JP2022536470A - 多段階クロマトグラフィープロセス中の望ましくない成分を除去する方法 - Google Patents

Abstract

単一のクロマトグラフィーマトリックスを使用したアフィニティー分離プロセスとアフィニティー捕捉プロセスとを組み合わせた、高分離能アフィニティークロマトグラフィーにより、密接に関連する分子種間の分離能が向上し、二重特異性抗体などのヘテロ二量体タンパク質の大規模な工業的生産における全体的な製造収率が大幅に改善される。さらに、塩濃度を低下させる能力により、タンクおよび装置に係る要件が軽減され、また希釈、限外濾過またはダイアフィルトレーションを必要とせずに生成物の純度および濃度を高めることができる。【選択図】図１

Description

本発明は、例えばアフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質の複雑な混合物からのヘテロ二量体タンパク質の精製など、タンパク質生成物の精製ためのクロマトグラフィーのプロセス流から望ましくない成分を除去するための方法に関する。具体的には、該方法は、アフィニティークロマトグラフィー（プロテインＡクロマトグラフィーなど）を介して、モノマーとホモ二量体の複雑な混合物から、ヘテロ二量体（二重特異性抗体など）を単離することを含み、その際、精製されたヘテロ二量体は低い塩濃度および導電率の溶出液に回収されることにより、ヘテロ二量体タンパク質のさらに下流の処理が容易になる。

タンパク質生成物の精製では、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡおよびタンパク質生成物の望ましくない種などの不純物を除去するために、様々なクロマトグラフィーステップを利用するマルチステップのプロセスがしばしば必要となる。多くの場合、クロマトグラフィーカラムまたはバッファーの成分は、各クロマトグラフィーステップから放出される溶出液の一部をなすが、これらの成分は、下流のプロセスステップにおいて望ましくないことがあり得る。例えば、高濃度の塩を使用することにより、あるタンパク質生成物を不純物または分子の望ましくない種から分離することを促進し得るものの、その塩が、さらなるクロマトグラフィーステップまたはウイルス不活化などの下流プロセスステップにおいて適合しないことがあり得る。

様々な二重特異性抗体フォーマットが提案されており、現在開発が行われている。かかるフォーマットの１つは、改善された薬物動態プロファイルおよび最小限の免疫原性を有する標準的な完全ヒトＩｇＧ抗体に基づくものである（その全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，７１３号を参照）。単一の共通の軽鎖と２つの異なる重鎖とが組み合わされて二重特異性抗体が形成される。重鎖の１つは、プロテインＡへのＦｃ＊の結合性が低減または除去された置換Ｆｃ配列（以下「Ｆｃ＊」）を含む。例えば、かかるＦｃ＊配列の１つは、ＣＨ３ドメインでのＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ（ＥＵ付番システム；ＩＭＧＴエクソン付番システムによるとＨ９５Ｒ／Ｙ９６Ｆ）置換を含む。２つの重鎖と共通の軽鎖との共発現により、３つの産物が得られ、そのうちの２つは重鎖のホモ二量体であり、１つは目的のヘテロ二量体の二重特異性産物である。Ｆｃ＊配列は、市販のアフィニティーカラムにおいて、高いアビディティのＦｃＦｃ重鎖ホモ二量体または弱い結合力のＦｃ＊Ｆｃ＊ホモ二量体と比較しプロテインＡに対する中間的な結合アフィニティーを有することによるＦｃＦｃ＊二重特異性産物の選択的精製を可能にする。

二重特異性ヘテロ二量体の商業的規模での精製を可能にするには、ＦｃＦｃホモ二量体と、Ｆｃ＊Ｆｃヘテロ二量体と、Ｆｃ＊Ｆｃ＊ホモ二量体との間の良好な分離能が、処理しようとする材料の量、コストおよび精製プロセスで使用される機器および材料のスペースの要件と並んで、必要となる。

本発明は、その１つ以上の態様または実施形態では、クロマトグラフィー溶出液から成分を除去する方法に関し、該方法は、（ａ）第１のクロマトグラフィーステップの実施であって、該成分が、クロマトグラフィーカラムにアプライされる第１のバッファー中に存在する、該実施と、（ｂ）該第１のクロマトグラフィーステップからの中間溶出液の回収であって、該中間溶出液がタンパク質生成物と該成分とを含む、該回収と、（ｃ）該中間溶出液のクロマトグラフィーカラムへの再アプライ、および該中間溶出液における濃度よりも低い濃度で該成分を含む第２のバッファーによる該タンパク質生成物の溶出と、（ｄ）ステップ（ｃ）からのクロマトグラフィー溶出液の回収であって、該成分が、該中間溶出液における濃度よりも低い濃度で該クロマトグラフィー溶出液中に存在する、該回収と、（ｅ）該クロマトグラフィー溶出液の、後続のプロセスステップへのアプライと、を含む。いくつかの実施形態では、該成分は該第２のバッファーに存在しない。

いくつかの実施形態では、該成分は塩（ｓａｌｔ）である。いくつかの場合では、中間溶出液中の塩濃度は５０ｍＭ超である。いくつかの場合では、中間溶出液中の塩の濃度は、≧１００ｍＭ、≧２５０ｍＭ、≧５００ｍＭ、≧６００ｍＭ、≧７００ｍＭ、≧８００ｍＭ、≧９００ｍＭ、または≧１０００ｍＭである。いくつかの場合では、中間溶出液中の塩濃度は５００ｍＭ±５０ｍＭである。

いくつかの実施形態では、第１のクロマトグラフィーステップは、アフィニティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーから選択される。いくつかの実施形態では、後続のプロセスステップは、第２のクロマトグラフィーステップである。いくつかの場合では、後続のプロセスステップは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、またはウイルス不活化から選択される。

いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、抗体（例えば二重特異性抗体）である。

本発明は、その１つ以上の態様および実施形態では、アフィニティー捕捉および溶出プロセスを採用することにより、ホモ二量体およびヘテロ二量体を含むタンパク質の複雑な混合物からの、例えば二重特異性抗体などのヘテロ二量体タンパク質を精製する方法に関する。

一態様では、本発明は、ヘテロ二量体タンパク質を精製する方法を提供し、該方法は、（ａ）タンパク質結合リガンドを含むアフィニティーマトリックスへの、ヘテロ二量体タンパク質と不純物の混合物の導入であって、該ヘテロ二量体タンパク質が、該タンパク質結合リガンドに対して異なるアフィニティーを有する第１および第２のポリペプチドを含み、少なくとも１つの不純物が該タンパク質結合リガンドに結合し、少なくとも１つの不純物が該タンパク質結合リガンドに結合しない、該導入と、（ｂ）２００ｍＭ超の塩濃度および５～９の第１のｐＨを含む第１の洗浄バッファーによる、該アフィニティーマトリックスの洗浄であって、不純物が除去される、該洗浄と、（ｃ）該アフィニティーマトリックスから、２００ｍＭ超の塩濃度および４～５の第２のｐＨを含む第１の溶出バッファーへのヘテロ二量体タンパク質の溶出および回収であって、第１の溶出液中に精製されたヘテロ二量体タンパク質が得られる、該溶出および回収と、（ｄ）４未満の第３のｐＨを含む第２の洗浄バッファーによる、該アフィニティーマトリックスの洗浄であって、不純物が除去される、該洗浄と、（ｅ）該アフィニティーマトリックスの、５～９の第４のｐＨへの平衡化と、（ｆ）該第１の溶出液の５～９のｐＨへの中和、およびそれに続く該第１の溶出液の該アフィニティーマトリックスへの再アプライと、（ｇ）１００ｍＭ未満の塩を含む第３の洗浄バッファーによる、該アフィニティーマトリックスの洗浄と、（ｈ）第２の溶出液への、精製された該ヘテロ二量体タンパク質の溶出および回収であって、該第２の溶出液が１００ｍＭ未満の塩を含む、該溶出および回収と、を含む。該方法の様々な実施形態では、第３の洗浄バッファーを介して、精製されたヘテロ二量体タンパク質が第２の溶出液に溶出され回収される。該方法のいくつかの実施形態では、第３の洗浄バッファーは、５０ｍＭ未満の塩を含む。

いくつかの実施形態では、不純物は、第１および第２のポリペプチドのホモ二量体種を含む。

いくつかの実施形態では、タンパク質結合リガンドはプロテインＡであり、アフィニティーマトリックスは、基材に固定されたプロテインＡリガンドを含む。いくつかの場合では、プロテインＡリガンドは、Ｚドメイン四量体を含む改変されたプロテインＡ、Ｙドメイン四量体を含む改変されたプロテインＡ、またはＤおよびＥドメインを欠失する改変されたプロテインＡである。一実施形態では、プロテインＡリガンドは、Ｚドメイン四量体を含む。

いくつかの実施形態では、タンパク質結合リガンドはプロテインＧであり、アフィニティーマトリックスは、基材に固定されたプロテインＧリガンドを含む。

該方法の様々な実施形態では、基材は粒子であり、アフィニティーマトリックスは、２５μｍ～１００μｍの平均直径の多数の粒子を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、４０μｍ～６０μｍの平均直径を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、４５μｍ～５５μｍの平均直径を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、約５０μｍの平均直径を含む。いくつかの場合では、粒子は、約１１００Åの平均直径を有する細孔を含む。

様々な実施形態では、基材は、アガロース、ポリ（スチレンジビニルベンゼン）、ポリメタクリレート、セルロース、細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）および球状シリカのうちの任意の１つ以上を含む。

該方法のいくつかの実施形態では、第１の溶出バッファーは、２５０ｍＭ超の濃度の塩を含む。いくつかの場合では、塩濃度は３００ｍＭ超または４００ｍＭ超である。いくつかの実施形態では、塩濃度は約５００ｍＭである。

該方法の様々な実施形態では、塩は、（ｉ）Ｃｌ^－、Ｂｒ^－、Ｉ^－、ＮＯ_３ ^－、Ｎ（ＣＨ_３）_４ ^＋、ＮＨ^４＋、Ｃｓ^＋、Ｒｂ^＋、Ｋ^＋、Ｎａ^＋、Ｈ^＋、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ａｌ^３＋含有塩、または（ｉｉ）ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２もしくはＮａＣｌ、から選択される。

該方法の様々な実施形態では、第２の溶出液は、５０ｍＭ未満の塩を含む。いくつかの実施形態では、第２の溶出液は、１０ｍＭ未満の塩を含む。

該方法の様々な実施形態では、第１のポリペプチドは、タンパク質結合リガンドに結合できるＣＨ３ドメインを含み、第２のポリペプチドは、タンパク質結合リガンドに結合できないＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、プロテインＡに結合できるＣＨ３ドメインを含み、第２のポリペプチドは、プロテインＡに結合できないＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、プロテインＧに結合できるＣＨ３ドメインを含み、第２のポリペプチドは、プロテインＧに結合できないＣＨ３ドメインを含む。様々な実施形態では、第２のポリペプチドは、そのＣＨ３ドメインにＨＹからＲＦへの置換を含む。

該方法の様々な実施形態では、第１のｐＨは６～８である。いくつかの実施形態では、第２のｐＨは４．０～４．２５である。いくつかの場合では、第２のｐＨは４．１０±０．０５である。いくつかの実施形態では、第３のｐＨは２．８～３．５である。いくつかの実施形態では、第４のｐＨは６～８である。

いくつかの実施形態では、該方法は、低塩（例えば１００ｍＭ未満、５０ｍＭ未満または２５ｍＭ未満）溶出液中への精製ヘテロ二量体タンパク質の溶出および回収に続く、さらなるクロマトグラフィーステップまたはウイルス不活化ステップをさらに含む。いくつかの場合では、精製された組成物の導電率は、５．０ｍＳ／ｃｍ未満に低下する。いくつかの場合では、精製された組成物の導電率は、２．０ｍＳ／ｃｍ未満に低下する。いくつかの実施形態では、さらなるクロマトグラフィーステップまたはウイルス不活化ステップは、１００ｍＭ未満の塩を含む条件下で実施される。いくつかの場合では、さらなるクロマトグラフィーステップは、イオン交換クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態では、該イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィーであり、５０ｍＭ未満の塩を含む条件下で実施される。

本方法の様々な実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、二重特異性抗原結合性タンパク質である。いくつかの実施形態では、該二重特異性抗原結合性タンパク質は、二重特異性抗体である。

様々な実施形態では、上記または本明細書で考察される実施形態の特徴または構成要素のうちのいずれかは組み合わせられ得、そのような組み合わせは本開示の範囲内に包含される。上記または本明細書で論じられるいずれの特定の値も、上記または本明細書で論じられる別の関連値と組み合わせられて、それらの値が範囲の上限および下限を表す範囲を列挙することができ、かかる範囲は本開示の範囲内に包含される。

本発明の実施形態による精製プロセスを図示する。

本発明が記述される前に、記載される特定の方法および実験条件は異なり得るため、かかる方法および条件に本発明が限定されないことを、理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載するためのものに過ぎず、限定的なものとしては意図されないことを理解されたく、その理由は、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるからである。

別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙された数値に関して使用されるとき、その値が列挙された値から１％以下だけ変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」という表現は、９９および１０１ならびにそれらの間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。

本明細書に記載されるものと同様または同等のいずれの方法および材料も本発明の実施または試験に使用され得るが、好ましい方法および材料をこれから説明する。本明細書において言及される全ての特許、出願および非特許刊行物は、それらの全体の参照により本明細書に組み込まれる。

全般
本発明は、精製されたヘテロ二量体タンパク質（例えば二重特異性抗体）を含む中和された溶出液を、タンパク質を精製するために使用される同じアフィニティーマトリックスに再アプライすることにより、全体的な生成物の収率を大幅に高め、高分子量種の存在を最小化でき、一方で、大規模な工業的生産のための精製システムのコストおよびフットプリントを削減できる、という発見に、少なくとも部分的に基づく。治療用の二重特異性抗体の大規模な製造および精製のための、材料コストおよびスペースに関する考慮は、重要な関心事である。複数のプロセスにクロマトグラフィーカラムを再利用することで、カラム材料（例えばクロマトグラフィー媒体や樹脂）のコストや、目的の製品を得るために必要な装置が占めるスペースを、いずれも最小限に抑える。アフィニティークロマトグラフィーを介する二重特異性抗体の精製は、これまでも文献で報告されているが、これらの方法は一般に、２つの別個のアフィニティーカラム（例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）およびＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ（商標））を利用し、また限外濾過／ダイアフィルトレーションまたは塩耐性マルチモーダル樹脂に依存してアフィニティークロマトグラフィープロセスステップから塩を除去する。本発明者らは、両方のアフィニティークロマトグラフィー処理ステップに単一のカラムを利用することにより、全体的な生成物の収率を大幅に改善でき（２つの別々のカラムを使用する場合の平均約７７％と比較し、平均約９２％）、ホモ二量体不純物からヘテロ二量体を確実に分離するために使用される塩を、限外濾過またはダイアフィルトレーションを必要とせずに除去でき、それにより、コストおよびスペースに関する考慮を削減し、高価な耐塩性の材料を必要とせずにさらなるクロマトグラフィーまたは他の洗練ステップ用の生成物流が提供されることを発見した。

定義
「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互連結された４つのポリペプチド鎖、すなわち２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子を包含する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＬ_Ｈ領域およびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域と、そこへ介在するフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存領域と、にさらに区分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順、すなわちＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。用語「高アフィニティー」抗体は、例えば表面プラズモン共鳴、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）または溶液アフィニティーＥＬＩＳＡによって測定したとき、少なくとも１０^－９Ｍ、少なくとも１０^－１Ｍ、少なくとも１０^－１１Ｍ、または少なくとも１０^－１２Ｍの、その標的への結合アフィニティーを有する抗体を指す。

「二重特異性抗体」というフレーズは、２つ以上のエピトープに選択的に結合できる抗体を包含する。二重特異性抗体は一般に、２つの異なる重鎖を含み、各重鎖は２つの異なる分子（例えば複数の抗原）または同じ分子（例えば同じ抗原）上の異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第１のエピトープおよび第２のエピトープ）に選択的に結合できる場合、第１のエピトープに対する第１の重鎖のアフィニティーは、一般に、第２のエピトープに対する第１の重鎖のアフィニティーよりも一桁～二桁、または三桁もしくは四桁低く、その逆も然りである。二重特異性抗体によって認識されるエピトープは、同じまたは異なる標的（例えば同じまたは異なるタンパク質）上にあり得る。二重特異性抗体は、例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製することができる。例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列を、異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合させることができ、かかる配列を、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞で発現させることができる。典型的な二重特異性抗体は、それぞれが３つの重鎖ＣＤＲならびにそれに（Ｎ末端からＣ末端に向かって）続くＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する、２つの重鎖と、抗原結合特異性を付与しないが各重鎖と会合できるか、または、各重鎖と会合でき且つ重鎖抗原結合領域によって結合される１つ以上のエピトープに結合できるか、または、各重鎖と会合でき且つ一方または両方のエピトープへの一方または両方の重鎖の結合を可能にする、免疫グロブリン軽鎖と、を有する。

本明細書で論じられる方法の様々な実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質、二重特異性抗体、Ｆｃ含有タンパク質などは、アイソタイプＩｇＧのものであり得る。いくつかの場合では、ヘテロ二量体タンパク質、二重特異性抗体、Ｆｃ含有タンパク質などは、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のものである。いくつかの場合では、ヘテロ二量体タンパク質、二重特異性抗体、Ｆｃ含有タンパク質などは、アイソタイプＩｇＧ１のものである。いくつかの場合では、ヘテロ二量体タンパク質、二重特異性抗体、Ｆｃ含有タンパク質などは、アイソタイプＩｇＧ４のものである。様々な実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質、二重特異性抗体、Ｆｃ含有タンパク質などは、完全にヒト型である。

「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」というフレーズは、任意の生物由来の免疫グロブリン重鎖定常領域配列を包含し、また特に明記しない限り、重鎖可変ドメインを包含する。重鎖可変ドメインは、特に明記しない限り、３つの重鎖ＣＤＲおよび４つのＦＲ領域を包含する。重鎖のフラグメントは、ＣＤＲ、ＣＤＲおよびＦＲ、ならびにそれらの組み合わせを包含する。典型的な重鎖は、可変ドメインに続いて、（Ｎ末端からＣ末端に向かって）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能性フラグメントは、抗原を特異的に認識する（例えば、マイクロモル、ナノモルまたはピコモルの範囲のＫＤで抗原を認識する）ことができ、細胞から発現および分泌されることができるフラグメントが包含され、それは少なくとも１つのＣＤＲを含む。

「軽鎖」というフレーズは、任意の生物由来の免疫グロブリン軽鎖定常領域配列を包含し、また特に明記しない限り、ヒトカッパおよびラムダ軽鎖を包含する。軽鎖可変（ＶＬ）ドメインは典型的に、特に指定がない限り、３つの軽鎖ＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を包含する。一般に、全長軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含むＶＬドメインと、軽鎖定常ドメインとを包含する。本発明で使用できる軽鎖としては、例えば、抗原結合性タンパク質によって選択的に結合される第１または第２の抗原のいずれにも選択的に結合しないものが挙げられる。適切な軽鎖としては、既存の抗体ライブラリー（ウェットライブラリーまたはインシリコ）で最も一般的に使用される軽鎖をスクリーニングすることによって同定できる軽鎖が挙げられ、該軽鎖は、抗原結合性タンパク質の抗原結合ドメインのアフィニティーおよび／または選択性を実質的に妨害しない。適切な軽鎖としては、抗原結合性タンパク質の抗原結合領域によって結合される一方または両方のエピトープに結合できるものが挙げられる。

「可変ドメイン」というフレーズは、（特に明記しない限り）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ酸領域を含む、免疫グロブリン軽鎖または重鎖の（必要に応じて修飾される）アミノ酸配列を包含する。「可変ドメイン」は、二重βシート構造を有するカノニカルドメイン（ＶＨまたはＶＬ）にフォールディングできるアミノ酸配列を包含し、該βシートは、第１のβシートの残基と第２のβシートの残基との間のジスルフィド結合によって連結されている。

「相補性決定領域」というフレーズまたは「ＣＤＲ」という用語は、通常（すなわち野生型動物では）、免疫グロブリン分子（例えば抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域内の２つのフレームワーク領域の間に現れる、生物体の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を包含する。ＣＤＲは、例えば生殖細胞系列の配列または再配列後もしくは再配列前の配列によって、ならびに、例えばナイーブまたは成熟したＢ細胞またはＴ細胞によって、コードされ得る。いくつかの状況では（例えばＣＤＲ３の場合）、ＣＤＲは、（例えば再配列前の核酸配列においては）隣接していないが、Ｂ細胞核酸配列においては、例えば配列のスプライシングまたは連結（例えば重鎖ＣＤＲ３を形成するためのＶ－Ｄ－Ｊ組換え）の結果隣接している、２つ以上の配列（例えば生殖系列配列）によってコードされ得る。

「Ｆｃ含有タンパク質」というフレーズは、抗体、二重特異性抗体、ヘテロ二量体タンパク質および免疫アドヘシン、ならびに、免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも機能性部分を含む他の結合タンパク質を包含する。「機能性部分」とは、Ｆｃ受容体（例えばＦｃγＲ、またはＦｃＲｎ、すなわち新生児Ｆｃ受容体）に結合でき、および／または、補体の活性化に関与できるＣＨ２およびＣＨ３領域を指す。Ｆｃ受容体に結合できず、補体を活性化できないようにする欠失、置換、挿入またはその他の修飾が、ＣＨ２およびＣＨ３領域に含まれる場合、該ＣＨ２およびＣＨ３領域は、機能性を有さない。

Ｆｃ含有タンパク質は、免疫グロブリンドメイン中に、結合タンパク質の１つ以上のエフェクター機能に影響を与えるような修飾（例えば、ＦｃγＲ結合、ＦｃＲｎ結合およびそれによる半減期、および／またはＣＤＣ活性に影響を与える修飾）を含むことができる。かかる修飾としては、限定されないが、免疫グロブリン定常領域中の、ＥＵ付番における２３８、２３９、２４８、２４９、２５０、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１５、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３３９、３４０、３４２、３４４、３５６、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３７３、３７５、３７６、３７８、３８０、３８２、３８３、３８４、３８６、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４２８、４３０、４３３、４３４、４３５、４３７、４３８および４３９、ならびにそれらの組み合わせ、における修飾が挙げられる。

かかるＦｃ修飾の非限定的な例としては、例えば、２５０位での（例えばＥまたはＱ）、２５０位および４２８位での（例えばＬまたはＦ）、２５２位での（例えばＬ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位での（例えばＳまたはＴ）および２５６位での（例えばＳ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）修飾、あるいは、４２８位および／または４３３位での（例えばＨ／Ｌ／Ｒ／ＳＩ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／または４３４位での（例えばＨ／ＦまたはＹ）修飾、あるいは、２５０位および／または４２８位での修飾、あるいは、３０７位または３０８位（例えば３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）および４３４位での修飾が挙げられる。一実施形態では、該修飾は、４２８Ｌ（例えばＭ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えばＮ４３４Ｓ）の修飾、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えばＶ２５９Ｉ）および３０８Ｆ（例えばＶ３０８Ｆ）の修飾、４３３Ｋ（例えばＨ４３３Ｋ）および４３４（例えば４３４Ｙ）の修飾、２５２、２５４および２５６（例えば２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ）の修飾、２５０Ｑおよび４２８Ｌの修飾（例えばＴ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）、３０７および／または３０８の修飾（例えば３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。

「スター置換」、「Ｆｃ＊」、および「ＨＣ＊」という用語は、ＣＨ３ドメイン内にプロテインＡ結合を無効にする配列を含む、任意の分子、免疫グロブリン重鎖、Ｆｃフラグメント、Ｆｃ含有分子、ヘテロ二量体タンパク質などを包含する。ＣＨ３ドメインにおけるプロテインＡ結合を減弱または無効にできるＨ９５ＲおよびＹ９６Ｆなどの特定の修飾は、ＵＳ８，５８６，７１３に記載されている。このジペプチド変異は「スター置換」と呼ばれる。

「細胞」という用語は、組換え核酸配列を発現するのに適する任意の細胞を包含する。該細胞としては、原核生物および真核生物のもの（単一細胞または複数細胞）、細菌細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．などの株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（ＳＦ－９、ＳＦ－２１、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、またはハイブリドーマもしくはクアドローマなどの融合細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、該細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウスの細胞である。いくつかの実施形態では、該細胞は真核生物のものであり、以下の細胞：ＣＨＯ（例えばＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えばＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ８０６５、ＨＬ－６０（例えばＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ－１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、および上記の細胞に由来する細胞株、から選択される。いくつかの実施形態では、該細胞は、１つ以上のウイルス遺伝子を含み、例えばウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えばＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）である。

「移動相修飾剤」というフレーズは、タンパク質間の非特異的（すなわち非アフィニティー的）なイオン性および他の非共有結合性の相互作用の影響を低減するか、または破壊する部分（moieties）を包含する。「移動相修飾剤」としては、例えば、塩、第Ｉ族および第ＩＩ族金属とアセテート、ビカーボネート、カーボネート、ハロゲン（例えばクロライドまたはフルオライド）、ニトレート、ホスフェートまたはスルフェートとのイオン性の組み合わせが挙げられる。「移動相修飾剤」の非限定的な例示的なリストとしては、酢酸のベリリウム、リチウム、ナトリウムおよびカリウム塩、重炭酸ナトリウムおよびカリウム、炭酸のリチウム、ナトリウム、カリウムおよびセシウム塩。塩酸のリチウム、ナトリウム、カリウム、セシウムおよびマグネシウム塩、フッ化ナトリウムおよびフッ化カリウム、硝酸のナトリウム、カリウムおよびカルシウム塩、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウム、ならびに硫酸カルシウムおよび硫酸マグネシウムが挙げられる。

「移動相修飾剤」はまた、非共有結合力を弱めるか、さもなければ妨害し、生体分子系内のエントロピーを増加させるカオトロピック剤も包含される。カオトロピック剤の非限定的な例としては、ブタノール、塩化カルシウム、エタノール、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素および尿素が挙げられる。カオトロピック剤は、タンパク質の溶解度に影響を与える塩を包含する。よりカオトロピックなアニオンとしては、例えば、クロライド、ニトレート、ブロマイド、クロレート、ヨージド、パークロレートおよびチオシアネートが挙げられる。よりカオトロピックなカチオンとして、例えば、リチウム、マグネシウム、カルシウムおよびグアニジニウムが挙げられる。

「移動相修飾剤」には、ｐＨ勾配もしくはｐＨステップへの添加時、または「移動相修飾剤」中でのプロテインＡ担体の平衡化およびｐＨステップもしくはｐＨ勾配のアプライ時に、イオン性または他の非共有相互作用に影響を与え、ホモ二量体ＩｇＧとヘテロ二量体ＩｇＧとの（例えば、野生型ヒトＩｇＧと、同じＩｇＧであるが本明細書に記載のＣＨ３ドメインの１つ以上の修飾を有するものとの）溶出間のｐＨ単位距離の拡張をもたらす部分が包含される。「移動相修飾剤」の適切な濃度は、同じカラム、ｐＨステップまたはｐＨ勾配を使用しながら、所定のｐＨステップまたはｐＨ勾配において最大のｐＨ距離が得られるまで「移動相修飾剤」の濃度を増加させていくことにより決定できる。「移動相修飾剤」はまた、例えばプロピレングリコール、エチレングリコールなどの非極性修飾剤を包含し得る。

本明細書で使用される「アフィニティークロマトグラフィー」は、等電点、疎水性またはサイズなどの生体分子の一般的な特性ではなく、生体分子間の特異的な可逆的相互作用を利用してクロマトグラフィー分離を行うクロマトグラフィー法である。「プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー」または「プロテインＡクロマトグラフィー」とは、免疫グロブリン分子のＦｃ部分に対するプロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのアフィニティーを利用する、特異的なアフィニティークロマトグラフィー法を指す。このＦｃ部分は、ヒトまたは動物の免疫グロブリン定常ドメインＣＨ２およびＣＨ３、またはこれらに実質的に類似する免疫グロブリンドメインを含む。プロテインＡには、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの細胞壁に由来する天然タンパク質、組換え法または合成法によって産生されたプロテインＡ、およびＦｃ領域に結合する能力を保持する変異体が包含される。実際には、プロテインＡクロマトグラフィーは、固相担体に固定化されたプロテインＡの使用を伴う。Ｇａｇｎｏｎ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍｏｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，ｐｐ．１５５－１９８，Ｖａｌｉｄａｔｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，１９９６を参照されたい。プロテインＧおよびプロテインＬも、アフィニティークロマトグラフィーに使用され得る。固相担体は、プロテインＡが付着する非水性のマトリックスである。かかる担体としては、アガロース、セファロース、ガラス、シリカ、ポリスチレン、ニトロセルロース、木炭、砂、セルロース、および他の適切な材料が挙げられる。かかる材料は当技術分野で周知である。任意の適切な方法を使用して、第２のタンパク質を固相担体に固定することができる。タンパク質を適切な固相担体に固定するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｏｓｔｒｏｖｅ，”ｉｎ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８２：３５７－３７１，１９９０を参照されたい。かかる固相担体は、プロテインＡが固定化されたまたはされない状態で、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆ．）、ＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの一部門，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｐａｌｌ（Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）およびＥＭＤ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓ．）などの多くの業者からの市販品として容易に入手できる。細孔ガラスマトリックスに固定化されたプロテインＡは、ＰＲＯＳＥＰ（登録商標）－Ａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）として市販されている。固相はまた、アガロース系のマトリックスであり得る。アガロースマトリックスに固定化されたプロテインＡは、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）として市販されている。

アフィニティークロマトグラフィーはまた、抗体、抗体のフラグメント、または免疫グロブリンドメインおよび／または配列を含むキメラ融合タンパク質と選択的に結合し、したがってそれらを精製するために使用できる媒体も包含する。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＹ、ＩｇＤおよびＩｇＥタイプを包含する。抗体はまた、ラクダ抗体、改変されたラクダ抗体、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、ナノボディなどの単鎖抗体も包含する。抗体フラグメントは、ＶＨ、ＶＬ、ＣＬ、ＣＨ配列を包含する。抗体フラグメントおよび抗体配列を含む融合タンパク質としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）_３、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、Ｆｃ融合タンパク質、トラップ分子などが挙げられる（Ａｙｙａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ５６（２０１２）：１１６－１２９を参照）。かかるアフィニティークロマトグラフィー培体は、抗体に選択的に結合するリガンド、それらのフラグメント、およびそれらのフラグメントを含む融合タンパク質を包含しうる。かかるリガンドとしては、抗体結合タンパク質、細菌由来の受容体、抗原、レクチン、または標的分子に対する抗－抗体が挙げられる。精製を必要とする抗体。例えば、ＩｇＧ－ＣＨ１、ＩｇＧ－Ｆｃ、ＩｇＧ－ＣＨ３、ＩｇＧ１、ＬＣ－カッパ、ＬＣ－ラムダ、ＩｇＧ３／４、ＩｇＡ、ＩｇＭなどのいずれか１つ以上に対するラクダ由来のアフィニティーリガンドを、該アフィニティーリガンドとして使用し得る（ＣＡＰＴＵＲＥＳＥＬＥＣＴクロマトグラフィー樹脂として市販、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）。

精製流から望ましくない成分を除去する方法
本発明の方法の実施形態は、タンパク質生成物の精製のためのプロセス流から望ましくない成分を除去する方法を包含する。この方法は、クロマトグラフィーステップから生成された溶出液から、下流のプロセスステップにとり不都合でありうる１つ以上の成分（例えば化学成分または塩）を除去することを目的とする。いくつかの実施形態では、該方法は、（ａ）第１のクロマトグラフィーステップの実施であって、該成分が、クロマトグラフィーカラムにアプライされる第１のバッファー中に存在する、該実施と、（ｂ）該第１のクロマトグラフィーステップからの中間溶出液の回収であって、該中間溶出液がタンパク質生成物と該成分とを含む、該回収と、（ｃ）該中間溶出液のクロマトグラフィーカラムへの再アプライ、および該中間溶出液における濃度よりも低い濃度で該成分を含む第２のバッファーによる該タンパク質生成物の溶出と、（ｄ）ステップ（ｃ）からのクロマトグラフィー溶出液の回収であって、該成分が、該中間溶出液における濃度よりも低い濃度で該クロマトグラフィー溶出液中に存在する、該回収と、（ｅ）該クロマトグラフィー溶出液の、後続のプロセスステップへのアプライと、を含む。いくつかの実施形態では、該成分は該第２のバッファーに存在しない。

ヘテロ二量体タンパク質を精製するための方法に関連して以下でより詳細に論じられるように、いくつかの実施形態では、該成分は塩である。いくつかの場合では、中間溶出液中の塩濃度は５０ｍＭ超である。いくつかの場合では、中間溶出液中の塩濃度は、≧１００ｍＭ、≧１５０ｍＭ、≧２００ｍＭ、≧２５０ｍＭ、≧３００ｍＭ、≧３５０ｍＭ、≧４００ｍＭ、≧４５０ｍＭ、≧５００ｍＭ、≧６００ｍＭ、≧７００ｍＭ、≧８００ｍＭ、≧９００ｍＭ、または≧１０００ｍＭである。いくつかの場合では、中間溶出液中の塩濃度は５００ｍＭ±５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、中間溶出液中の塩濃度は、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭまたは６００ｍＭであり、各値は±１０％の変動幅を含む。

いくつかの実施形態では、第１のクロマトグラフィーステップは、アフィニティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーから選択される。いくつかの実施形態では、後続のプロセスステップは、第２のクロマトグラフィーステップである。いくつかの場合では、後続のプロセスステップは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、またはウイルス不活化から選択される。いくつかの場合では、本明細書で論じられる方法は、２つのイオン交換ステップ間で利用され得、ここで、第１のイオン交換ステップは、後続のイオン交換ステップが適切に実施できる上限を超えてプールの導電率を増加させる。いくつかの場合では、本明細書で論じられる方法は、２つのクロマトグラフィーステップ間で利用され得、ここで、第１のステップでは、後続のクロマトグラフィーステップを適切に実施するために除去しなければならない化学成分が導入される。いくつかの場合では、本明細書で論じられる方法は、ウイルス濾過の前に利用することで、導電率を低下させ、それにより濾過性能を向上させ、実施時間を短縮することができる。いくつかの場合では、本明細書で論じられる方法は、混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）の前に利用することで、ＭＭＣ媒体を妨害または分解する化学成分を除去することができる。例えば、流れから、セラミックのヒドロキシアパタイトと適合しないシトレートを除去することが望ましい。

いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は抗体（例えば二重特異性抗体）である。

ヘテロ二量体タンパク質を精製する方法
本発明の方法の実施形態は、図１に示されるステップを包含する。例えば、ヘテロ二量体タンパク質を精製する方法は、（ａ）ヘテロ二量体タンパク質と不純物との混合物の、アフィニティーマトリックスへのローディングと、（ｂ）５～８のｐＨおよび２００ｍＭ超の塩濃度の第１の洗浄バッファーによる該アフィニティーマトリックスの洗浄と、（ｃ）４～５のｐＨおよび２００ｍＭ超の塩濃度の第１の溶出バッファーによる該ヘテロ二量体タンパク質の溶出および回収と、（ｄ）４未満のｐＨの第２の洗浄バッファーによる該アフィニティーマトリックスの洗浄と、（ｅ）該アフィニティーマトリックスの、５～９のｐＨへの平衡化と、（ｆ）該ヘテロ二量体タンパク質を含む該溶出液の、５～９のｐＨへの中和、および中和された該溶出液の該アフィニティーマトリックスへの再アプライと、（ｇ）１００ｍＭ未満の塩を含む第３の洗浄バッファーによる該アフィニティーマトリックスの洗浄と、（ｈ）１００ｍＭ未満の塩を含む溶出液による該ヘテロ二量体タンパク質の溶出および回収と、を含む。いくつかの実施形態では、該方法は、アフィニティーマトリックスを５～９のｐＨに平衡化する当初平衡化ステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、該方法は、第１の洗浄バッファーでの洗浄の後、ヘテロ二量体タンパク質の溶出および回収の前に、１００ｍＭ未満の塩を含む洗浄バッファーでアフィニティーマトリックスを洗浄することをさらに含む。

様々な実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質および不純物の混合物のアフィニティーマトリックスへのローディングは、ヘテロ二量体タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現する細胞を含む１つ以上のバイオリアクターに由来する清澄化細胞培養液をローディングすることを包含する。例えば、該細胞は、二重特異性抗体（例えば、ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異性抗体、２つのアームがＭＥＴの別個のエピトープに結合するＭＥＴ×ＭＥＴ二重特異性抗体、ＣＤ３×ＢＣＭＡ二重特異性抗体、ＣＤ２２×ＣＤ２８二重特異性抗体、ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体、ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗体、ＣＤ３×ＭＵＳ１６二重特異性抗体、ＣＤ３×ＳＴＥＡＰ２二重特異性抗体など）を形成する重鎖および軽鎖をそれぞれコードするヌクレオチドを発現し得る。いくつかの場合では、二重特異性抗体の抗原結合アームのそれぞれが、共通の軽鎖を含む。清澄化された細胞培養液には、ホモ二量体種、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡなどの不純物とともに、ヘテロ二量体タンパク質（例えば二重特異性抗体）が含まれる。いくつかの場合では、ヘテロ二量体タンパク質は、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの真核細胞で産生され得る。

いくつかの実施形態では、アフィニティーマトリックスにローディングされる混合物には、（ｉ）第１のポリペプチドの２つのコピーを含む第１のホモ二量体と、（ｉｉ）第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むヘテロ二量体と、（ｉｉｉ）第２のポリペプチドの２つのコピーを含む第２のホモ二量体と、を含むタンパク質の混合物が含まれる。第１および第２のポリペプチドは、アフィニティーマトリックスに対して異なるアフィニティーを有し、その結果、第１のホモ二量体、ヘテロ二量体および第２のホモ二量体は、アフィニティーマトリックスへの結合性の相違に基づいて分離することができる。アフィニティーマトリックスへの結合性の相違は、とりわけ、アフィニティーマトリックスを通過する溶液のｐＨおよび／またはイオン強度を変化させることによって操作することができる。

種々の実施形態では、バッファーまたは溶出液（またはその他）の文脈で本明細書で議論される塩は、Ｃｌ^－、Ｂｒ^－、Ｉ^－、ＮＯ_３ ^－、Ｎ（ＣＨ_３）_４ ^＋、ＮＨ^４＋、Ｃｓ^＋、Ｒｂ^＋、Ｋ^＋、Ｎａ^＋、Ｈ^＋、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋またはＡｌ^３＋を含む塩である。いくつかの実施形態では、塩は、Ｎａ^＋、Ｈ^＋、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋またはＡｌ^３＋を含む。いくつかの実施形態では、塩は、Ｃｌ^－、Ｂｒ^－、Ｉ^－、ＮＯ_３ ^－またはＣｌＯ_４ ^－を含む。いくつかの実施形態では、塩は、Ｎａ^＋、Ｈ^＋、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋またはＡｌ^３＋と、Ｃｌ^－、Ｂｒ^－、Ｉ^－、ＮＯ_３ ^－またはＣｌＯ_４ ^－との組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、塩は、ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２またはＮａＣｌから選択される。いくつかの実施形態では、塩はＮａＣｌである。いくつかの実施形態では、塩はＣａＣｌ_２である。いくつかの実施形態では、塩はＭｇＣｌ_２である。

清澄化した細胞培養液をローディングした後、アフィニティーマトリックスを、２００ｍＭ超の塩および５～９のｐＨを含む洗浄バッファーで洗浄する（図１の第１の洗浄バッファー）。いくつかの場合では、洗浄バッファーのｐＨは６～８である。いくつかの場合では、洗浄バッファーのｐＨは約７～約７．５である。様々な実施形態では、洗浄バッファーのｐＨは５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９もしくは９．０であるか、または凡そそれらのいずれかである。いくつかの場合では、洗浄バッファーのｐＨは７．２または約７．２である。様々な実施形態では、バッファーは、ｐＨを所望の数値点または所望の数値範囲内に維持できる任意のバッファーであり得る。様々な実施形態では、バッファーの濃度は約５ｍＭ～約１００ｍＭであり得る。いくつかの場合では、バッファーの濃度は約５ｍＭ～約１５ｍＭである。いくつかの場合では、バッファーの濃度は約５ｍＭ～約５０ｍＭである。いくつかの場合では、バッファーの濃度は約１０ｍＭ～約２５ｍＭである。いくつかの場合では、バッファーの濃度は約２０ｍＭ～約４０ｍＭである。いくつかの場合では、バッファーの濃度は約３０ｍＭ～約５０ｍＭである。様々な実施形態では、バッファーの濃度は、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭもしくは５０ｍＭであるか、または凡そそれらのいずれかである。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーの濃度は、約１０ｍＭであるか、または約１０ｍＭである。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーの濃度は、約４０ｍＭであるか、または約４０ｍＭである。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーはリン酸ナトリウムである。

いくつかの場合では、洗浄バッファーは、約２００ｍＭ～約８００ｍＭの濃度の塩を含む。いくつかの場合では、洗浄バッファーは、約２５０ｍＭ～約７５０ｍＭの濃度の塩を含む。いくつかの場合では、洗浄バッファーは、約３００ｍＭ～約７００ｍＭの濃度の塩を含む。いくつかの場合では、洗浄バッファーは、約３５０ｍＭ～約６５０ｍＭの濃度の塩を含む。いくつかの場合では、洗浄バッファーは、約４００ｍＭ～約６００ｍＭの濃度の塩を含む。いくつかの場合では、洗浄バッファーは、約４５０ｍＭ～約５５０ｍＭの濃度の塩を含む。いくつかの場合では、洗浄バッファーは、約２００ｍＭ、２１０、ｍＭ、２２０ｍＭ、２２５ｍＭ、２３０ｍＭ、２４０ｍＭ、２５０ｍＭ、２６０ｍＭ、２７０ｍＭ、２７５ｍＭ、２８０ｍＭ、２９０ｍＭ、３００ｍＭ、３１０ｍＭ、３２０ｍＭ、３２５ｍＭ、３３０ｍＭ、３４０ｍＭ、３５０ｍＭ、３６０ｍＭ、３７０ｍＭ、３７５ｍＭ、３８０ｍＭ、３９０ｍＭ、４００ｍＭ、４１０ｍＭ、４２０ｍＭ、４２５ｍＭ、４３０ｍＭ、４４０ｍＭ、４５０ｍＭ、４６０ｍＭ、４７０ｍＭ、４７５ｍＭ、４８０ｍＭ、４９０ｍＭ、５００ｍＭ、５１０ｍＭ、５２０ｍＭ、５２５ｍＭ、５３０ｍＭ、５４０ｍＭ、５５０ｍＭ、５６０ｍＭ、５７０ｍＭ、５７５ｍＭ、５８０ｍＭ、５９０ｍＭ、６００ｍＭ、６１０ｍＭ、６２０ｍＭ、６２５ｍＭ、６３０ｍＭ、６４０ｍＭ、６５０ｍＭ、６６０ｍＭ、６７０ｍＭ、６７５ｍＭ、６８０ｍＭ、６９０ｍＭ、７００ｍＭ、７１０ｍＭ、７２０ｍＭ、７２５ｍＭ、７３０ｍＭ、７４０ｍＭ、７５０ｍＭ、７６０ｍＭ、７７０ｍＭ、７８０ｍＭ、７９０ｍＭもしくは８００ｍＭ、または凡そそれらのいずれかの濃度の塩を含む。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーの塩濃度は、約５００ｍＭであるか、または約５００ｍＭである。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーは、約５００ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの場合では、このアフィニティーマトリックスの洗浄により、アフィニティーマトリックス材料（プロテインＡなど）に対するアフィニティーがほとんどまたはまったくない宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ホモ二量体種などの非結合の不純物が除去される。

いくつかの実施形態では、該方法は、ヘテロ二量体タンパク質の溶出の前に、ｐＨ５～９の塩をほとんど（＜２５ｍＭ）または全く含まない洗浄バッファーによる、任意選択の第２の洗浄を包含する。いくつかの実施形態では、この洗浄バッファーは、約１０ｍＭ～約５０ｍＭのＴｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、リン酸ナトリウム、または酢酸塩、またはそれらの組み合わせを含む。様々な実施形態では、この洗浄バッファーは、上記で論じられた第１の洗浄バッファーのｐＨに等しいｐＨを有する。

上記の１つ以上の洗浄に続いて、ヘテロ二量体タンパク質が、アフィニティーマトリックスから溶出バッファー（図１の最初の溶出バッファー）中に溶出され、溶出液に回収される。溶出バッファーのｐＨは約４～約５であり、２００ｍＭ超の濃度の塩を含む。いくつかの実施形態では、溶出バッファーのｐＨは約４．０～約４．２である。いくつかの実施形態では、溶出バッファーのｐＨは約４．４～約４．６である。様々な実施形態では、溶出バッファーのｐＨは、４．０、４．０５、４．１、４．１５、４．２、４．２５、４．３、４．３５、４．４、４．４５、４．５、４．５５、４．６、４．６５、４．７、４．７５、４．８、４．８５、４．９、４．９５もしくは５．０であるか、または凡そそれらのいずれかである。いくつかの実施形態では、溶出バッファーのｐＨは４．１である。いくつかの実施形態では、溶出バッファーのｐＨは４．５５である。様々な実施形態では、バッファーは、ｐＨを所望の数値点または所望の数値範囲内に維持できる任意のバッファーであり得る。様々な実施形態では、バッファーの濃度は約５ｍＭ～約１００ｍＭであり得る。いくつかの場合では、バッファーの濃度は約２５ｍＭ～約５５ｍＭである。いくつかの場合では、バッファーの濃度は約３０ｍＭ～約５０ｍＭである。様々な実施形態では、バッファーの濃度は、約３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭもしくは５０ｍＭであるか、または凡そそれらのいずれかである。いくつかの実施形態では、溶出バッファーの濃度は、約４０ｍＭであるか、または約４０ｍＭである。いくつかの実施形態では、溶出バッファーは酢酸である。いくつかの実施形態では、溶出バッファーはアセテートである。

いくつかの場合では、溶出バッファーは、約２００ｍＭ～約８００ｍＭの濃度の塩を含む。いくつかの場合では、溶出バッファーは、約２５０ｍＭ～約７５０ｍＭの濃度の塩を含む。いくつかの場合では、溶出バッファーは、約３００ｍＭ～約７００ｍＭの濃度の塩を含む。いくつかの場合では、溶出バッファーは、約３５０ｍＭ～約６５０ｍＭの濃度の塩を含む。いくつかの場合では、溶出バッファーは、約４００ｍＭ～約６００ｍＭの濃度の塩を含む。いくつかの場合では、溶出バッファーは、約４５０ｍＭ～約５５０ｍＭの濃度の塩を含む。いくつかの場合では、溶出バッファーは、２００ｍＭ、２１０、ｍＭ、２２０ｍＭ、２２５ｍＭ、２３０ｍＭ、２４０ｍＭ、２５０ｍＭ、２６０ｍＭ、２７０ｍＭ、２７５ｍＭ、２８０ｍＭ、２９０ｍＭ、３００ｍＭ、３１０ｍＭ、３２０ｍＭ、３２５ｍＭ、３３０ｍＭ、３４０ｍＭ、３５０ｍＭ、３６０ｍＭ、３７０ｍＭ、３７５ｍＭ、３８０ｍＭ、３９０ｍＭ、４００ｍＭ、４１０ｍＭ、４２０ｍＭ、４２５ｍＭ、４３０ｍＭ、４４０ｍＭ、４５０ｍＭ、４６０ｍＭ、４７０ｍＭ、４７５ｍＭ、４８０ｍＭ、４９０ｍＭ、５００ｍＭ、５１０ｍＭ、５２０ｍＭ、５２５ｍＭ、５３０ｍＭ、５４０ｍＭ、５５０ｍＭ、５６０ｍＭ、５７０ｍＭ、５７５ｍＭ、５８０ｍＭ、５９０ｍＭ、６００ｍＭ、６１０ｍＭ、６２０ｍＭ、６２５ｍＭ、６３０ｍＭ、６４０ｍＭ、６５０ｍＭ、６６０ｍＭ、６７０ｍＭ、６７５ｍＭ、６８０ｍＭ、６９０ｍＭ、７００ｍＭ、７１０ｍＭ、７２０ｍＭ、７２５ｍＭ、７３０ｍＭ、７４０ｍＭ、７５０ｍＭ、７６０ｍＭ、７７０ｍＭ、７８０ｍＭ、７９０ｍＭもしくは８００ｍＭであるか、または凡そそれらのいずれかの濃度の塩を含む。いくつかの実施形態では、溶出バッファーの塩濃度は、約５００ｍＭであるか、または約５００ｍＭである。いくつかの実施形態では、溶出バッファーは、約５００ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、溶出バッファーは、約５００ｍＭのＣａＣｌ_２を含む。いくつかの実施形態では、溶出バッファーは、約５００ｍＭのＭｇＣｌ_２を含む。

アフィニティーマトリックスからヘテロ二量体タンパク質を溶出および回収した後、アフィニティーマトリックスを約４未満のｐＨの洗浄バッファー（図１の第２の洗浄バッファー）で洗浄する。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーのｐＨは、約２．５～約３．５である。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーのｐＨは、３．０±０．２である。様々な実施形態では、洗浄バッファーのｐＨは、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８もしくは３．９であるか、または凡そそれらのいずれかである。洗浄バッファーは、上記のｐＨまたはｐＨ範囲を提供するための任意の適切な材料を含むことができる。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーは、約２０ｍＭ～約６０ｍＭの濃度の酢酸を含む。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーは、約３０ｍＭ～約５０ｍＭの濃度の酢酸を含む。いくつかの場合では、洗浄バッファーは約４０ｍＭの酢酸を含む。いくつかの場合では、このアフィニティーマトリックスの洗浄により、ホモ二量体種などの、ヘテロ二量体タンパク質よりも高いアフィニティーでアフィニティーマトリックス材料（タンパク質Ａなど）に以前に結合した不純物が除去される。いくつかの場合では、本発明の方法はまた、上記で説明した洗浄バッファーよりも、低いｐＨ（例えば、２．４５±０．２）および高い緩衝剤濃度（例えば５００ｍＭ酢酸）を含むバッファーによるアフィニティーマトリックスのさらなる洗浄を含み得る。

上記の１つ以上の洗浄液でさらなる不純物の除去を行った後、アフィニティーマトリックスを５～９のｐＨに再平衡化する。様々な実施形態では、アフィニティーマトリックスは、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９もしくは９．０、または凡そそれらのいずれかのｐＨに平衡化される。いくつかの実施形態では、アフィニティーマトリックスは、約７．２のｐＨに平衡化される。平衡化は、所望のｐＨを有する平衡化バッファーを用いて実施することができる。様々な実施形態では、バッファーは、ｐＨを所望の数値点または所望の数値範囲内に維持できる任意のバッファーであり得る。様々な実施形態では、バッファーの濃度は約５ｍＭ～約１００ｍＭであり得る。いくつかの場合では、バッファーの濃度は約１０ｍＭ～約３０ｍＭである。いくつかの場合では、バッファーの濃度は約３０ｍＭ～約５０ｍＭである。いくつかの場合では、バッファーの濃度は約４０ｍＭ～約６０ｍＭである。様々な実施形態では、バッファーの濃度は、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭ、５０ｍＭ、５１ｍＭ、５２ｍＭ、５３ｍＭ、５４ｍＭ、５５ｍＭ、５６ｍＭ、５７ｍＭ、５８ｍＭ、５９ｍＭもしくは６０ｍＭ、または凡そそれらのいずれかである。いくつかの実施形態では、バッファーの濃度は、約２０ｍＭであるか、または約２０ｍＭである。いくつかの実施形態では、バッファーの濃度は、約４０ｍＭであるか、または約４０ｍＭである。いくつかの実施形態では、バッファーの濃度は、約５０ｍＭであるか、または約５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、バッファーはリン酸ナトリウムである。いくつかの実施形態では、このバッファーは、約１０ｍＭ～約５０ｍＭのＴｒｉｓ、リン酸ナトリウムもしくは酢酸塩、またはそれらの組み合わせを含む。

アフィニティーマトリックスの平衡化に続いて、（ホモ二量体の混入物および他の不純物から精製された）ヘテロ二量体タンパク質を含む中和された溶出液は、５～９のｐＨで、上記の精製プロセスステップで使用されたものと同じアフィニティーマトリックスに再アプライされる。様々な実施形態では、中和された溶出液は、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９もしくは９．０、または凡そそれらのいずれかのｐＨで、アフィニティーマトリックスに再アプライされる。いくつかの実施形態では、ｐＨは約７．２であるか、または約７．２である。

中和された溶出液をアフィニティーマトリックスに再アプライした後、マトリックスを中性ｐＨおよび１００ｍＭ未満の塩濃度の洗浄バッファー（図１の第３の洗浄バッファー）で洗浄する。一般に、この洗浄バッファーのｐＨは、上記のようなアフィニティーマトリックスに再アプライされた中和された溶出液のｐＨと密接に対応する。様々な実施形態では、この洗浄バッファーの塩濃度は、約０ｍＭ～約１００ｍＭ、約０ｍＭ～約７５ｍＭ、約０ｍＭ～約５０ｍＭ、約０ｍＭ～約２５ｍＭまたは約０ｍＭ～約１０ｍＭと考えられる。様々な実施形態では、この洗浄バッファーの塩濃度は、９９ｍＭ、９５ｍＭ、９０ｍＭ、８５ｍＭ、８０ｍＭ、７５ｍＭ、７０ｍＭ、６５ｍＭ、６０ｍＭ、５５ｍＭ、５０ｍＭ、４５ｍＭ、４０ｍＭ、３５ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ以下、または凡そそれらのいずれかの濃度以下、または０ｍＭである。様々な実施形態では、バッファーは、ｐＨを所望の数値点または所望の数値範囲内に維持できる任意のバッファーであり得る。様々な実施形態では、バッファーの濃度は約５ｍＭ～約１００ｍＭであり得る。いくつかの場合では、バッファーの濃度は約１０ｍＭ～約３０ｍＭである。いくつかの場合では、バッファーの濃度は約３０ｍＭ～約５０ｍＭである。いくつかの場合では、バッファーの濃度は約４０ｍＭ～約６０ｍＭである。様々な実施形態では、バッファーの濃度は、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭ、５０ｍＭ、５１ｍＭ、５２ｍＭ、５３ｍＭ、５４ｍＭ、５５ｍＭ、５６ｍＭ、５７ｍＭ、５８ｍＭ、５９ｍＭもしくは６０ｍＭ、または凡そそれらのいずれかである。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーの濃度は、約２０ｍＭであるか、または約２０ｍＭである。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーの濃度は、約４０ｍＭであるか、または約４０ｍＭである。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーの濃度は、約５０ｍＭであるか、または約５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーはリン酸ナトリウムである。いくつかの実施形態では、この洗浄バッファーは、約１０ｍＭ～約５０ｍＭのＴｒｉｓ、リン酸ナトリウムもしくは酢酸塩、またはそれらの組み合わせを含む。

上記の洗浄に続いて、アフィニティーマトリックスから、約１００ｍＭ未満の塩を含む溶出液中に、精製されたヘテロ二量体タンパク質が溶出され、回収される。様々な実施形態では、溶出液の塩濃度は、約９９ｍＭ、９５ｍＭ、９０ｍＭ、８５ｍＭ、８０ｍＭ、７５ｍＭ、７０ｍＭ、６５ｍＭ、６０ｍＭ、５５ｍＭ、５０ｍＭ、４５ｍＭ、４０ｍＭ、３５ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ以下、または凡そそれらのいずれかの濃度以下、または０ｍＭである。一般に、ヘテロ二量体タンパク質の溶出は、約４未満のｐＨのバッファーを用いて実施される。いくつかの実施形態では、溶出バッファーのｐＨは約２．５～約３．５である。いくつかの実施形態では、溶出バッファーのｐＨは３．０±０．２である。様々な実施形態では、溶出バッファーのｐＨは、約２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８もしくは３．９であるか、または凡そそれらのいずれかである。溶出バッファーは、上記のｐＨまたはｐＨ範囲を提供するための任意の適切な材料を含むことができる。いくつかの実施形態では、溶出バッファーは、約２０ｍＭ～約６０ｍＭの濃度の酢酸を含む。いくつかの実施形態では、溶出バッファーは、約３０ｍＭ～約５０ｍＭの濃度の酢酸を含む。いくつかの場合では、溶出バッファーは約４０ｍＭの酢酸を含む。

様々な実施形態では、清澄化された細胞培養液からの、またはヘテロ二量体タンパク質を含む中和された溶出液からのアフィニティーマトリックスへのローディングは、最大約７５ｇ／Ｌアフィニティーマトリックス樹脂での材料の添加を包含し得る。様々な実施形態では、アフィニティーマトリックスは、６５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、または５０ｇ／Ｌ以下の材料でローディングされる。

本明細書で論じられる方法の様々な実施形態では、精製されたヘテロ二量体タンパク質溶出液から塩を除去するために、ダイアフィルトレーションも限外濾過も使用されない。後続の処理のために塩濃度を下げるために、目的の生成物を希釈する必要もない。この希釈、限外濾過またはダイアフィルトレーションを行わない塩濃度の低下により、これらの二重特異性抗体の精製に必要な装置およびタンクの設置のためのフットプリントが削減される。

いくつかの実施形態では、アフィニティーマトリックスは、基材に固定されたリガンド（例えばプロテインＡ）を含む。いくつかの場合では、基材はビーズまたは粒子であり、その結果、アフィニティーマトリックスは、リガンドが付着した複数の粒子となる。様々な実施形態では、リガンドはプロテインＡまたはプロテインＧである。リガンドがプロテインＡであるとき、プロテインＡは、天然に存在するかまたは修飾されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属由来のプロテインＡであり得るか、または改変されたプロテインＡであり得る。改変されたプロテインＡは、例えば、Ｚドメイン四量体であるか、Ｙドメイン四量体であるか、またはＤドメインおよびＥドメインを欠く改変されたプロテインＡであり得る。これらの例示される改変されたプロテインＡは、免疫グロブリンのＶＨ３ドメインに結合できない（または非常に低いアフィニティーでしか結合できない）が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４のＣＨ３ドメインには結合できる。

いくつかの場合では、アフィニティーマトリックス基材は、アガロース、ポリ（スチレンジビニルベンゼン）、ポリメタクリレート、細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）、球状シリカ、セルロースなどを含むか、またはそれらで作製される。基材がビーズまたは粒子として成形される実施形態では、粒子の平均直径は２５μｍ～１００μｍである。いくつかの実施形態では、粒子の平均直径は、約４０μｍ～約６０μｍである。いくつかの実施形態では、粒子の平均直径は、約４５μｍ～約５５μｍである。いくつかの実施形態では、粒子の平均直径は、約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４または５５μｍからである。いくつかの場合では、粒子の平均直径は約４５μｍである。いくつかの場合では、粒子の平均直径は約５０μｍである。いくつかの実施形態では、粒子は、３５μｍ、４５μｍ、６０μｍ、７５μｍまたは８５μｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約１０００Å、１０５０Å、１１００Å、１１５０Åまたは１２００Åの平均直径を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、約１１００Åの平均直径を有する細孔を含む。

本方法のいくつかの実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、プロテインＡに結合できるＣＨ３ドメイン（「Ｆｃ」）を含む第１のポリペプチドと、プロテインＡに結合できないＣＨ３ドメイン（「Ｆｃ＊」）を含む第２のポリペプチドと、を含む二重特異性抗体である。いくつかの場合では、第２のポリペプチドはそのＣＨ３ドメインに、Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ（ＥＵ付番システム、ＩＭＧＴエクソン付番システムではＨ９５Ｒ／Ｙ９６Ｆ）置換（別名「Ｆｃ＊」または「スター置換」）を含む。したがって、いくつかの実施形態では、第１のホモ二量体は、２つの非置換ＣＨ３ドメイン（すなわちＦｃＦｃ）を有する単一特異性抗体であり、第２のホモ二量体は、２つのＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ置換ＣＨ３ドメイン（すなわちＦｃ＊Ｆｃ＊）を有する単一特異性抗体であり、ヘテロ二量体タンパク質は、１つの非置換ＣＨ３ドメインと１つのＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ置換ＣＨ３ドメイン（すなわちＦｃ＊Ｆｃ）を有する二重特異性抗体である。

実施例１：ＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異性抗体（ＢｓＡｂ１）の精製
ＢｓＡｂ１の精製は、アフィニティー分離クロマトグラフィーステップおよびアフィニティー捕捉クロマトグラフィーステップを含む２ステップのプロセスとして実施した。アフィニティー分離ステップでは、清澄化された馴化培地から二重特異性抗体を捕捉し、それによって生成物の体積を減らし、タンパク質濃度を高め、またＦｃ＊Ｆｃ＊およびＦｃＦｃホモ二量体種の除去を通じて二重特異性の純度を高めた。アフィニティー分離プロセスからの二重特異性抗体の溶出に続いて、バッファー交換およびウイルス不活化の目的で、同じアフィニティーカラムに再ローディングする準備として、溶出液をより高いｐＨ（～７．２）に調整した。アフィニティー捕捉ステップでは、中性のアフィニティー分離プールから二重特異性抗体を捕捉し、それによって生成物の体積を減らし、タンパク質濃度を高め、またアフィニティー分離ステップで使用された溶出液から塩を除去したが、いずれも、より多くの装置およびタンクに関する要件を要するであろう限外濾過、ダイアフィルトレーションまたは希釈の必要性を有さなかった。いずれのクロマトグラフィーステップにおいても、Ｚドメインの四量体を含むＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）ｐｃｃ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む同じマトリックスを採用した。

アフィニティー捕捉プロセスに続き、二重特異性抗体プールを３．５０～３．６５のｐＨ（０．２５ＭグリシンＨＣｌによる）で３０～５０分間保持することを含むウイルスの不活化を行った。中性ｐＨにおいてウイルス不活化に続く二重特異性抗体のプール濾過を行った。

精製プロセスには、それぞれ表１および２に示すアフィニティー分離およびアフィニティー捕捉ステップを含めた。

結果：複数の精製の実施により、９７．１％の平均二重特異性純度が得られ、またウイルス不活化に続く濾過により、９２．８％のＢｓＡｂ１の二重特異性収率であった。約７１．７９ｍＳ／ｃｍから＜２．０ｍＳ／ｃｍへの導電率の低下が可能となった。アフィニティー分離プロセスの溶出ステップで、表１に記載されている塩化ナトリウムの代わりにｐＨ４．４５の５００ｍＭ ＣａＣｌ_２を使用した場合でも、ＢｓＡｂ１について同等の結果が得られた。

実施例２：ＭＥＴ×ＭＥＴ（異なるエピトープ）二重特異性抗体（ＢｓＡｂ２）の精製
ＢｓＡｂ２の精製は、実施例１に記載されるプロセスに従い実施したが、それぞれ表３および４に示されるアフィニティー分離およびアフィニティー捕捉ステップを含めた。

結果：複数の精製の実施により、９６．０％±０．７％の平均二重特異性純度が得られ、またウイルス不活化に続く濾過により、９０．９％のＢｓＡｂ２の二重特異性収率であった。約７０．７５ｍＳ／ｃｍから＜２．０ｍＳ／ｃｍへの導電率の低下が可能となった。

実施例３：ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体（ＢｓＡｂ３）の精製
ＢｓＡｂ３の精製は、実施例１に記載されるプロセスに従い実施したが、それぞれ表５および６に示されるアフィニティー分離およびアフィニティー捕捉ステップを含めた。

結果：複数の精製の実施により、９７．４％±０．５％の平均二重特異性純度が得られ、またウイルス不活化に続く濾過により、９３．４％のＢｓＡｂ３の二重特異性収率であった。約７２．８０ｍＳ／ｃｍから＜２．０ｍＳ／ｃｍへの導電率の低下が可能となった。

実施例４：ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体（ＢｓＡｂ４）の精製
ＢｓＡｂ４の精製は、実施例１に記載されるプロセスに従い実施したが、それぞれ表７および８に示されるアフィニティー分離およびアフィニティー捕捉ステップを含めた。

結果：複数の精製の実施により、９４．６％±１．０％の平均二重特異性純度が得られ、またウイルス不活化に続く濾過により、８６．０％のＢｓＡｂ４の二重特異性収率であった。約７０．７８ｍＳ／ｃｍから＜２．０ｍＳ／ｃｍへの導電率の低下が可能となった

実施例５：ＰＳＭＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体（ＢｓＡｂ５）の精製
ＢｓＡｂ５の精製は、実施例１に記載されるプロセスに従い実施したが、それぞれ表９および１０に示されるアフィニティー分離およびアフィニティー捕捉ステップを含めた。

結果：複数の精製の実施により、９６．１％±０．９％の平均二重特異性純度が得られ、またウイルス不活化に続く濾過により、９２．４％のＢｓＡｂ５の二重特異性収率であった。約７５．０９ｍＳ／ｃｍから＜２．０ｍＳ／ｃｍへの導電率の低下が可能となった。

実施例６：ＣＤ２２×ＣＤ２８二重特異性抗体（ＢｓＡｂ６）の精製
ＢｓＡｂ６の精製は、実施例１に記載されるプロセスに従い実施したが、それぞれ表１１および１２に示されるアフィニティー分離およびアフィニティー捕捉ステップを含めた。

結果：複数の精製の実施により、９６．５％±０．７％の平均二重特異性純度が得られ、またウイルス不活化に続く濾過により、９２．８％のＢｓＡｂ６の二重特異性収率であった。約７１．７８ｍＳ／ｃｍから＜２．０ｍＳ／ｃｍへの導電率の低下が可能となった。

実施例７：アフィニティー脱塩により得られた生成物の、ＵＦＤＦと比較した品質改善
ＢｓＡｂ１（ＣＤ３×ＣＤ２０）の組成物に存在する高分子量（ＨＭＷ）種の測定は、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）の使用ではなく、既存のアフィニティーカラムへの精製されたヘテロ二量体生成物の再アプライを利用することによるさらなる利点を示す。以下の表１３に示すように、既存のアフィニティーカラムに精製された二重特異性抗体を再アプライすると、ＨＭＷ種が０．８８％減少したが、ＵＦＤＦを使用すると、同じ精製された二重特異性抗体のＨＭＷが０．１２％増加した。

本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されるものに加えて本発明の様々な変更が前述の記載から当業者には明らかとなるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。

Claims (43)

1. クロマトグラフィー溶出液から成分を除去する方法であって、
   （ａ）第１のクロマトグラフィーステップの実施であって、前記成分が、クロマトグラフィーカラムにアプライされる第１のバッファー中に存在する、実施と、
   （ｂ）前記第１のクロマトグラフィーステップからの中間溶出液の回収であって、前記中間溶出液がタンパク質生成物と前記成分とを含む、回収と、
   （ｃ）前記クロマトグラフィーカラムへの前記中間溶出液の再アプライ、および前記中間溶出液中の濃度よりも低い濃度で前記成分を含む第２のバッファーによる前記タンパク質生成物の溶出と、
   （ｄ）ステップ（ｃ）からのクロマトグラフィー溶出液の回収であって、前記成分が、前記中間溶出液中の濃度よりも低い濃度で前記クロマトグラフィー溶出液中に存在する、回収と、
   （ｅ）前記クロマトグラフィー溶出液の、後続のプロセスステップへのアプライと、を含む方法。
2. 前記成分が前記第２のバッファーに存在しない、請求項１に記載の方法。
3. 前記成分が塩である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記中間溶出液中の前記塩の濃度が５０ｍＭ超である、請求項３に記載の方法。
5. 前記中間溶出液中の前記塩の濃度が、≧１００ｍＭ、≧２５０ｍＭ、または≧５００ｍＭである、請求項４に記載の方法。
6. 前記第１のクロマトグラフィーステップが、アフィニティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーから選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記後続のプロセスステップが、第２のクロマトグラフィーステップである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記後続のプロセスステップが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはウイルス不活化から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記タンパク質生成物が抗体である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. ヘテロ二量体タンパク質を精製する方法であって、
    （ａ）タンパク質結合リガンドを含むアフィニティーマトリックスへの、ヘテロ二量体タンパク質と不純物の混合物の導入であって、前記ヘテロ二量体タンパク質が、前記タンパク質結合リガンドに対して異なるアフィニティーを有する第１および第２のポリペプチドを含み、少なくとも１つの不純物が前記タンパク質結合リガンドに結合し少なくとも１つの不純物が前記タンパク質結合リガンドに結合しない、導入と、
    （ｂ）２００ｍＭ超の塩濃度および５～９の第１のｐＨを含む第１の洗浄バッファーによる、前記アフィニティーマトリックスの洗浄であって、不純物が除去される、洗浄と、
    （ｃ）２００ｍＭ超の塩濃度および４～５の第２のｐＨを含む第１の溶出バッファーへの、前記アフィニティーマトリックスからの前記ヘテロ二量体タンパク質の溶出および回収であって、第１の溶出液中に精製されたヘテロ二量体タンパク質が得られる、溶出および回収と、
    （ｄ）４未満の第３のｐＨを含む第２の洗浄バッファーによる、前記アフィニティーマトリックスの洗浄であって、不純物が除去される、洗浄と、
    （ｅ）前記アフィニティーマトリックスの、５～９の第４のｐＨへの平衡化と、
    （ｆ）前記第１の溶出液の、５～９のｐＨへの中和、およびそれに続く前記第１の溶出液の前記アフィニティーマトリックスへの再アプライと、
    （ｇ）１００ｍＭ未満の塩を含む第３の洗浄バッファーによる、前記アフィニティーマトリックスの洗浄と、
    （ｈ）第２の溶出液への、前記精製されたヘテロ二量体タンパク質の溶出および回収であって、前記第２の溶出液が１００ｍＭ未満の塩を含む、溶出および回収と、を含む方法。
11. 前記第３の洗浄バッファーが５０ｍＭ未満の塩を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記不純物が、前記第１および第２のポリペプチドのホモ二量体種を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
13. 前記タンパク質結合リガンドがプロテインＡであり、前記アフィニティーマトリックスが、基材に付着された前記プロテインＡリガンドを含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記プロテインＡリガンドが、Ｚドメイン四量体を含む改変されたプロテインＡ、Ｙドメイン四量体を含む改変されたプロテインＡ、またはＤおよびＥドメインを欠く改変されたプロテインＡである、請求項１３に記載の方法。
15. 前記タンパク質結合リガンドがプロテインＧであり、前記アフィニティーマトリックスが、基材に付着された前記プロテインＧリガンドを含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記基材が粒子であり、前記アフィニティーマトリックスが、２５μｍ～１００μｍの平均直径を含む多数の前記粒子を含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記粒子が４０μｍ～６０ｕｍの平均直径を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記粒子が４５μｍ～５５ｕｍの平均直径を含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記粒子が約５０μｍの平均直径を含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記基材が、アガロース、ポリ（スチレンジビニルベンゼン）、ポリメタクリレート、セルロース、細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）および球状シリカのいずれか１つ以上を含む、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記粒子が、約１１００Åの平均直径を有する細孔を含む、請求項１３～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記第１の溶出バッファーが、２５０ｍＭ超の濃度の塩を含む、請求項１０～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記塩濃度が３００ｍＭ超または４００ｍＭ超である、請求項２２に記載の方法。
24. 前記塩濃度が約５００ｍＭである、請求項２３に記載の方法。
25. 前記塩が、（ｉ）Ｃｌ^－、Ｂｒ^－、Ｉ^－、ＮＯ_３ ^－、Ｎ（ＣＨ_３）_４ ^＋、ＮＨ^４＋、Ｃｓ^＋、Ｒｂ^＋、Ｋ^＋、Ｎａ^＋、Ｈ^＋、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ａｌ^３＋を含む塩、（ｉｉ）Ｎａ^＋、Ｈ^＋、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋もしくはＡｌ^３＋と、Ｃｌ^－、Ｂｒ^－、Ｉ^－、ＮＯ_３ ^－、もしくはＣｌＯ_４ ^－との組み合わせ、または（ｉｉｉ）ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２もしくはＮａＣｌ、から選択される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記第２の溶出液が５０ｍＭ未満の塩を含む、請求項１０～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記第２の溶出液が１０ｍＭ未満の塩を含む、請求項２６に記載の方法。
28. 前記精製されたヘテロ二量体タンパク質が、前記第３の洗浄バッファーを介して、前記第２の溶出液に溶出され、回収される、請求項１０～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記第１のポリペプチドが、前記タンパク質結合リガンドに結合できるＣＨ３ドメインを含み、前記第２のポリペプチドが、前記タンパク質結合リガンドに結合できないＣＨ３ドメインを含む、請求項１０～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記第１のポリペプチドが、プロテインＡに結合できるＣＨ３ドメインを含み、前記第２のポリペプチドが、プロテインＡに結合できないＣＨ３ドメインを含む、請求項１０～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記第１のポリペプチドが、プロテインＧに結合できるＣＨ３ドメインを含み、前記第２のポリペプチドが、プロテインＧに結合できないＣＨ３ドメインを含む、請求項１０～２９のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記第２のポリペプチドが、そのＣＨ３ドメインにＨＹからＲＦへの置換を含む、請求項３０に記載の方法。
33. 前記第１のｐＨが６～８である、請求項１０～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記第２のｐＨが４．０～４．２５である、請求項１０～３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記第２のｐＨが４．１０±０．０５である、請求項３４に記載の方法。
36. 前記第３のｐＨが２．８～３．５である、請求項１０～３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 第４のｐＨが６～８である、請求項１０～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. ステップ（ｈ）に続くさらなるクロマトグラフィーステップまたはウイルス不活化ステップをさらに含む、請求項１０～３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記さらなるクロマトグラフィーステップまたはウイルス不活化ステップが、１００ｍＭ未満の塩濃度の条件下で実施される、請求項３８に記載の方法。
40. 前記さらなるクロマトグラフィーステップがイオン交換クロマトグラフィーを包む、請求項３９に記載の方法。
41. 前記イオン交換クロマトグラフィーが陰イオン交換クロマトグラフィーであり、５０ｍＭ未満の塩濃度の条件下で実施される、請求項４０に記載の方法。
42. 前記ヘテロ二量体タンパク質が二重特異性抗原結合性タンパク質である、請求項１０～４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 前記二重特異性抗原結合性タンパク質が二重特異性抗体である、請求項４２に記載の方法。
    

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