CN113993879A - 在多级色谱过程期间去除非期望的组分的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了使用单一色谱基质组合解析捕获过程和亲和捕获过程的高分辨率亲和色谱，所述高分辨率亲和色谱导致了密切相关分子种类之间的提高的分辨率，并且显著提高了异二聚体蛋白(例如双特异性抗体)的大规模商业生产的总产物产率。此外，通过降低盐浓度，与此同时提高产物纯度和浓度，而无需稀释、超滤或渗滤的能力降低了储罐和设备要求。

Description

在多级色谱过程期间去除非期望的组分的方法
技术领域
本发明涉及从用于纯化蛋白质产物(例如通过亲和色谱从复杂的蛋白质混合物中纯化异二聚体蛋白)的色谱工艺物料流中去除非期望的组分的方法。具体而言，所述方法包括通过亲和色谱(包括蛋白质A色谱)从单体和同二聚体的复杂混合物中分离异二聚体(包括双特异性抗体)，其中纯化的异源二聚体收集在低盐和电导率的洗脱液中以促进异二聚体蛋白的进一步下游处理。
背景技术
蛋白质产品的纯化往往需要利用各种色谱步骤去除杂质，例如宿主细胞蛋白质、DNA和非期望种类的蛋白质产品的多级过程。在许多情况下，色谱柱或缓冲液的组分形成了来自每个色谱步骤的洗脱液的一部分，但是这些组分在下游工艺步骤中可能是非期望的。例如，高浓度的盐可用于促进蛋白质产物与杂质或非期望种类的分子的分离，但是盐可能与下游工艺步骤例如附加色谱步骤或病毒灭活不相容。
已经提出了多种双特异性抗体形式，并且所述多种双特异性抗体形式目前正处于开发中。一种此类形式基于具有改进的药代动力学特征和最小免疫原性的标准全人IgG抗体(参见美国专利号8,586,713，所述美国专利的全文以引用方式并入本文)。一条共同轻链和两条不同重链组合以形成双特异性抗体。重链中的一条重链包含减少或消除Fc*与蛋白质A的结合的经取代的Fc序列(下文称为“Fc*”)。例如，一种此类Fc*序列包含CH3结构域中的H435R/Y436F(按照EU编号系统；H95R/Y96F按照IMGT外显子编号系统)取代。两条重链和共同轻链的共表达产生三种产物：所述产物中的两种产物是重链的同二聚体，并且所述产物中的一种产物是期望的异二聚体双特异性产物。由于与高亲和力FcFc重链同二聚体或弱结合Fc*Fc*同二聚体相比对蛋白质A的中等结合亲和力，Fc*序列允许在市售亲和柱上选择性纯化FcFc*双特异性产物。
为了实现双特异性异二聚体的商业规模纯化，需要FcFc同二聚体、Fc*Fc异二聚体和Fc*Fc*同二聚体之间的良好分离度，以及例如待处理材料的体积、纯化过程中所使用的设备和材料的成本和空间要求的考量。
发明内容
在本发明的一个或多个方面或实施方式中，本发明涉及从色谱洗脱液中去除组分的方法，所述方法包括：(a)执行第一色谱步骤，在所述第一色谱步骤中所述组分存在于施加到色谱柱的第一缓冲液中；(b)从第一色谱步骤收集中间洗脱液，其中中间洗脱液含有蛋白质产物和组分；(c)将所述中间洗脱液重新施加到所述色谱柱上，并用第二缓冲液洗脱所述蛋白质产物，所述第二缓冲液含有的组分的浓度低于所述中间洗脱液的所述组分的浓度；(d)收集来自步骤(c)的色谱洗脱液，其中所述组分以低于所述中间洗脱液的所述组分的浓度存在于所述色谱洗脱液中；以及(e)将所述色谱洗脱液应用于后续工艺步骤。在一些实施方式中，所述组分不存在于第二缓冲液中。
在一些实施方式中，所述组分是盐。在一些情况下，中间洗脱液中的盐的浓度大于50mM。在一些情况下，中间洗脱液中盐的浓度≥100mM、≥250mM、≥500mM、≥600mM、≥700mM、≥800mM、≥900mM、或≥1000mM。在一些情况下，中间洗脱液中的盐的浓度是500mM±50mM。
在一些实施方式中，第一色谱步骤选自亲和色谱或离子交换色谱。在一些实施方式中，后续工艺步骤是第二色谱步骤。在一些情况下，后续工艺步骤选自亲和色谱、离子交换色谱、混合模式色谱、疏水相互作用色谱、或病毒灭活。
在一些实施方式中，蛋白质产物是抗体(例如，双特异性抗体)。
在本发明的一个或多个方面和实施方式中，本发明涉及通过采用亲和捕获和洗脱过程从包括同二聚体和异二聚体的复杂蛋白质混合物中纯化异二聚体蛋白例如双特异性抗体的方法。
在一个方面中，本发明提供了一种纯化异二聚体蛋白的方法，所述方法包括：(a)将异二聚体蛋白和杂质的混合物引入含有蛋白质结合配体的亲和基质中，其中所述异二聚体蛋白包含对所述蛋白质结合配体具有不同亲和力的第一和第二多肽，并且其中至少一种杂质结合所述蛋白质结合配体并且至少一种杂质不结合所述蛋白质结合配体；(b)用包含浓度大于200mM的盐和为5至9的第一pH的第一洗涤缓冲液洗涤所述亲和基质以去除杂质；(c)在包含浓度大于200mM的盐和为4至5的第二pH的第一洗脱缓冲液中从亲和基质中洗脱和收集异二聚体蛋白，以获得在第一洗脱液中的纯化的异二聚体蛋白；(d)用包含小于4的第三pH的第二洗涤缓冲液洗涤亲和基质以去除杂质；(e)将亲和基质平衡至为5至9的第四pH；(f)将第一洗脱液中和至为5至9的pH，然后将第一洗脱液重新施加至所述亲和基质；(g)用包含小于100mM盐的第三洗涤缓冲液洗涤亲和基质；以及(h)在第二洗脱液中洗脱并收集纯化的异二聚体蛋白，其中所述第二洗脱液包含小于100mM的盐。在所述方法的多个实施方式中，纯化的异二聚体蛋白是通过第三洗涤缓冲液而被洗脱并收集在第二洗脱液中。在所述方法的一些实施方式中，第三洗涤缓冲液包含小于50mM的盐。
在一些实施方式中，杂质包括同二聚体种类的第一多肽和第二多肽。
在一些实施方式中，蛋白质结合配体是蛋白质A，并且亲和基质包含附着至基底的蛋白质A配体。在一些情况下，蛋白质A配体是包含Z结构域四聚体的工程化的蛋白质A、包含Y结构域四聚体的工程化的蛋白质A、或缺乏D结构域和E结构域的工程化的蛋白质A。在一个实施方式中，蛋白质A配体包含Z结构域四聚体。
在一些实施方式中，蛋白质结合配体是蛋白质G，并且亲和基质包含附着至底物的蛋白质G配体。
在所述方法的各种实施方式中，基底是颗粒并且亲和基质包括平均直径为25μm至100μm的多个颗粒。在一些实施方式中，颗粒的平均直径是40μm至60μm。在一些实施方式中，颗粒的平均直径是45μm至55μm。在一些实施方式中，颗粒的平均直径是约50μm。在一些情况下，颗粒的平均直径是约
Figure BDA0003404580620000031
在各种实施方式中，基底包括琼脂糖、聚(苯乙烯二乙烯基苯)、聚甲基丙烯酸酯、纤维素、可控孔径玻璃和球形二氧化硅中的任何一者或多者。
在所述方法的一些实施方式中，第一洗脱缓冲液包含浓度大于250mM的盐。在一些情况下，盐浓度大于300mM或大于400mM。在一些实施方式中，盐浓度是约500mM。
在所述方法的多个实施方式中，盐选自含有(i)Cl-、Br-、I-、NO3 -、N(CH3)4 +、NH4 +、Cs+、Rb+、K+、Na+、H+、Ca2+、Mg2+、Al3+；或(ii)CaCl2、MgCl2或NaCl的盐。
在所述方法的多个实施方式中，第二洗脱液包含小于50mM的盐。在一些实施方式中，第二洗脱液包含小于10mM的盐。
在所述方法的多个实施方式中，第一多肽包含能够与蛋白质结合配体结合的CH3结构域并且第二多肽包含不能与蛋白质结合配体结合的CH3结构域。在一些实施方式中，第一多肽包含能够结合蛋白质A的CH3结构域并且第二多肽包含不能结合蛋白质A的CH3结构域。在一些实施方式中，第一多肽包含能够结合蛋白质G的CH3结构域并且第二多肽包含不能结合蛋白质G的CH3结构域。在各种实施方式中，第二多肽在其CH3结构域中包含HY至RF取代。
在所述方法的各种实施方式中，第一pH是6至8。在一些实施方式中，第二pH是4.0至4.25。在一些情况下，第二pH是4.10±0.05。在一些实施方式中，第三pH是2.8至3.5。在一些实施方式中，第四pH是6至8。
在一些实施方式中，所述方法进一步包括在低盐(例如，小于100mM、小于50mM或小于25mM)洗脱液中洗脱和收集纯化的异二聚体蛋白之后的附加色谱步骤或病毒灭活步骤。在一些情况下，纯化的组合物的电导率降低至<5.0mS/cm。在一些情况下，纯化的组合物的电导率降低至<2.0mS/cm。在一些实施方式中，附加色谱步骤或病毒灭活步骤在具有小于100mM的盐的条件下执行。在一些情况下，附加色谱步骤包括离子交换色谱。在一些实施方式中，离子交换色谱是阴离子交换色谱并且在具有小于50mM的盐的条件下执行。
在所述方法的多个实施方式中，异二聚体蛋白是双特异性抗原结合蛋白。在一些实施方式中，所述双特异性抗原结合蛋白是双特异性抗体。
在各种实施方式中，上文或本文所讨论的实施方式的特征或组分中的任何特征或组分可组合，并且此类组合涵盖在本公开的范围内。上文或本文所讨论的任何特定值可以与上文或本文所讨论的另一个相关值组合以列举具有表示范围的上端和下端的值的范围，并且此类范围涵盖在本公开的范围内。
附图说明
图1是根据本发明实施方式的纯化过程的图示。
具体实施方式
在描述本发明之前，应当理解的是本发明不限于所描述的具体方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化。还应了解，本文所使用的术语仅用于描述具体实施方式，并且不打算为限制性的，因为本发明的范围将仅受所附权利要求书的限制。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。如本文所用，当用于提及具体所列举的数值时，术语“约”意指数值可以与所引用的值相差不超过1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101以及其之间的所有值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料，但现在描述了优选的方法和材料。本说明书中提及的所有专利、申请和非专利出版物均通过引用整体并入本文。
综述
本发明至少部分地基于以下发现：将含有纯化的异二聚体蛋白(例如，双特异性抗体)的经中和洗脱液重新施加至用于纯化蛋白质的相同亲和基质可显著提高总产物产率并最小化高分子量物质的存在，与此同时降低成本和用于大规模商业制造的纯化系统的占地面积。大规模制造和纯化治疗性双特异性抗体的材料和空间成本考量是重要的问题。色谱柱在多个过程中的重复使用使柱材料(例如，色谱介质或树脂)的成本以及获得所需产物所需的设备所占据的空间两者最小化。先前已经描述了通过亲和色谱纯化双特异性抗体，但是这些过程通常使用两个单独的亲和柱(例如，MabSelect SuReTM和MabCapture ATM)并依靠超滤/渗滤或耐盐多峰树脂从亲和色谱工艺步骤中去除盐。本发明人已经发现，通过对两个亲和色谱处理步骤利用单个柱，可以显著提高总产物产率(与当使用两个单独柱时约77％的平均值相比，显著提高至约92％的平均值)，并且无需超滤或渗滤即可去除用于实现异二聚体与同二聚体杂质的稳健分离的盐，从而降低成本和空间考量，与此同时为附加色谱或其他精制步骤提供产物流，而无需昂贵的耐盐材料。
定义
如本文所用的术语“抗体”包含由四条多肽链，即通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链组成的免疫球蛋白分子。每条重链包括重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包括轻链可变区(在本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域CL。VH区和VL区可以被进一步细分成被称作互补决定区(CDR)的高变区，其间散布着更保守的被称作构架区(FR)的区。每个VH和VL由从氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(重链CDR可缩写为HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链CDR可缩写为LCDR1、LCDR2和LCDR3)。术语“高亲和力”抗体是指如通过表面等离子体共振(例如，BIACORETM或溶液亲和ELISA)测量的对其靶标的结合亲和力为至少10-9M、至少10-1M；至少10-11M；或至少10-12M的那些抗体。
短语“双特异性抗体”包括能够选择性结合两个或更多个表位的抗体。双特异性抗体通常包含两条不同的重链，其中每条重链特异性结合不同的表位—在两个不同分子(例如，抗原)上或在同一分子上(例如，在同一抗原上)。如果双特异性抗体能够选择性结合两个不同的表位(第一表位和第二表位)，则第一重链对第一表位的亲和力通常会比第一重链对第二表位的亲和力低至少一到两个或三个或四个数量级，反之亦然。由双特异性抗体识别的表位可以在同一或不同的靶标上(例如，在同一或不同的蛋白质上)。例如，可以通过组合识别同一抗原的不同表位的重链来制备双特异性抗体。例如，编码识别同一抗原的不同表位的重链可变序列的核酸序列可以与编码不同重链恒定区的核酸序列融合，并且此类序列可以在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达。典型的双特异性抗体具有两条重链，每条重链具有三个重链CDR之后是(N末端至C末端)CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域；以及免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链不赋予抗原结合特异性但可以与每条重链缔合，或者可以与每条重链缔合并且可以结合由重链抗原结合区结合的表位中的一个或多个表位，或者可以与每条重链缔合并且使得能够将重链中的一条或两条重链与一个或两个表位结合。
在本文所讨论的方法的各种实施方式中，异二聚体蛋白、双特异性抗体、含Fc的蛋白质等可以是同种型IgG。在一些情况下，异二聚体蛋白、双特异性抗体、含Fc的蛋白质等属于同种型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些情况下，异二聚体蛋白、双特异性抗体、含Fc的蛋白质等是同种型IgG1。在一些情况下，异二聚体蛋白、双特异性抗体、含Fc的蛋白质等是同种型IgG4。在各种实施方式中，异二聚体蛋白、双特异性抗体、含Fc的蛋白质等是完全人的。
短语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括来自任何生物体的免疫球蛋白重链恒定区序列，并且除非另有说明，否则包括重链可变结构域。除非另有说明，否则重链可变结构域包括三个重链CDR和四个FR区。重链的片段包括CDR、CDR和FR，以及它们的组合。典型的重链在可变结构域之后具有(从N末端至C末端)CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域。重链的功能片段包括能够特异性识别抗原(例如，以微摩尔、纳摩尔或皮摩尔范围内的KD识别抗原)、能够表达和从细胞分泌，并且包含至少一个CDR的片段。
短语“轻链”包括来自任何生物体的免疫球蛋白轻链恒定区序列，并且除非另有说明，否则包括人κ和λ轻链。除非另有说明，否则轻链可变(VL)结构域通常包括三个轻链CDR和四个构架(FR)区。通常，全长轻链从氨基末端至羧基末端包括包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的VL结构域和轻链恒定结构域。可用于本发明的轻链包括例如不选择性结合由抗原结合蛋白选择性结合的第一或第二抗原的轻链。合适的轻链包括可以通过筛选现有抗体文库(湿文库或计算机模拟)中最常用的轻链来鉴定的轻链，其中所述轻链基本上不干扰抗原结合蛋白的抗原结合结构域的亲和力和/或选择性。合适的轻链包括能够结合由抗原结合蛋白的抗原结合区结合的一个或两个表位的轻链。
短语“可变结构域”包括免疫球蛋白轻链或重链的氨基酸序列(根据需要进行修饰)，所述氨基酸序列按从N末端至C末端的顺序(除非另有说明)包含以下氨基酸区域：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。“可变结构域”包括能够折叠成具有双重β折叠结构的规范结构域(VH或VL)的氨基酸序列，其中β折叠通过第一β折叠的残基与第二β折叠的残基之间的二硫键连接。
短语“互补决定区”或术语“CDR”包括由生物体的免疫球蛋白基因的核酸序列编码的氨基酸序列，所述氨基酸序列通常(即，在野生型动物中)出现在免疫球蛋白分子(例如，抗体或T细胞受体)的轻链或重链的可变区中的两个构架区之间。CDR可以由例如种系序列或重排或未重排的序列，并且例如由初始或成熟的B细胞或T细胞编码。在一些情况下(例如，对于CDR3)，CDR可由两个或更多个不连续(例如，在未重排的核酸序列中)但在B细胞核酸序列中连续(例如，作为剪接或连接序列的结果(例如，V-D-J重组以形成重链CDR3))的序列(例如，种系序列)编码。
短语“含Fc的蛋白质”包括抗体、双特异性抗体、异二聚体蛋白和免疫粘附素，以及包含至少免疫球蛋白CH2和CH3区的功能部分的其他结合蛋白。“功能部分”是指可结合Fc受体(例如，FcγR；或FcRn，即新生儿Fc受体)和/或可参与补体激活的CH2和CH3区域。如果CH2区和CH3区包含使其无法结合任何Fc受体并且也无法激活补体的缺失、取代和/或插入或其他修饰，则CH2区和CH3区不是功能性的。
含Fc的蛋白质可包含免疫球蛋白结构域中的修饰，包括其中修饰影响结合蛋白的一种或多种效应子功能的情况(例如，影响FcγR结合、FcRn结合并因此影响半衰期和/或CDC活性的修饰)。参考免疫球蛋白恒定区的EU编号，此类修饰包括但不限于以下修饰以及它们的组合：238、239、248、249、250、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、297、298、301、303、305、307、308、309、311、312、315、318、320、322、324、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、398、414、416、419、428、430、433、434、435、437、438和439。
举例而言但并非限制，结合蛋白是含Fc的蛋白质并且表现出增强的血清半衰期(与没有所述修饰的相同含Fc的蛋白质相比)并且具有在250(例如，E或Q)；250和428(例如，L或F)；252(例如，L/Y/F/W或T)、254(例如，S或T)和256(例如，S/R/Q/E/D或T)位处的修饰；或在428和/或433(例如，L/R/SI/P/Q或K)和/或434(例如，H/F或Y)位处的修饰；或在250和/或428位处的修饰；或在307或308(例如，308F、V308F)和434位处的修饰。在另一示例中，修饰可包括428L(例如，M428L)和434S(例如，N434S)修饰；428L、259I(例如，V259I)和308F(例如，V308F)修饰；433K(例如，H433K)和434(例如，434Y)修饰；252、254和256(例如，252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如，T250Q和M428L)；307和/或308修饰(例如，308F或308P)。
术语“星号取代”、“Fc*”和“HC*”包括在CH3结构域内含有消除与蛋白质A的结合的序列的任何分子、免疫球蛋白重链、Fc片段、含Fc的分子、异二聚体蛋白等。在US8,586,713中讨论了可以减少或消除蛋白质A在CH3结构域中的结合的特定修饰，例如H95R和Y96F。这种二肽突变被称为“星号取代”。
术语“细胞”包括任何适合于表达重组核酸序列的细胞。细胞包括原核生物和真核生物(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillusspp.)、链霉菌属(Streptomyces spp.)等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如、酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、甲醇毕赤酵母(P.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人动物细胞、人类细胞、或细胞融合体(例如，杂交瘤或四重杂交瘤(quadromas))。在一些实施方式中，细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方式中，细胞是真核细胞并且选自以下细胞：CHO(例如，CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如，COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾脏(例如，HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60(例如，BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT060562、塞尔托利氏细胞(Sertoli cell)、BRL3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞、以及来源于上述细胞的细胞系。在一些实施方式中，细胞包含一种或多种病毒基因，例如，表达病毒基因的视网膜细胞(例如，PER.C6TM细胞)。
短语“流动相改性剂”包括降低蛋白质之间的非特异性(即，非亲和性)离子和其他非共价相互作用的影响或破坏所述相互作用的部分。“流动相改性剂”包括例如盐、I族和II族金属与乙酸盐、碳酸氢盐、碳酸盐、卤素(例如，氯化物或氟化物)、硝酸盐、磷酸盐或硫酸盐的离子组合。“流动相改性剂”的非限制性说明性列表包括乙酸铍、乙酸锂、乙酸钠和乙酸钾；碳酸氢钠和碳酸氢钾；碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾和碳酸铯；氯化锂、氯化钠、氯化钾、氯化铯和氯化镁；氟化钠和氟化钾；硝酸钠、硝酸钾和硝酸钙；磷酸钠和磷酸钾；以及硫酸钙和硫酸镁。
“流动相改性剂”还包括离液剂，所述离液剂减弱或以其他方式干扰非共价力并增加生物分子系统内的熵。离液剂的非限制性示例包括丁醇、氯化钙、乙醇、盐酸胍、高氯酸锂、乙酸锂、氯化镁、苯酚、丙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲和尿素。离液剂包括影响蛋白质溶解度的盐。更离液的阴离子包括例如氯离子、硝酸根、溴离子、氯酸根、碘离子、高氯酸根和硫氰酸根。更离液的阳离子包括例如锂、镁、钙和胍。
“流动相改性剂”包括影响离子或其他非共价相互作用的那些部分，所述部分在添加到pH梯度或步骤时，或在“流动相改性剂”中的蛋白质A支持物平衡并应用pH步骤或梯度时，导致同二聚体IgG和异二聚体IgG(例如，野生型人IgG和相同的但带有如本文所述的CH3结构域的一个或多个修饰的IgG)的洗脱之间的pH单位距离加宽。“流动相改性剂”的合适浓度可以通过采用相同的色谱柱、pH步骤或梯度的其浓度来确定，其中增加“流动相改性剂”的浓度，直到在给定的pH步骤或pH梯度下达到最大pH距离。“流动相改性剂”还可包括非极性改性剂，包括例如丙二醇、乙二醇等。
如本文所用，“亲和色谱”是一种利用生物分子之间特定的、可逆的相互作用而不是生物分子的一般特性(例如等电点、疏水性或大小)来实现色谱分离的色谱方法。“蛋白质A亲和色谱”或“蛋白质A色谱”是指利用蛋白质A的IgG结合结构域对免疫球蛋白分子的Fc部分的亲和力的特定亲和色谱方法。该Fc部分包含人或动物免疫球蛋白恒定结构域CH2和CH3或与这些基本上相似的免疫球蛋白结构域。蛋白质A包括来自金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞壁的天然蛋白、通过重组或合成方法产生的蛋白质A、以及保留与Fc区结合能力的变体。在实践中，蛋白质A色谱涉及使用固定至固体支持物的蛋白质A。参见Gagnon,Protein AAffinity Chromotography,Purification Tools forMonoclonal Antibodies，第155-198页，Validated Biosystems,1996。蛋白质G和蛋白质L也可用于亲和色谱。固体支持物是蛋白质A粘附至的非水性基质。此类载体包括琼脂糖(agarose)、琼脂糖凝胶(sepharose)、玻璃、二氧化硅、聚苯乙烯、硝化纤维、活性炭、砂、纤维素和任何其他合适的材料。此类材料是在本领域中众所周知的。可以使用任何合适的方法将第二蛋白质附着至固体支持物。将蛋白质附着至合适的固体支持物的方法是本领域中众所周知的。参见例如Ostrove，Guide to Protein Purification,Methods inEnzymology,182:357-371,1990。此类带有和不带有固定的蛋白质A的固体支持物可从许多商业来源轻易获得，所述商业来源包括诸如Vector Laboratory(Burlingame,Calif.)、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,Calif.)、BioRad(Hercules,Calif.)、AmershamBiosciences(GE Healthcare的部分，Uppsala,Sweden)、Pall(Port Washington,NY)和EMD-Millipore(Billerica,Mass.)。固定至孔径玻璃基质的蛋白质A可作为
Figure BDA0003404580620000091
(Millipore)商购获得。固相也可以是基于琼脂糖的基质。固定在琼脂糖基质上的蛋白质A可作为MABSELECTTM(Amersham Biosciences)商购获得。
亲和色谱还包括可用于选择性结合并因此纯化抗体、抗体片段、或包含免疫球蛋白结构域和/或序列的嵌合融合蛋白的介质。抗体包括IgG型、IgA型、IgM型、IgY型、IgD型和IgE型。抗体还包括单链抗体，例如骆驼抗体、工程化的骆驼抗体、单链抗体、单结构域抗体、纳米抗体等。抗体片段包括VH序列、VL序列、CL序列、CH序列。包含抗体序列的抗体片段和融合蛋白包括例如F(ab’)3、F(ab’)2、Fab、Fc、Fv、dsFv、(scFv)2、scFv、scAb、微型抗体、双抗体、三体抗体、四体抗体、Fc融合蛋白、捕获分子等(参见Ayyar等人，Methods56(2012):116-129)。此类亲和色谱介质可包含选择性结合抗体、它们的片段、以及包含这些片段的融合蛋白的配体。此类配体包括抗体结合蛋白、细菌来源的受体、抗原、凝集素或针对靶分子的抗抗体。所述抗体需要纯化。例如，针对IgG-CH1、IgG-Fc、IgG-CH3、IgG1、LC-κ、LC-λ、IgG3/4、IgA、IgM等中的任何一者或多者的骆驼科动物来源的亲和配体可用作亲和配体(作为CAPTURESELECT色谱树脂市售，Life Technologies,Inc.,Carlsbad,Calif.)
从纯化物料流中去除非期望的组分的方法
本发明方法的实施方式包括从工艺物料流中去除非期望的组分以纯化蛋白质产物的方法。所述方法旨在从色谱步骤产生的洗脱液中去除可能对下游工艺步骤有害的一种或多种组分(例如，化学组分或盐)。在一些实施方式中，所述方法包括(a)进行第一色谱步骤，其中所述组分存在于施加至色谱柱的第一缓冲液中；(b)从第一色谱步骤收集中间洗脱液，其中所述中间洗脱液含有蛋白质产物和所述组分；(c)将中间洗脱液重新施加至色谱柱，并用第二缓冲液洗脱蛋白质产物，所述第二缓冲液含有的所述组分的浓度低于所述中间洗脱液的所述组分的浓度；(d)收集来自步骤(c)的色谱洗脱液，其中所述组分以低于中间洗脱液的所述组分的浓度存在于色谱洗脱液中；以及(e)将色谱洗脱液应用于后续工艺步骤。在一些实施方式中，所述组分不存在于第二缓冲液中。
如以下结合用于纯化异二聚体蛋白的方法更详细地讨论的，在一些实施方式中，所述组分是盐。在一些情况下，中间洗脱液中的盐的浓度大于50mM。在一些情况下，中间洗脱液中盐的浓度≥100mM、≥150mM、≥200mM、≥250mM、≥300mM、≥350mM、≥400mM、≥450mM、≥500mM、≥600mM、≥700mM、≥800mM、≥900mM、或≥1000mM。在一些情况下，中间洗脱液中的盐的浓度是500mM±50mM。在一些实施方式中，中间洗脱液中的盐的浓度是250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM、550mM、或600mM，其中每个值包括±10％的变化。
在一些实施方式中，第一色谱步骤选自亲和色谱或离子交换色谱。在一些实施方式中，后续工艺步骤是第二色谱步骤。在一些情况下，后续工艺步骤选自亲和色谱、离子交换色谱、混合模式色谱、或病毒灭活。在一些情况下，本文所讨论的方法可以在两个离子交换步骤之间利用，其中第一离子交换步骤将池的电导率增加到高于随后的离子交换步骤可以充分执行的电导率的上限。在一些情况下，本文所讨论的方法可以在两个色谱步骤之间利用，其中第一步骤引入了化学组分，所述化学组分必须被去除以便后续色谱步骤充分执行。在一些情况下，本文所讨论的方法可以在病毒过滤之前利用以降低电导率并由此提高过滤性能并减少运行时间。在一些情况下，本文所讨论的方法可以在混合模式色谱法(MMC)之前利用，以去除干扰或降解MMC介质的化学组分。例如，希望从与陶瓷羟磷灰石不相容的物料流中去除柠檬酸盐。
在一些实施方式中，蛋白质产物是抗体(例如，双特异性抗体)。
纯化异二聚体蛋白的方法
本发明方法的实施方式包括图1所示的步骤。例如，纯化异二聚体蛋白的方法包括(a)将异二聚体蛋白和杂质的混合物加载到亲和基质上，(b)用pH为5-8并且盐浓度大于200mM的第一洗涤缓冲液洗涤亲和基质，(c)用pH为4-5并且盐浓度大于200mM的第一洗脱缓冲液洗脱和收集异二聚体蛋白，(d)用pH小于4的第二洗涤缓冲液洗涤亲和基质，(e)将亲和基质平衡至为5-9的pH，(f)将含有异二聚体蛋白的洗脱液中和至为5-9的pH并将经中和的洗脱液重新施加至所述亲和基质，(g)用含有少于100mM盐的第三洗涤缓冲液洗涤亲和基质，以及(h)在含有少于100mM盐的洗脱液中洗脱和收集异二聚体蛋白。在一些实施方式中，所述方法进一步包括初始平衡步骤，其中将亲和基质平衡至为5-9的pH。在一些实施方式中，所述方法进一步包括在用第一洗涤缓冲液洗涤之后，但在洗脱和收集异二聚体蛋白之前，用含有小于100mM盐的洗涤缓冲液洗涤亲和基质。
在各种实施方式中，将异二聚体蛋白和杂质的混合物装载到亲和基质上包括从一个或多个生物反应器装载澄清的细胞培养物，所述生物反应器含有表达编码异二聚体蛋白的核苷酸序列的细胞。例如，所述细胞可以表达编码形成双特异性抗体(例如，CD3xCD20双特异性抗体、其中两条臂结合不同的MET表位的METxMET双特异性抗体、CD3xBCMA双特异性抗体、CD22xCD28双特异性抗体、PSMAxCD28双特异性抗体、CD3xPSMA双特异性抗体、CD3xMUC16双特异性抗体、CD3xSTEAP2双特异性抗体等)的重链和轻链中的每一者的核苷酸。在一些情况下，双特异性抗体的抗原结合臂中的每个抗原结合臂包含共同轻链。澄清的细胞培养物将包括异二聚体蛋白(例如，双特异性抗体)，以及诸如同二聚体种类、宿主细胞蛋白质和DNA的杂质。在一些情况下，异二聚体蛋白可以在真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生。
在一些实施方式中，加载到亲和基质上的混合物包括含有以下物质的混合物：(i)包含第一多肽的两个拷贝的第一同二聚体，(ii)包含第一多肽和第二多肽的异二聚体，以及(iii)包含第二多肽的两个拷贝的第二同二聚体。第一多肽和第二多肽对亲和基质具有不同的亲和力，使得第一同二聚体、异二聚体和第二同二聚体可以基于与亲和基质的差异结合而分离。与亲和基质的差异结合尤其可以通过改变经过亲和基质的溶液的pH和/或离子强度来操纵。
在各种实施方式中，在下文或本文结合任何缓冲液或洗脱液(或其他方面)所讨论的盐是包含Cl-、Br-、I-、NO3 -、N(CH3)4 +、NH4 +、Cs+、Rb+、K+、Na+、H+、Ca2+、Mg2+或Al3+的盐。在一些实施方式中，盐包含Na+、H+、Ca2+、Mg2+或Al3+。在一些实施方式中，盐包含Cl-、Br-、I-、NO3 -或ClO4 -。在一些实施方式中，盐包含Na+、H+、Ca2+、Mg2+或Al3+与Cl-、Br-、I-、NO3 -或ClO4 -的组合。在一些实施方式中，盐选自CaCl2、MgCl2或NaCl。在一些实施方式中，盐是NaCl。在一些实施方式中，盐是CaCl2。在一些实施方式中，盐是MgCl2。
在装载澄清的细胞培养物后，用包含大于200mM的盐和为5至9的pH的洗涤缓冲液(图1的第一洗涤缓冲液)洗涤亲和基质。在一些情况下，洗涤缓冲液的pH是6至8。在一些情况下，洗涤缓冲液的pH是约7至约7.5。在各种实施方式中，洗涤缓冲液的pH是5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、或9.0或是约5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、或9.0。在一些实施方式中，洗涤缓冲液的pH是7.2或是约7.2。在各种实施方式中，缓冲液可以是能够将pH保持在所需点或所需范围内的任何缓冲液。在各种实施方式中，缓冲液浓度可以是约5mM至约100mM。在一些情况下，缓冲液浓度是约5mM至约15mM。在一些情况下，缓冲液浓度是约5mM至约50mM。在一些情况下，缓冲液浓度是约10mM至约25mM。在一些情况下，缓冲液浓度是约20mM至约40mM。在一些情况下，缓冲液浓度是约30mM至约50mM。在各种实施方式中，缓冲液浓度是5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、38mM、39mM、40mM、41mM、42mM、43mM、44mM、45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、或50mM，或是约5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、38mM、39mM、40mM、41mM、42mM、43mM、44mM、45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、或50mM。在一些实施方式中，洗涤缓冲液浓度是10mM或是约10mM。在一些实施方式中，洗涤缓冲液浓度是40mM或是约40mM。在一些实施方式中，洗涤缓冲液是磷酸钠。
在一些情况下，洗涤缓冲液包含浓度为约200mM至约800mM的盐。在一些情况下，洗涤缓冲液包含浓度为约250mM至约750mM的盐。在一些情况下，洗涤缓冲液包含浓度为约300mM至约700mM的盐。在一些情况下，洗涤缓冲液包含浓度为约350mM至约650mM的盐。在一些情况下，洗涤缓冲液包含浓度为约400mM至约600mM的盐。在一些情况下，洗涤缓冲液包含浓度为约450mM至约550mM的盐。在一些情况下，洗涤缓冲液包含浓度为200mM、210、mM、220mM、225mM、230mM、240mM、250mM、260mM、270mM、275mM、280mM、290mM、300mM、310mM、320mM、325mM、330mM、340mM、350mM、360mM、370mM、375mM、380mM、390mM、400mM、410mM、420mM、425mM、430mM、440mM、450mM、460mM、470mM、475mM、480mM、490mM、500mM、510mM、520mM、525mM、530mM、540mM、550mM、560mM、570mM、575mM、580mM、590mM、600mM、610mM、620mM、625mM、630mM、640mM、650mM、660mM、670mM、675mM、680mM、690mM、700mM、710mM、720mM、725mM、730mM、740mM、750mM、760mM、770mM、780mM、790mM或800mM，或约200mM、210、mM、220mM、225mM、230mM、240mM、250mM、260mM、270mM、275mM、280mM、290mM、300mM、310mM、320mM、325mM、330mM、340mM、350mM、360mM、370mM、375mM、380mM、390mM、400mM、410mM、420mM、425mM、430mM、440mM、450mM、460mM、470mM、475mM、480mM、490mM、500mM、510mM、520mM、525mM、530mM、540mM、550mM、560mM、570mM、575mM、580mM、590mM、600mM、610mM、620mM、625mM、630mM、640mM、650mM、660mM、670mM、675mM、680mM、690mM、700mM、710mM、720mM、725mM、730mM、740mM、750mM、760mM、770mM、780mM、790mM或800mM的盐。在一些实施方式中，洗涤缓冲液的盐浓度是500mM或是约500mM。在一些实施方式中，洗涤缓冲液包含约500mM的NaCl。在一些情况下，亲和基质的这种洗涤去除了未结合的杂质，例如宿主细胞蛋白质、DNA和对亲和基质材料(例如，蛋白质A)几乎没有或没有亲和性的同二聚体物质。
在一些实施方式中，所述方法包括在异二聚体蛋白洗脱之前使用包含很少(<25mM)或不含盐并且pH为5至9的洗涤缓冲液的任选第二次洗涤。在一些实施方式中，该洗涤缓冲液包含约10mM至约50mM的Tris[三(羟甲基)氨基甲烷]]、磷酸钠或乙酸钠，或它们的组合。在各种实施方式中，所述洗涤缓冲液的pH值等于上述第一洗涤缓冲液的pH。
在上述一次或多次洗涤之后，异二聚体蛋白在洗脱缓冲液(图1的第一洗脱缓冲液)中从亲和基质洗脱并收集在洗脱液中。洗脱缓冲液具有为约4至约5的pH，并且包括浓度大于200mM的盐。在一些实施方式中，洗脱缓冲液的pH是约4.0至约4.2。在一些实施方式中，洗脱缓冲液的pH是约4.4至约4.6。在各种实施方式中，洗脱缓冲液的pH是4.0、4.05、4.1、4.15、4.2、4.25、4.3、4.35、4.4、4.45、4.5、4.55、4.6、4.65、4.7、4.75、4.8、4.85、4.9、4.95或5.0，或约4.0、4.05、4.1、4.15、4.2、4.25、4.3、4.35、4.4、4.45、4.5、4.55、4.6、4.65、4.7、4.75、4.8、4.85、4.9、4.95或5.0。在一些实施方式中，洗脱缓冲液的pH是4.1。在一些实施方式中，洗脱缓冲液的pH是4.55。在各种实施方式中，缓冲液可以是能够将pH保持在所需点或所需范围内的任何缓冲液。在各种实施方式中，缓冲液浓度可以是约5mM至约100mM。在一些情况下，缓冲液浓度是约25mM至约55mM。在一些情况下，缓冲液浓度是约30mM至约50mM。在各种实施方式中，缓冲液浓度是30mM、31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、38mM、39mM、40mM、41mM、42mM、43mM、44mM、45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、或50mM，或是约30mM、31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、38mM、39mM、40mM、41mM、42mM、43mM、44mM、45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、或50mM。在一些实施方式中，洗脱缓冲液浓度是40mM或是约40mM。在一些实施方式中，洗脱缓冲液是乙酸。在一些实施方式中，洗脱缓冲液是乙酸盐。
在一些情况下，洗脱缓冲液包含浓度为约200mM至约800mM的盐。在一些情况下，洗脱缓冲液包含浓度为约250mM至约750mM的盐。在一些情况下，洗脱缓冲液包含浓度为约300mM至约700mM的盐。在一些情况下，洗脱缓冲液包含浓度为约350mM至约650mM的盐。在一些情况下，洗脱缓冲液包含浓度为约400mM至约600mM的盐。在一些情况下，洗脱缓冲液包含浓度为约450mM至约550mM的盐。在一些情况下，洗脱缓冲液包含浓度为200mM、210、mM、220mM、225mM、230mM、240mM、250mM、260mM、270mM、275mM、280mM、290mM、300mM、310mM、320mM、325mM、330mM、340mM、350mM、360mM、370mM、375mM、380mM、390mM、400mM、410mM、420mM、425mM、430mM、440mM、450mM、460mM、470mM、475mM、480mM、490mM、500mM、510mM、520mM、525mM、530mM、540mM、550mM、560mM、570mM、575mM、580mM、590mM、600mM、610mM、620mM、625mM、630mM、640mM、650mM、660mM、670mM、675mM、680mM、690mM、700mM、710mM、720mM、725mM、730mM、740mM、750mM、760mM、770mM、780mM、790mM或800mM，或约200mM、210、mM、220mM、225mM、230mM、240mM、250mM、260mM、270mM、275mM、280mM、290mM、300mM、310mM、320mM、325mM、330mM、340mM、350mM、360mM、370mM、375mM、380mM、390mM、400mM、410mM、420mM、425mM、430mM、440mM、450mM、460mM、470mM、475mM、480mM、490mM、500mM、510mM、520mM、525mM、530mM、540mM、550mM、560mM、570mM、575mM、580mM、590mM、600mM、610mM、620mM、625mM、630mM、640mM、650mM、660mM、670mM、675mM、680mM、690mM、700mM、710mM、720mM、725mM、730mM、740mM、750mM、760mM、770mM、780mM、790mM或800mM的盐。在一些实施方式中，洗脱缓冲液的盐浓度是500mM或是约500mM。在一些实施方式中，洗脱缓冲液包含约500mM的NaCl。在一些实施方式中，洗脱缓冲液包含约500mM的CaCl2。在一些实施方式中，洗脱缓冲液包含约500mM的MgCl2。
在从亲和基质中洗脱和收集异二聚体蛋白后，用pH小于约4的洗涤缓冲液(图1的第二洗涤缓冲液)洗涤亲和基质。在一些实施方式中，洗涤缓冲液的pH是约2.5至约3.5。在一些实施方式中，洗涤缓冲液的pH是3.0±0.2。在各种实施方式中，洗涤缓冲液的pH是2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8或3.9，或是约2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8或3.9。洗涤缓冲液可包含任何合适的材料以提供上述pH或pH范围。在一些实施方式中，洗涤缓冲液包含浓度为约20mM至约60mM的乙酸。在一些实施方式中，洗涤缓冲液包含浓度为约30mM至约50mM的乙酸。在一些情况下，洗涤缓冲液包含约40mM的乙酸。在一些情况下，亲和基质的这种洗涤去除了先前结合的杂质，例如与异二聚体蛋白相比对亲和基质材料(例如，蛋白质A)具有更大亲和力的同二聚体物质。在一些情况下，本发明的方法还可包括用与上面讨论过的洗涤缓冲液相比包含更低pH(例如2.45±0.2)和更高浓度缓冲材料(例如，500mM乙酸)的缓冲液对亲和基质进行进一步洗涤。
在用上述洗涤(或多次洗涤)去除附加杂质后，将亲和基质重新平衡至为5至9的pH。在各种实施方式中，将亲和基质平衡至为5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、或9.0或是约5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、或9.0的pH。在一些实施方式中，将亲和基质平衡至为约7.2的pH。可以使用具有所需pH的平衡缓冲液执行平衡。在各种实施方式中，缓冲液可以是能够将pH保持在所需点或所需范围内的任何缓冲液。在各种实施方式中，缓冲液浓度可以是约5mM至约100mM。在一些情况下，缓冲液浓度是约10mM至约30mM。在一些情况下，缓冲液浓度是约30mM至约50mM。在一些情况下，缓冲液浓度是约40mM至约60mM。在各种实施方式中，缓冲液浓度是10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、38mM、39mM、40mM、41mM、42mM、43mM、44mM、45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM、56mM、57mM、58mM、59mM或60mM，或是约10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、38mM、39mM、40mM、41mM、42mM、43mM、44mM、45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM、56mM、57mM、58mM、59mM或60mM。在一些实施方式中，缓冲液浓度是20mM或是约20mM。在一些实施方式中，缓冲液浓度是40mM或是约40mM。在一些实施方式中，缓冲液浓度是50mM或是约50mM。在一些实施方式中，缓冲剂是磷酸钠。在一些实施方式中，缓冲液包含约10mM至约50mM的Tris、磷酸钠或乙酸盐，或它们的组合。
在平衡亲和基质后，在为5至9的pH将含有异二聚体蛋白(现在从同二聚体污染物和其他杂质中纯化出来)的经中和的洗脱液重新施加至与上述纯化过程步骤中使用的相同的亲和基质。在各种实施方式中，在为5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、或9.0或为约5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、或9.0的pH，将经中和的洗脱液重新施加至亲和基质。在一些实施方式中，pH是7.2或是约7.2。
在将经中和的洗脱液重新施加至亲和基质之后，用中性pH并且盐浓度小于100mM的洗涤缓冲液(图1的第三洗涤缓冲液)洗涤基质。通常，该洗涤缓冲液的pH将与重新施加至亲和基质的经中和的洗脱液的pH密切对应，如上所述。在各种实施方式中，所述洗涤缓冲液的盐浓度将是约0mM至约100mM、约0mM至约75mM、约0mM至约50mM、约0mM至约25mM，或约0mM至约10mM。在各种实施方式中，所述洗涤缓冲液的盐浓度是99mM、95mM、90mM、85mM、80mM、75mM、70mM、65mM、60mM、55mM、50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM或更小，或是约99mM、95mM、90mM、85mM、80mM、75mM、70mM、65mM、60mM、55mM、50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM或更小，是或0mM。在各种实施方式中，缓冲液可以是能够将pH保持在所需点或所需范围内的任何缓冲液。在各种实施方式中，缓冲液浓度可以是约5mM至约100mM。在一些情况下，缓冲液浓度是约10mM至约30mM。在一些情况下，缓冲液浓度是约30mM至约50mM。在一些情况下，缓冲液浓度是约40mM至约60mM。在各种实施方式中，缓冲液浓度是10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、38mM、39mM、40mM、41mM、42mM、43mM、44mM、45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM、56mM、57mM、58mM、59mM或60mM，或是约10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、38mM、39mM、40mM、41mM、42mM、43mM、44mM、45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM、56mM、57mM、58mM、59mM或60mM。在一些实施方式中，洗涤缓冲液浓度是20mM或是约20mM。在一些实施方式中，洗涤缓冲液浓度是40mM或是约40mM。在一些实施方式中，洗涤缓冲液浓度是50mM或是约50mM。在一些实施方式中，洗涤缓冲液是磷酸钠。在一些实施方式中，该洗涤缓冲液包含约10mM至约50mM的Tris、磷酸钠或乙酸盐，或它们的组合。
在上述洗涤之后，将纯化的异二聚体蛋白从亲和基质洗脱并收集在含有小于约100mM的盐的洗脱液中。在各种实施方式中，洗脱液的盐浓度是99mM、95mM、90mM、85mM、80mM、75mM、70mM、65mM、60mM、55mM、50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM或更小，或是约99mM、95mM、90mM、85mM、80mM、75mM、70mM、65mM、60mM、55mM、50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM或更小，是或0mM。通常，异二聚体蛋白的洗脱是用pH小于约4的缓冲液执行的。在一些实施方式中，洗脱缓冲液的pH是约2.5至约3.5。在一些实施方式中，洗脱缓冲液的pH是3.0±0.2。在各种实施方式中，洗脱缓冲液的pH是2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8或3.9，或是约2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8或3.9。洗脱缓冲液可包含任何合适的材料以提供上述pH或pH范围。在一些实施方式中，洗脱缓冲液包含浓度为约20mM至约60mM的乙酸。在一些实施方式中，洗脱缓冲液包含浓度为约30mM至约50mM的乙酸。在一些情况下，洗脱缓冲液包含约40mM的乙酸。
在各种实施方式中，从澄清的细胞培养物或从含有异二聚体蛋白的经中和的洗脱液加载亲和基质可包括添加含有高达约75g/L的亲和基质树脂的材料。在各种实施方式中，亲和基质装载有小于或等于65g/L、60g/L、55g/L或50g/L的材料。
在本文所讨论的方法的各种实施方式中，渗滤和超滤都不用于从纯化的异二聚体蛋白洗脱液中去除盐。也不需要稀释所需产品来降低后续处理的盐浓度。这种无需稀释、超滤或渗滤即降低盐浓度减少了纯化这些双特异性抗体所需的设备和储罐占地面积。
在一些实施方式中，亲和基质包含附着至基底的配体(例如，蛋白质A)。在一些情况下，基底是珠粒或粒子，使得亲和基质附着有配体的多个粒子。在各种实施方式中，配体是蛋白质A或蛋白质G。当配体是蛋白质A时，蛋白质A可以是天然存在的或经修饰的葡萄球菌(Staphylococcal)蛋白质A，或者它可以是经工程化的蛋白质A。工程化的蛋白质A可以是例如Z结构域四聚体、Y结构域四聚体、或缺乏D结构域和E结构域的经工程化的蛋白质A。这些经工程化的蛋白质A样本无法结合(或以非常低的亲和力结合)免疫球蛋白的VH3结构域，但仍可结合IgG1、IgG2和IgG4的CH3结构域。
在一些情况下，亲和基质基底包含琼脂糖、聚(苯乙烯二乙烯基苯)、聚甲基丙烯酸酯、可控孔径玻璃、球形二氧化硅、纤维素等或由其制成。在基底成形为珠粒或粒子的实施方式中，粒子的平均直径是25μm至100μm。在一些实施方式中，粒子的平均直径是约40μm至约60μm。在一些实施方式中，粒子的平均直径是约45μm至约55μm。在一些实施方式中，粒子的平均直径是约40μm、41μm、42μm、43μm、44μm、45μm、46μm、47μm、48μm、49μm、50μm、51μm、52μm、53μm、54μm或55μm。在一些情况下，粒子的平均直径是约45μm。在一些情况下，粒子的平均直径是约50μm。在一些实施方式中，粒子的平均直径是35μm、45μm、60μm、75μm、或85μm。在一些实施方式中，粒子包含平均直径为约
Figure BDA0003404580620000181
或
Figure BDA0003404580620000182
的孔。在一些实施方式中，粒子包含平均直径为约
Figure BDA0003404580620000183
的孔。
在所述方法的一些实施方式中，异二聚体蛋白是双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：第一多肽，所述第一多肽包含能够结合蛋白质A的CH3结构域(“Fc”)；和第二多肽，所述第二多肽包含不能结合蛋白质A的CH3结构域(“Fc*”)。在一些情况下，第二多肽在其CH3结构域中包含H435R/Y436F(按照EU编号系统；按照IMGT外显子编号系统是H95R/Y96F)取代(又名“Fc*”或“星号取代”)。因此，在一些实施方式中，第一同二聚体是具有两个未取代的CH3结构域(即，FcFc)的单特异性抗体；第二同二聚体是具有两个经H435R/Y436F取代的CH3结构域(即，Fc*Fc*)的单特异性抗体；并且异二聚体蛋白是双特异性抗体，所述双特异性抗体具有一个未取代的CH3结构域和一个经H435R/Y436F取代的CH3结构域(即，Fc*Fc)。
实施例
实施例1：CD3xCD20双特异性抗体(BsAb1)的纯化。
BsAb1的纯化是作为两步过程执行的，包括亲和解析色谱步骤和亲和捕获色谱步骤。亲和解析步骤从澄清的条件培养基中捕获双特异性抗体，从而通过去除Fc*Fc*和FcFc同二聚体种类来减少产物体积、增加蛋白质浓度并提高双特异性纯度。在从亲和解析过程中洗脱双特异性抗体后，将洗脱液调节至更高的pH(约7.2)，以准备用于随后重新加载到同一亲和柱上以进行缓冲液交换和病毒灭活。亲和捕获步骤从中性亲和解析池中捕获双特异性抗体，从而减少产物体积、增加蛋白质浓度、并从亲和解析步骤中使用的洗脱液中去除盐：所有这些都不需要超滤、渗滤或稀释，超滤、渗滤或稀释将需要增加的设备和储罐要求。两个色谱步骤均采用相同的基质，所述基质包含MabSelect SuReTM pcc树脂(GEHealthcare Life Sciences)，所述树脂包含Z结构域四聚体。
在亲和捕获过程之后进行病毒灭活，并且包括(使用0.25M甘氨酸盐酸盐)将双特异性抗体池保持在为3.50-3.65的pH达30-50分钟。在中性pH进行病毒灭活后，进行双特异性抗体的池过滤。
纯化过程包括分别在表1和表2中显示的亲和解析步骤和亲和捕获步骤。
表1：亲和解析过程步骤
Figure BDA0003404580620000191
Figure BDA0003404580620000201
CV—柱体积
表2：亲和捕获过程步骤
Figure BDA0003404580620000202
CV—柱体积
结果：多次纯化运行产生了97.1％的平均双特异性纯度，其中对于BsAb1，在病毒灭活后通过过滤得到的双特异性产率是92.8％。实现了电导率从约71.79mS/cm至<2.0mS/cm的降低。针对BsAb1实现了可比的结果，其中亲和解析过程的洗脱步骤利用pH为4.45的500mM CaCl2代替了表1中指出的氯化钠。
实施例2：METxMET(不同表位)双特异性抗体(BsAb2)的纯化。
BsAb2的纯化是根据实施例1中描述的过程执行的，但包括分别在表3和表4中显示的亲和解析步骤和亲和捕获步骤。
表3：亲和解析过程步骤
Figure BDA0003404580620000211
CV—柱体积
表4：亲和捕获过程步骤
Figure BDA0003404580620000212
CV—柱体积
结果：多次纯化运行产生了96.0％±0.7％的平均双特异性纯度，其中针对BsAb2，在病毒灭活后通过过滤得到的双特异性产率是90.9％。实现了电导率从约70.75mS/cm至<2.0mS/cm的降低。
实施例3：BCMAxCD3双特异性抗体(BsAb3)的纯化。
BsAb3的纯化是根据实施例1中描述的过程执行的，但包括分别在表5和表6中显示的亲和解析步骤和亲和捕获步骤。
表5：亲和解析过程步骤
Figure BDA0003404580620000221
CV—柱体积
表6：亲和捕获过程步骤
Figure BDA0003404580620000222
CV—柱体积
结果：多次纯化运行产生了97.4％±0.5％的平均双特异性纯度，其中针对BsAb3，在病毒灭活后通过过滤得到的双特异性产率是93.4％。实现了电导率从约72.80mS/cm至<2.0mS/cm的降低。
实施例4：BCMAxCD3双特异性抗体(BsAb4)的纯化。
BsAb4的纯化是根据实施例1中描述的过程执行的，但包括分别在表7和表8中显示的亲和解析步骤和亲和捕获步骤。
表7：亲和解析过程步骤
Figure BDA0003404580620000231
CV—柱体积
表8：亲和捕获过程步骤
Figure BDA0003404580620000232
CV—柱体积
结果：多次纯化运行产生了94.6％±1.0％的平均双特异性纯度，其中针对BsAb4，在病毒灭活后通过过滤得到的双特异性产率是86.0％。实现了电导率从约70.78mS/cm至<2.0mS/cm的降低。
实施例5：PSMAxCD28双特异性抗体(BsAb5)的纯化。
BsAb5的纯化是根据实施例1中描述的过程执行的，但包括分别在表9和表10中显示的亲和解析步骤和亲和捕获步骤。
表9：亲和解析过程步骤
Figure BDA0003404580620000241
CV—柱体积
表10：亲和捕获过程步骤
Figure BDA0003404580620000242
CV—柱体积
结果：多次纯化运行产生了96.1％±0.9％的平均双特异性纯度，其中针对BsAb5，在病毒灭活后通过过滤得到的双特异性产率是92.4％。实现了电导率从约75.09mS/cm至<2.0mS/cm的降低。
实施例6：CD22xCD28双特异性抗体(BsAb6)的纯化。
BsAb6的纯化是根据实施例1中描述的过程执行的，但包括分别在表11和表12中显示的亲和解析步骤和亲和捕获步骤。
表11：亲和解析过程步骤
Figure BDA0003404580620000251
CV—柱体积
表12：亲和捕获过程步骤
Figure BDA0003404580620000252
CV—柱体积
结果：多次纯化运行产生了96.5％±0.7％的平均双特异性纯度，其中针对BsAb6，在病毒灭活后通过过滤得到的双特异性产率是92.8％。实现了电导率从约71.78mS/cm至<2.0mS/cm的降低。
实施例7：与UFDF相比，亲和脱盐产生的产物的质量改进。
对BsAb1(CD3xCD20)组合物中存在的高分子量(HMW)物质的测量表明了将纯化的异二聚体产物重新施加至现有亲和柱而不是使用超滤/渗滤(UFDF)的附加优势。如下表13所示，将纯化的双特异性抗体重新施加至现有亲和柱将HMW种类进一步减少了0.88％，而UFDF的使用使相同纯化的双特异性抗体的HMW增加了0.12％。
表13：高分子量物种的变化
盐去除 装载HMW％ 池HMW％ ΔHMW％
UFDF 0.73 0.85 +0.12
重新施加至亲和柱 4.78 3.90 -0.88
本发明不被在本文所描述的具体实施方式限于一定的范围。事实上，除了本文所描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将从前面的描述中变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求书的范围内。

Claims (43)

1.一种从色谱洗脱液中去除组分的方法，所述方法包括：
(a)执行第一色谱步骤，在所述第一色谱步骤中所述组分存在于施加至色谱柱的第一缓冲液中；
(b)收集来自所述第一色谱步骤的中间洗脱液，其中所述中间洗脱液含有蛋白质产物和所述组分；
(c)将所述中间洗脱液重新施加至所述色谱柱，并用第二缓冲液洗脱所述蛋白质产物，所述第二缓冲液含有的所述组分的浓度低于所述中间洗脱液的所述组分的浓度；
(d)收集来自步骤(c)的所述色谱洗脱液，其中所述组分以低于所述中间洗脱液的所述组分的浓度存在于所述色谱洗脱液中；以及
(e)将所述色谱洗脱液应用于后续工艺步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述组分不存在于所述第二缓冲液中。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述组分是盐。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述中间洗脱液中的所述盐的浓度大于50mM。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述中间洗脱液中的所述盐的浓度≥100mM、≥250mM、或≥500mM。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述第一色谱步骤选自亲和色谱或离子交换色谱。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述后续工艺步骤是第二色谱步骤。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述后续工艺步骤选自亲和色谱、离子交换色谱、混合模式色谱、疏水相互作用色谱、或病毒灭活。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述蛋白质产物是抗体。
10.一种纯化异二聚体蛋白的方法，所述方法包括：
(a)将异二聚体蛋白和杂质的混合物引入含有蛋白质结合配体的亲和基质中，其中所述异二聚体蛋白包含对所述蛋白质结合配体具有不同亲和力的第一和第二多肽，并且其中至少一种杂质结合所述蛋白质结合配体配体并且至少一种杂质不结合所述蛋白质结合配体；
(b)用包含浓度大于200mM的盐和为5至9的第一pH的第一洗涤缓冲液洗涤所述亲和基质以去除杂质；
(c)在包含浓度大于200mM的盐和为4至5的第二pH的第一洗脱缓冲液中从所述亲和基质洗脱和收集所述异二聚体蛋白，以在第一洗脱液中获得纯化的异二聚体蛋白；
(d)用包含小于4的第三pH的第二洗涤缓冲液洗涤所述亲和基质以去除杂质；
(e)将所述亲和基质平衡至为5至9的第四pH；
(f)将所述第一洗脱液中和至为5至9的pH，然后将所述第一洗脱液重新施加至所述亲和基质；
(g)用包含小于100mM盐的第三洗涤缓冲液洗涤所述亲和基质；以及
(h)在第二洗脱液中洗脱并收集所述纯化的异二聚体蛋白，其中所述第二洗脱液包含小于100mM的所述盐。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述第三洗涤缓冲液包含小于50mM的盐。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述杂质包含同二聚体种类的所述第一和第二多肽。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述蛋白质结合配体是蛋白质A，并且所述亲和基质包括附着至基底的所述蛋白质A配体。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述蛋白质A配体是包含Z结构域四聚体的工程化的蛋白质A、包含Y结构域四聚体的工程化的蛋白质A、或缺乏D结构域和E结构域的工程化的蛋白质A。
15.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述蛋白质结合配体是蛋白质G，并且所述亲和基质包括附着至基底的所述蛋白质G配体。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述基底是粒子并且所述亲和基质包括平均直径为25μm至100μm的多个所述粒子。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述粒子的平均直径是40μm至60μm。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述粒子的平均直径是45μm至55μm。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述粒子的平均直径是约50μm。
20.根据权利要求13-19中任一项所述的方法，其中所述基底包括琼脂糖、聚(苯乙烯二乙烯基苯)、聚甲基丙烯酸酯、纤维素、可控孔径玻璃和球形二氧化硅中的任何一者或多者。
21.根据权利要求13-20中任一项所述的方法，其中所述粒子包括平均直径为约
Figure FDA0003404580610000021
的孔。
22.根据权利要求10-21中任一项所述的方法，其中所述第一洗脱缓冲液包含浓度大于250mM的盐。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述盐浓度大于300mM或大于400mM。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述盐浓度是约500mM。
25.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述盐选自含有以下的盐：(i)Cl-、Br-、I-、NO3 -、N(CH3)4 +、NH4 +、Cs+、Rb+、K+、Na+、H+、Ca2+、Mg2+、Al3+；(ii)Na+、H+、Ca2+、Mg2+或Al3+与Cl-、Br-、I-、NO3 -、或ClO4 -的组合，或(iii)CaCl2、MgCl2或NaCl。
26.根据权利要求10-25中任一项所述的方法，其中所述第二洗脱液包含小于50mM的所述盐。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述第二洗脱液包含小于10mM的所述盐。
28.根据权利要求10-27中任一项所述的方法，其中通过所述第三洗涤缓冲液将所述纯化的异二聚体蛋白洗脱并收集在所述第二洗脱液中。
29.根据权利要求10-28中任一项所述的方法，其中所述第一多肽包含能够与所述蛋白质结合配体结合的CH3结构域，并且所述第二多肽包含不能够与所述蛋白质结合配体结合的CH3结构域。
30.根据权利要求10-29中任一项所述的方法，其中所述第一多肽包含能够与蛋白质A结合的CH3结构域，并且所述第二多肽包含不能够与所述蛋白质A结合的CH3结构域。
31.根据权利要求10-29中任一项所述的方法，其中所述第一多肽包含能够与蛋白质G结合的CH3结构域，并且所述第二多肽包含不能够与所述蛋白质G结合的CH3结构域。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述第二多肽在其CH3结构域中包含HY至RF取代。
33.根据权利要求10-32中任一项所述的方法，其中所述第一pH是6至8。
34.根据权利要求10-33中任一项所述的方法，其中所述第二pH是4.0至4.25。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述第二pH是4.10±0.05。
36.根据权利要求10-35中任一项所述的方法，其中所述第三pH是2.8至3.5。
37.根据权利要求10-36中任一项所述的方法，其中所述第四pH是6至8。
38.根据权利要求10-37中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤(h)之后的附加色谱步骤或病毒灭活步骤。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述附加色谱步骤或病毒灭活步骤在具有小于100mM的盐的条件下执行。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述附加色谱步骤包括离子交换色谱。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述离子交换色谱是阴离子交换色谱并且在具有小于50mM的盐的条件下执行。
42.根据权利要求10-41中任一项所述的方法，其中所述异二聚体蛋白是双特异性抗原结合蛋白。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述双特异性抗原结合蛋白是双特异性抗体。
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