ili inhibitora serin/treonin kinaze, pri čemu se ADC i terapijski agens primenjuju istovremeno, odvojeno ili sekvencijalno. Kancer može sa velikom tendencijom rezistencije na terapijski agens. Kancer može biti rezistentan na terapijski agens. Terapijski agens može biti inhibitor PI3K ili mAb/rTKI.
1
[0031] Kao što su pronalazači predmetnog pronalaska prikazali i prethodno, u Tabeli 1, u određenim tipovima kancera je razvoj rezistencije bio udružen sa povećanom ili de novo ekspresijom AXL. Takvi kanceri mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na, melanom, nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer grlića materice, kancer jajnika, karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata (SCCHN), kancer dojke, gastrointestinalne stromalne tumore (GIST), kancer bubrega, neuroblastom, kancer jednjaka, rabdomiosarkom, akutnu mijeloidnu leukemiju (AML), hroničnu mijeloidnu leukemiju (CML).
[0032] Kancer ili tumor može biti izabran od kancera grlića materice, melanoma, NSCLC, SCCHN, kancera dojke, GIST, kancera bubrega, neuroblastoma, kancera jednjaka i rabdomiosarkoma. U drugom primeru izvođenja, kancer je hematološki kancer izabran od AML i CML.
[0033] Kancer ili tumor može karkaterisati najmanje jedna mutacija u aminokiselinskoj sekvenci EGFR-a, izabrana od L858R i T790M, kao što su npr. L858R ili T790M/L858R. Na primer, kancer ili tumor može biti NSCLC.
[0034] Najmanje jedan terapijski agens se može sastojati ili može sadržavati TKI inhibitor koji je antagonista EGFR-a, antagonista HER2, inhibitor ALK, inhibitor FLT3 ili kombinacija dva ili više od njih. Neograničavajući poželjni TKI uklјučuju erlotinib, gefitinib, lapatinib, osimertinib, rociletinib, imatinib, sunitinib, afanitib, krizotinib, midostaurin (PKC412) i kvizartinib (AC220). U jednom primeru izvođenja, TKI je EGFR inhibitor, kao što je erlotinib ili njegov terapijski aktivni analog ili derivat, npr. afatinib, lapatinib, osimertinib, rociletinib ili gefitinib.
[0035] Inhibitor tirozin kinaze može biti erlotinib, a kancer može biti NSCLC rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na erlotinib.
[0036] Inhibitor tirozin kinaze može biti erlotinib, a kancer može biti kancer pankreasa rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na erlotinib.
[0037] Inhibitor tirozin kinaze može biti gefitinib, a kancer može biti NSCLC rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na gefitinib.
[0038] Inhibitor tirozin kinaze može biti krizotinib, a kancer može biti NSCLC rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na krizotinib.
[0039] Inhibitor tirozin kinaze može biti lapatinib, a kancer može biti kancer dojke rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na lapatinib.
[0040] Inhibitor tirozin kinaze može biti imatinib, a kancer je CML rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na imatinib.
[0041] Inhibitor tirozin kinaze može biti imatinib, a kancer može biti GIST rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na imatinib.
[0042] Inhibitor tirozin kinaze može biti sunitinib, a kancer može biti GIST rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na sunitinib.
[0043] Inhibitor tirozin kinaze može biti sunitinib, a kancer može biti kancer bubrega rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na sunitinib.
[0044] Inhibitor tirozin kinaze može biti krizotinib, a kancer može biti neuroblastom rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na krizotinib.
[0045] Inhibitor tirozin kinaze može biti midostaurin (PKC412), a kancer može biti AML rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na midostaurin.
[0046] Inhibitor tirozin kinaze može biti kvizartinib, a kancer može biti AML rezistentan na ili je sa visokom tendencijom da postane rezistentan na kvizartinib.
[0047] Inhibitor tirozin kinaze može biti afatinib, a kancer može biti kancer dojke rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na afatinib.
[0048] Inhibitor tirozin kinaze može biti aksitinib, a kancer može biti kancer bubrega rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na aksitinib.
[0049] Inhibitor tirozin kinaze može biti lenvatinib, a kancer je kancer štitne žlezde rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na lenvatinib.
[0050] Predmetni opis posebno razmatra da je inhibitor tirozin kinaze agens koje inhibira EGFR, kao što je npr. erlotinib ili njegov terapijski aktivni analog ili derivat, poželјno gde je kancer NSCLC rezistentan na, ili je sa visokom tendencijom da postane rezistentan na agens koji inhibira EGFR. Specifičnije, kancer ili tumor (npr. NSCLC) može karakterisati najmanje jedna mutacija u EGFR-u izabrana od L858R i T790M ili njihove kombinacije.
[0051] Najmanje jedan terapijski agens se može sastojati od ili sadržavati PI3K inhibitor. Neograničavajući, poželјni inhibitori PI3K obuhvataju alpelisib i njegove terapijski aktivne analoge i derivate.
[0052] PI3Ki može biti alpelisib (BYL719), a kancer može biti SCCHN rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na alpelisib.
[0053] Najmanje jedan terapijski agens se može sastojati ili sadržavati antagonističko antitelo koje se vezuje za vanćelijski deo tirozin kinaznog receptora. Neograničavajući, poželjni mAb/rTKI uklјučuju cetuksimab i anti-IGF-IR MAB391, kao i terapijski aktivne analoge ili derivate cetuksimaba i MAB391.
[0054] MAb/rTKI može biti cetuksimab, a kancer može biti SCCHN rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na cetuksimab.
[0055] MAb/rTKI može biti anti-IGF-IR antitelo MAB391, a kancer može biti SCCHN rezistentan na, ili sa velikom tendencijom da postane rezistentan na MAB391.
[0056] Najmanje jedan terapijski agens se može sastojati ili sadržavati S/Th KI koji je inhibitor BRAF, inhibitor MEK ili njihova kombinacija. S/Th KI može biti inhibitor BRAF, kao što je vemurafenib (PLX4032) ili njegov terapijski efektivan derivat ili analog, npr. PLX4720 ili dabrafenib; ili VTXKIIE. S/Th KI može biti inhibitor MEK, poput selumetiniba (AZD6244) ili trametiniba.
[0057] S/Th KI može biti vemurafenib, a kancer može biti melanom rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na vemurafenib.
1
[0058] S/Th KI je vemurafenib, a kancer može biti kolorektalni kancer rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na vemurafenib.
[0059] S/Th KI može biti dabrafenib, a kancer može biti melanom rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na dabrafenib.
[0060] S/Th KI može biti dabrafenib, a kancer može biti kolorektalni kancer rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na dabrafenib.
[0061] S/Th KI može biti selumetinib, a kancer može biti kancer pankreasa rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na selumetinib.
[0062] S/Th KI može biti selumetinib, a kancer može biti melanom rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na selumetinib.
[0063] S/Th KI inhibitor može biti trametinib, a tumor može biti melanom rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na trametinib.
[0064] S/Th KI može biti VTXKIIE, a kancer može biti melanom rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na VTXKIIE.
[0065] S/Th KI može biti PLX4720, a kancer može biti melanom rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na PLX4720.
[0066] Najmanje jedan terapijski agens se može sastojati od ili sadržavati BRAF inhibitor. U određenom primeru izvođenja, inhibitor BRAF je vemurafenib (PLX4032) ili njegov terapijski efektivan analog ili derivat, kao što je dabrafenib ili PLX4720. Inhibitor BRAF može biti vemurafenib ili njegov terapijski aktivan derivat ili analog, a tumor može biti melanom rezistentan na, ili sa velikom tendencijom da postane rezistentan na vemurafenib. Vemurafenib može biti inhibitor BRAF kinaze u kojoj se nalaze određene mutacije, kao što su mutacije lokalizovane u P petlji bogatoj glicinima N režnja, kao i aktivacionom segmentu i bočnim regionima unutar kinaznog domena. Analog vemurafeniba može biti dabrafenib.
[0067] AXL-ADC obezbeđen predmetnim opisom može naročito biti za upotrebu u lečenju melanoma koji eksprimira AXL i rezistentan je na terapijski agens sa kojim se melanom leči ili je bio lečen, pri čemu je terapijski agens vemurafenib ili njegov terapijski efektivan analog ili derivate, i pri čemu melanom ispoljava mutaciju u BRAF. Preciznije, melanom može ispoljavati mutaciju u BRAF koja BRAF čini senzitivnim na inhibiciju sa vemurafenibom ili terapijski efektivnim analogom ili derivatom. Neograničavajuće mutacije uklјučuju aminokiselinske supstitucije, delecije ili insercije; poželјno, mutacija je aminokiselinska supstitucija. Specifični ostaci za takve mutacije obuhvataju, ali nisu ograničeni na, V600 (npr. V600E, V600K i V600D), ostatak L597 (npr. L597R); i ostatak K601 (K601E). U jednom primeru izvođenja, mutacija je izabrana od V600E, V600D, V600K, L597R i K601E.
[0068] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan terapijski agens se sastoji ili sadrži hemoterapijski agens izabran iz grupe koja se sastoji od paklitaksela, docetaksela, cisplatine, doksorubicina, etopozida, karboplatine i metformina ili njihove kombinacije. Terapijski agens može biti agens koji ciljano deluje na mikrotubule, poput npr. paklitaksela, docetaksela ili vinkristina ili terapijski aktivnog analoga ili
1
derivata bilo koga od njih. Najmanje jedan terapijski agens može biti taksan, poput paklitaksela, docetaksela ili terapijski aktivnog analoga ili derivata paklitaksela ili docetaksela.
[0069] Hemoterapijski agens može biti paklitaksel, a kancer može biti kancer grlića materice rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na paklitaksel.
[0070] Hemoterapijski agens može biti paklitaksel, a kancer može biti NSCLC rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na paklitaksel.
[0071] Hemoterapijski agens može biti paklitaksel, a kancer može biti kancer jajnika rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na paklitaksel.
[0072] Hemoterapeutik može biti docetaksel, a kancer može biti kancer glave i vrata rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na docetaksel.
[0073] Hemoterapeutik može biti docetaksel, a kancer može biti kancer želuca rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na docetaksel.
[0074] Hemoterapeutik može biti docetaksel, a kancer je kancer dojke rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na docetaksel.
[0075] Hemoterapeutik može biti docetaksel, a kancer može biti kancer prostate rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na docetaksel.
[0076] Hemoterapeutik može biti docetaksel, a kancer može biti NSCLC rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na docetaksel.
[0077] Hemoterapijski agens može biti cisplatin, a kancer može biti kancer jednjaka rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na cisplatin.
[0078] Hemoterapijski agens može biti cisplatin, a kancer može biti SCCHN rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na cisplatin.
[0079] Hemoterapijski agens može biti karboplatin, a kancer može biti SCCHN rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na karboplatin.
[0080] Hemoterapijski agens može biti cisplatin, a kancer može biti AML rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na cisplatin.
[0081] Hemoterapijski agens može biti doksorubicin, a kancer može biti AML rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na doksorubicin.
[0082] Hemoterapijski agens može biti etopozid, a kancer može biti AML rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na etopozid.
[0083] Hemoterapijski agens može biti metformin, a kancer može biti kancer prostate rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na metformin.
[0084] Hemoterapijski agens može biti cisplatin, a kancer može biti kancer jajnika rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na cisplatin.
1
[0085] Hemoterapijski agens može biti doksorubicin, a kancer može biti nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC) rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na doksorubicin.
[0086] Hemoterapijski agens može biti temozolomid, a tumor može biti astrocitom rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na temozolomid.
[0087] Hemoterapijski agens može biti karboplatin, a tumor može biti astrocitom rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na karboplatin.
[0088] Hemoterapijski agens može biti vinkristin, a tumor može biti astrocitom rezistentan na, ili sa visokom tendencijom da postane rezistentan na vinkristin.
[0089] Predmetni opis se odnosi na postupak lečenja kancera kod subjekta kome je to potrebno, pri čemu kancer jeste, ili je sa velikom tendencijom da postane, rezistentan na terapijski agens izabran od hemoterapijskog agensa, inhibitora tirozin kinaze, inhibitora PI3K, mAb/rTKI i inhibitora serin/treonin kinaze, pri čemu postupak obuhvata primenu subjektu terapijski efektivne količine ADC koji sadrži antitelo koje se vezuje za humani AXL. U jednom primeru izvođenja, terapijski agens je izabran od hemoterapijskog agensa, inhibitora tirozin kinaze i inhibitora serin/treonin kinaze. Na primer, hemoterapijski agens može biti taksan, inhibitor tirozin kinaze može biti inhibitor EGFR-a, a inhibitor serin/treonin kinaza može biti inhibitor BRAF ili MEK. U jednom primeru izvođenja, kancer je kancer koji eksprimira AXL.
[0090] Opis se odnosi na postupak lečenja NSCLC rezistentnog na erlotinib kod subjekta, postupak koji obuhvata primenu subjektu ADC-a koji sadrži antitelo koje se vezuje za humani AXL. U jednom primeru izvođenja, postupak dalјe obuhvata primenu erlotiniba, ili njegovog analoga ili derivata subjektu. Kancer može biti kancer koji eksprimira AXL.
[0091] Opis se odnosi na postupak lečenja melanoma rezistentnog na vemurafenib kod subjekta, pri čemu melanom karkateriše mutacija u BRAF i mutacija obezbeđuje inhibiciju BRAF kinazne aktivnosti mutiranog BRAF vemurafenibom, postupak koji obuhvata primenu subjektu ADC koji sadrži antitelo koje se vezuje za humani AXL. Mutacija može biti aminokiselinska supstitucija ostatka V600, L597 i/ili K601. Mutacija može biti izabrana od V600E, V600D, V600K, L597R i K601E. Postupak može dalјe obuhvatati primenu subjektu vemurafeniba, ili njegovog analoga ili derivata. Analog može biti dabrafenib. Kancer može biti kancer koji eksprimira AXL.
[0092] Predmetni opis se odnosi na postupak lečenja kancera grlića materice rezistentnog na paklitaksela kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata primenu subjektu ADC koji sadrži antitelo koje se vezuje za humani AXL. U jednom primeru izvođenja, postupak dalјe obuhvata primenu paklitaksela, ili njegovog analoga ili derivata, subjektu. Kancer može biti kancer koji eksprimira AXL.
[0093] Što se tiče AXL-ADC, lekar sa prosečnim iskustvom može lako odrediti i propisati efektivne količine potrebne farmaceutske kompozicije. U vezi sa navedenim, kada se odnosi na farmaceutsku kompoziciju, podrazumeva se i da ista sadrži kompoziciju kao takvu, ili obrnuto. Na primer, lekar može započeti sa dozama AXL-ADC koje su upotrebljene za pripremu farmaceutske kompozicije u vidu nivoa nižih od onih potrebnih da bi se postigao želјeni terapijski efekat, a potom postepeno povećavati dozu sve dok se ne postigne želјeni efekat. U principu, pogodna doza će biti ona količina jedinjenja koja je najmanja doza koja je efektivna u proizvodnji terapijskog efekta shodno određenom režimom doziranja. Takva efektivna doza će generalno zavisiti od faktora koji su prethodno opisani.
1
[0094] Na primer, „efektivna količina“ za terapijsku upotrebu može biti izmerena njenom sposobnošću da stabilizuje napredovanje bolesti. Sposobnost jedinjenja da inhibira kancer može, na primer, biti procenjena u sistemu životinjskog modela koji predviđa efikasnost u humanim tumorima. Alternativno, navedena osobina kompozicije može biti procenjena ispitivanjem sposobnosti jedinjenja da inhibira ćelijski rast ili da indukuje citotoksičnost u in vitro analizama koje su poznate iskusnom praktičaru. Terapijski efektivna količina terapijskog jedinjenja može smanjiti veličinu tumora ili na drugi način ublažiti simptome kod subjekta. Osoba sa prosečnim iskustvom u oblasti tehnike će biti sposobna da odredi takvu količinu na osnovu faktora kao što su veličina subjekta, težina simptoma subjekta i određena kompozicija ili način primene koji su odabrani za primenu. Na primer, kao što je već naznačeno, za procenu lečenja kancera mogu biti upotrebljene smernice Nacionalne sveobuhvatne mreže za kancer (NCCN, www.nccn.org) i Evropskog društva za medicinsku onkologiju (ESMO, www.esmo.org/Guidelines).
[0095] Primer neograničavajućeg raspona za terapijski efektivnu količinu AXL-ADC pronalaska je 0,02-100 mg/kg, kao što je oko 0,02-30 mg/kg, kao što je oko 0,05-10 mg/kg, 0,1-5 mg/kg ili 0,1-3 mg/kg, na primer, oko 0,5-3 mg/kg ili 0,5-2 mg/kg.
[0096] Primena može npr. biti intravenska, intramuskularna, intraperitonealna ili subkutana, i na primer, primena može biti proksimalno u odnosu na mesto ciljanog dejstva.
[0097] Režimi doziranja u prethodno navedenim postupcima i upotrebama se prilagođavaju tako da obezbede optimalan želјeni odgovor (npr. terapijski odgovor). Na primer, može biti primenjena jedna bolusna injekcija, može biti primenjeno nekoliko podeljenih doza tokom vremena ili doza može biti proporcionalno smanjena ili povećana shodno potrebama terapijske situacije.
[0098] U jednom primeru izvođenja, odnos efikasnosti i bezbednosti se optimizuje smanjivanjem specifične toksičnosti, kao što je, na primer, smanjivanjem odnosa leka i antitela (DAR) i/ili mešanjem AXL-ADC sa neobeleženim anti-AXL antitelom.
[0099] Efikasnost tretmana može biti praćena tokom terapije, npr. u unapred definisanim tačkama vremena. Postupci za merenje efikasnosti uglavnom zavise od određene vrste kancera i dobro su poznati stručnjaku iz oblasti tehnike. Efikasnost može biti praćena vizualizacijom područja oboljenja ili drugim dijagnostičkim postupcima koji su ovde dodatno opisani, npr. sprovođenjem jednog ili više PET-CT snimanja, na primer, upotrebom obeleženog anti-AXL antitela, fragmenta ili mini antitela izvedenog iz antitela specifičnog za AXL.
[0100] Ukoliko je poželjno, efektivna dnevna doza AXL-ADC može predstavljati dve, tri, četiri, pet, šest ili više pod-doza koje se primenjuju odvojeno u odgovarajućim intervalima tokom dana, opciono, u jediničnim doznim oblicima. AXL-ADC mogu biti primenjivani sporom kontinuiranom infuzijom tokom dužeg perioda, kao što je više od 24 sata, a da bi se smanjili neželјeni sporedni efekti.
[0101] Efektivna doza AXL-ADC takođe može biti primenjena tokom perioda primene doza od nedelju dana, dve il tri nedelje. Period primene doza može biti ograničen na, npr.8 nedelјa, 12 nedelјa ili dok se ne uspostavi klinički napredak. U jednom primeru izvođenja, AXL-ADC se primenjuje bilo jednom na svake 3 nedelјe (1Q3W) ili u vidu tri primene tokom 4 nedelje (3Q4W) tako da pacijent prima šesnaest ili dvanaest ciklusa AXL-ADC u intervalima od tri nedelјe ili četiri nedelјe tokom, npr. 48 nedelјa, uz produžavanje ili ponavljanje režima ukoliko je to potrebno.
1
[0102] Na primer, u jednom primeru izvođenja, AXL-ADC može biti primenjen infuzijom u nedelјnoj dozi između 10 i 500 mg/m<2>, kao što je između 200 i 400 mg/m<2>. Ovakva primena može biti ponovljena, npr. 1 do 8 puta, kao što je 3 do 5 puta. Primena može biti sprovedena kontinuiranom infuzijom tokom perioda od 1 do 24 sata, kao što je od 1 do 12 sati.
[0103] AXL-ADC može biti primenjen infuzijom na svake tri nedelјe u dozi između 10 i 500 mg/m<2>, kao što je između 50-200 mg/m<2>. Ovakva primena može biti ponovljena, npr.1 do 8 puta, kao što je od 3 do 5 puta. Primena može biti sprovedena kontinuiranom infuzijom tokom perioda od 1 do 24 sata, kao što je od 1 do 12 sati.
[0104] AXL-ADC može biti primenjen u vidu pojedinačne doze od oko 0,1-10 mg/kg, kao što je oko 1-3 mg/kg, svake nedelјe ili svake treće nedelјe do dvanaest puta, do osam puta, ili do kliničkog napretka. Primena može biti sprovedena kontinuiranom infuzijom tokom perioda od 1 do 24 sata, kao što je od 1 do 12 sati. Ovakvi režimi po potrebi mogu biti ponovlјeni jedan ili više puta, na primer, nakon 6 meseci ili 12 meseci. Doziranje može biti određeno ili podešeno merenjem količine jedinjenja predmetnog pronalaska u krvi nakon primene, na primer, vađenjem biološkog uzorka i upotrebom anti-idiotipskih antitela koja ciljano deluju na region za vezivanje antigena u anti-AXL antitelima.
[0105] AXL-ADC mogu biti primenjeni kao terapija održavanja, kao što je npr. jednom nedelјno u periodu od šest meseci ili duže. Kako se ovde upotrebljava, „terapija održavanja“ označava terapiju u svrhu izbegavanja ili odlaganja progresije ili ponovne pojave kancera. Uobičajeno je da, ukoliko je kancer u potpunoj remisiji nakon inicijalnog lečenja, terapija održavanja može biti upotrebljena da bi se izbegla i odložila ponovna pojava kancera. Ukoliko je kancer uznapredovao i potpuna remisija nije postignuta nakon početnog tretmana, terapija održavanja može biti upotrebljena da bi se usporio rast kancera, npr. da bi se produžio život pacijenta.
[0106] Kao neograničavajući primeri, lečenje prema predmetnom opisu može biti obezbeđeno u vidu dnevih doza jedinjenja predmetnog pronalaska u količini od oko 0,1-100 mg/kg, kao što je oko 0,1-50 mg/kg, kao što je oko 0,2; 0,5; 0,9; 1,0; 1,1; 1,5; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ili 100 mg/kg, po danu, najmanje jednog od dana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ili 40, ili alternativno, najmanje jedne nedelјe od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 nedelja nakon započinjanja lečenja, ili bilo koje kombinacije od navedenog, upotrebom pojedinačnih ili podelјenih doza na svakih 24, 12, 8, 6, 4 ili 2 sata, ili bilo koje od njihovih kombinacija.
[0107] Parenteralne kompozicije mogu biti formulisane u jediničnom doznom obliku za laku primenu i ujednačenost doze. Jedinični dozni oblik, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne kao jedinične doze za subjeke koji će biti lečeni; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja, izračunatu tako da proizvede želјeni terapijski efekat kada je udružena sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija jediničnih doznih oblika predmetnog pronalaska je diktirana i direktno zavisi od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapijskog efekta koji je potrebno postići, i (b) ograničenja svojstvenih oblasti tehnike pripreme jedinjenja kao što su aktivna jedinjenja za lečenje senzitivnosti kod pojedinaca.
[0108] Kao što je ovde opisano, AXL-ADC može biti upotrebljen u kombinaciji sa najmanje jednim dodatnim terapijskim agensom. Najmanje jedan dodatni terapijski agens može sadržavati ili se sastojati
2
od hemoterapijskog agensa, inhibitora tirozin kinaze, inhibitora PI3K, mAb/rTKI i/ili inhibitora serin/treonin kinaze na koje je kancer ili tumor rezistentan, ili je sa velikom tendencijom da razvije rezistenciju, kao što je navedeno u prethodnim primerima izvođenja.
[0109] AXL-ADC i jedan ili više terapijskih agenasa mogu biti primenjivani istovremeno, odvojeno ili sekvencijalno. Na primer, u jednom primeru izvođenja, kombinacija se upotrebljava za lečenje pacijenta obolelog od kancera koji prethodno nije primao tretman sa najmanje jednim terapijskim agensom. U drugom primeru izvođenja, kombinacija se upotrebljava za lečenje pacijenta obolelog od kancera kod koga prethodno lečenje sa najmanje jednim terapijskim agensom nije bilo uspešno. Efikasne doze i režimi doziranja za AXL-ADC i terapijski(e) agens(e) zavise od tipa neoplazije, tumora ili kancera koji će biti lečen i mogu biti određeni od strane stučne osobe.
[0110] Doze i režimi doziranja za jedan ili više terapijskih agenasa koji mogu biti upotrebljene zajedno sa AXL-ADC, mogu biti isti ili suštinski slični onima koji se normalno upotrebljavaju u lečenju takvih neoplazija, tumora ili kancera sa jednim ili sa više terapijskih agenasa. Doze terapijskog agensa/terapijskih agenasa mogu biti niže od onih koje se obično upotrebljavaju, ali režim doziranja može na druge načine biti sličan. Doze terapijskog agensa/terapijskih agenasa mogu biti slične onima koje se obično upotrebljavaju, ali režim doziranja može biti prilagođen tako da primena bude manje ili da budu manje učestale.
[0111] Tako, prema jednom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak lečenja kancera kod subjekta kome je isiti potreban, pri čemu kancer jeste, ili je sa visokom tendencijom da postane, rezistentan na terapijski agens izabran od hemoterapijskog agensa, inhibitora tirozin kinaze i inhibitora serina/treonin kinaze, a koji obuhvata primenu subjektu (i) ADC koji sadrži antitelo koje se vezuje za humani AXL i (ii) terapijskog agensa. U jednom primeru izvođenja, hemoterapijski agens je taksan, inhibitor tirozin kinaze je inhibitor EGFR-a, a inhibitor serin/treonin kinaze je inhibitor BRAF ili MEK. U jednom primeru izvođenja, kancer je kancer koji eksprimira AXL. AXL-ADC može, na primer, biti primenjen u terapijski efektivnoj količini u skladu sa režimom doziranja koji je prethodno detalјnije opisan. Na primer, kao neograničavajući primer, AXL-ADC može biti primenjen u količini od oko 0,02-100 mg/kg, kao što je oko 0,02-30 mg/kg, kao što je oko 0,05-10 mg/kg, bilo svake nedelјe (1Q1W), na svake 2 nedelјe (1Q2W) ili na svake 3 nedelјe (1Q3W) ili u vidu tri primene tokom 4 nedelјe (3Q4W), a tako da pacijent primi šesnaest ili dvanaest ciklusa AXL-ADC u intervalima od tri nedelјe ili četiri nedelјe tokom npr.48 nedelјa, uz produžavanje, skraćivanje ili ponavlјanje režima, što određuje nadležni lekar.
[0112] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na postupak lečenja NSCLC rezistentnog na erlotinib kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata primenu subjektu (i) ADC koji sadrži antitelo koje se vezuje za humani AXL i (ii) erlotiniba ili njegovog terapijski efektivnog analoga ili derivata. Erlotinib može, na primer, biti primenjen oralno u dozi od 50 do 300 mg, kao što je 100-200 mg, kao što je oko 150 mg, jednom ili dva puta dnevno, ili na svaka 2 ili 3 dana. Poželјno je da se erlotinib primenjuje jednom dnevno u dozi od oko 150 mg. U jednom primeru izvođenja, kancer je kancer koji eksprimira AXL.
[0113] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na postupak lečenja melanoma rezistentnog na vemurafenib kod subjekta, pri čemu melanom karakteriše mutacija u BRAF, mutacija koja obezbeđuje inhibiciju BRAF kinazne aktivnosti mutiranog BRAF sa vemurafenibom, pri čemu postupak obuhvata primenu subjektu (i) ADC koji sadrži antitelo koje se vezuje za humani AXL i (ii) vemurafeniba ili njegovog terapijski efektivnog analoga ili derivata. U jednom primeru izvođenja, kancer je kancer koji eksprimira AXL. U jednom primeru izvođenja, mutacija je aminokiselinska supstitucija ostatka V600, L597 i/ili K601. U jednom primeru izvođenja, mutacija je izabrana od V600E, V600D, V600K, L597R i K601E. Vemurafenib može, na primer, biti primenjen oralno u dozi od oko 200-2000 mg, 500-1500 mg, kao što je oko 1000 mg dnevno, npr.960 mg, tj. primena može biti u vidu 4 x tablete od 240 mg q12h (sa razmakom od približno 12 sati).
[0114] Predmetni opis obezbeđuje postupak lečenja melanoma rezistentnog na dabrafenib kod subjekta, pri čemu melanom karakteriše mutacija u BRAF, mutacija koja obezbeđuje inhibiciju BRAF kinazne aktivnosti mutiranog BRAF sa dabrafenibom, pri čemu postupak obuhvata primenu subjektu (i) ADC koji sadrži antitelo koje se vezuje za humani AXL i (ii) dabrafeniba ili njegovog terapijski efektivnog analoga ili derivata. U jednom primeru izvođenja, kancer je kancer koji eksprimira AXL. Mutacija može biti aminokiselinska supstitucija ostatka V600, L597 i/ili K601. Mutacija može biti izabrana od V600E, V600D, V600K, L597R i K601E. Dabrafenib može, na primer, biti primenjen subjektu oralno, u dozi od oko 50-300 mg, kao što je oko 100-200 mg, kao što je oko 150 mg, jednom ili dva puta dnevno ili na svaka 2 ili 3 dana. Poželјno je da se dabrafenib primenjuje kao oralna doza od 150 mg dva puta dnevno, npr. najmanje 1 sat pre obroka ili najmanje 2 sata nakon obroka.
[0115] Predmetni opis obezbeđuje postupak lečenja melanoma rezistentnog na dabrafenib, trametinib ili oba kod subjekta, pri čemu melanom karakteriše mutacija u BRAF, mutaciju koja obezbeđuje inhibiciju BRAF kinazne aktivnosti mutiranog BRAF sa dabrafenibom, pri čemu postupak obuhvata primenu subjektu (i) ADC koji sadrži antitelo koje se vezuje za humani AXL, (ii) dabrafeniba ili njegovog terapijski efektivnog analoga ili derivata i (iii) trametiniba ili njegovog terapijski efektivnog analoga ili derivata. Kancer može biti kancer koji eksprimira AXL. Mutacija može biti aminokiselinska supstitucija ostatka V600, L597 i/ili K601. Mutacija može biti izabrana od V600E, V600D, V600K, L597R i K601E. Dabrafenib može, na primer, biti primenjen subjektu oralno, u dozi od oko 50-300 mg, kao što je oko 100-200 mg, kao što je oko 150 mg, jednom ili dva puta dnevno ili na svaka 2 ili 3 dana. Poželјno je da se dabrafenib primenjuje kao oralna doza od 150 mg dva puta dnevno, npr. najmanje 1 sat pre obroka ili najmanje 2 sata nakon obroka. Tramatenib može, na primer, biti primenjen oralno, u dozi od oko 0,5 do 5 mg, kao što je oko 1 do 4 mg, kao što je oko 2-3 mg, kao što je oko 2 mg, jednom ili dva puta dnevno ili na svaka 2, 3 ili 4 dana, kao što je jednom dnevno.
[0116] Predmetni opis obezbeđuje postupak lečenja kancera grlića materice rezistentnog na taksane kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata primenu subjektu (i) ADC koji sadrži antitelo koje se vezuje za humani AXL i (ii) taksana za subjekta. U jednom primeru izvođenja, kancer je kancer koji eksprimira AXL. Poželјno je da je taksan paklitaksel ili njegov terapijski efektivan analog ili derivat, kao što je docetaksel. Paklitaksel može biti primenjen subjektu intravenski (iv), na primer, u dozi od oko 100-500 mg/m2, kao što je oko 125-400 mg/m2, kao što je oko 135 mg/m2, 175 mg/m2 ili 250 mg/m2 tokom nekoliko sati (npr.3 sata), a tretman može biti ponovljen na svakih 1, 2, 3, 4, 5 nedelјa, kao što je na svake 3 nedelјe. Alternativno, paklitaksel može biti primenjen intravenski u vidu paklitaksela vezanog za albumin (nab-paklitaksel), npr. u dozi od oko 50-400 mg/m2, kao što je oko 75-300 mg/m2, kao što je oko 100-200 mg/m2, kao što je oko 125 mg/m2, a tokom perioda dužeg od 30 min do 1 sata ili više i jednom nedelјno, uz ponavlјanje tretmana dva puta nedelјno, ili jednom u dve ili tri nedelјe, npr. jednom nedelјno. Docetaksel može, zauzvrat, biti primenjen iv u dozi od oko 25-500 mg/m2, kao što je oko 50-300 mg/m2, kao što je oko 75-200 mg/m2, kao što je oko 100 mg/m2 tokom perioda dužeg od 30 minuta do 2 sata, kao što je 1 sat, a tretman može biti ponovljen na svakih 1, 2, 3, 4 ili 5 nedelјa, kao što je na svake 3 nedelјe.
[0117] Preciznije, može biti upotrebljen AXL-ADC, samostalno ili u kombinaciji sa terapijskim agensom, za lečenje rekurentnog kancera kod subjekta, pri čemu se kancer ponovo javio nakon inicijalnog lečenja terapijskim agensom. Ukoliko se kancer pojavi ponovo još jednom nakon nakon početnog lečenja sa AXL-ADC-om, AXL-ADC može biti ponovo upotrebljen, samostalno ili zajedno sa terapijskim agensom, za lečenje rekurentnog kancera.
[0118] Predmetni opis obezbeđuje postupak odabira subjekta koji boluje od kancera, za lečenja sa kombinacijom AXL-ADC i terapijskog agensa izabranog od hemoterapijskog agensa, TKI, PI3Ki, mAb/rTKI i S/Th KI, koji obuhvata određivanje
(a) da li subjekat ispunjava kriterijume za lečenje hemoterapijskim agensm, TKI, PI3Ki, mAb/rTKI ili S/Th KI;
(b) da li je ekspresija AXL u kanceru udružena sa rezistencijom na TKI ili S/Th KI; i
(c) odabir subjekta koji ispunjava kriterijume za lečenje sa TKI ili S/Th KI i koji boluje od kancera kod koga je ekspresija AXL povezana sa rezistencijom na TKI ili S/Th KI. U jednom primeru izvođenja, terapijski agens je hemoterapijski agens, TKI ili S/Th KI.
[0119] Predmetni opis obezbeđuje postupak lečenja subjekta kome je postavljena dijagnoza melanoma koji jeste, ili je sa visokom tendencijom da postane, rezistentan na vemurafenib ili njegov terapijski efektivan analog ili derivat, pri čemu postupak obuhvata primenu terapijski efektivne količine ADC koja sadrži antitelo koje se vezuje za humani AXL.
[0120] Predmetni opis obezbeđuje postupak utvrđivanja da li je subjekat koji boluje od melanoma pogodan za lečenje sa kombinacijom (i) vemurafeniba ili njegovog terapijski efektivnog analoga ili derivata i (ii) ADC koji sadrži antitelo koje se vezuje za humani AXL, pri čemu se subjekat podvrgava ili je bio podvrgnut lečenju sa vemurafenibom (ili analogom ili derivatom) i utvrđeno je, ili se sumnja, da je rezistentan na vemurafenib (ili analog ili derivat), čime se utvrđuje da je subjekat pogodan za lečenje. Može biti utvrđeno i da li melanom eksprimira AXL. U jednom primeru izvođenja, analog je dabrafenib.
[0121] Predmetni opis obezbeđuje postupak lečenja subjekta kome je postavljena dijagnoza kancera grlića materice koji jeste, ili je sa visokom tendencijom da postane, rezistentan na paklitaksel ili njegov terapijski efektivan analog ili derivat, kao što je drugi taksan (npr. docetaksel), pri čemu postupak obuhvata primenu terapijski efektivne količine ADC koji sadrži antitelo koje se vezuje za humani AXL.
[0122] Predmetni opis obezbeđuje postupak utvrđivanja da li je subjekat koji boluje od kancera grlića materice pogodan za lečenje kombinacijom (i) paklitaksela ili njegovog terapijski efektivnog analoga ili derivata, poput drugog taksana (npr. docetaksela) i (ii) ADC koji sadrži antitelo koje se vezuje za humani AXL, pri čemu se subjekat podvrgava ili je bio podvrgnut lečenju sa paklitakselom i utvrđeno je, ili se sumnja, da je rezistentan na paklitaksel, čime se utvrđuje da je subjekat pogodan za lečenje. Prema dodatnom aspektu, može biti utvrđeno da li kancer grlića materice eksprimira AXL.
[0123] Za rezistentnu neoplaziju, tumor ili kancer koji će biti lečen sa anti-AXL-ADC može biti određeno da li eksprimira AXL.
[0124] Navedeno se može postići detekcijom nivoa AXL antigena, ili nivoa ćelija koji eksprimiraju AXL na svojoj ćelijskoj površini, u uzorku uzetom od pacijenta. Pacijent može, na primer, bolovati od
2
kancera grlića materice, melanoma ili NSCLC. AXL antigen koji se detektuje može biti solubilan AXL antigen, AXL antigen asociran sa ćelijom ili oba. Uzorak koji je potrebno ispitati može, na primer, biti doveden u kontakt sa anti-AXL antitelom pod uslovima koji omogućavaju vezivanje antitela za AXL, opciono zajedno sa kontrolnim uzorkom i/ili kontrolnim antitelom koje se vezuje za nerelevantan antigen. Vezanje antitela za AXL može tada biti detektovano (npr. upotrebom ELISA). Kada se upotrebljava kontrolni uzorak zajedno sa uzorkom koji se ispituje, nivo anti-AXL antitela ili kompleksa AXL sa anti-AXL antitelom se analizira u oba uzorka i statistički značajno viši nivo anti-AXL antitela ili kompleksa AXL sa anti-AXL antitelom u ispitivanom uzorku ukazuje na viši nivo AXL u uzorku koji se ispituje, u poređenju sa kontrolnim uzorkom, što ukazuje na veću ekspresiju AXL. Primeri uobičajenih imunoloških testova korisnih za ove namene obuhvataju, bez ograničenja, ELISA, RIA, FACS analize, analize plazmonske resonance, hromatografske analize, imunohistohemiju tkiva, imunoblot postupak i/ili imunoprecipitaciju.
[0125] Uzorak tkiva može biti uzet iz tkiva za koga je poznato ili se sumnja da sadrži AXL antigen i/ili ćelije koje eksprimiraju AXL. Na primer, detekcija in situ ekspresije AXL se može postići uklanjanjem histološkog uzorka, kao što je biopsijom tumora ili uzorak krvi iz pacijenta i obezbeđjivanjem anti-AXL antitela takvom uzorku nakon odgovarajuće pripreme uzorka. Antitelo može biti obezbeđeno primenom ili prekrivanjem uzorka sa antitelom, ašto se potom detektuje upotrebom odgovarajućih načina detekcije.
[0126] U prethodno navedenim analizama, anti-AXL antitelo može biti obeleženo supstancom koja se može detektovati da bi se omogućila detekcija antitela vezanog za AXL.
[0127] Nivo AXL koji je eksprimiran na ćelijama u uzorku takođe može biti određen shodno postupku koji je opisan u Primeru 23, gde se ekspresija AXL na plazma membrani humanih tumorskih ćelijskih linija kvantifikuje indirektnom imunofluorescencijom, upotrebom QIFIKIT analize (DAKO, Kat. br. K0078) i monoklonskog anti-AXL antitela (ovde: mišje monoklonsko antitelo ab89224; Abcam, Cambridge, Velika Britanija). Ukratko, priprema se jednoćelijska suspenzija i opciono se ista ispira. Sledeći koraci se izvode na ledu. Ćelije se zasejavaju, npr. u gustini od 100000 ćelija po ležištu ili epruveti, a zatim se iste talože i resuspenduju u 50 µL uzorka antitela koncentracije 10 µg/mL, opciono uz dodavanje kontrolnog antitela paralelnom uzorku. Nakon inkubacije od 30 minuta na 4°C, ćelije se talože i resuspenduju u 150 µL FACS pufera, a količina AXL se određuje FACS analizom, upotrebom, npr. sekundarnog, FITC obeleženog antitela koje se vezuje za anti-AXL i kontrolna antitela. Za svaku ćelijsku liniju se izračunava kapacitet vezivanja antitela (ABC), kao procena broja AXL molekula koji je eksprimiran na plazma membrane, upotrebom srednje vrednosti intenziteta fluorescence ćelija obojenih sa anti-AXL antitelom, na osnovu jednačine kalibracione krive, kao što je opisano u Primeru 23 (interpolacija nepoznatih sa standardne krive). Upotrebom postupka iz Primera 23, nivo AXL u ćelijama koje eksprimiraju AXL može biti određen na najmanje 5000, kao što je najmanje 8000, kao što je najmanje 13000.
[0128] Prisustvo ili nivo ćelija koje eksprimiraju AXL u neoplaziji, tumoru ili kanceru može biti ispitan upotrebom in vivo snimanja anti-AXL antitela koja su obeležena supstancama koje se mogu detektovati, postupcima koji su poznati u obalsti tehnike. Znatno veći signal sa mesta, poput poznatog, ili mesta za koga se sumanja da je mesto nalaženja tumora, u odnosu na signal pozadine ili signal u drugim kontrolama, ukazuje na prekomernu ekspresiju AXL u tumoru ili kanceru.
AXL-ADC
[0129] ADC pogodni za upotrebu u kontekstu predmetnog pronalaska mogu biti pripremljeni iz bilo kog anti-AXL antitela. Poželјna anti-AXL antitela karakteriše jedno ili više svojstava vezivanja AXL-a, varijabilne ili hipervarijabilne sekvence, ili kombinacija svojstava vezivanja i sekvenci, koje su navedene u aspektima i primerima izvođenja u tekstu koji sledi. Preciznije, antitelo može biti ono koje se vezuje za AXL, ali nije u kompeticiji vezivanja za AXL sa Faktorom specifičnim za zaustavljanje rasta tipa 6 (Gas6). Najpoželјnija su specifična anti-AXL antitela čije su sekvence opisane u Tabeli 4, a posebno antitelo označeno sa 107 i antitela koja dele jedno ili više svojstava vezivanja za AXL ili CDR, VH i/ili VL sekvence sa antitelom 107.
[0130] Tako, u jednom posebnom primeru izvođenja bilo kog od prethodnog aspekta ili primera izvođenja, anti-AXL antitelo sadrži najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, a VL region obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40.
[0131] ADC može sadržavati takvo anti-AXL antitelo povezano sa citotoksičnim agensom koji je auristatin ili njegov funkcionalni peptidni analog ili derivat, kao što je npr. monometil auristatin E, poželјno posredstvom maleimidokaproil-valin-citrulin-p-aminobenziloksi-karbonilnog (mc-vc-PAB) linkera.
[0132] Predviđeno je da se termin "antitelo", kako se ovde upotrebljava, odnosi na imunoglobulinski molekul, fragment imunoglobulinskog molekula, ili na derivat bilo koga od njih, koji je sa sposobnoću da se specifično vezuje za antigen pod uobičajenim fiziološkim i/ili uslovima specifičnim za tumore, sa polu-životom u vidu značajnih vremenskih perioda, kao što je najmanje oko 30 minuta, najmanje oko 45 minuta, najmanje oko jednog sata, najmanje oko dva sata, najmanje oko četiri sata, najmanje oko 8 sati, najmanje oko 12 sati, oko 24 sata ili više, oko 48 sati ili više, oko 3, 4, 5, 6, 7 ili više dana itd., ili u vidu bilo kog drugog relevantnog funkcionalno definisanog perioda (kao što je vreme dovolјno da se indukuje, pospeši, pojača i/ili moduliše fiziološki odgovor udružen sa vezivanjem antitela za antigen i/ili vreme dovolјno da se antitelo internalizuje). Region za vezivanje (ili vezujući domen, kako se ovde takođe upotrebljava, oba su istog značenja) koji intreaguje sa antigenom, sadrži varijabilne regione i teških i lakih lanaca imunoglobulinskog molekula. Konstantni regioni antitela (Abs) mogu posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uklјučujući razne ćelije imunog sistema (kao što su efektorske ćelije) i komponente sistema komplemenata kao što je C1q, prva komponenta u klasičnom putu aktivacije sistema komplementata. Kao što je prethodno naznačeno, termin antitelo, kako se ovde upotrebljava, osim ukoliko je drugačije navedeno ili jasno suprotstavlјeno kontekstu, uključuje fragmente antitela koja zadržavaju sposobnost da specifično interaguju, kao što je da se vezuju, sa antigenom. Pokazano je da funkcija antitela da vezuje antigen može biti ostvarena fragmentima antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata koji su obuhvaćeni pojmom "antitelo" uklјučuju (i) Fab' ili Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena, ili monovalentno antitelo kao što je opisano u WO 2007/059782; (ii) F(ab')2fragmente, bivalentne fragmente koji sadrže dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fd fragment koji se suštinski sastoji od VH i CH1 domena; (iv) Fv fragment koji se suštinski sastoji od VL i VH domena jednog kraka antitela, (v) dAb fragment (Ward i saradnici, 1989), koji se suštinski sastoji od VH domena i naziva se i domenskim antitelom (Holt i saradnici, 2003); (vi) kamelidna ili nano antitela (Revets i saradnici, 2005) i (vii) izolovan region koji određuje komplementarnost (CDR). Štaviše, iako su
2
dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana razdvojenim genima, oni mogu biti spojeni upotrebom postupaka rekombinantne tehnologije, sintetskim linkerom koji im omogućava da budu napravlјeni kao jedinstven proteinski lanac u kome se VL i VH regioni uparuju tako da se obrazuju monovalentni molekuli (poznati kao jednolančana antitela ili jednolančani Fv (scFv), pogledati na primer Bird i saradnici (1988) i Huston i saradnici (1988). Takva jednolančana antitela su obuhvaćena terminom antitela, osim ukoliko nije drugačije navedeno ili jasno naznačeno kontekstom. Iako su takvi fragmenti uglavnom obuhvaćeni značenjem pojma antitelo, oni zajedno i svaki nezavisno predstavljaju jedinstvene karakteristike predmetnog pronalaska koje karakterišu različite biološke osobine i korisnost. Ovakvi i drugi korisni fragmenti antitela se ovde dalje razmatraju u kontekstu predmetnog pronalaska. Takođe se podrazumeva da termin antitelo, ukoliko nije drugačije specifično navedeno, obuhvata i poliklonska antitela, monoklonska antitela (mAbs), polipeptide slične antitelima, kao što su himerna antitela i humanizovana antitela, kao i „fragmente antitela“ ili „njihove fragmente“ koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za antigen (fragmenti koji vezuju antigen), a koji se obezbeđuju bilo kojom poznatom tehnikom poput enzimskog cepanja, sinteze peptida i rekombinantnih tehnika, uz zadržavanje sposobnosti da budu konjugovani sa toksinom. Ovako generisana antitela mogu biti bilo kog izotipa.
[0133] Predviđeno je da se termini "imunoglobulinski teški lanac" ili "teški lanac imunoglobulina", kako se ovde upotrebljavaju, odnose na jedan od teških lanaca imunoglobulina. Teški lanac se obično sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćenog kao VH) i konstantnog regiona teškog lanca (ovde skraćenog kao CH) koji definiše izotip imunoglobulina. Konstantni region teškog lanca se obično sastoji od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Predviđeno je i da se termin "imunoglobulin", kako se ovde upotrebljava, odnosi na klasu strukturno srodnih glikoproteina koji se sastoje od dva para polipeptidnih lanaca, jednog para lakih (L) lanaca niske molekulske težine i jednog para teških (H) lanaca, pri čemu su sva četiri potencijalno međusobno povezana disulfidnim vezama. Struktura imunoglobulina je dobro okarakterisana (pogledati, na primer, Fundamental Immunology, poglavlje 7 (Paul W., izd., 2. Izd, Raven Press, N.Y. (1989). Unutar strukture imunoglobulina, dva teška lanca su međusobno povezana disulfidnim vezama u takozvanom "zglobnom regionu". Isto kao i teški lanci, svaki laki lanac se obično sastoji od nekoliko regiona; varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćenog kao VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca se obično sastoji od jednog domena, CL. Nadalјe, VH i VL regioni mogu dodatno biti podeljeni na regione hipervarijabilnosti (ili hipervarijabilne regione koji mogu biti hipervarijabilni u sekvenci i/ili obliku strukturno definisanih petlјi), koji se označavaju i kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR), a koji se smenjuju sa regionima koji su više evolutivno očuvani i označeni kao uokvirujući regioni (FR). Svaki VH i VL se obično sastoji od tri CDR sekvence i četiri FR sekvence, raspoređene od amino-kraja ka karboksilnom-kraju po sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. CDR sekvence su definisane u skladu sa IMGT (pogledati Lefranc i saradnici (1999) i Brochet i saradnici (2008)).
[0134] Termini "region koji vezuje antigen" ili "vezujući region", kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na regione antitela koji su sposobni da se vezuju za antigen. Antigen može biti bilo koji molekul, poput polipeptida, npr. prisutan na ćeliji, bakteriji ili virusnoj partikuli. Termini "antigen" i "mesto ciljanog dejstva" se mogu, u kontekstu predmetnog pronalaska, koristiti naizmenično, osim ukoliko to nije suprotno kontekstu.
[0135] Termin "vezivanje", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na vezivanje antitela na unapred određeni antigen ili ciljni molekul, obično sa afinitetom vezivanja koji odgovara KDod oko 10<-6>M ili
2
manje, npr.10<-7>M ili manje, kao što je oko 10<-8>M ili manje, kao što je oko 10<-9>M ili manje, oko 10<-10>M ili manje ili oko 10<-11>M ili čak manje, što se određuje, na primer, tehnologijom površinske plazmonske rezonance (SPR), upotrebom BIAcore 3000 instrumenta koji koristi antigen kao ligand i protein kao analit, kao i vezivanje antitela za unapred određeni antigen sa afinitetom koji odgovara KDkoja je najmanje deset puta niža, kao što je najmanje 100 puta niža, na primer najmanje 1000 puta niža, kao što je najmanje 10.000 puta niža, na primer najmanje 100.000 puta niža od njegovog afiniteta za vezivanje za nespecifičan antigen (npr. BSA, kazein), a koji je drugačiji u odnosu unapred određen antigen ili blisko srodan antigen. Količina sa kojom je afinitet niži zavisi od KDproteina, tako da kada je KDproteina veoma niska (to jest, protein je visoko specifičan), količina sa kojom je afinitet za antigen niži od afiniteta za nespecifičan antigen može biti najmanje 10000 puta. Termin "KD" (M), kako se ovde upotrebljava, odnosi se na ravnotežnu konstantu disocijacije određene interakcije antitela i antigena i dobija se delјenjem kdsa ka.
[0136] Termin "kd" (sek<-1>), kako se ovde upotrebljava, odnosi se na konstantu stope disocijacije određene interakcije antitelo-antigen. Navedena vrednost se takođe označava kao koffvrednost ili stopa disocijacije.
[0137] Termin "ka" (M<-1>x sec<-1>), kako se ovde upotrebljava, odnosi se na konstantu stope asocijacije određene interakcije antitela i antigena. Navedena vrednost se takođe označava kao konvrednost ili stopa asocijacije.
[0138] Termin "KA" (M<-1>), kako se ovde upotrebljava, odnosi se na ravnotežnu konstantu asocijacije određene interakcije antitela i antigena i dobija se delјenjem kasa kd.
[0139] Termin "AXL", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na protein naslovljen kao AXL, koji se označava i kao UFO ili JTK11, a koji predstavlja protein od 894 aminokiselina sa molekulskom težinom od 104-140 kDa, i koji je deo potfamilije sisarskih TAM tirozin kinaznih receptora (RTK). Molekulska težina je varijabilna usled potencijalnih razlika u glikozilaciji proteina. AXL protein se sastoji od dva vanćelijska domena slična imunoglobulinskim (slična Ig domenima) na N-terminalnom kraju proteina, dva vanćelijska fibronektinska domena tipa III (FNIII) koji su postavljeni proksimalno u odnosu na membranu, kao i od transmembranskog domena i unutarćelijskog kinaznog domena. AXL se aktivira nakon vezivanja njegovog liganda Gas6, homofilnim interakcijama nezavisnim od liganda između vanćelijskih domena AXL, a zatim sledi autofosforilacija u prisustvu reaktivnih vrsta kiseonika (Korshunov et al., 2012) ili transaktivacija preko EGFR-a (Meyer et al., 2013) i njegova aberantna ekspresija u nekoliko tipova tumora. Kod lјudi, AXL protein je kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:130 (humani AXL protein: Swissprot P30530; AXL protein cinomolgus majmuna: pristupni broj u Genbank bazi podataka - HB387229.1)).
[0140] Termin "homofilne interakcije nezavisne od liganda", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na asocijaciju između dva AXL molekula (eksprimirana na susednim ćelijama), a koja se odvija u odsustvu liganda.
[0141] Termin "antitelo koje vezuje AXL", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na bilo koje antitelo koje vezuje epitop na vanćelijskom delu AXL-a.
[0142] Termin "epitop" označava proteinsku determinant sposobnu da se specifično vezuje za antitelo. Epitopi se obično sastoje od površinskih grupa molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera ili
2
njihove kombinacije, i obično ih karakterišu specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju po tome što se vezivanje za prvonavedene, ali ne i za drugonavedene epitope, gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača. Epitop može sadržavati aminokiselinske ostatke koji su direktno uklјučeni u vezivanje i druge aminokiselinske ostatke koji nisu direktno uklјučeni u vezivanje, kao što su aminokiselinski ostaci koji su efektivno blokirani ili prekriveni specifičnim peptidom koji vezuje antigen (drugim rečima, aminokiselinski ostatak je unutar regiona “otiska” specifičnog peptida koji vezuje antigen).
[0143] Termin "ligand", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na supstancu, kao što je hormon, peptid, jon, lek ili protein, koja se specifično i reverzibilno vezuje za drugi protein, kao što je receptor, da bi se obrazovao veći kompleks. Vezanje liganda za receptor može izmeniti njegovu hemijsku konformaciju i odrediti njegovo funkcionalno stanje. Na primer, ligand može funkcionisati kao agonista ili antagonista.
[0144] Termini "ligand specifičan za zaustavljanje rasta tipa 6" ili "Gas6", kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na protein od 721 aminokiseline, molekulske težine od 75-80 kDa, koji funkcioniše kao ligand za TAM familiju receptora, uklјučujući AXL. Gas6 se sastoji od N-terminalnog regiona koji sadrži višestuke ostatke gama-karboksiglutaminske kiseline (Gla) koji su odgovorni za specifičnu interakciju sa negativno naelektrisanom fosfolipidnom membranom. Iako Gla domen nije neophodan za vezivanje Gas6 za AXL, potreban je za aktivaciju AXL. Gas6 se takođe može označiti kao "ligand za AXL".
[0145] Termini "monoklonsko antitelo", "monoklonsko At", "kompozicija monoklonskog antitela", "mAb" ili slično, kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na pripremu molekula antitela za jednomolekulske kompozicije. Kompoziciju monoklonskog antitela karakterišu jedinstvena specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop. Prema tome, termin "humano monoklonsko antitelo" se odnosi na antitela koja karakteriše jedinstvena sposobnost vezivanja i koja sadrže varijabilne i konstantne regione izvedene iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. Humana monoklonska antitela mogu biti proizvedena od strane hibridoma koji uklјučuje B ćeliju dobijenu iz transgene ili transhromozomske životinje različite od čoveka, kao što je transgeni miš, a koja je sa genomom koji sadrži transgen humanog teškog lanca i transgen lakog lanca, fuzionisana u imortalizovanu ćeliju.
[0146] U kontekstu predmetnog pronalaska, termin "ADC" se odnosi na konjugat antitela i leka koji se, u kontekstu predmetnog pronalaska, odnosi na anti-AXL antitelo koje je kuplovano sa terapijskom strukturom/grupom, npr. citotoksičnom grupom, kao što je opisano u predmetnoj prijavi. Grupa može npr. biti kuplovana sa linkerom za npr. cistein ili drugim postupcima konjugacije za druge aminokiseline. Grupa može biti nrp. lek ili toksin ili slično.
[0147] Kako se ovde upotrebljava, "terapijska struktura/grupa" označava jedinjenje koje ispoljava terapijski ili preventivni efekat kada se primenjuje subjektu, naročito kada se isporučuje kao ADC, kao što je ovde opisano. "Citotoksična" ili "citostatska" grupa je jedinjenje koje štetno deluje na (npr. ubija) ćelije. Pojedine citotoksične ili citostatske grupe za upotrebu u ADC su hidrofobne, što označava da nemaju ili su sa ograničenom rastvorljivošću u vodi, npr. rastvorljivost je 1 g/L ili manje (vrlo mala rastvorlјivost), kao što je 0,8 g/L ili manje, kao što je npr.0,6 g/L ili manje, poput 0,4 g/L ili manje, poput 0,3 g/L ili manje, kao što je 0,2 g/L ili manje, kao što je 0,1 g/L ili manje (praktično su nerastvorlјive). Primeri hidrofobnih citotoksičnih ili citostatskih grupa obuhvataju, ali nisu ograničeni na, određene inhibitore mikrotubulina, poput auristatina i njegovih derivata, npr. MMAF i MMAE, kao i majtanzina i njegovih derivata, npr. DM1.
2
[0148] Antitelo može karakterisati afinitet vezivanja (KD) za AXL opsega od 0,3x10<-9>do 63x10<-9>M, pri čemu se navedeni afinitet vezivanja meri upotrebom Interferometrije Bio-sloja sa solubilnim vanćelijskim domenom AXL-a.
[0149] Afinitet vezivanja može biti određen kao što je opisano u Primeru 2. Tako, antitelo može biti sa afinitetom vezivanja za antigen od 0,3x10<-9>do 63x10<-9>M, pri čemu se afinitet vezivanja određuje postupkom koji obuhvata korake;
i) nanošenje anti-AXL antitela na Capture biosenzore sa anti-humanim Fc, i
ii) određivanje asocijacije i disocijacije solubilnog rekombinantnog vanćelijskog domena AXL-a Interferometrijom Bio-sloja u različitim koncentracijama.
[0150] Termin "solubilni rekombinantni AXL vanćelijski domen", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na vanćelijski domen AXL-a koji odgovara aminokiselinama 1-447 iz proteina pune dužine (SEQ ID NO: 130; pogledati Primer 1) koji je rekombinantno eksprimiran. Usled odsustva transmembranskog i unutarćelijskog domena, rekombinantan AXL vanćelijski domen nije vezan za npr. površinu ćelije i ostaje u rastvoru. Poznato je kako rekombinantno eksprimirati protein, pogledati npr. Sambrook (1989), i stoga je unutar opsega znanja stručnjaka da obezbediti takav rekombinantni AXL vanćelijski domen.
[0151] Antitelo može biti sa stopom disocijacije od AXL-a od 6,9x10<-5>s<-1>do 9,7x10<-3>s<-1>, pri čemu se stopa disocijacije meri Interferometrijom Bio-sloja upotrebom solubilnog rekombinantnog AXL vanćelijskog domena.
[0152] Afinitet vezivanja može biti određen kao što je prethodno opisano (i u Primeru 2). Tako, u jednom primeru izvođenja, antitelo je sa stopom disocijacije od AXL-a od 6,9x10<-5>s<-1>do 9,7x10<-3>s<-1>, a pri čemu se stopa disocijacije meri postupkom koji obuhvata korake
i) nanošenje anti-AXL antitela na Capture biosenzore sa anti-humanim Fc, i
ii) određivanje asocijacije i disocijacije rekombinantnog AXL vanćelijskog domena Interferometrijom Bio-sloja u različitim koncentracijama.
[0153] Termin "stopa disocijacije", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na brzinu kojom se antitelo specifično za antigen vezuje za svoj antigen, disocira od tog antigena i izražava se u s<-1>. Tako, u kontekstu antitela koje vezuje AXL, termin "stopa disocijacije" se odnosi na disosovanje antitela koje vezuje AXL od rekombinantnog vanćelijskog domena AXL-a i izražava se s<-1>.
[0154] ADC za upotrebu u predmetnom pronalasku može sadržavati deo antitela koji se vezuje za vanćelijski domen AXL-a, a bez kompeticije sa ili ometanja vezivanja Gas6 za AXL. Preciznije, antitelo se može vezati za vanćelijski domen sličan Ig1 domenu bez kompeticije sa ili ometanja vezivanja Gas6 za AXL. Antitelo se može vezivati za vanćelijski domen sličan Ig1 domenu i ispoljiti smanjenje vezivanja Gas6 za AXL koje nije veće od 20%. Preciznije, antitelo može ispoljiti smanjenje maksimalnog vezivanja Gas6 za AXL koje nije veće od 15%. Antitelo može ispoljiti smanjenje maksimalnog vezivanja Gas6 za AXL koje nije veće od 10%. Antitelo može ispoljiti smanjenje maksimalnog vezivanja Gas6 za AXL koje nije veće od 5%. Antitelo može ispoljiti smanjenje maksimalnog vezivanja Gas6 za AXL koje nije veće od 4%. Antitelo može ispoljiti smanjenje maksimalnog vezivanja Gas6 za AXL koje nije veće od 2%.
2
Antitelo može ispoljiti smanjenje maksimalnog vezivanja Gas6 za AXL koje nije veće od 1%. Antitelo se može vezivati za vanćelijski domen sličan Ig2 domenu bez kompeticije sa ili ometanja vezivanja Gas6 za AXL. Antitelo se može vezati za vanćelijski domen sličan Ig2 i ispoljiti smanjenje maksimalnog vezivanja Gas6 za AXL koje nije veće od 20%, kao što je ono ne veće od 15%, kao što je ono ne veće od 10%, kao što je ono ne veće od 5%, kao što je ono ne veće od 4%, kao što je ono ne veće od 2%, kao što je ono ne veće 1%. Sposobnost da bude u kompeticiji sa ili da redukuje vezivanje Gas6 može biti određeno kao što je opisano u Primeru 2 ili Primeru 12. Antitelo se može vezivati za Ig2 domen u vanćelijskom domenu AXL-a bez bez kompeticije sa ili interferiranja sa maksimalnim vezivanjem Gas6 za AXL.
[0155] Maksimalno vezivanje antitela u prisustvu Gas6 može biti najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 97%, kao što je najmanje 99%, kao što je 100% od vezivanja u odsustvu Gas6, što se određuje testom kompeticije, pri čemu se kompeticija između vezivanja antitela za humani AXL i navedenog Gas6 određuje na A431 ćelijama prethodno inkubiranim sa Gas6 i bez Gas6.
[0156] Kompeticija između anti-AXL i Gas6liganda za AXL može biti određena kao što je opisano u Primeru 2 pod naslovom „Ometanje vezivanja anti-AXL sa vezivanjem Gas6“. Stoga, antitelo može biti ono koje nije u kompeticiji vezivanja za AXL sa Gas6, pri čemu se kompeticija u vezivanju određuje u analizi koja obuhvata korake
i) inkubiranje ćelija koje eksprimiraju AXL sa Gas6,
ii) dodavanje anti-AXL antitela koja će biti ispitana,
iii) dodavanje fluorescentno obeleženog sekundarnog reagensa koji detektuje anti-AXL antitela i
iv) analizu ćelija FACS postupkom.
[0157] Antitelo može biti ono koje nije u kompeticiji za vezivanje sa Gas6 ligandom, pri čemu se kompeticija u vezivanju određuje analizom koja obuhvata korake
i) inkubiranje ćelija koje eksprimiraju AXL sa anti-AXL antitelom,
ii) dodavanje Gas6,
iii) dodavanje fluorescentno obeleženog sekundarnog reagensa koji detektuje Gas6 i
iv) analiza ćelija FACS postupkom.
[0158] Antitelo može modulisati signalizaciju povezanu sa AXL-om u ćeliji koja eksprimira AXL, kada je ćelija u kontaktu sa antitelom.
[0159] Antitelo može biti ono koje ne moduliše signalizaciju povezanu sa AXL-om u ćeliji koja eksprimira AXL, kada je ćelija u kontaktu sa antitelom.
[0160] Neograničavajući primeri modulacije signalizacije povezane sa AXL-om obuhvataju modulaciju unutarćelijskih signalnih puteva kao što su PI3K/AKT, kaskada proteinske kinaze aktivirane mitogenom (MAPK), STAT ili NF-κB kaskade.
[0161] Anti-AXL antitelo ili AXL-ADC mogu biti u kompeticiji vezivanja za AXL sa antitelom koje sadrži varijabilni teški (VH) region i varijabilni laki (VL) region, izabrane iz grupe koju čine:
(a) VH region koji sadrži SEQ ID NO:1 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:2 [107];
(b) VH region koji sadrži SEQ ID NO:5 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:6 [148];
(c) VH region koji sadrži SEQ ID NO:34 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:35 [733]
(d) VH region koji sadrži SEQ ID NO:7 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:9 [154];
(e) VH region koji sadrži SEQ ID NO:10 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:11 [171];
(f) VH region koji sadrži SEQ ID NO:16 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:18 [183];
(g) VH region koji sadrži SEQ ID NO:25 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:26 [613];
(h) VH region koji sadrži SEQ ID NO:31 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:33 [726];
(i) VH region koji sadrži SEQ ID NO:3 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:4 [140];
(j) VH region koji sadrži SEQ ID NO:8 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:9 [154-M103L];
(k) VH region koji sadrži SEQ ID NO:12 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:13 [172];
(l) VH region koji sadrži SEQ ID NO:14 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:15 [181];
(m) VH region koji sadrži SEQ ID NO:17 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:18 [183-N52Q];
(n) VH region koji sadrži SEQ ID NO:19 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:20 [187];
(o) VH region koji sadrži SEQ ID NO:21 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:22 [608-01] ;
(p) VH region koji sadrži SEQ ID NO:23 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:24 [610-01] ;
(q) VH region koji sadrži SEQ ID NO:27 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:28 [613-08];
(r) VH region koji sadrži SEQ ID NO:29 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:30 [620-06]; i
(s) VH region koji sadrži SEQ ID NO:32 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:33 [726-M101L].
[0162] Kada se ovde upotrebljava u kontekstu antitela i Gas6 liganda ili u kontekstu dva ili više antitela, termin "u kompeticiji sa" ili "u unakrsnoj kompeticiji sa" označava da je antitelo u kompeticiji sa ligandom ili sa drugim antitelom, npr. "referentnim" antitelom u vezivanju za antigen, tim redom. Primer 2 opisuje primer kako se ispituje kompeticija anti-AXL antitela sa Gas6 ligandom za AXL. Poželјna referentna antitela za unakrsnu kompeticiju između dva antitela su ona koja sadrže vezujuće region koji sadrži VH region i VL region antitela koje je ovde označeno kao 107, 148, 733, 154, 171, 183, 613, 726, 140, 154-M103L, 172, 181, 183-N52Q, 187, 608-01, 610-01, 613-08, 620-06 ili 726-M101L, kao što je navedeno u Tabeli 4. Posebno poželјno referentno antitelo je antitelo označeno kao 107.
1
[0163] Anti-AXL antitelo može vezivati isti epitop na AXL-u kao i jedno ili više antitela iz prethodno navedenih primera izvođenja, što je definisano njihovim VH i VL sekvencama, npr. VH regionom koji sadrži SEQ ID NO:1 i VL regionom koji sadrži SEQ ID NO:2 [107].
[0164] Postupci određivanja epitopa za koji se antitelo vezuje su dobro poznati u stanju tehnike. Tako, stručnjaku će biti poznato kako da odredi takav epitop. Međutim, jedan primer određivanja da li se antitelo vezuje unutar bilo kog epitopa koji je ovde opisan može biti uvođenjem tačkastih mutacija u vanćelijski domen AXL vanćelijskog domena, npr. u svrhu identifikacije aminokiselina koje su uklјučene u vezivanje antitela za antigen. U okviru je znanja stručkanja kako da se uvede tačkasta mutacija(e) u vanćelijski domen AXL-a i ispita vezivanje ovakvog vanćelijskog domena AXL-a sa tačkastim mutacijama za antitelo, pošto se očekuje da će efekat tačkastih mutacije na celokupnu 3D strukturu biti minimalan.
[0165] Alternativni postupak je upotrebljen u Primeru 3, gde je specifičnost AXL domena mapirana pripremom panela himernih AXL mutanata čoveka i miša u kojima je humani, Ig2, FN1 ili FN2 domen zamenjen njegovim mišjim analogom, pa je određivano za kog se mutanta vezivalo anti-AXL antitelo. Ovakav postupaka se zasnivao na principu da ova humana antitela specifična za AXL prepoznaju humani, ali ne i mišji AXL. Tako, u odvojenim i specifičnim primerima izvođenja, antitelo se vezuje za domen AXL-a, Ig2 domen AXL-a, FN1 domen AXL-a ili FN2 domen AXL-a.
[0166] Postupak mapiranja epitopa veće rezolucije, kojim se identifikuju aminokiseline vanćelijskog domena AXL-a uključene u vezivanje antitela, takođe je upotrebljen u ovom primeru. Preciznije, ovim postupkom je analizirano vezivanje anti-AXL antitela za biblioteku varijanti AXL sekvence koje su generisane rekombinacijom AXL sekvenci izvedenih iz vrsta sa promenlјivim nivoom homologije sa humanom AXL sekvencom (SEQ ID NO:130) u vanćelijskom domenu. Ovakav postupak se zasnivao na principu da ova humana antitela specifična za AXL prepoznaju humani AXL, ali ne i AXL iz bilo koje druge vrste koja je upotrebljena u primeru.
[0167] Antitelo može vezivati epitop unutar domena AXL, a vezivanje antitela može zavisiti od jedne ili više ili svih aminokiselina koje odgovaraju pozicijama od L121 do Q129 ili od jedne ili više ili svih od T112 do Q124 u humanom AXL, pri čemu se numerisanje aminokiselinskih ostataka odnosi na njihove odgovarajuće pozicije u humanom AXL-u (SEQ ID NO:130). Antitelo možebiti na epitop unutar domena AXL-a, a vezivanje antitela može zavisiti od jedne ili više ili svih aminokiselina koje odgovaraju pozicijama od L121 do Q129 ili od T112 do Q124 humanog AXL-a. Vezanje antitela može zavisiti od jedne ili više ili svih aminokiselina na poziciji L121, G122, H123, Q124, T125, F126, V127, S128 i Q129, što odgovara aminokiselinama uključenim u vezivanje antitela koje je ovde označeno kao 107. Vezivanje antitela može zavisiti od jedne ili više ili svih aminokiselina na poziciji T112, G113, Q114, Y115, Q116, C117, L118, V119, F120, L121, G122, H123 i Q124.
[0168] Antitelo može vezivati epitop unutar Ig2 domena AXL-a, a vezivanje antitela može zavisiti od jedne ili više ili svih aminokiselina koje odgovarajna poziciji D170 ili kombinaciji sa D179 ili od jedne ili više ili svih aminokiselina na pozicijama od T182 do R190 humanog AXL-a. Vezanje antitela može zavisiti od aminokiselina na poziciji T182, A183, P183, G184, H185, G186, P187, Q189 i R190.
[0169] Antitelo se može vezivati za FN1 domen humanog AXL-a, a vezivanje antitela može zavisiti od jedne ili više ili svih aminokiselina koje odgovaraju pozicijama od Q272 do A287 i od G297 do P301 humanog AXL-a. Vezanje antitela može zavisiti od aminokiselina koje odgovaraju pozicijama od Q272 do A287 i od G297 do P301 humanog AXL-a.
2
[0170] Antitelo se može vezivati za FN2 domen humanog AXL-a, a vezivanje antitela može zavisiti od jedne ili više ili svih aminokiselina koje odgovaraju pozicijama A359, R386 i od Q436 do K439 humanog AXL-a.
[0171] Antitelo se može vezivati za epitop unutar Ig1 domena AXL-a, a epitop može sadržavati ili zahteva jednu ili više ili sve aminokiseline koje odgovaraju pozicijama od L121 do Q129 ili jednu ili više od T112 do Q124 humanog AXL-a, pri čemu se numerisanje aminokiselinskih ostataka odnosi na njihove odgovarajuće pozicije u humanom AXL-u (SEQ ID NO:130). U jednom primeru izvođenja, antitelo se vezuje za epitop unutar domena AXL-a, a epitop sadrži ili zahteva aminokiseline koje odgovaraju pozicijama od L121 do Q129 ili od T112 do Q124 humanog AXL-a. Poželјno, epitop sadrži jednu ili više ili sve aminokiseline na poziciji L121, G122, H123, Q124, T125, F126, V127, S128 i Q129, što odgovara aminokiselinama koje su uklјučene u vezivanje antitela koje je ovde označeno kao 107. Epitop može jedna ili više ili sve aminokiseline na poziciji T112, G113, Q114, Y115, Q116, C117, L118, V119, F120, L121, G122, H123 i Q124.
[0172] Antitelo se može vezivati za epitop unutar Ig2 domena AXL-a, a epitop može sadržavati ili zahtevati jednu ili više ili sve od aminokiselina koje odgovaraju poziciji D170 ili kombinaciju D179 ili jednu ili više ili sve od aminokiselina na pozicijama od T182 do R190 humanog AXL-a. Epitop može sadržavati ili zahtevati aminokiseline na poziciji T182, A183, P183, G184, H185, G186, P187, Q189 i R190.
[0173] Antitelo se može vezivati za epitop unutar FN1 domena humanog AXL-a, pri čemu epitop sadrži ili zahteva jednu ili više ili sve od aminokiselina koje odgovaraju pozicijama od Q272 do A287 i od G297 do P301 humanog AXL-a. Epitop može sadržavati ili zahtevati aminokiseline koje odgovaraju pozicijama od Q272 do A287 i od G297 do P301 humanog AXL-a.
[0174] Antitelo se može vezivati za epitop unutar FN2 domena humanog AXL-a, pri čemu epitop sadrži ili zahteva jednu ili više ili sve od aminokiselina koje odgovaraju pozicijama A359, R386 i od Q436 do K439 humanog AXL-a.
[0175] Antitelo se može vezivati za epitop unutar FN1 domena humanog AXL-a.
[0176] Antitelo se može vezivati za epitop na AXL-u, pri čemu epitop prepoznaje bilo koje od antitela definisano kao ono koje sadrži
(a) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 36, 37 i 38, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom [107];
(b) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 46, 47 i 48, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 49, AAS i 50, tim redom [148];
(c) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 114, 115 i 116, tim redom, i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 117, DAS i 118, tim redom [733];
(d) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 51, 52 i 53, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 55, GAS i 56, tim redom [154]; (e) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 51, 52 i 54, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 55, GAS i 56, tim redom [154-M103L];
(f) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 57, 58 i 59, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 60, GAS i 61, tim redom [171];
(g) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 62, 63 i 64, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 65, GAS i 66, tim redom [172];
(h) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 67, 68 i 69, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 70, GAS i 71, tim redom [181];
(i) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 72, 73 i 75, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 76, ATS i 77, tim redom [183];
(j) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 72, 74, i 75, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 76, ATS i 77, tim redom [183-N52Q];
(k) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 78, 79 i 80, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 81, AAS i 82, tim redom [187];
(l) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 83, 84 i 85, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 86, GAS i 87, tim redom [608-01];
(m) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 88, 89 i 90, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 91, GAS i 92, tim redom [610-01];
(n) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 93, 94 i 95, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 96, GAS i 97, tim redom [613];
(o) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 98, 99 i 100, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 10, DAS i 102, tim redom [613-08];
(p) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 103, 104, i 105, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 106, GAS i 107, tim redom [620-06];
(q) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 108, 109 i 110, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 112, AAS i 113, tim redom [726];
(r) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 108, 109 i 111, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 112, AAS i 113, tim redom [726-M101L];
4
(s) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 41, 42 i 43, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 44, AAS i 45, tim redom [140];
(t) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 93, 94 i 95, tim redom, i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 128, XAS, pri čemu je X D ili G, i 129, tim redom [613 / 613-08];
(u) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 46, 119 i 120, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 49, AAS i 50, tim redom [148 / 140];
(v) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 123, 124, i 125, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 60, GAS i 61, tim redom [171 / 172 / 181]; i
(w) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 121, 109, i 122, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 112, AAS i 113, tim redom [726 / 187]; i
(x) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.:93, 126 i 127, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 96, GAS i 97, tim redom [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06].
[0177] Antitelo se može vezivati za epitop na AXL-u, pri čemu epitop prepoznaje bilo koje od antitela definisano kao ono koje sadrži regon za vezivanje koji sadrži VH i VL sekvence antitela i izabrano je od onih koja su ovde označena kao 107, 061, 137, 148, 154-M103L, 171, 183-N52Q, 511, 613, 726-M102L i 733. Kao što je prikazano u Primeru 16, ova anti-AXL antitela se internalizuju i tako su pogodna za ADC pristup.
[0178] Antitelo može sadržavati najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, izabran iz grupe koju čine:
(a) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:36, 37, i 38, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:39, GAS i 40, tim redom [107];
(b) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.:46, 47, i 48, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:49, AAS i 50, tim redom [148];
(c) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:114, 115, i 116, tim redom, i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.:117, DAS i 118, tim redom [733];
(d) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.:51, 52 i 53, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:55, GAS i 56, tim redom [154];
(e) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.:51, 52 i 54, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:55, GAS i 56, tim redom [154-M103L];
(f) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.:57, 58 i 59, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 60, GAS i 61, tim redom [171];
(g) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 62, 63, i 64, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 65, GAS i 66, tim redom [172];
(h) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.:67, 68, i 69, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.:70, GAS i 71, tim redom [181];
(i) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.:72, 73 i 75, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.:76, ATS i 77, tim redom [183];
(j) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.:72, 74, i 75, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.:76, ATS i 77, tim redom [183-N52Q];
(k) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.:78, 79 i 80, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.:81, AAS i 82, tim redom [187];
(l) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.:83, 84, i 85, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.:86, GAS i 87, tim redom [608-01];
(m) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.:88, 89, i 90, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.:91, GAS i 92, tim redom [610-01];
(n) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.:93, 94, i 95, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.:96, GAS i 97, tim redom [613];
(o) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.:98, 99 i 100, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:101, DAS i 102, tim redom [613-08];
(p) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:103., 104, i 105, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:106, GAS i 107, tim redom [620-06];
(q) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:108, 109 i 110, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.:112, AAS i 113, tim redom [726];
(r) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:108, 109 i 111, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.:112, AAS i 113, tim redom [726-M101L];
(s) VH region koji sadrži CDRl, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:41, 42 i 43, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.:44, AAS i 45, tim redom [140];
(t) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.:93, 94 i 95, tim redom, i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.:128, XAS, pri čemu je X D ili G, i 129, tim redom [613 / 613-08];
(u) VH region koji sadrži CDRl, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.:46, 119, i 120, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:49, AAS i 50, tim redom [148 / 140];
(v) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:123, 124 i 125, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.:60, GAS i 61, tim redom [171 / 172 / 181]; i
(w) VH region koji sadrži CDRl, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:121, 109, i 122, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.:112, AAS i 113, tim redom [726 / 187]; i
(x) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.:93, 126 i 127, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.:96, GAS i 97, tim redom [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06].
[0179] Antitelo može sadržavati najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, izabran iz grupe koju čine:
(a) VH region koji sadrži SEQ ID NO:1 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:2 [107];
(b) VH region koji sadrži SEQ ID NO:5 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:6 [148];
(c) VH region koji sadrži SEQ ID NO:34 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:35 [733]
(d) VH region koji sadrži SEQ ID NO:7 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:9 [154];
(e) VH region koji sadrži SEQ ID NO:10 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:11 [171];
(f) VH region koji sadrži SEQ ID NO:16 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:18 [183];
(g) VH region koji sadrži SEQ ID NO:25 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:26 [613];
(h) VH region koji sadrži SEQ ID NO:31 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:33 [726];
(i) VH region koji sadrži SEQ ID NO:3 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:4 [140];
(j) VH region koji sadrži SEQ ID NO:8 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:9 [154-M103L];
(k) VH region koji sadrži SEQ ID NO:12 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:13 [172];
(l) VH region koji sadrži SEQ ID NO:14 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:15 [181];
(m) VH region koji sadrži SEQ ID NO:17 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:18 [183-N52Q]; (n) VH region koji sadrži SEQ ID NO:19 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:20 [187];
(o) VH region koji sadrži SEQ ID NO:21 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:22 [608-01];
(p) VH region koji sadrži SEQ ID NO:23 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:24 [610-01];
(q) VH region koji sadrži SEQ ID NO:27 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:28 [613-08];
(r) VH region koji sadrži SEQ ID NO:29 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:30 [620-06]; i
(s) VH region koji sadrži SEQ ID NO:32 i VL region koji sadrži SEQ ID NO:33 [726-M101L].
[0180] Predmetni opis takođe obezbeđuje antitela koja sadrže funkcionalne varijante VL regiona, VH regiona, ili jednog ili više CDR antitela koja su prethodno navedena. Funkcionalna varijanta VL, VH ili CDR koja se upotrebljava u kontekstu AXL antitela i dalјe omogućava da antitelo zadrži barem značajan udeo (najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95 %, 99% ili više) afiniteta/aviditeta i/ili specifičnosti/selektivnosti matičnog antitela i u pojedinim slučajevima takvo AXL antitelo može biti povezano sa većim afinitetom, selektivnošću i/ili specifičnošću u odnosu na matično antitelo.
[0181] Ovakve funkcionalne varijante obično zadržavaju značajan identitet sekvence sa matičnim antitelom. Procenat identiteta između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje su zajedničke za obe sekvence (tj. % homologije = br. identičnih pozicija/ukupan br. pozicija x 100), uzimajući u obzir broj praznina, kao i dužinu svake od praznina, koje moraju biti uvedeni radi optimalnog poravnanja dve sekvence. Poređenje sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence se može postići upotrebom matematičkog algoritma koji je dobro poznat u oblasti tehnike.
[0182] Identitet sekvence između dve aminokiselinske sekvence može, na primer, biti utvrđen upotrebom Needleman-Wunsch-ovog algoritma (Needleman i Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.48:443-453) što je uvršćeno i u Needle program EMBOSS paketa (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice i saradnici, 2000, Trends Genet.16:276-277), po mogućstvu verzije 5.0.0 ili novije. Upotreblјeni parametri su vrednost ograničenja praznine od 10, vrednost ekstenzije razmaka od 0,5 i EBLOSUM62 substituciona matrica (EMBOSS verzija BLOSUM62). Podaci dobijeni iz Needle programa obeležavaju "najduži identitet" (dobijen korišćenjem opcije -nobrief) upotrebljavaju se za dobijanje procenta identiteta i izračunavaju se na sledeći način:
(Identični ostaci X 100) / (Dužina poravnanja – Ukupan broj praznina u poravnanju)
[0183] VH, VL i/ili CDR sekvence varijanti se mogu razlikovati od sekvenci matičnih antitela i uglavnom su u vidu konzervativnih supstitucija; na primer, najmanje oko 35%, oko 50% ili više, oko 60% ili više, oko 70% ili više, oko 75% ili više, oko 80% ili više, oko 85% ili više, oko 90% ili više, (npr. oko 65-95%, kao što je oko 92%, 93% ili 94%) supstitucija u varijantama su konzervativne zamene aminokiselinskih ostataka.
[0184] VH, VL i/ili CDR sekvence varijanti se mogu razlikovati od sekvenci matičnih antitela i uglavnom biti u vidu konzervativnih supstitucija; na primer, 10 ili manje, kao što je 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, 2 ili manje ili 1 supstitucija u varijantama predstavlja konzervativne zamene aminokiselinskih ostataka.
[0185] Primeri izvođenja predmetnog pronalaska su takođe obezbeđeni za slučajeve u kojima su dozvoljene mutacije ili supstitucije do pet mutacija ili supstitucija duž tri CDR sekvence u varijabilnom region teškog lanca i/ili u varijabilnom region lakog lanca prethodnih primera izvođenja. Do pet mutacija ili supstitucija može biti raspoređeno duž tri CDR sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i tri CDR sekvence varijabilnog regiona lakog lanca. Do pet mutacija ili supstitucija može biti raspoređeno duž šest CDR sekvenci regiona za vezivanje. Mutacije ili supstitucije mogu biti sa konzervativnim, fizičkim ili funkcionalnim aminokiselinama tako da mutacije ili supstitucije ne menjaju epitop ili, poželjno, ne modifikuju afinitet vezivanja za epitop za više od 30%, kao što je više od 20% ili kao što je više od 10%. Konzervativne, fizičke ili funkcionalne aminokiseline su izabrane od 20 prirodnih aminokiselina, tj. od Arg, His, Lys, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Cys, Gly, Pro, Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr i Val.
[0186] Antitelo stoga može sadržavati najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region i VL region izabrane iz grupe koja se sastoji od VH i VL sekvenci koje su najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 97%, kao što je na najmanje 99% identične:
(a) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:1 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:2 [107];
(b) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:5 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:6 [148];
(c) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:34 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:35 [733]
(d) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:7 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:9 [154];
(e) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:10 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:11 [171];
(f) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:16 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:18 [183];
(g) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:25 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:26 [613] ;
(h) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:31 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:33 [726] ;
(i) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:3 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:4 [140];
(j) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:8 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:9 [154-M103L];
(k) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:12 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:13 [172];
(l) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:14 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:15 [181];
(m) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:17 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:18 [183-N52Q];
(n) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:19 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:20 [187] ;
(o) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:21 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:22 [608-01] ;
(p) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:23 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:24 [610-01] ;
(q) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:27 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:28 [613-08] ;
(r) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:29 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:30 [620-06]; i
(s) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:32 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:33 [726-M101L].
[0187] Predmetni opis takođe obezbeđuje antitela koja sadrže funkcionalne varijante VL regiona, VH regiona ili jednog ili više CDR antitela iz primera. Funkcionalna varijanta VL, VH ili CDR koja se upotrebljava u kontekstu AXL antitela i dalјe omogućava da antitelo zadrži barem značajan udeo (najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95 %, 99% ili više) afiniteta/aviditeta i/ili specifičnosti/selektivnosti matičnog antitela i u nekim slučajevima takvo AXL antitelo može biti povezano sa većim afinitetom, selektivnošću i/ili specifičnošću u odnosu na matično antitelo.
[0188] Ovakve funkcionalne varijante obično zadržavaju značajan identitet sekvence sa matičnim antitelom. Procenat identiteta između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje su zajedničke za obe sekvence (tj. % homologije = br. identičnih pozicija/ukupan br. pozicija x 100), uzimajući u obzir broj praznina, kao i dužinu svake od praznina, koje moraju biti uvedeni radi optimalnog poravnanja dve sekvence. Poređenje sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence se može postići upotrebom matematičkog algoritma koji je dobro poznat u oblasti tehnike.
[0189] VH, VL i/ili CDR sekvence varijanti se mogu razlikovati od sekvenci matičnih antitela i uglavnom su u vidu konzervativnih supstitucija; na primer, najmanje oko 35%, oko 50% ili više, oko 60% ili više, oko 70% ili više, oko 75% ili više, oko 80% ili više, oko 85% ili više, oko 90% ili više, (npr. oko 65-95%, kao što je oko 92%, 93% ili 94%) supstitucija u varijantama su konzervativne zamene aminokiselinskih ostataka.
[0190] VH, VL i/ili CDR sekvence varijanti se mogu razlikovati od sekvenci matičnih antitela i uglavnom su u vidu konzervativnih supstitucija; na primer, 10 ili manje, kao što je 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, 2 ili manje ili 1 supstitucija u varijantama predstavlja konzervativne zamene aminokiselinskih ostataka.
[0191] Primeri izvođenja predmetnog pronalaska su takođe obezbeđeni za slučajeve u kojima su dozvoljene mutacije ili supstitucije do pet mutacija ili supstitucija duž tri CDR sekvence u varijabilnom region teškog lanca i/ili u varijabilnom region lakog lanca prethodnih primera izvođenja. Do pet mutacija ili supstitucija može biti raspoređeno duž tri CDR sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i tri CDR sekvence varijabilnog regiona lakog lanca. Do pet mutacija ili supstitucija može biti raspoređeno duž šest CDR sekvenci regiona za vezivanje. Mutacije ili supstitucije mogu biti sa konzervativnim, fizičkim ili funkcionalnim aminokiselinama tako da mutacije ili supstitucije ne menjaju epitop ili, poželjno, ne modifikuju afinitet vezivanja za epitop za više od 30%, kao što je više od 20% ili kao što je više od 10%. Konzervativne, fizičke ili funkcionalne aminokiseline su izabrane od 20 prirodnih aminokiselina, tj. od Arg, His, Lys, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Cys, Gly, Pro, Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr i Val.
[0192] Tako antitelo može sadržavati najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region i VL region izabrane iz grupe koja se sastoji od VH i VL sekvenci koje su najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 97%, kao što je na najmanje 99% identične:
(t) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:1 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:2 [107];
(u) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:5 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:6 [148];
4
(v) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:34 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:35 [733]
(w) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:7 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:9 [154];
(x) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:10 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:11 [171];
(y) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:16 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:18 [183];
(z) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:25 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:26 [613];
(aa) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:31 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:33 [726];
(bb) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:3 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:4 [140];
(cc) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:8 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:9 [154-M103L];
(dd) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:12 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:13 [172];
(ee) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:14 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:15 [181];
(ff) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:17 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:18 [183-N52Q];
(gg) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:19 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:20 [187];
(hh) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:21 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:22 [608-01];
(ii) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:23 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:24 [610-01];
(jj) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:27 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:28 [613-08];
(kk) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:29 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:30 [620-06]; i
(ll) VH regionu koji sadrži SEQ ID NO:32 i VL regionu koji sadrži SEQ ID NO:33 [726-M101L].
[0193] Antitelo može sadržavati najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH i VL CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence anti-AXL antitela poznatog u oblasti tehnike, npr. antitla opisanog u bilo kojoj od publikacija: Leconet i saradnici (2013), Li i saradnici (2009), Ye i saradnici (2010), lida i saradnici (2014), WO 2012/175691 (INSERM), WO 2012/175692 (INSERM), WO 2013/064685 (Pierre Fabré Medicaments), WO 2013/090776 (INSERM), WO 2009/063965 (Chugai Pharmaceuticals), WO 2010/131733, WO 2011/159980 (Genentech), WO09062690 (U3 Pharma), WO2010130751 (U3 Pharma), WO2014093707 (Univerzitet Stanford) i EP2228392A1 (Chugai). Antitelo može biti mišje antitelo 1613F12 ili njegova himerna ili humanizovana varijanta, kao što je opisano u WO2014174111 (Pierre Fabré Medicament), pri čemu su VH i VL sekvence mišjeg antitela 1613F12 predstavlјene kao SEQ ID: 8 i SEQ ID: 7, tim redom. VH sekvenca humanizovane varijante antitela 1613F12 je izabrana od sekvenci koje su tamo opisane kao SEQ ID NO:29 do 49 i SEQ ID NO:82, a VL sekvenca humanizovane varijante antitela 1613F12 je izabrana iz sekvenci koje su tamo opisane kao SEQ ID NO:17 do 28 i SEQ ID: 81. Jedno specifično antitelo sadrži VH i VL sekvence koje su tamo opisane kao SEQ ID NO:29 i 17, tim redom. VH CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence mišjeg, himernog i humanizovanog 1613F12 su SEQ ID NO:4, 5 i 6, tim redom, a VL CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence mišjeg i humanizovanog 1613F12 su tamo opisane kao SEQ ID NO:1, 2, i 3, tim redom. Antitelo može biti antitelo opisano u WO2011159980 (Hoffman-La Roche), posebno u paragrafima od [0127] do [0229] (str.28-52). Na primer, antitelo može sadržavati VH i VL hipervarijabilne regione (HVR), ili VH i VL regione antitela YW327.6S2, koje su opisane u navedenoj prijavi kao SEQ ID NOS: 7, 8 i 9 (VH HVR1, 2 i 3, tim redom), SEQ ID NOS: 10, 11 i 12 (VL HVR1, 2 i 3, tim redom) i SEQ ID NOS: 103 i 104 (VH i VL sekvence, tim redom).
[0194] Antitelo može posredovati u umrežavanju ili grupisanju AXL molekula posredovanom antitelom (npr. zbog Fc-regiona antitela vezanog za AXL, a koji se vezuje za ćelije koje eksprimiraju FcR) na površini ćelije, što može dovesti do apoptoze ćelije.
[0195] Antitelo može indukovati ćelijski odgovor zavisan od Fc, kao što je ADCC ili ADCP u odnosu na ćeliju koja eksprimira AXL, nakon vezivanja antitela specifičnog za AXL za plazma membranu ćelije koja eksprimira AXL, u prisustvu efektorskih ćelija. Deo antitela je obično pune dužine i izotipa koji vodi ka ADCC ili ADCP odgovoru, kao što je to npr. IgG1,κ izotip.
[0196] Antitelo može indukovati CDC odgovor u odnosu ćelije koja eksprimiraju AXL, nakon vezivanja antitela specifičnog za AXL za plazma membranu ćelije koja eksprimira AXL, u prisustvu proteina sistema komplemenata, kao što su proteini sistema komplemenata koji su prisutni u normalnom humanom serumu, koji mogu biti aktivirani. Antitelo je obično pune dužine i izotipa koji je sposoban da indukuje aktivaciju sistema komplemenata, kao što je npr. IgG1,κ izotip.
[0197] Antitelo i/ili ADC može dalјe karakterisati internalizacija nakon vezivanja za AXL. Prema tome, antitelo i/ili ADC se mogu internalizovati i preneti do lizozoma radi specifičnog (tj. sa linkerom podložnim cepanju) ili nespecifičnog (sa linker koji nije podložan cepanju) proteolitičkog cepanja kompleksa anti-AXL antitelo-linker-lek.
[0198] Antitelo može interferirati sa regulacijom urođenog ili adaptivnog imunog odgovora posredovanom sa AXL, kao što je vezivanje antitela za makrofage, dendritične ćelije ili NK ćelije koji eksprimiraju AXL.
[0199] Terapijska struktura ADC može biti povezana sa ostatkom antitela preko linkera koji omogućava oslobađanje leka jednom kada se ADC internalizuje, npr. promenom pH ili u redukujućim uslovima. Pogodna tehnologija uvođenja linkera je poznata u oblasti tehnike, kao što je ovde opisano.
[0200] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži teški lanac izotipa izabranog iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U dodatnom primeru izvođenja, antitelo sadrži teški lanac izotipa izabranog iz grupe koja se sastoji od humanog IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4.
[0201] Termin "izotip", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na imunoglobulinsku klasu (na primer IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ili IgM) ili bilo koji alotip iste, kao što su IgG1m(za) i IgG1m(f)) koji su kodirani genima konstantnog regiona teškog lanca. Dodatno, svaki izotip teškog lanca se može kombinovati sa kapa (κ) ili lambda (λ) lakim lancem.
[0202] U jednom primeru izvođenja, izotip je IgG1, kao što je humani IgG1, opciono alotipa IgG1m(f).
[0203] U jednom primeru izvođenja, antitelo je monoklonsko antitelo pune dužine, opciono humano monoklonsko IgG1,κ antitelo pune dužine.
[0204] Termin "antitelo pune dužine", kada se ovde koristi, odnosi se na antitelo (npr. matično ili varijantu antitela) koje sadrži sve konstantne i varijabilne domene teških i lakih lanaca koji odgovaraju onima koja se normalno nalaze u antitelu tog izotipa divlјeg tipa. Antitelo pune dužine u skladu sa predmetnim pronalaskom može biti proizvedeno postupkom koji obuhvata korake (i) kloniranja CDR sekvenci u pogodan vektor koji sadrži kompletne sekvence teškog lanca i kompletnu sekvencu lakog lanca, i (ii) ekspresiju kompletnih sekvenci teških i lakih lanaca u odgovarajućim ekspresionim sistemima. Stručnjaku je poznat način proizvodnje antitela pune dužine kada se polazi bilo od CDR sekvenci ili potpunih sekvenci varijabilnih regiona. Stoga, stručnjaku će biti poznato kako da proizvede antitelo pune dužine prema predmetnom pronalasku.
[0205] Antitelo može biti humano antitelo.
[0206] Predviđeno je da termin "humano antitelo", kako se ovde upotrebljava, obuhvata antitela koja sadrže varijabilne i uokvirujuće regione izvedene iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci i humanog imunoglobilinskog konstatnog domena. Humana antitela opisa mogu sadržavati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani humanim germinativnim imunoglobulinskim sekvencama (npr. uvedeni su mutacijama, insercijama ili delecijama, nasumičnom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo). Ipak, nije predviđeno da termin "humano antitelo", kako se ovde upotrebljava, obuhvata antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativnih sekvenci druge vrste, različite od čoveka, poput miša, i ugrađene u humane uokvirujuće sekvence.
[0207] Kao što se ovde upotrebljava, humano antitelo je „izvedeno iz“ određene germinativne sekvence ukoliko je antitelo dobijeno iz sistema u kome se upotrebljavaju humane imunoglobulinske sekvence, na primer, imunizacijom transgenog miša koji nosi humane imunoglobulinske gene ili skriningom biblioteke humanih imunoglobulinskih gena, a pri čemu je izabrano humano antitelo najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, na primer najmanje 96%, kao što je najmanje 97%, na primer najmanje 98% ili kao što je najmanje 99% identično u aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom koja je kodirana germinativnim imunoglobulinskim genom. Uobičajeno je da osim CDR3 teškog lanca, humano antitelo izvedeno iz određene humane germinativne sekvence ne karakteriše više od 20 aminokiselinskih razlika, npr. ne više od 10 aminokiselinskih razlika, kao što je ne više od 9, 8, 7, 6 ili 5, na primer ne više od 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinske razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu kodiranu germinativnim imunoglobulinskim genom.
[0208] Antitelo prema predmetnom pronalasku može sadržavati aminokiselinske modifikacije u imunoglobulinskom teškom i/ili lakom lancu. Preciznije, aminokiseline u Fc regionu antitela mogu biti modifikovane.
[0209] Termin "Fc region", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na region koji sadrži, u smeru od N-ka C-kraju antitela, najmanje zglobni region, CH2 region i CH3 region. Fc region antitela može posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uklјučujući razne ćelije imunog sistema (kao što su efektorske ćelije) i komponente sistema komplemenata.
[0210] Termin "zglobni region”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na zglobni region imunoglobulinskog teškog lanca. Tako, na primer, zglobni region humanog IgG1 antitela odgovara aminokiselinama 216-230 prema Eu numeraciji koja je navedena u publikaciji Kabata i saradnika (1991). Ipak, zglobni region može biti i bilo kog drugog podtipa, kao što je ovde opisano.
[0211] Termin "CH1 region" ili "CH1 domen”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na CH1 region imunoglobulinskog teškog lanca. Tako, na primer, CH1 region humanog IgG1 antitela odgovara
4
aminokiselinama 118-215 prema Eu numeraciji koja je navedena u publikaciji Kabata i saradnika (1991). Ipak, CH1 region može biti i bilo kog drugog podtipa, kao što je ovde opisano.
[0212] Termin "CH2 region" ili "CH2 domen”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na CH2 region imunoglobulinskog teškog lanca. Tako, na primer, CH2 region humanog IgG1 antitela odgovara aminokiselinama 231-340 prema Eu numeraciji koja je navedena u publikaciji Kabata i saradnika (1991). Ipak, CH2 region može biti i bilo kog drugog podtipa, kao što je ovde opisano.
[0213] Termin "CH3 region" ili "CH3 domen”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na CH3 region imunoglobulinskog teškog lanca. Tako, na primer, CH3 region humanog IgG1 antitela odgovara aminokiselinama 341-447 prema Eu numeraciji koja je navedena u publikaciji Kabata i saradnika (1991). Ipak, CH3 region može biti i bilo kog drugog podtipa, kao što je ovde opisano.
[0214] U drugom primeru izvođenja, antitelo je antitelo sa deficijencijom u efektorskoj funkciji, stabilizovano IgG4 antitelo ili monovalentno antitelo.
[0215] U posebnom primeru izvođenja, teški lanac može biti modifikovan tako da je delecijom uklonjen ceo zglobni region.
[0216] Sekvenca antitela može biti modifikovana tako da ne sadrži bilo kakvo akceptorsko mesto za N-vezanu glikozilaciju.
[0217] Antitelo može biti jednolančano antitelo.
[0218] Predmetni opis se dalјe odnosi na multispecifično antitelo koje sadrži najmanje prvi region za vezivanje antitela prema bilo kom aspektu ili primeru izvođenja koji je ovde opisan, kao i drugi region za vezivanje koji vezuje različit ciljni molekul ili epitop u odnosu na prvi region za vezivanje. Termin "multispecifično antitelo", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na antitela u kojima se vezujući region vezuje za najmanje dva, kao što je najmanje tri, različita antigena ili najmanje dva, kao što su najmanje tri, različita epitopa na istom antigenu.
[0219] Predmetni opis se odnosi na upotrebu ADC koji sadrži bispecifično antitelo koje sadrži prvi region za vezivanje antitela prema bilo kom aspektu ili primeru izvođenja koji je ovde opisan, kao i drugi region za vezivanje koji vezuje različit ciljni molekul ili epitop u odnosu na prvi vezujući region.
[0220] Termin "bispecifičan", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na molekule koji se vezuju, kao što su antitela, gde se region za vezivanje vezujućeg molekula vezuje za dva različita antigena ili dva različita epitopa na istom antigenu.
[0221] Termin "bispecifično antitelo" se odnosi na antitelo koje je sa specifičnošću za najmanje dva različita, obično nepreklapajuća epitopa. Takvi epitopi mogu biti na istim ili različitim ciljnim molekulima. Ukoliko su epitopi na različitim ciljnim molekulima, takvi ciljni molekuli mogu biti na istoj ćeliji ili na različitim ćelijama, ćelijskim tipovima ili strukturama, poput vanćelijskog tkiva.
[0222] Termin "različit ciljni molekul”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na protein, molekul ili slično koji je drugačiji od AXL-a ili AXL fragmenta.
[0223] Primeri molekula bispecifičnih antitela koji mogu biti upotrebljeni u predmetnom pronalasku obuhvataju (i) jedno antitelo sa dva kraka koji sadrži različite regione koji vezuju antigen, (ii) jednolančano antitelo koje je sa specifičnošću za dva različita epitopa, npr. čine ga dva scFv koji su povezani u tandem posredstvom dodatnog peptidnog linkera; (iii) antitelo sa dvostruko varijabilnim domenom (DVD-Ig™), gde svaki laki lanac i teški lanac sadrži dva varijabilna domena koji su povezani u tandem posredstvom kratke peptidne spone (Wu et al., 2010); (iv) hemijski povezan bispecifičan (Fab’)2 fragment; (v) Tandab®, koji je fuzija dva jednolančana dimerna antitela što rezultuje u tetravalentnom bispecifičnom antitelu koje ima dva mesta vezivanja za svaki od cilјnih antigena; (vi) fleksibilno antitelo, koje je kombinacija scFv i dimernog antitela, a što rezultuje multivalentnim molekulom; (vii) takozvani molekul "usidri i zaključaj" (Dock-and-Lock®), zasnovan na "dimerizacionom i usidravajućem domenu" u Protein kinazi A, koji, kada se primenjuje Fab segmentima, može dovesti do nastanka trovalentnog bispecifičnog vezujućeg proteina koji se sastoji od dva identična Fab fragmenta povezana sa različitim Fab fragmentom; (viii) molekul označen kao “Škorpija” (engl. Scorpion), koji sadrži, npr. dva scFv koji su fuzionisani na oba kraja kraka humanog Fab; i (ix) dimerno antitelo.
[0224] Bispecifično antitelo predmetnog pronalaska može biti dimerno antitelo, umreženo antitelo, kao što je tzv. CrossMab, ili bispecifično antitelo dobijeno kontrolisanom izmenom Fab kraka (kao što je opisano u WO 2011/131746, Genmab A/S).
[0225] Primeri različitih klasa bispecifičnih antitela uklјučuju, ali nisu ograničeni na, (i) molekule slične IgG sa komplementarnim CH3 domenima da bi se prislilo odvijanje heterodimerizacije; (ii) rekombinantne dvostruko ciljajuće molekule slične IgG, gde svaka od dve strane molekula sadrži Fab fragment ili deo Fab fragmenta iz najmanje dva različita antitela; (iii) IgG fuzione molekule, gde su IgG antitela pune dužine fuzionisana sa dodatnim Fab fragmentom ili delovima Fab fragmenta; (iv) Fc fuzione molekule, gde su jednolančani Fv molekuli ili stabilizovana dimerna antitela fuzionisani sa konstantnim domenima teških lanaca, Fc-regionima ili njihovim delovima; (v) Fab fuzione molekule, gde su različiti Fab-fragmenti fuzionisani zajedno i fuzionisani sa konstantnim domenima teških lanaca, Fc-regionima ili njihovim delovima; i (vi) antitela zasnovana na SCFv- i dimernim antitelima i antitelima teškog lanca (npr. domenskim antitelima, nano antitelima - Nanobodies®), gde su različiti jednolančani Fv molekuli ili različita dimerna antitela ili različita antitela teškog lanca (npr. domenska antitela, Nanobodies®) fusionisana jedna sa drugima ili sa drugim proteinom ili molekulom nosača koji je fuzionisan sa konstantnim domenima teških lanaca, Fc-regionima ili njihovim delovima.
[0226] Primeri molekula sličnih IgG sa molekulima komplementarnim CH3 domenima obuhvataju, ali nisu ograničeni na, Triomab® (Trion Pharma/Fresenius Biotech, WO/2002/020039), Knobs-into-Holes (Genentech, WO9850431), CrossMabs (Roche, WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253) i elektrostatičke podudarne Fc heterodimerne molekule (Amgen, EP1870459 and WO2009089004; Chugai, US201000155133; Oncomed, WO2010129304), LUZ-Y (Genentech), DIG-antitelo i PIG-antitelo (Pharmabcine), antitelo konstruisanih domena dobijeno izmenom lanaca (SEEDbody od engl. Strand Exchange Engineered Domain body) (EMD Serono, WO2007110205), bispecifičan IgG1 i IgG2 (Pfizer/Rinat, WO11143545), Azymetric mrežu (Zymeworks/Merck, WO2012058768), mAb-Fv (Xencor, WO2011028952), XmAb (Xencor), bivalentna bispecifična antitela (Roche, WO2009/080254), bispecifičan IgG (Eli Lilly), DuoBody® molekule (Genmab A/S, WO 2011/131746), DuetMab (Medimmune, US2014/0348839), Biclonics (Merus, WO 2013/157953), NovImmune (κλ-antiela, WO 2012/023053), FcΔAdp (Regeneron, WO 2010/151792), (DT)-Ig (GSK/Domantis), antitela “dva u jedan” ili Fabs sa dualnom aktivnošću (Genentech, Adimab), mAb2 (F-Star, WO2008003116), Zybodies™ (Zyngenia), CovX-antitelo (CovX/Pfizer), Fynom antitela
4
(Covagen/Janssen Cilag), DutaMab (Dutalys/Roche), iMab (MedImmune), DVD-IgTM (dualnih varijabilnih domena, Abbott, US 7,612,18), antitela sa dvostrukim vrhom i dualnim domenima (Unilever; Sanofi Aventis, WO20100226923), Ts2Ab (MedImmune/AZ), BsAb (Zymogenetics), HERCULES (Biogen Idec, US007951918), fuzije scFv (Genentech/Roche, Novartis, Immunomedics, Changzhou Adam Biotech Inc, CN 102250246), TvAb (Roche, WO2012025525, WO2012025530), ScFv/Fc fuzije, SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS), Interceptor (Emergent), antitela dobijena tehnologijom dualnog afiniteta i preusmeravanja specifičnosti (Fc-DARTTM) (MacroGenics, WO2008/157379, WO2010/080538), BEAT (Glenmark), dimere dimernih antitela (Imclone/Eli Lilly) i hemijski fuzionisana mAt (Karmanos Cancer Center), kao i kovalentno fuzionisana mAt (AIMM therapeutics).
[0227] Primeri rekombinantnih dualno ciljajućih molekula sličnih IgG obuhvataju, ali nisu ograničeni na, dvostruko cilјajući (DT)-Ig (GSK/Domantis), antitelo “dva-u-jedan” (Genentech), umrežene Mabs (Karmanos Cancer Centar), mAb2 (F-Star, WO2008003116), Zybodies™ (Zyngenia), pristupe sa uobičajenim lakim lancima (Crucell/Merus, US 7,262,028), κλ antitela (NovImmune) i CovX-antitelo (CovX/Pfizer).
[0228] Primeri IgG fuzionih molekula obuhvataju, ali nisu ograničeni na, dvostruko varijabilni domen (DVD)-Ig™ (Abbott, US 7,612,181), antitela sa dvostrukom domenom i dvostrukim vrhom (Unilever; Sanofi Aventis, WO20100226923), bispecifične molekule slične IgG (ImClone)/Eli Lilly), Ts2Ab (MedImmune/AZ) i BsAb (Zymogenetics), HERCULES (Biogen Idec, US 7,951,918), scFv fuziju (Novartis), scFv fuziju (Changzhou Adam Biotech Inc, CN 102250246) i TvAb (Roche, WO2012025525,WO2012025530).
[0229] Primeri Fc fuzionih molekula obuhvataju, ali nisu ograničeni na, ScFv/Fc fuzione molekule (Academic Insitution), SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS), molekule dobijene tehnologijom dualnog afiniteta i preusmeravanja specifičnosti (Fc-DART™) (MacroGenics, WO2008157379 i WO2010080538) i dualni (ScFv)2-Fab (National Research Center for Antibody Medicine - Kina).
[0230] Primeri Fab fuzionih bispecifičnih antitela obuhvataju, ali nisu ograničeni na, F(ab)2 (Medarex/AMGEN), dualno delujuća antitela ili Bis-Fab (Genentech), Dock-and-Lock® (DNL) (ImmunoMedics), bivalentna bispecifična antitela (Biotecnol) i Fab-Fv (UCB-Celltech).
[0231] Primeri antitela zasnovanih na ScFv-, dimernim antitelima i domenskim antitelima obuhvataju, ali nisu ograničeni na, bispecifičan angažer T ćelija (BiTE®) (Micromet, Tandem Diabody (Tandab™) (Affimed), antitela dobijena tehnologijom za dualni afinitet i preusmeravanje specifičnosti (DART) (MacroGenics), jednolančano dimerno antitelo (Academic), antitela nalik TCR (AIT, ReceptorLogics), fuzioni molekul ScFv i humanog serumskog albumina (Merrimack) i COMBODY (Epigen Biotech), dvostruko ciljajuća nanoantitela® (Ablynx), antitela sa samo dualno ciljajućim domenima teških lanaca.
[0232] Bispecifično antitelo za upotrebu u vidu ADC prema predmetnom pronalasku može biti generisano uvođenjem modifikacija u konstantan region antitela.
[0233] Bispecifično antitelo može sadržavati prvi i drugi teški lanac, a svaki prvi i drugi teški lanac može sadržavati najmanje zglobni region, CH2 i CH3 region, pri čemu je u prvom teškom lancu supstituisana najmanje jedna od aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama izabranim iz grupe koja se
4
sastoji od K409, T366, L368, K370, D399, F405 i Y407 u teškom lancu humanog IgG1, dok je u drugom teškom lancu supstituisana najmanje jedna od aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama izabranim iz grupe koja se sastoji od F405, T366, L368, K370, D399, Y407 i K409 u teškom lancu humanog IgG1, a pri čemu prvi i drugi teški lanci nisu supstituisani na istim pozicijama.
[0234] Antitelo može biti ono u kome, u prvom teškom lancu, aminokiselina na poziciji koji odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 nije K, L ili M, a opciono aminokiselina na poziciji koji odgovara F405 u teškom lјudskom IgG1 lanac je F, dok u drugom teškom lancu, aminokiselina na poziciji koji odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 nije F i aminokiselina na poziciji koji odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je K.
[0235] Antitelo može biti ono u kome, u prvom teškom lancu, aminokiselina na poziciji koji odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 nije F, R i G, dok su u drugom teškom lancu supstituisane aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama izabranim iz grupe koja se sastoji od; T366, L368, K370, D399, Y407 i K409 u teškom lancu humanog IgG1.
[0236] Antitelo može biti ono u kome aminokiselina na poziciju koji odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 drugačija od K, L ili M u prvom teškom lancu, dok u drugom teškom lancu aminokiselina na poziciju koji odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1nije F i opciono aminokiselina na poziciji koji odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je K.
[0237] Antitelo može biti ono u kome, u navedenom prvom teškom lancu, aminokiselina na poziciji koji odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, dok aminokiselina na poziciji koji odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u navedenom drugom teškom lancu, ili obrnuto.
[0238] Prema tome, aminokiselina na poziciji koji odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 može biti R u prvom teškom lancu, dok aminokiselina na poziciji koji odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 može biti L u drugom teškom lancu.
[0239] Ukoliko nije drugačije navedeno ili je protivrečno kontekstu, aminokiseline sekvenci konstatnih regiona su ovde numerisane u skladu sa Eu-indeksom numeracije (opisanom u Kabat, 1991). Termini "Eu-indeks numeracije" i "Eu numeracija navedena u publikaciji Kabata" mogu biti upotrebljavani naizmenično i imaju isto značenje i svrhu. Stoga, aminokiselina ili segment u jednoj sekvenci koji "odgovara" aminokiselini ili segmentu u drugoj sekvenci predstavlja onu koja, kada su su sekvence poravnate upotrebom standardnog programa za poravnanje sekvenci poput ALIGN, ClustalW ili sličnog, odgovara drugoj aminokiselini ili segment, obično pri zadatim podešavanjima, pri čemu isto karakteriše identičnost od najmanje 50%, najmanje 80%, najmanje 90% ili najmanje 95% sa humanim IgG1 teškim lancem. U oblasti tehnike je dobro poznato kako poravnavati sekvence ili segmente sekvence i time odrediti odgovarajuće pozicije u sekvenci u odnosu na aminokiselinske pozicije prema predmetnom pronalasku.
[0240] Termin "aminokiselina koja odgovara pozicijama", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na broj pozicije aminokiseline u teškom lancu humanog IgG1.
[0241] Termini "aminokiselina" i "aminokiselinski ostatak" se ovde mogu koristiti naizmenično i ne treba ih smatrati kao ograničavajućima.
4
[0242] U kontekstu predmetnog pronalaska, aminokiselina može biti definisana kao konzervativna ili nekonzervativna aminokiselina, a shodno tome može biti i klasifikovana. Aminokiselinski ostaci mogu takođe biti podeljeni u klase definisane alternativnim fizičkim i funkcionalnim osobinama. Stoga se klase aminokiselina mogu definisati kao što je navedeno u okviru jedne ili obe od tabela koje slede:
Aminokiselinski ostaci konzervativne klase
Kiseli ostaci D i E
Bazni ostaci K, R i H
Hidrofilni nenaelektrisani ostaci S, T, N i Q
Alifatični nenaelektrisani ostaci G, A, V, L i I
Nepolarni nenaelektrisani ostaci C, M i P
Aromatični ostaci F, Y i W
Alternativne fizičke i funkcionalne klasifikacije aminokiselinskih ostataka
Ostaci koji sadrže alkoholne grupe S i T
Alifatični ostaci I, L, V i M
Ostaci asocirani sa cikloalkenilima F, H, W i Y
Hidrofobni ostaci A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W i Y Negativno naelektrisani ostaci D i E
Polarni ostaci C, D, E, H, K, N, Q, R, S i T
Pozitivno naelektrisani ostaci H, K i R
Mali ostaci A, C, D, G, N, P, S, T i V
Veoma mali ostaci A, G i S
Ostaci uklјučeni u obrazovanje petlje A, C, D, E, G, H, K, N, Q, R, S, P i T Fleksibilni ostaci Q, T, K, S, G, P, D, E i R
[0243] U kontekstu predmetnog pronalaska, supstitucija u antitelu se označava sa: Originalna aminokiselina – pozicija – supstituisana aminokiselina;
Prema dobro poznatoj nomenklaturi aminokiselina, upotrebljava se kod od tri slova ili kod u vidu jednog slova, uključujući kodove "Xaa" ili "X", da bi se označio bilo koji aminokiselinski ostatak. Tako, Xaa ili X obično mogu predstavlјati bilo koju od 20 aminokiselina koje se javlјaju u prirodi. Termin "koja se javlja u prirodi”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na bilo koji od sledećih aminokiselinskih ostataka; glicina, alanina, valina, leucina, izoleucina, serina, treonina, lizina, arginina, histidina, asparaginske kiseline, asparagina, glutaminske kiseline, glutamina, prolina, triptofana, fenilalanina, tirozina, metionina i cisteina. Tako, obeležavanje "K409R" ili "Lys409Arg" označava da antitelo sadrži supstituciju lizina sa argininom na aminokiselinskoj poziciji 409.
[0244] Supstitucija aminokiseline na datoj poziciji sa bilo kojom drugom aminokiselinom se označava kao: Originalna aminokiselina – pozicija; ili npr. "K409"
4
Za modifikacije u kojima originalna(e) aminokiselina(e) i/ili supstituisana(e) aminokiselina(e) mogu sadržavati više od jedne, ali ne i sve aminokiseline, više od jedne aminokiseline može biti razdvojeno sa "," ili "/". Npr. supstitucija lizina argininom, alaninom ili fenilalaninom na poziciji 409 je:
"Lys409Arg,Ala,Phe" ili "Lys409Arg/Ala/Phe" ili "K409R,A,F" ili "K409R/A/F" ili "K409 u R, A ili F".
[0245] Ovakvo obeležavanje se, u kontekstu predmetnog pronalaska, može koristiti naizmenično, ali ima isto značenje i svrhu.
[0246] Štaviše, termin "supstitucija" obuhvata supstituciju u bilo koju ili u druge od devetnaest prirodnih aminokiselina, ili u druge aminokiseline, kao što su aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi. Na primer, supstitucija aminokiseline K na poziciji 409 obuhvata svaku od sledećih supstitucija: 409A, 409C, 409D, 409E, 409F, 409G, 409H, 4091, 409L, 409M, 409N, 409Q, 409R, 409S, 409T, 409V, 409W, 409P i 409Y. Navedeno je, imeđu ostalog, ekvivalentno oznaci 409X, gde X označava bilo koju aminokiselinu drugačiju od originalne aminokiseline. Ovakve supstitucije se takođe mogu označiti sa K409A, K409C itd. ili K409A,C, itd. ili sa K409A/C/ itd. Isto se analogno može primeniti na sve i svaku poziciju koja je ovde pomenuta, da bi se specifično uključile bilo koje od ovakvih supstitucija.
[0247] Antitelo prema opisu može takođe sadržavati deleciju aminokiselinskog ostatka. Takva delecija može biti označena sa "del" i obuhvata, npr. ono što se može napisati kao K409del. Tako, u takvim primerima izvođenja, lizin na poziciji 409 je delecijom uklonjen iz aminokiselinske sekvence.
[0248] I prvi i drugi region za vezivanje bispecifičnog antitela mogu vezivati AXL. Međutim, prvi region za vezivanje sadrži drugačiji set CDR sekvenci od drugog vezujućeg regiona. Tako, bispecifično antitelo može sadržavati prvi i drugi region za vezivanje, kao i prvi i drugi teški lanac, pri čemu svaki prvi i drugi region za vezivanje sadrži VH i VL region izabran iz grupe koju čine;
a) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 36, 37 i 38, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom [107]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 46, 47 i 48, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 49, AAS i 50, tim redom [148];
b) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 36, 37 i 38, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom [107]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 114, 115 i 116, tim redom, i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 117, DAS i 118, tim redom [733];
c) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 36, 37 i 38, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom [107]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 41, 42 i 43, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 44, AAS i 45, tim redom [140];
d) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 36, 37 i 38, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom [107]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 51, 52 i 55,
4
tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 55, GAS i 56, tim redom. [154];
e) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 36, 37 i 38, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom [107]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 51, 52 i 54, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 55, GAS i 56, tim redom. [154-M103L];
f) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 36, 37 i 38, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom [107]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 57, 58 i 59, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 60, GAS i 61, tim redom [171];
g) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 36, 37 i 38, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom [107]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 62, 63 i 64, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 65, GAS i 66, tim redom [172];
h) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 36, 37 i 38, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom [107]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 67, 68 i 69, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 70, GAS i 71, tim redom [181];
i) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 36, 37 i 38, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom [107]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 72, 73 i 75, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 76, ATS i 77, tim redom [183];
j) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 36, 37 i 38, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom [107]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 72, 74, i 75, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 76, ATS i 77, tim redom [183-N52Q];
k) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 36, 37 i 38, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom [107]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 78, 79 i 80, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 81, AAS i 82, tim redom [187];
I) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 36, 37 i 38, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom [107]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 83, 84 i 85, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 86, GAS i 87, tim redom [608-01];
m) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 36, 37 i 38, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom [107]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 88, 89 i 90, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 91, GAS i 92, tim redom [610-01];
n) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 36, 37 i 38, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom [107]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 94, 95 i 95, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 96, GAS i 97, tim redom [613];
o) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 36, 37 i 38, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom [107]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 98, 99 i 100, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 101, DAS i 102, tim redom [613-08];
p) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 36, 37 i 38, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom [107]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 103, 104, i 105, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 106, GAS i 107, tim redom [620-06];
q) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 36, 37 i 38, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom [107]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 108, 109 i 110, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 112, AAS i 113, tim redom [726];
r) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 36, 37 i 38, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom [107]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 108, 109 i 111, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 112, AAS i 113, tim redom [726-M101L];
s) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 46, 47 i 48, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 49, AAS i 50, tim redom [148]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 114, 115 i 116, tim redom, i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 117, DAS i 118, tim redom [733];
t) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 46, 47 i 48, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 49, AAS i 50, tim redom [148]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 41, 42 i 43,
1
tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 44, AAS i 45, tim redom [107];
u) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 46, 47 i 48, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 49, AAS i 50, tim redom [148]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 51, 52 i 55, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 55, GAS i 56, tim redom. [154];
v) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 46, 47 i 48, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 49, AAS i 50, tim redom [148]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 51, 52 i 54, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 55, GAS i 56, tim redom. [154-M103L];
w) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 46, 47 i 48, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 49, AAS i 50, tim redom [148]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 57, 58 i 59, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 60, GAS i 61, tim redom [171];
x) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 46, 47 i 48, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 49, AAS i 50, tim redom [148]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 62, 63 i 64, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 65, GAS i 66, tim redom [172];
y) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 46, 47 i 48, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 49, AAS i 50, tim redom [148]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 67, 68 i 69, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 70, GAS i 71, tim redom [181];
z) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 46, 47 i 48, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 49, AAS i 50, tim redom [148]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 72, 73 i 75, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 76, ATS i 77, tim redom [183];
aa) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 46, 47 i 48, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 49, AAS i 50, tim redom [148]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 72, 74, i 75, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 76, ATS i 77, tim redom [183-N52Q];
bb) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 46, 47 i 48, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 49, AAS i 50, tim redom [148]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 78, 79 i 80,
2
tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 81, AAS i 82, tim redom [187];
cc) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 46, 47 i 48, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 49, AAS i 50, tim redom [148]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 83, 84 i 85, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 86, GAS i 87, tim redom [608-01];
dd) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 46, 47 i 48, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 49, AAS i 50, tim redom [148]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 88, 89 i 90, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 91, GAS i 92, tim redom [610-01];
ee) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 46, 47 i 48, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 49, AAS i 50, tim redom [148]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 94, 95 i 95, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 96, GAS i 97, tim redom [613];
ff) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 46, 47 i 48, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 49, AAS i 50, tim redom [148]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 98, 99 i 100, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 101, DAS i 102, tim redom [613-08];
gg) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 46, 47 i 48, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 49, AAS i 50, tim redom [148]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 103, 104, i 105, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 106, GAS i 107, tim redom [620-06];
hh) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 46, 47 i 48, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 49, AAS i 50, tim redom [148]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 108, 109 i 110, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 112, AAS i 113, tim redom [726];
ii) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 46, 47 i 48, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 49, AAS i 50, tim redom [148]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 108, 109 i 111, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 112, AAS i 113, tim redom [726-M101L];
jj) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 114, 115 i 116, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 117, DAS i 118, tim redom [733]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 41, 42 i 43, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 44, AAS i 45, tim redom [140];
kk) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 114, 115 i 116, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 117, DAS i 118, tim redom [733]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 51, 52 i 55, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 55, GAS i 56, tim redom. [154];
II) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 114, 115 i 116, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 117, DAS i 118, tim redom [733]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 51, 52 i 54, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 55, GAS i 56, tim redom. [154-M103L];
mm) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 114, 115 i 116, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 117, DAS i 118, tim redom [733]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 57, 58 i 59, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 60, GAS i 61, tim redom [171];
nn) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 114, 115 i 116, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 117, DAS i 118, tim redom [733]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 62, 63 i 64, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 65, GAS i 66, tim redom [172];
oo) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 114, 115 i 116, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 117, DAS i 118, tim redom [733]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 67, 68 i 69, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 70, GAS i 71, tim redom [181];
pp) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 114, 115 i 116, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 117, DAS i 118, tim redom [733]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 72, 73 i 75, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 76, ATS i 77, tim redom [183];
qq) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 114, 115 i 116, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 117, DAS i 118, tim redom [733]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 72, 74, i 75, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 76, ATS i 77, tim redom [183-N52Q];
rr) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 114, 115 i 116, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 117, DAS i 118, tim redom [733]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.:
4
78, 79 i 80, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 81, AAS i 82, tim redom [187];
ss) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 114, 115 i 116, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 117, DAS i 118, tim redom [733]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 83, 84 i 85, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 86, GAS i 87, tim redom [608-01];
tt) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 114, 115 i 116, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 117, DAS i 118, tim redom [733]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 88, 89 i 90, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 91, GAS i 92, tim redom [610-01];
uu) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 114, 115 i 116, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 117, DAS i 118, tim redom [733]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 94, 95 i 95, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 96, GAS i 97, tim redom [613];
vv) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 114, 115 i 116, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 117, DAS i 118, tim redom [733]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 98, 99 i 100, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 101, DAS i 102, tim redom [613-08];
ww) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 114, 115 i 116, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 117, DAS i 118, tim redom [733]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 103, 104, i 105, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 106, GAS i 107, tim redom [620-06];
xx) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 114, 115 i 116, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 117, DAS i 118, tim redom [733]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 108, 109 i 110, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 112, AAS i 113, tim redom [726]; i
yy) prvi VH region koji sadrži CDRl, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 114, 115 i 116, tim redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 117, DAS i 118, tim redom [733]; kao i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 108, 109 i 111, tim redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 112, AAS i 113, tim redom [726-M101L];
[0249] Antitela konjugovana sa citotoksičnim agensom, lekom ili sličnim su poznata i kao konjugati antitela i leka (ADC). ADC može biti sa poluživotom dovolјnog perioda vremena da se konjugat antitela i leka internalizuje, razgradi i da indukuje ubijanje ćelija oslobođenim toksinom.
[0250] Prema tome, ADC može sadržavati anti-AXL antitelo ili bispecifično antitelo i terapijsku strukturu, kao što je citotoksičan agens, hemoterapijski lek ili slično. Citotoksičan agens, hemoterapijski lek ili slično mogu biti konjugovani sa antitelom ili bispecifičnim antitelom preko linkera.
[0251] ADC su često dizajnirani tako da je koristan citotoksičan teret neaktivan kada se konjuguje sa antitelom. Koristan citotoksični teret može biti oslobođen unutar ćelije po internalizaciji ADC-a, nakon vezivanja za plazma membranu ćelija, ili, alternativno, kao odgovor na proteolitičku aktivnost u mikrosredini tumora. Termini "internalizovan" ili "internalizacija", kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na biološki proces u kome se molekuli, kao što je AXL-ADC, okružuju ćelijskom membranom i uvlače u unutrašnjost ćelije. Navedeno se može označiti i kao "endocitoza".
[0252] Shodno navedenom, u pojedinim slučajevima, može biti poželјno da se upotrebljavaju antitela koja podležu internalizaciji. Takva antitela, koja karakterišu dobra svojstva internalizacije, mogu biti pogodna za konjugaciju sa citotoksičnim agensom, lekom ili sličnim, opciono preko linkera koji je dizajniran tako da podleže cepanju unutar ćelije.
[0253] Jednom internalizovani, ADC se u većini slučajeva mogu isporučiti lizozomima, gde efektivno oslobađanje leka koristi prednost kataboličkog okruženja koje se nalazi u ovim organelama. Uobičajeno je da je linker onaj koji povezuje antitelo sa citotoksičnim agensom. Tako, dizajnirani su specijalizovani linkeri koji su podložni cepanju samo u specifičnoj mikrosredini koja se nalazi u ili na cilјnoj tumorskoj ćeliji ili u mikrosredini tumora. Primeri obuhvataju linkere koje se cepaju u kiselim uslovima, redukujućim uslovima ili sa specifičnim proteazama.
[0254] Stabilnost kompleksa antitelo-linker-lek u cirkulaciji je važna, pošto omogućava isporuku leka posredovanu antitelom do specifičnih cilјnih ćelija. Dodatno, dug poluživot ADC-a u cirkulaciji obezbeđuje izlaganje istom nakon injeciranja tokom od nekoliko dana do nekoliko nedelјa. Lekovi koji su konjugovani preko linkera koji nisu podložni cepanju i linkera koji su podložni cepanju sa proteazama, uglavnom su stabilniji u cirkulaciji od disulfidnih i hidrazonskih linkera, iako se stabilnost drugonavedenih linkera može podesiti izmenom susedne hemijske strukture (Alley et al., 2010).
[0255] Terapijska struktura može biti citotoksični agens. Citotoksin ili citotoksičan agens obuhvata bilo koji agens koji je štetan za ćelije (npr. ubija ih). Pogodni citotoksični agensi za obrazovanje ADC za upotrebu u predmetnom pronalasku obuhvataju taksol, tubulizine, duostatine, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihiroksi antracin dion, majtanzin ili njegov analog ili derivat, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin; kaliheamicin ili njegove analoge i derivate; antimetabolite (poput metotreksata, 6-merkaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracila, dekarbazina, hidroksiuree, asparaginaze, gemcitabina, kladribina), alkilujuće agense (kao što su mehloretamin, tioepa, hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU), lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, dakarbazin (DTIC), prokarbazin, mitomicin C, cisplatin i drugi derivati platine, kao što je karboplatin; kao i duokarmicin A, duokarmicin SA, CC-1065 (poznat kao rahelmicin) ili analoge ili derivate CC-1065), dolastatin, auristatin, pirolo[2,1-c][1,4] benzodiazepine (PDB), indolinobenzodiazepin (IGN) ili njegove analoge, antibiotike (kao što su daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, daunorubicin (ranije daunomicin), doksorubicin, idarubicin, mitramicin, mitomicin, mitoksantron, plikamicin, antramicin (AMC)), antimitotske agense (npr. agense koji ciljano deluju na tubulin), kao što su difterijski toksin i srodni molekuli (poput difterija A lanca i njegovih aktivnih fragmenata i hibridnih molekula); ricinski toksin (kao što je ricin A ili deglikozilovan A lanac ricinskog toksina), toksin kolere, toksin sličan Šiga toksinu (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), LT toksin, C3 toksin, Šiga toksin, toksin pertusisa, toksin tetanusa, Bovman-Birkov proteazni inhibitor soje, egzotoksin Pseudomonas-a, alorin, saporin, modecin, gelanin, A lanac abrina, A lanac modecina, alfa-sarcin, proteini Aleurites fordii, diantinski proteini, proteini Phytolacca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor momordica charantia, kurcin, krotin, inhibitor sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin i enomicinski toksini. Ostali pogodni konjugovani molekuli obuhvataju antimikrobne/litičke peptide kao što su CLIP, Magainin 2, melitin, Cekropin i P18; ribonukleaze (RNaze), DNazu I, stafilokokni enterotoksin-A, antivirusni protein vinobojke, toksin difterije i endotoksin Pseudomonas-a. Pogledati, na primer, Pastan i saradnici, Cell 47, 641 (1986) i Goldenberg, Calif. A Cancer Journal for Clinicians 44, 43 (1994). Terapijski agensi koji mogu biti primenjeni u kombinaciji sa anti-AXL antitelima ili konjugatima antitela i lekova predmetnog pronalaska, a koji su kao što je opisano ovde u drugom delu teksta, kao što su, npr, anti-kancer citokini ili hemokini, takođe su kandidati za terapijske strukture korisne za konjugovanje sa antitelom za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom.
[0256] Termin "citotoksičan agens”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na bilo koji agens koji je štetan za ćelije (npr. ubija ih). Radi opisa ovih klasa lekova koje su dobro poznate u oblasti tehnike i njihovih mehanizama dejstva, pogledati Goodman i saradnici (1990). Dodatne tehnike koje su relevantne za dobijanje imunotoksina antitela su obezbeđene u, na primer, Vitetta i saradnici (1993) i US 5,194,594.
[0257] U jednom primeru izvođenja, citotoksični agens je povezan sa navedenim antitelom, ili sa njegovim fragmentom, preko linkera koji je podložan cepanju, kao što je N-sukcinimidil 4-(2-piridilditio)-pentanoat (SSP), maleimidokaproil-valin-citrulin-p-aminobenziloksikarbonil (mc-vc-PAB) ili AV-1 K-lock valin-citrulin.
[0258] Termin "linker podložan cepanju", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na podskup linkera koji podležu katalitičkoj obradi od strane specifičnih proteaza u cilјnoj ćeliji ili u mikrosredini tumora, što rezultuje oslobađanjem citotoksičnog agensa. Primeri linkera podložnih cepanju su linkeri zasnovani na hemijskim motivima koji uključuju disulfide, hidrazone ili peptide. Druga podgrupa linkera podložnih cepanju predstavlja one u koje je dodat dodatni linkerski motiv između citotoksičnog agensa i primarnog linkera, tj. mesta koje vezuje kombinaciju antitela i linkera za antitelo. Motiv dodatnog linkera može biti podložan isecanju od strane agensa za cepanje koji je prisutan u unutarćelijskom okruženju (npr. unutar lizozoma ili endozoma ili kaveola). Linker može biti, npr. peptidil linker koji se cepa unutarćelijskom peptidazom ili proteaznim enzimom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, lizozomsku ili endozomalnu proteazu. U pojedinim primerima izvođenja, peptidil linker je dužine od najmanje dve aminokiseline ili je dužine od najmanje tri aminokiseline. Agensi za cepanje mogu obuhvatati katepsine B i D i plazmin, za koje je poznato da hidrolizuju derivate dipeptidnih lekova, što rezultuje oslobađanjem aktivnog leka unutar cilјnih ćelija (pogledati npr. Dubowchik i Walker, 1999, Pharm. Terapeutics 83:67-123). U specifičnom primeru izvođenja, peptidil liker koji je podložan cepanju unutarćelijskom proteazom je Val-Cit (valin-citrulinski) linker ili Phe-Lys (fenilalanin-lizinski) linker (pogledati npr. US6214345, koji opisuje sintezu doksorubicina sa Val-Cit linkerom). Prednost upotrebe unutarćelijskog proteolitičkog oslobađanja terapijskog agensa je što se agens obično utišava kada se konjuguje i što je serumska stabilnost konjugata obično visoka.
[0259] U sledećem primeru izvođenja, citotoksični agens je povezan sa navedenim antitelom, ili njegovim fragmentom, sa linkerom koji nije podložan cepanju, kao što je sukcinimidil-4(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilatni (MCC) ili maleimidokaproilni (MC) linker.
[0260] Termin "linker koji nije podložan cepanju", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na podskup linkera koji, za razliku od linkera koji su podložni cepanju, ne sadrži motive koji su specifični i prepoznatljivi na predvidiv način od strane unutarćelijskih ili vanćelijskih proteaza. Tako, ADC zasnovani na linkerima koji nisu podložni cepanju, ne oslobađaju se ili se ne cepaju iz antitela sve dok ne dođe do potpune razgradnje kompleksa antitelo-linker-lek u lizozomskom odeljku ćelije. Primeri linkera koji nisu podložni cepanju su tioetri. Linkerska jedinica može biti ona koja nije podložna cepanju i lek se može osloboditi razlaganjem antitela (pogledati US 2005/0238649). Ovakav linker obično nije suštinski osetljiv na vanćelijsko okruženje. Kako se ovde upotrebljava, "nije suštinski osetlјiv na vanćelijsko okruženje", u kontekstu linkera, označava da se ne više od 20%, obično ne više od oko 15%, obično ne više od oko 10%, a još češće ne više od oko 5%, ne više od oko 3% ili ne više od oko 1% linkera u uzorku jedinjenja koje je konjugat antitela i leka, cepa kada je jedinjenje koje je konjugat antitela i leka prisutno u vanćelijskom okruženju (npr. plazmi). Da li je linker suštinski neosetljiv na vanćelijsko okruženje, može se utvrditi, na primer, inkubiranjem jedinjenja koje je konjugat antitela i leka sa plazmom tokom unapred određenog vremenskog perioda (npr. 2, 4, 8, 16 ili 24 sata) i potom kvantifikacijom količine slobodnog leka koji je prisutan u plazmi.
[0261] U jednom primeru izvođenja, citotoksični agens je izabran iz grupe: agenasa koji cilјano deluju na DNK, npr. DNK alkilujućih agensa i umreživača, kao što su kaliheamicin, duokarmicin, rahelmicin (CC-1065), pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepini (PBD) i indolinobenzodiazepin (IGN); agenasa koji cilјano deluju na mikrotubule, kao što su duostatin poput duostatina-3, auristatina, kao što je monometilauristatin E (MMAE) i monometilauristatin F (MMAF), dolastatin, majtanzin, N(2')-deacetil-N(2')-(3-markapto-1-oksopropil)-majtanzin (DM1) i tubulizin; i nukleozidnih analoga; ili njihovih analoga, derivata ili prolekova.
[0262] U jednom primeru izvođenja, AXL-ADC sadrži kombinaciju;
i) linker podložan cepanju i citotoksični agens sa kapacitetom ubijanja susednih ćelija;
ii) linker podložan cepanju i citotoksični agens bez kapaciteta ubijanja susednih ćelija;
iii) linker koji nije podložan i citotoksični agens sa kapacitetom ubijanja susednih ćelija; ili
iv) linker koji nije podložan i citotoksični agens bez kapaciteta ubijanja susednih ćelija.
[0263] Termini "efekat ubijanja susednih ćelija", "ubijanje susednih ćelija", "kapacitet ubijanja susednih ćelija" ili "citotoksičnost susednih ćelija”, kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na efekat u kome je citotoksični agens koji je konjugovan sa antitelom, bilo preko linkera koji je podložan cepanju ili nije podložan cepanju, sa kapacitetom da difunduje kroz ćelijske membrane nakon oslobađanja iz antitela i da time prouzrokuje ubijanje susednih ćelija. Kada je citotoksični agens konjugovan preko linkera koji je podložan cepanju ili nije podložan cepanju, on može biti bilo citotoksični agens koji samostalno deluje ili citotoksični agens sa delom linkera koji ima sposobnost ubijanja susednih ćelija. Kapacitet difuzije kroz ćelijske membrane je povezan sa hidrofobnošću citotoksičnog agensa ili kombinacije citotoksičnog agensa i linkera. Ovakvi citotoksični agensi mogu prevashodno biti toksini koji prolaze kroz membrane, kao što je MMAE, koji se proteazama oslobađa iz antitela. Posebno kod tumora sa heterogenom cilјanom ekspresijom i kod solidnih tumora gde prodiranje antitela može biti ograničeno, efekat ubijanja susednih ćelija može biti poželјan.
[0264] Termini "bez kapaciteta ubijanja susednih ćelija", "bez efekta ubijanja susednih ćelija", "bez ubijanja susednih ćelija" ili "bez citotoksičnosti susednih ćelija”, kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na efekat u kome citotoksični agens koji je konjugovan sa antitelom, bilo linkerom koji je podložan cepanju ili nije podložan cepanju, nema sposobnost difuzije kroz ćelijske membrane nakon oslobađanja iz antitela. Stoga, takvi citotoksični agensi ili kombinacije citotoksičnog agensa i linkera, bilo da je on podložan cepanju ili ne, neće biti u stanju da ubiju susedne ćelije po oslobađanju iz antitela. Veruje se, bez vezivanja za teoriju, da će ovakve kombinacije citotoksičnog agensa ili linkera, bilo da je on podložan cepanju ili ne, ubiti samo ćelije koje eksprimiraju ciljni molekul za koji se antitelo vezuje.
[0265] Stabilna veza između antitela i citotoksičnog agensa je važan faktor ADC-a. U pretkliničkim i kliničkim ispitivanjima je dokazano da su bezbedni i tipovi linkera koji su podložni cepanju i oni koji nisu podložni cepanju.
[0266] Citotoksični agens može biti izabran iz grupe agenasa koji ciljano deluju na mikrotubule, kao što su auristatini i majtanzinoidi.
[0267] Termin "agensi koji ciljano deluju na mikrotubule”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na agens ili lek koji inhibira mitozu (ćelijsku deobu). Mikrotubule su strukture koje su neophodne za pravilno razdvajanje DNK tokom ćelijske deobe, a funkcija mikrotubula kritično zavisi od „dinamičke nestabilnosti“, tj. procesa u kome se strukture mikrotubula neprekidno izdužuju i skraćuju. Agensi koji ciljano deluju na mikrotubule remete ili stabilizuju mikrotubule, što sprečava stvaranje mitotskog vretena i rezultuje zaustavljanjem mitoze i apoptozom. Agensi koji ciljano deluju na mikrotubule mogu biti izvedeni iz npr. prirodnih supstanci poput biljnih alkaloida, i sprečavati da ćelije prolaze kroz mitozu narušavanjem ili stabilizujom polimerizaciju mikrotubula, čime sprečavaju obrazovanje mitotskog vretena i naknadnu ćelijsku deobu, što rezultuje u inhibiciji rasta kancera. Primeri agenasa koji ciljano deluju na mikrotubule su paklitaksel, docetaksel, vinblastin, vinkristin, vinorelbin, duostatini, auristatini, majtanzanoidi, tubulizini i dolastatin.
[0268] Citotoksični agens je tipa auristatina ili auristatinskih peptidnih analoga ili derivata (US 5,635,483;US 5,780,588). Pokazano je da auristatini ometaju dinamiku mikrotubula, hidrolizu GTP-a i jedarnu i ćelijsku deobu (Woyke i saradnici, 2001), kao i da ih karakteriše antikancerska (US 5,663,149) i antifungalna aktivnost (Pettit, 1998). Auristatinska struktura leka može biti vezana za antitelo posredstvom linkera, preko N (amino) kraja ili C (kraja) peptidne strukture leka.
[0269] Auristatinski primeri izvođenja za primer uključuju auristatinske strukture leka DE i DF sa monometil grupom vezanom na N-kraju, opisane u Senter i saradnici (2004) i opisane u US 2005/0238649.
[0270] Citotoksični agens može biti monometil auristatin E (MMAE);
pri čemu je antitelo povezano sa MMAE preko azota (N) na levoj strani prethodno navedene hemijske strukture preko odgovarajućeg linkera.
[0271] Citotoksični agens monometil auristatin E (MMAE) može biti povezan sa antitelom preko valincitrulinskog (VC) linkera.
[0272] Citotoksični agens monometil auristatin E (MMAE) može biti povezan sa antitelom preko valincitrulinskog (VC) linkera i maleimidokaproilskog (MC) linkera, pri čemu je kombinacija citotoksičnog agensa i linkera hemijske strukture;
gde je Mab antitelo.
[0273] Citotoksični agens može biti monometil auristatin F (MMAF);
gde je antitelo povezano sa MMAF preko azota (N) na levoj strani prethodno navedene hemijske strukture preko odgovarajućeg linkera.
[0274] Citotoksični agens monometil auristatin F (MMAF) može biti povezan sa antitelom preko maleimidokaproilskog (mc)-likera, pri čemu je kombinacija citotoksičnog agensa i linkera hemijske strukture;
gde je Mab antitelo.
[0275] Citotoksični agens može biti duostatin3.
[0276] Citotoksični agens može biti agens koji ciljano deluje na DNK.
[0277] Termin "agens koji deluje na DNK", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na specifičnu klasu citotoksičnih agenasa koji mogu biti sposobni da alkiluju i/ili umreže DNK. Primer takvog agensa koji deluje na DNK su IGN agensi koji sadrže indolino-benzodiazepinske dimere i pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepini (PBD) koji su veoma potentni zahvalјujući njihovoj sposobnosti da alkiluju i umrežavaju DNK. Drugi primer su IGN agensi koji sadrže indolino-benzodiazepinske monomere koji su veoma potentni zahvalјujući sposobnosti da alkiluju samo DNK. Duokarmicini su druga klasa agenasa koji deluju na DNK. Duokarmicini su mali molekuli, sitetski alkilirajući agensi koji se vezuju za mali žljeb DNK. Ova jedinjenja su pogodna za cilјano dejstvo na solidne tumore, kao i na hematološke tumore.
[0278] AXL-ADC sadrži od dva do četiri citotoksična molekula po antitelu. U zavisnosti od hemijskih osobina toksina i kombinacije linkera i toksina, konjugati sa od dva do četiri citotoksična molekula po antitelu mogu biti superiorniji od konjugata sa većim opterećenjem koji se brže uklanjaju iz cirkulacije u odnosu na konjugate sa manjim opterećenjem. Opterećenje citotoksičnim agensom se predstavlja sa p i prosečan je broj struktura citotoksičnog agensa po antitelu u molekulu (označen i kao odnos leka i antitela, DAR od engl. drug to antibody ratio). Opterećenje citotoksičnim agensom može biti opsega od 1 do 20 ostataka leka po antitelu i može se nalaziti na aminokiselinama sa korisnim funkcionalnim grupama kao što su, ali bez ograničavanja samo na, amino ili sulfhidrilne grupe, kao u lizinu ili cisteinu.
[0279] Broj citotoksičnih agensa po antitelu može biti od 1 do 8, kao što je 2 do 7, kao što je 2 do 6, kao što je 2 do 5, kao što je 2 do 4 i kao što je 2 do 3.
[0280] AXL-ADC može sadržavati od četiri do osam citotoksičnih molekula po antitelu. AXL-ADC može sadržavati od šest do deset citotoksičnih molekula po antitelu. AXL-ADC može sadržavati od 10 do 30, kao što je 15 do 25, kao što je 20, citotoksičnih molekula po antitelu.
[0281] U zavisnosti od načina konjugacije, p može biti ograničen brojem mesta vezivanja na antitelu, na primer, time što je mesto vezivanja tiol cisteina ili lizin. U principu, antitela ne sadrže mnogo slobodnih i reaktivnih tiolskih grupa cisteina koje mogu biti povezane sa strukturom leka, pošto je većina tiola cisteinskog ostatka u antitelu prisutna u vidu disulfidnih mostova. Stoga, u onim primerima izvođenja gde je citotoksični agens konjugovan preko cisteinskog tiola, antitelo može biti redukovano redukujućim agensom poput ditiotreitola (DTT) ili trikarboniletilfosfina (TCEP), pod delimično ili potpuno redukujućim uslovima, da bi se stvorile reaktivne cisteinske tiolne grupe. U određenim primerima izvođenja, opterećenje ADC pronalaska lekom je opsega od 1 do oko 8, pošto maksimalno 8 slobodnih cisteinskih tiolnih grupa postaje dostupno nakon (delimične) redukcije antitela (postoji 8 cisteina koji su uklјučeni u međulančano povezivanje disulfidnim mostovima).
[0282] Struktura leka sa linkerom može biti vcMMAE. Struktura leka sa linkerom tipa vcMMAE i postupci konjugacije su opisani u WO 2004/010957; US 7,659,241; US 7,829,531; i US 7,851,437 (Seattle Genetics). vcMMAE se obrazuje konjugacijom mc-vc-PAB linkera i citotoksične grupe MMAE, a struktura leka sa linkerom tipa vcMMAE je povezana sa anti-AXL antitelima preko cisteinskih ostataka upotrebom postupka sličnog onima koji su ovde opisani.
[0283] Struktura leka sa linkerom može biti mcMMAF. Struktura leka sa linkerom tipa mcMMAF i postupci konjugacije su opisani u US 7,498,298; US 7,994,135 i WO 2005/081711 (Seattle Genetics), a struktura leka sa linkerom tipa mcMMAF je povezana sa anti-AXL antitelima preko cisteinskih ostataka upotrebom postupka sličnog onima koji su ovde opisani.
1
[0284] Citotoksični agens može biti povezan sa 1 ili sa 2 lizina unutar aminokiselinske sekvence antitela konjugacijom tipa K-Lock™, kao što je opisano u WO 2013/173391, WO 2013/173392 i WO 2013/173393 (Concortis Biosystems). Duostatin3 (poznat i kao Duo3) može takođe biti vezan za anti-AXL antitela preko lizinskih ostatka upotrebom postupka koji je sličan onima koji su ovde opisani.
[0285] Druge tehnologije ugradnje linkera mogu biti upotrebljene u konjugatima anti-AXL antitela i leka pronalaska, kao što je ugradnja linkera koji sadrže hidroksilnu grupu.
[0286] Linker može biti vezan za slobodne cisteinske ostatke anti-AXL antitela dobijene (delimičnom) redukcijom anti-AXL antitela.
[0287] U posebnom primeru izvođenja, linker je mc-vc-PAB, a citotoksični agens je MMAE. Alternativno, linker je SSP, a citotoksični agens je DM1.
[0288] Linker može biti MMC, a citotoksični agens može biti DM1; ili linker može biti MC, a citotoksični agens može biti MMAF.
[0289] Linker može biti linker podložan cepanju tipa AV1-K lock, a citotoksični agens je duostatin3.
[0290] AXL-ADC može sadržavati linker mc-vc-PAB, citotoksični agens MMAE i antitelo, pri čemu najmanje jedan region za vezivanje sadrži VH region i VL region izabran iz grupe koju čine;
[0291] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region i VL region izabrane iz grupe koju čine
(y) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:36, 37, i 38, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:39, GAS i 40, tim redom [107];
(z) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.: 46, 47, i 48, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:49, AAS i 50, tim redom [148];
(aa) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:114, 115, i 116, tim redom, i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.:117, DAS i 118, tim redom [733];
(bb) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.: 51, 52 i 53, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:55, GAS i 56, tim redom [154];
(cc) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.: 51, 52 i 54, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:55, GAS i 56, tim redom [154-M103L];
(dd) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.: 57, 58 i 59, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 60, GAS i 61, tim redom [171];
(ee) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 62, 63, i 64, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 65, GAS i 66, tim redom [172];
(ff) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 67, 68, i 69, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 70, GAS i 71, tim redom [181];
2
(gg) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 72, 73 i 75, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 76, ATS i 77, tim redom [183];
(hh) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 72, 74, i 75, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 76, ATS i 77, tim redom [183-N52Q];
(ii) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 78, 79 i 80, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 81, AAS i 82, tim redom [187];
(jj) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 83, 84, 85, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.: 86, GAS i 87, tim redom [608-01];
(kk) VH region koji sadrži CDRl, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 88, 89, i 90, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 91, GAS i 92, tim redom [610-01];
(II) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 93, 94, i 95, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 96, GAS i 97, tim redom [613];
(mm) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 98, 99 i 100, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:101, DAS i 102, tim redom [613-08];
(nn) VH region koji sadrži CDRl, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:103., 104, i 105, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:106, GAS i 107, tim redom [620-06];
(oo) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:108, 109, i 110, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.: 112, AAS i 113, tim redom [726];
(pp) VH region koji sadrži CDRl, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:108, 109 i 111, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.: 112, AAS i 113, tim redom [726-M101L];
(qq) VH region koji sadrži CDRl, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:41, 42 i 43, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.: 44, AAS i 45, tim redom [140];
(rr) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 93, 94 i 95, tim redom, i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.:128, XAS, pri čemu je X D ili G, i 129, tim redom [613 / 613-08];
(ss) VH region koji sadrži CDRl, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.: 46, 119, i 120, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:49, AAS i 50, tim redom [148 / 140];
(tt) VH region koji sadrži CDRl, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:123, 124 i 125, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 60, GAS i 61, tim redom [171 / 172 / 181]; i
(uu) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.:121, 109, i 122, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.: 112, AAS i 113, tim redom [726 / 187]; i
(vv) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID NOs.: 93, 126 i 127, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 96, GAS i 97, tim redom [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06].
[0292] Konjugat anti-AXL antitela i leka može sadržavati konjugovanu nukleinsku kiselinu ili molekul udružen sa nukleinskom kiselinom. Konjugovana nukleinska kiselina može biti citotoksična ribonukleaza, antisens nukleinska kiselina, inhibitorni molekul RNK (npr. molekul siRNK) ili imunostimuliratorna nukleinska kiselina (npr. imunostimulatorni DNK molekul koji sadrži CpG motiv).
[0293] Anti-AXL antitelo može biti konjugovano sa aptamerom ili ribozimom ili funkcionalnim peptidnim analogom ili njegovim derivatom.
[0294] Obezbeđeni su i konjugati anti-AXL antitela i leka koji sadrže jednu ili više radioaktivno obeleženih aminokiselina. Radioaktivno obeleženo anti-AXL antitelo može biti upotrebljeno i u dijagnostičke i u terapijske svrhe (konjugacija sa radioaktivno obeleženim molekulama je još jedna moguća karakteristika). Neograničavajući primeri obeleživača za polipeptide uklјučuju<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc i<125>J,<131>J i<186>Re. Postupci za pripremu radioaktivno obeleženih aminokiselina i srodnih peptidnih derivata su poznati u oblasti tehnike (pogledati, na primer, Junghans i saradnici (1996); US 4,681,581; US 4,735,210; US 5,101,827; US 5,102,990; US 5,648,471; i US 5,697,902. Na primer, halogeni radioizotop može biti konjugovan hloraminskim T postupkom.
[0295] Antitelo može biti konjugovano sa radioizotopom ili sa helatom koji sadrži radioizotop. Na primer, antitelo može biti konjugovano sa helatornim linkerom, npr. DOTA, DTPA ili tiuksetanom, što omogućava da antitelo bude u kompleksu sa radioizotopom. Antitelo takođe može ili alternativno sadrži ili je konjugovano sa jednom ili sa više radioaktivno obeleženih aminokiselina ili drugih radioaktivno obeleženih molekula. Radioaktivno obeleženo anti-AXL antitelo može biti upotrebljeno i u dijagnostičke i u terapijske svrhe. Neograničavajući primeri radioizotopa uključuju<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<125>J,<111>In,<131>J,<186>Re,<213>Bs,<225>Ac i<227>Th.
[0296] Anti-AXL antitela mogu takođe biti hemijski modifikovana kovalentnom konjugacijom sa polimerom da bi se, na primer, povećao njihov poluživot u cirkulaciji. Primeri polimera i postupci njihovog vezivanja za peptide su ilustrovani, na primer, u US 4,766,106; US 4,179,337; US 4,495,285 and US 4,609,546. Dodatni polimeri obuhvataju polioksietilisane poliole i polietilen glikol (PEG) (npr. PEG sa molekulskom težinom između oko 1.000 i oko 40.000, kao što je između oko 2.000 i oko 20.000). Navedeno može, na primer, biti upotrebljeno ukoliko anti-AXL antitelo predstavlja fragment.
[0297] Može biti upotrebljen bilo koji postupak za konjugovanje anti-AXL antitela predmetnog pronalaska do konjugovanog(ih) molekula koji je poznat u oblasti tehnike, kao što su oni opisani prethodno, uklјučujući postupke opisane u Hunter i saradnici (1974), Pain i saradnici (1981) i Nygren (1982). Ovakva antitela mogu biti proizvedena hemijskim konjugovanjem drugih struktura sa N-terminalnim ili C-terminalnim krajem anti-AXL antitela (npr. H ili L lancem anti-AXL antitela) (pogledati, npr. Kanemitsu, 1994). Takvi konjugovani derivati antitela mogu takođe biti generisani konjugacijom
4
sa internim ostacima ili šećerima, ili sa aminokiselinama koje se ne javlјaju u prirodi ili sa dodatnim aminokiselinama koje su bile uvedene u konstantni domen antitela, gde je to prikladno.
[0298] Agensi mogu biti kuplovani bilo direktno ili indirektno sa anti-AXL antitelom. Jedan primer indirektnog kuplovanja drugog agensa je kuplovanje preko spejserske strukture za cisteinske ili lizinske ostatke u antitelu. U jednom primeru izvođenja, anti-AXL antitelo se konjuguje, upotrebom spejsera ili linkera, sa molekulom proleka koji se može aktivirati in vivo u terapijski lek. Nakon primene, spejseri ili linkeri se odvajaju cepanjem, destvom enzima koji se javljaju u tumorskim ćelijama ili dejstvom drugih uslova koji su specifični za tumor, pri čemu se obrazuje aktivan lek. Primeri takvih tehnologija sa prolekovima i linkerima su opisani u WO 2002/083180, WO 2004/043493, WO 2007/018431, WO 2007/089149, WO 2009/017394 and WO 2010/62171 (Syngenta BV). Pogodna tehnologija tipa antitelo-prolek i analozi duokarmicina se takođe mogu pronaći u US 6,989,452 (Medarex).
[0299] Anti-AXL antitelo može biti vezano za helatorski linker, npr. tiuksetan, koji omogućava da se antitelo konjuguje sa radioizotopom.
Kombinacije, kompozicije i kompleti
[0300] AXL-ADC za upotrebu prema predmetnom opisu može biti primenjen u obliku kompozicije. Kompozicija može biti farmaceutska kompozicija koja sadrži AXL-ADC i farmaceutski nosač.
[0301] AXL-ADC ili farmaceutska kompozicija koja sadrži AXL-ADC može biti za upotrebu u lečenju neoplazija u kombinaciji sa najmanje jednim terapijskim agensom sa kojim se neoplazija leči ili je bila lečena, tj. sa hemoterapijskim agensom, inhibitorom tirozin kinaze, inhibitorom PI3K, mAb/rTKI i/ili inhibitorom serin/treonin kinaze, a u skladu sa bilo kojim prethodnim aspektom ili primerom izvođenja. Na primer, terapijski agens može biti hemoterapijski agens, TKI ili S/Th TKI u skladu sa bilo kojim prethodnim aspektom ili primerom izvođenja. Obično se AXL-ADC i terapijski agens primenjuju odvojeno.
[0302] Farmaceutska kompozicija koja sadrži AXL-ADC može dalјe sadržavati najmanje jedan terapijski agens sa kojim se neoplazija leči ili je bila lečena, tj. sa hemoterapijskim agensom, inhibitorom tirozin kinaze, inhibitorom PI3K, mAb/rTKI i/ili inhibitorom serin/treonin kinaze u skladu sa bilo kojim prethodnim aspektom ili primerom izvođenja. Na primer, terapijski agens može biti hemoterapijski agens, TKI ili S/Th TKI u skladu sa bilo kojim prethodnim aspektom ili primerom izvođenja. AXL-ADC za upotrebu prema predmetnom pronalasku, u kombinaciji sa najmanje jednim terapijskim agensom, mogu takođe biti obezbeđeni u obliku kompleta za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu, pri čemu komplet može dodatno sadržavati uputstva za upotrebu. ADC i najmanje jedan terapijski agens su obično formulisani kao odvojene farmaceutske kompozicije.
[0303] Inhibitor tirozin kinaze u kombinaciji, kompoziciji ili kompletu može biti EGFR antagonista.
[0304] Inhibitor tirozin kinaze u kombinaciji, kompoziciji ili kompletu može biti izabran iz grupe koja se sastoji od erlotiniba, gefitiniba, lapatiniba, imatiniba, sunitiniba, krizotiniba, midostaurina (PKC412) i kvizartiniba (AC220), kao što su npr. erlotinib ili njegov analog ili derivat poput lapatiniba, gefitiniba ili. Poželјno, inhibitor tirozin kinaze je erlotinib.
[0305] Inhibitor serin/treonin kinaze u kombinaciji, kompoziciji ili kompletu može biti izabran od vemurafeniba, dabrafeniba, selumetiniba (AZD6244), VTX11E, trametiniba i PLX4720.
[0306] Inhibitor BRAF u kombinaciji, kompoziciji ili kompletu može biti vemurafenib (PLX4032) ili njegovog terapijski efektivan analog ili derivat, poput dabrafeniba ili PLX4720. Inhibitor BRAF može biti vemurafenib. U jednom primeru izvođenja, inhibitor BRAF može biti dabrafenib.
[0307] Inhibitor serin/treonin kinaze u kombinaciji, kompoziciji ili kompletu može sadržavati najmanje jedan inhibitor BRAF i najmanje jedan od inhibitora MEK, pri čemu je najmanje jedan inhibitor BRAF izabran od vemurafeniba, dabrafeniba i njihove kombinacije, i pri čemu je inhibitor MEK izabran od selumetiniba (AZD6244) i trametiniba i njihove kombinacije. Na primer, kombinacija, kompozicija ili komplet mogu sadržavati dabrafenib i trametinib; vemurafenib i trametinib; dabrafenib, vemurafenib i trametinib; dabrafenib i selumetinib; ili vemurafenib i selumetinib.
[0308] Najmanje jedan hemoterapijski agens u kombinaciji, kompoziciji ili kompletu može biti taksan, na primer, izabran od paklitaksela i docetaksela.
[0309] Najmanje jedno hemoterapijski agens u kombinaciji, kompoziciji ili kompletu može biti izabran iz grupe koja se sastoji od cisplatina, karboplatina, doksorubicina, etopozida i metformina.
[0310] Inhibitor PI3K u kombinaciji, kompoziciji ili kompletu može biti alpelisib (BYL719).
[0311] MAb/rTKi u kombinaciji, kompoziciji ili kompletu može biti Cetuksimab ili MAB391.
[0312] Kompleti mogu dalјe sadržavati, ukoliko je to poželjno, jednu ili više od raznih konvencionalnih komponentni kompleta, kao što su, na primer, spremnici sa jednim ili sa više farmaceutski prihvatlјivih nosača, dodatni spremnici itd., a što će biti očigledno stručnjacima iz oblasti tehnike. Štampana uputstva, bilo u vidu umetaka ili etiketa, koji ukazuju na količine komponenti koje je potrebno primeniti, smernice za primenu i/ili smernice za mešanje komponenti, takođe mogu biti uključena u komplet.
[0313] Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane sa farmaceutski prihvatlјivim nosačima ili razblaživačima, kao i sa bilo kojim drugim poznatim adjuvansima i ekscipijensima u skladu sa konvencionalnim tehnikama, kao što su one opisane u Remington: The Science and Practice of Pharmacy (1995).
[0314] Farmaceutski prihvatlјivi nosači ili razblaživači, kao i bilo koji drugi poznati adjuvansi i eksipijensi, trebali bi da budu pogodni za AXL-ADC i izabrani način primene. Pogodnost nosača i drugih komponenti farmaceutskih kompozicija se određuje na osnovu nedostatka značajnog negativnog uticaja na želјene biološke osobine izabranog jedinjenja ili farmaceutske kompozicije (npr. da je uticaj manji od značajnog uticaja (10% ili manje relativne inhibicije, 5% ili manje relativne inhibicije itd.) nakon vezivanje antigena).
[0315] Farmaceutska kompozicija može takođe sadržavati razblaživače, ispunjivače, soli, pufere, deterdžente (npr. nejonski deterdžent, kao što je Tween-20 ili Tween-80), stabilizatore (npr. šećere ili aminokiseline oslobođene proteina), konzervanse, agense za fiksiranje tkiva, solubilizatori i/ili druge materijale pogodne za uklјučivanje u farmaceutsku kompoziciju.
[0316] Stvarni dozni nivoi aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska mogu varirati tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efektivna u postizanju želјenog terapijskog odgovora za određenog pacijenta, kompoziciju i način primene, bez prisustva toksičnosti za pacijenta. Odabrani nivo doze će zavisiti od raznih farmakokinetičkih faktora, uklјučujući aktivnost određenih kompozicija, načina primene, vremena primene, stope izlučivanja određenog jedinjenja koje se koristi, trajanja lečenja, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala koji se koriste u kombinaciji sa određenim upotrebljenim kompozicijama, kao i od starosti, pola, težine, stanja, opšteg zdravstvenog stanja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji će biti lečen i sličnih faktora koji su dobro poznati u medicinskoj praksi.
[0317] Farmaceutska kompozicija može biti primenjena bilo kojim pogodnim putem i načinom primene. Pogodni putevi primene jedinjenja predmetnog pronalaska in vivo i in vitro su dobro poznati u oblasti tehnike i mogu biti izbrani od strane prosečno iskusnih stručnjaka.
[0318] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska se primenjuje parenteralno.
[0319] Termini "parenteralna primena" i "primenjeno parenteralno", kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na načine primene drugačiji od enteralne i topikalne primene, obično putem injekcije, a obuhvata epidermalno, intravensko, intramuskularno, intra-arterijsko, intratekalno, intrakapsularno, intraorbitalno, intrakardijalno, intradermalno, intraperitonealno, intratendinozno, transtrahealno, subkutano, subkutikularno, intra-artikularno, subkapsularno, subarahnoidno, intraspinalno, intrakranijalno, intratorakalno, epiduralno i intrasternalno injeciranje i infuziju.
[0320] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može biti primenjena intravenskim ili subkutanim injeciranjem ili infuzijom.
[0321] Farmaceutski prihvatlјivi nosači obuhvataju bilo koji i sve pogodne rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense, antioksidanse, kao i agense za odlaganje apsorpcije i slično, a koji su fiziološki kompatibilni sa AXL-ADC ili terapijskim agensom za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom.
[0322] Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji se mogu koristiti u farmaceutskim kompozicijama obuhvataju vodu, fiziološki rastvor, fiziološki rastvor puferisan fosfatom, etanol, dekstrozu, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slični), kao i njihove odgovarajuće smeše, bilјna ulјa, kao što su maslinovo ulјe, kukuruzno ulјe, ulјe kikirikija, ulje pamuka i susama, koloidni rastvori karboksimetil celuloze, tragakant guma i organski estri koji se mogu injecirati, poput etil oleata, i/ili razni puferi. Ostali nosači su dobro poznati u farmaceutskoj praksi.
[0323] Farmaceutski prihvatlјivi nosači obuhvataju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za trenutnu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je poznata u oblasti tehnike. Osim u slučaju kada je bilo koji konvencionalni medijum ili agens nekompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njegova upotreba u farmaceutskim kompozicijama.
[0324] Pravilna fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom materijala za oblaganje poput lecitina, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom surfaktanata.
[0325] Farmaceutske kompozicije mogu takođe sadržavati farmaceutski prihvatlјive antioksidanse, na primer (1) antioksidanse rastvorljive u vodi, kao što su askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i slični; (2) antioksidanse rastvorljive u ulјu, kao što su askorbil palmitat, butilisan hidroksianizol (BHA), butilisani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propil galat, alfa-tokoferol i slični; i (3) agense za helaciju metala, kao što su limunska kiselina, etilendiamin tetra sirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina i slično.
[0326] Farmaceutske kompozicije mogu takođe sadržavati izotonične agense, kao što su šećeri, polialkoholi poput manitola, sorbitola, glicerola ili natrijum hlorid u kompozicijama.
[0327] Farmaceutske kompozicije mogu takođe sadržavati jedan ili više adjuvanasa pogodnih za izabrani put primene, kao što su konzervansi, ovlaživači, emulgatori, sredstava za dispergovanje, konzervansi ili puferi, koji mogu poboljšati rok trajanja ili efektivnost farmaceutske kompozicije. AXL-ADC ili terapijski agnesi za upotrebu u predmetnom pronalasku mogu biti pripremljeni sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje od brzog otpuštanja, kao što su formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem, uklјučujući implantate, transdermalne flastere i mikro-inkapsulirane sisteme za isporuku. Takvi nosači mogu uklјučivati želatin, gliceril monostearat, gliceril distearat, biorazgradive, biokompatibilne polimere, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poli-orto-esteri i polilaktična kiselina samostalno ili sa voskom, ili drugi materijali koji su dobro poznati u oblasti tehnike. Postupci za pripremu ovakvih formulacija su opšte poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Pogledati npr. Robinbson: Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (1978).
[0328] Jedinjenja mogu biti formulisana tako da se obezbedi pravilna distribucija in vivo. Farmaceutski prihvatlјivi nosači za parenteralnu primenu obuhvata sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za trenutnu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je poznata u oblasti tehnike. Osim u slučaju kada je bilo koji konvencionalni medijum ili agens nekompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njegova upotreba u farmaceutskim kompozicijama. Ostala aktivna ili terapijska jedinjenja mogu takođe biti ugrađena u kompozicije.
[0329] Farmaceutske kompozicije za injeciranje obično moraju biti sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija može biti formulisana kao rastvor, mikroemulzija, lipozom ili druga uređena struktura koja je pogodna za visoku koncentraciju leka. Nosač može biti vodeni ili nevodeni rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliole (poput glicerola, propilen glikola, polietilen glikola i sličnih), i odgovarajuće smeše istih, bilјna ulјa poput maslinovog ulja, kao i organske estre za injeciranje poput etil oleata. Pravilna fluidnost se može održati, na primer, upotrebom obloge kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima, poželјno je da se u kompoziciju uklјuče izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi poput glicerola, manitola, sorbitola ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija kompozicije za injeciranje se može postići uklјučivanjem agensa koja odlaže apsorpciju u kompoziciju, na primer, monostearatnih soli i želatina. Sterilni rastvori za injeciranje mogu biti pripremljeni ugradnjim aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču, sa jednim ili sa kombinacijom sastojaka, npr. sa onima koji su prethodno nabrojani, ukoliko je to potrebno, nakon čega bi sledila sterilizacija mikrofiltracijom. U principu, disperzije se pripremaju ugradnjom aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potom dodavanjem drugih potrebnih sastojaka, npr. onih koji su ptrethodno nabojani. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, primeri postupaka pripreme su sušenje vakuumom i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija) kojima se dobija prah aktivnog sastojka i bilo koji dodatni želјeni sastojak iz njihovog rastvora koji je prethodno filtriran u cilju sterilizacije.
[0330] Sterilni rastvori za injeciranje mogu biti pripremljeni ugradnjom aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač, sa jednim ili sa kombinacijom prethodno nabrojanih sastojaka, nakon čega po potrebi sledi sterilizacija mikrofiltracijom. Generalno, disperzije se pripremaju ugradnjom aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potom dodavanjem drugih potrebnih sastojaka od onih koji su prethnodno nabrojani. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, primeri postupaka pripreme su sušenje vakuumom i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija) kojima se dobija prašak aktivnog sastojka zajedno sa bilo kojim dodatnim želјeni sastojkom iz njihovog rastvora koji je prethodno filtriran u cilju sterilizacije.
Proizvodnja anti-AXL antitela
[0331] Antitela za upotrebu kao ADC prema pronalasku mogu biti pripremljena rekombinantno u ćeliji domaćinu, upotrebom konstrukata nukleinskih kiselina, obično u vidu jednog ili više ekspresionih vektora. U jednom primeru izvođenja, konstrukt nukleinske kiseline kodira jednu ili više sekvenci prikazanih u Tabeli 1. U dodatnom primeru izvođenja, ekspresioni vektor dalјe sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira konstantni region lakog lanca, teški lanac ili i lake i teške lance antitela, npr. humanog IgG1, κ monoklonskog antitela.
[0332] Eksprimirano anti-AXL antitelo može naknadno biti konjugovan sa strukturom/grupom, kao što je ovde opisano. U drugom primeru izvođenja, a anti-AXL antitelo može biti naknadno upotrebljeno za generisanje bispecifičnog antitela kao što je ovde opisano, pre konjugacije.
[0333] Ekspresioni vektor može biti bilo koji pogodan vektor, uklјučujući hromozomske, nehromozomske i sintetske vektore nukleinskih kiselina (sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži odgovarajući set elemenata za kontrolu ekspresije). Primeri takvih vektora obuhvataju derivate SV40, bakterijske plazmide, fagnu DNK, bakulovirusne, plazmide kvasca, vektore izvedene iz kombinacije plazmida i fagne DNK, kao i vektore na bazi virusnih nukleinskih kiselina (RNK ili DNK). Nukleinska kiselina koja kodira anti-AXL antitelo se može nalaziti u okviru “golog” DNK ili RNK vektora, uklјučujući, na primer, linearni ekspresioni element (kao što je opisano, na primer, u Sykes i Johnson (1997), kompaktnog vektora nukleinske kiseline (kao što je opisano na primer u US 6,077,835 i/ili WO 00/70087), plazmidnog vektora kao što je pBR322, pUC 19/18 ili pUC 118/119, vektora nukleinske kiseline minimalne veličine (engl. midge - kao što je opisano na primer u Schakowski i saradnici (2001)), ili vektorskog konstrukta precipitirane nukleinske kiseline, poput konstrukta dobijenog precipitacijoma sa kalcijum fosfatom (kao što je opisano, na primer, u WO 00/46147; Benvenisty i Reshef, 1986; Wigler i saradnici, 1978; i Coraro i Pearson, 1981). Takvi vektori nukleinskih kiselina i njihova upotreba su dobro poznati u oblasti tehnike (pogledati na primer US 5,589,466 i US 5,973,972).
[0334] Vektor može biti onaj koji je pogodan za ekspresiju anti-AXL antitela u bakterijskoj ćeliji. Primeri takvih vektora obuhvataju ekspresione vektore kao što su BlueScript (Stratagene), pIN vektori (Van Heeke and Schuster, 1989), pET vektori (Novagen, Madison WI) i slični).
[0335] Ekspresioni vektor takođe može biti ili je alternativno vektor pogodan za ekspresiju u sistemu kvasca. Bilo koji vektor pogodan za ekspresiju u sistemu kvasca može biti upotrebljen. Pogodni vektori uklјučuju, na primer, vektore koji sadrže konstitutivne ili inducibilne promotore kao što su alfa faktor, alkoholna oksidaza i PGH (revijski pregled u Ausubel i saradnici, 1987, i Grant i saradnici, 1987).
[0336] Konstrukt i/ili vektor nukleinske kiseline može takođe sadržavati sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu sekrecije/lokalizacije, koja može omogućiti ciljano dopremanje polipeptida, kao što je nascentni polipeptidni lanac, do periplazmatskog prostora ili u medijum ćelijske kulture. Takve sekvence su poznate u oblasti tehnike i obuhvataju liderske ili signalne peptide sekrecije, sekvence za ciljanu isporuku u organele (npr. sekvence lokalizacije u jedru, signale zadržavanja u ER, sekvence mitohondrijalnog tranzita, hloroplastne tranzitne sekvence), sekvence lokalizacije/usidravanja u membrani (npr. sekvence zaustavljanja transfera, GPi sekvence za usidravanje) i slične.
[0337] U ekspresionom vektoru, nukleinske kiseline koje kodiraju anti-AXL antitelo mogu sadržavati ili biti udružene sa bilo kojim pogodnim promotorom, pojačivačem i drugim elementima koji olakšavaju ekspresiju. Primeri takvih elemenata obuhvataju snažne promotore ekspresije (npr. humani CMV IE promotor/pojačivač kao i RSV, SV40, SL3-3, MMTV i HIV LTR promotore), efektivne sekvence poli (A) terminacije, sekvencu početka replikacije za proizvod plazmida u E. coli, gen rezistencije na antibiotike kao selektivni marker i/ili pogodno mesto za kloniranje (npr. polilinker). Nukleinske kiseline takođe mogu sadržavati inducibilni promotor nasuprot konstitutivnom promotoru, kao što je CMV IE (iskusan stručnjak će prepoznati da su navedni termini zapravo predstavljaju opise stepena genske ekspresije pod određenim uslovima).
[0338] Ekspresioni vektor koji kodira anti-AXL-antitelo može biti pozicioniran u i/ili isporučen u ćeliju domaćina ili životinju domaćina putem virusnog vektora.
[0339] Ćelija domaćin može biti rekombinantna eukariotska ili prokariotska ćelija domaćin, kao što je transfektom, koji proizvodi anti-AXL antitelo kao što je ovde definisano, ili bispecifični molekul pronalaska, kao što je ovde definisano. Primeri ćelija domaćina obuhvataju ćelije kvasca, bakterijske ili sisarske ćelije, kao što su CHO ili HEK ćelije ili njihovi derivati. Na primer, ćelija može sadržavati nukleinsku kiselinu koja je stabilno integrisana u ćelijski genom koji sadrži sekvencu koja kodira ekspresiju anti-AXL. Ćelija može sadržavati i neintegrisanu nukleinsku kiselinu, poput plazmida, kozmida, fagemida ili elementa linearne ekspresije, koja sadrži kodirajuću sekvencu u cilju ekspresije anti-AXL antitela.
[0340] Predviđeno je da se termin "rekombinantna ćelija domaćina" (ili jednostavno "ćelija domaćin"), kako se ovde upotrebljava, odnosi na ćeliju u koju je uveden ekspresioni vektor. Podrazumeva se da je predviđeno da se ovakvi termini ne odnose samo na određenu predmetnu ćeliju, već i na potomstvo takve ćelije. Pošto se u sledećim generacijama mogu dogoditi određene modifikacije usled bilo mutacija ili uticaja okoline, takvo potomstvo ne mora, u stvari, biti identično matičnoj ćeliji, ali je još uvek uklјučeno u opseg termina "ćelija domaćin" kako se on ovde upotrebljava. Rekombinantne ćelije domaćina obuhvataju, na primer, transfektome, kao što su CHO ćelije, HEK-293 ćelije, PER.C6, NS0 ćelije i limfocitne ćelije, kao i prokariotske ćelije kao što su E. coli, ali i druge eukariotske ćelije domaćini poput bilјnih ćelija i ćelija gljiva.
[0341] Termin "transfektom", kako se ovde upotrebljava, obuhvata rekombinantne eukariotske ćelije domaćine koje eksprimiraju antitelo ili cilјni antigen, kao što su CHO ćelije, PER.C6, NS0 ćelije, HEK-293 ćelije, bilјne ćelije ili ćelije gljiva, uklјučujući ćelije kvasca.
[0342] Antitelo može alternativno biti proizvedeno u hibridomu pripremljenom od mišijih B ćelija slezine izolovanih iz miševa imunizovanih sa antigenom od interesa, na primer, u vidu ćelija koje eksprimiraju antigen na površini ili sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira vanćelijski region AXL-a.
Monoklonska antitela mogu takođe biti dobijena iz hibridoma izvedenih iz ćelija koje eksprimiraju antitelo kod imunizovanih lјudi ili sisara različitih od čoveka poput zečeva, pacova, pasa, primata itd.
[0343] Humana antitela mogu biti generisana upotrebom transgenih ili transhromozomskih miševa, npr. HuMab miševa, koji nose delove humanog imunog sistema, a ne mišji sistem. HuMab miš sadrži minilokus humanog imunoglobulinskog gena koji kodira nerearanžirane humane imnoglobulinske sekvence teškog (µ i γ) i κ lakog lanca, zajedno sa cilјanim mutacijama koje inaktiviraju endogene lokuse µ i κ lanaca (Lonberg i saradnici, 1994a). Shodno navedenom, miševi nakon imunizacije poizvode odgovor u vidu humanog antitela, a uvedeni transgeni humanih teških i lakih lanaca se podvrgavaju izmeni klase i somatskim mutacijama da bi se generisala humana IgG,κ monoklonska antitela visokog afiniteta (Lonberg i saradnici, 1994b; Lonberg i Huszar, 1995; Harding i Lonberg, 1995). Priprema HuMab miševa je detalјno opisana u Taylor i saradnici, 1992; Chen i saradnici, 1993; Tuaillon i saradnici, 1994; i Fishwild i saradnici, 1996. Pogledati takođe US 5,545,806; US 5,569,825; US 5,625,126; US 5,633,425; US 5,789,650; US 5,877,397; US 5,661,016; US 5,814,318; US 5,874,299; US 5,770,429; US 5,545,807; WO 98/024884; WO 94/025585; WO 93/001227; WO 92/022645; WO 92/003918; i WO 01/009187. Splenociti iz ovih transgenih miševa mogu biti upotrebljeni za generisanje hibridoma koji izlučuju humana monoklonska antitela, upotrebom dobro poznatih tehnika. Dodatno, humana antitela mogu biti generisana iz transgenih miševa ili pacova da bi se proizvela himerna antitela humanih i pacovskih antitela koja mogu biti upotrebljena kao izvor za rekombinantnu proizvodnju potpuno humanih monoklonskih antitela.
[0344] Dodatno, humana antitela mogu biti identifikovati upotrebom tehnologija prikazivanja, uklјučujući, bez ograničavanja samo na, prikazivanje na fagima, retrovirusno prikazivanje, ribozomalno prikazivanje, prikazivanje u sisarskim ćelijama, kvascima, kao i druge tehnike koje su poznate u oblasti tehnike, a dobijeni molekuli mogu biti potom podvrgnuti dodatnom sazrevanju, kao što je afinitetno sazrevanje, pošto su i takve tehnike dobro poznate u oblasti tehnike.
1
Tabela 4 - Sekvence
2
4
[0345] Predmetni pronalazak je dalјe ilustrovan putem primera koji slede i koje ne treba tumačiti dodatno ograničavajućima.
PRIMERI
Primer 1 - Imunizacija i generisanje AXL antitela
Ekspresioni konstrukti za AXL
[0346] Generisani su sledeći konstrukti optimizovanih kodona za ekspresiju različitih AXL varijanti pune dužine: humani (Homo sapiens) AXL (Genbank pristupni br. NP_068713.2), himerni AXL čoveka i cinomolgus majmuna u kome je humani vanćelijski domen (ECD) zamenjen sa ECD cinomolgus
1
majmuna (Macaca fascicularis) (translacijom sekvence sa Genbank pristupnim br. HB387229.1; ak 1-447), himerni AXL čoveka i miša u kome je humani ECD zamenjen sa ECD mišjeg (Mus musculus) AXL-a (Genbank pristupni NP_033491.2; ak 1-441), himerni AXL čoveka i muša u kome je humani domen sličan Ig domenu tipa I (ak 1-134, takođe ovde označen kao " Ig1 domen") zamenjen domenom I sličnim Ig domenu mišjeg AXL-a, himerni AXL čoveka i miša u kome je humani domen sličan Ig domenu tipa II (ak 148-194, ovde takođe označen kao „Ig2 domen“) zamenjen domenom sličnim Ig domenu tipa II mišjeg AXL-a, himerni AXL čoveka i miša u kome je humani domen sličan FNIII domenu tipa I (ak 227-329, ovde takođe označen kao "FN1 domen") zamenjen domenom sličnim FNIII domenu tipa I mišjeg AXL-a, himerni AXL čoveka i miša u kome je humani domen sličan FNIII domenu tipa II (ak 340-444, ovde takođe označen kao „domen FN2“) zamenjen domenom sličnim FNIII domenu tipa II mišjeg AXL-a. Dodatno, generisani su sledeći konstrukti optimizovanih kodona za razne AXL ECD varijante: vanćelijski domen (ECD) humanog AXL-a (ak 1-447) sa C-terminalom His oznakom (AXLECDHis), domen sličan FNIII domenu tipa II humanog AXL-a (ak 327-447) sa N-terminalnim signalnim peptidom i C-terminalom His oznakom (AXL-FN2ECDHis), kao i domeni slični Ig1 I Ig2 domenima humanog AXL-a (ak 1-227) sa C- terminalom His oznakom (AXL-Ig12ECDHis).
[0347] Konstrukti su sadržavali pogodna restrikciona mesta za kloniranje i optimalnu Kozak sekvencu (GCCGCCACC) (Kozak i saradnici, 1999). Konstrukti su klonirani u sisarski ekspresioni vektor pcDNA3.3 (Invitrogen).
Ekspresija AXL u EL4 ćelijama
[0348] EL4 ćelije su bile stabilno transfektovane sa pcDNA3.3 vektorom koji je sadržavao kodirajuću sekvencu humanog AXL-a pune dužine, a nakon selekcije sa antibiotskim agensom, G418 (Geneticin), izabrani su stabilni klonovi.
Prečišćavanje His-obeleženog AXL-a
[0349] AXLECDHis, AXL-FN2ECDHis i AXL-Ig12ECDHis su eksprimirani u HEK-293F ćelijama. Hisobeležavanje omogućava prečišćavanje afinitetnom hromatografijom sa imobilizovanim metalnim jonima. U ovom procesu, helator koji je pričvršćen na hromatografsku smolu je zasićen sa Co<2+>katjonima. Supernatanti koji su sadržavali His-obeležene proteine su serijski inkubirani sa smolom (tj. u vidu rastvora). His-obeleženi protein se snažno vezuje za zrna smole, dok se drugi proteini prisutni u supernatantu iz kulture ne vezuju ili vezuju slabo u poređenju sa His-obeleženim proteinima. Nakon inkubacije, zrna su izdvojena iz supernatanta i napakovana na kolonu. Kolona je isprana kako bi se uklonili slabo vezani proteini. Čvrsto vezani His-obeleženi proteini su zatim eluirani puferom koji je sadržavao imidazol, a koji biva u kompeticiji sa His u vezivanju za Co<2+>. Eluent je uklonjen iz proteina, izmenom pufera na koloni za desalinaciju.
Imunizacija
[0350] Antitela IgG1-AXL-061, IgG1-AXL-107, IgG1-AXL-183, IgG1-AXL-613 i IgG1-AXL-726 su dobijena iz sledećih imunizacija: HCo12-BalbC (IgG1-AXL-107), HCo17-BalbC (IgG1-AXL-183, IgG1-AXL-726) i HCo20 (IgG1-AXL-061, IgG1-AXL-613) transgeni miševi (Medarex, San Jose, CA, SAD) su imunizovani naizmenično, najpre intraperitonealnim (IP) injeciranjem 20 µg AXLECDHis proteina (IgG1-AXL-511, IgG1-AXL-613, IgG1-AXL-183), a zatim i sa 20 µg AXL-FN2ECDHIS plus 20 µg AXL-Ig12ECDHis (IgG1-AXL-726) ili 20 µg AXL-Ig12ECDHis (IgG1-AXL-107), nakon čega je sledila subkutana primena (SC; u bazu
2
repa) istog proteina, u intervalu od 14 dana. Urađeno je ukupno 8 imunizacija: 4 IP i 4 SC imunizacije. Prilikom većine imunizacija, prva imunizacija je rađena u kompletnom Frojndovom adjuvansu (CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, SAD), dok su sve naredne imunizacije izvođene u nekompletnom Frojndovom adjuvansu (IFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, SAD). Antitelo IgG1-AXL-183 je dobijeno iz imunizacije koja je rađena u adjuvantnom sistemu firme Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD).
[0351] Antitela IgG1-AXL-137, IgG1-AXL-148, IgG1-AXL-154, IgG1-AXL-171 i IgG1-AXL-733 su dobijena iz sledećih imunizacija: HCo12-BalbC (IgG1-AXL-137, IgG1- AXL-148), HCo17-BalbC (IgG1-AXL-154, IgG1-AXL-733) i HCo20-BalbC (IgG1-AXL-171) transgeni miševi (Medarex, San Jose, CA, SAD) su imunizovani sa 20 µg AXLECDHis proteina u CFA. Nakon toga, miševi su imunizovani naizmenično intraperitonealnim (IP) injeciranjem EL4 ćelija koje su bile transfektovane sa humanim AXL-om pune dužine u PBS-u, kao i subkutanim injeciranjem (SC; u bazu repa) AXLECDHis proteina u IFA, sa intervalom od 14 dana.
[0352] Miševima sa najmanje dva uzastopna titra antitela specifičnog za AXL sa vrednošću od 200 (razblaženje seruma 1/200) ili više, koji su detektovani antigen specifičnim skriningom upotrebom FMAT testa, kao što je opisano u dalјem tekstu, primenjena je bust doza, 3-4 dana pre fuzije (10 µg proteina izvedenog iz AXL-a je injecirano intravenski, u PBS-u).
Test skrininga specifičan za homegene antigene
[0353] Prisustvo anti-AXL antitela u serumima imunizovanih miševa ili HuMab (humanog monoklonskog antitela) u supernatantu kulture hibridoma ili transfektoma, određivano je skrining testom koji je bio specifičan za homogene antigene, upotrebom tehnologije fluorometrijskog testa u mikronskim zapreminama (FMAT; Applied Biosystems, Foster City, CA, SAD). Za navedeno su korišćene dve različito dizajnirane analize sa kombinacijama 4 ili 8 testova zasnovanih na ćelijama.
[0354] Dizajn analize sa 4 testa zasnovana na ćelijama je upotrebljen za analizu seruma iz imunizovanih miševa i kao primarni test skrininga za supernatant kulture hibridoma ili transfektoma. U ovom dizajnu analize sa 4 testa zasnovana na ćelijama, analizirano je vezivanje humanih antitela u uzorcima za A431 (DSMZ) i MDA-MB-231 ćelije (obe eksprimiraju AXL na ćelijskoj površini), kao i za vezivanje za TH1021-AXL (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale humani AXL pune dužine; proizvedene su kao što je prethodno opisano) i HEK293 ćelije divlјeg tipa (negativna kontrola koja ne eksprimira AXL), tim redom.
[0355] Uzorci supernatanta kulture hibridoma ili transfektoma su dodatno podvrgnuti analizi dizajniranoj tako da sadrži 8 testova zasnovanih na ćelijama. U ovih 8 testova, analizirano je vezivanje humanih antitela uzoraka za TH1021-hAXL (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale humani AXL), TH1021-cAXL (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale himerni humani i AXL cinomolgus majmuna u kome je humani ECD AXL-a bio zamenjen sa ECD cinomolgus majmuna), TH1021-mAXL (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale himerni AXL između čoveka i miša u kome je humani ECD zamenjen ECD-om iz AXL-a miša), TH1021-mlg1 (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale humani AXL u kome je domen sličan Ig domenu tipa I zamenjen sa domenom sličnim Ig domenu tipa I iz mišjeg AXL-a), TH1021-mlg2 (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale humani AXL sa domenom sličnim Ig domenu tipa II koji je bio zamenjen domenom sličnim Ig domenu tipa II mišjeg AXL-a), TH1021-mFN1 (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale humani AXL u kome je domen sličan FNIII domenu tipa I zamenjen sa domenom sličnim FNIII domenu tipa I mišjeg AXL-a), TH1021-mFN2 (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale humani AXL u kome je domen sličan FNIII domenu tipa II zamenjen sa domenom sličnim FNIII domenu tipa II mišjeg AXL-a) i HEK293 ćelije divlјeg tipa (negativna kontrola koja ne eksprimira AXL), tim redom.
[0356] Uzorci su dodavani ćelijama da bi se omogućilo vezivanje za AXL. Potom je vezivanje HuMab detektovano upotrebom fluorescentnog konjugata (kozji anti-Humani IgG Fc gama-DyLight649; Jackson ImmunoResearch). Humanizovano mišje antitelo specifično za AXL A0704P (sintetisano u HEK-293F ćelijama) upotrebljeno je kao pozitivna kontrola, dok su kao negativne kontrole korišćeni objedinjeni HuMab-mišji serum i ChromPure humani IgG kao celokupni molekul (Jackson ImmunoResearch), tim redom. Uzorci su skenirani upotrebom sistema za detekciju ćelija Applied Biosistems 8200 (8200 CDS) i očitana je srednja vrednost fluorescencija. Uzorci su smatrani pozitivnim kada su očitavanja bila veća od 50 i kada su “očitavanje x fluorescenca” bili najmanje tri puta veći u odnosu na negativnu kontrolu.
Generisanje HuMab hibridoma
[0357] HuMab miš u kome se razvio dovoljan titar antitela specifičnih za antigen (opisano prethodno) je žrtvovan, pa su prikupljeni slezina i limfni čvorovi koji okružuju trbušnu aortu i šuplju venu. Fuzija splenocita i ćelija limfnih čvorova u ćelijsku liniju mišjeg mijeloma (SP2.0 ćelije) je urađena elektrofuzijom, upotrebom sistema za elektrofuziju CytoPulse CEEF 50 (Cellectis, Paris, Francuska), suštinski prema uputstvima proizvođača. Potom su primarni bunarići subklonirani upotrebom ClonePix sistema (Genetix, Hampshire, UK). U tu svrhu, specifični hibridomi iz primarnih bunarića su zasejani u polutvrdi medijum napravlјen od 40% CloneMedia (Genetix, Hampshire, UK) i 60% HyQ 2x kompletnog medijuma (Hyclone, Waltham, SAD). Subklonovi su ponovo testirani upotrebom testa za vezivanje specifičnog antigena, kao što je prethodno opisano, pa su skenirani upotrebom IsoCyte sistema (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA). Nivoi IgG-a su izmereni upotrebom Octet-a (Fortebio, Menlo Park, SAD) da bi se za dalje umnožavanja selektovao klon iz primarnog bunarića koji je sa najboljom produkcijom. Dalje umnožavanje i kultivacija dobijenih HuMab hibridoma je rađena upotrebom standardnih protokola (npr. kao što je opisano u Coligan J.E., Bierer B.E., Margulies D.H., Shevach E.M. i Strober, W., izd. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 2006). Klonovi dobijeni ovim procesom su označeni kao PC1021.
Masena spektrometrija prečišćenih antitela
[0358] Mali alikvoti antitela od 0,8 mL koji su sadržavali supernatante hibridoma iz faze sa 6-bunarića ili iz Hyperflask-a su prečišćeni upotrebom PhyTip kolona koje su sadržavale smolu sa proteinom G (PhyNexus Inc., San Jose, SAD) upotrebom Sciclone ALH 3000 sistema (Caliper Lifesciences, Hopkinton, SAD). PhyTip kolone su korišćene u skladu sa uputstvima proizvođača, ali su puferi bili zamenjeni sa: PBS puferom za vezivanje (B. Braun, Medical BV, Oss, Norveška) i elucionim puferom sa 0,1M glicin-HCI pH 2,7 (Fluka Riedel-de Haën, Buchs, Nemačka). Nakon prečišćavanja, uzorci su neutralisani sa 2M Tris-HCI pH 9,0 (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Holandija). Alternativno, u pojedinim slučajevima su na kolonama prečišćavani veći volumeni supernatanta iz kulture, upotrebom Protein A afinitetne hromatografije na koloni.
[0359] Nakon prečišćavanja, uzorci su prebačeni u ploču sa 384 mesta (Waters, ploča sa kvadratnim bunarićima od 100 µl, kat.br. 186002631). Uzorci su deglikozilovani preko noći na 37°C sa N-glikozidazom F. Zatim je dodat DTT (15 mg/ml) (1 µl/bunariću), pa su uzorci inkubirani tokom 1 h na
4
37°C. Uzorci (5 ili 6 µl) su dalje desalinizirani na Acquity UPLC™ (Waters, Milford, SAD) upotrebom BEH300 C18 kolone (1,7 µm, 2,1 x 50 mm) na 60°C. Kao eluenti A i B su upotrebljeni MQ voda i acetonitril, LC-MS stepena čistoće (Biosolve, kat.br. 01204101, Valkenswaard, Holandija) sa 0,1% mravlјe kiseline (Fluka, kat.br. 56302, Buchs, Germany), tim redom. Maseni spektri elektrosprej jonizacije tipa vreme leta (engl. time-of-flight) su snimani u realnom vremenu, upotrebom micrOTOF™ masenog spektrometra (Bruker, Bremen, Nemačka) pri režimu rada sa pozitivnim jonima. Pre analize, skala od 900-3000 m/z je kalibrisana mešavinom za podešavanje ES (Agilent Technologies, Santa Clara, SAD). Maseni spektri su razvrstani upotrebom kompjuterskog programa DataAnalysis™ v.3.4 (Bruker) i algoritma maksimalne entropije za pretraživanje molekulskih težina između 5 i 80 kDa.
[0360] Nakon razvrstavanja, dobijene mase teških i lakih lanaca (pod redukujućim uslovima) za sve uzorke su upoređene da bi se pronašla identična antitela. Pri poređenju teških lanaca, uzeto je u obzir moguće prisustvo C-terminalnih varijanati lizina. Rezultat navedene analize je spisak jedinstvenih antitela, pri čemu je jedinstvenost definisana kao jedinstvena kombinacija teških i lakih lanaca. U slučajevima kada su pronađeni duplikati antitela, korišćeni su rezultati drugih testova da bi se utvrdilo koje je antitelo najbolјi materijal za nastavak eksperimenata.
Analiza sekvence varijabilnih domena AXL antitela i kloniranje u ekspresione vektore
[0361] Ukupna RNK je pripremlјena iz 0,2 do 5x10<6>ćelija hibridoma, dok je 5'-RACE-komplementarna DNK (cDNK) pripremlјena od 100 ng ukupne RNK, upotrebom SMART RACE kompleta za amplifikaciju cDNK (Clontech), prema uputstvima proizvođača. VH i VL kodirajući regioni su amplifikovani PCR-om i klonirani direktno, u otvoreni okvir čitanja ekspresionih vektora pGlf i pKappa, ligacijom nezavisnom od kloniranja (Aslanidis, C. i P.J. de Jong, Nucleic Acids Res 1990; 18(20): 6069-74). Za svako antitelo je sekvencirano 12 VL klonova i 12 VH klonova. Dobijene sekvence su prikazane u Tabeli 4. CDR sekvence su definisane u skladu sa IMGT (Lefranc i saradnici, 1999 i Brochet, 2008). Klonovi sa ispravnim otvorenim okvirom čitanja (ORF) su odabrani za dalјe istraživanje i ekspresiju. Vektori svih kombinacija teških i lakih lanaca koji su pronađeni, tranzijentno su koeksprimirani u FreestyleTM 293-F ćelijama upotrebom 293fectin-a.
[0362] Za antitela IgG1-AXL-154, IgG1-AXL-183 i IgG1-AXL-726, generisane su sledeće varijante sa tačkastim mutacijama u varijabilnim domenima: IgG1-AXL-154-M103L, IgG1-AXL-183-N52Q i IgG1 -AXL-726-M101L. Mutanti su generisani mutagenezom usmerenom na mesto, upotrebom Quickchange II kompleta za mutagenezu (Stratagene).
AXL kontrolna antitela
[0363] U pojedinim od Primera, za poređenje je upotrebljavano anti-AXL antitelo (IgG1- YW327.6S2) koje je prethodno opisano (EP 2220131, U3 Pharma; WO 2011/159980, Genentech). VH i VL sekvence za ova antitela specifična za AXL su klonirane u ekspresione vektore pGlf i pKappa.
Antitelo b12
[0364] U pojedinim od primera, kao negativna kontrola je upotrebljeno antitelo b12, antitelo specifično za gp120 (Barbas, 1993).
Ekspresija
[0365] Antitela su eksprimirana kao IgG1,κ. Smeše plazmidnih DNK koje kodiraju i teške i lake lance antitela su tranzijentno transfektovane u Freestyle HEK293F ćelije (Invitrogen, US), upotrebom 293fectin reagensa (Invitrogen, US), suštinski prema uputstvima proizvođača.
Prečišćavanje antitela
[0366] Supernatant kulture je profiltriran kroz 0,2 µm “dead-end” filtere, pa je nanet na MabSelect SuRe kolone od 5 mL (GE Health Care) koje su eluirane sa 0,1 M NaOH-natrijum citratom, pH 3. Eluat je odmah neutralisan sa 2M Tris-HCl, pH 9, pa podvrgnut dijalizi preko noći sa 12,6 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7,4 (B.Braun). Alternativno, nakon prečišćavanja, eluat je nanošen na HiPrep kolonu za desalinizaciju i antitelo je prebačeno u pufer sa 12,6 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7,4 (B.Braun). Nakon dijalize ili izmene pufera, uzorci su sterilno profiltrirani kroz 0,2 µm “dead-end” filtere. Čistoća je određena SDS-PAGE postupkom, a koncentracija IgG je izmerena upotrebom Octet-a (Fortebio, Menlo Park, SAD). Prečišćena antitela su čuvana na 4°C.
[0367] Antitelo IgG1-AXL-511 je generisano sledećim postupkom:
Ekspresioni konstrukti za AXL
[0368] Generisani su sledeći konstrukti optimizovanih kodona za ekspresiju različitih AXL varijanti pune dužine: humani (Homo sapiens) AXL (Genbank pristupni br. NP_068713.2), himerni AXL čoveka i cinomolgus majmuna u kome je humani vanćelijski domen (ECD) zamenjen sa ECD cinomolgus majmuna (Macaca fascicularis) (translacijom sekvence sa Genbank pristupnim br. HB387229.1; ak 1-447), himerni AXL čoveka i miša u kome je humani ECD zamenjen sa ECD mišjeg (Mus musculus) AXL-a (Genbank pristupni NP_033491.2; ak 1-441), himerni AXL čoveka i muša u kome je humani domen sličan Ig domenu tipa I (ak 1-134, takođe ovde označen kao " Ig1 domen") zamenjen domenom I sličnim Ig domenu mišjeg AXL-a, himerni AXL čoveka i miša u kome je humani domen sličan Ig domenu tipa II (ak 148-194, ovde takođe označen kao „Ig2 domen“) zamenjen domenom sličnim Ig domenu tipa II mišjeg AXL-a, himerni AXL čoveka i miša u kome je humani domen sličan FNIII domenu tipa I (ak 227-329, ovde takođe označen kao "FN1 domen") zamenjen domenom sličnim FNIII domenu tipa I mišjeg AXL-a, himerni AXL čoveka i miša u kome je humani domen sličan FNIII domenu tipa II (ak 340-444, ovde takođe označen kao „domen FN2“) zamenjen domenom sličnim FNIII domenu tipa II mišjeg AXL-a. Dodatno, generisani su sledeći konstrukti optimizovanih kodona za razne AXL ECD varijante: vanćelijski domen (ECD) humanog AXL-a (ak 1-447) sa C-terminalom His oznakom (AXLECDHis), domen sličan FNIII domenu tipa II humanog AXL-a (ak 327-447) sa N-terminalnim signalnim peptidom i C-terminalom His oznakom (AXL-FN2ECDHis), kao i domeni slični Ig1 I Ig2 domenima humanog AXL-a (ak 1-227) sa C- terminalom His oznakom (AXL-Ig12ECDHis).
[0369] Konstrukti su sadržavali pogodna restrikciona mesta za kloniranje i optimalnu Kozak sekvencu (GCCGCCACC) (Kozak i saradnici (1999) Gene 234: 187-208). Konstrukti su klonirani u sisarski ekspresioni vektor pcDNA3.3 (Invitrogen).
Ekspresija AXL u EL4 ćelijama
[0370] EL4 ćelije su bile stabilno transfektovane sa pcDNA3.3 vektorom koji je sadržavao kodirajuću sekvencu humanog AXL-a pune dužine, a nakon selekcije sa antibiotskim agensom, G418 (Geneticin), izabrani su stabilni klonovi.
Prečišćavanje His-obeleženog AXL-a
[0371] AXLECDHis, AXL-FN2ECDHis i AXL-Ig12ECDHis su eksprimirani u HEK-293F ćelijama, pa su prečišćeni afinitetnom hromatografijom sa imobilizovanim metalnim jonima.
Imunizacija
[0372] Za odabir antitela je upotrebljen materijal iz 4 transgena miša koji su eksprimirali genske sekvence humanih antitela. Miševi su imunizovani upotrebom raznih protokola imunizacije, pa su odabrani oni sa raznim odgovorima antitela i koji su proizvodili razne brojeve antitela u okviru tradicionalnih hibridoma postupaka. Miš A (uspešnost hibridoma postupka od 3,5%) je bio HCo17-BALB/c transgeni miš (Bristol-Myers Squibb, Redwood Cyti, CA, SAD) koji je naizmenično imunizovan intraperitonealno (IP) sa 20 µg AXL-FN2ECDHIS i sa 20 µg AXL-Ig12ECDH, pa subkutano (SC) (u osnovu repa) sa istim proteinom, u intervalu od 14 dana. Ukupno je izvršeno 8 imunizacija: 4 IP i 4 SC. Prilikom većine imunizacija, prva imunizacija je rađena sa kompletnim Frojndovim adjuvansom (CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, SAD), dok su sve naredne imunizacije rađene u nekompletnom Freundsovom adjuvansu (IFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, SAD). Miš B (uspešnost hibridoma postupka od 0%) je bio HCo12 transgeni miš (Medarex) imunizovan sa 20 µg AXLECDHis proteina, upotrebom sličnog protokola imunizacije kao i kod miša A. Miš C (uspešnost hibridoma postupka od 38%) je bio HCo12-BALB/c miš imunizovan naizmenično, najpre intraperitonealno (IP) sa EL4 ćelijama koje su bile transfektovane sa humanim AXL-om pune dužine u PBS-u, a potom i subkutano (SC; u osnovu repa) sa AXLECDHis proteinom u IFA, u intervalu od 14 dana. Miš D (uspešnost hibridoma postupka od 0%) je bio HCo12 transgeni miš (Medarex) imunizovan sa 20 µg AXL-Ig12ECDHis proteina, upotrebom sličnog protokola imunizacije kao i kod miša A.
[0373] Miševima sa najmanje dva uzastopna titra antitela specifičnog za AXL sa vrednošću od 200 (razblaženje seruma 1/200) ili više, primenjena je bust doza, 3-4 dana pre fuzije (10 µg proteina izvedenog iz AXL-a je injecirano intravenski, u PBS-u).
Izolacija RNK iz ćelija slezine
[0374] Ukupna RNK je izolovana iz ćelija slezine upotrebom Mini RNK easy kompleta (Qiagen). Prvi lanac cDNK za 5'-RACE je sintetisan upotrebom 150 ng RNK i SMART RACE kompleta za amplifikaciju cDNK (Clontech, Mountain View, CA, SAD), PrimeScript kompleta za reverznu transkripciju (Clontech) i SMART IIA oligo i oligodT kao prajmera. VL kodirujući regioni su amplifikovani PCR postupkom, upotrebom Advantage 2 polimeraze (Clontech), RACEkLIC4ortFW2 (320 nM), RACEkLIC4LongFW2 (80 nM) i RACEkLICRV_PmIA3 prajmera (400 nM), tokom 35 ciklusa od 30 sekundi na 95°C i 1 minut na 68°C. VH kodirujući regioni su amplifikovani PCR postupkom, upotrebom Pfu Ultra II Fusion HS DNK polimeraze (Stratagene), prajmera RACEG1LIC3shortFW (320 nM), RACEG1LIC3longFW (80 nM) i RACEG1LIC3RV2 (400 nM), tokom 40 ciklusa od 20 sekundi na 95°C, 20 sekundi na 66°C i 30 sekundi na 72°C, sa završnim korakom ekstenzije od 3 minuta na 72°C. VH ili VL kodirajući PCR proizvodi su razdvojeni upotrebom agarozne gel elektroforeze, a DNK proizvodi očekivane veličine su izolovani iz gela i prečišćeni upotrebom Qiagen MiniElute kompleta. VH i VL kodirajući regioni koji su amplifikovani PCR-om su klonirani, sa otvorenim okvirom čitanja, u pGlf sisarske ekspresione vektore (koji su sadržavali DNK sekvencu koja kodira konstantni region humanog IgG1 ) za region VH, i pKappa (koji je sadržavao DNK sekvencu koja kodira konstantni region kapa lakog lanca) za region VL, kloniranjem nezavisnim od ligacije (Aslanidis, C. and P. J. de Jong, Nucleic Acids Res 1990; 18 (20): 6069-74) u DH5αT1R soju E.coli (Life technologies), čime su dobijene pojedinačne bakterijske kolonije od kojih je svaka sadržavala po jedan HC ili LC ekspresioni vektor.
Sekvence prajmera
[0375]
LEE PCR
[0376] Elementi linearne ekspresije (LEE) dobijeni su amplifikacijom fragmenta koji su sadržavali CMV promotor, HC ili LC kodirajuće regione i poli A signal koji je sadržavao elemente iz ekspresionih plazmida. Za navedeno su regioni amplifikovani upotrebom Accuprime Taq DNK polimeraze (Life Technologies) i CMVPf(Bsal)2 i TkpA (Bsal)r prajmera, tokom 35 ciklusa od 45 sekundi na 94°C, 30 sekundi na 55°C i 2 (LC) ili 3 (HC) minuta na 68°C, upotrebom materijala iz kolonija E.coli (soj DH5α) koje su sadržavale plazmide, kao DNK matrice.
Tranzijentna ekspresija u HEK-293ćelijama
[0377] Antitela su eksprimirana kao IgG1,κ. Smeše plazmidne DNK koje su kodirale oba, i teške i lake lance antitela, tranzijentno su transfektovane u Freestyle 293-F ćelije (HEK293F) (Life Technologies, SAD) upotrebom 293fectin reagensa (Life Technologies), suštinski kao što je opisano u Vink T. i saradnici (2014) ('A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies', Methods, 65(1), 5-10).
[0378] Za LEE ekspresiju Abs je pomešano: 1 µl HC LEE PCR reakcione smeše, 1 µl LC PCR reakcione smeše i 1 µl smeše za pojačavanje od 30 ng/µl koja je sadržavala mešavinu 3 plazmida za pojačavanje ekspresije, kao što je opisano u Vink, T. i saradnici (2014), nakon čega je smeša transfektovana u HEK293F ćelije u ukupnoj zapremini od 100 µl upotrebom 293 fektina kao reagensa za transfekciju, prema uputstvima proizvođača (Life Technologies), upotrebom mikrotitar ploča sa 96 mesta kao posude, u osnovi kao što je prethodno opisano.
AXLECDHis ELISA
[0379] ELISA ploče (Greiner, Holandija) su obložene sa 0,5 µg/mL AXLECDHis u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom (PBS), u zapremini od 100 µl/bunaru, nakon čega su inkubirane 16 sati na sobnoj temperaturi (RT). Rastvor za oblaganje je potom uklonjen i bunarići su blokirani dodavanjem po 150 µl PBSTC (PBS-a koji je sadržao 0,1% tween-20 i 2% serum pileta), pa inkubirani tokom 1 sata na RT. Ploče su dalje isprane tri puta sa po 300 µl PBST (PBS koji je sadržao 0,1% tween-20)/bunaru i dodato je po 100 µl ispitivanog rastvora, nakon čega je sledila inkubacija tokom 1 sata na RT. Ploče su zatim isprane tri puta sa po 300 µl PBST/bunariću, pa je dodato po 100 µl kozjeg anti-humanog IgG antitela kuplovanog sa peroksidazom rena (razblaženje 1/3000) i ploče su inkubirane tokom 1 sata na RT. Nakon tri ispiranja sa po 300 µl PBST/bunaru, dodato je dalje po 100 µl ABTS rastvora (1 mg/mL) i ploče su inkubirane na RT sve dok nije uočen signal dovoljnog intenziteta, nakon čega je reakcija zaustavlјena dodavanjem 100 µl 2% rastvora oksalne kiseline. Ploče sa 96-mesta su očitane upotrebom ELISA čitača, na 405 nm.
Studija raznovrsnosti
[0380] Analizirano je vezivanje antitela iz uzoraka za TH1021-hAXL (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale humani AXL), TH1021-cAXL (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale himerni humani i AXL cinomolgus majmuna u kome je humani ECD AXL-a bio zamenjen sa ECD cinomolgus majmuna), TH1021-mAXL (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale himerni AXL između čoveka i miša u kome je humani ECD zamenjen ECD-om iz AXL-a miša), TH1021-mlg1 (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale humani AXL u kome je domen sličan Ig domenu tipa I zamenjen sa domenom sličnim Ig domenu tipa I iz mišjeg AXL-a), TH1021-mlg2 (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale humani AXL sa domenom sličnim Ig domenu tipa II koji je bio zamenjen domenom sličnim Ig domenu tipa II mišjeg AXL-a), TH1021-mFN1 (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale humani AXL u kome je domen sličan FNIII domenu tipa I zamenjen sa domenom sličnim FNIII domenu tipa I mišjeg AXL-a), TH1021-mFN2 (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale humani AXL u kome je domen sličan FNIII domenu tipa II zamenjen sa domenom sličnim FNIII domenu tipa II mišjeg AXL-a) i HEK293 ćelije divlјeg tipa (negativna kontrola koja ne eksprimira AXL), tim redom.
[0381] Uzorci iz LEE ekspresije su dodati ćelijama kako bi se omogućilo vezivanje za razne AXL konstrukte. Nakon toga, detektovano je vezivanje antitela upotrebom fluorescentnog konjugata (kozji anti-humani IgG Fc gama-DyLight649; Jackson ImmunoResearch). Uzorci su skenirani upotrebom sistema za detekciju ćelija Applied Biosistems 8200 (8200 CDS) i očitana je srednja vrednost intenziteta fluorescencije. Uzorci su smatrani pozitivnim kada su očitavanja bila veća od 50, i kada su “očitavanje x fluorescenca” bili najmanje tri puta veći u odnosu na negativnu kontrolu.
Obezbeđivanje HC i LC smeša:
[0382] Kod svakog miša je odabrano po 352 bakterijske kolonije koje su sadržavale HC ekspresioni vektor, kao i po 384 bakterijske kolonije koje su sadržavale LC ekspresioni vektor, pa su kolonije amlifikovane LEE PCR postupkom. Deo LEE reakcije je sekvenciran (AGOWA). Procenat konstrukata koji su sadržavali pravilan VH insert se u velikoj meri razlikovao između 4 miša, miša A (50%), miša B (23%), miša C (90%) i miša D (14%), i odgovarao je uspešnosti dobijenoj u procesu obrazovanja hibridoma, pogledati iznad. Raznovrsnost HC kod miševa je bila ograničena na samo malu količinu pravilih inserata, uz dominaciju velike grupe identičnih HC, 65/83 kod miša B i 46/49 kod miša D. Za miša B i D su izabrani jedinstveni HC (9 za miša B, 4 za miša D). Za miševe A i C nije napravljen odabir.
Kotransfekcija HC sa smešom LC
[0383] Pojedinačni HC koji kodira LEE je kontransfektovan sa smešom od 96 LC koji kodiraju LEE, upotrebom protokola za LEE transfekciju.
Selekcija HC iz antitela koja vezuju AXL
[0384] Kod miševa B i D, u supernatantima iz LEE kotransfekcija za pojedinačni HC sa smešom LC sekvenci, urađena je analiza vezivanja proizvedenih smeša antitela za AXL, upotrebom AXL ELISA postupka. Vezivanje za AXL je pokazano za 7 od 9 HC iz miša B i za 4 od 4 HC iz miša D.
[0385] Kod miševa A i C, u supernatantima iz LEE kotransfekcija za pojedinačni HC sa smešom LC sekvenci, urađena je analiza vezivanja proizvedenih smeša antitela za AXL, upotrebom studije skrininga raznovrsnosti. Ovakav skrining je omogućio i identifikaciju HC koji se vezuju za AXL, kao i grubo mapiranje epitopa, identifikacijom gubitka sposobnosti vezivanja antitela za AXL varijante. Kod miša A, približno 40% HC je bilo vezano za humani AXL, od kojih je većina izgubila sposobnost vezivanja bilo za Ig1 ili FNIII-2 domen kada su ovi domeni bili zamenjeni mišjim ekvivalentom. Kod miša C, približno 70% HC je bilo vezano za humani AXL, od kojih je većina izgubila sposobnost vezivanja bilo za Ig1 ili Ig2 domen kada su ovi domeni bili zamenjeni mišjim ekvivalentom. Na osnovu vezivanja utvrđenog sa AXL ELISA postupkom ili skriningom diverziteta, kao i na osnovu informacija o HC sekvencama i gubitku sposobnosti vezivanja za specifične domene AXL-a u skriningu diverziteta, izabrano je ukupno 12 jedinstvenih HC za određivanje najbolјeg LC.
Kotransfekcija HC sa pojedinačnim LC
[0386] Svaki pojedinačni HC LEE od 12 odabranih jedinstvenih HC, kotransfektovan je sa 96 pojedinačnih LC LEE iz LC smeše odgovarajućih miševa.
Selekcija LC iz antitela koja vezuju AXL
[0387] Upotrebom AXL ELISA postupka, analizirano je vezivanje sintetisanih antitela za AXL u supernatantima iz LEE ekspresija pojedinačnih HC/LC kombinacija. Na osnovu i rezultata ELISA i informacija o LC sekvenci, za svaki HC je pronađeno najmanje 6 LC i jedan je odabran kao najbolјi.
Antitela koja vezuju AXL su identifikovana kod sva 4 miša, čak i kod miševa koji nisu bili uspešni u hibridoma procesu.
Afinitet vezivanja antitela 511
[0388] Određen je afinitet jednog anti-AXL antitela (klona 511).
[0389] Afinitet je određen upotrebom Interferometrije Bio-sloja na ForteBio OctetRED384. Na Capture biosenzore sa anti-humanim Fc (AHC) (ForteBio, Portsmouth, Velika Britanija; kat. br.18-5064) je nanet hlgG (1 µg/mL) tokom 150 s, sa cilјem da se obezbedi odgovor od 1 nm. Nakon bazalne vrednosti (150 s), određivane su asocijacija (1000 s) i disocijacija (2000 s) AXLECDHis-a (kao što je opisano u Primeru 1), upotrebom raspona koncentracija od 10 µg/mL - 0,16 µg/mL (218 nM - 3 nM), kao i dvostrukih razblaženja. Za proračune je upotrebljena teorijska molekulska masa AXLECDHis-a dobijena na osnovu sekvence aminokiselina, tj.46 kDa. Eksperimenti su rađeni na OctetRED384 uređaju, uz mućkanje pri brzini od 1000 obrtaja/min i na 30°C. Svako antitelo je testirano u tri nezavisna eksperimenta.
[0390] Podaci su analizirani upotrebom programa ForteBio Data Analysis v7.0.3.1 i modela 1:1, kao i potpunog globalnog preklapanja sa vremenima asocijacije i disocijacije od po 1000 s, ukoliko nije drugačije navedeno. Upotrebljavano je vreme disocijacije od 1000 s (umesto vremena disocijacije od 2000 s koje je snimljeno), pošto je ono dovelo do boljeg uklapanja. Podaci su korigovani oduzimanjem referentne krive (antitela bez AXLECDHis), a Y-osa je usklađena sa poslednjih 5 s osnovnog merenja i primenom korekcije međukoraka, kao i Savitzky-Golay filtera.
[0391] Afinitet (KD) klona 511 za AXL je iznosio 23<∗>10<-9>M (kon1.7<∗>10<5>1/Ms i kdisod 3.9<∗>10<-3>1/s).
Sinteza duostatina-3.
Priprema jedinjenja 3:
[0392]
[0393] Rastvoru Boc-L-fenilalanina 1 (5,36 g; 20,2 mmol) u 30 mL metilen hlorida (DCM), dodat je karbonildiimidazol (CDI; 4,26 g; 26,3 mmol) i rastvor je mešan tokom 1 sata. Zatim su dodati rastvor 2 (3,67 g; 30,3 mmol) i 2,4-diaminobuterna kiselina (DBU, 4,5 mL, 30 mmol) u 15 mL DCM-a. Smeša je grejana na 40°C tokom 16 sati. Smeša je zatim razblažena sa 60 mL DCM-a i 40 mL vode, pa je neutralisana do pH 7 sa koncentrovanom HCl.
[0394] DCM ekstrakt je prikuplјen, ispran sa 0,2M HCl (60 mL), a zatim i sa zasićenim rastvorom soli (60 mL), nakon čega je osušen upotrebom Na2S04 i uparen da bi se dobilo 7,47 g sulfonamida zaštićenog sa Boc. Ovaj materijal je resuspendovan u 40 mL metanola, pa je dodato 200 mL 6N HCl/izopropanola i smeša je mešana tokom 2 sata. Rastvarač je uparen pod vakuumom, a zatim je
1
dodato 100 mL etra. Precipitat je prikuplјen filtriranjem, pa je osušen da bi se dobilo jedinjenje 3 kao HCI so (5,93 g; 96%); MS m/z 269,1 (M+H).
Priprema jedinjenja 5:
[0395]
[0396] Rastvoru jedinjenja 4 (1,09 g; 1,6 mmol) u 10 mL N N,N-dimetilformamida (DMF) su dodati 2-(IH-7-azabenzotriazol-1-il)-I,I,3,3-tetrametil uranijum heksafluorofosfat (HATU; 0,61 g; 1,6 mmol), diizopropiletilamin (DIEA, 0,56 mL) i jedinjenje 3 (0,49 g; 1,6 mmol), tim redosledom. Smeša je zatim mešana tokom 1 sata, pa razblažena sa 100 mL vode i 4 mL sirćetne kiseline. Talog je prikuplјen filtriranjem, osušen pod vakuumom, pa dodat u 10 mL 4M HCl/dioksana. Nakon 30 min, dodato je 200 mL etra i nerastvorlјiv precipitat je prikuplјen i prečišćen HPLC postupkom da bi se dobilo jedinjenje 5 u vidu tetrahidrofuranske soli (TFA, 1,3 g; 88%); MS m/z 835,5 (M+H). Jedinjenje 5 se u tekstu odnosi na duostatin-3.
Priprema jedinjenja 7:
[0397]
[0398] Rastvoru jedinjenja 5 (500 mg, 0,527 mmol) u 5 mL DMF-a, dodati su jedinjenje 6 (483 mg; 0,631 mmol), N-hidroksibenzotriazol (HOBt; 40 mg; 0,296 mmol) i DIEA (0,27 mL). Smeša je mešana tokom 16 sati, pa je dodato 0,4 mL piperidina. Nakon 1 sata, smeša je razblažena sa 100 mL etra i precipitat je prikuplјen i osušen da bi se dobilo jedinjenje 7 kao HCI so (640 mg, 95%); MS m/z 1240,7 (M+H).
Priprema jedinjenja 9:
[0399]
2
[0400] Rastvoru jedinjenja 8 (219 mg; 0,62 mmol) u 5 mL DMF-a su dodati HATU (236 mg; 0,62 mmol), DIEA (0,15 mL) i jedinjenje 7 (316 mg; 1,6 mmol), tim redom. Nakon jednog sata, dodato je 0,2 mL piperidina i smeša je mešana tokom 30 min, a zatim je prečišćena HPLC postupkom da bi se dobilo jedinjenje 9 kao TFA so (235 mg; 64%); MS m/z 1353,8 (M+H).
Priprema jedinjenja 11:
[0401]
[0402] Rastvoru jedinjenja 9 (235 mg, 0,16 mmol) u 2 mL metanola i 1 mL vode, dodati su rastvor dialdehida 10 (1,6 mL 0,3 M u iPrOH) i NaCNBH3 (180 mg; 2,85 mmol). Smeša je mešana tokom 2 sata na RT, a zatim je prečišćena HPLC postupko da bi se dobilo jedinjenja 11 u vidu TFA soli (126 mg, 50%); MS m/z 1465,8 (M+H)
Generisanje konjugata antitela specifičnog za AXL i leka (ADC).
[0403] Prečišćena AXL antitela IgG1-AXL-148, IgG1-AXL-183 i IgG1-AXL-726, kao i negativno kontrolno antitelo IgG1-b12, konjugovana su sa Duostatin-3 kompanije Concortis Biosystems, Inc. (San Diego, CA), kovalentnom konjugacijom i upotrebom K-lock AV1-valin-citrulinskog (vc) linkera (WO 2013/173391, WO 2013/173392 i WO 2013/173393, Concortis Biosystems)].
[0404] Konjugatima anti-AXL antitela i leka su dalje analizirani: koncentracija (apsorbancijom na 280 nm); odnos lek:antitelo (DAR), hromatografijom reverzne faze (RP-HPLC) i hromatografijom hidrofobne interakcije (HIC); količina nekonjugovanog leka (hromatografijom reverzne faze); procenat agregacije (hromatografijom isklјučenja po veličini, SEC-HPLC) i nivoi endotoksina (upotrebom LAL). Rezultati su bili sledeći (Tabela 5):
Tabela 5
Primer 2 - Karakteristike vezivanja AXL antitela
Afinitet vezivanja AXL antitela
[0405] Određeni su afiniteti vezivanja panela od 9 anti-AXL antitela, kao i 3 varijante ovih antitela sa pojedinačnim mutacijama aminokiselina u varijabilnim domenima (IgG1-AXL-154-M103L, IgG1-AXL-183-N52Q, IgG1-AXL-726 -M101L).
[0406] Afinitet je određen upotrebom Interferometrije Bio-sloja na ForteBio OctetRED384. Na Capture biosenzore sa anti-humanim Fc (AHC) (ForteBio, Portsmouth, Velika Britanija; kat. br.18-5064) je nanet hlgG (1 µg/mL) tokom 150 s, sa cilјem da se obezbedi odgovor od 1 nm. Nakon bazalne vrednosti (150 s), određivane su asocijacija (1000 s) i disocijacija (2000 s) AXLECDHis-a (kao što je opisano u Primeru 1), upotrebom raspona koncentracija od 10 µg/mL - 0,16 µg/mL (218 nM - 3 nM), kao i dvostrukih razblaženja. Za proračune je upotrebljena teorijska molekulska masa AXLECDHis-a dobijena na osnovu sekvence aminokiselina, tj.46 kDa. Eksperimenti su rađeni na OctetRED384 uređaju, uz mućkanje pri brzini od 1000 obrtaja/min i na 30°C. Svako antitelo je testirano u tri nezavisna eksperimenta.
[0407] Podaci su analizirani upotrebom programa ForteBio Data Analysis v7.0.3.1 i modela 1:1, kao i potpunog globalnog preklapanja sa vremenima asocijacije i disocijacije od po 1000 s, ukoliko nije drugačije navedeno. Upotrebljavano je vreme disocijacije od 1000 s (umesto vremena disocijacije od 2000 s koje je snimljeno), pošto je ono dovelo do boljeg uklapanja. Za antitela IgG1-AXL-154 i IgG1-AXL-154-M103L je upotrebljeno vreme disocijacije od 500 s. Za IgG1-AXL-012 i IgG1-AXL-094 su upotrebljena vremena disocijacije od 200 s. Podaci su korigovani oduzimanjem referentne krive (antitela bez AXLECDHis), a Y-osa je usklađena sa poslednjih 5 s osnovnog merenja i primenom korekcije međukoraka, kao i Savitzky-Golay filtera.
[0408] Afiniteti (KD) anti-AXL antitela su bili opsega od 0.3<∗>10<-9>M do 63<∗>10<-9>M (Tabela 6). Za mutiran IgG1-AXL-183-N52Q,, KDje bio niži nego za IgG1-AXL-183 divljeg tipa, zbog približno 2,5 puta veće stope disocijacije. Dobijena kinetika druga dva mutanta je bila slična kinetikama za IgG-a divlјeg tipa.
Tabela 6
4
Vezivanje AXL antitela za AXL čoveka, miša i cinomolgus majmuna
[0409] HEK293T ćelije su bile tranzijentno transfektovane sa ekspresionim konstruktima za humani AXL pune dužine, humani AXL sa vanćelijskim domenom cinomolgus majmuna (ECD) ili humani AXL sa mišjim ECD (pogledati Primer 1). Vezivanje HuMab-AXL antitela za ove ćelije je procenjeno upotrebom protočne citometrije. Transfektovane ćelije HEK293 su inkubirane tokom 30 minuta na 4°C, u prisustvu serijskih razblaženja AXL antitela (opseg finalne koncentracije od 0,0024-10 µg/mL). Nakon tri ispiranja sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom, ćelije su inkubirane sa kozjim anti-humanim IgG F(ab')2 konjugovanim sa R-fikoeritrinom (PE) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA; kat. br.109-116-098) koje je bilo razblaženo u odnosu 1/100 u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu (finalna zapremina 100 µL). Ćelije su zatim isprane dva puta sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom, resuspendovane u 120 µL PBS/0,1% BSA/0,02% azida i analizirane na FACS CantoII uređaju (BD Biosciences).
[0410] Krive vezivanja su analizirane postupkom nelinearne regresije (sigmoidnom dozno-zavisnom krivom sa promenjivim nagibom) upotrebom GraphPad Prism V5.04 kompjuterskog programa (GraphPad Software, San Diego, CA, SAD).
[0411] Slika 1A prikazuje da su HuMab-AXL antitela pokazala dozno-zavisno vezivanje za HEK293 ćelije koje su eksprimirale humani AXL-ECD. Pored toga, HuMab-AXL antitela su prepoznala AXL sa ECD-om cinomolgus majmuna, sa vrednošću EC50istog raspona kao i za potpuni humani AXL (Slika 1B). Nasuprot tome, vezivanje HuMabs za AXL sa mišjim ECD-om je bilo nisko (IgG1-AXL-107, IgG1-AXL-154, IgG1-AXL-154-M103L, IgG1-AXL-733, IgG1-AXL-183, IgG1-AXL-183-N52Q) ili se nije moglo detektovati (IgG1-AXL-171, IgG1-AXL-613, IgG1-AXL-726, IgG1-AXL-726-M101L, IgG1-AXL-148; Slika 1C). Kao što je bilo očekivano, IgG1-b12 antitelo, kao negativna kontrola, nije ispoljilo vezivanje za ćelije koje su eksprimirale bilo koju od varijanti AXL-a (Slika 1). Tabela 7 prikazuje vrednosti EC50 i standardne devijacije za vezivanje anti-AXL antitela za humani AXL ili za humani AXL sa ECD-om iz AXL-a cinomolgus majmuna (određivano u najmanje 3 eksperimenta). EC50 vrednosti vezivanja za humani AXL sa ECD-om iz AXL-a miša nije bilo moguće odrediti zbog veoma niskog ili odsustva vezivanja.
Tabela 7
Kompeticija između AXL antitela i Gas6 u vezivanju za AXL
[0412] Ispitano je i da li je AXL ligand Gas6 ometao vezivanje AXL antitela za AXL. Stoga su AXL-pozitivne A431 ćelije inkubirane 15 minuta na 4°C sa 10 µg/mL rekombinantnog humanog Gas6 (R&D Systems, Abingdon, Velika Britanija; kat. br. 885-GS). Nakon toga, pripremlјena su serijska razblaženja AXL antitela (finalnih koncentracija opsega 0,014-10 µg/mL), pa su dodata ćelijama i inkubirana tokom 30 minuta na 4°C. Nakon tri ispiranja sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom, ćelije su inkubirane u mraku sa 100 µL sekundarnih antitela na 4°C, tokom 30 minuta. Kao sekundarno antitelo je korišćen kozji antihumani IgG F(ab')2 konjugovan sa R-fikoeritrinom (PE) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA; kat. br.109-116-098), razblažen u odnosu 1/100 u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu. Ćelije su potom isprane dva puta sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom, resuspendovane u 120 µL PBS/0,1% BSA/0,02% azida i analizirane na FACS CantoII uređaju (BD Biosciences).
[0413] Alternativno, da bi se procenilo da li se AXL ligand Gas6 i dalјe može vezivati u prisustvu AXL antitela, A431 ćelije su prethodno inkubirane sa 10 µg/mL AXL antitela (15 minuta, 4°C). Nakon ove prethodne inkubacije antitela, ćelijama su dodata serijska razblaženja rekombinantnog humanog Gas6 (R&D Systems, Abingdon, Velika Britanija; kat. br. 885-GS) u finalnim koncentracijama od 0,001-20 µg/mL, pa su ćelije inkubirane tokom 30 minuta na 4°C . Nakon tri ispiranja sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom, ćelije su dalje inkubirane sa mišjim anti-Gas6 IgG2a (R&D Systems; kat. br. MAB885) na 4°C tokom 30 minuta. Nakon tri ispiranja sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom, ćelije su inkubirane u mraku sa kozjim anti-mišjim IgG obeleženim FITC-om (Dako, Heverlee, Belgium; kat. br. F049702) na 4°C tokom 30 minuta. Konačno, ćelije su isprane dva puta sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom, resuspendovane u 120 µL PBS/0,1% BSA/0,02% azida i analizirane na FACS CantoII uređaju (BD Biosciences).
[0414] Krive vezivanja su analizirane postupkom nelinearne regresije (sigmoidnom dozno-zavisnom krivom sa promenjivim nagibom) upotrebom GraphPad Prism V5.04 kompjuterskog programa (GraphPad Software, San Diego, CA, SAD).
[0415] U eksperimentima (n=3) u kojima su A431 ćelije prethodno inkubirane sa Gas6, maksimalne vrednosti vezivanja anti-AXL antitela su bile uporedive sa vezivanjem antitela u odsustvu Gas6 (maksimalno vezivanje nakon preinkubacije sa Gas6 je bilo 90-108% u odnosu na vezivanja bez prethodne inkubacije sa Gas6) (Tabela 7). EC50vrednosti za vezivanje AXL antitela sa ili u odsustvu prethodne inkubacije sa Gas6 su bile istog opsega, ili donekle pojačane nakon prethodne inkubacije sa Gas6 (Tabela 8).
[0416] Vezivanje kontrolnog AXL antitela YW327.6S2 za A431 ćelije je bilo značajno smanjeno u prisustvu Gas6 u poređenju sa vezivanjem bez Gas6. Maksimalno vezivanje YW327.6S2 u prisustvu Gas6 je iznosilo 19% od vezivanja bez prisustva Gas6, a EC50 vrednost vezivanja za A431 ćelije je bila 21 puta veća kada su ćelije bile prethodno inkubirane sa Gas6.
[0417] U eksperimentima u kojima su A431 ćelije bile prethodno inkubirane sa anti-AXL antitelama procenjivano je vezivanje sa Gas6 (n = 3). Vezivanje Gas6 za A431 ćelije je bilo slično onom sa ili bez prethodne inkubacije sa HuMab-AXL antitelom. Prosečne EC50 koncentracije vezivanja Gas6 kada su ćelije prethodno inkubirane sa HuMabs-om (0,34-0,83 µg/mL) i maksimalna vezanja su bila slična vezivanju za Gas6 u prisustvu kontrolnog negativnog antitela b12 (EC50 koncentracija: 0,40 µg/mL; 95-115% vezivanja Gas6 u prisustvu kontrolnog antitela b12). Vezivanje Gas6 za A431 ćelije je značajno smanjeno u prisustvu kontrolnog AXL antitela YW327.6S2 u poređenju sa vezivanjem prilikom prethodne inkubacije sa b12 (EC50 koncentracija je bila 14-puta veća). Maksimalno vezivanje Gas6 u prisustvu kontrolnog antitela YW327.6S2 je iznosilo 17% u odnosu na vezivanje u prisustvu kontrolnog negativnog antitela b12.
Tabela 8
Primer 3 – Studije mapiranja epitopa panela anti-AXL antitela
Određivanje specifičnosti AXL domena upotrebom himernih AXL molekula čoveka i miša
[0418] Specifičnost AXL domena AXL antitela je određena upotrebom panela himernih AXL mutanata čoveka i miša. Generisano je pet različitih himernih AXL molekula, u kojima su humani domen I sličan Ig (Ig1), domen II sličan Ig (Ig2), domen I sličan FNIII (FN1) ili domen II sličan FNIII (FN2), zamenjeni njihovim mišjim homolozima.
[0419] Generisani su sledeći konstrukti optimizovanih kodona za ekspresiju AXL himera čoveka i miša, koji su potom eksprimirani u HEK293F ćelijama kao što je opisano u Primeru 1:
Homo sapiens AXL - Mus musculus Ig1 domen (p33-AXL-mIg1): (SEQ ID NO:150)
Homo sapiens AXL - Mus musculus Ig2 domen (p33-AXL-mIg2): (SEQ ID NO:151)
Homo sapiens AXL - Mus musculus FN1 domen (p33-AXL-mFN1): (SEQ ID NO:152)
1
Homo sapiens AXL - Mus musculus FN2 domen (p33-AXL-mFN2): (SEQ ID NO:153)
[0420] Protočnom citometrijom je određivano vezivanje 1 µg/mL anti-AXL antitela za AXL himer čoveka i miša, kao što je opisano u Primeru 2. Kao IgG1 kontrolni izotip je bio uključen IgGl-b12.
[0421] Sva anti-AXL antitela je karakterisalo vezivanje za humani AXL (Slika 2A), dok je vezivanje bilo poništeno ili značajno redukovano kada je ECD humanog AXL-a bio zamenjen njegovim mišjim homologom (Slika 2B). Da bi se potvrdila ekspresija hsAXL-mmECD, uklјučeno je i unakrsno-reaktivno humano-mišje monoklonsko AXL antitelo YW327.6S2.
[0422] Anti-AXL antitela 107 i 613 su pokazala značajno smanjenje vezivanja za hsAXL-mmlg1 (Slika 2C), što ukazuje na prepoznavanje epitopa u Ig1 domenu AXL-a. Značajno redukovano vezivanje za hsAXL-mmlg2 su pokazali IgG1-AXL-148 i IgG1-AXL-171 (Slika 2D), što ukazuje na prepoznavanje epitopa u Ig2 domenu AXL-a. Smanjeno vezivanje za hsAXL-mmFN1 su pokazali IgG1-AXL-154, IgG1-AXL-183 i IgG1-AXL-733 (Slika 2E), što ukazuje na epitop vezivanja u FN1 domenu AXL-a. Konačno, vezivanje IgGl-AXL-726 je bilo izgublјeno kod hsAXL-mmFN2 (Slika 2F), što ukazuje na prepoznavanje epitopa unutar domena FN2.
[0423] Specifičnost AXL domena za sva anti-AXL antitela je sumarno prikazana u Tabeli 9.
Tabela 9
1 1
Mapiranje epitopa visoke rezolucije za identifikaciju aminokiselina u AXL vanćelijskom domenu uključenih u vezivanje za AXL antitela
[0424] Da bi se identifikovale aminokiseline u vanćelijskom domenu AXL-a koje su uklјučene u vezivanje anti-AXL antitela, biblioteka varijanti AXL sekvenci je generisana rekombinacijom AXL sekvenci izvedenih iz vrsta sa promenlјivim nivoom homologije sa sekvencom vanćelijskog domena humanog AXL-a. Ukratko, ekspresioni plazmid koji kodira humani AXL (Hs) je pomešan sa plazmidima za kloniranje koji kodiraju homologe AXL-a iz Mus musculus (Mm), Monodelphis domestica (Md; oposum), Anolis carolinensis (Ac; gušter) i Tetraodon nigroviridis (Tn; “pufferfish”), ili obrnuto. Kombinacija dva prajmera specifična bilo za klonirajući ili za ekspresioni vektor, korišćena je u postupku PCR amplifikacije vanćelijskog domena (ECD) AXL-a, sa skraćenim vremenom elongacije, pojačanim topljenjem i ponovnim spajanje nascentnih DNK lanaca replikacije tokom PCR ciklusa. ECD pune dužine je amplifikovan upotrebom “ugnježdenog” (engl. nested) PCR-a, specifičnog za proizvode rekombinacije koji sadrže krajeve koji potiču od oba vektora.
[0425] Dobijeni AXL ECD PCR proizvodi su klonirani u ekspresioni vektor stvarajući AXL pune dužine, a dobijeni plazmidi su sekvencirani, rangirani prema maksimalnoj razlici u odnosu na vektore koji su služili kao matrice, pa su odabrani oni sa sposobnošću da kreiraju minimalnu grupu sa maksimalnom sposobnošću diferencijacije. U HEK293-F ćelije, prema specifikacijama proizvođača (Life technologies), transfektovani su plazmidi koji kodiraju AXL homologe iz Hs, Mm, Md, Ac i Tn, četiri himerna plazmida između čoveka i miša koji kodiraju Hs AXL-a sa mišjim domenima Ig1, Ig2, Fn1 ili Fn2, i šesnaest najrazličitijih plazmida iz rekombinantne biblioteke. Podaci vezivanja dobijeni FACS analizama, upotrebom 1 µg/mL anti-AXL antitela, su razvrstani, pri čemu je bodovanje po aminokiselini bilo takvo da kada je mutacija prisutna ono iznosi (+1) ili (-1) kada nije u korelaciji sa gubitkom vezivanja, nakon čega je primenjena korekcija osnovne vrednosti i normalizacija u odnosu na skalu od -5 do 5, što je rezultovalo u skoru efekta po aminokiselini celokupnog ECD-a.
[0426] Podaci o razvrstanim podacima vezivanja su sumirani u Tabeli 9, u vidu aminokiselina koje su uklјučene u vezivanje. Antitela za koja nije bilo moguće mapirati mesto vezivanja sa visokom rezolucijom usled nedostatka rekombinacionih događaja u blizini tog mesta, označena su kao nerazrešena.
1 2
Primer 4 – Efektorske funkcije posredovane sa Fc
Citotoksičnost posredovana ćelijama i zavisna od antitela (ADCC)
[0427] Sposobnost anti-AXL antitela da indukuju ADCC u A431 ćelijama epidermoidnog karcinoma određivana je kao što je objašnjeno u dalјem tekstu. Kao efektorske ćelije su korišćene mononuklearne ćelije periferne iz krvi zdravih dobrovolјaca (UMC Utrecht, Holandija).
Obeležavanje cilјnih ćelija
[0428] A431 ćelije (5x10<6>ćelija) su prikupljene u medijumu za kulturu (medijum za kulturu RPMI 1640 koji je bio dopunjen sa 10% fetalnog seruma teleta (FSC)), kome je potom dodato 100 µCi<51>Cr (Chromium-51; Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, Holandija), nakon čega je smeša inkubirana u vodenom kupatilu na 37°C tokom sat vremena, uz treskanje. Nakon ispiranja ćelija (dva puta u PBS-u, 1200 rpm, 5 min), ćelije su resuspendovane u RPMI1640/10% FSC-a i prebrojane upotrebom tripan plave boje. Ćelije su razblažene do gustine od 1x10<5>ćelija/mL.
Priprema efektorskih ćelija
[0429] Mononuklearne ćelije periferne krvi (zdravi dobrovolјci, UMC Utrecht, Utrecht, The Holandija) su izolovane iz 45 mL sveže uzete heparinizovane krvi upotrebom Ficoll reagensa (Bio Whittaker; medijum za odvajanje limfocita, kat. br. 17-829E), prema uputstvima proizvođača. Nakon resuspendovanja ćelija u RPMI1640/10% FSC-a, ćelije su prebrojane upotrebom tripan plave boje i razblažene do gustine od 1x10<7>ćelija/mL.
Postavka za ADCC
[0430] U ploče sa 96-bunara je ispipetirano po 50 µl cilјnih ćelija obeleženih sa<51>Cr i u to je dodato 50 µl antitela, razblaženog u RPMI1640/10% FSC (trostuko razblaženje do finalnih koncentracija opsega 0,01-10 µg/mL). Ćelije su inkubirane na sobnoj temperaturi (RT), 15 min), pa je u njih dodato 50 µl efektorskih ćelija, što je rezultovalo odnosom efektorskih i cilјnih ćelija od 100:1 (za određivanje maksimalne lize, umesto efektorskih ćelija dodato je 100 µl 5% Triton-X100; za određivanje spontane lize je korišćeno 50 µL cilјnih ćelija i 100 µL RPMI1640/10% FSC). Ćelije su inkubirane preko noći na 37°C i u 5% CO2. Nakon obaranja ćelija centrifugiranjem (1200 rpm, 10 min), 70 µL supernatanta je prikuplјeno u mikrolitarske epruvete i prebrojano u gama brojaču. Procenat specifične lize je izračunat na sledeći način:
% specifične lize = (cpm uzorka – cpm samo ciljnih ćelija)/(cpm maks. lize - cpm samo ciljnih ćelija)
pri čemu cpm označava broj otkucaja u minuti.
[0431] IgG1-AXL-183-N52Q i IgG1-AXL-733 su indukovali ADCC od 15 do 21% u A431 ćelijama pri koncentraciji od 10 µg/mL (Slika 3). IgG1-AXL-148, IgG1-AXL-726-M101L, IgG1-AXL-171, IgG1-AXL-613, IgG1-AXL-107 i IgG1-AXL-154-M103L nisu indukovali značajnu ADCC u A431 ćelijama u koncentracijama do 10 µg/mL (Slika 3).
1
Primer 5 – Karakteristike vezivanja za konjugate AXL antitela i leka (AXL-ADC)
[0432] HEK293T ćelije su tranzijentno transfektovane sa konstruktima ekspresije za humani AXL pune dužine (pogledati Primer 1). Vezivanje anti-AXL antitela i AXL-ADC za ove ćelije je utvrđeno protočnom citometrijom. Tranzijentno transfektovane HEK293 ćelije su inkubirane tokom 30 minuta na 4°C sa serijskim razblaženjima anti-AXL antitela ili AXL-ADC (četvorostruka razblaženja; finalne koncentracije opsega 0,003-10 µg/mL). Nakon tri ispiranja sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom, ćelije su inkubirane u mraku u 100 µL sekundarnog antitela, na 4°C tokom 30 minuta. Kao sekundarno antitelo je korišćen kozji anti-humani IgG F(ab')2 konjugovan sa R-Fikoeritrinom (PE) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA; kat. br. 109-116-098), razblažen 1/100 u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu. Ćelije su potom isprane dva puta u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu, resuspendovane u 120 µL PBS/0,1% BSA/0,02% azida i analizirane upotrebom FACS Cantoll uređaja (BD Biosciences).
[0433] Krive vezivanja su analizirane nelinearnom regresijom (sigmoidna dozno-zavisna kriva sa promenlјivim nagibom) upotrebom GraphPad Prism V5.04 kompjuterskog programa (GraphPad Software, San Diego, CA, SAD).
[0434] Slika 4 pokazuje da je vezivanje anti-AXL antitela za HEK293 ćelije koje eksprimiraju humani AXL-ECD bilo slično vezanju za AXL-ADC-ove.
Primer 6 - In vitro citotoksičnost indukovana konjugatima antitela specifičnog za AXL i leka
[0435] LCLC-103H ćelije (humanog krupnoćelijskog kancera pluća) su gajene u kulturi, u RPMI 1640 medijumu sa L-glutaminom (Cambrex; kat. br. no. BE12-115F) dopunjenim sa 10% (vol/vol) toplotom inaktivisanim Cosmic serumom teleta (Perbio; kat. br. SH30087.03), 2 mM L-glutaminom (Cambrex; kat. br. US17-905C), kao i 50 IU/mL penicilina i 50 µg/mL streptomicina (Cambrex; kat. br. DE17-603E). MDA-MB-231 ćelije (humanog kancera dojke) su gajene u DMEM medijumu (Cambrex; kat. br. BE12-709F) sa dodatkom 10% (vol/vol) toplotom inaktivisanog Cosmic seruma teleta (Perbio; kat. br. SH30087.03), 1 mM natrijum piruvata (Cambrex; kat. br. BE13-115E), 2 mM L-glutamina (Cambrex; kat. br. US17-905C), 100 µM MEM NEAA (Invitrogen; kat. br. 11140), 50 IU/mL penicilina i 50 µg/mL streptomicina (Cambrex; kat. br. DE17-603E). Ćelijske linije su gajene na 37°C u vlažnom inkubatoru pri 5% (vol/vol) CO2. LCLC-103H i MDA-MB-231 ćelije su gajenje do postizanja skoro potpune konfluentnosti, nakon čega su bile tripsinizovane, resuspendovane u medijumu za kulturu i propuštene kroz ćelijski filter (BD Falcon, kat. br. 352340) da bi se dobila suspenzija pojedinačnih ćelija. U svaki bunar ploče za kulturu sa 96-mesta je zasejano 1x10<3>ćelija, pa su ćelije inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi, a potom i tokom 5 sati na 37°C, sa 5% CO2 da bi se omogućilo prijanjanje ćelija za ploču.
[0436] Serijska razblaženja (četvorostruka; finalne koncentracija opsega od 0,00015 do 10 µg/mL) konjugata AXL antitela i leka (AXL-ADC; pogledati Primer 1), pripremlјena su u medijumu za kulturu i dodata u bunariće ploče. Inkubacija ćelija sa 1 µM staurosporinom (#S6942-200, Sigma) je upotrebljena za dobijanje referentne vrednosti za smrtnost tumorskih ćelija od 100%. Netretirane ćelije su korišćene kao referentna vrednost za 0% smrtnosti tumorskih ćelija. Ploče su inkubirane 5 dana na 37°C, sa 5% CO2. Potom je u bunariće (20 µL po bunaru) dodat reagens CellTiter-Glo (Promega; kat. br. G7571) i ploče su inkubirane tokom 1,5 sata na 37°C, 5% CO2. Dalje je po 180 µL po bunaru prebačeno u bele ploče Optiplate™ sa 96-bunara (PerkinElmer, Waltham, MA; kat. br.6005299), koje su inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi. Konačno, izmerena je luminiscencija na EnVision čitaču za mikrotitar ploče (Envision, Perkin Elmer).
1 4
[0437] AXL-ADC tipa IgG1-AXL-148-vcDuo3, IgG1-AXL-183-vcDuo3 i IgG1-AXL-726-vcDuo3 su indukovali citotoksičnost u LCLC-103H ćelijama, sa IC50 vrednostima između 0,01 i 0,06 µg/mL, kao što je prikazano na Slici 5A. Slično tome, Slika 5B prikazuje da ovi AXL-ADC indukuju citoksičnost u MDA-MB-231 ćelijama sa IC50 vrednostima između 0,005 i 0,015 µg/mL.
Primer 7 - Varijante VH i VL regiona antitela koje omogućavaju vezivanje za AXL
[0438] Proteinske sekvence VH i VL regiona anti-AXL antitela iz panela (opisane u Primeru 1) su poravnate i upoređena je njihova sposobnost vezivanja za AXL kako bi se identifikovale kritične ili permisivne promene aminokiselinskih ostataka u VH ili VL regionima. Antitela sa identičnim VH ili VL regionima su stoga grupisana i njihovo vezivanje za humani AXL je upoređivano, pa su utvrđivane i razlike u VL ili VH sekvencama, tim redom. Vezivanje za tranzijentno eksprimirani humani AXL u HEK-293F ćelijama, je procenjivano skriningom specifičnim za homogene antigena, kao što je opisano u Primeru 1. U ovom primeru je urađeno numerisanje aminokiselinskih pozicija zarad poravnanja na osnovu sekvenci navedenih na Slici 6, tj. prva aminokiselina u prikazanom nizu je numerisana kao pozicija „1“, druga kao pozicija „2“ itd.
[0439] Najpre su grupisana antitela sa identičnim VL sekvencama.
[0440] Pokazano je da IgG1-AXL-148 i IgG1-AXL-140 imaju identičnu sekvencu VL regiona i da je prisutna jedna aminokiselinska razlika u HC CDR3 regionu (F je zamenjen sa I na aminokiselinskoj poziciji 109; Slika 6A). Oba antitela se vezuju za humani AXL (Tabela 10), što ukazuje da aminokiselina na poziciji 109 nije esencijalna za vezivanje antitela, pod pretpostavkom da mutacija identifikovana u CDR2 regionu (G zamenjen sa A aminokiselinskoj poziciji 56) ne kompenzuje gubitak sposobnosti vezivanja (Slika 6A).
[0441] Pokazano je i da IgG1-AXL-726 i IgG1-AXL-187 imaju identičnu sekvencu VL regiona i da se oba antitela vezuju za humani AXL (Tabela 10). Moguće su dve promene aminokiselinskih ostataka u HC CDR3 regionu (R sa S na poziciji 97 i A sa T na poziciji 105; Slika 6B) bez gubitka vezivanja, pod pretpostavkom da mutacije identifikovane u CDR1regionu (Y zamenjen sa H na poziciji 32) i/ili u uokvirujućim regionima (P3Q, V24I, Y25D, T86A i T117A) ne kompenzuju gubitak sposobnosti vezivanja (Slika 6B).
[0442] Pokazano je da IgG1-AXL-171, IgG1-AXL-172 i IgG1-AXL-181 imaju identičnu sekvencu VL regiona i da se sva antitela vezuju za humani AXL (Tabela 10). CDR3 regioni ova tri antitela su bili identični, a promena aminokiselinskih ostataka u HC CDR1 regionu (S zamenjen sa N na poziciji 31) ili u uokvirujućem regionu (H za Q na poziciji 82) je bila moguća bez gubitka sposobnosti vezivanja (Slika 6C).
[0443] Pokazano je da IgG1-AXL-613, IgG1-AXL-608-01, IgG1-AXL-610-01 i IgG1-AXL-620-06 imaju identičnu sekvencu VL regiona i da je u HC CDR3 regionu prisutna razlika u jednoj aminokiselini (N je zamenjen sa D na poziciji aminokiseline 101; Slika 6D). Sva antitela su se vezivala za humani AXL (Tabela 10), što ukazuje da aminokiselina na poziciji 101 nije esencijalna, pod pretpostavkom da mutacije identifikovane u HC CDR2 (V zamenjen sa A na poziciji 58) i/ili u uokvirujućim regionima (N35S, M37V, A61V, L70I, S88A) ne kompenzuju gubitak sposobnosti vezivanja (Slika 6D).
[0444] Zatim su grupirana antitela sa identičnim VH sekvencama.
1
[0445] Pokazano je da IgG1-AXL-613 i IgG1-AXL-613-08 imaju identičnu sekvencu VH regiona i da je prisutno pet razlika u aminokiselinama CDR3 regiona iz LC-a (RSNWL je zamenjeno sa YGSSY na pozicijama od 92 do 96; Slika 6E). Oba antitela su se vezivala za humani AXL (Tabela 10), što je ukazalo da su moguće varijacije aminokiselina na pozicijama od 92 do 96 i da one ne utiču na vezivanja antitela, pod pretpostavkom da mutacije koje su identifikovane u CDR1 (delecija S na poziciji 30), CDR2 (G51D), i/ili u uokvirujućim regionima (G9A, S54N, R78S, Q100G, L104V) ne kompenzuju gubitak sposobnosti vezivanja (Slika 6E).
Tabela 10
Primer 8 - In vitro citotoksičnost indukovana AXL antitelima konjugovanim sa MMAE
Konjugacija MMAE za anti-AXL antitela
[0446] Anti-AXL antitela su prečišćena hromatografijom sa Proteinom A, standardnim procedurama, pa su konjugovana sa vcMMAE. Kompleks leka i vcMMAE linkera je alkilovan na cisteinima antitela koja su redukovana, postupcima koji su opisani u literaturi (pogledati Sun i saradnici, 2005; McDonagh i saradnici, 2006; i Alley i saradnici, 2008). Reakcija je zaustavljena dodavanjem N-acetilcisteina u višku. Bilo koji preostali nekonjugovani lek je uklonjen prečišćavanjem i konačni konjugati anti-AXL antitela i leka su formulisani u PBS-u. Konjugatima anti-AXL antitela i leka su naknadno analizirani koncentracija (apsorbancijom na 280 nm), odnos lek:antitelo (DAR, hromatografijom reverzne faze (RP-HPLC) i hromatografijom hidrofobne interakcije (HIC)), količina nekonjugovanog leka (hromatografijom reverzne faze), procenat agregacije (hromatografijom isklјučenja po veličini, SEC-HPLC) i nivoi endotoksina (LAL). Rezultati su prikazani ispod, u Tabeli 11.
1
Tabela 11 - Pregled različitih karakteristika konjugata antitela i leka.
Ćelijska kultura
[0447] LCLC-103H ćelije (humanog krupnoćelijskog kancera pluća) i ćelije A431 (DMSZ, Braunschweig, Nemačka) su gajene u RPMI 1640 medijumu uz dodatak L-glutamina (Cambrex; kat. br. BE12-115F), 10% (vol/vol) toplotom inaktivisanog Cosmic seruma teleta (Perbio; kat. br. SH30087.03), 2 mM L-glutamina (Cambrex; kat. br. US17-905C), 50 IU/mL penicilina i 50 µg/mL streptomicina (Cambrex; kat. br. DE17-603E). MDA-MB231 ćelije su gajene u DMEM medijumu sa visokom koncentracijom glukoze i HEPES-om (Lonza, kat. br. BE12-709F), sa donorskim goveđim serumom sa gvožđem (Life Technologies, kat. br. 10371-029), 2 mM L-glutaminom (Lonza, kat. br. BE17-605E), 1 mM natrijumpiruvatom (Lonza, kat. br. BE13-115E) i MEM neesencijalnim rastvorom aminokiselina (Life Technologies, kat. br. 11140). Ćelijske linije su gajene na 37°C u vlažnom inkubatoru sa 5% (vol/vol) CO2. Ćelije LCLC-103H, A431 i MDA-MB231 su gajene do postizanja skoro potpune konfluentnosti, nakon čega su tripsinizovane, resuspendovane u medijumu za kulturu i propuštene kroz filter za ćelije (BD Falcon, kat. br.352340) da bi se dobila suspenzija pojedinačnih ćelija. U svaki bunar ploče sa 96-bunarića je zasejano po 1x10<3>ćelija, pa su ćelije inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim i tokom 5 sati na 37°C pri 5% CO2,kako bi se omogućilo njihovo prijanjanje za podlogu.
Test citotoksičnosti
[0448] Serijska razblaženja (finalnih koncentracija opsega od 0,00015 do 10 µg/mL) AXL antitela konjugovanih sa MMAE, pripremlјena su u medijumu za kulturu i dodata u bunare. Inkubacija ćelija sa 1 µM staurosporina (#S6942-200, Sigma) je korišćena kao referentna vrednost za smrtnost tumorskih ćelija od 100%. Netretirane ćelije su upotrebljene kao referentna vrednost za rast ćelija od 100%. Ploče su inkubirane 5 dana na 37°C, u 5% CO2. Zatim je u bunare (20 µL po bunaru) dodat reagens CellTiter-Glo (Promega; kat. br. G7571) i ploče su inkubirane tokom 1,5 sata na 37°C, 5% CO2. Potom je po 180 µL iz svakog bunarića prebačeno u bele ploče Optiplate™ sa 96-bunara (PerkinElmer, Waltham, MA;
1
kat. br. 6005299), koje su zatim inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi. Konačno, izmerena je luminiscencija na EnVision čitaču za mikrotitar ploče (Envision, Perkin Elmer).
[0449] AXL antitela konjugovana sa MMAE su indukovala smrtnosti LCLC-103H ćelija od 50%, u koncentracijama između 0,004 i 0,219 µg/mL, kao što je prikazano u Tabeli 12 i na Slici 7.
[0450] Slično navedenom, AXL-ADC su efikasno indukovali citotoksičnost u A431 (Tabela 13) i Slika 15A) i MDA-MB231 ćelijama (Tabela 13 i Slika 15B).
Tabela 12 - Citotoksičnost anti-AXL antitela konj. sa MMAE u LCLC-103H ćelijama (EC50 vrednosti)
Tabela 13. Citotoksičnost anti-AXL antitela konj. sa MMAE u A431 i MDA-MB-231 ćelijama (EC50).
1
Primer 9 - Terapijski tretman LCLC-103H tumorskih ksenografta sa anti-AXL antitelima konjugovanim sa MMAE kod SCID miševa
[0451] Kod SCID miševa je određivana in vivo efikasnost anti-AXL antitela konjugovanih sa MMAE u uspostavljenim subkutanim (SC) LCLC-103H ksenograftima tumora. U desni bok ženki SCID miševa potkožno je injecirano 5 x 10<6>LCLC-103H tumorskih ćelija (krupnoćelijskog karcinoma pluća, dobijene od Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)) u 200 µL PBS-a. Počevši od 14-21 dana nakon inokulacije tumorskih ćelija, kada je prosečna veličina tumora iznosila >100-200 mm<3>i kada je primećen jasan rast tumora, intraperitonealno je primenjena jedna injekcija (100 µL/miš) sa 1 mg/kg (20 µg/miš) IgG1-AXL-vcMMAE antitela (kao što je opisano u dodatnom Primeru 1) ili kontrolna injekcija (sa nekonjugovanim IgG1-b12). Zapremina tumora je određivana najmanje dva puta nedelјno. Zapremine tumora (mm<3>) su izračunate na osnovu merenja dobijenih upotrebom nonijusa (PLEXX) kao: 0,52 x (dužina) x (širina)<2>.
[0452] Panel anti-AXL-vcMMAE antitela je pokazao širok spektar anti-tumorske aktivnosti kod uspostavljenih SC LCLC-103H tumora (Slika 8). Klonovi IgG1-AXL-733-vcMMAE, IgG1-AXL-107-vcMMAE i IgG1-AXL-148-vcMMAE su indukovali regresiju tumora, klonovi AXL-171-vcMMAE, IgG1-AXL-511-vcMMAE i IgG1-AXL-613-vcMMAE su indukovali inhibiciju rasta tumora, dok klonovi IgG1-AXL-154-M103L-vcMMAE, IgG1-AXL-183-N52Q-vcMMAE i IgG1-AXL-726-M101L-vcMMAE nisu ispoljili nikakvu ili samo minornu inhibiciju rasta tumora.
[0453] Statistička analiza je urađena poslednjeg dana, kada su sve grupe bile intaktne (30. dan), upotrebom jednofaktorskog ANOVA testa (Dannett-ov test višestrukih poređenja u odnosu na kontrolni IgG1-b12) i ukazala je na veoma značajnu razliku (p<0,0001) u zapremini tumora za IgG1-b12 u odnosu na IgG1-AXL-733-vcMMAE, IgG1-AXL-107-vcMMAE i IgG1-AXL-148-vcMMAE. Kod nekih miševa unutar ovih grupa, tretmana sa ovim klonovima je doveo do potpune redukcije tumora. Tretman sa klonovima IgG1-AXL-171-vcMMAE, IgG1-AXL-511-vcMMAE i IgG1-AXL-613-vcMMAE je takođe doveo do značajne inhibicije rasta tumora u poređenju sa IgG1-b12, ali su razlike bile manje izražene (p<0,05 do p<0,001). Rast tumora nije bio značajno promenjen kod miševa koji su tretirani klonovima IgG1-AXL-154-M103L-vcMMAE, IgG1-AXL-183-N52Q-vcMMAE i IgG1-AXL-726-M101L-vcMMAE u poređenju sa kontrolnim IgG1-b12.
[0454] Primećena je anti-tumorska aktivnost anti-AXL-vcMMAE antitela u raznim in vivo modelima tumora. U dva modela ksenografta izvedena iz ćelijskih linija (A431; epidermoidni adenokarcinom i MDA-MB-231; kancer dojke), anti-AXL-vcMMAE antitela su indukovala inhibiciju rasta tumora, dok je regresija tumora indukovana anti-AXL-vcMMAE antitelom kod dva modela ksenografta poreklom od pacijenata, jednog sa karcinomom pankreasa i drugog sa rakom grlića materice.
Primer 10 - Anti-tumorska efikasnost AXL-ADC u ksenograftnom modelu izvedenom iz kancera pankreasa pacijenta (PDX) sa heterogenom ciljnom ekspresijom
[0455] Anti-tumorska aktivnost IgG1-AXL-107-vcMMAE, IgG1-AXL-148-vcMMAE i IgG1-AXL-733-vcMMAE je određena u PDX modelu kancera pankreasa PAXF1657 (eksperimenti su urađeni od strane Oncotest-a, Freiburg, Nemačka). Tkivo humanog tumora pankreasa je subkutano implantirano u levi bok ženki NMRI nu/nu miševa starih 5-7 nedelјa. Nasumično razvrstavanje životinja je izvedeno na sledeći način: životinje koje su bile sa tumorom veličine 50 - 250 mm<3>, poželjno 80 - 200 mm<3>, su raspoređene u 7 eksperimentalnih grupa (8 životinja po grupi), uzimajući u obzir da u grupi budu
1
prisutne uporedive vrednosti medijane i aritmetičke sredine zapremine tumora. Na dan nasumičnog razvrstavanja životinja (dan 0), 3 ADC-a su primenjena intravenski (i.v), u koncentraciji bilo od 4 mg/kg ili 2 mg/kg, a kontrolna grupa je primila jednu dozu IgG1-b12 (4 mg/kg). Zapremine tumora (mm<3>) su praćene dva puta nedelјno i izračunate su iz merenja upotrebom nonijusa (PLEXX) kao: 0,52 x (dužina) x (širina)<2>.
[0456] Bojenje PAXF1657 tumora je rađeno standardnim imunohistohemijskim tehnikama. Ukratko, zamrznuta tkiva su fiksirana sa acetonom u trajanju od 10 minuta, pa je endogena peroksidaza blokirana upotrebom vodonik peroksida. Nakon toga, preseci tkiva su blokirani normalnim mišjim serumom i bojenje je urađeno inkubacijom sa 5 µg/mL pet objedinjenih IgG1-AXL antitela (IgG1-AXL-061, IgG1-AXL-137, IgG1-AXL-148, IgG1 -AXL-183, IgG1-AXL-726). Nakon inkubacije sa sekundarnim antitelom koje je bilo konjugovano sa peroksidazom rena (HRP), HRP je vizuelizovan amino-etil karbazolom (AEC; rezultat je pojava crvene boje). Svaka mikroskopska pločica je kontrastirana hematoksilinom (plav) da bi se identifikovali nukleusi, pa je prekrivena glicergelom i pokrovnim staklom. Preseci imunoobojenih tkiva su digitalizovani na manualnom mikroskopu firme Zeiss (AxioSkop) pri uvećanjima do 10x i 40x.
[0457] Slika 9 pokazuje heterogenu AXL ekspresiju u PAXF1657 tumorima. Dok se kod pojedinih tumorskih ćelija zapaža snažno bojenje AXL-a, druge ćelije ga ne pokazuju. Na crno-beloj fotografiji, AXL bojenje izgleda kao tamno sivo. Bojenje hematoksilinom (jedara) deluje kao svetlo sivo.
[0458] Slika 10A pokazuje da je tretman miševa sa 2 mg/kg IgG1-AXL-107-vcMMAE, IgG1-AXL-148-vcMMAE i IgG1-AXL-733-vcMMAE značajno smanjio rast PAXF1657 tumora u poređenju sa kontrolnom grupom. Doza od 4 mg/kg IgG1-AXL-107-vcMMAE, IgG1-AXL-148-vcMMAE i IgG1-AXL-733-vcMMAE je indukovala regresiju PAXF1657 tumora. Četrnaestog dana nakon tretmana, prosečna veličina tumora kod miševa koji su bili tretirani sa 2 mg/kg ili 4 mg/kg IgG1-AXL-107-MMAE, IgG1-AXL-148-MMAE ili IgG1-AXL-733-MMAE je bila značajno manja nego kod miševa koji su tretirani IgG izotipskom kontrolom (IgG1-b12) (p<0,001; Tukey-ev test višestrukih poređenja).
[0459] Tretman miševa nekonjugovanim IgG1-AXL-148 nije doveo do anti-tumorske aktivnosti u PAXF1657 modelu (Slika 10B). Međutim, konjugovani IgG1-AXL-148-vcMMAE je indukovao doznozavisnu antitumorsku aktivnost u ovom modelu (Slika 10B), pokazujući da terapijski kapacitet AXL-ADC zavisi od citotoksične aktivnosti MMAE.
[0460] Štaviše, tretman miševa sa ADC IgG1-b12-vcMMAE koji nije sa ciljnim dejstvom, nije pokazao anti-tumorsku aktivnost u PAXF1657 modelu (Slika 10C), ilustrujući da terapijski kapacitet AXL-ADC-ova takođe zavisi od specifičnog cilјanog vezivanja.
Primer 11 – Vezivanja AXL antitela za Ig1 domen
[0461] Specifičnost AXL domena u AXL antitelima IgG1-AXL-061, IgG1-AXL-107, IgG1-AXL-137 i IgG1-AXL-613 je određena upotrebom panela mutanata himernog AXL-a čoveka i miša. Da bi se potvrdila ekspresija hsAXL-mmECD, uklјučeno je unakrsno-reaktivno humano-mišje monoklonsko AXL antitelo YW327.6S2. Antitelo IgG1-b12 je uključeno kao izotipsko kontrolno antitelo. Pet različitih himernih AXL molekula je generisano i eksprimirano u HEK293F, kao što je opisano u Primeru 3. Ukratko, humani domen sličan Ig domenu tipa I (Ig1), domen sličan Ig domenu tipa II (Ig2), humani domen sličan FNIII domenu tipa (FN1 ) ili humani domen sličan FNIII domenu tipa II (FN2) su zamenjeni njihovim mišjim
11
homolozima. Vezivanje 1 µg/mL anti-AXL antitela za AXL himere čoveka i miša je određivano protočnom citometrijom, kao što je opisano u Primeru 2.
[0462] Sva anti-AXL antitela su pokazala sposobnost vezivanje za humani AXL (Slika 11A), dok je vezivanje poništeno kada je ECD humanog AXL-a zamenjen njegovim mišjim homologom (Slika 11B).
Kao što je i bilo očekivano, humano-mišje monoklonsko AXL antitelo sa unakrsnom reaktivnošću, YW327.6S2, je pokazalo vezivanje za hsAXL-mmECD, potvrđujući pravilnu ekspresiju hsAXL-mmECD.
[0463] AXL antitela IgG1-AXL-061, IgG1-AXL-107, IgG1-AXL-137 i IgG1-AXL-613 su pokazala smanjeno vezivanje za hsAXL-mmIg1 (Slika 11C), ilustrujući prepoznavanje epitopa u AXL Ig1 domenu. U skladu sa time, nije bilo uticaja na vezivanje IgG1-AXL-061, IgG1-AXL-107, IgG1-AXL-137 i IgG1-AXL-613 za hsAXL-mmIg2 (Slika 11D), hsAXL-mmFN1 (Slika 11E) ili hsAXL-mmFN2 (Slika 11F). Humano-mišje monoklonsko AXL antitelo sa unakrsnom reaktivnosšću, YW327.6S2, je ispoljilo vezivanje za sve himerne AXL varijante, potvrđujući pravilnu ekspresiju ovih proteina.
Primer 12 - AXL antitela IgG1-AXL-107 i IgGI-AXL-613 se vezuju za Ig1 domen, ali nisu u kompeticiji vezivanja za Gas6
[0464] Ispitivano je i da li vezivanje AXL antitela IgG1-AXL-061, IgG1-AXL-107, IgG1-AXL-137 ili IgG1-AXL-613 interferira sa vezivanjem AXL liganda Gas6 za AXL. Zbog toga je testirano vezivanje Gas6 za A431 ćelije koje su prethodno bile inkubirane sa 10 µg/mL AXL antitela, kao što je opisano u Primeru 2. Prethodna inkubacija sa AXL antitelom YW327.6S2 je opisana kao ona koja je u kompeticiji sa Gas6 u vezivanju za AXL, dok su kao kontrole uključeni IgG1-b12 (izotipska kontrola) ili medijum (negativna kontrola).
[0465] Krive vezivanja su analizirane postupkom nelinearne regresije (sigmoidnom dozno-zavisnom krivom sa promenjivim nagibom) upotrebom GraphPad Prism V5.04 kompjuterskog programa (GraphPad Software, San Diego, CA, SAD).
[0466] Slika 12 i Tabela 14 pokazuju da je vezivanje Gas6 za A431 ćelije koje su prethodno bile inkubirane sa IgG1-AXL-107 i IgG1-AXL-613 antitelima, bilo slično vezivanju kontrolnih IgG1-b12 i medijuma. Navedeno ilustruje da vezivanje IgG1-AXL-107 i IgG1-AXL-613 za AXL ne ometa vezivanje Gas6, kao što je prikazano u Primeru 2. Vezivanje Gas6 za A431 ćelije je bilo u velikoj meri smanjeno u prisustvu IgG1-AXL-061, IgG1-AXL-137 i kontrolnog AXL antitela YW327.6S2 u poređenju sa vezivanjem kontrolnih IgG1-b12 i samog medijuma.
[0467] U eksperimentima u kojima su A431 ćelije prethodno bile inkubirane sa Gas6, maksimalne vrednosti vezivanja IgG1-AXL-107 i IgG1-AXL-613 su bile uporedive sa vezivanjem antitela u odsustvu Gas6 (maksimalno vezivanje nakon predinkubacije sa Gas6 je iznosilo 91-108% od vezivanja bez prethodne inkubacije sa Gas6) (Tabela 14). EC50vednosti vezivanja za IgG1-AXL-107 i IgG1-AXL-613 sa ili bez prethodne inkubacije sa Gas6 su bile istog opsega ili nešto više nakon prethodne inkubacija sa Gas6 (Tabela 14), što ilustruje da IgG1-AXL-107 i IgG1-AXL-613 nisu u kompeticiji vezivanja sa Gas6.
[0468] Slično kontrolnom antitelu YW327.6S2, vezivanje IgG1-AXL-061 i IgG1-AXL-137 za A431 ćelije je bilo značajno redukovano u prisustvu Gas6 u poređenju sa vezivanjem u njegovom odsustvu (maksimalno vezivanje nakon prethodne inkubacije sa Gas6 je bilo 40-43% u odnosu na vezivanja bez prethodne inkubacije sa Gas6; Tabela 14). EC50vrednosti za IgG1-AXL-061 i IgG1-AXL-137 nije bilo moguće pravilno odrediti nakon prethodne inkubacije sa Gas6 (Tabela 14). Ovo pokazuje da su IgG1-AXL-061 i IgG1-AXL-137 u kompeticija sa Gas6 u vezivanju za AXL.
[0469] Navedeni podaci pokazuju da antitela koja se vezuju za AXL Ig1 domen imaju različit efekat na vezivanje Gas6.
Tabela 14
Primer 13 - In vivo anti-tumorska efikasnost AXL-ADC u modelima ksenografta sa i bez autokrine (endogene) proizvodnje Gas6
Proizvodnja Gas6 u A431 i LCLC-103H tumorskim ćelijama
[0470] Ispitano je najpre da li A431 i LCLC-103H ćelije proizvode Gas6. Ćelije su stoga gajene u kompletnom medijumu tokom 3 dana. Nivoi Gas6 u supernatantu su određeni upotrebom Quantikine ELISA testa za humani Gas6 (R&D Systems, Minneapolis, MN), prema uputstvima proizvođača. Ovaj test upotrebljava kvantitativni ELISA „sendvič“ postupak. Monoklonsko Ab specifično za humani Gas6 je naneto na mikrotitarsku ploču. Standardi i uzorci su ispipetirani u bunare, i bilo koji humani Gas6 prisutan u uzorku je bio vezan sa imobilisanim At. Nakon ispiranja supstanci koje nisu bile vezane, u bunariće je dodato poliklonsko At koje je bilo povezano sa enzimom i specifično za humani Gas6. Nakon ispiranja radi uklanjanja nevezanog At-enzim reagensa, u svaki bunarić je dodat supstrat tako da se boja razvijala srazmerno količini prisutnog humanog Gas6 koji je bio vezan u početnom koraku. Razvijanje boje je zatim zaustavljeno i izmeren je intenziteti obojenosti.
[0471] Utvrđeno je da medijum ćelijske kulture A431 ćelijske linije sadrži 2576 ng/mL Gas6, dok je koncentracija Gas6 u medijumu LCLC-103H ćelijske linije bila više od 20 puta manja (Tabela 15).
Tabela 15 - Proizvodnja Gas6 u kondicionom medijumu tumorskih ćelija.
Anti-tumorska aktivnost AXL-ADC in vivo
[0472] In vivo anti-tumorska aktivnost IgG1-AXL-061-vcMMAE (Ig1-veznik), IgG1-AXL-107-vcMMAE (Ig1-veznik), IgG1-AXL-137-vcMMAE (Ig1-veznik), IgG1-AXL-148-vcMMAE (Ig2-veznik), IgG1-AXL-183-vcMMAE (FN1-veznik) i IgG1-AXL-726-vcMMAE (FN2-veznik) je određena u A431 modelu tumora (epidermoidnog karcinoma), koji stvara visoke nivoe Gas6, kao i u LCLC-103H modelu tumora (krupnoćelijskog karcinoma pluća), koji produkuje niske nivoe Gas6.
[0473] Indukcija tumora je izvedena subkutanom injekcijom 5 x 10<6>A431 ili LCLC-103H tumorskih ćelija (obe dobijene od Leibniz-Institut-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)) u 200 µL PBS-a, u desni bok ženki SCID miševa. Tretman je započet 14-21 dan nakon inokulacije ćelija tumora, kada je prosečna veličina tumora iznosila >100-200 mm<3>i kada se jasno uočavao rast tumora. Miševi su primili jednu injekciju ili ukupno 4 dvonedelјne intraperitonealne injekcije sa IgG1-AXL-vcMMAE ADC ili kontrolnim antitelom (nekonjugovani IgG1-b12), kao što je naznačeno. Zapremina tumora je određivana dva puta nedeljno. Zapremine tumora (mm<3>) su izračunate na osnovu merenja upotrebom nonijusa (PLEXX) kao: 0,52 x (dužina) x (širina)<2>.
[0474] Slika 13A pokazuje da tretman miševa sa 3 mg/kg IgG1-AXL-107-vcMMAE, IgG1-AXL-148-vcMMAE i IgG1-AXL-733-vcMMAE indukuje inhibiciju rasta A431 tumora.
[0475] Slika 13B pokazuje da tretman miševa sa 3 mg/kg IgG1-AXL-148-vcMMAE, IgG1-AXL-183-vcMMAE (FN1-veznik) i IgG1-AXL-726-vcMMAE (FN2-veznik) indukuje inhibiciju rasta A431 tumora. Nasuprot tome, klonovi IgG1-AXL-061-vcMMAE i IgG1-AXL-137-vcMMAE nisu ispoljili anti-tumorsku aktivnost u A431 ksenograftnom modelu.
[0476] Slika 14A pokazuje da tretman miševa sa 3 mg/kg IgG1-AXL-061-vcMMAE, IgG1-AXL-137-vcMMAE, IgG1-AXL-148-vcMMAE, IgG1-AXL-183-vcMMAE i IgG1-AXL-726-vcMMAE indukuje regresiju tumora u LCLC-103H ksenograftnom modelu. Slično tome, tretman miševa sa 1 mg/kg IgG1-AXL-107-vcMMAE ili 1 mg/kg IgG1-AXL-613-vcMMAE je indukovao regresiju LCLC-103H tumora (Slika 14B).
[0477] Ukratko, svi AXL-ADC su pokazali antitumorsku aktivnost u LCLC-103H ksenograftnom modelu koji produkuje nizak nivo Gas6. U A431 ksenograftnom modelu koji proizvodi visoke nivoe Gas6, antitumorska aktivnost je uočena samo za one AXL-ADC koji nisu bili u kompeticiji vezivanja za AXL sa ligandom Gas6.
Primer 14 - AXL ekspresija u tumorima različitih indikacija
[0478] Ekspresija AXL je procenjivana upotrebom sveže isečenih parafinskih kalupa i formalinom fiksiranih (FFPE) mikronskih serijskih preseka tkiva tumora (TMA) koji su sadržali uzorke centralnog
11
tkiva iz pacijenata sa kancerom štitne žlezde, jednjaka, jajnika, pankreasa, pluća, dojke, grlića materice ili endometrijuma, ili pak sa malignim melanomom. TMA su nabavljeni od firme US BioMax.
[0479] FFPE mikroskopske pločice sa mikronskim serijskim presecima tumora su deparafinisane i podvrgnute demaskiranju antigena (pH 6), nakon čega je endogena peroksidaza blokirana inkubacijom sa 0,1% H2O2 u citratno/fosfatnom puferu. Da bi se detektovala ekspresija AXL-a, TMA su inkubirani sa zečjim anti-AXL antitelom (Santa Cruz, kat. br: sc-20741) u koncentraciji od 1 µg/mL, tokom 60 min (sobna temperatura (RT)). Da bi se identifikovale (tumorske) ćelije epitelnog porekla, TMA su inkubirani sa zečjim anti-citokeratinskim antitelom (Abcam, kat. br. Ab9377) u razblaženju od 1:50 tokom 60 minuta (RT). Nakon koraka ispiranja, TMA su inkubirani sa anti-zečjim IgG dekstranskim polimerom konjugovanim sa peroksidazom (ImmunoLogic, kat. br.: DPVR55HRP) da bi se detektovalo vezivanje zečjeg anti-AXL i zečjeg anti-citokeratinskog antitela. Konačno, vezivanje anti-zečjeg IgG dekstranskog polimera je vizuelizovano di-amin-benzadinom (DAB; smeđa boja; DAKO, kat.br.: K346811). U TMA sa centralnim regionima malignih melanoma, vezivanje anti-zečjeg IgG dekstranskog polimera je vizuelizovano sa amino-etil karbazolom (AEC; crvena boja; Vector, SK4200). Jedra su na TMA vizuelizovana hematoksilinom (plava boja).
[0480] TMA imunoobojeni na AXL i citokeratin su digitalizovani upotrebom Aperio skenera mikroskopskih pločica pri uvećanju od 20 puta, a imunohistohemijsko bojenje preseka tkiva je kvantifikovano kompjuterskim programom za analizu slika tkiva (Definiens Tissue Studio Software, verzija 3.6.1), upotrebom algoritma zasnovanog na ćelijama. Algoritam je dizajniran tako da identifikuje i kvantifikuje procenat AXL- ili citokeratin-pozitivnih ćelija u biopsijama (opseg 0 - 100%) i da kvantifikuje intenzitet bojenja AXL-a u ćelijama pozitivnim pozitivnim na AXL (optička gustina (OD); opseg 0 - 3) u svakom centralnom regionu tumora. Tumorske ćelije su ocenjivane kao pozitivne na AXL, kada je OD AXL-a bio najmanje 0,1. Procenat ćelija pozitivnih na AXL tumora (opseg 0 - 100%) po centralnom regionu tumora je izračunat delјenjem ukupnog broja ćelija pozitivnih na AXL sa ukupnim brojem ćelija pozitivnih na citokeratin na sekvencijalnim presecima centralnog regiona tumora. Prosečan intenzitet bojenja AXL (OD) u svakom centralnom regionu tumora je izračunat delјenjem sume AXL OD svih tumorskih ćelija pozitivnih na AXL brojem tumorskih ćelija pozitivnih na AXL.
[0481] Tumorski preseci iz pacijenata sa malignim melanomom su bodovani ručno. Intenzitet bojanja na AXL je procenjivan kao slab (1+), umeren (2+) ili jak (3+), a procenat ćelija melanoma pozitivnih na AXL je procenjivan u intervalima od 10% (raspon 0 - 100%).
[0482] Slika 16 pokazuje grafički prikaz AXL ekspresije u centralnom regionu tumora štitne žlezde, jednjaka, jajnika, dojke, pluća, pankreasa, grlića materice i endometrijuma. Tabela 16 prikazuje procenat centralnih regiona tumora koji su ispoljili AXL ekspresiju u više od 10% tumorskih ćelija, za svaku od indikacija. Slika 17 prikazuje reprezentativni primer centralnog region tkiva koje je imunoobojeno na AXL, za svaku od indikacija. Slike ilustruju heterogenu ekspresiju AXL u tkivu tumora.
Tabela 16
Primer 15 - AXL antitela specifično vezuju AXL, ali ne i ostale članove familije TAM receptora.
Ekspresija humanih AXL, MER i TYRO3 u HEK-293F ćelijama
[0483] Generisani su sledeći konstrukti optimizovanih kodona za ekspresiju različitih proteina pune dužine: humani (Homo sapiens) AXL (Genbank pristupni br. NP_O68713.2), humani MER (Genbank pristupni br. EAW52096.1) i humani TYRO3 (Genbank pristupni br. Q06418.1) Konstrukti su sadržavali pogodna restrikciona mesta za kloniranje i optimalnu Kozak sekvencu (GCCGCCACC) (Kozak i saradnici, 1999). Konstrukti su klonirani u sisarski ekspresioni vektor pcDNA3.3 (Invitrogen).
[0484] FreestileTM 293-F ćelije (subklon HEK-293 prilagođen rastu u suspenziji i hemijski definisanom Freestyle medijumu, (HEK-293F)) su nabavljene od firme Invitrogen i transfektovane su sa ekspresionim plazmidima upotrebom 293fectin reagensa (Invitrogen), prema uputstvima proizvođača, a potom su ostavljene da rastu tokom 24-48 sati.
Studija vezivanja AXL antitela za humani AXL, humani MER ili humani TYRO3
[0485] U HEK-293F ćelijama tranzijentno transfektovanim sa ekspresionim konstruktima za humane AXL, MER ili TYRO3 pune dužine, protočnom citometrijom je određivan stepen vezivanje HuMab-AXL antitela. Transfektovane HEK-293F ćelije su inkubirane sa serijskim razblaženjima AXL antitela (četvorostruka razblaženja; finalni opseg koncentracija 0,002-10 µg/mL) tokom 30 minuta na 4°C. Nakon tri ispiranja u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu, ćelije su inkubirane sa kozjim anti-humanim IgG F(ab')2 konjugovanim sa R-fikoeritrinom (PE) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West
11
Grove, PA; kat. br. 109-116-098) koji je bio razblažen 1/100 u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu (finalna zapremina od 100 µL). Ćelije su zatim isprane dva puta u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu, resuspendovane u 120 µL PBS/0,1% BSA/0,02% azida i analizirane upotrebom FACS Cantoll uređaja (BD Biosciences). Za kontrolu ekspresije je uklјučeno bojenje sa mišjim anti-humanim Mer (R&D Systems, kat. br. Mab8912) i mišjim anti-humanim TYRO3 (Dtk) (R&D Systems, kat. br. MAB859), a IgG1-b12 je bilo uklјučeno kao nevezujuće izotipsko kontrolno antitelo. Krive vezivanja su analizirane postupkom nelinearne regresije (sigmoidnom dozno-zavisnom krivom sa promenjivim nagibom) upotrebom GraphPad Prism V5.04 kompjuterskog programa (GraphPad Software, San Diego, CA, SAD).
[0486] Slika 18A prikazuje da Humab-AXL antitela karakteriše dozno-zavisno vezivanje za HEK293 ćelije koje eksprimiraju humani AXL. Nasuprot tome, nije primećeno vezivanje HuMab-AXL antitela za ćelije koje eksprimiraju MER (Slika 18B) ili TYRO3 (Slika 18C) ili za netransfektovane HEK293 ćelije (Slika 18D). Bojenje sa antitelom specifičnim za MER i TYRO3 je potvrdilo da transfektovane ćelije pokazuju pravilnu ekspresiju MER (Slika 18F) ili TYRO3 (Slika 18G), tim redom.
Primer 16 - Internalizacija anti-AXL antitela vezanih za površinu ćelije
Internalizacija HuMab-AXL vezanih za ćelijsku površinu upotrebom protočne citometrije.
[0487] Internalizacija HuMab-AXL vezanih za ćelijsku površinu MDA-MB-231 i Calu-1 ćelije (ćelijska linija humanog karcinoma pluća; ATCC, kataloški broj HTB-54) je procenjivana protočnom citometrijom. Po 50.000 ćelija je zasejavano u mikrotitar ploče za kulturu tkiva sa 96-mesta i potom je ostavlјeno da se ćelije pričvrste za podlogu tokom 6 sati na 37°C. Ploče su inkubirane na 4°C tokom 30 minuta pre inkubacije sa serijskim razblaženjima AXL antitela (opseg finalnih koncentracija 0,0032-10 µg/mL) na 4°C tokom 1 sata. Nakon toga, medijum je zamenjen medijumom za kulturu tkiva bez antitela i ćelije su inkubirane preko noći (16-18 sati) na 37°C ili 4°C. Ćelije su zatim odvojene od podloge sa 40 µL toplog rastvora tripsina, isprane ledeno hladnim PBS/0,1% BSA/0,02% azidom i inkubirane tokom 30 minuta na 4°C sa kozjim anti-humanim IgG F(ab')2 konjugovanim sa R-fikoeritrinom (PE) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA; kat. br. 109-116-098) koji je bio razblažen 1/100 u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu (finalna zapremina od 100 µL) da bo se deteltpvača AXL antitela na površni ćelija. Konačno, ćelije su isprane dva puta u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu, resuspendovane u 120 µL PBS/0,1% BSA/0,02% azida i analizirane upotrebom FACS Cantoll uređaja (BD Biosciences).
[0488] Krive vezivanja su analizirane postupkom nelinearne regresije (sigmoidnom dozno-zavisnom krivom sa promenjivim nagibom) upotrebom GraphPad Prism V5.04 kompjuterskog programa (GraphPad Software, San Diego, CA, SAD).
[0489] Slika 19 pokazuje da je za sva AXL HuMab antitela i pri svim ispitivanim koncentracijama, više antitela detektovano na plazma membranama ćelija koje su inkubirane na 4°C nakon vezivanja antitela, u poređenju sa ćelijama koje su inkubirane na 37°C. Navedeno ilustruje da su na 37°C antitela AXL bila internalizovana po vezanju za plazma membranu.
Internalizacija Fab-TAMRA/QSY7 i analiza unutarćelijske razgradnje
[0490] Internalizacija AXL antitela je ispitivana u testu internalizacije Fab-TAMRA/QSY7. Ovaj test koristi uparenu fluoroforu (TAMRA) i prigušivač (eng. quencher) (QSY7). Na primer, nakon konjugacije
11
sa istim proteinom, a kada su u neposrednoj blizini, TAMRA fluorescencija biva prigušena sa QSY7. U ovom primeru, fragmenti kozjeg anti-humanog IgG-a (Jackson Immunoresearch) su konjugovani sa TAMRA/QSY7 (Fab-TAMRA/QSY7) kao što je opisano (Ogawa i saradnici, Mol Pharm 2009; 6(2):386-395), a AXL HuMab (1,5 µg/mL) je prethodno inkubiran sa Fab-TAMRA/QSY7 (12 µg/mL; 30 min, 4°C). Kompleks je zatim dodat u LCLC-103H ćelije, nakon čega su ćelije inkubirane tokom 24 h u mraku, uz treskanje (200 rpm, 37°C). Internalizacija kompleksa HuMab-Fab-TAMRA/QSY7 i unutarćelijska razgradnja u endozomima i lizozomima je prouzrokovala disocijaciju TAMRA/QSY7, što je dovelo do dovodi do prestanka prigušivanja TAMRA signala. Na FACS Cantoll uređaju (BD Biosciences) je izmerena fluorescencija TAMRA u LCLC-103H ćelijama koja su bile inkubirane sa AXL antitelom koje je bilo u kompleksu sa Fab-TAMRA/QSY7.
[0491] Kao što je prikazano na Slici 20, intenzitet fluorescencije LCLC-103H ćelija je bio pojačan nakon inkubacije sa kompleksom AXL-antitelo-Fab-TAMRA/QSY7, u poređenju sa inkubacijom koja je podrazumevala IgG1-b12-Fab-TAMRA/QSY7 ili sam Fab-TAMRA/QSY7 kompleks. Navedeno ilustruje da se AXL antitela internalizuju po vezivanju za LCLC-103H ćelije.
Primer 17 - Anti-tumorska efikasnost AXL-ADC u modelu ksenografta kancera jednjaka koji potiče od pacijenta (PDX)
[0492] Anti-tumorska aktivnost IgG1-AXL-107-vcMMAE (ovde označenog i kao "HuMax-AXL-ADC") je ispitivana i u subkutanom PDX modelu tumora jednjaka ES0195 kod BALB/c “golih” miševa (eksperimenti su urađeni u Crown Bioscience, Taicang Jiangsu Province, Kina). Fragmenti tumora iz donorskog miša sa ksenograftima tumora jednjaka poreklom iz pacijenta (ES0195) su upotrebljeni za inokulaciju u BALB/c “gole” miševe. Svaki miš je inokuliran subkutano na desnom boku sa jednim fragmentom tumora (prečnika 2-3 mm) i tumori su ostavlјeni da rastu sve dok zapremina tumora nije iznosila oko 150 mm<3>. Nasumično razvrstavanje životinja je izvedeno na sledeći način: životinje kod kojih je tumor bio veličine oko 150 mm<3>su raspoređene u 5 eksperimentalnih grupa (8 životinja po grupi), uzimajući u obzir da po grupama budu prisutne uporedive vrednosti medijane i aritmetičke sredine zapremine tumora. Grupe tretmana su bile: IgG1-b12, IgG1-b12-vcMMAE, IgG1-AXL-107, IgG1-AXL-107-vcMMAE i paklitaksel. Antitela i ADC-ovi su dozirani intravenski (i.v.), u koncentraciji od 4 mg/kg, na dan razvrstavanja (dan 0) i sedmog dana. Paklitaksel je doziran intraperitonealno (i.p.), u koncentraciji od 20 mg/kg, dana 0, 7 i 14. Zapremine tumora (mm<3>) su praćene dva puta nedeljno i izračunate su na osnovu merenja upotrebom nonijusa (PLEXX) kao: 0,52 x (dužina) x (širina)<2>.
[0493] Slika 21 prikazuje da je tretman miševa sa IgG1-AXL-107-vcMMAE indukovao regresiju ES0195 tumora u poređenju sa kontrolnim grupama tretiranim sa IgG1-b12 i IgG1-b12-MMAE (p<0,001, 23. dan, jednofaktorska ANOVA). Tretman miševa sa IgG1-b12-vcMMAE ADC koga ne karakteriše ciljano dejstvo, nije pokazao anti-tumorsku aktivnost u ovom modelu, ilustrujući da terapijski kapacitet AXL-ADC zavisi od specifičnog cilјanog vezivanja. Miševi koji su bili tretirani paklitakselom je karakterisao inhibiran rasta tumora, ali i manje efektivna inhibicija u poređenju sa IgG1-AXL-107-vcMMAE tretmanom (p<0,05, 23. dan, jednofaktorska ANOVA).
11
Primer 18 - Anti-tumorska efikasnost AXL-ADC u modelu ksenografta kancera grlića materice koji potiče od pacijenta (PDX)
[0494] Anti-tumorska aktivnost IgG1-AXL-183-vcMMAE i IgG1-AXL-726-vcMMAE je potom ispitivana u CEXF 773 modelu ksenografta kancera grlića materice koji potiče od pacijenta (PDX) u NMRI nu/nu miševima (Harlan, Holandija). Eksperimente je uradila firma Oncotest (Freiburg, Nemačka).
[0495] Fragmenti tumora su dobijeni iz ksenografta u serijskom pasažiranju kod golih miševa. Nakon uklanjanja iz donorskog miša, tumori su isečeni na fragmente (prečnika 4-5 mm) i smeštani u PBS (sa 10% penicilina/streptomicina) do trenutka potkožne implantacije. Miševima su pod izofluoranskom anestezijom jednostrano postavljeni potkožni implantati tumora u bok. Tumori su ostavljeni da rastu sve dok zapremina tumora nije iznosila 50-250 mm<3>.
[0496] Nasumično razvrstavanje životinja je urađeno na sledeći način: životinje sa tumorom zapremine 50-250 mm<3>su raspodelјene u 4 eksperimentalne grupe (8 životinja po grupi), uzimajući u obzir da unutar grupa budu uporedive vrednosti medijane i aritmetičke sredine zapremine tumora. Grupe za tretman su bile: IgG1-b12, IgG1-b12-vcMMAE, IgG1-AXL-183-vcMMAE i IgG1-AXL-726-vcMMAE. Antitela i ADC su dozirani intravenski (i.v.) u koncentraciji od 4 mg/kg, na dan razvrstavanja u grupe (dan 0) i sedmog dana. Zapremine tumora (mm<3>) su praćene dva puta nedeljno i izračunate su na osnovu merenja upotrebom nonijusa (PLEXX) kao: 0,52 x (dužina) x (širina)<2>.
[0497] Slika 22 prikazuje da je tretman miševa sa IgG1-AXL-183-vcMMAE ili IgG1-AXL-726-vcMMAE indukovao regresiju CEXF 773 tumora u poređenju sa kontrolnim grupama tretiranim sa IgG1-b12 i IgG1-b12-MMAE. Tretman miševa sa IgG1-b12-vcMMAE ADC koga ne karakteriše ciljano dejstvo, nije pokazao anti-tumorsku aktivnost u ovom modelu, ukazujući da terapijski kapacitet AXL-ADC zavisi od specifičnog cilјanog vezivanja. Statistička analiza veličine tumora 28. dana (Kruskal-Wallis i Mantel-Cox, uz cut-off za veličinu tumora od 500 mm<3>), pokazala je da je prosečna veličina tumora kod miševa tretiranih sa IgG1-AXL-183-vcMMAE ili IgG1-AXL-726-vcMMAE bila značajno manja nego kod miševa koji su bili tretirani sa IgG1-b12 i IgG1-b12-vcMMAE (p<0,001). IgG1-AXL-183-vcMMAE i IgG1-AXL-726-vcMMAE su bili podjednako efikasni.
Primer 19 - Anti-tumorska efikasnost AXL-ADC u ortotopskom ksenograftnom modelu kancera dojke
[0498] Anti-tumorska aktivnost IgG1-AXL-183-vcMMAE i IgG1-AXL-726-vcMMAE je zatim ispitivana u ortotopskom MDA-MB-231 D3H2LN ksenograftnom modelu.
[0499] MDA-MB-231-luc D3H2LN Bioware ćelije (adenokarcinom mlečne žlezde; Perkin Elmer, Waltham, MA) su implantirane u masno tkivo mlečne žlezde ženki SCID miševa (CB-17/lcrPrkdcscid/CRL) (Charles-River) starosti 6-11 nedelјa, pod izofluoranskom anestezijom. Tumori su ostavljeni da rastu, a miševi su nasumično razvrstani kada su tumori dostigli volumen od ∼325 mm<3>. Životinje su tada i nasumično razvrstane u 4 eksperimentalne grupe (6-7 životinja u grupi), uzimajući u obzir da u okviru grupa budu uporedive vrednosti medijane i aritmetičke sredine zapremine tumora. Tretirane grupe su bile: IgG1-b12, IgG1-b12-vcMMAE, IgG1-AXL-183-vcMMAE i IgG1-AXL-726-vcMMAE. Životinje su primile ukupno 4 dvonedeljne doze od 3 mg/kg antitela ili ADC, počevši od dana razvrstavanja u grupe. Zapremine tumora (mm<3>) su praćene dva puta nedeljno i izračunate su na osnovu merenja upotrebom nonijusa (PLEXX) kao: 0,52 x (dužina) x (širina)<2>.
11
[0500] Slika 23 pokazuje da je tretman miševa sa IgG1-AXL-183-vcMMAE ili IgG1-AXL-726-vcMMAE indukovao regresiju MDA-MB-231 tumora u poređenju sa kontrolnim grupama tretiranim sa IgG1-b12 i IgG1-b12-MMAE. Tretman miševa sa IgG1-b12-vcMMAE ADC koji je bez ciljanog dejstva, nije pokazao antitumorsku aktivnost u ovom modelu, pokazujući da terapijski kapacitet AXL-ADC zavisi od specifičnog cilјanog vezivanja. Statistička analiza veličine tumora 32. dana (jednofaktorska ANOVA) pokazala je da je prosečna veličina tumora kod miševa koji su tretirani s IgG1-AXL-183-vcMMAE ili IgG1-AXL-726-vcMMAE bila statistički značajno manja nego kod miševa koji su su bili tretirani sa IgG1-b12 i IgG1-b12-vcMMAE (P<0,001). Nisu primećene razlike između tretiranih grupa IgG1-AXL-183-vcMMAE i IgG1-AXL-726-vcMMAE, što je ukazalo da su ovi ADC indukovali podjednako efikasnu anti-tumorsku aktivnost.
Primer 20 - In vitro citotoksičnost indukovana konjugatima AXL-specifičnih antitela i leka je zavisna od cilјne ekspresije
[0501] Citotoksičnost IgG1-AXL-107-vcMMAE je testirana in vitro, na ćelijskim linijama humanih tumora sa različitim nivoima ekspresije AXL.
Ćelijska kultura
[0502] LS174T ćelije (ćelijska linija humanog kolorektalnog adenokarcinoma; ATCC, kat. br. CL-188) su gajene u minimalnom esencijalnom medijumu (MEM) sa Glutamax-om, Hepes-om i fenol crvenim (Life Technologies, kat. br. 42360-024). Komponente medijuma su bile 10% donorski goveđi serum sa gvožđem (DBSI) (Life Technologies, kat. br.10371-029), 1% natrijum-piruvat (100 mM; Lonza, kat. br. BE13-115E) i 1% penicilin/streptomicina (Lonza, kat. br. DE17-603E).
[0503] NCI-H226 ćelije (ćelijska linija humanog karcinoma skvamoznih ćelija; ATCC, kat. br. CRL-5826), NCI-H661 ćelije (humani krupnoćelijski kancer pluća; ATCC, kat. br. HTB-183) i NCI-H1299 ćelije (humani nesitnoćelijksi kancer pluća; ATCC, kat. br. CRL-5803) su gajene u RPMI 1640 medijumu (ATCC modifikacija; Life Technologies, kat. br. A10491-01). Komponente medijuma su bile sa 10% donorskog goveđeg seruma sa gvožđem (DBSI; Life Technologies, kat. br.10371-029) i 1% penicilin/streptomicina (Lonza, kat. br. DE17-603E).
[0504] SKOV-3 ćelije (humani adenokarcinom jajnika; ATCC, kat. br. HTB-77) su gajene u McCoy-evom 5A medijumu sa L-glutaminom i HEPES-om (Lonza, kat. br. BE12-168F). Komponente medijuma su bile 10% donorski goveđi serum sa gvožđem (DBSI; Life Technologies, kat. br. 10371-029) i 1% penicilin/streptomicina (Lonza, kat. br. DE17-603E).
[0505] Calu-1 ćelije (humani epidermoidni karcinom pluća; ATCC, kat. br. HTB-54) su gajene u McCoy -evom 5A medijumu sa Katopeptonom, bez HEPES-a (Life Technologies, kat. br. 26600-023). Komponente medijuma su bile 10% donorski goveđi serum sa gvožđem (DBSI; Life Technologies, kat. br. 10371-029), 1% L-glutamin (200 nM) u 0,85% rastvoru NaCl (Lonza, kat. br. BE17-605F) i 1% penicilin/streptomicin (Lonza, kat. br. DE17-603E). Calu-1 ćelije su rezistentne na EGFR cilјanu terapiju.
[0506] LCLC-103H ćelije (humani krupnoćelijski kancer pluća), A431 ćelije (humani epidermoidni adenokarcinom) i MDA-MB-231 ćelije (humani kancer dojke) su gajene kao što je opisano u Primeru 8.
Kvantifikacija AXL ekspresije na plazma membrani ćelijskih linija humanih tumora
11
[0507] Ekspresija AXL-a na plazma membranama ćelija humanih tumora je ispitivana indirektnom imunofluorescencijom, upotrebom QIFIKIT kompleta (DAKO, kat. br. K0078) sa mišjim monoklonskim antitelom Z49M (Santa Cruz biotechnology, kat. br. sc-73719). Zalepljene ćelije su tripsinizovane i propuštene kroz ćelijski filter da bi se dobila suspenzija pojedinačnih ćelija. Ćelije su zatim oborene centrifugiranjem tokom 5 minuta pri brzini od 1.200 obrtaja/min, isprane PBS-om i resuspendovane u koncentraciji od 1x10<6>ćelija/mL. Sledeći koraci su izvedeni na ledu. Po 100 µL suspenzija pojedinačnih ćelija (sa 100.000 ćelija po bunaru) je zasejano u polistirenske ploče sa 96-bunara i okruglim dnom (Greiner Bio-One, kat. br.650101). Ćelije su zatim oborene centrifugiranjem tokom 3 minuta pri brzini od 300xg i resuspendovane u koncentraciji od 10 µg/mL u po 50 µL uzorka antitela ili mišje IgG1 izotipske kontrole (BD/Pharmingen, kat. br.555746). Nakon inkubacije od 30 minuta na 4°C, ćelije su istaložene, pa resuspendovane u 150 µL FACS pufera. Zrna za podešavanje i kalibraciju su dodata na ploču prema uputstvima proizvođača. Ćelije i zrna su paralelno isprane dva puta sa 150 µL FACS pufera i resuspendovane u 50 µL kozjeg anti-mišjeg IgG konjugovanog sa FITC-om (1/50; DAKO, kat. br. K0078). Sekundarno antitelo je inkubirano tokom 30 minuta na 4°C u mraku. Ćelije i zrna su isprane dva puta sa 150 µL FACS pufera i resuspendovane u 100 µL FACS pufera. Imunofluorescencija je merena na FACS CantoII uređaju (BD Biosciences), snimanjem 10.000 događaja u vijabilnim ćelijama. Srednji intenzitet fluorescencije zrna za kalibraciju je upotrebljenza izračunavanje kalibracione krive upotrebom GraphPad Prism kompjuterskog programa (GraphPad Software, San Diego, CA, SAD). Za svaku ćelijsku liniju su izračunati kapacitet vezivanja antitela (ABC), kao procena broja AXL molekula koji su eksprimirani na plazma membrani, a koji je izračunat upotrebom srednje vrednosti intenziteta fluorescencije ćelija obojenih AXL antitelom, na osnovu jednačine kalibracione krive (interpolacijom nepoznatih vrednosti sa standardne krive, upotrebom GraphPad kompjuterskog programa).
Test citotoksičnosti
[0508] Za ćelije LCLC-103H, A431, MDA-MB-231, NCI-H226, NCI-H661, NCI-H1299, LS174T i SKOV-3, je urađen in vitro test citotoksičnosti, kao što je opisano u Primeru 8. Za Calu-1, test citotoksičnosti je urađen kao što je opisano u Primeru 8, uz prilagođavanje u vidu dužine inkubacije ćelija sa 5 na 11 dana. Dozno-zavisne krive su generisane postupkom nelinearne regresije upotrebom GraphPad Prism kompjuterskog programa. Procenat vijabilnih ćelija pri koncentraciji IgG1-AXL-107-vcMMAE od 1 µg/mL je interpolisan sa krive zavisnosti od doze.
[0509] Kao što je prikazano na Slici 24, IgG1-AXL-107-vcMMAE je indukovao najsnažniju citotoksičnost u ćelijskim linijama sa visokom ekspresijom AXL-a, dok je citotoksičnost bila niska ili je izostala u ćelijskim linijama sa niskom ekspresijom AXL-a. Slika takođe ilustruje da je IgG1-AXL-107-vcMMAE efektivan u indukciji citotoksičnosti u ćelijama rezistentnim na EGFR cilјanu terapiju, kao što su Calu-1 ćelije.
12
Primer 21 - Pobolјšana anti-tumorska efikasnost IgG1-AXL-107-vcMMAE u kombinaciji sa erlotinibom u NSCLC modelu ksenografta (PDX) dobijenom iz pacijenta.
LU2511 PDX model
[0510] Anti-tumorska aktivnost IgG1-AXL-107-vcMMAE je procenjena i u subkutanom NSCLC PDX modelu LU2511 rezistentnom na erlotinib kod BALB/c “golih” miševa (eksperimenti su urađeni od strane firme Crown Bioscience, okrug Changping, Peking, Kina). Svaki miš je inokuliran subkutano na desnom boku, sa jednim fragmentom tumora (prečnika 2-3 mm) i tumori su ostavlјeni da rastu sve dok zapremina tumora nije iznosila oko 200 mm<3>. Nasumično razvrstavanje životinja je izvedeno na sledeći način: životinje kod kojih je tumor bio veličine oko 200 mm<3>su raspoređene u 5 eksperimentalnih grupa (8 životinja po grupi), uzimajući u obzir da po grupama budu prisutne uporedive vrednosti medijane i aritmetičke sredine zapremine tumora. Grupe tretmana su bile: IgG1-b12, IgG1-b12-vcMMAE, IgG1-AXL-107, IgG1-AXL-107-vcMMAE, erlotinib i erlotinib plus IgG1-AXL-107-vcMMAE. Antitela i ADC su dozirani intravenski (i.v.), u dozi od 4 mg/kg, na dan razvrstavanja (dan 0) i sedmog dana. Erlotinib je doziran oralno (per os) u dozi u koncentraciji od 50 mg/kg dnevno tokom 2 nedelјe. Zapremine tumora (mm<3>) su praćene dva puta nedeljno i izračunate su na osnovu merenja upotrebom nonijusa (PLEXX) kao: 0,5 x (dužina) x (širina)<2>.
[0511] Slika 25 pokazuje da tretman miševa erlotinibom nije indukovao anti-tumorsku aktivnost, što je i bilo očekivano. IgG1-AXL-107-vcMMAE je indukovao inhibiciju rasta LU2511tumora u poređenju sa kontrolnim grupama tretiranim sa IgG1-b12 (p<0.01, 10. dan, jednofaktorski ANOVA test; Slika 25B) i IgG1-b12-MMAE (p<0,05, 10. dan, jednofaktorski ANOVA test; Slika 25B). Tretman miševa kombinacijom IgG1-AXL-107-vcMMAE i erlotiniba je indukovao snažnije anti-tumorsko delovanje u odnosu na samostalnu primenu IgG1-AXL-107-vcMMAE u ovom modelu (p<0,05, 17. dan, jednofaktorski ANOVA test; Slika 25C).
LU0858 PDX model
[0512] Anti-tumorska aktivnost IgG1-AXL-107-vcMMAE je procenjena i u subkutanom NSCLC PDX modelu LU0858 rezistentnom na erlotinib kod BALB/c “golih” miševa (eksperimenti su urađeni od strane firme CrownBioscience, okrug Changping, Peking, Kina). Inokulacija fragmenata tumora u BALB/c “gole” miševe i nasumična raspodela životinja su urađeni kao što je prethodno opisano.
[0513] Tretman sa IgG1-AXL-107-vcMMAE (2 ili 4 mg/kg) je urađen Dana 0 i 7, nakon nasumične raspodele životinja u grupe (Slika 32). Ispitan je tretman sa IgG1-AXL-107-vcMMAE u kombinaciji sa EGFR inhibitorom erlotinibom. Erlotinib je primenjivan svakodnevno, tokom 14 dana, u dozi od 50 mg/kg. Kao kontrole su upotrebljeni samostalan tretman Erlotinibom, sa IgG1-b12-vcMMAE i IgG1-b12. Samostalan tretman Erlotinibom nije imao uticaja na rast tumora. U koncentraciji od 2 mg/kg, samostalan tretman sa IgG1-AXL-107-vcMMAE takođe nije imao uticaja na rast tumora. U koncentraciji od 4 mg/kg, samostalan tretman sa IgG1-AXL-107-vcMMAE je indukovao inhibiciju rasta tumora u poređenju sa kontrolnim tretmanom sa IgG1-b12-vcMMAE. Kombinacija 4 mg/kg IgG1-AXL-107-vcMMAE sa erlotinibom nije pobolјšala rezultat u odnosu na samostalan tretman sa IgG1-AXL-107-vcMMAE (Slika 32). Dodavanje erlotiniba tretmanu sa 2 mg/kg IgG1-AXL-107-vcMMAE je dovelo do inhibicije rasta slične onoj koja je detektovana kod grupe koja je primila 4 mg/kg IgG1-AXL-107-vcMMAE.
LU1868 PDX model
[0514] Anti-tumorska aktivnost IgG1-AXL-107-vcMMAE je procenjena dalje i u subkutanom NSCLC PDX modelu LU1858 rezistentnom na erlotinib kod BALB/c “golih” miševa (eksperimenti su urađeni od strane firme CrownBioscience, okrug Changping, Peking, Kina). Inokulacija fragmenata tumora u BALB/c “gole” miševe i nasumična raspodela životinja su urađeni kao što je prethodno opisano.
[0515] Tretman sa IgG1-AXL-107-vcMMAE (2 ili 4 mg/kg) je urađen Dana 0 i 7, nakon nasumične raspodele životinja u grupe. Ispitan je tretman sa IgG1-AXL-107-vcMMAE u kombinaciji sa EGFR inhibitorom erlotinibom. Erlotinib je primenjivan svakodnevno, tokom 14 dana, u dozi od 50 mg/kg. Kao kontrole su bili uključeni samostalan tretman Erlotinibom, sa IgG1-b12-vcMMAE i IgG1-b12 (Slika 33).
[0516] Analiza Mann-Whitney testom je urađena 21. Dana, radi poređenja efekata lečenja u odnosu na IgG1-b12 ili IgG1-b12-vcMMAE, kao i 28. dana da bi se uporedili efekti samostalnog tretmana sa 2 mg/kg IgG1-AXL-107-vcMMAE u odnosu na 2 mg/kg IgG1-AXL-107-vcMMAE u kombinaciji sa erlotinibom i 31. dana radi poređenja efekata samostalnog tretmana sa 4 mg/kg IgG1-AXL-107-vcMMAE u odnosu na 4 mg/kg IgG1-AXL-107-vcMMAE u kombinaciji sa erlotinibom. Samostalan tretman Erlotinibom nije imao uticaja na rast tumora. U koncentraciji od 2 mg/kg i 4 mg/kg, samostalan tretman sa IgG1-AXL-107-vcMMAE je indukovao inhibiciju rasta tumora, dok kombinacija IgG1-AXL-107-vcMMAE sa erlotinibom nije pobolјšala ovaj rezultat u odnosu na samostalan tretman sa IgG1-AXL-107-vcMMAE (Slika 33).
LXFA 526 PDX model
[0517] Anti-tumorska aktivnost IgG1-AXL-107-vcMMAE je procenjena potom u subkutanom NSCLC PDX modelu LXFA 526 rezistentnom na erlotinib (eksperimenti su urađeni od strane firme Oncotest, Freiburg, Nemačka). Inokulacija fragmenata tumora u mužjake NMRI nu/nu miševe stare 4-6 nedelјa i nasumična raspodela životinja su urađeni kao što je prethodno opisano.
[0518] Tretman sa IgG1-AXL-107-vcMMAE (2 ili 4 mg/kg) je urađen Dana 0 i 7, nakon nasumične raspodele životinja u grupe (Slika 34). Ispitan je i tretman sa IgG1-AXL-107-vcMMAE u kombinaciji sa EGFR inhibitorom erlotinibom. Erlotinib je primenjivan svakodnevno, tokom 14 dana, u dozi od 50 mg/kg. Kao kontrole su upotrebljeni samostalan tretman Erlotinibom, sa IgG1-b12-vcMMAE i IgG1-b12. Samostalan tretman Erlotinibom nije imao uticaja na rast tumora. IgG1-AXL-107-vcMMAE je indukovao inhibiciju rasta tumora u dozi od 2 mg//kg, dok je u dozi od 4 mg/kg, IgG1-AXL-107-vcMMAE indukovao potpunu regresiju tumora kod svih miševa najmanje do 76. dana. Kombinovan tretman IgG1-AXL-107-vcMMAE sa nivoom doze od 2 mg/kg ili 4 mg/kg sa erlotinibom je ispoljio sličnu antitumorsku aktivnost u poređenju sa samostalnim tretmanom sa IgG1-AXL-107-vcMMAE (Slika 34).
LXFA 677 i LXFA 6773 PDX modeli
[0519] Anti-tumorska aktivnost IgG1-AXL-107-vcMMAE je procenjena dalje u subkutanom NSCLC PDX modelu LXFA 677 i LXFA 677_3 modelu, koji je izveden iz LXFA 677 modela i koga karakteriše stečena rezistencija na erlotinib (eksperimenti su urađeni od strane firme Oncotest, Freiburg, Nemačka). Inokulacija fragmenata tumora u mužjake NMRI nu/nu miševe stare 4-6 nedelјa i nasumična raspodela životinja su urađeni kao što je prethodno opisano.
[0520] Tretman sa IgG1-AXL-107-vcMMAE (2 ili 4 mg/kg) je urađen Dana 0 i 7, nakon nasumične raspodele životinja u grupe. Ispitan je i tretman sa IgG1-AXL-107-vcMMAE u kombinaciji sa EGFR inhibitorom erlotinibom. Erlotinib je primenjivan svakodnevno, tokom 14 dana, u dozi od 50 mg/kg. Kao kontrole su upotrebljeni samostalan tretman Erlotinibom, sa IgG1-b12-vcMMAE i IgG1-b12. Erlotinib je indukovao delimičnu regresiju tumora u LXFA 677 modelu, ali nije imao uticana na rast tumora u LXFA 677_3 modelu rezistentnom na erlotinib, kao što je i bilo očekivano (Slika 35). IgG1-AXL-107-vcMMAE je indukovao inhibiciju rasta tumora u dozi od 2 mg/kg, dok je u dozi od 4 mg/kg, IgG1-AXL-107-vcMMAE indukovao delimičnu regresiju tumora u LXFA 677 modelu. U LXFA 677_3 modelu rezistentnom na erlotinib, IgG1-AXL-107-vcMMAE je indukovao potpunu regresiju tumora sa oba nivoa doze, koja je trajala najmanje do 41. dana. U dva modela, kombinovano lečenje sa IgG1-AXL-107-vcMMAE u dozi od 4 mg/kg, kao i sa 2 mg/kg, sa erlotinibom je indukovalo sličnu antitumorsku aktivnostu u poređenju sa samostalnim tretmanom sa IgG1-AXL-107-vcMMAE (Slika 35).
Tabela 17. Pregled PDX modela pluća, status mutacija EGFR-a i odgovor na erlotinib i AXL-ADC.
Primer 22 - NSCLC ćelijske linije koje su rezistentne na EGFR inhibitore erlotinib, gefitinib i afatinib pokazuju pojačanu ekspresiju Axl proteina i pojačanu senzitivnost na IgG1-AXL-107-vcMMAE in vitro
[0521] Uticaj stečene rezistencije na erlotinib na ekspresiju Axl proteina u panelu NSCLC ćelijskih linija je ispitan imunoblot analizom. Pored toga, ispitana je osetljivost NSCLC ćelijskih linija na IgG1-AXL-107-vcMMAE in vitro.
Ćelijska kultura i antikancerski agensi
[0522] Svi materijali za kulturu tkiva su nabavljeni od kompanije Gibco Life Technologies (Carlsbad, CA). Ćelijska linija NSCLC adenokarcinoma osetljiva na erlotinib HCC827 je kuplјena od ATCC. HCC827 ćelije su divlјeg tipa za KRAS i karakteriše ih mutacija tipa delecije egzona 19 u EGFR-u (delecija E746 - A750), koja je povezana sa senzitivnošću na EGFR-TKI. Ćelije su kultivisane u RPMI-1640 Glutamax medijumu sa dodatkom 10% fetalnog seruma govečeta (FBS) i uz 50 µg/ml penicilin-streptomicina, a gajene su u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2na 37ºC. EGFR inhibitori (erlotinib, gefitinib i afatinib) su nabavljeni od kompanije Selleck Chemicals (Houston, TX). Erlotinib i gefitinib su rastvoreni u DMSO-u, alikvotirani i čuvani na -20°C.
12
Analiza kratkih tandemskih ponovaka
[0523] Da bi se potvrdila autentičnost ćelijske linije, izvršena je analiza kratkih tandemskih ponovaka (STR) upotrebom Cell ID™ sistema (kat. br. G9500, Promega, Madison, SAD), kao što je opisano od strane proizvođača. Ukratko, deset specifičnih lokusa humanog genoma je amplifikovano PCR postupkom i analizirano kapilarnom elektroforezom. Utvrdili smo da su ER10, ER20 i ER30 bili istih alelskih veličina u svih deseet lokusa kao parentalni HCC827 klon. Takođe smo utvrdili da su veličine alelslih lokusa identične onima koje je objavio ATCC.
Prečišćavanje DNK i analiza mutacija EGFR/KRAS
[0524] DNK je ekstrahovana iz ćelija upotrebom QIAamp DNA Mini kompleta (Qiagen, Hilden, Nemačka), a status mutacija u EGFR i KRAS je ispitan upotrebom TheraScreen EGFR RGQ PCR kompleta i TheraScreen KRAS RGQ PCR kompleta (Qiagen, Hilden, Nemačka), kao što je opisano od strane proizvođača.
In vitro test citotoksičnosti za ispitivanje senzitivnosti ćelijskih linija na erlotinib ili AXL-ADC
[0525] Po 2000 ćelija/bunariću (5000 ćelija u slučaju ER20) je zasejano u mikrotitar ploče sa 96 mesta i ćelije su ostavljene da se zalepe tokom 6-8 h, a pre dodavanja erlotiniba, gefitiniba, afatiniba, IgG1-AXL-107-vcMMAE ili izotipskog kontrolnog ADC IgG1-b12- vcMMAE; ćelije su zatim inkubirane na 37°C i u 5% CO2tokom 5 dana, pa je urađena kvantifikacija upotrebom Cell Titer Glo testa (kao što je opisano u Primeru 8). Netretirane ćelije su upotrebljene kao referentna vrednost za ćelijski rast od 100%. Ploče su inkubirane tokom 4 ili 5 dana na 37°C, u 5% CO2. Analiza sa kristal ljubičastom bojom je urađena dodavanjem rastvora za bojenje tokom 5 minuta na RT, ispiranjem ćelija dva puta u H2O, ponovnim rastvaranjem u Na-citratnom puferu (29,41 g Na-citrata u 50% EtOH) i merenjem apsorbancije na 570 nm.
Generisanje NSCLC ćelijskih linija rezistentnih na erlotinib ili gefitinib
[0526] Iz HCC827 ćelijske linije su generisane tri izogene ćelijske linije rezistentne na erlotinib, kontinuiranim izlaganjem erlotinibu. Ćelije su u početku bile izložene 1 µM erlotinibu, pa je koncentracija erlotiniba postepeno povećana na 20 µM ili 30 µM, tim redom, tokom perioda od šest meseci. Jednom kada su ćelijske linije stekle rezistenciju na erlotinib, gajane su u medijumu za kulturu kao što je prethodno opisano, uz dodatak 20 µM ili 30 µM erlotiniba.
[0527] Slično navedenom, jedna izogena ćelijska linija rezistentna na erlotinib i 5 ćelijskih linija rezistentnih na gefitinib su generisane iz ćelijske linije PC9, kontinuiranim izlaganjem erlotinibu ili gefitinibu. Ćelije su u početku izlagane 1 µM erlotinibu ili gefitinibu, pa je koncentracija TKI postepeno povećavana do 30 µM tokom perioda od šest meseci.
Imunoblot analiza
[0528] Ekspresija Axl je određena imunoblot analizom. Aktivacija Axl je određena merenjem fosforilacije, upotrebom antitela specifičnih za fosforilisane forme. Ćelije su isprane u ledeno hladnom TBS-u, centrifugirane i lizirane u RIPA puferu (10 mM Tris HCl pH 8, 5 mM Na2EDTA pH 8, 1% NP-40, 0,5% natrijum-dioksiholat, 0,1% SDS), koji je sadržavao i proteazne i fosfatazne inhibitore (Complete Mini PhosphoSTOP, Roche, Bazel, Švajcarska). Koncentracije proteina su određene sa Pierce BCA proteinski testom (Thermo Fisher Scientific, SAD), prema protokolu proizvođača. Po 5-40 µg proteina je razdvojeno na 4-12% RunBlue SDS-PAGE gelovima (Expedeon, San Diego, CA), a zatim je urađen transfer proteina na PVDF membranu (GE Healthcare Life Sciences, Danska), koja je dalje blokirana i inkubirana sa primarnim antitelom preko noći, na 4°C. Anti-aktinsko antitelo je nabavljeno od kompanije Abcam (kat. br. ab8226), dok je antitelo na ukupan AXL nabavljeno od firme R&D Systems (kat. br. AF154). Membrane su zatim inkubirane sa kozjim anti-zečjim, kozjim anti-mišjim (Dako, Danska) ili magarećim anti-kozjim (Santa Cruz) sekundarnim antitelom konjugovanim sa HRP u razblaženju od 1:5000, na sobnoj temperaturi i tokom 1 h. Imunoreaktivne trake su vizuelizovana sa ECL Prime Western Blotting Detecting reagensom firme Amersham (GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, Velika Britanija) i izlaganjem CL-osetljivom filmu (Thermo Fisher Scientific, SAD).
Rezultati
[0529] HCC827 ćelijska linija divlјeg tipa je bila veoma senzitivna na tretman erlotinibom, sa IC50od približno 0,005 µM. Ćelijske linije rezistentne na erlotinib ER10, ER20 i ER30, koje su generisane izlaganjem rastućim koncentracijama erlotiniba tokom šest meseci, nisu bile senzitivne na erlotinib (IC50>50 µM) (Tabela 18). Stabilnost fenotipa rezistencije na erlotinib je potvrđena gajenjem ER10, ER20 i ER30 ćelijskih linija u odsustvu erlotiniba tokom šest nedelјa. Nakon šest nedelјa, ćelijske linije su ispoljile isti nivo rezistencije na erlotinib. Mutacioni status EGFR i KRAS u ćelijskim linijama rezistentnim na erlotinib je ostao nepromenjen u poređenju sa parentalnom ćelijskom linijom (Tabela 18). Ekspresija Axl proteina je bila pozitivno regulisana u ćelijskim linijama izvedenim iz HCC827 koje su stekle rezistenciju na erlotinib (Slika 26A). Pozitivna regulacija Axl je bila očuvana kada su ćelijske linije bile gajene u odsustvu erlotiniba (Slika 26A).
[0530] Slično navedenom, ekspresija Axl proteina je bila pozitivno regulisana u ćelijskim linijama izvedenim iz PC9 koje su stekle rezistenciju na erlotinib ili gefitinib (Slika 26B).
Tabela 18. Karakteristike parentalne ćelijske linije HCC827 i izvedenih ćelijskih linija rezistentnih na erlotinib.
12
[0531] Ispitivana je i senzitivnost HCC827 i PC9 ćelija divljeg tipa i rezistentnih na erlotinib/gefitinib, na IgG1-AXL-107-vcMMAE. Ćelije su stoga bile izlagane rastućim koncentracijama IgG1-AXL-107-vcMMAE (opsegs 10 µg/mL - 3,8 x 10<-5>µg/mL) tokom 5 dana, nakon čega je određivana ćelijska vijabilnost. Slike 27A i B pokazuju da su HCC827 i PC9 ćelije divljeg tipa neosetlјive na tretman sa IgG1-AXL-107-vcMMAE (Slike 27F i J), ali da pokazuju snažno smanjenu vijabilnost nakon tretmana sa EGFR inhibitorima (Slike 27C i I). HCC827-ER20 i HCC827-ER30 ćelijske linije, sa stečenom rezistencijom na EGFR-TKI erlotinib, takođe su bile rezistentne na EGFR-TKI gefitinib i afatinib (Slika 27D i E), ali ih je karakterisala i smanjena vijabilnost nakon tretmana sa IgG1-AXL-107-vcMMAE (Slika 27A). PC9-ER ćelijska linija sa stečenom rezistencijom na EGFR-TKI erlotinib (Slika 27I) takođe je ispoljila smanjenu vijabilnost nakon tretmana sa IgG1-AXL-107-vcMMAE (Slika 27B i K). Tretman kontrolnim ADC-om, sa IgG1-b12-vcMMAE, nije uticao na ćelijsku vijabilnost do koncentracije od 10 µg/mL, u bilo kojoj od ispitivanih ćelijskih linija (Slike 27F, G, H, J i K).
Primer 23 - Rezistencija na BRAF inhibitor PLX4720 je povezana sa pozitivnom regulacijom ekspresije Axl proteina i povećanom senzitivnošću na IgG1-AXL-107-vcMMAE
[0532] U panelu uspostavljenih ćelijskih linija humanog melanoma (CDX) i ćelijskih linija melanoma niskog pasaža izvedenih iz pacijenata (PDX), ekspresija Axl proteina i senzitivnost na IgG1-AXL-107-vcMMAE su ispitivani u odnosu na njihovu inherentnu ili stečenu rezistenciju na inhibiciju rasta nakon tretmana sa BRAF inhibitorom PLX4720, analogom klinički odobrenog BRAF inhibitora vemurafeniba.
Ćelijska kultura
[0533] SKMEL147 linija je dobijena iz laboratorije Reuven Agami sa Holandskog instituta za kancer. A875 je nabavljena od kompanije Thermo Fischer, COLO679 od firme Sigma, SKMEL28 i A375 ćelija od ATCC-a. Melanomske ćelijske linije su gajene u DMEM-u, uz dodatak 10% fetalnog seruma govečeta (Sigma), 100 U/ml penicilina i 0,1 mg/ml streptomicina (sve od firme Gibco). Ćelijske linije su održavane na 37°C, u vlažnom inkubatoru sa 5% (vol/vol) CO2.
Generisanje ćelijskih linija rezistentnih na PLX4720
[0534] Ćelijske linije senzitivne na BRAF inhibitor (SKMEL28 i A375) su gajene u prisustvu rastućih koncentracija BRAF inhibitora PLX4720 (Selleck Chemicals, Houston, TX, SAD, kompanija: Selleck Chemicals, Houston, TX, SAD, kataloški broj: S1152) do 3 µM radi uspostavlјanja odgovarajućih SKMEL28R i A375R linija rezistentnih na PLX4720. Sve ćelijske linije rezistentne na lekove su trajno gajene u prisustvu 3 µM PLX4720.
Generisanje ćelijskih linija melanoma niskog pasaža poreklom iz pacijenata (PDX)
[0535] Medicinsko etičko veće bolnice Antoni van Leeuwenhoek sa Holandskog instituta za kancer, odobrilo je prikuplјanje i upotrebu humanog tkiva. Eksperimente na životinjama je odobrio eksperimentalni komitet za životinje sa instituta i isti su urađeni prema važećim pravilima i propisima. Materijal humanih tumora je dobijen tokom operacija ili uzimanjem biopsija tumora od pacijenata sa malignim melanomom, upotrebom igle promera od 14 godža. Fragmenti tumora od<~>5mm<3>su upotrebljeni za subkutanu implantaciju u NOD.Cg-PrkdcS<cid>Il2rg<tm1Wjl>/SzJ miševe, što je rađeno pod anestezijom. Rast tumora je meren dva puta nedelјno sa nonijusom. Pre dostižanja veličine tumora od 1000 mm<3>, miševi su žrtvovani, tumori su uklonjeni i komadići tumora su disocirani u suspenzije
12
pojedinačnih ćelija, zasađeni u Petrijeve šolje od 10 cm i uzgajani kao primarne ćelijske kulture u DMEM-u 10% FBS (Sigma) 100 U/ml penicilina i 0,1 mg/ml streptomicin (sve od firme Gibco).
Imunoblot analiza
[0536] Ekspresija Axl i MITF je određena upotrebom imunoblot analize. Proteini u ćelijskom lizatu su razdvojeni na 4-12% SDS-PAGE gelu i preneti na PVDF membranu koja je naknadno obojena sa antitelom specifičnim za Axl (sc-1096 Santa Cruz) u 5% BSA/PBS-Tween-u, ili pak na nitroceluloznu membranu koja je zatim bojena na MITF (ab12039 Abcam) u 5% nemasnom mleku / PBS-Tween-u. Kao kontrola za nanošenje na gel, upotrebljavana su antitela za vinkulin ili beta-aktin.
Kvantifikacija ekspresije AXL na plazma membrani ćelijskih linija melanoma
[0537] Ekspresija AXL na plazma membrani humanih tumorskih ćelijskih linija je kvantifikovana indirektnom imunofluorescencijom i upotrebom QIFIKIT analize (DAKO, kat. br. K0078). Axl je detektovan upotrebom mišjeg monoklonskog antitela ab89224 (Abcam, Cambridge, Velika Britanija). Adherentne ćelije su tripsinizovane i propuštene kroz ćelijsko sito da bi se dobile suspenzije pojedinačnih ćelija. Ćelije su zatim istaložene centrifugiranjem tokom 5 minuta na 1200 obrtaja/min, isprane PBS-om i resuspendovane u koncentraciji od 1x10<6>ćelija/mL. Sledeći koraci su rađeni na ledu. Po 100 µL suspenzija pojedinačnih ćelija (100.000 ćelija po bunariću) je zasejano u polistirenske ploće sa 96 mesta i okruglim dnom (Greiner Bio-One, kat. br. 650101). Ćelije su dalje opet spuštene centrifugiranjem tokom 3 minuta na 300xg i resuspendovane u 50 µL uzorka antitela ili mišjeg IgG1 izotipskog kontrolnog uzorka (kat. broj QF2040741, serijski broj MA1-10406, Pierce) u koncentraciji od 10 µg/mL. Nakon inkubacije od 30 minuta na 4°C, ćelije su ponovo istaložene i resuspendovane u 150 µL FACS pufera (PBS koji je sadržavao 0,1% BSA). Zrna za podešavanje i kalibraciju su dodata na ploču prema uputstvima proizvođača. Ćelije i zrna su paralelno isprane dva puta sa 150 µL FACS pufera i resuspendovane u 50 µL kozjeg anti-mišjeg IgG konjugovanog sa FITC-om (1/50; DAKO, kat. br. K0078). Sekundarno antitelo je inkubirano tokom 30 minuta na 4°C u mraku. Ćelije i zrna su isprane dva puta sa 150 µL FACS pufera i resuspendovane u 100 µL FACS pufera. Imunofluorescencija je merena na FACS CantoII uređaju (BD Biosciences), snimanjem 10.000 događaja u vijabilnim ćelijama. Srednji intenzitet fluorescencije zrna za kalibraciju je upotrebljenza izračunavanje kalibracione krive upotrebom GraphPad Prism kompjuterskog programa (GraphPad Software, San Diego, CA, SAD). Za svaku ćelijsku liniju su izračunati kapacitet vezivanja antitela (ABC), kao procena broja AXL molekula koji su eksprimirani na plazma membrani koji je izračunat upotrebom srednje vrednosti intenziteta fluorescencije ćelija obojenih AXL antitelom, na osnovu jednačine kalibracione krive (interpolacijom nepoznatih vrednosti sa standardne krive, upotrebom GraphPad kompjuterskog programa).
In vitro citotoksičnost
[0538] Ćelije su gajenje do postizanja skoro potpune konfluentnosti, nakon čega su ćelije bile tripsinizovane, resuspendovane u medijumu za kulturu i propuštene kroz ćelijsko sito (BD Falcon, kat. br. 352340) da bi se dobila suspenzija pojedinačnih ćelija. Ćelije su zasejane na pločama sa 96 mesta upotrebom sledećih gustina za zasejavanje: 2000 ćelija/bunariću za ustanovljene ćelijske linije, 4000 ćelija/bunariću za ćelije koje su izvedene iz PDX. Četiri sata nakon zasejavanja, dodat je IgG1-AXL-107-vcMMAE. Serijska razblaženja (faktor razblaženja je bio 10 puta; finalne koncentracije su bile raspona od 0,0001 do 10 µg/mL) IgG1-AXL-107-vcMMAE su pripremlјena u medijumu za kulturu, pa su dodata
12
u ploče. Nakon 5 dana (za CD uzorke) ili 8 dana (za PDX uzorke) inkubacije na 37°C, 5% CO2, u bunariće je dodat CellTiter-Glo reagens (Promega; kat. br. G7571) i urađen je luminescentni test ćelijske vijabilnosti (Promega, Madison, WI) prema protokolu proizvođača. Luminiscencija je izmerena na čitaču mikrotitar ploča Infinite M200 (Tecan), a vijabilnost je izračunata na sledeći način: % vijabilnosti = (luminiscencija uzorka od interesa - luminescencija PAO)/(prosečna luminescencija tretiranog kontrolnog nosača - luminescencija PAO), pri čemu PAO predstavlјa 5 µM fenil arsinski oksid koji dovodi do ubijanja ćelija od 100%.
SKMEL147 model ksenografta melanoma
[0539] Anti-tumorska aktivnost IgG1-AXL-107-vcMMAE je ispitana u SKMEL147 modelu subkutanog melanoma kod NMRI “golih” miševa. Miševima je u levi bok subkutano ubrizgano 2,5x105 SKMEL147 ćelija melanoma koje eksprimiraju visoke nivoe Axl (pogledati Sliku 28 i Tabelu 15) i koje su bile resuspendovane u matrigelu u odnosu 1:1, u ukupnoj zapremini od 100 µL. Tumori su mereni tri puta nedelјno nonijusom, pa kada su tumori bili 100 mm3, životinje su nasumično raspoređene u sledeće grupe tretmana: za IgG1-b12 (4 mg/kg), IgG1-b12-vcMMAE (4 mg/kg), IgG1-107 (4 mg/kg), IgG1-107-vcMMAE (2 mg/kg) i IgG1-107-vcMMAE (4 mg/kg).
[0540] Dana 12 i 19 nakon ubrizgavanja tumorskih ćelija (1. i 8. dan nakon nasumične raspodele životinja), ispitivana jedinjenja su injecirana u repnu venu životinja u ukupnoj zapremini od 100 µL. Životinje su žrtvovane kada je veličina tumora prešla 1000 mm3.
Tretman mešovite populacije SKMEL28 ćelija divlјih vrsta i SKMEL28 ćelija rezistentnih na PLX4720
[0541] SKMEL28 ćelije divlјeg tipa i SKMEL28 ćelije rezistentne na PLX4720 (SKMEL28-R) su bile transfektovane sa ekspresionim vektorima koji su sadržavali fluorofore mCherry (crvena) ili GFP (zelena), tim redom. Nakon toga, ćelije su zasejane u odnosu od 1:1, sa po 50.000 ćelija svake ćelijske linije, u ploču sa 6 bunarića (ukupno 100.000 ćelija/bunariću). Nakon 3 sata, u bunariće su dodata sledeća jedinjenja: IgG1-AXL-107-vcMMAE (1 µg/mL), IgG1-b12-MMAE (1 µg/mL; izotipski kontrolni ADC), PLX4720 (10 µM; BRAF inhibitor), dabrafenib (1 µM; BRAF inhibitor) ili trametinib (0,1 µM; inhibitor MEK). Nakon 4 dana, ćelije su tripsinizovane, isprane jednom u PBS-u 1% BSA i analizirane protočnom citometrijom.
Imunohistohemija
[0542] Ekspresija AXL je analizirana na sveže isečenim presecima celokupnog tkiva (WT) sa malignim melanomom koje je bilo ukalupljeno u parafin i fiksirano formalinom (FFPE). Bojenje je urađeno manuelno, u nosačima za pločice firme Sequenza (Ted Pella Inc., Redding, CA, SAD; kat. br.36105).
[0543] Pre bojenja, FFPE preseci tkiva su deparafinisani u 100% ksilenu (Sigma-Aldrich, kat. br.16446; tri puta, 5 minuta) i dehidratisani u 96% etanolu (Sigma Aldrich, kat. br.32294; dva puta, 5 min.) na RT. Nakon toga, urađen je korak demaskiranja antigena. Preseci za imunohistohemiju su inkubirani u citratnom puferu (pH 6; DAKO; kat. br. S2369) tokom 5 minuta, pa je blokirana endogena peroksidaza u citratnom/fosfatnom puferu (0,43 M limunska kiselina; 0,35 M Na2HPO4.2H2O; pH 5,8) na RT tokom 15 min. Preseci su pre inkubacije sa primarnim antitelom inkubirani u 10% normalnog humanog seruma (CLB/Sanquin, kat. br. K1146) u PBS-u. Ekspresija Axl je određena inkubacijom sa 3 µg/ml zečjeg poliklonskog anti-humanog Axl antitela H-124 u PBS-u u koji je bilo dodato 2% normalnog humanog
12
seruma, na RT tokom 60 minuta. Preseci su zatim isprani u PBS-u u koji je bilo dodato 0,1% Tween-20 (dva puta, 3 min.), a dalje je vezivanje zečjih antitela specifičnih za Axl detektovano sa nerazblaženim Bright Vision poli-HRP-anti-zečjim IgG. HRP je vizualizovan sa 3-amino-9-etilkarbazolskom (AEC) hromoforom (crvena boja; Sigma, kat. br. A6926-100TAB); jedra su kontrastno obojena hematoksilinom (DAKO, kat. br. S3309). Preseci su analizirani od strane sertifikovanog patologa sa Holandskog instituta za kancer (NKI, Amsterdam, Holandija), koji je ocenjivao intenzitet i lokalizaciju Axl bojenja u svakom uzorku. Primeri su prikazani na Slici 39.
Rezultati
[0544] Ekspresija AXL je analizirana upotrebom panela ustanovljenih ćelijskih linija melanoma (Tabela 19) primarnih melanomskih linija niskog pasaža (PDX, Tabela 20). Ekspresija AXL, određena imunoblot analizom (Slika 28), bila je u obrnutoj korelaciji sa MITF ekspresijom u ustanovljeni ćelijskim linijama (Slika 28A), kao i kliničkim uzorcima dobijenim od pacijenata (Slika 28B). U panelu ustanovljenih ćelijskih linija, ekspresija Axl je takođe određena kvantitativnom protočnom citometrijom. Primer ćelijske linije koja je negativna i pozitivna na AXL je prikazan na Slici 29. Nivoi ekspresije Axl (izraženi kao ABC) za sve ćelijske linije su navedeni u vidu liste u Tabeli 19, zajedno sa statusom mutacija BRAF u ćelijskim linijama.
[0545] U sledećem koraku, procenjena je senzitivnost ustanovljenih ćelijskih linija melanoma i PDX panela na IgG1-AXL-107-vcMMAE, upotrebom testova vijabilnosti. Ćelije su tokom 5 dana bile izložene rastućim koncentracijama IgG1-AXL-107-vcMMAE (opsega od 1 x 10<-4>do 10 µg/mL), nakon čega je određivana ćelijska vijabilnost. Rezultati su sumirani u Tabelama 19 i 20, a krive doznih odgovora su prikazana na Slikama 30 i 31. Slika 30 pokazuje da su sve 4 ćelijske linije koje eksprimiraju AXL (SKMEL147, A875, A375R, SKMEL28R), od kojih su tri bile rezistentne na PLX4720, senzitine na tretman sa IgG1-AXL-107-vcMMAE. Dve ćelijske linije koje su bile negativne na AXL, COLO679 i SKMEL28, nisu pokazale promene vijabilnosti nakon tretmana sa IgG1-AXL-107-vcMMAE. Tri PDX uzorka rezistentna na PLX4720 su ispitana u testovima vijabilnosti upotrebom IgG1-AXL-107-vcMMAE. Slika 31 pokazuje da su dve PDX kulture sa visokom ekspresijom AXL-a, MO16 i MO19R, bile senzitivne na tretman sa IgG1-AXL-107-vcMMAE, dok PDX kultura M082 sa niskom ekspresijom AXL-a nije ispoljila drugačiji odgovor od onog koji je uočen kod IgG1-b12- vcMMAE kontrolnog tretmana.
Tabela 19. Karakteristike panela ćelijskih linija melanoma.
12
Tabela 20. Karakteristike kultura melanoma dobienih iz acienata
[0546] U SKMEL147 modelu ksenografta melanoma, miševi tretirani sa IgG1-b12, IgG1-b12-vcMMAE ili IgG1-AXL-107 nisu pokazali inhibiciju rasta tumora. IgG1-AXL-107-vcMMAE je indukovao inhibiciju rasta tumora sa 2 mg/kg, dok je doza od 4 mg/kg IgG1-AXL-107-vcMMAE izazvala snažnu regresiju tumora koja je trajala do oko 50 dana (Slika 36A).
[0547] HuMax-AXL-ADC u dozi od 4 mg/kg je ispoljio snažan anti-tumorski efekat, ali su tumori ponovo počeli da rastu nakon 50. dana. Četiri miša kod kojih je došlo do ponovnog rasta tumora nakon početne regresije tumora sa 4 mg/kg IgG1- AXL-107-vcMMAE su 55. dana ponovo tretirani sa jednom dozom od 4 mg/kg IgG1-AXL-107-vcMMAE, dok su radi poređenje praćena dva druga netretirana miša.
[0548] Ponovljen tretman sa 4 mg/kg IgG1-AXL-107-vcMMAE je doveo do regresije tumora kod sva četiri miša, dok je kod dva miša koji su paralelno praćeni došlo do rasta tumora (Slika 36B). Dva od četiri ponovo tretirana miša je ispoljila regresiju tumora koja je ostala do najmanja 80. dana, a ponovan rast tumora je uočen oko 70. dana kod dva druga miša kod kojih je tretman ponovljen (Slika 36B).
[0549] U mešovitoj populaciji SKMEL28 ćelija divljeg tipa i SKMEL28 ćelija rezistentnih na PLX4720, u odnosu na netretiranu kontrolu, ukupan broj ćelija je bio smanjen za 74-62% kada su ćelijske smeše bile tretirane sa IgG1-AXL-107-vcMMAE, PLX4720 ili dabrafenibom (Slika 37A). Tretiranje ćelijskih smeša sa kombinacijama IgG1-AXL-107-vcMMAE i PLX4720, IgG1-AXL-107-vcMMAE i dabrafeniba, dabrafeniba i trametiniba ili dabrafeniba, trametiniba i IgG1-AXL-107-vcMMAE je indukovalo smanjenje ukupnog broja ćelija za 81-92% u odnosu na netretirane ćelije (Slika 37A).
[0550] Da bi se ispitalo da li su specifične ćelijske populacije iskorenjene, određen je odnos zelene (od SKMEL28-R ćelija pozitivnih na GFP) i crvene boje (od SKMEL28-R ćelija pozitivnih na mCherry). Kao što je i očekivano, odsustvo tretmana i tretman sa IgG1-b12-vcMMAE nisu uticali na odnos GFP/mCherry, pošto ukupan broj ćelija takođe nije bio izmenjen (Slika 37B). Tretman sa IgG1-AXL-107-vcMMAE je rezultovao izrazito smanjenim odnosom GFP/mCherry (Slika 37B), što ukazuje na specifično ubijanje SKMEL28-R ćelija. Nasuprot navedenom, tretman BRAF inhibitorima, PLX4720 ili dabrafenibom, povećao je odnos GFP/mCherry (Slika 37B), što ukazuje na specifično ubijanje SKMEL28 ćelija. Kod kombinacija IgG1-AXL-107-vcMMAE i PLX4720, dabrafeniba i trametiniba ili dabrafeniba, trametiniba i IgG1-AXL-107-vcMMAE, utvrđen je odnos bliži 1 (Slika 37B), što ukazuje da su obe vrste ćelija bile ubijene sa sličnom efikasnošću. Tretman kombinacijom IgG1-AXL-107-vcMMAE i dabrafeniba je doveo do snažnog smanjenja GFP/mCherry odnosa (Slika 37B), što ukazuje na efikasnije ubijanje SKMEL28-R ćelija u upotreblјenim koncentracijama.
1
Rezultati IHC
[0551] Ukupno je analizirano 45 uzoraka, od kojih 3 nisu sadržavala tumorski materijal, zbog čega su isključeni iz analize. Pored toga, uklјučeno je 7 podudarnih uzoraka uzetih pre i nakon primene vemurafeniba kod istih pacijenata, kao i 1 podudarni uzorak pre - i nakon tretmana sa dabrafenibom/trametinibom.
[0552] U uzorcima 41/42 je detektovana ekspresija Axl u podgrupi regiona melanoma. Intenzitet obojenosti se razlikovao kod tumora iz pacijenata (Tabela 21).
[0553] Dodatno, primećena je pozitivna regulacija ekspresije Axl (izmerena od strane patologa kao povećanje intenziteta bojenja) u 4/7 podudarnih uzoraka pre i nakon tretmana sa vemurafenibom (Tabela 21).
Tabela 21. Bojenje Axl-a u tumorskom tkivu iz pacijenata sa melanomom.
1 1
12
Primer 24 - CV1664 PDX model
[0554] Anti-tumorska aktivnost IgG1-AXL-107-vcMMAE je ispitana u subkutanom CV1664 PDX modelu kancera grlića materice kod “golih” BALB/c miševa (eksperimenti izvedeni od strane firme CrownBioscience, okrug Changping, Peking, Kina). Inokulacija fragmenata tumora u “gole” BALB/c miševe i nasumična raspodela životinja su rađeni kao što je opisano u Primeru 21.
[0555] Tretman sa IgG1-AXL-107-vcMMAE (2 ili 4 mg/kg) je rađen Dana 0 i 7 nakon nasumične raspodele životinja po grupama (Slika 38). Kao kontrole su upotrebljeni tretmani paklitakselom (20 mg/kg; intraperitonealno), nekonjugovanim IgG1-AXL-107 (4 mg/kg), IgG1-b12-vcMMAE (4 mg/kg) i IgG1-b12 (4 mg/kg), u istim danima.
[0556] IgG1-AXL-107-vcMMAE je indukovao snažnu regresiju tumora u oba nivoa doze, koja je trajala najmanje do 49. dana (Slika 38A, B). Samostalan tretman sa nekonjugovanim IgG1-AXL-107 i IgG1-b12-vcMMAE je indukovao manju inhibiciju rasta tumora u poređenju sa IgG1-b12 kontrolnom grupom. Paklitaksel je indukovao delimičnu regresiju tumora.
[0557] Dva miša kod kojih je došlo do ponovnog rasta tumora nakon početne regresije tumora sa 4 mg/kg IgG1-AXL-107-vcMMAE, ponovo su tretirani sa 2 doze od 4 mg/kg IgG1-AXL-107-vcMMAE, 55. i 62. dana. Rezultat navedenog je bila delimična regresija tumora kod oba miša (Slika 38C). Nakon ponovnog rasta tumora, ovi miševi su ponovo tretirani sa 2 doze IgG1-AXL-107-vcMMAE od 4 mg/kg, 105. i 112. dana, što je dovelo do delimične regresije tumora kod obe životinje (Slika 38C).
[0558] Tri miša kod kojih je došlo do ponovnog rasta tumora nakon početne regresije tumora sa paklitakselom, ponovo su tretirani sa 2 doze od 4 mg/kg IgG1-AXL-107-vcMMAE, 55. i 62. dana. Kod dva od tri miša je došlo do potpune regresije tumora nakon ponovnog tretmana sa IgG1-AXL-107-vcMMAE (Slika 38D). Kod preostalog miša je došlo do delimične regresije tumora. Nakon ponovnog rasta tumora, ovaj miš je ponovo tretiran sa 2 doze od 4 mg/kg IgG1-AXL-107-vcMMAE, 98. i 105. dana, što je opet dovelo do delimične regresije tumora (Slika 38D).
1
SPISAK REFERENCI
[0559]
Bahadoran i saradnici, J Clin Oncol; 2013, 1.jul; 31(19): e324-e326
Bansal i saradnici, Oncotarget.2015, 20. jun; 6(17):15321-31
Blakely i saradnici, Cancer Discov.2012, okt; 2(10):872-5
Bleeker i saradnici, J Immunol.2004, 1. okt.; 173(7):4699-707.
Bollag i saradnici, Nat Rev Drug Discov 2012, nov; 11(11):873-86
Brand i saradnici, Clin Cancer Res.2015, 1. jun; 21(11):2601-12
Dahlman i saradnici, Cancer Discov.2012, sep; 2(9):791-7. Epub 13. jul 2012.
Debruyne i saradnici, Oncogene.2015, 30. nov, doi: 10.1038/onc.2015.434
Dufies i saradnici, Oncotarget.2011, nov; 2(11):874-85
Elkabets i saradnici, Cancer Cell.2015, 13. april; 27(4):533-46
Greig i saradnici, Drugs, 2016, feb; 76(2):263-73.
Herbst i saradnici, Expert Opin Investig Drugs. februar 2007.16(2):239-49
Hilger i saradnici, Int J Clin Pharmacol Ther.2002. dec; 40(12):567-8.
Hong i saradnici, Cancer Lett.18. septembar 2008.268(2):314-24.
Hong i saradnici, Cancer Res.2013, 1. januara 73(1):331-40.
Hong i saradnici, Clin Cancer Res.2012, 15. apr; 18(8):2326-35.
Huang i saradnici, Cancer Res.15. sep 2010., 70(18):7221-31. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-10-0391 Kim i saradnici, Curr Opin Mol Ther.2004, februar; 6(1):96-103.
Kim i saradnici, Mol Oncol.2013, 7. dec; (6):1093-102.
Konieczkowski i saradnici, 2014, Cancer Discov 4: 816-827.
Li i saradnici, Oncogene.2008, 7. avg; 27(34):4702-11.
Li i saradnici, Cancer Lett.2016, 28. jan; 370(2):332-44.
Liu i saradnici, Cancer Res.1. sep 2009, 69(17):6871-8
Mahadevan i saradnici, Oncotarget.2015, 10. feb.; 6(4):1954-66
Mordant i saradnici, Mol Cancer Ther.2010, Feb; 9(2):358-68
Muller i saradnici, Nat Commun.2014, 15. decembar; 5:5712
Park i saradnici, Leukemia.2015, dec.; 29(12):2382-9
Pettazzoni i saradnici, Cancer Research 2015; 75:1091-1101.
Pollack i saradnici, J. Pharmacol Ekp Ther.1999, nov.; 291(2):739-48
Prewett i saradnici, J Immugether Emphasis Tumor Immunol.1996, nov.; 19(6):419-27.
Sirotnak i saradnici, Clin Cancer Res.2000, dec; 6(12):4885-92.
Talavera i saradnici, Cancer Res.15. jula 2009; 69(14):5851-9
Tan i saradnici, Lung Cancer.2012, maj; 76(2):177-82.
Wilson i saradnici, Cancer Res.2014, 15. okt.; 74(20):5878-90
Wong i saradnici, J. Pharmacol Exp Ther. April 2009; 329(1):360-7.
Xia i saradnici, Oncogene.2002, 12. septembar; 21(41):6255-63.
Yang i saradnici, Crit Rev Oncol Hematol.2001, apr; 38(1):17-23.
Zhang i saradnici, Nat Genet.2012, 1. jul; 44(8):852-60
Zhou i saradnici, Oncogene.2016, maj; 35(21):2687-97
WO 2014/174111; Pierre Fabré Medicament i Spirogen Sarl
WO 09/062690; U3 Pharma
WO 2010/130751; U3 Pharma
WO 2014/093707; Stanford univerzitet
EP 2228392 A1; Chugai
Yang i saradnici, EORTC sastanak 2013, poster 493 (2013a)
Yang i saradnici, Int. J. Cancer: 132, E74-E84 (2013b)
1 4
Paccez i saradnici, Int. J. Cancer: 134, 1024-1033 (2014) (Epub 2013, 4. jun)
Leconet i saradnici, Oncogene, 1-10 (2013)
Linger i saradnici, Expert Opin. Ther. Targets, 14(10):1073-1090 (2010.)
Li i saradnici, Oncogene, 28, 3442-3455 (2009)
Ye i saradnici, Oncogene, 1-11 (2010)
Alley i saradnici, Current Opinion in Chem. Bio., 4, 529-537 (2010.)
lida i saradnici, Anticancer Research, 34:1821-1828 (2014)
Tschuch i saradnici, AACR-EORTC sastanak 2015, poster A10 (2015)
King i saradnici, Cancer Res.2006, dec 1; 66(23):11100-5.
Montagut i saradnici, J.Cancer Res.15. jun 2008., 68(12):4853-61.
Sequist i saradnici, N Engl J Med.2015, 6. avgust; 373(6):578-9
Li i saradnici, Structure. februar 2008; 16(2):216-27
Pedersen i saradnici, Cancer Res.15. januar 2010., 70(2):588-97.
Mishima i saradnici, Cancer Res.2001, 15. jul; 61(14):5349-54
WO 2012/175691; INSERM
WO 2012/175692; INSERM
WO 2013/064685; PF Medicament
WO 2013/090776; INSERM
WO 2009/063965; Chugai Pharmaceuticals
WO 2010/131733
Hfizi i saradnici, 2006, FEBS Journal, 273; 5231-5244
WO 2007/059782; Genmab A/S
Ward i saradnici, Nature 341, 544-546 (1989)
Holt i saradnici; Trends Biotechnol.2003, nov; 21(11):484-90
Revets i saradnici; Expert Opin Biol Ther.2005, jan; 5(1):111-24
Bird i saradnici, Science 242, 423-426 (1988)
Huston i saradnici, PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)
Fundamental immunology, poglavlje 7 (Paul W., ur., drugo izd. Raven Press, N. Y. (1989)
Lefranc MP. i saradnici, Nucleic Acids Research, 27 i saradnici, 209-212, 1999
Brochet X. Nucl. Acids Res.36, W503-508 (2008)
Korshunov i saradnici, Clin Sci (Lond).2012, apr; 122(8):361-8.
Sambrook i saradnici, Molecular Cloning: A laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, poglavlje 15
Kabat, E.A. i saradnici, Sequences of proteins of immunological interest.5. izdanje - US Department of Health and Human Services, NIH publication No.91-3242, pp 662,680,689 (1991)
WO 2004/010957; Seattle Genetics, Inc.
US 7,659,241; Seattle Genetics, Inc.
Wu i saradnici, Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, U: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)
WO 2011/131746; Genmab A/S
WO/2002/020039; Trion Pharma/Fresenius Biotech
WO9850431; Genetech
WO2011117329; Roche
EP1870459; Amgen
WO2009089004; Amgen
US 2010/00155133; Chugai
WO 2010/129304; Oncomed
WO2007/110205; EMD Serono
WO 2010/015792; Regeneron
WO 11/143545; Pfizer/Rinat
WO 2012/058768: Zymeworks/Merck
WO 2011/028952; Xencor
1
WO 2009/080254; Roche
WO 2008/003116; F-Star
US 7,262,028; Crucell/Merus
US 7,612,181; Abbott
WO 2010/0226923; Unilever, Sanofi Aventis
US 7,951,918; Biogen Idec
CN 102250246; Changzhou Adam Biotech Inc
WO 2012/025525; Roche
WO 2012/025530; Roche
WO 2008/157379; Macrogenics
WO 2010/080538; Macrogenics
Goodman i saradnici, Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis Of Therapeutics, 8. izd., Macmillan Publishing Co., 1990
Vitetta, Immunol. Today 14, 252 (1993)
US 5,194,594
US 2005/0238649
WO 2013/173391; Concortis Biosystems, Corp.
Junghans i saradnici, u Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2. izdanje, Chafner and Longo, ur., Lippincott Raven (1996))
US 4,681,581
US 4,735,210
US 5,101,827
US 5,102,990
US 5,648,471
US 5,697,902
US 4,766,106
US 4,179,337
US 4,495,285
US 4,609,546
Hunter i saradnici, Nature 144, 945 (1962), David i saradnici, Biochemistry 13, 1014 (1974)
Pain i saradnici, J. Immunol. Meth.40, 219 (1981.)
Nygren, J. Histochem. and Citochem.30, 407 (1982)
Antibody Engineering Handbook, uredio Osamu Kanemitsu, objavio Chijin Shokan (1994.)
WO 2002/083180; Syngenta BV
WO 2004/043493; Syngenta BV
WO 2007/018431; Syngenta BV
WO 2007/089149; Syngenta BV
WO 2009/017394; Syngenta BV
WO 2010/62171; Syngenta BV
US 6,989,452; Medarex
Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. izdanje, Gennaro, ur., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995
Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ur., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978
Sikes i Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)
US 6,077, 835
WO 00/70087
Schakowski i saradnici, Mol Ther 3, 793-800 (2001)
WO 00/46147
Benvenisty i Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986)
Wigler i saradnici, Cell 14, 725 (1978.)
Coraro i Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981.)
1
US 5,589,466
US 5,973,972
Van Heeke i Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989)
Ausubel i saradnici, izd. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987)
Grant i saradnici, Methods in Enzimol 153, 516-544 (1987)
Lonberg, N. i saradnici, Nature 368, 856859 (1994a)
Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49101 (1994b)
Lonberg, N. i Huszar, D., Intern. Rev. Immunol, vol.136593 (1995)
Harding, F. i Lonberg, N. Ann N. Y. Acad. Sci 764536546 (1995)
Taylor, L. i saradnici, Nucleic Acids Research 20, 62876295 (1992)
Chen, J. i saradnici, International Immunology 5, 647656 (1993)
Tuaillon i saradnici, J. Immunol.152, 29122920 (1994)
Tailor, L. i saradnici, International Immunology 6, 579591 (1994)
Fishwild, D. i saradnici, Nature Biotechnology 14, 845851 (1996)
US 5,545,806
US 5,569,825
US 5,625,126
US 5,633,425
US 5,789,650
US 5,877,397
US 5,661,016
US 5,814,318
US 5,874,299
US 5,770,429
US 5,545,807
WO 98/024884
WO 94/025585
WO 93/001227
WO 92/022645
WO 92/003918
WO 01/009187
Shieh, Neoplasia 2005
Koorstra, Cancer Biol Ther 2009
Hector, Cancer Biol Ther 2010
Sun, Ann Oncol, 2003
Srivastava (ur.), Radiolabeled Monoclonal Antibodies For Imaging And Therapy (Plenum Press 1988), Chase "Medical Applications of Radioisotopes," u Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18. izdanje, Gennaro i saradnici, (ur.), str.624-652 (Mack Publishing Co., 1990) Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies," u Biotechnology And Pharmacy 227-49, Pezzuto i saradnici., (ur.) (Chapman & Hall 1993)
US 5,057,313
US 6,331,175
US 5,635,483
US 5,780,588
Woyke i saradnici (2001) Antimicrob. Agents and Chemother.45(12):3580-3584
US5663149
Pettit i saradnici, (1998) Antimicrob. Agents and Chemother.42:2961-2965
Senter i saradnici, Proceedings of the American Association for Cancer Research. Vol. 45, broj apstrakta 623, predstavlјen 28. marta 2004.
US 2005/0238649
US 7,498,298; Seattle Genetics, Inc.
1
US 7,994,135; Seattle Genetics, Inc.
WO 2005/081711; Seattle Genetics, Inc.
Kozak i saradnici (1999) Gene 234: 187-208
EP 2220131; U3 Pharma
WO 2011/159980; Genentech
Barbas, CF. J Mol Biol.1993, 5. april; 230(3):812-23 US 7,829,531; Seattle Genetics, Inc.
US 7,851,437; Seattle Genetics, Inc.
WO 2013/173392; Concortis Biosystems, Corp.
WO 2013/173393; Concortis Biosystems, Corp.
Sun i saradnici (2005) Bioconjugate Chem.16: 1282-1290 McDonagh i saradnici, (2006) Protein Eng. Design Sel.19: 299-307 Alley i saradnici, (2008) Bioconjugate Chem.19: 759-765
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
�
11
��
�
14
�
�
�
1
�
�
11
12
�
��
�
�
1
�
�
�
21
22
�
��
2
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
�
21
22
�
��
2
�
�
�
2
24

Claims (37)

Patentni zahtevi
1. Konjugat antitela i leka (ADC) koji sadrži antitelo koje se vezuje za humani AXL za upotrebu u lečenju kancera rezistentnog na najmanje jedan terapijski agens izabran iz grupe koja se sastoji od inhibitora tirozin kinaze, inhibitora serin/treonin kinaze i hemoterapijskog agensa, pri čemu ADC sadrži najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 36, 37 i 38, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom.
2. ADC za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde je inhibitor tirozin kinaze izabran iz grupe koja se sastoji od erlotiniba, afatiniba, gefitiniba, lapatiniba, osimertiniba, rociletiniba, imatiniba, sunitiniba, krizotiniba, midostaurina (PKC412) i kvizartiniba (AC220).
3. ADC za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde je inhibitor serin/treonin kinaze inhibitor BRAF ili inhibitor MEK.
4. ADC za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, gde
(a) inhibitor BRAF je izabran iz grupe koja se sastoji od vemurafeniba (PLX4032), dabrafeniba i bilo kog od njihovih terapijski efektivnih analoga ili derivata, kao što je PLX4720;
(b) inhibitor MEK izabran od trametiniba i selumetiniba (AZD6244) i bilo kog od njihovih terapijski efektivnih analoga ili derivata.
5. ADC za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde je hemoterapijski agens izabran iz grupe koja se sastoji od paklitaksela, docetaksela, cisplatina, metformina, doksorubicina, etopozida, karboplatina ili njihove kombinacije.
6. ADC za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde
(a) inhibitor tirozin kinaze je izabran od antagoniste receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR), antagoniste HER2, inhibitora ALK i inhibitora FLT3 ili bilo koje njihove kombinacije;
(b) inhibitor serin/treonin kinaze je izabran između inhibitora BRAF i inhibitora MEK ili njihove kombinacije;
(c) hemoterapijski agens je izabran od paklitaksela, docetaksela, cisplatina, metformina, doksorubicina, etopozida, karboplatina ili njihove kombinacije.
7. ADC za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, gde
(a) inhibitor tirozin kinaze je inhibitor EGFR;
(b) inhibitor serin/treonin kinaza je inhibitor BRAF; i
(c) hemoterapijski agens je taksan.
8. ADC za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu kancer predstavlja kancer koji eksprimira AXL.
9. ADC za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je kancer izabran od melanoma, nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC), kancera grlića materice, karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata (SCCHN), kancera dojke, gastrointestinalnog stomalnog tumora (GIST), renalnog kancera, kancera prostate, neuroblastoma, kancera pankreasa, kancera jednjaka, rabdomiosarkoma, akutne mijeloidne leukemije (AML) ili hronične mijeloidne leukemije (CML).
10. ADC za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koji je za upotrebu u kombinaciji sa terapijskim agensom, pri čemu se ADC i terapijski agens primenjuju istovremeno, odvojeno ili sekvencijalno.
11. ADC za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, za upotrebu u lečenju NSCLC rezistentnog na agens koji inhibira EGFR, kao što je erlotinib.
12. ADC za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koji je za upotrebu u lečenju melanoma rezistentnog na vemurafenib.
13. ADC za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koji je za upotrebu u lečenju kancera grlića materice rezistentnog na paklitaksel ili njegov terapijski efektivan analog ili derivat, kao što je docetaksel.
14. ADC za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde ADC sadrži citotoksični agens, hemoterapijski lek ili radioizotop vezan za antitelo.
15. ADC za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je terapijski ostatak citotoksičan agens, opciono povezan za ADC putem linkera.
16. ADC za upotrebu prema patentnom zahtevu 15, gde je citotoksičan agens povezan sa antitelom preko linkera koji je podložan cepanju kao što je N-sukcinimidil 4-(2-piridilditio)-pentanoat (SSP), maleimidokaproil-valin-citrulin-p-aminobenziloksikarbonil (mc-vc-PAB) ili AV-1 K-lock valincitrulin.
17. ADC za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 15 do 16, gde je citotoksičan agens povezan sa antitelom preko linkera koji nije podložan cepanju, kao što je sukcinimidil-4(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat (MCC) ili maleimidokaproil (MC).
18. ADC za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 15 do 17, gde je citotoksičan agens izabran iz grupe koja se sastoji od agenasa koji ciljano deluju na DNK, npr. DNK alkilatora i umreživača, kao što su kaliheamicin, duokarmicin, rahelmicin (CC-1065), pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepini (PBD) i indolinobenzodiazepin (IGN); agenasa koji ciljano deluju na mikrotubule, poput duostatina, kao što su duostatin-3, auristatin, kao što su monometilauristatin E (MMAE) i monometilauristatin F (MMAF), dolastatin, majtanzin, N(2')-deacetil-N(2')-(3-markapto-1-oksopropil)-majtanzin (DM1) i tubulizin; i nukleozidni analozi; ili njihovi analozi, derivati ili prolekovi.
19. ADC za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 15 do 18, gde
(a) linker je podložan cepanju i citotoksičan agens karakteriše kapacitet ubijanja susednih ćelija;
(b) linker je podložan cepanju i citotoksičan agens ne karakteriše kapacitet ubijanja susednih ćelija;
(c) linker nije podložan cepanju i citotoksičan agens karakteriše kapacitet ubijanja susednih ćelija; ili
(d) linker nije podložan cepanju i citotoksičan agens ne karakteriše kapacitet ubijanja susednih ćelija.
20. ADC za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 15 do 19, gde je linker mc-vc-PAB i citotoksičan agens je MMAE.
21. ADC za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 15 do 19, gde je linker SSP i citotoksičan agens je DM1.
22. ADC za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 15 do 19, gde je lek duostatin3.
23. ADC za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je aminokiselinska sekvenca humanog AXL kao što je navedeno u SEQ ID NO: 130.
24. ADC za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koji se vezuje za AXL cinomolgus majmuna koji je kao što je navedeno u SEQ ID NO: 147.
25. ADC za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde antitelo sadrži najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region koji je najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 97%, kao što je na najmanje 99% identičan sa SEQ ID NO: 1 i VL region koji je najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 97%, kao što je najmanje 99% identičan sa SEQ ID NO: 2 [107].
26. ADC za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde najmanje jedan region za vezivanje sadrži VH region koji sadrži SEQ ID NO: 1 i VL region koji sadrži SEQ ID NO: 2 [107].
27. ADC za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde
antitelo sadrži najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 36, 37 i 38, tim redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID NOs.: 39, GAS i 40, tim redom, [107],
linker je mc-vc-PAB i
citotoksični agens je MMAE.
28. ADC za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu se antitelo vezuje za epitop na AXL i pri čemu epitop biva prepoznat od strane bilo kog antitela koje je definisano u patentnom zahtevu 19.
29. ADC za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu se antitelo vezuje za epitop unutar Ig1 domena AXL, epitop sadrži ili zahteva jednu ili više aminokiselina koje odgovaraju pozicijama od L121 do Q129 ili od T112 do Q124 humanog AXL.
30. ADC za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde antitelo sadrži teški lanac izotipa izabranog iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4.
31. ADC za upotrebu prema patentnom zahtevu 30, gde je izotip IgG1, opciono alotip IgGlm(f).
32. ADC prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koje je monoklonsko antitelo pune dužine, kao što je monoklonsko IgG1,κ antitelo pune dužine.
33. ADC za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 32, gde antitelo predstavlja antitelo sa deficijencijom u efektorskim funkcijama, stabilizovano IgG4 antitelo ili monovalentno antitelo.
34. ADC za upotrebu prema patentnom zahtevu 33, gde je teški lanac modifikovan tako da je deletiran ceo zglobni region.
35. ADC za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 33 i 34, gde je sekvenca antitela modifikovana tako da ne sadrži nijedno akceptorsko mesto za N-vezanu glikozilaciju.
36. ADC za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je antitelo jednolančano antitelo.
37. ADC za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je antitelo bispecifično antitelo koje sadrži prvi region za vezivanje antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva i drugi region za vezivanje koji vezuje različit ciljni molekul ili epitop u odnosu na prvi region za vezivanje.
RS20200419A 2015-07-10 2016-07-08 Konjugati antitela specifičnog za axl i lekova za lečenje kancera RS60141B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2015/065900 WO2016005593A1 (en) 2014-07-11 2015-07-10 Antibodies binding axl
US201662278283P 2016-01-13 2016-01-13
PCT/EP2016/066353 WO2017009258A1 (en) 2015-07-10 2016-07-08 Axl-specific antibody-drug conjugates for cancer treatment
EP16739079.8A EP3319993B1 (en) 2015-07-10 2016-07-08 Axl-specific antibody-drug conjugates for cancer treatment

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60141B1 true RS60141B1 (sr) 2020-05-29

Family

ID=57756861

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200419A RS60141B1 (sr) 2015-07-10 2016-07-08 Konjugati antitela specifičnog za axl i lekova za lečenje kancera

Country Status (22)

Country Link
US (4) US20180326084A1 (sr)
EP (3) EP3319993B1 (sr)
JP (5) JP6892431B2 (sr)
KR (1) KR20180033523A (sr)
CN (3) CN108368171A (sr)
AU (3) AU2016292762B2 (sr)
CA (2) CA2991805A1 (sr)
CY (1) CY1123983T1 (sr)
DK (1) DK3319993T3 (sr)
EA (2) EA201890272A1 (sr)
ES (2) ES2784685T3 (sr)
HR (1) HRP20200551T1 (sr)
HU (1) HUE049072T2 (sr)
IL (2) IL256790B (sr)
LT (1) LT3319993T (sr)
ME (1) ME03772B (sr)
PL (1) PL3319993T3 (sr)
PT (1) PT3319993T (sr)
RS (1) RS60141B1 (sr)
SI (1) SI3319993T1 (sr)
SM (1) SMT202000359T1 (sr)
WO (2) WO2017009258A1 (sr)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL296633A (en) 2014-07-11 2022-11-01 Genmab As Antibodies that bind axl
CA2991805A1 (en) * 2015-07-10 2017-01-19 Genmab A/S Axl-specific antibody-drug conjugates for cancer treatment
JP2019505520A (ja) 2016-01-13 2019-02-28 ゲンマブ エー／エス 抗体およびその薬物コンジュゲートの製剤
CN109311858B (zh) 2016-05-26 2021-12-03 里科瑞尔姆Ip控股有限责任公司 Egfr抑制剂化合物
WO2018007592A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Genmab A/S New dosage regimens for antibody drug conjugates based on anti-axl antibodies
WO2018051306A1 (en) 2016-09-19 2018-03-22 Novartis Ag Therapeutic combinations comprising a raf inhibitor and a erk inhibitor
MX393780B (es) 2017-01-17 2025-03-24 Heparegenix Gmbh Inhibidores de proteina cinasa para promover la regeneracion hepatica o reducir o prevenir la muerte de hepatocitos
KR20240032157A (ko) 2017-05-02 2024-03-08 노파르티스 아게 병용 요법
KR102811888B1 (ko) * 2017-09-08 2025-05-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 암의 진단 및 치료 방법
SG11202002331QA (en) * 2017-09-13 2020-04-29 Nat Res Council Canada Axl-specific antibodies and uses thereof
CN111936141A (zh) * 2018-03-30 2020-11-13 诺华股份有限公司 包含达拉菲尼、曲美替尼和erk抑制剂的三重药物组合
MA52657A (fr) * 2018-04-10 2021-02-17 Genmab As Anticorps spécifiques d'axl pour le traitement du cancer
CN110483639A (zh) 2018-05-15 2019-11-22 复旦大学 靶向axl的抗体及抗体-药物偶联物及其制备方法和用途
CN110540592B (zh) 2018-05-29 2022-08-09 杭州尚健生物技术有限公司 结合axl蛋白的抗体及其应用
EP3856783A1 (en) * 2018-09-26 2021-08-04 Genmab A/S Axl-specific antibodies for treatment of non-small cell lung cancer
WO2020188086A1 (en) * 2019-03-20 2020-09-24 Imcheck Therapeutics Sas Antibodies having specificity for btn2 and uses thereof
WO2020205576A1 (en) * 2019-03-29 2020-10-08 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-axl antibodies and methods of use thereof
MX2021013817A (es) 2019-05-13 2021-12-14 Novartis Ag Nuevas formas cristalinas de n-(3-(2-(2-hidroxietoxi)-6-morfolinop iridin-4-il)-4-metilfenil)-2-(trifluorometil)isonicotinamida como inhibidores de raf para el tratamiento del cancer.
WO2021154156A1 (en) * 2020-01-31 2021-08-05 Agency For Science, Technology And Research Anti-axl antibody and uses thereof
CN115210263A (zh) * 2020-02-28 2022-10-18 西福根有限公司 抗axl抗体和组合物
CN115551509A (zh) * 2020-05-12 2022-12-30 诺华股份有限公司 包含craf抑制剂的治疗组合
WO2022026807A2 (en) * 2020-07-30 2022-02-03 Albert Einstein College Of Medicine Antibodies targeting sars-cov-2 and uses thereof
KR20230107606A (ko) * 2020-11-06 2023-07-17 데이 원 바이오파마슈티칼즈, 인크. 저등급 신경교종 치료를 위한 raf 억제제
KR102549520B1 (ko) 2021-01-29 2023-07-03 일리미스테라퓨틱스 주식회사 비염증성 식세포작용 유도 활성을 갖는 융합분자
CN117177754A (zh) * 2021-02-19 2023-12-05 首日生物制药公司 Raf抑制剂和mek抑制剂的组合
AU2024224437A1 (en) * 2023-02-22 2025-08-14 Resolute Science, Inc. Compositions and methods for targeting tumor-associated macrophages
WO2024178140A1 (en) * 2023-02-22 2024-08-29 Resolute Science, Inc. Compositions and methods for targeting tumor-associated macrophages

Family Cites Families (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US761218A (en) 1899-10-05 1904-05-31 U S Standard Voting Machine Co Register or counter.
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4681581A (en) 1983-12-05 1987-07-21 Coates Fredrica V Adjustable size diaper and folding method therefor
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US5101827A (en) 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
US5648471A (en) 1987-12-03 1997-07-15 Centocor, Inc. One vial method for labeling antibodies with Technetium-99m
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
ATE172879T1 (de) 1989-08-09 1998-11-15 Rhomed Inc Direkte radioetikettierung von antikörpern und sonstigen proteinen mittels technetium oder rhenium
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5194594A (en) 1990-09-07 1993-03-16 Techniclone, Inc. Modified antibodies
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
JPH06508880A (ja) 1991-07-08 1994-10-06 ユニバーシティ　オブ　マサチューセッツ　アット　アムハースト サーモトロピック液晶セグメント化ブロックコポリマー
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
DK0979281T3 (da) 1997-05-02 2005-11-21 Genentech Inc Fremgangsmåde til fremstilling af multispecifikke antistoffer med heteromultimere og fælles bestanddele
DE60013773T2 (de) 1999-02-03 2005-11-10 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Methoden zur Herstellung von therapeutischen Kalziumphosphat Partikeln
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
IL147765A0 (en) 1999-07-29 2002-08-14 Medarex Inc HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO HER2/neu
DE10043437A1 (de) 2000-09-04 2002-03-28 Horst Lindhofer Verwendung von trifunktionellen bispezifischen und trispezifischen Antikörpern zur Behandlung von malignem Aszites
EP1243276A1 (en) 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
US7129261B2 (en) 2001-05-31 2006-10-31 Medarex, Inc. Cytotoxic agents
PT2314629E (pt) 2002-07-18 2014-01-22 Merus B V Produção recombinante de misturas de anticorpos
DK1545613T3 (da) 2002-07-31 2011-11-14 Seattle Genetics Inc Auristatinkonjugater og deres anvendelse til behandling af cancer, en autoimmun sygdom eller en infektiøs sygdom
WO2004043493A1 (en) 2002-11-14 2004-05-27 Syntarga B.V. Prodrugs built as multiple self-elimination-release spacers
CN107213469A (zh) 2003-11-06 2017-09-29 西雅图基因公司 能够与配体偶联的单甲基缬氨酸化合物
US7741568B2 (en) 2005-01-13 2010-06-22 The Wiremold Company Downward facing receptacle assembly for cable raceway
TWI671403B (zh) 2005-03-31 2019-09-11 中外製藥股份有限公司 控制組裝之多肽的製造方法
CA2617907A1 (en) 2005-08-05 2007-02-15 Syntarga B.V. Triazole-containing releasable linkers and conjugates comprising the same
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
AU2006317242A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
CN101415679A (zh) 2006-02-02 2009-04-22 辛塔佳有限公司 水溶性cc-1065类似物及其缀合物
GEP20135917B (en) 2006-03-17 2013-09-10 Biogen Idec Inc Stabilized polypeptide compositions
ES2395969T3 (es) 2006-03-24 2013-02-18 Merck Patent Gmbh Dominios de proteínas heterodiméricas genéticamente modificados
AT503902B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von immunglobulinen
EP2070956A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Total Petrochemicals Research Feluy Process for the production of a bimodal polypropylene having low ash content
ES2702087T3 (es) 2007-06-21 2019-02-27 Macrogenics Inc Diacuerpos covalentes y sus usos
WO2009017394A1 (en) 2007-08-01 2009-02-05 Syntarga B.V. Substituted cc-1065 analogs and their conjugates
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
CN101939336B (zh) * 2007-11-12 2014-05-14 U3制药有限公司 Axl抗体
TW200936160A (en) 2007-11-15 2009-09-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Monoclonal antibodies that bind to anexelekto and uses thereof
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
WO2010015792A1 (en) 2008-08-06 2010-02-11 Argenta Discovery Limited Nitrogen containing heterocyclic compounds useful as bifunctional modulators of m3 receptors and beta-2 receptors
JP5397668B2 (ja) 2008-09-02 2014-01-22 ソニー株式会社 記憶素子および記憶装置
CA2742568C (en) 2008-11-03 2017-09-26 Syntarga B.V. Novel cc-1065 analogs and their conjugates
SG172254A1 (en) 2008-12-19 2011-07-28 Macrogenics Inc Covalent diabodies and uses thereof
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
MX2011011825A (es) 2009-05-11 2011-12-06 U3 Pharma Gmbh Anticuerpos humanizados para axl.
CN102459344A (zh) 2009-05-15 2012-05-16 中外制药株式会社 抗axl抗体
KR101747103B1 (ko) 2009-06-26 2017-06-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
LT2769737T (lt) * 2009-07-20 2017-06-26 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ctla4 antikūno derinys su etopozidu, skirtas sinerginiam proliferacinių ligų gydymui
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
EP2548027A2 (en) * 2010-03-18 2013-01-23 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method for predicting the responsiveness to chemotherapy
TWI426920B (zh) 2010-03-26 2014-02-21 Hoffmann La Roche 雙專一性、雙價抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體
PL2560993T3 (pl) 2010-04-20 2024-11-04 Genmab A/S Heterodimeryczne białka zawierające region FC przeciwciała i sposoby ich wytwarzania
CA2797981C (en) 2010-05-14 2019-04-23 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
WO2011159980A1 (en) 2010-06-18 2011-12-22 Genentech, Inc. Anti-axl antibodies and methods of use
RU2608640C2 (ru) 2010-08-16 2017-01-23 Новиммун С.А. Способы получения мультиспецифичных и мультивалентных антител
RU2013110876A (ru) 2010-08-24 2014-09-27 Рош Гликарт Аг Активируемые биспецифические антитела
RU2013110875A (ru) 2010-08-24 2014-09-27 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА, СОДЕРЖАЩИЕ СТАБИЛИЗИРОВАННЫЙ ДИСУЛЬФИДОМ ФРАГМЕНТ Fv
AU2011325833C1 (en) 2010-11-05 2017-07-13 Zymeworks Bc Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain
CN102250246A (zh) 2011-06-10 2011-11-23 常州亚当生物技术有限公司 抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体及其应用
JP6033293B2 (ja) * 2011-06-22 2016-11-30 インサーム（インスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル）Ｉｎｓｅｒｍ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｌａ Ｓａｎｔｅ Ｅｔ Ｄｅ Ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌｅ） 抗Ａｘｌ抗体及びその使用
WO2012175692A1 (en) 2011-06-22 2012-12-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-axl antibodies and uses thereof
EP2589609A1 (en) 2011-11-03 2013-05-08 Pierre Fabre Medicament Antigen binding protein and its use as addressing product for the treatment of cancer
US9879061B2 (en) 2011-12-15 2018-01-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Inhibition of AXL/GAS6 signaling in the treatment of liver fibrosis
HRP20201004T1 (hr) 2011-12-20 2020-10-16 Medimmune, Llc Modificirani polipeptidi za skelete bispecifičnog protutijela
DK2838917T3 (da) 2012-04-20 2019-08-26 Merus Nv Fremgangsmåder og midler til frembringelse af heterodimere ig-lignende molekyler
HK1208216A1 (en) 2012-05-15 2016-02-26 Concortis Biosystems, Corp Drug-conjugates, conjugation methods, and uses thereof
US9624308B2 (en) * 2012-11-05 2017-04-18 Pierre Fabre Medicament Antigen binding proteins
US20150315552A1 (en) 2012-12-14 2015-11-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Inhibition of AXL Signaling in Primary Tumor Therapy
US20160097370A1 (en) * 2013-03-26 2016-04-07 James L. Rodgers High-torque wind turbine
WO2014174111A1 (en) 2013-04-26 2014-10-30 Pierre Fabre Medicament Axl antibody-drug conjugate and its use for the treatment of cancer
US10028958B2 (en) * 2014-04-19 2018-07-24 Massachusetts Institute Of Technology Methods of treating cancer with a combination of selected MEK1/2 and AXL inhibitors
GB201410825D0 (en) * 2014-06-18 2014-07-30 Bergenbio As Anti-axl antibodies
IL296633A (en) * 2014-07-11 2022-11-01 Genmab As Antibodies that bind axl
CA2991805A1 (en) * 2015-07-10 2017-01-19 Genmab A/S Axl-specific antibody-drug conjugates for cancer treatment
WO2018007592A1 (en) * 2016-07-08 2018-01-11 Genmab A/S New dosage regimens for antibody drug conjugates based on anti-axl antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
CY1123983T1 (el) 2022-03-24
CA3010887A1 (en) 2017-07-20
IL256790A (en) 2018-03-29
JP7428680B2 (ja) 2024-02-06
IL260065A (en) 2018-07-31
JP2018525354A (ja) 2018-09-06
PL3319993T3 (pl) 2020-07-27
US20190022243A1 (en) 2019-01-24
AU2017206967A1 (en) 2018-07-26
AU2022259847A1 (en) 2022-12-08
CN108368171A (zh) 2018-08-03
US20230321261A1 (en) 2023-10-12
HRP20200551T1 (hr) 2020-07-10
JP6892431B2 (ja) 2021-06-23
KR20180033523A (ko) 2018-04-03
HUE049072T2 (hu) 2020-09-28
EP3402822B1 (en) 2025-03-12
ME03772B (me) 2021-04-20
HK1255412A1 (en) 2019-08-16
EA201890272A1 (ru) 2018-08-31
EA201891607A1 (ru) 2019-01-31
JP2021138727A (ja) 2021-09-16
CN116617410A (zh) 2023-08-22
IL256790B (en) 2021-06-30
WO2017121877A1 (en) 2017-07-20
LT3319993T (lt) 2020-05-11
SI3319993T1 (sl) 2020-06-30
JP2022037170A (ja) 2022-03-08
DK3319993T3 (da) 2020-04-20
AU2022259847B2 (en) 2024-05-02
AU2016292762A1 (en) 2018-02-01
JP2024038480A (ja) 2024-03-19
EP3319993B1 (en) 2020-01-15
US20200397913A1 (en) 2020-12-24
SMT202000359T1 (it) 2020-09-10
US20180326084A1 (en) 2018-11-15
JP2019509257A (ja) 2019-04-04
ES2784685T3 (es) 2020-09-29
EP3730520A1 (en) 2020-10-28
CA2991805A1 (en) 2017-01-19
ES3029907T3 (en) 2025-06-25
CN108884165A (zh) 2018-11-23
AU2022259847C1 (en) 2024-08-08
EP3319993A1 (en) 2018-05-16
WO2017009258A1 (en) 2017-01-19
EP3402822A1 (en) 2018-11-21
EP3402822C0 (en) 2025-03-12
PT3319993T (pt) 2020-04-22
AU2016292762B2 (en) 2022-07-28
AU2017206967B2 (en) 2024-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2022259847B2 (en) AXL-specific antibody-drug conjugates for cancer treatment
ES2774428T3 (es) Anticuerpos que se unen a AXL
HK40076909A (en) Antibodies binding axl
HK1255412B (en) Axl-specific antibody-drug conjugates for cancer treatment
HK40000535B (en) Axl‑specific antibody‑drug conjugates for cancer treatment
HK40000535A (en) Axl‑specific antibody‑drug conjugates for cancer treatment
HK1238271A1 (en) Antibodies binding axl
HK1238271B (en) Antibodies binding axl