RU2647758C2 - Легковыделяемые биспецифические антитела с природным иммуноглобулиновым форматом - Google Patents

Легковыделяемые биспецифические антитела с природным иммуноглобулиновым форматом Download PDF

Info

Publication number
RU2647758C2
RU2647758C2 RU2015140911A RU2015140911A RU2647758C2 RU 2647758 C2 RU2647758 C2 RU 2647758C2 RU 2015140911 A RU2015140911 A RU 2015140911A RU 2015140911 A RU2015140911 A RU 2015140911A RU 2647758 C2 RU2647758 C2 RU 2647758C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
protein
domain
human
binding
heavy chain
Prior art date
Application number
RU2015140911A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2015140911A (ru
Inventor
Самьюэл ДЭВИС
Эрик СМИТ
Дуглас МАКДОНАЛД
Кара Луиз ОЛСОН
Original Assignee
Регенерон Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=42738900&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2647758(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Регенерон Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Регенерон Фармасьютикалз, Инк.
Publication of RU2015140911A publication Critical patent/RU2015140911A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2647758C2 publication Critical patent/RU2647758C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/08—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using activating agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/08—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using activating agents
    • C07K1/088—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using activating agents containing other elements, e.g. B, Si, As
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/247—IL-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/248—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биохимии. Описано изобретение - способ выделения биспецифического антигенсвязывающего белка. Способ включает в себя стадии: контактирование разрушенной клетки или смеси антигенсвязывающих белков с аффинной подложкой с белком А, и, элюирование биспецифического антигенсвязывающего белка с использованием градиента рН в присутствии ионного модификатора. Способ включает в себя использование ионного модификатора, который является солью, выбранной из ацетата бериллия, лития, натрия или калия; бикарбоната натрия или калия; карбоната лития, натрия, калия или цезия; хлорида лития, натрия, калия, цезия или магния; фторида натрия или калия; нитрата натрия, калия или кальция; фосфата натрия или калия; или сульфата кальция или магния. Изобретение расширяет арсенал средств для выделения антигенсвязывающих биспецифических белков. 24 з.п. ф-лы, 11 ил., 3 табл., 12 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к антигенсвязывающим белкам или антителам с гетеродимерами тяжелых цепей, т.е. антителам с двумя тяжелыми цепями иммуноглобулинов, которые отличаются по меньшей мере одной аминокислотой, что позволяет проводить выделение антигенсвязывающего белка на основе различной аффинности к аффинному реагенту тяжелой цепи иммуноглобулина и модифицированной или мутированной тяжелой цепи иммуноглобулина. Изобретение также относится к антигенсвязывающим белкам (в том числе, к биспецифическим антителам), которые имеют участки СН2 и СН3 IgG с различными аффинностями к белку А, что обеспечивает их быстрое выделение за счет различного связывания участков IgG с белком А.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Антитела представляют собой многофункциональные молекулы, обладающие уникальной специфичностью связывания мишеневого антигена, а также способностью к взаимодействию с иммунной системой посредством механизмов, которые являются антиген-независимыми. Многие биологические лекарственные средства, используемые в настоящее время для лечения рака, представляют собой моноклональные антитела, направленные против антигенов, которые, как правило, сверхэкспрессированы на мишеневой злокачественной клетке. Если такие антитела связывают опухолевые клетки, то они могут запускать механизм антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC). К сожалению, злокачественные клетки часто обладают механизмами, которые подавляют эти нормальные иммунные ответы.
В последние годы значительные усилия были направлены на создание терапевтических средств, аналогичных антителам, которые обладают более чем одной антиген-связывающей специфичностью, например, биспецифических антител. В случае способов лечения злокачественной опухоли, полиспецифический характер может обеспечить возможность применения, например, одной связывающей специфичности для нацеливания молекулы к антигену опухолевой клетки, а другой связывающей специфичности для индукции ответа, который в норме отсутствует в иммунной системе. Биспецифические антитела также могут быть использованы в качестве лигандов-заменителей для двухкомпонентных гетеродимерных рецепторных систем, которые в норме активируются их природным лигандом, который связывает и объединяет оба компонента.
В данной области разработаны различные форматы для направления терапевтического потенциала, обусловленного молекулами с многочисленными связывающими специфичностями. Желательно, такие молекулы должны представлять собой удобные в работе белки, которые легко получать и очищать, и которые обладают подходящими свойствами in vivo, например, фармакокинетикой, подходящей для намеченной мишени, минимальной иммуногенностью и, если необходимо, эффекторными функциями обычных антител.
Самый прямой способ получения биспецифического антитела (экспрессия двух различных антител в одной клетке) приводит к получению нескольких видов, поскольку соответствующие тяжелые цепи образуют и гомо- и гетеродимеры, а нужны только гетеродимеры. Также, легкие и тяжелые цепи могут образовать пару несоответствующим образом. Ниже описаны некоторые примеры форматов, которые пытаются разрешить эти проблемы различными способами.
Один из форматов, используемый для биспецифичных молекул-активаторов Т-клеток (BiTE) (см., например, Wolf Е. et al. (2005) Drug Discovery Today 10:1237-1244)), основан на элементах одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv). scFv состоит из вариабельных областей легкой и тяжелой цепи антител, соединенных посредством гибкого линкера, который, как правило, может сворачиваться соответствующим образом и благодаря этому области могут связывать "свой" антиген. BiTE последовательно соединяет две различные специфичности scFv на одной цепи (см. фиг. 1А). Подобная конфигурация предотвращает получение молекул с двумя копиями вариабельной области одной и той же тяжелой цепи. Кроме того, конструируют конфигурацию линкера для обеспечения правильного объединения соответствующих легких и тяжелых цепей.
Формат BiTE имеет некоторые недостатки. Во-первых, общеизвестно, что молекулы scFv склонны к агрегации. И хотя иммуногенность линкеров scFv по общему мнению является низкой, нельзя исключить возможность продукции антител против BiTE. Отсутствие участка Fc в формате BiTE также делает его время полужизни в сыворотке очень короткой, и это влечет за собой сложности вследствие частых повторных введений или вследствие непрерывной инфузии посредством помпы. В конечном итоге, отсутствие Fc также подразумевает отсутствие эффекторных функций, опосредованных Fc, которые могут являться эффективными в некоторых условиях.
Второй формат (фиг. 1В) представляет собой гибрид моноклонального антитела мыши и крысы, и основывается на модификации общепринятой аффинной хроматографии с белком А (см., например, Lindhofer, Н. et al. (1995) J. Immunol. 155:219-225)). В данном формате, антитело IgG2a мыши и IgG2b крысы продуцируются вместе в одной клетке (например, либо в виде квадромы, полученной слиянием двух гибридом, либо в сконструированных клетках СНО). Так как легкие цепи каждого антитела связываются преимущественно тяжелыми цепями родственных видов, то можно получить только три отдельных вида антител: два исходных антитела, и гетеродимер двух антител, содержащий одну пару тяжелой/легкой цепи каждого, связанную посредством их участков Fc. Требуемый гетеродимер можно легко очищать из смеси, так как его свойства связывания с белком А отличаются от свойств связывания исходных антител: IgG2b крысы не связывается с белком А, в то время как IgG2a мыши связывается. Таким образом, гетеродимер мышь-крыса связывается с белком А, но элюируется при более высоком значении рН, чем гомодимер IgG2a мыши, и это делает возможным селективную очистку биспецифического антитела. Как и в случае с форматом BiTE, этот гибридный формат обладает двумя моновалентными антигенсвязывающими участками.
Недостатком гибрида мышь/крыса в том, что он не является человеческим, это, вероятно, вызовет иммунный ответ у пациента, что может иметь побочные эффекты (например, реакции «НАМА» или «HARA»), и/или нейтрализовать эффект терапии.
На современном уровне техники обсуждали третий формат, обозначаемый как «выступы-во-впадины» (фиг. 1С), как возможно эффективный для получения биспецифических антител (патент США №7183076). В этой стратегии, конструируют участки Fc из двух антител для создания одного выступающего «выступа», и другой комплементарной «впадины». Утверждают, что будучи полученными в одной и той же клетке, тяжелые цепи преимущественно образуют гетеродимеры, а не гомодимеры, посредством объединения сконструированных «выступов» с конструированными «впадинами». Проблемы правильного спаривания легкой и тяжелой цепи решают посредством выбора антител, которые обладают различными специфичностями, но используют одинаковые легкие цепи.
Недостаток этого формата состоит в том, что стратегия «выступы-во-впадины» может приводить к продукции значительного количества гомодимеров, что, таким образом, влечет за собой дополнительные стадии очистки. Эта проблема осложняется тем фактом, что контаминирующие виды по многим своим свойствам очень похожи на желаемые виды. Сконструированные формы могут также являться иммуногенными, так как мутации, вводимые для создания «выступов» и «впадин», привносят чужеродные последовательности.
Сохраняется необходимость в формате биспецифического антитела, в частности для терапевтического применения, который минимизирует некоторые или все недостатки, перечисленные выше.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1 проиллюстрировано три формата биспецифического антитела: (А) биспецифический активатор Т-клеток (BiTE); (В) гибрид мышь-крыса; и (С) "выступы-во-впадины" с общей легкой цепью.
На фиг. 2 проиллюстрирована модификация FcΔAdp: (А) выравнивание Fc-областей IgG1 человека (SEQ ID NO: 1) и IgG3 (SEQ ID NO: 3), демонстрирующее модификацию FcΔAdp, окаймленную рамкой; (В) схематическое изображение биспецифического антитела FcΔAdp.
На фиг. 3 проиллюстрировано выравнивание доменов СН3 IgG1 человека (с использованием нумерации экзонов IMGT и нумерацию EU), IgG2, и IgG4, с дипептидной модификацией ΔAdp и без дипептидной модификации ΔAdp, а также IgG3.
На фиг. 4 показана регистрация результатов выделения биспецифического антитела на колонке с белком А, которые показывают профиль элюции с использованием ступенчатого градиента.
На фиг. 5 представлен профиль связывания IL4-Ra и IL-6Ra в BIACORE™ для фракций, элюированных с колонки при хроматографическом разделения, показанном на фиг. 4. Антитела во фракциях захватывали иммобилизованными антителами против Fc и затем растворимые IL-4Ra или IL-6Ra исследовали на связывание с захваченными антителами.
На фиг. 6 показан фармакокинетический профиль биспецифического антитела FcΔAdp (IL-6RΔ/IL-4R), гомодимера FcΔAdp (IL-6RΔ/IL-6RΔ), антитела IgG1 с последовательностью СН3 дикого типа (IL-4R/IL-4R) и контрольного моноспецифического антитела.
На фиг. 7 проиллюстрирована эффективность биспецифического антитела CD20xCD3ΔAdp в анализе цитолиза клеток Raji.
На фиг. 8 проиллюстрирован неспецифический цитолиз клеток (293) с биспецифическим антителом CD20xCD3ΔAdp.
На фиг. 9 показаны результаты экспериментов по экспрессии, с использованием различных гетеродимеров mFc. Панель А: анализ Вестерн-блоттинг зависящего от pH разделения гетеродимерного mIgG2a/mIgG2aPTTTK от гомодимерного mIgG2a и гомодимерного IgG2aPTTTK; панель В: анализ Вестерн-блоттинг зависящего от pH разделения гетеродимерного mIgG2a/mIgG2aTTTK от гомодимерного mIgG2a и гомодимерного IgG2aTTTK; IP = исходная фракция; FT = фракция, пропущенная через колонку; W2 = вторая промывка (1×PBS pH 7,2); Е1 = первая элюция (20 мМ Na цитрат, 1М NaCl рН 5,5); Е2 = вторая элюция (20 мМ Na цитрат, 1М NaCl; 57% pH 5,5 + 43% pH 2,6); Е3 = третья элюция (20 мМ Na цитрат, 1М NaCl pH 2,6).
На фиг. 10 проиллюстрировано предпочтительное образование гетеродимеров мутантов IgG2a над образованием гетеродимеров смешанных изотипов (например, mIgG2a и mIgG1), с использованием соотношения 4:1 для конструкта IFNAR1:IFNAR2. Дорожка 1: IFNAR1-IgG2a:IFNAR2-IgG1; дорожка 2: INFAR1-IgG2a:IFNAR2-IgG2aTTT; дорожка 3: IFNAR1-IgG2a:IFNAR2-IgG2aTTTK; дорожка 4: IFNAR1-IgG2a:IFNAR2-IgG2aPTTTK; дорожка 5: IFNAR1-IgG2a:IFNAR2-IgG2aRF.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение по меньшей мере отчасти основано на использовании в биспецифическом антигенсвязывающем белке двух последовательностей константного домена СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина, которые отличаются по меньшей мере одной аминокислотой. Отличие по меньшей мере в одной аминокислоте приводит к повышенной эффективности при выделении белка, так как отличие приводит к различной способности последовательностей домена СН3 связываться с аффинным средством.
В одном из аспектов, разработан антигенсвязывающий белок, содержащий первый и второй полипептид, первый полипептид содержит, от N-конца до С-конца, первую антигенсвязывающую область, которая селективно связывает первый антиген, за которым следует константная область, которая содержит первую область СН3 IgG человека, выбранного из IgG1 (SEQ ID NO: 1), IgG2 (SEQ ID NO: 3), IgG4 (SEQ ID NO: 5), и их комбинацию; и, второй полипептид, содержащий, от N-конца до С-конца, вторую антигенсвязывающую область, которая селективно связывает второй антиген, с последующей константной областью, которая содержит вторую область СН3 IgG человека, выбранную из IgG1, IgG2, IgG4, и их комбинацию, где вторая область СН3 содержит модификацию, которая снижает или устраняет связывание второго домена СН3 с белком А.
В одном из вариантов осуществления вторая область СН3 содержит модификацию 95R (при нумерации экзонов IMGT; 435R при нумерации EU). В другом варианте осуществления вторая область СН3 дополнительно содержит модификацию 96F (IMGT; 436F при EU). В конкретных вариантах осуществления, вторая область СН3 выбрана из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 6.
В одном из вариантов осуществления вторая область СН3 происходит из модифицированного IgG1 человека (SEQ ID NO: 2) и дополнительно содержит модификацию, выбранную из группы, состоящей из D16E, L18M, N44S, K52N, V57M и V82I (IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M и V422I при EU).
В одном из вариантов осуществления вторая область СН3 происходит из модифицированного IgG2 человека (SEQ ID NO: 4) и дополнительно содержит модификацию, выбранную из группы, состоящей из N44S, K52N и V82I (IMGT; N384S, K392N и V422I при EU).
В одном из вариантов осуществления вторая область СН3 происходит из модифицированного IgG4 человека (SEQ ID NO: 6), и дополнительно содержит модификацию, выбранную из группы, состоящей из Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q и V82I (IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q и V422I при EU).
В одном из вариантов осуществления домен СН3 происходит из химерного домена, который содержит последовательности из двух или более IgG1 человека, IgG2 человека, IgG3 человека и IgG4 человека.
В одном из вариантов осуществления домен СН3 происходит из IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека, и антигенсвязывающий белок дополнительно содержит домен СН1 и СН2, где домен СН1 и домен СН2 независимо выбраны из группы, состоящей из домена СН1 или СН2 IgG1 человека, домена СН1 или СН2 IgG2 человека, химерного IgG1/IgG2 человек/человек или химерного IgG1/IgG3 человек/человек или химерного домена IgG2/IgG3 человек/человек или химерного IgG1/IgG4 человек/человек или химерного IgG3/IgG4 или химерного домена IgG2/IgG4. В конкретном варианте осуществления химерные домены IgG1/IgG2, IgG1/IgG3, IgG2/IgG3, IgG1/IgG4, IgG3/IgG4 и IgG2/IgG4 являются неиммуногонными или по существу неиммуногенными для человека.
В одном из вариантов осуществления антигенсвязывающий белок дополнительно содержит легкую цепь иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления легкая цепь иммуноглобулина выбрана из легкой цепи лямбда и каппа человека.
В одном из вариантов осуществления каждая первая и вторая антигенсвязывающие области содержат по меньшей мере один CDR, в другом варианте осуществления по меньшей мере два CDR, в другом варианте осуществления каждая содержит три CDR. В конкретном варианте осуществления CDR происходят из тяжелой цепи иммуноглобулина. В другом конкретном варианте осуществления тяжелая цепь представляет собой тяжелую цепь иммуноглобулина человека.
В одном из вариантов осуществления первая антигенсвязывающая область содержит первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, а вторая антигенсвязывающая область содержит второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина.
В одном из вариантов осуществления первый и второй вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина независимо выбирают из домена иммуноглобулина мыши, крысы, хомяка, кролика, макака, человекообразной обезьяны и человека.
В одном из вариантов осуществления первый и второй вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина независимо содержат CDR человека, CDR мыши, CDR крысы, CDR кролика, CDR макака, CDR человекообразной обезьяны и гуманизированные CDR. В одном из вариантов осуществления CDR происходит из человека и является соматически мутированным.
В одном из вариантов осуществления первый и второй вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина содержат каркасную область человека (FR). В одном из вариантов осуществления FR человека представляет собой соматически мутированный FR человека.
В одном из вариантов осуществления первую и/или вторую антигенсвязывающие области получают скринингом фаговой библиотеки, содержащей вариабельные области антитела, по реактивности по отношению к представляющему интерес антигену. В другом варианте осуществления первую и/или вторую антигенсвязывающие области получают иммунизацией животного, не являющегося человеком, такого как мышь, крыса, кролик, макака или человекообразная обезьяна, представляющим интерес антигеном и идентификацией последовательности нуклеиновой кислоты вариабельной области антитела, кодирующей вариабельную область, специфичную для представляющего интерес антигена. В конкретном варианте осуществления животное, не являющееся человеком, содержит один или несколько генов вариабельной области иммуноглобулина человека. В другом конкретном варианте осуществления один или несколько генов вариабельной области иммуноглобулина человека представлены в животном, не являющемся человеком, внехромосомно, в виде перестановки в локусе эндогенного иммуноглобулина, или в виде трансгена, случайным образом интегрированного в геном животного, не являющегося человеком. В одном из вариантов осуществления первую и/или вторую антигенсвязывающие области получают из гибридомы или квадромы, в другом варианте осуществления посредством скрининга иммунных клеток иммунизированного животного, не являющегося человеком, используя сортировку клеток.
В одном из вариантов осуществления антигенсвязывающий белок представляет собой биспецифическое антитело. В одном из вариантов осуществления биспецифическое антитело полностью является биспецифическим антителом человека и независимо обладает аффинностью для каждого эпитопа в микромолярном, наномолярном или пикомолярном диапазоне.
В одном из вариантов осуществления антигенсвязывающий белок является неиммуногенным или по существу неиммуногенным для человека. В конкретном варианте осуществления антигенсвязывающий белок не содержит неприродный эпитоп для Т-клетки человека. В одном из вариантов осуществления модификация области СН3 является неиммуногенной или по существу неиммуногенной для человека. В конкретном варианте осуществления модификация области СН3 не приводит в результате к образованию неприродного эпитопа для Т-клетки человека.
В одном из вариантов осуществления антигенсвязывающий белок содержит тяжелую цепь, где тяжелая цепь является неиммуногенной или по существу неиммуногенной для человека. В одном из вариантов осуществления тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, которая не содержит неприродный эпитоп для Т-клетки. В одном из вариантов осуществления тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, протеолиз которой не может привести к образованию аминокислотной последовательности из приблизительно 9 аминокислот, которые являются иммуногенными для человека. В конкретном варианте осуществления человек представляет собой человека, который подвергся действию антигенсвязывающего белка. В одном из вариантов осуществления тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, протеолиз которой не может привести к образованию аминокислотной последовательности, состоящей из приблизительно 13-17 аминокислот, которые являются иммуногенными для человека. В конкретном варианте осуществления человек представляет собой человека, который подвергся действию антигенсвязывающего белка.
В одном из аспектов, представлен биспецифический связывающий белок, содержащий модификации в СН2 и/или СН3, как описано в настоящем документе, где биспецифический связывающий белок содержит первую связывающую молекулу, которая специфически распознает антиген на В-клетке, и вторую связывающую молекулу, которая специфично распознает антиген на Т-клетке.
В одном из вариантов осуществления связывающий белок представляет собой биспецифическое антитело. В конкретном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит тяжелую цепь IgG1 человека и тяжелую цепь IgG1ΔAdp человека. В одном из вариантов осуществления первая связывающая молекула представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи человека, который специфично распознает CD20. В одном из вариантов осуществления вторая связывающая молекула представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека, который специфично распознает CD3. В одном из вариантов осуществления биспецифическое антитело демонстрирует, в анализе цитолиза Raji, ЕС50 приблизительно равное 2,8-3,2×10-12 М или приблизительно равное 2,8-3,0×10-12 М, и демонстрирует не более, чем приблизительно 1-10%, или 1-5% неспецифического цитолиза в анализе неспецифического клеточного цитолиза, где "фоновая" клетка не содержит эпитоп CD20. В конкретном варианте осуществления "фоновая" клетка представляет собой клетку 293. В другом конкретном варианте осуществления неспецифический клеточный цитолиз в анализе измеряют в концентрации биспецифического антитела от приблизительно 10-8 М до приблизительно 10-14 М.
В одном из аспектов, был создан способ для получения биспецифического антитела, где способ предусматривает: получение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей первую тяжелую цепь иммуноглобулина, содержащую первый вариабельный домен, который распознает первый эпитоп, где первая тяжелая цепь иммуноглобулина содержит константный домен изотипов IgG1, IgG2 или IgG4, или химерный константный домен этих изотипов; получение второй последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вторую тяжелую цепь иммуноглобулина, содержащую второй вариабельный домен, который распознает второй эпитоп, где вторая тяжелая цепь иммуноглобулина содержит константный домен изотипов IgG1, IgG2 или IgG4 или химерный константный домен этих изотипов, который содержит модификацию в его домене СН3, которая устраняет или снижает связывание с белком А; получение третьей последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь иммуноглобулина, которая образует пару с первой и второй тяжелой цепью иммуноглобулина; введение первой, второй и третьей последовательности нуклеиновой кислоты в клетку млекопитающего; что позволяет клетке экспрессировать иммуноглобулин, и выделение иммуноглобулина с использованием белка А.
В одном из вариантов осуществления клетка выбрана из СНО, COS, 293, HeLa и клетки сетчатки, экспрессирующей вирусную последовательность нуклеиновой кислоты (например, клетка PERC.6™).
В одном из аспектов, представлен биспецифический антигенсвязывающий белок, который содержит первую специфичность, которая связывает антиген и вторую специфичность, которая активирует рецептор, где биспецифический антигенсвязывающий белок содержит первый полипептид, содержащий первый домен СН3 IgG1, IgG2 или IgG4, который содержит связывающую белок А детерминанту, и второй полипептид, содержащий второй домен СН3 IgG1, IgG3 или IgG4, который лишен связывающей белок А детерминанты.
В одном из вариантов осуществления вторая специфичность, которая активирует рецептор, связывает рецептор с KD, которая представлена в молярном, миллимолярном, микромолярном, наномолярном или пикомолярном диапазоне.
В одном из вариантов осуществления вторая специфичность связывает рецептор, выбранный из рецептора, связывающего G-белок, рецептора тирозинкиназы, интегрина и Toll-подобного рецептора.
В одном из вариантов осуществления вторая специфичность связывается с рецептором и вызывает изменение рецептора или субъединицы или белка, физически связанного с ним для осуществления фосфорилирования серина, треонина или тирозина; обуславливает циклитизацию нуклеотида (например, цАМФ, цАДФ или цГМФ); обуславливает продукцию фосфатидилинозитола или его производных (например, IP3 или PIP3); обуславливает продукцию липидного вторичного мессенджера (например, диацилглицерола, церамида, лизофосфатидной кислоты, эйкозаноида); обуславливает дефосфорилирование (например, фосфатазную активность); обуславливает фосфорилирование липида для образования вторичного мессенджера; обуславливает гидролиз вторичного мессенджера; обуславливает протеолиз; обуславливает окислительно-восстановительный путь передачи сигнала; обуславливает перемещение белка в клеточные органеллы (например, в ядро); обуславливает агрегацию рецептора (самого с собой) для образования гомо- или (с другими рецепторами) гетеромультимеров; или обуславливает открытие или закрытие трансмембранного канала.
В одном из аспектов, предоставлен способ получения биспецифического антитела, включающий: выделение представляющего интерес биспецифического антитела из квадромы, где представляющее интерес биспецифическое антитело содержит первую тяжелую цепь, которая представляет собой изотип IgG1, IgG2 или IgG4, вторую тяжелую цепь, которая представляет собой изотип IgG1, IgG2 или IgG4, обладающий константным доменом, который содержит модификацию в своем домене СН3, который устраняет или снижает связывание с белком А, где представляющее интерес биспецифическое антитело выделяют, используя белок А.
В одном из аспектов, предоставлен способ получения биспецифического антитела, включающий стадию выделения из разрушенной клетки или смеси антител биспецифического антитела, имеющего селективно модифицированные домены СН3 IgG1, IgG2 или IgG4, где селективно модифицированный домен СН3 является неиммуногенным или по существу неиммуногенным для человека, и где модификация приводит к получению биспецифического антитела с гетеродимерной тяжелой цепью, мономеры которых обладают различной аффинностью к белку А и биспецифическое антитело выделяют из разрушенной клетки или смеси, используя белок А.
В одном из вариантов осуществления биспецифическое антитело выделяют, используя аффинную подложку с белком А, где биспецифическое антитело элюируется при pH от приблизительно 3,9 до приблизительно 4,4, от приблизительно 4,0 до приблизительно 4,3, от приблизительно 4,1 до приблизительно 4,2 или приблизительно pH 4,2. В одном из вариантов осуществления биспецифическое антитело элюируется при pH приблизительно 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4 или 4,5.
В одном из вариантов осуществления биспецифическое антитело выделяют, используя аффинную подложку с белком А и градиент pH или стадию, где градиент pH или стадия включает ионный модификатор. В конкретном варианте осуществления ионный модификатор представлен в молярной концентрации от приблизительно 0,5 до приблизительно 1,0. В конкретном варианте осуществления ионный модификатор представляет собой соль. В одном из вариантов осуществления ионный модификатор выбран из группы, состоящей из бериллия, лития, натрия и калиевых солей ацетата; натрия и калия бикарбонатов; лития, натрия, калия и цезия карбонатов; лития, натрия, калия, цезия и хлорида магния; натрия и калия фторидов; натрия, калия и кальция нитратов; натрия и калия фосфатов; и кальция и сульфата магния. В конкретном варианте осуществления ионный модификатор представляет собой галоидную соль щелочного металла или щелочно-земельного металла. В конкретном варианте осуществления ионный модификатор представляет собой хлорид натрия.
В одном из аспектов, связывающий белок, содержащий Fc, где Fc содержит первый домен СН3, который модифицирован как описано в настоящем документе и второй СН3, который не модифицируют, с тем, чтобы создать гетеродимерный Fc, где избирательная модификация приводит к тому, что связывающий белок элюируется из аффинного материала с белком А при единицах pH, равных 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,3 или 1,4, более высоких чем единицы pH для соответствующего связывающего белка, который не имел избирательной модификации.
В одном из вариантов осуществления селективно модифицированный связывающий белок элюируется при pH приблизительно 4,2, тогда как не модифицированный связывающий белок элюируется при pH приблизительно 3. В одном из вариантов осуществления селективно модифицированный связывающий белок элюируется при значении pH приблизительно равном 4,5, тогда как не модифицированный связывающий белок элюируется при значении pH, приблизительно равном 3,5. В одном из вариантов осуществления селективно модифицированный связывающий белок элюируется при значении pH приблизительно равном 4, тогда как немодифицированный связывающий белок элюируется при значении pH, приблизительно равном 2,8-3,5, 2,8-3,2 или 2,8-3. В одном из вариантов осуществления селективно модифицированный связывающий белок элюируется при значении pH, приблизительно равном 4,2, тогда как немодифицированный связывающий белок элюируется при значении pH, приблизительно равном 2,8. В одном из вариантов осуществления селективно модифицированный связывающий белок элюируется при значении pH приблизительно равном 4,4, тогда как немодифицированный связывающий белок элюируется при значении pH, приблизительно равном 3,6. В этих вариантах осуществления, «немодифицированный» относится к отсутствию модификации в 435 (нумерация EU), или отсутствию модификации в 435 и 436 (нумерация EU), в обоих доменах СН3.
Любые варианты осуществления и аспекты, описываемые в настоящем документе можно использовать в комбинации друг с другом, если не указано иначе или не очевидно из контекста. Другие варианты осуществления будут очевидны специалистам в данной области из обзора последующего описания.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Изобретение не ограничено конкретными способами и описанными экспериментальными условиями, по существу способы и условия могут изменяться. Также следует понимать, что используемая в настоящем документе терминология представлена только для описания конкретных вариантов осуществления, и не предназначена для ограничения, так как объем настоящего изобретения определен пунктами формулы изобретения.
Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области, к которому относится настоящее изобретение. Несмотря на то, что в практическом осуществлении или анализе по настоящему изобретению можно использовать любые способы и материалы, похожие или эквивалентные способам и материалам, описываемым в настоящем документе, конкретные способы и материалы описаны в документе. Все указанные публикации включены, таким образом, в качестве ссылки.
Как используется в настоящем документе термин «антитело» включает молекулы иммуноглобулинов, состоящие из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых цепей (Н) и двух легких цепей (L), связанных дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращено в настоящем документе как HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена, CH1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращено в настоящем документе как LCVR или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен CL. Области VH и VL можно дополнительно подразделять на области гипервариабельности, обозначаемые определяющими комплементарность областями (CDR), перемежающиеся с областями, которые являются более консервативными, обозначаемые каркасными областями (FR). Каждый VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенные от аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (CDR тяжелой цепи могут быть сокращены как HCDR1, HCDR2 и HCDR3; CDR легкой цепи могут быть сокращены как LCDR1, LCDR2 и LCDR3. Термин «высокая аффинность» антитела относится к таким антителам, которые обладают аффинностью связывания со своей мишенью по меньшей мере равной 10-9 М, по меньшей мере 10-10 М; по меньшей мере 10-11 М; или по меньшей мере 10-12 М, как измерено поверхностным плазмонным резонансом, например, BIACORE™ или аффинной ELISA в растворе.
Выражение «антигенсвязывающий белок» включает белок, имеющий по меньшей мере один CDR и способный к избирательному распознаванию антигена, т.е. белок, который является способным к связыванию антигена с KD, которая представлена по меньшей мере в микромолярном диапазоне. Для терапевтических антигенсвязывающих белков (например, терапевтических антител) обычно требуется KD, которая представлена в наномолярном или пикомолярном диапазоне. Выражение «антигенсвязывающий белок» также включает белок, содержащий первый и второй домен СН3, как описано в настоящем документе и первый белок или распознающий лиганд домен и второй белок или распознающий лиганд домен, где первый белок или распознающий лиганд домен и второй белок или распознающий лиганд домен, каждый независимо распознает один и тот же белок или лиганд или вместе распознают один и тот же белок или лиганд, или каждый независимо распознает различные белок или лиганд. Одним из примеров такого белка является иммуноадгезин, содержащий слитый белок - (гетеро- или гомо-) димер, где полипептиды димера представляют собой слитые полипептиды, которые содержат рецепторный компонент или лигандный компонент, где лигандный компонент включает аминокислотную последовательность, связывающую рецептор.
Выражение «биспецифическое антитело» включает антитело, способное селективно связывать два или более эпитопа. Биспецифические антитела, как правило, включают две различные тяжелые цепи, где каждая тяжелая цепь специфически связывает разные эпитопы или на различных молекулах (например, антигенах) или на одной и той же молекуле (например, на одном и том же антигене). Если биспецифическое антитело способно селективно связывать два различных эпитопа (первый эпитоп и второй эпитоп), аффинность первой тяжелой цепи для первого эпитопа, как правило, будет по меньшей мере от одного до двух или трех или четырех порядков ниже, чем аффинность первой тяжелой цепи для второго эпитопа и наоборот. Эпитопы, распознаваемые биспецифический антителом могут представлять собой одну и ту же или различную мишень (например, на одном и том же или различном белке). Биспецифические антитела можно получать, например, комбинированием тяжелых цепей, которые распознают различные эпитопы на одном и том же антигене. Например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельные последовательности тяжелой цепи, которые распознают различные эпитопы одного и того же антигена могут быть слиты с последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими различные константные области тяжелой цепи, и такие последовательности можно экспрессировать в клетке, которая экспрессирует легкую цепь иммуноглобулина. Типичное биспецифическое антитело имеет две тяжелые цепи, где каждая имеет три CDR тяжелой цепи, с последующим (от N-конца до С-конца) доменом СН1, шарнирной областью, доменом СН2 и доменом СН3, и легкой цепью иммуноглобулина, которая или не наделена антигенсвязывающей специфичностью, но может объединяться с каждой из тяжелой цепей, или может объединяться с каждой из тяжелых цепей и может связывать один или несколько эпитопов, ограниченных антигенсвязывающими областями тяжелой цепи, или может объединяться с каждой из тяжелых цепей и способствует связыванию или одной или обеих тяжелых цепей с одним или обоими эпитопами.
Термин «клетка» включает любую клетку, которая является подходящей для экспрессии рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты. Клетки включают клетки прокариот и эукариот (одноклеточные или многоклеточные), бактериальные клетки (например, штаммы Е. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp. и т.д.), клетки микобактерий, клетки грибов, дрожжевые клетки (например, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastor is, P. methanolica и т.д.), растительные клетки, клетки насекомых (например, SF-9, SF-21, клетки насекомых, инфицированные бакуловирусом, Trichoplusia ni и т.д.), не относящиеся к человеку животные клетки, клетки человека, или слияния клеток, такие как, например, гибридомы или квадромы. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку человека, макака, человекообразной обезьяны, хомяка, крысы или мыши. В некоторых вариантах осуществления клетка является эукариотической и выбрана из следующих клеток: СНО (например, СНО K1, DXB-11 СНО, Veggie-CHO), COS (например, COS-7), клетки сетчатой оболочки глаза, Vero, CV1, почек (например, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, НВ 8065, HL-60, (например, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (эпидермальная), CV-1, U937, 3Т3, клеток L, клеток С127, SP2/0, NS-0, ММТ 060562, клеток Сертоли, клеток BRL 3А, клеток НТ1080, миеломной клетки, опухолевой клетки и клеточной линии, полученной из указанных выше клеток. В некоторых вариантах осуществления клетка включает один или несколько вирусных генов, например, клетка сетчатой оболочки глаза, которая экспрессирует вирусный ген (например, клетки PER.С6™).
Выражение «определяющая комплементарность область» или термин «CDR» включает аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты генов иммуноглобулина организма, которые, как правило, (т.е. у животных дикого типа) присутствует между двумя каркасными областями в вариабельной области легкой или тяжелой цепи молекулы имуноглобулина (например, антитела или рецептора Т-клетки). CDR может кодироваться, например, последовательностью зародышевой линии или перестроенной или неперестроенной последовательностью, и, например, природной или зрелой В-клеткой или Т-клеткой. В некоторых случаях (например, для CDR3), CDR могут быть кодированы двумя или более последовательностями (например, последовательностями зародышевой линии), которые не являются смежными (например, в неперестроенной последовательности нуклеиновой кислоты), но являются смежными в последовательности нуклеиновой кислоты в В-клетке, например, в результате сплайсинга или соединения последовательностей (например, рекомбинация V-D-J для образования тяжелой цепи CDR3).
Выражение «тяжелая цепь» или «тяжелая цепь иммуноглобулина» включает последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина любого организма, и если не указано иначе, включает вариабельный домен тяжелой цепи. Вариабельные домены тяжелой цепи включают три области CDR тяжелой цепи и четыре FR, если не указано иначе. Фрагменты тяжелых цепей включают CDR, CDR и Fs, и их комбинации. Характерная тяжелая цепь дополнительно содержит вариабельный домен (с N-конца до С-конца), домен СН1, шарнирную область, домен СН2 и домен СН3. Функциональный фрагмент тяжелой цепи включает фрагмент, который способен специфически распознавать антиген (например, распознавание антигена с KD в микромолярном, наномолярном или пикомолярном диапазоне), который способен экспрессироваться и секретироваться из клетки, и который содержит по меньшей мере один CDR.
Выражение «содержащий Fc белок» включает антитела, биспецифические антитела, иммуноадгезины и другие связывающие белки, которые содержат по меньшей мере функциональную часть области СН2 и СН3 иммуноглобулина. «Функциональная часть» относится к областям СН2 и СН3, которые могут связывать рецептор Fc (например, FcγR; или FcRn, т.е. неонатальный рецептор Fc), и/или которые могут принимать участие в активации комплемента. Если области СН2 и СН3 содержат делеции, замены и/или вставки или другие модификации, которые не позволяют областям связывать любой рецептор Fc и также не позволяют активировать комплемент, то области СН2 и СН3 не являются функциональными.
Содержащие Fc белки могут содержать модификации в иммуноглобулиновых доменах, включающие такие модификации, которые оказывают влияние на одну или несколько эффекторных функций связывающего белка (например, модификации, которые затрагивают связывание FcγR, связывание FcRn и таким образом, влияют на время полужизни, и/или активность CDC). Такие модификацию включают, но ими не ограничиваются, следующие модификации и их комбинации, со ссылкой к нумерации EU константной области иммуноглобулина: 238, 239, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438 и 439.
Например, но не в качестве ограничения, связывающий белок представляет собой белок, содержащий Fc и демонстрирует увеличенное время полужизни в сыворотке (по сравнению с тем же белком, содержащим Fc без перечисленных модификаций) и имеет модификацию в положении 250 (например, Е или Q); 250 и 428 (например, L или F); 252 (например, L/Y/F/W или Т), 254 (например, S или Т) и 256 (например, S/R/Q/E/D или Т); или модификацию в положении 428 и/или 433 (например, L/R/SI/P/Q или K) и/или 434 (например, H/F или Y); или модификацию в положении 250 и/или 428; или модификацию в положении 307 или 308 (например, 308F, V308F) и 434. В другом примере, модификация может включать модификацию 428L (например, M428L) и 434S (например, N434S); модификацию 428L, 259I (например, V259I) и 308F (например, V308F); модификацию 433K (например, H433K) и 434 (например, 434Y); модификацию 252, 254 и 256 (например, 252Y, 254Т и 256Е); модификацию 250Q и 428L (например, T250Q и M428L); модификацию 307 и/или 308 (например, 308F или 308Р).
Выражение «ионный модификатор» включает группы, которые снижают или устраняют неспецифические (т.е. неаффинные) ионные взаимодействия между белками. «Ионные модификаторы» включают, например, соли, ионные комбинации металлов группы I и группы II с ацетатом, бикарбонатом, карбонатом, галогеном (например, хлоридом или фторидом), нитратом, фосфатом или сульфатом. Неограничивающий иллюстративный перечень «ионных модификаторов» включает бериллий, литий, натрий и калиевые соли ацетата; натрия и калия бикарбонаты; лития, натрия, калия и цезия карбонаты; лития, натрия, калия, цезия и хлорида магния; натрия и калия фториды; натрия, калия и кальция нитраты; натрия и калия фосфаты; и кальция и сульфат магния. «Ионные модификаторы» включают такие группы, которые оказывают ионное воздействие, которые, при добавлении к линейному или ступенчатому градиенту рН, или при уравновешивании носителя с белком А в «ионном модификаторе» и применении линейного или ступенчатого градиента pH, приводят к увеличению промежутка между единицами pH при элюции гомодимерного IgG и гетеродимерного IgG (например, IgG дикого типа человека и подобного IgG, но несущего одну или несколько модификаций в его домене СН3, как описано в настоящем документе). Подходящую концентрацию «ионного модификатора» можно определять посредством его концентрации, применяя колонку, упомянутую выше, линейный или ступенчатый градиент pH, с увеличением концентрации «ионного модификатора» до тех пор, пока не достигнут максимального промежутка при данном ступенчатом или линейном градиенте pH.
Выражение «легкая цепь» включает последовательность константной области легкой цепи иммуноглобулина из любого организма, и, если не указано иначе, включает легкие цепи каппа и лямбда человека. Вариабельные домены легкой цепи (VL), как правило, включают три CDR легкой цепи и четыре каркасных области (FR), если не указано иначе. Как правило, полноразмерная легкая цепь включает, от аминоконца до карбоксильного конца, домен VL, который включает FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 и константный домен легкой цепи. Легкие цепи, которые можно использовать по настоящему изобретению, включают такие легкие цепи, которые, например, не связывают селективно или первый или второй антиген, селективно связанный антигенсвязывающим белком. Подходящие легкие цепи включают легкие цепи, которые можно идентифицировать посредством скрининга обычно используемых легких цепей в существующих библиотеках антител (библиотеки в жидкостях или компьютерного моделирования), где легкие цепи по существу не влияют на аффинность и/или избирательность антигенсвязывающих доменов антигенсвязывающего белка. Подходящие легкие цепи включают такие легкие цепи, которые могут связывать один или оба эпитопа, которые связаны антигенсвязывающими областями антигенсвязывающего белка.
Выражение «микромолярный диапазон» предназначен для обозначения микромолярности 1-999; выражение «наномолярный диапазон» предназначен для обозначения наномолярности 1-999; выражение «пикомолярный диапазон» предназначен для обозначения пикомолярности 1-999.
Выражение «соматически мутированный» включает последовательность нуклеиновой кислоты из В-клетки, которая подверглась действию механизма переключению класса, где последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области иммуноглобулина (например, тяжелая цепь вариабельного домена или содержащая последовательность CDR или FR тяжелая цепь) в В-клетке, которую подвергли механизму переключения класса, не идентична последовательности нуклеиновой кислоты в В-клетке до переключения класса, такой как, например, различие в CDR или каркасной последовательности нуклеиновой кислоты между В-клеткой, которая не подверглась переключению класса и В-клеткой, которая подверглась действию механизма переключения класса. «Соматически мутированный» включает последовательности нуклеиновой кислоты В-клетки с созревшей аффинностью, которая не идентична соответствующим последовательностям в В-клетках, которые не являются аффинно созревшими (т.е. последовательности в геноме клеток зародышевой линии). Выражение «соматически мутированный» также включает последовательность нуклеиновой кислоты из В-клетки после представления В-клетки представляющему интерес антигену, где последовательность нуклеиновой кислоты отличается от соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты до представления В-клетки представляющему интерес антигену. Выражение «соматически мутированный» относится к последовательностям антител, которые были получены от животного, например, мыши, имеющей последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области иммуноглобулина человека, в ответ на антигенную стимуляцию, и которые является следствием процессов отбора, природно-действующих у такого животного.
Выражение «вариабельный домен» включает аминокислотную последовательность легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина (модифицированных как требуется), которые содержат следующие аминокислотные области, в последовательности от N-конца до С-конца (если не указано иначе): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. «Вариабельный домен» включает аминокислотную последовательность, способную сворачиваться в канонический домен (VH или VL), обладающий двойной бета-складчатой структурой, где бета-складчатые структуры соединены дисульфидной связью между остатком первой бета-складчатой структурой и второй бета-складчатой структурой.
Биспецифические антитела с модифицированными областями СН3 IgG
Авторы изобретения разработали новый формат, в котором комбинируются общепринятая стратегия легких цепей с использованием схемы избирательной очистки с белком А, которую можно использовать с компонентами антитела человека.
Так как ранее отмечено (Lindhofer Н. et al. (1995) J. Immunol. 155:219-225)), что IgG3 человека не связывается с белком А, то его теоретически можно использовать вместе с любыми другими тремя подклассами IgG человека в способе очистки, схожим со способом очистки, используемом для гибридов мышь-крыса. Однако хотя последовательности всех четырех подклассов IgG человека являются высокогомологичными, не известно будут ли области Fc IgG1, IgG2 и IgG4 образовывать гомодимеры с IgG3; даже лишь преимущественное формирование гомодимеров будет, при некоторых условиях, иметь отрицательное влияние на общий выход желаемых гетеродимеров (например, выделение из квадром). Дополнительные модификации также могут быть необходимы для компенсирования различий между шарнирной областью IgG3 и шарнирной областью других подклассов. Дополнительные модификации были бы также предпочтительны в некоторых случаях, не требующих наличия полноразмерного Fc IgG3, из-за возможного влияния на эффекторные функции.
Таким образом, авторы изобретения разработали «минимальный» формат, который использует, по случайности, простую определяющую детерминанту для связывания белка А. Сообщали (Jendeberg, L. et al. (1997) J. Immunological Meth, 201:25-34)), что неспособность IgG3 к связыванию белка А определяется одним аминокислотным остатком Arg435 (нумерация EU; Arg95 по IMGT), соответствующую позицию которого в других подклассах IgG занимает остаток гистидина. Таким образом, вместо IgG3 возможно использовать последовательность IgG1, в которой His435 заменен на Arg. Таким образом, согласно новой схеме очистки наличие единственной точечной мутации в IgG1 должно быть достаточным для получения различных значений аффинностей связывания. Данная модификация будет названа IgG1ΔA, для обозначения неспособности иммуноглобулина к связыванию белка А (и, аналогично, IgG2ΔA и IgG4ΔA или в более общем смысле, FcΔA).
Однако обозначенная точечная мутация приводит к образованию новой пептидной последовательности, которая, возможно, за счет мутации может быть иммуногенной. Точечная мутация, теоретически, может быть нагружена на молекулу МНС класса II и презентирована Т-клеткам, и таким образом, вызывать иммунный ответ. Для предотвращения этой опасности можно использовать дипептидную мутацию, H435R/Y436F (нумерация EU; H95R/Y96F по IMGT). Последовательность, полученная в результате в области модификации, является идентичной соответствующей последовательности IgG3 (см. фиг. 2А), и таким образом, можно было бы ожидать, что она будет иммунологически «невидимой», так как не присутствовало бы неприродных коротких пептидов, пригодных для презентации Т-клеткам. Опубликовано, что такой двойной мутант по-прежнему не связывает белок A (Jendeberg, L. et al. (1997) J. Immunological Meth. 201:25-34). В результате, дипептидная мутация не включает какие-либо остатки, которые, как полагают, создают возможность димерного взаимодействия Fc, таким образом маловероятно, что мутация затрагивает формирование гетеродимеров. Эту дипептидную мутацию обозначают как «IgG1ΔAdp» (и, аналогично, IgG2ΔAdp, IgG4ΔAdp и FcΔAdp). Положение дипептидной модификации в IgG1, IgG2 и IgG4 показано на фиг. 3 в последовательностях, обозначенных IgG1ΔAdp, IgG2ΔAdp и IgG4ΔAdp, представленных вместе с последовательностью дикого типа домена СН3 IgG человека, а также hIgG3, демонстрирующей нумерацию экзонов IMGT и нумерацию EU.
Модификация FcΔAdp не включает какие-либо остатки, которые, как полагают, образуют возможность димерного взаимодействия Fc, таким образом, маловероятно, что модификация FcΔAdp затрагивает формирование гетеродимеров. Так как FcΔAdp является очень небольшой, ее, вероятно, также можно включать в другие сконструированные формы Fc. IgG2ΔAdp и IgG4ΔAdp могут быть полезными в случаях, при которых желательно наличие эффекторных функций (или их потеря), связанные с каждым из последних.
В сущности, формат биспецифического антитела, описанный выше, включает два антитела с различной специфичностью, которые используют одинаковые легкие цепи, где Fc-область одной из них модифицируют согласно формату FcΔAdp (см. фиг. 2В). Его конфигурация соответствует конфигурации природного антитела человека, и таким образом, должна разделять присущие ему положительные свойства, включающие низкую склонность к агрегации, стабильность in vivo, минимальную иммуногенность, биораспределение, аналогичное биораспределению антител, хорошую фармакокинетику, и, необязательно, эффекторные функции. Разработаны способы выделения таких биспецифических антител, которые являются относительно быстрыми и простыми в исполнении.
Биспецифические связывающие белки с модифицированными областями СН IgG мыши.
Авторы изобретения разработали способ быстрого выделения связывающих белков, содержащих тяжелую цепь иммуноглобулина (или его фрагмента, содержащего функциональные СН2 и СН3), которые являются гетеродимерными в отношении одной или нескольких аминокислот в домене СНЗ. Тщательный отбор модификаций в домене СН IgG мыши и применение технологии индивидуального разделения предоставляет возможность быстрого выделения связывающего белка, содержащего две селективно модифицированных области СН мыши из гомодимеров и гетеродимеров, которые не содержат модификации.
IgG1 мыши, который содержит пролин в положении 247, треонин в положении 252, 254 и 256 и лизин в положении 258, только слабо связывается с белком А. Однако IgG2a и IgG2b мыши содержат различные остатки в этих положениях (за исключением положений 256 и 258 IgG2b) и IgG2a и 2b мыши хорошо связываются с белком А. Избирательное модифицирование областей СН двух IgG мыши в способе получения антитела, которое является гетеродимерным по тяжелым цепям, будет придавать такому антителу различные свойства связывания с белком А. Таким образом, разрабатываются различные схемы выделения на основе белка А, что предусматривает быстрое отделение модифицированного гетеродимера от любого гомодимера IgG мыши, будь то гомодимер IgG1 (который только очень слабо связал бы, если бы связывание произошло, белок А) или гомодимер IgG2a мыши, гомодимер IgG2b мыши или гетеродимер IgG2a/IgG2b. Например, биспецифическое антитело, обладающее двумя различными вариабельными доменами тяжелой цепи, но одного изотипа, например, IgG2a, можно экспрессировать в подходящей экспрессионной системе, которая задействует последовательности тяжелой цепи, где модифицируют только одну из СН областей IgG2a для снижения действия или удаления детерминанты, связывающей белок А. Таким образом, только одна из областей СН IgG2a будет демонстрировать значимую аффинность для белка А, и любое антитело, образованное из димера немодифицированного IgG2a и модифицированного IgG2a будет быстро выделено из модифицированного гетеродимера.
В различных вариантах осуществления, антитело, отличающееся тем, что одна область СН димера Fc содержит модифицированную область СН, в то время как другая область СН димера Fc лишена модификаций. Область СН IgG модифицируют для включения конкретных аминокислот в конкретные положения (нумерация EU), выбранных из группы, состоящей из: 252Т, 254Т и 256Т; 252Т, 254Т, 256Т и 258K; 247Р, 252Т, 254Т, 256Т и 258K; 435R и 436F; 252Т, 254Т, 256Т, 435R и 436F; 252Т, 254Т, 256Т, 258K, 435R и 436F; 24tP, 252Т, 254Т, 256Т, 258K, 435R и 436F; и 435R. В конкретном варианте осуществления выполняют конкретную группу модификаций, выбранных из групп, состоящих из: М252Т, S254T, S256T; М252Т, S254T, S256T, I258K; I247P, М252Т, S254T, S256T, I258K; H435R, H436F; М252Т, S254T, S256T, H435R, H436F; М252Т, S254T, S256T, I258K, H435R, H436F; I247P, М252Т, S254T, S256T, I258K, H435R, H436F; и H435R.
Гетеродимерные связывающие белки, основанные на IgG мыши, можно использовать для множества вариантов применения. Например, такие связывающие белки предусматривают способ выделения биспецифических антител с константными доменами мыши, где модификации не влияют или по существу не влияют на связывание антитела с одним или несколькими Fc-рецепторами мыши так, что антитело может принимать участие, например, в ADCC или CDC и также связывать два или более эпитопов на одной или различных мишенях.
В одном из аспектов, способ выделения связывающего белка включает первую область СН IgG мыши и вторую область СН IgG мыши, где первую область СН IgG модифицируют (но не вторую область СН IgG), с тем, чтобы снизить или устранить аффинность связывания с белком А первой области СН IgG мыши, но не второй области СН IgG мыши, и где связывающий белок содержит первый связывающий фрагмент, который связывает первый эпитоп и вторую связывающую детерминанту, которая связывает второй эпитоп.
В одном из вариантов осуществления модификации не изменяют или по существу не изменяют аффинность связывания связывающего белка с Fc-рецептором. В одном из вариантов осуществления связывающий белок содержит модификации, которые увеличивают или снижают аффинность связывающего белка к Fc-рецептору.
В одном из вариантов осуществления модификация не изменяет или по существу не изменяет время полужизни связывающего белка в сыворотке мыши, содержащей нативные FcγR-рецепторы мыши и/или нативный FcRn мыши, по сравнению с соответствующим связывающим белком, который не имеет модификаций.
В одном из вариантов осуществления модификация не изменяет или по существу не изменяет, по сравнению со связывающим белком, который не имеет модификации, время полужизни связывающего белка в сыворотке мыши, которая содержит замену нативных высокоаффинных и низкоаффинных FcγR-рецепторов мыши и/или FcRn-рецептор.
В одном из вариантов осуществления первый и второй эпитопы различны и представлены на различных клетках или на различных белках. В одном из вариантов осуществления первый эпитоп и второй эпитоп различны и представлены на одной и той же клетке или белке.
В одном из вариантов осуществления Fc-рецептор выбран из высокоаффинного Fc-рецептора, низкоаффинного Fc-рецептора и FcRn. В конкретном варианте осуществления Fc-рецептор выбран из одного или нескольких FcRn мыши, FcγR мыши, FcγRIIB мыши, FcγRIII мыши, FcγRIV мыши и их комбинации. В конкретном варианте осуществления Fc-рецептор выбирают из одного или нескольких FcRn человека, FcγR человека, FcγRIIB человека, FcγRIIC человека, FcγRIIIB человека, FcγRIIIA человека, FcγRIIA человека и их комбинации.
Иммуногенность
Одним преимуществом многих вариантов осуществления изобретения является возможность использования модификации для создания биспецифического антитела, которое является как быстро выделяемым, основанным на различном связывании с белком А, так и неиммуногенным или по существу неиммуногенным для человека. Эта характеристика делает такие варианты осуществления особенно подходящим при создании биспецифических антител для применения в качестве терапевтических средств для человека и при создании иммуноадгезинов, которые например, являются неиммуногенными или по существу неимуногенными (с применением связывающих молекул человека, т.е. рецепторных компонентов человека и/или лигандов человека). Эта характеристика связана с биспецифическими антителами, обладающими доменами СН3 с модификациями H95R/Y96F (нумерация IMGT) в IgG1, IgG2 и IgG3, и такими доменами СН3, которые содержат дополнительные модификации, что приводит в результате к модифицированному положению, отражающему последовательность дикого типа различных изотипов IgG. Таким образом, хотя модификация не присутствует в природе, связанная с конкретным изотипом IgG модифицированная последовательность локально идентична последовательности дикого типа различных изотипов IgG, и как ожидают, модификация не будет иммуногенной или по существу иммуногенной. Также возможно, что модификация является неиммуногенной даже если ее последовательность локально не идентична любой нативной последовательности; такие модификации также могут быть полезны. Минимальная точечная мутация H95R (нумерация IMGT), при отсутствии иммуногенности, будет, таким образом, представлять собой подходящий вариант осуществления изобретения.
Таким образом, разработаны биспецифические антитела, которые являются неиммуногенным или по существу неиммуногенным для человека, в отношении их константных доменов тяжелой цепи, но, которые, тем не менее, содержат одну или несколько различных модификаций в константном домене тяжелой цепи, включая модификацию, которая приводит к различной аффинности константных доменов тяжелой цепи в отношении аффинного реагента {например, белка А). Модификации включают те, которые описаны в настоящем документе. В конкретном варианте осуществления биспецифическое антитело, которое является неиммуногенным или по существу неиммуногенным для человека в отношении его домена СН3, даже с селективно модифицированной тяжелой цепью, представляет собой IgG1, IgG2 или IgG4 человека, содержащие домен СН3, который включает одну из следующих модификаций (или, в другом варианте осуществления, по существу содержит одну из следующих модификаций): H95R или H95R и Y96F (нумерация IMGT).
Как ожидают, биспецифические антитела являются неиммуногенными или по существу неиммуногенными, в отношении людей, у которых не была нарушена в какой-либо значительной степени толерантность к изоформам IgG1, IgG2 и IgG4 человека.
В частности, как ожидают, модификация FcΔAdp является иммунологически «невидимой», так как связывающая бороздка молекул МНС класса II вмещает 9-мерный пептид, который содержит основную детерминанту, распознаваемую различными петлями рецептора Т-клеток, таким образом маловероятно, что пептиды, лишенные любой природной 9-мерной подпоследовательности будут вызывать иммунный ответ. Однако пептиды, длиннее чем 9-мерные (как правило, от приблизительно 13 до 17 мерный) связываются МНС класса II, и возможно, что выступающие сегменты могут потенциально оказывать влияние на связывание. Таким образом, дополнительные модификации (дополнительно к модификации FcΔAdp), которые устраняют более длинные неприродные последовательности могут дополнительно снижать возможность развития иммуногенности. Одним конкретным примером является модификация V422I (EU; V82I по нумерации IMGT), которая увеличивает длину минимального неприродного пептида на величину от 14 до 39 остатков в IgG1ΔAdp и до 43 остатков в аналогично обозначенном IgG2ΔAdp. Другим примером является модификация L445P (EU; L105P по нумерации IMGT) в IgG4ΔAdp, которая увеличивает длину на величину от 10 до 14 остатков.
Фармакокинетика
Участок связывания для белка А перекрывается с участком связывания для неонатального Fc-рецептора, FcRN, который, как полагают, отвечает за придание иммуноглобулинам более длительного времени полужизни в сыворотке. Таким образом, модификации, располагающиеся поблизости от участка связывания белка А, увеличивают возможность того, что формат иммуноглобулина, представленный в настоящем документе, может иметь более короткое время полужизни в сыворотке, чем формат IgG1, 2 и 4, учитывая то, что IgG3 человека обладает более коротким временем полужизни в сыворотке (приблизительно 7 сут), по сравнению с другими подклассами IgG (приблизительно 21 сут). Показано, что некоторые мутанты Fc, с измененным His435, не связывают FcRN и у мышей обладают более коротким временем полужизни. Однако фармакокинетический анализ показал, что время полужизни в сыворотке гетеродимера IgG1ΔA/IgG1 не существенно отличается от времени полужизни гомодимера IgGl (см. пример 2). Таким образом, мутация IgG1ΔAdp имеет преимущество при удалении способности связывания с белком А, в то время как все еще сохраняет более длинное время полужизни IgG1.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления разработан биспецифичный антигенсвязывающий белок, который включает модификацию домена СН3, как описано в настоящем документе, где антигенсвязывающий белок демонстрирует фармакокинетический профиль, эквивалентный профилю такого же биспецифичного антигенсвязывающего белка, который не имеет модификации в домене СН3. В одном из вариантов осуществления разработано биспецифическое антитело, которое содержит гетеродимерный Fc IgG1ΔA/IgG1, где биспецифическое антитело имеет время полужизни в сыворотке, которое приблизительно в 1,5 раза, приблизительно в 2 раза, приблизительно в 2,5 раза или приблизительно в 3 раза выше, чем время полужизни биспецифического антитела, которое в другом отношении является идентичным, но содержит домен СН3 IgG3 или которое в другом отношении идентично, но содержит по меньшей мере одну тяжелую цепь IgG3. В одном из вариантов осуществления разработано биспецифическое антитело, содержащее гетеродимерный Fc IgG1ΔA/IgG1, где биспецифическое антитело демонстрирует время полужизни в сыворотке, которое является приблизительно таким же, что и время полужизни биспецифического антитела без модификации IgG1ΔA (т.е. гомодимерное биспецифическое антитело IgG1).
Тяжелые цепи иммуноглобулинов
Вариабельные области тяжелой цепи иммуноглобулина, которые можно использовать для создания биспецифических антител с желаемыми характеристиками (например, желаемой специфичностью, аффинностью, функциональными свойствами, например, блокирующие, неблокирующие, ингибирующие, активирующие и т.д.) можно получать, используя любой известный в данной области способ. Желаемые тяжелые цепи можно затем конструировать посредством клонирования последовательностей нуклеиновой кислоты, содержащей вариабельные области в конструкты, обладающие желаемыми константными областями тяжелой цепи, описываемыми в настоящем документе.
В одном из вариантов осуществления первая тяжелая цепь содержит вариабельную область, которая кодируется нуклеиновой кислотой, полученной из генома зрелой В-клетки первого животного, которое иммунизировано первым антигеном и первую тяжелую цепь, которая специфично распознает первый антиген. В конкретном варианте осуществления вторая тяжелая цепь содержит вариабельную область, которая кодируется нуклеиновой кислотой, которую получают из генома зрелой В-клетки второго животного, которое иммунизировано вторым антигеном, и вторая тяжелая цепь специфично распознает второй антиген.
В одном из вариантов осуществления первое животное и/или второе животное представляют собой генетически модифицированное животное, содержащее неперестроенную вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В одном из вариантов осуществления первое животное и/или второе животное представляет собой генетически модифицированное животное, содержащее неперестроенную вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека и константную область иммуноглобулина человека. В одном из вариантов осуществления первое животное и/или второе животное представляет собой генетически модифицированную мышь, которая содержит неперестроенную вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека.
Последовательности вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина можно получать любым другим известным в данной области способом, например, посредством фагового дисплея, и полученные таким образом последовательности можно использовать для создания нуклеиново-кислотных конструктов, соединенных с нуклеиновыми кислотами, кодирующими любую подходящую тяжелую цепь, например, тяжелые цепи с модифицированными доменами СН3 как описано в настоящем документе, и помещать в экспрессирующую конструкцию и переносить в клетку, способную к созданию тяжелой цепи, например, в присутствии подходящей легкой цепи.
Легкие цепи иммуноглобулинов
Биспецифические антитела, содержащие две тяжелые цепи, которые распознают два различных эпитопа (или два различных антигена) более легко выделять, если они могут образовать пару с одинаковыми легкими цепями (т.е. легкими цепями, имеющими идентичные вариабельные и константные домены). В данной области известны различные способы создания легких цепей, которые могут образовывать пару с двумя тяжелыми цепями различной специфичности, не затрагивая при этом или по существу не затрагивая способность к избирательности и/или аффинность вариабельного домена тяжелой цепи по отношению к его антигену-мишени.
В одном из подходов, легкую цепь можно отбирать посредством исследования статистических данных использования всех вариабельных доменов легких цепей, определяя наиболее часто используемую легкую цепь в антителе человека, и образуя пару, в которой легкая цепь взаимодействует с двумя тяжелыми цепями различной специфичности.
В другом подходе, легкую цепь можно отобрать, изучая последовательность легкой цепи в библиотеке в формате фагового дисплея (например, библиотека в формате фагового дисплея, содержащая последовательность вариабельной области легкой цепи человека, например, библиотека ScFv человека) и отбирая из библиотеки наиболее общеупотребительную вариабельную область легкой цепи.
В другом подходе, легкую цепь можно отбирать, исследуя библиотеку вариабельных последовательностей легких цепей в формате фагового дисплея, используя вариабельные последовательности обоих тяжелых цепей в качестве зондов. Легкую цепь, которая связывается с обоими вариабельными последовательностями тяжелой цепи отбирают в качестве легкой цепи для связывания с тяжелыми цепями и обеспечивают связывание и/или активацию в отношении обоих эпитопов.
В другом подходе, легкую цепь можно отбирать комбинированием известных легких цепей с желаемыми тяжелыми цепями и исследованием полученного в результате биспецифического антитела на специфичность связывания, аффинность и/или способность к активации.
В тех случаях, когда при осуществлении любого из подходов при отборе легкой цепи встречаются трудности (например, легкая цепь оказывает влияние на связывание с антигеном одной или обеих тяжелых цепей или легкая цепь не связывается в достаточной степени с одной или обеими тяжелыми цепями), легкая цепь может совпадать с легкой цепью, родственной тяжелым цепям, и модификации в легкой цепи создают с целью большей совместимости характеристик последовательностей, характерных для родственных легких цепей обеих тяжелых цепей. При необходимости минимизировать возможность иммуногенности, модификации, предпочтительно, приводят в результате к получению последовательностей, которые присутствуют среди известных последовательностей легкой цепи, таким образом, является маловероятным, что протеолетический процессинг приведет к получению эпитопа для Т-клетки, если исходить из параметров и способов, известных в данной области для оценки вероятности возникновения иммуногенности (т.е. компьютерное моделирование, анализы в жидкостях).
Антитела и связывающие белки
Композиции и способы особенно подходят для создания биспецифических антител человека, т.е. биспецифических антител, содержащих константные и вариабельные домены иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления, антитела человека включают такие антитела, которые обладают вариабельными и константными доменами тяжелой цепи, полученными из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека, в некоторых вариантах осуществления полученных из соматически мутированных последовательностей иммуноглобулинов человека (полученных, например, от животного, которое содержит последовательности генов иммуноглобулина человека). В некоторых вариантах осуществления, вариабельные или константные области иммуноглобулина человека могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые иммуноглобулиновыми последовательностями зародышевой линии человека или кодируемые в результате наличия рекомбинации и/или сплайсинга, например, в CDR и в частности CDR3. Антитела человека не предназначены для включения антител, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мышь, трансплантированы в каркасные последовательности человека. Такие антитела обозначают как гуманизированные или химерные антитела. Антитела человека не включают антитела, содержащие мутации, например, введенные in vitro случайным или сайт-специфическим мутагенезом, а мутации являются, предпочтительно, неиммуногенными для человека.
Способы и композиции можно использовать для создания химерных антител, предпочтительно, неиммуногенных для человека, или с низкой иммуногенностью. Химерные антитела представляют собой антитела, в которых одна из вариабельных областей тяжелой цепи или каркасная или CDR или константная область тяжелой цепи или домен происходит из различных видов (например, человека и мыши или человека и примата). В некоторых вариантах осуществления химерные антитела включают антитела, обладающие вариабельной областью тяжелой цепи, происходящей из не принадлежащего к человеку вида (например, мыши) и константной области тяжелой цепи человека. В некоторых вариантах осуществления химерные антитела включают антитела, обладающие вариабельной областью тяжелой цепи человека и константной областью тяжелой цепи не принадлежащего к человеку вида (например, мыши). В различных вариантах осуществления области, происходящие из мыши, идентичны или по существу идентичны последовательности зародышевой линии иммуноглобулина человека с соматической гипермутацией или без нее. Химерные антитела также включают антитела, обладающие константной областью легкой цепи, которая идентична или по существу идентична зародышевой линии иммуноглобулина человека и не принадлежащей к человеку (например, мышь) тяжелой цепью или человеческой/не принадлежащей человеку химерной тяжелой цепью. Химерные антитела включают антитела, обладающие константным доменом легкой цепи, который идентичен или по существу идентичен не принадлежащей к человеку (например, мышь) последовательности иммуноглобулина зародышевой линии и тяжелой цепью человеческого происхождения или химерной тяжелой цепью или человеческой/не принадлежащей человеку химерной тяжелой цепью.
В некоторых вариантах осуществления представлены композиции и способы для получения антител с созревшей аффинностью. В некоторых вариантах осуществления антитело с созревшей аффинностью содержит одно или несколько изменений в одном или нескольких CDR, которые приводят к более высокой аффинности (например, KD в наномолярном или пикомолярном диапазоне) антитела по отношению к его мишеневому антигену, по сравнению с по существу идентичным антителом, которое не содержит изменений. Антитела с созревшей аффинностью можно получать любым подходящим способом, известным в данной области, например, случайным или сайт-специфическим мутагенезом CDR и/или каркасных областей с последующим скринингом аффинности, перестановкой домена VH и т.д.
В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой нейтрализующие антитела. Нейтрализующие антитела включают антитела, способные к нейтрализации, ингибированию или предотвращению биологической активности антигенов.
Нейтрализующие антитела включают антитела, которые, при связывании с антигеном, предотвращают или снижают способность антигенов взаимодействовать с природной мишенью антигена in vivo и in vitro. Примеры нейтрализующих антител включают антитела к белковому лиганду биологического рецептора, который предотвращает связывание лиганда с рецептором, или антитело к биологическому рецептору, который предотвращает связывание рецептора и его лиганду, при этом связывание лиганда в отсутствие антитела побуждает рецептор вызывать изменения внутри клетки. Определение того, является ли антитело нейтрализующим антителом, как правило, влечет за собой проведение функционального исследования, где измеряют эффект антител на биологическую активность антигена.
Способы и композиции по изобретению также могут использоваться для различных вариантов применения в отношении антител и других связывающих белков. Краткое описание некоторых эффективных вариантов применения представлены в настоящем документе.
Можно создать биспецифические связывающие белки, которые включают специфичность связывания по отношению к опухолевым антигенам и антигенам Т-клеток, которые нацелены на антиген на клетке, например, на CD20 и также нацелены на антиген на Т-клетке, например, на CD3. Таким образом, биспецифическое антитело нацелено на обе представляющие интерес клетки у пациента (например, на В-клетку у пациента с лимфомой, посредством связывания CD20), а также на Т-клетку пациента. Биспецифическое антитело, в различных вариантах осуществления сконструировано таким образом, чтобы активировать Т-клетку при связывании CD3, таким образом, связывая Т-клеточную активацию с конкретной, выбранной опухолевой клеткой.
Также можно получать биспецифичные связывающие белки, которые содержат две связывающие молекулы, каждая из которых нацелена на партнера по связыванию (т.е. каждая нацелена на различные мишени) на поверхности одной и той же клетки. Такое конструирование особенно подходит для нацеливания на конкретные клетки или типы клеток, которые экспрессируют обе мишени на поверхности одной и той же клетки. Несмотря на то, что мишени могут присутствовать по отдельности на других клетках, связывающие молекулы этих связывающих белков выбирают таким образом, чтобы каждая связывающая молекула связывала свою мишень с относительно низкой аффинностью (например, низкой микромолярной или высокой наномолярной, например, KD выше ста наномолей, например, 500, 600, 700, 800 наномолей). Таким образом, пролонгированное связывание мишени благоприятно только в случаях, когда две мишени близко расположены на одной и той же клетке.
Можно получать биспецифические связывающие белки, которые содержат две связывающие молекулы, которые связывают одну и ту же мишень, каждая в различном эпитопе одной и той же мишени. Такое конструирование особенно подходит для максимального увеличения возможности успешного блокирования мишени связывающим белком. Одну и ту же биспецифическую связывающую молекулу можно нацеливать на многочисленные внеклеточные петлевые структуры, например, трансмембранный канал или клеточный поверхностный рецептор.
Можно получать биспецифические связывающие белки, которые включают две связывающие молекулы, которые кластерируют и активируют негативные регуляторы иммунного пути передачи сигнала с целью иммунной супрессии. Подавление в значении цис можно достигать, когда мишени представлены на одной и той же клетке; подавление в значении транс можно достигать, когда мишени представлены на различных клетках. Подавление в значении цис, например, можно получать со специфическим связывающим белком, обладающим связывающей группой к IgGRIIb и связывающей группой к FelD1, так как IgGRIIb способен к кластерированию только в присутствие FelD1, с целью подавления иммунного ответа к FelD1. Подавления в значении транс, можно достигать, например, посредством биспецифического связывающего белка, обладающего связывающей группой к BTLA и связывающей группой, которая специфично связывает представляющий интерес тканеспецифический антиген, таким образом, кластерирование ингибиторной молекулы BTLA происходит только в выбранной мишеневой ткани, которая, возможно, связана с аутоиммунными заболеваниями.
Можно получать биспецифические связывающие белки, которые активируют многокомпонентные рецепторы. При таком конструировании, две связывающие молекулы, направляли против двух компонентов рецепторного связывания, поперечного связывания рецептора и активирования передачи сигнала с рецептора. Это можно осуществить, например, используя биспецифический связывающий белок со связывающей группой, которая связывает IFNAR1 и связывающей группой, которая связывает 1FNAR2, где связывание приводит к поперечному связыванию рецептора. Такой биспецифический связывающий белок может являться альтернативой лечению интерфероном.
Можно получать биспецифические связывающие белки, которые осуществляют транспорт связывающих молекул через полупроницаемые барьеры, например, гематоэнцефалический барьер. При таком конструировании, одна связывающая молекула связывает мишень, которая может проходит через конкретный избирательный барьер; другая связывающая молекула нацелена на молекулу с терапевтической активностью, где мишеневая молекула с терапевтической активностью не может, в обычных условиях, пересекать барьер. Это свойство биспецифического связывания белка подходит для доставки терапевтических средств к тканям, которых терапевтическое средство иначе бы не достигло. Некоторые примеры включают нацеливание рецептора pIGR для транспортировки терапевтического средства в желудочно-кишечный тракт или легкие, или нацеливание трансферринового рецептора для транспортировки терапевтического средства через гематоэнцефалический барьер.
Можно получать биспецифические связывающие белки, которые транспортируют связывающие молекулы в конкретные клетки или типы клеток. При этом конструировании, одна связывающая молекула нацелена на клеточный поверхностный белок (например, рецептор), который легко интернализуется в клетку. Другая связывающая молекула нацелена на внутриклеточный белок, в тех случаях, когда связывание внутриклеточного белка вызывает терапевтический эффект.
Можно получать биспецифические связывающие белки, которые связывают поверхностный рецептор фагоцитарной иммунной клетки и поверхностную молекулу инфекционного патогена (например, дрожжей или бактерии), для передачи инфекционного патогена в окружение фагоцитарной иммунной клетки для облегчения фагоцитоза патогена. Примером такого конструирования было бы биспецифическое антитело, которое нацелено на молекулы CD64 или CD89, а также на патоген.
Можно получать биспецифические связывающие белки, которые имеют вариабельную область антитела в качестве одной из связывающих молекул, а в качестве второй связывающей молекулы не относящаяся к Ig молекула. Вариабельная область антитела осуществляет нацеливание, в то время как не относящаяся к Ig молекула представляет собой эффектор или токсин, соединенный с Fc. Таким образом, лиганд (например, эффектор или токсин) доставляют к мишени, связанной вариабельной областью антитела.
Можно получать биспецифические связывающие белки, которые имеют две молекулы, где каждая связывается с областью Ig (например, последовательностью Ig, содержащей области СН2 и СН3) таким образом, что любые две белковые молекулы можно приблизить друг к другу за счет Fc. Примеры такого конструирования включают ловушки, например, гомо- или гетеродимерные молекулы-ловушки.
Нуклеиновые кислоты
Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие моноклональные антитела можно получать любыми подходящими способами, известными в данной области. Примеры подходящих способов получения моноклональных антител (и их последовательности нуклеиновой кислоты) включают, например, гибридомный способ (см., например, Kohler et al. (1975) Nature 256:495-497) или фаговой библиотеки антител (см., например, см. Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628).
В различных вариантах осуществления вариабельные домены тяжелой цепи получают из последовательностей нуклеиновой кислоты генетически модифицированного животного или трансгенного животного. В некоторых вариантах осуществления области получают из животного, которое содержит минилокус иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления области получают из мышей, содержащих одну или несколько внехромосомных нуклеиновых кислот, которые содержат одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих последовательности иммуноглобулина. В различных вариантах осуществления животное может иметь одну или несколько неперестроенных последовательностей нуклеиновых кислот иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления животное включает последовательности вариабельной области легкой цепи человека, в некоторых вариантах осуществления вариабельные последовательности тяжелой цепи человека, в некоторых вариантах осуществления вариабельные последовательности тяжелой и легкой цепи, и в некоторых вариантах осуществления дополнительно содержит последовательности константной области человека. В конкретном варианте осуществления последовательности нуклеиновой кислоты получают из мыши, у которой эндогенные сегменты вариабельных генов тяжелой цепи и сегменты вариабельных генов легкой цепи мыши заменены на сегменты вариабельных генов тяжелой цепи и сегменты вариабельных генов легкой цепи человека.
В некоторых вариантах осуществления последовательности нуклеиновой кислоты получают из "наивных" В или Т-клеток такого животного. В других вариантах осуществления последовательности нуклеиновой кислоты получают из В или Т-клеток животного, которое иммунизировано антигеном, представляющим интерес.
В различных вариантах осуществления последовательности нуклеиновой кислоты получают из клеток, амплифицируя их с праймерами, включающими, например, наборы вырожденных праймеров, которые содержат одну или несколько FR, соединительную цепь или константные последовательности.
В различных вариантах осуществления вариабельные домены тяжелой цепи получают из нуклеиновых кислот животного, которое иммунизировано представляющим интерес антигеном. Например, не относящееся к человеку трансгенное или генетически модифицированное животное иммунизируют представляющим интерес антигеном (например, подвергая животное воздействию антигена или клетки, несущей антиген или нуклеиновой кислоты, кодирующей зкспрессируемую форму антигена), позволяя животному перенести иммунный ответ, выделяют иммунные клетки из животного (например, В-клетки), необязательно иммортализующие клетки, и скринируют клетки для идентификации реакционной способности к антигену и/или идентификации и/или выделения последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариабельную область иммуноглобулина, который способен распознавать антиген, будучи помещенным в условия антитела. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой В-клетку. В некоторых вариантах осуществления В-клетку иммунизированного животного используют для создания гибридомы, и идентифицируют В-клетки, экспрессирующие антитела, которые специфично распознают эпитоп антигена и идентифицируют и/или выделяют последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют аминокислотную последовательность вариабельной области.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты получают из человекообразных, нечеловекообразных приматов (например, человекообразных обезьян, таких как шимпанзе), макак (например, яванская или резус), грызунов (например, мыши, крысы, хомяки), осла, коз, овцы и т.д.
В некоторых вариантах осуществления тяжелые цепи содержат последовательности, которые получают из клеток человека. Например, эмбриональных клеток человека, подвергающихся воздействию антигена in vitro и помещенных в подходящее животное-хозяина (например, мышь SCID).
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты встраивают в клетку, используя вектор. Векторы включают, например, плазмиды, космиды, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы растений, YAC, ВАС, элисомы, полученные на основе EBV.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты представлены в векторе экспрессии или экспрессирующей конструкции. В некоторых вариантах осуществления вектор экспрессии или конструкт представляет собой вектор, который содержит промотор, функционально связанный с представляющей интерес последовательностью нуклеиновой кислоты, такой как представляющая интерес последовательность нуклеиновой кислоты, которая способна экспрессироваться в подходящих условиях в подходящей клетке. Векторы экспрессии или конструкты могут включать лидерные последовательности, энхансеры, промоторные элементы, которые усиливают транскрипцию или трансляцию, последовательности, останавливающие транскрипцию, сплайсируемые последовательности, усиливающие транскрипцию интроны, элементы IRES, маркерные гены, выделенные последовательности, участки распознавания рекомбиназы, гомологичные плечи, вирусные последовательности, операторы (например, прокариотические операторы) и т.д. В некоторых вариантах осуществления векторы экспрессии содержат элементы, которые предусматривают индуцируемую экспрессию, например, прокариотический оператор, функционально связанный с эукариотическим промотором. В некоторых вариантах осуществления экспрессию индуцируют при добавлении индуктора экспрессии. В других вариантах осуществления экспрессию индуцируют устранением ингибитора экспрессии. В некоторых вариантах осуществления экспрессию индуцируют изменением температуры.
В некоторых вариантах осуществления одна или несколько нуклеотидных последовательностей тяжелой цепи представлены на одном и том же векторе. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи в настоящем документе представлены на одном и том же векторе. В одном из вариантов осуществления две последовательности нуклеиновой кислоты тяжелой цепи и последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи представлены в одном и том же векторе.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты экспрессируются в клетке, которая содержит одну или несколько нуклеиновых кислот из вируса. В конкретных вариантах осуществления, вирус выбирают из аденовируса, аденоассоциированного вируса, SV-40, вируса Эпштейна-Барра, ретровируса, лентивируса, бакуловируса, коронавируса, вируса простого герпеса, полиовируса, вируса лихорадки леса Семлики, вируса Sindbis и вируса вакцинии.
Клетки-хозяева представляют собой клетки, которые могут быть трансформированы для экспрессии представляющей интерес нуклеиновой кислоты. В различных вариантах осуществления трансформация включает изменение нуклеиново-кислотного состава клетки таким образом, чтобы она содержала экзогенные нуклеиновые кислоты (например, нуклеиновую кислоту, не присутствующую в клетке в природе или одну или несколько дополнительных копий нуклеиновой кислоты, соответствующих последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в клетке в природе). Нуклеиново-кислотный состав клетки можно изменять любыми подходящими способами, известными в данной области, например, интегрированием нуклеиновой кислоты в клеточный геном или помещением ее в клетку во внехромосомной или внегеномной форме. В некоторых вариантах осуществления нуклеиново-кислотное содержимое клетки можно изменять таким образом, чтобы клетка временно экспрессировала представляющую интерес нуклеиновую кислоту, или нуклеиново-кислотное содержимое можно изменять таким образом, чтобы клетка стабильно экспрессировала представляющую интерес нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления изменение в генетическом содержимом клетки наследуется при делении клетки.
Выделение биспецифического антигенсвязывающего белка
После того как выбрали подходящий набор модификаций, основываясь на информации, предоставленной в настоящем документе, были предприняты попытки выделить биспецифический антигенсвязывающий белок, используя способы, известные в данной области. Обычно применяемые опубликованные способы не при всех условиях могут обеспечить хорошее разделение.
Lindhofer et al. сконструировал биспецифическое антитело с гетеродимерной тяжелой цепью, где одна тяжелая цепь связывает белок A (IgG мыши), а другая тяжелая цепь не связывает белок А (IgG крысы), и успешно отделил гетеродимерное биспецифическое антитело крыса/мышь из смеси квадром и димеров мышь/мышь крыса/крыса, используя ступенчатый градиент рН со значениями от нейтрального до рН 5,8 для элюции гетеродимера и затем ступенчатый градиент со значениями рН от 5,8 до 3,5 для элюции гомодимера мышь/мышь (см. Lindhofer et al. (1995) Preferential species-restricted heavy/light chain pairing in rat/mouse quadromas: Implications for a single-step purification of bispecific antibodies. J. Immunol. 155(1):219-225).
Подход Lindhofer не подходит при применении его для отделения гомодимера IgG1 из гетеродимера IgG1 с двумя тяжелыми цепями IgG1, которые являлись идентичными, за исключением того, что один из доменов СН3 IgG1 содержал дипептидную модификацию H435R/Y436F. Авторы изобретения обнаружили, что при линейном градиенте pH, IgG1 с модифицированным дипептидом элюировался при pH со значением приблизительно 3,9, тогда как гомодимер IgG1 элюировался при pH со значением приблизительно 3,7. Различие в значениях pH посчитали не достаточным для достижения хорошего отделения гетеродимера от гомодимера, используя способ Lindhofer. Предсказуемым образом различие не воспроизводилось.
Изменение в характере хроматографии наблюдали в процессе хроматографии, при использовании довольно значительной ионной силы, вносимой ионной силой буферного раствора для сохранения конкретного значения pH или градиента. Но успешного разделения не достигали добавлением органического модификатора (1-пропанол). Напротив, несколько неожиданным явилось то, что для некоторых хроматографических процессов добавление от 0,5 молярного до 1,0 молярного ионного модификатора (например, NaCl) радикально и непредвиденно увеличило разделение гомодимерного IgG1 и гетеродимерного IgG1. Добавление ионного модификатора расширило диапазон pH для элюции (1,2 единиц pH с ионным модификатором, но 0,2 единицы pH без ионного модификатора), таким образом, при ступенчатом градиенте pH возможно успешное разделение двух видов. В других хроматографических процессах, однако, успешного разделения достигли при концентрации NaCl всего приблизительно 150 мМ (см. пример 4). Для того чтобы убедиться, что можно достичь успешного разделения, в одном из вариантов осуществления выделение биспецифического антигенсвязывающего белка выполнили в присутствии ионного модификатора с молярностью от приблизительно 0,5 до приблизительно 1,0.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления способ разделения биспецифического антигенсвязывающего белка, содержащего гетеродимерный IgG с одной цепью, содержащей модификацию как описано в настоящем документе, включает стадию использования градиента pH в присутствии ионного модификатора. В одном из вариантов осуществления ионный модификатор представлен в концентрации, достаточной для максимального увеличения в различии pH между элюцией с подложки с белком А гомодимера IgG и гетеродимера IgG, как описано в настоящем документе (т.е. с модификациями СН3). В конкретном варианте осуществления ионный модификатор представлен в молярной концентрации от приблизительно 0,5 до приблизительно 1,0. В другом конкретном варианте осуществления ионный модификатор представлен в молярной концентрации от приблизительно 0,15 до приблизительно 0,5.
В одном из вариантов осуществления ионный модификатор представляет собой соль. В одном из вариантов осуществления ионный модификатор представляет собой соль щелочного металла или щелочно-земельного металла и галоген. В конкретном варианте осуществления соль представляет собой хлористую соль щелочного металла или щелочно-земельного металла, например, NaCl, KCl, LiCl, CaCl2, MgCl2. В конкретном варианте осуществления соль представлена в молярности приблизительно 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0.
В одном из вариантов осуществления значение градиента pH составляет от приблизительно pH 3,9 до приблизительно pH 4,5, в другом варианте осуществления от приблизительно pH 4,0 до приблизительно pH 4,4 и в другом варианте осуществления от приблизительно pH 4,1 до приблизительно pH 4,3. В конкретном варианте осуществления градиент представляет собой линейный градиент.
В одном из вариантов осуществления градиент pH представляет собой ступенчатый градиент. В одном из вариантов осуществления способ включает применение для уравновешивания колонки с белком А (уравновешенной, например, PBS или другим подходящим буфером или жидкостью) значения pH приблизительно 3,9, значения pH приблизительно 4,0, значения pH приблизительно 4,1, значения pH приблизительно 4,2, значения pH приблизительно 4,3 или значения pH приблизительно 4,4. В конкретном варианте осуществления значение pH составляет приблизительно 4,2.
В одном из вариантов осуществления биспецифическое антитело, содержащее гетеродимерный IgG с доменом СН3 элюируется с подложки с белком А в одной или нескольких фракциях, по существу не содержащих негетеродимерный IgG. В конкретном варианте осуществления элюированные фракции биспецифического антитела содержат менее чем приблизительно 1%, 0,5% или 0,1% суммарного белка по массе, который представляет собой негетеродимерное антитело.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры используют для представления описания специалистам в данной области того, каким образом получить и использовать способы и композиции по изобретению, и не предназначены для ограничения объема того, что авторы изобретения рассматривают в качестве своего изобретения. Были предприняты усилия для обеспечения точности используемых значений (например, количества, температура и т.д.), но необходимо учитывать некоторые экспериментальное ошибки отклонения. Если не указано иначе, части представляют собой массовые части, молекулярная масса представляет собой среднюю молекулярную массу, температура представлена в градусах Цельсия, и давление представлено в значении, соответствующем атмосферному или около атмосферного.
Пример 1: Биспецифический антигенсвязывающий белок IL-4Ra/IL-6Ra
Выявлено, что два известных антитела изотипа IgG1 человека, одно против IL-4Ra, а другое против IL-6Ra, имели легкие цепи, которые отличались только четырьмя аминокислотами. Эксперимент по совместной экспрессии показал, что легкая цепь антитела против IL-4Ra могла быть замещена легкой цепью из IL-6Ra и все еще сохранять высокую связывающую способность к IL-4Ra, таким образом, позволяя ему продуцировать биспецифическое антитело, используя тяжелую цепь антитела против IL-4Ra и тяжелую цепь антитела против IL-6Ra и одну и ту же легкую цепь. Таким образом, модифицировали тяжелую цепь антитела IL-6Ra для создания FcΔAdp (т.е. дипептидную модификацию СН3 H95R/Y96F, по нумерации экзонов IMGT).
Легкую цепь антитела против IL-6Ra затем совместно экспрессировали в клетках СНО с тяжелыми цепями антитела против IL4Ra/Fc и против IL6Ra/FcΔAdp, и кондиционированную среду из эти клеток подвергли хроматографии с белком А. После загрузки колонки с белком А клеточным супернатантами, содержащими смесь гомо и гетеродимеров, проводили элюцию со ступенчатым градиентом pH, получаемым различной комбинацией двух буферов (А: 100 мМ цитрата Na, 150 мМ NaCl, pH 6,0 и В: 100 мМ цитрата Na, 150 мМ NaCl, pH 3,0; см. фиг. 4), получая, таким образом, три ступени при pH 6,0, pH 4,2 и pH 3,0, соответственно. На фиг. 4, IL-4R обозначает против IL-4Ra и IL-6RA обозначает против IL-6Ra(IgG1ΔAdp). Указанные фракции с колонки исследовали на связывание с белками IL-6Ra и IL-4Ra (см. фиг. 5). Выполняли ступенчатую элюцию, что приводило к появлению одного пика при элюции при значении pH, равном 4,2, и второму пику при значении pH равном 3,0 (фиг. 4). Анализ BIACORE™ показал, что проточный материал мог связывать растворимый IL-6Ra, но не IL-4Ra, как и ожидалось (фиг. 5). Фракции, соответствующие пику при значении pH, равному 4,2, могли связывать приблизительно равные количества IL-6Ra и IL-4Ra, что согласуется с наличием гетеродимеров. Фракции, соответствующие пику элюции при значении pH, равном 3,0, могли связывать только IL-4Ra, а не IL-6Ra, что согласуется с ожидаемым гомодимером против IL-4Ra. Это доказывает, что гетеродимерное биспецифическое антитело могло быть эффективно выделено с использованием хроматографии с белком А, с простым ступенчатым градиентом pH.
Пример 2: Фармакокинетика белков FcΔAdp
Для тестирования того, оказала ли влияние модификация FcΔAdp на фармакокинетику гетеродимерной молекулы, содержащей Fc/FcΔAdp, мышам вводили очищенные гетеродимерные виды белков против IL-4Ra/против IL-6Ra, описанные выше, и концентрации иммуноглобулина человека в сыворотке измеряли в течение периода 28 сут (фиг. 6; Таблица 1). Время полужизни в сыворотке гетеродимера составляло приблизительно 10 сут, аналогично гетеродимеру дикого типа. Это доказывает, что модификации FcΔAdp не оказывают видимого действия на время полужизни в сыворотке.
Figure 00000001
Пример 3: Биспецифический антигенсвязывающий белок CD20/CD3
Выявлено, что тяжелая цепь известного антитела против CD20 человека, будучи совместно экспрессированной с легкой цепью известного (активирующего) антитела против CD3 человека, все еще способна связывать CD20. Легкую цепь белка против CD3 затем подвергали совместной экспрессии или с тяжелой цепью белка против CD20/Fc, тяжелой цепью белка против CD3/FcΔAdp, или обоими тяжелыми цепями. Полученную в результате смешанную популяцию гомо- и гетеродимеров затем использовали в биоанализе для определения способности к уничтожению клеток-мишеней, экспрессирующих CD20 (фиг. 7). В кратком изложении, 2×107 РВМС клеток человека активировали 6×107 гранул CD3×CD28 (Invitrogen) в течение 72 ч. Тридцать единиц IL-2 (система R&D) затем добавляли и клетки инкубировали дополнительно в течение 24 ч. Клетки затем разделяли до концентрации 0,5×106/мл и добавляли дополнительные 30 Ед IL-2. Клетки затем инкубировали дополнительные 48 ч и использовали в биоанализе. В сутки биоанализа 2×106/мл клеток-мишеней, экспрессирующих CD20 (Raji) метили в течение 30 минут 8 мкМ кальцеина-АМ (Invitrogen). Промытые клетки-мишени добавляли к активированным клеткам hPBMC в отношении 1:10 мишень:эффекторные клетки (общее количество клеток на лунку 220000) в 200 микролитрах суммарного объема с указанным количеством супернатанта, содержащего антитело. Клетки инкубировали в течение 2 ч и получали супернатант и количественно определяли флуоресценцию. Цитотоксичность измеряли, рассчитывая отношение специфической флуоресценции к максимальной флуоресценции. Ни отдельно антитело против CD20 (использующее легкую цепь белка против CD3) ни антитело против CD3 не смогли вызвать цитолиз клеток-мишеней; даже смешивание двух реагентов не оказало действия. Однако, в случае, если все три компонента подвергались совместной экспрессии, наблюдали значительный цитолиз, что показывает, что эффект был вызван наличием гетеродимерных биспецифических видов. Основываясь на расчетном количестве биспецифического антитела в супернатанте временно трансфицированных клеток СНО, ЕС50 для цитолиза определили приблизительно равной 15 пМ.
Пример 4: Специфичность клеточного цитолиза у очищенного биспецифического антигенсвязывающего белка CD20/CD3
Супернатанты клеток СНО из эксперимента по трансфекции, который описаны в примере 3, подвергали аффинной хроматографии с белком А, используя ступенчатый градиент для элюции. Ступенчатый градиент получали посредством изменения комбинаций двух буферов (А: 20 мМ цитрата Na, 1М NaCl, pH 5,2; В: 20 мМ Na цитрат, 1М NaCl, pH 2,7). Таким образом, чтобы получить три ступени при значениях pH равных 5,2, pH 4,2 и pH 2,8, соответственно. Белок, соответствующий пику элюции при pH 4,2 затем использовали в анализе цитолиза, как описано в примере 3. Цитолиз мишени наблюдали при ЕС50 равной 3 пМ (фиг. 8). Дополнительный анализ цитотоксичности проводили для исследования специфичности наблюдаемого цитолиза к мишени. В этом эксперименте меченые клетки-мишени, экспрессирующие CD20 (Raji) или не экспрессирующие CD20 (293) инкубировали с активированными РВМС человека. Каждый тип клетки-мишени добавляли для анализа или отдельно или в комбинации с немеченными клетками-мишенями другого типа. Во всех случаях клетки-мишени, экспрессирующие CD20 подвергались специфичному цитолизу при ЕС50, равной 3 рМ, тогда как клеточная линия, не экспрессирующая CD20 не подвергалась цитолизу.
Пример 5: Разделение с белком А селективно модифицированного hIgG2 Fc
Селективно модифицированный гетеродимерный IgG2 человека Fc/ΔAdpFc и немодифицированный гомодимерный IgG2 человека Fc/Fc впервые получены способом "связывания и промывки" через колонку с белком A (rProtein A FF, GE). Для дополнительного отделения hIgG2 Fc/ΔAdpFc из hIgG2 Fc/Fc, проводили элюцию посредством ступенчатого градиента, используя систему SMART™ (GE), как указано далее. Система растворов состояла из раствора A (PBS, 1X), раствора В (20 мМ цитрата натрия и 1М NaCl, pH 5,5) и раствора С (20 мМ цитрата натрия и 1М NaCl, pH 2,5). Элюцию начали с изократического элюирования с 100% А в первые 20 мин с последующим мгновенным переключением до 100% В в 20 мин. Затем начинали линейный градиент до 33,5% С и 66,5% В в течение следующих 10 мин; концентрацию 33,5% раствора С сохраняли в течение 20 мин до полной элюции первого пика (Fc/ΔAdpFc). Линейный градиент от 33,5% С до 100% С следовал в течение следующих 30 мин. Скорость потока поддерживали на уровне 250 микролитров/мин и результаты хроматограммы детектировали при 280 нм детектором UV. hIgG2 Fc/ΔAdpFc элюировался при pH 4,5, тогда как hIgG2 элюировался при pH 3,5.
Пример 6: Разделение с белком А селективно модифицированного hIgG4 Fc
Селективно модифицированный гетеродимерный IgG4 человека (Fc/ΔAdpFc) и немодифицированный гомодимерный IgG4 (Fc/Fc) впервые получены способом "связывания и промывки" через колонку с белком A (rProtein A FF, GE). Для дополнительного отделения hIgG4 Fc/ΔAdpFc из hIgG4 Fc/Fc, проводили элюцию посредством ступенчатого градиента, используя систему SMART™ (GE), как указано далее. Система растворов состояла из раствора A (PBS, 1X), раствора В (20 мМ цитрата натрия и 1М NaCl, pH 5,1) и раствора С (20 мМ цитрата натрия и 1М NaCl, pH 2,8). Элюцию начали с изократического элюирования с 100% А в первые 20 мин с последующим мгновенным переключением до 100% В в 20 мин. Затем начинали линейный градиент до 50% С и 50% В в течение следующих 10 мин; концентрацию 50% раствора С сохраняли в течение 20 мин вплоть до полной элюции первого пика (Fc/ΔAdpFc). Линейный градиент от 50% С до 100% С следовал в течение следующих 30 мин. Скорость потока поддерживали на уровне 250 микролитров/мин и результаты хроматограмм детектировали при 280 нм посредством детектора UV. hIgG4 Fc/ΔdpFc элюировался при pH приблизительно 4, тогда как гомодимер элюировался в течение градиента pH от приблизительно 4 до pH 2,8.
Пример 7: Разделение с белком А селективно модифицированного hIgG1 CD3xCD20
Селективно модифицированный гетеродимерный IgG1 против hCD3xCD20 (Fc/ΔAdpFc) и немодифицированный гомодимерный белок против hCD20 разделяли на колонке в 1 мл rProtein AFF (GE Biosciences), как указано далее. Система растворов представляла собой буфер Al (PBS 1X), буфер А2 (20 мМ цитрата натрия и 1М NaCl pH 5,1), буфер В (20 мМ цитрата натрия и 1М NaCl pH 2,8).
Смешанный образец подвергали связыванию и промывали в PBS и буфере А2. Ступенчатый градиент использовали для получения pH 4,2, при котором элюировался биспецифический CD3*×CD20 IgG1 (Fc/ΔAdpFc), затем использовали линейный градиент pH 4,2-2,8, при котором элюировался гомодимерный IgG1 против hCD20.
Пример 8: Аффинность связывания модифицированных СН3 с рецепторами Fc
Аффинность связывания биспецифического антитела изотипа IgG1 человека с модификацией ΔAdp (H435R и Y436F, нумерация EU) с различными рецепторами Fc человека тестировали в анализе стационарного равновесия связывания Biacore™.
В кратком изложении, чип на основе карбоксиметилированного декстрана (СМ5) со связанным с амином mAb против penta-his (Qiagen) использовали для связывания различных конструктов рецепторов Fc человека. Далее с поверхностями различных покрытых белками против penta-his чипов СМ 5 связывали эктодомены рецептора Fc, меченые his: FcγRI, FcγRIIA (полиморф R131), FcγRIIB и FcγRIIIB (каждый из которых получен R&D Systems); и RcγRIIA (полиморф Н131), FcγRIIIA (полиморф V176) и RcγRIIIA (полиморф F176) (каждый получен от Regeneron). Антитела пропускали через поверхность из расчета трех концентраций для высокоаффинного эктодомена рецептора FcγRI (25 нМ, 50 нМ и 100 нМ), и из расчета между микромолярностью 5 до наномолярности 39 для низкоаффинных эктодоменов рецептора FcγR и определяли значение констант скорости ассоциации и диссоциации (ka и kd) и использовали их для расчета равновесной константы диссоциации антител (KDs). Исследования связывания проводили при комнатной температуре, используя буфер HBS-T pH 7,2. Определили Kds для контрольного антитела (hmAb), антитела против CD20 и антитела против модификации CD3Δdp, и биспецифического антитела CD20xCD3Δdp. Значения KD для антитела против CD3Δdp не показало значимых различий в связывании с любым из тестируемых рецепторов Fc, по сравнению с немодифицированным изотипом антител hIgG1 (таблица 2).
Figure 00000002
Пример 9: Фармакокинетика биспецифического hIgG1ΔAdp у мышей hFcRn
Фармакокинетическую скорость выведения биспецифического антитела IgG1ΔAdp против hCD3/hCD20 и его контролей, связанных с антителом (IgG против hCD3 и гомодимер IgGΔAdp против hCD3) определяли у мышей дикого типа (WT) и мышей, гомозиготных по замене FcRn мыши геном hFcRn (мышь hFcRn). Мыши дикого типа и мыши hFcRn представляли собой гибридные линии с исходной, содержащей C57BL6 (75%) и 129Sv (25%). Группы содержали по 4 мыши или WT или hFcRn, за исключением случая с одной группой мышей WT, получившей изотипически сходное контрольное антитело IgG1, в которой группа содержала 3 мыши. Мыши получили 1 мг/кг изотипически сходного (hIgG1) контрольного антитела, биспецифического IgG1ΔAdp против hCD3xCD20, IgG1 против hCD3 или гомодимера IgG1ΔAdp против hCD3. Все тестируемые компоненты вводили подкожно. Кровь собирали в 0 ч, 6 ч, 1 сут, 2 сут, 3 сут, 4 сут, 7 сут, 10 сут, 14 сут, 21 сут и 30 сут.
Уровни антител человека в сыворотке определяли "сэндвич" способом ELISA. В кратком изложении, поликлональным антителом козы против IgG человека (Fc-специфичное) (Jackson ImmunoResearch) покрыли 96-луночные планшеты из расчета концентрации один микрограмм/мл и инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем планшеты блокировали БСА, образцы сыворотки в 6 кратных серийных разведениях и стандартные образцы соответствующих антител в 12-кратных серийных разведениях добавляли к планшету и инкубировали в течение одного часа при (комнатной температуре. После промывания для удаления несвязавшегося антитела, детектировали связанные антитела человека, используя то же поликлональное антитело козы против IgG человека (Fc-специфичное), конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP) (Jackson ImmunoResearch) и выявляли посредством стандартного колориметрического тетраметилбензидинового субстрата (ТМВ) согласно рекомендациям производителя. Оптическую плотность при 450 нм регестрировали на спектрофотометре для чтения планшетов и рассчитывали концентрацию hIgG в образцах сыворотки, используя контрольную кривую, которую получали на той же плашке.
Не наблюдали значимого различия во времени полужизни в сыворотке четырех тестируемых антител IgG1 в течение периода в 30 сут. В частности, не наблюдали значимого различия между антителами IgG1, имеющими модификацию ΔAdp и антителами IgG1 дикого типа. Не наблюдали различия среди антител мышей дикого типа (mFcRn) или мышей, имеющих гуманизированное антитело FcRn (hFcRn). Как и ожидалось, у мышей hFcRn наблюдали немного ускоренный клиренс, по сравнению с мышами дикого типа. Результаты представлены в таблице 3.
Figure 00000003
Пример 10: Крупномасштабное выделение в буфере с низким содержанием соли
Биспецифическое антитело CD3xCD20ΔAdp выделяли по изобретению из крупномасштабной культуры. В кратком изложении, клеточную линию СНО-K1, экспрессирующую биспецифическое антитело против hCD3×CD20ΔAdp (модификация в тяжелой цепи CD3) культивировали в 11-литровом биореакторе. Клетки, несущие биспецифическое антитело вырастали до плотности приблизительно 8,25×106 клеток/мл, выход приблизительно 250-350 мг антитела/л. В отличие от этого, выход контрольного антитела против hCD3 составил приблизительно 100-150 мг/л.
Антитело выделяли на смоле MabSelect SuRe™ (GE) (толщина слоя 20 см, 1 см ID), уравновешенной 10 мМ фосфата натрия, 0,5М NaCl, pH 7,2, осветленную клеточную культуру наносили до 19 г/л, и колонку промывали 10 мМ фосфата натрия, 0,5 М NaCl, pH 7,2, из расчета 3 объемов колонки, с последующим промыванием 20 мМ фосфата натрия, pH 7,2 (без NaCl) из расчета 2 объемов колонки. Антитело элюировали 40 мМ ацетата, pH 3,0.
Моноспецифическое антитело против CD30 элюировалось при pH 3,6, тогда как биспецифическое антитело hCD3xCD20DAdp элюировалось при pH 4,4.
Пример 11: Избирательная элюция гетеродимеров мыши в среднем диапазоне значений pH с колонки с белком А
Клетки СНО-K1 временно трансфицировали экспрессирующими конструкциями внеклеточного домена IFNAR1 человека (hIFNAR1) и IFNAR2 человека (hIFNAR2), слитого с последовательностью дикого типа или мутантной последовательностью (TTTK или PTTK) mIgG2a Fc. Отношение между hIFNAR1-mFc и hIFNAR2-mFc поддерживали из расчета 1:1 посредством трансфицирования клеток равными количествами двух экспрессионных плазмид. Среду для культивирования собирали через 4 сут после трансфекции и подвергали очистке с белком А, используя центрифужные колонки объемом 0,2 мл NAb Protein A Plus™ (Thermo Scientific/Pierce). В кратком изложении, колонки уравновешивали 1×PBS, pH 7,2. Один мл среды для культивирования CHO-K1 инкубировали со смолой с белком А в течение 10 мин при комнатной температуре. Колонку затем промывали три раза 1×PBS, pH 7,2. Связанные белки элюировали буфером с 20 мМ цитрата натрия, содержащим 1 М NaCl. Проводили три элюции, используя 0,4 мл элюирующего буфера с понижающими значениями pH. Белки в различных фракциях определяли посредством анализа вестерн-блоттинг.
Результаты показали, что при элюции с градиентом pH возможно отделение гетеродимеров дикого типа и звездчатого мутанта mIgG2a от гомодимеров дикого типа mIgG2a (см. фракцию Е1 на обоих гелях фиг. 9).
Пример 12: Преимущественное образование гетеродимеров мутантов mIgG2a над гетеродимерами изотипов
Конструировали ДНК плазмиды для экспрессии в млекопитающих внеклеточных доменов рецепторов интерферона I типа (hIFNAR1 и hIFNAR2) с С-концевым Fc мыши (mIgG2a или mIgG1). Мутации в последовательности mIgG2a вводили, используя сайт-специфический мутагенез. Мутанты представляли собой ТТТ = М252Т, S254T, S256T; TTTK = М252Т, S254T, S256T, I258K; PTTTK = I247P, М252Т, S254T, S256T, I258K; RF = H435R, H436F. Клетки CHO-K1 временно трансфицировали экспрессирующими конструкциями. Отношение между IFNAR1-mFc и IFNAR2-mFc поддерживали из расчета 4:1 посредством трансфекции клеток 4-кратным избытком экспрессирующей плазмиды hIFNAR1-mFc (hIFNAR1-mIgG2a) по сравнению с hIFNAR2-mFc (mIgG1 или мутантный mIgG2a). Среду для культивирования собирали через 4 сут после трансфекции и белки mFc детектировали анализом вестерн-блоттинг.
Результат показал, что образование гетеродимеров между mIgG2a и mIgG1 намного менее эффективно, чем образование гетеродимеров между mIgG2a дикого типа и мутантами mIgG2a (сравни дорожки 1, 2, 5 фиг.10). Отношение 4:1 конструкт IFNAR1:IFNAR2 использовали для поддержания избытка конструкта IgG2a дикого типа в эксперименте.

Claims (32)

1. Способ выделения биспецифического антигенсвязывающего белка, включающий:
контактирование разрушенной клетки или смеси антигенсвязывающих белков с аффинной подложкой с белком А; и
элюирование биспецифического антигенсвязывающего белка с использованием градиента рН в присутствии ионного модификатора;
при этом биспецифический антигенсвязывающий белок содержит гетеродимерную область IgG СН3, содержащую первый и второй IgG СН3 домен, каждый из которых обладает различной аффинностью к белку А.
2. Способ по п. 1, в котором ионный модификатор представляет собой соль.
3. Способ по п. 1, в котором ионный модификатор представляет собой соль, выбранную из ацетата бериллия, лития, натрия или калия; бикарбоната натрия или калия; карбоната лития, натрия, калия или цезия; хлорида лития, натрия, калия, цезия или магния; фторида натрия или калия; нитрата натрия, калия или кальция; фосфата натрия или калия; или сульфата кальция или магния.
4. Способ по п. 1, в котором ионный модификатор представляет собой соль щелочного металла или щелочно-земельного металла и галогена.
5. Способ по п. 1, в котором ионный модификатор представляет собой NaCl, KCl, LiCl, CaCl2 или MgCl2.
6. Способ по п. 1, в котором ионный модификатор представляет собой NaCl.
7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором ионный модификатор присутствует в молярной концентрации от приблизительно 0,15 до приблизительно 0,5.
8. Способ по п. 7, в котором ионный модификатор представляет собой NaCl и присутствует в концентрации по меньшей мере приблизительно 150 ммоль/л.
9. Способ по любому из пп. 1-6, в котором ионный модификатор присутствует в молярной концентрации от приблизительно 0,5 до приблизительно 1,0, необязательно в молярной концентрации приблизительно 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0.
10. Способ по любому из пп. 1-6, в котором градиент рН представляет собой от рН приблизительно 3,9 до рН приблизительно 4,5, или от рН приблизительно 4,0 до рН приблизительно 4,4, или от рН приблизительно 4,1 от рН приблизительно рН 4,3.
11. Способ по любому из пп. 1-6, в котором градиент рН представляет собой линейный градиент.
12. Способ по любому из пп. 1-6, в котором градиент рН представляет собой ступенчатый градиент, и необязательно способ дополнительно включает применяемый для уравновешивания колонки с белком А этап с рН приблизительно 3,9, рН приблизительно 4,0, рН приблизительно 4,1, рН приблизительно 4,2, рН приблизительно 4,3, рН приблизительно 4,4 или рН приблизительно 4,5.
13. Способ по любому из пп. 1-6, в котором биспецифический антигенсвязывающий белок элюируют при рН между приблизительно 3,9 и приблизительно 4,4, приблизительно 4,0 и приблизительно 4,3, приблизительно 4,1 и приблизительно 4,2, или приблизительно рН 4,2.
14. Способ по любому из пп. 1-6, в котором биспецифический антигенсвязывающий белок элюируют при рН приблизительно 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4 или 4,5.
15. Способ по любому из пп. 1-6, в котором смесь представляет собой среду для культивирования.
16. Способ по любому из пп. 1-6, в котором биспецифический антигенсвязывающий белок, содержащий гетеродимерную область IgG СН3 элюируют в одной или нескольких фракциях, содержащих менее чем приблизительно 1%, 0,5% или 0,1% суммарного белка по массе антител, включающих гомодимерную область IgG СН3, которая включает области СН3 с одинаковой аффинностью к белку А.
17. Способ по любому из пп. 1-6, в котором вторая область IgG СН3 содержит модификацию, которая снижает или устраняет связывание второго домена СН3 с белком А.
18. Способ по п. 17, в котором каждый из первого и второго домена IgG СН3 представляет собой домен СН3 тяжелой цепи IgG человека, выбранный из группы, состоящей из домена СН3 тяжелой цепи IgG1 человека, домена СН3 тяжелой цепи IgG2 человека и домена СН3 тяжелой цепи IgG4 человека.
19. Способ по п. 18, в котором модификация выбрана из группы, состоящей из (a) 95R и (b) 95R и 96F в нумерации экзонов IMGT, или (а') 435R и (b') 435R и 436F в нумерации системы EU.
20. Способ по п. 19, в котором второй домен СН3 представляет собой:
домен СН3 IgG1 человека и дополнительно содержит от одной до пяти модификаций, выбранных из группы, состоящей из 16Е, 18М, 44S, 52N, 57М и 82I в нумерации экзонов IMGT, или 356Е, 358М, 384S, 392N, 397М и 422I в нумерации системы EU;
домен СН3 IgG2 человека и дополнительно содержит от одной до двух модификаций, выбранных из группы, состоящей из 44S, 52N и 82I в нумерации экзонов IMGT, или 384S, 392N и 422I в нумерации системы EU; или
домен СН3 IgG4 человека и дополнительно содержит от одной до семи модификаций, выбранных из группы, состоящей из 15R, 44S, 52N, 57М, 69К, 79Q и 82I в нумерации экзонов IMGT, или 355R, 384S, 392N, 397М, 409К, 419Q и 422I в нумерации системы EU.
21. Способ по п. 19 или 20, в котором второй домен СН3 представляет собой домен СН3 IgG4 человека и дополнительно содержит модификацию 105Р в нумерации экзонов IMGT, или 445Р в нумерации системы EU.
22. Способ по п. 19 или 20, в котором первый и второй IgG СН3 домены одинакового изотипа.
23. Способ по п. 17, в котором гетеродимерные области СН3 биспецифического антигенсвязывающего белка являются неиммуногенными или по существу неиммуногенными для человека.
24. Способ по п. 14, в котором биспецифический антигенсвязывающий белок содержит две легкие цепи, которые являются одинаковыми.
25. Способ по п. 14, в котором биспецифический антигенсвязывающий белок демонстрирует фармакокинетический профиль, который не существенно отличается от такого же биспецифического антигенсвязывающего белка, содержащего гомодимерную IgG СН3 область.
26. Способ по любому из пп. 1-6, в котором используют колонку с белком А в качестве аффинной подложки с белком А.
RU2015140911A 2009-06-26 2015-09-25 Легковыделяемые биспецифические антитела с природным иммуноглобулиновым форматом RU2647758C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22068709P 2009-06-26 2009-06-26
US61/220.687 2009-06-26

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2014114172/10A Division RU2569157C2 (ru) 2009-06-26 2014-04-10 Легковыделяемые биспецифические антитела с природным иммуноглобулиновым форматом

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2015140911A RU2015140911A (ru) 2017-03-30
RU2647758C2 true RU2647758C2 (ru) 2018-03-19

Family

ID=42738900

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2012102602/10A RU2522002C2 (ru) 2009-06-26 2010-06-25 Легковыделяемые биспецифические антитела с природным иммуноглобулиновым форматом
RU2014114172/10A RU2569157C2 (ru) 2009-06-26 2014-04-10 Легковыделяемые биспецифические антитела с природным иммуноглобулиновым форматом
RU2015140911A RU2647758C2 (ru) 2009-06-26 2015-09-25 Легковыделяемые биспецифические антитела с природным иммуноглобулиновым форматом

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2012102602/10A RU2522002C2 (ru) 2009-06-26 2010-06-25 Легковыделяемые биспецифические антитела с природным иммуноглобулиновым форматом
RU2014114172/10A RU2569157C2 (ru) 2009-06-26 2014-04-10 Легковыделяемые биспецифические антитела с природным иммуноглобулиновым форматом

Country Status (24)

Country Link
US (6) US8586713B2 (ru)
EP (3) EP2445936A1 (ru)
JP (5) JP5816170B2 (ru)
KR (5) KR101904065B1 (ru)
CN (2) CN102471378B (ru)
AU (2) AU2010265933B2 (ru)
CA (1) CA2766220C (ru)
CY (1) CY1124358T1 (ru)
DK (1) DK2975051T3 (ru)
ES (1) ES2865648T3 (ru)
HK (1) HK1219283A1 (ru)
HR (1) HRP20210637T1 (ru)
HU (1) HUE054257T2 (ru)
IL (2) IL217000A0 (ru)
LT (1) LT2975051T (ru)
MX (5) MX368932B (ru)
MY (3) MY192182A (ru)
PL (1) PL2975051T3 (ru)
PT (1) PT2975051T (ru)
RU (3) RU2522002C2 (ru)
SG (1) SG176868A1 (ru)
SI (1) SI2975051T1 (ru)
TW (1) TWI507525B (ru)
WO (1) WO2010151792A1 (ru)

Families Citing this family (518)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090137416A1 (en) 2001-01-16 2009-05-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Isolating Cells Expressing Secreted Proteins
CN105884893A (zh) 2002-07-18 2016-08-24 莫鲁斯有限公司 抗体混合物的重组生产
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
ES2408582T3 (es) 2003-05-30 2013-06-21 Merus B.V. Biblioteca de Fab para la preparación de una mezcla de anticuerpos
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
US9284375B2 (en) 2005-04-15 2016-03-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9963510B2 (en) 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
WO2006113665A2 (en) 2005-04-15 2006-10-26 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US11254748B2 (en) 2005-04-15 2022-02-22 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
DK2009101T3 (en) 2006-03-31 2018-01-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody modification method for purification of a bispecific antibody
CA2647846C (en) 2006-03-31 2016-06-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
RU2526512C2 (ru) 2007-09-26 2014-08-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Модифицированная константная область антитела
JP5334319B2 (ja) 2007-09-26 2013-11-06 中外製薬株式会社 Ｃｄｒのアミノ酸置換により抗体の等電点を改変する方法
KR20220162801A (ko) 2008-04-11 2022-12-08 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
EP2409991B1 (en) 2009-03-19 2017-05-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
US20120071634A1 (en) 2009-03-19 2012-03-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody Constant Region Variant
HUE054257T2 (hu) 2009-06-26 2021-08-30 Regeneron Pharma Könnyen izolálható, natív immunglobulin felépítésû bispecifikus antitestek
CN102686738A (zh) * 2009-09-01 2012-09-19 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 通过改进的a蛋白洗脱增强的蛋白质纯化
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
JP5837821B2 (ja) 2009-09-24 2015-12-24 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
EP2522724B1 (en) * 2009-12-25 2020-02-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide modification method for purifying polypeptide multimers
US20130045492A1 (en) * 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US20120021409A1 (en) 2010-02-08 2012-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
NZ631363A (en) 2010-02-08 2016-05-27 Regeneron Pharma Common light chain mouse
WO2011108714A1 (ja) 2010-03-04 2011-09-09 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
US9150663B2 (en) * 2010-04-20 2015-10-06 Genmab A/S Heterodimeric antibody Fc-containing proteins and methods for production thereof
JO3340B1 (ar) 2010-05-26 2019-03-13 Regeneron Pharma مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري
CA2806252C (en) 2010-07-29 2019-05-14 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
CN103154025B (zh) 2010-08-02 2015-07-01 宏观基因有限公司 共价双抗体及其用途
RU2612903C2 (ru) * 2010-08-02 2017-03-13 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Мыши, у которых вырабатываются связывающие белки, содержащие vl-домены
RS59589B1 (sr) 2010-11-05 2019-12-31 Zymeworks Inc Dizajniranje stabilnog heterodimernog antitela sa mutacijama u fc domenu
KR102099580B1 (ko) 2010-11-17 2020-04-10 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 혈액응고 제viii 인자의 기능을 대체하는 기능을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자
JO3756B1 (ar) 2010-11-23 2021-01-31 Regeneron Pharma اجسام مضادة بشرية لمستقبلات الجلوكاجون
TWI807362B (zh) 2010-11-30 2023-07-01 日商中外製藥股份有限公司 細胞傷害誘導治療劑
WO2012073992A1 (ja) 2010-11-30 2012-06-07 中外製薬株式会社 複数分子の抗原に繰り返し結合する抗原結合分子
BR112013021526B1 (pt) * 2011-02-25 2021-09-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polipeptídio variante, métodos para manter ou diminuir as atividades de ligação a fcgriia (tipo r) e fcgriia (tipo h) e aumentar a atividade de ligação a fcgriib de um polipeptídio e para a supressão da produção de um anticorpo contra um polipeptídio compreendendo a região fc do anticorpo, métodos para a produção do referido polipeptídio com atividades de ligação mantidas ou diminuídas e aumentada e para a produção suprimida de um anticorpo, composição farmacêutica e uso de um polipeptídio
WO2012132067A1 (ja) * 2011-03-30 2012-10-04 中外製薬株式会社 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法
TWI671315B (zh) 2011-03-28 2019-09-11 法商賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
BR112013029892A2 (pt) 2011-05-21 2016-12-20 Macrogenics Inc polipeptídeo, molécula de ligação a antígeno, diacorpo e uso de uma porção polipeptídica de uma proteína de ligação a soro desimunizada
JP5997151B2 (ja) 2011-06-30 2016-09-28 中外製薬株式会社 ヘテロ二量化ポリペプチド
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
DK2739740T3 (da) 2011-08-05 2019-12-09 Regeneron Pharma Universelle, humaniserede letkæde-mus
CA2791109C (en) 2011-09-26 2021-02-16 Merus B.V. Generation of binding molecules
EP2762493B1 (en) 2011-09-30 2021-06-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
RS56458B1 (sr) * 2011-10-17 2018-01-31 Regeneron Pharma Miševi sa ograničenim teškim lancem imunoglobulina
PT2771364T (pt) 2011-10-27 2019-09-10 Genmab As Produção de proteínas heterodiméricas
CN104011207B (zh) 2011-10-31 2018-09-18 中外制药株式会社 控制了重链与轻链的缔合的抗原结合分子
PT2773671T (pt) 2011-11-04 2021-12-14 Zymeworks Inc Geração de anticorpo heterodimérico estável com mutações no domínio fc
CA2855822C (en) 2011-11-14 2022-11-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for increasing muscle mass and muscle strength by specifically antagonizing gdf8 and/or activin a
EP3574897B1 (en) 2011-11-18 2022-01-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Extended release formulation comprising polymer protein microparticles for use in the vitreous of the eye for treating vascular eye disorders
JP6124800B2 (ja) 2011-11-30 2017-05-10 中外製薬株式会社 免疫複合体を形成する細胞内への運搬体（キャリア）を含む医薬
EP2794905B1 (en) 2011-12-20 2020-04-01 MedImmune, LLC Modified polypeptides for bispecific antibody scaffolds
CN108101983A (zh) 2012-03-02 2018-06-01 瑞泽恩制药公司 艰难梭状芽孢杆菌毒素的人源抗体
KR20140136462A (ko) 2012-03-06 2014-11-28 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 공통 경쇄 마우스
US9815909B2 (en) 2012-03-13 2017-11-14 Novimmune S.A. Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
KR102213535B1 (ko) 2012-03-16 2021-02-08 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 pH-민감성 면역글로불린 서열을 발현하는 비-사람 동물
US20140013456A1 (en) 2012-03-16 2014-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
MX2014011047A (es) 2012-03-16 2015-04-08 Regeneron Pharma Ratones que producen proteinas de union a un antigeno con caracteristicas de union dependientes del ph.
HUE037659T2 (hu) 2012-03-16 2018-09-28 Regeneron Pharma Hisztidinmódosított könnyûlánc antitestek és genetikailag módosított rágcsálók ennek az elõállítására
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
NZ772318A (en) 2012-04-20 2023-06-30 Merus Nv Methods and means for the production of ig-like molecules
BR112014026740B1 (pt) 2012-04-27 2022-10-04 Bioatla, Llc Anticorpo, composição, método para fornecer um anticorpo com adcc realçada, e, uso de um anticorpo
MX364449B (es) 2012-06-12 2019-04-26 Regeneron Pharma Animales no humanos humanizados con loci de cadena pesada de inmunoglobulina restringidos.
EP2862875B1 (en) 2012-06-14 2023-09-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTIGEN-BINDING MOLECULE CONTAINING MODIFIED Fc REGION
WO2014004586A1 (en) 2012-06-25 2014-01-03 Zymeworks Inc. Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells
EP3632462A1 (en) 2012-07-06 2020-04-08 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
WO2014006217A1 (en) 2012-07-06 2014-01-09 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
WO2014022540A1 (en) 2012-08-02 2014-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
JO3462B1 (ar) 2012-08-22 2020-07-05 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية تجاه gfr?3 وطرق لاستخدامها
DK2889377T3 (da) 2012-08-24 2020-03-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fc?RIIb-Specifik Fc-regionsvariant
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
JP2015529236A (ja) 2012-09-25 2015-10-05 グレンマーク ファーマシューティカルズ， エセ．アー． ヘテロ二量体免疫グロブリンの精製
SI2900694T1 (sl) * 2012-09-27 2018-12-31 Merus N.V. Bispecifična IGG protitelesa kot vključitelji T-celic
JP6273205B2 (ja) 2012-10-05 2018-01-31 協和発酵キリン株式会社 ヘテロダイマータンパク質組成物
EP2914634B1 (en) 2012-11-02 2017-12-06 Zymeworks Inc. Crystal structures of heterodimeric fc domains
CA2890575C (en) 2012-11-05 2021-11-09 Jumpei Enami Antibody and antibody composition production method
TW202206465A (zh) 2012-11-14 2022-02-16 美商再生元醫藥公司 重組細胞表面捕捉蛋白質
JP6347490B2 (ja) 2012-11-28 2018-06-27 ザイムワークス，インコーポレイテッド 遺伝子操作された免疫グロブリン重鎖−軽鎖対およびその使用
US9914785B2 (en) 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
US10766960B2 (en) 2012-12-27 2020-09-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Heterodimerized polypeptide
IL313424A (en) 2013-01-10 2024-08-01 Genmab Bv Variants of human IGG1 FC region and uses thereof
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
WO2014110601A1 (en) 2013-01-14 2014-07-17 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
EP2945969A1 (en) 2013-01-15 2015-11-25 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
TWI635098B (zh) * 2013-02-01 2018-09-11 再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
BR112015019350A2 (pt) 2013-02-20 2017-08-22 Regeneron Pharma Animal não humano, locus de imunoglobulina, e, métodos de fabricação de um animal não humano, para a obtenção de uma sequência de ácido nucleico e de fabricação de uma proteína de ligação ao antígeno
US9487587B2 (en) 2013-03-05 2016-11-08 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells of a companion animal that express an activating receptor and cells that express B7-H3 and uses thereof
SG11201506294TA (en) 2013-03-13 2015-09-29 Regeneron Pharma Common light chain mouse
SG11201506278RA (en) 2013-03-13 2015-09-29 Regeneron Pharma Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
BR112015021979A2 (pt) 2013-03-14 2017-08-29 Regeneron Pharma Anticorpos humanos para grem1
EP3839044A1 (en) 2013-03-14 2021-06-23 MacroGenics, Inc. Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells that express an activating receptor
US10472389B2 (en) * 2013-03-14 2019-11-12 Emd Millipore Corporation Methods of increasing protein purity using protein A based chromatography
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
CA3093606A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins for induction of t cells
KR102049990B1 (ko) 2013-03-28 2019-12-03 삼성전자주식회사 c-Met 항체 및 VEGF 결합 단편이 연결된 융합 단백질
EP3783017A1 (en) 2013-04-02 2021-02-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant
US11357866B2 (en) * 2013-04-03 2022-06-14 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Expression of HIV inhibitors by mesenchymal stem cells
KR102282134B1 (ko) 2013-04-29 2021-07-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 인간 fcrn-결합 변형된 항체 및 사용 방법
ES2871383T3 (es) * 2013-04-29 2021-10-28 Hoffmann La Roche Anticuerpos asimétricos modificados que se unen al receptor de Fc y procedimientos de uso
TWI655207B (zh) 2013-07-30 2019-04-01 再生元醫藥公司 抗活化素ａ之抗體及其用途
US11384149B2 (en) 2013-08-09 2022-07-12 Macrogenics, Inc. Bi-specific monovalent Fc diabodies that are capable of binding CD32B and CD79b and uses thereof
UA116479C2 (uk) 2013-08-09 2018-03-26 Макродженікс, Інк. БІСПЕЦИФІЧНЕ МОНОВАЛЕНТНЕ Fc-ДІАТІЛО, ЯКЕ ОДНОЧАСНО ЗВ'ЯЗУЄ CD32B I CD79b, ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ
EP2840091A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific diabodies that are capable of binding gpA33 and CD3 and uses thereof
EP2839842A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding CD123 and CD3 and uses thereof
WO2015033223A2 (en) * 2013-09-03 2015-03-12 Novimmune S.A. Readily isolated bispecific binding molecules with native format having mutated constant regions
CN104418947A (zh) * 2013-09-11 2015-03-18 香港大学 抗her2和抗-igf-ir的双特异性抗体及其用途
TR201909967T4 (tr) 2013-09-18 2019-07-22 Regeneron Pharma Histidin ile işlenmiş hafif zincirli antikorlar ve bunu üretmeye yönelik genetik olarak modifiye edilmiş insan olmayan hayvanlar.
MX2016003616A (es) 2013-09-27 2016-07-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo para producir heteromultimeros de polipeptidos.
CN105873953A (zh) 2013-11-04 2016-08-17 格兰马克药品股份有限公司 重靶向t细胞的异源二聚免疫球蛋白的产生
BR112016011401A2 (pt) 2013-11-20 2017-09-26 Regeneron Pharma moduladores de aplnr e utilizações dos mesmos
RU2737882C2 (ru) 2013-11-27 2020-12-04 Займворкс Инк. Биспецифические антигенсвязывающие конструкции против her2
EA038933B1 (ru) 2013-12-17 2021-11-11 Дженентек, Инк. Биспецифические анти-cd3 антитела и способы их применения
JP2017029001A (ja) * 2013-12-19 2017-02-09 国立研究開発法人産業技術総合研究所 プロテインｇの細胞膜外ドメインの新規な改変型タンパク質
EP3842455A1 (en) 2014-01-15 2021-06-30 F. Hoffmann-La Roche AG Fc-region variants with improved protein a-binding
CN105899534B (zh) 2014-01-15 2020-01-07 豪夫迈·罗氏有限公司 具有修饰的FCRN和保持的蛋白A结合性质的Fc区变体
TWI680138B (zh) 2014-01-23 2019-12-21 美商再生元醫藥公司 抗ｐｄ-ｌ１之人類抗體
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
WO2015127158A1 (en) * 2014-02-21 2015-08-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods, compositions and kits for cell specific modulation of target antigens
AU2015223566B2 (en) 2014-02-28 2020-10-08 Merus N.V. Antibodies that bind EGFR and ErbB3
AU2015223567B2 (en) 2014-02-28 2020-09-10 Merus N.V. Antibody that binds ErbB-2 and ErbB-3
TWI754319B (zh) * 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
SG11201607015VA (en) 2014-03-21 2016-09-29 Regeneron Pharma V<sb>L</sb> ANTIGEN BINDING PROTEINS EXHIBITING DISTINCT BINDING CHARACTERISTICS
KR20210088756A (ko) 2014-03-21 2021-07-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단일 도메인 결합 단백질을 생산하는 비-인간 동물
CN106471009B (zh) 2014-03-28 2020-01-03 Xencor公司 结合至cd38和cd3的双特异性抗体
MY194892A (en) 2014-04-07 2022-12-22 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Immunoactivating antigen-binding molecule
AU2015260230A1 (en) * 2014-05-13 2016-11-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha T cell-redirected antigen-binding molecule for cells having immunosuppression function
JO3701B1 (ar) 2014-05-23 2021-01-31 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية - بروتين كورونا فيروس الشوكي
EP4026850A1 (en) 2014-05-28 2022-07-13 Zymeworks Inc. Modified antigen binding polypeptide constructs and uses thereof
TW202132337A (zh) 2014-05-28 2021-09-01 美商艾吉納斯公司 抗糖皮質素誘導性ｔｎｆｒ家族相關性受體（ｇｉｔｒ）抗體類及使用彼等之方法
TWI747041B (zh) 2014-05-29 2021-11-21 美商宏觀基因股份有限公司 三特異性結合分子及其使用方法
AR101262A1 (es) * 2014-07-26 2016-12-07 Regeneron Pharma Plataforma de purificación para anticuerpos biespecíficos
WO2016019969A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Ludwig-Maximilians-Universität München Subcutaneously administered bispecific antibodies for use in the treatment of cancer
AU2015314744A1 (en) 2014-09-12 2017-03-02 Genentech, Inc. Anti-CLL-1 antibodies and immunoconjugates
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
US10717778B2 (en) 2014-09-29 2020-07-21 Duke University Bispecific molecules comprising an HIV-1 envelope targeting arm
MA40894A (fr) * 2014-11-04 2017-09-12 Glenmark Pharmaceuticals Sa Immunoglobulines hétéro-dimères reciblant des lymphocytes t cd3/cd38 et leurs procédés de production
US11773166B2 (en) 2014-11-04 2023-10-03 Ichnos Sciences SA CD3/CD38 T cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins and methods of their production
CA2960569A1 (en) * 2014-11-06 2016-05-12 F. Hoffmann-Laroche Ag Fc-region variants with modified fcrn- and protein a-binding properties
EP3611188B1 (en) * 2014-11-06 2022-05-04 F. Hoffmann-La Roche AG Fc-region variants with modified fcrn-binding and methods of use
US11566082B2 (en) 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
HUE050831T2 (hu) 2014-11-17 2021-01-28 Regeneron Pharma Daganatkezelési módszerek a CD3XCD20 bispecifikus antitest használatával
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
CN107406512A (zh) 2014-11-26 2017-11-28 Xencor公司 结合cd3和cd38的异二聚体抗体
US10889653B2 (en) 2014-11-26 2021-01-12 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
EP3546567A1 (en) 2014-12-06 2019-10-02 GEMoaB Monoclonals GmbH Genetic modified pluri- or multipotent stem cells and uses thereof
TWI701258B (zh) 2014-12-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 流行性感冒病毒血球凝集素之人類抗體
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
EP3789039A1 (en) 2014-12-22 2021-03-10 The Rockefeller University Anti-mertk agonistic antibodies and uses thereof
TWI710573B (zh) 2015-01-26 2020-11-21 美商再生元醫藥公司 抗伊波拉病毒醣蛋白之人類抗體
US10227411B2 (en) 2015-03-05 2019-03-12 Xencor, Inc. Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions
KR102618312B1 (ko) 2015-03-17 2023-12-28 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 항muc16 항체 및 그의 용도
EP3271403A1 (en) 2015-03-19 2018-01-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
TWI735433B (zh) 2015-03-27 2021-08-11 美商再生元醫藥公司 偵測生物污染物之組成物及方法
US10556952B2 (en) 2015-03-30 2020-02-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Heavy chain constant regions with reduced binding to Fc gamma receptors
EP3279216A4 (en) 2015-04-01 2019-06-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha PROCESS FOR PREPARING POLYPEPTIDE HETERO OLIGOMER
MX2017013267A (es) 2015-04-15 2018-08-15 Regeneron Pharma Metodos para aumentar la fuerza y funcionalidad con inhibidores del factor de diferenciacion y crecimiento 8 (gdf8).
US10520511B2 (en) 2015-05-12 2019-12-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multimeric protein purity determination
EP3736290A1 (en) 2015-05-29 2020-11-11 Agenus Inc. Anti-ctla-4 antibodies and methods of use thereof
KR20180012860A (ko) 2015-06-15 2018-02-06 누맙 이노베이션 아게 이종 이량체 다중 특이적 항체 포맷
WO2016205200A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Genentech, Inc. Anti-cll-1 antibodies and methods of use
US10113003B2 (en) 2015-06-23 2018-10-30 Innate Pharma Multispecific NK engager proteins
AU2016289480C1 (en) 2015-07-06 2021-10-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
ES2973885T3 (es) 2015-07-09 2024-06-24 Genmab As Anticuerpos biespecíficos y multiespecíficos y método para aislarlos
WO2017009258A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 Genmab A/S Axl-specific antibody-drug conjugates for cancer treatment
KR102709815B1 (ko) 2015-07-10 2024-09-24 메뤼스 엔.페. 인간 cd3 결합 항체
JOP20160154B1 (ar) 2015-07-31 2021-08-17 Regeneron Pharma أجسام ضادة مضاد لل psma، وجزيئات رابطة لمستضد ثنائي النوعية الذي يربط psma و cd3، واستخداماتها
TW202340452A (zh) 2015-08-04 2023-10-16 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
US10538595B2 (en) 2015-08-26 2020-01-21 Bison Therapeutics, Inc. Multispecific antibody platform and related methods
CN107949573B (zh) 2015-09-01 2022-05-03 艾吉纳斯公司 抗-pd-1抗体及其使用方法
KR20180069839A (ko) 2015-10-08 2018-06-25 자임워크스 인코포레이티드 카파 및 람다 경사슬을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드 구조체 및 이의 용도
TWI756187B (zh) 2015-10-09 2022-03-01 美商再生元醫藥公司 抗ｌａｇ３抗體及其用途
RS61800B1 (sr) 2015-10-23 2021-06-30 Merus Nv Vezujući molekuli koji inhibiraju rast kancera
WO2017079768A1 (en) 2015-11-08 2017-05-11 Genentech, Inc. Methods of screening for multispecific antibodies
JP6925278B2 (ja) 2015-11-18 2021-08-25 中外製薬株式会社 液性免疫応答の増強方法
EP3378487B1 (en) 2015-11-18 2022-03-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Combination therapy using t cell redirection antigen binding molecule against cell having immunosuppressing function
CN108699136B (zh) 2015-12-07 2022-03-18 Xencor股份有限公司 结合cd3和psma的异二聚抗体
HUE063377T2 (hu) 2015-12-22 2024-01-28 Regeneron Pharma Anti-PD-1 antitestek és bispecifikus anti-CD20/anti-CD3 antitestek kombinációja a rák kezelésére
SG11201803989WA (en) * 2015-12-28 2018-06-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for promoting efficiency of purification of fc region-containing polypeptide
GB201602156D0 (en) * 2016-02-05 2016-03-23 Jones Philip C And Boku University Of Natural Resources And Life Sciences Heterodimers and purification thereof
BR112018068363A2 (pt) 2016-03-14 2019-01-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd fármaco terapêutico indutor de dano celular para uso em terapia de câncer
EP3433281A1 (en) 2016-03-21 2019-01-30 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
AR108295A1 (es) 2016-04-20 2018-08-08 Regeneron Pharma Composiciones y métodos para preparar anticuerpos basados en el uso de un locus mejorador de expresión
AR109451A1 (es) * 2016-04-20 2018-12-12 Regeneron Pharma Composiciones y métodos para preparar anticuerpos basados en el uso de loci mejoradores de expresión
US11352446B2 (en) 2016-04-28 2022-06-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making multispecific antigen-binding molecules
US10889615B2 (en) 2016-05-11 2021-01-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
WO2017194593A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Method of cleaning and/or sanitizing a separation matrix
CN109071613A (zh) 2016-05-11 2018-12-21 通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司 分离基质
EP3455240A1 (en) 2016-05-11 2019-03-20 GE Healthcare BioProcess R&D AB Method of storing a separation matrix
JP7031934B2 (ja) 2016-05-11 2022-03-08 サイティバ・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 分離マトリックス
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
TWI786044B (zh) 2016-05-13 2022-12-11 美商再生元醫藥公司 藉由投予ｐｄ-１抑制劑治療皮膚癌之方法
AU2017268458B2 (en) 2016-05-20 2022-07-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide RNAS
MX2018014387A (es) 2016-05-27 2019-03-14 Agenus Inc Anticuerpos anti proteina inmunoglobulina de linfocitos t y dominio de mucina 3 (tim-3) y métodos para usarlos.
FI3468586T3 (fi) 2016-06-14 2024-10-29 Xencor Inc Bispesifisiä immuuniaktivaatiota vapauttavia vasta-aineita
MY196220A (en) 2016-06-14 2023-03-23 Regeneron Pharma Anti-C5 Antibodies and uses Thereof
EP3475304B1 (en) 2016-06-28 2022-03-23 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
MA45554A (fr) 2016-07-01 2019-05-08 Resolve Therapeutics Llc Fusions de binucléase optimisées.
WO2018007999A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Staten Biotechnology B.V. Anti-apoc3 antibodies and methods of use thereof
TW201815821A (zh) 2016-07-18 2018-05-01 美商再生元醫藥公司 抗茲卡病毒抗體及使用方法
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
US10772972B2 (en) 2016-09-23 2020-09-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-STEAP2 antibody drug conjugates, and compositions and uses thereof
WO2018067331A1 (en) 2016-09-23 2018-04-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bi specific anti-muc16-cd3 antibodies and nti-muc16 drug conjugates
TWI843168B (zh) 2016-10-11 2024-05-21 美商艾吉納斯公司 抗ｌａｇ－３抗體及其使用方法
PE20240950A1 (es) 2016-10-14 2024-05-06 Xencor Inc PROTEINAS DE FUSION FC HETERODIMERICAS IL 15/IL 15R(alfa)
CN110461868A (zh) 2016-11-01 2019-11-15 根马布私人有限公司 多肽变体及其用途
US11332521B2 (en) 2016-11-07 2022-05-17 Neuracle Science Co., Ltd. Anti-family with sequence similarity 19, member A5 antibodies and method of use thereof
JP2020503260A (ja) 2016-11-15 2020-01-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体による処置のための投与
CA3046205A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Agenus Inc. Anti-ctla-4 antibodies and methods of use thereof
WO2018115262A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Innate Pharma Heterodimeric antigen binding proteins
TWI781130B (zh) 2017-01-03 2022-10-21 美商再生元醫藥公司 抗金黃色葡萄球菌溶血素ａ毒素之人類抗體
SG11201907321TA (en) 2017-02-07 2019-09-27 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-gprc5d antibody and molecule comprising the antibody
SG11201906961UA (en) 2017-02-10 2019-08-27 Genmab Bv Polypeptide variants and uses thereof
CN110650974B (zh) 2017-02-10 2024-04-19 瑞泽恩制药公司 用于免疫-pet成像的放射性标记的抗-lag3抗体
US20200291089A1 (en) 2017-02-16 2020-09-17 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
JP7304288B2 (ja) 2017-02-17 2023-07-06 サノフイ ジストログリカンおよびラミニン２に対する特異性を有する多特異性結合性分子
WO2018151841A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Sanofi Multispecific binding molecules having specificity to dystroglycan and laminin-2
WO2018158719A1 (en) 2017-03-02 2018-09-07 Novartis Ag Engineered heterodimeric proteins
SG11201908678XA (en) 2017-03-27 2019-10-30 Celgene Corp Methods and compositions for reduction of immunogenicity
KR102706161B1 (ko) 2017-03-31 2024-09-19 젠맵 홀딩 비.브이. 이중특이적 항-cd37 항체, 모노클로날 항-cd37 항체 및 그의 사용 방법
IL310223A (en) 2017-03-31 2024-03-01 Merus Nv Bispecific antibodies that bind ERBB-2 and ERBB3 for use in the treatment of cells with a fusion gene NRG1
US11603407B2 (en) 2017-04-06 2023-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stable antibody formulation
CN110770255A (zh) 2017-04-11 2020-02-07 印希彼有限公司 具有受限cd3结合的多特异性多肽构建体及其使用方法
CA3059366A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Agenus Inc. Anti-cd137 antibodies and methods of use thereof
CN110506056A (zh) 2017-04-21 2019-11-26 斯塔滕生物技术有限公司 抗apoc3抗体和其使用方法
PT3618863T (pt) 2017-05-01 2023-08-23 Agenus Inc Anticorpos anti-tigit e seus métodos de utilização
US20210246227A1 (en) 2017-05-31 2021-08-12 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
MX2019014576A (es) * 2017-06-05 2020-07-29 Janssen Biotech Inc Anticuerpos multiespecíficos manipulados genéticamente y otras proteínas multiméricas con mutaciones asimétricas en la región ch2-ch3.
JP7549961B2 (ja) 2017-06-05 2024-09-12 ヌマブ セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト 少なくともｃｄ３及びｈｓａを標的とするヘテロ二量体多重特異性抗体フォーマット
MA49259A (fr) 2017-06-07 2020-04-15 Genmab Bv Anticorps thérapeutiques à base d'hexamères d'igg mutées
AU2018281280A1 (en) 2017-06-07 2020-01-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for internalizing enzymes
GB201709970D0 (en) 2017-06-22 2017-08-09 Kymab Ltd Bispecific antigen-binding molecules
SG11201911610TA (en) 2017-06-27 2020-01-30 Regeneron Pharma Tropism-modified recombinant viral vectors and uses thereof for the targeted introduction of genetic material into human cells
US11696572B2 (en) 2017-06-27 2023-07-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ASGR1 locus
CN110914295B (zh) 2017-06-28 2024-08-09 里珍纳龙药品有限公司 抗人乳头瘤病毒(hpv)抗原结合蛋白及其使用方法
US11613588B2 (en) 2017-06-28 2023-03-28 The Rockefeller University Anti-mertk agonistic antibodies and uses thereof
CA3067603A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Xencor, Inc. Targeted heterodimeric fc fusion proteins containing il-15/il-15ra and antigen binding domains
AU2018298039B2 (en) 2017-07-06 2023-02-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cell culture process for making a glycoprotein
WO2019009346A1 (ja) * 2017-07-06 2019-01-10 日東紡績株式会社 抗ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体、およびその抗体を利用したヒトＩｇＧ４測定試薬
TW202348250A (zh) 2017-07-24 2023-12-16 美商再生元醫藥公司 穩定化之抗體組合物及其製法
TWI799432B (zh) 2017-07-27 2023-04-21 美商再生元醫藥公司 抗ctla-4抗體及其用途
KR20200041897A (ko) 2017-08-01 2020-04-22 에이비 스튜디오 인코포레이티드 이중특이 항체 및 그의 용도
US11541103B2 (en) 2017-08-03 2023-01-03 Amgen Inc. Interleukin-21 mutein/ anti-PD-1 antibody conjugates
EP3665198A1 (en) 2017-08-09 2020-06-17 Merus N.V. Antibodies that bind egfr and cmet
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
US10947295B2 (en) 2017-08-22 2021-03-16 Sanabio, Llc Heterodimers of soluble interferon receptors and uses thereof
MX2020002502A (es) 2017-09-08 2020-07-20 Amgen Inc Inhibidores de kras g12c y metodos para utilizarlos.
WO2019055841A1 (en) * 2017-09-14 2019-03-21 Denali Therapeutics Inc. ANTI-TREM2 ANTIBODIES AND METHODS OF USE
JP2021500865A (ja) 2017-09-29 2021-01-14 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｓｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）標的抗原および補体成分に結合する二重特異性抗原結合分子ならびにその使用
NZ761329A (en) 2017-09-29 2023-04-28 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a humanized ttr locus and methods of use
KR20200059281A (ko) 2017-10-04 2020-05-28 암젠 인크 트랜스타이레틴 면역글로불린 융합
CN111246885B (zh) 2017-10-20 2024-06-11 豪夫迈·罗氏有限公司 从单特异性抗体生成多特异性抗体的方法
WO2019086362A1 (en) 2017-10-30 2019-05-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for in vivo generation of multispecific antibodies from monospecific antibodies
MA50516A (fr) 2017-10-31 2020-09-09 Staten Biotechnology B V Anticorps anti-apoc3 et leurs procédés d'utilisation
CN111344306A (zh) * 2017-11-02 2020-06-26 拜耳股份公司 结合alk-1和bmpr-2的双特异性抗体
CN111741757B (zh) * 2017-11-03 2023-12-19 莱蒂恩技术公司 用于用抗ror1免疫治疗来治疗癌症的组合物和方法
JP2021502100A (ja) 2017-11-08 2021-01-28 ゼンコア インコーポレイテッド 新規抗ｐｄ−１配列を用いた二重特異性および単一特異性抗体
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
CA3079363A1 (en) 2017-11-21 2019-05-31 Innate Pharma Multispecific antigen binding proteins
CN116064611A (zh) 2017-11-30 2023-05-05 瑞泽恩制药公司 包含人源化trkb基因座的非人动物
US11365265B2 (en) 2017-12-13 2022-06-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-C5 antibody combinations and uses thereof
US11319355B2 (en) 2017-12-19 2022-05-03 Xencor, Inc. Engineered IL-2 Fc fusion proteins
JP7321159B2 (ja) 2017-12-22 2023-08-04 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 薬剤生成物不純物を特性決定するためのシステム及び方法
EP3728328B1 (en) 2017-12-22 2024-10-23 Argenx BVBA Bispecific antigen binding construct
UY38049A (es) 2018-01-12 2019-07-31 Amgen Inc Anti-pd-1 anticuerpos y métodos de tratamiento
WO2019145455A1 (en) 2018-01-24 2019-08-01 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
MA51681A (fr) 2018-01-26 2021-05-05 Regeneron Pharma Anticorps humains contre l'hémagglutinine de la grippe
CA3085177A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 Regeneron Pharamaceuticals, Inc. System and method for characterizing size and charge variant drug product impurities
TWI825066B (zh) 2018-02-01 2023-12-11 美商再生元醫藥公司 治療性單株抗體之品質屬性的定量及模型化
TWI786265B (zh) 2018-02-02 2022-12-11 美商再生元醫藥公司 用於表徵蛋白質二聚合之系統及方法
KR20200118065A (ko) 2018-02-08 2020-10-14 제넨테크, 인크. 이중특이적 항원-결합 분자 및 이의 사용 방법
GB201802487D0 (en) 2018-02-15 2018-04-04 Argenx Bvba Cytokine combination therapy
MX2020008988A (es) 2018-02-28 2020-09-28 Regeneron Pharma Sistemas y metodos para la identificacion de contaminantes virales.
JP7579706B2 (ja) 2018-03-01 2024-11-08 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 体組成を変更するための方法
US20210009711A1 (en) 2018-03-14 2021-01-14 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
WO2019178362A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
JP7315565B2 (ja) 2018-03-19 2023-07-26 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド マイクロチップキャピラリー電気泳動アッセイおよび試薬
BR112020019026A2 (pt) 2018-03-24 2020-12-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Animal não humano geneticamente modificado, métodos para produzir o animal não humano geneticamente modificado, para geração de uma proteína de ligação a antígeno, para obtenção de um ácido nucleico, e, para obtenção de uma célula que expressa um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana e/ou um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina humana, método in vitro de produção de um domínio variável de imunoglobulina humana, ácido nucleico, célula hospedeira, célula isolada, e, domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana
US10982006B2 (en) 2018-04-04 2021-04-20 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
JP2021520812A (ja) 2018-04-11 2021-08-26 インヒブルクス インコーポレイテッド 制約されたｃｄ３結合を有する多重特異性ポリペプチド構築物ならびに関連する方法および使用
WO2019204655A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains
KR20210010862A (ko) 2018-04-18 2021-01-28 젠코어 인코포레이티드 IL-15/IL-15Rα Fc-융합 단백질 및 PD-1 항원 결합 도메인을 함유하는 PD-1 표적화 이종이량체 융합 단백질 및 이의 용도
CA3097711A1 (en) 2018-04-30 2019-11-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibodies, and bispecific antigen-binding molecules that bind her2 and/or aplp2, conjugates, and uses thereof
AU2019264217A1 (en) 2018-05-03 2020-12-17 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
TW202016125A (zh) 2018-05-10 2020-05-01 美商再生元醫藥公司 用於定量及調節蛋白質黏度之系統與方法
WO2019215702A1 (en) 2018-05-10 2019-11-14 Neuracle Science Co., Ltd. Anti-family with sequence similarity 19, member a5 antibodies and method of use thereof
BR112020023145A2 (pt) 2018-05-17 2021-02-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. anticorpo anti-cd63 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, molécula de ligação ao antígeno biespecífica, proteína terapêutica de múltiplos domínios, polinucleotídeo composição farmacêutica, e, composto
EP3802605A1 (en) 2018-06-01 2021-04-14 Compugen Ltd. Anti-pvrig/anti-tigit bispecific antibodies and methods of use
TWI848953B (zh) 2018-06-09 2024-07-21 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 針對癌症治療之多特異性結合蛋白
CN112437682B (zh) 2018-06-19 2024-11-05 里珍纳龙药品有限公司 抗因子XII/XIIa抗体和其用途
TW202005985A (zh) 2018-06-21 2020-02-01 美商再生元醫藥公司 用雙特異性抗ＣＤ３ｘＭＵＣ１６抗體及抗ＰＤ－１抗體治療癌症的方法
EP3810194A1 (en) 2018-06-22 2021-04-28 Genmab Holding B.V. Anti-cd37 antibodies and anti-cd20 antibodies, compositions and methods of use thereof
CN112513074A (zh) 2018-06-22 2021-03-16 健玛保 生产两种或更多种不同抗体的受控混合物的方法
WO2020004490A1 (ja) 2018-06-26 2020-01-02 協和キリン株式会社 コンドロイチン硫酸プロテオグリカン－５に結合する抗体
EP3816290A4 (en) 2018-06-26 2022-03-30 Kyowa Kirin Co., Ltd. ANTIBODIES BINDING TO CELL ADHESIVE MOLECULE 3
EP3841124A4 (en) 2018-06-29 2022-03-23 ApitBio, Inc. ANTI-L1CAM ANTIBODIES AND THEIR USES
CA3105448A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
TW202428612A (zh) * 2018-07-10 2024-07-16 美商雷傑納榮製藥公司 修飾結合分子以最小化已存在的交互作用
TW202012926A (zh) 2018-07-13 2020-04-01 美商再生元醫藥公司 醣基化肽之偵測及定量
WO2020012038A1 (en) 2018-07-13 2020-01-16 Genmab A/S Trogocytosis-mediated therapy using cd38 antibodies
MA53122A (fr) 2018-07-13 2021-05-19 Genmab As Variants d'anticorps cd38 et leurs utilisations
TWI838389B (zh) 2018-07-19 2024-04-11 美商再生元醫藥公司 雙特異性抗-BCMAｘ抗-CD3抗體及其用途
CA3105891A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs containing a constrained cd3 binding domain and a receptor binding region and methods of using the same
CN112639471B (zh) 2018-08-13 2024-04-09 瑞泽恩制药公司 在模拟体内条件下的治疗性蛋白质选择
KR20210045413A (ko) 2018-08-17 2021-04-26 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 다량체 단백질의 양 및 순도를 측정하기 위한 방법 및 크로마토그래피 시스템
US11047863B2 (en) 2018-08-17 2021-06-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for de novo protein sequencing
AU2019325565A1 (en) 2018-08-23 2021-03-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-Fc epsilon-R1 alpha (FceR1a) antibodies, bispecific antigen-binding molecules that bind FceR1a and CD3, and uses thereof
MX2021002279A (es) 2018-08-27 2021-05-27 Regeneron Pharma Uso de espectroscopia raman en la purificacion corriente abajo.
CA3100038A1 (en) 2018-08-30 2020-03-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for characterizing protein complexes
MX2021002190A (es) 2018-08-31 2021-05-14 Regeneron Pharma Estrategia de dosificacion que mitiga el sindrome de liberacion de citoquinas para los anticuerpos biespecificos cd3/cd20.
GB2576914A (en) 2018-09-06 2020-03-11 Kymab Ltd Antigen-binding molecules comprising unpaired variable domains produced in mammals
AU2019352017A1 (en) 2018-10-03 2021-05-06 Staten Biotechnology B.V. Antibodies specific for human and cynomolgus ApoC3 and methods of use thereof
AU2019355971A1 (en) 2018-10-03 2021-05-06 Xencor, Inc. IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
US20240252635A1 (en) 2018-10-04 2024-08-01 Genmab Holding B.V. Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-cd37 antibodies
EP3864049A1 (en) 2018-10-11 2021-08-18 Inhibrx, Inc. Pd-1 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
TW202028246A (zh) 2018-10-11 2020-08-01 美商英伊布里克斯公司 B7h3單域抗體及其治療性組合物
US20210380679A1 (en) 2018-10-11 2021-12-09 Inhibrx, Inc. Dll3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
WO2020076992A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. 5t4 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
CN112805303B (zh) 2018-10-23 2024-08-20 瑞泽恩制药公司 抗npr1抗体及其用途
EP3870976B1 (en) 2018-10-25 2023-11-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for analysis of viral capsid protein composition
WO2020087065A1 (en) * 2018-10-26 2020-04-30 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to cd38
SG11202103628PA (en) 2018-10-31 2021-05-28 Regeneron Pharma Method and system of identifying and quantifying a protein
EP3877409A1 (en) 2018-11-06 2021-09-15 Genmab A/S Antibody formulation
EP3883961A1 (en) 2018-11-20 2021-09-29 Takeda Vaccines, Inc. Novel anti-zika virus antibodies and uses thereof
SG11202102060PA (en) 2018-11-21 2021-03-30 Regeneron Pharma Anti-staphylococcus antibodies and uses thereof
US11249089B2 (en) 2018-12-12 2022-02-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. System and method of analysis of a protein using liquid chromatography-mass spectrometry
US11782023B2 (en) 2018-12-19 2023-10-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ce-western applications for antibody development
GB201820687D0 (en) 2018-12-19 2019-01-30 Kymab Ltd Antagonists
US20220064327A1 (en) 2018-12-21 2022-03-03 Kymab Limited Fixaxfx bispecific antibody with common light chain
EP3904375A4 (en) * 2018-12-24 2022-09-28 Seoul National University R & DB Foundation INTERFERON NEUTRALIZING FC TYPE 1 FUSION PROTEIN AND ITS USE
AU2019416895A1 (en) 2018-12-24 2021-08-12 Sanofi Pseudofab-based multispecific binding proteins
EP4220173A3 (en) 2019-01-16 2023-10-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for characterizing disulfide bonds
MX2021009267A (es) 2019-01-31 2021-09-10 Regeneron Pharma Analisis ce-ms de microfluidos naturales de la heterogeneidad de la carga de anticuerpos.
JP2022522662A (ja) 2019-02-21 2022-04-20 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド Ｔ細胞に結合する多機能性分子および自己免疫障害を処置するためのその使用
GB2598218B (en) 2019-02-21 2024-05-08 Marengo Therapeutics Inc Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
CA3130508A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Marengo Therapeutics, Inc. Antibody molecules that bind to nkp30 and uses thereof
EP3927744A1 (en) 2019-02-21 2021-12-29 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
CA3131016A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Andreas Loew Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
DK3930847T5 (da) 2019-02-26 2024-08-05 Inspirna Inc Anti-mertk-antistoffer med høj affinitet og anvendelser deraf
BR112021016955A2 (pt) 2019-03-01 2021-11-23 Xencor Inc Composição, composição de ácido nucleico, composição de vetor de expressão, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos de produção de um domínio de ligação de membro de família 3 de pirofosfatase/fosfodiesterase de ectonucleotídeo e de tratamento de um câncer, anticorpo anti-enpp3, e, anticorpo heterodimérico
AU2020256225A1 (en) 2019-04-03 2021-09-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for insertion of antibody coding sequences into a safe harbor locus
CN117178959A (zh) 2019-04-04 2023-12-08 瑞泽恩制药公司 包括人源化凝血因子12基因座的非人动物
MX2021012335A (es) 2019-04-10 2021-11-12 Regeneron Pharma Anticuerpos humanos que se unen a ret y metodos de uso de los mismos.
MA55881A (fr) 2019-05-09 2022-03-16 Genmab Bv Schémas posologiques pour une combinaison d'anticorps anti-dr5 destinés à être utilisés dans le traitement du cancer
CN113841051A (zh) 2019-05-21 2021-12-24 瑞泽恩制药公司 识别和定量宿主细胞蛋白的方法
JP2022534867A (ja) 2019-06-04 2022-08-04 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ベータスリップ変異を有するヒト化ｔｔｒ遺伝子座を含む非ヒト動物と使用方法
CN113874511A (zh) 2019-06-05 2021-12-31 瑞泽恩制药公司 具有从κ基因座表达的有限λ轻链谱系的非人类动物和其用途
MX2021015156A (es) 2019-06-11 2022-01-18 Regeneron Pharma Anticuerpos anti-pcrv que se unen a pcrv, composiciones que comprenden anticuerpos anti-pcrv, y metodos de uso de estos.
JP2022536470A (ja) 2019-06-13 2022-08-17 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 多段階クロマトグラフィープロセス中の望ましくない成分を除去する方法
CA3139827A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of bispecific antigen-binding molecules that bind psma and cd3 in combination with 4-1bb co-stimulation
JP2022537269A (ja) 2019-06-21 2022-08-25 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｍｕｃ１６およびｃｄ３に結合する二重特異性抗原結合分子の４－１ｂｂ共刺激と組み合わせての使用
EP3997112A1 (en) 2019-07-08 2022-05-18 Amgen, Inc Multispecific transthyretin immunoglobulin fusions
GB201910900D0 (en) * 2019-07-31 2019-09-11 Scancell Ltd Modified fc-regions to enhance functional affinity of antibodies and antigen binding fragments thereof
EP4010371A1 (en) 2019-08-08 2022-06-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Novel antigen binding molecule formats
TW202120553A (zh) 2019-08-15 2021-06-01 美商再生元醫藥公司 用於細胞靶向之多特異性抗原結合分子及其用途
PE20220299A1 (es) 2019-08-15 2022-03-07 Janssen Biotech Inc Materiales y metodos para fragmentos variables de cadena unica mejorados
CN114585644A (zh) 2019-08-30 2022-06-03 艾吉纳斯公司 抗cd96抗体及其使用方法
US11773156B2 (en) 2019-10-28 2023-10-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-hemagglutinin antibodies and methods of use thereof
WO2021091953A1 (en) 2019-11-05 2021-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. N-terminal scfv multispecific binding molecules
EP4055046A1 (en) 2019-11-06 2022-09-14 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
EP4065086A1 (en) 2019-11-25 2022-10-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sustained release formulations using non-aqueous emulsions
WO2021108363A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele
IL293330A (en) 2019-12-02 2022-07-01 Regeneron Pharma mhc ii peptide protein structures and uses thereof
IL288360B2 (en) 2019-12-06 2023-09-01 Regeneron Pharma Anti-vegf protein preparations and methods for their production
MX2022006714A (es) 2019-12-06 2022-08-08 Regeneron Pharma Métodos de tratamiento del mieloma múltiple con anticuerpos anti-bcma x anti-cd3 bisespecíficos.
CN115087670A (zh) 2019-12-11 2022-09-20 西拉格国际有限责任公司 包含ltbr和edb结合结构域的多特异性结合分子及其用途
TW202136316A (zh) 2019-12-20 2021-10-01 美商再生元醫藥公司 新穎之il2促效劑及其使用方法(一)
WO2021130717A1 (ko) 2019-12-26 2021-07-01 에이비엘바이오 주식회사 단백질 a 친화성 크로마토그래피를 이용한 생리활성 펩티드의 정제 방법
EP4084821A4 (en) 2020-01-03 2024-04-24 Marengo Therapeutics, Inc. CD33-BINDING MULTIFUNCTIONAL MOLECULES AND THEIR USES
KR20220123116A (ko) 2020-01-08 2022-09-05 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 질량 스펙트럼 분석에서 신호를 향상하기 위한 아미노산의 용도
CA3165660A1 (en) 2020-01-16 2021-07-22 Genmab A/S Formulations of cd38 antibodies and uses thereof
CN115398236B (zh) 2020-01-21 2024-06-11 瑞泽恩制药公司 用于糖基化的蛋白质的电泳的去糖基化方法
KR20220132597A (ko) 2020-01-27 2022-09-30 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 단백질의 번역 후 변형에 대한 탠덤 질량 태그 다중화 정량화
EP4096396A1 (en) 2020-01-28 2022-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized pnpla3 locus and methods of use
WO2021155071A1 (en) 2020-01-29 2021-08-05 Inhibrx, Inc. Cd28 single domain antibodies and multivalent and multispecific constructs thereof
CA3166301A1 (en) 2020-01-30 2021-08-05 Shunhai WANG Platform for native liquid chromatography-mass spectrometry
EP4097483A1 (en) 2020-01-31 2022-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High confidence compound identification by liquid chromatography-mass spectrometry
US20230081547A1 (en) 2020-02-07 2023-03-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized klkb1 locus and methods of use
IL295419A (en) 2020-02-11 2022-10-01 Regeneron Pharma Anti-acvr1 antibodies and their uses
WO2021190980A1 (en) 2020-03-22 2021-09-30 Quadrucept Bio Limited Multimers for viral strain evolution
US20230102342A1 (en) 2020-03-23 2023-03-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use
CN115605506A (zh) 2020-03-25 2023-01-13 伊莱利利公司（Us） 多特异性结合蛋白及其开发方法
IL296514A (en) 2020-03-30 2022-11-01 Univ Mie Bispecific antibody
EP4136442A1 (en) 2020-04-14 2023-02-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ultraviolet monitoring of chromatography performance by orthogonal partial least squares
AU2021261420A1 (en) 2020-04-24 2022-12-01 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to T cell related cancer cells and uses thereof
CA3182893A1 (en) 2020-05-08 2021-11-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf traps and mini-traps and methods for treating ocular disorders and cancer
WO2021228904A1 (en) 2020-05-11 2021-11-18 Academisch Medisch Centrum Neutralizing antibodies binding to the spike protein of sars-cov-2 suitable for use in the treatment of covid-19, compositions comprising the same and uses thereof
CN115667290A (zh) 2020-05-12 2023-01-31 再生元制药公司 新型il10激动剂及其使用方法
EP4149976A1 (en) 2020-05-12 2023-03-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-glp1r antagonist antibodies and methods of use thereof
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
US20230232796A1 (en) 2020-06-26 2023-07-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ace2 locus
JP2023534726A (ja) 2020-07-23 2023-08-10 ジェンマブ ビー．ブイ． 多発性骨髄腫の治療に使用するための抗ｄｒ５抗体と免疫調節イミド薬との併用
US11725052B2 (en) 2020-08-18 2023-08-15 Cephalon Llc Anti-PAR-2 antibodies and methods of use thereof
MX2023001962A (es) 2020-08-19 2023-04-26 Xencor Inc Composiciones anti-cd28.
EP4200017A1 (en) 2020-08-20 2023-06-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for preventing and treating cardiac dysfunction and covid-19 with activin a antagonists
GB2616128A (en) 2020-08-26 2023-08-30 Marengo Therapeutics Inc Antibody molecules that bind to NKp30 and uses thereof
CA3190755A1 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Andreas Loew Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
KR20230074487A (ko) 2020-08-26 2023-05-30 마렝고 테라퓨틱스, 인크. Trbc1 또는 trbc2를 검출하는 방법
JP2023542820A (ja) 2020-08-31 2023-10-12 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 細胞培養成績を改善し、アスパラギン配列バリアントを軽減するためのアスパラギン供給戦略
AU2021342159A1 (en) 2020-09-11 2023-03-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification and production of antigen-specific antibodies
IL301037A (en) 2020-09-18 2023-05-01 Regeneron Pharma Antigen binding molecules that bind CD38 and/or CD28 and uses thereof
BR112023005742A2 (pt) 2020-10-02 2023-05-02 Genmab As Anticorpo, composição, composição farmacêutica, método para tratar uma doença, ácido nucléico, vetor de expressão, célula, método para produzir um anticorpo, kit de partes, e, anticorpo anti-idiotípico
MX2023004436A (es) 2020-10-15 2023-05-08 UCB Biopharma SRL Moleculas de union que multimerizan cd45.
EP4232481A1 (en) 2020-10-22 2023-08-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-fgfr2 antibodies and methods of use thereof
KR20230107305A (ko) 2020-11-10 2023-07-14 상하이 치루 파마슈티컬 리서치 앤 디벨롭먼트 센터 리미티드 클라우딘 18a2 및 cd3에 대한 이중특이성 항체 및 이중특이성 항체의 용도
CA3191141A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Hunter Chen Sustained release formulations using non-aqueous membrane emulsification
CN114539416B (zh) * 2020-11-26 2024-11-08 盛禾(中国)生物制药有限公司 一种双特异性抗体的层析纯化工艺
US20220257707A1 (en) 2020-12-17 2022-08-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fabrication of protein-encapsulating microgels
WO2022133239A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin proteins that bind to npr1 agonists
AU2021400324A1 (en) 2020-12-20 2023-07-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for identification of scrambled disulfides in biomolecules
CA3204625A1 (en) * 2021-01-11 2022-07-14 Caitlin STEIN Variant ch3 domains engineered for preferential ch3 heterodimerization, multi-specific antibodies comprising the same, and methods of making thereof
TW202233827A (zh) 2021-01-20 2022-09-01 美商再生元醫藥公司 改良細胞培養中蛋白質效價的方法
WO2022165171A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating cytokine release syndrome
TW202246314A (zh) 2021-01-28 2022-12-01 美商特蘭治療公司 抗棘狀醣蛋白抗體及其治療用途
KR102661163B1 (ko) 2021-02-04 2024-04-26 주식회사 지뉴브 항 pd-1 항체 및 그의 용도
WO2022184659A1 (en) 2021-03-01 2022-09-09 Quadrucept Bio Limited Antibody domains & multimers
BR112023017442A2 (pt) 2021-03-03 2023-09-26 Regeneron Pharma Métodos para identificar regiões em uma proteína e para modificar a viscosidade de uma droga proteica, e, droga proteica
MX2023010499A (es) 2021-03-09 2023-09-18 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen a cd3 y cldn6.
KR20230154311A (ko) 2021-03-10 2023-11-07 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 gpc3에 결합하는 이종이량체 항체
CA3207652A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Stephanie Cornen Cytokine anchors for nkp46-binding nk cell engager proteins
AU2022248779A1 (en) 2021-03-29 2023-09-28 Daiichi Sankyo Company, Limited Stable multispecific molecule and use thereof
AR125255A1 (es) 2021-04-02 2023-06-28 Regeneron Pharma Métodos de predicción y modulación de la glicación de una proteína
WO2022212876A1 (en) 2021-04-02 2022-10-06 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
CN117597359A (zh) 2021-04-08 2024-02-23 马伦戈治疗公司 与tcr结合的多功能分子及其用途
TW202309081A (zh) 2021-04-27 2023-03-01 美商安進公司 藉由使用溫度調節不對稱多特異性抗體之產物品質
WO2022235628A1 (en) * 2021-05-04 2022-11-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific fgf21 receptor agonists and their uses
CN117597365A (zh) 2021-05-04 2024-02-23 再生元制药公司 多特异性fgf21受体激动剂及其应用
CA3218786A1 (en) 2021-05-25 2022-12-01 Lifei HOU C-x-c motif chemokine receptor 6 (cxcr6) binding molecules, and methods of using the same
BR112023024984A2 (pt) 2021-06-01 2024-02-20 Regeneron Pharma Tampão de amostra de eletroforese aquosa, método para identificar contaminantes ou impurezas em uma amostra de droga proteica, e, kit
WO2022258691A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkg2d, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
CN117529504A (zh) 2021-06-09 2024-02-06 先天制药公司 结合至cd20、nkp46、cd16并缀合至il-2的多特异性抗体
AU2022288123A1 (en) 2021-06-09 2023-11-30 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp46, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
WO2022258678A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp30, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
IL309349A (en) 2021-06-14 2024-02-01 argenx BV Antibodies against interleukin 9 and methods of using them
TW202321282A (zh) 2021-07-19 2023-06-01 美商再生元醫藥公司 Il12受體促效劑及其使用方法
TW202322850A (zh) * 2021-08-05 2023-06-16 美商美國禮來大藥廠 抗體最佳化
TW202322846A (zh) 2021-08-16 2023-06-16 美商再生元醫藥公司 新穎的il27受體促效劑及其使用方法
WO2023028612A2 (en) 2021-08-27 2023-03-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-tslpr (crlf2) antibodies
AU2022338208A1 (en) 2021-09-06 2024-03-21 Genmab A/S Antibodies capable of binding to cd27, variants thereof and uses thereof
AR127006A1 (es) 2021-09-08 2023-12-06 Regeneron Pharma UN MÉTODO BASADO EN ESPECTROMETRÍA DE MASAS Y DE ALTO RENDIMIENTO PARA CUANTIFICAR ANTICUERPOS Y OTRAS PROTEÍNAS QUE CONTIENEN Fc
JP2024539928A (ja) 2021-11-04 2024-10-31 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 改変ｃａｃｎｇ１遺伝子座を含む非ヒト動物
US20230279153A1 (en) 2021-11-11 2023-09-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cd20-pd1 binding molecules and methods of use thereof
AU2022398486A1 (en) 2021-11-24 2024-05-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cancer with bispecific anti-cd3 x muc16 antibodies and anti-ctla-4 antibodies
CN118401668A (zh) 2021-11-30 2024-07-26 第一三共株式会社 蛋白酶裂解性掩蔽抗体
AU2022408149A1 (en) 2021-12-06 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antagonist anti-npr1 antibodies and methods of use thereof
AU2022408167A1 (en) 2021-12-08 2024-06-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutant myocilin disease model and uses thereof
EP4451863A1 (en) 2021-12-20 2024-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising humanized ace2 and tmprss loci
WO2023133280A1 (en) 2022-01-07 2023-07-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating recurrent ovarian cancer with bispecific anti-muc16 x anti-cd3 antibodies alone or in combination with anti-pd-1 antibodies
TW202337900A (zh) 2022-01-12 2023-10-01 美商再生元醫藥公司 改良使用親和層析的異二聚蛋白質自雜質之解析的方法
WO2023150798A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for defining optimal treatment timeframes in lysosomal disease
IL314707A (en) 2022-02-09 2024-10-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Environmentally reactive masked antibody and its use
US20230257432A1 (en) 2022-02-11 2023-08-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for screening 4r tau targeting agents
MX2024010339A (es) 2022-02-23 2024-09-30 Xencor Inc Anticuerpos anti-cd28 x anti-psma.
US20240059786A1 (en) 2022-02-24 2024-02-22 Xencor, Inc. Anti-cd28 x anti-trop2 antibodies
US20230340128A1 (en) 2022-02-24 2023-10-26 Xencor, Inc. Anti-cd28 x anti-msln antibodies
TW202400228A (zh) 2022-02-25 2024-01-01 美商再生元醫藥公司 減輕細胞激素釋放症候群的給藥方案
WO2023176881A1 (ja) 2022-03-16 2023-09-21 第一三共株式会社 多重特異的分子と免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせ
WO2023177772A1 (en) 2022-03-17 2023-09-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating recurrent epithelioid sarcoma with bispecific anti-muc16 x anti-cd3 antibodies alone or in combination with anti-pd-1 antibodies
WO2023196903A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antigen-binding molecules that bind and cd3 and tumor associated antigens (taas) and uses thereof
WO2023201226A1 (en) 2022-04-11 2023-10-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for universal tumor cell killing
WO2023212677A2 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification of tissue-specific extragenic safe harbors for gene therapy approaches
WO2023220603A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors and methods for in vivo antibody production
WO2023220647A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific binding molecule proproteins and uses thereof
TW202409090A (zh) 2022-05-12 2024-03-01 丹麥商珍美寶股份有限公司 在組合療法中能夠結合到ｃｄ２７之結合劑
WO2023218046A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
WO2023224912A1 (en) 2022-05-16 2023-11-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating metastatic castration-resistant prostate cancer with bispecific anti-psma x anti-cd3 antibodies alone or in combination with anti-pd-1 antibodies
US20230416396A1 (en) 2022-05-18 2023-12-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antigen binding molecules that bind cd38 and 4-1bb, and uses thereof
WO2023230594A1 (en) 2022-05-27 2023-11-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interleukin-2 proproteins and uses thereof
US20230391844A1 (en) 2022-06-04 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interleukin-2 proproteins and uses thereof
WO2023240109A1 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific molecules for modulating t-cell activity, and uses thereof
WO2024020199A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Native microfluidic ce-ms analysis of antibody charge heterogeneity
WO2024026474A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle
WO2024026488A2 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a modified transferrin receptor locus
US20240052051A1 (en) 2022-07-29 2024-02-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-tfr:payload fusions and methods of use thereof
WO2024030453A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating metastatic castration-resistant prostate cancer with bispecific anti-psma x anti-cd28 antibodies in combination with anti-pd-1 antibodies
US20240067691A1 (en) 2022-08-18 2024-02-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interferon receptor agonists and uses thereof
WO2024040247A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interferon proproteins and uses thereof
WO2024056861A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Avidicure Ip B.V. Multispecific antigen binding proteins for stimulating nk cells and use thereof
US20240224964A9 (en) 2022-09-29 2024-07-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Correction of hepatosteatosis in humanized liver animals through restoration of il6/il6r/gp130 signaling in human hepatocytes
WO2024081180A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing alloantibody levels in subjects in need of solid organ transplantation
US20240209100A1 (en) 2022-10-21 2024-06-27 Diagonal Therapeutics Inc. Heteromeric agonistic antibodies to il-18 receptor
WO2024092031A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Seismic Therapeutic, Inc. VARIANT IgG FC POLYPEPTIDES AND USES THEREOF
WO2024092133A1 (en) 2022-10-27 2024-05-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-acvr1 antibodies and their use in the treatment of trauma-induced heterotopic ossification
TW202432177A (zh) 2022-10-31 2024-08-16 丹麥商珍美寶股份有限公司 Ｃｄ３８抗體及其用途
WO2024098002A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle
WO2024102948A1 (en) 2022-11-11 2024-05-16 Celgene Corporation Fc receptor-homolog 5 (fcrh5) specific binding molecules and bispecific t-cell engaging antibodies including same and related methods
US20240173426A1 (en) 2022-11-14 2024-05-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes
WO2024107759A2 (en) 2022-11-14 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-fgfr3 antibodies and antigen-binding fragments and methods of use thereof
WO2024123698A1 (en) 2022-12-08 2024-06-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods to characterizing a fragment crystallizable domain of a bispecific antibody
WO2024130175A2 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antigen-binding molecules that bind to aav particles and uses
WO2024138191A1 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ace2 fusion proteins and uses thereof
WO2024152014A1 (en) 2023-01-13 2024-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fgfr3 binding molecules and methods of use thereof
WO2024151978A1 (en) 2023-01-13 2024-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Il12 receptor agonists and methods of use thereof
WO2024155982A2 (en) 2023-01-20 2024-07-25 Invetx, Inc. Bispecific binding agents for use in companion animals
WO2024173248A1 (en) 2023-02-13 2024-08-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of muscle related disorders with anti-human cacng1 antibodies
US20240277844A1 (en) 2023-02-17 2024-08-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Induced nk cells responsive to cd3/taa bispecific antibodies
US20240287186A1 (en) 2023-02-28 2024-08-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. T cell activators and methods of use thereof
WO2024182455A2 (en) 2023-02-28 2024-09-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multivalent anti-spike protein binding molecules and uses thereof
WO2024192308A2 (en) 2023-03-14 2024-09-19 Xencor, Inc. Anti-cd28 compositions
WO2024194685A2 (en) 2023-03-17 2024-09-26 Oxitope Pharma B.V. Anti-phosphocholine antibodies and methods of use thereof
WO2024194686A2 (en) 2023-03-17 2024-09-26 Oxitope Pharma B.V. Anti-phosphocholine antibodies and methods of use thereof
WO2024197151A2 (en) 2023-03-22 2024-09-26 Salubris Biotherapeutics, Inc. Anti-5t4 antigen binding domains, antibody-drug conjugates and methods of use thereof
WO2024211807A1 (en) 2023-04-07 2024-10-10 Diagonal Therapeutics Inc. Hinge-modified bispecific antibodies
WO2024211796A1 (en) 2023-04-07 2024-10-10 Diagonal Therapeutics Inc. Bispecific agonistic antibodies to activin a receptor like type 1 (alk1)
WO2024216226A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 Xencor, Inc. Anti-cd28 x anti-enpp3 antibodies
WO2024216221A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 Xencor, Inc. Anti-cd28 x anti-trop2 antibodies

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4444878A (en) * 1981-12-21 1984-04-24 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Bispecific antibody determinants
US20040241878A1 (en) * 2002-09-13 2004-12-02 Jorg Thommes Method of purifying polypeptides by simulated moving bed chromatography
US20070196363A1 (en) * 1997-05-02 2007-08-23 Genentech, Inc. Method for Making Multispecific Antibodies Having Heteromultimeric and Common Components
US20090263392A1 (en) * 2006-03-31 2009-10-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of modifying antibodies for purification of bispecific antibodies
RU2010129539A (ru) * 2007-12-21 2012-01-27 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг (Ch) Двухвалентные биспецифические антитела

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09100296A (ja) * 1984-09-26 1997-04-15 Takeda Chem Ind Ltd 蛋白質の相互分離方法
GB8626412D0 (en) 1986-11-05 1986-12-03 Clark M R Antibodies
GB8626413D0 (en) 1986-11-05 1986-12-03 Gilliland L K Antibodies
CA2118508A1 (en) * 1992-04-24 1993-11-11 Elizabeth S. Ward Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5456909A (en) * 1992-08-07 1995-10-10 T Cell Sciences, Inc. Glycoform fractions of recombinant soluble complement receptor 1 (sCR1) having extended half-lives in vivo
US5945311A (en) 1994-06-03 1999-08-31 GSF--Forschungszentrumfur Umweltund Gesundheit Method for producing heterologous bi-specific antibodies
DE122009000068I2 (de) * 1994-06-03 2011-06-16 Ascenion Gmbh Verfahren zur Herstellung von heterologen bispezifischen Antikörpern
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
JPH0987300A (ja) * 1995-07-14 1997-03-31 Takeda Chem Ind Ltd 雑種蛋白質およびその用途
DK0826695T3 (da) 1996-09-03 2002-04-15 Gsf Forschungszentrum Umwelt Tilintetgørelse af kontaminerende tumorceller i stamcelletransplantater med bispecifikke antistoffer
EP0826696B1 (de) * 1996-09-03 2002-05-29 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Verwendung bi-und trispezifischer Antikörper zur Induktion einer Tumorimmunität
DE19725586C2 (de) 1997-06-17 1999-06-24 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von Zellpräparaten zur Immunisierung mittels heterologer intakter bispezifischer und/oder trispezifischer Antikörper
US6994853B1 (en) 1998-09-25 2006-02-07 Trion Pharma Gmbh Time-staggered utilization of tumor cells in combination with intact antibodies for immunization
US20040220388A1 (en) * 2000-06-30 2004-11-04 Nico Mertens Novel heterodimeric fusion proteins
US7169903B2 (en) 2001-12-21 2007-01-30 Biosynexus Incorporated Multifunctional monoclonal antibodies directed to peptidoglycan of gram-positive bacteria
US20030224000A1 (en) * 2001-12-21 2003-12-04 Kokai-Kun John Fitzgerald Methods for blocking or alleviating staphylococcal nasal colonization by intranasal application of monoclonal antibodies
CN105884893A (zh) 2002-07-18 2016-08-24 莫鲁斯有限公司 抗体混合物的重组生产
US7923538B2 (en) 2005-07-22 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Recombinant antibody composition
AU2008207898B2 (en) 2007-01-23 2012-05-03 Xencor, Inc Optimized CD40 antibodies and methods of using the same
MX350962B (es) 2008-01-07 2017-09-27 Amgen Inc Metodo para fabricar moleculas heterodimericas de fragmentos cristalizables de anticuerpo, utilizando efectos electrostaticos de direccion.
JO3672B1 (ar) * 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
HUE054257T2 (hu) 2009-06-26 2021-08-30 Regeneron Pharma Könnyen izolálható, natív immunglobulin felépítésû bispecifikus antitestek
CA2791109C (en) 2011-09-26 2021-02-16 Merus B.V. Generation of binding molecules

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4444878A (en) * 1981-12-21 1984-04-24 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Bispecific antibody determinants
US20070196363A1 (en) * 1997-05-02 2007-08-23 Genentech, Inc. Method for Making Multispecific Antibodies Having Heteromultimeric and Common Components
US20040241878A1 (en) * 2002-09-13 2004-12-02 Jorg Thommes Method of purifying polypeptides by simulated moving bed chromatography
US20090263392A1 (en) * 2006-03-31 2009-10-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of modifying antibodies for purification of bispecific antibodies
RU2010129539A (ru) * 2007-12-21 2012-01-27 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг (Ch) Двухвалентные биспецифические антитела

Also Published As

Publication number Publication date
JP5816170B2 (ja) 2015-11-18
PT2975051T (pt) 2021-05-04
KR20120027055A (ko) 2012-03-20
JP2021004261A (ja) 2021-01-14
EP3916011A1 (en) 2021-12-01
KR20140112569A (ko) 2014-09-23
US20160251395A1 (en) 2016-09-01
US20100331527A1 (en) 2010-12-30
JP2022173489A (ja) 2022-11-18
CN103833855A (zh) 2014-06-04
KR20160141879A (ko) 2016-12-09
TWI507525B (zh) 2015-11-11
KR102010827B1 (ko) 2019-08-14
KR101904065B1 (ko) 2018-10-04
WO2010151792A1 (en) 2010-12-29
KR20180034638A (ko) 2018-04-04
EP2975051B1 (en) 2021-04-14
CN102471378A (zh) 2012-05-23
CA2766220A1 (en) 2010-12-29
DK2975051T3 (da) 2021-04-26
JP2018035193A (ja) 2018-03-08
MX2021009234A (es) 2022-06-14
MX2019012601A (es) 2019-12-16
US20220024973A1 (en) 2022-01-27
JP2012531439A (ja) 2012-12-10
JP7153048B2 (ja) 2022-10-13
IL217000A0 (en) 2012-02-29
US20190031713A1 (en) 2019-01-31
AU2010265933B2 (en) 2015-05-14
AU2010265933A1 (en) 2012-01-19
MX342623B (es) 2016-10-06
HUE054257T2 (hu) 2021-08-30
MX2011014008A (es) 2012-06-01
LT2975051T (lt) 2021-07-12
MY164121A (en) 2017-11-30
HK1219283A1 (zh) 2017-04-28
KR20180110190A (ko) 2018-10-08
MY152963A (en) 2014-12-15
EP2445936A1 (en) 2012-05-02
ES2865648T3 (es) 2021-10-15
HRP20210637T1 (hr) 2021-08-20
US9309326B2 (en) 2016-04-12
AU2015207952B2 (en) 2016-06-02
US20140248664A1 (en) 2014-09-04
KR101835648B1 (ko) 2018-03-07
RU2569157C2 (ru) 2015-11-20
KR101747103B1 (ko) 2017-06-14
TW201116625A (en) 2011-05-16
US11168111B2 (en) 2021-11-09
US20220389055A1 (en) 2022-12-08
RU2012102602A (ru) 2013-08-10
SG176868A1 (en) 2012-02-28
BRPI1015561A2 (pt) 2020-10-13
RU2522002C2 (ru) 2014-07-10
RU2015140911A (ru) 2017-03-30
IL265732B (en) 2020-03-31
PL2975051T3 (pl) 2021-09-20
SI2975051T1 (sl) 2021-08-31
RU2014114172A (ru) 2015-10-20
JP2015227386A (ja) 2015-12-17
EP2975051A1 (en) 2016-01-20
CN102471378B (zh) 2014-04-02
CY1124358T1 (el) 2022-07-22
IL265732A (en) 2019-05-30
US8586713B2 (en) 2013-11-19
MY192182A (en) 2022-08-04
AU2015207952A1 (en) 2015-08-20
MX368932B (es) 2019-10-22
US9982013B2 (en) 2018-05-29
JP6247673B2 (ja) 2017-12-13
CA2766220C (en) 2021-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2647758C2 (ru) Легковыделяемые биспецифические антитела с природным иммуноглобулиновым форматом
BRPI1015561B1 (pt) Anticorpo biespecífico que é heterodimérico com relação à ligação à proteína a e métodos para produção e isolamento do mesmo

Legal Events

Date Code Title Description
HZ9A Changing address for correspondence with an applicant