JP2024038480A - 癌治療用のａｘｌ特異的抗体－薬物コンジュゲート - Google Patents

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Abstract

【課題】特に耐性または難治性の癌を治療するための、ヒトＡＸＬに結合する抗体－薬物コンジュゲートを提供する。【解決手段】チロシンキナーゼ阻害剤、セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤および化学療法剤からなる群より選択される少なくとも１種の治療剤に耐性の癌の治療に使用するための、ヒトＡＸＬに結合する抗体を含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。【選択図】図１

Description

発明の分野
本発明は、治療に使用するための、特に耐性または難治性の癌を治療するための、ヒトAXLに結合する抗体-薬物コンジュゲート(ADC)に関する。
発明の背景
AXLは、哺乳動物の受容体型チロシンキナーゼ(RTK)のTAMサブファミリーに属する104～140kDaの膜貫通タンパク質であり、形質転換する能力がある(Paccez et al., 2014)。AXL細胞外ドメインは、2つの膜遠位N末端免疫グロブリン(Ig)様ドメイン(Ig1およびIg2ドメイン)と、2つの膜近位フィブロネクチンIII型(FNIII)反復配列(FN1およびFN2ドメイン)との組み合わせから構成される(Paccez et al., 2014)。胃癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌などの様々な癌において、AXLの高度発現またはデノボ(de novo)発現が報告されている(Paccez et al., 2014)。注目すべきことに、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤および/または化学療法に対して耐性を示す数種類の癌は、増大したまたはデノボのAXLタンパク質を示すことが見出されている。特に、上皮成長因子受容体(EGFR)標的療法(Wilson et al., 2014; Brand et al., 2015; Zhang et al., 2012; Blakely et al., 2012)またはB-raf (BRAF)経路の阻害剤(Muller et al., 2014)に対して耐性を有する腫瘍細胞は、高度のまたはデノボのAXL発現を示した。さらに、AXLの高度発現またはデノボ発現は、PI3K阻害剤BYL719に耐性の頭頸部癌(SCCHN)(Elkabets et al., 2015)において、HER2を標的とする薬剤ラパチニブに耐性の乳癌(Liu et al., 2009)において、イマチニブに耐性の消化管間質腫瘍(GIST)(Mahadevan et al., 2015)において、スニチニブに耐性の腎臓癌(Zhou et al., 2015)において、ALK阻害剤クリゾチニブに耐性の神経芽腫細胞および非小細胞肺癌(NSCLC)(Debruyne et al., 2015; Kim et al., 2013)において、シスプラチンに耐性の食道癌(Hong et al., 2013)において、IGF-IR抗体MAB391に耐性の横紋筋肉腫(Huang et al., 2010)において、FLT3阻害剤であるミドスタウリン(PKC412)またはキザルチニブ(AC220)に耐性の急性骨髄性白血病(AML)(Park et al., 2015)において、薬剤耐性AML (Hong et al., 2008)において、ならびにイマチニブに耐性の慢性骨髄性白血病(Dufies et al., 2011)において報告された。AXLの発現はまた、メトホルミンに対する耐性を獲得した前立腺癌細胞においても誘導された(Bansal et al., 2015)。
AXLは、そのリガンドであるビタミンK依存性のgrowth arrest-specific factor 6 (Gas6：増殖停止特異的因子6)の結合時に活性化され得る。AXLへのGas6結合は、AXLの二量体化、細胞内シグナル伝達経路(例えば、PI3K/AKT、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)、STATおよびNF-κBカスケードなど)の自己リン酸化とその後の活性化をもたらす(Leconet et al., 2013)。癌細胞では、AXLの発現は、腫瘍細胞の運動性、浸潤、遊走に関連しており、かつ上皮間葉移行(EMT)に関わっている(Linger et al., 2010)。
AXLおよび/またはそのリガンドGas6の標的阻害は、例えば低分子または抗AXL抗体を用いる、抗腫瘍療法として有効であり得る(Linger et al., 2010)。抗AXL抗体は、受容体発現のダウンレギュレーション、腫瘍細胞増殖の低減、およびアポトーシスの誘導によって、インビボでのNSCLCおよび乳癌異種移植片の成長を減弱させることが記載されている(Li et al., 2009; Ye et al., 2010; WO 2011/159980, Genentech)。様々な他の抗AXL抗体も報告されており(Leconet et al., 2013; Iida et al., 2014; WO 2012/175691, INSERM社; WO 2012/175692, INSERM社; WO 2013/064685, Pierre Fabre Medicaments社; WO 2013/090776, INSERM社; WO 2009/063965, 中外製薬およびWO 2010/131733)、例えば、抗AXL抗体とピロロベンゾジアゼピン(PBD)二量体に基づくADC (WO 2014/174111, Pierre Fabre Medicament社およびSpirogen Sari社)が含まれる。
しかしながら、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤および/または化学療法に耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い癌を、特にAXL-ADCを使用して、治療するための改善された方法の必要性が依然として残されている。
本発明者らは、抗AXL抗体に基づくADCを使用して、ある種の治療剤に対して耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、癌を効果的に治療することができることを見出した。
したがって、一局面において、本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤、PI3K阻害剤、受容体型チロシンキナーゼに結合するアンタゴニスト抗体、セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤および化学療法剤からなる群より選択される、少なくとも1種の治療剤に耐性の癌を治療する際に使用するための、ヒトAXLに結合する抗体を含むADCに関する。
一局面において、本発明は、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤、PI3K阻害剤、受容体型チロシンキナーゼに結合するアンタゴニスト抗体、またはセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤から選択される治療剤と組み合わせて癌を治療する際に使用するための、ヒトAXLに結合する抗体を含むADCに関する。ADCと治療剤は、例えば、同時に、別々に、または逐次的に投与することができる。
[本発明1001]
チロシンキナーゼ阻害剤、セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤および化学療法剤からなる群より選択される少なくとも1種の治療剤に耐性の癌の治療に使用するための、ヒトAXLに結合する抗体を含む抗体-薬物コンジュゲート(ADC)。
[本発明1002]
前記チロシンキナーゼ阻害剤が、エルロチニブ、アファチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、オシメルチニブ、ロシレチニブ、イマチニブ、スニチニブ、クリゾチニブ、ミドスタウリン(PKC412)およびキザルチニブ(AC220)からなる群より選択される、本発明1001の使用のためのADC。
[本発明1003]
前記チロシンキナーゼ阻害剤が、エルロチニブまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体、例えば、ラパチニブ、アファチニブまたはゲフィチニブである、本発明1002の使用のためのADC。
[本発明1004]
前記チロシンキナーゼ阻害剤がエルロチニブである、本発明1003の使用のためのADC。
[本発明1005]
前記セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤が、BRAF阻害剤またはMEK阻害剤である、本発明1001の使用のためのADC。
[本発明1006]
(a) 前記BRAF阻害剤が、ベムラフェニブ(PLX4032)、ダブラフェニブ、およびそれらのいずれかの治療上有効な類似体もしくは誘導体、例えばPLX4720、からなる群より選択され；
(b) 前記MEK阻害剤が、トラメチニブ、セルメチニブ(AZD6244)、およびそれらのいずれかの治療上有効な類似体もしくは誘導体から選択される
本発明1005の使用のためのADC。
[本発明1007]
前記BRAF阻害剤がベムラフェニブである、本発明1006の使用のためのADC。
[本発明1008]
前記BRAF阻害剤がダブラフェニブである、本発明1006の使用のためのADC。
[本発明1009]
前記MEK阻害剤がトラメチニブである、本発明1005の使用のためのADC。
[本発明1010]
前記化学療法剤が、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、メトホルミン、ドキソルビシン、エトポシド、カルボプラチン、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1001の使用のためのADC。
[本発明1011]
前記化学療法剤が、パクリタキセルまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体、例えばドセタキセルである、本発明1010の使用のためのADC。
[本発明1012]
(a) 前記チロシンキナーゼ阻害剤が、EGFRアンタゴニスト、HER2アンタゴニスト、ALK阻害剤およびFLT3阻害剤、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択され；
(b) 前記セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤が、BRAF阻害剤およびMEK阻害剤、またはそれらの組み合わせから選択され；
(c) 前記化学療法剤が、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、メトホルミン、ドキソルビシン、エトポシド、カルボプラチン、またはそれらの組み合わせから選択される
前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1013]
(a) 前記チロシンキナーゼ阻害剤がEGFR阻害剤であり；
(b) 前記セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤がBRAF阻害剤であり；かつ
(c) 前記化学療法剤がタキサンである
本発明1012の使用のためのADC。
[本発明1014]
前記癌が、前記治療剤による治療中に耐性を獲得した、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1015]
前記癌が、前記治療剤による治療の開始時から耐性であった、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1016]
前記癌が、AXLを発現する癌である、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1017]
前記癌が、メラノーマ、非小細胞肺癌(NSCLC)、子宮頸癌、頭頸部扁平上皮癌(SCCHN)、乳癌、消化管間質腫瘍(GIST)、腎臓癌、前立腺癌、神経芽細胞腫、膵臓癌、食道癌、横紋筋肉腫、急性骨髄性白血病(AML)、または慢性骨髄性白血病(CML)から選択される、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1018]
前記ADCが、前記治療剤と組み合わせて使用するためのものであり、該ADCと該治療剤が同時に、別々に、または逐次的に投与される、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1019]
エルロチニブに耐性のAXL発現NSCLCの治療に使用するための、ヒトAXLに結合する抗体を含むADC。
[本発明1020]
前記ADCが、エルロチニブと組み合わせて使用され、該ADCとエルロチニブが同時に、別々に、または逐次的に投与される、本発明1019の使用のためのADC。
[本発明1021]
ベムラフェニブまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体に耐性のAXL発現メラノーマの治療に使用するための、ヒトAXLに結合する抗体を含むADCであって、該メラノーマがBRAFに変異を呈し、該変異がベムラフェニブによる該変異型BRAFのキナーゼ活性の阻害をもたらす、該使用のためのADC。
[本発明1022]
前記ADCが、ベムラフェニブと組み合わせて使用するためのものであり、該ADCとベムラフェニブが同時に、別々に、または逐次的に投与される、本発明1021の使用のためのADC。
[本発明1023]
ダブラフェニブまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体に耐性のAXL発現メラノーマの治療に使用するための、ヒトAXLに結合する抗体を含むADCであって、該メラノーマがBRAFに変異を呈し、該変異がダブラフェニブによる該変異型BRAFのキナーゼ活性の阻害をもたらす、該使用のためのADC。
[本発明1024]
前記ADCが、ダブラフェニブと組み合わせて使用するためのものであり、該ADCとダブラフェニブが、任意で例えばトラメチニブなどのMEK阻害剤とさらに組み合わせて、同時に、別々に、または逐次的に投与される、本発明1023の使用のためのADC。
[本発明1025]
前記変異が、V600、L597およびK601から選択されるBRAF残基にあり、例えば、V600E、V600K、V600D、L597RおよびK601Eから選択される変異である、本発明1021～1024のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1026]
パクリタキセルまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体、例えばドセタキセル、に耐性のAXL発現子宮頸癌の治療に使用するための、ヒトAXLに結合する抗体を含むADC。
[本発明1027]
前記ADCが、パクリタキセルと組み合わせて使用され、該ADCとパクリタキセルが同時に、別々に、または逐次的に投与される、本発明1026の使用のためのADC。
[本発明1028]
化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤またはセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤から選択される治療剤と組み合わせて癌の治療に使用するための、ヒトAXLに結合する抗体を含むADCであって、該ADCと該治療剤が同時に、別々に、または逐次的に投与される、該使用のためのADC。
[本発明1029]
エルロチニブと組み合わせてNSCLCの治療に使用するためのものである、本発明1028の使用のためのADC。
[本発明1030]
前記ADCが、ベムラフェニブと組み合わせてメラノーマの治療に使用するためのものであり、該メラノーマがBRAFに変異を呈し、該変異がベムラフェニブによる該変異型BRAFのキナーゼ活性の阻害をもたらす、本発明1028の使用のためのADC。
[本発明1031]
前記ADCが、ダブラフェニブと組み合わせてメラノーマの治療に使用するためのものであり、該メラノーマがBRAFに変異を呈し、該変異がダブラフェニブによる該変異型BRAFのキナーゼ活性の阻害をもたらす、本発明1028の使用のためのADC。
[本発明1032]
前記変異が、V600、L597およびK601から選択されるBRAF残基にあり、例えば、V600E、V600K、V600D、L597RおよびK601Eから選択される変異である、本発明1030および1031のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1033]
トラメチニブと組み合わせてメラノーマの治療に使用するためのものである、本発明1028の使用のためのADC。
[本発明1034]
前記抗体に連結されている細胞傷害性薬剤、化学療法剤、または放射性同位体を含む、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1035]
治療部分が細胞傷害性薬剤であり、該細胞傷害性薬剤が、任意でリンカーを用いて前記ADCに連結されている、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1036]
前記細胞傷害性薬剤が、切断可能なリンカー、例えば、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルジチオ)-ペンタノアート(SSP)、マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル(mc-vc-PAB)またはAV-1 K-lockバリン-シトルリンを用いて前記抗体に連結されている、本発明1035の使用のためのADC。
[本発明1037]
前記細胞傷害性薬剤が、切断不可能なリンカー、例えば、スクシンイミジル-4(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(MCC)またはマレイミドカプロイル(MC)を用いて前記抗体に連結されている、本発明1035～1036のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1038]
前記細胞傷害性薬剤が、DNAを標的とする薬剤、例えば、DNAアルキル化剤および架橋剤、例えばカリケアマイシン、デュオカルマイシン、ラケルマイシン(CC-1065)、ピロロ[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン(PBD)、およびインドリノベンゾジアゼピン(IGN)；微小管を標的とする薬剤、例えばデュオスタチン、例えばデュオスタチン-3、アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチンE (MMAE)およびモノメチルアウリスタチンF (MMAF)、ドラスタチン、メイタンシン、N(2')-デアセチル-N(2')-(3-メルカプト-1-オキソプロピル)-メイタンシン(DM1)、およびツブリシン；ならびにヌクレオシド類似体；またはそれらの類似体、誘導体、もしくはプロドラッグからなる群より選択される、本発明1035～1037のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1039]
(a) 前記リンカーが切断可能であり、かつ前記細胞傷害性薬剤がバイスタンダー殺傷能を有する；
(b) 前記リンカーが切断可能であり、かつ前記細胞傷害性薬剤がバイスタンダー殺傷能を有さない；
(c) 前記リンカーが切断不可能であり、かつ前記細胞傷害性薬剤がバイスタンダー殺傷能を有する；または
(d) 前記リンカーが切断不可能であり、かつ前記細胞傷害性薬剤がバイスタンダー殺傷能を有さない
本発明1035～1038のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1040]
前記リンカーがmc-vc-PABであり、かつ前記細胞傷害性薬剤がMMAEである、本発明1035～1039のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1041]
前記リンカーがSSPであり、かつ前記細胞傷害性薬剤がDM1である、本発明1035～1039のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1042]
前記薬物がデュオスタチン3である、本発明1035～1039のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1043]
前記抗体が、ヒトAXLへの結合についてGrowth Arrest-Specific 6 (Gas6)と競合しない、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1044]
Gas6の存在下でのヒトAXLへの最大抗体結合が、競合アッセイにより測定した場合に、Gas6の非存在下での結合の少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％、例えば100％であり、ヒトAXLに結合する前記抗体とGas6との間の競合が、Gas6と共におよびGas6なしでプレインキュベートされたA431細胞で測定される、本発明1043の使用のためのADC。
[本発明1045]
前記抗体が、ヒトAXLに対して0.3×10-9～63×10-9Mの範囲の結合親和性(KD)を有し、任意で、該結合親和性が、可溶性AXL細胞外ドメインを用いてバイオレイヤー干渉法により測定される、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1046]
前記抗体が、AXLに対して9.7×10-5～4.4×10-3 s-1の解離速度を有し、任意で、該解離速度が、可溶性組み換えAXL細胞外ドメインを用いてバイオレイヤー干渉法により測定される、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1047]
前記ヒトAXLのアミノ酸配列がSEQ ID NO:130に記載の通りである、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1048]
SEQ ID NO:147に記載のカニクイザルAXLに結合する、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1049]
(a) それぞれSEQ ID No:36、37および38のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:39、GAS、およびSEQ ID No:40のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[107]；
(b) それぞれSEQ ID No:46、47および48のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:49、AAS、およびSEQ ID No:50のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[148]；
(c) それぞれSEQ ID No:114、115および116のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:117、DAS、およびSEQ ID No:118のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[733]；
(d) それぞれSEQ ID No:51、52および53のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:55、GAS、およびSEQ ID No:56のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[154]；
(e) それぞれSEQ ID No:51、52および54のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:55、GAS、およびSEQ ID No:56のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[154-M103L]；
(f) それぞれSEQ ID No:57、58および59のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:60、GAS、およびSEQ ID No:61のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[171]；
(g) それぞれSEQ ID No:62、63および64のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:65、GAS、およびSEQ ID No:66のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[172]；
(h) それぞれSEQ ID No:67、68および69のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:70、GAS、およびSEQ ID No:71のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[181]；
(i) それぞれSEQ ID No:72、73および75のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:76、ATS、およびSEQ ID No:77のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[183]；
(j) それぞれSEQ ID No:72、74および75のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:76、ATS、およびSEQ ID No:77のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[183-N52Q]；
(k) それぞれSEQ ID No:78、79および80のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:81、AAS、およびSEQ ID No:82のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[187]；
(l) それぞれSEQ ID No:83、84および85のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:86、GAS、およびSEQ ID No:87のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[608-01]；
(m) それぞれSEQ ID No:88、89および90のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:91、GAS、およびSEQ ID No:92のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[610-01]；
(n) それぞれSEQ ID No:93、94および95のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:96、GAS、およびSEQ ID No:97のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[613]；
(o) それぞれSEQ ID No:98、99および100のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:101、DAS、およびSEQ ID No:102のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[613-08]；
(p) それぞれSEQ ID No:103、104および105のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:106、GAS、およびSEQ ID No:107のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[620-06]；
(q) それぞれSEQ ID No:108、109および110のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:112、AAS、およびSEQ ID No:113のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[726]；
(r) それぞれSEQ ID No:108、109および111のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:112、AAS、およびSEQ ID No:113のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[726-M101L]；
(s) それぞれSEQ ID No:41、42および43のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:44、AAS、およびSEQ ID No:45のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[140]；
(t) それぞれSEQ ID No:93、94および95のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:128、XAS（配列中、XはDまたはGである）、およびSEQ ID No:129のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[613/613-08]；
(u) それぞれSEQ ID No:46、119および120のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:49、AAS、およびSEQ ID No:50のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[148/140]；
(v) それぞれSEQ ID No:123、124および125のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:60、GAS、およびSEQ ID No:61のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[171/172/181]；
(w) それぞれSEQ ID No:121、109および122のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:112、AAS、およびSEQ ID No:113のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[726/187]；ならびに
(x) それぞれSEQ ID No:93、126および127のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:96、GAS、およびSEQ ID No:97のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[613/608-01/610-01/620-06]
からなる群より選択されるVH領域とVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1050]
(a) それぞれSEQ ID No:36、37および38のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに
(b) それぞれSEQ ID No:39、GAS、およびSEQ ID No:40のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[107]
を含む少なくとも1つの結合領域を含む、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1051]
前記抗体が、
(a) SEQ ID No: 1と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No: 2と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[107]；
(b) SEQ ID No: 5と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No: 6と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[148]；
(c) SEQ ID No:34と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:35と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[733]；
(d) SEQ ID No: 7と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No: 9と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[154]；
(e) SEQ ID No:10と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:11と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[171]；
(f) SEQ ID No:16と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:18と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[183]；
(g) SEQ ID No:25と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:26と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[613]；
(h) SEQ ID No:31と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:33と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[726]；
(i) SEQ ID No: 3と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No: 4と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[140]；
(j) SEQ ID No: 8と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No: 9と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[154-M103L]；
(k) SEQ ID No:12と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:13と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[172]；
(l) SEQ ID No:14と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:15と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[181]；
(m) SEQ ID No:17と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:18と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[183-N52Q]；
(n) SEQ ID No:19と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:20と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[187]；
(o) SEQ ID No:21と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:22と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[608-01]；
(p) SEQ ID No:23と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:24と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[610-01]；
(q) SEQ ID No:27と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:28と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[613-08]；
(r) SEQ ID No:29と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:30と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[620-06]；ならびに
(s) SEQ ID No:32と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:33と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[726-M101L]
からなる群より選択されるVH領域とVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1052]
前記少なくとも1つの結合領域が、
(a) SEQ ID No: 1を含むVH領域およびSEQ ID No: 2を含むVL領域[107]；
(b) SEQ ID No: 5を含むVH領域およびSEQ ID No: 6を含むVL領域[148]；
(c) SEQ ID No:34を含むVH領域およびSEQ ID No:35を含むVL領域[733]；
(d) SEQ ID No: 7を含むVH領域およびSEQ ID No: 9を含むVL領域[154]；
(e) SEQ ID No:10を含むVH領域およびSEQ ID No:11を含むVL領域[171]；
(f) SEQ ID No:16を含むVH領域およびSEQ ID No:18を含むVL領域[183]；
(g) SEQ ID No:25を含むVH領域およびSEQ ID No:26を含むVL領域[613]；
(h) SEQ ID No:31を含むVH領域およびSEQ ID No:33を含むVL領域[726]；
(i) SEQ ID No: 3を含むVH領域およびSEQ ID No: 4を含むVL領域[140]；
(j) SEQ ID No: 8を含むVH領域およびSEQ ID No: 9を含むVL領域[154-M103L]；
(k) SEQ ID No:12を含むVH領域およびSEQ ID No:13を含むVL領域[172]；
(l) SEQ ID No:14を含むVH領域およびSEQ ID No:15を含むVL領域[181]；
(m) SEQ ID No:17を含むVH領域およびSEQ ID No:18を含むVL領域[183-N52Q]；
(n) SEQ ID No:19を含むVH領域およびSEQ ID No:20を含むVL領域[187]；
(o) SEQ ID No:21を含むVH領域およびSEQ ID No:22を含むVL領域[608-01]；
(p) SEQ ID No:23を含むVH領域およびSEQ ID No:24を含むVL領域[610-01]；
(q) SEQ ID No:27を含むVH領域およびSEQ ID No:28を含むVL領域[613-08]；
(r) SEQ ID No:29を含むVH領域およびSEQ ID No:30を含むVL領域[620-06]；ならびに
(s) SEQ ID No:32を含むVH領域およびSEQ ID No:33を含むVL領域[726-M101L]
からなる群より選択されるVH領域とVL領域を含む、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1053]
前記少なくとも1つの結合領域が、SEQ ID No: 1を含むVH領域およびSEQ ID No: 2を含むVL領域[107]を含む、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1054]
前記抗体が、それぞれSEQ ID No:36、37および38のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:39、GAS、およびSEQ ID No:40のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域とを含む少なくとも1つの結合領域[107]を含み、
前記リンカーがmc-vc-PABであり、かつ
前記細胞傷害性薬剤がMMAEである、
前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1055]
前記抗体が、それぞれSEQ ID No:36、37および38のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:39、GAS、およびSEQ ID No:40のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域とを含む少なくとも1つの結合領域[107]を含み、
前記リンカーがSSPであり、かつ
前記細胞傷害性薬剤がDM1である、
本発明1001～1050のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1056]
前記抗体がAXL上のエピトープに結合し、該エピトープが、本発明1039の抗体のいずれかによって認識される、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1057]
前記抗体がAXLのIg1ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープが、ヒトAXLの位置L121～Q129またはT112～Q124に対応する1つ以上のアミノ酸を含むかまたは必要とする、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1058]
前記抗体がAXLのIg2ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープが、ヒトAXLの位置D170またはD179の組み合わせに対応するアミノ酸、および位置T182～R190に対応する1つ以上のアミノ酸を含むかまたは必要とする、本発明1001～1050のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1059]
前記抗体がヒトAXLのFN1ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープが、ヒトAXLの位置Q272～A287およびG297～P301に対応する1つ以上のアミノ酸を含むかまたは必要とする、本発明1001～1050のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1060]
前記抗体がヒトAXLのFN2ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープが、ヒトAXLの位置A359、R386に対応するアミノ酸、および位置Q436～K439に対応する1つ以上のアミノ酸を含むかまたは必要とする、本発明1001～1050のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1061]
前記抗体が、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるアイソタイプの重鎖を含む、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1062]
前記アイソタイプが、IgG1、任意でアロタイプIgG1m(f)である、本発明1061の使用のためのADC。
[本発明1063]
完全長モノクローナル抗体、例えば完全長モノクローナルIgG1,κ抗体である、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1064]
前記抗体が、エフェクター機能欠損抗体、安定化されたIgG4抗体、または一価抗体である、本発明1001～1063のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1065]
ヒンジ領域全体を欠失するように重鎖が改変されている、本発明1064の使用のためのADC。
[本発明1066]
前記抗体の配列が、N結合型グリコシル化のためのアクセプター部位を含まないように改変されている、本発明1064および1065のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1067]
前記抗体が一本鎖抗体である、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1068]
前記抗体が、前記本発明のいずれかの抗体の第1の結合領域と、該第1の結合領域とは異なる標的またはエピトープに結合する第2の結合領域とを含む二重特異性抗体である、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1069]
前記二重特異性抗体が第1および第2の重鎖を含み、該第1および第2の重鎖のそれぞれが少なくともヒンジ領域、CH2およびCH3領域を含み、該第1の重鎖において、ヒトIgG1重鎖中のK409、T366、L368、K370、D399、F405およびY407からなる群より選択される位置に対応する位置におけるアミノ酸のうちの少なくとも1つが置換されており、かつ該第2の重鎖において、ヒトIgG1重鎖中のF405、T366、L368、K370、D399、Y407およびK409からなる群より選択される位置に対応する位置におけるアミノ酸のうちの少なくとも1つが置換されており、かつ該第1および第2の重鎖の置換が同じ位置における置換ではない、本発明1068の使用のためのADC。
[本発明1070]
前記第1の重鎖において、ヒトIgG1重鎖のK409に対応する位置のアミノ酸がRであり、かつ前記第2の重鎖において、ヒトIgG1重鎖のF405に対応する位置のアミノ酸がLであるか、またはその逆である、本発明1001～1069のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1071]
前記抗体が、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物中に含まれる、前記本発明のいずれかの使用のためのADC。
[本発明1072]
ヒトAXLに結合する抗体を含むADCと、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤およびセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤からなる群より選択される少なくとも1種の治療剤とを含むキットであって、該ADCおよび該少なくとも1種の治療剤が、同時に、別々に、または逐次的に投与されるためのものである、キット。
[本発明1073]
対象における癌を治療する方法であって、該対象に、ヒトAXLに結合する抗体を含むADCと、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤またはセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤から選択される治療剤とを投与する工程を含み、該ADCおよび該治療剤が、同時に、別々に、または逐次的に投与される、前記方法。
[本発明1074]
対象におけるNSCLCを治療する方法であって、該対象に、ヒトAXLに結合する抗体を含むADCと、エルロチニブとを投与する工程を含み、該ADCおよびエルロチニブが、同時に、別々に、または逐次的に投与される、前記方法。
[本発明1075]
前記NSCLCがエルロチニブに耐性である、本発明1074の方法。
[本発明1076]
前記NSCLCがAXLを発現する、本発明1074～1075のいずれかの方法。
[本発明1077]
対象におけるメラノーマを治療する方法であって、該対象に、
- ヒトAXLに結合する抗体を含むADC、および
- ベムラフェニブまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体
を投与する工程を含み、
該メラノーマがBRAFに変異を呈し、該変異がベムラフェニブによる該変異型BRAFのキナーゼ活性の阻害をもたらし、かつ
該ADCおよびベムラフェニブまたはその類似体もしくは誘導体を同時に、別々に、または逐次的に投与する、前記方法。
[本発明1078]
対象におけるメラノーマを治療する方法であって、該対象に、
- ヒトAXLに結合する抗体を含むADC、および
- ダブラフェニブまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体
を投与する工程を含み、
該メラノーマがBRAFに変異を呈し、該変異がダブラフェニブによる該変異型BRAFのキナーゼ活性の阻害をもたらし、かつ
該ADCおよびダブラフェニブまたはその類似体もしくは誘導体を同時に、別々に、または逐次的に投与する、前記方法。
[本発明1079]
前記変異が、V600、L597およびK601から選択されるBRAF残基にあり、例えば、V600E、V600K、V600D、L597RおよびK601Eから選択される変異である、本発明1077および1078のいずれかの方法。
[本発明1080]
前記メラノーマが、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、またはそれらのいずれかの類似体もしくは誘導体に耐性である、本発明1077～1079のいずれかの方法。
[本発明1081]
対象におけるメラノーマを治療する方法であって、該対象に、
- ヒトAXLに結合する抗体を含むADC、および
- トラメチニブまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体
を投与する工程を含み、かつ
該ADCおよびトラメチニブまたはその類似体もしくは誘導体を同時に、別々に、または逐次的に投与する、前記方法。
[本発明1082]
前記メラノーマがAXLを発現する、本発明1077～1081のいずれかの方法。
[本発明1083]
癌の治療を必要とする対象における癌を治療する方法であって、
該癌が、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤およびセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤から選択される治療剤に耐性であり、
該方法が、治療有効量の、ヒトAXLに結合する抗体を含むADCを該対象に投与する工程を含む、前記方法。
[本発明1084]
本発明1001～1071のいずれかの特徴を含む、本発明1072～1030のいずれかのキットまたは方法。
これらのおよび他の局面ならびに態様は、抗原結合特性または配列により特徴付けられる抗AXL抗体に基づくAXL-ADCの使用、該ADCに適する治療部分、該ADCと特定の治療剤との組み合わせ、および耐性新生物を治療する方法を含めて、以下にさらに詳細に説明される。
（A）ヒトAXL-ECD、（B）カニクイザルAXL-ECD、または（C）マウスAXL-ECDをトランスフェクトしたHEK293細胞に対する、抗AXL抗体の結合曲線。示したデータは、実施例2に記載されているような1つの代表的な実験の平均蛍光強度（MFI）である。 マウス-ヒトAXLキメラに対する抗AXL抗体の結合を、実施例3に記載されているように行った。以下のホモ・サピエンス（Homo sapiens）AXL（hsAXL）およびハツカネズミ（Mus musculus）AXL（mmAXL）キメラタンパク質を試験した：（A）hsAXLおよびモック、（B）hsAXL-mmECD、（C）hsAXL-mmIg1、（D）hsAXL-mmIg2、（E）hsAXL-mmFN1、（F）hsAXL-mmFN2。 A431細胞における抗AXL抗体依存性細胞媒介性細胞傷害。A431細胞における抗AXL抗体による抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を、実施例4に記載されているように測定した。 AXL抗体-薬物コンジュゲート（AXL-ADC）の結合特性。ヒトAXLを一過性にトランスフェクトしたHEK293T細胞に対するAXL-ADCの結合を、実施例5に記載されているように測定した。示したデータは、1つの代表的な実験の平均蛍光強度（MFI）である。 AXL抗体-薬物コンジュゲートにより誘導されるインビトロ細胞傷害。AXL抗体-薬物コンジュゲートによる細胞傷害の誘導を、実施例6に説明されているように測定した。 AXLに対する結合を可能にする抗体VHおよびVLのバリアント。同一のVLまたはVH領域を有する抗体を整列させ、それぞれ、VH（図A～D）またはVL（図E）配列における差を特定して、図において四角により示した。CDR領域に下線を引いている。 LCLC-103H細胞におけるADCによる細胞傷害の誘導を、実施例8に記載されているように測定した。 実施例9に記載されているような、治療的LCLC-103H異種移植モデルにおけるMMAEコンジュゲートAXL抗体による抗腫瘍活性。 実施例10に記載されているような、AXLモノクローナル抗体のプールを用いた凍結PAXF1657腫瘍切片（膵臓癌PDXモデル）の免疫組織化学染色。 （A）PAXF1657モデルのAXL-ADCでの治療的処置後の平均腫瘍サイズ。コンジュゲートされていないAXL Humab（C）および標的化されていないADC（D）は、抗腫瘍活性を示さず、AXL-ADCの治療能力が、MMAEの細胞傷害活性および標的結合に依存していたことが示される。エラーバーは標準誤差を表す。 （A）PAXF1657モデルのAXL-ADCでの治療的処置後の平均腫瘍サイズ。コンジュゲートされていないAXL Humab（C）および標的化されていないADC（D）は、抗腫瘍活性を示さず、AXL-ADCの治療能力が、MMAEの細胞傷害活性および標的結合に依存していたことが示される。エラーバーは標準誤差を表す。 （A）PAXF1657モデルのAXL-ADCでの治療的処置後の平均腫瘍サイズ。コンジュゲートされていないAXL Humab（C）および標的化されていないADC（D）は、抗腫瘍活性を示さず、AXL-ADCの治療能力が、MMAEの細胞傷害活性および標的結合に依存していたことが示される。エラーバーは標準誤差を表す。 マウス-ヒトAXLキメラに対する抗AXL抗体の結合を、実施例11に記載されているように行った。以下のホモ・サピエンスAXL（hsAXL）およびハツカネズミAXL（mmAXL）キメラタンパク質を試験した：（A）hsAXLおよびモック、（B）hsAXL-mmECD、（C）hsAXL-mmIg1、（D）hsAXL-mmIg2、（E）hsAXL-mmFN1、（F）hsAXL-mmFN2。 AXLのIg1ドメインに結合する抗体とプレインキュベートしていたA431細胞に対するヒトGas6（hGas6）の結合。示したデータは、1つの代表的な実験の平均蛍光強度（MFI）である。 実施例13に記載されているような、高レベルの内在性Gas6を産生する治療的A431異種移植モデルにおける、MMAEコンジュゲートAXL抗体の抗腫瘍活性。パネルAおよびBは、2つの独立した実験からの結果を示す。 実施例13に記載されているような、低レベルの内在性Gas6を発現する治療的LCLC-103H異種移植モデルにおける、MMAEコンジュゲートAXL抗体の抗腫瘍活性。パネルAおよびBは、2つの独立した実験からの結果を示す。 A431細胞（A）およびMDA-MB231細胞（B）におけるAXL-ADCによる細胞傷害の誘導を、実施例8に記載されているように測定した。 甲状腺癌、食道癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、および子宮内膜癌におけるAXL染色。AXL陽性細胞の平均AXL染色強度（OD）をX軸上にプロットし、AXL陽性腫瘍細胞のパーセンテージをY軸上にプロットしている。各ドットは、個々の患者に由来する腫瘍コアを表す。 様々な腫瘍徴候についてAXL免疫染色した腫瘍コアの代表的な例。 AXL抗体はAXLに特異的に結合するが、他のTAM受容体ファミリーメンバーには結合しない。ヒトAXL（A）、ヒトMER（B）、ヒトTYRO3（C）をトランスフェクトしたHEK293細胞、またはトランスフェクトしていないHEK293細胞（D）に対するHuMab-AXL抗体の結合。示したデータは、実施例15に記載されているような1つの代表的な実験の平均蛍光強度（MFI）である。 AXL抗体はAXLに特異的に結合するが、他のTAM受容体ファミリーメンバーには結合しない。トランスフェクトした細胞の妥当な発現を確認するために、トランスフェクトしていないHEK293F細胞、およびAXL（E）、MER（F）、またはTYRO3（G）をトランスフェクトした細胞を、MER特異的抗体およびTYRO3特異的抗体で染色した。示したデータは、実施例15に記載されているような1つの代表的な実験の平均蛍光強度（MFI）である。 AXL抗体と1時間4℃でインキュベートし、その後、4℃または37℃で一晩インキュベーションを行った腫瘍細胞株の形質膜上のAXL抗体の検出。MDA-MB-231細胞において、37℃でインキュベートしていた細胞上よりも、4℃でインキュベートしていた細胞の形質膜上により多くの抗体が検出され、37℃での膜結合抗体の内部移行が示された。 AXL抗体と1時間4℃でインキュベートし、その後、4℃または37℃で一晩インキュベーションを行った腫瘍細胞株の形質膜上のAXL抗体の検出。MDA-MB-231細胞において、37℃でインキュベートしていた細胞上よりも、4℃でインキュベートしていた細胞の形質膜上により多くの抗体が検出され、37℃での膜結合抗体の内部移行が示された。 AXL抗体と1時間4℃でインキュベートし、その後、4℃または37℃で一晩インキュベーションを行った腫瘍細胞株の形質膜上のAXL抗体の検出。Calu-1細胞において、37℃でインキュベートしていた細胞上よりも、4℃でインキュベートしていた細胞の形質膜上により多くの抗体が検出され、37℃での膜結合抗体の内部移行が示された。 AXL抗体と1時間4℃でインキュベートし、その後、4℃または37℃で一晩インキュベーションを行った腫瘍細胞株の形質膜上のAXL抗体の検出。Calu-1細胞において、37℃でインキュベートしていた細胞上よりも、4℃でインキュベートしていた細胞の形質膜上により多くの抗体が検出され、37℃での膜結合抗体の内部移行が示された。 Fab-TAMRA/QSY7と複合体形成させたAXL抗体とのインキュベーション後の、LCLC-103H細胞の幾何平均蛍光強度。IgG1-b12およびFab-TAMRA/QSY7単独を、陰性対照として含めた。 （A）食道癌PDXモデルES0195における、IgG1-AXL-107-vcMMAEでの治療的処置後の平均腫瘍サイズ。IgG1-b12およびIgG1-b12-MMAEを、それぞれ、アイソタイプ対照抗体およびアイソタイプ対照ADCとして含めた。（B）雌SCIDマウスの乳房脂肪体におけるMDA-MB-231-luc D3H2LN腫瘍細胞の注射後32日目の、個々のマウス中の腫瘍サイズ。* p＜0.05；** p＜0.0001。 患者由来の子宮頸癌異種移植モデルにおけるAXL-ADCの治療効果。（A）子宮頸癌PDXモデルCEXF 773における、IgG1-AXL-183-vcMMAEまたはIgG1-AXL-726-vcMMAEでの治療的処置後の平均腫瘍サイズ。IgG1-b12およびIgG1-b12-MMAEを、それぞれ、アイソタイプ対照抗体およびアイソタイプ対照ADCとして含めた。（B）子宮頸癌PDXモデルCEXF 773における処置の開始後28日目の、個々のマウス中の腫瘍サイズ。* p＜0.001。 同所乳癌異種移植モデルにおけるAXL-ADCの治療活性。（A）同所MDA-MB-231-luc D3H2LN異種移植モデルにおける、IgG1-AXL-183-vcMMAEまたはIgG1-AXL-726-vcMMAEでの治療的処置後の平均腫瘍サイズ。IgG1-b12およびIgG1-b12-MMAEを、それぞれ、アイソタイプ対照抗体およびアイソタイプ対照ADCとして含めた。（B）雌SCIDマウスの乳房脂肪体におけるMDA-MB-231-luc D3H2LN腫瘍細胞の注射後32日目の、個々のマウス中の腫瘍サイズ。* p＜0.001。 形質膜上に様々なレベルのAXL発現を有するヒト腫瘍細胞株における、IgG1-AXL-107-vcMMAEの細胞傷害。ヒト腫瘍細胞株の形質膜におけるAXL発現を、Qifikit解析を用いて評価し、IgG1-AXL-107-vcMMAEの細胞傷害を、1μg/mLのIgG1-AXL-107-vcMMAEへの曝露後に細胞培養中に残った生腫瘍細胞のパーセンテージとして表した。 エルロチニブ耐性NSCLC患者由来の異種移植片(PDX)モデルにおけるエルロチニブと組み合わせたIgG1-AXL-107-vcMMAEの改善された抗腫瘍効果。NSCLC PDXモデルLU2511におけるIgG1-AXL-107-vcMMAE、エルロチニブ、またはIgG1-AXL-107-vcMMAEと組み合わせたエルロチニブによる治療処置後の平均腫瘍サイズ。IgG1-b12およびIgG1-b12-MMAEを、それぞれアイソタイプ対照抗体およびアイソタイプ対照ADCとして含めた。*, p＜0.05；**, p＜0.01；ns, 有意ではない(一元配置ANOVA検定)。 EGFR-TKIに対する獲得耐性を有するNSCLC細胞株におけるAxlタンパク質発現の増強。Axlタンパク質の発現はウェスタンブロッティングで測定した。等しいタンパク質ローディングの対照としてアクチン染色を用いた。エルロチニブの存在下(＋)または非存在下(－)で培養した細胞においてAxlの発現を評価した。 IgG1-AXL-107-vcMMAEに対する親(野生型)およびエルロチニブ耐性のHCC827細胞の感受性を生存率アッセイで評価した。親(野生型)およびエルロチニブ耐性の細胞株を、漸増濃度のIgG1-AXL-107-vcMMAEに5日間曝露し、その後細胞生存率を実施例22に記載の通りに測定した。 IgG1-AXL-107-vcMMAEに対する親(野生型)およびエルロチニブ耐性のPC9細胞の感受性を生存率アッセイで評価した。親(野生型)およびエルロチニブ耐性の細胞株を、漸増濃度のIgG1-AXL-107-vcMMAEに5日間曝露し、その後細胞生存率を実施例22に記載の通りに測定した。 EGFR-TKIに対する親(野生型)HCC827細胞の感受性を生存率アッセイで評価した。親(野生型)細胞株を、漸増濃度のエルロチニブ、ゲフィチニブまたはアファチニブに4または5日間曝露し、その後細胞生存率を実施例22に記載の通りに測定した。 EGFR-TKIに対するエルロチニブ耐性HCC827細胞の感受性を生存率アッセイで評価した。エルロチニブ耐性細胞株を、漸増濃度のエルロチニブ、ゲフィチニブまたはアファチニブに4または5日間曝露し、その後細胞生存率を実施例22に記載の通りに測定した。 EGFR-TKIに対するエルロチニブ耐性のHCC827細胞の感受性を生存率アッセイで評価した。エルロチニブ耐性細胞株を、漸増濃度のエルロチニブ、ゲフィチニブまたはアファチニブに4または5日間曝露し、その後細胞生存率を実施例22に記載の通りに測定した。 IgG1-AXL-107-vcMMAEに対する親(野生型)HCC827細胞の感受性を生存率アッセイで評価した。親(野生型)細胞株を、漸増濃度のIgG1-b12-vcMMAEまたはIgG1-AXL-107-vcMMAEに4日間曝露し、その後細胞生存率を実施例22に記載の通りに測定した。 IgG1-AXL-107-vcMMAEに対するエルロチニブ耐性HCC827細胞の感受性を生存率アッセイで評価した。エルロチニブ耐性細胞株を、漸増濃度のIgG1-b12-vcMMAEまたはIgG1-AXL-107-vcMMAEに4日間曝露し、その後細胞生存率を実施例22に記載の通りに測定した。 IgG1-AXL-107-vcMMAEに対するエルロチニブ耐性HCC827細胞の感受性を生存率アッセイで評価した。エルロチニブ耐性細胞株を、漸増濃度のIgG1-b12-vcMMAEまたはIgG1-AXL-107-vcMMAEに4日間曝露し、その後細胞生存率を実施例22に記載の通りに測定した。 EGFR-TKIに対する親(野生型)およびエルロチニブ耐性のPC9細胞の感受性を生存率アッセイで評価した。親(野生型)およびエルロチニブ耐性の細胞株を、漸増濃度のエルロチニブに4または5日間曝露し、その後細胞生存率を実施例22に記載の通りに測定した。 IgG1-AXL-107-vcMMAEに対する親(野生型)PC9細胞の感受性を生存率アッセイで評価した。親(野生型)細胞株を、漸増濃度のIgG1-b12-vcMMAEまたはIgG1-AXL-107-vcMMAEに4日間曝露し、その後細胞生存率を実施例22に記載の通りに測定した。 IgG1-AXL-107-vcMMAEに対するエルロチニブ耐性PC9細胞の感受性を生存率アッセイで評価した。エルロチニブ耐性細胞株を、漸増濃度のIgG1-b12-vcMMAEまたはIgG1-AXL-107-vcMMAEに4日間曝露し、その後細胞生存率を実施例22に記載の通りに測定した。 樹立メラノーマ細胞株および患者由来の低継代初代メラノーマ株(PDX)におけるAXL発現。(A) 樹立メラノーマ細胞株では可変レベルのAXL発現が観察された。AXLの高度発現またはデノボ発現は、PLX4720耐性細胞株(A375-R、SKMEL28R、SKMEL147)において観察された。(B) AXL発現は、15例のうち8例の患者由来初代メラノーマ株において観察された。樹立メラノーマ細胞株と低継代PDX培養物の両方において、AXL発現はMITF発現と逆の相関関係があった。 細胞表面上のAXLタンパク質発現。定量的フローサイトメトリーによって測定された、Axl陰性およびAxl陽性メラノーマ細胞株におけるAXL発現の例。明るい灰色のプロットはAXL特異的抗体による染色を表し、濃い灰色のプロットはアイソタイプ対照抗体による染色を表す。 樹立メラノーマ細胞株のIgG1-AXL-107-vcMMAEに対する感受性。メラノーマ細胞株(A～F；CDX)をIgG1-AXL-107-vcMMAEまたはアイソタイプ対照ADCのIgG1-b12-vcMMAEにより3つ組(triplicate)で5日間処理した。細胞生存率をCellTiter-Gloアッセイで評価し、ADC濃度に対してプロットした。 初代メラノーマ細胞培養物のIgG1-AXL-107-vcMMAEに対する感受性。低継代初代メラノーマ細胞株(A～C；PDX)をIgG1-AXL-107-vcMMAEまたはアイソタイプ対照ADCのIgG1-b12-vcMMAEにより3つ組で8日間処理した。細胞生存率をCellTiter-Gloアッセイで評価し、ADC濃度に対してプロットした。 エルロチニブ耐性LU0858 NSCLC患者由来異種移植片(PDX)モデルにおけるIgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍効果。IgG1-AXL-107-vcMMAE、エルロチニブ、またはIgG1-AXL-107-vcMMAEと組み合わせたエルロチニブによる治療処置後の平均腫瘍サイズを示す(A)。IgG1-b12およびIgG1-b12-MMAEを、それぞれアイソタイプ対照抗体およびアイソタイプ対照ADCとして含めた。11日目(B)と21日目(C)の時点あたりの各群の平均腫瘍サイズおよびSEM、ならびに群あたりの個々のマウスの腫瘍サイズを示す。*, p＜0.05；**, p＜0.01；ns, 有意ではない(マン・ホイットニー検定)。 エルロチニブ耐性LU1868 NSCLC患者由来異種移植片(PDX)モデルにおけるIgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍効果。IgG1-AXL-107-vcMMAE、エルロチニブ、またはIgG1-AXL-107-vcMMAEと組み合わせたエルロチニブによる治療処置後の平均腫瘍サイズを示す。IgG1-b12およびIgG1-b12-MMAEを、それぞれアイソタイプ対照抗体およびアイソタイプ対照ADCとして含めた。 エルロチニブ耐性LU1868 NSCLC患者由来異種移植片(PDX)モデルにおけるIgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍効果。IgG1-AXL-107-vcMMAE、エルロチニブ、またはIgG1-AXL-107-vcMMAEと組み合わせたエルロチニブによる治療処置21日目における各群の平均腫瘍サイズおよびSEM、ならびに群あたりの個々のマウスの腫瘍サイズを示す。IgG1-b12-MMAEをアイソタイプ対照ADCとして含めた。*, p＜0.05；**, p＜0.01；ns, 有意ではない(マン・ホイットニー検定)。 エルロチニブ耐性LU1868 NSCLC患者由来異種移植片(PDX)モデルにおけるIgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍効果。IgG1-AXL-107-vcMMAE、またはIgG1-AXL-107-vcMMAEと組み合わせたエルロチニブによる治療処置28日目における各群の平均腫瘍サイズおよびSEM、ならびに群あたりの個々のマウスの腫瘍サイズを示す。*, p＜0.05；**, p＜0.01；ns, 有意ではない(マン・ホイットニー検定)。 エルロチニブ耐性LU1868 NSCLC患者由来異種移植片(PDX)モデルにおけるIgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍効果。IgG1-AXL-107-vcMMAE、またはIgG1-AXL-107-vcMMAEと組み合わせたエルロチニブによる治療処置31日目における各群の平均腫瘍サイズおよびSEM、ならびに群あたりの個々のマウスの腫瘍サイズを示す。*, p＜0.05；**, p＜0.01；ns, 有意ではない(マン・ホイットニー検定)。 エルロチニブ耐性LXFA 526 NSCLC患者由来異種移植片(PDX)モデルにおけるIgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍効果。(A) IgG1-AXL-107-vcMMAE、エルロチニブ、またはIgG1-AXL-107-vcMMAEと組み合わせたエルロチニブによる治療処置後の平均腫瘍サイズ。(B) 23日目における各群の平均腫瘍サイズおよびSEM、ならびに群あたりの個々のマウスの腫瘍サイズ。*, p＜0.05；**, p＜0.01；ns, 有意ではない(マン・ホイットニー検定)。 エルロチニブ耐性を獲得したNSCLC患者由来異種移植片(PDX)モデルLXFA 677におけるIgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍効果。IgG1-AXL-107-vcMMAE、エルロチニブ、またはIgG1-AXL-107-vcMMAEと組み合わせたエルロチニブによる治療処置後の平均腫瘍サイズを示す。 エルロチニブ耐性を獲得したNSCLC患者由来異種移植片(PDX)モデルLXFA 677におけるIgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍効果。IgG1-AXL-107-vcMMAE、またはIgG1-AXL-107-vcMMAEと組み合わせたエルロチニブによる治療処置21日目におけるLXFA 677モデルの各群の平均腫瘍サイズおよびSEM、ならびに群あたりの個々のマウスの腫瘍サイズ。*, p＜0.05；**, p＜0.01；ns, 有意ではない(マン・ホイットニー検定)。 エルロチニブ耐性を獲得したNSCLC患者由来異種移植片(PDX)モデルLXFA 677_3におけるIgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍効果。IgG1-AXL-107-vcMMAE、エルロチニブ、またはIgG1-AXL-107-vcMMAEと組み合わせたエルロチニブによる治療処置後の平均腫瘍サイズを示す。 エルロチニブ耐性を獲得したNSCLC患者由来異種移植片(PDX)モデルLXFA 677_3におけるIgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍効果。IgG1-AXL-107-vcMMAE、またはIgG1-AXL-107-vcMMAEと組み合わせたエルロチニブによる治療処置37日目におけるLXFA 677_3モデルの各群の平均腫瘍サイズおよびSEM、ならびに群あたりの個々のマウスの腫瘍サイズ。*, p＜0.05；**, p＜0.01；ns, 有意ではない(マン・ホイットニー検定)。 メラノーマモデルSKMEL147におけるIgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍効果。IgG1-b12、IgG1-b12-vcMMAE、IgG1-AXL-107、またはIgG1-AXL-107-vcMMAEによる治療処置後の平均腫瘍サイズを示す(A)。観察された(n＝2)またはIgG1-AXL-107-vcMMAEで再治療された(n＝4) IgG1-AXL-107-vcMMAEマウスの腫瘍サイズを(B)に示す。 SKMEL28野生型細胞(赤色)とPLX4720耐性SKMEL28-R細胞(緑色)を1：1で混合し、IgG1-AXL-107-vcMMAE (AXL-ADC)、IgG1-b12-MMAE (b12-ADC)、PLX4720 (PLX)、ダブラフェニブ(dabr)、トラメチニブ(tram)、または示される組み合わせで処置した。(A) 未処置の細胞に対する総細胞数。(B) SKMEL28-R/SKMEL28細胞の比に対応するGFP/mCherry比。 子宮頸癌PDXモデルCV1664におけるIgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍効果。IgG1-b12、IgG1-b12-vcMMAE、IgG1-AXL-107、IgG1-AXL-107-vcMMAE、またはパクリタキセルによる治療処置後の平均腫瘍サイズを示す。 子宮頸癌PDXモデルCV1664におけるIgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍効果。IgG1-b12-vcMMAE、IgG1-AXL-107、IgG1-AXL-107-vcMMAE、またはパクリタキセルによる治療処置46日目における各群の平均腫瘍サイズおよびSEM、ならびに群あたりの個々のマウスの腫瘍サイズを示す。*, p＜0.05；**, p＜0.01；ns, 有意ではない(マン・ホイットニー検定)。 子宮頸癌PDXモデルCV1664におけるIgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍効果。IgG1-AXL-107-vcMMAEで再処置したIgG1-AXL-107-vcMMAE処置マウスにおける平均腫瘍サイズを示す。 子宮頸癌PDXモデルCV1664におけるIgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍効果。IgG1-AXL-107-vcMMAEで再処置したパクリタキセル処置マウスにおける平均腫瘍サイズを示す。 初代メラノーマサンプルにおいて免疫組織化学により検出されたAxl発現の例。(A) 陽性+++Axl染色強度を有するメラノーマの例、(B) +と++の間の陽性Axl染色強度を有するメラノーマの例、(C) ベムラフェニブでの処置前および処置後の同じ患者由来のメラノーマ組織におけるAxl発現の例；左＝ベムラフェニブ処置前、Axl染色強度：弱く+；右＝ベムラフェニブ処置後、Axl染色強度：弱く+ないし++、(D) 初代メラノーマ組織内の++強度を有する不均一なAxl発現の例。
発明の詳細な説明
治療的適用
本発明は、本明細書に記載されるような、特定の化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤(例えば、EGFR阻害剤)、セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤(例えば、BRAF阻害剤)、PI3K阻害剤、および受容体型チロシンキナーゼに対するアンタゴニスト抗体に耐性であるか、耐性になる傾向が高い、癌または腫瘍を治療する際に使用するための、本明細書中のいずれかの局面または態様において定義されるAXL特異的ADC (本明細書では「AXL-ADC」とも呼ばれる)に関する。
本発明は、EGFR標的療法、BRAF/MEK標的療法、または微小管を標的とする薬剤に耐性の腫瘍細胞において細胞傷害性を誘導する際に、AXL-ADCがインビトロおよびインビボの両方において有効である、という発見に少なくとも幾分かは基づいている。例えば、EGFR阻害剤であるエルロチニブ、ゲフィチニブおよびアファチニブに対する耐性を獲得したNSCLC細胞は、AXL-ADCによる処置で生存率の低下を示し(実施例21)、また、異なるEGFR遺伝子状態を有するエルロチニブ耐性モデルは、AXL-ADCについての感受性を示した(実施例22；表17)。注目すべきことに、EGFR阻害剤エルロチニブによる治療が抗腫瘍活性を誘導しなかったいくつかの腫瘍モデルでは、AXL-ADCまたはAXL-ADCとエルロチニブの併用による治療が強力な抗腫瘍活性を誘導した(実施例22)。例えば、エルロチニブ感受性細胞株に由来するエルロチニブ耐性細胞株は、AXL-ADCに対して特に感受性である－より低い用量でより強い抗腫瘍活性が得られた(実施例22)。さらに、BRAF阻害剤であるPLX4720(ベムラフェニブの類似体)またはダブラフェニブに耐性のメラノーマ細胞株は、AXLの高度発現を示しかつAXL-ADCによる治療に感受性であり、AXL-ADCはPLX4720に耐性のインビボメラノーマモデルにおいて強い抗腫瘍活性を示した(実施例23)。さらに、AXL-ADCは、パクリタキセルによる治療後に腫瘍が進行してしまった子宮頸癌の腫瘍モデルにおいて、完全または部分的な腫瘍退縮を誘導した(実施例24)。
したがって、一局面において、本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤、PI3K阻害剤、受容体型チロシンキナーゼに対するアンタゴニスト抗体、セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤、および化学療法剤からなる群より選択される少なくとも1種の治療剤に耐性でありかつ/または耐性になる傾向が高い癌を治療する際に使用するための、AXL-ADC、例えばHuMax-AXL-ADCを提供する。特定の態様では、治療剤はチロシンキナーゼ阻害剤、セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤および化学療法剤から選択される。
別の局面において、本発明は、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤、PI3K阻害剤、受容体型チロシンキナーゼに対するアンタゴニスト抗体、およびセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤から選択される治療剤と組み合わせて癌を治療する際に使用するための、AXL-ADC、例えばHuMax-AXL-ADCを提供し、ここで、ADCと治療剤は同時に、別々に、または逐次的に投与される。癌は治療剤に耐性であり、かつ/または治療剤に対して耐性になる傾向が高い可能性がある。特定の態様では、治療剤はチロシンキナーゼ阻害剤、セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤および化学療法剤から選択される。
本明細書で使用する「耐性」、「治療抵抗性」または「難治性」の癌、腫瘍などは、その癌または腫瘍が治療開始時から治療剤による処置に応答しない(本明細書では「自然耐性」と呼ばれる)か、または治療剤による処置に初期には応答したが、処置の一定期間後に治療剤に対して非応答性もしくはより低い応答性になり(本明細書では「獲得耐性」と呼ばれる)、進行性疾患をもたらす場合の、対象における癌または腫瘍を意味する。固形腫瘍については、疾患の初期安定化もまた初期応答に相当する。耐性の他の指標には、治療剤による処置にもかかわらず、癌の再発、全身腫瘍組織量の増加、新たに確認された転移などが含まれる。腫瘍または癌が治療剤に耐性であるか、または耐性になる傾向が高いかは、当業者によって判定され得る。全米総合癌センターネットワーク(National Comprehensive Cancer Network: NCCN, www.nccn.org)および欧州臨床腫瘍学会(European Society for Medical Oncology: ESMO, www.esmo.org/Guidelines)は、特定の癌が治療に応答するかどうかを評価するためのガイドラインを提供している。下記の表1および本明細書の他の箇所に記載されるように、特定の化学療法剤(例えば、タキサンなどの微小管を標的とする薬剤(MTA))、チロシンキナーゼ阻害剤(例えば、EGFR阻害剤)、セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤(例えば、BRAF阻害剤またはMEK阻害剤)、PI3K阻害剤、およびアンタゴニスト抗体に耐性を生じる癌または腫瘍は、AXLを発現することが判明している。
本明細書で使用する用語「対象」は、典型的には、AXL-ADCを投与されるヒトであり、例えば、AXLを発現する細胞の死滅によって直接または間接的に治療され得る癌を有すると診断されたヒト患者を含む。
本明細書で使用する場合、特定の治療剤に対して耐性の「傾向が高い」癌は、特定のクラスの薬物による治療に対して耐性または難治性であるか、そのようになる傾向が高いことが知られている癌である。例えば、耐性とAXLの高度発現またはデノボ発現との間に相関性があると本明細書に記載される治療剤で処置されているか、そのような治療剤による処置の対象となることが判明している癌患者は、耐性の傾向が高い癌を患っている。AXLの高度発現またはデノボ発現と関連することが知られており、したがって治療剤に対して耐性であるか耐性になる傾向が高い、癌および治療剤の非限定的な例は、以下の表1に示される。さらに、実施例24に示すように、AXL-ADCは、パクリタキセルによる治療後に腫瘍が進行した子宮頸癌の腫瘍モデルにおいて、完全または部分的な腫瘍退縮を誘導した。治療剤に対する自然耐性または獲得耐性を有し、かつAXL-ADC治療に感受性である他のタイプの癌および腫瘍もまた、本明細書の他の箇所に記載される。
（表１）AXLの高度またはデノボ発現を誘導する治療剤の例
Figure 2024038480000002
* N-(3-(5-クロロ-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-カルボニル)-2,4-ジフルオロフェニル)プロパン-1-スルホンアミド
** 6-(4-ブロモ-2-クロロアニリノ)-7-フルオロ-N-(2-ヒドロキシエトキシ)-3-メチルベンゾイミダゾール-5-カルボキサミド
*** 4-[2-(2-クロロ-4-フルオロアニリノ)-5-メチルピリミジン-4-イル]-N-[(1S)-1-(3-クロロフェニル)-2-ヒドロキシエチル]-1H-ピロール-2-カルボキサミド
本明細書で使用する「チロシンキナーゼ阻害剤」または「TKI」は、チロシンキナーゼまたはチロシンキナーゼから下流のシグナル伝達を阻害する化合物、典型的には薬剤を指す。チロシンキナーゼは、タンパク質のチロシンへのリン酸基の付加(リン酸化)を担う酵素であり、このリン酸化は、TKIが直接または間接的に阻害する工程である。チロシンのリン酸化は、細胞内シグナル伝達カスケードの活性化をもたらす。多くのTKIは癌治療に有用である。このようなTKIおよびそれらの標的の非限定的な例は、上記の表1に示されており、例えば、エルロチニブなどのEGFR阻害剤が含まれる。一態様において、本明細書で使用するチロシンキナーゼ阻害剤という用語は、チロシンキナーゼのタンパク質リン酸化活性、例えばEGFRのチロシンキナーゼ活性、を特異的に阻害する化合物を指す。
臨床で使用される多くのTKIは低分子薬剤であるが、受容体型チロシンキナーゼの細胞外部分に結合し、それによって受容体媒介シグナル伝達を阻害する、アンタゴニスト抗体などの「受容体型チロシンキナーゼ阻害剤」(rTKI)も存在する(本明細書では「mAb/rTKI」と呼ばれる)。そのような抗体の例は、セツキシマブおよびMAB391である。
本明細書で使用する「ホスホイノシチド3-キナーゼ阻害剤」または「PI3KI」は、PI3K/AKT経路における酵素を阻害する化合物、典型的には薬剤を指す。PI3KIの例としては、アルペリシブ(BYL791)が挙げられる。
本明細書で使用する「セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤」または「S/Th KI」は、BRAFもしくはMEKなどのセリン/スレオニンキナーゼ、またはBRAF/MEK経路を介するなどのセリン/スレオニンキナーゼから下流のシグナル伝達経路を阻害する化合物、典型的には薬剤を指す。セリン/スレオニンキナーゼは、セリンまたはスレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化を担う酵素であり、このリン酸化は、S/Th KIが直接または間接的に阻害する工程である。セリンまたはスレオニンのリン酸化は、細胞内シグナル伝達カスケードの活性化をもたらす。癌治療に有用なS/Th KIおよびそれらの標的の例は、上記の表1に示されており、ベムラフェニブおよびその類似体もしくは誘導体などのBRAF阻害剤が含まれる。一態様において、本明細書で使用する用語セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤は、セリン/スレオニンキナーゼのタンパク質リン酸化活性、例えば変異型BRAFまたはMEKのセリン/スレオニンキナーゼ活性、を特異的に阻害する化合物を指す。
ベムラフェニブ(PLX4032)は、経口的に利用可能な、ATP競合性の、変異型BRAFキナーゼの低分子阻害剤であり、これは、特定の変異を含むBRAFに選択的に結合してそれを阻害し、結果的に、変異型BRAFキナーゼを発現する腫瘍細胞において過剰に活性化された下流のMAPKシグナル伝達経路の阻害をもたらす。ヒト癌で同定されたBRAF変異は、一般に、キナーゼドメイン内のNローブのグリシンリッチPループならびに活性化セグメントおよび隣接領域に位置する。ベムラフェニブは、例えば、残基V600 (例えば、V600E)、残基L597 (例えば、L597R; Bahadoran et al., 2013)、および残基K601 (Dahlman et al., 2012)を含むがこれらに限定されない、こうした変異のいくつかを有するBRAFキナーゼに結合して、それを阻害する。
本明細書で使用する場合、薬物の「誘導体」とは、薬物から直接化学反応によって誘導されたまたは誘導可能な化合物である。本明細書で使用する場合、薬物の「類似体」または「構造類似体」とは、薬物と類似した構造および/または作用機序を有するが、少なくとも1つの構造要素において異なる化合物のことである。例えば「ベムラフェニブ」または「エルロチニブ」などの、薬物の「治療上有効な」類似体または誘導体は、その薬物と比較して、類似したまたは改善された治療効果を有するが、例えば、安定性、標的特異性、溶解性、毒性などの1つ以上において異なっていてよい。
以下の表2および表3は、それぞれ、ベムラフェニブおよびエルロチニブと同様の作用機序(それぞれ、BRAFまたはEGFR阻害)を有するBRAFおよびEGFR阻害剤を示す。
（表２）BRAF阻害剤
Figure 2024038480000003
* (E)-5-(1-(2-ヒドロキシエチル)-3-(ピリジン-4-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-2,3-ジヒドロインデン-1-オンオキシム
** (E)-5-(2-(4-(2-(ジメチルアミノ)エトキシ)フェニル)-4-(ピリジン-4-イル)-1H-イミダゾール-5-イル)-2,3-ジヒドロインデン-1-オンオキシム
*** 3-(2-シアノプロパン-2-イル)-N-(4-メチル-3-(3-メチル-4-オキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-6-イルアミノ)フェニル)ベンズアミド
（表３）EGFR阻害剤
Figure 2024038480000004
したがって、本明細書に示すように、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、トラメチニブまたはそれらの任意の2つ以上の組み合わせに対して耐性のメラノーマ；およびエルロチニブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、またはそれらの任意の2つ以上の組み合わせに対して耐性のNSCLCは、腫瘍細胞によるAXLのデノボまたは高度発現と関連し得る。かくして、このような腫瘍はAXL特異的ADCによる治療の対象となり得る。
一局面において、本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤、および化学療法剤から選択される少なくとも1種の治療剤に耐性である、対象における癌を治療する方法であって、AXL-ADCを投与する工程を含む方法を提供する。癌は、例えば、該治療剤を用いた以前の治療またはまだ進行中の治療の間に耐性を獲得したものであり得る。あるいは、癌は、該治療剤による治療の開始時から耐性であった。一態様では、癌はAXLを発現する癌である。他の局面において、治療剤はPI3K阻害剤またはmAb/rTKIである。
一局面において、本発明は、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤またはセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤から選択される少なくとも1種の治療剤と組み合わせて、AXL-ADCを投与する工程を含む、対象における癌を治療する方法を提供し、その場合に、ADCと治療剤は、同時に、別々に、または逐次的に投与される。一態様では、癌は治療剤への耐性の傾向が高い。一態様では、癌は治療剤に耐性である。他の局面において、治療剤はPI3K阻害剤またはmAb/rTKIである。
本発明の発明者らによって示され、かつ上の表1に示されるように、特定のタイプの癌において、耐性の発生は、増大したまたはデノボのAXL発現に関連している。そのような癌としては、限定するものではないが、メラノーマ、非小細胞肺癌(NSCLC)、子宮頸癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌(SCCHN)、乳癌、消化管間質腫瘍(GIST)、腎臓癌、神経芽細胞腫、食道癌、横紋筋肉腫、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)が挙げられる。
前述の局面または態様の一実施態様において、癌または腫瘍は、子宮頸癌、メラノーマ、NSCLC、SCCHN、乳癌、GIST、腎臓癌、神経芽細胞腫、食道癌および横紋筋肉腫から選択される。別の実施態様において、癌は、AMLおよびCMLから選択される血液癌である。
特定の態様において、癌または腫瘍は、L858RおよびT790Mから選択されるEGFRアミノ酸配列の少なくとも1つの変異、例えばL858RまたはT790M/L858R、によって特徴付けられる。例えば、その癌または腫瘍はNSCLCであり得る。
一態様において、前記少なくとも1種の治療剤は、EGFRアンタゴニスト、HER2アンタゴニスト、ALK阻害剤、FLT3阻害剤、またはそれらの2つ以上の組み合わせであるTKI阻害剤からなるか、またはそれを含む。非限定的な好ましいTKIとしては、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、オシメルチニブ、ロシレチニブ、イマチニブ、スニチニブ、アファニチブ、クリゾチニブ、ミドスタウリン(PKC412)、およびキザルチニブ(AC220)が挙げられる。一態様では、TKIは、EGFR阻害剤、例えばエルロチニブまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体、例えば、アファチニブ、ラパチニブ、オシメルチニブ、ロシレチニブ、またはゲフィチニブである。
特定の一態様では、チロシンキナーゼ阻害剤はエルロチニブであり、癌はエルロチニブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、NSCLCである。
特定の一態様では、チロシンキナーゼ阻害剤はエルロチニブであり、癌はエルロチニブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、膵臓癌である。
特定の一態様では、チロシンキナーゼ阻害剤はゲフィチニブであり、癌はゲフィチニブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、NSCLCである。
特定の一態様では、チロシンキナーゼ阻害剤はクリゾチニブであり、癌はクリゾチニブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、NSCLCである。
特定の一態様では、チロシンキナーゼ阻害剤はラパチニブであり、癌はラパチニブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、乳癌である。
特定の一態様では、チロシンキナーゼ阻害剤はイマチニブであり、癌はイマチニブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、CMLである。
特定の一態様では、チロシンキナーゼ阻害剤はイマチニブであり、癌はイマチニブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、GISTである。
特定の一態様では、チロシンキナーゼ阻害剤はスニチニブであり、癌はスニチニブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、GISTである。
特定の一態様では、チロシンキナーゼ阻害剤はスニチニブであり、癌はスニチニブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、腎臓癌である。
特定の一態様では、チロシンキナーゼ阻害剤はクリゾチニブであり、癌はスニチニブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、神経芽細胞腫である。
特定の一態様では、チロシンキナーゼ阻害剤はミドスタウリン(PKC412)であり、癌はミドスタウリンに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、AMLである。
特定の一態様では、チロシンキナーゼ阻害剤はキザルチニブであり、癌はキザルチニブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、AMLである。
特定の一態様では、チロシンキナーゼ阻害剤はアファチニブであり、癌はアファチニブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、乳癌である。
特定の一態様では、チロシンキナーゼ阻害剤はアキシチニブであり、癌はアキシチニブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、腎臓癌である。
特定の一態様では、チロシンキナーゼ阻害剤はレンバチニブであり、癌はレンバチニブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、甲状腺癌である。
チロシンキナーゼ阻害剤がEGFR阻害剤、例えばエルロチニブまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体であり、好ましくは癌がEGFR阻害剤に耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、NSCLCである場合の実施態様が特に企図される。特定の態様では、その癌または腫瘍(例えば、NSCLC)は、L858RおよびT790M、またはそれらの組み合わせから選択されるEGFRの少なくとも1つの変異により特徴付けられる。
一態様において、前記少なくとも1種の治療剤は、PI3K阻害剤からなるか、またはそれを含む。非限定的な好ましいPI3K阻害剤は、アルペリシブまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体を含む。
特定の一態様では、PI3Kiはアルペリシブ(BYL719)であり、癌はアルペリシブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、SCCHNである。
一態様において、前記少なくとも1種の治療剤は、受容体型チロシンキナーゼの細胞外部分に結合するアンタゴニスト抗体からなるか、またはそれを含む。非限定的な好ましいmAb/rTKIは、セツキシマブおよび抗IGF-IR MAB391、ならびにセツキシマブおよびMAB391の治療上有効な類似体もしくは誘導体を含む。
特定の一態様では、mAb/rTKIはセツキシマブであり、癌はセツキシマブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、SCCHNである。
特定の一態様では、mAb/rTKIは抗IGF-IR抗体MAB391であり、癌はMAB391に耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、SCCHNである。
一態様において、前記少なくとも1種の治療剤は、BRAF阻害剤、MEK阻害剤またはそれらの組み合わせであるS/Th KIからなるか、またはそれを含む。一態様では、S/Th KIはBRAF阻害剤、例えばベムラフェニブ(PLX4032)またはその治療上有効な誘導体もしくは類似体、例えばPLX4720もしくはダブラフェニブ；またはVTXKIIEである。一態様では、S/Th KIはMEK阻害剤、例えばセルメチニブ(AZD6244)またはトラメチニブである。
特定の一態様では、S/Th KIはベムラフェニブであり、癌はベムラフェニブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、メラノーマである。
特定の一態様では、S/Th KIはベムラフェニブであり、癌はベムラフェニブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、結腸直腸癌である。
特定の一態様では、S/Th KIはダブラフェニブであり、癌はダブラフェニブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、メラノーマである。
特定の一態様では、S/Th KIはダブラフェニブであり、癌はダブラフェニブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、結腸直腸癌である。
特定の一態様では、S/Th KIはセルメチニブであり、癌はセルメチニブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、膵臓癌である。
特定の一態様では、S/Th KIはセルメチニブであり、癌はセルメチニブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、メラノーマである。
特定の一態様では、S/Th KI阻害剤はトラメチニブであり、腫瘍はトラメチニブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、メラノーマである。
特定の一態様では、S/Th KIはVTXKIIEであり、癌はVTXKIIEに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、メラノーマである。
特定の一態様では、S/Th KIはPLX4720であり、癌はPLX4720に耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、メラノーマである。
一態様において、前記少なくとも1種の治療剤は、BRAF阻害剤からなるか、またはそれを含む。特定の態様では、BRAF阻害剤はベムラフェニブ(PLX4032)またはその治療上有効な誘導体もしくは類似体、例えばダブラフェニブもしくはPLX4720である。別の特定の態様では、BRAF阻害剤はベムラフェニブまたはその治療上有効な誘導体もしくは類似体であり、腫瘍はベムラフェニブに耐性であるか、または耐性になる傾向が高い、メラノーマである。ベムラフェニブは、特定の変異を有するBRAFキナーゼの阻害剤であり、例えば、該変異は、キナーゼドメイン内のNローブのグリシンリッチPループならびに活性化セグメントおよび隣接領域に位置する。一態様では、ベムラフェニブ類似体はダブラフェニブである。
したがって、特定の一態様において、本開示によって提供されるAXL-ADCは、メラノーマを治療中であるかまたは治療したことがある治療剤に対して耐性のAXLを発現するメラノーマを治療する際に使用するためのものであり、ここで、該治療剤はベムラフェニブまたはその治療上有効な誘導体もしくは類似体であり、かつ該メラノーマはBRAFに変異を呈する。特に、該メラノーマは、ベムラフェニブまたは治療上有効な類似体もしくは誘導体による阻害に対してBRAFを感受性にする、BRAF変異を呈する。非限定的な変異は、アミノ酸置換、欠失または挿入を含む；好ましくは、該変異はアミノ酸置換である。このような変異の特定の残基には、限定するものではないが、V600(例えば、V600E、V600KおよびV600D)、残基L597(例えば、L597R)、および残基K601 (K601E)が含まれる。一態様では、該変異はV600E、V600D、V600K、L597RおよびK601Eから選択される。
一態様において、前記少なくとも1種の治療剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、カルボプラチンおよびメトホルミンからなる群より選択される化学療法剤からなるか、またはそれを含む。一態様では、治療剤は、微小管を標的とする薬剤、例えば、パクリタキセル、ドセタキセルまたはビンクリスチン、またはそのいずれかの治療上有効な類似体もしくは誘導体である。一態様では、該少なくとも1種の治療剤は、タキサン、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、またはパクリタキセルもしくはドセタキセルの治療上有効な類似体もしくは誘導体である。
特定の一態様では、化学療法剤はパクリタキセルであり、癌はパクリタキセルに耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、子宮頸癌である。
特定の一態様では、化学療法剤はパクリタキセルであり、癌はパクリタキセルに耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、NSCLCである。
特定の一態様では、化学療法剤はパクリタキセルであり、癌は、パクリタキセルに耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、卵巣癌である。
特定の一態様では、化学療法剤はドセタキセルであり、癌は、ドセタキセルに耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、頭頸部癌である。
特定の一態様では、化学療法剤はドセタキセルであり、癌は、ドセタキセルに耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、胃癌である。
特定の一態様では、化学療法剤はドセタキセルであり、癌は、ドセタキセルに耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、乳癌である。
特定の一態様では、化学療法剤はドセタキセルであり、癌は、ドセタキセルに耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、前立腺癌である。
特定の一態様では、化学療法剤はドセタキセルであり、癌は、ドセタキセルに耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、NSCLCである。
特定の一態様では、化学療法剤はシスプラチンであり、癌は、シスプラチンに耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、食道癌である。
特定の一態様では、化学療法剤はシスプラチンであり、癌は、シスプラチンに耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、SCCHNである。
特定の一態様では、化学療法剤はカルボプラチンであり、癌は、カルボプラチンに耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、SCCHNである。
特定の一態様では、化学療法剤はシスプラチンであり、癌は、シスプラチンに耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、AMLである。
特定の一態様では、化学療法剤はドキソルビシンであり、癌は、ドキソルビシンに耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、AMLである。
特定の一態様では、化学療法剤はエトポシドであり、癌は、エトポシドに耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、AMLである。
特定の一態様では、化学療法剤はメトホルミンであり、癌は、メトホルミンに耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、前立腺癌である。
特定の一態様では、化学療法剤はシスプラチンであり、癌は、シスプラチンに耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、卵巣癌である。
特定の一態様では、化学療法剤はドキソルビシンであり、癌は、ドキソルビシンに耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、非小細胞肺癌(NSCLC)である。
特定の一態様では、化学療法剤はテモゾロミドであり、腫瘍は、テモゾロミドに耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、星状細胞腫である。
特定の一態様では、化学療法剤はカルボプラチンであり、腫瘍は、カルボプラチンに耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、星状細胞腫である。
特定の一態様では、化学療法剤はビンクリスチンであり、腫瘍は、ビンクリスチンに耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、星状細胞腫である。
したがって、一局面において、本発明は、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤、PI3K阻害剤、mAb/rTKI、およびセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤から選択される治療剤に耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、対象における癌を治療する方法に関し、該方法は、対象に、治療有効量の、ヒトAXLに結合する抗体を含むADCを投与する工程を含む。一態様では、治療剤は、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤、およびセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤から選択される。例えば、化学療法剤はタキサンであり、チロシンキナーゼ阻害剤はEGFR阻害剤であり、セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤はBRAF阻害剤またはMEK阻害剤であり得る。一態様では、その癌はAXLを発現する癌である。
一態様において、本発明は、対象におけるエルロチニブ耐性NSCLCを治療する方法に関し、該方法は、対象に、ヒトAXLに結合する抗体を含むADCを投与する工程を含む。一態様では、該方法は、対象にエルロチニブまたはその類似体もしくは誘導体を投与することをさらに含む。一態様では、その癌はAXLを発現する癌である。
一態様において、本発明は、対象におけるベムラフェニブ耐性メラノーマを治療する方法に関し、ここで、該メラノーマはBRAFに変異を呈し、該変異はベムラフェニブによる変異型BRAFのBRAFキナーゼ活性の阻害をもたらし、該方法は、対象に、ヒトAXLに結合する抗体を含むADCを投与する工程を含む。一態様では、この変異は、残基V600、L597および/またはK601におけるアミノ酸置換である。一態様では、変異は、V600E、V600D、V600K、L597RおよびK601Eから選択される。一態様では、該方法は、対象にベムラフェニブまたはその類似体もしくは誘導体を投与することをさらに含む。一態様では、該類似体はダブラフェニブである。一態様では、その癌はAXLを発現する癌である。
一態様において、本発明は、対象におけるパクリタキセル耐性子宮頸癌を治療する方法に関し、この方法は、対象に、ヒトAXLに結合する抗体を含むADCを投与する工程を含む。一態様では、該方法は、対象にパクリタキセルまたはその類似体もしくは誘導体を投与することをさらに含む。一態様では、その癌はAXLを発現する癌である。
AXL-ADCに関して、当技術分野で通常の知識を有する医師は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。これに関連して、薬学的組成物に言及する場合、組成物をそのようなものとして含み、逆もまた同様であることも理解されるべきである。例えば、医師は、薬学的組成物中で用いられるAXL-ADCの用量を、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に用量を増加させることができる。一般的に、適切な用量は、特定の投薬レジメンに従って治療効果を奏するのに有効な最低用量である化合物の量である。そのような有効用量は、一般的に、上述した要因に依存するであろう。
例えば、治療的使用のための「有効量」は、疾患の進行を安定させるその能力によって測定され得る。癌を抑制する化合物の能力は、例えば、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系で評価される。あるいは、組成物のこの特性は、当業者に公知のインビトロアッセイで、細胞増殖を阻害するかまたは細胞傷害性を誘発する化合物の能力を調べることによって、評価することができる。治療用化合物の治療有効量は、腫瘍サイズを縮小させるか、さもなければ対象の症状を改善し得る。当業者は、そのような量を、対象のサイズ、対象の症状の重篤度、および選択される特定の組成物または投与経路などの要因に基づいて、決定することができよう。例えば、すでに示したように、全米総合癌センターネットワーク(National Comprehensive Cancer Network: NCCN, www.nccn.org)および欧州臨床腫瘍学会(European Society for Medical Oncology: ESMO, www.esmo.org/Guidelines)の癌治療を評価するためのガイドラインを使用することができる。
本発明のAXL-ADCの治療有効量の非限定的な例示的範囲は、0.02～100mg/kgであり、例えば、約0.02～30mg/kg、約0.05～10mg/kg、0.1～5mg/kgまたは0.1～3mg/kgなど、例えば約0.5～3mg/kgまたは0.5～2mg/kgである。
投与は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下であってよく、場合によっては、標的部位の近位に投与することができる。
上記の治療方法および使用における投薬レジメンは、最適な所望の応答(例えば、治療応答)が得られるように調整される。例えば、単回ボーラスを投与するか、いくつかの分割用量を経時的に投与するか、または用量を治療状況の緊急性によって示されるように比例的に増減することができる。
一態様において、有効性-安全性ウィンドウは、例えば薬物-抗体比(DAR)を低下させることによって、および/またはAXL-ADCを未標識抗AXL抗体と混合することによって、比毒性を低下させることにより最適化される。
一態様において、治療の有効性は、治療中に、例えば所定の時点で、モニターされる。有効性を測定するための方法は、一般的に、特定の癌のタイプに依存しており、当業者には周知である。一態様では、有効性は、患部の視覚化によって、または本明細書にさらに記載される他の診断方法によって、例えば、標識された抗AXL抗体、フラグメントまたはAXL特異的抗体に由来するミニ抗体を用いて、1回以上のPET-CTスキャンを実施することによって、モニターすることができる。
必要に応じて、AXL-ADCの有効1日量は、1日を通して適切な間隔で、任意に単位剤形で、別々に投与される2、3、4、5、6またはそれ以上の分割用量とすることができる。別の態様では、AXL-ADCは、望ましくない副作用を最小限に抑えるために、長時間、例えば24時間以上にわたって、低速の連続注入により投与される。
AXL-ADCの有効用量はまた、週1回、週2回または週3回の投薬期間を用いて投与することもできる。投薬期間は、例えば、8週間、12週間または臨床的進行が確立されるまでに制限され得る。一態様では、AXL-ADCを3週に1回(1Q3W)または4週にわたって3回(3Q4W)投与して、患者がAXL-ADCの16または12サイクルを3週または4週間隔で、例えば48週間、受け取り、必要に応じてこのレジメンを延長または反復するようにする。
例えば、一態様では、AXL-ADCを10～500mg/m2、例えば200～400mg/m2の週1回用量で、注入によって投与することができる。こうした投与は、例えば1～8回、例えば3～5回、繰り返すことができる。投与は、1～24時間、例えば1～12時間にわたって、連続注入により行うことができる。
別の態様では、AXL-ADCを10～500mg/m2、例えば50～200mg/m2の投与量で、3週間ごとに注入によって投与する。こうした投与は、例えば1～8回、例えば3～5回、繰り返すことができる。投与は、1～24時間、例えば1～12時間にわたって、連続注入により行うことができる。
一態様では、AXL-ADCは、約0.1～10mg/kg、例えば約1～3mg/kgの単回投与として、週にまたは3週ごとに1回、12回まで、8回まで、または臨床的進行まで投与される。投与は、1～24時間、例えば1～12時間にわたって、連続注入により行うことができる。このようなレジメンは、例えば6ヶ月または12ヶ月後に、必要に応じて1回以上繰り返してもよい。投与量は、例えば生体サンプルを採取して、抗AXL抗体の抗原結合領域を標的とする抗イディオタイプ抗体を使用することにより、投与時の血液中の本発明の化合物の量を測定することによって決定または調整することができる。
一態様では、AXL-ADCは、維持療法として、例えば6ヶ月以上にわたって週1回、投与される。本明細書で使用する「維持療法」とは、癌の進行または再発を回避するかまたは遅延させるための療法を意味する。典型的には、癌が最初の治療の後で完全寛解している場合、癌の再発を回避または遅延させるために維持療法が用いられる。癌が進行しており、最初の治療の後で完全寛解が達成されていない場合は、癌の成長を遅らせるために、例えば患者の寿命を延ばすために、維持療法が使用され得る。
非限定的な例として、本発明による治療処置は、本発明の化合物の1日投与量として、1日あたり約0.1～100mg/kg、例えば約0.1～50mg/kg、例えば約0.2、0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90または100mg/kgの量で、治療の開始後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39もしくは40日目のうちの1日以上に、あるいは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20週目のうちの1週以上に、またはこれらの任意に組み合わせた日もしくは週に、24、12、8、6、4または2時間ごとの単回投与もしくは分割投与、またはこれらの任意の組み合わせを使用して、提供され得る。
非経口組成物は、投与のしやすさおよび投与量の均一性のために、単位剤形として製剤化することができる。ここで使用される単位剤形とは、治療される対象のための単位投与量として適した物理的離散単位を指す；各単位は、必要とされる薬学的担体と共同して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、(a)活性化合物の特有の性質および達成すべき特定の治療効果、ならびに(b)そのような活性化合物を配合する分野に固有の、個体における感受性の処置のための制限、によって決定づけられ、かつそれらに直接依存する。
本明細書に記載するように、AXL-ADCは少なくとも1種の追加の治療剤と組み合わせて使用され得る。少なくとも1種の追加の治療剤は、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤、PI3K阻害剤、mAb/rTKI、および/またはセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤を含むか、またはそれらからなり、先の態様で説明したように、癌または腫瘍はそれらに対して耐性であるか、または耐性を生じる傾向が高いものである。
AXL-ADCと前記1種以上の治療剤は同時に、別々に、または逐次的に投与することができる。例えば、一態様では、この組み合わせは、該少なくとも1種の治療剤による前治療を受けたことがない癌患者を治療するために使用される。別の態様では、この組み合わせは、該少なくとも1種の治療剤による前治療に失敗した癌患者を治療するために使用される。AXL-ADCと治療剤(複数可)のための効果的な投与量および投薬レジメンは、治療される新生物、腫瘍または癌に依存し、当業者によって決定され得る。
一態様において、AXL-ADCと共に使用される1種以上の治療剤の投与量および投薬レジメンは、該1種以上の治療剤による新生物、腫瘍または癌の治療において通常使用されるものと同じであるか、または本質的に類似している。一態様では、治療剤(複数可)の投与量は、通常使用される量よりも少ないが、投薬レジメンはその他の点で類似している。一態様では、治療剤(複数可)の投与量は、通常使用される量と同様であるが、投薬レジメンはより少ない頻度の投与に調整される。
したがって、一局面において、本発明は、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤およびセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤から選択される治療剤に耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、対象における癌を治療する方法に関し、該方法は、対象に、(i)ヒトAXLに結合する抗体を含むADCと、(ii)該治療剤とを投与する工程を含む。一態様では、化学療法剤はタキサンであり、チロシンキナーゼ阻害剤はEGFR阻害剤であり、セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤はBRAF阻害剤またはMEK阻害剤である。一態様では、癌はAXLを発現する癌である。AXL-ADCは、例えば、上でより詳細に説明した投薬レジメンに従って、治療有効量で投与され得る。例えば、非限定的な例として、AXL-ADCを約0.02～100mg/kg、例えば約0.02～30mg/kg、例えば約0.05～10mg/kgの量で、週1回(1Q1W)、2週に1回(1Q2W)もしくは3週に1回(1Q3W)、または4週間にわたって3回(3Q4W)投与して、患者がAXL-ADCの16または12サイクルを3週または4週間隔で、例えば48週間、受け取るようにし、主治医が決定したレジメンを延長、短縮または反復する。
一態様において、本発明は、対象におけるエルロチニブ耐性NSCLCを治療する方法に関し、該方法は、対象に、(i)ヒトAXLに結合する抗体を含むADC、および(ii)エルロチニブまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体を投与する工程を含む。エルロチニブは、例えば、50～300mg、例えば100～200mg、例えば約150mgの用量で、1日1～2回、または2～3日ごとに、経口投与することができる。好ましくは、エルロチニブを約150mgの用量で1日1回投与する。一態様では、その癌はAXLを発現する癌である。
一態様において、本発明は、対象におけるベムラフェニブ耐性メラノーマを治療する方法に関し、ここで、該メラノーマはBRAFに変異を呈し、該変異はベムラフェニブによる変異型BRAFのBRAFキナーゼ活性の阻害をもたらすものであり、該方法は、対象に、(i)ヒトAXLに結合する抗体を含むADC、および(ii)ベムラフェニブまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体を投与する工程を含む。一態様では、その癌はAXLを発現する癌である。一態様では、この変異は、残基V600、L597および/またはK601におけるアミノ酸置換である。一態様では、該変異は、V600E、V600D、V600K、L597RおよびK601Eから選択される。ベムラフェニブは、例えば、1日あたり約200～2000mg、500～1500mg、例えば約1000mgの用量で経口投与することができ、例えば、960mgを4×240mg錠剤としてq12hr(約12時間間隔)で投与する。
一態様において、本発明は、対象におけるダブラフェニブ耐性メラノーマを治療する方法に関し、ここで、該メラノーマはBRAFに変異を呈し、該変異はダブラフェニブによる変異型BRAFのBRAFキナーゼ活性の阻害をもたらすものであり、該方法は、対象に、(i)ヒトAXLに結合する抗体を含むADC、および(ii)ダブラフェニブまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体を投与する工程を含む。一態様では、その癌はAXLを発現する癌である。一態様では、この変異は、残基V600、L597および/またはK601におけるアミノ酸置換である。一態様では、該変異は、V600E、V600D、V600K、L597RおよびK601Eから選択される。ダブラフェニブは、例えば、約50～300mg、例えば約100～200mg、例えば約150mgの用量で、1日1～2回または2～3日ごとに、対象に経口投与することができる。好ましくは、ダブラフェニブを150mgとして1日2回、例えば、少なくとも食事の1時間前または少なくとも食事の2時間後に、経口投与する。
一態様において、本発明は、対象におけるダブラフェニブ、トラメチニブまたは両方に耐性のメラノーマを治療する方法に関し、ここで、該メラノーマはBRAFに変異を呈し、該変異はダブラフェニブによる変異型BRAFのBRAFキナーゼ活性の阻害をもたらすものであり、該方法は、対象に、(i)ヒトAXLに結合する抗体を含むADC、(ii)ダブラフェニブまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体、および(iii)トラメチニブまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体を投与する工程を含む。一態様では、その癌はAXLを発現する癌である。一態様では、この変異は、残基V600、L597および/またはK601におけるアミノ酸置換である。一態様では、該変異は、V600E、V600D、V600K、L597RおよびK601Eから選択される。ダブラフェニブは、例えば、約50～300mg、例えば約100～200mg、例えば約150mgの用量で、1日1～2回または2～3日ごとに、対象に経口投与することができる。好ましくは、ダブラフェニブを150mgとして1日2回、例えば、少なくとも食事の1時間前または少なくとも食事の2時間後に、経口投与する。トラメチニブは、例えば、約0.5～5mg、例えば約1～4mg、例えば約2～3mg、例えば約2mgの用量で、1日1～2回または2、3もしくは4日ごとに、例えば1日1回、経口投与することができる。
一局面において、本発明は、対象におけるタキサン耐性の子宮頸癌を治療する方法に関し、該方法は、対象に、(i)ヒトAXLに結合する抗体を含むADC、および(ii)タキサンを投与する工程を含む。一態様では、その癌はAXLを発現する癌である。好ましくは、タキサンは、パクリタキセルまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体、例えばドセタキセルである。パクリタキセルは、例えば、約100～500mg/m2、例えば約125～400mg/m2、例えば約135mg/m2、175mg/m2または250mg/m2の用量で、数時間(例えば3時間)にわたって対象に静脈内(iv)投与することができ、この治療を1、2、3、4、5週ごとに、例えば3週ごとに、繰り返す。あるいは、パクリタキセルをアルブミン結合パクリタキセル(nab-パクリタキセル)として、例えば約50～400mg/m2、例えば約75～300mg/m2、例えば約100～200mg/m2、例えば約125mg/m2の用量で、30分～1時間以上にわたって静脈内投与し、この治療を週2回、または2～3週ごとに1回、例えば週1回、繰り返すことができる。次に、ドセタキセルを約25～500mg/m2、例えば約50～300mg/m2、例えば約75～200mg/m2、例えば約100mg/m2の用量で、30分～2時間、例えば1時間にわたって静脈内投与し、この治療を1、2、3、4、5週ごとに、例えば3週ごとに、繰り返すことができる。
上記局面の特定の態様において、AXL-ADCは、単独でまたは治療剤と組み合わせて、対象における再発癌を治療するために使用され、この場合、その癌は該治療剤による初期治療後に再発したものである。癌がAXL-ADCによる初期治療後にもう一度再発した場合には、AXL-ADCを、その再発癌を治療するために、単独でまたは治療剤と一緒に、再度使用することができる。
一局面において、本発明は、AXL-ADCと、化学療法剤、TKI、PI3KI、mAb/rTKIおよびS/Th KIから選択される治療剤との組み合わせで治療するための、癌に罹患している対象を選択する方法に関し、該方法は、
(a) 対象が化学療法剤、TKI、PI3KI、mAb/rTKIまたはS/Th KIによる治療の基準を満たすかどうか；
(b) 癌におけるAXLの発現がTKIまたはS/Th KIに対する耐性と関連するかどうか；
を判定し、そして
(c) TKIまたはS/Th KIによる治療の基準を満たしており、かつAXLの発現がTKIまたはS/Th KIに対する耐性と関連する癌に罹患している対象を選択する。一態様では、該治療剤は化学療法剤、TKIまたはS/Th KIである。
一局面において、本発明は、ベムラフェニブまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体に耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、メラノーマを有すると診断された対象を治療する方法に関し、該方法は、治療有効量の、ヒトAXLに結合する抗体を含むADCを投与する工程を含む。
一局面において、本発明は、メラノーマに罹患している対象が、(i)ベムラフェニブまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体と、(ii)ヒトAXLに結合する抗体を含むADCとの組み合わせによる治療に適しているかどうかを判定する方法に関し、この場合、該対象はベムラフェニブ(またはその類似体もしくは誘導体)による治療を受けているか、または受けたことがあり、かつベムラフェニブ(またはその類似体もしくは誘導体)に耐性であると判定されているか、または耐性の疑いがあり、したがって、該対象は該治療に適していると判定される。さらなる局面では、メラノーマがAXLを発現するかどうかが判定される。一態様では、その類似体はダブラフェニブである。
一局面において、本発明は、パクリタキセルまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体、例えば別のタキサン(例：ドセタキセル)、に耐性であるかまたは耐性になる傾向が高い、子宮頸癌と診断された対象を治療する方法に関し、該方法は、治療有効量の、ヒトAXLに結合する抗体を含むADCを投与する工程を含む。
一局面において、本発明は、子宮頸癌に罹患している対象が、(i)パクリタキセルまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体、例えば別のタキサン(例：ドセタキセル)と、(ii)ヒトAXLに結合する抗体を含むADCとの組み合わせによる治療に適しているかどうかを判定する方法に関し、この場合、該対象はパクリタキセルによる治療を受けているか、または受けたことがあり、かつパクリタキセルに耐性であると判定されているか、または耐性の疑いがあり、したがって、該対象は該治療に適していると判定される。さらなる局面では、子宮頸癌がAXLを発現するかどうかが判定される。
一態様において、抗AXL-ADCで治療される耐性の新生物、腫瘍または癌は、AXLを発現すると判定されたものである。
特定の一態様において、これは、患者から採取したサンプル中のAXL抗原のレベル、またはAXLを細胞表面上に発現する細胞のレベルを検出することによって達成される。患者は、例えば、子宮頸癌、メラノーマまたはNSCLCに罹患している可能性がある。検出されるAXL抗原は、可溶性AXL抗原、細胞結合型AXL抗原、またはその両方であり得る。例えば、試験されるサンプルを、抗AXL抗体のAXLへの結合を可能にする条件下で抗AXL抗体に、任意で対照サンプルおよび/または無関係の抗原に結合する対照抗体と共に、接触させる。その後、該抗体のAXLへの結合を(例えば、ELISAを用いて)検出することができる。対照サンプルを試験サンプルと一緒に使用する場合、抗AXL抗体または抗AXL抗体-AXL複合体のレベルを両方のサンプルで分析し、対照サンプルと比較して、試験サンプル中の抗AXL抗体または抗AXL抗体-AXL複合体の統計的に有意な高レベルは、試験サンプル中のAXLのより高いレベルを示し、これによりAXLのより高い発現が示される。このような目的に有用な従来のイムノアッセイの例としては、限定するものではないが、ELISA、RIA、FACSアッセイ、プラズモン共鳴アッセイ、クロマトグラフィーアッセイ、組織免疫組織化学、ウェスタンブロット、および/または免疫沈降が挙げられる。
組織サンプルは、AXL抗原および/またはAXLを発現する細胞を含むことが知られているか、または含むと予想される組織から採取することができる。例えば、インサイチューでのAXL発現の検出は、患者から腫瘍生検または血液サンプルなどの組織学的検体を取り出し、該検体の適切な調製後に、そのような検体に抗AXL抗体を供給することによって達成され得る。該検体に該抗体をアプライするか、または重層することによって該抗体を供給し、次いで適切な手段を用いて該抗体を検出する。
上記のアッセイにおいて、抗AXL抗体は、AXLに結合した抗体を検出できるようにする検出可能物質で標識され得る。
サンプル中の細胞上に発現されたAXLのレベルもまた、実施例23に記載の方法に従って測定することができ、そこでは、ヒト腫瘍細胞株の形質膜上のAXL発現が、モノクローナル抗AXL抗体(ここでは、マウスモノクローナル抗体ab89224; Abcam社, Cambridge, 英国)を用いて、QIFIKIT分析(DAKO社, カタログ番号K0078)を用いた間接免疫蛍光法によって定量化された。簡潔に述べると、単細胞懸濁液を調製し、任意で洗浄する。次の工程は氷上で実施する。該細胞を、例えば100,000細胞/ウェルまたはチューブで、播種し、その後ペレット化し、10μg/mLの濃度の抗体サンプル50μL中に再懸濁させる。任意で、対照抗体を並行サンプルに添加する。4℃で30分間インキュベートした後、細胞をペレット化し、FACS緩衝液150μL中に再懸濁させ、AXLの量を、例えば抗AXL抗体および対照抗体に結合する二次FITC標識抗体を用いた、FACS分析によって測定する。各細胞株について、形質膜上に発現されたAXL分子の数の推定値である抗体結合能(ABC)は、実施例23に記載されるキャリブレーション曲線の式(標準曲線からの未知数の補間)に基づいて、AXL抗体染色細胞の平均蛍光強度を用いて算出された。一態様では、実施例23の方法を用いて、AXL発現細胞上のAXLのレベルは、少なくとも5000、例えば少なくとも8000、例えば少なくとも13000と推定される。
特定の態様において、新生物、腫瘍または癌におけるAXL発現細胞の存在またはレベルは、当技術分野で公知の方法に従って、検出可能に標識された抗AXL抗体のインビボイメージングにより評価される。バックグラウンドまたは他の対照よりも有意に高い、ある部位からの、例えば既知のまたは疑わしい腫瘍部位からの、シグナルは、その腫瘍または癌におけるAXLの過剰発現を示している。
AXL-ADC
本発明において使用するのに適したADCは、任意の抗AXL抗体から調製することができる。好ましい抗AXL抗体は、以下の局面および態様に示される、AXL結合特性、可変もしくは超可変配列、または結合特性と配列特性の組み合わせの1つ以上によって特徴付けられる。特定の局面では、該抗体はAXLに結合するが、そのリガンドであるGrowth Arrest-Specific 6 (Gas6)とAXL結合について競合しない。最も好ましいのは、表4に配列が記載される特定の抗AXL抗体、特に107と表示された抗体、ならびに抗体107と1つ以上のAXL結合特性またはCDR、VHおよび/またはVL配列を共有する抗体である。
したがって、前述の局面または態様の特定の一実施態様において、抗AXL抗体は、VH領域とVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、ここで、VH領域はSEQ ID No: 36、37および38のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含み、VL領域はSEQ ID No: 39、GASおよび40のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む。
好ましい態様において、ADCは、アウリスタチンまたはその機能性ペプチド類似体もしくは誘導体、例えばモノメチルアウリスタチンEなどである細胞傷害性薬剤に、好ましくはマレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル(mc-vc-PAB)リンカーを介して、連結された抗AXL抗体を含む。
本明細書において使用される「抗体」という用語は、典型的な生理学的および／または腫瘍特異的条件下で、少なくとも約30分、少なくとも約45分、少なくとも約1時間、少なくとも約2時間、少なくとも約4時間、少なくとも約8時間、少なくとも約12時間、約24時間もしくはそれより長い時間、約48時間もしくはそれより長い時間、約3、4、5、6、7日もしくはそれより長い日数などのような有意な期間の半減期、または任意の他の関連する機能的に定義される期間（抗原に対する抗体結合と関連する生理学的応答を誘導、促進、増強、および／もしくは調節するのに十分な時間、ならびに／または抗体が内部移行するのに十分な時間）を伴い、抗原に特異的に結合する能力を有する、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の断片、またはそのいずれかの誘導体を指すように意図される。抗原と相互作用する結合領域（または本明細書において使用され得る結合ドメイン、両方は同じ意味を有する）は、免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の両方の可変領域を含む。抗体（Ab）の定常領域は、免疫系の種々の細胞（エフェクター細胞など）、および、補体活性化の古典経路における第1の構成要素であるC1qなどの補体系の構成要素を含む、宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介し得る。上記で示されるように、本明細書において使用される抗体という用語は、別の方法で述べられるか、または文脈によって明確に否定されない限り、抗原に対して特異的に相互作用する、例えば結合する能力を保持する抗体の断片を含む。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって行われ得ることが示されている。「抗体」という用語内に包含される結合断片の例は、（i）VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなる一価断片、またはWO 2007/059782に記載されている一価抗体である、Fab'またはFab断片；（ii）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結されている2つのFab断片を含む二価断片である、F(ab')2断片；（iii）VHおよびCH1ドメインから本質的になるFd断片；（iv）抗体の単一アームのVLおよびVHドメインから本質的になるFv断片；（v）VHドメインから本質的になり、ドメイン抗体（Holt et al., 2003）とも呼ばれる、dAb断片（Ward et al., 1989）；（vi）ラクダ科動物またはナノボディ（Revets et al., 2005）、ならびに（vii）単離された相補性決定領域（CDR）を含む。さらに、Fv断片の2つのドメインであるVLおよびVHは、別々の遺伝子によりコードされているが、組み換え法を用いて、VLおよびVH領域が対形成して一価分子を形成している単一のタンパク質鎖（一本鎖抗体または一本鎖Fv（scFv）として公知である、例としてBird et al., 1988およびHuston et al., 1988を参照されたい）として作製されることを可能にする合成リンカーにより接続されていてもよい。そのような一本鎖抗体は、別の方法で言及されるか、または文脈によって明確に示されない限り、抗体という用語内に包含される。そのような断片は、概して、抗体の意味の内に含まれるが、それらは、集合的におよび各々独立的に、本発明の独特の特徴であり、異なる生物学的特性および有用性を呈する。本発明の文脈におけるこれらのおよび他の有用な抗体断片は、本明細書においてさらに議論される。抗体という用語は、別の方法で特定されない限り、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb）、抗体様ポリペプチド、例えばキメラ抗体およびヒト化抗体、ならびに、酵素的切断、ペプチド合成、および組み換え技術などの任意の公知の技術によって提供され、かつ毒素にコンジュゲートされる能力を保持する、抗原に特異的に結合する能力を保持する「抗体断片」または「その断片」（抗原結合断片）も含むこともまた、理解されるべきである。生成される抗体は、任意のアイソタイプを所有することができる。
本明細書において使用される「免疫グロブリン重鎖」または「免疫グロブリンの重鎖」という用語は、免疫グロブリンの重鎖のうちの1つを指すように意図される。重鎖は、典型的に、重鎖可変領域（本明細書においてVHと省略される）、および免疫グロブリンのアイソタイプを定義する重鎖定常領域（本明細書においてCHと省略される）から構成される。重鎖定常領域は、典型的に、CH1、CH2、およびCH3の3つのドメインから構成される。本明細書において使用される「免疫グロブリン」という用語は、1対の低分子量の軽（L）鎖および1対の重（H）鎖の、2対のポリペプチド鎖からなり、すべての4つがジスルフィド結合によって潜在的に相互接続されている、構造的に関連する糖タンパク質のクラスを指すように意図される。免疫グロブリンの構造は、十分に特徴決定されている（例として、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)を参照されたい）。免疫グロブリンの構造内で、2つの重鎖は、いわゆる「ヒンジ領域」においてジスルフィド結合を介して相互接続されている。重鎖と同等に、各軽鎖は、典型的に、いくつかの領域；軽鎖可変領域（本明細書においてVLと省略される）、および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、典型的に、1つのドメインCLから構成される。さらに、VHおよびVL領域は、フレームワーク領域（FR）と呼ばれる、より保存されている領域で分散される、相補性決定領域（CDR）とも呼ばれる、超可変性の領域（または、構造的に定義されたループの配列および／もしくは形態において超可変的であり得る超可変領域）にさらに細分され得る。各VHおよびVLは、典型的に、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置される、3つのCDRおよび4つのFRから構成される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。CDR配列は、IMGTにしたがって定義される（Lefranc MP. et al. (1999)およびBrochet et al. (2008)を参照されたい）。
本明細書において使用される「抗原結合領域」または「結合領域」という用語は、抗原に結合することができる抗体の領域を指す。抗原は、例えば、細胞、細菌、またはビリオン上に存在する、ポリペプチドなどの任意の分子であることができる。「抗原」および「標的」という用語は、文脈によって明確に否定されない限り、本発明の文脈において互換的に使用され得る。
本明細書において使用される「結合」という用語は、例として、BIAcore 3000機器において抗原をリガンドとして、およびタンパク質を分析物として用いた表面プラズモン共鳴（SPR）により決定した場合に、典型的に、約10-6 M未満、例えば10-7 M未満、例えば約10-8 M未満、例えば約10-9 M未満、約10-10 M未満、または約10-11 Mもしくはさらにそれより低いKDに対応する結合親和性での、あらかじめ決定された抗原または標的に対する抗体の結合を指し、あらかじめ決定された抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、BSA、カゼイン）に対する結合のその親和性よりも少なくとも10倍低い、例えば少なくとも100倍低い、例として少なくとも1,000倍低い、例えば少なくとも10,000倍低い、例として少なくとも100,000倍低いKDに対応する親和性で、あらかじめ決定された抗原に結合する。親和性がより低い量は、タンパク質のKDに依存するため、タンパク質のKDが非常に低い（すなわち、タンパク質が高度に特異的である）場合、抗原に対する親和性が非特異的抗原に対する親和性より低い量は、少なくとも10,000倍であり得る。本明細書において使用される「KD」（M）という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の解離平衡定数を指し、kdをkaで割ることによって得られる。
本明細書において使用される「kd」（秒-1）という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度定数を指す。前記値は、kオフ値またはオフ速度とも呼ばれる。
本明細書において使用される「ka」（M-1×秒-1）という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の会合速度定数を指す。前記値は、kオン値またはオン速度とも呼ばれる。
本明細書において使用される「KA」（M-1）という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の会合平衡定数を指し、kaをkdで割ることによって得られる。
本明細書において使用される「AXL」という用語は、哺乳動物TAM受容体チロシンキナーゼ（RTK）のサブファミリーの一部である104～140 kDaの分子量を有する894アミノ酸タンパク質であり、UFOまたはJTK11とも呼ばれる、AXLという名称のタンパク質を指す。分子量は、タンパク質のグリコシル化における可能性のある差のために可変である。AXLタンパク質は、タンパク質のN末端上の2つの細胞外免疫グロブリン様（Ig様）ドメイン、2つの膜近位の細胞外フィブロネクチンIII型（FNIII）ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内キナーゼドメインからなる。AXLは、そのリガンドGas6の結合時に、AXL細胞外ドメイン間のリガンド非依存性同種親和性相互作用により、活性酸素種の存在下での自己リン酸化により（Korshunov et al., 2012）、またはEGFRを通したトランス活性化により（Meyer et al., 2013）活性化され、いくつかの腫瘍タイプにおいて異常に発現している。ヒトにおいて、AXLタンパク質は、SEQ ID N0:130に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされている（ヒトAXLタンパク質：Swissprot P30530；カニクイザルAXLタンパク質：GenbankアクセッションHB387229.1）。
本明細書において使用される「リガンド非依存性同種親和性相互作用」という用語は、リガンドの非存在下で起こる（近隣細胞上に発現した）2つのAXL分子間の会合を指す。
本明細書において使用される「AXLに結合する抗体」という用語は、AXLの細胞外部分上のエピトープに結合する任意の抗体を指す。
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸、糖側鎖、またはそれらの組み合わせなどの分子の表面グルーピングからなり、通常、特異的な3次元構造特性、および特異的な電荷特性を有する。コンフォメーションエピトープおよび非コンフォメーションエピトープは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合が失われるが、後者に対する結合は失われないという点で区別される。エピトープは、結合に直接関与しているアミノ酸残基、および、特異的な抗原結合ペプチドによって有効に遮断されるかまたは覆われるアミノ酸残基（換言すると、アミノ酸残基が特異的な抗原結合ペプチドの占有面積内である）などの、結合に直接関与していない他のアミノ酸残基を含み得る。
本明細書において使用される「リガンド」という用語は、受容体などの別のタンパク質に特異的にかつ可逆的に結合して、より大きな複合体を形成する、ホルモン、ペプチド、イオン、薬物、またはタンパク質などの物質を指す。受容体に対するリガンド結合は、その化学的コンフォメーションを変更し得、その機能状態を決定する。例として、リガンドは、アゴニストまたはアンタゴニストとして機能し得る。
本明細書において使用される「Growth Arrest-Specific 6」または「Gas6」という用語は、AXLを含むTAMファミリーの受容体に対するリガンドとして機能する、75～80 kDaの分子量を有する721アミノ酸タンパク質を指す。Gas6は、負に荷電したリン脂質膜との特異的相互作用を担う、複数のγ-カルボキシグルタミン酸残基（Gla）を含有するN末端領域から構成される。Glaドメインは、Gas6のAXLに対する結合には必要ではないが、AXLの活性化に必要とされる。Gas6はまた、「AXLに対するリガンド」とも呼ばれ得る。
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」、「モノクローナルAb」、「モノクローナル抗体組成物」、「mAb」などの用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を提示する。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する、単一の結合特異性を提示する抗体を指す。ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合させた、トランスジェニック非ヒト動物または染色体導入（transchromosomal）非ヒト動物、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスから取得されたB細胞を含むハイブリドーマによって、産生され得る。
本発明の文脈において、用語「ADC」は、抗体薬物コンジュゲートを指し、本発明においては、治療部分（例えば、本出願に記載される細胞傷害性部分）に連結されている抗AXL抗体を指す。それは、例えば、システインにリンカーで連結されるか、または他のアミノ酸に他のコンジュゲーション法で連結され得る。該部分は、例えば、薬物または毒素などであり得る。
本明細書で使用する「治療部分」とは、対象に投与された場合、特に本明細書に記載のADCとして送達された場合に、治療効果または予防効果を発揮する化合物を意味する。「細胞傷害性」または「細胞増殖抑制性」部分は、細胞に有害な(例えば、細胞を死滅させる)化合物である。ADCで使用するための、いくつかの細胞傷害性または細胞増殖抑制性部分は疎水性であり、これは、それらの水中での溶解度が全くないかまたはわずかしかなく、例えば、1g/L以下(ごくわずかに可溶性)、例えば0.8g/L以下、0.6g/L以下、0.4g/L以下、0.3g/L以下、0.2g/L以下、0.1g/L以下(事実上不溶性)であることを意味する。例示的な疎水性の細胞傷害性または細胞増殖抑制性部分としては、限定するものではないが、ある種のミクロチューブリン阻害剤、例えばアウリスタチンとその誘導体、例えばMMAFおよびMMAE、ならびにメイタンシンとその誘導体、例えばDM1などが挙げられる。
一態様において、該抗体はAXLに対して0.3×10-9～63×10-9Mの範囲の結合親和性(KD)を有し、その結合親和性は可溶性AXL細胞外ドメインを用いてバイオレイヤー干渉法(Bio-layer Interferometry)により測定される。
結合親和性は、実施例2に記載するように測定することができる。したがって、一態様では、該抗体は抗原に対して0.3×10-9～63×10-9Mの結合親和性を有し、その結合親和性は以下の工程を含む方法により測定される：
i) 抗ヒトFc Captureバイオセンサに抗AXL抗体をロードする工程；および
ii) 可溶性組み換えAXL細胞外ドメインの会合および解離を様々な濃度でバイオレイヤー干渉法により測定する工程。
本明細書で使用する用語「可溶性組み換えAXL細胞外ドメイン」とは、組み換えにより発現された完全長タンパク質(SEQ ID NO:130；実施例1参照)のアミノ酸1-447に対応するAXL細胞外ドメインを指す。膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインが存在しないため、組み換えAXL細胞外ドメインは、例えば細胞表面に、結合されず、溶液中にとどまる。タンパク質を組み換えにより発現させる方法は周知であり、Sambrook (1989)を参照されたい。したがって、そのような組み換えAXL細胞外ドメインを提供することは、当業者の知識の範囲内である。
一態様において、該抗体はAXLに対して6.9×10-5 s-1～9.7×10-3 s-1の解離速度を有し、その解離速度は可溶性組み換えAXL細胞外ドメインを用いるバイオレイヤー干渉法により測定される。
結合親和性は、上記のように(および実施例2に記載のように)測定することができる。したがって、一態様では、該抗体はAXLに対して6.9×10-5 s-1～9.7×10-3 s-1の解離速度を有し、解離速度は以下の工程を含む方法により測定される：
i) 抗ヒトFc Captureバイオセンサに抗AXL抗体をロードする工程；および
ii) 組み換えAXL細胞外ドメインの会合および解離を様々な濃度でバイオレイヤー干渉法により測定する工程。
本明細書で使用する用語「解離速度」は、抗原に結合した抗原特異的抗体がその抗原から解離する速度を指し、s-1として表される。したがって、AXLに結合している抗体の文脈において、用語「解離速度」は、AXLに結合している抗体がAXLの組み換え細胞外ドメインから解離することを指し、s-1として表される。
一局面において、本発明で使用するためのADCは、AXLへのGas6結合に競合または干渉することなく、AXLの細胞外ドメインに結合する抗体部分を含む。特定の態様では、該抗体は、AXLへのGas6結合に競合または干渉することなく、細胞外ドメインIg1ドメインに結合する。一態様では、該抗体は細胞外ドメインIg1に結合し、該抗体が示すAXLへの最大Gas6結合の減少は20％以下である。一態様では、該抗体が示すAXLへの最大Gas6結合の減少は15％以下である。一態様では、該抗体が示すAXLへの最大Gas6結合の減少は10％以下である。一態様では、該抗体が示すAXLへの最大Gas6結合の減少は5％以下である。一態様では、該抗体が示すAXLへの最大Gas6結合の減少は4％以下である。一態様では、該抗体が示すAXLへの最大Gas6結合の減少は2％以下である。一態様では、該抗体が示すAXLへの最大Gas6結合の減少は1％以下である。一態様では、該抗体は、AXLへのGas6結合に競合または干渉することなく、AXL細胞外ドメイン中のIg2ドメインに結合する。一態様では、該抗体はAXL細胞外ドメイン中のIg2ドメインに結合し、該抗体が示すAXLへの最大Gas6結合の減少は、20％以下、例えば、15％以下、10％以下、5％以下、4％以下、2％以下、1％以下である。この態様がGas6結合に競合するまたは該結合を低減させる能力は、実施例2または実施例12に開示されるように測定され得る。一態様では、該抗体は、AXLへの最大Gas6結合に競合または干渉することなく、AXL細胞外ドメイン中のIg2ドメインに結合する。
一態様において、Gas6の存在下での最大抗体結合は、競合アッセイにより測定した場合に、Gas6の非存在下での結合の少なくとも90％、例えば少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも99％、例えば100％であり、この場合、ヒトAXLに結合する抗体とGas6との間の競合は、Gas6と共におよびGas6なしでプレインキュベートされたA431細胞で測定される。
AXLに対する抗AXLとリガンドGas6との間の競合は、「Gas6結合による抗AXL結合の干渉」の見出しの下で実施例2に記載されるように測定され得る。したがって、一態様では、該抗体はAXL結合についてリガンドGas6と競合せず、この場合、結合についての競合は、以下の工程を含むアッセイにより測定される：
i) AXL発現細胞をGas6と共にインキュベートする工程；
ii) 試験すべき抗AXL抗体を添加する工程；
iii) 抗AXL抗体を検出する蛍光標識二次試薬を添加する工程；および
iv) FACSにより該細胞を分析する工程。
別の態様では、該抗体は結合についてリガンドGas6と競合せず、この場合、結合についての競合は、以下の工程を含むアッセイにより測定される：
i) AXL発現細胞を抗AXL抗体と共にインキュベートする工程；
ii) Gas6を添加する工程；
iii) Gas6を検出する蛍光標識二次試薬を添加する工程；および
iv) FACSにより該細胞を分析する工程。
一態様において、該抗体は、AXL発現細胞が該抗体と接触したときに、該細胞におけるAXL関連シグナル伝達をモジュレートする。
一態様において、該抗体は、AXL発現細胞が該抗体と接触したときに、該細胞におけるAXL関連シグナル伝達をモジュレートしない。
AXL関連シグナル伝達のモジュレーションの非限定的な例には、PI3K/AKT、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)、STATまたはNF-κBカスケードなどの細胞内シグナル伝達経路のモジュレーションが含まれる。
一態様において、抗AXL抗体またはAXL-ADCは、以下からなる群より選択される可変重鎖(VH)領域と可変軽鎖(VL)領域を含む抗体とAXLへの結合について競合する：
(a) SEQ ID No: 1を含むVH領域およびSEQ ID No: 2を含むVL領域[107]；
(b) SEQ ID No: 5を含むVH領域およびSEQ ID No: 6を含むVL領域[148]；
(c) SEQ ID No:34を含むVH領域およびSEQ ID No:35を含むVL領域[733]；
(d) SEQ ID No: 7を含むVH領域およびSEQ ID No: 9を含むVL領域[154]；
(e) SEQ ID No:10を含むVH領域およびSEQ ID No:11を含むVL領域[171]；
(f) SEQ ID No:16を含むVH領域およびSEQ ID No:18を含むVL領域[183]；
(g) SEQ ID No:25を含むVH領域およびSEQ ID No:26を含むVL領域[613]；
(h) SEQ ID No:31を含むVH領域およびSEQ ID No:33を含むVL領域[726]；
(i) SEQ ID No: 3を含むVH領域およびSEQ ID No: 4を含むVL領域[140]；
(j) SEQ ID No: 8を含むVH領域およびSEQ ID No: 9を含むVL領域[154-M103L]；
(k) SEQ ID No:12を含むVH領域およびSEQ ID No:13を含むVL領域[172]；
(l) SEQ ID No:14を含むVH領域およびSEQ ID No:15を含むVL領域[181]；
(m) SEQ ID No:17を含むVH領域およびSEQ ID No:18を含むVL領域[183-N52Q]；
(n) SEQ ID No:19を含むVH領域およびSEQ ID No:20を含むVL領域[187]；
(o) SEQ ID No:21を含むVH領域およびSEQ ID No:22を含むVL領域[608-01]；
(p) SEQ ID No:23を含むVH領域およびSEQ ID No:24を含むVL領域[610-01]；
(q) SEQ ID No:27を含むVH領域およびSEQ ID No:28を含むVL領域[613-08]；
(r) SEQ ID No:29を含むVH領域およびSEQ ID No:30を含むVL領域[620-06]；ならびに
(s) SEQ ID No:32を含むVH領域およびSEQ ID No:33を含むVL領域[726-M101L]。
抗体およびGas6リガンドの文脈において、または2つ以上の抗体の文脈において本明細書で使用する場合、用語「と競合する」または「と交差競合する」は、抗体が抗原への結合においてリガンドまたは別の抗体(例えば、「参照」抗体)とそれぞれ競合することを示す。実施例2は、抗AXL抗体とAXLリガンドGas6との競合を試験する方法の例を記載している。2つの抗体間の交差競合のための好ましい参照抗体は、表4に示されるような、本明細書中で107、148、733、154、171、183、613、726、140、154-M103L、172、181、183-N52Q、187、608-01、610-01、613-08、620-06または726-M101Lと呼ばれる抗体のVH領域とVL領域を含む結合領域を含むものである。特に好ましい参照抗体は、107と呼ばれる抗体である。
一態様において、抗AXL抗体は、そのVHおよびVL配列、例えばSEQ ID No:1を含むVH領域とSEQ ID No:2を含むVL領域[107]、によって定義されるような、上記態様に従う抗体のいずれか1つ以上と同じAXL上のエピトープに結合する。
抗体が結合するエピトープの決定方法は、当技術分野で周知である。したがって、当業者は、そのようなエピトープの決定の仕方を知っているであろう。しかしながら、抗体が本明細書に記載されるエピトープに結合するか否かを決定する1つの例は、例えば抗原への抗体結合に関与するアミノ酸を同定するために、AXL細胞外ドメインの細胞外ドメイン中に点変異を導入することによるものである。点変異が全体的な3D構造に及ぼす影響は最小限であると予想されるので、AXL細胞外ドメインに点変異(複数可)を導入して、点変異導入AXL細胞外ドメインへの抗体結合を試験することは、当業者の知識の範囲内である。
代替方法が実施例3で使用された。この方法では、ヒトIg1、Ig2、FN1またはFN2ドメインがマウス類似体によって置き換えられたヒト-マウスキメラAXL変異体のパネルを作製し、抗AXL抗体がどの変異体に結合したかを判定することによって、AXLドメイン特異性がマッピングされた。この方法は、これらのヒトAXL特異的抗体がヒトAXLを認識するが、マウスAXLを認識しないという原理に基づいていた。したがって、別の特定の態様では、該抗体は、AXLのIg1ドメイン、AXLのIg2ドメイン、AXLのFN1ドメイン、またはAXLのFN2ドメインに結合する。
抗体結合に関与するAXL細胞外ドメインのアミノ酸を同定する、より高分解能のエピトープマッピング法もまた、この実施例で使用された。具体的には、この方法では、細胞外ドメイン中のヒトAXL配列(SEQ ID NO:130)と様々なレベルの相同性を有する種に由来するAXL配列の組み換えにより作製されたAXL配列バリアントのライブラリーへの抗AXL抗体の結合が分析された。この方法は、これらのヒトAXL特異的抗体がヒトAXLを認識するが、この実施例で使用された他の種に由来するAXLを認識しないという原理に基づいていた。
したがって、一態様では、該抗体はAXLのIg1ドメイン内のエピトープに結合し、その抗体結合は、ヒトAXLの位置L121～Q129に対応するアミノ酸の1つ以上もしくは全部、またはT112～Q124の1つ以上もしくは全部に依存する；ここで、アミノ酸残基のナンバリングは、ヒトAXL(SEQ ID NO:130)中のそれらのそれぞれの位置を指す。一態様では、該抗体はAXLのIg1ドメイン内のエピトープに結合し、その抗体結合はヒトAXLの位置L121～Q129またはT112～Q124に対応するアミノ酸に依存する。好ましい態様では、抗体結合は、本明細書で107と呼ばれる抗体の結合に関与するアミノ酸に対応する、位置L121、G122、H123、Q124、T125、F126、V127、S128およびQ129の1つ以上または全部のアミノ酸に依存する。一態様では、抗体結合は、位置T112、G113、Q114、Y115、Q116、C117、L118、V119、F120、L121、G122、H123およびQ124の1つ以上または全部のアミノ酸に依存する。
別の態様において、該抗体はAXLのIg2ドメイン内のエピトープに結合し、抗体結合は、ヒトAXLの位置D170もしくはD179の組み合わせに対応するアミノ酸の1つ以上もしくは全部、または位置T182～R190のアミノ酸の1つ以上もしくは全部に依存する。一態様では、抗体結合は、位置T182、A183、P183、G184、H185、G186、P187、Q189およびR190のアミノ酸に依存する。
別の態様において、該抗体はヒトAXLのFN1ドメインに結合し、抗体結合は、ヒトAXLの位置Q272～A287およびG297～P301に対応するアミノ酸の1つ以上または全部に依存する。一態様では、抗体結合は、ヒトAXLの位置Q272～A287およびG297～P301に対応するアミノ酸に依存する。
別の態様において、該抗体はヒトAXLのFN2ドメインに結合し、抗体結合は、ヒトAXLの位置A359、R386、およびQ436～K439に対応するアミノ酸の1つ以上または全部に依存する。
さらに別の態様において、該抗体はAXLのIg1ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープは、ヒトAXLの位置L121～Q129に対応するアミノ酸の1つ以上もしくは全部、またはT112～Q124の1つ以上もしくは全部を含むかまたは必要とする；ここで、アミノ酸残基のナンバリングは、ヒトAXL(SEQ ID NO:130)中のそれらのそれぞれの位置を指す。一態様では、該抗体はAXLのIg1ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープは、ヒトAXLの位置L121～Q129またはT112～Q124に対応するアミノ酸を含むかまたは必要とする。好ましい態様では、該エピトープは、本明細書で107と呼ばれる抗体の結合に関与するアミノ酸に対応する、位置L121、G122、H123、Q124、T125、F126、V127、S128およびQ129の1つ以上または全部のアミノ酸を含む。一態様では、該エピトープは、位置T112、G113、Q114、Y115、Q116、C117、L118、V119、F120、L121、G122、H123およびQ124の1つ以上または全部のアミノ酸を含む。
別の態様において、該抗体はAXLのIg2ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープは、ヒトAXLの位置D170、もしくはD179の組み合わせに対応するアミノ酸の1つ以上もしくは全部、または位置T182～R190のアミノ酸の1つ以上もしくは全部を含むかまたは必要とする。一態様では、該エピトープは、位置T182、A183、P183、G184、H185、G186、P187、Q189およびR190のアミノ酸を含むかまたは必要とする。
別の態様において、該抗体はヒトAXLのFN1ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープは、ヒトAXLの位置Q272～A287およびG297～P301に対応するアミノ酸の1つ以上または全部を含むかまたは必要とする。一態様では、該エピトープは、ヒトAXLの位置Q272～A287およびG297～P301に対応するアミノ酸を含むかまたは必要とする。
別の態様において、該抗体はヒトAXLのFN2ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープは、ヒトAXLの位置A359、R386、およびQ436～K439に対応するアミノ酸の1つ以上または全部を含むかまたは必要とする。
一態様において、該抗体はヒトAXLのFN1様ドメイン内のエピトープに結合する。
1つの態様において、抗体は、AXL上のエピトープに結合し、該エピトープは、以下により定義される抗体のいずれか1つによって認識される：
（a）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [107]；
（b）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [148]；
（c）それぞれ、SEQ ID NO:114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [733]；
（d）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および53のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [154]；
（e）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および54のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [154-M103L]；
（f）それぞれ、SEQ ID NO:57、58、および59のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [171]；
（g）それぞれ、SEQ ID NO:62、63、および64のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:65、GAS、およびSEQ ID NO:66のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [172]；
（h）それぞれ、SEQ ID NO:67、68、および69のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:70、GAS、およびSEQ ID NO:71のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [181]；
（i）それぞれ、SEQ ID NO:72、73、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [183]；
（j）それぞれ、SEQ ID NO:72、74、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [183-N52Q]；
（k）それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:81、AAS、およびSEQ ID NO:82のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [187]；
（l）それぞれ、SEQ ID NO:83、84、および85のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:86、GAS、およびSEQ ID NO:87のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [608-01]；
（m）それぞれ、SEQ ID NO:88、89、および90のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:91、GAS、およびSEQ ID NO:92のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [610-01]；
（n）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613]；
（o）それぞれ、SEQ ID NO:98、99、および100のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:10、DAS、およびSEQ ID NO:102のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613-08]；
（p）それぞれ、SEQ ID NO:103、104、および105のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:106、GAS、およびSEQ ID NO:107のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [620-06]；
（q）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および110のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726]；
（r）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および111のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726-M101L]；
（s）それぞれ、SEQ ID NO:41、42、および43のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:44、AAS、およびSEQ ID NO:45のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [140]；
（t）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:128、XAS（配列中、XはDまたはGである）、およびSEQ ID NO:129のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613 / 613-08]；
（u）それぞれ、SEQ ID NO:46、119、および120のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [148 / 140]；
（v）それぞれ、SEQ ID NO:123、124、および125のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [171 / 172 / 181]；ならびに
（w）それぞれ、SEQ ID NO:121、109、および122のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726 / 187]；ならびに
（x）それぞれ、SEQ ID NO:93、126、および127のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06]。
特定の態様において、抗体はAXL上のエピトープに結合し、該エピトープは、本明細書において107、061、137、148、154-M103L、171、183-N52Q、511、613、726-M102Lおよび733と称される抗体から選択される抗体のVHおよびVL配列を含む結合領域を含むことにより定義される抗体のいずれか1つによって認識される。実施例16において示すように、これらの抗AXL抗体は内部移行し、したがってADCアプローチに適している。
1つの態様において、抗体は、以下からなる群より選択されるVH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む：
（a）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [107]；
（b）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [148]；
（c）それぞれ、SEQ ID NO:114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [733]；
（d）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および53のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [154]；
（e）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および54のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [154-M103L]；
（f）それぞれ、SEQ ID NO:57、58、および59のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [171]；
（g）それぞれ、SEQ ID NO:62、63、および64のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:65、GAS、およびSEQ ID NO:66のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [172]；
（h）それぞれ、SEQ ID NO:67、68、および69のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:70、GAS、およびSEQ ID NO:71のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [181]；
（i）それぞれ、SEQ ID NO:72、73、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [183]；
（j）それぞれ、SEQ ID NO:72、74、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [183-N52Q]；
（k）それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:81、AAS、およびSEQ ID NO:82のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [187]；
（l）それぞれ、SEQ ID NO:83、84、および85のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:86、GAS、およびSEQ ID NO:87のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [608-01]；
（m）それぞれ、SEQ ID NO:88、89、および90のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:91、GAS、およびSEQ ID NO:92のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [610-01]；
（n）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613]；
（o）それぞれ、SEQ ID NO:98、99、および100のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:101、DAS、およびSEQ ID NO:102のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613-08]；
（p）それぞれ、SEQ ID NO:103、104、および105のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:106、GAS、およびSEQ ID NO:107のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [620-06]；
（q）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および110のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726]；
（r）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および111のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726-M101L]；
（s）それぞれ、SEQ ID NO:41、42、および43のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:44、AAS、およびSEQ ID NO:45のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [140]；
（t）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:128、XAS（配列中、XはDまたはGである）、およびSEQ ID NO:129のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613 / 613-08]；
（u）それぞれ、SEQ ID NO:46、119、および120のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [148 / 140]；
（v）それぞれ、SEQ ID NO:123、124、および125のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [171 / 172 / 181]；ならびに
（w）それぞれ、SEQ ID NO:121、109、および122のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726 / 187]；ならびに
（x）それぞれ、SEQ ID NO:93、126、および127のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06]。
1つの態様において、抗体は、以下からなる群より選択されるVH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む：
（a）SEQ ID NO:1を含むVH領域、およびSEQ ID NO:2を含むVL領域 [107]；
（b）SEQ ID NO:5を含むVH領域、およびSEQ ID NO:6を含むVL領域 [148]；
（c）SEQ ID NO:34を含むVH領域、およびSEQ ID NO:35を含むVL領域 [733]；
（d）SEQ ID NO:7を含むVH領域、およびSEQ ID NO:9を含むVL領域 [154];
（e）SEQ ID NO:10を含むVH領域、およびSEQ ID NO:11を含むVL領域 [171]；
（f）SEQ ID NO:16を含むVH領域、およびSEQ ID NO:18を含むVL領域 [183]；
（g）SEQ ID NO:25を含むVH領域、およびSEQ ID NO:26を含むVL領域 [613]；
（h）SEQ ID NO:31を含むVH領域、およびSEQ ID NO:33を含むVL領域 [726]；
（i）SEQ ID NO:3を含むVH領域、およびSEQ ID NO:4を含むVL領域 [140]；
（j）SEQ ID NO:8を含むVH領域、およびSEQ ID NO:9を含むVL領域 [154-M103L]；
（k）SEQ ID NO:12を含むVH領域、およびSEQ ID NO:13を含むVL領域 [172]；
（l）SEQ ID NO:14を含むVH領域、およびSEQ ID NO:15を含むVL領域 [181]；
（m）SEQ ID NO:17を含むVH領域、およびSEQ ID NO:18を含むVL領域 [183-N52Q]；
（n）SEQ ID NO:19を含むVH領域、およびSEQ ID NO:20を含むVL領域 [187]；
（o）SEQ ID NO:21を含むVH領域、およびSEQ ID NO:22を含むVL領域 [608-01]；
（p）SEQ ID NO:23を含むVH領域、およびSEQ ID NO:24を含むVL領域 [610-01]；
（q）SEQ ID NO:27を含むVH領域、およびSEQ ID NO:28を含むVL領域 [613-08]；
（r）SEQ ID NO:29を含むVH領域、およびSEQ ID NO:30を含むVL領域 [620-06]；ならびに
（s）SEQ ID NO:32を含むVH領域、およびSEQ ID NO:33を含むVL領域 [726-M101L]。
本発明はまた、上記抗体のVL領域、VH領域または1つ以上のCDRの機能的バリアントを含む抗体を提供する。AXL抗体との関連で使用されるVL、VHまたはCDRの機能的バリアントは、該抗体が親抗体の親和性/結合活性および/または特異性/選択性のかなり大きな割合(少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％またはそれ以上)を保持することを依然として可能にし、場合によっては、このようなAXL抗体は、親抗体よりも高い親和性、選択性および/または特異性を伴っていることがある。
このような機能的バリアントは、典型的には、親抗体に対する顕著な配列同一性を保持する。2つの配列間の同一性パーセントは、2つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、それらの配列によって共有される同一位置の数の関数(すなわち、相同性％＝同一位置の数/位置の総数×100)である。配列の比較および2つの配列間の同一性パーセントの決定は、当技術分野で周知の数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。
2つのアミノ酸配列間の配列同一性は、例えば、EMBOSSパッケージ(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)のNeedleプログラム、好ましくはバージョン5.0.0以降、により実行されるNeedleman-Wunschアルゴリズム(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)を用いて決定することができる。使用されるパラメータは、ギャップオープンペナルティ10、ギャップ伸長ペナルティ0.5、およびEBLOSUM62 (BLOSUM62のEMBOSSバージョン)置換マトリックスである。「最長同一性」(-nobriefオプションを用いて取得)と表示されたNeedleの出力は、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される。
(同一残基×100)/(アラインメントの長さ－アラインメント中のギャップの総数）
バリアントのVH、VLおよび/またはCDR配列は、主に保存的な置換により親抗体配列のものと異なり得る；例えば、バリアントにおける置換の少なくとも約35％、約50％以上、約60％以上、約70％以上、約75％以上、約80％以上、約85％以上、約90％以上(例えば、約65～95％、例えば約92％、93％または94％)は、保存的アミノ酸残基置換である。
バリアントのVH、VLおよび/またはCDR配列は、主に保存的な置換により親抗体配列のものと異なり得る；例えば、バリアントにおける置換の10以下、例えば、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、2以下または1つは、保存的アミノ酸残基置換である。
また、上記の態様の可変重鎖および/または可変軽鎖の3つのCDR配列にわたって5つまでの変異または置換が可能である実施態様も提供される。5つまでの変異または置換は、可変重鎖の3つのCDR配列および可変軽鎖の3つのCDR配列にわたって分布し得る。5つまでの変異または置換は、結合領域の6つのCDR配列にわたって分布していてもよい。変異または置換は、変異または置換がエピトープを変化させないように、好ましくはエピトープに対する結合親和性を30％より大きく改変しないように、例えば20％より大きく改変しないように、例えば10％より大きく改変しないように、保存的な物理的または機能的アミノ酸のものであり得る。保存的な物理的または機能的アミノ酸は、存在する20種の天然アミノ酸、すなわち、Arg、His、Lys、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Cys、Gly、Pro、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、TyrおよびValから選択される。
したがって、一態様において、前記抗体は、以下のVH領域およびVL領域と少なくとも90％、例えば、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも99％同一であるVHおよびVL配列からなる群より選択されるVH領域とVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む：
(a) SEQ ID No: 1を含むVH領域およびSEQ ID No: 2を含むVL領域[107]；
(b) SEQ ID No: 5を含むVH領域およびSEQ ID No: 6を含むVL領域[148]；
(c) SEQ ID No:34を含むVH領域およびSEQ ID No:35を含むVL領域[733]；
(d) SEQ ID No: 7を含むVH領域およびSEQ ID No: 9を含むVL領域[154]；
(e) SEQ ID No:10を含むVH領域およびSEQ ID No:11を含むVL領域[171]；
(f) SEQ ID No:16を含むVH領域およびSEQ ID No:18を含むVL領域[183]；
(g) SEQ ID No:25を含むVH領域およびSEQ ID No:26を含むVL領域[613]；
(h) SEQ ID No:31を含むVH領域およびSEQ ID No:33を含むVL領域[726]；
(i) SEQ ID No: 3を含むVH領域およびSEQ ID No: 4を含むVL領域[140]；
(j) SEQ ID No: 8を含むVH領域およびSEQ ID No: 9を含むVL領域[154-M103L]；
(k) SEQ ID No:12を含むVH領域およびSEQ ID No:13を含むVL領域[172]；
(l) SEQ ID No:14を含むVH領域およびSEQ ID No:15を含むVL領域[181]；
(m) SEQ ID No:17を含むVH領域およびSEQ ID No:18を含むVL領域[183-N52Q]；
(n) SEQ ID No:19を含むVH領域およびSEQ ID No:20を含むVL領域[187]；
(o) SEQ ID No:21を含むVH領域およびSEQ ID No:22を含むVL領域[608-01]；
(p) SEQ ID No:23を含むVH領域およびSEQ ID No:24を含むVL領域[610-01]；
(q) SEQ ID No:27を含むVH領域およびSEQ ID No:28を含むVL領域[613-08]；
(r) SEQ ID No:29を含むVH領域およびSEQ ID No:30を含むVL領域[620-06]；ならびに
(s) SEQ ID No:32を含むVH領域およびSEQ ID No:33を含むVL領域[726-M101L]。
本発明はまた、これらの例の抗体のVL領域、VH領域または1つ以上のCDRの機能的バリアントを含む抗体を提供する。AXL抗体との関連で使用されるVL、VHまたはCDRの機能的バリアントは、該抗体が親抗体の親和性/結合活性および/または特異性/選択性のかなり大きな割合(少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％またはそれ以上)を保持することを依然として可能にし、場合によっては、このようなAXL抗体は、親抗体よりも高い親和性、選択性および/または特異性を伴っていることがある。
このような機能的バリアントは、典型的には、親抗体に対する顕著な配列同一性を保持する。2つの配列間の同一性パーセントは、2つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、それらの配列によって共有される同一位置の数の関数(すなわち、相同性％＝同一位置の数/位置の総数×100)である。配列の比較および2つの配列間の同一性パーセントの決定は、当技術分野で周知の数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。
バリアントのVH、VLおよび/またはCDR配列は、主に保存的な置換により親抗体配列のものと異なり得る；例えば、バリアントにおける置換の少なくとも約35％、約50％以上、約60％以上、約70％以上、約75％以上、約80％以上、約85％以上、約90％以上(例えば、約65～95％、例えば約92％、93％または94％)は、保存的アミノ酸残基置換である。
バリアントのVH、VLおよび/またはCDR配列は、主に保存的な置換により親抗体配列のものと異なり得る；例えば、バリアントにおける置換の10以下、例えば、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、2以下または1つは、保存的アミノ酸残基置換である。
また、上記の態様の可変重鎖および/または可変軽鎖の3つのCDR配列にわたって5つまでの変異または置換が可能である実施態様も提供される。5つまでの変異または置換は、可変重鎖の3つのCDR配列および可変軽鎖の3つのCDR配列にわたって分布し得る。5つまでの変異または置換は、結合領域の6つのCDR配列にわたって分布していてもよい。変異または置換は、変異または置換がエピトープを変化させないように、好ましくはエピトープに対する結合親和性を30％以上、例えば20％以上、例えば10％以上改変しないように、保存的な物理的または機能的アミノ酸のものであり得る。保存的な物理的または機能的アミノ酸は、存在する20種の天然アミノ酸、すなわち、Arg、His、Lys、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Cys、Gly、Pro、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、TyrおよびValから選択される。
一態様において、前記抗体は、以下のVH領域およびVL領域と少なくとも90％、例えば、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも99％同一のVHおよびVL配列からなる群より選択されるVH領域とVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む：
(t) SEQ ID No: 1を含むVH領域およびSEQ ID No: 2を含むVL領域[107]；
(u) SEQ ID No: 5を含むVH領域およびSEQ ID No: 6を含むVL領域[148]；
(v) SEQ ID No:34を含むVH領域およびSEQ ID No:35を含むVL領域[733]；
(w) SEQ ID No: 7を含むVH領域およびSEQ ID No: 9を含むVL領域[154]；
(x) SEQ ID No:10を含むVH領域およびSEQ ID No:11を含むVL領域[171]；
(y) SEQ ID No:16を含むVH領域およびSEQ ID No:18を含むVL領域[183]；
(z) SEQ ID No:25を含むVH領域およびSEQ ID No:26を含むVL領域[613]；
(aa) SEQ ID No:31を含むVH領域およびSEQ ID No:33を含むVL領域[726]；
(bb) SEQ ID No: 3を含むVH領域およびSEQ ID No: 4を含むVL領域[140]；
(cc) SEQ ID No: 8を含むVH領域およびSEQ ID No: 9を含むVL領域[154-M103L]；
(dd) SEQ ID No:12を含むVH領域およびSEQ ID No:13を含むVL領域[172]；
(ee) SEQ ID No:14を含むVH領域およびSEQ ID No:15を含むVL領域[181]；
(ff) SEQ ID No:17を含むVH領域およびSEQ ID No:18を含むVL領域[183-N52Q]；
(gg) SEQ ID No:19を含むVH領域およびSEQ ID No:20を含むVL領域[187]；
(hh) SEQ ID No:21を含むVH領域およびSEQ ID No:22を含むVL領域[608-01]；
(ii) SEQ ID No:23を含むVH領域およびSEQ ID No:24を含むVL領域[610-01]；
(jj) SEQ ID No:27を含むVH領域およびSEQ ID No:28を含むVL領域[613-08]；
(kk) SEQ ID No:29を含むVH領域およびSEQ ID No:30を含むVL領域[620-06]；ならびに
(ll) SEQ ID No:32を含むVH領域およびSEQ ID No:33を含むVL領域[726-M101L]。
一態様において、前記抗体は、当技術分野で公知の抗AXL抗体のVHおよびVL CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む、少なくとも1つの結合領域を含むが、公知の抗AXL抗体としては、例えば、Leconet et al. (2013); Li et al. (2009); Ye et al. (2010); Iida et al. (2014); WO 2012/175691 (INSERM社); WO 2012/175692 (INSERM社); WO 2013/064685 (Pierre Fabre Medicaments社); WO 2013/090776 (INSERM社); WO 2009/063965 (中外製薬); WO 2010/131733; WO 2011/159980 (Genentech社); WO09062690 (U3 Pharma社); WO2010130751 (U3 Pharma社); WO2014093707 (Stanford大学)およびEP2228392A1 (中外)に記載される抗体があり、これらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。特定の一態様では、該抗体はWO2014174111 (Pierre Fabre Medicament社)に記載されるマウス抗体1613F12またはそのキメラもしくはヒト化バリアントであり、マウス抗体1613F12のVHおよびVL配列は、それぞれ、SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:7として提示される。1613F12のヒト化抗体バリアントのVH配列は、SEQ ID NO:29～49およびSEQ ID NO:82としてそこに開示された配列から選択され、1613F12のヒト化抗体バリアントのVL配列は、SEQ ID NO:17～28およびSEQ ID NO:81としてそこに開示された配列から選択される。1つの特定の抗体は、それぞれSEQ ID NO:29および17としてそこに開示されたVHおよびVL配列を含む。マウス、キメラおよびヒト化1613F12のVH CDR1、CDR2およびCDR3配列は、それぞれSEQ ID NO:4、5および6であり、マウスおよびヒト化1613F12のVL CDR1、CDR2およびCDR3配列は、それぞれSEQ ID NO:1、2および3としてそこに開示される。特定の一態様では、該抗体は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるWO2011159980 (Hoffman-La Roche社)、特に段落[0127]～[0229](28～52ページ)に記載される。例えば、該抗体は、抗体YW327.6S2のVHおよびVL超可変領域(HVR)、またはVHおよびVL領域を含むことができ、それらはSEQ ID NO:7、8および9 (それぞれVH HVR1、2および3)、SEQ ID NO:10、11および12 (それぞれVL HVR1、2および3)、ならびにSEQ ID NO:103および104 (それぞれVHおよびVL配列)としてそこに開示される。
一態様において、該抗体は、細胞の表面上のAXL分子の抗体媒介性の架橋またはクラスタリング(例えば、FcR発現細胞に結合するAXL結合抗体のFc領域による)を媒介し、その細胞のアポトーシスを引き起こすことができる。
一態様において、該抗体は、Fc依存性細胞応答、例えば、エフェクター細胞の存在下で該AXL特異的抗体がAXL発現細胞の形質膜に結合した後に、AXL発現細胞に対するADCCまたはADCPを誘導する。この態様では、該抗体の抗体部分は、典型的には完全長であり、例えばIgG1、κアイソタイプのような、ADCCまたはADCP応答をもたらすアイソタイプのものである。
一態様において、該抗体は、正常ヒト血清中に存在する補体タンパク質のような、活性化され得る補体タンパク質の存在下で、AXL発現細胞の形質膜にAXL特異的抗体が結合した後に、AXL発現細胞に対するCDC応答を誘導する。この態様では、該抗体の抗体部分は、典型的には完全長であり、例えばIgG1、κアイソタイプのような、補体系の活性化を誘導することが可能なアイソタイプのものである。
前記抗体および/またはADCは、AXLへの結合時の内在化(internalization)によってさらに特徴付けられる。したがって、一態様では、該抗体および/またはADCは、内在化されて、抗AXL抗体-リンカー-薬物複合体の特異的(すなわち切断可能なリンカー)または非特異的(切断不能なリンカー)タンパク分解切断のためにリソソームに輸送される。
一態様において、該抗体は、例えば、AXLを発現するマクロファージ、樹状細胞またはNK細胞への該抗体の結合により、先天性免疫応答または適応免疫応答のAXL媒介調節を妨げる。
一態様において、ADCの治療部分は、リンカーを介して抗体部分に連結されるが、該リンカーは、例えばpHの変化または還元条件によってADCが内在化されると、薬物の放出を可能にする。適切なリンカー技術は、本明細書に記載されるように、当技術分野で公知である。
一態様において、該抗体は、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるアイソタイプの重鎖を含む。さらなる態様において、該抗体は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるアイソタイプの重鎖を含む。
本明細書において使用される「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる、免疫グロブリンクラス（例として、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE、もしくはIgM、または任意のそのアロタイプ、例えば、IgG1m(za)およびIgG1m(f)）を指す。さらに、各重鎖アイソタイプは、カッパ（κ）またはラムダ（λ）軽鎖のいずれかと組み合わせることができる。
1つの態様において、アイソタイプはIgG1、例えばヒトIgG1、任意でアロタイプIgG1m(f)である。
1つの態様において、抗体は、完全長モノクローナル抗体、任意で完全長ヒトモノクローナルIgG1,κ抗体である。
本明細書において使用される場合の「完全長抗体」という用語は、そのアイソタイプの野生型抗体において普通に見出されるものに対応するすべての重鎖および軽鎖の定量ドメインおよび可変ドメインを含有する抗体（例えば、親抗体またはバリアント抗体）を指す。本発明による完全長抗体は、（i）CDR配列を、完全な重鎖配列および完全な軽鎖配列を含む適しているベクター中にクローニングする工程、および（ii）適している発現系において完全な重鎖および軽鎖配列を発現する工程を含む方法によって産生され得る。CDR配列または完全な可変領域配列のいずれかから出発する場合に、完全長抗体を産生することは、当業者の知識内である。したがって、当業者は、本発明による完全長抗体を生成する方法を承知しているであろう。
1つの態様において、抗体はヒト抗体である。
本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域およびフレームワーク領域、ならびにヒト免疫グロブリン定常ドメインを有する抗体を含むように意図される。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロのランダムもしくは部位特異的な変異誘発によって、またはインビボでの体細胞変異によって導入される変異、挿入、または欠失）を含み得る。しかし、本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の非ヒト種の生殖細胞系列に由来するCDR配列が、ヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むようには意図されない。
本明細書において使用される際、抗体が、例として、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを免疫化することによって、またはヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって、ヒト免疫グロブリン配列を用いた系から取得され、選択されたヒト抗体が、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例として少なくとも96％、例えば少なくとも97％、例として少なくとも98％、または例えば少なくとも99％、アミノ酸配列が同一である場合に、ヒト抗体は、特定の生殖細胞系列配列「に由来する」。典型的に、特定のヒト生殖細胞系列配列に由来するヒト抗体は、重鎖CDR3の外側で、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、20個以下のアミノ酸の差、例えば、10個以下のアミノ酸の差、例えば9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、または5個以下、例として4個以下、3個以下、2個以下、または1個以下のアミノ酸の差を提示することになる。
本発明による抗体は、免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖においてアミノ酸改変を含み得る。特定の態様において、抗体のFc領域中のアミノ酸が改変され得る。
本明細書において使用される「Fc領域」という用語は、抗体のN末端からC末端への方向で、少なくともヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域を含む領域を指す。抗体のFc領域は、免疫系の種々の細胞（エフェクター細胞など）および補体系の構成要素を含む、宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
本明細書において使用される「ヒンジ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域を指す。したがって、例えば、ヒトIgG1抗体のヒンジ領域は、Kabat et al. (1991)に示されているようなEuナンバリングによるアミノ酸216～230に対応する。しかし、ヒンジ領域はまた、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれかであってもよい。
本明細書において使用される「CH1領域」または「CH1ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のCH1領域を指す。したがって、例えば、ヒトIgG1抗体のCH1領域は、Kabat et al. (1991)に示されているようなEuナンバリングによるアミノ酸118～215に対応する。しかし、CH1領域はまた、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれかであってもよい。
本明細書において使用される「CH2領域」または「CH2ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のCH2領域を指す。したがって、例えば、ヒトIgG1抗体のCH2領域は、Kabat et al. (1991)に示されているようなEuナンバリングによるアミノ酸231～340に対応する。しかし、CH2領域はまた、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれかであってもよい。
本明細書において使用される「CH3領域」または「CH3ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のCH3領域を指す。したがって、例えば、ヒトIgG1抗体のCH3領域は、Kabat et al. (1991)に示されているようなEuナンバリングによるアミノ酸341～447に対応する。しかし、CH3領域はまた、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれかであってもよい。
別の態様において、抗体は、エフェクター機能欠損抗体、安定化IgG4抗体、または一価抗体である。
1つの特定の態様において、重鎖は、全ヒンジ領域が欠失しているように改変されている。
1つの態様において、抗体の配列は、N結合型グリコシル化のためのいかなるアクセプター部位も含まないように改変されている。
1つの態様において、抗体は一本鎖抗体である。
さらなる局面において、本発明は、少なくとも、本明細書に記載されるいずれかの局面または態様による抗体の第1の結合領域、および第1の結合領域とは異なる標的またはエピトープに結合する第2の結合領域を含む、多重特異性抗体に関する。本明細書において使用される「多重特異性抗体」という用語は、結合領域が、少なくとも2つ、例えば少なくとも3つの異なる抗原、または、同じ抗原上の少なくとも2つ、例えば少なくとも3つの異なるエピトープに結合する抗体を指す。
1つの態様において、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの局面または態様による抗体の第1の結合領域と、第1の結合領域とは異なる標的またはエピトープに結合する第2の結合領域とを含む二重特異性抗体を含むADCの使用に関する。
本明細書において使用される「二重特異性」という用語は、結合分子の結合領域が、2つの異なる抗原、または同じ抗原上の2つの異なるエピトープに結合する、抗体などの結合分子を指す。
「二重特異性抗体」という用語は、少なくとも2つの異なる、典型的にはオーバーラップしないエピトープに対して特異性を有する抗体を指す。そのようなエピトープは、同じ標的または異なる標的上にあってもよい。エピトープが異なる標的上にある場合、そのような標的は、同じ細胞または異なる細胞、細胞タイプもしくは構造、例えば細胞外組織上にあってもよい。
本明細書において使用される「異なる標的」という用語は、AXLまたはAXL断片以外の別のタンパク質、分子などを指す。
本発明において使用され得る二重特異性抗体分子の例は、（i）異なる抗原結合領域を含む2つのアームを有する単一抗体；（ii）例えば、余分のペプチドリンカーにより直列に連結された2つのscFvを介して、2つの異なるエピトープに対して特異性を有する一本鎖抗体；（iii）各軽鎖および重鎖が、短いペプチド連結を通して直列に2つの可変ドメインを含有する、デュアル可変ドメイン抗体（DVD－Ig（商標））（Wu et al., 2010）；（iv）化学的に連結された二重特異性(Fab')2断片；（v）2つの一本鎖ダイアボディの融合物であり、標的抗原の各々に対して2つの結合部位を有する四価の二重特異性抗体を結果として生じるTandab（登録商標）；（vi）scFvとダイアボディとの組み合わせであり、多価の分子を結果として生じるフレキシボディ（flexibody）；（vii）タンパク質キナーゼAにおける「二量体化およびドッキングドメイン」に基づき、Fabに適用した場合には、異なるFab断片に連結された2つの同一のFab断片からなる三価の二重特異性結合タンパク質を生じることができる、いわゆる「ドックおよびロック」分子（Dock-and-Lock（登録商標））；（viii）例えば、ヒトFabアームの両方の末端に融合された2つのscFvを含む、いわゆるScorpion分子；ならびに（ix）ダイアボディを含む。
1つの態様において、本発明の二重特異性抗体は、ダイアボディ、CrossMabなどのクロスボディ、または、制御されたFabアーム交換を介して取得される二重特異性抗体（例えばWO 2011/131746, Genmab A/Sに記載されている）である。
二重特異性抗体の様々なクラスの例は、（i）ヘテロ二量体化を強いる相補的CH3ドメインを有するIgG様分子；（ii）分子の2つの側面が各々、少なくとも2つの異なる抗体のFab断片またはFab断片の一部を含有する、組み換えIgG様二重標的分子；（iii）完全長IgG抗体が、余分のFab断片またはFab断片の一部に融合されている、IgG融合分子；（iv）一本鎖Fv分子または安定化ダイアボディが、重鎖定常ドメイン、Fc領域、またはその一部に融合されている、Fc融合分子；（v）様々なFab断片が、互いに融合され、重鎖定常ドメイン、Fc領域、またはその一部に融合されている、Fab融合分子；ならびに、（vi）様々な一本鎖Fv分子または様々なダイアボディまたは様々な重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、Nanobodies（登録商標））が、互いに融合されているか、または、重鎖定常ドメイン、Fc領域、またはその一部に融合されている別のタンパク質または担体分子に融合されている、ScFvベースおよびダイアボディベース、および重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、Nanobodies（登録商標））を含むが、これらに限定されない。
相補的CH3ドメイン分子を含むIgG様分子の例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：Triomab(登録商標)(Trion Pharma/Fresenius Biotech社, WO/2002/020039)、Knobs-into-Holes (Genentech社, WO9850431)、CrossMAb (Roche社, WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253)、静電的に適合したFcヘテロ二量体分子(Amgen社, EP1870459およびWO2009089004; 中外, US201000155133; Oncomed社, WO2010129304)、LUZ-Y (Genentech社)、DIG-body、PIG-bodyおよびTIG-body (Pharmabcine社)、Strand Exchange Engineered Domain body (SEEDbody)(EMD Serono社, WO2007110205)、二重特異性IgG1およびIgG2 (Pfizer/Rinat社, W011143545)、Azymetric scaffold (Zymeworks/Merck社, WO2012058768)、mAb-Fv (Xencor社, WO2011028952)、XmAb (Xencor社)、二価二重特異性抗体(Roche社, WO2009/080254)、二重特異性IgG (Eli Lilly社)、DuoBody(登録商標)分子(Genmab A/S社, WO 2011/131746)、DuetMab (Medimmune社, US2014/0348839)、Biclonics (Merus社, WO 2013/157953)、Novlmmune社(κλBody, WO 2012/023053)、FcΔAdp (Regeneron社, WO 2010/151792)、(DT)-Ig (GSK/Domantis社)、Two-in-one抗体またはDual Action Fab (Genentech社, Adimab社)、mAb2 (F-Star社, WO2008003116)、Zybody(商標)(Zyngenia社)、CovX-body (CovX/Pfizer社)、FynomAb (Covagen/Janssen Cilag社)、DutaMab (Dutalys/Roche社)、iMab (Medimmune社)、二重可変ドメイン(DVD)-IgTM (Abbott社, US 7,612,18)、二重ドメイン二重ヘッド抗体(Unilever社; Sanofi Aventis社, WO20100226923)、Ts2Ab (Medimmune/AZ社)、BsAb (Zymogenetics社)、HERCULES (Biogen Idec社, US007951918)、scFv融合体(Genentech/Roche社, Novartis社, Immunomedics社, Changzhou Adam Biotech社, CN 102250246)、TvAb (Roche社, WO2012025525, WO2012025530)、ScFv/Fc融合体、SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion社, Zymogenetics/BMS社)、Interceptor (Emergent社)、Dual Affinity Retargeting Technology (Fc-DARTTM)(MacroGenics社, WO2008/157379, WO2010/080538)、BEAT (Glenmark社)、Di-Diabody (Imclone/Eli Lilly社)、ならびに化学的に架橋されたmAbs (Karmanos Cancer Center)および共有結合で融合されたmAbs (AIMM therapeutics社)。
組み換えIgG様二重標的分子の例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：Dual Targeting (DT)-Ig (GSK/Domantis社)、Two-in-one抗体(Genentech社)、架橋Mab (Karmanos Cancer Center)、mAb2 (F-Star社, WO2008003116)、Zybody(商標)(Zyngenia社)、共通の軽鎖を用いるアプローチ(Crucell/Merus社, US 7,262,028)、κλBody (Novlmmune社)およびCovX-body (CovX/Pfizer社)。
IgG融合分子の例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：二重可変ドメイン(DVD)-Ig(商標)(Abbott社, US 7,612,181)、二重ドメイン二重ヘッド抗体(Unilever社; Sanofi Aventis社, WO20100226923)、IgG様二重特異性(ImClone/Eli Lilly社)、Ts2Ab (MedImmune/AZ社)およびBsAb (Zymogenetics社)、HERCULES (Biogen Idec社, US 7,951,918)、scFv融合体(Novartis社)、scFv融合体(Changzhou Adam Biotech社, CN 102250246)およびTvAb (Roche社, WO2012025525, WO2012025530)。
Fc融合分子の例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：ScFv/Fc融合体(大学研究機関)、SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion社, Zymogenetics/BMS社)、Dual Affinity Retargeting Technology (Fc-DART(商標))(MacroGenics社, WO2008157379およびWO2010080538)および二重(ScFv)2-Fab (National Research Center for Antibody Medicine - 中国)。
Fab融合二重特異性抗体の例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：F(ab)2 (Medarex/AMGEN社)、Dual-ActionまたはBis-Fab (Genentech社)、Dock-and-Lock (登録商標) (DNL) (ImmunoMedics社)、二価二重特異性(Biotecnol社)およびFab-Fv (UCB-Celltech社)。
ScFvベースの抗体、ダイアボディベースの抗体およびドメイン抗体の例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE(登録商標))(Micromet社)、タンデムダイアボディ(Tandab(商標))(Affimed社)、Dual Affinity Retargeting Technology (DART) (MacroGenics社)、一本鎖ダイアボディ(大学)、TCR様抗体(AIT社, ReceptorLogics社)、ヒト血清アルブミンScFv融合体(Merrimack社)およびCOMBODY (Epigen Biotech社)、二重標的ナノボディ(dual targeting nanobodies(登録商標))(Ablynx)、二重標的重鎖のみのドメイン抗体。
本発明によるADCとして使用するための二重特異性抗体は、その抗体の定常領域に改変を導入することによって作製することができる。
特定の一態様において、二重特異性抗体は第1および第2の重鎖を含み、第1および第2の重鎖のそれぞれは少なくともヒンジ領域、CH2およびCH3領域を含み、ここで、第1の重鎖において、ヒトIgG1重鎖中のK409、T366、L368、K370、D399、F405およびY407からなる群より選択される位置に対応するアミノ酸のうちの少なくとも1つが置換されており、かつ第2の重鎖において、ヒトIgG1重鎖中のF405、T366、L368、K370、D399、Y407およびK409からなる群より選択される位置に対応するアミノ酸のうちの少なくとも1つが置換されており、第1および第2の重鎖は同じ位置で置換されない。
一態様では、第1の重鎖において、ヒトIgG1重鎖のK409に対応する位置のアミノ酸はK、LまたはMではなく、かつ任意でヒトIgG1重鎖のF405に対応する位置のアミノ酸はFであり、第2の重鎖において、ヒトIgG1重鎖のF405に対応する位置のアミノ酸はFではなく、かつヒトIgG1重鎖のK409に対応する位置のアミノ酸はKである。
一態様では、第1の重鎖において、ヒトIgG1重鎖のF405に対応する位置のアミノ酸はF、RまたはGではなく、第2の重鎖において、ヒトIgG1重鎖のT366、L368、K370、D399、Y407およびK409からなる群より選択される位置に対応するアミノ酸は置換されている。
一態様では、ヒトIgG1重鎖のK409に対応する位置のアミノ酸は、第1の重鎖においてK、LまたはM以外であり、第2の重鎖において、ヒトIgG1重鎖のF405に対応する位置のアミノ酸はFではなく、かつ任意でヒトIgG1重鎖のK409に対応する位置のアミノ酸はKである。
一態様では、ヒトIgG1重鎖のF405に対応する位置のアミノ酸は、第1の重鎖においてLであり、ヒトIgG1重鎖のK409に対応する位置のアミノ酸は、第2の重鎖においてRであり、またはその逆である。
したがって、一態様では、ヒトIgG1重鎖のK409に対応する位置のアミノ酸は、第1の重鎖においてRであり、かつヒトIgG1重鎖のF405に対応する位置のアミノ酸は、第2の重鎖においてLである。
別の方法で述べるかまたは文脈によって否定されない限り、定常領域配列のアミノ酸は、本明細書においてEuインデックスのナンバリング（Kabat, 1991に記載されている）にしたがって、ナンバリングされている。「Euインデックスのナンバリング」および「Kabatに示されているEuナンバリング」という用語は、互換的に使用され、同じ意味および目的を有し得る。したがって、別の配列におけるアミノ酸またはセグメントに「対応する」1つの配列におけるアミノ酸またはセグメントとは、ALIGN、ClustalW、または同様のものなどの標準的な配列アラインメントプログラムを用いて、典型的にはデフォルトの設定で他のアミノ酸またはセグメントと整列し、ヒトIgG1重鎖に対して少なくとも50％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％の同一性を有するものである。配列または配列中のセグメントを整列させ、それにより、本発明によるアミノ酸位置に対応する配列中の位置を決定する方法は、当技術分野において周知である。
本明細書において使用される「位置に対応するアミノ酸」という用語は、ヒトIgG1重鎖におけるアミノ酸位置の数を指す。
「アミノ酸」および「アミノ酸残基」という用語は、本明細書において互換的に使用され得、限定するように理解されるべきではない。
本発明の文脈において、アミノ酸は、保存的アミノ酸または非保存的アミノ酸によって定義され得、そのため、それに応じて分類され得る。アミノ酸残基はまた、代替の物理的および機能的特性によって定義されるクラスに分けられ得る。したがって、アミノ酸のクラスは、以下のリストのうちの一方または両方において反映され得る。
保存的クラスのアミノ酸残基
Figure 2024038480000005
アミノ酸残基の代替の物理的および機能的分類
Figure 2024038480000006
本発明の文脈において、抗体における置換は、以下のように示される：
元のアミノ酸-位置-置換されたアミノ酸。
アミノ酸の十分に認識されている命名法に言及すると、3文字コードまたは1文字コードが使用され、任意のアミノ酸残基を示すコード「Xaa」または「X」を含む。したがって、XaaまたはXは、典型的に、20種の天然に存在するアミノ酸の任意を表し得る。本明細書において使用される「天然に存在する」という用語は、以下のアミノ酸残基；グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、およびシステインのいずれか1つを指す。それに応じて、「K409R」または「Lys409Arg」という表示法は、抗体が、アミノ酸位置409にリジンのアルギニンでの置換を含むことを意味する。
所定の位置でのアミノ酸の任意の他のアミノ酸への置換は、以下のように言及される：
元のアミノ酸-位置；または例えば「K409」。
元のアミノ酸および／または置換されたアミノ酸が、1つより多いが、すべてではないアミノ酸を含み得る改変について、1つより多いアミノ酸は、「,」または「/」によって分離され得る。例えば、位置409でのリジンのアルギニン、アラニン、またはフェニルアラニンでの置換は、以下である：
「Lys409Arg,Ala,Phe」または「Lys409Arg/Ala/Phe」または「K409R,A,F」または「K409R/A/F」または「K409をR、A、またはFへ」。
そのような呼称は、本発明の文脈において互換的に使用され得るが、同じ意味および目的を有する。
さらに、「置換」という用語は、任意の1種または残りの19種の天然アミノ酸への、または非天然アミノ酸などの他のアミノ酸への置換を包含する。例えば、位置409のアミノ酸Kの置換は、以下の置換：409A、409C、409D、409E、409F、409G、409H、409I、409L、409M、409N、409Q、409R、409S、409T、409V、409W、409P、および409Yの各々を含む。なお、これは、Xが元のアミノ酸以外の任意のアミノ酸を称する呼称409Xと同等である。これらの置換はまた、K409A、K409Cなど、またはK409A,C,など、またはK409A/C/などと称され得る。同じことが、類推により本明細書において述べられる各々のおよびあらゆる位置に、そのような置換の任意の1つを本明細書において具体的に含むようにあてはまる。
本発明による抗体はまた、アミノ酸残基の欠失を含み得る。そのような欠失は、「del」と表示され得、例えば、K409delとの表記を含む。したがって、そのような態様において、位置409のリジンは、アミノ酸配列から欠失している。
1つの態様において、二重特異性抗体の第1および第2の結合領域の両方が、AXLに結合する。しかし、第1の結合領域は、第2の結合領域とは異なるCDR配列のセットを含む。したがって、特定の態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の結合領域、ならびに第1および第2の重鎖を含み、第1および第2の結合領域は、以下からなる群より選択されるVHおよびVL領域を各々含む；
（a）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [148]；
（b）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [733]；
（c）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:41、42、および43のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:44、AAS、およびSEQ ID NO:45のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [140]；
（d）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および55のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [154]；
（e）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および54のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [154-M103L]；
（f）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:57、58、および59のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [171]；
（g）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:62、63、および64のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:65、GAS、およびSEQ ID NO:66のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [172]；
（h）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:67、68、および69のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:70、GAS、およびSEQ ID NO:71のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [181]；
（i）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:72、73、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [183]；
（j）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:72、74、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [183-N52Q]；
（k）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:81、AAS、およびSEQ ID NO:82のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [187]；
（l）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:83、84、および85のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:86、GAS、およびSEQ ID NO:87のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [608-01]；
（m）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:88、89、および90のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:91、GAS、およびSEQ ID NO:92のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [610-01]；
（n）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:94、95、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [613]；
（o）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:98、99、および100のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:101、DAS、およびSEQ ID NO:102のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [613-08]；
（p）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:103、104、および105のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:106、GAS、およびSEQ ID NO:107のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [620-06]；
（q）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および110のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [726]；
（r）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および111のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [726-M101L]；
（s）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [733]；
（t）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:41、42、および43のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:44、AAS、およびSEQ ID NO:45のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [107]；
（u）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および55のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [154]；
（v）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および54のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [154-M103L]；
（w）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:57、58、および59のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [171]；
（x）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:62、63、および64のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:65、GAS、およびSEQ ID NO:66のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [172]；
（y）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:67、68、および69のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:70、GAS、およびSEQ ID NO:71のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [181]；
（z）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:72、73、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [183]；
（aa）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:72、74、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [183-N52Q]；
（bb）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:81、AAS、およびSEQ ID NO:82のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [187]；
（cc）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:83、84、および85のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:86、GAS、およびSEQ ID NO:87のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [608-01]；
（dd）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:88、89、および90のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:91、GAS、およびSEQ ID NO:92のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [610-01]；
（ee）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:94、95、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [613]；
（ff）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:98、99、および100のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:101、DAS、およびSEQ ID NO:102のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [613-08]；
（gg）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:103、104、および105のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:106、GAS、およびSEQ ID NO:107のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [620-06]；
（hh）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および110のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [726]；
（ii）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および111のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [726-M101L]；
（jj）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 41、42、および43のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:44、AAS、およびSEQ ID NO:45のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [140]；
（kk）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 51、52、および55のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [154]；
（ll）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 51、52、および54のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [154-M103L]；
（mm）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 57、58、および59のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [171]；
（nn）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 62、63、および64のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:65、GAS、およびSEQ ID NO:66のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [172]；
（oo）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 67、68、および69のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:70、GAS、およびSEQ ID NO:71のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [181]；
（pp）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 72、73、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [183]；
（qq）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 72、74、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [183-N52Q]；
（rr）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 78、79、および80のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:81、AAS、およびSEQ ID NO:82のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [187]；
（ss）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 83、84、および85のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:86、GAS、およびSEQ ID NO:87のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [608-01]；
（tt）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 88、89、および90のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:91、GAS、およびSEQ ID NO:92のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [610-01]；
（uu）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 94、95、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [613]；
（vv）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 98、99、および100のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:101、DAS、およびSEQ ID NO:102のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [613-08]；
（ww）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 103、104、および105のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:106、GAS、およびSEQ ID NO:107のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [620-06]；
（xx）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 108、109、および110のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [726]；ならびに
（yy）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 108、109、および111のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [726-M101L]。
細胞傷害性薬剤、薬物などにコンジュゲートされた抗体は、抗体-薬物コンジュゲート（ADC）としても公知である。ADCは、抗体-薬物コンジュゲートが内部移行され、分解され、放出された毒素により細胞殺傷を誘導するのに十分な期間の半減期を有し得る。
したがって、ADCは、抗AXL抗体または二重特異性抗体、および、細胞傷害性薬剤や化学療法薬などの治療部分を含む。細胞傷害性薬剤や化学療法薬などは、リンカーを介して抗体または二重特異性抗体にコンジュゲートされ得る。
ADCはしばしば、細胞傷害性ペイロードが、抗体にコンジュゲートされている際には不活性であるように設計される。細胞傷害性ペイロードは、細胞の形質膜への結合後のADCの内部移行時に細胞内で、あるいは、腫瘍微小環境中のタンパク質分解活性に応答して、放出され得る。本明細書において使用される「内部移行される」または「内部移行」という用語は、AXL-ADCなどの分子が、細胞膜により包み込まれて、細胞の内部中に引き込まれる生物学的プロセスを指す。それはまた、「エンドサイトーシス」とも呼ばれ得る。
したがって、いくつかの事例において、内部移行を受ける抗体を使用することが望ましい場合がある。良好な内部移行特性を有するそのような抗体は、任意で、細胞内で切断されるように設計されているリンカーを介した、細胞傷害性薬剤、薬物などへのコンジュゲーションに適していてもよい。
ADCは、ひとたび内部移行されると、たいていの場合にリソソームへ送達され得、有効な薬物放出は、これらのオルガネラで見出される異化環境を利用する。抗体を細胞傷害性薬剤と接続するのは、典型的にはリンカーである。したがって、専門のリンカーが、標的腫瘍細胞中もしくは標的腫瘍細胞上、または腫瘍微小環境中に見出される特異的な微小環境においてのみ切断されるように設計されている。例は、酸性条件、還元条件、または特異的なプロテアーゼによって切断されるリンカーを含む。
循環における抗体-リンカー-薬物の安定性は、これにより特異的な標的細胞への薬物の抗体媒介性送達が可能になるため、重要である。加えて、ADCの長い循環半減期により、注射後数日間から数週間の曝露が提供される。切断不可能なリンカーおよびプロテアーゼで切断可能なリンカーを通してコンジュゲートされている薬物は、ジスルフィドリンカーおよびヒドラゾンリンカーよりも、循環において概してより安定であるが、後者の2つのリンカーの安定性は、近隣の化学構造の変更によって調整することができる（Alley et al., 2010）。
1つの態様において、治療部分は細胞傷害性薬剤である。細胞毒素または細胞傷害性薬剤は、細胞に対して有害である（例えば、殺傷する）任意の作用物質を含む。本発明において用いるためのADCを形成するのに適している細胞傷害性薬剤は、taxol、ツブリシン、デュオスタチン（duostatin）、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（dihydroxy anthracin dione）、メイタンシンまたはその類似体もしくは誘導体、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン；カリケアマイシンまたはその類似体もしくは誘導体；抗代謝剤（メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、5-フルオロウラシル、ダカルバジン（decarbazine）、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、クラドリビンなど）、アルキル化剤（メクロレタミン、チオテパ（thioepa）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（BSNU）、ロムスチン（CCNU）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（DTIC）、プロカルバジン、マイトマイシンC、シスプラチン、およびカルボプラチンなどの他の白金誘導体；ならびにデュオカルマイシンA、デュオカルマイシンSA、CC-1065（ラシェルマイシンとしても公知である）、またはCC-1065の類似体もしくは誘導体など）、ドラスタチン、アウリスタチン、ピロロ[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン（PDB）、インドリノベンゾジアゼピン（IGN）またはその類似体、抗生物質（ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（AMC）など）、抗有糸分裂作用物質（例えば、チューブリンを標的とする薬剤）、例えば、ジフテリア毒素および関連分子（ジフテリアA鎖およびその活性断片およびハイブリッド分子など）；リシン毒素（リシンAまたは脱グリコシル化リシンA鎖毒素）、コレラ毒素、志賀様毒素（SLT-I、SLT-II、SLT-IIV）、LT毒素、C3毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、大豆ボーマン・バークプロテアーゼ阻害剤、緑膿菌（Pseudomonas）外毒素、アロリン、サポリン、モデシン、ゲラニン（gelanin）、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolacca americana）タンパク質（PAPI、PAPII、およびPAP-S）、ニガウリ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、およびエノマイシン毒素を含む。他の適しているコンジュゲート分子は、CLIP、マガイニン2、メリチン、セクロピン、およびP18などの抗微生物／溶菌ペプチド；リボヌクレアーゼ（RNアーゼ）、DNアーゼI、ブドウ球菌腸毒素-A、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ジフテリア毒素、および緑膿菌内毒素を含む。例えば、Pastan et al., Cell 47, 641 (1986)およびGoldenberg, Calif. A Cancer Journal for Clinicians 44, 43 (1994)を参照されたい。例えば抗癌サイトカインまたはケモカインなどの、本明細書において別の場所に記載されるような、本発明にしたがって使用するための抗AXL抗体または抗体-薬物コンジュゲートと組み合わせて投与され得る治療用作用物質もまた、本発明にしたがって使用するための抗体へのコンジュゲーションに有用な治療部分のための候補である。
本明細書において使用される「細胞傷害性薬剤」という用語は、細胞に対して有害である（例えば、殺傷する）任意の作用物質を指す。当技術分野において周知であるこれらのクラスの薬物、およびそれらの作用機構の説明のためには、Goodman et al. (1990)を参照されたい。抗体免疫毒素の調製に関連する追加の技術は、例としてVitetta et al. (1993)およびUS 5,194,594に提供されている。
1つの態様において、細胞傷害性薬剤は、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルジチオ)-ペンタノアート（SSP）、マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル（mc-vc-PAB）、またはAV-1 K-lockバリン-シトルリンなどの切断可能なリンカーで、前記抗体またはその断片に連結されている。
本明細書において使用される「切断可能なリンカー」という用語は、標的とされる細胞または腫瘍微小環境において特異的なプロテアーゼによって触媒され、細胞傷害性薬剤の放出を結果としてもたらす、リンカーのサブセットを指す。切断可能なリンカーの例は、ジスルフィド、ヒドラゾン、またはペプチドを含む化学モチーフに基づくリンカーである。切断可能なリンカーの別のサブセットは、細胞傷害性薬剤と主要リンカーとの間、すなわち、リンカー-薬物の組み合わせを抗体に付着させる部位に、余分のリンカーモチーフが加わる。いくつかの態様において、余分のリンカーモチーフは、細胞内環境中（例えば、リソソームまたはエンドソームまたは小胞内）に存在する切断可能な作用物質によって切断可能である。リンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームのプロテアーゼを含むがこれらに限定されない、細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーであることができる。いくつかの態様において、ペプチジルリンカーは、少なくとも2アミノ酸長または少なくとも3アミノ酸長である。切断作用物質は、カテプシンBおよびD、ならびにプラスミンを含むことができ、これらのすべては、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して、標的細胞の内側で活性薬物の放出を結果としてもたらすことが公知である（例えば、Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123を参照されたい）。具体的な態様において、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチジルリンカーは、Val-Cit（バリン-シトルリン）リンカーまたはPhe-Lys（フェニルアラニン-リジン）リンカーである（Val-Citリンカーを有するドキソルビシンの合成を記載している米国特許第6214345号を参照されたい）。治療用作用物質の細胞内タンパク質分解性放出を用いる利点は、作用物質が、コンジュゲートされている際には典型的に減衰されており、コンジュゲートの血清安定性が、典型的に高いことである。
別の態様において、細胞傷害性薬剤は、スクシンイミジル-4(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート（MCC）またはマレイミドカプロイル（MC）などの切断不可能なリンカーで、前記抗体またはその断片に連結されている。
本明細書において使用される「切断不可能なリンカー」という用語は、切断可能なリンカーとは対照的に、細胞内または細胞外のプロテアーゼによって特異的にかつ予想通りに認識されるモチーフを含まない、リンカーのサブセットを指す。したがって、切断不可能なリンカーに基づくADCは、完全な抗体-リンカー-薬物複合体がリソソーム区画において分解されるまで、抗体から放出または切断されない。切断不可能なリンカーの例は、チオエーテルである。さらに別の態様において、リンカー単位は切断可能ではなく、薬物は抗体分解によって放出される（US 2005/0238649を参照されたい）。典型的に、そのようなリンカーは、細胞外環境に対して実質的に感受性がない。本明細書において使用される際、リンカーの文脈における「細胞外環境に対して実質的に感受性がない」とは、抗体薬物コンジュゲート化合物の試料において、リンカーの20％以下、典型的には約15％以下、より典型的には約10％以下、およびさらにより典型的には約5％以下、約3％以下、または約1％以下が、抗体薬物コンジュゲート化合物が細胞外環境（例えば、血漿）中に存在する際に切断されることを意味する。リンカーが細胞外環境に対して実質的に感受性がないかどうかは、例えば、抗体薬物コンジュゲート化合物をあらかじめ設定された時間（例えば、2、4、8、16、または24時間）、血漿とインキュベートし、次いで、血漿中に存在する遊離の薬物の量を定量することによって判定することができる。
1つの態様において、細胞傷害性薬剤は、DNAを標的とする薬剤、例えば、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、ラシェルマイシン（CC-1065）、ピロロ[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン（PBD）、およびインドリノベンゾジアゼピン（IGN）などのDNAアルキル化剤および架橋剤；微小管を標的とする薬剤、例えばデュオスタチン、例えばデュオスタチン-3、アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチンE（MMAE）およびモノメチルアウリスタチンF（MMAF）、ドラスタチン、メイタンシン、N(2')-デアセチル-N(2')-(3-マルカプト-1-オキソプロピル)-メイタンシン（DM1）、およびツブリシン；ならびにヌクレオシド類似体；またはそれらの類似体、誘導体、もしくはプロドラッグの群から選択される。
1つの態様において、AXL-ADCは、以下の組み合わせを含む；
i）バイスタンダー殺傷能力を有する、切断可能なリンカーおよび細胞傷害性薬剤；
ii）バイスタンダー殺傷能力を有さない、切断可能なリンカーおよび細胞傷害性薬剤；
iii）バイスタンダー殺傷能力を有する、切断不可能なリンカーおよび細胞傷害性薬剤；または
iv）バイスタンダー殺傷能力を有さない、切断不可能なリンカーおよび細胞傷害性薬剤。
本明細書において使用される「バイスタンダー殺傷効果」、「バイスタンダー殺傷」、「バイスタンダー殺傷能力」、または「バイスタンダー細胞傷害」という用語は、切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーのいずれかにより抗体にコンジュゲートされている細胞傷害性薬剤が、抗体からの放出後に細胞膜を横切って拡散する能力を有し、それにより近隣細胞の殺傷を引き起こす効果を指す。細胞傷害性薬剤が切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーによりコンジュゲートされている場合、バイスタンダー殺傷能力を有するのは、細胞傷害性薬剤のみまたはリンカーの一部を有する細胞傷害性薬剤のいずれかであり得る。細胞膜を横切って拡散する能力は、細胞傷害性薬剤または細胞傷害性薬剤とリンカーとの組み合わせの疎水性に関連する。そのような細胞傷害性薬剤は、有利には、プロテアーゼにより抗体から放出されているMMAEなどの膜透過性毒素であり得る。特に、不均質な標的発現を有する腫瘍および抗体浸透が限定され得る固形腫瘍において、バイスタンダー殺傷効果が望ましい場合がある。
本明細書において使用される「非バイスタンダー殺傷能力」、「非バイスタンダー殺傷効果」、「非バイスタンダー殺傷」、または「非バイスタンダー細胞傷害」という用語は、切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーのいずれかにより抗体にコンジュゲートされている細胞傷害性薬剤が、抗体からの放出後に細胞膜を横切って拡散する能力を有さない効果を指す。したがって、そのような細胞傷害性薬剤または細胞傷害性薬剤とリンカーとの組み合わせは、抗体からの放出時に近隣細胞を殺傷することができないことになる。理論により縛られることなく、細胞傷害性薬剤と切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーのいずれかとのそのような組み合わせは、抗体が結合する標的を発現する細胞のみを殺傷することになると確信される。
抗体と細胞傷害性薬剤との間の安定な連結は、ADCの重要な要因である。切断可能なタイプおよび切断不可能なタイプの両方のリンカーが、前臨床試験および臨床試験において安全であることが判明している。
1つの態様において、細胞傷害性薬剤は、アウリスタチンおよびメイタンシノイドなどの微小管を標的とする薬剤の群から選択される。
本明細書において使用される「微小管を標的とする薬剤」という用語は、有糸分裂（細胞分裂）を阻害する作用物質または薬物を指す。微小管は、細胞分裂中のDNAの妥当な分離に不可欠な構造であり、微小管機能は、「動的不安定性」、すなわち微小管構造が連続的に伸長および短縮するプロセスに決定的に依存する。微小管を標的とする薬剤は、微小管を破壊または安定化して、有糸分裂紡錘体の形成を阻止し、有糸分裂の停止およびアポトーシスを結果としてもたらす。微小管を標的とする薬剤は、例えば、植物アルカロイドなどの天然物質に由来することができ、微小管の重合を破壊または安定化し、かくして有糸分裂紡錘体の形成およびその後の細胞分裂を阻止することによって細胞が有糸分裂を経験するのを阻止し、癌性増殖の阻害を結果としてもたらす。微小管を標的とする薬剤の例は、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、デュオスタチン、アウリスタチン、メイタンシノイド、ツブリシン、およびドラスタチンである。
1つの態様において、細胞傷害性薬剤は、アウリスタチンまたはアウリスタチンペプチド類似体および誘導体である（US 5,635,483；US 5,780,588）。アウリスタチンは、微小管動態、GTP加水分解、ならびに核分裂および細胞分裂を干渉し（Woyke et al., 2001）、抗癌活性（US 5,663,149）および抗真菌活性（Pettit, 1998）を有することが示されている。アウリスタチン薬物部分は、ペプチド薬物部分のN（アミノ）末端またはC（末端）を通して、リンカーを介して抗体に付着され得る。
例示的なアウリスタチン態様は、Senter et al. (2004)に開示され、US 2005/0238649に記載されている、N末端連結モノメチルアウリスタチン薬物部分DEおよびDFを含む。
特定の態様において、細胞傷害性薬剤は、モノメチルアウリスタチンE（MMAE）；
Figure 2024038480000007
であり、抗体は、適切なリンカーにより上記の化学構造の左側の窒素（N）でMMAEに連結されている。
1つの態様において、細胞傷害性薬剤モノメチルアウリスタチンE（MMAE）は、バリン-シトルリン（VC）リンカーを介して抗体に連結されている。
別の態様において、細胞傷害性薬剤モノメチルアウリスタチンE（MMAE）は、バリン-シトルリン（VC）リンカーおよびマレイミドカプロイル（MC）リンカーを介して抗体に連結されており、細胞傷害性薬剤とリンカーとの組み合わせは、化学構造；
Figure 2024038480000008
を有し、式中、MAbは抗体である。
1つの態様において、細胞傷害性薬剤は、モノメチルアウリスタチンF（MMAF）；
Figure 2024038480000009
であり、抗体は、適切なリンカーにより上記の化学構造の左側の窒素（N）でMMAFに連結されている。
1つの態様において、細胞傷害性薬剤モノメチルアウリスタチンF（MMAF）は、マレイミドカプロイル（mc）リンカーを介して抗体に連結されており、細胞傷害性薬剤とリンカーとの組み合わせは、化学構造；
Figure 2024038480000010
を有し、式中、MAbは抗体である。
1つの態様において、細胞傷害性薬剤はデュオスタチン3である。
別の特定の態様において、細胞傷害性薬剤はDNAを標的とする薬剤である。
本明細書において使用される「DNAを標的とする薬剤」という用語は、DNAをアルキル化および／または架橋することができる特定のクラスの細胞傷害性薬剤を指す。そのようなDNA作用剤の例は、DNAをアルキル化および架橋するそれらの能力のおかげで非常に強力である、インドリノ-ベンゾジアゼピン二量体およびピロロ[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン（PBD）を含むIGN剤である。別の例は、DNAをアルキル化のみする能力のおかげで非常に強力である、インドリノ-ベンゾジアセピン単量体を含むIGN剤である。デュオカルマイシンは、別のクラスのDNA作用剤である。デュオカルマイシンは、低分子の合成DNA副溝結合アルキル化剤である。これらの化合物は、固形腫瘍および血液腫瘍を標的とするのに適している。
1つの態様において、AXL-ADCは、抗体あたり2～4個の細胞傷害性分子を含む。毒素およびリンカー-毒素の組み合わせの化学的特性に応じて、抗体あたり2～4個の細胞傷害性薬剤は、より少量が負荷されているコンジュゲートよりも循環からより急速に浄化される、より多量に負荷されたコンジュゲートよりも優れている場合がある。細胞傷害性薬剤の負荷は、pにより表され、分子における抗体あたりの細胞傷害性薬剤部分の平均数（薬物対抗体の比、DARとも称される）である。細胞傷害性薬剤の負荷は、抗体あたり1～20個の薬物部分の範囲にわたり得、リジンまたはシステイン中のような、アミノ基またはスルフヒドリル基などであるがこれらに限定されない、有用な官能基を有するアミノ酸上で起こり得る。
1つの態様において、抗体あたりの細胞傷害性薬剤の数は、1～8個、例えば2～7個、例えば2～6個、例えば2～5個、例えば2～4個、および例えば2～3個である。
別の態様において、AXL-ADCは、抗体あたり4～8個の細胞傷害性分子を含む。別の態様において、AXL-ADCは、抗体あたり6～10個の細胞傷害性分子を含む。さらに別の態様において、AXL-ADCは、抗体あたり10～30個、例えば15～25個、例えば20個の細胞傷害性分子を含む。
コンジュゲーションの方法に応じて、pは、抗体上の付着部位の数によって限定され得、例えば、付着はシステインチオールまたはリジンである。概して、抗体は、薬物部分に連結され得る多くの遊離かつ反応性のシステインチオール基を含有しておらず、なぜなら、抗体中のたいていのシステインチオール残基は、ジスルフィド架橋として存在するからである。そのため、細胞傷害性薬剤がシステインチオールを介してコンジュゲートされているそれらの態様において、抗体は、反応性のシステインチオール基を生成するために、部分的または完全な還元条件下で、ジチオスレイトール（DTT）またはトリカルボニルエチルホスフィン（TCEP）などの還元剤で還元され得る。ある特定の態様において、最大で8個の遊離システインチオール基が、抗体の（部分的）還元後に利用可能になる（鎖間ジスルフィド結合に関与する8個のシステインが存在する）ため、本発明のADCについての薬物負荷は、1～約8個の範囲にわたる。
1つの態様において、薬物リンカー部分はvcMMAEである。vcMMAE薬物リンカー部分およびコンジュゲーション法は、WO 2004/010957；US 7,659,241；US 7,829,531；およびUS 7,851,437（Seattle Genetics；それぞれ参照により本明細書に組み入れられる）に開示されており、vcMMAEは、リンカーmc-vc-PABと細胞傷害性部分MMAEとのコンジュゲーションによって形成され、vcMMAE薬物リンカー部分は、それらにおいて開示されているものと同様の方法（例えば、実施例8に記載されている方法）を用いて、システイン残基で抗AXL抗体に結合されている。
1つの態様において、薬物リンカー部分はmcMMAFである。mcMMAF薬物リンカー部分およびコンジュゲーション法は、US 7,498,298；US 11/833,954；およびWO 2005/081711（Seattle Genetics；それぞれ参照により本明細書に組み入れられる）に開示されており、mcMMAF薬物リンカー部分は、その中に開示されているものと同様の方法を用いて、システイン残基で抗AXL抗体に結合されている。
1つの態様において、細胞傷害性薬剤は、WO 2013/173391、WO 2013/173392、およびWO 2013/173393（Concortis Biosystems）に記載されているように、K-Lock（商標）コンジュゲーションによって抗体アミノ酸配列内の1または2個のリジンに連結されている。デュオスタチン3（Duo3としても公知である）もまた、その中に記載されているものと同様の方法を用いて、リジン残基で抗AXL抗体に結合されていてもよい。
ヒドロキシル基を含むリンカーなどの他のリンカー技術が、本発明の使用のための抗AXL抗体薬物コンジュゲートにおいて使用され得る。
1つの態様において、リンカーは、抗AXL抗体の（部分的）還元によって取得される抗AXL抗体の遊離システイン残基に付着される。
特定の態様において、リンカーはmc-vc-PABであり、細胞傷害性薬剤はMMAEであるか；またはリンカーはSSPであり、細胞傷害性薬剤はDM1である。
特定の態様において、リンカーはMMCであり、細胞傷害性薬剤はDM1であるか；またはリンカーはMCであり、細胞傷害性薬剤はMMAFである。
特定の態様において、リンカーは切断可能なリンカーAV1-K lockであり、細胞傷害性薬剤はデュオスタチン3である。
1つの態様において、AXL-ADCは、リンカーmc-vc-PAB、細胞傷害性薬剤MMAE、ならびに、少なくとも1つの結合領域が、以下からなる群より選択されるVH領域およびVL領域を含む抗体を含む。
一態様において、前記抗体は、以下からなる群より選択されるVH領域とVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む：
(y) それぞれSEQ ID No:36、37および38のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:39、GAS、およびSEQ ID No:40のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[107]；
(z) それぞれSEQ ID No:46、47および48のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:49、AAS、およびSEQ ID No:50のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[148]；
(aa) それぞれSEQ ID No:114、115および116のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:117、DAS、およびSEQ ID No:118のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[733]；
(bb) それぞれSEQ ID No:51、52および53のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:55、GAS、およびSEQ ID No:56のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[154]；
(cc) それぞれSEQ ID No:51、52および54のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:55、GAS、およびSEQ ID No:56のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[154-M103L]；
(dd) それぞれSEQ ID No:57、58および59のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:60、GAS、およびSEQ ID No:61のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[171]；
(ee) それぞれSEQ ID No:62、63および64のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:65、GAS、およびSEQ ID No:66のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[172]；
(ff) それぞれSEQ ID No:67、68および69のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:70、GAS、およびSEQ ID No:71のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[181]；
(gg) それぞれSEQ ID No:72、73および75のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:76、ATS、およびSEQ ID No:77のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[183]；
(hh) それぞれSEQ ID No:72、74および75のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:76、ATS、およびSEQ ID No:77のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[183-N52Q]；
(ii) それぞれSEQ ID No:78、79および80のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:81、AAS、およびSEQ ID No:82のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[187]；
(jj) それぞれSEQ ID No:83、84および85のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:86、GAS、およびSEQ ID No:87のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[608-01]；
(kk) それぞれSEQ ID No:88、89および90のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:91、GAS、およびSEQ ID No:92のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[610-01]；
(ll) それぞれSEQ ID No:93、94および95のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:96、GAS、およびSEQ ID No:97のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[613]；
(mm) それぞれSEQ ID No:98、99および100のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:101、DAS、およびSEQ ID No:102のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[613-08]；
(nn) それぞれSEQ ID No:103、104および105のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:106、GAS、およびSEQ ID No:107のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[620-06]；
(oo) それぞれSEQ ID No:108、109および110のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:112、AAS、およびSEQ ID No:113のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[726]；
(pp) それぞれSEQ ID No:108、109および111のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:112、AAS、およびSEQ ID No:113のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[726-M101L]；
(qq) それぞれSEQ ID No:41、42および43のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:44、AAS、およびSEQ ID No:45のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[140]；
(rr) それぞれSEQ ID No:93、94および95のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:128、XAS（配列中、XはDまたはGである）、およびSEQ ID No:129のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[613/613-08]；
(ss) それぞれSEQ ID No:46、119および120のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:49、AAS、およびSEQ ID No:50のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[148/140]；
(tt) それぞれSEQ ID No:123、124および125のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:60、GAS、およびSEQ ID No:61のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[171/172/181]；
(uu) それぞれSEQ ID No:121、109および122のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:112、AAS、およびSEQ ID No:113のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[726/187]；ならびに
(vv) それぞれSEQ ID No:93、126および127のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:96、GAS、およびSEQ ID No:97のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[613/608-01/610-01/620-06]。
別の代替的な態様において、抗AXL抗体-薬物コンジュゲートは、コンジュゲートされた核酸または核酸関連分子を含む。このような態様では、コンジュゲートされた核酸は、細胞傷害性リボヌクレアーゼ、アンチセンス核酸、阻害性RNA分子(例えば、siRNA分子)、または免疫刺激性核酸(例えば、免疫刺激性CpGモチーフ含有DNA分子)である。
別の代替的態様において、抗AXL抗体は、アプタマーもしくはリボザイム、またはその機能的ペプチド類似体もしくは誘導体にコンジュゲートされる。
別の代替的態様においては、1つ以上の放射性標識アミノ酸を含む抗AXL抗体-薬物コンジュゲートが提供される。放射性標識された抗AXL抗体は、診断目的および治療目的の両方に使用することができる(放射性標識分子へのコンジュゲーションは考えられる別の特徴である)。ポリペプチド用の標識の非限定的な例には、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、125I、131I、および186Reが含まれる。放射性標識されたアミノ酸および関連するペプチド誘導体を調製するための方法は、当技術分野で公知である(例えば、Junghans et al. (1996); US 4,681,581; US 4,735,210; US 5,101,827; US 5,102,990; US 5,648,471; およびUS 5,697,902を参照されたい)。例えば、ハロゲン放射性同位体は、クロラミンT法によってコンジュゲートすることができる。
一態様において、該抗体は、放射性同位体または放射性同位体含有キレートにコンジュゲートされる。例えば、該抗体をキレート剤リンカー、例えばDOTA、DTPAまたはチウキセタン(tiuxetan)にコンジュゲートすることができ、該リンカーは、該抗体が放射性同位体と複合体形成することを可能にする。該抗体は、1つ以上の放射性標識アミノ酸または他の放射性標識分子を追加的にまたは代替的に含むか、それらにコンジュゲートされ得る。放射性標識された抗AXL抗体は、診断目的と治療目的の両方に使用することができる。放射性同位体の非限定的な例としては、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、125I、111In、131I、186Re、213Bs、225Acおよび227Thが挙げられる。
抗AXL抗体はまた、例えばその循環半減期を増加させるために、ポリマーへの共有結合によって化学修飾することができる。例示的なポリマーおよびそれらをペプチドに結合させる方法は、例えば、US 4,766,106; US 4,179,337; US 4,495,285およびUS 4,609,546に説明されている。さらなるポリマーには、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール(PEG)(例えば、約1,000～約40,000、例えば約2,000～約20,000の分子量を有するPEG)が含まれる。これは、例えば、抗AXL抗体がフラグメントである場合に使用することができる。
上記のようなコンジュゲートされる分子に抗AXL抗体をコンジュゲートするための当技術分野で公知の方法は、例えば、Hunter et al. (1974)、Pain et al. (1981)およびNygren (1982)に記載される方法を含めて、どれも使用することができる。このような抗体は、抗AXL抗体(例えば、抗AXL抗体のH鎖またはL鎖)のN末端側またはC末端側に他の成分を化学的にコンジュゲートすることによって作製され得る(例えば、Kanemitsu, 1994を参照されたい)。このようなコンジュゲートされた抗体誘導体はまた、内部残基もしくは糖でのコンジュゲーションによって、または必要に応じて抗体定常ドメインに導入された非天然アミノ酸もしくは追加のアミノ酸でのコンジュゲーションによっても作製され得る。
これらの物質は、抗AXL抗体に直接または間接的にカップリングすることができる。第2の物質の間接的カップリングの一例は、スペーサー部分を介した抗体中のシステインまたはリシン残基へのカップリングである。一態様では、抗AXL抗体は、インビボで治療薬物に活性化され得るプロドラッグ分子に、スペーサーまたはリンカーを介して、コンジュゲートされる。投与後、該スペーサーまたはリンカーは、腫瘍細胞関連酵素または他の腫瘍特異的状態によって切断され、それにより活性薬物が形成される。そのようなプロドラッグ技術およびリンカーの例は、WO 2002/083180、WO 2004/043493、WO 2007/018431、WO 2007/089149、WO 2009/017394およびWO 2010/62171 (Syngenta BV社；これらの各々は参照により本明細書に組み入れられる)に記載されている。適切な抗体-プロドラッグ技術およびデュオカルマイシン類似体はまた、US 6,989,452 (Medarex社；参照により本明細書に組み入れられる)に見ることができる。
一態様において、抗AXL抗体は、該抗体が放射性同位体とコンジュゲートすることを可能にする、キレート剤リンカー、例えばチウキセタンに結合される。
組み合わせ、組成物およびキット
本発明に従って使用されるAXL-ADCは、組成物の形態で投与することができる。一局面において、該組成物は、AXL-ADCおよび薬学的担体を含む薬学的組成物である。
一態様において、AXL-ADCまたはAXL-ADCを含む薬学的組成物は、新生物が治療されているかまたは治療されたことがある少なくとも1種の治療剤、すなわち、前述の局面または態様のいずれかに記載の化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤、PI3K阻害剤、mAb/rTKIおよび/またはセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤と組み合わせて、新生物を治療する際に使用される。例えば、治療剤は、前述の局面または態様のいずれかに記載の化学療法剤、TKIまたはS/Th KIであり得る。典型的には、AXL-ADCと治療剤は別々に投与される。
しかし、一態様において、AXL-ADCを含む薬学的組成物は、新生物が治療されているかまたは治療されたことがある少なくとも1種の治療剤、すなわち、前述の局面または態様のいずれかに記載の化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤、PI3K阻害剤、mAb/rTKIおよび/またはセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤をさらに含む。例えば、治療剤は、前述の局面または態様のいずれかに記載の化学療法剤、TKIまたはS/Th KIであり得る。少なくとも1種の治療剤と組み合わせて本発明に従って使用するためのAXL-ADCは、同時に、別々に、または逐次的に投与するためのキットの形態で提供することもでき、該キットは使用説明書をさらに含み得る。ADCおよび少なくとも1種の治療剤は、典型的には、別個の薬学的組成物として製剤化される。
一態様において、前記組み合わせ、組成物またはキット中のチロシンキナーゼ阻害剤は、EGFRアンタゴニストである。
一態様において、前記組み合わせ、組成物またはキット中のチロシンキナーゼ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、イマチニブ、スニチニブ、クリゾチニブ、ミドスタウリン(PKC412)およびキザルチニブ(AC220)からなる群より選択され、例えば、エルロチニブまたはその類似体もしくは誘導体、例えばラパチニブ、ゲフィチニブなどである。好ましい態様では、チロシンキナーゼ阻害剤はエルロチニブである。
一態様において、前記組み合わせ、組成物またはキット中のセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤は、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、セルメチニブ(AZD6244)、VTX11E、トラメチニブおよびPLX4720から選択される。
一態様において、前記組み合わせ、組成物またはキット中のBRAF阻害剤は、ベムラフェニブ(PLX4032)またはその治療上有効な類似体もしくは誘導体、例えばダブラフェニブまたはPLX4720である。一態様では、BRAF阻害剤はベムラフェニブである。一態様では、BRAF阻害剤はダブラフェニブである。
一態様において、前記組み合わせ、組成物またはキット中のセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤は、少なくとも1種のBRAF阻害剤と少なくとも1種のMEK阻害剤を含み、ここで、少なくとも1種のBRAF阻害剤は、ベムラフェニブ、ダブラフェニブおよびこれらの組み合わせから選択され、MEK阻害剤は、セルメチニブ(AZD6244)、トラメチニブ、およびこれらの組み合わせから選択される。例えば、前記組み合わせ、組成物またはキットは、ダブラフェニブとトラメチニブ；ベムラフェニブとトラメチニブ；ダブラフェニブとベムラフェニブとトラメチニブ；ダブラフェニブとセルメチニブ；またはベムラフェニブとセルメチニブを含むことができる。
一態様において、前記組み合わせ、組成物またはキット中の少なくとも1種の化学療法剤は、タキサンであり、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルから選択される。
一態様において、前記組み合わせ、組成物またはキット中の少なくとも1種の化学療法剤は、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、エトポシドおよびメトホルミンからなる群より選択される。
一態様において、前記組み合わせ、組成物またはキット中のPI3K阻害剤は、アルペリシブ(BYL719)である。
一態様において、前記組み合わせ、組成物またはキット中のmAb/rTKIは、セツキシマブまたはMAB391である。
前記キットは、必要に応じて、様々な従来の医薬キット構成要素の1つ以上、例えば、1種以上の薬学的に許容される担体を含む容器、追加の容器など、をさらに含むことができ、当業者には容易に明らかになるであろう。投与される成分の量、投与に関するガイドライン、および/または諸成分を混合するためのガイドラインを示す、インサートまたはラベルとしての、印刷された説明書もキットに含めることができる。
薬学的組成物は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (1995)に開示されているものなどの従来の技術にしたがって、薬学的に許容される担体または希釈剤、ならびに任意の他の公知のアジュバントおよび賦形剤とともに製剤化され得る。
薬学的に許容される担体または希釈剤、ならびに任意の他の公知のアジュバントおよび希釈剤は、AXL-ADCおよび選択された投与の様式に適しているべきである。薬学的組成物の担体および他の構成要素の適合性は、選択された化合物または薬学的組成物の望ましい生物学的特性に対して有意な負の影響がない（例えば、抗原結合時に実質的な影響に満たない（10％以下の相対的阻害、5％以下の相対的阻害など））ことに基づいて決定される。
薬学的組成物はまた、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、界面活性剤（例えば、Tween-20またはTween-80などの非イオン性界面活性剤）、安定剤（例えば、糖またはタンパク質を含まないアミノ酸）、保存剤、組織固定剤、可溶化剤、および／または薬学的組成物中に含まれるのに適している他の材料も含み得る。
薬学的組成物における活性成分の実際の投薬レベルは、患者に対して毒性であることなく、特定の患者、組成物、および投与の様式にとって望ましい治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るために、変動し得る。選択される投薬レベルは、特定の組成物の活性、投与の経路、投与の時間、使用される特定の化合物の排出の速度、処置の持続期間、使用される特定の組成物と組み合わせて用いられる他の薬物、化合物、および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康、および事前の病歴、ならびに医学分野において周知である同様の要因を含む、様々な薬物動態学的要因に依存することになる。
薬学的組成物は、任意の適している経路および様式によって投与され得る。インビボおよびインビトロで本発明の化合物を投与するのに適している経路は、当技術分野において周知であり、当業者によって選択され得る。
1つの態様において、薬学的組成物は、非経口的に投与される。
本明細書において使用される「非経口投与」および「非経口的に投与される」という用語は、通常注射による、経腸および局所投与以外の投与の様式を指し、表皮、静脈内、筋肉内、動脈内、クモ膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、腱内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、硬膜外、および胸骨内の注射および注入を含む。
1つの態様において、薬学的組成物は、静脈内または皮下の注射または注入によって投与される。
薬学的に許容される担体は、本発明にしたがって使用するためのAXL-ADCまたは治療用作用物質と生理学的に適合性である、任意およびすべての適している溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤、抗酸化剤、ならびに吸収遅延剤などを含む。
薬学的組成物において使用され得る、適している水性および非水性の担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノール、デキストロース、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適している混合物、オリーブ油、コーン油、落花生油、綿実油、およびゴマ油などの植物油、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、トラガカントガム、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル、ならびに／または種々の緩衝剤を含む。他の担体が、薬学分野において周知である。
薬学的に許容される担体は、無菌の注射可能な溶液および分散系の即時調製のための、無菌の水性溶液または分散系および無菌の粉末を含む。薬学的活性物質のためのそのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野において公知である。いずれかの従来の媒体または作用物質が活性化合物と不適合性である限りを除いて、薬学的組成物におけるそれらの使用が企図される。
妥当な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散系の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。
薬学的組成物はまた、薬学的に許容される抗酸化剤、例として（1）アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどのような水溶性抗酸化剤；（2）アスコルビルパルミタート、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、プロピルガラート、α-トコフェロールなどのような油溶性抗酸化剤；および（3）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などのような金属キレート剤も含み得る。
薬学的組成物はまた、組成物中に、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、グリセロール、または塩化ナトリウムなどの等張剤も含み得る。
薬学的組成物はまた、薬学的組成物の貯蔵寿命または有効性を増強し得る、保存剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、保存剤または緩衝剤などの、選択される投与の経路に適切な1つまたは複数のアジュバントも含有し得る。本発明にしたがって使用するためのAXL-ADCまたは治療用作用物質は、インプラント、経皮貼付剤、およびマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤などの、急速な放出から化合物を保護することになる担体とともに調製され得る。そのような担体は、ゼラチン、グリセリルモノステアラート、グリセリルジステアラート、生分解性生体適合性のポリマー、例えばエチレンビニルアセタート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリ-オルト-エステル、および単独もしくはワックスを伴うポリ乳酸、または当技術分野において周知である他の材料を含み得る。そのような製剤の調製のための方法は、概して、当業者に公知である。例えば、Robinson: Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (1978)を参照されたい。
1つの態様において、化合物は、インビボでの妥当な分布を確実にするように製剤化され得る。非経口投与のための薬学的に許容される担体は、無菌の注射可能な溶液または分散系の即時調製のための、無菌の水性溶液または分散系および無菌の粉末を含む。薬学的活性物質のためのそのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野において公知である。いずれかの従来の媒体または作用物質が活性化合物と不適合性である限りを除いて、薬学的組成物におけるそれらの使用が企図される。他の活性化合物または治療用化合物もまた、組成物中に組み入れられ得る。
注射用の薬学的組成物は、典型的に、製造および保存の条件下で無菌および安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適している他の規則正しい構造として製剤化され得る。担体は、例として、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適している混合物、オリーブ油などの植物油、ならびに、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルを含有する、水性または非水性の溶媒、または分散媒であってもよい。妥当な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散系の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。多くの場合に、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばグリセロール、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが、好ましいと考えられる。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアラート塩およびゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされ得る。無菌の注射可能な溶液は、必要とされる量の活性化合物を、例えば上記で列挙されたような成分の1つまたは組み合わせとともに適切な溶媒中に組み込むこと、必要とされる際には、その後の滅菌マイクロ濾過によって調製され得る。概して、分散系は、活性化合物を、基本の分散媒、および、例えば上記で列挙されたもの由来の必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌の粉末の場合、調製の方法の例は、事前に滅菌濾過されたその溶液から、活性成分プラス任意の追加の望ましい成分の粉末を生じる、真空乾燥および冷凍乾燥（凍結乾燥）である。
無菌の注射可能な溶液は、必要とされる量の活性化合物を、上記で列挙された成分の1つまたは組み合わせとともに適切な溶媒中に組み込むこと、必要とされる際には、その後の滅菌マイクロ濾過によって調製され得る。概して、分散系は、活性化合物を、基本の分散媒、および上記で列挙されたもの由来の必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌の粉末の場合、調製の方法の例は、事前に滅菌濾過されたその溶液から、活性成分プラス任意の追加の望ましい成分の粉末を生じる、真空乾燥および冷凍乾燥（凍結乾燥）である。
抗AXL抗体の産生
本発明によるADCとして使用するための抗体は、典型的には1つ以上の発現ベクターの形態の核酸構築物を用いて、宿主細胞において組み換え的に調製することができる。一態様では、該核酸構築物は表1に示す1つ以上の配列をコードする。さらなる態様では、該発現ベクターは、抗体、例えばヒトIgG1,κモノクローナル抗体、の軽鎖、重鎖、または軽鎖と重鎖の両方の定常領域をコードする核酸配列をさらに含む。
発現された抗AXL抗体は、その後、本明細書に記載されるような部分にコンジュゲートされ得る。別の態様において、コンジュゲーションの前に、抗AXL抗体は、その後、本明細書に記載されるような二重特異性抗体を生成するために使用され得る。
発現ベクターは、染色体、非染色体、および合成核酸ベクター（発現制御エレメントの適しているセットを含む核酸配列）を含む、任意の適しているベクターであり得る。そのようなベクターの例は、SV40の誘導体、細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAとの組み合わせに由来するベクター、ならびにウイルス核酸（RNAまたはDNA）ベクターを含む。1つの態様において、抗AXL抗体をコードする核酸は、例えば、直鎖状発現エレメント（例として、Sykes and Johnston (1997)に記載されている）を含む裸のDNAもしくはRNAベクター、コンパクト核酸ベクター（例として、US 6,077, 835 および／もしくは WO 00/70087 に記載されている）、pBR322、pUC19/18、もしくはpUC118/119などのプラスミドベクター、「midge」最小サイズの核酸ベクター（例として、Schakowski et al., (2001)に記載されている）中に、または、リン酸カルシウム沈殿構築物などの沈殿核酸ベクター構築物（例としてWO 00/46147、Benvenisty and Reshef, 1986、Wigler et al., 1978、およびCoraro and Pearson, 1981に記載されている）として含まれる。そのような核酸ベクターおよびその使用法は、当技術分野において周知である（例として、US 5,589,466 および US 5,973,972 を参照されたい）。
1つの態様において、ベクターは、細菌細胞における抗AXL抗体の発現に適している。そのようなベクターの例は、BlueScript（Stratagene）、pINベクター（Van Heeke & Schuster, 1989）、pETベクター（Novagen, Madison WI）など）のような発現ベクターを含む。
発現ベクターは、またもしくは代替的に、酵母システムにおける発現に適しているベクターであり得る。酵母システムにおける発現に適している任意のベクターが、使用され得る。適しているベクターは、例えば、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびPGHなどの構成性または誘導性のプロモーターを含むベクター（F. Ausubel et al., 1987 および Grant et al., 1987 に概説されている）を含む。
核酸構築物および／またはベクターはまた、新生ポリペプチド鎖などのポリペプチドを、ペリプラズム腔へまたは細胞培養培地中に標的化することができる、分泌／局在化配列をコードする核酸配列も含み得る。そのような配列は、当技術分野において公知であり、分泌リーダーまたはシグナルペプチド、オルガネラ標的配列（例えば、核局在化配列、ER保持シグナル、ミトコンドリア移行配列、葉緑体移行配列）、膜局在化／アンカー配列（例えば、輸送停止配列、GPIアンカー配列）などを含む。
発現ベクターにおいて、抗AXL抗体をコードする核酸は、任意の適しているプロモーター、エンハンサー、および他の発現促進エレメントを含み得るか、またはそれらと関連し得る。そのようなエレメントの例は、強い発現プロモーター（例えば、ヒトCMV IEプロモーター／エンハンサー、ならびにRSV、SV40、SL3-3、MMTV、およびHIV LTRプロモーター）、有効なポリ(A)終結配列、大腸菌（E.coli）におけるプラスミド産物用の複製開始点、選択可能マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子、および／または好都合なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）を含む。核酸はまた、CMV IEなどの構成性プロモーターとは対照的に誘導性プロモーターも含み得る（そのような用語が、ある一定の条件下での遺伝子発現の程度の実質的な記述子であることを、当業者は認識するであろう）。
1つの態様において、抗AXL抗体をコードする発現ベクターは、ウイルスベクターを介して、宿主細胞もしくは宿主動物中に位置づけられ得るか、および／または送達され得る。
宿主細胞は、本明細書において定義される抗AXL抗体、または本明細書において定義される本発明の二重特異性分子を産生する、トランスフェクトーマなどの組み換え真核生物または原核生物の宿主細胞でありうる。宿主細胞の例は、酵母、細菌および哺乳動物細胞、例えば、CHOもしくはHEK細胞、またはその誘導体を含む。例えば、1つの態様において、細胞は、抗AXL抗体の発現をコードする配列を含む、細胞ゲノム中に安定に組み込まれた核酸を含む。別の態様において、宿主細胞は、抗AXL抗体の発現をコードする配列を含む、プラスミド、コスミド、ファージミド、または直鎖状発現エレメントなどの組み込まれていない核酸を含む。
本明細書において使用される「組み換え宿主細胞」（または単純に「宿主細胞」）という用語は、発現ベクターがその中に導入されている細胞を指すように意図される。そのような用語は、特定の対象細胞だけではなく、そのような細胞の子孫もまた指すように意図されることが、理解されるべきである。変異または環境の影響のいずれかにより、ある一定の改変が次の世代において起こり得るため、そのような子孫は、実際のところ親細胞と同一ではない場合があるが、本明細書において使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に依然として含まれる。組み換え宿主細胞は、例えば、CHO細胞、HEK-293細胞、PER.C6、NSO細胞、およびリンパ球細胞などのトランスフェクトーマ、ならびに大腸菌などの原核生物細胞、ならびに、植物細胞および真菌などの他の真核生物宿主を含む。
本明細書において使用される「トランスフェクトーマ」という用語は、CHO細胞、PER.C6、NS0細胞、HEK-293細胞、植物細胞、または酵母細胞を含む真菌などの、抗体または標的抗原を発現する、組み換え真核生物宿主細胞を含む。
あるいは、抗体は、例として表面上に抗原を発現する細胞の形態の、AXLの細胞外領域、または関心対象の抗原をコードする核酸で免疫化されたマウスから取得されたマウス脾臓B細胞より調製されたハイブリドーマから産生され得る。モノクローナル抗体はまた、免疫化されたヒト、または、ウサギ、ラット、イヌ、霊長類などのような非ヒト哺乳動物の抗体発現細胞に由来するハイブリドーマから取得され得る。
ヒト抗体は、マウス免疫系ではなくヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックマウスまたはトランスクロモソーマルマウス、例えばHuMAbマウス、を用いて作製することができる。HuMAbマウスは、内因性のμおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的変異と共に、再配列されていないヒト重鎖(μおよびγ)およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含む(Lonberg et al., 1994a)。その結果、このマウスは、免疫化されるとヒト抗体応答を開始し、導入されたヒト重鎖および軽鎖トランスジーンは、高親和性ヒトIgG,κモノクローナル抗体を生成するためのクラススイッチおよび体細胞変異を受ける(Lonberg et al., 1994b; Lonberg and Huszar, 1995; Harding and Lonberg, 1995)。HuMAbマウスの作製は、Taylor et al., 1992; Chen et al., 1993; Tuaillon et al., 1994; およびFishwild et al., 1996に詳しく記載されている。さらに、US 5,545,806; US 5,569,825; US 5,625,126; US 5,633,425; US 5,789,650; US 5,877,397; US 5,661,016; US 5,814,318; US 5,874,299; US 5,770,429; US 5,545,807; WO 98/024884; WO 94/025585; WO 93/001227; WO 92/022645; WO 92/003918; およびWO 01/009187も参照されたい。これらのトランスジェニックマウス由来の脾細胞を用いて、周知の技術に従ってヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製することができる。さらに、ヒト抗体は、完全なヒトモノクローナル抗体の組み換え生産のための供給源として使用できる、ヒト-ラットキメラ抗体を産生するトランスジェニックマウスまたはラットから作製することができる。
さらに、ヒト抗体は、ディスプレイタイプの技術によって同定することができ、こうした技術には、限定するものではないが、ファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、哺乳動物ディスプレイ、酵母ディスプレイおよび当技術分野で公知の他の技術が含まれる。得られた分子は、親和性成熟などの、さらなる成熟に供することができ、このような技術は当技術分野で周知である。
（表４）配列
Figure 2024038480000011
Figure 2024038480000012
Figure 2024038480000013
Figure 2024038480000014
Figure 2024038480000015
Figure 2024038480000016
Figure 2024038480000017
Figure 2024038480000018
Figure 2024038480000019
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これらの実施例はさらなる限定として解釈されるべきでない。
実施例1‐免疫化およびAXL抗体の生成
AXL用の発現構築物
種々の完全長AXLバリアントの発現用の以下のコドン最適化構築物を生成した：ヒト（ホモ・サピエンス）AXL（Genbankアクセッション番号NP_068713.2）、ヒト細胞外ドメイン（ECD）がカニクイザル（マカカ・ファスシクラリス（Macaca fascicularis））AXLのECD（GenbankアクセッションHB387229.1の翻訳；アミノ酸1～447）で置き換えられたヒト-カニクイザルキメラAXL、ヒトECDがマウス（ハツカネズミ）AXLのECD（GenbankアクセッションNP_033491.2；アミノ酸1～441）で置き換えられたヒト-マウスキメラAXL、ヒトIg様ドメインI（アミノ酸1～134、本明細書において「Ig1ドメイン」とも呼ばれる）がマウスAXLのIg様ドメインIで置き換えられたヒト-マウスキメラAXL、ヒトIg様ドメインII（アミノ酸148～194、本明細書において「Ig2ドメイン」とも呼ばれる）がマウスAXLのIg様ドメインIIにより置き換えられたヒト-マウスキメラAXL、ヒトFNIII様ドメインI（アミノ酸227～329、本明細書において「FN1ドメイン」とも呼ばれる）がマウスAXLのFNIII様ドメインIで置き換えられたヒト-マウスキメラAXL、ヒトFNIII様ドメインII（アミノ酸340～444、本明細書において「FN2ドメイン」とも呼ばれる）がマウスAXLのFNIII様ドメインIIにより置き換えられたヒト-マウスキメラAXL。加えて、種々のAXL ECDバリアント用の以下のコドン最適化構築物を生成した：C末端Hisタグを有するヒトAXLの細胞外ドメイン（ECD）（アミノ酸1～447）（AXLECDHis）、N末端シグナルペプチドおよびC末端Hisタグを有するヒトAXLのFNIII様ドメインII（アミノ酸327～447）（AXL-FN2ECDHis）、ならびに、C末端Hisタグを有するヒトAXLのIg1ドメインおよびIg2ドメイン（アミノ酸1～227）（AXL-Ig12ECDHis）。
構築物は、クローニングに適している制限酵素部位および最適コザック（GCCGCCACC）配列を含有した（Kozak et al., 1999）。構築物を、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.3（Invitrogen）にクローニングした。
EL4細胞におけるAXL発現
EL4細胞に、完全ヒトAXLコード配列を含有するpcDNA3.3ベクターを安定にトランスフェクトして、抗生剤G418（Geneticin）での選択後に、安定なクローンを選択した。
Hisタグ付加AXLの精製
AXLECDHis、AXL-FN2ECDHis、およびAXL-Ig12ECDHisを、HEK-293F細胞において発現させた。Hisタグにより、固定化金属親和性クロマトグラフィーでの精製が可能になる。このプロセスにおいて、クロマトグラフィー樹脂上に固定されたキレーターは、Co2+カチオンを充填している。Hisタグ付加タンパク質を含有する上清を、バッチモード（すなわち、溶液）において樹脂とインキュベートした。Hisタグ付加タンパク質は、樹脂ビーズに強く結合し、他方、培養上清中に存在する他のタンパク質は結合しないか、またはHisタグ付加タンパク質と比較して弱く結合する。インキュベーション後に、ビーズを上清から回収して、カラム中に詰める。弱く結合したタンパク質を除去するために、カラムを洗浄する。次いで、強く結合したHisタグ付加タンパク質を、Co2+に対するHisの結合と競合するイミダゾールを含有する緩衝液で溶出する。脱塩カラム上の緩衝液交換により、溶出剤をタンパク質から除去する。
免疫化
抗体IgG1-AXL-061、IgG1-AXL-107、IgG1-AXL-183、IgG1-AXL-613、およびIgG1-AXL-726は、以下の免疫化に由来した：20μgのAXLECDHisタンパク質（IgG1-AXL-511、IgG1-AXL-613、IgG1-AXL-183）、20μg AXL-FN2ECDHISプラス20μg AXL-Ig12ECDHis（IgG1-AXL-726）、または20μg AXL-Ig12ECDHis（IgG1-AXL-107）で腹腔内に（IP）、および同じタンパク質で皮下に（SC；尾の基部）、14日の間隔で交互に免疫化したHCo12-BalbC（IgG1-AXL-107）、HCo17-BalbC（IgG1-AXL-183、IgG1-AXL-726）、およびHCo20（IgG1-AXL-061、IgG1-AXL-613）トランスジェニックマウス（Medarex, San Jose, CA, USA）。合計で8回の免疫化：4回のIP免疫化および4回のSC免疫化を行った。大部分の免疫化について、最初の免疫化は、完全フロイントアジュバント（CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA）において行い、すべてのその後の免疫化は、不完全フロイントアジュバント（IFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA）において行った。抗体IgG1-AXL-183は、Sigmaアジュバントシステム（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）においてすべて行った免疫化に由来した。
抗体IgG1-AXL-137、IgG1-AXL-148、IgG1-AXL-154、IgG1-AXL-171、およびIgG1-AXL-733は、以下の免疫化に由来した： HCo12-BalbC（IgG1-AXL-137、IgG1-AXL-148）、HCo17-BalbC（IgG1-AXL-154、IgG1-AXL-733）、およびHCo20-BalbC（IgG1-AXL-171）トランスジェニックマウス（Medarex, San Jose, CA, USA）を、CFA中の20μgのAXLECDHisタンパク質で免疫化した。その後、マウスを、PBS中の完全長ヒトAXLをトランスフェクトしたEL4細胞で腹腔内に（IP）、およびIFA中のAXLECDHisタンパク質で皮下に（SC；尾の基部）、14日の間隔で交互に免疫化した。
下記のような抗原特異的スクリーニングFMATアッセイにおいて検出された、200（1/200の血清希釈）またはそれより高い、少なくとも2回の連続したAXL特異的抗体タイターを有するマウスを、融合の3～4日前に追加免疫した（PBS中の10μgのAXL由来タンパク質を静脈内に注射した）。
均質抗原特異的スクリーニングアッセイ
免疫化マウスの血清中、またはHuMab（ヒトモノクローナル抗体）ハイブリドーマもしくはトランスフェクトーマの培養上清中の抗AXL抗体の存在を、Fluorometric Micro volume Assay Technology（FMAT; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いた均質抗原特異的スクリーニングアッセイによって判定した。このために、4細胞ベースアッセイまたは8細胞ベースアッセイのいずれかの組み合わせを有する、2つの異なる試験設計を使用した。
4細胞ベースアッセイ試験設計を、免疫化マウス由来の血清の試験のために、および、ハイブリドーマまたはトランスフェクトーマの培養上清用の一次スクリーニング試験として使用した。4アッセイ試験設計においては、試料を、それぞれ、A431（DSMZ）およびMDA-MB-231細胞（両方とも細胞表面にAXLを発現する）に対するヒト抗体の結合、ならびに、TH1021-AXL（完全長ヒトAXLを一過性に発現するHEK-293F細胞；上記のように産生される）およびHEK293野生型細胞（AXLを発現しない陰性対照）に対する結合について解析した。
ハイブリドーマまたはトランスフェクトーマの培養上清試料を、追加的に、8細胞ベースアッセイ試験設計に供した。8アッセイ試験設計においては、試料を、それぞれ、TH1021-hAXL（ヒトAXLを一過性に発現するHEK-293F細胞）、TH1021-cAXL（ヒトECDがカニクイザルAXLのECDで置き換えられているヒト-カニクイザルAXLキメラを一過性に発現するHEK-293F細胞）、TH1021-mAXL（ヒトECDがマウスAXLのECDで置き換えられているヒト-マウスAXLキメラを一過性に発現するHEK-293F細胞）、TH1021-mIg1（マウスAXLのIg様ドメインIにより置き換えられているIg様ドメインIを有するヒトAXLを一過性に発現するHEK-293F細胞）、TH1021-mIg2（マウスAXLのIg様ドメインIIにより置き換えられているIg様ドメインIIを有するヒトAXLを一過性に発現するHEK-293F細胞）、TH1021-mFN1（マウスAXLのFNIII様ドメインIにより置き換えられているFNIII様ドメインIを有するヒトAXLを一過性に発現するHEK-293F細胞）、TH1021-mFN2（マウスAXLのFNIII様ドメインIIにより置き換えられているFNIII様ドメインIIを有するヒトAXLを一過性に発現するHEK-293F細胞）、およびHEK293野生型細胞（AXLを発現しない陰性対照）に対するヒト抗体の結合について解析した。
試料を、細胞に添加して、AXLに結合させた。その後、HuMabの結合を、蛍光コンジュゲート（ヤギ抗ヒトIgG Fcγ-DyLight649；Jackson ImmunoResearch）を用いて検出した。AXL特異的なヒト化マウス抗体A0704P（HEK-293F細胞において産生）を陽性対照として使用し、HuMabマウスのプールした血清およびChromPureヒトIgG、全分子（Jackson ImmunoResearch）を、それぞれ、陰性対照として使用した。試料を、Applied Biosystems 8200 Cellular Detection System（8200 CDS）を用いてスキャンし、平均蛍光を読み取り値として使用した。カウントが50よりも高く、カウント×蛍光が陰性対照より少なくとも3倍高かった場合に、試料を陽性と述べた。
HuMabハイブリドーマの生成
十分な抗原特異的タイターが生じたHuMabマウス（上記）を屠殺して、脾臓、ならびに腹部大動脈および大静脈に隣接したリンパ節を収集した。脾細胞およびリンパ節細胞のマウス骨髄腫細胞株（SP2.0細胞）への融合を、CytoPulse CEEF 50 Electrofusion System（Cellectis, Paris, フランス）を用いた電気融合により、本質的に製造業者の説明書にしたがって行った。次に、初代ウェルを、ClonePix システム（Genetix, Hampshire, UK）を用いてサブクローニングした。この目的で、特異的な初代ウェルハイブリドーマを、40％ CloneMedia（Genetix, Hampshire, UK）および60％ HyQ 2×完全培地（Hyclone, Waltham, USA）から作製した半固体培地に播種した。サブクローンを、上記のような抗原特異的結合アッセイにしたがって再試験し、IsoCyteシステム（Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA）を用いてスキャンした。さらなる拡大用に、初代ウェルあたり最良の産生クローンを選択するために、Octet（Fortebio, Menlo Park, USA）を用いてIgGレベルを測定した。結果として生じたHuMabハイブリドーマのさらなる拡大および培養を、標準的なプロトコル（例えば、Coligan J.E., Bierer, B.E., Margulies, D.H., Shevach, E.M. and Strober, W., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 2006に記載されている）に基づいて行った。このプロセスに由来するクローンを、PC1021と称した。
精製抗体の質量分析
6ウェルまたはHyperflask段階由来の、抗体を含有するハイブリドーマ上清の小さな0.8 mlアリコートを、Sciclone ALH 3000ワークステーション（Caliper Lifesciences, Hopkinton, USA）上で、プロテインG樹脂を含有するPhyTipカラム（PhyNexus Inc., San Jose, USA）を用いて精製した。PhyTipカラムは、製造業者の説明書にしたがって使用したが、緩衝液を、結合緩衝液PBS（B. Braun, Medical B.V., Oss, オランダ）および溶出緩衝液0.1Mグリシン-HCl pH 2.7（Fluka Riedel-de Haen, Buchs, ドイツ）により置き換えた。精製後に、試料を、2Mトリス-HCl pH 9.0（Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, オランダ）で中和した。あるいは、いくつかの場合、より大きい体積の培養上清を、プロテインA親和性カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。
精製後に、試料を、384ウェルプレート（Waters, 100μl正方形ウェルプレート, パート番号186002631）中に置いた。試料を、37℃で一晩、N-グリコシダーゼFで脱グリコシル化した。DTT（15 mg/ml）を添加（1μl/ウェル）し、37℃で1時間インキュベートした。試料（5または6μl）を、BEH300 C18, 1.7μm, 2.1×50 mmカラムを有するAcquity UPLC（商標）（Waters, Milford, USA）上で、60℃で脱塩した。両方とも0.1％ギ酸（Fluka, カタログ番号56302, Buchs, ドイツ）を含むMQ水およびLC-MSグレードのアセトニトリル（Biosolve, カタログ番号01204101, Valkenswaard, オランダ）を、それぞれ溶出液AおよびBとして使用した。飛行時間型エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルを、陽イオンモードで作動するmicrOTOF（商標）質量分析計（Bruker, Bremen, ドイツ）上で、オンラインで記録した。解析の前に、900-3000 m/zスケールを、ESチューニングミックス（Agilent Technologies, Santa Clara, USA）で較正した。質量スペクトルを、5～80 kDaの間の分子量について探索する最大エントロピーアルゴリズムを用いたDataAnalysis（商標）ソフトウェアv. 3.4（Bruker）でデコンボリューションした。
デコンボリューション後に、すべての試料について結果として生じた重鎖および軽鎖の質量（還元条件下）を、重複する抗体を見出すために比較した。重鎖の比較においては、C末端リジンバリアントの可能性のある存在を考慮に入れた。これにより、固有の抗体の一覧表が結果としてもたらされ、ここで固有とは重鎖および軽鎖の固有の組み合わせとして定義される。重複する抗体が見出された場合には、他の試験由来の結果を使用して、どの抗体が実験を継続するのに最良の材料であるかを決定した。
AXL抗体可変ドメインの配列解析および発現ベクターにおけるクローニング
全RNAを0.2～5×106個のハイブリドーマ細胞から調製して、5'-RACE-相補DNA（cDNA）を、SMART RACE cDNA Amplificationキット（Clontech）を用い、製造業者の説明書にしたがって100 ng全RNAから調製した。VHおよびVLをコードする領域を、PCRにより増幅し、ライゲーション非依存性クローニング（Aslanidis, C. and P.J. de Jong, Nucleic Acids Res 1990;18(20): 6069-74）によってpG1fおよびpKappa発現ベクターにインフレームで直接クローニングした。各抗体について、12種のVLクローンおよび12種のVHクローンを配列決定した。結果として生じた配列を、表4に示す。CDR配列を、IMGT（Lefranc MP. et al., 1999 および Brochet, 2008）にしたがって定義した。正確なオープンリーディングフレーム（ORF）を有するクローンを、さらなる研究および発現のために選択した。見出された重鎖および軽鎖のすべての組み合わせのベクターを、293fectinを用いてFreestyle 商標 293-F細胞に、一過性に共発現させた。
抗体IgG1-AXL-154、IgG1-AXL-183、およびIgG1-AXL-726について、可変ドメイン中に点変異を有する以下のバリアントを生成した：IgG1-AXL-154-M103L、IgG1-AXL-183-N52Q、およびIgG1-AXL-726-M101L。変異体は、Quickchange II変異導入キット（Stratagene）を用いた部位特異的変異導入によって生成した。
AXL対照抗体
実施例のいくつかにおいて、以前に記載されている、AXLに対する比較抗体（IgG1-YW327.6S2）を使用した（EP 2 220 131, U3 Pharma；WO 2011/159980, Genentech）。これらのAXL特異的抗体のVHおよびVLの配列を、pG1fおよびpKappa発現ベクター中にクローニングした。
b12抗体
実施例のいくつかにおいて、gp120特異的抗体である抗体b12（Barbas, 1993）を、陰性対照として使用した。
発現
抗体を、IgG1,κとして発現させた。抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードするプラスミドDNA混合物を、293fectin（Invitrogen, US）を用いてFreestyle HEK293F細胞（Invitrogen, US）に、本質的に製造業者により記載されているように、一過性にトランスフェクトした。
抗体の精製
培養上清を、0.2μmデッドエンドフィルターを通して濾過し、5 mL MabSelect SuReカラム（GE Health Care）上にロードして、0.1 M酢酸ナトリウム-NaOH、pH 3で溶出した。溶出液を、直ちに2Mトリス-HCl、pH 9で中和し、12.6 mM NaH2PO4、140 mM NaCl、pH 7.4（B.Braun）に対して一晩透析した。あるいは、精製に続いて、溶出液をHiPrep脱塩カラム上にロードして、抗体を12.6 mM NaH2PO4、140 mM NaCl、pH 7.4（B.Braun）緩衝液中に交換した。透析または緩衝液の交換の後、試料を、0.2μmデッドエンドフィルターを通して滅菌濾過した。純度をSDS-PAGEにより測定し、IgG濃度をOctet（Fortebio, Menlo Park, USA）を用いて測定した。精製抗体は、4℃で保存した。
抗体IgG1-AXL-511を、以下の方法により生成した。
AXL用の発現構築物
種々の完全長AXLバリアントの発現用の以下のコドン最適化構築物を生成した：ヒト（ホモ・サピエンス）AXL（Genbankアクセッション番号NP_068713.2）、ヒト細胞外ドメイン（ECD）がカニクイザル（マカカ・ファスシクラリス）AXLのECD（GenbankアクセッションHB387229.1の翻訳；アミノ酸1～447）で置き換えられたヒト-カニクイザルキメラAXL、ヒトECDがマウス（ハツカネズミ）AXLのECD（GenbankアクセッションNP_033491.2；アミノ酸1～441）で置き換えられたヒト-マウスキメラAXL、ヒトIg様ドメインI（アミノ酸1～147、本明細書において「Ig1ドメイン」とも呼ばれる）がマウスAXLのIg様ドメインIで置き換えられたヒト-マウスキメラAXL、ヒトIg様ドメインII（アミノ酸148～227、本明細書において「Ig2ドメイン」とも呼ばれる）がマウスAXLのIg様ドメインIIにより置き換えられたヒト-マウスキメラAXL、ヒトFNIII様ドメインI（アミノ酸228～326、本明細書において「FN1ドメイン」とも呼ばれる）がマウスAXLのFNIII様ドメインIで置き換えられたヒト-マウスキメラAXL、ヒトFNIII様ドメインII（アミノ酸327～447、本明細書において「FN2ドメイン」とも呼ばれる）がマウスAXLのFNIII様ドメインIIにより置き換えられたヒト-マウスキメラAXL。加えて、種々のAXL ECDバリアント用の以下のコドン最適化構築物を生成した：C末端Hisタグを有するヒトAXLの細胞外ドメイン（ECD）（アミノ酸1～447）（AXLECDHis）、N末端シグナルペプチドおよびC末端Hisタグを有するヒトAXLのFNIII様ドメインII（アミノ酸327～447）（AXL-FN2ECDHis）、ならびに、C末端Hisタグを有するヒトAXLのIg1ドメインおよびIg2ドメイン（アミノ酸1～227）（AXL-Ig12ECDHis）。
構築物は、クローニングに適している制限酵素部位および最適コザック（GCCGCCACC）配列を含有した（Kozak et al. (1999) Gene 234: 187-208）。構築物を、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.3（Invitrogen）にクローニングした。
EL4細胞におけるAXL発現
EL4細胞に、完全長ヒトAXLコード配列を含有するpcDNA3.3ベクターを安定にトランスフェクトして、抗生剤G418（Geneticin）での選択後に、安定なクローンを選択した。
Hisタグ付加AXLの精製
AXLECDHis、AXL-FN2ECDHis、およびAXL-Ig12ECDHisを、HEK293F細胞において発現させ、固定化金属親和性クロマトグラフィーで精製した。
免疫化
ヒト抗体遺伝子配列を発現する4種のトランスジェニックマウス由来の材料を、抗体を選択するために使用した。種々の免疫化プロトコルで免疫化して、種々の抗体応答を有し、伝統的なハイブリドーマプロセスから種々の数の抗体を生じるマウスを選択した。マウスA（ハイブリドーマプロセスにおいて3.5％のヒット）は、HCo17-BALB/cトランスジェニックマウス（Bristol-Myers Squibb, Redwood City, CA, USA）であり、20μg AXL-FN2ECDHISプラス20μg AXL-Ig12ECDHisで腹腔内に（IP）、および同じタンパク質で皮下に（SC；尾の基部）、14日の間隔で交互に免疫化した。合計で8回の免疫化：4回のIP免疫化および4回のSC免疫化を行った。大部分の免疫化について、最初の免疫化は、完全フロイントアジュバント（CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA）において行い、すべてのその後の免疫化は、不完全フロイントアジュバント（IFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA）において行った。マウスB（ハイブリドーマプロセスにおいて0％のヒット）は、マウスAと同様の免疫化プロトコルを用いて、20μgのAXLECDHisタンパク質で免疫化したHCo12トランスジェニックマウス（Medarex）であった。マウスC（ハイブリドーマプロセスにおいて38％のヒット）は、PBS中の完全長ヒトAXLをトランスフェクトしたEL4細胞で腹腔内に（IP）、およびIFA中のAXLECDHisタンパク質で皮下に（SC；尾の基部）、14日の間隔で交互に免疫化したHCo12-BALB/cマウスであった。マウスD（ハイブリドーマプロセスにおいて0％のヒット）は、マウスAと同様の免疫化プロトコルを用いて、20μgのAXL-Ig12ECDHisタンパク質で免疫化したHCo12トランスジェニックマウス（Medarex）であった。
200（1/200の血清希釈）またはそれより高い、少なくとも2回の連続したAXL特異的抗体タイターを有するマウスを、融合の3～4日前に追加免疫した（PBS中の10μgのAXL由来タンパク質を静脈内に注射した）。
脾臓細胞からのRNAの単離
全RNAを、Mini RNA easyキット（Qiagen）を用いて脾臓細胞から単離した。5'-RACE用のファーストストランドcDNAを、150 ngのRNAを用い、SMART RACE cDNA Amplificationキット（Clontech, Mountain View, CA, USA）、PrimeScript Reverse Transcriptase（Clontech）、ならびにプライマーとしてSMART IIAオリゴおよびオリゴdTを用いて合成した。VLをコードする領域を、Advantage 2ポリメラーゼ（Clontech）、プライマーRACEkLIC4短FW2（320 nM）、RACEkLIC4長FW2（80 nM）、およびRACEkLICRV_PmlA3（400 nM）を用い、95℃で30秒、および68℃で1分の35サイクルを行うPCRによって増幅した。VHをコードする領域を、Pfu Ultra II Fusion HS DNAポリメラーゼ（Stratagene）、プライマーRACEG1LIC3短FW（320 nM）、RACEG1LIC3長FW（80 nM）、およびRACEG1LIC3RV2（400 nM）を用い、95℃で20秒、66℃で20秒、および72℃で30秒の40サイクルを行って、72℃で3分の最終的な伸長工程で終わるPCRによって増幅した。VHまたはVLをコードするPCR産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、期待されるサイズのDNA産物をゲルから切って、Qiagen MiniEluteキットを用いて精製した。PCRによって増幅されたVHおよびVLのコード領域を、哺乳動物発現ベクターである、VH領域用のpG1f（ヒトIgG1定常領域をコードするDNA配列を含有する）およびVL領域用のpKappa（κ軽鎖定常領域をコードするDNA配列を含有する）にインフレームで、大腸菌株DH5αT1R（Life technologies）におけるライゲーション依存性クローニング（Aslanidis, C. and P.J. de Jong, Nucleic Acids Res 1990;18(20): 6069-74）によってクローニングし、単一のHCまたはLC発現ベクターを各々含有する単一の細菌コロニーを生じた。
プライマー配列
Figure 2024038480000020
LEE PCR
直鎖状発現エレメント（LEE）を、CMVプロモーター、HCまたはLCをコードする領域、およびポリAシグナル含有エレメントを含有する断片を発現プラスミドから増幅することによって産生した。このために、Accuprime Taq DNAポリメラーゼ（Life Technologies）、ならびにプライマーCMVPf(Bsal)2およびTkpA(Bsal)rを用いて、94℃で45秒、55℃で30秒、および68℃で2分（LC）または3分（HC）の35サイクルを行い、DNA鋳型としてプラスミドを含有する大腸菌（DH5α株）コロニーの材料を用いて、領域を増幅した。
HEK-293細胞における一過性発現
抗体を、IgG1,κとして発現させた。抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードするプラスミドDNA混合物を、本質的にVink, T., et al. (2014) ('A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies', Methods, 65 (1), 5-10)により記載されているように、293fectin（Life technologies）を用いてFreestyle 293-F（HEK293F）細胞（Life technologies, USA）に、一過性にトランスフェクトした。
AbのLEE発現のために、1μlのHC LEE PCR反応混合物、1μlのLC PCR反応混合物、および、1μlの、Vink, T., et al. (2014)に記載されている3種の発現増強プラスミドのミックスを含有する30 ng/μl増強ミックスを混合して、本質的に上に記載されているように、容器として96ウェルプレートを用いて、トランスフェクション試薬として293fectinを用い、製造業者（Life technologies）の説明書にしたがって、100μlの総体積においてHEK293F細胞にトランスフェクトした。
AXLECDHis ELISA
ELISAプレート（Greiner, オランダ）を、100μl／ウェルのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の0.5μg/ml AXLECDHisでコーティングし、室温（RT）で16時間インキュベートした。コーティング溶液を除去して、150μl PBSTC（0.1％ tween-20および2％ニワトリ血清を含有するPBS）をウェルに添加し、RTで1時間インキュベートすることによって、ウェルをブロッキングした。プレートを、300μl PBST（0.1％ tween-20を含有するPBS）／ウェルで3回洗浄して、100μlの試験溶液を添加し、その後RTで1時間のインキュベーションを行った。300μlのPBST／ウェルで3回洗浄した後、100μlの西洋ワサビペルオキシダーゼとカップリングした抗体ヤギ抗ヒトIgG（1/3000に希釈）を添加して、RTで1時間インキュベートした。300μlのPBST／ウェルで3回洗浄した後、100μlのABTS（1mg/ml）溶液を添加し、十分なシグナルが観察されるまでRTでインキュベートして、100μlの2％シュウ酸溶液を添加することによって反応を停止した。96ウェルプレートを、ELISAリーダー上で405 nmで測定した。
多様性スクリーニング
試料を、それぞれ、TH1021-hAXL（ヒトAXLを一過性に発現するHEK293F細胞）、TH1021-cAXL（ヒトECDがカニクイザルAXLのECDで置き換えられているヒト-カニクイザルAXLキメラを一過性に発現するHEK293F細胞）、TH1021-mAXL（ヒトECDがマウスAXLのECDで置き換えられているヒト-マウスAXLキメラを一過性に発現するHEK293F細胞）、TH1021-mIg1（マウスAXLのIg様ドメインIにより置き換えられているIg様ドメインIを有するヒトAXLを一過性に発現するHEK293F細胞）、TH1021-mIg2（マウスAXLのIg様ドメインIIにより置き換えられているIg様ドメインIIを有するヒトAXLを一過性に発現するHEK293F細胞）、TH1021-mFN1（マウスAXLのFNIII様ドメインIにより置き換えられているFNIII様ドメインIを有するヒトAXLを一過性に発現するHEK293F細胞）、TH1021-mFN2（マウスAXLのFNIII様ドメインIIにより置き換えられているFNIII様ドメインIIを有するヒトAXLを一過性に発現するHEK293F細胞）、およびHEK293F細胞（AXLを発現しない陰性対照）に対する抗体の結合について解析した。
LEE発現由来の試料を、細胞に添加して、種々のAXL構築物に結合させた。その後、抗体の結合を、蛍光コンジュゲート（ヤギ抗ヒトIgG Fcγ-DyLight649；Jackson ImmunoResearch）を用いて検出した。試料を、Applied Biosystems 8200 Cellular Detection System（8200 CDS）を用いてスキャンし、平均蛍光を読み取り値として使用した。カウントが50よりも高く、カウント×蛍光が陰性対照より少なくとも3倍高かった場合に、試料を陽性と述べた。
HCおよびLCプールの提供：
各マウスについて、352種のHC発現ベクターを含有する細菌コロニーおよび384種のLC発現ベクターを含有する細菌コロニーを選んで、LEE PCRにより増幅した。LEE反応物の一部を配列解析した（AGOWA）。妥当なVHインサートを含有する構築物のパーセンテージは、4種のマウスの間で、マウスA（50％）、マウスB（23％）、マウスC（90％）、およびマウスD（14％）と大きく異なっており、上記を参照されたいハイブリドーマプロセスにおいて得られたヒットの変動に似ていた。限定された量の妥当なインサートのみを有するマウスにおけるHCの多様性は、同一のHCの大きな群によって支配されており、マウスBにおいて65/83、およびマウスDにおいて46/49であった。マウスBおよびDについて、固有のHC（マウスBについて9種、マウスDについて4種）を選択した。マウスAおよびCについては選択を行わなかった。
HCとLCプールとの共トランスフェクション
単一のHCをコードするLEEを、96種のLCをコードするLEEのプールと、LEEトランスフェクションプロトコルを用いて共トランスフェクトした。
AXL結合抗体のHC選択
マウスBおよびDについて、単一HCとプールしたLCとのLEE共トランスフェクション由来の上清を、産生された抗体混合物のAXL結合についてAXL ELISAにより解析した。マウスB由来の9種のHCのうち7種が、AXL結合を結果としてもたらし、マウスD由来の4種のHCのうちの4種が、AXL結合を結果としてもたらした。
マウスAおよびCについて、単一HCとプールしたLCとのLEE共トランスフェクション由来の上清を、産生された抗体混合物のAXL結合について多様性スクリーニングにより解析した。このスクリーニングによって、AXLバリアントに対する抗体の結合の喪失を特定することによる、AXL結合HCの特定および大まかなエピトープマッピングの両方が可能になった。マウスAからは、HCのおよそ40％がヒトAXLに結合し、そのうちの大部分は、Ig1またはFNIII-2ドメインのいずれかに対する結合を、これらのドメインがマウス同等物により置き換えられた際に失った。マウスCからは、HCのおよそ70％がヒトAXLに結合し、そのうちの大部分は、Ig1またはIg2ドメインのいずれかに対する結合を、これらのドメインがマウス同等物により置き換えられた際に失った。AXL ELISAまたは多様性スクリーニングにより測定されるような結合、HC配列情報、および多様性スクリーニングにおける特異的なAXLドメインに対する結合の喪失に基づいて、合計で12種の固有のHCを、最良のLCの決定のために選択した。
HCの単一LCとの共トランスフェクション
12種の固有の選択されたHCの各々の単一HC LEEを、対応するマウスのLCプール由来の96種の単一LC LEEと共トランスフェクトした。
AXL結合抗体のLC選択
単一HC/LCの組み合わせのLEE発現の上清を、産生された抗体のAXL結合についてAXL ELISAにより解析した。ELISAの結果およびLC配列情報の両方に基づいて、各HCについて、少なくとも6種のLCが見出され、単一のLCが最良として選択された。マウスがハイブリドーマプロセスにおいて成功していなかった場合でさえ、AXL結合抗体は、4匹全部のマウスから同定された。
抗体511の結合親和性
1つの抗AXL抗体（クローン511）の親和性を測定した。
親和性を、ForteBio OctetRED384上でバイオレイヤー干渉法を用いて測定した。抗ヒトFc Capture（AHC）バイオセンサー（ForteBio, Portsmouth, UK; カタログ番号18-5064）に、1 nmの負荷応答を目標にして、hIgG（1μg/mL）を150秒間負荷した。ベースライン（150秒）後に、AXLECDHis（実施例1に記載されている）の会合（1000秒）および解離（2000秒）を、2倍希釈工程で10μg/mL～0.16μg/mL（218 nM～3 nM）の濃度範囲を用いて測定した。算出のために、アミノ酸配列に基づくAXLECDHisの理論的な分子量、すなわち46 kDaを使用した。実験を、1000 rpmで振盪しながら、30℃で、OctetRED384上で実施した。各抗体を、3回の独立した実験において試験した。
データを、別の方法で述べない限り、1000秒の会合時間および1000秒の解離時間での1:1モデルおよびグローバルフルフィットを用いて、ForteBio Data Analysis Software v7.0.3.1で解析した。（獲得された2000秒の解離時間の代わりに）1000秒の解離時間を、これがより良好なフィットを結果としてもたらしたために使用した。データ追跡を、参照曲線（AXLECDHisを含まない抗体）を引くことによって補正し、Y軸をベースラインの最後の5秒に整列させ、工程間（interstep）補正およびサビツキー・ゴーレイ（Savitzky-Golay）フィルタリングを適用した。
クローン511のAXLに対する親和性（KD）は、23*10-9M（kオン 1.7*105 1/Msおよび3.9*10-3 1/sのk解離）であった。
デュオスタチン-3合成
化合物3の調製：
Figure 2024038480000021
30 mLの塩化メチレン（DCM）中のBoc-L-フェニルアラニン1（5.36 g、20.2 mmol）の溶液に、カルボニルジイミダゾール（CDI、4.26 g、26.3 mmol）を添加して、1時間撹拌した。次いで、15 mLのDCM中の2（3.67 g、30.3 mmol）および2,4-ジアミノ酪酸（DBU、4.5 mL、30 mmol）の溶液を添加した。混合物を、40℃で16時間加熱した、混合物を、60 mLのDCMおよび40 mLの水で希釈し、次いで、濃HClでpH 7に中和した。DCM抽出物を収集して、0.2M HCl（60 mL）で、次いで塩水（60 mL）で洗浄し、Na2SO4の上で乾燥し、蒸発させて、7.47 gのBoc保護されたスルホンアミドを生み出した。この材料を、40 mLのメタノールに懸濁し、次いで、200 mLの6N HCl／イソプロパノールを添加して、混合物を2時間撹拌した。溶媒を、真空下で蒸発させ、次いで、100 mLのエーテルを添加した。沈殿を、濾過により収集し、乾燥して、化合物3をHCl塩（5.93 g、96％）；MS m/z 269.1（M+H）として生み出した。
化合物5の調製：
Figure 2024038480000022
10 mLのN,N-ジメチルホルムアミド（DMF）中の化合物4（1.09 g、1.6 mmol）の溶液に、2-(1H-7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウラニウムヘキサフルオロホスファート（HATU、0.61 g、1.6 mmol）、ジイソプロピルエチルアミン（DIEA、0.56 mL）、および化合物3（0.49 g、1.6 mmol）をその順序で添加した。混合物を1時間撹拌して、100 mLの水および4 mLの酢酸で希釈した。沈殿を、濾過により収集し、真空下で乾燥して、10 mLの4M HCl／ジオキサンに添加した。30分後、200 mLのエーテルを添加して、不溶性沈殿を収集し、HPLCにより精製して、化合物5をテトラヒドロフラン塩（TFA、1.3 g、88％）；MS m/z 835.5 (M+H)として生み出した。化合物5を、本原稿を通してデュオスタチン-3と呼ぶ。
化合物7の調製：
Figure 2024038480000023
5 mLのDMF中の化合物5（500 mg、0.527 mmol）の溶液に、化合物6（483 mg、0.631 mmol）、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt、40 mg、0.296 mmol）、およびDIEA（0.27 mL）を添加した。混合物を16時間撹拌し、その後、0.4 mLのピペリジンを添加した。1時間後、混合物を100 mLのエーテルで希釈して、沈殿を収集し、乾燥して、化合物7をHCl塩（640 mg、95％）；MS m/z 1240.7 (M+H)として生み出した。
化合物9の調製：
Figure 2024038480000024
5 mLのDMF中の化合物8（219 mg、0.62 mmol）の溶液に、HATU（236 mg、0.62 mmol）、DIEA（0.15 mL）、および化合物7（316 mg、1.6 mmol）をそれぞれ添加した。1時間後、0.2 mLのピペリジンを添加して、混合物を30分間撹拌し、次いで、HPLCにより精製して、化合物9をTFA塩（235 mg、64％）；MS m/z 1353.8 (M+H)として生み出した。
化合物11の調製：
Figure 2024038480000025
2 mLのメタノールおよび1 mLの水中の化合物9（235 mg、0.16 mmol）の溶液に、ジアルデヒド10（1.6 mLのiPrOH中0.3M）およびNaCNBH3（180 mg、2.85 mmol）の溶液を添加した。混合物をRTで2時間撹拌し、次いで、HPLCにより精製して、化合物11をTFA塩（126 mg、50％）；MS m/z 1465.8 (M+H)として生じさせた。
AXL特異的抗体-薬物コンジュゲート（ADC）の生成
精製AXL抗体IgG1-AXL-148、IgG1-AXL-183、およびIgG1-AXL-726、ならびに陰性対照抗体IgG1-b12を、K-lock AV1-バリン-シトルリン（vc）リンカーを用いた共有結合性コンジュゲーションを通して、Concortis Biosystems, Inc.（San Diego, CA）によりデュオスタチン-3とコンジュゲートした（Concortis Biosystemsによる、WO 2013/173391、WO 2013/173392、および WO 2013/173393）。
抗AXL抗体薬物コンジュゲートを、その後、濃度（280 nmでの吸光度により）、逆相クロマトグラフィー（RP-HPLC）および疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）により薬物対抗体の比（「DAR」）、コンジュゲートされていない薬物の量（逆相クロマトグラフィーにより）、凝集のパーセンテージ（サイズ排除クロマトグラフィー、SEC-HPLCにより）、ならびにエンドドキシンレベル（LALにより）について解析した。結果は、以下のようであった（表5）。
（表５）
Figure 2024038480000026
実施例2‐AXL抗体の結合特性
AXL抗体の結合親和性
9種の抗AXL抗体、ならびに可変ドメイン中に単一のアミノ酸変異を有するこれらの抗体の3種のバリアント（IgG1-AXL-154-M103L、IgG1-AXL-183-N52Q、IgG1-AXL-726-M101L）のパネルの親和性を測定した。
親和性を、ForteBio OctetRED384上でバイオレイヤー干渉法を用いて測定した。抗ヒトFc Capture（AHC）バイオセンサー（ForteBio, Portsmouth, UK；カタログ番号18-5064）に、1 nmの負荷応答を目標にして、hIgG（1μg/mL）を150秒間負荷した。ベースライン（150秒）後に、AXLECDHis（実施例1に記載されている）の会合（1000秒）および解離（2000秒）を、2倍希釈工程で10μg/mL～0.16μg/mL（218 nM～3 nM）の濃度範囲を用いて測定した。算出のために、アミノ酸配列に基づくAXLECDHisの理論的な分子量、すなわち46 kDaを使用した。実験を、1000 rpmで振盪しながら30℃で、OctetRED384上で実施した。各抗体を、3回の独立した実験において試験した。
データを、別の方法で述べない限り、1000秒の会合時間および1000秒の解離時間での1:1モデルおよびグローバルフルフィットを用いて、ForteBio Data Analysis Software v7.0.3.1で解析した。（獲得された2000秒の解離時間の代わりに）1000秒の解離時間を、これがより良好なフィットを結果としてもたらしたために使用した。抗体IgG1-AXL-154およびIgG1-AXL-154-M103Lについては、500秒の解離時間を使用した。IgG1-AXL-012およびIgG1-AXL-094については、200秒の解離時間を使用した。データ追跡を、参照曲線（AXLECDHisを含まない抗体）を引くことによって補正し、Y軸をベースラインの最後の5秒に整列させ、工程間補正およびサビツキー-ゴーレイフィルタリングを適用した。
抗AXL抗体の親和性（KD）は、0.3*10-9M～63*10-9Mの範囲であった（表6）。変異体IgG1-AXL-183-N52Qについて、KDは、およそ2.5倍高い解離速度のために、野生型IgG1-AXL-183よりも低かった。他の2種の変異体の観察された速度論は、野生型IgGの速度論に類似していた。
（表６）
Figure 2024038480000027
ヒト、マウス、およびカニクイザルAXLに対するAXL抗体の結合
HEK293T細胞に、完全長ヒトAXL、カニクイザル細胞外ドメイン（ECD）を有するヒトAXL、またはマウスECDを有するヒトAXL用の発現構築物を一過性にトランスフェクトした（実施例1を参照されたい）。これらの細胞に対するHuMab-AXL抗体の結合を、フローサイトメトリーにより評定した。トランスフェクトしたHEK293細胞を、AXL抗体の連続希釈液（最終濃度範囲0.0024～10μg/mL）と4℃で30分間インキュベートした。PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で3回洗浄した後、細胞を、PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で1/100に希釈したR-フィコエリスリン(PE)コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA；カタログ番号109-116-098）とインキュベートした（最終体積100μL）。次に、細胞を、PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で2回洗浄し、120μL PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中に再懸濁して、FACS Cantoll（BD Biosciences）上で解析した。
結合曲線を、GraphPad Prism V5.04ソフトウェア（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を使用し、非線形回帰（可変の勾配を有するシグモイド用量応答）を用いて解析した。
図1Aは、HuMab-AXL抗体が、ヒトAXL-ECDを発現するHEK293細胞に対して用量依存性結合を示したことを示す。さらに、HuMab-AXL抗体は、完全ヒトAXLについてと同じ範囲のEC50値で、カニクイザルECDを有するAXLを認識した（図1B）。対照的に、マウスECDを有するAXLに対するHuMabの結合は低かった（IgG1-AXL-107、IgG1-AXL-154、IgG1-AXL-154-M103L、IgG1-AXL-733、IgG1-AXL-183、IgG1-AXL-183-N52Q）か、または検出可能でなかった（IgG1-AXL-171、IgG1-AXL-613、IgG1-AXL-726、IgG1-AXL-726-M101L、IgG1-AXL-148；図1C）。期待されたように、陰性対照抗体IgG1-b12は、AXLバリアントのいずれを発現する細胞に対しても結合を示さなかった（図1）。表7は、ヒトAXLまたはカニクイザルAXL ECDを有するヒトAXLに対する抗AXL抗体の結合についてのEC50値および標準偏差（少なくとも3回の実験において決定された）を示す。マウスAXL ECDを有するヒトAXLに対する結合についてのEC50値は、非常に低いか、または欠如している結合のために決定できなかった。
（表７）
Figure 2024038480000028
AXL結合についてのAXL抗体とGas6との間の競合
AXLリガンドであるGas6が、AXLに対するAXL抗体の結合を干渉するかどうかを試験した。そのために、AXL陽性A431細胞を、10μg/mLの組み換えヒトGas6（R&D Systems, Abingdon, UK；カタログ番号885-GS）と4℃で15分間インキュベートした。その後、AXL抗体の連続希釈液を調製し（最終濃度範囲0.014～10μg/mL）、細胞に添加して、4℃で30分間インキュベートした。PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で3回洗浄した後、細胞を、100μLにおいて二次抗体と4℃で30分間、暗所でインキュベートした。Fc領域に結合する二次抗体として、PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で1/100に希釈したR-フィコエリスリン(PE)コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA；カタログ番号109-116-098）を使用した。次に、細胞を、PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で2回洗浄し、120μL PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中に再懸濁して、FACS Cantoll（BD Biosciences）上で解析した。
あるいは、AXLリガンドであるGas6が、AXL抗体の存在下で依然として結合できるかどうかを評価するために、A431細胞を、10μg/mLのAXL抗体とプレインキュベート（15分、4℃）した。抗体のプレインキュベーション後に、組み換えヒトGas6（R&D Systems, Abingdon, UK；カタログ番号885-GS）の連続希釈液を、0.001～20μg/mLの最終濃度で細胞に添加して、4℃で30分間インキュベートした。PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で3回洗浄した後、細胞を、マウス抗Gas6 IgG2a（R&D Systems；カタログ番号MAB885）と4℃で30分間インキュベートした。PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で3回洗浄した後、細胞を、FITC標識ヤギ抗マウスIgG（Dako, Heverlee, ベルギー；カタログ番号F049702）と4℃で30分間、暗所でインキュベートした。次に、細胞を、PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で2回洗浄し、120μL PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中に再懸濁して、FACS Cantoll（BD Biosciences）上で解析した。
結合曲線を、GraphPad Prism V5.04ソフトウェア（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を使用し、非線形回帰（可変の勾配を有するシグモイド用量応答）を用いて解析した。
A431細胞をGas6とプレインキュベートした実験（n＝3）において、抗AXL抗体の最大結合値は、Gas6の非存在下での抗体結合に匹敵していた（Gas6プレインキュベーション後の最大結合は、Gas6プレインキュベーションを伴わない結合の90～108％であった）（表7）。Gas6プレインキュベーションを伴うかまたは伴わないAXL抗体結合についてのEC50値は、同じ範囲であったか、または、Gas6プレインキュベーション後にいくらか増強されていた（表8）。
A431細胞に対する対照AXL抗体YW327.6S2の結合は、Gasを伴わない結合と比較して、Gas6の存在下で大きく低減した。Gas6の存在下でのYW327.6S2の最大結合は、Gas6を伴わない結合の19％であり、A431細胞に対する結合についてのEC50値は、細胞をGas6とプレインキュベートしていた際に21倍高かった。
A431細胞を抗AXL抗体とプレインキュベートした実験において、Gas6結合を評定した（n＝3）。A431細胞に対するGas6の結合は、HuMab-AXL抗体とのプレインキュベーションを伴うかまたは伴わない場合で類似していた。細胞をHuMab（0.34～0.83μg/mL）とプレインキュベートした際のGas6結合の平均EC50濃度、および最大Gas6結合は、陰性対照抗体b12の存在下でのGas6結合に類似していた（EC50濃度：0.40μg/mL；b12対照抗体の存在下でのGas6結合の95～115％）。A431細胞に対するGas6の結合は、b12とのプレインキュベーションと比較して、対照AXL抗体YW327.6S2の存在下で大きく低減した（EC50濃度は14倍高かった）。対照抗体YW327.6S2の存在下でのGas6の最大結合は、陰性対照抗体b12の存在下での結合の17％であった。
（表８）
Figure 2024038480000029
an.a.、適用不可能
*低い結合のためにEC50は精度が低い値である。
実施例3‐抗AXL抗体パネルのエピトープマッピング研究
ヒト-マウスAXLキメラ分子を用いたAXLドメイン特異性の測定
AXL抗体のAXLドメイン特異性を、ヒト-マウスキメラAXL変異体のパネルを用いて測定した。ヒトIg様ドメインI（Ig1）、Ig様ドメインII（Ig2）、ヒトFNIII様ドメインI（FN1）、またはヒトFNIII様ドメインIIドメイン（FN2）のいずれかがそれらのマウスホモログで置き換えられた、5種の異なるキメラAXL分子を生成した。
実施例1に記載されているように、AXLヒト-マウスキメラの発現用の以下のコドン最適化構築物を生成して、HEK293F細胞において発現させた。
ヒト（Homo sapiens）AXL（p33-HAHs-AXL）：（SEQ ID NO: 148）
Figure 2024038480000030
マウス（Mus musculus）AXL（p33-HAMm-AXL）：（SEQ ID NO: 149）
Figure 2024038480000031
ヒト（Homo sapiens）AXL - マウス（Mus musculus）Ig1ドメイン（p33-AXL-mIg1）：（SEQ ID NO: 150）
Figure 2024038480000032
ヒト（Homo sapiens）AXL - マウス（Mus musculus）Ig2ドメイン（p33-AXL-mIg2）：（SEQ ID NO: 151）
Figure 2024038480000033
ヒト（Homo sapiens）AXL - マウス（Mus musculus）FN1ドメイン（p33-AXL-mFN1）：（SEQ ID NO: 152）
Figure 2024038480000034
ヒト（Homo sapiens）AXL - マウス（Mus musculus）FN2ドメイン（p33-AXL-mFN2）：（SEQ ID NO: 153）
Figure 2024038480000035
実施例2に記載されているように、ヒト-マウスAXLキメラに対する1μg/mL抗AXL抗体の結合を、フローサイトメトリーにより測定した。IgG1-b12を、アイソタイプ対照IgG1として含めた。
すべての抗AXL抗体が、ヒトAXLに対する結合を示した（図2A）のに対して、ヒトAXL ECDがそのマウスホモログで置き換えられた際には、結合は撤廃されたか、または強く低減した（図2B）。ヒト-マウス交差反応性モノクローナルAXL抗体であるYW327.6S2を、hsAXL-mmECDの発現を確認するために含めた。
抗AXL抗体107および613は、hsAXL-mmIg1に対して強く低減した結合を示し（図2C）、AXL Ig1ドメイン中のエピトープの認識が示された。IgG1-AXL-148およびIgG1-AXL-171は、hsAXL-mmIg2に対して強く低減した結合を示し（図2D）、AXL Ig2ドメイン中のエピトープの認識が示された。IgG1-AXL-154、IgG1-AXL-183、およびIgG1-AXL-733は、hsAXL-mmFN1に対して低減した結合を示し（図2E）、AXL FN1ドメイン中の結合エピトープを示した。最後に、IgG1-AXL-726の結合は、hsAXL-mmFN2において失われ（図2F）、FN2ドメイン内のエピトープの認識が示された。
すべての抗AXL抗体についてのAXLドメイン特異性を、表9に要約する。
（表９）
Figure 2024038480000036
an.d.、未決定
AXL抗体の結合に関与するAXL細胞外ドメイン中のアミノ酸を特定するための高分解能エピトープマッピング
抗AXL抗体の結合に関与するAXL細胞外ドメイン中のアミノ酸を特定するために、細胞外ドメイン中にヒトAXL配列と変動するレベルの相同性を有する種に由来するAXL配列の組み換えによって、AXL配列バリアントのライブラリーを生成した。簡潔に言うと、ヒトAXL（Hs）をコードする発現プラスミドを、ハツカネズミ（Mm）、ハイイロジネズミオポッサム（Monodelphis domestica）（Md；フクロネズミ）、グリーンアノール（Anolis carolinensis）（Ac；トカゲ）、およびミドリフグ（Tetraodon nigroviridis）（Tn；フグ）のAXLホモログをコードするクローニングプラスミドと混合するか、またはその逆を行った。クローニングベクターまたは発現ベクターのいずれかに特異的な2種のプライマーの組み合わせを使用して、PCRサイクリング中に新生DNA複製鎖の融解およびリアニーリングを強要する、伸長時間が省略された、AXL細胞外ドメイン（ECD）を増幅するPCRを行った。両方のベクターから生じた終端を含有する組み換え産物に再び特異的な、ネスティッドPCRを用いて、完全長ECDを増幅した。
結果として生じたAXL ECD PCR産物を、完全長AXLを創り出す発現ベクター中にクローニングし、結果として生じたプラスミドを、配列決定し、鋳型ベクターに対する最大の差によってランク付けし、最大の差別化力を有する最小の集合を創り出すように選択した。Hs、Mm、Md、Ac、およびTn由来のAXLホモログをコードするプラスミド、マウスIg1、Ig2、Fn1、またはFn2ドメインを有するHs AXLをコードする4種のヒト／マウスキメラプラスミド、ならびに組み換えライブラリー由来の16種の最も差別化するプラスミドを、製造業者（Life technologies）により供給された仕様書にしたがって、HEK293-F細胞中にトランスフェクトした。1μg/mLの抗AXL抗体を用いたFACS結合データを、変異が結合の喪失と相関した（+1）か、または相関しなかった（-1）かをアミノ酸あたりでスコア化することによってデコンボリューションし、その後、ベースライン補正および-5～+5のスケールへの正規化を適用して、完全ECDにわたるアミノ酸あたりのインパクトスコアを結果として生じた。
デコンボリューションした結合データを、結合に関与するアミノ酸として表9に要約する。結合部位の近傍での組み換え事象が欠如していたために、結合部位を高分解能でマップできなかった抗体を、分離されていないとして示す。
実施例4‐Fc媒介性エフェクター機能
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）
A431類表皮癌細胞のADCCを誘導する抗AXL抗体の能力を、下記に説明するように測定した。エフェクター細胞として、健常ボランティア由来の末梢血単核細胞（UMC Utrecht, オランダ）を使用した。
標的細胞の標識
A431細胞を、培養培地（10％ウシ胎児血清（FSC）を補給したRPMI 1640培養培地）中に収集（5×106細胞）して、それに100μCi 51Cr（クロム-51；Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, オランダ）を添加し、混合物を、37℃の水浴において1時間（hr）、振盪しながらインキュベートした。細胞の洗浄（PBS中で2回、1200 rpm、5分）後に、細胞を、RPMI1640/10％ FSC中に再懸濁して、トリパンブルー排除により計数した。細胞を、1×105細胞／mLの密度に希釈した。
エフェクター細胞の調製
末梢血単核細胞（健常ボランティア、UMC Utrecht, Utrecht, オランダ）を、Ficoll（Bio Whittaker；リンパ球分離媒体、カタログ17-829E）により製造業者の説明書にしたがって、45 mLの新しく採取したヘパリン血から単離した。細胞のRPMI1640/10％ FSC中への再懸濁後に、細胞を、トリパンブルー排除により計数し、1×107細胞／mLの密度に希釈した。
ADCCの設定
50μlの51Cr標識標的細胞を、96ウェルプレート中にピペットで移し、RPMI1640/10％ FSC中に希釈した（最終濃度範囲0.01～10μg/mLの3倍希釈液）50μLの抗体を添加した。細胞をインキュベート（室温（RT）、15分）して、50μlのエフェクター細胞を添加し、100:1のエフェクター対標的比を結果として生じた（最大溶解の決定のために、エフェクター細胞の代わりに100μlの5％ Triton-X100を添加し；自然溶解の決定のために、50μLの標的細胞および100μLのRPMI1640/10％ FSCを使用した）。細胞を、37℃および5％ CO2で一晩インキュベートした。細胞をスピンダウン（1200 rpm、10分）した後、70μLの上清をmicronicチューブ中に採集して、γカウンターにおいてカウントした。特異的溶解のパーセンテージを、以下のように算出した：
特異的溶解％＝（試料のcpm－標的細胞のみのcpm）／（最大溶解のcpm－標的細胞のみのcpm）
式中、cpmは分あたりのカウントである。
IgG1-AXL-183-N52QおよびIgG1-AXL-733は、10μg/mLの濃度でA431細胞において15～21％のADCCを誘導した（図3）。IgG1-AXL-148、IgG1-AXL-726-M101L、IgG1-AXL-171、IgG1-AXL-613、IgG1-AXL-107、およびIgG1-AXL-154-M103Lは、10μg／mLまでの濃度でA431細胞において有意なADCCを誘導しなかった（図3）。
実施例5‐AXL抗体-薬物コンジュゲート（AXL-ADC）の結合特性
HEK293T細胞に、完全長ヒトAXL用の発現構築物を一過性にトランスフェクトした（実施例1を参照されたい）。これらの細胞に対する抗AXL抗体およびAXL-ADCの結合を、フローサイトメトリーにより評定した。一過性にトランスフェクトしたHEK293細胞を、抗AXL抗体またはAXL-ADCの連続希釈液（4倍希釈液；最終濃度範囲0.003～10μg/mL）と4℃で30分間インキュベートした。PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で3回洗浄した後、細胞を、100μLにおいて二次抗体と4℃で30分間、暗所でインキュベートした。二次抗体としては、PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で1/100に希釈したR-フィコエリスリン(PE)コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA；カタログ番号109-116-098）を使用した。次に、細胞を、PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で2回洗浄し、120μL PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中に再懸濁して、FACS Cantoll（BD Biosciences）上で解析した。
結合曲線を、GraphPad Prism V5.04ソフトウェア（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を使用し、非線形回帰（可変の勾配を有するシグモイド用量応答）を用いて解析した。
図4は、ヒトAXL-ECDを発現するHEK293細胞に対する抗AXL抗体の結合が、AXL-ADCの結合に類似していたことを示す。
実施例6‐AXL特異的抗体薬物コンジュゲートにより誘導されるインビトロ細胞傷害
LCLC-103H細胞（ヒト大細胞肺癌）細胞を、10％（体積／体積）熱不活化Cosmic Calf Serum（Perbio；カタログ番号SH30087.03）、2 mM L-グルタミン（Cambrex；カタログ番号US17-905C）、50 IU/mLペニシリン、および50μg/mLストレプトマイシン（Cambrex；カタログ番号DE17-603E）を補給した、L-グルタミンを含むRPMI1640（Cambrex；カタログ番号BE12-115F）中で培養した。MDA-MB-231細胞（ヒト乳癌）を、10％（体積／体積）熱不活化Cosmic Calf Serum（Perbio；カタログ番号SH30087.03）、1 mMピルビン酸ナトリウム（Cambrex；カタログ番号BE13-115E）、2 mM L-グルタミン（Cambrex；カタログ番号US17-905C）、100μM MEM NEAA（Invitrogen；カタログ番号11140）、50 IU/mLペニシリン、および50μg/mLストレプトマイシン（Cambrex；カタログ番号DE17-603E）を補給した、DMEM（Cambrex；カタログ番号BE12-709F）中で培養した。細胞株は、37℃で、5％（体積／体積）CO2加湿インキュベーターにおいて維持した。LCLC-103HおよびMDA-MB-231細胞を、コンフルエント近くまで培養し、その後、細胞をトリプシン処理して、培養培地中に再懸濁し、セルストレーナー（BD Falcon、カタログ番号352340）を通過させて、単一細胞懸濁液を取得した。1×103細胞を、96ウェル培養プレートの各ウェルに播種し、細胞を、室温で30分間、その後37℃、5％ CO2で5時間インキュベートして、プレートに接着させた。
AXL抗体薬物コンジュゲート（AXL-ADC；実施例1を参照されたい）の連続希釈液（4倍；0.00015～10μg/mLの範囲にわたる最終濃度）を培養培地中で調製し、プレートに添加した。細胞と1μMスタウロスポリン（#S6942-200, Sigma）とのインキュベーションを、100％腫瘍細胞殺傷用の参照として使用した。無処置の細胞を、0％腫瘍細胞殺傷用の参照として使用した。プレートを、37℃、5％ CO2で5日間インキュベートした。次に、CellTiter-Glo Reagent（Promega；カタログ番号G7571）をウェルに添加して（ウェルあたり20μL）、プレートを37℃、5％ CO2で1.5時間インキュベートした。その後、ウェルあたり180μLを、白色96ウェルOptiplate（商標）プレート（PerkinElmer, Waltham, MA；カタログ番号6005299）に移して、室温で30分間インキュベートした。最後に、発光を、EnVisionマルチプレートリーダー（Envision, Perkin Elmer）上で測定した。
AXL-ADCであるIgG1-AXL-148-vcDuo3、IgG1-AXL-183-vcDuo3、およびIgG1-AXL-726-vcDuo3は、図5Aに示されるように、0.01～0.06μg/mLの間のIC50値で、LCLC-103H細胞において細胞傷害を誘導した。同様に、図5Bは、これらのAXL-ADCが、0.005～0.015μg/mLの間のIC50値でMDA-MB-231細胞の細胞傷害を誘導したことを示す。
実施例7‐AXLに対する結合を可能にする抗体VHおよびVLのバリアント
VHまたはVL領域におけるアミノ酸残基の決定的または許容的な変化を特定するために、（実施例1に記載されている）抗AXL抗体パネルのVHおよびVL領域のタンパク質配列を、整列させて、AXL結合について比較した。そのために、同一のVHまたはVL領域を有する抗体を、グループ化して、それぞれ、ヒトAXLに対する結合およびVLまたはVH配列における差について比較した。HEK-293F細胞により一過性に発現されるヒトAXLに対する結合を、実施例1に記載されているような均質抗原特異的スクリーニングアッセイにおいて評価した。本実施例において行われたアラインメントについてのアミノ酸位置のナンバリングは、図6に提示される配列に基づいて行われ、すなわち、示される配列における1番目のアミノ酸を位置「1」とナンバリングし、2番目を位置「2」とする、などであった。
最初に、同一のVL配列を有する抗体をグループ化した。
IgG1-AXL-148およびIgG1-AXL-140は、同一のVL配列を有することが見出され、HC CDR3領域中に1個のアミノ酸の差を示した（アミノ酸位置109でIに対してF；図6A）。抗体は両方ともヒトAXLに結合して（表10）、位置109のアミノ酸は抗体結合にとって不可欠ではないことが示され、CDR2領域において特定された変異（アミノ酸位置56でAに対してG）は結合の喪失を補償しないことが仮定された（図6A）。
IgG1-AXL-726およびIgG1-AXL-187は、同一のVL配列を有することが見出され、抗体は両方ともヒトAXLに結合した（表10）。HC CDR3領域中の2個のアミノ酸残基の変化（位置97でSに対してR、および位置105でTに対してA；図6B）が、結合を失うことなく可能とされ、CDR1において特定された変異（位置32でHに対してY）および／またはフレームワーク領域において特定された変異（P3Q、V24I、Y25D、T86A、およびT117A）は、結合の喪失を補償しないことが仮定された（図6B）。
IgG1-AXL-171、IgG1-AXL-172、およびIgG1-AXL-181は、同一のVL配列を有することが見出され、すべての抗体はヒトAXLに結合した（表10）。これらの3種の抗体のCDR3領域は同一であったが、HC CDR1中のアミノ酸残基の変化（位置31でNに対してS）またはフレームワーク領域中のアミノ酸残基の変化（位置82でQに対してH）が、結合を失うことなく可能とされた（図6C）。
IgG1-AXL-613、IgG1-AXL-608-01、IgG1-AXL-610-01、およびIgG1-AXL-620-06は、同一のVL配列を有することが見出され、HC CDR3領域中に1個のアミノ酸の差を示した（アミノ酸位置101でDに対してN；図6D）。すべての抗体はヒトAXLに結合して（表10）、位置101のアミノ酸は不可欠ではないことが示され、HC CDR2において特定された変異（位置58でAに対してV）および／またはフレームワーク領域において特定された変異（N35S、M37V、A61V、L70I、S88A）は、結合の喪失を補償しないことが仮定された（図6D）。
次に、同一のVH配列を有する抗体をグループ化した。
IgG1-AXL-613およびIgG1-AXL-613-08は、同一のVH配列を有することが見出され、LCのCDR3領域中に5個のアミノ酸の差を示した（位置92～96でYGSSYに対してRSNWL；図6E）。抗体は両方ともヒトAXLに結合して（表10）、位置92～96でのアミノ酸の変動が可能とされ、抗体結合に影響を及ぼさないことが示され、CDR1において特定された変異（位置30でSの欠失）、CDR2において特定された変異（G51D）、および／またはフレームワーク領域において特定された変異（G9A、S54N、R78S、Q100G、L104V）は、結合の喪失を補償しないことが仮定された（図6E）。
（表１０）
Figure 2024038480000037
実施例8‐MMAEコンジュゲートAXL抗体により誘導されるインビトロ細胞傷害
抗AXL抗体へのMMAEのコンジュゲーション
抗AXL抗体を、標準的な手順にしたがってプロテインAクロマトグラフィーにより精製し、vcMMAEにコンジュゲートした。文献に記載されている手順にしたがって（Sun et al., 2005、McDonagh et al., 2006、および Alley et al., 2008 を参照されたい）、薬物-リンカーvcMMAEを、還元された抗体のシステインにアルキル化した。過剰量のN-アセチルシステインの添加によって、反応を終息させた。いずれの残りのコンジュゲートされていない薬物も、精製によって除去し、最終的な抗AXL抗体薬物コンジュゲートを、PBSにおいて製剤化した。抗AXL抗体薬物コンジュゲートを、その後、濃度（280 nmでの吸光度により）、逆相クロマトグラフィー（RP-HPLC）および疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）により薬物対抗体の比（DAR）、コンジュゲートされていない薬物の量（逆相クロマトグラフィーにより）、凝集のパーセンテージ（サイズ排除クロマトグラフィー、SEC-HPLCにより）、ならびにエンドトキシンレベル（LALにより）について解析した。結果を、下記の表11に示す。
（表１１）抗体-薬物コンジュゲートの様々な特性の概要
Figure 2024038480000038
細胞培養
LCLC-103H細胞（ヒト大細胞肺癌）およびA431細胞（DMSZ, Braunschweig, ドイツ）を、10％（体積／体積）熱不活化Cosmic Calf Serum（Perbio；カタログ番号SH30087.03）、2 mM L-グルタミン（Cambrex；カタログ番号US17-905C）、50 IU/mLペニシリン、および50μg/mLストレプトマイシン（Cambrex；カタログ番号DE17-603E）を補給した、L-グルタミンを含むRPMI1640（Cambrex；カタログ番号BE12-115F）中で培養した。MDA-MB231細胞を、高グルコースおよびHEPESを含むDMEM（Lonza #BE12-709F）、Donor Bovine Serum with Iron（Life Technologies #10371-029）、2 mM L-グルタミン（Lonza #BE17-605E）、1 mMピルビン酸ナトリウム（Lonza #BE13-115E）、およびMEM Non-Essential Amino Acids Solution（Life Technologies #11140）中で培養した。細胞株は、37℃で、5％（体積／体積）CO2加湿インキュベーターにおいて維持した。LCLC-103H、A431、およびMDA-MB231細胞を、コンフルエント近くまで培養し、その後、細胞をトリプシン処理して、培養培地中に再懸濁し、セルストレーナー（BD Falcon、カタログ番号352340）を通過させて、単一細胞懸濁液を取得した。1×103細胞を、96ウェル培養プレートの各ウェルに播種し、細胞を、室温で30分間、その後37℃、5％ CO2で5時間インキュベートして、プレートに接着させた。
細胞傷害アッセイ
MMAEコンジュゲートAXL抗体の連続希釈液（0.00015～10μg/mLの範囲にわたる最終濃度）を培養培地中で調製し、プレートに添加した。細胞と1μMスタウロスポリン（#S6942-200, Sigma）とのインキュベーションを、100％腫瘍細胞殺傷用の参照として使用した。無処置の細胞を、100％細胞成長用の参照として使用した。プレートを、37℃、5％ CO2で5日間インキュベートした。次に、CellTiter-Glo Reagent（Promega；カタログ番号G7571）をウェルに添加して（ウェルあたり20μL）、プレートを37℃、5％ CO2で1.5時間インキュベートした。その後、ウェルあたり180μLを、白色96ウェルOptiplate（商標）プレート（PerkinElmer, Waltham, MA；カタログ番号6005299）に移して、室温で30分間インキュベートした。最後に、発光を、EnVisionマルチプレートリーダー（Envision, Perkin Elmer）上で測定した。
MMAEコンジュゲートAXL抗体は、表12および図7に示されるように、0.004～0.219μg/mLの間の濃度で、LCLC-103H細胞において50％細胞殺傷を誘導した。
同様に、AXL-ADCは、A431細胞（表13および図15A）ならびにMDA-MB231細胞（表13および図15B）において細胞傷害を効率的に誘導した。
（表１２）LCLC-103H細胞におけるMMAEコンジュゲートAXL抗体の細胞傷害（EC50値）
Figure 2024038480000039
（表１３）A431およびMDA-MB-231細胞におけるMMAEコンジュゲートAXL抗体の細胞傷害（EC50値）
Figure 2024038480000040
実施例9‐SCIDマウスにおけるLCLC-103H腫瘍異種移植片のMMAEコンジュゲート抗AXL抗体での治療的処置
MMAEコンジュゲート抗AXL抗体のインビボ効力を、確立されたSCIDマウスにおける皮下（SC）LCLC-103H異種移植腫瘍において測定した。200μL PBS中の5×106個のLCLC-103H（大細胞肺癌）腫瘍細胞（Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)から取得）を、雌SCIDマウスの右側腹部の皮下に注射した。平均腫瘍サイズが100～200 mm3よりも大きく、明瞭な腫瘍成長が観察された、腫瘍細胞接種の14～21日後に開始して、1 mg/kg（20μg／マウス）のIgG1-AXL-vcMMAE抗体（補足的な実施例1に記載されている）または対照（コンジュゲートされていないIgG1-b12）での単回注射を、腹腔内に与えた（100μL／マウス）。腫瘍体積を、少なくとも週あたり2回測定した。腫瘍体積（mm3）を、キャリパー（PLEXX）測定値から0.52×（長さ）×（幅）2として算出した。
抗AXL-vcMMAE抗体のパネルは、確立されたSC LCLC-103H腫瘍において広範囲の抗腫瘍活性を示した（図8）。クローンIgG1-AXL-733-vcMMAE、IgG1-AXL-107-vcMMAE、およびIgG1-AXL-148-vcMMAEは、腫瘍退縮を誘導し、クローンAXL-171-vcMMAE、IgG1-AXL-511-vcMMAE、およびIgG1-AXL-613-vcMMAEは、腫瘍成長阻害を誘導し、クローンIgG1-AXL-154-M103L-vcMMAE、IgG1-AXL-183-N52Q-vcMMAE、およびIgG1-AXL-726-M101L-vcMMAEは、腫瘍成長阻害を示さなかったか、または軽微の腫瘍成長阻害のみを示した。
一元配置分散分析（対照IgG1-b12に対するダネットの多重比較検定）を用いた、すべての群が無傷であった最後の日（30日目）の統計解析により、IgG1-b12対IgG1-AXL-733-vcMMAE、IgG1-AXL-107-vcMMAE、およびIgG1-AXL-148-vcMMAEの間で腫瘍体積における非常に有意な差（p＜0.0001）が示された。これらのクローンでの処置は、これらの群内のいくつかのマウスにおいて、完全な腫瘍低減につながった。クローンIgG1-AXL-171-vcMMAE、IgG1-AXL-511-vcMMAE、およびIgG1-AXL-613-vcMMAEでの処置もまた、IgG1-b12と比較して有意な腫瘍成長阻害を示したが、差はさほど明白ではなかった（p＜0.05～p＜0.001）。クローンIgG1-AXL-154-M103L-vcMMAE、IgG1-AXL-183-N52Q-vcMMAE、およびIgG1-AXL-726-M101L-vcMMAEで処置したマウスの腫瘍成長は、IgG1-b12対照と比較して有意に影響を受けなかった。
抗AXL-vcMMAE抗体の抗腫瘍活性は、種々の他のインビボ腫瘍モデルにおいて観察された。2種の細胞株由来の異種移植モデル（A431；類表皮腺癌、およびMDA-MB-231；乳癌）において、抗AXL-vcMMAE抗体は腫瘍成長阻害を誘導し、腫瘍退縮が、膵臓癌および子宮頸癌を有する患者からの2種の患者由来の異種移植モデルにおいて、抗AXL-vcMMAE抗体により誘導された。
実施例10‐不均質な標的発現を有する膵臓癌患者由来の異種移植（PDX）モデルにおけるAXL-ADCの抗腫瘍効力
IgG1-AXL-107-vcMMAE、IgG1-AXL-148-vcMMAE、およびIgG1-AXL-733-vcMMAEの抗腫瘍活性を、PAXF1657膵臓癌PDXモデルにおいて測定した（Oncotest, Freiburg, ドイツにより行われた実験）。ヒト膵臓腫瘍組織を、5～7週齢の雌NMRI nu/nuマウスの左側腹部の皮下に移植した。動物の無作為化を、以下のように行った：50～250 mm3、好ましくは80～200 mm3の間の体積の腫瘍を有する動物を、群腫瘍体積の比較可能な中央値および平均値を考慮して、7種の実験群（群あたり8匹の動物）に分配した。無作為化の日（0日目）に、3種のADCを、4 mg/kgまたは2 mg/kgのいずれかで静脈内に（i.v.）投与し、対照群は、単一用量のIgG1-b12（4 mg/kg）を受けた。腫瘍体積（mm3）を、週に2回モニターして、キャリパー（PLEXX）測定値から0.52×（長さ）×（幅）2として算出した。
PAXF1657腫瘍の染色を、標準的な免疫組織化学技術で行った。簡潔に言うと、凍結組織を、アセトンで10分間固定化し、内在性ペルオキシダーゼを、過酸化水素を用いて消耗させた。その後、組織切片を正常マウス血清でブロッキングし、5μg/mLの、5種のIgG1-AXL抗体（IgG1-AXL-061、IgG1-AXL-137、IgG1-AXL-148、IgG1-AXL-183、IgG1-AXL-726）のプールとのインキュベーションによって染色を行った。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲートの二次抗体とのインキュベーション後に、HRPを、アミノエチルカルバゾール（AEC；赤色を結果として生じる）で可視化した。各スライドを、核を特定するためにヘマトキシリン（青色）で対比染色し、glycergel中にカバーガラスをかけた。免疫染色した組織切片を、手動Zeiss顕微鏡（AxioSkop）上で10倍および40倍の倍率でデジタル化した。
図9は、PAXF1657腫瘍における不均質なAXL発現を示す。強いAXL染色が、いくつかの腫瘍細胞において観察されるが、他の細胞はAXL染色を示していない。白黒写真において、AXL染色は濃い灰色として見える。ヘマトキシリン染色（核）は、薄い灰色として見える。
図10Aは、2 mg/kgのIgG1-AXL-107-vcMMAE、IgG1-AXL-148-vcMMAE、およびIgG1-AXL-733-vcMMAEでのマウスの処置が、対照群と比較して、PAXF1657腫瘍の成長を有意に低減させたことを示す。4 mg/kgの用量で、IgG1-AXL-107-vcMMAE、IgG1-AXL-148-vcMMAE、およびIgG1-AXL-733-vcMMAEは、PAXF1657腫瘍の腫瘍退縮を誘導した。処置後の14日目に、2 mg/kgまたは4 mg/kgのIgG1-AXL-107-MMAE、IgG1-AXL-148-MMAE、またはIgG1-AXL-733-MMAEで処置していたマウスにおける平均腫瘍サイズは、アイソタイプ対照IgG（IgG1-b12）で処置していたマウスにおけるよりも有意に小さかった（p＜0.001；チューキーの多重比較検定）。
コンジュゲートされていないIgG1-AXL-148でのマウスの処置は、PAXF1657モデルにおいて抗腫瘍活性を結果としてもたらさなかった（図10B）。しかし、コンジュゲートされたIgG1-AXL-148-vcMMAEは、このモデルにおいて用量依存性抗腫瘍活性を誘導し（図10B）、AXL-ADCの治療能力はMMAEの細胞傷害活性に依存していることが示された。
さらに、標的化されていないADCであるIgG1-b12-vcMMAEでのマウスの処置は、PAXF1657モデルにおいて抗腫瘍活性を示さず（図10C）、AXL-ADCの治療能力は特異的な標的結合にも依存することが示された。
実施例11‐Ig1ドメインに結合するAXL抗体
AXL抗体IgG1-AXL-061、IgG1-AXL-107、IgG1-AXL-137、およびIgG1-AXL-613のAXLドメイン特異性を、ヒト-マウスキメラAXL変異体のパネルを用いて測定した。ヒト-マウス交差反応性モノクローナルAXL抗体であるYW327.6S2を、hsAXL-mmECDの発現を確認するために含めた。IgG1-b12を、アイソタイプ対照抗体として含めた。実施例3に記載されているように、5種の異なるキメラAXL分子を生成して、HEK293Fにおいて発現させた。簡潔に言うと、ヒトIg様ドメインI（Ig1）、Ig様ドメインII（Ig2）、ヒトFNIII様ドメインI（FN1）、またはヒトFNIII様ドメインIIドメイン（FN2）を、それらのマウスホモログで置き換えた。実施例2に記載されているように、ヒト-マウスAXLキメラに対する1μg/mL抗AXL抗体の結合を、フローサイトメトリーにより測定した。
すべての抗AXL抗体が、ヒトAXLに対する結合を示した（図11A）のに対して、ヒトAXL ECDがそのマウスホモログで置き換えられた際には、結合は撤廃された（図11B）。期待されたように、ヒト-マウス交差反応性モノクローナルAXL抗体YW327.6S2は、hsAXL-mmECDに対する結合を示し、hsAXL-mmECDの妥当な発現が確認された。
AXL抗体IgG1-AXL-061、IgG1-AXL-107、IgG1-AXL-137、およびIgG1-AXL-613は、hsAXL-mmIg1に対して強く低減した結合を示し（図11C）、AXL Ig1ドメイン中のエピトープの認識が示された。これと合致して、IgG1-AXL-061、IgG1-AXL-107、IgG1-AXL-137、およびIgG1-AXL-613のhsAXL-mmIg2（図11D）、hsAXL-mmFN1（図11E）、またはhsAXL-mmFN2（図11F）に対する結合は、影響を受けなかった。ヒト-マウス交差反応性モノクローナルAXL抗体YW327.6S2は、すべてのキメラAXLバリアントに対する結合を示し、これらのタンパク質の妥当な発現が確認された。
実施例12‐AXL抗体IgG1-AXL-107およびIgG1-AXL-613はIg1ドメインに結合するが、Gas6結合と競合しない
AXL抗体IgG1-AXL-061、IgG1-AXL-107、IgG1-AXL-137、またはIgG1-AXL-613の結合が、AXLリガンドであるGas6のAXLに対する結合を干渉するかどうかを試験した。そのために、実施例2に記載されているように、10μg/mL AXL抗体とプレインキュベートしていたA431細胞に対するGas6の結合を試験した。AXL結合についてGas6と競合することが記載されたAXL抗体YW327.6S2、IgG1-b12（アイソタイプ対照）、または培地（陰性対照）とのプレインキュベーションを、対照として含めた。
結合曲線を、GraphPad Prism V5.04ソフトウェア（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を使用した非線形回帰（可変の勾配を有するシグモイド用量応答）を用いて解析した。
図12および表14は、IgG1-AXL-107およびIgG1-AXL-613抗体とプレインキュベートしていたA431細胞に対するGas6の結合が、IgG1-b12および培地対照に類似していたことを示す。これは、実施例2に示されるように、AXLに対するIgG1-AXL-107およびIgG1-AXL-613の結合が、Gas6結合を干渉しないことを示す。A431細胞に対するGas6の結合は、IgG1-b12および培地対照と比較して、IgG1-AXL-061、IgG1-AXL-137、および対照AXL抗体YW327.6S2の存在下で大きく低減した。
A431細胞をGas6とプレインキュベートした実験において、IgG1-AXL-107およびIgG1-AXL-613の最大結合値は、Gas6の非存在下での抗体結合に匹敵していた（Gas6プレインキュベーション後の最大結合は、Gas6プレインキュベーションを伴わない結合の91～108％であった）（表14）。Gas6プレインキュベーションを伴うかまたは伴わない、IgG1-AXL-107およびIgG1-AXL-613結合についてのEC50値は、同じ範囲であったか、またはGas6プレインキュベーション後にいくらか高く（表14）、IgG1-AXL-107およびIgG1-AXL-613がGas6結合と競合しないことが示された。
対照抗体YW327.6S2と同様に、A431細胞に対するIgG1-AXL-061およびIgG1-AXL-137の結合は、Gas6を伴わない結合と比較して、Gas6の存在下で大きく低減した（Gas6プレインキュベーション後の最大結合は、Gas6プレインキュベーションを伴わない結合の40～43％であった；表14）。IgG1-AXL-061およびIgG1-AXL-137についてのEC50値は、Gas6プレインキュベーション後には妥当に決定できなかった（表14）。これは、IgG1-AXL-061およびIgG1-AXL-137がAXLへの結合についてGas6と競合することを示す。
これらのデータは、AXL Ig1ドメインに結合する抗体が、Gas6結合に対して差別的な効果を有することを実証する。
（表１４）
Figure 2024038480000041
an.a.、適用不可能
*低い結合のためにEC50は精度が低い値である。
実施例13‐自己分泌（内在性）Gas6産生を伴うおよび伴わない異種移植モデルにおけるAXL-ADCのインビボ抗腫瘍効力
A431およびLCLC-103H腫瘍細胞のGas6産生
A431細胞およびLCLC-103H細胞がGas6を産生するかどうかを試験した。そのために、細胞を、完全培養培地中で3日間成長させた。上清中のGas6レベルを、Quantikine Human Gas6 ELISA（R&D Systems, Minneapolis, MN）を用い、製造業者の説明書にしたがって決定した。このアッセイは、定量的サンドイッチELISA技術を使用する。ヒトGas6に特異的なモノクローナルAbが、マイクロプレート上にプレコーティングされている。標準品および試料をウェル中にピペットで移すと、存在する任意のヒトGas6が、固定されたAbによって結合される。任意の結合していない物質を洗浄して除去した後、ヒトGas6に特異的な酵素連結ポリクローナルAbをウェルに添加する。任意の結合していないAb-酵素試薬を除去するための洗浄後に、基質をウェルに添加すると、最初の工程において結合したヒトGas6の量に比例して色が顕出する。顕色を停止して、色の強度を測定する。
A431細胞によって調整された細胞培養培地は、2576 ng/mLのGas6を含有することが見出され、他方、LCLC-103H細胞によって調整された培地中のGas6の濃度は、20倍より大きく、低かった（表15）。
（表１５）腫瘍細胞調整培地中のGas6産生
Figure 2024038480000042
インビボでのAXL-ADCの抗腫瘍活性
IgG1-AXL-061-vcMMAE（Ig1結合剤）、IgG1-AXL-107-vcMMAE（Ig1結合剤）、IgG1-AXL-137-vcMMAE（Ig1結合剤）、IgG1-AXL-148-vcMMAE（Ig2結合剤）、IgG1-AXL-183-vcMMAE（FN1結合剤）、およびIgG1-AXL-726-vcMMAE（FN2結合剤）のインビボ抗腫瘍活性を、高レベルのGas6を産生するA431（類表皮癌）腫瘍モデル、および、低レベルのGas6を産生するLCLC-103H（大細胞肺癌）腫瘍モデルにおいて測定した。
腫瘍誘導を、200μL PBS中の5×106個のA431またはLCLC-103H腫瘍細胞（両方ともLeibniz-Institut - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)から取得）の、雌SCIDマウスの右側腹部における皮下注射によって行った。処置は、平均腫瘍サイズが100～200 mm3よりも大きく、明瞭な腫瘍成長が観察された、腫瘍細胞接種の14～21日後に開始した。マウスは、示されているように、IgG1-AXL-vcMMAE ADCまたは対照抗体（コンジュゲートされていないIgG1-b12）での単回注射、または合計で4回の週2回の腹腔内注射を受けた。腫瘍体積を、少なくとも週あたり2回測定した。腫瘍体積（mm3）を、キャリパー（PLEXX）測定値から0.52×（長さ）×（幅）2として算出した。
図13Aは、3 mg/kgのIgG1-AXL-107-vcMMAE、IgG1-AXL-148-vcMMAE、およびIgG1-AXL-733-vcMMAEでのマウスの処置が、A431腫瘍の成長阻害を誘導したことを示す。
図13Bは、3 mg/kgのIgG1-AXL-148-vcMMAE、IgG1-AXL-183-vcMMAE（FN1結合剤）、およびIgG1-AXL-726-vcMMAE（FN2結合剤）でのマウスの処置が、A431腫瘍の成長阻害を誘導したことを示す。対照的に、クローンIgG1-AXL-061-vcMMAEおよびIgG1-AXL-137-vcMMAEは、A431異種移植モデルにおいて抗腫瘍活性を示さなかった。
図14Aは、3 mg/kgのIgG1-AXL-061-vcMMAE、IgG1-AXL-137-vcMMAE、IgG1-AXL-148-vcMMAE、IgG1-AXL-183-vcMMAE、およびIgG1-AXL-726-vcMMAEでのマウスの処置が、LCLC-103H異種移植モデルにおいて腫瘍退縮を誘導したことを示す。同様に、1 mg/kgのIgG1-AXL-107-vcMMAEまたは1 mg/kgのIgG1-AXL-613-vcMMAEでのマウスの処置は、LCLC-103H腫瘍の退縮を誘導した（図14B）。
要約すると、すべてのAXL-ADCは、低レベルのGas6を産生するLCLC-103H異種移植モデルにおいて抗腫瘍活性を示した。高レベルのGas6を産生するA431異種移植モデルにおいて、抗腫瘍活性は、AXLリガンドであるGas6と競合しなかったAXL-ADCについてのみ観察された。
実施例14‐様々な腫瘍徴候におけるAXL発現
AXLの発現を、甲状腺癌、食道癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌もしくは子宮内膜癌、または悪性メラノーマを有する患者由来の組織コアを含む、新しく切ったパラフィン包埋、ホルマリン固定（FFPE）の腫瘍組織マイクロアレイ（TMA）において評定した。TMAは、US BioMaxから取得した。
FFPE腫瘍アレイスライドを、脱パラフィン化して抗原復旧（pH 6）に供し、内在性ペルオキシダーゼを、クエン酸／リン酸緩衝液中の0.1％ H2O2とのインキュベーションによって消耗させた。AXL発現を検出するために、TMAを、1μg/mLの濃度のウサギ抗AXL（Santa Cruz、カタログ番号：sc-20741）と60分間インキュベート（室温（RT））した。上皮起源の（腫瘍）細胞を特定するために、TMAを、1:50の希釈のウサギ抗サイトケラチン（Abcam、カタログ番号ab9377）と60分間インキュベート（RT）した。洗浄工程後に、TMAを、ペルオキシダーゼコンジュゲートの抗ウサギIgGデキストランポリマー（ImmunoLogic、カタログ番号：DPVR55HRP）とインキュベートして、ウサギ抗AXL抗体およびウサギ抗サイトケラチン抗体の結合を検出した。最後に、抗ウサギIgGデキストランポリマーの結合を、ジアミノベンジジン（DAB；茶色；DAKO、カタログ番号：K346811）で可視化した。悪性メラノーマ組織コアを有するTMAにおいては、抗ウサギIgGデキストランポリマーの結合を、アミノエチルカルバゾール（AEC；赤色；Vector、SK4200）で可視化した。TMAにおける核を、ヘマトキシリン（青色）で可視化した。
AXLおよびサイトケラチンを免疫染色したTMAを、Aperioスライドスキャナーで20倍の倍率でデジタル化し、免疫染色を、細胞ベースのアルゴリズムを用いて、組織画像解析ソフトウェア（Definiens Tissue Studioソフトウェア、バージョン3.6.1）で定量した。アルゴリズムは、生検材料におけるAXLまたはサイトケラチンの陽性細胞のパーセンテージ（範囲0～100％）を特定および定量するように、ならびに、各腫瘍コアにおけるAXL陽性腫瘍細胞のAXL染色強度（光学密度（OD）；範囲0～3）を定量するように、設計された。AXL ODが少なくとも0.1であった場合に、腫瘍細胞をAXL陽性とスコア化した。腫瘍コアあたりのAXL陽性腫瘍細胞のパーセンテージ（範囲0～100％）は、連続した腫瘍コアにおいて、AXL陽性細胞の総数をサイトケラチン陽性細胞の総数で割ることによって算出した。各腫瘍コアにおける平均AXL染色強度（OD）は、すべてのAXL陽性腫瘍細胞のAXL ODの和を、AXL陽性腫瘍細胞の数で割ることによって算出した。
悪性メラノーマを有する患者由来の腫瘍アレイは、手動でスコア化した。AXL染色強度を、弱（1+）、中（2+）、または強（3+）のいずれかとしてスコア化し、AXL陽性メラノーマ細胞のパーセンテージを、10％間隔でスコア化した（範囲0～100％）。
図16は、甲状腺癌、食道癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、および子宮内膜癌の腫瘍コアにおけるAXL発現のグラフによる表示を提供する。表16は、各徴候について、腫瘍細胞の10％より多くにおいてAXL発現を示した腫瘍コアのパーセンテージを示す。図17は、各徴候について、AXLを免疫染色した組織コアの代表的な例を示す。図は、腫瘍組織におけるAXLの不均質な発現を示す。
（表１６）
Figure 2024038480000043
使用した略語：NSCLC、非小細胞肺癌；SLCL、小細胞肺癌；TNBC、トリプルネガティブ乳癌
実施例15‐AXL抗体はAXLに特異的に結合するが、他のTAM受容体ファミリーメンバーには結合しない
HEK-293F細胞におけるヒトAXL、MER、およびTYRO3の発現
種々の完全長タンパク質の発現用の以下のコドン最適化構築物を生成した：ヒト（ホモ・サピエンス）AXL（Genbankアクセッション番号NP_068713.2）、ヒトMER（Genbankアクセッション番号EAW52096.1）、およびヒトTYRO3（Genbankアクセッション番号Q06418.1）。 構築物は、クローニングに適している制限酵素部位および最適コザック（GCCGCCACC）配列（Kozak et al., 1999）を含有した。構築物を、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.3（Invitrogen）にクローニングした。
Freestyle商標293-F（浮遊増殖および化学的に定義されたFreestyle培地に適応したHEK-293サブクローン、（HEK-293F））細胞を、Invitrogenから取得して、293fectin（Invitrogen）を用い、製造業者の説明書にしたがって発現プラスミドをトランスフェクトして、24～48時間増殖させた。
ヒトAXL、ヒトMER、またはヒトTYRO3に対するAXL抗体の結合研究
完全長ヒトAXL、MER、またはTYRO3用の発現構築物を一過性にトランスフェクトしたHEK-293F細胞を、HuMab-AXL抗体の結合についてフローサイトメトリーにより評定した。トランスフェクトしたHEK-293F細胞を、AXL抗体の連続希釈液（4倍希釈液；最終濃度範囲0.002～10μg/mL）と4℃で30分間インキュベートした。PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で3回洗浄した後、細胞を、PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で1/100に希釈したR-フィコエリスリン(PE)コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA；カタログ番号109-116-098）とインキュベートした（最終体積100μL）。次に、細胞を、PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で2回洗浄し、120μL PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中に再懸濁して、FACS Cantoll（BD Biosciences）上で解析した。マウス抗ヒトMer（R&D Systems、カタログMab8912）およびマウス抗ヒトTyro3（Dtk）（R&D Systems、カタログMAB859）での染色を、発現についての対照として含め、IgG1-b12を、非結合アイソタイプ対照抗体として含めた。結合曲線を、GraphPad Prism V5.04ソフトウェア（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を使用し、非線形回帰（可変の勾配を有するシグモイド用量応答）を用いて解析した。
図18Aは、Humab-AXL抗体が、ヒトAXLを発現するHEK293細胞に対して用量依存性結合を示したことを示す。対照的に、MERを発現する細胞（図18B）もしくはTYRO3を発現する細胞（図18C）、またはトランスフェクトしていないHEK293細胞（図18D）に対するHuMab-AXL抗体の非結合が観察された。MERおよびTyro3に特異的な抗体での染色により、トランスフェクトした細胞は、それぞれ、MER（図18F）またはTYRO3（図18G）の妥当な発現を示したことが確認された。
実施例16‐細胞表面に結合したAXL抗体の内部移行
フローサイトメトリーにより評定した、細胞表面に結合したHuMab-AXLの内部移行
MDA-MB-231およびCalu-1細胞（ヒト肺癌細胞株；ATCC、カタログ番号HTB-54）に対する、細胞表面に結合したHuMab-AXL抗体の内部移行を、フローサイトメトリーにより評定した。50,000細胞を、96ウェル組織培養プレートに播種して、37℃で6時間付着させた。プレートを、AXL抗体の連続希釈液（最終濃度範囲0.0032～10μg/mL）との4℃で1時間のインキュベーション前に、4℃で30分間インキュベートした。その後、培地を、抗体を含まない組織培養培地により置き換え、細胞を、37℃または4℃で一晩（16～18時間）インキュベートした。その後、細胞表面上のAXL抗体を検出するために、細胞を、40μLの温かいトリプシン溶液で剥離し、氷冷PBS/0.1％ BSA/0.02％アジドで洗浄し、PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で1/100に希釈したR-フィコエリスリン(PE)コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA；カタログ番号109-116-098）と4℃で30分間インキュベートした（最終体積100μL）。最後に、細胞を、PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で2回洗浄し、120μL PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中に再懸濁して、FACS Cantoll（BD Biosciences）上で解析した。
結合曲線を、GraphPad Prism V5.04ソフトウェア（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を使用し、非線形回帰（可変の勾配を有するシグモイド用量応答）を用いて解析した。
図19は、試験したすべてのAXL HuMab抗体についておよびすべての濃度で、抗体結合後に4℃でインキュベートしていた細胞の形質膜上に、37℃でインキュベートしていた細胞と比較してより多くの抗体が検出されたことを示す。これは、37℃で、AXL抗体が、形質膜への結合時に内部移行されることを示す。
Fab-TAMRA/QSY7内部移行および細胞内分解アッセイ
AXL抗体の内部移行を、Fab-TAMRA/QSY7内部移行アッセイにおいて評価した。このアッセイは、蛍光体（TAMRA）と消光剤（QSY7）のペアを使用する。きわめて接近すると、例えば、同じタンパク質へのコンジュゲーション時に、TAMRA蛍光はQSY7によって消光される。この実施例においては、ヤギ抗ヒトIgG Fab断片（Jackson Immunoresearch）を、記載されているように（Ogawa et al. Mol Pharm 2009;6(2):386-395）TAMRA/QSY7とコンジュゲートして（Fab-TAMRA/QSY7）、AXL HuMab（1.5μg/mL）を、Fab-TAMRA/QSY7とプレインキュベートした（12μg/mL；30分、4℃）。複合体をその後、LCLC-103H細胞に添加して、振盪条件（200 rpm、37℃）下で、24時間のインキュベートの間、暗所でインキュベートした。HuMab-Fab-TAMRA/QSY7複合体の内部移行、ならびにエンドソームおよびリソソームにおける細胞内分解は、TAMRA/QSY7の解離を引き起こし、TAMRAの脱消光（dequenching）を結果としてもたらす。Fab-TAMRA/QSY7と複合体形成したAXL抗体とインキュベートしていたLCLC-103H細胞のTAMRA蛍光を、FACS CantoII（BD Biosciences）上で測定した。
図20に示されるように、LCLC-103H細胞の蛍光強度は、AXL抗体-Fab-TAMRA/QSY7複合体とのインキュベーション時に、IgG1-b12-Fab-TAMRA/QSY7またはFab-TAMRA/QSY7単独と比較して増強された。これは、AXL抗体が、LCLC-103H細胞への結合時に内部移行されることを示す。
実施例17‐食道癌患者由来の異種移植（PDX）モデルにおけるAXL-ADCの抗腫瘍効力
IgG1-AXL-107-vcMMAE（本明細書において「HuMax-AXL-ADC」とも称される）の抗腫瘍活性を、BALB/cヌードマウスにおける皮下食道PDXモデルES0195において評定した（Crown Bioscience. Taicang Jiangsu Province, 中国により行われた実験）。患者由来の食道異種移植片を有するドナーマウスからの腫瘍断片（ES0195）を、BALB/cヌードマウス中への接種のために使用した。各マウスに、1つの腫瘍断片（直径2～3 mm）を右側腹部の皮下に接種して、腫瘍体積が約150 mm3になるまで腫瘍を成長させた。動物の無作為化を、以下のように行った：約150 mm3の体積の腫瘍を有する動物を、群腫瘍体積の比較可能な中央値および平均値を考慮して、5種の実験群（群あたり8匹の動物）に分配した。処置群は、IgG1-b12、IgG1-b12-vcMMAE、IgG1-AXL-107、IgG1-AXL-107-vcMMAE、およびパクリタキセルであった。抗体およびADCを、無作為化の日（0日目）および7日目に、4 mg/kgで静脈内に（i.v.）投与した。パクリタキセルは、0、7、および14日目に、20 mg/kgで腹腔内に（i.p.）投与した。腫瘍体積（mm3）を、週に2回モニターして、キャリパー（PLEXX）測定値から0.52×（長さ）×（幅）2として算出した。
図21は、IgG1-AXL-107-vcMMAEでのマウスの処置が、IgG1-b12およびIgG1-b12-MMAE対照群と比較して、ES0195腫瘍の腫瘍退縮を誘導したことを示す（23日目にp＜0.001、一元配置分散分析検定）。標的化されていないADCであるIgG1-b12-vcMMAEでのマウスの処置は、このモデルにおいて抗腫瘍活性を示さず、AXL-ADCの治療能力は特異的な標的結合に依存することが示された。パクリタキセルで処置したマウスは、腫瘍成長阻害を示したが、これはIgG1-AXL-107-vcMMAEでの処置と比較して有効性が低かった（23日目にp＜0.05、一元配置分散分析検定）。
実施例18‐子宮頸癌患者由来の異種移植（PDX）モデルにおけるAXL-ADCの抗腫瘍効力
IgG1-AXL-183-vcMMAEおよびIgG1-AXL-726-vcMMAEの抗腫瘍活性を、NMRI nu/nuマウス（Harlan, オランダ）における患者由来の子宮頚癌異種移植CEXF 773モデルにおいて評定した。実験は、Oncotest（Freiburg, ドイツ）により行われた。
腫瘍断片を、連続継代のヌードマウスにおける異種移植片から取得した。ドナーマウスからの切除後、腫瘍を、断片（直径4～5 mm）に切って、皮下移植までPBS（10％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む）中に置いた。イソフルラン麻酔下のマウスが、側腹部に片側皮下腫瘍移植を受けた。腫瘍体積が50～250 mm3になるまで、腫瘍を成長させた。
動物の無作為化を、以下のように行った：50～250 mm3の体積の腫瘍を有する動物を、群腫瘍体積の比較可能な中央値および平均値を考慮して、4種の実験群（群あたり8匹の動物）に分配した。処置群は、IgG1-b12、IgG1-b12-vcMMAE、IgG1-AXL-183-vcMMAE、およびIgG1-AXL-726-vcMMAEであった。抗体およびADCを、無作為化の日（0日目）および7日目に、4 mg/kgで静脈内に（i.v.）投与した。腫瘍体積（mm3）を、週に2回モニターして、キャリパー（PLEXX）測定値から0.52×（長さ）×（幅）2として算出した。
図22は、IgG1-AXL-183-vcMMAEまたはIgG1-AXL-726-vcMMAEでのマウスの処置が、IgG1-b12およびIgG1-b12-MMAE対照群と比較して、CEXF 773腫瘍の腫瘍退縮を誘導したことを示す。標的化されていないADCであるIgG1-b12-vcMMAEでのマウスの処置は、このモデルにおいて抗腫瘍活性を示さず、AXL-ADCの治療能力は特異的な標的結合に依存することが示された。28日目の腫瘍サイズの統計解析（腫瘍サイズカットオフ500 mm3を用いたクラスカル・ワリスおよびマンテル・コックス）により、IgG1-AXL-183-vcMMAEまたはIgG1-AXL-726-vcMMAEで処置したマウスにおける平均腫瘍サイズは、IgG1-b12およびIgG1-b12-vcMMAEで処置していたマウスにおけるよりも有意に小さかったことが示された（p＜0.001）。IgG1-AXL-183-vcMMAEとIgG1-AXL-726-vcMMAEとは、同等に有効であった。
実施例19‐同所乳癌異種移植モデルにおけるAXL-ADCの抗腫瘍効力
IgG1-AXL-183-vcMMAEおよびIgG1-AXL-726-vcMMAEの抗腫瘍活性を、同所MDA-MB-231 D3H2LN異種移植モデルにおいて評定した。
MDA-MB-231-luc D3H2LN Bioware細胞（乳腺腺癌；Perkin Elmer, Waltham, MA）を、6～11週齢の雌SCID（C.B-17/IcrPrkdc-scid/CRL）マウス（Charles-River）の乳房脂肪体に、イソフルラン麻酔下で移植した。腫瘍を成長させて、腫瘍が約325 mm3に達した際に、マウスを無作為化した。そのために、マウスを、群腫瘍体積の比較可能な中央値および平均値を考慮して、4種の実験群（群あたり6～7匹の動物）に分配した。処置群は、IgG1-b12、IgG1-b12-vcMMAE、IgG1-AXL-183-vcMMAE、およびIgG1-AXL-726-vcMMAEであった。動物は、無作為化の日に開始して、3 mg/kgの抗体またはADCの、合計で4回の週2回投与を受けた。腫瘍体積（mm3）を、週に2回モニターして、キャリパー（PLEXX）測定値から0.52×（長さ）×（幅）2として算出した。
図23は、IgG1-AXL-183-vcMMAEまたはIgG1-AXL-726-vcMMAEでのマウスの処置が、IgG1-b12およびIgG1-b12-MMAE対照群と比較して、MDA-MB-231腫瘍の腫瘍退縮を誘導したことを示す。標的化されていないADCであるIgG1-b12-vcMMAEでのマウスの処置は、このモデルにおいて抗腫瘍活性を示さず、AXL-ADCの治療能力は特異的な標的結合に依存することが示された。32日目の腫瘍サイズの統計解析（一元配置分散分析検定）により、IgG1-AXL-183-vcMMAEまたはIgG1-AXL-726-vcMMAEで処置していたマウスにおける平均腫瘍サイズは、IgG1-b12およびIgG1-b12-vcMMAEで処置していたマウスにおけるよりも有意に小さかったことが示された（p＜0.001）。IgG1-AXL-183-vcMMAE処置群とIgG1-AXL-726-vcMMAE処置群との間に、差は観察されず、これらが同等に有効な抗腫瘍活性を誘導したことが示された。
実施例20‐AXL特異的抗体薬物コンジュゲートにより誘導されるインビトロ細胞傷害は標的発現に依存する
IgG1-AXL-107-vcMMAEのインビトロ細胞傷害を、様々なレベルのAXL発現を有するヒト腫瘍細胞株において試験した。
細胞培養
LS174T細胞（ヒト結腸直腸腺癌細胞株；ATCC、カタログ番号CL-188）を、Glutamax、Hepes、およびフェノールレッドを含む最小必須培地（MEM）（Life Technologies、カタログ番号42360-024）中で培養した。構成要素は、10％ Donor Bovine Serium with Iron（DBSI）（Life Technologies、カタログ番号10371-029）および1％ピルビン酸ナトリウム（100 mM；Lonza、カタログ番号BE13-115E）および1％ペニシリン／ストレプトマイシン（Lonza、カタログ番号DE17-603E）である。
NCI-H226細胞（ヒト肺扁平上皮癌；ATCC、カタログ番号CRL-5826）、NCI-H661細胞（ヒト大細胞肺癌；ATCC、カタログ番号HTB-183）、およびNCI-H1299細胞（ヒト非小細胞肺癌；ATCC、カタログ番号CRL-5803）を、RPMI 1640培地（ATCC改変；Life Technologies、カタログ番号A10491-01）中で培養した。構成要素は、10％ Donor Bovine Serium with Iron（DBSI；Life Technologies、カタログ番号10371-029）および1％ペニシリン／ストレプトマイシン（Lonza、カタログ番号DE17-603E）である。
SKOV-3細胞（ヒト卵巣腺癌；ATCC、カタログ番号HTB-77）を、L-グルタミンおよびHEPESを含むマッコイ5A培地（Lonza、カタログ番号BE12-168F）中で培養した。構成要素は、10％ Donor Bovine Serium with Iron（DBSI；Life Technologies、カタログ番号10371-029）および1％ペニシリン／ストレプトマイシン（Lonza、カタログ番号DE17-603E）である。
Calu-1細胞（ヒト肺類表皮癌；ATCC、カタログ番号HTB-54）を、カトペプトン（Catopeptone）を含み、HEPESを含まないマッコイ5A培地（Life Technologies、カタログ番号26600-023）中で培養した。構成要素は、10％ Donor Bovine Serium with Iron（DBSI；Life Technologies、カタログ番号10371-029）および0.85％ NaCl溶液中の1％ L-グルタミン（200 nM）（Lonza、カタログ番号BE17-605F）および1％ペニシリン／ストレプトマイシン（Lonza、カタログ番号DE17-603E）である。Calu-1細胞は、EGFR標的療法に対して耐性である。
LCLC-103H細胞（ヒト大細胞肺癌）、A431細胞（ヒト類表皮腺癌）、およびMDA-MB-231細胞（ヒト乳癌）は、実施例8に記載されているように培養した。
ヒト腫瘍細胞株の形質膜上のAXL発現の定量
ヒト腫瘍細胞株の形質膜上のAXL発現を、QIFIKIT（DAKO、カタログ番号K0078）をマウスモノクローナル抗体Z49M（Santa Cruz biotechnology、カタログ番号sc-73719）とともに用いた間接免疫蛍光により評価した。接着細胞をトリプシン処理し、セルストレーナーを通過させて、単一細胞懸濁液を取得した。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によってペレットにし、PBSで洗浄して、1×106細胞／mLの濃度で再懸濁した。次の工程は、氷上で行った。100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり100,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル丸底プレート（Greiner Bio-One、カタログ番号650101）に播種した。細胞を、300×gで3分間の遠心分離によってペレットにし、10μg/mLの濃度の50μL抗体試料またはマウスIgG1アイソタイプ対照試料（BD/Pharmingen、カタログ番号555746）中に再懸濁した。4℃で30分のインキュベーション後に、細胞をペレットにし、150μL FACS緩衝液中に再懸濁した。セットアップおよび較正ビーズを、製造業者の説明書にしたがってプレートに添加した。細胞およびビーズを、並行して、150μL FACS緩衝液でさらに2回洗浄し、50μLのFITCコンジュゲートヤギ抗マウスIgG（1/50；DAKO、カタログ番号K0078）中に再懸濁した。二次抗体を、4℃で30分間、暗所でインキュベートした。細胞およびビーズを、150μL FACS緩衝液で2回洗浄し、100μL FACS緩衝液中に再懸濁した。免疫蛍光を、FACS Canto II（BD Biosciences）上で、生細胞のゲート内の10,000イベントを記録することによって測定した。較正ビーズの平均蛍光強度を、GraphPad Prismソフトウェア（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を用いて較正曲線を算出するために使用した。各細胞株について、抗体結合能力（ABC）、形質膜上に発現しているAXL分子の数の推定値を、較正曲線の方程式に基づき、AXL抗体染色細胞の平均蛍光強度を用いて算出した（GraphPadソフトウェアを用いた、標準曲線からの未知のものの内挿）。
細胞傷害アッセイ
LCLC-103H、A431、MDA-MB-231、NCI-H226、NCI-H661、NCI-H1299、LS174T、およびSKOV-3細胞について、インビトロ細胞傷害アッセイを、実施例8に記載されているように行った。Calu-1については、細胞培養を5日の代わりに11日インキュベートしたという調節を伴い、実施例8に記載されているように行った。用量応答曲線を、Graphpad Prismソフトウェアを使用し、非線形回帰解析を用いて生成した。1μg/mLのIgG1-AXL-107-vcMMAE濃度での生細胞のパーセンテージを、用量応答曲線から内挿した。
図24に示されるように、IgG1-AXL-107-vcMMAEは、高いAXL発現を有する細胞株において最も強力な細胞傷害を誘導したのに対して、低いAXL発現を有する細胞株においては、細胞傷害は低かったか、または欠如していた。図はまた、IgG1-AXL-107-vcMMAEが、Calu-1などのEGFR標的療法に対して耐性である細胞における細胞傷害の誘導に有効であることも示す。
実施例21 - NSCLC患者由来異種移植片(PDX)モデルにおけるエルロチニブと組み合わせたIgG1-AXL-107-vcMMAEの改善された抗腫瘍効果
LU2511 PDXモデル
IgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍活性を、BALB/cヌードマウスでの皮下エルロチニブ耐性NSCLC PDXモデルLU2511において評価した(Crown Bioscience社(Changping District, 北京, 中国)で実施した実験)。患者由来のNSCLC異種移植片(LU2511)を有するドナーマウスからの腫瘍断片を、BALB/cヌードマウスへの接種のために使用した。各マウスの右脇腹に1つの腫瘍断片(直径2～3mm)を皮下接種し、腫瘍体積が約200mm3になるまで腫瘍を増殖させた。動物の無作為化を次のように行った：約200mm3の体積の腫瘍がある動物を、群の腫瘍体積の同等の中央値および平均値を考慮して、5つの実験群(1群8匹)に割り振った。処置群は次の通りであった：IgG1-b12、IgG1-b12-vcMMAE、IgG1-AXL-107-vcMMAE、エルロチニブ、およびエルロチニブ＋IgG1-AXL-107-vcMMAE。抗体およびADCを、無作為化の日(0日目)と7日目に4mg/kgで静脈内(i.v.)投与した。エルロチニブは50mg/kg/日で2週間経口(per os)投与した。腫瘍体積(mm3)は、週に2回モニターして、キャリパー(PLEXX)測定値から0.5×(長さ)×(幅)2として算出した。
図25は、マウスのエルロチニブによる治療が、予想された抗腫瘍活性を誘導しなかったことを示す。IgG1-AXL-107-vcMMAEは、IgG1-b12 (10日目でp＜0.01、一元配置ANOVA検定；図25B)およびIgG1-b12-MMAE (10日目でp＜0.05、一元配置ANOVA検定；図25B)対照群と比較して、LU2511腫瘍の増殖抑制を誘導した。IgG1-AXL-107-vcMMAEとエルロチニブの組み合わせによるマウスの治療は、このモデルにおいてIgG1-AXL-107-vcMMAE単独よりも強力な抗腫瘍活性を誘導した(17日目でp＜0.05、一元配置ANOVA検定；図25C)。
LU0858 PDXモデル
IgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍活性を、BALB/cヌードマウスでの皮下エルロチニブ耐性NSCLC PDXモデルLU0858において評価した(Crown Bioscience社(Changping District, 北京, 中国)で実施した実験)。腫瘍断片のBALB/cヌードマウスへの接種および無作為化を上記のように実施した。
群の無作為化後0日目と7日目に、IgG1-AXL-107-vcMMAE (2または4mg/kg)による治療を行った(図32)。EGFR阻害剤エルロチニブと組み合わせたIgG1-AXL-107-vcMMAE治療も試験した。エルロチニブは50mg/kgの用量で14日間毎日投与した。エルロチニブ単独、IgG1-b12-vcMMAEおよびIgG1-b12を対照として用いた。エルロチニブ単独では腫瘍増殖に効果がなかった。2mg/kgで、IgG1-AXL-107-vcMMAE単独では腫瘍増殖に効果がなかった。4mg/kgでは、IgG1-AXL-107-vcMMAE単独は、IgG1-b12-vcMMAE対照と比較して、腫瘍増殖の抑制を誘導した。4mg/kgのIgG1-AXL-107-vcMMAEとエルロチニブとの組み合わせは、IgG1-AXL-107-vcMMAE単独に対する成果を改善しなかった(図32)。2mg/kgのIgG1-AXL-107-vcMMAE治療へのエルロチニブの添加は、4mg/kgのIgG1-AXL-107-vcMMAEを受け取った群と同様の増殖抑制をもたらした。
LU1868 PDXモデル
IgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍活性を、BALB/cヌードマウスでの皮下エルロチニブ耐性NSCLC PDXモデルLU1858において評価した(Crown Bioscience社(Changping District, 北京, 中国)で実施した実験)。腫瘍断片のBALB/cヌードマウスへの接種および無作為化を上記のように実施した。
群の無作為化後0日目と7日目に、IgG1-AXL-107-vcMMAE (2または4mg/kg)による治療を行った。EGFR阻害剤エルロチニブと組み合わせたIgG1-AXL-107-vcMMAE治療も試験した。エルロチニブは50mg/kgの用量で14日間毎日投与した。エルロチニブ単独、IgG1-b12-vcMMAEまたはIgG1-b12による治療を対照として含めた(図33)。
マン・ホイットニー検定による分析を、IgG1-b12またはIgG1-b12-vcMMAEに対する治療効果を比較するために21日目に、エルロチニブと組み合わせたIgG1-AXL-107-vcMMAE 2mg/kgに対するIgG1-AXL-107-vcMMAE 2mg/kg単独の効果を比較するために28日目に、エルロチニブと組み合わせたIgG1-AXL-107-vcMMAE 4mg/kgに対するIgG1-AXL-107-vcMMAE 4mg/kg単独の効果を比較するために31日目に行った。エルロチニブ単独では腫瘍増殖に効果がなかった。2mg/kgおよび4mg/kgで、IgG1-AXL-107-vcMMAE単独は腫瘍増殖の抑制を誘導したが、IgG1-AXL-107-vcMMAEとエルロチニブとの組み合わせは、IgG1-AXL-107-vcMMAE単独に対する成果を改善しなかった(図33)。
LXFA 526 PDXモデル
IgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍活性を、皮下エルロチニブ耐性NSCLC PDXモデルLXFA 526において評価した(Oncotest社(Freiburg, ドイツ)で実施した実験)。4～6週齢の雄NMRI nu/nuマウスへの腫瘍断片の接種および無作為化を上記のように実施した。
群の無作為化後0日目と7日目に、IgG1-AXL-107-vcMMAE (2または4mg/kg)による治療を行った(図34)。EGFR阻害剤エルロチニブと組み合わせたIgG1-AXL-107-vcMMAE治療も試験した。エルロチニブは50mg/kgの用量で14日間毎日投与した。エルロチニブ単独、IgG1-b12-vcMMAEおよびIgG1-b12を対照として用いた。エルロチニブ単独では腫瘍増殖に効果がなかった。IgG1-AXL-107-vcMMAEは2mg/kgの用量で腫瘍増殖の抑制を誘導した。一方、4mg/kgの用量では、IgG1-AXL-107-vcMMAEは少なくとも76日目まで全てのマウスにおいて完全な腫瘍退縮を誘導した。2mg/kgまたは4mg/kgの用量レベルでのIgG1-AXL-107-vcMMAEのエルロチニブとの併用治療は、IgG1-AXL-107-vcMMAE単独と比較して同様の抗腫瘍活性を示した(図34)。
LXFA 677モデルおよびLXFA 677_3PDXモデル
IgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍活性を、皮下エルロチニブ耐性NSCLC PDXモデルLXFA 677およびLXFA 677_3モデル(LXFA 677モデルに由来し、エルロチニブに対する獲得耐性を有する)において評価した(Oncotest社(Freiburg, ドイツ)で実施した実験)。4～6週齢の雄NMRI nu/nuマウスへの腫瘍断片の接種および無作為化を上記のように実施した。
群の無作為化後0日目と7日目に、IgG1-AXL-107-vcMMAE (2または4mg/kg)による治療を行った。EGFR阻害剤エルロチニブと組み合わせたIgG1-AXL-107-vcMMAE治療も試験した。エルロチニブは50mg/kgの用量で14日間毎日投与した。エルロチニブ単独、IgG1-b12-vcMMAEおよびIgG1-b12を対照として用いた。エルロチニブは、LXFA 677モデルにおいて部分的腫瘍退縮を誘導したが、エルロチニブ耐性LXFA 677_3モデルでは、予想されたように、腫瘍増殖に効果がなかった(図35)。IgG1-AXL-107-vcMMAEは、2mg/kgの用量で腫瘍増殖の抑制を誘導し、一方、4mg/kgの用量では、IgG1-AXL-107-vcMMAEは、LXFA 677モデルにおいて部分的腫瘍退縮を誘導した。エルロチニブ耐性LXFA 677_3モデルにおいて、IgG1-AXL-107-vcMMAEは両方の用量レベルで完全な腫瘍退縮を誘導し、これは少なくとも41日目まで持続した。これら2つのモデルにおいて、4mg/kgまたは2mg/kgでのIgG1-AXL-107-vcMMAEのエルロチニブとの併用治療は、IgG1-AXL-107-vcMMAE単独と比較して同様の抗腫瘍活性を誘導した(図35)。
（表１７）肺PDXモデル、EGFR変異状態、ならびにエルロチニブおよびAXL-ADCに対する応答の概要
Figure 2024038480000044
a Yang et al. EORTC meeting 2013 , Poster 493 (2013)
b Yang et al. Int. J. Cancer: 132, E74-E84 (2013)
c Tschuch et al. AACR-EORTC meeting 2015 , Poster A10 (2015)
実施例22 - EGFR阻害剤であるエルロチニブ、ゲフィチニブおよびアファチニブに耐性であるNSCLC細胞株は、インビトロで高度のAxlタンパク質発現およびIgG1-AXL-107-vcMMAEに対する高感受性を示す
NSCLC細胞株のパネルにおいて、Axlタンパク質発現に及ぼすエルロチニブに対する獲得耐性の影響をウェスタンブロット分析で評価した。さらに、NSCLC細胞株をIgG1-AXL-107-vcMMAEに対するそれらの感受性についてインビトロで評価した。
細胞培養および抗癌剤
全ての組織培養材料は、Gibco Life Technologies社(Carlsbad, CA)から入手した。エルロチニブ感受性NSCLC腺癌細胞株HCC827は、ATCCから購入した。HCC827細胞はKRAS野生型であり、EGFR-TKIに対する感受性に関連するEGFRのエクソン19欠失(exon19del)変異(E746～A750の欠失)を有する。細胞を、10％ウシ胎仔血清(FBS)および50μg/mLペニシリン-ストレプトマイシンを補充したRPMI-1640 Glutamax培地中で培養し、37℃で5％CO2の加湿雰囲気中に維持した。EGFR阻害剤(エルロチニブ、ゲフィチニブおよびアファチニブ)はSelleck Chemicals社(Houston, TX)から購入した。エルロチニブとゲフィチニブはDMSO中に溶解し、分注して-20℃で保存した。
ショートタンデムリピート解析
細胞株の真正(authenticity)を確認するために、Cell ID(商標)System(カタログ番号G9500, Promega社, Madison, 米国)を用いてメーカーの説明に従ってショートタンデムリピート(STR)解析を行った。簡潔に述べると、ヒトゲノムの10個の特定遺伝子座をPCR増幅し、キャピラリー電気泳動で分析した。本発明者らは、ER10、ER20およびER30が10個全ての遺伝子座で親HCC827クローンと同じ対立遺伝子サイズを有することを見出した。本発明者らはまた、対立遺伝子座のサイズがATCCによって公表されたものと同一であることを見出した。
DNA精製およびEGFR/KRAS変異試験
QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen社, Hilden, ドイツ)を用いて該細胞からDNAを抽出し、TheraScreen EGFR RGQ PCRキットおよびTheraScreen KRAS RGQ PCRキット(Qiagen社, Hilden, ドイツ)をメーカーの記載の通りに用いて、EGFRおよびKRASの変異状態を調べた。
エルロチニブまたはAXL-ADCに対する細胞株の感受性を試験するためのインビトロ細胞傷害アッセイ
2000個/ウェル(ER20の場合には5000個)の細胞を96ウェルプレートに播種し、6～8時間付着させてからエルロチニブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、IgG1-AXL-107-vcMMAEまたはアイソタイプ対照ADCのIgG1-b12-vcMMAEを添加した；その後、37℃、5％CO2で5日間インキュベートし、Cell Titer Gloアッセイ(実施例8に記載)で定量した。未処置細胞を100％細胞増殖の基準として使用した。プレートを37℃、5％CO2で4または5日間インキュベートした。クリスタルバイオレットアッセイを実施するために、染色溶液を室温で5分間添加し、細胞をH2Oで2回洗浄し、クエン酸Na緩衝液(50％EtOH中のクエン酸Na 29.41g)に再溶解して、570nmでの吸光度を測定した。
エルロチニブまたはゲフィチニブ耐性NSCLC細胞株の作製
3つの同系のエルロチニブ耐性細胞株を、エルロチニブへの連続曝露によって、HCC827細胞株から作製した。細胞を最初に1μMのエルロチニブに曝露し、エルロチニブ濃度を6ヶ月間にわたってそれぞれ20μMまたは30μMに徐々に増加させた。細胞株がエルロチニブ耐性を獲得したら、20μMまたは30μMのエルロチニブを補充した上記の培地で培養した。
同様に、1つの同系のエルロチニブ耐性細胞株および5つのゲフィチニブ耐性細胞株を、エルロチニブまたはゲフィチニブへの連続曝露によって、PC9細胞株から作製した。細胞を最初に1μMのエルロチニブまたはゲフィチニブに曝露し、TKI濃度を6ヶ月間にわたって30μMまで徐々に増加させた。
ウェスタンブロッティング
Axlの発現をウェスタンブロット分析により確かめた。Axl活性化は、リン酸化特異的抗体を用いてリン酸化を測定することによって確認した。細胞を氷冷TBSで洗浄し、スピンダウンし、プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤(Complete Mini PhosphoSTOP, Roche社, Basel, スイス)の両方を含有するRIPA緩衝液(10mM Tris HCl pH8, 5mM Na2EDTA pH8, 1％NP-40, 0.5％デオキシコール酸ナトリウム, 0.1％SDS)中で溶解させた。タンパク質濃度は、Pierce BCAタンパク質アッセイ(Thermo Fisher Scientific社, 米国)によってメーカーのプロトコルに従って測定した。5～40μgのタンパク質を4～12％のRunBlue SDS-PAGEゲル(Expedeon社, San Diego, CA)上で分離し、PVDFメンブレン(GE Healthcare Life Sciences社, デンマーク)に移し、ブロックし、その後一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。抗アクチン抗体をAbcam社(カタログ番号ab8226)から購入し、総AXLに対する抗体をR&D Systems社(カタログ番号AF154)から購入した。次いで、該メンブレンをヤギ抗ウサギ、ヤギ抗マウス(Dako社, デンマーク)またはロバ抗ヤギ(Santa Cruz社) HRP結合二次抗体と共に1：5000希釈にて室温で1時間インキュベートした。免疫反応性バンドをAmersham ECL Primeウェスタンブロッティング検出試薬(GE Healthcare Life Sciences社, Buckinghamshire, 英国)で可視化し、CL-Xposureフィルム(Thermo Fisher Scientific社, 米国)に露光した。
結果
HCC827野生型細胞株は、エルロチニブ処置に対して非常に感受性が高く、IC50は約0.005μMであった。漸増濃度のエルロチニブに6ヶ月間曝露することによって作製されたエルロチニブ耐性細胞株ER10、ER20およびER30は、エルロチニブに感受性でなかった(IC50＞50μM)(表18)。エルロチニブ耐性表現型の安定性は、ER10、ER20およびER30細胞株をエルロチニブの非存在下で6週間培養することによって確認した。6週間後、細胞株は同レベルのエルロチニブ耐性を示した。エルロチニブ耐性細胞株のEGFRおよびKRASの変異状態は、親細胞株と比較して変化していなかった(表18)。Axlタンパク質の発現は、エルロチニブに対する耐性を獲得したHCC827由来の細胞株においてアップレギュレートされた(図26A)。Axlのアップレギュレーションは、該細胞株をエルロチニブの非存在下で培養したときに保存された(図26A)。
同様に、Axlタンパク質の発現は、エルロチニブまたはゲフィチニブに対する耐性を獲得したPC9由来の細胞株においてもアップレギュレートされた(図26B)。
（表１８）親HCC827細胞株および誘導されたエルロチニブ耐性細胞株の特性
Figure 2024038480000045
野生型およびエルロチニブ/ゲフィチニブ耐性のHCC827細胞およびPC9細胞のIgG1-AXL-107-vcMMAEに対する感受性を評価した。そのため、細胞を漸増濃度(10μg/mL～3.8×10-5μg/mLの範囲)のIgG1-AXL-107-vcMMAEに5日間曝露し、その後、細胞生存率を測定した。図27AおよびBは、野生型のHCC827細胞およびPC9細胞がIgG1-AXL-107-vcMMAEによる処置に対して非感受性である(図27FおよびJ)が、EGFR阻害剤で処置すると生存率が大きく低下する(図27CおよびI)ことを示している。EGFR-TKIエルロチニブに対する耐性を獲得したHCC827-ER20およびHCC827-ER30細胞株は、EGFR-TKIゲフィチニブおよびアファチニブに対しても耐性であった(図27DおよびE)が、IgG1-AXL-107-vcMMAEで処置すると生存率の低下を示した(図27A)。EGFR-TKIエルロチニブに対する耐性を獲得したPC9-ER細胞株(図27I)もまた、IgG1-AXL-107-vcMMAEで処置した際に生存率の低下を示した(図27BおよびK)。対照ADCのIgG1-b12-vcMMAEによる処置は、試験したいずれの細胞株においても10μg/mLの濃度まで細胞生存率に影響を与えなかった(図27F、G、H、JおよびK)。
実施例23 - BRAF阻害剤PLX4720に対する耐性は、アップレギュレートされたAxlタンパク質発現およびIgG1-AXL-107-vcMMAEに対する高い感受性と関連している
樹立ヒトメラノーマ細胞株(CDX)および患者由来の低継代メラノーマ細胞株(PDX)のパネルにおいて、Axlタンパク質の発現およびIgG1-AXL-107-vcMMAEに対する感受性を、BRAF阻害剤PLX4720(臨床的に承認されたBRAF阻害剤ベムラフェニブの類似体)での処置による増殖抑制に対するそれらの内因性耐性または獲得耐性との関連で、評価した。
細胞培養
SKMEL147は、オランダ癌研究所(Netherlands Cancer Institute)のReuven Agami研究室から入手した。A875はThermo Fisher社から、COLO679はSigma社から、SKMEL28およびA375細胞はATCCから入手した。メラノーマ細胞株は、10％ウシ胎仔血清(Sigma社)、100U/mlペニシリンおよび0.1mg/mlストレプトマイシン(全てGibco社)を補充したDMEM中で培養した。これらの細胞株は、5％(vol/vol)CO2加湿インキュベータ内で37℃に維持した。
PLX4720耐性細胞株の作製
BRAF阻害剤感受性細胞株(SKMEL28およびA375)を3μMまでの漸増濃度のBRAF阻害剤PLX4720(会社: Selleck Chemicals, Houston, TX, 米国, カタログ番号: S1152)の存在下で培養して、対応するPLX4720耐性SKMEL28RおよびA375Rを樹立した。全ての薬剤耐性細胞株は、3μMのPLX4720の存在下で永続的に培養した。
患者由来の低継代(PDX)メラノーマ細胞株の作製
オランダ癌研究所のAntoni van Leeuwenhoek病院の医療倫理委員会は、ヒト組織の採取と使用を承認した。動物実験は、同研究所の動物実験委員会によって承認され、適用すべき規則および法規に従って実施した。ヒト腫瘍材料は、手術中に取得するか、または14ゲージ針を用いて悪性メラノーマ患者から腫瘍生検を採ることによって得た。約5mm3の腫瘍断片をNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1wjl/SzJマウスの皮下移植に使用し、移植を麻酔下で行った。腫瘍の成長をキャリパーで週2回測定した。腫瘍サイズが1000mm3に達する前に、マウスを犠牲にし、腫瘍を摘出し、腫瘍片を単細胞懸濁液へと解離させ、10cm培養皿上にプレーティングして、DMEM＋10％FBS(Sigma社)＋100U/mlペニシリンおよび0.1mg/mlストレプトマイシン(全てGibco社)中で初代細胞培養物として増殖させた。
ウェスタンブロット分析
AxlおよびMITFの発現を、ウェスタンブロット分析を用いて測定した。細胞溶解物中のタンパク質を4～12％のSDS-PAGEゲル上で分離し、PVDFメンブレンに移した後、PBS-Tween中の5％BSA中でAxlに特異的な抗体(sc-1096, Santa Cruz社)により染色するか、またはニトロセルロース膜に移して、PBS-Tween中の5％無脂肪粉乳中でMITF (abl2039, Abcam社)により染色した。ゲルローディングを調整するために、ビンキュリンまたはβ-アクチンに対する抗体を使用した。
メラノーマ細胞株の形質膜上のAXL発現の定量
ヒト腫瘍細胞株の形質膜上のAXL発現は、QIFIKIT分析(DAKO社, カタログ番号K0078)を用いた間接免疫蛍光法により定量した。マウスモノクローナル抗体ab89224(Abcam社, Cambridge, 英国)を用いてAxlを検出した。接着細胞をトリプシン処理し、細胞ストレーナーに通して単細胞懸濁液を得た。細胞を1200rpmで5分間遠心分離してペレット化し、PBSで洗浄し、1×106細胞/mLの濃度で再懸濁した。次の工程は氷上で行った。100μLの単細胞懸濁液(ウェルあたり100,000細胞)をポリスチレン96ウェル丸底プレート(Greiner Bio-One社, カタログ番号650101)に播種した。細胞を300×gで3分間遠心分離してペレット化し、10μg/mLの濃度の抗体サンプルまたはマウスIgG1アイソタイプ対照サンプル(カタログ番号QF2040741, ロット番号MA1-10406, Pierce社)50μL中に再懸濁した。4℃で30分間インキュベートした後、細胞をペレット化し、150μLのFACS緩衝液(0.1％BSAを含むPBS)に再懸濁した。セットアップ用およびキャリブレーション用ビーズをメーカーの説明書に従ってプレートに添加した。並行して細胞およびビーズを150μLのFACS緩衝液で2回以上洗浄し、50μLのFITC結合ヤギ抗マウスIgG (1/50; DAKO社, カタログ番号K0078)に再懸濁した。二次抗体を暗所にて4℃で30分間インキュベートした。細胞およびビーズを150μLのFACS緩衝液で2回洗浄し、100μLのFACS緩衝液に再懸濁した。生細胞ゲート内で10,000事象を記録することにより、FACS Calibur (BD Biosciences社)上で免疫蛍光を測定した。キャリブレーション用ビーズの平均蛍光強度は、GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software社, San Diego, CA, 米国)を用いてキャリブレーション曲線を作成するために使用した。各細胞株について、形質膜上に発現されたAXL分子の数の推定値である抗体結合能(ABC)は、キャリブレーション曲線の式(GraphPadソフトウェアを用いて、標準曲線からの未知数の補間)に基づいて、AXL抗体で染色された細胞の平均蛍光強度を用いて算出した。
インビトロ細胞傷害性
細胞をほぼコンフルエントになるまで培養した後、細胞をトリプシン処理し、培地に再懸濁し、細胞ストレーナー(BD Falcon社, カタログ番号352340)に通して単細胞懸濁液を得た。細胞を、次の播種密度を用いて96ウェルフォーマットで培養した：樹立細胞株については2000細胞/ウェル、PDX由来細胞株については4000細胞/ウェル。播種の4時間後にIgG1-AXL-107-vcMMAEを添加した。IgG1-AXL-107-vcMMAEの連続希釈液(10倍;最終濃度0.0001～10μg/mLの範囲)を培地中に調製して、プレートに添加した。37℃、5％CO2での5日間(CDサンプルについて)または8日間(PDXサンプル)のインキュベーション後に、CellTiter-Glo試薬(Promega社; カタログ番号G7571)をウェルに加え、発光細胞生存率アッセイ(Luminescent Cell Viability Assay; Promega社, Madison, WI)をメーカーのプロトコルに従って行った。発光(ルミネセンス)をInfinite M200マイクロプレートリーダー(Tecan社)で測定し、生存率を次のように計算した：生存率％＝(ルミネセンス対象サンプル－ルミネセンスPAO)/(処理された対照ビヒクルの平均ルミネセンス－ルミネセンスPAO)、ここでPAOは100％細胞死滅のための5μMフェニルアルシンオキシドを表す。
SKMEL147メラノーマ異種移植片モデル
IgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍活性は、NMRIヌードマウスの皮下メラノーマモデルSKMEL147において評価した。マウスの左脇腹に、マトリゲル中1：1に再懸濁した2.5×105個のSKMEL147メラノーマ細胞(高レベルのAxlを発現する；図28および表15参照)を全量100μLで皮下注入した。腫瘍をキャリパーで週3回測定し、腫瘍が100mm3になったとき、動物を次の治療群に無作為化した：IgG1-b12 (4mg/kg)、IgG1-b12-vcMMAE (4mg/kg)、IgG1-107 (4mg/kg)、IgG1-107-vcMMAE (2mg/kg)、およびIgG1-107-vcMMAE (4mg/kg)。
腫瘍細胞注入後12日目および19日目(無作為化の1日目および8日目)に、試験化合物を全量100μlで動物の尾静脈に注入した。腫瘍サイズが1000mm3を超えたとき、動物を犠牲にした。
SKMEL28野生型細胞とPLX4720耐性SKMEL28細胞との混合集団の処置
SKMEL28野生型細胞およびPLX4720に耐性のSKMEL28細胞(SKMEL28-R)を、それぞれ、蛍光色素分子mCherry(赤色)またはGFP(緑色)の発現ベクターでトランスフェクトした。続いて、6ウェルプレートに各細胞株50,000個(合計で100,000細胞/ウェル)を用いて、1：1の比で細胞を播種した。3時間後、次の化合物をウェルに加えた：IgG1-AXL-107-vcMMAE (1μg/mL)、IgG1-b12-MMAE (1μg/mL; アイソタイプ対照ADC)、PLX4720 (10μM; BRAF阻害剤)、ダブラフェニブ(1μM; BRAF阻害剤)、またはトラメチニブ(0.1μM; MEK阻害剤)。4日後、細胞をトリプシン処理し、PBS＋1％BSAで1回洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。
免疫組織化学
AXLの発現は、新たに切除してパラフィン包埋し、ホルマリン固定した(FFPE)、悪性メラノーマを含む全組織(WT)において評価した。染色はSequenzaスライドラック(Ted Pella社, Redding, CA, 米国; カタログ番号36105)で手作業により行った。
染色前に、FFPE組織スライドを、室温にて、100％キシレン(Sigma-Aldrich社, カタログ番号16446; 3回、5分)中で脱パラフィンし、96％エタノール(Sigma-Aldrich社, カタログ番号32294; 2回、5分)中で脱水した。その後、抗原回復を行った。IHCスライドをクエン酸緩衝液(pH6; DAKO社; カタログ番号S2369)中で5分間インキュベートし、クエン酸/リン酸緩衝液(0.43Mクエン酸, 0.35M Na2HPO4・2H2O; pH5.8)中で内因性ペルオキシダーゼを室温で15分間ブロックした。スライドを、一次抗体とのインキュベーションの前に、PBS中の10％正常ヒト血清(CLB/Sanquin社, カタログ番号K1146)中でインキュベートした。Axl発現は、2％正常ヒト血清を補充したPBS中の3μg/mLのウサギポリクローナル抗ヒトAxl抗体H-124と共に室温で60分間インキュベートすることにより測定した。スライドを0.1％Tween-20を補充したPBSで洗浄し(2回、3分)、Axlに特異的なウサギ抗体の結合を、未希釈のBright VisionポリHRP抗ウサギIgGにより検出した。HRPを3-アミノ-9-エチルカルバゾール(AEC)発色団(赤色; Sigma社, カタログ番号A6926-100TAB)で可視化した；核をヘマトキシリン(DAKO社, カタログ番号S3309)で対比染色した。オランダ癌研究所(NKI, Amsterdam, オランダ)の認定病理学者がスライドを分析して、各サンプルにおけるAxl染色の強度および局在を評価した。例を図39に示す。
結果
AXL発現は、樹立メラノーマ細胞株(表19)および低継代初代メラノーマ株(PDX、表20)のパネルにおいて評価した。ウェスタンブロットで測定されたAXL発現(図28)は、樹立細胞株(図28A)でも臨床患者由来サンプル(図28B)でもMITF発現に逆相関した。樹立細胞株のパネルでは、Axl発現を定量的フローサイトメトリーによっても測定した。AXL陰性および陽性細胞株の例を図29に示す。全ての細胞株についてのAxl発現レベル(ABCとして表される)を、これらの細胞株のBRAF変異状態と共に、表19に示す。
次に、樹立メラノーマ細胞株およびPDXのパネルのIgG1-AXL-107-vcMMAEに対する感受性を生存率アッセイで評価した。細胞をIgG1-AXL-107-vcMMAEの漸増濃度(範囲1×10-4～10μg/mL)に5日間曝露した後、細胞生存率を測定した。結果を表19および20に要約し、用量応答曲線を図30および31に示す。図30は、4つ全てのAXL発現細胞株(SKMEL147、A875、A375R、SKMEL28R)が、そのうちの3つはPLX4720に耐性であったものの、IgG1-AXL-107-vcMMAE処置に感受性であることを示す。2つのAXL陰性細胞株COL0679およびSKMEL28は、IgG1-AXL-107-vcMMAEで処置した際に生存率の変化を示さなかった。3つのPLX4720耐性PDXサンプルを、IgG1-AXL-107-vcMMAEを用いて生存率アッセイで試験した。図31に示すように、2つのAXL高発現PDX培養物MO16およびMO19RはIgG1-AXL-107-vcMMAEによる処置に感受性であったのに対し、AXL低発現PDX培養物M082はIgG1-b12-vcMMAE対照処置で見られた応答と異なる応答を示さなかった。
（表１９）メラノーマ細胞株パネルの特性
Figure 2024038480000046
*BLQ＝定量下限値未満(＜3300、キャリブレーションビーズの最低ABC値)
（表２０）患者由来メラノーマ培養物の特性
Figure 2024038480000047
SKMEL147メラノーマ異種移植片モデルにおいて、IgG1-b12、IgG1-b12-vcMMAE、またはIgG1-AXL-107で治療したマウスは腫瘍増殖の抑制を示さなかった。IgG1-AXL-107-vcMMAEは2mg/kgで腫瘍増殖の抑制を誘導し、4mg/kgの用量では強い腫瘍退縮を誘導し、これは50日目頃まで持続した(図36A)。
こうして、4mg/kgの用量でのHuMax-AXL-ADCは顕著な抗腫瘍効果を示したが、腫瘍は50日目以後に再び増殖を開始した。4mg/kgのIgG1-AXL-107-vcMMAEによる初期の腫瘍退縮後に腫瘍の再増殖を示した4匹のマウスを、55日目に4mg/kgのIgG1-AXL-107-vcMMAEの単回投与で再治療し、その間比較のために他の2匹のマウスを観察した。
4mg/kgのIgG1-AXL-107-vcMMAEによる再治療は、4匹全てのマウスにおいて腫瘍退縮をもたらしたが、観察された2匹のマウスは腫瘍増殖を示した(図36B)。再治療した4匹のマウスのうち2匹は少なくとも80日目まで続く腫瘍退縮を示したが、他の2匹の再治療マウスでは70日目頃に腫瘍の再増殖が観察された(図36B)。
SKMEL28野生型(wt)細胞とSKMEL28 PLX4720耐性細胞の混合集団では、細胞混合物をIgG1-AXL-107-vcMMAE、PLX4720、またはダブラフェニブで処置した場合に、未処置の対照と比較して、総細胞数が74～62％減少した(図37A)。細胞混合物をIgG1-AXL-107-vcMMAEとPLX4720、IgG1-AXL-107-vcMMAEとダブラフェニブ、ダブラフェニブとトラメチニブ、またはダブラフェニブとトラメチニブとIgG1-AXL-107-vcMMAEの組み合わせで処置すると、未処置の細胞と比較して、総細胞数の81～92％の減少が誘導された(図37A)。
特定の細胞集団が根絶されたかどうかを評価するために、緑色(GFP陽性SKMEL28-R細胞)と赤色(mCherry陽性SKMEL28細胞)の比を求めた。予想通り、未処置およびIgG1-b12-vcMMAE処置はGFP/mCherry比に影響を及ぼさず、同様に総細胞数も影響を受けなかった(図37B)。IgG1-AXL-107-vcMMAEによる処置はGFP/mCherry比の大幅な低下をもたらし(図37B)、SKMEL28-R細胞の特異的死滅を示した。反対に、BRAF阻害剤であるPLX4720またはダブラフェニブによる処置はGFP/mCherry比を増加させ(図37B)、SKMEL28細胞の特異的死滅を示した。IgG1-AXL-107-vcMMAEとPLX4720、ダブラフェニブとトラメチニブ、またはダブラフェニブとトラメチニブとIgG1-AXL-107-vcMMAEの組み合わせは、1に近い比を示し(図37B)、両方の細胞型が同様の効力で死滅したことを示した。IgG1-AXL-107-vcMMAEとダブラフェニブとの組み合わせによる処置は、GFP/mCherry比を大きく低下させ(図37B)、使用濃度でのSKMEL28-R細胞のより効率的な死滅を示した。
結果IHC
全部で45のサンプルを分析し、そのうちの3つは腫瘍材料を含まなかったので、分析から除外した。さらに、同じ患者からの対合したベムラフェニブ処置前および処置後のサンプル7つと、対合したダブラフェニブ/トラメチニブ処置前および処置後のサンプル1つが含まれていた。
42個のうちの41個のサンプルにおいて、Axl発現がメラノーマ領域のサブセットで検出された。染色強度は患者腫瘍ごとに異なっていた(表21)。
さらに、Axl発現のアップレギュレーション(病理学者が染色強度の増加により測定した)は、対合したベムラフェニブ処置前後のサンプル7つのうち4つにおいて観察された(表21)。
（表２１）メラノーマ患者由来の腫瘍組織におけるAxl染色
Figure 2024038480000048
Figure 2024038480000049
a -：陰性；陽性染色強度：弱く+＜+＜++＜+++；陽性染色領域：散発的＜限局的＜局所的＜部分的；NA：入手不可
実施例24 - CV1664 PDXモデル
IgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍活性を、BALB/cヌードマウスの皮下子宮頸癌PDXモデルCV1664において評価した(CrownBioscience社(Changping District, 北京, 中国)で実施した実験)。BALB/cヌードマウスへの腫瘍断片の接種および無作為化は、実施例21に記載したように行った。
群の無作為化後0日目と7日目に、IgG1-AXL-107-vcMMAE (2または4mg/kg)による治療を行った(図38)。パクリタキセル(20mg/kg；腹腔内)、コンジュゲートされていないIgG1-AXL-107 (4mg/kg)、IgG1-b12-vcMMAE (4mg/kg)およびIgG1-b12 (4mg/kg)による同じ日の治療を、対照として使用した。
IgG1-AXL-107-vcMMAEは、両方の用量レベルで強い腫瘍退縮を誘導し、これは少なくとも49日目まで持続した(図38A、B)。コンジュゲートされていないIgG1-AXL-107およびIgG1-b12-vcMMAEによる治療は、IgG1-b12対照群と比較して、腫瘍増殖のわずかな抑制を誘導したにすぎなかった。パクリタキセルは部分的な腫瘍退縮を誘導した。
4mg/kgのIgG1-AXL-107-vcMMAEを用いた初期腫瘍退縮後に腫瘍の再増殖を示した2匹のマウスを、55日目と62日目に4mg/kgのIgG1-AXL-107-vcMMAEで2回再治療した。これにより、両方のマウスにおいて部分的な腫瘍退縮が生じた(図38C)。腫瘍の再増殖時に、これらのマウスを105日目と112日目に4mg/kgのIgG1-AXL-107-vcMMAEで2回再治療したところ、再び両方の動物において部分的な腫瘍退縮が生じた(図38C)。
パクリタキセルを用いた初期腫瘍退縮後に腫瘍再増殖を示した3匹のマウスを、55日目と62日目に4mg/kgのIgG1-AXL-107-vcMMAEで2回再治療した。3匹のマウスのうち2匹は、IgG1-AXL-107-vcMMAEによる再治療時に完全な腫瘍退縮を示した(図38D)。残りのマウスは部分的な腫瘍退縮を示した。腫瘍の再増殖時に、このマウスを98日目と105日目に4mg/kgのIgG1-AXL-107-vcMMAEで2回再治療したところ、再び部分的な腫瘍退縮が生じた(図38D)。
参照文献
Figure 2024038480000050
Figure 2024038480000051
Figure 2024038480000052
Figure 2024038480000053
Figure 2024038480000054
Figure 2024038480000055
Figure 2024038480000056
Figure 2024038480000057
配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> Genmab A/S
<120> AXL-SPECIFIC ANTIBODY-DRUG CONJUGATES FOR CANCER TREATMENT
<150> PCT/EP2015/065900
<151> 2015-07-10
<150> US 62/278,283
<151> 2016-01-13
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<170> PatentIn version 3.5

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<400> 5
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ile Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Arg Gly Tyr Ser Gly Tyr Val Tyr Asp Ala Phe Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120

<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105

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<211> 121
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 7
Glu Val Gln Leu Leu Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ile Gly Gly Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Gly Phe Ile Met Val Arg Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

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<211> 121
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 8
Glu Val Gln Leu Leu Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ile Gly Gly Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

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<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 9
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> homo sapiens
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Asp Ile Ser Val Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 11
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
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<212> PRT
<213> homo sapiens
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<212> PRT
<213> homo sapiens
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
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<212> PRT
<213> homo sapiens
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<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
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Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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115

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<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 18
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 123
<212> PRT
<213> homo sapiens
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<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
<400> 21
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<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 22
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<210> 23
<211> 124
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
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35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Val Gln Lys Phe
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Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Asp Val Phe Asp
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<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
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<210> 25
<211> 124
<212> PRT
<213> homo sapiens
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Asp Val Phe Asp
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<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 26
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<211> 124
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 27
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<210> 28
<211> 106
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 28
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<210> 29
<211> 124
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 29
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<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 30
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<210> 31
<211> 123
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 31
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<210> 32
<211> 123
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 32
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<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
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<210> 34
<211> 120
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
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100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
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<210> 35
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 35
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105

<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 36
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5

<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 37
Thr Ser Gly Ser Gly Ala Ser Thr
1 5

<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 38
Ala Lys Ile Trp Ile Ala Phe Asp Ile
1 5

<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 39
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5

<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 40
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr
1 5

<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 41
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5

<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 42
Ile Ser Ile Ser Gly Ala Ser Thr
1 5

<210> 43
<211> 13
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 43
Arg Gly Tyr Ser Gly Tyr Val Tyr Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10

<210> 44
<211> 6
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 44
Gln Gly Ile Ser Asn Trp
1 5

<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 45
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5

<210> 46
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 46
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5

<210> 47
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 47
Ile Ser Ile Ser Gly Gly Ser Thr
1 5

<210> 48
<211> 13
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 48
Arg Gly Tyr Ser Gly Tyr Val Tyr Asp Ala Phe Asp Phe
1 5 10

<210> 49
<211> 6
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 49
Gln Gly Ile Ser Asn Trp
1 5

<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 50
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5

<210> 51
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 51
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5

<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 52
Ile Ser Ile Gly Gly Gly Asn Ala
1 5

<210> 53
<211> 14
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 53
Ala Lys Pro Gly Phe Ile Met Val Arg Gly Pro Leu Asp Tyr
1 5 10

<210> 54
<211> 14
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 54
Ala Lys Pro Gly Phe Ile Leu Val Arg Gly Pro Leu Asp Tyr
1 5 10

<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 55
Gln Ser Val Ser Asn Ser Tyr
1 5

<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 56
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr
1 5

<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 57
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5

<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 58
Ile Ser Val Ser Gly Gly Ser Thr
1 5

<210> 59
<211> 18
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 59
Ala Lys Glu Gly Tyr Ile Trp Phe Gly Glu Ser Leu Ser Tyr Ala Phe
1 5 10 15
Asp Ile

<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 60
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5

<210> 61
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 61
Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Phe Thr
1 5

<210> 62
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 62
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala
1 5

<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 63
Ile Ser Val Ser Gly Gly Ser Thr
1 5

<210> 64
<211> 18
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 64
Ala Lys Glu Gly Tyr Ile Trp Phe Gly Glu Ser Leu Ser Tyr Ala Phe
1 5 10 15
Asp Ile

<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 65
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5

<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 66
Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Phe Thr
1 5

<210> 67
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 67
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5

<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 68
Ile Ser Val Ser Gly Gly Ser Thr
1 5

<210> 69
<211> 18
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 69
Ala Lys Glu Gly Tyr Ile Trp Phe Gly Glu Ser Leu Ser Tyr Ala Phe
1 5 10 15
Asp Ile

<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 70
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5

<210> 71
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 71
Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Phe Thr
1 5

<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 72
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr
1 5

<210> 73
<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 73
Ile Asn Gln Ser Gly
1 5

<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 74
Ile Gln Gln Ser Gly Ser Thr
1 5

<210> 75
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 75
Ala Ser Gly Asn Trp Asp His Phe Phe Asp Tyr
1 5 10

<210> 76
<211> 6
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 76
Gln Gly Ile Ser Ser Trp
1 5

<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 77
Gln Gln Ala Lys Ser Phe Pro Trp Thr
1 5

<210> 78
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 78
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr His
1 5

<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 79
Ile Ser His Ser Gly Arg Thr
1 5

<210> 80
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 80
Ala Ser Phe Ile Thr Met Ile Arg Gly Thr Ile Ile Thr His Phe Asp
1 5 10 15
Tyr

<210> 81
<211> 6
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 81
Gln Gly Ile Ser Ser Trp
1 5

<210> 82
<211> 9
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<213> homo sapiens
<400> 82
Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5

<210> 83
<211> 8
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<213> homo sapiens
<400> 83
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5

<210> 84
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 84
Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala
1 5

<210> 85
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 85
Ala Arg Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Asp Val Phe Asp
1 5 10 15
Ile

<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 86
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5

<210> 87
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 87
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Tyr Thr
1 5

<210> 88
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 88
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5

<210> 89
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 89
Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala
1 5

<210> 90
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 90
Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Asp Val Phe Asp
1 5 10 15
Ile

<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 91
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5

<210> 92
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 92
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Tyr Thr
1 5

<210> 93
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 93
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5

<210> 94
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 94
Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Val
1 5

<210> 95
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 95
Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Asp Val Phe Asp
1 5 10 15
Ile

<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 96
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5

<210> 97
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 97
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Tyr Thr
1 5

<210> 98
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 98
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5

<210> 99
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 99
Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Val
1 5

<210> 100
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 100
Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Asp Val Phe Asp
1 5 10 15
Ile

<210> 101
<211> 6
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 101
Gln Ser Val Ser Ser Tyr
1 5

<210> 102
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 102
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Leu Thr
1 5

<210> 103
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 103
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5

<210> 104
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 104
Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala
1 5

<210> 105
<211> 18
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 105
Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Asp Val Phe Asp
1 5 10 15
Ile Ser

<210> 106
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 106
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5

<210> 107
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 107
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Tyr Thr
1 5

<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 108
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr
1 5

<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 109
Ile Ser His Ser Gly Arg Thr
1 5

<210> 110
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 110
Ala Arg Phe Ile Thr Met Ile Arg Gly Ala Ile Ile Thr His Phe Asp
1 5 10 15
Tyr

<210> 111
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 111
Ala Arg Phe Ile Thr Leu Ile Arg Gly Ala Ile Ile Thr His Phe Asp
1 5 10 15
Tyr

<210> 112
<211> 6
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 112
Gln Gly Ile Ser Ser Trp
1 5

<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 113
Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5

<210> 114
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 114
Gly Phe Ser Phe Ser Thr Tyr Ala
1 5

<210> 115
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 115
Ile Ser Tyr Asp Gly Asp Asn Lys
1 5

<210> 116
<211> 13
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 116
Ala Arg Gly Arg Lys Leu Gly Ile Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10

<210> 117
<211> 6
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 117
Gln Gly Ile Ser Ser Ala
1 5

<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 118
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Phe Thr
1 5

<210> 119
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Wherein X is A or G
<400> 119
Ile Ser Ile Ser Gly Xaa Ser Thr
1 5

<210> 120
<211> 13
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> Misc
<222> (13)..(13)
<223> Wherein X is I of F
<400> 120
Arg Gly Tyr Ser Gly Tyr Val Tyr Asp Ala Phe Asp Xaa
1 5 10

<210> 121
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Wherein X is I or F
<400> 121
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Xaa
1 5

<210> 122
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Wherein X is S or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Wherein X is T or A
<400> 122
Ala Xaa Phe Ile Thr Met Ile Arg Gly Xaa Ile Ile Thr His Phe Asp
1 5 10 15
Tyr

<210> 123
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Wherein X is S or N
<400> 123
Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Tyr Ala
1 5

<210> 124
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 124
Ile Ser Val Ser Gly Gly Ser Thr
1 5

<210> 125
<211> 18
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 125
Ala Lys Glu Gly Tyr Ile Trp Phe Gly Glu Ser Leu Ser Tyr Ala Phe
1 5 10 15
Asp Ile

<210> 126
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Wherein X is A or V
<400> 126
Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Xaa
1 5

<210> 127
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Wherein X is D or N
<400> 127
Ala Arg Arg Gly Xaa Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Asp Val Phe Asp
1 5 10 15
Ile

<210> 128
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Wherein X is S or deleted
<400> 128
Gln Ser Val Xaa Ser Ser Tyr
1 5

<210> 129
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Wherein X is R or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Wherein X is Sor G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Wherein X is Sor G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Wherein X is N or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Wherein X is W or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Wherein X is W or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Wherein X is L or Y
<400> 129
Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr
1 5

<210> 130
<211> 894
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 130
Met Ala Trp Arg Cys Pro Arg Met Gly Arg Val Pro Leu Ala Trp Cys
1 5 10 15
Leu Ala Leu Cys Gly Trp Ala Cys Met Ala Pro Arg Gly Thr Gln Ala
20 25 30
Glu Glu Ser Pro Phe Val Gly Asn Pro Gly Asn Ile Thr Gly Ala Arg
35 40 45
Gly Leu Thr Gly Thr Leu Arg Cys Gln Leu Gln Val Gln Gly Glu Pro
50 55 60
Pro Glu Val His Trp Leu Arg Asp Gly Gln Ile Leu Glu Leu Ala Asp
65 70 75 80
Ser Thr Gln Thr Gln Val Pro Leu Gly Glu Asp Glu Gln Asp Asp Trp
85 90 95
Ile Val Val Ser Gln Leu Arg Ile Thr Ser Leu Gln Leu Ser Asp Thr
100 105 110
Gly Gln Tyr Gln Cys Leu Val Phe Leu Gly His Gln Thr Phe Val Ser
115 120 125
Gln Pro Gly Tyr Val Gly Leu Glu Gly Leu Pro Tyr Phe Leu Glu Glu
130 135 140
Pro Glu Asp Arg Thr Val Ala Ala Asn Thr Pro Phe Asn Leu Ser Cys
145 150 155 160
Gln Ala Gln Gly Pro Pro Glu Pro Val Asp Leu Leu Trp Leu Gln Asp
165 170 175
Ala Val Pro Leu Ala Thr Ala Pro Gly His Gly Pro Gln Arg Ser Leu
180 185 190
His Val Pro Gly Leu Asn Lys Thr Ser Ser Phe Ser Cys Glu Ala His
195 200 205
Asn Ala Lys Gly Val Thr Thr Ser Arg Thr Ala Thr Ile Thr Val Leu
210 215 220
Pro Gln Gln Pro Arg Asn Leu His Leu Val Ser Arg Gln Pro Thr Glu
225 230 235 240
Leu Glu Val Ala Trp Thr Pro Gly Leu Ser Gly Ile Tyr Pro Leu Thr
245 250 255
His Cys Thr Leu Gln Ala Val Leu Ser Asp Asp Gly Met Gly Ile Gln
260 265 270
Ala Gly Glu Pro Asp Pro Pro Glu Glu Pro Leu Thr Ser Gln Ala Ser
275 280 285
Val Pro Pro His Gln Leu Arg Leu Gly Ser Leu His Pro His Thr Pro
290 295 300
Tyr His Ile Arg Val Ala Cys Thr Ser Ser Gln Gly Pro Ser Ser Trp
305 310 315 320
Thr His Trp Leu Pro Val Glu Thr Pro Glu Gly Val Pro Leu Gly Pro
325 330 335
Pro Glu Asn Ile Ser Ala Thr Arg Asn Gly Ser Gln Ala Phe Val His
340 345 350
Trp Gln Glu Pro Arg Ala Pro Leu Gln Gly Thr Leu Leu Gly Tyr Arg
355 360 365
Leu Ala Tyr Gln Gly Gln Asp Thr Pro Glu Val Leu Met Asp Ile Gly
370 375 380
Leu Arg Gln Glu Val Thr Leu Glu Leu Gln Gly Asp Gly Ser Val Ser
385 390 395 400
Asn Leu Thr Val Cys Val Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Gly Asp Gly Pro
405 410 415
Trp Ser Leu Pro Val Pro Leu Glu Ala Trp Arg Pro Gly Gln Ala Gln
420 425 430
Pro Val His Gln Leu Val Lys Glu Pro Ser Thr Pro Ala Phe Ser Trp
435 440 445
Pro Trp Trp Tyr Val Leu Leu Gly Ala Val Val Ala Ala Ala Cys Val
450 455 460
Leu Ile Leu Ala Leu Phe Leu Val His Arg Arg Lys Lys Glu Thr Arg
465 470 475 480
Tyr Gly Glu Val Phe Glu Pro Thr Val Glu Arg Gly Glu Leu Val Val
485 490 495
Arg Tyr Arg Val Arg Lys Ser Tyr Ser Arg Arg Thr Thr Glu Ala Thr
500 505 510
Leu Asn Ser Leu Gly Ile Ser Glu Glu Leu Lys Glu Lys Leu Arg Asp
515 520 525
Val Met Val Asp Arg His Lys Val Ala Leu Gly Lys Thr Leu Gly Glu
530 535 540
Gly Glu Phe Gly Ala Val Met Glu Gly Gln Leu Asn Gln Asp Asp Ser
545 550 555 560
Ile Leu Lys Val Ala Val Lys Thr Met Lys Ile Ala Ile Cys Thr Arg
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<210> 135
<211> 894
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 135
Met Ala Trp Arg Cys Pro Arg Met Gly Arg Val Pro Leu Ala Trp Cys
1 5 10 15
Leu Ala Leu Cys Gly Trp Ala Cys Met Ala Pro Arg Gly Thr Gln Ala
20 25 30
Glu Glu Ser Pro Phe Val Gly Asn Pro Gly Asn Ile Thr Gly Ala Arg
35 40 45
Gly Leu Thr Gly Thr Leu Arg Cys Gln Leu Gln Val Gln Gly Glu Pro
50 55 60
Pro Glu Val His Trp Leu Arg Asp Gly Gln Ile Leu Glu Leu Ala Asp
65 70 75 80
Ser Thr Gln Thr Gln Val Pro Leu Gly Glu Asp Glu Gln Asp Asp Trp
85 90 95
Ile Val Val Ser Gln Leu Arg Ile Thr Ser Leu Gln Leu Ser Asp Thr
100 105 110
Gly Gln Tyr Gln Cys Leu Val Phe Leu Gly His Gln Thr Phe Val Ser
115 120 125
Gln Pro Gly Tyr Val Gly Leu Glu Gly Leu Pro Tyr Phe Leu Glu Glu
130 135 140
Pro Glu Asp Arg Thr Val Ala Ala Asn Thr Pro Phe Asn Leu Ser Cys
145 150 155 160
Gln Ala Gln Gly Pro Pro Glu Pro Val Asp Leu Leu Trp Leu Gln Asp
165 170 175
Ala Val Pro Leu Ala Thr Ala Pro Gly His Gly Pro Gln Arg Ser Leu
180 185 190
His Val Pro Gly Leu Asn Lys Thr Ser Ser Phe Ser Cys Glu Ala His
195 200 205
Asn Ala Lys Gly Val Thr Thr Ser Arg Thr Ala Thr Ile Thr Val Leu
210 215 220
Pro Gln Gln Pro Arg Asn Leu His Leu Val Ser Arg Gln Pro Thr Glu
225 230 235 240
Leu Glu Val Ala Trp Thr Pro Gly Leu Ser Gly Ile Tyr Pro Leu Thr
245 250 255
His Cys Thr Leu Gln Ala Val Leu Ser Asp Asp Gly Met Gly Ile Gln
260 265 270
Ala Gly Glu Pro Asp Pro Pro Glu Glu Pro Leu Thr Ser Gln Ala Ser
275 280 285
Val Pro Pro His Gln Leu Arg Leu Gly Ser Leu His Pro His Thr Pro
290 295 300
Tyr His Ile Arg Val Ala Cys Thr Ser Ser Gln Gly Pro Ser Ser Trp
305 310 315 320
Thr His Trp Leu Pro Val Glu Thr Pro Glu Gly Val Pro Leu Gly Pro
325 330 335
Pro Glu Asn Val Ser Ala Met Arg Asn Gly Ser Gln Val Leu Val Arg
340 345 350
Trp Gln Glu Pro Arg Val Pro Leu Gln Gly Thr Leu Leu Gly Tyr Arg
355 360 365
Leu Ala Tyr Arg Gly Gln Asp Thr Pro Glu Val Leu Met Asp Ile Gly
370 375 380
Leu Thr Arg Glu Val Thr Leu Glu Leu Arg Gly Asp Arg Pro Val Ala
385 390 395 400
Asn Leu Thr Val Ser Val Thr Ala Tyr Thr Ser Ala Gly Asp Gly Pro
405 410 415
Trp Ser Leu Pro Val Pro Leu Glu Pro Trp Arg Pro Gly Gln Gly Gln
420 425 430
Pro Leu His His Leu Val Ser Glu Pro Pro Pro Arg Ala Phe Ser Trp
435 440 445
Pro Trp Trp Tyr Val Leu Leu Gly Ala Val Val Ala Ala Ala Cys Val
450 455 460
Leu Ile Leu Ala Leu Phe Leu Val His Arg Arg Lys Lys Glu Thr Arg
465 470 475 480
Tyr Gly Glu Val Phe Glu Pro Thr Val Glu Arg Gly Glu Leu Val Val
485 490 495
Arg Tyr Arg Val Arg Lys Ser Tyr Ser Arg Arg Thr Thr Glu Ala Thr
500 505 510
Leu Asn Ser Leu Gly Ile Ser Glu Glu Leu Lys Glu Lys Leu Arg Asp
515 520 525
Val Met Val Asp Arg His Lys Val Ala Leu Gly Lys Thr Leu Gly Glu
530 535 540
Gly Glu Phe Gly Ala Val Met Glu Gly Gln Leu Asn Gln Asp Asp Ser
545 550 555 560
Ile Leu Lys Val Ala Val Lys Thr Met Lys Ile Ala Ile Cys Thr Arg
565 570 575
Ser Glu Leu Glu Asp Phe Leu Ser Glu Ala Val Cys Met Lys Glu Phe
580 585 590
Asp His Pro Asn Val Met Arg Leu Ile Gly Val Cys Phe Gln Gly Ser
595 600 605
Glu Arg Glu Ser Phe Pro Ala Pro Val Val Ile Leu Pro Phe Met Lys
610 615 620
His Gly Asp Leu His Ser Phe Leu Leu Tyr Ser Arg Leu Gly Asp Gln
625 630 635 640
Pro Val Tyr Leu Pro Thr Gln Met Leu Val Lys Phe Met Ala Asp Ile
645 650 655
Ala Ser Gly Met Glu Tyr Leu Ser Thr Lys Arg Phe Ile His Arg Asp
660 665 670
Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asn Glu Asn Met Ser Val Cys Val
675 680 685
Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys Lys Ile Tyr Asn Gly Asp Tyr Tyr Arg
690 695 700
Gln Gly Arg Ile Ala Lys Met Pro Val Lys Trp Ile Ala Ile Glu Ser
705 710 715 720
Leu Ala Asp Arg Val Tyr Thr Ser Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly
725 730 735
Val Thr Met Trp Glu Ile Ala Thr Arg Gly Gln Thr Pro Tyr Pro Gly
740 745 750
Val Glu Asn Ser Glu Ile Tyr Asp Tyr Leu Arg Gln Gly Asn Arg Leu
755 760 765
Lys Gln Pro Ala Asp Cys Leu Asp Gly Leu Tyr Ala Leu Met Ser Arg
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Cys Trp Glu Leu Asn Pro Gln Asp Arg Pro Ser Phe Thr Glu Leu Arg
785 790 795 800
Glu Asp Leu Glu Asn Thr Leu Lys Ala Leu Pro Pro Ala Gln Glu Pro
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Pro Pro Gly Ala Ala Gly Gly Ala Asp Pro Pro Thr Gln Pro Asp Pro
835 840 845
Lys Asp Ser Cys Ser Cys Leu Thr Ala Ala Glu Val His Pro Ala Gly
850 855 860
Arg Tyr Val Leu Cys Pro Ser Thr Thr Pro Ser Pro Ala Gln Pro Ala
865 870 875 880
Asp Arg Gly Ser Pro Ala Ala Pro Gly Gln Glu Asp Gly Ala
885 890

<210> 136
<211> 124
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 136
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly His Thr Tyr His Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Asn Leu Leu Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

<210> 137
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 137
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5

<210> 138
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 138
Ile Ser Gly Ser Gly Gly His Thr
1 5

<210> 139
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 139
Ala Lys Asp Arg Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Asn Leu Leu Asp
1 5 10 15
Tyr

<210> 140
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 140
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Glu Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gly Gly Ala Lys Val Glu Ile Lys
100 105

<210> 141
<211> 6
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 141
Gln Gly Ile Ser Ser Trp
1 5

<210> 142
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 142
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5

<210> 143
<211> 123
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 143
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Val Gln Asn Leu
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120

<210> 144
<211> 108
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 144
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Trp Pro Arg
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105

<210> 145
<211> 124
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 145
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Val Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Gly Tyr Ser Ser Ser Trp Tyr Ala Glu Tyr Phe Gln
100 105 110
His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

<210> 146
<211> 108
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 146
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105

<210> 147
<211> 893
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 147
Ala Trp Arg Cys Pro Arg Met Gly Arg Val Pro Leu Ala Trp Cys Leu
1 5 10 15
Ala Leu Cys Gly Trp Val Cys Met Ala Pro Arg Gly Thr Gln Ala Glu
20 25 30
Glu Ser Pro Phe Val Gly Asn Pro Gly Asn Ile Thr Gly Ala Arg Gly
35 40 45
Leu Thr Gly Thr Leu Arg Cys Gln Leu Gln Val Gln Gly Glu Pro Pro
50 55 60
Glu Val His Trp Leu Arg Asp Gly Gln Ile Leu Glu Leu Ala Asp Ser
65 70 75 80
Thr Gln Thr Gln Val Pro Leu Gly Glu Asp Glu Gln Asp Asp Trp Ile
85 90 95
Val Val Ser Gln Leu Arg Ile Ala Ser Leu Gln Leu Ser Asp Ala Gly
100 105 110
Gln Tyr Gln Cys Leu Val Phe Leu Gly His Gln Asn Phe Val Ser Gln
115 120 125
Pro Gly Tyr Val Gly Leu Glu Gly Leu Pro Tyr Phe Leu Glu Glu Pro
130 135 140
Glu Asp Arg Thr Val Ala Ala Asn Thr Pro Phe Asn Leu Ser Cys Gln
145 150 155 160
Ala Gln Gly Pro Pro Glu Pro Val Asp Leu Leu Trp Leu Gln Asp Ala
165 170 175
Val Pro Leu Ala Thr Ala Pro Gly His Gly Pro Gln Arg Asn Leu His
180 185 190
Val Pro Gly Leu Asn Lys Thr Ser Ser Phe Ser Cys Glu Ala His Asn
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210 215 220
Gln Gln Pro Arg Asn Leu His Leu Val Ser Arg Gln Pro Thr Glu Leu
225 230 235 240
Glu Val Ala Trp Thr Pro Gly Leu Ser Gly Ile Tyr Pro Leu Thr His
245 250 255
Cys Thr Leu Gln Ala Val Leu Ser Asp Asp Gly Met Gly Ile Gln Ala
260 265 270
Gly Glu Pro Asp Pro Pro Glu Glu Pro Leu Thr Leu Gln Ala Ser Val
275 280 285
Pro Pro His Gln Leu Arg Leu Gly Ser Leu His Pro His Thr Pro Tyr
290 295 300
His Ile Arg Val Ala Cys Thr Ser Ser Gln Gly Pro Ser Ser Trp Thr
305 310 315 320
His Trp Leu Pro Val Glu Thr Pro Glu Gly Val Pro Leu Gly Pro Pro
325 330 335
Glu Asn Ile Ser Ala Thr Arg Asn Gly Ser Gln Ala Phe Val His Trp
340 345 350
Gln Glu Pro Arg Ala Pro Leu Gln Gly Thr Leu Leu Gly Tyr Arg Leu
355 360 365
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370 375 380
Arg Gln Glu Val Thr Leu Glu Leu Gln Gly Asp Gly Ser Val Ser Asn
385 390 395 400
Leu Thr Val Cys Val Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Gly Asp Gly Pro Trp
405 410 415
Ser Leu Pro Val Pro Leu Glu Ala Trp Arg Pro Gly Gln Ala Gln Pro
420 425 430
Val His Gln Leu Val Lys Glu Thr Ser Ala Pro Ala Phe Ser Trp Pro
435 440 445
Trp Trp Tyr Ile Leu Leu Gly Ala Val Val Ala Ala Ala Cys Val Leu
450 455 460
Ile Leu Ala Leu Phe Leu Val His Arg Arg Lys Lys Glu Thr Arg Tyr
465 470 475 480
Gly Glu Val Phe Glu Pro Thr Val Glu Arg Gly Glu Leu Val Val Arg
485 490 495
Tyr Arg Val Arg Lys Ser Tyr Ser Arg Arg Thr Thr Glu Ala Thr Leu
500 505 510
Asn Ser Leu Gly Ile Ser Glu Glu Leu Lys Glu Lys Leu Arg Asp Val
515 520 525
Met Val Asp Arg His Lys Val Ala Leu Gly Lys Thr Leu Gly Glu Gly
530 535 540
Glu Phe Gly Ala Val Met Glu Gly Gln Leu Asn Gln Asp Asp Ser Ile
545 550 555 560
Leu Lys Val Ala Val Lys Thr Met Lys Ile Ala Ile Cys Thr Arg Ser
565 570 575
Glu Leu Glu Asp Phe Leu Ser Glu Ala Val Cys Met Lys Glu Phe Asp
580 585 590
His Pro Asn Val Met Arg Leu Ile Gly Val Cys Phe Gln Gly Ser Glu
595 600 605
Arg Glu Ser Phe Pro Ala Pro Val Val Ile Leu Pro Phe Met Lys His
610 615 620
Gly Asp Leu His Ser Phe Leu Leu Tyr Ser Arg Leu Gly Asp Gln Pro
625 630 635 640
Val Tyr Leu Pro Thr Gln Met Leu Val Lys Phe Met Ala Asp Ile Ala
645 650 655
Ser Gly Met Glu Tyr Leu Ser Thr Lys Arg Phe Ile His Arg Asp Leu
660 665 670
Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asn Glu Asn Met Ser Val Cys Val Ala
675 680 685
Asp Phe Gly Leu Ser Lys Lys Ile Tyr Asn Gly Asp Tyr Tyr Arg Gln
690 695 700
Gly Arg Ile Ala Lys Met Pro Val Lys Trp Ile Ala Ile Glu Ser Leu
705 710 715 720
Ala Asp Arg Val Tyr Thr Ser Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val
725 730 735
Thr Met Trp Glu Ile Ala Thr Arg Gly Gln Thr Pro Tyr Pro Gly Val
740 745 750
Glu Asn Ser Glu Ile Tyr Asp Tyr Leu Arg Gln Gly Asn Arg Leu Lys
755 760 765
Gln Pro Ala Asp Cys Leu Asp Gly Leu Tyr Ala Leu Met Ser Arg Cys
770 775 780
Trp Glu Leu Asn Pro Gln Asp Arg Pro Ser Phe Thr Glu Leu Arg Glu
785 790 795 800
Asp Leu Glu Asn Thr Leu Lys Ala Leu Pro Pro Ala Gln Glu Pro Asp
805 810 815
Glu Ile Leu Tyr Val Asn Met Asp Glu Gly Gly Gly Tyr Pro Glu Pro
820 825 830
Pro Gly Ala Ala Gly Gly Ala Asp Pro Pro Thr Gln Leu Asp Pro Lys
835 840 845
Asp Ser Cys Ser Cys Leu Thr Ser Ala Glu Val His Pro Ala Gly Arg
850 855 860
Tyr Val Leu Cys Pro Ser Thr Ala Pro Ser Pro Ala Gln Pro Ala Asp
865 870 875 880
Arg Gly Ser Pro Ala Ala Pro Gly Gln Glu Asp Gly Ala
885 890

<210> 148
<211> 903
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 148
Met Ala Trp Arg Cys Pro Arg Met Gly Arg Val Pro Leu Ala Trp Cys
1 5 10 15
Leu Ala Leu Cys Gly Trp Ala Cys Met Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
20 25 30
Tyr Ala Ala Pro Arg Gly Thr Gln Ala Glu Glu Ser Pro Phe Val Gly
35 40 45
Asn Pro Gly Asn Ile Thr Gly Ala Arg Gly Leu Thr Gly Thr Leu Arg
50 55 60
Cys Gln Leu Gln Val Gln Gly Glu Pro Pro Glu Val His Trp Leu Arg
65 70 75 80
Asp Gly Gln Ile Leu Glu Leu Ala Asp Ser Thr Gln Thr Gln Val Pro
85 90 95
Leu Gly Glu Asp Glu Gln Asp Asp Trp Ile Val Val Ser Gln Leu Arg
100 105 110
Ile Thr Ser Leu Gln Leu Ser Asp Thr Gly Gln Tyr Gln Cys Leu Val
115 120 125
Phe Leu Gly His Gln Thr Phe Val Ser Gln Pro Gly Tyr Val Gly Leu
130 135 140
Glu Gly Leu Pro Tyr Phe Leu Glu Glu Pro Glu Asp Arg Thr Val Ala
145 150 155 160
Ala Asn Thr Pro Phe Asn Leu Ser Cys Gln Ala Gln Gly Pro Pro Glu
165 170 175
Pro Val Asp Leu Leu Trp Leu Gln Asp Ala Val Pro Leu Ala Thr Ala
180 185 190
Pro Gly His Gly Pro Gln Arg Ser Leu His Val Pro Gly Leu Asn Lys
195 200 205
Thr Ser Ser Phe Ser Cys Glu Ala His Asn Ala Lys Gly Val Thr Thr
210 215 220
Ser Arg Thr Ala Thr Ile Thr Val Leu Pro Gln Gln Pro Arg Asn Leu
225 230 235 240
His Leu Val Ser Arg Gln Pro Thr Glu Leu Glu Val Ala Trp Thr Pro
245 250 255
Gly Leu Ser Gly Ile Tyr Pro Leu Thr His Cys Thr Leu Gln Ala Val
260 265 270
Leu Ser Asn Asp Gly Met Gly Ile Gln Ala Gly Glu Pro Asp Pro Pro
275 280 285
Glu Glu Pro Leu Thr Ser Gln Ala Ser Val Pro Pro His Gln Leu Arg
290 295 300
Leu Gly Ser Leu His Pro His Thr Pro Tyr His Ile Arg Val Ala Cys
305 310 315 320
Thr Ser Ser Gln Gly Pro Ser Ser Trp Thr His Trp Leu Pro Val Glu
325 330 335
Thr Pro Glu Gly Val Pro Leu Gly Pro Pro Glu Asn Ile Ser Ala Thr
340 345 350
Arg Asn Gly Ser Gln Ala Phe Val His Trp Gln Glu Pro Arg Ala Pro
355 360 365
Leu Gln Gly Thr Leu Leu Gly Tyr Arg Leu Ala Tyr Gln Gly Gln Asp
370 375 380
Thr Pro Glu Val Leu Met Asp Ile Gly Leu Arg Gln Glu Val Thr Leu
385 390 395 400
Glu Leu Gln Gly Asp Gly Ser Val Ser Asn Leu Thr Val Cys Val Ala
405 410 415
Ala Tyr Thr Ala Ala Gly Asp Gly Pro Trp Ser Leu Pro Val Pro Leu
420 425 430
Glu Ala Trp Arg Pro Gly Gln Ala Gln Pro Val His Gln Leu Val Lys
435 440 445
Glu Pro Ser Thr Pro Ala Phe Ser Trp Pro Trp Trp Tyr Val Leu Leu
450 455 460
Gly Ala Val Val Ala Ala Ala Cys Val Leu Ile Leu Ala Leu Phe Leu
465 470 475 480
Val His Arg Arg Lys Lys Glu Thr Arg Tyr Gly Glu Val Phe Glu Pro
485 490 495
Thr Val Glu Arg Gly Glu Leu Val Val Arg Tyr Arg Val Arg Lys Ser
500 505 510
Tyr Ser Arg Arg Thr Thr Glu Ala Thr Leu Asn Ser Leu Gly Ile Ser
515 520 525
Glu Glu Leu Lys Glu Lys Leu Arg Asp Val Met Val Asp Arg His Lys
530 535 540
Val Ala Leu Gly Lys Thr Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly Ala Val Met
545 550 555 560
Glu Gly Gln Leu Asn Gln Asp Asp Ser Ile Leu Lys Val Ala Val Lys
565 570 575
Thr Met Lys Ile Ala Ile Cys Thr Arg Ser Glu Leu Glu Asp Phe Leu
580 585 590
Ser Glu Ala Val Cys Met Lys Glu Phe Asp His Pro Asn Val Met Arg
595 600 605
Leu Ile Gly Val Cys Phe Gln Gly Ser Glu Arg Glu Ser Phe Pro Ala
610 615 620
Pro Val Val Ile Leu Pro Phe Met Lys His Gly Asp Leu His Ser Phe
625 630 635 640
Leu Leu Tyr Ser Arg Leu Gly Asp Gln Pro Val Tyr Leu Pro Thr Gln
645 650 655
Met Leu Val Lys Phe Met Ala Asp Ile Ala Ser Gly Met Glu Tyr Leu
660 665 670
Ser Thr Lys Arg Phe Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met
675 680 685
Leu Asn Glu Asn Met Ser Val Cys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys
690 695 700
Lys Ile Tyr Asn Gly Asp Tyr Tyr Arg Gln Gly Arg Ile Ala Lys Met
705 710 715 720
Pro Val Lys Trp Ile Ala Ile Glu Ser Leu Ala Asp Arg Val Tyr Thr
725 730 735
Ser Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Thr Met Trp Glu Ile Ala
740 745 750
Thr Arg Gly Gln Thr Pro Tyr Pro Gly Val Glu Asn Ser Glu Ile Tyr
755 760 765
Asp Tyr Leu Arg Gln Gly Asn Arg Leu Lys Gln Pro Ala Asp Cys Leu
770 775 780
Asp Gly Leu Tyr Ala Leu Met Ser Arg Cys Trp Glu Leu Asn Pro Gln
785 790 795 800
Asp Arg Pro Ser Phe Thr Glu Leu Arg Glu Asp Leu Glu Asn Thr Leu
805 810 815
Lys Ala Leu Pro Pro Ala Gln Glu Pro Asp Glu Ile Leu Tyr Val Asn
820 825 830
Met Asp Glu Gly Gly Gly Tyr Pro Glu Pro Pro Gly Ala Ala Gly Gly
835 840 845
Ala Asp Pro Pro Thr Gln Pro Asp Pro Lys Asp Ser Cys Ser Cys Leu
850 855 860
Thr Ala Ala Glu Val His Pro Ala Gly Arg Tyr Val Leu Cys Pro Ser
865 870 875 880
Thr Thr Pro Ser Pro Ala Gln Pro Ala Asp Arg Gly Ser Pro Ala Ala
885 890 895
Pro Gly Gln Glu Asp Gly Ala
900

<210> 149
<211> 904
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 149
Met Ala Trp Arg Cys Pro Arg Met Gly Arg Val Pro Leu Ala Trp Cys
1 5 10 15
Leu Ala Leu Cys Gly Trp Ala Cys Met Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
20 25 30
Tyr Ala Ala His Lys Asp Thr Gln Thr Glu Ala Gly Ser Pro Phe Val
35 40 45
Gly Asn Pro Gly Asn Ile Thr Gly Ala Arg Gly Leu Thr Gly Thr Leu
50 55 60
Arg Cys Glu Leu Gln Val Gln Gly Glu Pro Pro Glu Val Val Trp Leu
65 70 75 80
Arg Asp Gly Gln Ile Leu Glu Leu Ala Asp Asn Thr Gln Thr Gln Val
85 90 95
Pro Leu Gly Glu Asp Trp Gln Asp Glu Trp Lys Val Val Ser Gln Leu
100 105 110
Arg Ile Ser Ala Leu Gln Leu Ser Asp Ala Gly Glu Tyr Gln Cys Met
115 120 125
Val His Leu Glu Gly Arg Thr Phe Val Ser Gln Pro Gly Phe Val Gly
130 135 140
Leu Glu Gly Leu Pro Tyr Phe Leu Glu Glu Pro Glu Asp Lys Ala Val
145 150 155 160
Pro Ala Asn Thr Pro Phe Asn Leu Ser Cys Gln Ala Gln Gly Pro Pro
165 170 175
Glu Pro Val Thr Leu Leu Trp Leu Gln Asp Ala Val Pro Leu Ala Pro
180 185 190
Val Thr Gly His Ser Ser Gln His Ser Leu Gln Thr Pro Gly Leu Asn
195 200 205
Lys Thr Ser Ser Phe Ser Cys Glu Ala His Asn Ala Lys Gly Val Thr
210 215 220
Thr Ser Arg Thr Ala Thr Ile Thr Val Leu Pro Gln Arg Pro His His
225 230 235 240
Leu His Val Val Ser Arg Gln Pro Thr Glu Leu Glu Val Ala Trp Thr
245 250 255
Pro Gly Leu Ser Gly Ile Tyr Pro Leu Thr His Cys Asn Leu Gln Ala
260 265 270
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580 585 590
Asp His Pro Asn Val Met Arg Leu Ile Gly Val Cys Phe Gln Gly Ser
595 600 605
Glu Arg Glu Ser Phe Pro Ala Pro Val Val Ile Leu Pro Phe Met Lys
610 615 620
His Gly Asp Leu His Ser Phe Leu Leu Tyr Ser Arg Leu Gly Asp Gln
625 630 635 640
Pro Val Tyr Leu Pro Thr Gln Met Leu Val Lys Phe Met Ala Asp Ile
645 650 655
Ala Ser Gly Met Glu Tyr Leu Ser Thr Lys Arg Phe Ile His Arg Asp
660 665 670
Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asn Glu Asn Met Ser Val Cys Val
675 680 685
Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys Lys Ile Tyr Asn Gly Asp Tyr Tyr Arg
690 695 700
Gln Gly Arg Ile Ala Lys Met Pro Val Lys Trp Ile Ala Ile Glu Ser
705 710 715 720
Leu Ala Asp Arg Val Tyr Thr Ser Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly
725 730 735
Val Thr Met Trp Glu Ile Ala Thr Arg Gly Gln Thr Pro Tyr Pro Gly
740 745 750
Val Glu Asn Ser Glu Ile Tyr Asp Tyr Leu Arg Gln Gly Asn Arg Leu
755 760 765
Lys Gln Pro Ala Asp Cys Leu Asp Gly Leu Tyr Ala Leu Met Ser Arg
770 775 780
Cys Trp Glu Leu Asn Pro Gln Asp Arg Pro Ser Phe Thr Glu Leu Arg
785 790 795 800
Glu Asp Leu Glu Asn Thr Leu Lys Ala Leu Pro Pro Ala Gln Glu Pro
805 810 815
Asp Glu Ile Leu Tyr Val Asn Met Asp Glu Gly Gly Gly Tyr Pro Glu
820 825 830
Pro Pro Gly Ala Ala Gly Gly Ala Asp Pro Pro Thr Gln Pro Asp Pro
835 840 845
Lys Asp Ser Cys Ser Cys Leu Thr Ala Ala Glu Val His Pro Ala Gly
850 855 860
Arg Tyr Val Leu Cys Pro Ser Thr Thr Pro Ser Pro Ala Gln Pro Ala
865 870 875 880
Asp Arg Gly Ser Pro Ala Ala Pro Gly Gln Glu Asp Gly Ala
885 890

<210> 154
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 154
aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg 30

<210> 155
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 155
acggacggca ggaccact 18

<210> 156
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 156
acggacggca ggaccactaa gcagtggtat caacgcaga 39

<210> 157
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 157
cagcaggcac accactgagg cagttccaga tttc 34

<210> 158
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 158
acggacggca ggaccagt 18

<210> 159
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 159
acggacggca ggaccagtaa gcagtggtat caacgcagag t 41

<210> 160
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 160
ggaggagggc gccagtggga agaccga 27

<210> 161
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 161
gccagatata cgcgttgaca 20

<210> 162
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 162
gatctgctat ggcagggcct 20

Claims (84)

  1. チロシンキナーゼ阻害剤、セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤および化学療法剤からなる群より選択される少なくとも1種の治療剤に耐性の癌の治療に使用するための、ヒトAXLに結合する抗体を含む抗体-薬物コンジュゲート(ADC)。
  2. 前記チロシンキナーゼ阻害剤が、エルロチニブ、アファチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、オシメルチニブ、ロシレチニブ、イマチニブ、スニチニブ、クリゾチニブ、ミドスタウリン(PKC412)およびキザルチニブ(AC220)からなる群より選択される、請求項1記載の使用のためのADC。
  3. 前記チロシンキナーゼ阻害剤が、エルロチニブまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体、例えば、ラパチニブ、アファチニブまたはゲフィチニブである、請求項2記載の使用のためのADC。
  4. 前記チロシンキナーゼ阻害剤がエルロチニブである、請求項3記載の使用のためのADC。
  5. 前記セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤が、BRAF阻害剤またはMEK阻害剤である、請求項1記載の使用のためのADC。
  6. (a) 前記BRAF阻害剤が、ベムラフェニブ(PLX4032)、ダブラフェニブ、およびそれらのいずれかの治療上有効な類似体もしくは誘導体、例えばPLX4720、からなる群より選択され；
    (b) 前記MEK阻害剤が、トラメチニブ、セルメチニブ(AZD6244)、およびそれらのいずれかの治療上有効な類似体もしくは誘導体から選択される
    請求項5記載の使用のためのADC。
  7. 前記BRAF阻害剤がベムラフェニブである、請求項6記載の使用のためのADC。
  8. 前記BRAF阻害剤がダブラフェニブである、請求項6記載の使用のためのADC。
  9. 前記MEK阻害剤がトラメチニブである、請求項5記載の使用のためのADC。
  10. 前記化学療法剤が、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、メトホルミン、ドキソルビシン、エトポシド、カルボプラチン、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の使用のためのADC。
  11. 前記化学療法剤が、パクリタキセルまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体、例えばドセタキセルである、請求項10記載の使用のためのADC。
  12. (a) 前記チロシンキナーゼ阻害剤が、EGFRアンタゴニスト、HER2アンタゴニスト、ALK阻害剤およびFLT3阻害剤、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択され；
    (b) 前記セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤が、BRAF阻害剤およびMEK阻害剤、またはそれらの組み合わせから選択され；
    (c) 前記化学療法剤が、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、メトホルミン、ドキソルビシン、エトポシド、カルボプラチン、またはそれらの組み合わせから選択される
    前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  13. (a) 前記チロシンキナーゼ阻害剤がEGFR阻害剤であり；
    (b) 前記セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤がBRAF阻害剤であり；かつ
    (c) 前記化学療法剤がタキサンである
    請求項12記載の使用のためのADC。
  14. 前記癌が、前記治療剤による治療中に耐性を獲得した、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  15. 前記癌が、前記治療剤による治療の開始時から耐性であった、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  16. 前記癌が、AXLを発現する癌である、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  17. 前記癌が、メラノーマ、非小細胞肺癌(NSCLC)、子宮頸癌、頭頸部扁平上皮癌(SCCHN)、乳癌、消化管間質腫瘍(GIST)、腎臓癌、前立腺癌、神経芽細胞腫、膵臓癌、食道癌、横紋筋肉腫、急性骨髄性白血病(AML)、または慢性骨髄性白血病(CML)から選択される、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  18. 前記ADCが、前記治療剤と組み合わせて使用するためのものであり、該ADCと該治療剤が同時に、別々に、または逐次的に投与される、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  19. エルロチニブに耐性のAXL発現NSCLCの治療に使用するための、ヒトAXLに結合する抗体を含むADC。
  20. 前記ADCが、エルロチニブと組み合わせて使用され、該ADCとエルロチニブが同時に、別々に、または逐次的に投与される、請求項19記載の使用のためのADC。
  21. ベムラフェニブまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体に耐性のAXL発現メラノーマの治療に使用するための、ヒトAXLに結合する抗体を含むADCであって、該メラノーマがBRAFに変異を呈し、該変異がベムラフェニブによる該変異型BRAFのキナーゼ活性の阻害をもたらす、該使用のためのADC。
  22. 前記ADCが、ベムラフェニブと組み合わせて使用するためのものであり、該ADCとベムラフェニブが同時に、別々に、または逐次的に投与される、請求項21記載の使用のためのADC。
  23. ダブラフェニブまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体に耐性のAXL発現メラノーマの治療に使用するための、ヒトAXLに結合する抗体を含むADCであって、該メラノーマがBRAFに変異を呈し、該変異がダブラフェニブによる該変異型BRAFのキナーゼ活性の阻害をもたらす、該使用のためのADC。
  24. 前記ADCが、ダブラフェニブと組み合わせて使用するためのものであり、該ADCとダブラフェニブが、任意で例えばトラメチニブなどのMEK阻害剤とさらに組み合わせて、同時に、別々に、または逐次的に投与される、請求項23記載の使用のためのADC。
  25. 前記変異が、V600、L597およびK601から選択されるBRAF残基にあり、例えば、V600E、V600K、V600D、L597RおよびK601Eから選択される変異である、請求項21～24のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  26. パクリタキセルまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体、例えばドセタキセル、に耐性のAXL発現子宮頸癌の治療に使用するための、ヒトAXLに結合する抗体を含むADC。
  27. 前記ADCが、パクリタキセルと組み合わせて使用され、該ADCとパクリタキセルが同時に、別々に、または逐次的に投与される、請求項26記載の使用のためのADC。
  28. 化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤またはセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤から選択される治療剤と組み合わせて癌の治療に使用するための、ヒトAXLに結合する抗体を含むADCであって、該ADCと該治療剤が同時に、別々に、または逐次的に投与される、該使用のためのADC。
  29. エルロチニブと組み合わせてNSCLCの治療に使用するためのものである、請求項28記載の使用のためのADC。
  30. 前記ADCが、ベムラフェニブと組み合わせてメラノーマの治療に使用するためのものであり、該メラノーマがBRAFに変異を呈し、該変異がベムラフェニブによる該変異型BRAFのキナーゼ活性の阻害をもたらす、請求項28記載の使用のためのADC。
  31. 前記ADCが、ダブラフェニブと組み合わせてメラノーマの治療に使用するためのものであり、該メラノーマがBRAFに変異を呈し、該変異がダブラフェニブによる該変異型BRAFのキナーゼ活性の阻害をもたらす、請求項28記載の使用のためのADC。
  32. 前記変異が、V600、L597およびK601から選択されるBRAF残基にあり、例えば、V600E、V600K、V600D、L597RおよびK601Eから選択される変異である、請求項30および31のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  33. トラメチニブと組み合わせてメラノーマの治療に使用するためのものである、請求項28記載の使用のためのADC。
  34. 前記抗体に連結されている細胞傷害性薬剤、化学療法剤、または放射性同位体を含む、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  35. 治療部分が細胞傷害性薬剤であり、該細胞傷害性薬剤が、任意でリンカーを用いて前記ADCに連結されている、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  36. 前記細胞傷害性薬剤が、切断可能なリンカー、例えば、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルジチオ)-ペンタノアート(SSP)、マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル(mc-vc-PAB)またはAV-1 K-lockバリン-シトルリンを用いて前記抗体に連結されている、請求項35記載の使用のためのADC。
  37. 前記細胞傷害性薬剤が、切断不可能なリンカー、例えば、スクシンイミジル-4(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(MCC)またはマレイミドカプロイル(MC)を用いて前記抗体に連結されている、請求項35～36のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  38. 前記細胞傷害性薬剤が、DNAを標的とする薬剤、例えば、DNAアルキル化剤および架橋剤、例えばカリケアマイシン、デュオカルマイシン、ラケルマイシン(CC-1065)、ピロロ[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン(PBD)、およびインドリノベンゾジアゼピン(IGN)；微小管を標的とする薬剤、例えばデュオスタチン、例えばデュオスタチン-3、アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチンE (MMAE)およびモノメチルアウリスタチンF (MMAF)、ドラスタチン、メイタンシン、N(2')-デアセチル-N(2')-(3-メルカプト-1-オキソプロピル)-メイタンシン(DM1)、およびツブリシン；ならびにヌクレオシド類似体；またはそれらの類似体、誘導体、もしくはプロドラッグからなる群より選択される、請求項35～37のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  39. (a) 前記リンカーが切断可能であり、かつ前記細胞傷害性薬剤がバイスタンダー殺傷能を有する；
    (b) 前記リンカーが切断可能であり、かつ前記細胞傷害性薬剤がバイスタンダー殺傷能を有さない；
    (c) 前記リンカーが切断不可能であり、かつ前記細胞傷害性薬剤がバイスタンダー殺傷能を有する；または
    (d) 前記リンカーが切断不可能であり、かつ前記細胞傷害性薬剤がバイスタンダー殺傷能を有さない
    請求項35～38のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  40. 前記リンカーがmc-vc-PABであり、かつ前記細胞傷害性薬剤がMMAEである、請求項35～39のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  41. 前記リンカーがSSPであり、かつ前記細胞傷害性薬剤がDM1である、請求項35～39のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  42. 前記薬物がデュオスタチン3である、請求項35～39のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  43. 前記抗体が、ヒトAXLへの結合についてGrowth Arrest-Specific 6 (Gas6)と競合しない、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  44. Gas6の存在下でのヒトAXLへの最大抗体結合が、競合アッセイにより測定した場合に、Gas6の非存在下での結合の少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％、例えば100％であり、ヒトAXLに結合する前記抗体とGas6との間の競合が、Gas6と共におよびGas6なしでプレインキュベートされたA431細胞で測定される、請求項43記載の使用のためのADC。
  45. 前記抗体が、ヒトAXLに対して0.3×10-9～63×10-9Mの範囲の結合親和性(KD)を有し、任意で、該結合親和性が、可溶性AXL細胞外ドメインを用いてバイオレイヤー干渉法により測定される、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  46. 前記抗体が、AXLに対して9.7×10-5～4.4×10-3 s-1の解離速度を有し、任意で、該解離速度が、可溶性組み換えAXL細胞外ドメインを用いてバイオレイヤー干渉法により測定される、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  47. 前記ヒトAXLのアミノ酸配列がSEQ ID NO:130に記載の通りである、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  48. SEQ ID NO:147に記載のカニクイザルAXLに結合する、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  49. (a) それぞれSEQ ID No:36、37および38のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:39、GAS、およびSEQ ID No:40のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[107]；
    (b) それぞれSEQ ID No:46、47および48のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:49、AAS、およびSEQ ID No:50のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[148]；
    (c) それぞれSEQ ID No:114、115および116のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:117、DAS、およびSEQ ID No:118のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[733]；
    (d) それぞれSEQ ID No:51、52および53のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:55、GAS、およびSEQ ID No:56のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[154]；
    (e) それぞれSEQ ID No:51、52および54のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:55、GAS、およびSEQ ID No:56のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[154-M103L]；
    (f) それぞれSEQ ID No:57、58および59のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:60、GAS、およびSEQ ID No:61のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[171]；
    (g) それぞれSEQ ID No:62、63および64のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:65、GAS、およびSEQ ID No:66のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[172]；
    (h) それぞれSEQ ID No:67、68および69のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:70、GAS、およびSEQ ID No:71のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[181]；
    (i) それぞれSEQ ID No:72、73および75のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:76、ATS、およびSEQ ID No:77のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[183]；
    (j) それぞれSEQ ID No:72、74および75のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:76、ATS、およびSEQ ID No:77のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[183-N52Q]；
    (k) それぞれSEQ ID No:78、79および80のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:81、AAS、およびSEQ ID No:82のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[187]；
    (l) それぞれSEQ ID No:83、84および85のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:86、GAS、およびSEQ ID No:87のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[608-01]；
    (m) それぞれSEQ ID No:88、89および90のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:91、GAS、およびSEQ ID No:92のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[610-01]；
    (n) それぞれSEQ ID No:93、94および95のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:96、GAS、およびSEQ ID No:97のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[613]；
    (o) それぞれSEQ ID No:98、99および100のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:101、DAS、およびSEQ ID No:102のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[613-08]；
    (p) それぞれSEQ ID No:103、104および105のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:106、GAS、およびSEQ ID No:107のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[620-06]；
    (q) それぞれSEQ ID No:108、109および110のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:112、AAS、およびSEQ ID No:113のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[726]；
    (r) それぞれSEQ ID No:108、109および111のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:112、AAS、およびSEQ ID No:113のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[726-M101L]；
    (s) それぞれSEQ ID No:41、42および43のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:44、AAS、およびSEQ ID No:45のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[140]；
    (t) それぞれSEQ ID No:93、94および95のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:128、XAS（配列中、XはDまたはGである）、およびSEQ ID No:129のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[613/613-08]；
    (u) それぞれSEQ ID No:46、119および120のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:49、AAS、およびSEQ ID No:50のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[148/140]；
    (v) それぞれSEQ ID No:123、124および125のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:60、GAS、およびSEQ ID No:61のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[171/172/181]；
    (w) それぞれSEQ ID No:121、109および122のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:112、AAS、およびSEQ ID No:113のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[726/187]；ならびに
    (x) それぞれSEQ ID No:93、126および127のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:96、GAS、およびSEQ ID No:97のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[613/608-01/610-01/620-06]
    からなる群より選択されるVH領域とVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  50. (a) それぞれSEQ ID No:36、37および38のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに
    (b) それぞれSEQ ID No:39、GAS、およびSEQ ID No:40のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域[107]
    を含む少なくとも1つの結合領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  51. 前記抗体が、
    (a) SEQ ID No: 1と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No: 2と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[107]；
    (b) SEQ ID No: 5と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No: 6と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[148]；
    (c) SEQ ID No:34と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:35と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[733]；
    (d) SEQ ID No: 7と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No: 9と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[154]；
    (e) SEQ ID No:10と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:11と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[171]；
    (f) SEQ ID No:16と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:18と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[183]；
    (g) SEQ ID No:25と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:26と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[613]；
    (h) SEQ ID No:31と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:33と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[726]；
    (i) SEQ ID No: 3と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No: 4と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[140]；
    (j) SEQ ID No: 8と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No: 9と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[154-M103L]；
    (k) SEQ ID No:12と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:13と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[172]；
    (l) SEQ ID No:14と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:15と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[181]；
    (m) SEQ ID No:17と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:18と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[183-N52Q]；
    (n) SEQ ID No:19と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:20と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[187]；
    (o) SEQ ID No:21と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:22と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[608-01]；
    (p) SEQ ID No:23と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:24と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[610-01]；
    (q) SEQ ID No:27と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:28と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[613-08]；
    (r) SEQ ID No:29と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:30と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[620-06]；ならびに
    (s) SEQ ID No:32と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVH領域、および、SEQ ID No:33と少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％同一であるVL領域[726-M101L]
    からなる群より選択されるVH領域とVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  52. 前記少なくとも1つの結合領域が、
    (a) SEQ ID No: 1を含むVH領域およびSEQ ID No: 2を含むVL領域[107]；
    (b) SEQ ID No: 5を含むVH領域およびSEQ ID No: 6を含むVL領域[148]；
    (c) SEQ ID No:34を含むVH領域およびSEQ ID No:35を含むVL領域[733]；
    (d) SEQ ID No: 7を含むVH領域およびSEQ ID No: 9を含むVL領域[154]；
    (e) SEQ ID No:10を含むVH領域およびSEQ ID No:11を含むVL領域[171]；
    (f) SEQ ID No:16を含むVH領域およびSEQ ID No:18を含むVL領域[183]；
    (g) SEQ ID No:25を含むVH領域およびSEQ ID No:26を含むVL領域[613]；
    (h) SEQ ID No:31を含むVH領域およびSEQ ID No:33を含むVL領域[726]；
    (i) SEQ ID No: 3を含むVH領域およびSEQ ID No: 4を含むVL領域[140]；
    (j) SEQ ID No: 8を含むVH領域およびSEQ ID No: 9を含むVL領域[154-M103L]；
    (k) SEQ ID No:12を含むVH領域およびSEQ ID No:13を含むVL領域[172]；
    (l) SEQ ID No:14を含むVH領域およびSEQ ID No:15を含むVL領域[181]；
    (m) SEQ ID No:17を含むVH領域およびSEQ ID No:18を含むVL領域[183-N52Q]；
    (n) SEQ ID No:19を含むVH領域およびSEQ ID No:20を含むVL領域[187]；
    (o) SEQ ID No:21を含むVH領域およびSEQ ID No:22を含むVL領域[608-01]；
    (p) SEQ ID No:23を含むVH領域およびSEQ ID No:24を含むVL領域[610-01]；
    (q) SEQ ID No:27を含むVH領域およびSEQ ID No:28を含むVL領域[613-08]；
    (r) SEQ ID No:29を含むVH領域およびSEQ ID No:30を含むVL領域[620-06]；ならびに
    (s) SEQ ID No:32を含むVH領域およびSEQ ID No:33を含むVL領域[726-M101L]
    からなる群より選択されるVH領域とVL領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  53. 前記少なくとも1つの結合領域が、SEQ ID No: 1を含むVH領域およびSEQ ID No: 2を含むVL領域[107]を含む、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  54. 前記抗体が、それぞれSEQ ID No:36、37および38のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:39、GAS、およびSEQ ID No:40のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域とを含む少なくとも1つの結合領域[107]を含み、
    前記リンカーがmc-vc-PABであり、かつ
    前記細胞傷害性薬剤がMMAEである、
    前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  55. 前記抗体が、それぞれSEQ ID No:36、37および38のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVH領域と、それぞれSEQ ID No:39、GAS、およびSEQ ID No:40のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVL領域とを含む少なくとも1つの結合領域[107]を含み、
    前記リンカーがSSPであり、かつ
    前記細胞傷害性薬剤がDM1である、
    請求項1～50のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  56. 前記抗体がAXL上のエピトープに結合し、該エピトープが、請求項39に記載される抗体のいずれかによって認識される、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  57. 前記抗体がAXLのIg1ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープが、ヒトAXLの位置L121～Q129またはT112～Q124に対応する1つ以上のアミノ酸を含むかまたは必要とする、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  58. 前記抗体がAXLのIg2ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープが、ヒトAXLの位置D170またはD179の組み合わせに対応するアミノ酸、および位置T182～R190に対応する1つ以上のアミノ酸を含むかまたは必要とする、請求項1～50のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  59. 前記抗体がヒトAXLのFN1ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープが、ヒトAXLの位置Q272～A287およびG297～P301に対応する1つ以上のアミノ酸を含むかまたは必要とする、請求項1～50のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  60. 前記抗体がヒトAXLのFN2ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープが、ヒトAXLの位置A359、R386に対応するアミノ酸、および位置Q436～K439に対応する1つ以上のアミノ酸を含むかまたは必要とする、請求項1～50のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  61. 前記抗体が、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるアイソタイプの重鎖を含む、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  62. 前記アイソタイプが、IgG1、任意でアロタイプIgG1m(f)である、請求項61記載の使用のためのADC。
  63. 完全長モノクローナル抗体、例えば完全長モノクローナルIgG1,κ抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  64. 前記抗体が、エフェクター機能欠損抗体、安定化されたIgG4抗体、または一価抗体である、請求項1～63のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  65. ヒンジ領域全体を欠失するように重鎖が改変されている、請求項64記載の使用のためのADC。
  66. 前記抗体の配列が、N結合型グリコシル化のためのアクセプター部位を含まないように改変されている、請求項64および65のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  67. 前記抗体が一本鎖抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  68. 前記抗体が、前記請求項のいずれか一項記載の抗体の第1の結合領域と、該第1の結合領域とは異なる標的またはエピトープに結合する第2の結合領域とを含む二重特異性抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  69. 前記二重特異性抗体が第1および第2の重鎖を含み、該第1および第2の重鎖のそれぞれが少なくともヒンジ領域、CH2およびCH3領域を含み、該第1の重鎖において、ヒトIgG1重鎖中のK409、T366、L368、K370、D399、F405およびY407からなる群より選択される位置に対応する位置におけるアミノ酸のうちの少なくとも1つが置換されており、かつ該第2の重鎖において、ヒトIgG1重鎖中のF405、T366、L368、K370、D399、Y407およびK409からなる群より選択される位置に対応する位置におけるアミノ酸のうちの少なくとも1つが置換されており、かつ該第1および第2の重鎖の置換が同じ位置における置換ではない、請求項68記載の使用のためのADC。
  70. 前記第1の重鎖において、ヒトIgG1重鎖のK409に対応する位置のアミノ酸がRであり、かつ前記第2の重鎖において、ヒトIgG1重鎖のF405に対応する位置のアミノ酸がLであるか、またはその逆である、請求項1～69のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  71. 前記抗体が、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物中に含まれる、前記請求項のいずれか一項記載の使用のためのADC。
  72. ヒトAXLに結合する抗体を含むADCと、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤およびセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤からなる群より選択される少なくとも1種の治療剤とを含むキットであって、該ADCおよび該少なくとも1種の治療剤が、同時に、別々に、または逐次的に投与されるためのものである、キット。
  73. 対象における癌を治療する方法であって、該対象に、ヒトAXLに結合する抗体を含むADCと、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤またはセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤から選択される治療剤とを投与する工程を含み、該ADCおよび該治療剤が、同時に、別々に、または逐次的に投与される、前記方法。
  74. 対象におけるNSCLCを治療する方法であって、該対象に、ヒトAXLに結合する抗体を含むADCと、エルロチニブとを投与する工程を含み、該ADCおよびエルロチニブが、同時に、別々に、または逐次的に投与される、前記方法。
  75. 前記NSCLCがエルロチニブに耐性である、請求項74記載の方法。
  76. 前記NSCLCがAXLを発現する、請求項74～75のいずれか一項記載の方法。
  77. 対象におけるメラノーマを治療する方法であって、該対象に、
    - ヒトAXLに結合する抗体を含むADC、および
    - ベムラフェニブまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体
    を投与する工程を含み、
    該メラノーマがBRAFに変異を呈し、該変異がベムラフェニブによる該変異型BRAFのキナーゼ活性の阻害をもたらし、かつ
    該ADCおよびベムラフェニブまたはその類似体もしくは誘導体を同時に、別々に、または逐次的に投与する、前記方法。
  78. 対象におけるメラノーマを治療する方法であって、該対象に、
    - ヒトAXLに結合する抗体を含むADC、および
    - ダブラフェニブまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体
    を投与する工程を含み、
    該メラノーマがBRAFに変異を呈し、該変異がダブラフェニブによる該変異型BRAFのキナーゼ活性の阻害をもたらし、かつ
    該ADCおよびダブラフェニブまたはその類似体もしくは誘導体を同時に、別々に、または逐次的に投与する、前記方法。
  79. 前記変異が、V600、L597およびK601から選択されるBRAF残基にあり、例えば、V600E、V600K、V600D、L597RおよびK601Eから選択される変異である、請求項77および78のいずれか一項記載の方法。
  80. 前記メラノーマが、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、またはそれらのいずれかの類似体もしくは誘導体に耐性である、請求項77～79のいずれか一項記載の方法。
  81. 対象におけるメラノーマを治療する方法であって、該対象に、
    - ヒトAXLに結合する抗体を含むADC、および
    - トラメチニブまたはその治療上有効な類似体もしくは誘導体
    を投与する工程を含み、かつ
    該ADCおよびトラメチニブまたはその類似体もしくは誘導体を同時に、別々に、または逐次的に投与する、前記方法。
  82. 前記メラノーマがAXLを発現する、請求項77～81のいずれか一項記載の方法。
  83. 癌の治療を必要とする対象における癌を治療する方法であって、
    該癌が、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤およびセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤から選択される治療剤に耐性であり、
    該方法が、治療有効量の、ヒトAXLに結合する抗体を含むADCを該対象に投与する工程を含む、前記方法。
  84. 請求項1～71のいずれか一項記載の特徴を含む、請求項72～30のいずれか一項記載のキットまたは方法。
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